MX2014008101A

MX2014008101A - Proteinas de union especificas duales dirigidas contra il-13 y/o il-17.

Info

Publication number: MX2014008101A
Application number: MX2014008101A
Authority: MX
Inventors: Tariq Ghayur; Chung-Ming Hsieh; Carrie L Goodreau
Original assignee: Abbvie Inc
Priority date: 2011-12-30
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2014-09-25
Also published as: EP2797955A2; WO2013102042A3; US20150344566A1; TW201333035A; UY34558A; US9120870B2; JP2015508994A; WO2013102042A2; CA2861610A1; AU2012362326A1; AU2012362326A2; AR089529A1; US20130236458A1; CN104159920A; BR112014015851A2

Abstract

Proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas de ingeniería que se unen a la IL-13 y/o a la IL-17, junto con métodos de elaboración y sus usos en la prevención, el diagnóstico y/o tratamiento de una enfermedad.

Description

PROTEÍNAS DE UNIÓN ESPECÍFICAS DUALES DIRIGIDAS CONTRA 1L-13 Y/O IL-17 Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional Estadounidense No. 61/581,964, presentada el 30 de diciembre, 2011, es incorporada por referencia la descripción completa de la presente.

Listado de Secuencia La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias que se ha presentado en formato ASCII a través de EFS-Web y se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Tal copia ASCII, creada el 21 de enero de 2013, es nombrado 11664304.txt y es de 46,788 bytes de tamaño Campo de la Invención Se proporcionan proteínas de unión multivalente y multiespecífico que se unen a IL-13 y/o IL-17, métodos para elaborarlas y sus usos en el diagnóstico, la prevención y/o tratamiento de enfermedades inflamatorias agudas y crónicas, cáncer y otras enfermedades.

Antecedentes de la Invención Las proteínas diseñadas, como las proteínas de unión multiespecificas con capacidad de unirse a dos o más antígenos son conocidas en la técnica. Tales proteínas de unión multiespecificas se pueden generar usando fusión celular, conjugación química, o técnicas de ADN recombinante. Existe una variedad de estructuras de proteínas de unión multiespecíficas que son conocidas en la técnica y muchas estructuras y métodos tienen distintas desventajas.

Se han producido anticuerpos biespecíficos usando la tecnología del cuadroma. Sin embargo, la presencia de productos secundarios desapareados, y rendimientos de producción significativamente reducidos con esta tecnología, indica que se necesitan procedimientos sofisticados de purificación. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden producir mediante conjugación química de dos mAbs diferentes. Sin embargo, este enfoque no genera preparaciones homogéneas.

Otros enfoques usados previamente incluyen el acoplamiento de dos anticuerpos parentales con un entrecruzador hetero-bifuncional, la producción de moléculas Fv de cadena simple en tándem, diacuerpos, diacuerpos biespecíficos, diacuerpos de cadena simple y di-diacuerpos. Sin embargo, cada uno de estos enfoques presenta desventajas. Adicionalmente, se ha descrito una construcción de anticuerpos multivalentes que comprenden dos repeticiones Fab en la cadena pesada de una IgG y con capacidad de unirse a cuatro moléculas de antígeno (ver la publicación PCT No. WO 0177342, y iller, et al. (2003) J. Immunol. 170(9): 4854-61).

En la Patente Estadounidense No. 7,612,181 proporciona una nueva familia de proteínas de unión capaces de unirse a dos o más antígenos con gran afinidad, que se denominan proteínas de unión de dominio variable dual (proteína de unión DVD) o inmunoglobulinas de dominio variable dual (DVD-lg™).

Mientras se proporciona en la técnica una variedad de estructuras, con algunas ventajas y desventajas, se necesitan construcciones específicas para preparar proteínas de unión multivalentes con propiedades específicas y que se unen a objetivos específicos. Además, las secuencias del dominio variable nuevas pueden mejorar aún más las propiedades de las proteínas de unión.

La interleuquina 13 (IL-13) es una glicoproteína de 17 kDa producida por células T activadas del linaje Th2. La función de la IL-13 incluye el intercambio del isotipo de inmunoglobulina a IgE en células B humanas y la supresión de la producción de citoquinas inflamatorias. La IL-13 se asocia principalmente con la inducción de la inflamación de las vías respiratorias, como el asma. También se ha relacionado con otras enfermedades alérgicas, condiciones fibróticas, cáncer y enfermedades infecciosas.

La interleuquina-17 (IL-17, también denominada IL-17A) es una glicoproteína homodimérica de 20-30 kD secretada por células T activadas en el sitio de la inflamación. La IL-17 actúa como una citoquina proinflamatoria por inducción de la producción de múltiples moléculas de adhesión, citoquinas y quimioquinas inflamatorias en diversos tejidos para reclutar monocitos y neutrófilos hacia el sitio de inflamación. La IL-17 también cumple un papel importante en la maduración de células progenitoras hematopoyéticas. Una producción inapropiada o excesiva de IL-17 está asociada con la patología de diversas enfermedades o trastornos incluyendo artritis reumatoide, asma, lupus, rechazo de aloinjertos, otras enfermedades inflamatorias o autoinmunes y cáncer.

Existe la necesidad en la técnica de las proteínas de unión multivalentes mejoradas capaces de unirse a IL-13 y/o IL-17. En la presente se proporcionan nuevas proteínas de unión que se une a la IL-13 y a la IL-17.

Breve Descripción de la Invención Se proporcionan proteínas de unión capaces de unirse a la IL-13 y/o a la IL-17. En una modalidad, se proporcionan proteínas de unión capaces de unirse a la IL-13 y/o a la IL-17 con una gran afinidad.

En una modalidad, se proporciona una proteína de unión que comprende una cadena de polipéptido que une IL-13 y/o IL-17, en donde una cadena de polipéptido comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, C es un dominio constante, X1 representa un aminoácido o un polipéptido, X2 representa una región Fe, y n es 0 o 1. En una modalidad, VD1 y VD2 en la proteína de unión son dominios variables de cadena pesada. En otra modalidad, VD1 y VD2 tienen la capacidad de unirse al mismo antígeno. En otra modalidad, VD1 y VD2 tienen la capacidad de unirse a diferentes antígenos. En aun otra modalidad, C es un dominio constante de la cadena pesada. Por ejemplo, X1 es un conector con la condición de que X1 no es CH1.

En una modalidad la proteína de unión descrita en el presente documento comprende una cadena de polipéptido que une IL-13 y/o IL-17, en donde la cadena de polipéptido comprende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada, VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada, C es un dominio constante de cadena pesada, X1 es un conector, y X2 es una región Fe. En una modalidad, X1 es un conector con la condición de que no es CH1.

En una modalidad la proteína de unión descrita en el presente documento comprende una cadena de polipéptido que une 11-13 y/o IL-17, en donde la cadena de polipéptido comprende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera, VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera, C es un dominio constante de cadena ligera, X1 es un conector, y X2 no comprende una región Fe. En una modalidad, X1 es un conector con la condición de que no es CL.

En otra modalidad, una proteína de unión que une IL-13 y/o IL-17 que comprende dos cadenas polipeptídicas, en donde primera cadena de polipéptido comprende VD 1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada, VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada, C es un dominio constante de cadena pesada, X1 es un primer conector, y X2 es una región Fe; y la segunda cadena de polipéptido comprende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera, VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera, C es un dominio constante de cadena ligera, X1 es un segundo conector, y X2 no comprende una región Fe. En algunas modalidades, el primer y el segundo X1 son iguales. En otras modalidades, el primer y el segundo X1 son diferentes. En algunas modalidades el primer X1 no es un dominio CH1 y/o el segundo X1 no es un dominio CL. En una modalidad, el primer conector X1 y el segundo conector X1 son cortos (por ejemplo, 6 aminoácidos). En otra modalidad, el primer conector X1 y el segundo conector X1 son largos (por ejemplo, más de 6 aminoácidos). En otra modalidad, el primer X1 es un conector corto y el segundo X1 es un conector largo. En otra modalidad, el primer X1 es un conector largo y el segundo X1 es un conector corto.

En una modalidad, la proteína de unión de dominio variable dual (DVD por sus siglas en inglés) comprende cuatro cadenas polipeptídicas, en donde cada una de las primeras dos cadenas polipeptídicas comprende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada, VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada, C es un dominio constante de la cadena pesada, X1 es un primer conector y X2 es una región Fe; y cada una de las segundas dos cadenas polipeptídicas comprende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera, VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera, C es un dominio constante de la cadena ligera, X1 es un segundo conector y X2 no comprende una región Fe. Tal proteína de unión DVD tiene cuatro sitios de unión al antígeno. En algunas modalidades, el primer y el segundo X1 son iguales. En otras modalidades, el primer y el segundo X1 son diferentes. En algunas modalidades, el primer X1 no es un dominio CH1 y/o el segundo X1 no es un dominio CL. En otra modalidad, las proteínas de unión descritas en el presente documento tienen la capacidad de unirse a la IL-13 y a la IL-17. Por lo tanto, en algunas modalidades, las proteínas de unión comprenden al menos dos dominios variables de secuencias (por ejemplo, VD1 y VD2) capaces de unirse a la IL-13 y a la IL-17, en cualquier orientación. En algunas modalidades, VD1 y VD2 se seleccionan de manera independiente entre sí. Por ello, en algunas modalidades, VD1 y VD2 comprenden la misma SEC ID No. y, en otras modalidades, VD1 y VD2 comprenden SEC ID Nos. Son diferentes.

En una Modalidad. (a) la proteína de unión se une a la IL-13 y a la IL-17; (b) el dominio variable de la cadena pesada VD1 o VD2 comprende tres CDRs de la SEC ID No.: 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49; (c) los dominios variables de la cadena pesada VD1 y VD2 comprenden de manera independiente tres CDRs de la SEC ID No.: 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49; (d) el dominio variable de la cadena pesada VD1 comprende tres CDRs de la SEC ID No.: 36, 38, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49, y el dominio variable de la cadena pesada VD2 comprende tres CDRs de la SEC ID No.: 30, 32 o 34; o (e) el dominio variable de la cadena pesada VD2 comprende tres CDRs de la SEC ID No.: 36, 38, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49 y el dominio variable de la cadena pesada VD1 comprende tres CDRs de la SEC ID No.: 30, 32 o 34.

En otra Modalidad. (a) el dominio variable de la cadena pesada VD1 o VD2 comprende la SEC ID No.: 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49; (b) los dominios variables de la cadena pesada VD1 y VD2 comprenden de manera independiente la SEC ID No.: 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49; (c) el dominio variable de la cadena pesada VD1 comprende la SEC ID No.: 36, 38, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49, y el dominio variable de la cadena pesada VD2 comprende la SEC ID No.: 30, 32 o 34; o (d) el dominio variable de la cadena pesada VD2 comprende la SEC ID No.: 36, 38, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49 y el dominio variable de la cadena pesada VD1 comprende la SEC ID No.: 30, 32 o 34.

En una Modalidad. (a) la proteína de unión se une a la IL-13 y a la IL-17; (b) el dominio variable de la cadena pesada VD1 o VD2 comprende tres CDRs de la SEC ID No.: 50, 51, 52, 53 o 54; (c) el dominio variable de la cadena pesada VD1 o VD2 comprende de manera independiente tres CDRs de la SEC ID No.: 50, 51 , 52, 53 O 54; (d) el dominio variable de la cadena ligera VD1 comprende tres CDRs de la SEC ID No.: 37, 39, 41, 50, 51, 52, 53 o 54 y el dominio variable de la cadena ligera VD2 comprende tres CDRs de la SEC ID No.: 31 , 33 o 35; o (e) el dominio variable de la cadena ligera VD2 comprende tres CDRs de la SEC ID No.: 37, 39, 41, 50, 51, 52, 53 o 54 y el dominio variable de la cadena ligera VD1 comprende tres CDRs de la SEC ID No.: 31, 33 o 35.

En otra Modalidad. (a) el dominio variable de la cadena ligera VD1 o VD2 comprende la SEC ID No.: 50, 51, 52, 53 o 54; (b) los dominios variables de la cadena ligera VD1 y VD2 comprenden de manera independiente la SEC ID No.: 50, 51, 52, 53 o 54; (c) el dominio variable de la cadena ligera VD1 comprende la SEC ID No.: 37, 39, 41, 50, 51, 52, 53 o 54 y el dominio variable de la cadena ligera VD2 comprende la SEC ID No.: 31, 33 o 35; o (d) el dominio variable de la cadena ligera VD2 comprende la SEC ID No.: 37, 39, 41, 50, 51, 52, 53 o 54 y el dominio variable de la cadena ligera VD1 comprende la SEC ID No.: 31, 33 o 35.

En otra modalidad, la proteína de unión comprende una secuencia de la cadena pesada y de la cadena ligera como se muestra en la Tabla 1 del presente documento.

Una modalidad adicional, de cualquiera de las modalidades de la cadena pesada, la cadena ligera, de dos cadenas o cuatro cadenas, incluye al menos un conector X1 que comprende: AKTTPKLEEGEFSEAR (SEC ID No.: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEC ID No.: 2); AKTTPKLGG (SEC ID No.: 3); SAKTTPKLGG (SEC ID No.: 4); SAKTTP (SEC ID No.: 5); RADAAP (SEC ID No.: 6); RADAAPTVS (SEC ID No.: 7); RADAAAAGGPGS (SEC ID No.: 8); RADAAAA(G4S)4 (SEC ID No.: 9): SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEC ID No.: 10); ADAAP (SEC ID No.: 11); ADAAPTVSIFPP (SEC ID No.: 12); TVAAP (SEC ID No.: 13); TVAAPSVFIFPP (SEC ID No.: 14); QPKAAP (SEC ID No.: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEC ID No.: 16); AKTTPP (SEC ID No.: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEC ID No.: 18); AKTTAP (SEC ID No.: 19); AKTTAPSVYPLAP (SEC ID No.: 20); ASTKGP (SEC ID No.: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEC ID No.: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID No.: 23); GENKVEYAPALMALS (SEC ID No.: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEC ID No.: 25); GHEAAAVMQVQYPAS (SEC ID No.: 26); TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP (SEC ID No.: 27); O ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP (SEC ID No.: 28); o secuencias basadas en G/S (por ejemplo, G4S (SEC ID No.: 29) y repeticiones G4S (SEC ID No.: 29)). En una modalidad, X2 es una región Fe. En otra modalidad, X2 es una región Fe variante.

En aun otra modalidad, la región Fe, si está presente en el primer polipéptido, es la secuencia nativa de la región Fe o una secuencia variante de la región Fe. En aún otra modalidad, la región Fe es una región Fe de una lgG1, una región Fe de una lgG2, una región Fe de una lgG3, una región Fe de una lgG4, una región Fe de una IgA, una región Fe de una IgM, una región Fe de una IgE o una región Fe de una IgD.

Se proporciona un método para elaborar una proteína de unión que se une a la IL-13 y/o a la IL-17. En una modalidad, el método de elaboración de una proteína de unión que se une a IL-13 y/o IL-17, comprende las etapas de a) obtener un primer anticuerpo parental, o una porción de unión al antígeno del mismo, que se une a IL-13; b) obtener un segundo anticuerpo parental, o una porción de unión al antígeno del mismo, que se une a IL-17; c) preparar una o más construcciones que codifican cualquiera de las proteínas de unión que se describen en el presente documento; y d) expresar las cadenas polipeptídicas, de manera tal que se genera una proteína de unión que se une al primer y al segundo antígenos.

En cualquiera de las modalidades de la presente, el dominio variable de la cadena pesada VD1 , si está presente, y el dominio variable de la cadena ligera, si está presente, puede ser un primer anticuerpo parental o una porción de unión al antfgeno del mismo; el dominio variable de la cadena pesada VD2, si está presente, y el dominio variable de la cadena ligera, si está presente, puede ser de un segundo anticuerpo parental o una porción de unión al antígeno del mismo. El primer y segundo anticuerpos parentales pueden ser iguales o diferentes.

En una modalidad, el primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno del mismo se une al primer antígeno, y el segundo anticuerpo parental o porción de unión ai antígeno del mismo se une al segundo antígeno. En una modalidad, el primero y segundo antígeno son el mismo antígeno. En otra modalidad, los anticuerpos parentales unen diferentes epitopes en el mismo antígeno. En otra modalidad el primer y segundo antígenos son antígenos diferentes. En otra modalidad, el primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno del mismo, se une al primer antígeno con una potencia diferente de la potencia con la cual el segundo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno del mismo, se une al segundo antígeno. En aún otra modalidad, el primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno del mismo, se une al primer antígeno con una afinidad diferente de la afinidad con la cual el segundo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno del mismo, se une al segundo antígeno.

En otra modalidad el primer anticuerpo parental o una porción de unión al antígeno del mismo, y el segundo anticuerpo parental o una porción de unión al antígeno del mismo, comprenden un anticuerpo humano, un anticuerpo con CDR injertada, un anticuerpo humanizado y/o un anticuerpo madurado por afinidad.

En otra modalidad la proteína de unión posee al menos una propiedad deseada exhibida por el primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno del mismo, o el segundo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno del mismo. Como alternativa, el primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno del mismo y el segundo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno del mismo posee al menos una propiedad deseada exhibida por la proteína de unión. En una modalidad, la propiedad deseada es uno o más parámetros del anticuerpo. En otra modalidad, los parámetros del anticuerpos son especificidad por el antígeno, afinidad por el antígeno, potencia, función biológica, reconocimiento de epitope, estabilidad, solubilidad, eficacia de producción, inmunogenicidad, farmacocinética, biodisponibilidad, reactividad cruzada de tejido, o unión al antígeno ortólogo. En una modalidad, la proteína de unión es multivalente. En otra modalidad, la proteína de unión es multiespecífica. Las proteínas de unión multivalentes y o multiespecíficas descritas en el presente documento tienen propiedades deseadas particularmente para una perspectiva terapéutica. Por ejemplo, la proteína de unión multivalente y o multiespecífica puede (1) ser internalizada (y/o catabolizada) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al cual los anticuerpos se unen; (2) ser una proteína de unión agonista; y/o (3) inducir la muerte celular y/o apoptosis de una célula que expresa un antígeno al cual se puede unir la proteína de unión multivalente. El "anticuerpo parental" que proporciona al menos una especificidad de unión al antígeno de las proteínas de unión multivalentes y o multiespecíficas puede ser uno que sea internalizado (y/o cataboiizado) por una célula que expresa un antígeno al cual se une el anticuerpo; y/o puede ser un agonista, anticuerpo inductor de muerte celular, y/o inductor de apoptosis, y la proteína de unión multivalente y o multiespecífica como se describe en el presente documento puede mostrar mejora en una o más de estas propiedades. Más aun, el anticuerpo parental puede carecer de una o más de estas propiedades, pero puede proporcionarlas cuando se construye como una proteína de unión multivalente como se describe en el presente documento.

En otra modalidad, la proteína de unión tiene una constante de asociación (Kon) a uno o más objetivos de al menos 102M"1s1 aproximadamente; al menos 103M" s1 aproximadamente; al menos 104M*1s1 aproximadamente; al menos 105M"1s1 aproximadamente; o al menos 106M"1s1 aproximadamente, medida por resonancia de plasmón superficial. En una modalidad, la proteína de unión tiene una constante de asociación (Kon) con uno o más objetivos de aproximadamente 102M"1s"1 a aproximadamente 103M"1s"1; aproximadamente 103M~V1 a aproximadamente 10 M"V1 ; entre aproximadamente 104M"1s"1 a aproximadamente 105M"1s"1; o entre aproximadamente 10 "1s"1 a aproximadamente 106 ' s'1, como medida por resonancia de plasmón superficial.

En otra modalidad, la proteína de unión tiene una constante de velocidad de disociación (Koff) para uno o más objetivos de como máximo 10"3s"1 aproximadamente; como máximo 10"4s"1 aproximadamente; como máximo 10"5s"1 aproximadamente; o como máximo 10"6s"1 aproximadamente, medida por resonancia de plasmón superficial. En una modalidad, la proteína de unión tiene una constante de disociación (Kotf) con uno o más objetivos de aproximadamente 10"3s"1 a aproximadamente 10"4s"1; de aproximadamente 10" s"1 a aproximadamente 10"5s"1; o de aproximadamente 10"5s"1 a aproximadamente 10"6s"1, medida por resonancia de plasmón superficial.

En otra modalidad, la proteína de unión tiene una constante de disociación (Kd) con uno o más objetivos de como máximo 10"7M aproximadamente; como máximo 10"8M aproximadamente; como máximo 10'9M aproximadamente; como máximo 10"10M aproximadamente; como máximo 10' 1M aproximadamente; como máximo 10"12M aproximadamente; o como máximo 10" 3M. En una modalidad, la proteína de unión tiene una constante de disociación (Kd) para sus objetivos de aproximadamente 10"7M a aproximadamente 10"8M; de aproximadamente 10"8M a aproximadamente 10 M; de aproximadamente 10 M a aproximadamente 10" 0M; de aproximadamente 10"10M a aproximadamente 10'11M; de aproximadamente 10"11M a aproximadamente 10"12M; o de aproximadamente 10"12 M a aproximadamente 10" 3M.

En otra modalidad, la proteína de unión es un conjugado que además comprende un agente. En una modalidad, el agente es una molécula de inmunoadhesión, un agente para determinar imágenes, un agente terapéutico o un agente citotóxico. En una modalidad, el agente para determinar imágenes es una marca radioactiva, una enzima, una marca fluorescente, una marca luminiscente, una marca bioluminiscente, una marca magnética y biotina. En otra modalidad, la radiomarca es 3H, 1 C, 35S, 90Y, "Te, 111ln, 125l, 131l, 177Lu, 166Ho y 153Sm. En aún otra modalidad, el agente terapéutico o citotóxico es un anti-metabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citoquina, un agente anti-angiogénico, un agente anti-mitótico, una antraciclina, una toxina o un agente apoptótico.

En otra modalidad, la proteína de unión es una proteína de unión cristalizada y existe como un cristal. En una modalidad, el cristal es un cristal farmacéutico de liberación controlada libre de vehículos. En otra modalidad, la proteína de unión cristalizada tiene una vida media in vivo más prolongada que su contraparte soluble. En aún otra modalidad, la proteína de unión cristalizada retiene su actividad biológica.

En otra modalidad, la proteína de unión que se describe en el presente documento está glicosilada. Por ejemplo, la glicosilación sigue un patrón de glicosilación humano.

También proporciona un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de las proteínas de unión descritas en el presente documento. Una modalidad adicional proporciona un vector que comprende al ácido nucleico aislado descrito en el presente documento, en donde el vector es pcDNA; pTT (Durocher et al., (2002) Nucleic Acids Res., 30(2); pTT3 (pTT con un sitio de clonación múltiple adicional; pEFBOS (Mizushima y Nagata (1990) Nucleic Acids Res., 18(17); pBV; pJV; pcDNA3.1 TOPO; pEF6 TOPO; pBOS; pHybE; o pBJ. En una modalidad, el vector es un vector que se describe en la Publicación de Patente Estadounidense No.20090239259.

En otro aspecto, se transforma una célula huésped con el vector descrito en el presente documento. En una modalidad, la célula huésped es una célula procariota, por ejemplo, E. coli. En otra modalidad, la célula huésped es una célula eucariota, por ejemplo, una célula protista, una célula animal, una célula vegetal o una célula fúngica. En una modalidad, la célula huésped es una célula de mamífero incluyendo, sin limitaciones, CHO, COS; NSO, SP2, PER.C6; o una célula fúngica como Saccharomyces cerevisiae; o una célula de insecto como Sf9. En una modalidad, dos o más proteínas de unión, por ejemplo, con distintas especificidades, se producen en una sola célula huésped recombinante. Por ejemplo, la expresión de una mezcla de anticuerpos ha sido denominada Oligoclonics™ (Merus B.V., Países Bajos), Patentes Estadounidenses Nos. 7,262,028 y 7,429,486.

Se proporciona un método para producir una proteína de unión que se describe en el presente documento, que comprende cultivar cualquiera de las células huésped que se describen en el presente documento en un medio de cultivo, bajo condiciones apropiadas para producir la proteína de unión. En una modalidad, 50 - 75% de la proteína de unión producida es una proteína de unión tetravalente con especificidad dual. En otra modalidad, 75 -90% de la proteína de unión producida es una proteína de unión tetravalente con especificidad dual. En otra modalidad, 90 - 95% de la proteína de unión producida con este método es una proteína de unión tetravalente con especificidad dual.

Una modalidad proporciona una composición para la liberación de una proteína de unión en donde dicha composición comprende una proteína de unión cristalizada, un ingrediente y al menos un vehículo polimérico. En una modalidad, el vehículo polimérico es ácido poli(acrílico), un poli(cianoacrilato), un poli(aminoácido), un poli(anhídrido), un poli(depsipéptido), un poli(éster), un ácido poli(láctico) , un ácido poli(láctico-co-glicólico) o PLGA, poli(b-hidroxibutirato), poli(caprolactona), poli(dioxanona), poli(etilenglicol), poli((hidroxipropil)metacrilamida, poli[(órgano)fosfaceno], un poli(orto-éster), alcohol poli(vinílico), poli(vinilpirrolidona), un copolímero de anhídrido maleico-alquil vinil éter, un poliol plurónico, albúmina, alginato, celulosa, un derivado de celulosa, colágeno, fibrina, gelatina, ácido hialurónico, un oligosacárido, un glicaminoglicano, un polisacárido sulfatado o mezclas y copolímeros de los mismos. En una modalidad, el ingrediente es albúmina, sacarosa, trehalosa, lactitol, gelatina, hidroxipropil-ß-ciclodextrina, metoxipolietilenglicol o polietilenglicol.

Otra modalidad proporciona un método de tratamiento de un mamífero que comprende la etapa de administrarle al mamífero una cantidad eficaz de una composición descrita en el presente documento.

Se proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión descrita en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende al menos un agente terapéutico adicional para tratar un trastorno. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapéutico, un agente para determinar imágenes, un agente citotóxico, un inhibidor de la angiogénesis (incluyendo, sin limitaciones, un anticuerpo anti-VEGF o VEGF-trap); un inhibidor de quinasa (incluyendo, sin limitaciones, un inhibidor de KDR y TIE-2); un bloqueante de moléculas de co-estimulación (incluyendo, sin limitaciones, anti-B7.1, anti-B7.2, CTLA4-lg, anti-CD20); un bloqueante de moléculas de adhesión (incluyendo, sin limitaciones, un anticuerpo anti-LFA-1, un anticuerpo anti-E/L selectina, un inhibidor de moléculas pequeñas); anticuerpo anti-citoquina o un fragmento funcional de éste (incluyendo, sin limitaciones, anticuerpos anti-IL-18, anti-TNF, anti-l L-6/receptor de citoquina); metotrexato; ciclosporina; rapamicina; FK506; marca o informante detectable; un antagonista de TNF; un antirreumático; un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroidal (NSAID por sus siglas en inglés), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueante neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriático, un corticosteroides, un esteroide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona del crecimiento, un fármaco de reemplazo hormonal, un radiofármaco, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, una medicación para el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, una epinefrina o un análogo, una citoquina o un antagonista de citoquina.

Se proporciona un método para tratar un sujeto humano que sufre de un trastorno en donde el objetivo o los objetivos que se pueden unir a la proteína de unión que se describe en el presente documento son perjudiciales, que comprende administrarle al sujeto humano una proteína de unión que se describe en el presente documento, de manera de inhibir la actividad del objetivo o los objetivos en el sujeto humano, y aliviar uno o más de los síntomas o efectuar el tratamiento. Las proteínas de unión provistas en el presente documento se pueden usar para tratar seres humanos que sufren de enfermedades autoinmunes como, por ejemplo, aquellas que están asociadas con una inflamación. En una modalidad, las proteínas de unión provistas en el presente documento o porciones de unión al antígeno de las mismas, se usan para tratar asma, alergias, enfermedad alérgica de pulmón, rinitis alérgica, dermatitis atópica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD por sus siglas en inglés), fibrosis, fibrosis quística (CF por sus siglas en inglés), enfermedad fibrótica de pulmón, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis hepática, lupus, enfermedades hepáticas y fibrosis relacionadas con hepatitis B, sepsis, lupus sistémica eritematosa (SLE por sus siglas en inglés), glomerulonefritis, enfermedades inflamatorias de la piel, psoriasis, diabetes, diabetes mellitus dependiente de insulina, enfermedades infecciosas causadas por VIH, enfermedad de intestino inflamatorio (IBD por sus siglas en inglés), colitis ulcerosa (UC por sus siglas en inglés), enfermedad de Crohn (CD por sus siglas en inglés), artritis reumatoide (RA por sus siglas en inglés), osteoartritis (OA por sus siglas en inglés), esclerosis múltiple (MS por sus siglas en inglés), enfermedad de injerto versus huésped (GVHD por sus siglas en inglés), rechazo de trasplantes, enfermedad cardíaca isquémica (IHD por sus siglas en inglés), enfermedad celíaca, hipersensibilidad de contacto, enfermedad de hígado alcohólico, enfermedad de Behcet, enfermedad vascular aterosclerótica, enfermedades inflamatorias de la superficie ocular o enfermedad de Lyme.

En otra modalidad, el trastorno o la condición a tratar comprende los síntomas causados por una infección viral en un humano que es causado, por ejemplo, por VIH, el rinovirus humano, un enterovirus, un coronavirus, un virus herpes, un virus de influenza, un virus de parainfluenza, un virus sincitial respiratorio o un adenovirus.

Las proteínas de unión provistas en el presente documento se pueden usar para tratar trastornos neurológicos. En una modalidad, las proteínas de unión provistas en el presente documento o porciones de unión al antígeno de los mismos, se usan para tratar enfermedades neurodegenerativas, y condiciones relacionadas con la regeneración neuronal y lesiones de la médula espinal.

En una modalidad, las enfermedades que pueden ser tratadas o diagnosticadas con las composiciones y los métodos descritos en el presente documento incluyen, sin limitaciones, cánceres primarios y metastáticos, incluyendo carcinomas de mama, colon, recto, pulmón, orofaringe, hipofaringe, esófago, estómago, páncreas, hígado, vesícula biliar y conductos biliares, intestino delgado, tracto urinario (incluyendo riñón, vejiga y urotelio), tracto genital femenino (incluyendo cuello uterino, útero y ovarios, y también el coriocarcinoma y la enfermedad trofoblástica gestacional), tracto genital masculino (incluyendo próstata, vesículas seminales, testículos y tumores de las células germinales), glándulas endocrinas (incluyendo las glándulas tiroides, adrenal y pituitaria), y piel, así como hemangiomas, melanomas, sarcomas (incluyendo los que surgen de tejidos óseos y blandos, y también el sarcoma de Kaposi), tumores de cerebro, los nervios, los ojos y las meninges (incluyendo astrocitomas, gliomas, glioblastomas, retinoblastomas, neuromas, neuroblastomas, Schwannomas y meningiomas), tumores sólidos que surgen de tumores malignos hematopoyéticos, como leucemias y linfomas (linfomas de Hodgkin y no Hodgkin).

