ES2621652T3

ES2621652T3 - Dispositivo implantable que contiene material de matriz reabsorbible y rapamicina para evitar o tratar enfermedades vasculoproliferativas

Info

Publication number: ES2621652T3
Application number: ES10176383.7T
Authority: ES
Inventors: Sriram S Iyer; Nicholas N Kipshidze; Victor V Nikolaychik
Original assignee: Vascular Therapies Inc
Current assignee: Vascular Therapies Inc
Priority date: 2001-01-16
Filing date: 2002-01-16
Publication date: 2017-07-04
Anticipated expiration: 2022-01-16
Also published as: US20190201383A1; AU2002249958B2; MXPA03006315A; DK2314293T3; PT2314293T; US20150209334A1; JP4584537B2; EP2314293A1; US20030113359A1; CA2434972C; EP1351681A2; US8858982B2; RU2345719C2; WO2002062335A2; WO2002062335A3; DE60237671D1; RU2003125357A; US10272073B2; CA2434972A1; CY1119109T1

Abstract

Un material de manguito o matriz que eluye fármaco antivasculoproliferativo implantable adaptado para ser colocado en contacto con el exterior de una estructura vascular para manejar la hiperplasia que resulta de la formación de una anastomosis que comprende: a) Un material de matriz biocompatible flexible para envolver alrededor del exterior de la estructura vascular en donde el material de matriz biocompatible está llevando un fármaco vasculoproliferativo; y b) El fármaco antivasculoproliferativo es rapamicina.

Description

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Se puede utilizar una mezcla de fármacos adecuados y/o aditivos. Además de una matriz de proteína reabsorbible y un agente antiproliferativo, este dispositivo implantable contiene opcionalmente, agentes que inhiben la acumulación de colágeno en la pared vascular y farmacéuticos que ayudan a reducir la calcificación de la pared vascular.

La rapamicina se eluye desde el exterior y se difunde a través de la pared del vaso y/o injerto al interior de la vena y/o arteria y/o injerto. La elusión de rapamicina hacia y a través de la pared vascular desde el exterior tiene lugar durante la fase de curación de los sitios anastomosicos y el fármaco evitará la supresión/inhibición o tratará la proliferación de células del músculo liso que acompaña tal curación. Así, la presente invención suministra un método para inhibir la respuesta vasculoproliferativa en los extremos anastomósicos de un injerto o derivación de acceso vascular mediante la elusión gradual o liberación sincronizada de un fármaco desde el exterior al vaso interior, es decir, mediante el suministro transvascular utilizando una fuente extravascular.

Breve descricpción de las figuras Las FIGURAS 1A, 1B, 2A y 2B muestran realizaciones preferidas de la presente invención. Las FIGURAS 2A y 2B muestran otra realización de la presente invención en la que se emplea un soporte exterior o

estructura esquelética. Las FIGURAS 3A-3C muestran una realización con autoenclavamiento de esta invención. La FIGURA 4: otro ejemplo de un diseño para autoenclavamiento de la presente invención. La FIGURA 5 muestra el dispositivo básico que se muestra en las FIGURAS 1A-1B/2A-2B e incluye un soporte o

bastidor de alambre exterior que ayuda a la retención de la forma del manguito.

Las FIGURAS 6-13 muestran algunos despliegues posibles del manguito que eluye el fármaco de la presente invención en el contexto de diversas necesidades de reparación de vasos. La FIGURA 14 muestra las velocidades de liberación de colágeno saturado con tetraciclina y rapamicina. La

rapamicina se combinó con un material matriz de colágeno utilizando cuatro diferentes formatos. Los números sobre el eje de las y muestra la concentración de fármaco en microgramos por ml. Leyenda: A= Colágeno saturado con Tetraciclina B= Colágeno saturado con Rapamicina C= Rapamicina dispersada a través de colágeno D= Colágeno conjugado con Rapamicina

E= Combinación de formas dispersas y conjugadas de Rapamicina La FIGURA 15 es una comparación de la inhibición del Crecimiento de las Células del Músculo liso utilizando matrices de colágeno combinadas con diferentes agentes antiproliferativos. Los números sobre el eje y denota los números de célula.

Leyenda: A= Control B= Colágeno + Actinomisina D C= Colágeno + Rapamicina La FIGURA 16 es una comparación del efecto de Rapamicina, Tacrolimus y Paclitaxel (tres dosis) sobre Células del

Músculo Liso Humano. La FIGURA 17 es una comparación del efecto de Rapamicina, Tacrolimus y (tres dosis) de Paclitaxel en tres dosificaciones, sobre células endoteliales humanas.

