MXPA04004671A - Anticuerpos anti-interleucina-6, composiciones, metodos y usos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 quimerico, humanizado o con injerto de CDR novedoso, derivado del anticuerpo CLB-8 de murino, que incluye acidos nucleicos aislados que codifican por lo menos uno de dicho anticuerpo anti-IL-6, vectores, celulas hospederas, animales transgenicos o plantas, y metodos de elaboracion y uso de los mismos, incluyendo composiciones terapeuticas, metodos y dispositivos.

Description

ANTICUERPOS ANTI-INTERLEUCINA-6, COMPOSICIONES, METODOS Y USOS ANTECEDENTES DE LA INVENCION CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a anticuerpos, que incluyen porciones o variantes especificadas, específicos para por lo menos una proteína de interleucina-6 (IL-6 también conocida como Interferón ß2)) o fragmento de la misma, así como ácidos nucleicos que codifican dichos anticuerpos anti-IL-6, ácidos nucleicos complementarios, vectores, células hospederas, y métodos de elaboración y uso de los mismos, que incluyen formulaciones terapéuticas, administración y dispositivos.

TECNICA RELACIONADA lnterleucina-6 (IL-6) es una cítocina pro-inflamatoria que se produce a través de muchos tipos de células diferentes. In vivo, los monocitos estimulados, fibroblastos, y células endoteliales representan las fuentes principales de IL-6. Otras células tales como macrófagos, linfocitos T y B granulocitos, queratinocitos, células mastoideas, osteoblastos, condrocitos, células gliales, y células de músculo liso también producen IL-6 después de estimulación (Kishimoto, t., Bloód 74:1-10 (1989) y Kurihara, N. et al., J. Immulogy 144:226-4230 (1990)). Varias células tumorales también producen IL-6 (Smith, P.C. et al Cytokine and Growth Factor Reviews 12:33-40 (2001 )) y recientemente se indicó que IL-6 es un factor de pronóstico para progresión de cáncer de próstata (Nakashima, J. et al. Clinical Cáncer Research 6:2707-2706 (2000)). La producción de IL-6 puede ser regulada por la propia IL-6 y dependiendo del tipo de célula, IL-6 puede estimular o inhibir su propia síntesis. IL-6 se puede unir al receptor de IL-6 expresado en células B, T, activadas por mitógeno, monocitos periféricos y cierto tumores (Ishimi, Y. et al., J. Immunology 145:3297-3303 (1990)). El receptor de IL-6 tiene al menos dos formas diferentes y está compuesto de una cadena alfa llamada gp80 que es responsable de unión a IL-6 y una cadena beta designada gp130 que es necesaria para transducción de señal (Adebanjo, O. et al., J. Cell Biology 142:1347-1356 (1998) y Poli, V. et al., EMBO 13:1 189-1 196 (1994)). La familia citocina que incluye IL-6, LIF, Oncostatina M, IL-1 1 , CNTF, y CT-1 tienen todas la subunidad gp130 en sus receptores. Además, todos lo miembros de la familia citocina de IL-6 pueden inducir expresión hepática de proteínas de fase aguda. (Bellido, T. et al., J. Clin Investigation 97-431-437 (1996)), 8790790. Existen por lo menos dos funciones biológicas principales de IL-6: mediación de proteínas de fase aguda y desempeño como un factor de diferenciación y activación (Avvisti, G. et al., Baillieres Clinical Hematology 8:815-829 (1995) y Poli, V. ét ai., EMBÓ 13:1 189-1 196 (1994)). Las proteínas de fase aguda son conocidas por regular respuestas inmunes, mediar inflamación, y desempeñar un papel en remodelación de tejido. Como un factor de diferenciación y activación, IL-6 induce a las células B a diferenciar y secretar anticuerpo, induce a las células T a diferenciarse en células T citotóxicas, activa factores de señalización celular y promueve hematopoyesis (Ishimi, Y. et al., J. immunology 145:3297-3303 (1990)). IL-6 está principalmente involucrada en muchas funciones y procesos corporales críticos. Como resultado, los procesos fisiológicos que incluyen metabolismo óseo, transformación neoplástica, y respuestas inmunes e inflamatorias pueden ser mejoradas, suprimidas o evitadas a través de la manipulación de la actividad biológica de IL-6 in vivo por medio de un anticuerpo (Adebanjo, O. et al., J. Cell Biology 142:1347-1356 (1998)). Estudios recientes han indicado que un Mab para IL-6 puede inhibir crecimiento in vivo de tumores de próstata (Smith, P.C. y Keller, E.T., The prostate in press and Okamoto, M. et al., Cáncer Research 57:141 -146 (1997) y carcinoma renal (Weissglas, M. et al., The Journal of Urology 153:554-557 (1995). Además de un efecto directo el crecimiento tumoral, el bloqueo de la producción de IL-6 también puede quimiosensibilizar y mejorar la eficacia citotóxica (Smith, P.C. et al. Cytokine and Growth Factor Reviews 12:33-40 (2001 )). Colectivamente, la literatura enseña que el bloqueo de la actividad de IL-6 puede inhibir degradación ósea, crecimiento tumoral y caquexia por cáncer.