En otra modalidad proporciona el uso de la proteína de unión para el tratamiento de una enfermedad o trastorno, en donde dicha enfermedad o trastorno es artritis reumatoide, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis séptica, artritis de Lyme, artritis psoriática, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad de intestino inflamatoria, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis, escleroderma, enfermedad de injerto versus huésped, rechazo de trasplante de órganos, enfermedad inmune aguda o crónica asociada con el trasplante de órganos, sarcoidosis, ateroesclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schoenlein, vasculitis microscópica de los ríñones, hepatitis crónica activa, uveítis, shock séptico, síndrome de shock tóxico, síndrome de sepsis, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parasitarias, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversa aguda, corea de Huntington, mal de Parkinson, mal de Alzheimer, accidente cerebrovascular, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, formas malignas, insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio, enfermedad de Addison, esporádica, deficiencia poliglandular tipo I y deficiencia poliglandular tipo II, síndrome de Schmidt, síndrome de dificultad respiratoria de adultos (agudo), alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriática, artropatía eolítica ulcerosa, sinovitis enteropática, artropatía asociada con clamidia, yersinia y salmonella, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arterioesclerosis, alergia atópica, enfermedad bullosa autoinmune, pénfigo vulgar, pénfigo foliácea, penfigoide, enfermedad por IgA lineal, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica Coombs positiva, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/enfermedad Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de células gigantes, hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmune criptogénica, síndrome de la enfermedad de inmunodeficiencia adquirida, enfermedades relacionadas con la inmunodeficiencia adquirida, hepatitis B, hepatitis C, inmunodeficiencia común variada (hipogammaglobulinemia variable común), cardiomiopatía dilatada, esterilidad femenina, insuficiencia ovárica, insuficiencia ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial post-inflamatoria, pneumonitis intersticial, enfermedad pulmonar intersticial asociada con enfermedades del tejido conectivo, enfermedad pulmonar asociada con enfermedades del tejido conectivo mixtas, enfermedad pulmonar intersticial asociada con esclerosis sistémicas, enfermedad pulmonar intersticial asociada con artritis reumatoide, enfermedad pulmonar asociada con lupus eritematoso sistémico, enfermedad pulmonar asociada con dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada con la enfermedad de Sjógren, enfermedad pulmonar asociada con espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada con hemosiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármacos, fibrosis, fibrosis por radiación, bronquiolitis obliterante, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar linfocítica infiltrante, enfermedad pulmonar intersticial postinfecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune tipo- 1 (hepatitis autoinmune o lupoide clásica), hepatitis autoinmune tipo-2 (hepatitis por anticuerpo anti-LKM), hipoglucemia autoinmune, resistencia a insulina tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroid ismo, enfermedad inmune aguda asociada con el trasplante de órganos, enfermedad inmune crónica asociada con el trasplante de órganos, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis tipo 1, psoriasis tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, enfermedad renal NOS, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los ríñones, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso discoide, esterilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad al esperma, esclerosis múltiple (todos los subtipos), oftalmía simpática, hipertensión pulmonar secundaria a una enfermedad del tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjógren, enfermedad de Takayasu/arteritis, trombocitopenia autoinmune, trombocitopenia idiopática, enfermedad autoinmune de la tiroides, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmune bocioso (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixedema primaria, uveítis facogénica, vasculitis primaria, vitíligo, enfermedad hepática aguda, enfermedad hepática crónica, cirrosis alcohólica, daño hepático inducido por alcohol, colestasis, enfermedad hepática idiosincrática, hepatitis inducida por fármacos, esteatohepatitis no alcohólica, alergia y asma, infección por estreptococos grupo B (GBS por sus siglas en inglés), trastornos mentales (por ejemplo, depresión y esquizofrenia), enfermedades mediadas por tipo Th2 y tipo Th1, dolor agudo y crónico (diferentes formas de dolor), y distintos tipos de cáncer como cáncer de pulmón, mama, estómago, vejiga, colon, páncreas, ovario, próstata y rectal y formas malignas hematopoyéticas (leucemia y linfoma), abetalipoproteinemia, acrocianosis, aguda y procesos parasitarios o infecciosos crónicos, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL por sus siglas en inglés), leucemia mieloide aguda (AML por sus siglas en inglés), infección bacteriana aguda o crónica, pancreatitis aguda, insuficiencia renal aguda, adenocarcinomas, latidos ectópicos aéreos, complejo de demencia del SIDA, hepatitis inducida por alcohol, conjuntivitis alérgica, dermatitis por contacto alérgica, rinitis alérgica, rechazo a aloinjertos, déficit de alfa-1 -antitripsina, esclerosis lateral amiotrófica, anemia, angina pectoris, degeneración de células del asta anterior, terapia anti cd3, síndrome antifosfolípido, reacciones de hipersensibilidad anti-receptor, aneurismas aórticos y periféricos, disección aórtica, hipertensión arterial, arterioesclerosis, fístula arteriovenosa, ataxia, fibrilación auricular (sostenida o paroxística), taquicardia auricular, bloqueo aurículoventricular, linfoma de células B, rechazo de injerto óseo, rechazo de trasplante de médula ósea (BMT por sus siglas en inglés), bloqueo de ramas de haz de His, linfoma de Burkitt, acidez estomacal, arritmias cardiacas, síndrome de atontamiento cardiaco, tumores cardiacos, cardiomiopatía, respuesta de inflamación a una derivación [bypass] cardiopulmonar, rechazo al trasplante de cartílago, degeneraciones de la corteza del cerebelo, trastornos del cerebelo, taquicardia auricular caótica o multifocal, trastornos asociados con una quimioterapia, leucemia mielocítica crónica (CML por sus siglas en inglés), alcoholismo crónico, patologías inflamatorias crónicas, leucemia linfocítica crónica (CLL por sus siglas en inglés), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD por sus siglas en inglés), intoxicación crónica por salicilato, carcinoma colorrectal, insuficiencia cardiaca congestiva, conjuntivitis, dermatitis por contacto, cor pulmonale, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, sepsis con cultivo negativo, fibrosis quística, trastornos asociados con una terapia con citoquinas, demencia pugilística, enfermedades desmielinizantes, fiebre hemorrágica del dengue, dermatitis, condiciones dermatológicas, diabetes, diabetes mellitus, enfermedad ateriosclerótica diabética, enfermedad de cuerpos difusos de Lewy, cardiomiopatía congestiva dilatada, trastornos del ganglio basal, síndrome de Down en la edad madura, trastornos del movimiento inducidos por fármacos que bloquean los receptores de dopamina del CNS, sensibilidad a fármacos, eczema, encefalomielitis, endocarditis, endocrinopatía, epiglotitis, infección por el virus Epstein-Barr, eritromelalgia, trastornos extrapiramidales y del cerebelo, linfohistiocitosis hematofagocítica familiar, rechazo al implante de timo fetal, ataxia de Friedreich, trastornos funcionales de las arterias periféricas, sepsis fúngicas, gangrena gaseosa, úlcera gástrica, nefritis glomerular, rechazo a injertos de cualquier órgano o tejido, sepsis Gram-negativa, sepsis Gram-positiva, granulomas debidos a organismos intracelulares, leucemia de células pilosas, enfermedad de Hallervorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, fiebre del heno, rechazo al trasplante de corazón, hemacromatosis, hemodiálisis, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombocitopénica trombolítica, hemorragia, hepatitis (A), arritmias del haz de His, infección por VIH/neuropatía por VIH, enfermedad de Hodgkin, trastornos de movimientos hiperquinéticos, reacciones de hipersensibilidad, pneumonitis por hipersensibilidad, hipertensión, trastornos de movimientos hipoquinéticos, evaluación del eje hipotalámico-pituitario-adrenal, enfermedad de Addison idiopática, fibrosis pulmonar idiopática, toxicidad mediada por anticuerpos, astenia, atrofia muscular espinal infantil, inflamación de la aorta, influenza a, exposición a radiación ionizante, iridociclitis/uveítis/neuritis óptica, lesiones por reperfusión isquémica, accidente cerebrovascular isquémico, artritis reumatoide juvenil, atrofia muscular espinal juvenil, sarcoma de Kaposi, rechazo al trasplante de riñón, legionella, leishmaniasis, lepra, lesiones del sistema corticoespinal, lipedema, rechazo al trasplante de hígado, linfedema, malaria, linfoma maligno, histiocitosis maligna, melanoma maligno, meningitis, meningococcemia, metabólica/idiopática, migraña cefalea, trastorno mitocondrial multisistémico, enfermedad del tejido conectivo mixto, gammopatía monoclonal, mieloma múltiple, degeneraciones de múltiples sistemas (Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager y Machado-Joseph), miastenia grave, Mycobacterium avium intracellulare , Mycobacterium tuberculosis, síndrome mielodiplástico, infarto de miocardio, trastornos isquémicos del miocardio, carcinoma nasofaríngeo, enfermedad pulmonar neonatal crónica, nefritis, nefrosis, enfermedades neurodegenerativas, atrofias musculares neurogénicas I, fiebre neutropénica, linfoma no Hodgkins, oclusión de la aorta abdominal y ramas de ésta, trastornos arteriales oclusivos, terapia okt3, orquitis/epididimitis, procedimientos de reversión de orquitis/vasectomía, organomegalia, osteoporosis, rechazo al trasplante de páncreas, carcinoma pancreático, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia maligna, rechazo al trasplante de paratiroides, enfermedad inflamatoria pélvica, rinitis perenne, enfermedad del pericardio, enfermedad aterosclerótica periférica, trastornos vasculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, neumonía neumocistitis carinii, neumonía, síndrome de POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gammopatía monoclonal y síndrome de cambios de piel), síndrome de postperfusión, síndrome postbomba, síndrome de cardiotomía post-MI, preeclampsia, parálisis supranuclear progresiva, hipertensión pulmonar primaria, terapia de radiación, fenómeno y enfermedad de Raynaud, enfermedad de Raynaud, enfermedad de Refsum, taquicardia por QRS estrecho regular, hipertensión renovascular, lesión por reperfusión, cardiomiopatía restrictiva, sarcomas, escleroderma, corea senil, demencia senil de tipo cuerpo de Lewy, artropatías, shock, anemia de células falsiformes, rechazo de aloinjertos de piel, síndrome de cambios de piel, rechazo al trasplante de intestino delgado, tumores sólidos, arritmias específicas, ataxia espinal, degeneraciones espinocerebelosas, miositis estreptococcica, lesiones estructurales del cerebelo, panencefalitis esclerosante subaguda, síncope, sífilis del sistema cardiovascular, anafilaxia sistémica, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, artritis reumatoide juvenil de comienzo sistémico, células T o FAB ALL, telangiectasia, tromboangitis obliterans, trombocitopenia, toxicidad, trasplantes, traumatismo/hemorragia, reacciones de hipersensibilidad tipo III, hipersensibilidad de tipo IV, angina inestable, uremia, urosepsis, urticaria, enfermedades de las válvulas cardiacas, venas varicosas, vasculitis, enfermedades venosas, trombosis venosa, fibrilación ventricular, infecciones virales y fúngicas, encefalitis vital/meningitis aséptica, síndrome hemafagocítico asociado a virus, síndrome Wernicke-Korsakoff, síndrome Wilson, rechazo a xenoinjertos de cualquier órgano o tejido, síndromes coronarios agudos, polineuritis idiopática aguda, polirradiculopatía inflamatoria desmielinizante aguda, isquemia aguda, enfermedad de Still del adulto, anafilaxis, síndrome de anticuerpo antifosfolípido, anemia aplásica, eczema atópico, dermatitis atópica, dermatitis autoinmune, trastorno autoinmune asociado con una infección por estreptococo, enteropatía autoinmune, síndrome de pérdida de la audición autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS por sus siglas en inglés), miocarditis autoinmune, falla ovárica prematura autoinmune, blefaritis, bronquiectasias, penfigoide bulloso, enfermedad cardiovascular, síndrome antifosfol ípido catastrófico, enfermedad celíaca, espondilosis cervical, isquemia crónica, penfigoide cicatrizal, síndrome clínicamente aislado (CIS por sus siglas en inglés) con riesgo de esclerosis múltiple, conjuntivitis, trastorno psiquiátrico en la niñez, enfermedad crónica, dacriocistitis, dermatomiositis, retinopatía diabética, diabetes, hernia de disco, prolapso de disco, anemia hemolítica inmune inducida por fármacos, endometriosis, endoftalmitis, episcleritis, eritema multiforme, eritema multiforme mayor, penfigoide gestacional, síndrome de Guillain-Barre (GBS por sus siglas en inglés), síndrome de Hughes, enfermedad de Parkinson idiopática, neumonía intersticial idiopática, alergia mediada por IgE, anemia hemolítica inmune, miositis por cuerpos de inclusión, enfermedad inflamatoria infecciosa ocular, enfermedad inflamatoria desmielinizante, enfermedad inflamatoria del corazón, enfermedad inflamatoria del riñón, IPF/UIP, iritis, queratitis, queratoconjuntivitis seca, enfermedad de Kussmaul o enfermedad de Kussmaul-Meier, parálisis de Landry, histiocitosis de las células de Langerhans, Lívido reticularis, poliangitis microscópica con degeneración macular, morbus Bechterev; trastorno neuronal motor, penfigoide de la membrana mucosa, insuficiencia multiorgánica, síndrome mielodisplásico, miocarditis, trastornos de las raíces nerviosas, neuropatía, hepatitis no-A no-B, neuritis óptica, osteolisis, JRA pauciarticular, enfermedad oclusiva arterial periférica (PAOD por sus siglas en inglés), enfermedad vascular periférica (PVD por sus siglas en inglés), enfermedad arterial periférica (PAD por sus siglas en inglés), flebitis, poliarteritis nodosa (o periarteritis nodosa), policondritis, pollmialgia reumática, poliosis, JRA Pollarticular, síndrome de deficiencia pollendócrina, polimiositis, polimialgla reumática (PMR por sus siglas en Inglés), síndrome de post-bomba, parkinsonismo primario, cáncer de próstata y rectal y formas malignas hematopoyéticas (leucemia y linfoma), prostatitis, aplasia de glóbulos rojos pura, insuficiencia adrenal primaria, neuromielitis óptica recurrente, restenosis, enfermedad del corazón reumático, SAPHO (sinovitls, acné, pustulosis, hiperostosis y osteítis), amiloidosis secundaria, pulmón de shock, escleritis, ciática, insuficiencia adrenal secundarla, enfermedad del tejido conectivo asociada a siliconas, dermatosis de Sneddon-Wilkinson, espondilitis anquilosante, síndrome de Stevens-Johnson (SJS), arteritls temporal, retinitis toxoplásmica, necrólisis epidérmica tóxica, mielitis transversa, TRAPS (síndrome periódico asociado al receptor del factor de necrosis tumoral), reacción alérgica de Tipo 1, diabetes de Tipo II, urticaria, neumonía intersticial usual (UIP por sus siglas en inglés), vasculitis, conjuntivitis vernal, retinitis viral, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada (síndrome VKH), degeneración macular húmeda o cicatrización de heridas.

En una modalidad, las proteínas de unión, o las porciones de unión al antígeno de éstas, se usan para tratar un cáncer o en la prevención o inhibición de metástasis de los tumores que se describen en el presente documento, ya sea solos o en combinación con radioterapia y/o agentes quimioterapéuticos.

En otro aspecto, proporciona un método de tratamiento de un paciente que sufre de un trastorno que comprende la etapa de administrar cualquiera de las proteínas de unión descritas en el presente documento, de forma concurrente o después de la administración de un segundo agente. En una modalidad, el segundo agente adicional es budenosida, factor de crecimiento epidérmico, corticosteroides, ciclosporina, sulfasalazina, aminosalicilatos, 6-mercaptopurina, azatioprina, metronidazol, inhibidores de lipoxigenasa, mesalamina, olsalazina, balsalazida, antioxidantes, inhibidores de tromboxano, antagonistas del receptor de IL-1, anticuerpos monoclonales anti-IL-10, anticuerpos monoclonales anti-IL-6, factores de crecimiento, inhibidores de elastasa, compuestos de piridinil-imidazol, anticuerpos o agonistas de TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-18, IL-23, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF, anticuerpos de CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos, metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetil, leflunomida, NSAID, ibuprofeno, corticosteroides, prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, IRAK, NIK, IKK, p38, inhibidores de MAP quinasa, inhibidores de la enzima convertidora de I L- 1 ß , inhibidores de la enzima convertidora de TNFa, inhibidores de la señalización de células T, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, receptores solubles de citoquinas, receptor soluble de p55 TNF, receptor soluble de p75 TNF, sIL-1RI, sIL-IRII, slL-6R, citoquinas antiinflamatorias, IL-4, IL-10, IL-11, IL-11 o TGF3. En una modalidad particular, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento son administradas al paciente mediante al menos un modo seleccionado entre parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intraventricular, intracerebeloso, intracerebroventricular, intracolónico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocárdico, intraóseo, intrapélvico, intrapericárdíaco, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterino, intravesical, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal y transdérmico.

También se proporcionan anticuerpos anti-idiotipos contra las proteínas de unión descritas en el presente documento. Un anticuerpo anti-idiotipo incluye cualquier molécula que contiene una proteína o un péptido que comprende al menos una porción de una molécula de inmunoglobulina como, pero en un sentido no limitativo, al menos una región determinante de complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una porción de unión al ligando de la misma, una región variable de la cadena pesada o de la cadena ligera, una región constante de la cadena pesada o ligera, una región de marco de trabajo o cualquier porción de la misma, que se pueda incorporar en una proteína de unión provisto en el presente documento.

Se proporciona un método para determinar la presencia, la cantidad o la concentración de IL-13 y/o IL-17, o un fragmento del mismo, en una muestra de prueba. El método comprende evaluar en la muestra de prueba al antígeno, o un fragmento del mismo, con un inmunoensayo, en donde el inmunoensayo (i) usa al menos una proteína de unión y al menos una marca detectable y (ii) comprende comparar una señal generada por la marca detectable como una indicación directa o indirecta de la presencia, la cantidad o la concentración del antígeno, o un fragmento del mismo, en la muestra de prueba con una señal generada como una indicación directa o indirecta de la presencia, la cantidad o la concentración del antígeno, o un fragmento del mismo, en un control o un calibrador, El calibrador opcionalmente forma parte de una serie de calibradores en donde cada uno de los calibradores difiere de los demás calibradores en la serie por la concentración del antígeno o un fragmento del mismo. El método puede incluir (i) poner la muestra de prueba en contacto con al menos un agente de captura, que se une a un epitope sobre el antígeno, o un fragmento del mismo, como para formar un complejo de agente de captura/antígeno, o un fragmento del mismo (ii) poner el complejo de agente de captura/antígeno, o un fragmento del mismo, en contacto con al menos un agente de detección, que comprende una marca detectable y se une a un epitope sobre el antígeno, o un fragmento del mismo, que no es unido por el agente de captura, para formar un complejo de un agente de captura/antígeno, o un fragmento del mismo/agente de detección, y (iii) determinar la presencia, la cantidad o la concentración del antígeno, o un fragmento del mismo, en la muestra de prueba en base a la señal generada por la marca detectable en el complejo de un agente de captura/antígeno, o un fragmento del mismo/agente de detección formado en (ii), en donde al menos un agente de captura y/o al menos un agente de detección es al menos una proteína de unión.

Como alternativa, el método puede comprender (i) poner la muestra de prueba en contacto con al menos un agente de captura, que se une a un epitope sobre el antígeno, o un fragmento del mismo, como para formar un complejo de agente de captura/antígeno, o un fragmento del mismo, y simultáneamente o sucesivamente, en cualquier orden, poner la muestra de prueba en contacto con un antígeno marcado de manera detectable, o un fragmento del mismo, que puede competir con cualquier antígeno, o un fragmento del mismo, en la muestra de prueba para la unión de al menos un agente de captura, en donde cualquier antígeno o fragmento del mismo, presente en la muestra de prueba y el antígeno marcado de manera detectable compiten entre sí para formar un complejo de agente de captura/antígeno, o un fragmento del mismo, y un complejo de agente de captura/antígeno marcado de manera detectable, o un fragmento del mismo, respectivamente, y (ii) determinar la presencia, la cantidad o la concentración del antígeno, o un fragmento del mismo, en la muestra de prueba en base a la señal generada por la marca detectable en el complejo de agente de captura/antígeno marcado de manera detectable, o un fragmento del mismo, formado en (ii), en donde al menos un agente de captura es de al menos una proteína de unión, y en donde la señal generada por la marca detectable en el complejo de agente de captura/antígeno marcado de manera detectable, o un fragmento del mismo, es inversamente proporcional a la cantidad o concentración del antígeno, o un fragmento del mismo, en la muestra de prueba.

La muestra de prueba puede ser de un paciente, en cuyo caso el método puede comprender además diagnosticar, pronosticar o evaluar la eficacia del tratamiento terapéutico/profiláctico en el paciente. Si el método también comprende evaluar la eficiencia del tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente, el método opcionalmente también comprende modificar el tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente en la medida necesaria para mejorar su eficacia. El método puede adaptarse para su uso en un sistema automatizado o en un sistema semiautomatizado. Por consiguiente, los métodos que se describen en el presente documento también se pueden usar para determinar si un sujeto tiene o no, o está en riesgo o no de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección dada. Específicamente, tal método puede comprender las siguientes etapas: (a) determinar la concentración o cantidad de analito, o un fragmento del mismo, en una muestra de prueba de un sujeto (por ejemplo, usando los métodos que se describen en el presente documento, o métodos conocidos en la técnica); y (b) comparar la concentración o cantidad de analito, o un fragmento del mismo, que se determinó en la etapa (a) con un nivel predeterminado, en donde, si la concentración o cantidad de analito que se determinó en la etapa (a) es favorable con respecto a un nivel predeterminado, entonces se determina que el sujeto no tiene o no está en riesgo de tener una enfermedad, trastorno o condición dada. Sin embargo, si la concentración o cantidad de analito que se determinó en la etapa (a) no es favorable con respecto al nivel predeterminado, entonces se determina que el sujeto tiene o está en riesgo de tener una enfermedad, trastorno o condición dada.

Además, en el presente documento proporciona un método para monitorear el progreso de una enfermedad en un sujeto. En forma óptima, el método comprende las siguientes etapas: (a) determinar la concentración o cantidad de analito en una muestra de prueba de un sujeto; (b) determinar la concentración o cantidad de analito en una muestra de prueba posterior del sujeto; y (c) comparar la concentración o cantidad de analito que se determinó en la etapa (b) con la concentración o cantidad de analito que se determinó en la etapa (a), en donde si la concentración o cantidad que se determinó en la etapa (b) está inalterada o no es favorable en comparación con la concentración o cantidad de analito que se determinó en la etapa (a), entonces se determina que la enfermedad del sujeto ha continuado, progresado o empeorado. Por comparación, si la concentración o cantidad de analito que se determinó en la etapa (b) es favorable en comparación con la concentración o cantidad de analito que se determinó en la etapa (a), entonces se determina que la enfermedad del sujeto se ha interrumpido, ha retrocedido o ha mejorado.

Opcionalmente, el método comprende además comparar la concentración o cantidad de analito que se determinó en la etapa (b), por ejemplo, con un nivel predeterminado. Además, opcionalmente el método comprende tratar al sujeto con una o más composiciones farmacéuticas durante un período de tiempo si la comparación muestra que la concentración o la cantidad de analito que se determinó en la etapa (b), por ejemplo, está desfavorablemente alterada con relación al nivel predeterminado.

También proporciona un conjunto de elementos para evaluar en una muestra la presencia de IL-13 y/o IL-17o un fragmento del mismo. El conjunto de elementos comprende al menos un componente para evaluar un antígeno en la muestra de prueba o un fragmento del mismo e instrucciones para evaluar un antígeno en la muestra de prueba, en donde al menos un componente incluye al menos una composición que comprende la proteína de unión descrito en el presente documento, en donde la proteína de unión opcionalmente está marcada de manera detectable.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1 es una representación esquemática de las construcciones de proteínas de unión de dominio variable dual (DVD).

Descripción Detallada de la Invención Se proporcionan proteínas de unión multivalentes y/o multiespecíficas capaces de unirse a la I L 13 y/o a la IL-17. También se proporcionan proteínas de unión de dominio variable dual (proteínas de unión DVD) o inmunoglobulinas de dominio variable dual (DVD-lg™), y las composiciones farmacéuticas con las mismas, así como ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes y células huésped para elaborar tales proteínas de unión DVD. Se proporcionan asimismo métodos de uso de las proteínas de unión DVD para detectar antígenos específicos, ya sea in vi tro o in vivo.

A menos que se definan de otro modo en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados en el presente documento tienen los significados que comúnmente les dan los expertos en la técnica. En el caso en que haya una ambigüedad latente, las definiciones proporcionadas en el presente documento tienen prioridad sobre cualquier definición de diccionario o extrínseca. A menos que lo requiera de otro modo el contexto, los términos singulares incluirán las formas plurales y los términos plurales incluirán las formas singulares. El uso de "o" significa "y/o" a no ser que se diga lo contrario. El uso del término "incluir", así como otras formas, como "incluye" e "incluido", no es limitativo.

En general, las nomenclaturas usadas en conexión con el cultivo de células y tejidos, la biología molecular, la inmunología, la microbiología, la genética y la química y la hibridización de proteínas y ácidos nucleicos descritas en el presente documento, y los procedimientos correspondientes, son aquellos conocidos y de uso común en la técnica. Los métodos y los procedimientos de la presente generalmente se llevan a cabo de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y se describen en esta especificación, a menos que se indique lo contrario. Las reacciones enzimáticas y los procedimientos de purificación se llevan a cabo de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como comúnmente se lleva a cabo en la técnica o como se describe en el presente documento.

Las nomenclaturas usadas en conexión con los procedimientos de laboratorio y los procesos de química analítica, la química de síntesis orgánica y la química farmacéutica descritas en el presente documento, y los procedimientos correspondientes, son aquellos bien conocidos y de uso común en la técnica. Se usan técnicas convencionales para la síntesis química, los análisis químicos, las preparaciones farmacéuticas, la formulación, la administración y el tratamiento de los pacientes.

Para que la descripción se comprenda con mayor facilidad, a continuación se definen determinados términos selectos.

El término "anticuerpo", se refiere a cualquier molécula de inmunoglobulina (Ig), que está generalmente compuesta por cuatro cadenas de polipéptidos, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), o cualquier fragmento funcional, mutante, variante o derivado de éstas, que retienen las características de unión al epitope de una molécula Ig. Tales formatos de un fragmento, un mutante, una variante o un derivado de un anticuerpo son conocidos en la técnica. En una modalidad de un anticuerpo de longitud completa, cada cadena pesada está compuesta por una región variable de la cadena pesada (VH) y una región constante de la cadena pesada (CH). La CH está compuesta por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de la cadena ligera (VL) y una región constante de la cadena ligera (CL). La CL está compuesta por un solo dominio CL. Las VH y VL se pueden dividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDRs), interdispersas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones de marco de trabajo (FRs). En general, cada VH y VL está compuesta de tres CDR y cuatro FR, dispuestas, desde el extremo aminoterminal hacia el extremo carboxiterminal, en el siguiente orden: FR1, CDR 1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG 1, lgG2, IgG 3, lgG4, lgA1 e lgA2) o subclase.

El término "anticuerpo biespecífico" se refiere a un anticuerpo que se une a un antígeno (o a un epitope) en uno de sus brazos de unión (un par de HC/LC) y se una a un antígeno (o un epitope) diferente en su segundo brazo de unión (un par diferente de HC/LC). Un anticuerpo biespecífico tiene dos brazos de unión a antígenos diferentes (en tanto la especificidad y secuencia de la CDR) y es monovalente para cada antígeno al que se une. Los anticuerpos biespecíficos incluyen los que fueron generados mediante la tecnología del cuadroma (Milstein y Cuello (1983) Nature 305(5934): 537-40), por conjugación química de dos anticuerpos monoclonales diferentes (Staerz et al., (1985) Nature 314(6012): 628-31) o por botón en ojal o enfoques similares, que introduce mutaciones en la región Fe (Holliger et al., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90(14): 6444-6448).

Un anticuerpo "madurado por afinidad" es un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más de sus CDR, alteraciones que pueden resultar en una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con la afinidad del anticuerpo parental, que no posee alteraciones. Los ejemplos de anticuerpos madurados por afinidad tendrán afinidades por el antígeno objetivo en el orden nanomolar o aún picomolar. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen con procedimientos conocidos en la técnica. En Marks et al. BidITechnology 10:779-783 (1992) se describe la maduración por afinidad mediante el barajado de dominios VH y VL. La mutagénesis al azar de residuos de la CDR y/o el marco se describe en Barbas et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-3813; Schier et al. (1995) Gene 169:147-155; Perler ef al. (1995) J. Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al. (1995) J. Immunol. 154(7): 3310-9; Hawkins et al., (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896 y una mutación en posiciones de mutagénesis selectivas, posiciones de contacto o hipermutación con un residuo de aminoácido que mejora la actividad como se describe en la Patente Estadounidense No. 6,914,128.

El término "anticuerpo con injerto de CDR" se refiere a un anticuerpo que comprende secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera en donde las secuencias de una o más de las regiones CDR de VH y/o VL se reemplazan por secuencias CDR de otro anticuerpo. Por ejemplo, los dos anticuerpos pueden ser de especies diferentes, como anticuerpos que tienen regiones variables de la cadena pesada y ligera de murinos, en donde una o más de las CDRs de murinos fueron reemplazadas por secuencias CDR humanas.

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo de una especie no humana que fue alterado para que fuera más "tipo humano", es decir, más similar a las secuencias de línea germinal humanas. Un tipo de anticuerpo humanizado es un anticuerpo con una CDR injertada en donde las secuencias CDR no humanas han sido insertadas en secuencias VH y VL no humanas para reemplazar las secuencias CDR humanas correspondientes. Un "anticuerpo humanizado" también es un anticuerpo, o una variante, un derivado, un análogo o un fragmento del mismos, que comprende secuencias de la región del marco de trabajo (FR) que presenta sustancialmente (por ejemplo, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, ai menos un 98% o al menos un 99% de identidad con) la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano y al menos una CDR que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado puede comprender la totalidad de al menos uno, y típicamente dos dominios variables (Fab, Fab', F(ab') 2, FabC, Fv), en donde la totalidad o sustancialmente todas las regiones de CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana (es decir, el anticuerpo donante), y la totalidad o sustancialmente todas las regiones de marco son las de una inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. En una modalidad, un anticuerpo humanizado también comprende al menos una porción de una región Fe de una inmunoglobulina humana. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado solamente contiene una cadena ligera humanizada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado solamente contiene una cadena pesada humanizada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado solamente contiene un dominio variable humanizado de una cadena ligera y/o un dominio variable humanizado de una cadena pesada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado contiene una cadena ligera así como al menos el dominio variable de una cadena pesada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado contiene una cadena pesada así como al menos el dominio variable de una cadena ligera.