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Las FIGURAS 1A, 1B, 2A y 2B ilustran realizaciones preferidas de la presente invención 1. En la FIGURA 1A se muestra una hoja rectangular de un material matriz 2 con un agente 3 de la presente invención (punteado) distribuido en esta. La FIGURA 1B ilustra otra realización de la invención mostrada en la FIGURA 1A en la cual se ha creado un agujero 4 en el material matriz 3,2 que contiene el fármaco. Un experto en la técnica comprenderá que el diámetro del agujero 4 se ajustará para albergar el diámetro externo de cualquier estructura vascular o de injerto que pase a través de este. En una realización, el diámetro del agujero 4 es de 6 milímetros.

Las FIGURAS 2A y 2B muestran otra realización de la presente invención en la cual se emplea un soporte exterior o estructura esquelética o medio 5. El soporte 5 es exterior a la hoja de material matriz 2 cuando la hoja 2 se enrolla o embobina en una forma cilíndrica. El medio esquelético exterior, como puede ser politetrafluoroetileno (PTFE) y hojas de dacrón son algunos de los materiales de soporte actualmente contemplados. Un experto en la técnica ideará muchos otros medios de soporte esqueléticos exteriores. Como se muestra, la FIGURA 2B ilustra una realización de la invención en la que se emplea un agujero 4 (que puede ser de diferente diámetro).

Las FIGURAS 3A, 3B y 3C ilustran una realización de la invención empleando un diseño de enclavamiento en el que un borde de la hoja rectangular que eluye el agente o material matriz enclava adyacente el borde contraria. Más específicamente, la FIGURA 3A muestra un material matriz 2 rectangular con el agente 3 (mostrado punteado) colocado o distribuido en este. También se muestra en la hoja que se ilustra en la FIGURA 3A una serie de muescas 6 en forma de v ubicadas aproximadamente junto a un borde 7 del material matriz que contiene el agente. Cooperando con las muescas 6 en el borde 8 contrario están una serie de salientes 9. Las salientes 9 tienen forma de cabeza de flecha. No obstante, en esta invención se contemplan otras combinaciones de salientes 9 y ranuras 6. Así pues, el montaje de una realización de un manguito de la presente invención incluye enrollar el borde 8 hacia el borde 7 (mostrada en la FIGURA 3B) e insertar las salientes 9 en las ranuras 6. Como se muestra en la FIGURA 3C las salientes 9 han sido insertadas en las ranuras 6 desde el interior de la estructura tubular, entendiéndose que los puntos 10 de las salientes 9 sobresalen del interior al exterior de la estructura. Como se muestra, los siguientes bordes 11 de las salientes 9 cooperan con las ranuras 6 en forma de v para enclavar la estructura plana en un manguito 12 cilíndrico con dimensiones vasculares. El manguito 12 vascular además entonces define un lumen 14. El lumen 14 es de una dimensión vascular de modo que la superficie interior del manguito 12 esté en contacto con la superficie exterior de una estructura vascular a la cual se une el manguito 12. En este modo, el manguito con dimensión vascular que eluye el fármaco o agente se despliega sobre y alrededor de la estructura vascular con la cual se puede utilizar esta invención.

Las FIGURAS 4A y 4B ilustran una segunda realización de enclavamiento de la presente invención. En la realización, se utiliza una forma de tira de la presente invención. El manguito 16 que eluye el agente comprende material matriz 17 que eluye el fármaco o el agente, alargado (solo o junto con medios de soporte externos, no mostrados). En el material matriz 17 se han creado dos candados 18 ubicados en extremos opuestos de este. Cooperando con el candado 18 están las ventanas 19 en las cuales los candados 18 se de tal manera que el manguito 16 es desplegado contra y sobre el exterior de la estructura vascular operante. Como se muestra en la FIGURA. 4B, el candado 18 se puede insertar en la ventana 19 desde el interior hacia el exterior. En una realización alternativa, el candado 18 se puede insertar en la ventana 19, desde el exterior hacia el interior de la estructura del manguito. En la FIGURA 4A también se muestra un orificio 20 de derivación representativo que incluye dos alas o aletas 21 de contacto de la derivación.

La FIGURA 5 muestra otra realización de la presente invención en la cual se emplea un soporte de alambre o bastidor externo. El bastidor 20 de alambre externo rodea una realización preferida de la presente invención, es decir, un PTFE y el material matriz 22 de colágeno recubierto con fármaco colocado alrededor del vaso 24.

Las FIGURAS 6-13 muestran algunas fístulas arteriovenosas. Un manguito o material matriz que eluye el fármaco de la presente invención 26 se muestra implantado, envuelto o colocado alrededor de las diferentes fístulas 32 mostradas en algunas figuras. En cada una de estas figuras las estructuras venosas están designadas 28 y las estructuras arteriales están designadas con 30. Las flechas 34 muestran la dirección del flujo sanguíneo.