La inmunotérápia pasiva que emplea anticuerpos no humanos, policlonales (por ejemplo, anti-sueros) o monoclonales (Mabs) y fragmentos de los mismos (por ejemplo, productos de digestión proteolítica de los mismos) son agentes terapéuticos potenciales que están siendo desarrollados como tratamiento para diversas enfermedades. Sin embargo, se sabe que los anticuerpos compuestos de porciones no humanas producen una respuesta inmune cuando se administran a humanos. Esta respuesta inmune con frecuencia hace que la administración de anticuerpos repetida no sea adecuada para terapia y puede dar como resultado una depuración mediada por complejo inmune de los anticuerpos de circulación, reduciendo así el beneficio terapéutico a los pacientes. Los ejemplos de condiciones que pueden ser atribuidas a la administración repetida de anticuerpos compuestos de porciones no humana son enfermedad del suero y anafilaxis. En un intento por evitar estos y otros problemas, se han realizado un número de métodos que incluyen la quimerización y "humanización" para reducir la ¡nmunogenicidad de los anticuerpos/fragmentos de los mismos. Estos métodos han producido anticuerpos que tienen una ¡nmunogenicidad reducida. Estos anticuerpos sustancialmente son de origen humano, solamente con las regiones de determinación de complementariedad (CDR) y ciertos residuos de armazón que influyen en la conformación de CDR siendo de origen no humano. Por lo tanto, anticuerpos monoclonales de humano o humanizados novedosos son particularmente útiles solos o en combinación con moléculas existentes para usos inmunoterapéuticos. En consecuencia, existe la necesidad de proveer anticuerpos neutralizantes de alta afinidad, quiméricos o humanos para IL-6 o fragmentos de los mismos que superen uno o más de estos problemas, así como mejoras sobre anticuerpos conocidos o fragmentos de los mismos para uso en condiciones de prevención, tratamiento, mejora, o diagnóstico relacionadas con la IL-6. Los anticuerpos monoclonales de murino para IL-6 producidos a partir de una línea celular de hibridoma se conocen por ejemplo en la patente de E.U.A 5,618,700. La patente de E.U.A. 5,856,135 describe anticuerpos de humano reconfigurados para IL-6 humano derivado de un anticuerpo monoclonal de ratón SK2, en el cual las regiones de determinación de complementariedad (CDR) de la región variable del anticuerpo de ratón SK2 son transplantadas a la región variable de un anticuerpo de humano y unidas a la región constante de un anticuerpo de humano. Los anticuerpos monoclonales neutralizantes para IL-6 se pueden dividir en dos grupos: con base en el reconocimiento de dos epítopes distintos en la molécula de IL-6 designada Sitio I y Sitio II. El sitio I es un epítope conformacional designado gp130 compuesto de porciones amino terminal y carboxi terminal de la molécula de IL-6. El sitio II, designado SIL6R, incluye los aminoácidos críticos para actividad (Brakenhoff et al. J. Immunol. (1990) (145:561 ).

Un anticuerpo monoclonai dé IL-6 de murino se refiere como CLB-8 el cual tiene alta afinidad y el cual se une al epítope gp130 de sitio I (Brakenhoff et al supra). Sin embargo, como se describe anteriormente, el anticuerpo de murino es altamente inmunogénico en humano y por lo tanto, su valor terapéutico está limitado. De esta forma, existe una necesidad continua de anticuerpos para IL-6 que exhiban alta afinidad y un perfil farmacéutico favorable.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención provee anticuerpos anti-IL-6 quiméricos aislados, humanizados y/o con injerto de CDR, que tiene por lo menos una región de unión a antígeno derivada del anticuerpo anti-IL-6 CLB-8 de alta afinidad, así como composiciones de anticuerpo anti-IL-6, ácidos nucleicos que codifican o que son complementarios, vectores, células hospederas, composiciones, formulaciones, dispositivos, animales transgénicos, plantas transgénicas relacionadas con los mismos, y método para hacer y utilizar los mismos, como se describe y se permite en la presente, y combinación con lo que se conoce en la técnica. El anticuerpo de la invención específicamente neutraliza IL-6 humano con alta afinidad. La presente invención provee por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 CLB-8 quimérico aislado, humanizado o con injerto de CDR ("anticuerpo cCLB-8") como se describe en la presente. El anticuerpo cCLB-8 de acuerdo con la presente invención incluye cualquier molécula de péptido o proteína que comprende por lo menos una región de determinación de complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una porción de unión a ligando de la misma, derivada del anticuerpo monoclonal CLB-8 de murino, en combinación con una región constante de cadena pesada o de cadena ligera, una región de armazón o cualquier porción de la misma, que puede ser incorporada en un anticuerpo de la presente invención. En una modalidad, la invención se refiere a un anticuerpo anti-IL-6 quimérico que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, cada una de las cadenas comprende por lo menos parte de una región constante de humano y por lo menos parte de una región variable (v) derivada del anticuerpo monoclonal cCLB-8 de murino que tiene especificidad a IL-6 de humano, dicho anticuerpo se une con alta afinidad a un epitope inhibidor y/o neutralizante de IL-6 de humano, tal como el anticuerpo cCLB-8. La invención también incluye fragmentos o un derivado de dicho anticuerpo, tal como una o más porciones de la cadena de anticuerpo, tal como las regiones de diversidad o variables de unión, constantes de cadena pesada, o las regiones de unión o variables constantes de cadena ligera. En un aspecto, la presente invención provee moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden, que son complementarias o que hibridan a un polinucleótido que codifica los anticuerpos anti-IL-6 específicos antes mencionados que comprende por lo menos una secuencia, dominio, porción o variante especificados de los mismos. La presente invención provee además vectores recombinantes qué comprenden dichas moléculas de ácido nucleico de anticuerpo anti-IL-6, células hospederas que contienen dichos ácidos nucleicos y/o vectores recombinantes, asi como métodos para hacer y/o utilizar dichos ácidos nucleicos de anticuerpo, vectores y/o células hospederas. Por lo menos un anticuerpo de la invención se une por lo menos a un epítope determinado especifico para al menos una proteína de IL-6, subunidad, fragmento, porción o cualquier combinación de los mismos. Por lo menos un epítope puede comprender al menos una región de unión a anticuerpo que comprende al menos una porción de dicha proteína, epítope el cual de preferencia está conformado de al menos 1 -5 aminoácidos de por lo menos una porción del mismo, como por ejemplo sin límite, por lo menos un dominio funcional, extracelular, soluble, hidrófilo, externo o citoplásmico de dicha proteína, o cualquier porción de la misma. Por lo menos el anticuerpo puede comprender al menos una porción especificada de por lo menos una región de determinación de complementariedad (CDR) (por ejemplo, CDR1 , CDR2 o CDR3 de la región variable de cadena pesada o ligera) derivada del anticuerpo monoclonal CLB-8 de murino, y/o por lo menos una región de armazón constante o variable o cualquier porción de la misma. Por lo menos la secuencia de aminoácidos de anticuerpo puede opcionalmente comprender además por los menos una sustitución, inserción o deleción especificada como se describe en la presente o como se conoce en la técnica.