Los términos "proteína de unión de dominio variable dual" e "inmunoglobulina de dominio variable dual" se refieren a una proteína de unión que tiene dos dominios variables en cada uno de sus dos brazos de unión (por ejemplo, un par de HC/LC) (ver la Publicación PCT No.: WO 02/02773), cada uno de los cuales puede unirse a un antígeno. En una modalidad, cada dominio variable se une a diferentes antígenos o epitopes. En otra modalidad, cada dominio variable se une al mismo antígeno o epitope. En otra modalidad, una proteína de unión con dominio variable dual tiene dos brazos de unión al antígeno idéntico, con una especificidad idéntica y con secuencias CDR idénticas, y es bivalente para cada antígeno al que se une. En una modalidad, las proteínas de unión a DVD pueden ser monoespecíficas, es decir, capaces de unirse a un antígeno, o multiespecíficas, es decir, capaces de unirse a dos o más antígenos. Las proteínas de unión DVD que comprenden dos polipéptidos DVD de cadena pesada y dos polipéptidos DVD de cadena ligera se conocen como una DVD-lg™. En una modalidad, cada mitad de una proteína de unión DVD de cuatro cadenas comprende un polipéptido DVD de la cadena pesada, y un polipéptido DVD de la cadena ligera, y dos sitios de unión al antígeno. En una modalidad, cada sitio de unión comprende un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera, con la participación de un total de 6 CDR en la unión al antígeno por sitio de unión al antígeno.

El término "anticuerpo anti-idiotípico" se refiere a un anticuerpo generado contra la secuencia de aminoácidos del sitio de combinación con antígenos de otro anticuerpo. Los anticuerpos anti-idiotípicos pueden administrarse para mejorar una respuesta inmune contra un antígeno.

El término "actividad biológica" hace referencia a cualquier propiedad biológica de una molécula (ya sea que esté presente en la naturaleza, como puede hallársela in vivo, o que se proporciona o se produzca por medios recombinantes). Las propiedades biológicas incluyen, sin limitaciones, la unión a un receptor; la inducción de la proliferación celular, la inhibición del crecimiento celular, la inducción de otras citoquinas, la inducción de la apoptosis y la actividad enzimática.

El término "neutralizar" denota contrarrestar la actividad biológica de un antígeno mediante la unión específica de una proteína capaz de unirse al antígeno. En una modalidad, la proteína de unión neutralizadora se une a un antígeno (por ejemplo, una citoquina) y reduce su actividad biológica al menos aproximadamente 20, 40, 60, 80, 85%, o más.

La "especificidad" se refiere a la capacidad de una proteína de unión para unirse selectivamente a un antígeno.

La "afinidad" es la fuerza de la interacción entre una proteína de unión y un antígeno, y está determinada por la secuencia de las CDRs de la proteína de unión, así como por la naturaleza del antígeno, como su tamaño, forma y/o carga. Las proteínas de unión se pueden seleccionar por las afinidades que proporcionen los puntos finales terapéuticos deseados minimizando al mismo tiempo los efectos secundarios negativos. La afinidad se puede medir usando métodos conocidos por un experto en la técnica (US 20090311253).

El término "potencia" se refiere a la capacidad de una proteína de unión para lograr un efecto deseado, y es una medida de su eficacia terapéutica. La potencia se puede evaluar usando métodos conocidos por un experto en la técnica (US 20090311253).

El término "reactividad cruzada" se refiere a la capacidad de una proteína de unión de unirse a un objetivo distinto de aquel contra el que fue generado. En general, una proteína de unión se unirá a sus tejidos/antígenos objetivo con una afinidad apropiadamente alta, pero mostrará una afinidad apropiadamente baja por tejidos normales distintos de los tejidos objetivo. Las proteínas de unión individuales generalmente se seleccionan para cumplir con dos criterios. (1) Tinción de tejido apropiada para la expresión conocida del objetivo del anticuerpo. (2) Patrón de tinción similar entre tejidos humanos y de especies tox (ratón y mono cinomólogos) del mismo órgano. Estos y otros métodos de evaluación de la reactividad cruzada son conocidos por un experto en la técnica (US 20090311253).

El término "función biológica" se refiere a las acciones específicas In vitro o ¡n vivo de una proteína de unión. Las proteínas de unión se pueden dirigir a diversas clases de antígenos y lograr los resultados terapéuticos deseados mediante múltiples mecanismos de acción. Las proteínas de unión se pueden ser objetivos de proteínas solubles, antígenos de la superficie celular, así como a depósitos de proteínas extracelulares. Las proteínas de unión pueden agonizar, antagonizar o neutralizar la actividad de sus objetivos. Las proteínas de unión pueden asistir en la depuración de los objetivos a los cuales se unen, o pueden dar como resultado citotoxicidad cuando se unen a células. Se pueden incorporar porciones de dos o más anticuerpos en un formato multivalente para obtener funciones distintas en una sola molécula de proteína de unión. Los ensayos in vitro y los modelos in vivo usados para evaluar la función biológica son conocidos por un experto en la técnica (US 20090311253).

Una proteína de unión "estable" es aquella en la cual la proteína de unión esencialmente conserva su estabilidad física, estabilidad química y/o actividad biológica con el almacenamiento. Se desea una proteína de unión multivalente que sea estable in vitro a diferentes temperaturas por un período de tiempo prolongado. Los métodos para estabilizar proteínas de unión y evaluar su estabilidad a diversas temperaturas son conocidos por un experto en la técnica (US 20090311253).

El término "solubilidad" se refiere a la capacidad de una proteína para permanecer dispersa dentro de una solución acuosa. La solubilidad de una proteína en una formulación acuosa depende de la distribución apropiada de residuos de aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos, y por ello, se puede correlacionar la solubilidad con la producción de proteínas correctamente plegadas. Un experto en la técnica podrá detectar un incremento o una disminución en la solubilidad de una proteína de unión usando técnicas y métodos de HPLC de rutina conocidos por un experto en la técnica (US 20090311253).

Las proteínas de unión se pueden producir usando una variedad de células huésped o se pueden producir in vitro, y el rendimiento relativo por esfuerzo determina la "eficiencia de producción". Los factores que afectan la eficiencia de producción incluyen, pero en un sentido no taxativo, el tipo de célula huésped (procariota o eucariota), la elección del vector de expresión, la elección de la secuencia de nucleótidos y los métodos usados. Los materiales y métodos usados en la producción de proteínas de unión, así como la medición de la eficiencia de producción, son conocidos por un experto en la técnica (US 20090311253).

El término "inmunogenicidad" significa la capacidad de una sustancia para inducir una respuesta inmune. La administración de una proteína de unión terapéutica puede dar como resultado a incidencia determinada de una respuesta inmune. Los potenciales elementos que podrían inducir inmunogenicidad en un formato multivalente deben ser analizados durante la selección de los anticuerpos parentaies, y se deben realizar etapas para reducir tales riesgos para optimizar los anticuerpos parentaies antes de incorporar sus secuencias en un formato de proteína de unión multivalente. Los métodos para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos y proteínas de unión son conocidos por un experto en la técnica (US 20090311253).

Los términos "marca" y "marca detectable" se refieren a un grupo unido a un miembro de un par de unión específico, como un anticuerpo o su analito para que una reacción (por ejemplo, la unión) entre los miembros del par de unión específico sea detectable. El miembro marcado del par de unión específico se denomina "marcado de manera detectable". Por lo tanto, el término "proteína de unión marcada" hace referencia a una proteína con una marca incorporada que permite identificar la proteína de unión. En una modalidad, la marca es un marcador detectable que puede producir una señal que puede detectarse por medios visuales o instrumentales, por ejemplo, la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la incorporación una de unidades biotiniladas a un polipéptido, unidades que pueden detectarse con avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o una actividad enzimática que puede detectarse con métodos ópticos o colorimétricos). Los ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, sin limitaciones, los que se indicarán a continuación: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H 1 C 35S, 90Y, "Te, 11ln, 125l, 13 , 177Lu, 66Ho o 153Sm); cromógenos, marcas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, lantánido-fósforos), marcas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, luciferasa, fosfatasa alcalina); marcadores quimioluminiscentes; grupos de biotinilo; epitopes de polipéptidos predeterminados que son reconocidos por un informante secundario (por ejemplo, secuencias de cierre [zipper] de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, marcas de epitope); y agentes magnéticos, como quelatos de gadolinio. Los ejemplos representativos de las marcas que se usan habitualmente en los inmunoensayos incluyen las unidades que producen luz, por ejemplo, los compuestos de acridinio, y las unidades que producen fluorescencia, por ejemplo, la fluoresceína. Con relación a esto, la porción propiamente dicha puede no estar marcada para la detección, pero puede tornarse detectable al reaccionar con otra porción adicional.

El término "conjugado" hace referencia a una proteína de unión, como un anticuerpo, unida a una segunda porción química, como un agente terapéutico o citotóxico. El término "agente" incluye un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto obtenido a partir de materiales biológicos. En una modalidad, los agentes terapéuticos o citotóxicos incluyen, sin limitaciones, toxinas pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, y análogos u homólogos de éstos. Cuando se usa en el contexto de un inmunoensayo, el anticuerpo conjugado puede ser un anticuerpo marcado para la detección, usado como anticuerpo de detección.

Los términos "cristal" y "cristalizado" hacen referencia a una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo), o una porción de unión al antígeno de ésta, que existe en forma de un cristal. Los cristales son una forma de materia en estado sólido que es diferente de otras formas, como el estado sólido amorfo o el estado líquido cristalino. Los cristales están compuestos por disposiciones de átomos, iones o moléculas tridimensionales, repetitivas y regulares (por ejemplo, proteínas, como anticuerpos), o ensamblajes moleculares (por ejemplo, complejos de antígenos/anticuerpos). Estas disposiciones tridimensionales siguen relaciones matemáticas bien comprendidas en el campo. La unidad fundamental, o bloque de construcción, que se repite en un cristal, se denomina unidad asimétrica. La repetición de la unidad asimétrica en una disposición que satisface una simetría cristalográfica dada y bien definida proporciona la "célula individual" del cristal. La repetición de la célula individual por repeticiones regulares en las tres dimensiones proporciona el cristal. Ver Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, CRYSTALLIZATION OF NUCLEIC ACIDS AND PROTEINS, A PRACTICAL APPROACH, 2a edición, pages. 20 1-16, Oxford University Press, Nueva York, Nueva York, (1999).

El término "vector" hace referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que está unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que designa un rizo de ADN circular de cadena doble con el que pueden unirse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, que permite unir segmentos de ADN adicionales al genoma viral. Otros vectores incluyen vectores a ARN. Determinados vectores son capaces de replicarse en forma autónoma en la célula huésped en la que han sido introducidos (por ejemplo, los vectores bacterianos con un origen de replicación en bacterias y los vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamíferos) pueden integrarse en el genoma de una célula huésped al introducirse en ella, por lo que se replican junto con el genoma del huésped. Determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes con los que están unidos operativamente. Estos vectores se conocen en el presente documento como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión útiles para los procedimientos de ADN recombinante comúnmente toman la forma de plásmidos. En esta solicitud, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente, ya que el plásmido es la forma de vector de uso más común. Sin embargo, también se incluyen otras formas de vectores de expresión, como vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adeno-asociados), que tienen funciones equivalentes. Se usó un grupo de vectores pHybE (Solicitud de Patente Estadounidense No. Serie. 61/021,282) para el clonado del anticuerpo parental y de la proteína de unión DVD-lg. Se usó V1, derivado de pJP183; pHybE-hCgl ,z, no V2, para el clonado de las cadenas pesadas del anticuerpo y del DVD con una región constante salvaje. Se usó V2, derivado de pJP191; pHybE-hCk V3, para el clonado de las cadenas ligeras del anticuerpo y del DVD con una región kappa constante. Se usó V3, derivado de pJP192; pHybE-hCI V2, para el clonado de las cadenas ligeras del anticuerpo y del DVD con una región lambda constante. Se usó V4, construido con un péptido señal lambda y una región constante kappa, para el clonado de las cadenas ligeras del DVD con un dominio híbrido V lambda-kappa. Se usó V5, construido con un péptido señal kappa y una región constante lambda, para el clonado de las cadenas ligeras del DVD con un dominio híbrido V kappa-lambda. Se usó V7, derivado de pJP183; pHybE-hCgl ,z, no V2, para el clonado de las cadenas pesadas del anticuerpo y del DVD con una región constante mutante (234,235 AA).

Los términos "célula huésped recombinante" o "célula huésped" hacen referencia a la célula en la que se introduce ADN exógeno. Estos términos hacen referencia no solamente a la célula específica en cuestión, sino también a la progenie de tal célula. Como es posible que ocurran modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, de hecho, esta progenie puede no ser idéntica a la célula progenitora, pero aún se incluye dentro del término "célula huésped", como se usa en el presente documento. En una modalidad, las células huésped incluyen células procariotas y eucariotas. En una modalidad, las células eucariotas incluyen células protistas, fúngicas, vegetales y animales. En otra modalidad, las células huésped incluyen, sin limitaciones, la línea de células procariotas de E. coli; las líneas de células de mamífero CHO, HEK 293, COS, NSO, SP2 y PER.C6; la línea de células de insecto Sf9; y las células fúngicas de Saccharomyces cerevisiae.

El término "transfección" comprende una variedad de técnicas usadas comúnmente para la introducción de un ácido nucleico exógeno (por ejemplo, ADN) en una célula huésped, por ejemplo, electroporación, precipitación por fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextran y semejantes.

El término "citoquina" se refiere a una proteína liberada por una población de célula que actúa sobre otra población de células como un mediador intercelular. El término citoquina incluye proteínas de fuentes naturales o cultivos de células recombinantes, y equivalentes con actividad biológica de las secuencias de citoquinas nativas.

El término "muestra biológica" significa una cantidad de una sustancia un ser vivo o proveniente de un ser que estuvo vivo. Estas sustancias incluyen, pero en un sentido no taxativo, sangre (por ejemplo, sangre completa), plasma, suero, orina, fluido amniótico, fluido sinovial, células endoteliales, leucocitos, monocitos, otras células, órganos, tejidos, médula ósea, nodulos linfáticos y bazo.

El término "componente" se refiere a un elemento de una composición. Con relación a los conjuntos de elementos de diagnóstico, por ejemplo, un componente puede ser un anticuerpo de captura, un anticuerpo de detección o conjugado, un control, un calibrador, una serie de calibradores, un panel de sensibilidad, un recipiente, una solución amortiguadora, un diluyente, una sal, una enzima, un cofactor para una enzima, un reactivo de detección, un reactivo/solución de pretratamiento, un sustrato (por ejemplo, como una solución), una solución de detención y semejantes, que se puede incluir en un conjunto de elementos para evaluar una muestra de prueba. Por consiguiente, un "componente" puede incluir un polipéptido u otro analito descrito antes, que es inmovilizado sobre un soporte sólido, como por unión a un anticuerpo anti-analito (por ejemplo, anti-polipéptido). Algunos componentes pueden hallarse en solución o liofilizados, y han de ser reconstituidos para usarlos en el ensayo.

Un "control" hace referencia a una composición de la que se conoce que no contiene el analito ("control negativo") o que sí contiene el analito ("control positivo"). Un control positivo puede comprender una concentración conocida del analito. Los términos "control", "control positivo" y "calibrador" pueden usarse indistintamente en el presente documento para hacer referencia a una composición que comprende una concentración conocida del analito. Un "control positivo" puede usarse para establecer las características de desempeño del ensayo, y se trata de un indicador útil de la integridad de los reactivos (por ejemplo, los analitos).

Un "corte predeterminado" y un "nivel predeterminado" generalmente hacen referencia al valor de corte de un ensayo que se usa para evaluar la eficacia de diagnóstico/pronóstico/terapéutica, mediante la comparación de los resultados del ensayo con el corte/nivel predeterminado, en donde el corte/nivel predeterminado ya ha sido ligado o asociado a diversos parámetros clínicos (por ejemplo, la severidad de una enfermedad, el progreso/la falta de progreso/la mejora, etcétera). Si bien en esta descripción pueden proporcionarse ejemplos de niveles predeterminados, es bien conocido que los valores de corte pueden variar dependiendo de la naturaleza del inmunoensayo (por ejemplo, los anticuerpos usados etcétera). Además, aquellos expertos en la técnica han de poder adaptar la descripción provista en el presente documento a otros inmunoensayos, para obtener valores de corte específicos para otros inmunoensayos sobre la base de la descripción. Si bien el valor preciso de un corte/nivel predeterminado puede variar entre los ensayos, las correlaciones que se describen en el presente documento (si existen) deberían ser generalmente aplicables.

Un "reactivo de pretratamiento", por ejemplo, un reactivo de lisis, precipitación y/o solubilización, como se usa en un ensayo de diagnóstico como se describe en el presente documento, es uno que lisa las células y/o solubiliza un analito que está presente en una muestra de prueba. El pretratamiento no es necesario para todas las muestras, como se describe con mayor detalle en el presente documento. Entre otros acontecimientos, la solubilización del analito (por ejemplo, el polipéptido de interés) puede comprender la liberación del analito de cualquier proteína de unión endógena que pueda estar presente en la muestra. Un reactivo de pretratamiento puede ser homogéneo (que no requiere una etapa de separación) o heterogéneo (que requiere una etapa de separación). Con el uso de un reactivo de pretratamiento heterogéneo, es necesario eliminar las proteínas de unión al analito que hayan precipitado de la muestra de prueba antes de proceder con la siguiente etapa del ensayo.

Los "reactivos de control de calidad", en el contexto de los inmunoensayos y los conjuntos de elementos que se describen en el presente documento, incluyen, sin limitaciones, calibradores, controles y paneles de sensibilidad. Un "calibrador" o "referencia" típicamente se usa (por ejemplo, uno o más, como una pluralidad) para establecer curvas de calibración (estándar) para interpolar la concentración de un analito, como un anticuerpo o un analito. Como alternativa, puede usarse un solo calibrador que sea cercano a un corte positivo/negativo predeterminado. Pueden usarse varios calibradores combinados (es decir, más de un calibrador, o una cantidad variable de calibradores) para conformar un "panel de sensibilidad".

El término "miembro de unión específico" es un miembro de un par de unión específico. Un par de unión específico comprende dos moléculas diferentes, cada una de las cuales se une específicamente a través de medios químicos o físicos. Entonces, además de los antígenos y los anticuerpos de los pares de unión específicos, otros pares de unión específicos pueden incluir biotina y avidina (o estreptavidina), hidratos de carbono y lectinas, secuencias de nucleótidos complementarias, moléculas efectoras y receptoras, cofactores y enzimas, inhibidores de enzimas y enzimas, y semejantes. Además, los pares de unión específicos pueden incluir miembros que son análogos de los miembros de unión específicos originales, por ejemplo, un análogo de un analito. Los miembros de unión inmunorreactivos específicos incluyen antígenos, fragmentos de antígenos y anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales y policlonales, así como complejos, fragmentos y variantes (incluyendo fragmentos de variantes) de éstos, ya sea aislados o producidos por medios recombinantes.

El término "región Fe" define la región C-terminal de la cadena pesada de una inmunoglobulina, que puede generarse mediante la digestión con papaína de un anticuerpo intacto. La región Fe puede ser la secuencia de una región Fe nativa o de una variante de una región Fe. La región Fe de una inmunoglobulina generalmente comprende dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3, y opcionalmente comprende un dominio CH4. Los reemplazos de residuos de aminoácidos en la porción Fe para alterar la función efectora del anticuerpo son conocidos en la técnica (por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 5,648,260 y 5,624,821). La región Fe interviene en diferentes funciones efectoras importantes, por ejemplo, inducción de citoquinas, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC por sus siglas en inglés), fagocitosis, citotoxicidad mediada por complemento (CDC por sus siglas en inglés) y velocidad de depuración/vida media de los anticuerpos y en los complejos antígeno-anticuerpo. En algunos casos, estas funciones efectoras son deseables para inmunoglobulinas terapéuticos, pero en otros casos, puede ser innecesario o incluso perjudicial, dependiendo de los objetivos terapéuticos.

El término "porción de unión al antígeno" de una proteína de unión significa uno o más fragmentos de una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo) que retienen la capacidad para unirse específicamente a un antígeno. La porción de unión al antígeno de una proteína de unión puede consistir de fragmentos de un anticuerpo de longitud completa, así como formatos biespecíficos, específicos duales o multiespecíficos; específicamente la unión a dos o más antígenos diferentes. Los ejemplos de fragmentos de unión comprendidos por el término "porción de unión al antígeno" de una proteína de unión incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos entre sí en la región bisagra a través de un enlace disulfuro; (iii) un fragmento Fd, que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv, que consiste en los dominios FL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento dAb, que comprende un solo dominio variable; y (vi) una región de determinación de la complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, a conocer, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden conectarse uno con otro usando un conector sintético que les permita prepararlos como una sola cadena de proteína, en donde las regiones VL y VH se apareen para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena simple (scFv). Tales anticuerpos de cadena simple también se consideran dentro del término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo. También se incluyen otras formas de anticuerpos, como los diacuerpos. Además, los anticuerpos de cadena simple también incluyen los "anticuerpos lineales", que comprenden un par de segmentos Fv en tándem (VH-CH1-VH-CH1), que junto con los polipéptidos complementarios de la cadena ligera, forman un par de regiones de unión al antígeno.

El término "proteína de unión multivalente" hace referencia a una proteína de unión que comprende dos o más sitios de unión al antígeno. En una modalidad, la proteína de unión multivalente se diseña para que tenga tres o más sitios de unión al antígeno, y no es un anticuerpo de origen natural. El término "proteína de unión multiespecífica" hace referencia a una proteína de unión con la capacidad de unir dos o más objetivos relacionados o no relacionados. En una modalidad, las proteínas de unión con dominio variable dual (DVD) de la presente comprenden dos o más sitios de unión al antígeno, y son proteínas tetravalentes o multivalentes.

El término "conector" se refiere a un residuo de aminoácido o a un polipéptido que comprende dos o más residuos de aminoácidos unidos por medio de enlaces peptídicos que se usan para unir dos polipéptidos entre sí (por ejemplo, dos dominios VH o dos dominios VL). Estos conectores peptídicos son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Holliger, et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, et al. (1994) Structure 2: 1121-1123).

Los términos "numeración de Kabat", "definiciones de Kabat" y "nomenclatura de Kabat" se usan indistintamente en el presente documento. Estos términos, que son reconocidos en la técnica, hacen referencia a un sistema para numerar los residuos de aminoácidos que son más variables (es decir, hipervariables) que otros residuos de aminoácidos en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo o en una porción de unión al antígeno de éste (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190: 382-391 y Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Publicación del NIH No. 91-3242). Para la región variable de la cadena pesada, la región hipervariable se extiende entre las posiciones de los aminoácidos 31 a 35 para CDR1, entre las posiciones de los aminoácidos 50 a 65 para CDR2 y entre las posiciones de los aminoácidos 95 a 102 para CDR3. Para la región variable de la cadena ligera, la región hipervariable se extiende entre las posiciones de los aminoácidos 24 a 34 para CDR1, entre las posiciones de los aminoácidos 50 a 56 para CDR2 y entre las posiciones de los aminoácidos 89 a 97 para CDR3.

El término "CDR" se refiere a una región determinante de complementariedad dentro de una secuencia de ia región variable de una inmunoglobulina. Para cada una de las regiones variables, hay tres CDR en cada una de las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera, que se denominan CDR1, CDR2 y CDR3. El término "conjunto de CDR" hace referencia a un grupo de tres CDR que aparecen en una sola región variable y permiten ia unión al antígeno. Los límites exactos de estas CDR han sido definidos en distintos términos de acuerdo con distintos sistemas. El sistema descrito por Kabat (Kabat et al., (1987) y (1991)) no solamente proporciona un sistema de numeración no ambiguo de los residuos que puede aplicarse a cualquier región variable de un anticuerpo, sino que también proporciona límites precisos para los residuos que definen las tres CDR. Estas CDR pueden denominarse CDR Kabat. Chothia y colaboradores (Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al. Nature 342: 877-883 (1989)) descubrieron que determinadas sub-porciones dentro de las CDR de Kabat adoptan conformaciones casi idénticas en sus esqueletos peptídicos, a pesar de que hay una gran diversidad a nivel de las secuencias de aminoácidos. Estas sub-porciones se denominaron L 1 , L2 y L3 o H1, H2 y H3, en donde "L" y "H" hacen referencia a las regiones de la cadena ligera y la cadena pesada, respectivamente. Estas regiones pueden denominarse CDR Chotia, y tienen límites que se superponen con las CDR Kabat. Otros límites que definen CDR que se superponen con las CDR de Kabat fueron descritos por Padlan {FASEB J. 9:133-139 (1995)) y MacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996)). Aún otras definiciones de límites de CDR pueden no seguir estrictamente uno de los sistemas de la presente, pero aun así se superponen con las CDR Kabat, aunque pueden estar acortadas o alargadas a la luz de las predicciones o los descubrimientos experimentales de residuos o grupos de residuos particular, o aún CDR completas, que no afectan significativamente la unión al antígeno. En los métodos usados en el presente documento pueden usarse CDR definidas de acuerdo con cualquiera de estos sistemas, aunque en algunas modalidades se usan CDRs definidas de acuerdo con Kabat o Chotia.

El término "epitope" se refiere a una región de un antígeno que está unida por medio de una proteína de unión, por ejemplo, un polipéptido y/u otro determinante capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor sobre una célula T. En determinadas modalidades, los epitopes determinantes incluyen agrupaciones superficiales de moléculas con actividad química, como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, fosforilos o sulfonilos, y en determinadas modalidades, pueden tener características específicas en su estructura tridimensional y/o características de carga específicas. En una modalidad, un epitope comprende entonces los residuos de aminoácido de una región de un antígeno o fragmento del mismo conocido por unirse al sitio complementario sobre el miembro de unión específico. Un fragmento antigénico puede contener más de un epitope. En determinadas modalidades, una proteína de unión une específicamente un antígeno cuando reconoce su antígeno objetivo en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. Las proteínas de unión se "unen al mismo epitope" si los anticuerpos compiten (uno evita la unión o modula el efecto del otro). Además, las definiciones estructurales de los epitopes (superpuestos, similares, idénticos) son informativas, y las definiciones funcionales incluyen parámetros estructurales (de unión) y funcionales (modulación, competición). Regiones diferentes de proteínas pueden cumplir diferentes funciones. Por ejemplo regiones específicas de una citoquina interaccionan con su receptor de citoquina para dar lugar a la activación del receptor mientras que otras regiones de la proteína pueden ser requeridas para la estabilización de la citoquina. Para anular los efectos negativos del señalamiento de citoquinas, la citoquina puede ser el objetivo de una proteína de unión que se une específicamente a las regiones que interactúan con el receptor, impidiendo de esa manera la unión de su receptor. Como alternativa, la proteína de unión puede estar dirigida a las regiones responsables de la estabilización de citoquinas, designando de esa manera a la proteína para su degradación. Los métodos para visualizar y modelar el reconocimiento de epitopes son conocidos por un experto en la técnica (US 20090311253).

La "farmacocinética" se refiere al proceso por el cual un fármaco es absorbido, distribuido, metabolizado y excretado por un organismo. Para generar una molécula de una proteína de unión multivalente con un perfil farmacocinético deseado, se seleccionan anticuerpos monoclonales párenteles con perfiles farmacocinéticos similarmente deseados. Los perfiles PK de los anticuerpos monoclonales párenteles se pueden determinar fácilmente en roedores usando métodos conocidos por un experto en la técnica (US 2009031 253).

La "biodisponibilidad" se refiere a la cantidad de fármaco activo que alcanza su objetivo después de la administración. La biodisponibilidad es una función de varias de las propiedades descritas previamente, incluyendo estabilidad, solubilidad, inmunogenicidad y farmacocinética, y se puede evaluar usando métodos conocidos por un experto en la técnica (US 20090311253).

El término "resonancia de plasmón superficial" denota un fenómeno óptico que permite analizar las interacciones bioespecíficas a tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteínas en una matriz biosensora, por ejemplo, usando el sistema BIAcore® (Biacore International AB, a GE Healthcare Company, Uppsala, Suecia y Piscataway, NJ). Por descripciones adicionales, ver Jónsson, et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26. El término "Kon" se refiere a la constante de asociación para la asociación de una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo o proteína DVD-lg) al antígeno para formar, por ejemplo, el complejo de DVD-lg/antígeno. El término "Kon" también significa "constante de velocidad de asociación", o "ka", como se usan indistintamente en el presente documento. Este valor indica la velocidad de unión de una proteína de unión con su antígeno objetivo, o la velocidad de formación de un complejo entre una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo) y el antígeno, como puede obtenerse de acuerdo con la siguiente ecuación: Anticuerpo ("Ab") + Antígeno ("Ag")?Ab-Ag El término "K0ff" hace referencia a la constante de disociación para la disociación, o la "constante de la velocidad de disociación", de una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo o proteína DVD-lg), por ejemplo, del complejo de proteína DVD-lg/antígeno, como es conocido en la técnica. Este valor representa la constante de disociación de una proteína de unión de su antígeno objetivo, o la separación del complejo Ab-Ag en el transcurso del tiempo, lo que resulta «en el anticuerpo y el antígeno libres, como se ilustra en la siguiente ecuación: Ab + Ag<— Ab-Ag.

Los términos "Kd" y "constante de disociación en el equilibro", hacen referencia al valor obtenido en una medición de titulación en el equilibrio, o a la división de la constante de la velocidad de disociación (Koff) por la constante de la velocidad de asociación (Kon). La constante de velocidad de asociación, la constante de velocidad de disociación y la constante de disociación en equilibrio se usan para representar la afinidad de unión de una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo o proteína DVD-lg) por un antígeno. Los métodos para determinar las constantes de activación y desactivación son bien conocidos en la técnica. El uso de técnicas basadas en fluorescencia ofrece una sensibilidad elevada y la capacidad de examinar muestras en amortiguadores fisiológicos en equilibrio. Pueden usarse otros enfoques e instrumentos experimentales, como el ensayo BIAcore® (análisis de interacción biomolecular), por ejemplo, los instrumentos disponibles en BIAcore International AB, una compañía de GE Healthcare, Uppsala, Suecia. Adicionalmente, también puede usarse un ensayo KinExA® (ensayo de exclusión cinética), disponible en Sapidyne Instruments (Boise, Idaho).