Las FIGURAS 10-13 ilustran otra realización de la invención en la cual se utiliza un injerto, por ejemplo un injerto de PTFE 36 junto con la presente invención. Como se muestra en la FIGURA 13, el injerto 36 puede incluir un material matriz con un fármaco o agente 36 (punteado) de esta invención.

Otra aplicación del manguito presente incluye la utilización de la capa de proteína interior embebida con el fármaco como una fuente del fármaco o reservorio de fármaco. En esta aplicación el fármaco elegido puede ser reabastecido periódicamente, por ejemplo, mediante punción del manguito con una aguja y suministrando más fármaco a este o creando un reservorio para el fármaco dentro del manguito a partir del cual este se puede eluir progresivamente.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se establecen para ilustrar el dispositivo y el método de preparación de las matrices para el suministro de fármaco antiproliferativo, rapamicina.

Los ejemplos se establecen solo con el propósito de ilustración y no se pretenden en un sentido limitante.

Los datos en los ejemplos que no se refieren a la materia objeto de las reivindicaciones están presentes solo con 5 propósitos comparativos.

Ejemplo 1: Efecto inhibitorio de los diferentes agentes antiproliferativos

Se colocaron matrices de colágeno prefabricadas en diferentes soluciones de fármaco antiproliferativo hasta que ocurrió saturación completa. Los fármacos antiproliferativos fueron elegidos para representar los compuestos más activos capaces de inhibir células del músculo liso y fibroblasto sin inhibir las enzimas colagenasa y elastasa. (La 10 colagenasa y elastasa inhiben enzimáticamente la acumulación de colágeno una causa de restenosis). Las matrices de colágeno fueron saturadas con estos compuestos a una concentración de 25 g/mL del liofilizado, se lavaron con regulador de fosfatos 0.066 M (pH 7.4) a 37ºC durante 24 horas y se cortaron en la forma de un disco con densidad del compuesto alrededor de 5 g por cm2. Después del lavado los discos estériles de 15 mm de diámetro se colocaron en placas de cultivo de 24 pozos y se sembraron células con una densidad de 5000 por cm2. Cinco días

15 después se midió el número de células y se evaluó la actividad enzimática en las alicuotas de medios por hidrolisis de sustratos cromogénicos y espectrofotometria. Estos datos se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1. Efecto inhibidor de los diferentes agentes.

Agente: Inhibición SMC % Inhibición de fibroblasto % Actividad de colagenasa % Actividad de elastasa %

Control, matriz plana: 0 0 100 100

Paclitaxel*: 88 ± 6 62 ± 11 98 ± 5 90 ± 4

Rapamicina: 94 ± 5 90 ± 12 137 ± 8 142 ± 5

Ciclosporina A*: 61 ± 7 53 ± 7 104 ± 5 87 ± 7

Tetraciclina libre* base: 11 ± 8 13 ± 5 56 ± 8 81 ± 4

Metotrexato*: 32 ± 9 28 ± 6 23 ± 12 14 ± 3

Actinomicina D*: 44 ± 11 35 ± 8 55 ± 9 84 ± 11

*Comparativo

En este ensayo comparativo in vitro, entre los agentes probados, paclitaxel y rapamicina funcionaron del mismo 20 modo.

Ejemplo 2: Capacidad de los diferentes tipos de matrices para la unión de Rapamicina

En el siguiente estudio in vitro se probó la habilidad de las diferentes matrices para unir rapamicina. Una matriz de

colágeno prefabricada (BioMend, Sulzer Calcitek, Inc., o Biopatch, Ethicon Inc., conteniendo colágeno, alginato) con

rapamicina se preparó como está descrito en el Ejemplo 1 a una concentración inicial de rapamicina de 250 mg/ml. 25 Matrices prefabricadas de quitosan (utilizando la técnica descrita en: Almin, C., Chunlin, H. Juliang, B. et al.,

"Antibiotic loaded chitosan bar. In vitro, in vivo study of a posible treatment for osteomielitis" Clin Orthop pp. 239-247

(sep-1999) y fibrina (utilizando la técnica mencionada en el Ejemplo 5) también se colocaron en 250 mg/ml de

rapamicina en solución de DMSO hasta que se observó saturación completa. Después de la evaporación del

disolvente, las matrices combinadas con los fármacos se lavaron con regulador de fosfatos 0.066 M (pH 7.4) a 37º C 30 durante 24 horas.