Los anticuerpo preferidos de la presente invención incluyen aquellos anticuerpos quiméricos, humanizados y/o con injerto de CDR que competitivamente inhibirán la unión in vivo a IL-6 de humano de CLB-8 de murino anti-IL-6, anti-IL-6 CLB-8 quimérico, o un anticuerpo que tenga subtancialmente las mismas características de unión, así como fragmentos y regiones del mismo. Los anticuerpos preferidos de la presente invención son aquellos que unen epítopes reconocidos por CLB-8 y cCLB-8, los cuales se incluyen en el epítope gp130 de sitio 1. Los métodos preferidos para determinar la especificidad y afinidad de anticuerpo monoclonal mediante inhibición competitiva se pueden encontrar en Harlow, et al, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), incorporada como referencia a la presente solicitud. La presente invención provee además por lo menos un anticuerpo anti-idiotipo de IL-6 para al menos un anticuerpo cCLB-8 anti-IL-6 de la presente invención. El anticuerpo anti-idiotipo incluye cualquier proteína o péptido que contiene moléculas que comprenden por lo menos una porción de una molécula de inmonoglobulina, como por ejemplo, sin límite, por lo menos una región de determinación de complementariedad (CDR) o de una porción de unión de ligando o de cadena pesada o ligera de la misma, una región variable de cadena pesada o de cadena ligera, una región constante de cadena pesada o de cadena ligera, una región de armazón, o cualquier porción de la misma que se puede incorporar en un anticuerpo anti-idiotipo al anticuerpo de la presente invención. Un anticuerpo anti-idiotipo de la invención puede incluir o derivarse de cualquier mamífero, como por ejemplo de humano, un ratón, un conejo, un roedor, un primate, y similares. La presente invención provee en un aspecto, moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden, que son complementarias, o que hibridan a un polinucleótido que codifica por lo menos un anticuerpo anti-idiotipo de IL-6, que comprende al menos una secuencia, dominio, porción o variante especificados del mismo. La presente invención provee además vectores recombinantes que comprenden dicho anticuerpo anti-idiotipo de IL-6 que codifica moléculas de ácido nucleico, células hospederas que contienen dichos ácidos nucleicos y/o vectores recombinantes, así como métodos para hacer y/o utilizar dichos ácidos nucleicos de anticuerpo anti-idiotipo, vectores y/o células hospederas. La presente invención también provee por lo menos un método para expresar al menos un anticuerpo anti-IL-6 antes mencionado, o anticuerpo anti-idiotipo de IL-6 en un célula hospedera, que comprende cultivar una célula hospedera como se describe en la presente, bajo condiciones en donde al menos un anticuerpo anti-IL-6 se expresa en cantidades detectables y/o recuperables. La presente invención también provee por lo menos una composición que comprende (a) un anticuerpo anti-IL-6 cCLB-8 asilado que codifica ácido nucleico y/ó anticuerpo como^ se describe en la presente; y (b) un vehículo o diluyente adecuado. El vehículo o diluyente puede opcionalmente ser farmacéuticamente aceptable, de acuerdo con vehículos o diluyentes conocidos. La composición opcionalmente puede comprender además por lo menos otro compuesto, proteina o composición. La presente invención provee además un método o composición de anticuerpo anti-IL-6 cCLB-8, para administrar una cantidad terapéuticamente efectiva para modular o tratar al menos una condición relacionada con IL-6 en una célula, tejido; órgano, animal o paciente y/o, antes, después o durante una condición relacionada, como se conoce en la técnica y/o como se describe en la presente .! La presente invención provée además por lo menos una composición, dispositivo y/o método de suministro de una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 cCLB-8, de acuerdo con la presente invención. ; Í La presente invención provee adicionalmente al menos un método o composición de anticuerpo anti-IL-6 cCLB-8, para diagnosticar por lo menos una condición relacionada con IL-6 en una célula, tejido, órgano, animal o paciente y/o antes, después o durante una condición relacionada como se conoce en la técnica y/o como se describe en la presente. La presente invención prove;e también por lo menos una composición .dispositivo y/o método de suministro para diagnóstico de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6, de acuerdo cón la presente invención.