El término "variante" significa un polipéptido que difiere de un polipéptido dado en cuanto a la secuencia de aminoácidos por la adición (por ejemplo, inserción), supresión o sustitución conservadora de aminoácidos, pero que retiene la actividad biológica del polipéptido dado (por ejemplo, una variante de anticuerpo IL-17 puede competir con un anticuerpo anti-IL-17 por la unión al IL-17). En la técnica, se reconoce que una sustitución conservativa de un aminoácido, es decir, el reemplazo de un aminoácido por un aminoácido diferente con propiedades similares (por ejemplo, hidrofilicidad y el grado y distribución de las regiones cargadas) típicamente comprende un cambio menor. Estos cambios menores pueden identificarse, en parte, considerando el índice hidropático de los aminoácidos, como es conocido en la técnica (ver, por ejemplo, Kyte et al. (J. Mol. Biol., 157: 105-132). El índice hidropático de un aminoácido se basa en la consideración de su hidrofobicidad y su carga. En la técnica, se conoce que se pueden sustituir de aminoácidos con índices hidropáticos similares en una proteína y que la proteína aún retiene su función. En un aspecto, se realizan sustituciones por aminoácidos que tienen índices hidropáticos de ± 2. La hidrofilicidad de los aminoácidos también puede usarse para determinar las sustituciones que han de resultar en proteínas que retendrán la función biológica. En el contexto de un péptido, la consideración de la hidrofilicidad de los aminoácidos permite calcular la máxima hidrofilicidad local promedio de que el péptido, una medida útil de la que se ha informado que está bien correlacionada con la antigenicidad y la inmunogenicidad (ver, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 4,554,101). La sustitución por aminoácidos con valores de hidrofilicidad similares puede resultar en péptidos que retengan la actividad biológica, por ejemplo, la inmunogenicidad, como es conocido en la técnica. En un aspecto, las sustituciones se llevan a cabo con aminoácidos que tienen valores de hidrofilicidad de ± 2 el uno del otro. Tanto el índice de hidrofobicidad como el valor de hidrofilicidad de los aminoácidos están influidos por la cadena lateral particular de dicho aminoácido. De manera consistente con esta observación, ha de comprenderse que las sustituciones de aminoácidos que sean compatibles con la función biológica dependerán de la similitud relativa de los aminoácidos, y particularmente las cadenas laterales de dichos aminoácidos, determinada a partir de la hidrofobicidad, la hidrofilicidad, la carga, el tamaño y otras propiedades. El término "variante" también incluye un polipéptido o un fragmento del mismo que ha sido procesado diferencialmente, como por proteólisis, fosforilación, u otra modificación de post-traducción, pero que aún retiene su actividad biológica o su reactividad con el antígeno, por ejemplo, la capacidad para unirse a la IL-17. El término "variante" comprende los fragmentos de una variante a menos que se defina de otra manera. Una variante puede ser 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76 o 75% idéntica a la secuencia de tipo salvaje.

Generación de Proteínas de Unión Se proporcionan proteínas de unión capaces de unirse a la IL-13 y/o a la IL-17 y métodos para elaborar las mismas. La proteína de unión se puede generar usando diversas técnicas. Se proporcionan vectores de expresión, células huésped y métodos para generar proteínas de unión y son bien conocidos en la técnica.

Generación de los Anticuerpos Monoclonales Parentales Los dominios variables de la proteína de unión con DVD pueden obtenerse a partir de anticuerpos parentales, incluyendo anticuerpos policlonales y monoclonales capaces de unirse a antígenos de interés. Estos anticuerpos pueden ser de ocurrencia natural o pueden generarse con tecnología de recombinación. El experto en la técnica está familiarizado con muchos métodos para producir anticuerpos, incluyendo, pero en un sentido no taxativo, el uso de técnicas de hibridoma, el método de anticuerpo de linfocito seleccionado (SLAM por sus siglas en inglés), el uso de un fago, una levadura o expresión de una fusión de ARN-proteína u otra biblioteca, inmunización de un animal no humano que comprende al menos algunos de los locus de inmunoglobulinas humanas y preparación de anticuerpos quiméricos, con injerto de CDR y humanizados. Ver, por ejemplo, la publicación de Patente Estadounidense No. 20090311253 A1. Los dominios variables también se pueden preparar usando técnicas de maduración por afinidad.

Criterio para la Selección de Anticuerpos Monoclonales Parentales Se proporciona una modalidad que comprende seleccionar anticuerpos parentales con al menos una o más propiedades deseadas en la molécula de proteína de unión DVD. En una modalidad, la propiedad deseada es uno o más de los parámetros del anticuerpo, como, por ejemplo, especificidad por el antígeno, afinidad por el antígeno, potencia, función biológica, reconocimiento de epitope, estabilidad, solubilidad, eficacia de producción, inmunogenicidad, farmacocinética, biodisponibilidad, reactividad cruzada de tejido, o unión al antígeno ortólogo. Ver, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 20090311253, Construcción de Moléculas de Proteínas de Unión La proteína de unión se puede diseñar de manera tal que dos dominios variables de la cadena ligera (VL) diferentes de los dos anticuerpos monoclonales parentales diferentes se unen en tándem, directamente o por medio de un conector usando técnicas de ADN recombinante, seguido por un dominio constante de la cadena ligera CL. De manera similar, la cadena pesada comprende dos dominios variables de la cadena pesada (VH) diferentes asociados en tándem, directamente o por medio de un conector, seguidos por el domino constante CH1 y la región Fe (Figura 1).

Los dominios variables pueden obtenerse usando técnicas de ADN recombinante a partir de un anticuerpo progenitor que se genera por alguno de los métodos que se describen en el presente documento. En una modalidad, el domino variable es un domino variable murino de la cadena pesada o ligera. En otra modalidad, el domino variable es un dominio variable de cadena pesada o ligera con CDR injertada o humanizado. En una modalidad, el domino variable es un domino variable humano de la cadena pesada o ligera.

La secuencia conectora puede ser un solo aminoácido o una secuencia polipeptídica. En una modalidad, la elección de las secuencias conectoras se basa en el análisis de la estructura cristalina de varias moléculas Fab. Existe un acoplamiento flexible natural entre el domino variable y el dominio constante CH1/CL en Fab o en la estructura molecular del anticuerpo. Este acoplamiento natural comprende aproximadamente entre 10 y 12 residuos de aminoácidos, contribuidos por entre 4 y 6 residuos del extremo C terminal del dominio V y entre 4 y 6 residuos del extremo N terminal del domino CL/CH1. Las proteínas de unión DVD-lg se generaron usando entre 5 y 6 residuos de aminoácidos N terminales, o entre 11 y 12 residuos de aminoácidos, de CL o CH1, como conector en la cadena ligera y cadena pesada, respectivamente. Los residuos N terminales de los dominios CL o CH1, en particular los primeros 5 a 6 residuos de aminoácidos, pueden adoptar una conformación en bucle sin estructuras secundarias fuertes, y por lo tanto pueden actuar como conectores flexibles entre los dos dominios variables. Los residuos N terminales de los dominios CL o CH1 son una extensión natural de los dominios variables, ya que son parte de las secuencias de Ig, y por lo tanto minimizan en gran medida cualquier inmunogenicidad potencial que pueda surgir de los conectores y los empalmes.

En una modalidad adicional, cualquiera de las modalidades de una cadena pesada, una cadena ligera, dos cadenas o cuatro cadenas, incluye al menos un conector que comprende: AKTTPKLEEGEFSEAR (SEC ID No.: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEC ID No.: 2); AKTTPKLGG (SEC ID No.: 3); SAKTTPKLGG (SEC ID No.: 4); SAKTTP (SEC ID No.: 5); RADAAP (SEC ID No.: 6); RADAAPTVS (SEC ID No.: 7); RADAAAAGGPGS (SEC ID No.: 8); RADAAAA(G4S)4 (SEC ID No.: 9); SAKTTP KLEEGEFSEARV (SEC ID No.: 10); ADAAP (SEC ID No.: 11); ADAAPTVSIFPP (SEC ID No.: 12); TVAAP (SEC ID No.: 13); TVAAPSVFIFPP (SEC ID No.: 14); QPKAAP (SEC ID No.: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEC ID No.: 16); AKTTPP (SEC ID No.: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEC ID No.: 18); AKTTAP (SEC ID No.: 19), AKTTAPSVYPLAP (SEC ID No.: 20); ASTKGP (SEC ID No.: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEC ID No.: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID No.: 23); GENKVEYAPALMALS (SEC ID No.: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEC ID No.: 25); o GHEAAAVMQVQYPAS (SEC ID No.: 26); TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP (SEC ID No.: 27); ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP (SEC ID No.: 28); o secuencias basadas en G/S (por ejemplo, repeticiones G4S; SEC ID No.: 29). En una modalidad, X2 es una región Fe. En otra modalidad, X2 es una región Fe variante.

Otras secuencias conectoras pueden incluir cualquier secuencia de cualquier longitud del dominio CL/CH1 pero no todos los residuos del dominio CL/CH1, por ejemplo, los primeros 5 - 12 residuos de aminoácidos un dominio CL/CH1; los conectores de la cadena ligera pueden ser de CK o ??; y los conectores de la cadena pesada pueden derivar del CH1 de cualquier isotipos, incluyendo Cy1, Cy2, Cy3, Cy4, Cal, Ca2, C5, Ce y ?µ. Las secuencias conectoras también pueden derivar de otras proteínas, como proteínas similares a Ig (por ejemplo, TCR, FcR, IR), pueden ser secuencias basadas en G/S, (por ejemplo, repeticiones G4S; SEC ID No.: 29); secuencias derivadas de la región de la bisagra y otras secuencias de otras proteínas naturales.

En una modalidad se asocia un dominio constante a los dos dominios variables asociados usando técnicas de ADN recombinante. En una modalidad, la secuencia que comprende dominios variables de la cadena pesada asociados de la cadena pesada se asocia a un dominio constante de la cadena pesada y la secuencia que comprende dominios variables de cadena ligera asociados se asocia a un dominio constante de cadena ligera. En una modalidad, los dominios constantes son dominio constante de la cadena pesada humana y dominio constante de cadena ligera humana, respectivamente. En una modalidad, la cadena pesada DVD se asocia además a una región Fe. La región Fe puede ser la secuencia de una región Fe nativa o de una variante de una región Fe. En otra modalidad, la región Fe es una región Fe humana. En otra modalidad la región Fe incluye una región Fe de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE, o IgD.

En otra modalidad se combinan dos polipéptidos DVD de la cadena pesada y dos polipéptidos DVD de la cadena ligera para formar una proteína DVD-lg. En las Tablas 1A - 1C se enumeran secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de ejemplos de anticuerpos que son de utilidad para el tratamiento de una enfermedad. En una modalidad, proporciona una proteína DVD-lg que comprende al menos dos de las regiones VH y/o VL que se listan en las Tablas 1A - 1C, en cualquier orientación. En algunas modalidades, VD1 y VD2 se seleccionan de manera independiente entre sí. Por ello, en algunas modalidades, VD1 y VD2 comprenden la misma SEC ID No.: y, en otras modalidades, VD1 y VD2 comprenden SEC ID Nos.: diferentes. Las secuencias de los dominios VH y VL provistas a continuación comprenden secuencias de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) y de marco de trabajo que son conocidas en la técnica o que se pueden obtener usando métodos conocidos en la técnica. En algunas modalidades, se reemplaza una o más de estas secuencias de CDRs y/o de marco de trabajo, sin pérdida de función, por otras secuencias de CDRs y/o de marco de trabajo de las proteínas de unión conocidas en la técnica por unirse al mismo antígeno.

Tabla 1A: Listado de Secuencias de Aminoácidos de las Regiones VH y VL de los Anticuerpos para Generar Proteínas de Unión, Incluyendo Proteínas de Unión Multivalentes (las Secuencias CDR están Resaltadas con Negritas) Tabla 1B. Secuencias Individuales de VH IL-17 de Clones Madurados por Afinidad para Generar las Proteínas de Unión, Incluyendo Proteínas de Unión Multivalentes Tabla 1C. Secuencias Individuales de VL IL-17 de Clones Madurados por Afinidad para Generar las Proteínas de Unión, Incluyendo Proteínas de Unión Multivalentes La descripción detallada de las proteínas de unión DVD-lg específicas capaces de unirse a objetivos de unión específicos, y los métodos para prepararlas, proporcionará en la sección de Ejemplos más adelante.

Producción de Proteínas de Unión Las proteínas de unión de la presente pueden producirse con cualquiera de una cantidad de procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la expresión puede efectuarse a partir de células huésped en las cuales se han transfectado uno o más vectores de expresión que codifican las cadenas DVD pesada y ligera de acuerdo con procedimientos convencionales. Aunque es posible expresar las proteínas de unión DVD de la presente en células huésped procariotas o eucariotas, las proteínas de unión DVD se expresan en células eucariotas, por ejemplo, en células huésped de mamíferos, ya que la probabilidad de que se ensamble y se secrete una proteína de unión DVD plegada correctamente y con actividad inmunológica es mayor en las células eucariotas (y en particular, en células de mamíferos) que en las células eucariotas.

En un sistema ejemplar para la expresión recombinante de las proteínas con DVD, se introduce un vector de expresión recombinante que codifica la cadena pesada con DVD y la cadena ligera con DVD en células CHO dhfr- por medio de una transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de las cadenas pesada y ligera de DVD están unidos operativamente en cada caso a elementos reguladores, que consisten en el potenciador de CMV y el promotor AdMLP, con el fin de obtener niveles de transcripción elevados de los genes. El vector de expresión recombinante también contiene un gen DHFR, que permite seleccionar las células CHO dhfrD transfectadas con el vector usando una selección/amplificación con metotrexato. Las células huésped transformadas seleccionadas se cultivan de modo que se expresen las cadenas pesada y ligera de DVD, y la proteína DVD intacta se aisla del medio de cultivo. Se usan técnicas convencionales de biología molecular para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células huésped, seleccionar las transformantes, cultivar las células huésped y obtener la proteína DVD del medio de cultivo. En la presente también proporciona un método de síntesis de una proteína DVD que comprende cultivar una célula huésped provista en el presente documento en un medio de cultivo adecuado hasta sintetizar una proteína DVD. Además, el método puede comprender aislar la proteína DVD del medio de cultivo.

Una característica importante de la proteína de unión DVD es que puede ser producida y purificada de una manera similar que un anticuerpo convencional. La producción de la proteína de unión DVD resulta en un solo producto de importancia homogéneo con la actividad con especificidad dual deseada, sin modificaciones de secuencia en la región constante o modificaciones químicas de ningún tipo. Otros métodos descritos con anterioridad para generar proteínas de unión completas "biespecíficas", "multiespecíficas" y "multiespecíficas multivalentes" pueden resultar en la producción intracelular o por secreción de una mezcla de proteínas de unión monoespecíficas, multiespecíficas o multivalentes completas, y proteínas de unión multivalentes completas con combinaciones de distintos sitios de unión.

Sorprendentemente, el diseño de las "proteínas de unión multivalentes completas con especificidad dual" de la presente resulta en una cadena ligera con dominio variable dual y una cadena pesada con dominio variable dual que se ensamblan primariamente para obtener las "proteínas de unión completas multi alentes con especificidad dual" deseadas.

Al menos 50%, al menos 75% y al menos 90% de las moléculas de ¡nmunoglobuünas con dominio variable dual ensambladas y expresadas es la proteína tetravalente con especificidad dual deseada y por lo tanto poseen mayor utilidad comercial. Entonces, en el presente documento proporciona un método para expresar una cadena ligera con dominio variable dual y una cadena pesada con dominio variable dual en una sola célula, lo que resulta en un producto primario de una "proteína de unión tetravalente completa con especificidad dual".

En la presente proporciona un método para expresar una cadena ligera con dominio variable dual y una cadena pesada con dominio variable dual en una sola célula, lo que resulta en un "producto primario" de una "proteína de unión tetravalente completa con especificidad dual", en donde el "producto primario" es más de 50%, como más de 75% y más de 90%, de la totalidad de la proteína ensamblada, que comprende una cadena ligera con dominio variable dual y una cadena pesada con dominio variable dual.

Usos de las Proteínas de Unión Debido a su capacidad de unirse a dos o más antígenos, las proteínas de unión de la presente pueden usase para detectar los antígenos (por ejemplo, en una muestra biológica, como suero o plasma) usando un inmunoensayo convencional, como un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o una coloración inmunohistoquímica del tejido. La proteína de unión se marca directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables apropiadas se incluyen distintas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos. Los ejemplos apropiados de enzimas, se incluye la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la ß-galactosidasa o la acetilcolinesterasa; entre los ejemplos de grupos prostéticos complejos apropiados, se incluye la estreptavidina/biotina y la avidina/biotina; entre los ejemplos de materiales fluorescentes apropiados, se incluye la umbeliferona, la fluoresceína, el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, la diclorotriazinilamino fluoresceína, el cloruro de dansilo o la ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y entre los ejemplos de materiales radioactivos apropiados, se incluyen 3H, 14C, 35S, 90Y, "Te, 111ln, 125l, 31l, 177Lu, 166Ho, y 153Sm.

En una modalidad, las proteínas de unión de la presente son capaces de neutralizar la actividad de los objetivos de sus antígenos in vitro e in vivo. Por consiguiente, estas proteínas de unión pueden usarse para inhibir la actividad del antígeno, por ejemplo, en un cultivo de células que contiene los antígenos, en sujetos humanos u otros sujetos mamíferos que presenten antígenos con los que reaccione una proteína de unión de la presente. En otra modalidad, proporciona un método para reducir la actividad del antígeno en un sujeto que sufre una enfermedad o un trastorno en donde la actividad del antígeno es perjudicial. Una proteína de unión de la presente puede serle administrada a un sujeto humano con fines terapéuticos.

El término "un trastorno en donde la actividad del antígeno es perjudicial" incluye enfermedades y otros trastornos en donde se ha demostrado que la presencia del antígeno en un sujeto que sufre el trastorno es responsable de la patofisiología del trastorno o es un factor que contribuye al empeoramiento del trastorno. Por consiguiente, un trastorno en donde la actividad del antígeno es perjudicial es uno en donde se espera que la reducción de la actividad del antígeno alivie los síntomas y/o el progreso del trastorno. Estos trastornos pueden evidenciarse, por ejemplo, a través de un incremento en la concentración del antígeno en un fluido biológico de un sujeto que sufre el trastorno (por ejemplo, un incremento en la concentración del antígeno en suero, plasma, fluido sinovial del sujeto, etcétera). Entre los ejemplos no limitativos de trastornos que pueden tratarse con las proteínas de unión de la presente, se incluyen aquellos trastornos indicados en la sección anterior y en la sección relacionada con composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de unión.

Las proteínas de unión son útiles como agentes terapéuticos para el bloqueo simultáneo de dos objetivos diferentes, con el fin de mejorar la eficacia/seguridad y/o incrementar la cobertura del paciente.

Además, las proteínas de unión DVD de la presente pueden usarse para la administración con especificidad tisular (direccionamiento hacia un marcador tisular y un mediador de enfermedades para obtener una PK local mejorada, lo que resulta en una mayor eficacia y/o una menor toxicidad), incluyendo una administración intracelular (direccionamiento hacia un receptor de internalización y una molécula intracelular), una administración en el interior del cerebro (direccionamiento hacia un receptor de transferrina y un mediador de enfermedades del CNS, para atravesar la barrera hematoencefálica). La proteína de unión DVD también puede servir como proteína de transporte para administrar un antígeno en una localización específica, por medio de la unión a un epitope no neutralizador del antígeno, y también para incrementar la vida media del antígeno. Además, la proteína de unión DVD pueden diseñarse de manera que estén unidas físicamente a los dispositivos médicos que se implanten en los pacientes o para que se dirijan a estos dispositivos médicos (ver Burke et al. (2006) Advanced Drug Deliv. Rev. 58(3): 437-446; Hildebrand et al. (2006) Surface and Coatings Technol. 200(22-23): 200(22-23) 6318-6324; Drug/device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis, Wu (2006) Biomaterials 27(11): 2450-2467; Mediation of the cyto ine network in the implantation of orthopedic devices, Marques* (2005) Biodegradable Systems in Tissue Engineer. Regen. Med. 377-397). En resumen, el direccionamiento de tipos apropiados de células al sitio del implante médico puede promover la cicatrización y la restauración de la función normal del tejido. Como alternativa, también proporciona la inhibición de los mediadores (incluyendo, sin limitaciones, citoquinas) liberados al implantarse el dispositivo por una DVD-lg unida o dirigida a un dispositivo.

Uso de las Proteínas de Unión en Diversas Enfermedades Las moléculas de proteínas de unión provistas en el presente documento son de utilidad como moléculas terapéuticas para tratar diversas enfermedades, por ejemplo, en donde los objetivos que son reconocidos por las proteínas de unión son perjudiciales. Tales proteínas de unión pueden unirse a uno o más objetivos que participen en una enfermedad específica. También se ha demostrado que la inhibición de la IL-13 y/o de la IL-17 mejoran las vacunas anti-virales en modelos en animales y puede ser beneficiosa en el tratamiento de VIH y otras enfermedades infecciosas, por ejemplo, el rinovirus humano, otros enterovirus, coronavirus, virus herpes, virus de la influenza, virus de la parainfluenza, virus sincitial respiratorio o adenovirus.

Sin limitar la descripción, se proporciona información adicional sobre determinadas condiciones de enfermedad.

Respuesta Autoinmune e Inflamatoria Humana La IL-13 y/o la IL-17 se han relacionado con las respuestas autoinmunes e inflamatorias generales, incluyendo, por ejemplo, asma, alergias, enfermedad pulmonar alérgica, rinitis alérgica, dermatitis atópica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), fibrosis, fibrosis quística (CF), enfermedad pulmonar f i brótica , fibrosis pulmonar id iopática , fibrosis hepática, lupus, enfermedades y fibrosis de hígado relacionadas con la hepatitis B, sepsis, lupus sistémica eritematosa (SLE), glomerulonefritis, enfermedades inflamatorias de la piel, psoriasis, diabetes, diabetes mellitus dependiente de insulina, enfermedad de intestino inflamatorio (IBD), colitis ulcerosa (UC), enfermedad de Crohn (CD), artritis reumatoide (RA), osteoartritis (OA), esclerosis múltiple (MS), enfermedad de injerto versus huésped (GVHD), rechazo de trasplantes, enfermedad cardíaca isquémica (IHD), enfermedad celíaca, hipersensibilidad de contacto, enfermedad de hígado alcohólico, enfermedad de Behcet, enfermedad vascular ateroesclerótica, enfermedades inflamatorias de la superficie ocular o enfermedad de Lyme.

Asma El asma alérgico se caracteriza por la presencia de eosinofilia, metaplasia de las células caliciformes, alteraciones en las células epiteliales, hiperreactividad de las vías aéreas (AHR por sus siglas en inglés), y expresión de las citoquinas Th2 y Th1, así como niveles elevados de IgE en suero. Los corticosteroides constituyen el tratamiento antiinflamatorio más importante para el asma en la actualidad, pero su mecanismo de acción no es específico e implica riesgos de seguridad, especialmente en la población de pacientes juveniles. Por lo tanto, se necesita el desarrollo de terapias más específicas y dirigidas. Existen cada vez más evidencias de que, en ratones, la IL-13 imita muchas de las características del asma, incluyendo la AHR, la hipersecrecion de mucus y la fibrosis de las vías aéreas, independientemente de la inflamación eosinofílica (Finotto, et al., (2005) Internat. Immunol., 17(8): 993-1007; Padilla, et al., (2005) J. Immunol., 174(12): 8097-8105).

Se ha propuesto que la IL-13 cumple un rol fundamental en originar las respuestas patológicas asociadas con asma. El desarrollo de una terapia con anticuerpos monoclonales anti-IL-13 para reducir los efectos de la IL-13 en los pulmones es un enfoque novedoso, excitante y prometedor como nuevo tratamiento para el asma. Sin embargo, también hay otros mediadores de las vías inmunológicas diferenciales relacionadas con la patogénesis del asma, y que bloquean a estos mediadores, además de la IL-13, que pueden ofrecer beneficios terapéuticos adicionales. Tales pares de objetivos incluyen, pero en un sentido no taxativo, IL-13 y una citoquina pro-inflamatoria, como IL-17. Existe cada vez más evidencia que la IL-17 está relacionada con la patogénesis de asma. La IL-17 induce a los neutrófilos en las vías respiratorias y también aumenta la inflamación eosinofílica mediada por células auxiliares T 2 (Th2) de las vías respiratorias en el asma. Estudios recientes han demostrado que los inhibidores y otros diversos reguladores de la IL-17 reducen la inflamación de las vías respiratorias inducida por antígenos, hipersensibilidad bronquial y los niveles de citoquinas Th2 en modelos de asma en animales (por una revisión ver Park y Lee (2010) Respiratory Res., 11:78).

Los modelos de animales, como el modelo de asma inducido por OVA en ratones, en donde puede evaluarse la inflamación y la AHR, son conocidos en la técnica y pueden usarse para determinar la capacidad de diversas moléculas de proteínas de unión de tratar el asma. Los modelos en animales para estudiar asma se describen en Coffman, et al., (2005) J. Exp. Med. 201(12): 1875-1879; Lloyd et al., (2001) Adv. Immunol. 77 263: 263-295; Boyce et al., (2005) J. Exp. Med. 201(12): 1869-1873; y Snibson et al., (2005) J. Brit. Soc. Allergy Clin. Immunol. 35(2): 146-52. Además de las evaluaciones de seguridad de rutina con estos pares de objetivos, se podrán diseñar pruebas específicas para determinar el grado de inmunosupresión que sean útiles para seleccionar los mejores pares de objetivos (ver Luster et al., Toxicol. 92(1-3): 229-43; Descotes et al., (1992) Dev. Biol. Standard. 77: 99-102; Hart et al., (2001) J. Allergy Clin. Immunol. 108(2): 250-257).

Artritis Reumatoide La artritis reumatoide (RA), una enfermedad sistémica, se caracteriza por una reacción inflamatoria crónica en el sinovio de las articulaciones, y está asociada a la degeneración del cartílago y la erosión del hueso y uxtaarticular. Muchas citoquinas proinflamatorias las quimioquinas y los factores de crecimiento, se expresan en las articulaciones enfermas. Estudios recientes indican que el compromiso de las células T en la RA está mediado en un grado significativo por la IL-17. Estudios en animales han mostrado que se detectó una expresión de la IL-17 marcadamente aumentada en ratones que desarrollan lesiones articulares semejantes a la RA humana. Se observaron asimismo efectos beneficiosos del bloqueo de la IL-17 en varios modelos de la enfermedad en animales (por una revisión, ver Witowski et al., (2004) Cell. Mol. Life Sci., 61: 567-579). Se puede establecer si una molécula de proteína de unión será útil para el tratamiento de la artritis reumática usando modelos animales de RA pre-clínica, como el modelo de artritis inducida por colágeno en ratón. Otros modelos útiles también son bien conocidos en la técnica (ver Brand (2005) Comp. Med. 55(2): 114-22). Sobre la base de la reactividad de los anticuerpos parentales con ortólogos humanos y de ratón (por ejemplo, la reactividad con TNF humano y de ratón, TWEAK humana y de ratón, etcétera), pueden realizarse estudios de convalidación en el modelo de CIA en ratón con moléculas de proteínas de unión derivadas de un "anticuerpo de reemplazo coincidente". En resumen, puede hacerse coincidir una proteína de unión basada en dos (o más) anticuerpos objetivo específicos de ratón, en la mayor medida posible, con las características de los anticuerpos parentales humanos o humanizados usados para la construcción de proteínas de unión humanas (afinidad similar, potencia de neutralización similar, vida media similar, etcétera).

LUPUS Eritematoso Sistémico (SLE) La característica distintiva inmunopatogénica del SLE es la activación de las células B policlonales, lo que resulta en hipergiobuiinemia, producción de autoanticuerpos y formación de complejos inmunes. Se han detectado niveles aumentados significativos de IL-13 e IL-17 en pacientes con lupus sistémica eritematosa (Morimoto et al., (2001) Autoimmunity, 34(1): 19-25; Wong et al., (2008) Clin Immunol., 127(3): 385-93). La IL-17 representa una citoquina importante en la patogénesis de SLE. Se ha demostrado una mayor producción de IL-17 en pacientes con SLE, así como en animales con enfermedades tipo lupus. Los modelos en animales han demostrado que el bloqueo de la IL-17 disminuye las manifestaciones de lupus (por una revisión, ver Nalbandian et al., (2009) 157(2): 209-215). Sobre la base de la reactividad cruzada de los anticuerpos parentales por los ortólogos humanos y de ratón (por ejemplo, la reactividad por el CD20 humano y de ratón, por la interferón alfa humana y de ratón, etcétera), pueden realizarse estudios de validación con el modelo de lupus en ratón usando moléculas de proteínas de unión derivadas de "anticuerpos de reemplazos coincidentes". Brevemente, una proteína de unión basada en dos (o más) anticuerpos específicos para objetivos de ratón puede modificarse en la medida de lo posible para que presente características similares a las de los anticuerpos progenitores humanos o humanizados que se usaron para construir la proteína de unión humana (por ejemplo, para que presente una afinidad, una potencia de neutralización o una vida media similar, etcétera).

Esclerosis Múltiple La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad humana compleja de tipo autoinmune que posee una etiología predominantemente desconocida. La destrucción inmunológica de la proteína básica de la mielina (MBP) en el sistema nervioso es la patología más saliente de la esclerosis múltiple. De mayor importancia son los mecanismos inmunológicos que contribuyen con el desarrollo de autoinmunidad. En particular, la expresión de antígenos, las interacciones entre las citoquinas y los leucocitos, y las células T reguladoras, que ayudan a balancear/modular otras células T, como células Th1 y Th2, son áreas importantes para la identificación de objetivos para la terapia. En la MS, se ha detectado una mayor expresión de IL-17 tanto en las lesiones de cerebro como en células mononucleares aisladas de sangre y fluido cerebroespinal. Las células productoras de IL-17 están extremadamente enriquecidas en las lesiones activas de MS, lo cual sugiere que la neutralización de esta citoquina tiene el potencial de ser beneficiosa (por una revisión, ver Witowski et al., (2004) Cell. Mol. Life Sci., 61: 567-579).

En la técnica se conocen varios modelos animales para evaluar la utilidad de las moléculas de proteína de unión de media-lg para tratar la MS (ver Steinman L, et al., (2005) Trends Immunol., 26(11): 565-71; Lublin, F.D. et al., (1985) Springer Semin. Immunopathol. 8(3): 197-208; Genain, CP. et al., (1997) J. Mol. Med. 75(3): 187-97; Tuohy, V.K. et al., (1999) J. Exp. Meó. 189(7): 1033-42; Owens, T. et al., (1995) Neurol. Clin. 13(1):51-73; y Hart et al., (2005) J. Immunol. 175(7):4761 -8.) Sobre la base de la reactividad cruzada de los anticuerpos parentales para estudios de validación de ortólogos de especies humanas y de animal, el modelo de EAE de ratón se puede conducir con moléculas de proteínas de unión derivadas de "anticuerpos de reemplazos coincidentes". Brevemente, una proteína de unión basada en dos (o más) anticuerpos específicos para objetivos de ratón puede modificarse en la medida de lo posible para que presente características similares a las de los anticuerpos progenitores humanos o humanizados que se usaron para construir la proteína de unión humana (por ejemplo, para que presente una afinidad, una potencia de neutralización o una vida media similar, etcétera). El mismo concepto se aplica a modelos animales en otras especies distintas de roedores, en donde se seleccionaría una proteína de unión derivada de un "anticuerpo de reemplazo coincidente" para los estudios anticipados de farmacología, y posiblemente seguridad. Además de las evaluaciones de seguridad de rutina con estos pares de objetivos, podrán diseñarse pruebas específicas para determinar el grado de inmunosupresión que sean útiles para seleccionar los mejores pares de objetivos (ver Luster et al., Toxicology, 92(1-3): (1994) Toxico!., 92(1-3): 229-43; Descotes et al., (1992) Devel. Biol. Standard. 77: 99-102; Jones (2000) IDrugs 3(4): 442-6).