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18% (de preferencia 12%) se hinchó durante la noche en ácido acético 0.3-0.6 M (de preferencia 0.52 M), a 4º C. La suspensión hinchada se dispersó con 3 litros de hielo triturado durante 10-20 minutos (preferido 12 minutos) en una licuadora y después se homogeneizó durante 30 minutos en un aparato Ultra-Turrax (Alfa, Suecia). La lechada resultante se filtró a través de una serie de filtros (Cellectro, Bellco, RU) con tamaños de poros decrecientes desde 250 m hasta 20 m, instalados en un soporte de filtro (Millipore). Después de la desgasificación a 0.04-0.09 mbar, de preferencia 0.06 mbar, la lechada se mezcló con dos litros de NaOH 0.1-0.05 M enfriado, el pH final se ajustó a 7.4 ±

0.3. La suspensión neutralizada se puede almacenar a 4-6º C solo durante algunas horas antes de la formación de la matriz. Esta suspensión neutralizada sirve como base para la preparación de una forma saturada o dispersada de una matriz que contenga rapamicina. La lechada neutralizada puede ser colada directamente como una película húmeda con un espesor de 3 mm en una superficie hidrófoba plana a temperatura ambiente, se forma una película seca con un espesor de aproximadamente 60-70 m. De 3 a 5 mL de lechada cubren un área de 10 cm2. En la parte superior de esta superficie se pueden formar algunas capas. Las capas servirán como base para la preparación de la forma saturada del agente antiproliferativo sumergiendo la película de colágeno en soluciones de rapamicina.

Se puede utilizar una combinación simultánea de suspensión neutralizada y rapamicina u otros agentes en suspensión para la preparación de una película con una forma dispersa de ingredientes activos

Un factor importante en la preparación del material de matriz es la porosidad del portador proteínico a partir del cual se va a formar el dispositivo. La porosidad se puede regular por la velocidad de secado, temperatura y las características del colágeno inicial. La porosidad es importante porque regula la cinética de la liberación del fármaco. Se desea que la matriz sea suficientemente porosa para unir moléculas pequeñas como rapamicina (peso molecular 914.2) y muy durable para mantener la forma del dispositivo. Se sometieron a prueba muestras de la matriz de colágeno con tamaño de poro efectivo de 0.002 a 0.1 micras. Se observó mayor capacidad de unión (para unir rapamicina en experimentos de saturación) con la matriz que tenía el tamaño de poro de 0.004 micras. Además, las matrices de colágeno con tamaños de poro más grandes son frágiles. Dado que la capacidad de unión de la matriz al agente antiproliferativo es crucial para esta aplicación, se utilizaron tres diferentes concentraciones de rapamicina para preparar una combinación rapamicina matriz de colágeno a partir de colágeno comercial preparado con una densidad óptima de poros. Las tres diferentes concentraciones marcadas como alta, media y baja, fueron 120 ± 5 g/cm2, 60 ± 4 g/cm2 y 30 ± 3 g/cm2, respectivamente. Ninguna de estas matrices fueron frágiles ni tuvieron distribución de rapamicina no uniforme. Las diferentes densidades permiten regular la cinética de liberación del fármaco.

Ejemplo 5: Preparación de un dispositivo matriz de fibrina implantable, combinado con un agente antiproliferativo

En general, para preparar un dispositivo a base de matriz de fibrina cargado con un agente antiproliferativo, se preparan soluciones acuosas de fibrinógeno y trombina como se describe a continuación. El fibrinógeno comercial se puede adquirir de algunos vendedores como Sigma, American Red Cross o se puede preparar a partir de plasma por las técnicas bien conocidas. De otro modo, el fibrinógeno preparado por los métodos recombinantes es conveniente para este uso. La trombina activa comercial se puede adquirir de Sigma o de Johnson y Johnson como trombina tópica USP, Thrombogen. Para preparar las soluciones de fibrinógeno y trombina que se utilizan para preparar la matriz, se miden los componentes necesarios, se pesan y disuelven en aproximadamente 900 mL de agua deionizada. Las Tablas 4 y 5 describen las composiciones preferidas que se utilizan para preparar soluciones de fibrinógeno y trombina para prefabricar la matriz, respectivamente.

El glicerol en la Tabla 4 se utiliza como plastificador. Para la presente invención también serían convenientes otros plastificadores. El regulador Tris se utiliza para ajustar el pH. Alternativas convenientes para Tris incluyen HEPES, trizina y otras soluciones amortiguadoras con una pKa entre 6.8 y 8.3. El Triton X-100 es un detergente no iónico y estabilizador y se puede sustituir por otros detergentes y estabilizadores. El ácido caprilico se puede sustituir por otros agentes que proporcionen protección contra desnaturalización, por ejemplo el ácido algínico.