En un aspecto, la presente invención provee al menos un anticuerpo anti-IL-6 cCLB-8 de mamífero aislado, que comprende al menos una región variable que comprende SEQ ID NO:7 u 8. En otro aspecto, la presente invención provee por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 cCLB-8 de mamífero aislado, que comprende (i) todas las secuencias de aminoácidos de regiones de determinación de complementariedad (CDR) de cadena pesada de SEQ ID NOS: 1 , 2, y 3; o (ii) todas las secuencias de aminoácidos de CDR de cadena ligera de SEQ ID NOS: 4, 5, y 6. En otro aspecto, la presente invención provee al menos un anticuerpo anti-IL-6 cCLB-8 de mamífero aislado, que comprende al menos una CDR de cadena pesada o de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de por lo menos una de SEQ ID NOS: 1 , 2, 3, 4, 5, ó 6. En otro aspecto, la presente invención provee al menos un anticuerpo anti-IL-6 cCLB-8 de mamífero aislado, que comprende al menos una CDR de humano, en donde el anticuerpo específicamente se une a por lo menos un epítope que comprende al menos 1 -3 aminoácidos de la IL-6 de humano. Por lo menos un anticuerpo puede opcionalmente unirse a IL-6 con una afinidad (Kd) de por lo menos 10"9M, preferiblemente por lo menos 10" 10M, y/o sustancialmente neutralizar por lo menos una actividad de al menos una proteína de IL-6. En una modalidad preferida, el anticuerpo se une a IL-6 con una afinidad (Kd) de por lo menos 1 x 10"11 M, preferiblemente 4 x 10"11 y neutraliza IL-6 humana. De preferencia, el anticuerpo no se une a otros miembros de la superfamilia de IL-6 y bloquea la trans-señalización de GP130. También se provee un ácido nucleico asilado que codifica al menos un anticuerpo anti-IL-6 cCLB-8 de mamífero aislado, un vector de ácido nucleico aislado que comprende el ácido nucleico aislado, y/o una célula hospedera procarióntica o eucarióntica que comprende el ácido nucleico aislado. La célula hospedera opcionalmente puede ser al menos una seleccionada de COS- , COS-7, HEK293, BHK21 , CHO, BSC-1 , Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, mieloma, o células de linfoma, o cualquier derivado, célula inmortalizada o transformada de las mismas. También se provee un método para producir al menos un anticuerpo anti-IL-6 cCLB-8 que comprende traducir el anticuerpo que codifica el ácido nucleico bajo condiciones in vitro, in vivo o in situ, para que el anticuerpo IL-6 se exprese en cantidades detectables o recuperables. Se provee además una composición que comprende al menos un anticuerpo anti-IL-6 cCLB-8 quimérico aislado y por lo menos un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender opcionalmente una cantidad efectiva de por lo menos un compuesto o proteína seleccionado de al menos una marca detectable o reportero, un antagonista TNF, un antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (NSAID), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antisoriático, un corticosteroide, un esteroide anabólico, una eritropoietina, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un fármaco de reemplazo hormonal, un radiofarmacéutico, un antidepresivo, un antisicótico, un estimulante, un medicamento asmático, un agonista beta, un esteroide inhalado, una epinefrina o análogo de epinefrina, una citocina, o un antagonista de citocina. La presente invención provee además un anticuerpo anti-idiotipo o fragmento que específicamente se une al menos a un anticuerpo anti-IL-6 cCLB-8 aislado de la presente invención. También se provee un método para diagnosticar o tratar una condición relacionada con IL-6 en una célula, tejido, órgano o animal, que comprende poner en contacto o administrar una composición que comprende una cantidad efectiva de al menos un anticuerpo anti-IL-6 cCLB-8 aislado de la invención con o hacia la célula, tejido, órgano o animal. El método puede comprender opcionalmente utilizar una cantidad efectiva de 0.001 -50 mg/kilogramo de las células, tejido, órgano o animal. El método puede comprender además opcionalmente utilizar la puesta en contacto o la administración al menos mediante un modo seleccionado de parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intraarticular, ¡ntrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intracelial, ¡ntracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocardial, intraosteal, intrapélvico, intrapericardiaco, intraperitoneal, intrapleural, i ntra prostético, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, en bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, o transdérmico. Opcionalmente, el método también puede comprender además administrar antes, de manera concurrente o después del anticuerpo poniendo en contacto o administrando por lo menos una composición que comprende una cantidad efectiva de al menos un compuesto o proteína seleccionada de al menos uno de una marca detectable o reportero, un antagonista TNF, un antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (NSAID), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antisoriático, un corticosteroide, un esteroide anabólico, una eritropoietina, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un fármaco de reemplazo hormonal, un radiofarmacéutico, un antidepresivo, un antisicótico, un estimulante, un medicamento asmático, un agonista beta, un esteroide inhalado, una epinefrina o análogo de epinefrina, una citocina, o un antagonista de citocina. También se provee un dispositivo médico, que comprende al menos un anticuerpo anti-IL-6 de mamífero aislado de la invención, en donde el dispositivo es conveniente para poner en contacto o administrar por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 al menos a través de un modo seleccionado de parenteral, subcutáneos, intramuscular, intravenoso, ¡ntraarticular, intrabronquíal, ¡ntraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, ¡ntracólico, intracervical, ¡ntragástrico, ¡ntrahepático, ¡ntramiocardial, intraosteal, ¡ntrapélvico, intrapericardiaco, ¡ntraperitoneal, intrapleural, ¡ntraprostático, intrapulmonar, ¡ntrarrectal, ¡ntrarrenal, intraespinal, ¡ntrasinovial, ¡ntratorácico, intrauterino, intravesical, en bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, o transdérmico. También se provee un artículo de fabricación para uso farmacéutico o de diagnóstico en humanos, que comprende material de empaquetamiento y un contenedor que comprende una solución o una forma liofilizada de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 de mamífero aislado de la presente invención. El artículo de fabricación puede comprender opcionalmente tener el contenedor como un componente de un dispositivo o sistema de suministro parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, ¡ntracólico, intracervical, ¡ntragástrico, ¡ntrahepático, ¡ntramiocardial, intraosteal, ¡ntrapélvico, intrapericardiaco, ¡ntraperitoneal, intrapleural, ¡ntraprostático, intrapulmonar, ¡ntrarrectal, ¡ntrarrenal, intraespinal, ¡ntrasinovial, ¡ntratorácico, intrauterino, intravesical, en bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, o transdérmico. Se provee además un método para producir al menos un anticuerpo anti-IL-6 aislado de la presente invención, que comprende proveer una célula hospedera o animal transgénico o planta transgénica o célula vegetal capaz de expresar en cantidades recuperables el anticuerpo. Se provee además en la presente invención al menos un anticuerpo anti-IL-6 producido a través del método anterior. La presente invención provee adicionalmente cualquier invención descrita en la presente.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una gráfica que muestra la unión de cCLB8 a IL-6 recombinante de humano. La figura 2 es una gráfica que muestra la inhibición de secreción murina de IgM mediada por IL-6 a partir de células SKW6.4 mediante cCLB8. La figura 3 es una gráfica que muestra la inhibición de producción de MCP-1 mediada por IL-6 mediante cCLB8. La figura 4 es una imagen de un western blot que muestra la inhibición de cCLB8 de señalización de IL-6 en células de leucemia monocíticas de humano THP-1. La figura 5 es una gráfica que muestra la inhibición por parte de cCLB8 de producción de amiloide A de suero inducida por IL-6 a partir de células HepG2. La figura 6 es una gráfica que muestra la capacidad de cCLB8 para neutralizar proliferación celular inducida por rhlL-6.