Sepsis Las respuestas inflamatorias e inmunes avasalladoras son características esenciales del choque séptico, y tienen una participación clave en la patogénesis del daño en los tejidos, el fallo de múltiples órganos y la muerte inducida por sepsis. Se ha demostrados que las citoquinas son mediadores de shock séptico. Estas citoquinas tienen un efecto tóxico directo sobre los tejidos; también activan la fosfolipasa A2. Estos y otros efectos resultan en concentraciones incrementadas del factor activador de las plaquetas, la promoción de la actividad del óxido nítrico sintetasa, la promoción de la infiltración de los tejidos por neutrófilos, y la promoción de la actividad de los neutrófilos. Se ha demostrado que los niveles de IL-17 y el pronóstico clínico de sepsis se correlacionan negativamente. La neutralización de la IL-17A puede mejorar significativamente el índice de supervivencia de los pacientes con sepsis (ver Flierl et al., (2008) FASEB J. 22: 2198-2205).

Una modalidad está dirigida a proteínas de unión capaces de unirse a uno o más objetivos relacionados con la sepsis, como, por ejemplo la IL-13 y la IL-17. La eficacia de tales proteínas de unión para el tratamiento de sepsis puede evaluarse en modelos preclínicos en animales que son conocidos en la técnica (ver Buras et al (2005) Nat. Rev. Drug Discov 4(10): 854-65 y Calandra et al., (2000) Nat. Med. 6(2): 164-70).

Trastornos Neurolóqicos Enfermedades Neurodegenerativas Las enfermedades neurodegenerativas usualmente son enfermedades dependientes de la edad o agudas (por ejemplo, accidentes cardiovasculares, lesiones traumáticas cerebrales, lesiones en la médula espinal, etcétera). Se caracterizan por la pérdida progresiva de las funciones neuronales (por ejemplo, muerte de células neuronales, pérdida de axones, distrofia neurítica, desmielinización), pérdida de movilidad y pérdida de memoria. Estas enfermedades neurodegenerativas crónicas representan una interacción compleja entre múltiples tipos celulares y mediadores. Las estrategias de tratamiento para estas enfermedades son limitadas, y la mayoría comprende el bloqueo de los procesos inflamatorios con agentes antiinflamatorios no específicos (por ejemplo, corticosteroides, inhibidores de la COX) o agentes para prevenir la pérdida de neuronas y/o funciones sinápticas. Con estos tratamientos, no es posible detener el progreso de la enfermedad. Las terapias específicas dirigidas a más de un mediador de enfermedades pueden ofrecer una eficacia terapéutica aún mejor en las enfermedades neurodegenerativas crónicas que la observada con el direccionamiento de un solo mecanismo de enfermedad (ver Deane et al., (2003) Nature Med. 9: 907-13; y Masliah et al., (2005) Neuron., 46: 857).

Las moléculas de proteínas de unión provistas en el presente documento se pueden unir a uno o más objetivos relacionados con enfermedades neurodegenerativas crónicas, como el mal de Alzheimer. La eficacia de las moléculas de proteínas de unión puede convalidarse en modelos animales preclínicos, como los ratones transgénicos en donde se sobreexpresa la proteína precursora amiloide o RAGE, en los cuales se desarrollan síntomas similares a los de la enfermedad de Alzheimer. Además, se pueden construir moléculas de proteínas de unión para evaluar su eficacia en los modelos animales, y las mejores proteínas de unión para aplicaciones terapéuticas pueden seleccionarse para evaluaciones en pacientes humanos. Las moléculas de proteínas de unión también se pueden usar para el tratamiento de otras enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Parkinson.

Regeneración Neuronal v Lesiones en la Médula Espinal A pesar de un incremento en el conocimiento de los mecanismos patológicos, las lesiones en la médula espinal (SCI por sus siglas en inglés) aún son una afección devastadora y representan una indicación médica caracterizada por una elevada necesidad médica. La mayoría de las lesiones en la médula espinal son lesiones por contusión o compresión, y la lesión primaria comúnmente es seguida por mecanismos de lesión secundarios (mediadores inflamatorios, por ejemplo, citoquinas y quimioquinas) que empeoran la lesión inicial y resultan en un agrandamiento significativo del área de la lesión, algunas veces hasta 10 veces. La IL-17 es un mediador de degeneración secundaria, que contribuye en la neuroinflamación e impide la recuperación funcional. Se ha demostrado en estudios que usan ratones KO para IL-17 que la IL-17 contribuye en la respuesta neuroinflamatoria y la hipersensibilidad al dolor después de una lesión neuropática (Kim y Moalem-Taylor (2010) J Pain., 12(3): 370-83). Una deficiencia de IL-17 mejora la recuperación locomotora y la preservación de tejido después de una lesión por contusión de médula espinal en ratones (Hill et al., (2011) Neurosci Lett., 487(3): 363-7).

La eficacia de las moléculas de proteínas de unión se puede validar en modelos pre-clínicos de lesión de médula espinal en animales. Además, estas moléculas de proteínas de unión pueden construirse para evaluar su eficacia en los modelos animales, y las mejores proteínas de unión para aplicaciones terapéuticas pueden seleccionarse para evaluaciones en pacientes humanos. En general, los anticuerpos no cruzan la barrera hematoencefálica (BBB por sus siglas en inglés) en forma eficiente y relevante. Sin embargo, en algunas enfermedades neurológicas, por ejemplo, los accidentes cerebrovasculares, las lesiones traumáticas cerebrales, la esclerosis múltiple, etcétera, la BBB puede estar comprometida y esto permite una mayor penetración de las proteínas de unión y los anticuerpos en el cerebro. En otros trastornos neurológicos, en los que no se producen fugas en la BBB, puede usarse el direccionamiento de sistemas de transporte endógeno, que incluyen transportadores mediados por un vehículo, como un vehículo de glucosa o aminoácido y receptores/estructuras celulares que intervienen en la transcitosis mediada por receptores a nivel del endotelio vascular de la BBB, permitiendo de esa manera el transporte trans-BBB de proteínas de unión. Las estructuras en la BBB que permiten dicho transporte incluyen, pero en un sentido no taxativo, el receptor de insulina, el receptor de transferrina, LRP y RAGE. Además, las estrategias también permiten el uso de las proteínas de unión como lanzaderas para transportar fármacos potenciales dentro del CNS incluyendo fármacos de bajo peso molecular, nanopartículas y ácidos nucleicos (Coloma MJ, et al. (2000) Pharm Res. 17(3): 266-74; Boado et al., (2007) Bioconjug. Chem. 18(2): 447-55).

Trastornos Oncológicos La terapia con anticuerpos monoclonales ha emergido como una modalidad terapéutica importante para el cáncer (von Mehren et al. (2003) Annu. Rev. Med. 54: 343-69). El uso de anticuerpos con especificidad dual dirigidos a dos mediadores tumorales separados probablemente tenga beneficios adicionales, en comparación con una terapia monoespecífica. Se ha sugerido que la IL-17 soporta el crecimiento de tumores, probablemente por estimulación de la angiogénesis. La IL-13 cumple un rol importante en la regulación de la inmunidad anti-tumoral y el crecimiento tumoral. Hay estudios que indican que la IL-13 es central para una nueva vía inmunoreguladora en la cual las células NKT suprimen la immunovigilancia tumoral. (Por una revisión, ver Kolls et al., (2003) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 28: 9-11, y Terabe et al., (2004) Cáncer Immunol Immunother., 53(2): 79-85.) En una modalidad, las enfermedades que pueden ser tratadas o diagnosticadas con las composiciones y los métodos provistos incluyen, sin limitaciones, cánceres primarios y metastáticos, incluyendo carcinomas de mama, colon, recto, pulmón, orofaringe, hipofaringe, esófago, estómago, páncreas, hígado, vesícula biliar y conductos biliares, intestino delgado, tracto urinario (incluyendo riñón, vejiga y urotelio), tracto genital femenino (incluyendo cuello uterino, útero y ovarios, y también el coriocarcinoma y la enfermedad trofoblástica gestacional), tracto genital masculino (incluyendo próstata, vesículas seminales, testículos y tumores de las células germinales), glándulas endocrinas (incluyendo las glándulas tiroides, adrenal y pituitaria), y piel, así como hemangiomas, melanomas, sarcomas (incluyendo los que surgen de tejidos óseos y blandos, y también el sarcoma de Kaposi), tumores de cerebro, los nervios, los ojos y las meninges (incluyendo astrocitomas, gliomas, glioblastomas, retinoblastomas, neuromas, neuroblastomas, Schwannomas y meningiomas), tumores sólidos que surgen de tumores malignos hematopoyéticos, como leucemias y linfomas (linfomas de Hodgkin y no Hodgkin).

En una modalidad, los anticuerpos provistos, o las porciones de unión al antígeno de éstos, se usan para tratar un cáncer o en la prevención de metástasis de los tumores que se describen en el presente documento, ya sea solos o en combinación con radioterapia y/u otros agentes quimioterapéuticos.

Terapia Genética En una modalidad específica, las secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína de unión u otro agente profiláctico o terapéutico de la invención son administradas con el fin de tratar, prevenir, manejar o aliviar un trastorno o uno o más síntomas de éste por medio de una terapia de genes. La terapia de genes hace referencia a una terapia que comprende la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o que puede expresarse. En esta modalidad, los ácidos nucleicos producen el anticuerpo o los agentes profilácticos o terapéuticos de la presente codificados por los mismos, que produce un efecto profiláctico o terapéutico.

Se puede usar cualquiera de los métodos de terapia de genes disponibles en la técnica en los métodos provistos en el presente documento. Por revisiones generales de los métodos de terapia génica, ver Goldspiel et al. (1993) Clin. Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; ulligan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; Mayo, 1993, TIBTECH 11 (5):155-215. Los métodos comúnmente conocidos en la técnica para la tecnología de ADN recombinante que pueden usarse se describen en Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York (1993); y Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, Nueva York (1990). Con descripciones detalladas de diversos métodos de terapia génica descrita en la Publicación de Patente No. US20050042664.

Composiciones Farmacéuticas Se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una o más proteínas de unión, ya sea a solas o en combinación con agentes profilácticos, agentes terapéuticos y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de unión de la presente son para usar, pero en un sentido no limitativo, en el diagnóstico, la detección o el monitoreo de un trastorno, en la prevención, el tratamiento, la inhibición, el manejo o el alivio de un trastorno, o uno o más de síntomas del mismo, y/o en investigación. La formulación de las composiciones farmacéuticas, ya sea solas o en combinación con agentes profilácticos, agentes terapéuticos y/o vehículos farmacéuticamente aceptables, son conocidos por un experto en la técnica (Publicación de Patente Estadounidense No. 20090311253 A1).

Los métodos para administrar un agente profiláctico o terapéutico de la invención incluyen, sin limitaciones, la administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea), la administración epidural, la administración intratumoral y la administración a través de las mucosas (por ejemplo, las vías intranasal u oral) y administración pulmonar (por ejemplo, los compuestos en aerosol administrados con un inhalador o nebulizador). La formulación de las composiciones farmacéuticas para rutas de administración específicas, y los materiales y las técnicas necesarios para los diversos métodos de administración se encuentran disponibles y son conocidos por un experto en la técnica (Publicación de Patente Estadounidense No. 20090311253 A1).

Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, puede administrarse un solo bolo, puede administrarse varias dosis divididas en el tiempo o la dosis puede reducirse o incrementarse proporcionalmente como lo indican las exigencias de la situación terapéutica. Resulta especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en una forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y mayor uniformidad de dosificación. El término la forma de dosificación individual hace referencia a unidades físicamente discretas, apropiadas para dosificaciones individuales en los sujetos mamíferos a tratar; en donde cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo, calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico que se requiera. La especificación para la forma de dosificación individual de la presente está dictada y depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular que se desea obtener, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de las composiciones de un compuesto activo tal para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos.

Un ejemplo de rango no limitativo de una cantidad eficaz para el uso terapéutico o profiláctico de una proteína de unión de la presente comprende 0.1 - 20 mg/kg, por ejemplo, 1 - 10 mg/kg. Se debe tener en cuenta que los valores de la dosificación pueden variar con el tipo y la severidad de la condición a aliviar. También ha de comprenderse que, para un sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse con el correr del tiempo, de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional del encargado de administrar o supervisar la administración de las composiciones, y que los rangos de dosificación que se indican en el presente documento solamente se presentan a modo de ejemplo y no han de limitar el alcance o la práctica de la composición que se reivindica.

Terapia de Combinación La proteína de unión provista en el presente documento también se puede administrar con uno o más agentes terapéuticos adicionales que sean de utilidad en el tratamiento de diversas enfermedades, el agente adicional es seleccionado por el experto para fines establecidos. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapéutico reconocido en la técnica como útil para tratar la enfermedad o la afección que se está tratando con el anticuerpo de la presente. La combinación también puede incluir más de un agente adicional, por ejemplo, dos o tres agentes adicional.

Los agentes para terapias de combinación incluyen, sin limitaciones, agentes antineoplásticos, radioterapia, quimioterapia, por ejemplo, con agentes alquilantes del ADN, cisplatina, carboplatina, agentes anti-tubulina, paclitaxel, docetaxel, taxol, doxorrubicina, gemcitabina, gemzar, antraciclinas, adriamicina, inhibidores de la topoisomerasa I, inhibidores de la topoisomerasa II, 5-fluorouracilo (5-FU), leucovorina, irinotecano, inhibidores de la tirosin quinasa receptora (por ejemplo, erlotinib, gefitinib), inhibidores de COX-2 (por ejemplo, celecoxib), inhibidores de quinasas y ARNpi.

Las combinaciones para tratar enfermedades autoinmunes e inflamatorias comprenden uno o más fármacos antiinflamatorias no esteroidales, también conocidas como NSAID, que incluyen fármacos como el ibuprofeno. Otras combinaciones comprenden corticosteroides, incluyendo prednisolona. Los efectos colaterales bien conocidos del uso de los esteroides pueden reducirse o incluso eliminarse limitando la dosis de esteroides requerida cuando se tratan pacientes en combinación con las proteínas de unión de la presente. Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para artritis reumatoide con los cuales se puede combinar un anticuerpo, o porción de anticuerpo, provisto en el presente documento, incluyen los siguientes: fármacos antinflamatorios) supresores de citoquina (CSAIDs); anticuerpos para otras citoquinas o factores de crecimiento humanos o antagonistas de éstos, por ejemplo, TNF, LT, I IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, IL-21, IL-23, interferones, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Los anticuerpos, o porciones de unión al antígeno de la presente, pueden combinarse con anticuerpos contra moléculas de la superficie celular como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, CTLA o sus ligandos, incluyendo CD154 (gp39 o CD40L).

Las combinaciones de agentes terapéuticos pueden interferir en diferentes puntos en la cascada autoinmune y la subsiguiente cascada inflamatoria. Los ejemplos incluyen una proteína de unión descrita en el presente documento y un antagonista de TNF como un anticuerpo TNF quimérico, humanizado o humano, Adalimumab, (Publicación PCT No. WO 97/29131), CA2 (Remicade™), CDP 571, un receptor de TNF p55 o p75 soluble, o un derivado del mismo (p75TNFR1gG (Enbrel™) o p55TNFR1gG (Lenercept)), un inhibidor de gna enzima convertidora de TNFa (TACE); o un inhibidor de IL-1 (un inhibidor de la enzima convertidora de interleuquina-1 , IL-1RA, etcétera). Otras combinaciones incluyen una proteína de unión descrita en el presente documento e interleuquina 11. Aún otras combinaciones incluyen los participantes clave de la respuesta autoinmune, que pueden actuar de manera paralela a la función de IL-12, de manera dependiente de la función o en concierto con ella; en especial, se prefieren los antagonistas de la IL-18, incluyendo los anticuerpos contra IL-18, los receptores solubles de IL-18 o una proteína de unión a IL-18. Se ha demostrado que IL-12 e IL-18 tienen funciones superpuestas pero diferentes, y una combinación de antagonistas de ambos será muy eficaz. Aún otra combinación es una proteína de unión descrita en el presente documento y un inhibidor anti-CD4 no supresor. Aún otras combinaciones incluyen una proteína de unión descrita en el presente documento y un antagonista de la vía co-estimulante CD80 (B7.1) o CD86 (B7.2) incluyendo un anticuerpo, un receptor soluble o un ligando antagonista.

Los anticuerpos de la presente, o porciones de unión al antígeno de las mismas, también se pueden combinar con un agente, como metotrexato, 6-MP, azatioprina sulfasalazina, mesalazina, olsalazina cloroquinina/hidroxicloroquina, penicilamina, aurotiomalato (intramuscular y oral), azatioprina, colchicina, corticosteroides (oral, inhalados y por inyección local), agonistas del adrenorreceptor beta-2 (salbutamol, terbutalina, salmeterol), xantinas (teofilina, aminofilina), cromoglicato, nedocromil, ketotifeno, ipratropio y oxitropio, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetilo, leflunomida, NSAID, por ejemplo, ibuprofeno, corticosteroides como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización por citoquinas proinflamatorias, como TNFa o IL-1 (por ejemplo inhibidores de IRAK, NIK, IKK, p38 o MAP quinasa), inhibidores de la enzima convertidora de I L- 1 , inhibidores de la enzima convertidora de TNFa (TACE), inhibidores de la señalización de células T como inhibidores de quinasas, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, receptores solubles de citoquinas y derivados de los mismos (por ejemplo receptores de TNF solubles, p55 o p75 y los derivados p75TN FRIgG (Enbrel™ y p55TN FRIgG (Lenercept)), si L-1 Rl, sIL-1RII, SIL-6R), citoquinas antiinflamatorias (por ejemplo IL-4, IL-10, IL-11, I L-13 y TGFP), celecoxib, ácido fólico, sulfato de hidroxicloroquina, rofecoxib, etanercep, infliximab, naproxeno, valdecoxib, sulfasalazina, metilprednisolona, meloxicam, acetato de metilprednisolona, timorato de oro y sodio, aspirina, triamcinolona acetonida, mesilato de propoxifeno/apap, folato, nabumetona, diclofenac, piroxicam, etodolac, diclofenac de sodio, oxaprozina, clorhidrato de oxicodona, bitartrato de hidrocodona/apap, diclofenaco de sodio/misoprostol, fentanilo, anakinra recombinante humano, clorhidrato de tramadol, salsalato, sulindac, cianocobalamina/fa/piridoxina, acetaminofeno, alendronato de sodio, prednisolona, sulfato de morfina, clorhidrato de lidocaína, indometacina, sulfato de glucosamina/condroitina, clorhidrato de amitriptilina, sulfadiazina, clorhidrato de oxicodona/acetaminofeno, clorhidrato de olopatadina, misoprostol, naproxeno de sodio, omeprazol, ciclofosfamida, rituximab, IL-1 TRAP, MRA, CTLA4-IG, I L-18 BP, anti-IL-18, anti-IL15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX740, Roflumilast, IC-485, CDC-801 y Mesopram. Las combinaciones incluyen metotrexato o leflunomida, y en casos de artritis moderada o severa, ciclosporina.

En una modalidad, la proteína de unión o la porción de unión al antígeno de ésta se administra en combinación con uno de los siguientes agentes para el tratamiento de artritis reumatoide: inhibidor de moléculas pequeñas de KDR, inhibidor de moléculas pequeñas de Tie-2; metotrexato; prednisona; celecoxib; ácido fólico; sulfato de hidroxicloroquina; rofecoxib; etanercept; infliximab; lefunomida; naproxeno; valdecoxib; sulfasalazina; metilprednisolona; ibuprofeno; meloxicam; acetato de metilprednisolona; tiomalato de oro y sodio; aspirina; azatioprina; triamcinolona acetonida; napsilato de propoxifeno/apap; folato; nabumetona; diclofenac; piroxicam; etodolac; diclofenaco de sodio; oxaprozina; clorhidrato de oxicodona; bitartrato de hidrocodona/apap; diclofenac de sodio/misoprostol ; fentanilo; anakinra recombinante humano; clorhidrato de tramadol; salsalato; sulindac; cianocobalamina/fa/piridoxina; acetaminofeno; alendronato de sodio; prednisolona; sulfato de morfina; clorhidrato de lidocaína; indometacina; sulfato de glucosamina/condroitina; ciclosporina; clorhidrato de amitriptilina; sulfadiazina; clorhidrato de oxicodona/acetaminofeno; clorhidrato de olopatadina; misoprostol; naproxeno de sodio; omeprazol; micofenolato mofetil; ciclofosfamida; rituximab; IL-1 TRAP; MRA; CTLA4-IG; IL-18 BP; ??_-1ß/23; anti-IL 18; anti-IL 15; BIRB-796; SCIO-469; VX-702; AMG-548; VX-740; Roflumilast; IC-485; CDC-801; o mesopram.

Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para el síndrome de intestino irritable con los cuales pueden combinarse una proteína de unión de la presente incluyen los siguientes: budenosida; factor de crecimiento epidérmico; corticosteroides; ciclosporina, sulfasalazina; aminosalicilatos; 6-mercaptopurina; azatioprina; metronidazol; inhibidores de la lipooxigenasa; mesalamina; olsalazina; balsalazida; antioxidantes; inhibidores del tromboxano; antagonistas del receptor de IL-1; anticuerpos monoclonales a nti-l L- 1 ß ; anticuerpos monoclonales anti-IL-6; factores de crecimiento; inhibidores de la elastasa; compuestos de piridinil-imidazol; anticuerpos o antagonistas de otras citoquinas o factores de crecimiento humanos, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, I L- 1 ß , IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF o PDGF. Los anticuerpos de la presente, o porciones de unión al antígeno de éstos, pueden combinarse con anticuerpos contra moléculas de la superficie celular como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos. Los anticuerpos de la presente, o porciones de unión al antígeno de los mismos, también se pueden combinar con agentes, como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetilo, lefunomida, NSAID, por ejemplo, ibuprofeno, corticosteroides como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización por citoquinas proinflamatorias como TNFa o IL-1 (por ejemplo, inhibidores de IRAK, NIK, IKK, p38 o MAP quinasa), inhibidores de la enzima convertidora de IL- 1ß, inhibidores de la enzima convertidora de TNFa, inhibidores de la señalización de células T como inhibidores de quinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, receptores solubles de citoquinas y derivados de los mismos (por ejemplo, los receptores solubles de TNF p55 o p75, sIL-IRI, slL-1RI, slL-6R) y citoquinas antiinflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-11, IL13 y TGF ) o un inhibidor de blc-2.

Los ejemplos de agentes terapéuticos para la enfermedad de Crohn con los cuales puede combinarse una proteína de unión incluyen los siguientes: antagonistas de TNF, por ejemplo, anticuerpos anti-TNF, D2E7 (Publicación PCT No. WO 97/29131; HUMIRA), CA2 (REM ICADE), CDP 571, construcciones de TNFR-Ig, inhibidores de p75TNFRIgG (ENBREL) y p55TNFRIgG (LENERCEPT), e inhibidores de PDE4. Los anticuerpos de la presente, o porciones de unión al antígeno de los mismos, se pueden combinar con corticosteroides, por ejemplo, budenosida y dexametasona. Las proteínas de unión de la presente, o las porciones de unión al antígeno de éstas, también pueden combinarse con agentes como sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico y olsalazina, y agentes que interfieren con la síntesis o la acción de citoquinas proinflamatorias, como IL-1, por ejemplo, inhibidores de la enzima convertidora de I L- 1 ß o l L- 1 ra. Los anticuerpos de la presente, o una porción de unión al antígeno del mismo, también se pueden usar con inhibidores de la señalización de células T, por ejemplo, inhibidores de tirosina de las quinasa 6-mercaptopurinas. Las proteínas de unión de la presente, o porciones de unión al antígeno de éstos, pueden combinarse con la IL-11. Las proteínas de unión de la presente, o porciones de unión al antígeno de éstos, pueden combinarse con mesalamina, prednisona, azatioprina, mercaptopurina, infliximab, metilprednisolonsuccinato de sodio, difenoxilato/sulfato de atropina, clorhidrato de loperamida, metotrexato, omeprazol, folato, ciprofloxacina/dextrosa-agua, bitartrato de hidrocodona/apap, clorhidrato de tetraciclina, fluocinonida, metronidazol, timerosal/ácido bórico, colestiramina/sacarosa, clorhidrato de ciprofoxacina, sulfato de hiosciamina, clorhidrato de meperidina, clorhidrato de midazolam, clorhidrato de oxicodona/acetaminofeno, clorhidrato de prometazina, fosfato de sodio, sulfametoxazol/trimetoprim, celecoxib, policarbofilo, napsilato de propoxifeno, hidrocortisona, multivitaminas, balsalazida disódica, fosfato de codeína/apap, clorhidrato de colesevelam, cianocobalamina, ácido fólico, levofloxacina, metilprednisolona, natalizumab e interferón-gamma.

Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para la esclerosis múltiple con los cuales pueden combinarse las proteínas de unión de la presente incluyen los siguientes: corticoesteroides; prednisolona; metilprednisolona; azatioprina; ciclofosfamida; ciclosporina; metotrexato; 4-aminopiridina; tizanidina; interferón-ß? a (Avonex®; Biogen); interferón-ß? b (Betaseron ; Chiron/Berlex); interferón a-?3) (Interferón Sciences/Fujimoto), interferón-a (Alfa Wassermann/J&J), interferón ß??-IF (Serono/Inhale Therapeutics), Peglnterferon a 2b (Enzon/Schering-Plough), Copolímero 1 (Cop-1; Copaxone®; Teva Pharmaceutical Industries, Inc).; oxígeno hiperbárico; inmunoglobulina intravenosa; clabribina; anticuerpos para otras citoquinas o factores de crecimiento humanos o antagonistas de los mismos y sus receptores, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-23, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, o PDGF. Las proteínas de unión de la presente pueden combinarse con anticuerpos contra moléculas de la superficie celular, como CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90, o sus ligandos. Las proteínas de unión de la presente también se pueden combinar con agentes, como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetilo, lefunomida, NSAID, por ejemplo, ibuprofeno, corticosteroides como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización por citoquinas proinflamatorias como TNFa o IL-1 (por ejemplo, inhibidores de IRAK, NIK, IKK, p38 o MAP quinasa), inhibidores de la enzima convertidora de IL-1ß, inhibidores de la enzima convertidora de TNFa, inhibidores de la señalización de células T como inhibidores de quinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6- mercaptopurinas, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, receptores solubles de citoquinas y derivados de los mismos (por ejemplo, los receptores solubles de TNF p55 o p75, sIL-IRI, slL-1RI, slL-6R) y citoquinas antiinflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-11, IL13 y TGF ) o un inhibidor de blc-2.

Los ejemplos de agentes terapéuticos para esclerosis múltiple con los que se pueden combinar proteínas de unión de la presente para incluir interferón- ß, son por ejemplo, IFN ia y IFISipib; copaxone, corticoesteroides, inhibidores de caspasa, por ejemplo inhibidores de caspasa-1, inhibidores de IL-1, inhibidores de TNF, y anticuerpos para los ligandos CD40 y CD80.

Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para el tratamiento de esclerosis múltiple con los cuales pueden combinarse proteínas de unión de la presente incluyen los siguientes, albuterol, salmeterol/fluticasona, montelukast de sodio, propionato de fluticasona, budesonida, prednisona, xinafoato de salmeterol, levalbuterol HCI, albuterol sulfato/ipratropio, prednisolona fosfato de sodio, triancinolona acetonida, dipropionato de beclometasona, bromuro de ipratropio, azitromicina, acetato de pirbuterol, prednisolona, teofilina anhidra, metilprednisolona succinato de sodio, claritromicina, zafirlukast, fumarato de formoterol, vacuna para el virus de la gripe, trihidrato de amoxicilina, flunisolide, inyecciones para alergias, cromoglicato de sodio, clorhidrato de fexofenadina, flunisolide/mentol, amoxicilina/clavulanato, levofloxacina, dispositivo para asistencia de inhalación, guaifenesina, dexametasona fosfato de sodio, moxifloxacina HCI, doxiciclina hidrato, guaifenesina/d-metorphan, p-efedrina/cod/clorfenir, gatifloxacina, clorhidrato de cetirizina, mometasona furoato, xinafoato de salmeterol, benzonatato, cefalexina, pe/hidrocodona/clorfenir, cetirizina HCI/pseudoefedrina, fenilefrina/cod/prometazina, codeína/prometazina, cefprozilo, dexametasona, guaifenesina/pseudoefedrina, clorfeniramina/hidrocodona, nedocromil de sodio, sulfato de terbutalina, epinefrina, metilprednisolona y sulfato de metaproterenol.

Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para el tratamiento de COPD con los cuales pueden combinarse proteínas de unión de la presente incluyen los siguientes, sulfato de albuterol/ipratropio, bromuro de ipratropio, salmeterol/futicasona, albuterol, xinafoato de salmeterol, propionato de fluticasona, prednisona, teofilina anhidra, metilprednisolona succinato sodio, montelukast de sodio, budesonida, fumarato de formoterol, triamcinolona acetonida, levofoxacina, guaifenesina, azitromicina, dipropionato de beclometasona, clorhidrato de levalbuterol, flunisolida, ceftriaxona de sodio, amoxicilina trihidrato, gatifoxacina, zafirlukast, amoxicilina/clavulanato, flunisolida/mentol, clorfeniramina/hidrocodona, sulfato de metaproterenol, metilprednisolona, furoato de mometasona, p-efedrina/cod/clorfenir, acetato de pirbuterol, p- efedrina/loratadina, sulfato de terbutalina, bromuro de tiotropio, (R,R)-formoterol, TgAAT, cilomilast, roflumilast.

Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para el tratamiento de psoriasis con los cuales pueden combinarse proteínas de unión de la presente incluyen los siguientes. KDR, pequeña molécula inhibidora de Tie-2, calcipotrieno, propionato de clobetasol, triancinolona acetonida, propionato de halobetasol, tazaroteno, metotrexato, fluocinonida, betametasona diprop aumentada, fluocinolona acetonida, acitretin, champú de alquitrán, valerato de betametasona, mometasona furoato, ketoconazol, pramoxine/fluocinolona, valerato de hidrocortisona, flurandrenolide, urea, betametasona, clobetasol propionato/emoll, propionato de fluticasona, azitromicina, hidrocortisona, fórmula humectante, ácido fólico, desonide, pimecrolimus, alquitrán de carbón, diacetato de diflorasona, etanorcept folato, ácido láctico, metoxsalen, hc/bismuto subgal/znox/resor, acetato de metilprednisolona, prednisona, pantalla solar, halcinonide, ácido salicílico, antralina, pivalato de clocortolona, extracto de carbón mineral, alquitrán de carbón/ácido salicílico, alquitrán de carbón/ácido salicílico/azufre, desoximetasona, diazepam, emoliente, fluocinonide/emoliente, aceite mineral/aceite de castor/na lact, aceite mineral/aceite de maní, petróleo/miristato de isopropilo, psoralen, ácido salicílico, jabón/tribromsalan, timerosal/ácido bórico, celecoxib, infliximab, ciclosporina, alefacept, efalizumab, tacrolimus, pimecrolimus, PUVA, UVB, y sulfasalazina.