TABLA 4. Composición de la solución de fibrinógeno

Componente: Rango de la composición g/litro Composición preferida g/litro

Fibrinógeno: 50-120 76

Glicerol: 20-80 40.5

Tris Regulador: 3-25 12.1

Ácido caprílico: 10 -35 18.7

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Triton X-100: 2 -8 5.4

Heparina: 0.5-6 2.38

Tabla 5. Composición de Trombina

Componente: Rango de Composición g/litro Composición preferida g/litro

Trombina: 5,000-100,000 unidades 8,000 unidades

Albúmina: 1-100 50

Factor XIII: 1,000-5,000 unidades 2,500 unidades

CaCl2: 50-250 mg/litros 123 mg/litros

Troglitazona: 3-24 8

El fibrinógeno convertido en fibrina es el reactivo más importante en la matriz porque controla las propiedades de la matriz, tal como flexibilidad, tamaño de poro y densidad de la masa de la fibra. Estas características determinan la facilidad con la que otras moléculas pueden difundirse dentro de la matriz y el tiempo que la matriz puede permanecer intacta antes de ser reabsorbida.

En la Tabla 5 la albumina es un estabilizador de trombina. La trombina regula la velocidad de formación de la matriz de fibrina. Se prefiere la presencia del factor XIII, pero no es necesaria. El factor XIII retícula en forma covalente la fibrina, haciendo más estable la matriz. Los iones calcio son necesarios para la activación de la trombina. El Troglitozone (Sankyo, Japon) es un derivado de tiazolidiona que disminuye la acumulación de colágeno en la pared vascular. (Yao L, Mizushige K, Murakarni K et al., Troglitozone decreases collagen accumulation in prediabetic stage of a type II diabetic rat model. Heart 2000: 84: 209-210.

Es preferible disolver por completo cada componente antes de adicionar el siguiente componente. Si es necesario, después de que se disuelve el último componente, se ajusta el pH a 7.0-7.4 y se ajusta el volumen de la solución a un litro con agua. Las soluciones entonces se desgasifican. Ambas soluciones se distribuyen por bomba a través de la cámara de la mezcla sobre una superficie no adherente, de preferencia hidrófoba, para formar una película de aproximadamente 2 mm de espesor. Luego la película se seca durante aproximadamente 3 a 6 horas a temperatura en el intervalo de aproximadamente a 20º C a 60º C, a una presión de alrededor de 30 Torr. La humedad residual de la película es alrededor de l0%, de preferencia menor que 3% del peso húmedo total.

Sobre esta superficie se adiciona Rapamicina sólida, anhidra para crear la densidad en el intervalo de 100 a 500 g por cm2 de película. Una segunda capa de matriz de fibrina se forma sobre esta superficie de modo que el fármaco queda intercalado entre las dos capas de fibrina.

En una realización de la presente invención se podría adicionar un agente antiproliferativo/antirestenosico tipo rapamicina o taxol, un fármaco antirechazo tipo rapamicina o Tacrolimus, un fármaco antiinflamatorio y/o un oligonucleotido antisentido para potenciar los efectos antirestenosicos. Estos materiales solidos serian adicionados para complementar el complejo fibrinarapamicina tipo sándwich antes descrito.

Ejemplo 6: Método para reticular la matriz de quitosan

Para aumentar la capacidad de unión de una matriz de quitosan para el fármaco antiproliferativo se utiliza gesticulación de la fibra. 50 mL de suspensión de quitosan enfriada, con una concentración desde 10% hasta 25% (de preferencia 12%) se mezcló suave y lentamente con 5 a 25 ml de cloranhídrido de ácido acrílico durante 30 minutos para acetilar este polímero. Después de este periodo se adiciono una solución de rapamicina en DMSO a una concentración de 250 g/mL, se mezcló vigorosamente y se vertió sobre la superficie de la matriz de quitosan para la gesticulación espontánea y formación de rapamicina conjugada. Este método, por la estructura micro porosa del quitosan, permite aumentar la capacidad de unión de la matriz desde 15% hasta 45%.

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Ejemplo 7: Incorporación de rapamicina en la matriz de colágeno por dispersión, inmovilización e inmovilizacióndispersión

Además de la técnica de saturación, la rapamicina se incorporó en la matriz de colágeno por tres métodos diferentes: dispersión, inmovilización e inmovilización dispersión.