La figura 7 es una gráfica que muestra la reducción relativa en pérdida de peso corporal de hospedero en ratones que portan tumores humanos tratados con anticuerpo de IL-6 anti-humano y anti-ratón. La figura 8A-G es una gráfica que muestra los perfiles de estudio de inhibición de suero de 7 anticuerpos anti-idiotipo. La figura 9 es una gráfica que muestra la inhibición de unión de cCLB8 a IL-6 de humano mediante anti-id Mabs. La figura 10 es una gráfica que muestra la unión anti-id a cCLB-8 preunido a IL-6 de humano.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención provee anticuerpos anti-IL-6 aislados, recombinantes y/o sintéticos quiméricos, humanizados o con injerto de CDR que tienen al menos una región de unión a antígeno derivada del anticuerpo CLB-8 y anticuerpos anti-idiotipo de IL-6 de los mismos, asi como composiciones y moléculas de ácido nucleico de codificación que comprenden al menos un polinucleótido que codifica al menos dicho anticuerpo anti-IL-6 o anticuerpo anti-idiotipo. La presente invención incluye además, pero no se limita a métodos para hacer y utilizar dichos ácidos nucleicos y anticuerpos y anticuerpos anti-idiotipo, que incluyen composiciones de diagnóstico y terapéuticas, métodos y dispositivos.

Como se utiliza en la presente, un anticuerpo "anti-interleucina-6 CLB-8", "anticuerpo anti-IL-6 CLB-8", "porción de anticuerpo anti-IL-6 CLB-8", o "fragmento de anticuerpo anti-IL-6 CLB-8" y/o "variante de anticuerpo anti-IL-6 CLB-8" y similares incluyen cualquier proteína o péptido que contiene molécula que comprende al menos una porción de una molécula de inmunoglobulina, que contiene por lo menos una región de determinación de complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una porción de unión a ligando del mismo derivado del anticuerpo monoclonal CLB-8 de mu no en combinación con una región variable de cadena pesada o de cadena ligera, una región constante de cadena pesada o de cadena ligera, una región de armazón, o cualquier porción de la misma, que puede ser incorporada en un anticuerpo de la presente invención. Dicho anticuerpo afecta opcionalmente además un ligando específico, como por ejemplo, sin límite, en donde dicho anticuerpo modula, disminuye, incrementa, antagoniza, agoniza, mitiga, alivia, bloquea, inhibe, suprime y/o interfiere con por lo menos una actividad o unión de IL-6, o con actividad o unión del receptor de IL-6, in vitro, in situ y/o in vivo. Como un ejemplo no limitativo, un anticuerpo anti-IL-6 adecuado, porción o variante especificada de la presente invención se puede unir con alta afinidad a un epítope inhibidor y/o neutralizante de IL-6 de humano. Un anticuerpo anti-IL-6 adecuado, porción especificada, o variante también puede opcionalmente afectar por lo menos una de actividad o función de IL-6, tal como por ejemplo sin límite, síntesis de proteína, ARN o ADN, liberación de IL-6, señalización del receptor de IL-6, rompimiento de IL-6 de membrana, actividad de IL-6, producción y/o síntesis de IL-6. El término "anticuerpo" pretende además abarcar anticuerpos, fragmentos de digestión, porciones y variantes especificados de los mismos, que incluyen imitadores de anticuerpo o que comprenden porciones de anticuerpos que imitan la estructura y/o función de un anticuerpo o fragmento o porción especificada del mismo, que incluye anticuerpos y fragmentos de cadena sencilla de los mismos; cada uno contiene por lo menos una CDR derivada del anticuerpo monoclonal CLB-8. Los fragmentos funcionales incluyen fragmentos de unión a antígeno que se unen a una IL-6 de mamífero. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo capaces de unión a IL-6 o porciones de la misma, que incluyen pero no se limitan a fragmentos de Fab (por ejemplo, mediante digestión de papaína), Fab' (por ejemplo, mediante digestión de pepsina y reducción parcial) y F(ab' )2 (por ejemplo, mediante digestión de pepsina), facb (por ejemplo, mediante digestión de plasmina), pFc' (por ejemplo, mediante digestión de pepsina o plasmina), Fd (por ejemplo, mediante digestión de pepsina, reducción parcial y reagregación), Fv o scFv (por ejemplo, mediante técnicas de biología molecular), están abarcados en la invención (véase por ejemplo Colligan, Immunology, supra). Dichos fragmentos pueden ser producidos mediante rompimiento enzimático, técnicas sintéticas o recombinantes, como se conoce en la técnica y/o como se describe en la presente. Los anticuerpos también se pueden producir en una variedad de formas truncadas utilizando genes de anticuerpo en los cuales uno o más codones de detención han sido introducidos corriente arriba del sitio de detención natural. Por ejemplo, un gen de combinación que codifica una porción de cadena pesada de F(ab')2 puede ser diseñado para incluir secuencias de ADN que codifican el dominio CHi y/o región de articulación