Los ejemplos de agentes terapéuticos para SLE (lupus) con los cuales pueden combinarse proteínas de unión de la presente incluyen los que siguen: NSAID, por ejemplo, diclofenaco, naproxeno, ibuprofeno, piroxicam, indometacina; inhibidores de COX2, por ejemplo, celecoxib, rofecoxib, valdecoxib; fármacos anti-malaria, por ejemplo, hidroxicloroquina; esteroides, por ejemplo, prednisona, prednisolona, budenosida, dexametasona; citotóxicos, por ejemplo, azatioprina, ciclofosfamida, micofenolato mofetil, metotrexato; inhibidores de PDE4 o un inhibidor de la síntesis de purina, por ejemplo Cellcept. Las proteínas de unión de la presente también se puede combinar con agentes como sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico, olsalazina, I muran® y agentes que interfieren con la síntesis, producción o acción de citoquinas proinflamatorias como IL-1, por ejemplo, inhibidores de caspasa como inhibidores de la enzima convertidora de I L- 1 ß y IL-1ra. Las proteínas de unión de la presente también se puede usar con inhibidores de la señalización de las células T, por ejemplo, inhibidores de la tirosina quinasa, o con moléculas dirigidas a la activación de las células T, por ejemplo, CTLA-4-IgG o anticuerpos de la familia anti-B7, anticuerpos de la familia anti-PD-1. Las proteínas de unión de la presente puede combinarse con IL-11 o anticuerpos anti-citoquinas, por ejemplo, fonotolizumab (un anticuerpo anti-IFNg), o anticuerpos antireceptores, por ejemplo, anticuerpos contra el receptor de IL-6 y anticuerpos contra las moléculas de la superficie de las células B. Los anticuerpos provistos en el presente documento o una porción de unión al antígeno de los mismos también se pueden usar con LJP 394 (abetimus), agentes que suprimen o inactivan células B, por ejemplo, Rituximab (anticuerpo anti-CD20), linfostat-B (anticuerpo anti-BlyS), antagonistas de TNF, por ejemplo, anticuerpos anti-TNF, Adalimumab (Publicación PCT No. WO 97/29131; HUMIRA), CA2 (REMICADE), CDP 571, construcciones TNFR-lg, (p75TNFRIgG (ENBREL) y p55TNFRIgG (Lenercept)) e inhibidores bcl-2, porque se ha demostrado que la sobreexpresión de bcl-2 en ratones transgénicos causa un fenotipo semejante a lupus (ver Marquina). Las composiciones farmacéuticas provistas en el presente documento pueden incluir una "cantidad eficaz para el uso terapéutico" o una "cantidad eficaz para el uso profiláctico" de una proteína de unión provista en el presente documento. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" hace referencia a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y por los períodos de tiempo necesarios, para obtener el resultado terapéutico deseado. Aquellos expertos en la técnica han de poder determinar la cantidad eficaz para el uso terapéutico de la proteína de unión, la cual puede variar de acuerdo con factores como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y peso del individuo, y la capacidad de la proteína de unión de generar la respuesta deseada en el individuo. Una cantidad eficaz para el uso terapéutico también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o la porción de unión al anticuerpo es superado por los efectos terapéuticos beneficiosos. Una "cantidad eficaz para uso profiláctico" hace referencia a una cantidad eficaz, a dosificaciones y por los períodos de tiempo necesarios para obtener el resultado profiláctico deseado. Típicamente, dado que se usa una dosis profiláctica en los sujetos antes o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad eficaz para el uso profiláctico será menor que la cantidad eficaz para el uso terapéutico.

Diagnósticos La descripción en el presente documento también proporciona aplicaciones de diagnóstico incluyendo, pero en un sentido no taxativo, métodos de ensayo para diagnóstico, conjuntos de elementos para diagnóstico que contienen una o más proteínas de unión, y adaptación de los métodos y de los conjuntos de elementos para su uso en sistemas automáticos y/o semi-automáticos. Los métodos, conjuntos de elementos y adaptaciones provistos se pueden usar en la detección, el monitoreo y/o el tratamiento de una enfermedad o trastorno en un individuo. Esto se explica con mayor detalle a continuación.

Método de Ensayo La presente exposición también proporciona un método para determinar la presencia, cantidad o concentración de un analito o un fragmento del mismo en una muestra de prueba usando al menos una proteína de unión como se describe en el presente documento. En el método se puede usar cualquier ensayo apropiado conocido en la técnica. Los ejemplos incluyen, pero en un sentido no taxativo, inmunoensayos y/o métodos que usan espectrometría de masa.

Los inmunoensayos provistos por la presente descripción pueden incluir inmunoensayos tipo sándwich, radioinmunoensayos (RIA por sus siglas en inglés), inmunoensayos con enzimas (EIA por sus siglas en inglés), ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayos de inhibición competitiva, inmunoensayo de polarización por fluorescencia (FPIA por sus siglas en inglés), técnica de inmunoensayo multiplicado por enzimas (E IT por sus siglas en inglés), transferencia de energía de resonancia bioluminiscente (BRET por sus siglas en inglés) y ensayos quimioluminiscentes homogéneos, entre otros.

Un inmunoensayo de micropartículas quimioluminiscentes, en particular uno que usa el analizador automático ARCHITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), es un ejemplo de un inmunoensayo ejemplificativo.

En la presente descripción se proporcionan métodos que usan espectrometría de masa e incluyen, pero en un sentido no taxativo, MALDI (desorción/ionización láser asistida por matriz) o SELDI (desorción/ionización láser potenciada por superficie).

Los métodos para recolectar, manejar, procesar y analizar muestras de prueba biológicas usando inmunoensayos y espectrometría de masa son bien conocidos por un experto en la técnica, y se proporcionan para la práctica de la presente descripción (US 2009-0311253 A1).

Conjunto de Elementos También proporciona un conjunto de elementos para analizar una muestra de ensayo para estudiar la presencia, cantidad o concentración de un analito o un fragmento de éste en una muestra de prueba. El conjunto de componentes comprende al menos un componente para ensayar la muestra de prueba para estudiar el analito o fragmento del mismo e instrucciones para ensayar la muestra de prueba para estudiar el analito o fragmento del mismo. Al menos un componente para ensayar la muestra de prueba para estudiar el analito o un fragmento del mismo, puede incluir una composición que comprende una proteína de unión descrita en el presente documento y/o un anti-analito de una proteína de unión (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma), que opcionalmente esta inmovilizada sobre una fase sólida.

Opcionalmente, el conjunto de elementos puede comprender un calibrador o control, que puede comprender un analito aislado o purificado. El conjunto de elementos pueden comprender al menos un componente para evaluar la muestra de prueba para un analito mediante un inmunoensayo y/o espectrometría de masa. Los componentes de los conjuntos de elementos, incluyendo el analito, la proteína de unión y/o la anti-proteína de unión analito, o fragmentos de los mismos, opcionalmente se pueden marcar usando cualquier marca detectable conocida en la técnica. Los materiales y los métodos para la creación provistos para la práctica de la presente descripción son conocidos por un experto en la técnica (US 2009-0311253 A1).

Adaptación del Conjunto de Elementos v Método El conjunto de elementos (o sus componentes), así como también el método para determinar la presencia, cantidad o concentración de un analito en una muestra de prueba mediante un ensayo, como un inmunoensayo como se describe en el presente documento, puede adaptarse para usar en una variedad de sistemas automatizados y semiautomatizado (incluyendo a aquellos en donde la fase sólida comprende una micropartícula), como se describe, por ejemplo, en las Patentes Estadounidense No. 5,089,424 y 5,006,309, y como se encuentra comercialmente en el mercado, por ejemplo, en Abbott Laboratories (Abbott Park, IL) como ARCHITECT®.

Otras plataformas disponibles de Abbott Laboratories incluyen, sin limitaciones, AxSYM®, IMx® (ver, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,294,404), PRISM®, EIA (esfera), y Quantum™ II, así como también otras plataformas. Además, los ensayos, conjuntos de elementos y los componentes del conjunto de elementos pueden usarse en otros formatos, por ejemplo, en otros sistemas de ensayo electroquímicos manuales o cerca del paciente. La presente descripción es, por ejemplo, aplicable al sistema de inmunoensayo electroquímico Abbott Point de Care (i- STAT®, Abbott Laboratories) que lleva a cabo inmunoensayos en sándwich. Los inmunosensores y sus métodos de elaboración y operación en dispositivos de prueba descartables se describen, por ejemplo en las Patentes Estadounidense No.: 5,063,081, 7,419,821 y 7,682,833; y en la Publicación de Patente Estadounidense No. 20060160164; y las publicaciones de Patente de los EE.UU. No.. 20040018577, 20060160164 y US 200903 1253.

Para aquellos expertos en la técnica, ha de ser evidente que es posible realizar modificaciones y adaptaciones apropiadas a los métodos que se describen en el presente documento usando equivalentes apropiados, sin apartarse del alcance de las modalidades que se describen en el presente documento. Habiéndose descrito algunas modalidades de la presente en detalle, ésta podrá comprenderse más claramente con referencia a los siguientes ejemplos, que solamente se incluyen con fines ilustrativos y no pretenden limitarla.

Ejemplos Ejemplo 1: Generación de un anticuerpo monoclonal anti-IL-17 humanizado h10F7 Ejemplo 1.2: Maduración por afinidad del anticuerpo anti-IL-17 humana humanizado h10F7 El anticuerpo anti-IL-17 humana humanizado fue descrito con anterioridad. Este anticuerpo fue madurado subsiguientemente por afinidad para mejorar su afinidad global por la IL-17 humana, de mono cinomólogos y de ratón. Se obtuvieron varias bibliotecas de acuerdo con las siguientes especificaciones: Biblioteca H1 + H2: Mutagénesis limitada a 7 residuos en 30, 31, 33, 35, 53, 56, 57 y 58.

Alternar entre secuencias de la línea germinal humana y de h10F7 en las posiciones 27, 48, 51, 52, 54, 67 y 69.

Biblioteca H3: Mutagénesis limitada en 95 - 100c y 102.

Alternar entre secuencias de la línea germinal humana y de h10F7 en 93.

Biblioteca LC 1: Mutagénesis limitada en 30, 31, 32, 34, 50, 53, 89, 91, 92, 93 y 96.

Alternar entre secuencias de la línea germinal humana y de h10F7 en las posiciones 4, 24, 27, 29, 33, 36, 43, 47, 52 y 55.

Biblioteca LC 2: Se construyó con un residuo adicional en la posición G28 en la CDR1 para aumentar la identidad para los anticuerpos humanos.

Mutagénesis limitada en 28, 30, 31, 32, 34, 50, 53, 89, 91 , 92, 93 y 96.

Alternar entre secuencias de la línea germinal humana y de h10F7 en las posiciones 24, 27, 29, 33, 37, 44, 48, 52 y 55.

Una mutación de la línea germinal del marco de trabajo en FR1 (posición 4) a evaluar primero como scFv. "M" será preferido ante "L" si no afecta a la unión.

Biblioteca rHC: Recombina los resultados de las bibliotecas H1 + H2 y H3.

Biblioteca rHCLC: Recombina los resultados de las bibliotecas H1 + H2, H3 y LC1 o LC2 (seleccionar LC2 ante LC1 si el resultado de unión de LC2 parece ser al menos tan bueno como el tipo salvaje, de lo contrario recombinar el resultado LC1).

Las cuatro bibliotecas se seleccionaron por separado por la capacidad de unirse a la IL-17 humana, de mono cinomólogos y de ratón en la presencia de concentraciones decrecientes de antígenos biotinilados. Todas las secuencias de CDR mutadas que fueron recuperadas de las selecciones de bibliotecas se recombinaron en bibliotecas adicionales y las bibliotecas recombinadas fueron sometidas condiciones de selección más severas antes de identificar los anticuerpos individuales.

En la siguiente tabla proporciona un listado de las secuencias de aminoácidos de VH y VL del anticuerpo h10F7 que fueron sometidas al protocolo de selección de maduración por afinidad. Los residuos de aminoácidos de las CDRs individuales de cada secuencia VH y VL están resaltados en negritas.

Tabla 2: Residuos de Aminoácidos Observados en el Anticuerpo anti-IL-17 h10F7 Madurado por Afinidad En las Tablas 1B y 1C en la sección B anterior, proporcionan secuencias individuales de VH y VL de los clones convertidos. Estas secuencias maduradas por afinidad fueron convertidas en IgG de longitud completa, Tabla 3: Clones scFv Madurados por Afinidad de h10F7 Convertidos en IgG de Longitud Completa Ejemplo 2: Generación y caracterización de proteínas de unión de dominio variable dual (DVD) anti-IL-13 y anti-IL-17 Se generaron proteínas de unión de dominio variable dual (DVD) de cadena cuádruple usando anticuerpos parentales con secuencias de aminoácidos conocidas mediante la síntesis de fragmentos polinucleotídicos que codificaran las secuencias de proteína de unión de DVD de cadena variable pesada y proteína de unión de DVD de cadena variable ligera y clonando después los fragmentos en un vector pHybC-D2 de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Se clonaron y expresaron construcciones de la proteína de unión DVD en células 293 y se purificaron de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Más adelante se proporcionan las cadenas VH y VL DVD para las proteínas de unión DVD.

Ejemplo 2.1: Proteínas de unión DVD que se unen a IL-13 y a IL-17 Tabla 4 Nombre Nombre del del Dominio Fórmula de dominio dominio Conector variable SEC ID VD1 - variable variable interno X1 - VD2 DVD exterior DVD2150L AB397VL LK-largo AB273VL 31 - 14 - 37 DVD2151H AB273VH HG-corto AB397VH 36 - 21 - 30 DVD2151L AB273VL LK-largo AB397VL 37 - 14 - 31 DVD2152H AB397VH HG-largo AB273VH 30 - 22 - 36 DVD2152L AB397VL LK-corto AB273VL 31 - 13 - 37 DVD2153H AB273VH HG-largo AB397VH 36 - 22 - 30 DVD2153L AB273VL LK-corto AB397VL 37 - 13 - 31 DVD2154H AB397VH HG-corto AB274VH 30 - 21 - 38 DVD2154L AB397VL LK-corto AB274VL 31 - 13 - 39 DVD2155H AB274VH HG-corto AB397VH 38 - 21 - 30 DVD2155L AB274VL LK-corto AB397VL 39 - 13 - 31 DVD2156H AB397VH HG-corto AB274VH 30 - 21 - 38 DVD2156L AB397VL LK-largo AB274VL 31 - 14 - 39 DVD2157H AB274VH HG-corto AB397VH 38 - 21 - 30 DVD2157L AB274VL LK-largo AB397VL 39 - 14 - 31 DVD2158H AB397VH HG-largo AB274VH 30 - 22 - 38 DVD2158L AB397VL LK-corto AB274VL 31 - 13 - 39 DVD2159H AB274VH HG-largo AB397VH 38 - 22 - 30 Nombre Nombre del del Dominio Fórmula de dominio dominio Conector variable SEC ID VD1 - variable variable interno X1 - VD2 DVD exterior DVD2177L AB274VL LK-corto AB398VL 39 - 13 - 33 DVD2178H AB398VH HG-corto AB275VH 32 - 21 - 40 DVD2178L AB398VL LK-corto AB275VL 33 - 13 - 41 DVD2179H AB275VH HG-corto AB398VH 40 - 21 - 32 DVD2179L AB275VL LK-corto AB398VL 41 - 13 - 33 DVD2180H AB398VH HG-corto AB275VH 32 - 21 - 40 DVD2180L AB398VL LK-largo AB275VL 33 - 14 - 41 DVD2181 H AB275VH HG-corto AB398VH 40 - 21 - 32 DVD2181L AB275VL LK-largo AB398VL 41 - 14 - 43 DVD2182H AB398VH HG-largo AB275VH 32 - 22 - 40 DVD2182L AB398VL LK-corto AB275VL 33 - 13 - 41 DVD2183H AB275VH HG-largo AB398VH 40 - 22 - 32 DVD2183L AB275VL LK-corto AB398VL 41 - 13 - 33 DVD2184H AB399VH HG-corto AB273VH 34 - 21 - 36 DVD2184L AB399VL LK-corto AB273VL 35 - 13 - 37 DVD2185H AB273VH HG-corto AB399VH 36 - 21 - 34 DVD2185L AB273VL LK-corto AB399VL 37 - 13 - 35 DVD2186H AB399VH HG-corto AB273VH 34 - 21 - 36 Nombre Nombre del del Dominio Fórmula de dominio dominio Conector variable SEC ID VD1 - variable variable interno X1 - VD2 DVD exterior DVD2186L AB399VL LK-largo AB273VL 35 - 14 - 37 DVD2187H AB273VH HG-corto AB399VH 36 - 21 - 34 DVD2187L AB273VL LK-largo AB399VL 37 - 14 - 35 DVD2188H AB399VH HG-largo AB273VH 34 - 22 - 36 DVD2188L AB399VL LK-corto AB273VL 35 - 13 - 37 DVD2189H AB273VH HG-largo AB399VH 36 - 22 - 34 DVD2189L AB273VL LK-corto AB399VL 37 - 13 - 35 DVD2190H AB399VH HG-corto AB274VH 34 - 21 - 38 DVD2190L AB399VL LK-corto AB274VL 35 - 13 - 39 DVD2191H AB274VH HG-corto AB399VH 38 - 21 - 34 DVD2191L AB274VL LK-corto AB399VL 39 - 13 - 35 DVD2192H AB399VH HG-corto AB274VH 34- 21 - 38 DVD2192L AB399VL LK-largo AB274VL 35 - 14 - 39 DVD2193H AB274VH HG-corto AB399VH 38 - 21 - 34 DVD2193L AB274VL LK-largo AB399VL 39 - 14 - 35 DVD2194H AB399VH HG-largo AB274VH 34 - 22 - 38 DVD2194L AB399VL LK-corto AB274VL 35- 13 - 39 DVD2195H AB274VH HG-largo AB399VH 38 - 22 - 34 Nombre Nombre del del Dominio Fórmula de dominio dominio Conector variable SEC ID VD1 - variable variable interno X1 - VD2 DVD exterior DVD2195L AB274VL LK-corto AB399VL 39 - 13 - 35 DVD2196H AB399VH HG-corto AB275VH 34 - 21 - 40 DVD2196L AB399VL LK-corto AB275VL 35 - 13 - 41 DVD2197H AB275VH HG-corto AB399VH 40 - 21 - 34 DVD2197L AB275VL LK-corto AB399VL 41 - 13 - 35 DVD2198H AB399VH HG-corto AB275VH 34 - 21 - 40 DVD2198L AB399VL LK-largo AB275VL 35 - 14 - 41 DVD2199H AB275VH HG-corto AB399VH 40 - 21 - 34 DVD2199L AB275VL LK-largo AB399VL 41 - 14 - 35 DVD2200H AB399VH HG-largo AB275VH 34 - 22 - 40 DVD2200L AB399VL LK-corto AB275VL 35 - 13 - 41 DVD2201 H AB275VH HG-largo AB399VH 40 - 22 - 34 DVD2201L AB275VL LK-corto AB399VL 41 - 13 - 35 La Tabla 5 contiene los datos del rendimiento para anticuerpos parentales y construcciones de DVD-lg expresados como miligramos por litro en células 293.

Tabla 5: Expresión Transitoria en Rendimientos de Anticuerpos Parentales y Construcciones de DVD-lg en Células 293 Todas las moléculas DVD-lg se expresaban bien en las células 293. Las moléculas DVD-lg se purificaron fácilmente en una columna de proteína A. En la mayoría de los casos, se pudo obtener >5 mg/l de proteína DVD-lg purificada de los sobrenadantes de células 293.

Ejemplo 3: Ensayos usados para determinar la actividad funcional de los anticuerpos parentales y las proteínas DVD-lg Ejemplo 3.1: Bioensayo y ensayo de neutralización con IL-13 Se plaquearon células A549 a razón de 1.5 - 2 x 105 células por cavidad en un volumen de 100 µ? y se incubaron durante la noche a 37°C, 5% de CO2. Después de una incubación durante la noche de 16 - 20 horas, se removieron los 100 µ? de medio originales de volumen de siembra y se agregaron 100 µ? de rhTNF-a 400 ng/ml (concentrado 2x) a todas las cavidades. Las placas se dejaron a 37°C, 5% de C02 hasta la adición de IL-13 y de anticuerpo o de proteína DVD-lg. Se preparó una solución madre de trabajo 20 pg/ml de anticuerpo o proteína DVD-lg (concentrado 4x) en medio F12 completo. Se realizó una dilución en serie de ocho puntos (5 Mg/ml-0.0003 pg/ml) en medio F12 completo en placas de dilución Marsh. Se agregaron sesenta ul/caridad de dilución de cada anticuerpo o proteína DVD-lg por cuadruplicado a una placa con fondo en v de 96 cavidades (Costar, No. 3894) y 60 µ? de una solución concentrada 4x (20 ng/ml) de IL-13 a todas las cavidades excepto el control de células solamente. Después de 1 hora de incubación, se agregaron 100 µ? del complejo anterior de I L-13/anticuerpo o proteína DVD-lg a las células A549. El volumen de todas las cavidades era de 200 µ?. La concentración final de IL-13 recombinante era de 5 ng/ml y de rhTNF-a era de 200 ng/ml. Todos los reactivos de la placa se concentraron después a 1x. Después de 16 - 20 horas de incubación, se transfirió el contenido de las cavidades (200 µ?) a una placa de fondo redondo de 96 cavidades (Costar No. 3799) y se colocaron en un congelador a -20°C. Se evaluaron los niveles de hTARC en los sobrenadantes mediante un ELISA en el laboratorio de ensayo. La potencia de neutralización se determinó calculando el porcentaje de inhibición con relación al valor control de IL-13 5 ng/ml solamente. Los valores de IC50 informados (respuestas de la curva sigmoidea de dosis) se calcularon usando GraphPad Prism. Tabla 6: Ensayo de neutralización de IL-13 con el anticuerpo parental contra IL-13 y proteína de DVD-lg Todas las proteínas DVD-lg que contienen VD de AB397, AB398 o AB399, ya sea en posición N-terminal o C-terminal, mostraron neutralización en el ensayo de neutralización de A549 IL-13.

Ejemplo 3.2: Bioensayo y ensayo de neutralización con IL-17 La línea celular HS27 humana (ATCC No. CRL-1634) secreta IL-6 como respuesta a IL-17. La secreción de IL-6 inducida por IL-17 es inhibida por anticuerpos neutralizantes anti-IL-17 (Ver, por ejemplo, J. Imm. 155:5483-5486, 1995 o Cytokine 9:794-800, 1997)).

Las células HS27 se mantuvieron en medio de ensayo (medio DMEM rico en glucosa (Gibco No. 11965) con suero fetal bovino 10% (Gibco No. 26140), L-glutamina 4 mM, piruvato de sodio 1 mM, penicilina G (100 U/500 mi) y estreptomicina (100 pg/500 mi)). Las células se cultivaron en frascos T150 hasta una confluencia del 80 - 90% aproximadamente el día del ensayo. La IL-17 humana (R&D Systems, No. 317-IL/CF) se reconstituyó en PBS estéril sin Ca2+ y Mg2+ guardado congelado, recién descongelado para su uso y se diluyó a 40 ng/ml (4X) en medio de ensayo. Se efectuó una dilución en serie de los anticuerpos en una placa separada (concentraciones 4X), se mezclaron con un volumen igual de IL-17 humano 40 ng/ml (4X) y se incubaron a 37°C durante 1 hora. Las células HS27 (típicamente 20,000 células aproximadamente en 50 µ? de medio de ensayo) se agregaron a cada cavidad de una placa para cultivo tisular de fondo plano de 96 cavidades (Costar No. 3599), seguido por la adición de 50 µ? del anticuerpo o de la proteína DVD-lg preincubado más la mezcla de IL-17. La concentración final de IL-17 era de 10 ng/ml. Las células se incubaron durante 24 horas aproximadamente a 37°C. Después se recolectaron los sobrenadantes de medio. El nivel de neutralización de IL-17 se midió determinando la cantidad de IL-6 en el sobrenadante usando un conjunto de elementos comercial Meso Scale Discovery de acuerdo con las instrucciones del fabricador. Los valores de IC50 se obtuvieron usando el ajuste de la pendiente variable del logaritmo de la concentración del anticuerpo o de la DVD-lg™ versus la cantidad de IL-6.

Tabla 7: Ensayo de neutralización de IL-17 con el anticuerpo parental contra IL-17 y proteína de DVD-lg Todas las proteínas DVD-lg que contienen VD de AB273, AB274 o AB275, ya sea en posición N-terminal o C-terminal, mostraron neutralización en el ensayo de neutralización de HS27 IL-17.

Ejemplo 3.3: Determinación de la afinidad usando tecnología BIACORE Tabla 8: Reactivos usados en los análisis con Biacore Métodos con BIACORE: El ensayo BIACORE (Biacore, Inc, Piscataway, NJ) permitió determinar la afinidad de los anticuerpos o DVD-lg con las mediciones cinéticas de las constantes de asociación y disociación. La unión de los anticuerpos o proteínas DVD-lg a un antígeno objetivo (por ejemplo, un antígeno objetivo recombinante purificado) se determinó por mediciones basadas en resonancia de plasmón superficial con un instrumento Biacore® 1000 o 3000 (Biacore® AB, Uppsala, Suecia) usando HBS-EP de corrida (HEPES 10 mM [pH 7.4], NaCI 150 mM, EDTA 3 m y agente tensioactivo P20 0.005%) a 25°C. Todos los compuestos químicos se obtuvieron de Biacore® AB (Uppsala, Suecia) o de lo contrario de una fuente diferente descrita en el texto. Por ejemplo, se inmovilizaron aproximadamente 5000 RU de anti-lgG de ratón de cabra, (Fcy), anticuerpo policlonal específico del fragmento (Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL) diluido en acetato de sodio 10 mM (pH 4.5) directamente por medio de un chip biosensor de grado investigación CM5 usando un conjunto de elementos para acoplamiento de aminas estándar de acuerdo con las instrucciones y procedimientos del proporcionador a 25 g/ml. Las fracciones no reactivas sobre la superficie del biosensor fueron bloqueadas con etanolamina. Como superficie de reacción, se usó una superficie de carboximetil dextrano modificado en las celdas de flujo 2 y 4. El carboximetil dextrano no modificado sin IgG de cabra anti-humana en las celdas de flujo 1 y 3 se usó como superficie de referencia. Se usó carboximetil dextrano no modificado sin anti-lgG de ratón de cabra en la celda de flujo 1 y 3 como superficie de referencia. Para el análisis cinético, se ajustaron simultáneamente ecuaciones derivadas del modelo de unión de Langmuir 1:1 a las fases de asociación y disociación de las ocho inyecciones (usando un análisis de ajuste global) usando el software Biaevaluation 4.0.1. Los anticuerpos o proteínas DVD-lg a capturar como ligando (25 pg/ml) se inyectan sobre matrices de reacción a una velocidad de flujo de 5 µ?/minutos. Los anticuerpos o proteínas DVD-lg que serán capturados como ligando (25 pg/ml) se inyectaron sobre las matrices de reacción a una velocidad de flujo de 5 µ?/minutos. Las constantes de velocidad de asociación y disociación, kon (M~ 1s"1) y k0ff (s"1) se determinaron bajo una velocidad de flujo continuo de 25 µ?/minuto. Las constantes de velocidad se derivaron efectuando mediciones de unión cinética a diferentes concentraciones de antígeno que varía en un rango de 10 - 200 nM. La constante de disociación del equilibrio (M) de la reacción entre los anticuerpos o proteínas DVD-lg y el antígeno objetivo se calcula después a partir de las constantes cinéticas según la siguiente fórmula: KD = k0ff/k0n. La unión se registra como una función del tiempo y se calculan las constantes cinéticas. En este ensayo, se midieron constantes de asociación tan rápidas como 106M"1s"1 y disociaciones tan lentas como 10 V1.

Tabla 9: Análisis BIACORE de anticuerpos parentales y proteínas de DVD Se mantuvo la unión de todas las proteínas de DVD-lg caracterizada con Biacore y era comparable a la de los anticuerpos parentales. Todos los dominios variables se unieron con una afinidad alta similar que los anticuerpos parentales.

Ejemplo 4: Caracterización de los anticuerpos y las proteínas DVD-lg La capacidad de las proteínas de DVD-lg purificadas para inhibir una actividad funcional se determina, por ejemplo, usando el bioensayo con citoquinas que se describe en el Ejemplo 3. Las afinidades de unión de las proteínas de DVD-lg con el antígeno humano recombinante se determinan usando medición por resonancia de plasmón superficial (Biacore®) como se describe en el Ejemplo 4. Se califican los valores de IC50 de los bioensayos y la afinidad de las proteínas de DVD-lg. Las proteínas de DVD-lg que conservan por completo la actividad de los mAbs parentales se seleccionan como candidatos para su futuro desarrollo. Las 2 - 3 proteínas de DVD-lg más favorables se caracterizan por completo.

Ejemplo 4.1: Análisis farmacocinético de los anticuerpos humanizados o de las proteínas de DVD-lg Se realizan estudios farmacocinéticos en ratas Sprague-Dawley y monos macaco. Las ratas macho y hembra y los monos macaco reciben dosis por vía intravenosa o subcutánea que consiste de una sola dosis de mAb 4 mg/kg y proteínas de DVD-lg y las muestras se analizan usando ELISA de captura de antígeno y los parámetros farmacocinéticos se determinan mediante análisis no compartimentalizado. Brevemente, se recubren placas para ELISA con anticuerpo anti-biotina de cabra (5 mg/ml, 4°C, durante la noche), se bloquean con Superblock (Pierce) y se incuban con antígeno humano biotinilado a 50 ng/ml en Superblock TTBS 10% a temperatura ambiente durante 2 horas. Se diluyen en serie las muestras de suero (suero 0.5%, Superblock en TTBS 10%) y se incuban sobre la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente. La detección se efectúa con anticuerpo anti-humano de cabra marcado con HRP y las concentraciones se determinan con la ayuda de curvas estándar usando el ajuste logístico de cuatro parámetros. Los valores de los parámetros farmacocinéticos se determinan con el modelo no compartimental usando el programa de computación WinNonlin (Pharsight Corporation, Mountain View, CA). Se seleccionan los mAbs humanizados con un buen perfil farmacocinético (T1/2 es de 8 - 13 días o mejor, con una baja depuración y excelente biodisponibilidad 50 - 100%).

Ejemplo 4.2: Análisis fisicoquímico y estabilidad in vitro de los anticuerpos monoclonales humanizados y las proteínas de DVD-lg Cromatografía por exclusión de tamaño Los anticuerpos o las proteínas de DVD-lg se diluyeron hasta 2.5 mg/ml con agua y se analizan 20 mi con un sistema de HPLC Shimadzu usando una columna G3000 SWXL gel TSK (Tosoh Bioscience, No. cat. k5539-05k). Las muestras se eluyeron de la columna con sulfato de sodio 211 mM, fosfato de sodio 92 mM, pH 7.0, a una velocidad de flujo de 0.3 ml/minuto. Las condiciones operativas del sistema de HPLC fueron como se indica a continuación: Fase móvil: Na2S04 211 mM, Na2HP04*7H20 92 mM, pH 7.0 Gradiente: Isocrático Velocidad de flujo: 0.3 ml/minuto Longitud de onda del detector: 280 nm Temperatura del enfriador del muestreador automático: 4°C Temperatura del horno de la columna: Ambiente Duración de la corrida: 50 minutos La Tabla 10 contiene los datos de la pureza de los anticuerpos parentales y de las proteínas de DVD-lg expresados como un porcentaje de monómeros (proteína no agregada del peso molecular esperado) determinado con el protocolo anterior. Tabla 10: Pureza de los anticuerpos parentales y las proteínas de DVD-lg determinada mediante cromatografía por exclusión de tamaño Las proteínas de DVD-lg mostraron un excelente perfil SEC, en donde la mayoría de las proteínas de DVD-lg presentan >90% de monómeros. Este perfil de proteínas de DVD-lg fue similar al observado para los anticuerpos parentales.