Técnica de dispersión: se preparó una lechada acuosa de colágeno insoluble en agua utilizando colágeno de piel de bovino liofilizado, altamente purificado, anhidro, no reticulado obtenido de Elastin Product Co, Inc., (Owensville, MO). Este colágeno y el búfer solubilizador se enfriaron a una temperatura de 2-8º C, de preferencia 4º C, y se mezcló vigorosamente para preparar la lechada de colágeno que contenía 10-21% (de preferencia 12%) de la proteína colágeno. Esta lechada contiene 9% de plastificador, 15% de glicerol o rapamicina en DMSO a una concentración de 250 g/mL y agua. La solución tuvo una viscosidad de 50,000 cps. Inmediatamente después de mezclar con rapamicina, se adiciona 8% de glutaraldehido a la lechada (100-350 mL por litro de lechada). La lechada acuosa debe ser homogénea y desgasificada, el pH se ajusta a 6.0-7.1. La solución se mezcla constantemente con agitación vigorosa y se dispersa por: bomba sobre una superficie no adherente para formar una película de alrededor de 2 mm de espesor. Todos los procedimientos se llevan a cabo a una temperatura de 4º C. La película luego se seca durante aproximadamente 3-7 horas a temperaturas alrededor de 45º C, y una presión de 15 Torr hasta que su humedad residual es menor que aproximadamente 10% del peso total. La aplicación de la solución del fármaco y los pasos de secado se repiten tres veces más.

II): Técnica de inmovilización: Se realiza la misma preparación de colágeno de Elastin Product Co. Un volumen de 12% de lechada de colágeno se enfría y se acopla con rapamicina por esterificación del fármaco antiproliferativo, La esterificación se lleva a cabo con N-hidroxisuccinimida 0.9 M (Pierce Biochemical, Rockford, IL) en presencia de Ndiciclohexilcarbodiimida 0.9 M (Pierce Biochemical, Rockford, IL) a 2-4º C durante 2 días. Los conjugados se preparan por titulación del Ester Nhidroxisuccinimida activo de rapamicina en DMSO bajo la superficie de la suspensión de colágeno en agitación, el pH de la reacción se mantiene entre 7.0 y 8.5, de preferencia 7.8. Después del secado, las películas con la rapamicina conjugada se lavan con NaCl 0.15 M con un contenido de bicarbonato de sodio 0.02 M a un pH de 7.4. La HPLC muestra que no hay rapamicina libre en la matriz. El éster de rapamicina reacciona con los grupos amino o hidroxilo de los residuos aminoácidos formando un enlace covalente con el colágeno. Después de esta inmovilización, la rapamicina se libera como resultado de una degradación-erosión in vivo o in vitro de la matriz. Nakano et al., hacen referencia a la degradación de colágeno (SM-10500) y la reabsorción por un proceso metabólico natural en monos resus durante 6 meses. Ref: Nakano M, Nakayama Y, Kohda A et al,. Acute subcutaneus toxicity of SM-10500 in rats. Kisoto Rinsho (reporte clínico) 1995; 29: 1675-1699.

Para estudiar la velocidad de liberación de rapamicina a partir de la matriz, las muestras se lavan con búfer de fosfatos 0.066 M (pH 7.4) a 37º C durante 24 horas y se cortan para dar una forma de disco con un área de 1.88 cm2 y se colocan en placas de cultivo de 24 pozos conteniendo NaCl 0.14 M, búfer Tris 0.05 M, 0.5% de albumina y 0.1 mg/ml; de colagenasa a pH 7.0. La colagenasa se adiciona para aumentar la erosión de la matriz de colágeno y facilitar la liberación de rapamicina. De los pozos se recolectan alicuotas en diferentes intervalos de tiempo.

También se prepara una combinación de las formas dispersada y conjugada. En todas estas formas, el contenido de rapamicina es 5.0 g por cm2. Las muestras se colocan en los pozos y se adiciona 1 mL del medio de elusión que contiene suero. Se toman las alicuotas cada hora.

El contenido de rapamicina se mide de conformidad con el procedimiento de Ferron et al., (Ferron GM, Conway WD y Jusko WJ. Lipophilic benzamide and anilide derivatives as high-performance liquid chromatography internal standard: application to sirolimus (rapamycin) determination. J. Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997; Dec 703: 243251). Estas mediciones se hacen utilizando ensayos en lotes y, por tanto, representan velocidades de liberación a una velocidad de flujo de 0 mL/min. Los resultados se muestran en la Tabla 6 y se grafican en la Figura 14; las concentraciones del fármaco antiproliferativo están en g/mL.