de la cadena pesada. Las diversas porciones de anticuerpos pueden ser unidas químicamente a través de técnicas convencionales, o pueden ser preparadas como una proteína contigua utilizando técnicas de ingeniería genética. De acuerdo con la invención, se proveen anticuerpos quiméricos o humanizados en donde las CDR se derivan del anticuerpo CLB-8 de murino capaz de unirse a IL-6 de humano y por lo menos una porción, o el resto del anticuerpo se deriva de uno o más anticuerpos de humano. De esta manera, la parte humana del anticuerpo puede incluir el armazón, dominios CL, CH (por ejemplo CH1 , CH2, CH3), regiones de articulación (VL, VH)) las cuales son sustancialmente no inmunogénicas en humanos. Como se utiliza en la presente, anticuerpos "quiméricos" o anticuerpos "humanizados" o "con injerto de CDR" incluyen cualquier combinación de las CDR de murino antes descritas con una o más proteínas o péptidos derivados de un anticuerpo de humano. Las regiones del anticuerpo que se derivan de anticuerpos de humano no, necesitan tener 100% de identidad con anticuerpos de humano. En una modalidad preferida, la mayor parte de residuos de aminoácidos humanos posibles son retenidos para que la inmunogenicidad sea insignificante, pero los residuos humanos pueden ser modificados según sea necesario para soportar él sitio cié unión a antígéno formado por las CDR y al mismo tiempo maximizar de manera simultánea la humanización del anticuerpo. Dichos cambios o variaciones opcionalmente y preferiblemente retienen o reducen la inmunogenicidad en humanos u otras especies relativas a anticuerpos no modificados. Se señala que un anticuerpo humanizado puede ser producido a través de una célula procarióntica o eucarióntica o animal no humano, que es capaz de expresar de manera funcional genes de inmunoglobulina humana redispuesta (por ejemplo, cadena pesada y/o cadena ligera). Además, cuando el anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla, puede comprender un péptido enlazador que no se encuentra en anticuerpos de humano puros. Por ejemplo, un Fv puede comprender un péptido enlazador, tal como dos a aproximadamente ocho residuos de glicina y otro aminoácido, que se conecta con la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera. Dichos péptidos enlazadores se consideran de origen humano. Los anticuerpos biespecíficos, heteroespecíficos, heteroconjugados o similares también se pueden utilizar que son anticuerpos monoclonales, humanizados, que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En este caso, una de las especificidades de unión es para al menos una proteína de IL-6, la otra es para cualquier otro antígeno. Los métodos para hacer anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada- cadena ligera de ¡nmunogloBüÜhá, en donde las* dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature 305:537 (1983)). Debido a la clasificación aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales solamente una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, la cual normalmente se realiza a través de pasos de cromatografía de afinidad, es más bien difícil de manejar, y los resultados de producción son bajos. Se describen procedimientos similares por ejemplo en WO 93/08829, patentes de E. U. A. Nos. 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker et al., EMBO J. 10:3655 (1991 ), Suresh et al., Methods in Enzimology 121 :210 (1986), cada uno incorporado completamente a la presente como referencia. Los anticuerpos anti-IL-6 CLB-8 útiles en los métodos y composiciones de la presente invención están caracterizados por unión de alta afinidad a IL-6 y opcional y preferiblemente tienen baja toxicidad. En particular, es útil en la presente invención un anticuerpo, fragmento o variante especificado de la invención, en donde los componentes individuales, tales como la región variable, región constante y armazón, de manera individual y/o colectiva, opcional y preferiblemente poseen baja inmunogenicidad. Los anticuerpos que pueden ser utilizados en la invención están opcionalmente caracterizados por su capacidad para tratar pacientes durante períodos extendidos con alivio de síntomas mensurables y baja y/o aceptable toxicidad. La baja o aceptable inmunogenicidad y/o alta afinidad, así como otras propiedades adecuadas, pueden contribuir a los resultados terapéuticos obtenidos. "Baja inmunogenicidad" se define en la presente como elevar respuestas significativas de HAHA, HACA o HAMA en menos de aproximadamente 75%, o preferiblemente menos de aproximadamente 50% de los pacientes tratados y/o elevar títulos bajos en el paciente tratado (menos de aproximadamente 300, preferiblemente menos de aproximadamente 100 medidos con un inmunoensayo de enzima de antígeno doble) (Elliot et al., Lancer 344: 1 125-1 127 (1994), completamente incorporada a la presente como referencia).