SDS-PAGE Se analizan los anticuerpos y proteínas de DVD-lg por electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) tanto bajo condiciones reductores como no reductoras. Se usa el lote Adalimumab de AFP04C como un control. Para las condiciones reductoras, se mezclan las muestras 1:1 con la solución 2X amortiguadora de tris glicina para muestras de SDS-PAGE (Invitrogen, cat No. LC2676, lote No. 1323208) con DTT 100 mM, y se calientan a 60°C durante 30 minutos. Para las condiciones no reductoras, se mezclan las muestras 1:1 con la solución amortiguadora para muestras y se calientan a 100°C durante 5 minutos. Las muestras reducidas (10 mg por calle) se cargan en un gel de tris-glicina 12% pre-armado (Invitrogen, cat No. EC6005box, lote No. 6111021), y las muestras no reducidas (10 mg por calle) se cargan en un gel de tris-glicina 8 - 16% pre- armado (Invitrogen, cat No. EC6045box, lote No. 6111021). Ver Blue Plus 2 (Invitrogen, cat No. LC5925, lote No. 1351542) se usa como un marcador de peso molecular. Se corren los geles en una caja-celda de mini gel XCell SureLock (Invitrogen, cat No. EI0001) y se separan las proteínas aplicando primero un voltaje de 75 para concentrar las muestras en el gel, seguido por un voltaje constante de 125 hasta que el frente de colorante alcanza la base del gel. La solución amortiguadora de corrida usada es la solución amortiguadora 1X tris glicina SDS, preparada a partir de una solución amortiguadora 10X tris glicina SDS (ABC, MPS-79-080106). Los geles se tiñen durante la noche con colorante azul coloidal (Invitrogen cat No. 46-7015, 46-7016) y se destiñen con agua Milli-Q hasta que el fondo se encuentra transparente. Después se analizan los geles teñidos usando un analizador de Expresión Epson (modelo 1680, S/N DASX003641). Análisis de Velocidad de Sedimentación Se cargan los anticuerpos o las proteínas de DVD-lg en la cámara de la muestra de cada una de tres piezas centrales estándar de dos-sectores de carbono epon. Estas piezas centrales tienen una longitud de paso óptico de 1,2 cm y están construidas con ventanas de zafiro. Se usa PBS como solución amortiguadora de referencia y cada cámara contuvo 140 µ?. Se examinan todas las muestras simultáneamente usando un rotor de 4 cavidades (AN-60TÍ) en una ultracentrífuga analítica Beckman ProteomeLab XL-I (No. de serie PL106C01).

Se programan las condiciones de corrida y se realiza el control de la centrífuga usando ProteomeLab (v5.6). Se permite que las muestras y el rotor lleguen al equilibrio térmico durante una hora previa al análisis (20.0 ± 0.1°C). La confirmación del cargado correcto de las celdas se realiza a 3000 rpm y se registra un único análisis para cada celda. Las condiciones de la velocidad de sedimentación son las siguientes: Volumen de la Célula de la Muestra: 420 mi Volumen de la Célula de Referencia: 420 mi Temperatura: 20°C Velocidad del Rotor: 35,000 rpm Tiempo 8:00 horas Longitud de onda UV: 280 nm Tamaño del Paso Radial: 0.003 cm Recolección de datos. Un dato por etapa sin promedio de señal.

Número Total de Análisis: 100 Medición de peso molecular de LC-EM de anticuerpos intactos Se analizan los pesos moleculares de anticuerpos intactos y proteínas de DVD-lg por LC-EM. Cada anticuerpo o proteína de DVD-lg se diluye hasta aproximadamente 1 mg/ml con agua. Se usa un sistema HPLC 1100 (Agilent) con una microtrampa para proteínas (Michrom Bioresources, Inc, cat No. 004/25109/03) para desalar e introducir 5 mg de la muestra en un espectrómetro de masa API Qstar pulsar i (Applied Biosystems). Se usa un gradiente corto para eluir las muestras. Se corre el gradiente con la fase móvil A (0.08% FA, 0.02% TFA en agua de HPLC) y la fase móvil B (0.08% FA y 0.02% TFA en acetonitrilo) con una baja velocidad de flujo de 50 ml/minuto. El espectrómetro de masa se opera en un voltaje de aerosol de 4.5 kvolts con un rango de análisis de proporción masa a carga entre 2000 a 3500.

Medición del peso molecular por LC-EM de cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos y proteínas de DVD-lg Las medidas de peso molecular de la cadena ligera (LC), cadena pesada (HC) y HC desglicosilada de los anticuerpos y proteínas de DVD-lg se analizan por LC-EM. Los anticuerpos y proteínas de DVD-lg se diluyen a 1 mg/ml con agua y la muestra se reduce a LC y HC con una concentración final de 10 mM DTT durante 30 minutos a 37°C. Para desglicosilar el anticuerpo y proteínas de DVD-lg, se incuban 100 mg del anticuerpo con 2 mi de PNGasa F, 5 mi de 10% N-octilglucósido en un volumen total de 100 mi durante la noche a 37°C. Después de la desglicosilación, la muestra se reduce con una concentración final de 10 mM DTT durante 30 minutos a 37°C. Se usa un sistema de HPLC Agilent 1100 con una columna C4 (Vydac, cat# 214TP5115, S/N 060206537204069) para desalar e introducir la muestra (5 mg) en un espectrómetro de masa API Qstar pulsar i (Applied Biosystems). Se usa un gradiente corto para eluir las muestras. Se corre el gradiente con la fase móvil A (0.08% FA, 0.02% TFA en agua de HPLC) y la fase móvil B (0.08% FA y 0.02% TFA en acetonitrilo) con una baja velocidad de flujo de 50 ml/minuto. El espectrómetro de masa se opera en un voltaje de aerosol de 4.5 kvolts con un rango de análisis de proporción masa a carga entre 800 a 3500.

Mapeo de Péptidos Se desnaturaliza el anticuerpo o la proteína de DVD-lg durante 15 minutos a temperatura ambiente con una concentración final de clorhidrato de guanidino 6M en 75 m bicarbonato de amonio. Las muestras desnaturalizadas se reducen con una concentración final de DTT 10 mM a 37°C durante 60 minutos, seguido por alquilación con ácido iodoacético 50 mM (IAA) en oscuridad a 37°C durante 30 minutos. Después de la alquilación, la muestra se dializa durante la noche contra cuatro litros de bicarbonato de amonio 10 mM a 4°C. La muestra dializada se diluye a 1 mg/ml con bicarbonato de amonio 10 mM, pH 7.8 y se digieren 100 mg de anticuerpo o proteína de DVD-lg con tripsina (Promega, cat# V5111) o Lys-C (Roche, cat# 11 047 825 001) a una relación de 1:20 (peso en peso) tripsina/Lys-C:anticuerpo o proteína de DVD-lg a 37°C durante 4 horas. Digests are quenched con 1 mi de 1N HCI. Para el mapeo de péptidos con detección por espectrómetro de masa, se separaron 40 mi de las digestiones por cromatografía líquida de alto rendimiento en fase reversa (RPHPLC) en una columna C18 (Vydac, cat# 218TP51, S/N NE9606 10.3.5) con un sistema de HPLC Agilent 1100. Se corre la separación con el mismo gradiente usado para el mapeo de péptidos, usando la fase móvil A (0.02% TFA, 0.08% FA en agua de grado de HPLC) y la fase móvil B (0.02% TFA y 0.08% FA en acetonitrilo) con una velocidad de flujo de 50 ml/mínuto. El espectrómetro de masa API QSTAR Pulsar i se opera en modo positivo con un voltaje de aerosol de 4.5 kvolts y un rango de análisis de proporción masa a carga entre 800 y 2500.

Mapeo de puentes disulfuro Para desnaturalizar el anticuerpo, se mezclan 100 mi de anticuerpo o de la proteína DVD-lg con 300 mi de HCI de guanidino 8M en bicarbonato de amonio 100 mM. Se chequea el pH para asegurar que se encuentre entre 7 y 8 y se desnaturalizan las muestras durante 15 minutos a temperatura ambiente en una concentración final de HCI de guanidino 6M. Una porción de la muestra desnaturalizada (100 mi) se diluye a 600 mi con agua Milli-Q para dar una concentración final de HCL de guanidino de 1M. La muestra (220 mg) se digiere con tripsina (Promega, cat # V5111, lote # 22265901) o Lys-C (Roche, cat# 11047825001, lote # 12808000) con unas relaciones 1:50 tripsina o 1:50 Lys-C: anticuerpo o proteína de DVD-lg (peso en peso) (4.4 mg de enzima: 220 mg de muestra) a 37°C durante aproximadamente 16 horas. Se agregaron 5 mg adicionales de tripsina o Lys-C a las muestras y la digestión se permitió proceder durante 2 horas adicionales a 37°C. Las digestiones se detuvieron por el agregado de 1 mi de TFA a cada muestra. Las muestras digeridas se separan por RPHPLC usando una columna C18 (Vydac, cat No. 218TP51 S/N NE020630-4-1 A) en un sistema de HPLC Agilent. Se corre la separación con el mismo gradiente usado para el mapeo de péptidos, usando la fase móvil A (0.02% TFA, 0.08% FA en agua de grado de HPLC) y la fase móvil B (0.02% TFA y 0.08% FA en acetonitrilo) con una velocidad de flujo de 50 ml/minuto. Las condiciones operativas de HPLC son las mismas que las usadas para el mapeo de péptidos. El espectrómetro de masa API QSTAR Pulsar i se opera en modo positivo con un voltaje de aerosol de 4.5 kvolts y un rango de análisis de proporción masa a carga entre 800 y 2500. Los enlaces disulfuro se asignan por comparación de los MWs observados de los péptidos con los MWs predichos de péptidos trípticos o Lys-C unidos por enlaces disulfuro.

Determinación de sulfhidrilos libres El método usado para cuantificar cisternas libres en un anticuerpo o proteína de DVD-lg se basa en la reacción del reactivo de Ellman, 5.50- ditio-bis (ácido 2- nitrobenzoico) (DTNB), con grupos sulfhidrilo (SH) la cual da lugar a un producto cromofórico característico, ácido 5-tio-(2-nitrobenzóico) (TNB). La reacción se ilustra en la fórmula: DTNB + RSH · RS-TNB + TNB- + H + La absorbancia de TNB- se mide a 412 nm usando un espectrofotómetro Cary 50. Se gráfica una curva de absorbencia usando diluciones de 2 mercaptoetanol (b-ME) como el estándar de SH libre y las concentraciones de los grupos sulfhidrilos libres en la proteína se determinan por absorbencia a 412 nm de la muestra.

Las soluciones madre de estándar b-ME se prepara por dilución seriada de 14.2 M b-ME con agua de grado HPLC hasta una concentración final de 0.142 mM. Después se prepararon los estándares por triplicado para cada concentración. Se concentra el anticuerpo o proteína de DVD-lg hasta 10 mg/ml usando un filtro de ultra centrífuga Amicon 10,000 MWCO (Millipore, cat No. UFC801096, lote No. L3KN5251) y la solución amortiguadora se cambia a la formulación de solución amortiguadora usada para Adalimumab (fosfato de sodio monobásico 5.57 mM, fosfato de sodio dibásico 8.69 mM, NaCI 106.69 mM, citrato de sodio 1.07 mM, ácido cítrico 6.45 mM, manitol 66.68 mM, pH 5.2, Tween® 0.1% (p/v)). Se mezclan las muestras en un agitador a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después se agregaron 180 mi de 100 mM de solución amortiguada con Tris, pH 8.1 a cada muestra y estándar seguido por el agregado de 300 mi de 2 mM DTNB en 10 mM de solución amortiguada con fosfato, pH 8.1. Después de un riguroso mezclado, se mide la absorción a 412 nm de las muestras y estándares en un espectrofotómetro Cary 50. La curva estándar se obtiene por el gráfico de la cantidad de SH libre y OD412 nm de los estándares de b-ME. Se calcula el contenido de SH libres de las muestras en base a esta curva después de la sustracción del objetivo.

Cromatografía de intercambio catiónico débil El anticuerpo o proteína de DVD-lg se diluye a 1 mg/ml con fosfato de sodio 10 mM, pH 6.0. La heterogeneidad de carga se analiza usando un sistema de HPLC Shimadzu HPLC con una columna analítica WCX-10 ProPac (Dionex, cat# 054993, S/N 02722). Las muestras se cargan en la columna en 80% de la fase móvil A (fosfato de sodio 10 mM, pH 6.0) y 20% de la fase móvil B (fosfato de sodio 10 mM, NaCI 500 mM, pH 6.0) y se eluyen con una velocidad de flujo de 1.0 ml/minuto.

Caracterización de oligosacáridos Se derivatizan los oligosacáridos liberados después del tratamiento del anticuerpo o proteína de DVD-lg con PNGasa F, con el reactivo de marcado 2-aminobenzamida (2-AB). Se separan los oligosacáridos marcados con fluorescencia por cromatografía líquida de alto rendimiento de fase normal (NPHPLC) y se caracterizan las diferentes formas de oligosacáridos en base a la comparación del tiempo de retención con estándares conocidos.

El anticuerpo o proteína de DVD-lg se digiere primero con PNGasa F para cortar los oligosacáridos N-unidos de la porción Fe de la cadena pesada. Se coloca el anticuerpo o proteína de DVD-lg (200 mg) en un tubo Eppendorf de 500 mi junto con 2 mi de PNGasa F y 3 mi de N-octilglucósido 10%. Se agrega una solución amortiguadora salina de fosfatos para llevar el volumen final a 60 mi. Se incuba la muestra durante la noche a 37°C en un termoagitador Eppendorf ajustado en 700 RPM. También se digiere el lote AFP04C de Adalimumab con PNGasa F como un control.

Después del tratamiento con PNGasa F, se incuban las muestras a 95°C durante 5 minutos en un termoagitador Eppendorf ajustado en 750 RPM para precipitar las proteínas, después se colocan las muestras en una centrífuga Eppendorf durante 2 minutos a 10,000 RPM para bajar las proteínas precipitadas. Los sobrenadantes que contienen los oligosacáridos se transfieren a un tubo Eppendorf de 500 mi y se secan en una Speed-vac a 65°C.

Se marcan los oligosacáridos con 2AB usando un 2AB conjunto de elementos de marcado adquirido de Prozyme (cat No. GKK-404, lote No. 132026). El reactivo de marcado se prepara de acuerdo con las instrucciones del proporcionador. Se agrega ácido acético (150 mi, provisto en el conjunto de elementos) al frasco de DMSO (provisto en el conjunto de elementos) y se mezcla por pipeteo de la solución hacia arriba y hacia abajo varias veces. Se transfiere la mezcla de ácido acético/DMSO (100 mi) a un frasco del colorante 2-AB (justo antes de su uso) y se mezcla hasta que el colorante se encuentra completamente disuelto. Después se agrega la solución del colorante a un frasco de reductor (provisto en el conjunto de elementos) y se mezcla bien (reactivo de marcado). El reactivo de marcado (5 mi) se agrega a cada frasco de la muestra seca de oligosacáridos, y se mezclan exhaustivamente. Se colocan los frascos de la reacción en un termoagitador Eppendorf ajustado a 65°C y 700-800 RPM durante 2 horas de reacción.

Después de la reacción de marcado, se remueve el exceso de colorante fluorescente usando Cartuchos GlicCIean S de Prozyme (cat No. GKI-4726). Los cartuchos se lavan antes de la adición de las muestras con 1 mi de agua Milli-Q seguido por 5 lavados de 1 mi de solución de ácido acético 30%. Justo antes de agregar las muestras, se agrega 1 mi de acetonitrilo (Burdick y Jackson, cat No. AH015-4) a los cartuchos.

Después de que todo el acetonitrilo hubo pasado a través del cartucho, la muestra se ubica sobre el centro del disco recientemente lavado y se permite su adsorción al disco durante 10 minutos. Se lava el disco con 1 mi de acetonitrilo seguido por cinco lavados de 1 mi de acetonitrilo 96%. Los cartuchos se colocan encima de un tubo Eppendorf de 1.5 mi y se eluyen los oligosacáridos marcados con 2-AB con 3 lavados (400 mi cada lavado) de agua Milli Q.

Se separan los oligosacáridos usando una columna de HPLC Glicosep N (cat No. GKI-4728) conectada a un sistema de HPLC Shimadzu. El sistema de HPLC Shimadzu consistió de un controlador del sistema, un degaseador, bombas binarias, un cargador automático de muestras con un enfriador de muestra, y un detector de fluorescencia.

Estabilidad a temperaturas elevadas La solución amortiguadora del anticuerpo o proteína de DVD-lg es alguna entre fosfato de sodio monobásico 5.57 mM, fosfato de sodio dibásico 8.69 mM, NaCI 106.69 mM, citrato de sodio 1.07 mM, ácido cítrico 6.45 mM, manitol 66.68 mM, Tween 0.1% (p/v), pH 5.2; o histidina 10 mM, metionina 10 mM, o manitol 4%, pH 5.9 cuando se usan filtros de ultra centrífuga Amicon. Se ajusta la concentración final de los anticuerpos o proteína de DVD-lg a 2 mg/ml con las soluciones amortiguadoras apropiadas. Después se esterilizan por filtración las soluciones de anticuerpo o proteína de DVD-lg y se preparan alícuotas de 0.25 mi bajo condiciones de esterilidad. Las alícuotas se dejan ya sea a -80, 5, 25°C, o 40°C durante 1, 2 o 3 semanas. Al final del período de incubación, se analizan las muestras por cromatografía de exclusión de tamaño y SDS-PAGE.

Las muestras de estabilidad se analizan por SDS-PAGE tanto bajo condiciones reductoras como no reductoras. El procedimiento usado es el mismo que se describe en el presente documento solicitud. Los geles se tiñen durante la noche con colorante azul coloidal (Invitrogen cat No. 46-7015, 46-7016) y se destiñen con agua Milli-Q hasta que el fondo se encuentra transparente. Después se analizan los geles teñidos usando un analizador de Expresión Epson (modelo 1680, S/N DASX003641). Para obtener más sensibilidad, se tiñen los mismos geles con plata usando el conjunto de elementos para tinción con plata (Owl Scientific) y se usan los procedimientos recomendados dados por el fabricante.

Fluorimetría de barrido dinámica Las Proteínas DVD-lg se dializaron en solución amortiguadora de citrato 10 mM fosfato 10 mM, pH 6.0, para obtener una concentración final de 1 mg/ml. Se corrieron triplicados para cada proteína DVD-lg. Para cada muestra, se agregaron 27 µ? de la proteína DVD-lg en una cavidad de una placa de 96 cavidades y se mezclaron con 3 µ? de colorante SYPRO Orange (Invitrogen) diluido 4X. El colorante es suministrado en DMSO a una concentración de 5000X y se diluyó hasta la concentración de trabajo de 4X en agua. La placa se centrifugó durante 30 segundos para asegurar que tanto el colorante como la proteína se asentaran en el fondo de las cavidades y el mezclado completo se aseguró por aspiración suave con una punta de pipeta. La placa se selló después con una película adhesiva.

Se usó PCR de tiempo real (Applied Biosciences, Serie 7500) para medir el cambio en las intensidades de fluorescencia con la temperatura. La placa se calentó de 25°C a 95°C a una velocidad de rampa de temperatura de aproximadamente 0.5°C/minuto y se recolectó la fluorescencia de emisión usando un filtro TAM RA. Los datos se exportaron a Microsoft Excel y se graficaron como temperatura versus fluorescencia por cada proteína DVD-lg. Se observó un comienzo de fusión a medida que la temperatura en el termograma se eleva por encima de la fluorescencia basal. SYPRO Orange es un colorante hidrofóbico y se une preferencialmente a los residuos hidrofóbicos expuestos en una molécula de proteína desplegada. Por consiguiente, el comienzo de la temperatura de desplegado, medida como un aumento en la fluorescencia, es una indicación de la estabilidad térmica de la proteína DVD-lg. La temperatura de desplegado para las proteínas DVD-lg se pueden consultar en la Tabla 11. Tabla 11: Estabilidad térmica de las proteínas DVD-lg determinada por fluorimetría de barrido dinámica La mayoría de las proteínas DVD-lg mostró una temperatura de desplegado >50. Este perfil de proteínas de DVD-lg fue similar al observado para los anticuerpos parentales.

Determinación de la solubilidad Los candidatos de proteína DVD-lg se dializaron en His 15 mM, pH 6.0. Esto fue seguido por concentración de los mismos hasta 50 µ? en centricones con un corte de 30K. La solubilidad se confirmó visualmente por ausencia de precipitación después de almacenamiento a 4°C y se determinó cuantitativamente por medición de absorbancia UV a 280nm.

Tabla 12: Solubilidad de las proteínas DVD-lg 1S8 La mayoría de las proteínas DVD-lg mostraron un aspecto claro y se pudieron concentrar a más de 25 mg/ml. Este perfil de proteínas de DVD-lg fue similar al observado para los anticuerpos parentales.

Incorporación por Referencia El contenido de todas las referencias citadas (incluyendo, por ejemplo, las referencias de la literatura, de patentes, de solicitudes de patente y de sitios de Internet) que se pueden encontrar en las citas en toda esta solicitud así como en las figuras se incorporan expresamente y por completo a modo de referencia para cualquier fin, así como las referencias citadas en las mismas. En la descripción se usarán, a menos que se indique de otra manera, las técnicas convencionales de inmunología, biología molecular y de biología celular, que son bien conocidos en la técnica.

La presente descripción también incorpora por completo a modo de referencia las técnicas bien conocidas en el campo de la biología molecular y la administración de fármacos. Estas técnicas incluyen, sin limitaciones, las técnicas que se describen en las siguientes publicaciones: Ausubel et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BlOLOGY, John Wiley &Sons, NY (1993); Ausubel, F.M. et al. eds., SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (4a Ed. 1999) John Wiley & Sons, NY. (ISBN 0-471-32938-X); CONTROLLED DRUG BIOAVAILABILITY, DRUG PRODUCT DESIGN AND PERFORMANCE, Smolen and Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, CRYSTALLIZATION OF NUCLEIC ACIDS AND PROTEINS, a Practical Approach, 2a ed., pages. 20 1-16, Oxford University Press, Nueva York, Nueva York, (1999); Goodson, en MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELÉASE, vol. 2, pages. 115-138 (1984); Hammerling, et al., en: MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981; Harlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a edición. 1988); Kabat et al., PROTEIN SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) y (1991); Kabat, E.A., ef al., (1991) SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, No. publication 91.-3242; Kontermann and Dubel eds., ANTIBODY ENGINEERING (2001) Springer-Verlag. Nueva York. 790 páginas (ISBN 3-540-41354-5).

Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); Lu and Weiner eds., CLONING AND EXPRESSION VECTORS FOR GENE FUNCTION ANALYSIS (2001) BioTechniques Press. Westborough, MA. 298 páginas (ISBN 1 -881299-21 -X).

MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELÉASE, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Ratón, Fia. (1974); Oíd, R.W. & S.B. Primrose, PRINCIPLES OF GENE MANIPULATION: AN INTRODUCTION TO GENETIC ENGINEERING (3a Ed. 1985) Blackwell Scientific Publications, Boston. Studies in Microbiology; V.2:409 pages. (ISBN 0-632-01318-4).

Sambrook, J. et al., eds., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2a Ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Vols. 1-3. (ISBN 0-87969-309-6).

SUSTAINED AND CONTROLLED RELEASE DRUG DELIVERY SYSTEMS, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978 Winnacker, E.L. FROM GENES TO CLONES: INTRODUCTION TO GENE TECHNOLOGY (1987) VCH Publishers, NY (traduced por Horst Ibelgaufts).634 páginas (ISBN 0-89573-614-4).

Equivalencias La presente descripción puede realizarse en otras formas específicas sin apartarse de su espíritu o características esenciales. Por ello, las modalidades precedentes han de considerarse en todo respecto como ilustrativas en lugar de limitativas de la descripción. El alcance de la descripción está indicado entonces por las reivindicaciones adjuntas en lugar de la descripción precedente, y todos los cambios que se encuentran dentro del significado y rango de equivalencia de las reivindicaciones están comprendidas dentro del alcance.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de unión que comprende una primera y una segunda cadena de polipéptidos, cada una de las cuales comprende de manera independiente VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde: VD1 es un primer dominio variable; VD2 es un segundo dominio variable; C es un dominio constante; X1 es un conector con la condición que X1 no sea CH1; X2 es una región Fe, n es 0 o 1 ; en donde los dominios VD1 en la primera y la segunda cadena de polipéptidos forman un primer sitio de unión objetivo funcional y los dominios VD2 en la primera y la segunda cadena de polipéptidos forman un segundo sitio de unión objetivo funcional; y en donde la proteína de unión tiene la capacidad de unirse a la IL-13 y a la IL-17, en donde: (i) los dominios variables que forman un sitio de unión objetivo funcional para IL-13 comprenden: tres CDRs de la SEC ID No.: 30 y tres CDRs de la SEC ID No.: 31, tres CDRs de la SEC ID No.: 32 y tres CDRs de la SEC ID No.: 33, o tres CDRs de la SEC ID No.: 34 y tres CDRs de la SEC ID No.: 35; y (ii) los dominios variables que forman un sitio de unión objetivo funcional para IL-17 comprenden: tres CDRs de la SEC ID No.: 36 y tres CDRs de la SEC ID No.: 37, tres CDRs de la SEC ID No.: 38 y tres CDRs de la SEC ID No.: 39, tres CDRs de la SEC ID No.: 40 y tres CDRs de la SEC ID No.: 41, tres CDRs de la SEC ID No.: 42 y tres CDRs de la SEC ID No.: 52, tres CDRs de la SEC ID No.: 42 y tres CDRs de la SEC ID No.: 53, tres CDRs de la SEC ID No.: 43 y tres CDRs de la SEC ID No.: 50, tres CDRs de la SEC ID No.: 44 y tres CDRs de la SEC ID No.: 51, tres CDRs de la SEC ID No.: 45 y tres CDRs de la SEC ID No.: 54, tres CDRs de la SEC ID No.: 46 y tres CDRs de la SEC ID No.: 51, tres CDRs de la SEC ID No.: 47 y tres CDRs de la SEC ID No.: 54, tres CDRs de la SEC ID No.: 48 y tres CDRs de la SEC ID No.: 51 o tres CDRs de la SEC ID No.: 49 y tres CDRs de la SEC ID No.: 51.

2. Una proteína de unión que comprende dos primeras y dos segundas cadenas de polipéptidos, cada una de las cuales comprende de manera independiente VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde: VD1 es un primer dominio variable; VD2 es un segundo dominio variable; C es un dominio constante; X1 es un conector con la condición que X1 no sea CH1; X2 es una región Fe, n es 0 o 1 ; en donde los dominios VD1 en cada conjunto de la primera y segunda cadenas de polipéptidos forman primeros sitios de unión objetivos funcionales y los dominios VD2 en cada conjunto de la primera y segunda cadenas de polipéptidos forman un segundo sitio de unión objetivo funcional; y en donde la proteína de unión tiene la capacidad de unirse a la IL-13 y a la IL-17, en donde: (i) los dominios variables que forman un sitio de unión objetivo funcional para IL-13 comprenden: tres CDRs de la SEC ID No.: 30 y tres CDRs de la SEC ID No.: 31, tres CDRs de la SEC ID No.: 32 y tres CDRs de la SEC ID No.: 33, o tres CDRs de la SEC ID No.: 34 y tres CDRs de la SEC ID No.: 35; y (ii) los dominios variables que forman un sitio de unión objetivo funcional para IL-17 comprenden: tres CDRs de la SEC ID No.: 36 y tres CDRs de la SEC ID No.: 37, tres CDRs de la SEC ID No.: 38 y tres CDRs de la SEC ID No.: 39, tres CDRs de la SEC ID No.: 40 y tres CDRs de la SEC ID No.: 41, tres CDRs de la SEC ID No.: 42 y tres CDRs de la SEC ID No.: 52, tres CDRs de la SEC ID No.: 42 y tres CDRs de la SEC ID No.: 53, tres CDRs de la SEC ID No.: 43 y tres CDRs de la SEC ID No.: 50, tres CDRs de la SEC ID No.: 44 y tres CDRs de la SEC ID No.: 51, tres CDRs de la SEC ID No.: 45 y tres CDRs de la SEC ID No.: 54, tres CDRs de la SEC ID No.: 46 y tres CDRs de la SEC ID No.. 51, tres CDRs de la SEC ID No.: 47 y tres CDRs de la SEC ID No.: 54, tres CDRs de la SEC ID No.: 48 y tres CDRs de la SEC ID No.: 51 o tres CDRs de la SEC ID No.: 49 y tres CDRs de la SEC ID No.: 51.

3. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la proteína de unión se une a la IL-13 y a la IL-17 con: (i) una IC50 de como máximo 2.442 nM aproximadamente para IL-13 y/o como máximo 0.7034 nM aproximadamente para IL-17, medida con un ELISA de unión directa; (ii) una constante de velocidad (Kon) de al menos 2.10 x 104 M"1s"1 aproximadamente para IL-13 y/o como máximo 6.80 x 103 M'V1 aproximadamente para IL-17, medida por resonancia de plasmón superficial; (iii) una constante de velocidad (Koff) de como máximo 1.40 x 10"4 s'1 aproximadamente para IL-13 y/o como máximo 1.70 x 10' s" aproximadamente para IL-17, medida por resonancia de plasmón superficial; y/o (iv) una constante de disociación (Kd) de como máximo 1.10 x 10"10 M aproximadamente para IL-13 y/o como máximo 2.60 x 10"8 M aproximadamente para IL-17, medida por resonancia de plasmón superficial.

4. La proteína de unión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en donde: (i) X1 es cualquiera de las SEC ID No.: 1 - 29 o una secuencia de repetición G4S (SEC ID No. 29); (ii) X1 no es CL. (Mi) (X1)n es (X1)0 y/o (X2)n es (X2)0; (iv) la región Fe es una variante de la secuencia de la región Fe; (v) la región Fe es una región Fe de una lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE, o IgD; (iv) la proteína de unión es una proteína de unión cristalizada; y/o (v) los dominios variables que forman un sitio de unión objetivo funcional para IL-13 comprenden: SEC ID No.: 30 y SEC ID No.: 31, SEC ID No.: 32 y SEC ID No.: 33, o SEC ID No.: 34 y SEC ID No.: 35, y los dominios variables que forman un sitio de unión objetivo funcional para IL-17 comprenden: SEC ID No.: 36 y SEC ID No.: 37, SEC ID No.: 38 y SEC ID No.: 39, SEC ID No.: 40 y SEC ID No.: 41, SEC ID No.: 42 y SEC ID No.: 52, SEC ID No.: 42 y SEC ID No.: 53, SEC ID No.: 43 y SEC ID No.: 50, SEC ID No.: 44 y SEC ID No.: 51, SEC ID No.: 45 y SEC ID No.: 54, SEC ID No.: 46 y SEC ID No.: 51, SEC ID No.: 47 y SEC ID No.: 54, SEC ID No.: 48 y SEC ID No.: 51 o SEC ID No.: 49 y SEC ID No.: 51.