Estos datos muestran que diferentes formas del fármaco que se embeben y de los fármacos con diferente solubilidad tienen cinéticas diferentes. En el caso de tetraciclina comparativamente soluble, después de la saturación de la matriz de colágeno con la base libre, ocurre una liberación pico en un corto periodo de tiempo, mientras que para rapamicina menos soluble este pico se pospone durante varias horas. Se ha mostrado en experimentos in vitro, que el colágeno saturado con antibióticos solubles tales como gentamicina, sefotaxina, tetraciclina o clindamicina suministra estos antibióticos a concentraciones efectivas durante 4 días. [Wachol – Drewek Z, Pfeiter M, Scholl E. “” (Biomateriales 1996; 17: 1733 -1738)]. También se demostró in vivo en otros laboratorios, que, colágeno saturado con gentamicina a

Tabla 6: Velocidad de liberación de colágeno saturado con tetraciclina y rapamicina. La rapamicina se combinó con la matriz de colágeno utilizando 4 métodos diferentes

Tiempo (horas): Colágeno saturado con tetraciclina* Colágeno saturado con Rapamicina Rapamicina dispersada en todo el colágeno Colágeno conjugado con Rapamicina Combinación de las formas dispersadas y conjugadas

1: 0.06 0.01 0.01 0 0.01

2: 0.4 0.05 0.03 0 0.02

3: 0.96 0.09 0.06 0.01 0.07

4: 0.54 0.15 0.08 0.02 0.09

5: 0.15 0.19 0.12 0.05 0.17

6: 0.08 0.28 0.18 0.07 0.26

7: 0.02 0.57 0.19 0.11 0.31

8: 0.01 0.44 0.29 0.13 0.32

9: 0.01 0.24 0.41 0.19 0.34

10: - 0.20 0.62 0.27 0.41

11: - 0.19 0.61 0.31 0.78

12: - 0.18 0.40 0.42 0.76

13: - 0.15 0.32 0.45 0.79

14: - 0.02 0.16 0.32 0.45

24: - 0.11 0.24 0.42

Matriz totalmente disuelta: 0 0.003 0.23 0.53 0.39

*Comparativo

concentración de 3 g/g e implantada en el tejido muscular es capaz de suministrar antibiótico a la sangre durante el día 28. No obstante, la concentración fue menos que Óptima. (Mehta S. Humphrey JS, Schenkman DI et al., "Gentamycin distribution from a collagen carrier" J Orthop. Res., 1996; 14: 749-754). En teoría, si se conoce la 5 concentración baja de colagenasa en el espacio perivascular y el flujo bajo del fluido perivascular (solo algunos mililitros por día) un material matriz saturado con rapamicina podría producir in vivo la cinética del suministro, lo cual soportaría la concentración local eficaz del fármaco antiproliferativo durante un periodo de varias semanas para prevenir y combatir el avance de la proliferación de las CML. Las concentraciones inhibitorias para CML estarían en el intervalo de 0.001 hasta 0.005 g/mL de medios de cultivo. Estos niveles se cumplen o exceden in vitro durante 3

10 semanas. Además, la rapamicina dispersada en la matriz de colágeno puede mostrar un efecto antiproliferativo durante un mes o más. Por último, las formas conjugadas y combinadas pueden soportar el tratamiento hasta la erosión completa de la matriz.

Ejemplo 8: Actividad Biológica de Rapamicina en la Matriz de Rapamicina-Colágeno

El parámetro más importante cuando se evalúa la combinación de rapamicina y colágeno es la inhibición del

15 crecimiento de las células del músculo liso (CML), Para evaluar este parámetro, las CML a una densidad de 5,000 células por cm2 se siembran sobre una superficie de cultivo tisular control y matrices de prueba (Tabla 7). Las curvas del crecimiento celular se representan en la Figura 15.

La actinomicina D se libera rápidamente de la matriz del fármaco y suprime el crecimiento celular solo durante un periodo de tiempo corto. Un cambio de medios retira la actinomicina soluble y después de varios lavados no está presente, ningún antibiótico en los medios ni en la matriz. Como resultado, las células comienzan a proliferar como es normal. Debido a una liberación progresiva, lenta de rapamicina, la supresión del crecimiento celular continuará a lo largo del periodo de observación.

Número de Célula

Tabla 7: Comparación de la inhibición del crecimiento de las células del músculo liso utilizando matrices de colágeno saturadas con actinomicina D y rapamicina

Días en cultivo: Control Colágeno + Actinomicina D* Colágeno + Rapamicina

0: 5000 5000 5000

1: 6430 ± 20.4 5230 ± 16.8 4800 ± 9.5

2: 10240 ± 27.1 7350 ± 19.5 5040 ± 11.2

3: 16340 ± 30.12 9400 ± 13.2 6230 ± 13.4

4: 27100 ± 25.4 14280 ± 17.6 7400 ± 15.1

5: 38450 ± 22.6 23540 ± 17.8 8000 ± 17.8

6: 40000 ± 20.7 29300 ± 19.4 8550 ± 13.9

7: 40100 ± 20.5 32090 ± 32.1 8500 ±14.4

*Comparativo

10 Ejemplo 9

Dos diferentes tipos de matrices, colágeno y fibrina, combinadas con agentes antiproliferativos (en forma individual o en combinación) junto con la vitamina K se adicionan al medio de cultivo celular en diferentes proporciones. Se siembran las células a la misma densidad, en el día 5 se miden los números de células viables por el ensayo de azul de Alamar. Los datos se presentan en la Tabla 8.