Utilidad Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención se pueden utilizar para producción de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 o variante especificada del mismo, que puede ser utilizada para medir un efecto en una célula, tejido, órgano o animal (incluyendo mamíferos y humanos), para diagnosticar, monitorear, modular, tratar, aliviar, ayudar a prevenir la incidencia de, o reducir los síntomas de, por lo menos una condición de IL-6, seleccionada pero no limitada a por lo menos una de un trastorno o enfermedad inmune, un trastorno o enfermad cardiovascular, un trastorno o enfermedad infecciosa, maligna y/o neurológica, un trastorno o enfermedad alérgica; un trastorno o enfermedad de la piei; un trastorno o enfermedad hematológica, y/o un trastorno o enfermedad pulmonar, u otra condición relacionada con IL-6 conocida o especificada. Dicho método puede comprender administrar una cantidad efectiva de una composición o una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo anti-IL-6 a una célula, tejido, órgano, animal o paciente en necesidad de dicha modulación, tratamiento, alivio, prevención, o reducción en síntomas, efectos o mecanismos. La cantidad efectiva puede comprender una cantidad de aproximadamente 0.001 a 500 mg/kg por administración sencilla (por ejemplo, bolo), múltiple o continua, o para obtener una concentración en suero de 0.01-5000 µg/ml de concentración en suero por administración sencilla, múltiple o continua, o cualquier escala o valor efectivo en la presente, como se realiza y se determina utilizando métodos conocidos, como se describe en la presente o como se conoce en la técnica relevante.

Citas Todas las publicaciones o patentes aquí citadas se incorporan completamente a la presente como referencia ya que muestran el estado de la técnica al momento de la presente invención y/o proveen una descripción y habilitación de la presente invención. Las publicaciones se refieren a cualquier publicación científica o de patente, o cualquier otra información disponible en cualquier formato de medios, incluyendo formatos grabados, electrónicos o impresos. Las siguientes referencias se incorporan completamente a la presente como referencia: Ausubel, et al. ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001 ); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lañe, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc. NY (1994-2001 ); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001 ).

Anticuerpos de la presente invención De acuerdo con la presente invención, el anticuerpo anti-IL-6 CLB-8 quimérico es un anticuerpo en el cual la región variable o CDR se derivan del anticuerpo CLB-8 de murino capaz de unirse y de inhibir la función de IL-6 de humano y el armazón y regiones constantes del anticuerpo se derivan de uno o más anticuerpos de humano. La región variable o CDR derivados del anticuerpo CLB-8 de murino, de preferencia tienen de aproximadamente 90% a aproximadamente 100% de identidad con la región variable o CDR del anticuerpo CLB-8 de murino, aunque cualquier y toda modificación, incluyendo sustitución, inserción y deleción, se contemplan siempre que el anticuerpo quimérico mantenga la capacidad de unirse y de inhibir el factor de tejido. Las regiones de los anticuerpos quiméricos, humanizados o con injerto de CDR que se derivan de anticuerpos de humano no necesitan tener 100% de identidad con los anticuerpos de humano. En una modalidad preferida, la mayor parte de los residuos de aminoácido de humano posible se retienen para que la inmunogenicidad sea insignificante, pero los residuos de humanos, en particular residuos de la región de armazón, son sustituidos según se requiera y como se presenta a continuación de acuerdo con la presente invención. Dichas modificaciones se describen en la presente según sea necesario para soportar el sitio de unión a antígeno formado por las CDR y al mismo tiempo maximizar de manera simultánea la humanización del anticuerpo. El anticuerpo monoclonal de murino CLB-8 contra IL-6 de humano a partir del cual se puede derivar la región variable o CDR se conoce en la técnica (Brakenhoff et al, supra), incorporada a la presente como referencia en esta solicitud, o se puede producir a través de métodos bien conocidos de producción de anticuerpos monoclonales (véase por ejemplo Harlow . et al., eds., 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, Nueva York). IL-6 de humano purificada contra la cual se pueden elevar los anticuerpos monoclonales se conoce de igual manera. El experto en la técnica puede determinar las secuencias de la región variable y/o CDR mediante referencia a la literatura científica publicada o bancos de datos de secuencias, o mediante clonación y secuenciación de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo de murino a través de metodología convencional. De conformidad con la presente invención, las secuencias de aminoácidos y ADNc de la cadena pesada (SEQ ID NOS: 3 y 4 respectivamente) de cadena pesada de CLB- 8 de murino se provee en la figura 1. El ADNc y secuencia de aminoácidoá deducida de la cadena ligera de CLB-8 de murino se provee en la figura 2. Cada una de las regiones variables de cadena pesada y ligera contienen tres CDR que se combinan para formar el sitio de unión a antígeno. Las tres CDR están rodeadas por cuatro regiones FR que principalmente funcionan para soportar las CDR. Las secuenbias de las CDR dentro de las secuencias de las regiones variables de laS cadenas pesadas y ligeras pueden ser identificadas a través de alineación asistida por computadora de acuerdo con Kabat et al. (1987) en Sequence of Proteins of Immunological Interest, 4a ed., United States Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, Washington, D.C., o mediante modelación molecular de las regiones variables, por ejémplo utilizando el programa í ENCAD según lo describe Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168:595. En una modalidad preferida, las DR se derivan de anticuerpo monoclonal de murino CLB-8. Las CDR de cabena pesada preferidas tienen i las siguientes secuencias: j CDR1 SFAMS j (SEQ ID NO:1 ) CDR2 EISSGGSYTYYPDTyTG (SEQ ID NO:2) CDR3 GLWGYYALDY i (SEQ ID NO:3) Las CDR de cadena ligera preferidas tienen las siguientes secuencias: ¡ CDR1 SASSSVSYMY \ (SEQ ID NO:4) I ? CDR2 DTSNLAS j (SEQ ID N0:5) CDR3 QQWSGYPYT | (SEQ ID N0:6) de SEQ ID