5. Un conjugado de una proteína de unión que comprende una proteína de unión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, el conjugado de proteína de unión comprende además un agente, en donde el agente es una molécula de inmunoadhesión, un agente para obtener imágenes, un agente terapéutico o un agente citotóxico, en donde. (i) el agente para obtener imágenes es una radiomarca, una enzima, una marca fluorescente, una marca luminiscente, una marca bioluminiscente, una marca magnética o biotina, y en donde opcionalmente dicha radiomarca es 3H, 1 C, 35S, 90Y, "Te, 11ln, 125l, 131l, 177Lu, 166Ho o 153Sm, o (ii) el agente terapéutico o citotóxico es un anti-metabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citoquina, un agente anti-angiogénico, un agente anti-mitótico, una antraciclina, una toxina o un agente apoptótico.

6. Un ácido nucleico aislado que codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína de unión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Un vector que comprende al ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el vector opcionalmente se selecciona entre pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV, pcDNA3.1 TOPO, pEF6 TOPO, pHybE, pBOS o pBJ.

8. Una célula huésped que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 7.

9. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la célula huésped es una célula procariota, Escherichia coli, una célula eucariota, una célula protista, una célula animal, una célula vegetal, una célula fúngica, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula Sf9, una célula de mamífero, una célula de ave, una célula CHO o una célula COS.

10. Un método para producir una proteína de unión que comprende cultivar una célula huésped de acuerdo con las reivindicaciones 8 o 9, en un medio de cultivo, bajo condiciones apropiadas para producir la proteína de unión.

11. Una proteína producida con el método de la reivindicación 10.

12. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12, además comprende al menos un agente terapéutico adicional, en donde el agente terapéutico adicional se selecciona opcionalmente entre un agente para obtener imágenes, un agente citotóxico, un inhibidor de la angiogénesis; un inhibidor de quinasa; un bloqueador de moléculas de co-estimulación; un bloqueador de moléculas de adhesión; un anticuerpo anti-citoquina o un fragmento funcional del mismo; metotrexato; ciclosporina; rapamicina; FK506; una marca o informante detectable; un antagonista de TNF; un antirreumático; un relajante muscular, un narcótico, un fármaco anti-inflamatoria no esteroide (NSAID), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antlmicrobiano, un antipsoriático, un corticosteroides, un esteroide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una ¡nmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona del crecimiento, un fármaco de reemplazo hormonal, un radiofármaco, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, una medicación para el asma, un beta agonista, un esteroide inhalado, un esteroide oral, una epinefrina o un análogo, una citoquina o un antagonista de citoquina.

14. Uso de la protelna de unión de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno en un sujeto, lo que comprende la administración al sujeto de la proteína de unión, de modo tal de efectuar dicho tratamiento.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el trastorno es artritis reumatoide, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis séptica, artritis de Lyme, artritis psoriática, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad de intestino inflamatoria, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis, escleroderma, enfermedad de injerto versus huésped, rechazo de trasplante de órganos, enfermedad inmune aguda o crónica asociada con el trasplante de órganos, sarcoidosis, ateroesclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schoenlein, vasculitis microscópica de los ríñones, hepatitis crónica activa, uveítis, shock séptico, síndrome de shock tóxico, síndrome de sepsis, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parasitarias, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversa aguda, corea de Huntington, mal de Parkinson, mal de Alzheimer, accidente cerebrovascular, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, formas malignas, insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio, enfermedad de Addison, esporádica, deficiencia poliglandular tipo I y deficiencia poliglandular tipo II, síndrome de Schmidt, síndrome de dificultad respiratoria de adultos (agudo), alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriática, artropatía eolítica ulcerosa, sinovitis enteropática, artropatía asociada con clamidia, yersinia y salmonella, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arterioesclerosis, alergia atópica, enfermedad bullosa autoinmune, pénfigo vulgar, pénfigo foliácea, penfigoide, enfermedad por IgA lineal, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica Coombs positiva, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/enfermedad Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de células gigantes, hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmune criptogénica, síndrome de la enfermedad de inmunodeficiencia adquirida, enfermedades relacionadas con la inmunodeficiencia adquirida, hepatitis B, hepatitis C, inmunodeficiencia común variada (hipogammaglobulinemia variable común), cardiomiopatía dilatada, esterilidad femenina, insuficiencia ovárica, insuficiencia ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial post-inflamatoria, pneumonitis intersticial, enfermedad pulmonar intersticial asociada con enfermedades del tejido conectivo, enfermedad pulmonar asociada con enfermedades del tejido conectivo mixtas, enfermedad pulmonar intersticial asociada con esclerosis sistémicas, enfermedad pulmonar intersticial asociada con artritis reumatoide, enfermedad pulmonar asociada con lupus eritematoso sistémico, enfermedad pulmonar asociada con dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada con la enfermedad de Sjógren, enfermedad pulmonar asociada con espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada con hemosiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármacos, fibrosis, fibrosis por radiación, bronquiolitis obliterante, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar linfocítica infiltrante, enfermedad pulmonar intersticial postinfecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune tipo- 1 (hepatitis autoinmune o lupoide clásica), hepatitis autoinmune tipo-2 (hepatitis por anticuerpo anti-LKM), hipoglucemia autoinmune, resistencia a insulina tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, enfermedad inmune aguda asociada con el trasplante de órganos, enfermedad inmune crónica asociada con el trasplante de órganos, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis tipo 1, psoriasis tipo 2, ieucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, enfermedad renal NOS, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los ríñones, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso discoide, esterilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad al esperma, esclerosis múltiple (todos los subtipos), oftalmía simpática, hipertensión pulmonar secundaria a una enfermedad del tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjógren, enfermedad de Takayasu/arterítis, trombocitopenia autoinmune, trombocitopenia idiopática, enfermedad autoinmune de la tiroides, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmune bocioso (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixedema primaria, uveítis facogénica, vasculitis primaria, vitíligo, enfermedad hepática aguda, enfermedad hepática crónica, cirrosis alcohólica, daño hepático inducido por alcohol, colestasis, enfermedad hepática idiosincrática, hepatitis inducida por fármacos, esteatohepatitis no alcohólica, alergia y asma, infección por estreptococos grupo B (GBS), trastornos mentales (por ejemplo, depresión y esquizofrenia), enfermedades mediadas por tipo Th2 y tipo Th1, dolor agudo y crónico (diferentes formas de dolor), y distintos tipos de cáncer como cáncer de pulmón, mama, estómago, vejiga, colon, páncreas, ovario, próstata y rectal y formas malignas hematopoyéticas (leucemia y linfoma), abetalipoproteinemia, acrocianosis, aguda y procesos parasitarios o infecciosos crónicos, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), infección bacteriana aguda o crónica, pancreatitis aguda, insuficiencia renal aguda, adenocarcinomas, latidos ectópicos aéreos, complejo de demencia del SIDA, hepatitis inducida por alcohol, conjuntivitis alérgica, dermatitis por contacto alérgica, rinitis alérgica, rechazo a aloinjertos, déficit de alfa- 1 -antitripsina, esclerosis lateral amiotrófica, anemia, angina pectoris, degeneración de células del asta anterior, terapia anti cd3, síndrome antifosfolípido, reacciones de hipersensibilidad antireceptor, aneurismas aórticos y periféricos, disección aórtica, hipertensión arterial, arterioesclerosis, fístula arteriovenosa, ataxia, fibrilación auricular (sostenida o paroxística), taquicardia auricular, bloqueo aurículoventricular, linfoma de células B, rechazo de injerto óseo, rechazo de trasplante de médula ósea (BMT), bloqueo de ramas de haz de His, linfoma de Burkitt, acidez estomacal, arritmias cardiacas, síndrome de atontamiento cardiaco, tumores cardiacos, cardiomiopatía, respuesta de inflamación a una derivación [bypass] cardiopulmonar, rechazo al trasplante de cartílago, degeneraciones de la corteza del cerebelo, trastornos del cerebelo, taquicardia auricular caótica o multifocal, trastornos asociados con una quimioterapia, leucemia mielocítica crónica (CML), alcoholismo crónico, patologías inflamatorias crónicas, leucemia linfocítica crónica (CLL), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), intoxicación crónica por salicilato, carcinoma colorrectal, insuficiencia cardiaca congestiva, conjuntivitis, dermatitis por contacto, cor pulmonale, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, sepsis con cultivo negativo, fibrosis quística, trastornos asociados con una terapia con citoquinas, demencia pugilística, enfermedades desmielinizantes, fiebre hemorrágica del dengue, dermatitis, condiciones dermatológicas, diabetes, diabetes mellitus, enfermedad ateriosclerótica diabética, enfermedad de cuerpos difusos de Lewy, cardiomiopatía congestiva dilatada, trastornos del ganglio basal, síndrome de Down en la edad madura, trastornos del movimiento inducidos por fármacos que bloquean los receptores de dopamina del CNS, sensibilidad a fármacos, eczema, encefalomielitis, endocarditis, endocrinopatía, epiglotitis, infección por el virus Epstein-Barr, eritromelalgia, trastornos extrapiramidales y del cerebelo, linfohistiocitosis hematofagocítica familiar, rechazo al implante de timo fetal, ataxia de Friedreich, trastornos funcionales de las arterias periféricas, sepsis fúngicas, gangrena gaseosa, úlcera gástrica, nefritis glomerular, rechazo a injertos de cualquier órgano o tejido, sepsis Gram-negativa, sepsis Gram-positiva, granulomas debidos a organismos intracelulares, leucemia de células pilosas, enfermedad de Hallervorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, fiebre del heno, rechazo al trasplante de corazón, hemacromatosis, hemodiálisis, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombocitopénica trombolítica, hemorragia, hepatitis (A), arritmias del haz de His, infección por VIH/neuropatía por VIH, enfermedad de Hodgkin, trastornos de movimientos hiperquinéticos, reacciones de hipersensibilidad, pneumonitis por hipersensibilidad, hipertensión, trastornos de movimientos hipoquinéticos, evaluación del eje hipotalámico-pituitario-adrenal, enfermedad de Addison idiopática, fibrosis pulmonar idiopática, toxicidad mediada por anticuerpos, astenia, atrofia muscular espinal infantil, inflamación de la aorta, influenza a, exposición a radiación ionizante, iridociclitis/uveítis/neuritis óptica, lesiones por reperfusión isquémica, accidente cerebrovascular isquémico, artritis reumatoide juvenil, atrofia muscular espinal juvenil, sarcoma de Kaposi, rechazo al trasplante de riñon, legionella, leishmaniasis, lepra, lesiones del sistema corticoespinal, lipedema, rechazo al trasplante de hígado, linfedema, malaria, linfoma maligno, histiocitosis maligna, melanoma maligno, meningitis, meningococcemia, metabólica/idiopática, migraña cefalea, trastorno mitocondrial multisistémico, enfermedad del tejido conectivo mixto, gammopatía monoclonal, mieloma múltiple, degeneraciones de múltiples sistemas ( encel Dejenne-Thomas Shi-Drager y Machado-Joseph), miastenia grave, Mycobacterium avium intracellulare, Mycobacterium tuberculosis, síndrome mielodiplástico, infarto de miocardio, trastornos isquémicos del miocardio, carcinoma nasofaríngeo, enfermedad pulmonar neonatal crónica, nefritis, nefrosis, enfermedades neurodegenerativas, atrofias musculares neurogénicas I, fiebre neutropénica, linfoma no Hodgkins, oclusión de la aorta abdominal y ramas de ésta, trastornos arteriales oclusivos, terapia okt3, orquitis/epididimitis, procedimientos de reversión de orquitis/vasectomía, organomegalia, osteoporosis, rechazo al trasplante de páncreas, carcinoma pancreático, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia maligna, rechazo al trasplante de paratiroides, enfermedad inflamatoria pélvica, rinitis perenne, enfermedad del pericardio, enfermedad aterosclerótica periférica, trastornos vasculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, neumonía neumocistitis carinii, neumonía, síndrome de POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gammopatía monoclonal y síndrome de cambios de piel), síndrome de postperfusión, síndrome postbomba, síndrome de cardiotomía post- I, preeclampsia, parálisis supranuclear progresiva, hipertensión pulmonar primaria, terapia de radiación, fenómeno y enfermedad de Raynaud, enfermedad de Raynaud, enfermedad de Refsum, taquicardia por QRS estrecho regular, hipertensión renovascular, lesión por reperfusión, cardiomiopatía restrictiva, sarcomas, escleroderma, corea senil, demencia senil de tipo cuerpo de Lewy, artropatías, shock, anemia de células falsiformes, rechazo de aloinjertos de piel, síndrome de cambios de piel, rechazo al trasplante de intestino delgado, tumores sólidos, arritmias específicas, ataxia espinal, degeneraciones espinocerebelosas, miositis estreptococcica, lesiones estructurales del cerebelo, panencefalitis esclerosante subaguda, síncope, sífilis del sistema cardiovascular, anafilaxia sistémica, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, artritis reumatoide juvenil de comienzo sistémico, células T o FAB ALL, telangiectasia, tromboangitis obliterans, trombocitopenia, toxicidad, trasplantes, traumatismo/hemorragia, reacciones de hipersensibilidad tipo III, hipersensibilidad de tipo IV, angina inestable, uremia, urosepsis, urticaria, enfermedades de las válvulas cardiacas, venas varicosas, vasculitis, enfermedades venosas, trombosis venosa, fibrilación ventricular, infecciones virales y fúngicas, encefalitis vital/meningitis aséptica, síndrome hemafagocítico asociado a virus, síndrome Wernicke-Korsakoff, síndrome Wiison, rechazo a xenoinjertos de cualquier órgano o tejido, síndromes coronarios agudos, polineuritis ¡diopática aguda, polirradiculopatía inflamatoria desmielinizante aguda, isquemia aguda, enfermedad de Still del adulto, anafilaxis, síndrome de anticuerpo antifosfolípido, anemia aplásica, eczema atópico, dermatitis atópica, dermatitis autoinmune, trastorno autoinmune asociado con una infección por estreptococo, enteropatía autoinmune, síndrome de pérdida de la audición autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS), miocarditis autoinmune, falla ovárica prematura autoinmune, blefaritis, bronquiectasias, penfigoide bulloso, enfermedad cardiovascular, síndrome antifosfolípido catastrófico, enfermedad celíaca, espondilosis cervical, isquemia crónica, penfigoide cicatrizal, síndrome clínicamente aislado (CIS) con riesgo de esclerosis múltiple, conjuntivitis, trastorno psiquiátrico en la niñez, enfermedad crónica, dacriocistitis, dermatomiositis, retinopatía diabética, diabetes, hernia de disco, prolapso de disco, anemia hemolítica inmune inducida por fármacos, endometriosis, endoftalmitis, episcleritis, eritema multiforme, eritema multiforme mayor, penfigoide gestacional, síndrome de Guillain-Barre (GBS), síndrome de Hughes, enfermedad de Parkinson idiopática, neumonía intersticial idiopática, alergia mediada por IgE, anemia hemolítica inmune, miositis por cuerpos de inclusión, enfermedad inflamatoria infecciosa ocular, enfermedad inflamatoria desmielinizante, enfermedad inflamatoria del corazón, enfermedad inflamatoria del riñón, IPF/UIP, iritis, queratitis, queratoconjuntivitis seca, enfermedad de Kussmaul o enfermedad de Kussmaul-Meier, parálisis de Landry, histiocitosis de las células de Langerhans, Lívido reticularis, poliangitis microscópica con degeneración macular, morbus Bechterev; trastorno neuronal motor, penfigoide de la membrana mucosa, insuficiencia multiorgánica, síndrome mielodisplásico, miocarditis, trastornos de las raíces nerviosas, neuropatía, hepatitis no-A no-B, neuritis óptica, osteolisis, JRA pauciarticular, enfermedad oclusiva arterial periférica (PAOD), enfermedad vascular periférica (PVD), enfermedad arterial periférica (PAD), flebitis, poliarteritis nodosa (o periarteritis nodosa), policondritis, polimialgia reumática, poliosis, JRA Poliarticular, síndrome de deficiencia poliendócrina, polimiositis, polimialgia reumática (P R), síndrome de post- bomba, parkinsonismo primario, cáncer de próstata y rectal y formas malignas hematopoyéticas (leucemia y linfoma), prostatitis, aplasia de glóbulos rojos pura, insuficiencia adrenal primaria, neuromielitis óptica recurrente, restenosis, enfermedad del corazón reumático, SAPHO (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis y osteítis), amiloidosis secundaria, pulmón de shock, escleritis, ciática, insuficiencia adrenal secundaria, enfermedad del tejido conectivo asociada a siliconas, dermatosis de Sneddon-Wilkinson, espondilitis anquilosante, síndrome de Stevens-Johnson (SJS), arteritis temporal, retinitis toxoplásmica, necrólisis epidérmica tóxica, mielitis transversa, TRAPS (síndrome periódico asociado al receptor del factor de necrosis tumoral), reacción alérgica de Tipo 1, diabetes de Tipo II, urticaria, neumonía intersticial usual (UIP), vasculitis, conjuntivitis vernal, retinitis viral, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada (síndrome VKH), degeneración macular húmeda o cicatrización de heridas.

16. El uso de acuerdo con la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en donde el medicamento se formula para una administración por vía parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intraventricular, intracerebelosa, intracerebroventricular, intracolónica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intramiocárdica, intraósea, intrapélvico, intrapericardíaco, intraperitoneal, i ntra pleural, ¡ntraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmica.

17. Un método para determinar l-a presencia, cantidad o concentración de al menos un objetivo o un fragmento de éste en una muestra de prueba con un inmunoensayo, en donde el inmunoensayo comprende poner en contacto la muestra de prueba con al menos una proteína de unión y al menos una marca detectable, en donde al menos una proteína de unión comprende la proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, además comprende: (i) poner en contacto la muestra de prueba con al menos una proteína de unión, en donde la proteína de unión se une a un epitope en el objetivo o en un fragmento de éste, con el fin de formar un primer complejo; (¡i) poner en contacto el complejo con al menos una marca detectable, en donde la marca detectable se une a la proteína de unión, o bien a un epitope en el objetivo o en un fragmento de éste al que no se une la proteína de unión, con el fin de formar un segundo complejo; y (iii) detectar la presencia, cantidad o la concentración del objetivo o del fragmento de éste en la muestra de prueba, sobre la base de la señal generada por la marca detectable en el segundo complejo, en donde la presencia, cantidad o la concentración del objetivo o del fragmento de éste están directamente correlacionadas con la señal generada por la marca detectable.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 17, que además comprende: (i) poner en contacto la muestra de prueba con al menos una proteína de unión, en donde la proteína de unión se une a un epitope en el objetivo o en un fragmento de éste, con el fin de formar un primer complejo; (ii) poner en contacto el complejo con al menos una marca detectable, en donde la marca detectable compite con el objetivo o con un fragmento de éste por la unión a la proteína de unión, con el fin de formar un segundo complejo; y (iii) detectar la presencia, cantidad o la concentración del objetivo o del fragmento de éste en la muestra de prueba, sobre la base de la señal generada por la marca detectable en el segundo complejo, en donde la presencia, cantidad o la concentración del objetivo o del fragmento de éste están indirectamente correlacionadas con la señal generada por la marca detectable.

20. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 - 19, en donde la muestra de prueba es de un paciente y el método: (i) además comprende diagnosticar, pronosticar o evaluar la eficiencia de un tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente, (ii) además comprende modificar el tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente que necesita una mejora de la eficacia; (iii) está adaptado para su uso en un sistema automático o un sistema semiautomático, y/o (iv) determina la presencia, la cantidad o concentración de más de un objetivo en la muestra.

21. Un conjunto de elementos para evaluar la presencia, la cantidad o la concentración de un objetivo, o de un fragmento de éste, el conjunto de elementos comprende: (i) instrucciones para analizar la muestra de prueba para el objetivo o fragmento del mismo, y (ii) al menos una proteína de unión que comprende la proteína de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 2.

22. Una proteína de unión que comprende una primera y una segunda cadena de polipéptido, en donde la primera cadena de polipéptido comprende VD1-(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde; VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada; C es un dominio constante; X1 es un conector con la condición que X1 no sea CH1; X2 es una región Fe, n es O o 1 ; y en donde la segunda cadena de polipéptido comprende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde; VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera; C es un dominio constante; X1 es un conector con la condición que X1 no sea CL; X2 es una región Fe; n es 0 o 1 ; y en donde los dominios VD1 en la primera y la segunda cadena de polipéptidos forman un primer sitio de unión objetivo funcional y los dominios VD2 en la primera y la segunda cadena de polipéptidos forman un segundo sitio de unión objetivo funcional; y en donde la proteína de unión tiene la capacidad de unirse a la IL-13 y a la IL-17, en donde: (i) los dominios variables que forman un sitio de unión objetivo funcional para IL-13 que comprende: tres CDRs de la SEC ID No.: 30 y tres CDRs de la SEC ID No.: 31, tres CDRs de la SEC ID No.: 32 y tres CDRs de la SEC ID No.: 33, o tres CDRs de la SEC ID No.: 34 y tres CDRs de la SEC ID No.: 35; y (ii) los dominios variables que forman un sitio de unión objetivo funcional para IL-17 que comprenden: tres CDRs de la SEC ID No.: 36 y tres CDRs de la SEC ID No.: 37, tres CDRs de la SEC ID No.: 38 y tres CDRs de la SEC ID No.: 39, tres CDRs de la SEC ID No.: 40 y tres CDRs de la SEC ID No.: 41, tres CDRs de la SEC ID No.: 42 y tres CDRs de la SEC ID No.: 52, tres CDRs de la SEC ID No.: 42 y tres CDRs de la SEC ID No.: 53, tres CDRs de la SEC ID No.: 43 y tres CDRs de la SEC ID No.: 50, tres CDRs de la SEC ID No.: 44 y tres CDRs de la SEC ID No.: 51, tres CDRs de la SEC ID No.: 45 y tres CDRs de la SEC ID No.: 54, tres CDRs de la SEC ID No.: 46 y tres CDRs de la SEC ID No.: 51, tres CDRs de la SEC ID No.: 47 y tres CDRs de la SEC ID No.: 54, tres CDRs de la SEC ID No.: 48 y tres CDRs de la SEC ID No.: 51 o tres CDRs de la SEC ID No.: 49 y tres CDRs de la SEC ID No.: 51.

23. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la proteína de unión se une a la IL-13 y a IL-17 con: (i) una IC50 de como máximo 2.442 nM aproximadamente para IL-13 y/o como máximo 0.7034 nM aproximadamente para IL-17, medida con un ELISA de unión directa; (ii) una constante de velocidad (Kon) de al menos 2.10 x 104 M"1s"1 aproximadamente para IL-13 y/o como máximo 6.80 x 103 M"1s"1 aproximadamente para IL-17, medida por resonancia de plasmón superficial; (iii) una constante de velocidad (K0ff) de como máximo 1.40 x 10" s 1 aproximadamente para IL-13 y/o como máximo 1.70 x 10" s"1 aproximadamente para IL-17, medida por resonancia de plasmón superficial; y/o (iv) una constante de disociación (Kd) de como máximo 1.10 x 10" M aproximadamente para IL-13 y como máximo 2.60 x 10"8 M aproximadamente para IL-17, medida por resonancia de plasmón superficial .

24. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 22 o reivindicación 23, en donde la proteína e unión comprende dos primeras cadenas polipeptídicas y dos segundas cadenas polipeptídicas.

25. La proteína de unión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3 o 22 - 24, en donde la proteína de unión comprende: DVD2148H (que comprende las SEC ID No.: 30 y 36) y DVD2148L (que comprende las SEC ID No.: 31 y 37); DVD2149H (que comprende las SEC ID No.: 36 y 30) y DVD2149L (que comprende las SEC ID No.: 37 y 31); DVD2150H (que comprende las SEC ID No.: 30 y 36) y DVD2150L (que comprende las SEC ID No.: 31 y 37); DVD2151H (que comprende las SEC ID No.: 36 y 30) y DVD2151L (que comprende las SEC ID No.: 37 y 31); DVD2152H (que comprende las SEC ID No.: 30 y 36) y DVD2152L (que comprende las SEC ID No.: 31 y 37); DVD2153H (que comprende las SEC ID No.: 36 y 30) y DVD2153L (que comprende las SEC ID No.: 37 y 31); DVD 2154H (que comprende las SEC ID No.: 30 y 38) y DVD2154L (que comprende las SEC ID No.: 31 y 39); DVD2155H (que comprende las SEC ID No.: 38 y 30) y DVD2155L (que comprende las SEC ID No.: 39 y 31); DVD2156H (que comprende las SEC ID No.: 30 y 38) y DVD2156L (que comprende las SEC ID No.: 31 y 39); DVD2157H (que comprende las SEC ID No.: 38 y 30) y DVD2157L (que comprende las SEC ID No.: 39 y 31); DVD2158H (que comprende las SEC ID No.: 30 y 38) y DVD2158L (que comprende las SEC ID No.: 31 y 39) ; DVD2159H (que comprende las SEC ID No.: 38 y 30) y DVD2159L (que comprende las SEC ID No.: 39 y 31); DVD2160H (que comprende las SEC ID No.: 30 y 40) y DVD2160L (que comprende las SEC ID No.: 31 y 41); DVD2161H (que comprende las SEC ID No.: 40 y 30) y DVD2161L (que comprende las SEC ID No.: 41 y 31); DVD2162H (que comprende las SEC ID No.: 30 y 40) y DVD2162L (que comprende las SEC ID No.: 31 y 41); DVD2163H (que comprende las SEC ID No.: 40 y 30) y DVD2163L (que comprende las SEC ID No.: 41 y 31); DVD2164H (que comprende las SEC ID No.: 30 y 40) y DVD2164L (que comprende las SEC ID No.: 31 y 41); DVD2165H (que comprende las SEC ID No.: 40 y 30) y DVD2165L (que comprende las SEC ID No.: 41 y 31) ; DVD2166H (que comprende las SEC ID No.: 32 y 36) y DVD2166L (que comprende las SEC ID No.: 33 y 37); DVD2167H (que comprende las SEC ID No.: 36 y 32) y DVD2167L (que comprende las SEC ID No.: 37 y 33); DVD2168H (que comprende las SEC ID No.: 32 y 36) y DVD2168L (que comprende las SEC ID No.: 33 y 37); DVD2169H (que comprende las SEC ID No.: 36 y 32) y DVD2169L (que comprende las SEC ID No.: 37 y 33); DVD2170H (que comprende las SEC ID No.: 32 y 36) y DVD2170L (que comprende las SEC ID No.: 33 y 37); DVD2171H (que comprende las SEC ID No.: 36 y 32) y DVD2171L (que comprende las SEC ID No.: 37 y 33); DVD2172H (que comprende las SEC ID No.: 32 y 38) y DVD2172L (que comprende las SEC ID No.: 33 y 39); DVD2173H (que comprende las SEC ID No.: 38 y 32) y DVD2173L (que comprende las SEC ID No.: 39 y 33); DVD2174H (que comprende las SEC ID No.: 32 y 38) y DVD2174L (que comprende las SEC ID No.: 33 y 39); DVD2175H (que comprende las SEC ID No.: 38 y 32) y DVD2175L (que comprende las SEC ID No.: 39 y 33); DVD2176H (que comprende las SEC ID No.: 32 y 38) y DVD2176L (que comprende las SEC ID No,: 33 y 39); DVD2177H (que comprende las SEC ID No.: 38 y 32) y DVD2177L (que comprende las SEC ID No.: 39 y 33); DVD2178H (que comprende las SEC ID No.: 32 y 40) y DVD2178L (que comprende las SEC ID No.: 33 y 41); DVD2179H (que comprende las SEC ID No.: 40 y 32) y DVD2179L (que comprende las SEC ID No.: 41 y 33); DVD2180H (que comprende las SEC ID No.: 32 y 40) y DVD2180L (que comprende las SEC ID No.: 33 y 41); DVD2181H (que comprende las SEC ID No.: 40 y 32) y DVD2181L (que comprende las SEC ID No.: 41 y 33); DVD2182H (que comprende las SEC ID No.: 32 y 40) y DVD2182L (que comprende las SEC ID No.: 33 y 41); DVD2183H (que comprende las SEC ID No.: 40 y 32) y DVD2183L (que comprende las SEC ID No.: 41 y 33); DVD2184H (que comprende las SEC ID No.: 34 y 36) y DVD2184L (que comprende las SEC ID No.: 35 y 37); DVD2185H (que comprende las SEC ID No.: 36 y 34) y DVD2185L (que comprende las SEC ID No.: 37 y 35); DVD2186H (que comprende las SEC ID No.: 34 y 36) y DVD2186L (que comprende las SEC ID No.: 35 y 37) ; DVD2187H (que comprende las SEC ID No.: 36 y 34) y DVD2187L (que comprende las SEC ID No.: 37 y 35); DVD2188H (que comprende las SEC ID No.: 34 y 36) y DVD2188L (que comprende las SEC ID No.: 35 y 37); DVD2189H (que comprende las SEC ID No.: 36 y 34) y DVD2189L (que comprende las SEC ID No.: 37 y 35); DVD2190H (que comprende las SEC ID No.: 34 y 38) y DVD2190L (que comprende las SEC ID No.: 35 y 39); DVD2191H (que comprende las SEC ID No.: 38 y 34) y DVD2191L (que comprende las SEC ID No.: 39 y 35); DVD2192H (que comprende las SEC ID No.: 34 y 38) y DVD2192L (que comprende las SEC ID No.: 35 y 39); DVD2193H (que comprende las SEC ID No.: 38 y 34) y DVD2193L (que comprende las SEC ID No.: 39 y 35); DVD2194H (que comprende las SEC ID No.: 34 y 38) y DVD2194L (que comprende las SEC ID No.: 35 y 39); DVD2195H (que comprende las SEC ID No.: 38 y 34) y DVD2195L (que comprende las SEC ID No.: 39 y 35); DVD2196H (que comprende las SEC ID No.: 34 y 40) y DVD2196L (que comprende las SEC ID No.: 35 y 41); DVD2197H (que comprende las SEC ID No.: 40 y 34) y DVD2197L (que comprende las SEC ID No.: 41 y 35); DVD2198H (que comprende las SEC ID No.: 34 y 40) y DVD2198L (que comprende las SEC ID No.: 35 y 41); DVD2199H (que comprende las SEC ID No.: 40 y 34) y DVD2199L (que comprende las SEC ID No.: 41 y 35); DVD2200H (que comprende las SEC ID No.: 34 y 40) y DVD2200L (que comprende las SEC ID No.: 35 y 41); o DVD2201H (que comprende las SEC ID No.: 40 y 34) y DVD2201L (que comprende las SEC ID No.: 41 y 35).