15 Tabla 8: Inhibición del crecimiento celular (%)

Proporción de matriz a medio: Colágeno más Rapamicina Colágeno más Rapamicina más Taxol Colágeno más Rapamicina más Vitamina K Fibrina más Rapamicina Fibrina más Rapamicina más Taxol

1: 400: 5 4 8 3 2

1: 200: 25 27 34 21 19

1: 100: 54 50 77 56 55

1: 50: 73 76 99 79 78

1: 25: 88 88 99 79 84

1: 12.5: 95 99 99 98 96

1: 6.25: 95 99 99 100 98

10

15

20

25

30

35

Ejemplo 10: Efecto antiproliferativo de la combinación de Rapamicina y Heparina combinadas en una matriz de colágeno

Los efectos antiproliferativos de diferentes componentes combinados dentro de una matriz pueden mostrar sinergia. Se utiliza una combinación de rapamicina dispersada, heparina soluble e inmovilizada. Para inmovilizar la heparina, se mezclan 5 mL de solución enfriada de heparina en una concentración de 1 mg/mL a 10 mg/mL (de preferencia 5 mg/mL) con 5 a 20 mL (de preferencia 11.4 mL) de cloranhidrido de ácido acrílico a la tasa de aproximadamente 1 L por min (de preferencia 2.5 L por min). Después de la adición, se agita la mezcla durante 30 minutos a una temperatura de 4-8º C. El colágeno heparinizado se lava intensamente con solución salina amortiguada con fosfato de sodio pH 7.4. Se utiliza un ensayo colorimétrico con eosina A para determinar la concentración de la heparina inmovilizada en la matriz. Utilizando este método, se puede ligar covalentemente a 2 la matriz entre 0.01 mg/cm2 y

0.1 mg/cm2.

Una combinación como esta combinada con Rapamicina tiene efecto inhibidor sobre el crecimiento de las CML en cultivos si se adiciona en forma de suspensión en el medio a una proporción 1: 100, mientras que las formas individuales tienen menores efectos; la relación 1: 25 para heparina sola a 1: 65 para rapamicina dispersada. Cada uno de estos fármacos puede inhibir la restenosis por vía de diferentes mecanismos, de aquí que es razonable esperar el efecto sinérgico cuando se utiliza en combinación. La heparina también se puede utilizar en una forma saturada en la matriz en combinación con antiproliferativos.

Ejemplo 11

El suministro local sostenido de Dexametasona en combinación con Rapamicina (u otros agentes antiproliferativos) se puede utilizar para inhibir simultáneamente la restenosis así como reacciones inflamatorias. Se prepara una lechada de colágeno al 20% (peso/peso), a la cual se adiciona una suspensión al 2% (peso/peso) de dexametasona. Esta mezcla se asperja sobre una superficie de plástico para formar la película. El espesor final de la película abarca desde 1.92 hasta 2.14 mm (promedio 2 mm). Esta hoja es flexible y mecánicamente estable. La cinética de la elusión de dexametasona a partir de la matriz c (colágeno más rapamicina) se caracterizó en un sistema in vitro. Hojas de 15 mm de diámetro se colocaron en los pozos y se sumergieron en 2.5 mL de una solución amortiguada de fosfatos. En los puntos de tiempo que abarcaban desde los días 1 hasta 7, la concentración de dexametasona en las alicuotas del búfer para elusión se midió mediante espectrofotometría. Se confirmó mediante HPLC la estabilidad química de la dexametasona a lo largo del proceso de formación de la hoja, almacenamiento en el estado anhidro y elusión. La elusión acumulada in vitro de la dexametasona se muestra en la Tabla 9.

Mas de 50% de la elusión de dexametasona ocurrió en el transcurso de los primeros 3 días, con una desnivelación de las curvas de elusión después de 6 días. La dexametasona puede prevenir respuesta inflamatoria grave, la cual es máxima durante este periodo y puede actuar en forma sinérgica con rapamicina para reducir restenosis. Contrario a una endoprotesis que eluye dexametasona, el suministro perivascular no inhibe la regeneración de las células endoteliales y actúa directamente sobre los fibroblastos y las células del músculo liso.

Tabla 9: Elusión acumulada in vitro de dexametasona a partir de una matriz de colágeno

Masa de dexametasona eluida (microgramos): Tiempo (días)

0
0

211 ± 23: 1

489 + 31: 2

605 ± 42: 3

672 ± 38: 4

725 ± 21: 5

733 ± 18: 6

745 ± 13: 7

Ejemplo 12

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Claims

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