NOS:1-6. En una modalidad preferida, las CDR tienen de i aproximadamente 90% a aproximadamente 10p% de homología con las CDR de SEQ ID NOS: 1-6. En una modalidad de mayor preferencia, las CDR tienen de aproximadamente 100% de homología con lias CDR de SEQ ID NOS:1-6. Alternativamente, toda la región variable de cadena pesada y región variable de cadena ligera del anticuerpo CLB-8 de murino como se expone en el ejemplo 2 (SEQ ID NOS: 7 y 8) se pueden combinar con las regiones de armazón y constantes de humano para formar el anticuerpo cCLB-8 quimérico de la presente invención. j Los genes humanos que codifican! las regiones (C) constantes de los anticuerpos quiméricos, fragmentos y regiones de la presente invención se pueden derivar de una librería de hígado fetal humano, mediante métodos conocidos. Se pueden derivar lós genes dé régión C humanos de cualquier célula humana incluyendo aquellas que expresan y producen inmunoglobulinas humanas. La región CH humana se puede derivar de cualquiera de las clases conocidas de isotipos de cadenas H humanas, incluyendo gamma, µ, a, d, e, y subtipos de los mismos, como G1 , G2, G3 y G4. Ya que el isotipo de cadena H es responsable de las diversas funciones efectoras de un anticuerpo, la elección de la región CH estará guiada por las funciones deseadas en el efector, como la fijación de complemento o la actividad en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Preferiblemente, la región CH se deriva de gamma 1 (lgG1 ). Se puede derivar la región CL humana a partir de isotipo de cadena L humana, kappa o lambda, preferiblemente kappa. Se obtienen los genes que codifican las regiones C de inmunoglobulina humana de células humanas mediante técnicas de clonación estándares (Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel et al, eds. Current Protocols in Molecular Biology (1987-1993)). Los genes de región C humana están fácilmente disponibles a partir de clones conocidos que contiene genes que representan las dos clases de cadenas L, las cinco clases de cadenas H y las subclases de las mismas. Se pueden preparar los fragmentos de anticuerpo y médico, como F(ab )2 y Fab, al designar un gen de cadena H quimérico que se trunca apropiadamente. Por ejemplo, un gen quimérico que codifica una porción de cadena H de un fragmento F(ab )2 incluiría secuencias de ÁDN qué codifican él dominio CH1 y la región de articulación de las cadenas H, seguida por un codón de paro transnacional para generar la molécula troncada. En general, los anticuerpos de murino, humano, o murino y quiméricos, fragmentos y regiones de la presente invención se producen al clonar segmentos ADN que codifican las regiones de unión a antígeno de cadena H y L de un anticuerpo específico para TNF y que unen estos segmentos ADN a segmentos ADN que codifican regiones CH y CL, respectivamente, para producir genes codificadores de inmunoglobulina de murino, humanos o quiméricos. Así, en una modalidad preferida, se crea un gen quimérico fusionado que comprende un primer segmento ADN que codifica por lo menos la región de unión de antígeno de origen no humano, como una región V funcionalmente reacomodada con el segmento de unión (J), ligado a un segundo segmento ADN que codifica por lo menos una parte de una región C humana. Se pueden modificar las secuencias de regiones variables del anticuerpo CLB-8 de murino mediante inserciones, sustituciones y deleciones al grado que el anticuerpo quimérico mantenga la capacidad de unirse a e inhibir la IL-6 humana. El experto en la técnica puede dilucidar el mantenimiento de esta actividad al llevar a cabo los ensayos funcionales que se describen a continuación. Por ejemplo, las regiones variables pueden tener de alrededor de 50% aproximadamente 100% de homología a las regiones variables de SEQ ID NOS: 7-8. En una modalidad preferida las regiones variables tienen de alrededor de 80% a aproximadamente 100% de homología con las regiones variables de SEQ ID NOS: 7-8. En una modalidad mayormente preferida las regiones variables tienen de alrededor de 90% a aproximadamente 100% de homología a las regiones variables de SEQ ID NOS. 7-8. En la modalidad mayormente preferida las regiones variables tienen alrededor de 100% de homología con los CDRs de los SEQ ID NOS: 1 -6 . Por razón de conveniencia, se ha adoptado en la presente el esquema de numeración de Kabat et al. Se designan los residuos medíante números en minúsculas o guiones según sea necesario para adaptar las secuencias presentes a las secuencias numeradas estándar de Kabat. De conformidad con la presente invención, se pueden retener residuos en la región FR que son idiosincráticas al anticuerpo madre, por ejemplo CLB-8. También se pueden retener residuos que se ha demostrado son críticos para la humanización de otros anticuerpos. Se siguen las directrices anteriores hasta el grado necesario para dar apoyo al sitio de unión de antígeno formado por los CDRs y simultáneamente aumentar al máximo la humanización del anticuerpo. Se muestran en el ejemplo 2 a continuación la secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada representativa derivada del anticuerpo CLB-8 monoclonal de muríno y un anticuerpo humano. También se muestra en el ejemplo 2 la secuencia de aminoácido de una región variable dé cadena ligera quimérica representativa derivada de anticuerpo CLB-8 monoclonal de murino y un anticuerpo humano. De conformidad con la presente invención, se ha demostrado que un anticuerpo quimérico que contiene regiones variables del anticuerpo CLB-8 de murino es tan efectivo como una anticuerpo IL-6 monoclonal de murino en la unión con anti-IL-6. Por lo menos se puede producir opcionalmente un anticuerpo de la presente invención mediante una línea celular, una línea celular mezclada, una célula inmortalizada o una población clonada de células inmortalizadas, como se sabe en la técnica. Ver por ejemplo Ausubel, et al., ed., Current Protocols ¡n Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001 ); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratoy Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lañe, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Collígan, et al., eds., Current Protocols ¡n Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001 ); Colligan et al., Current Protocolos in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001 ), cada una incorporada en su totalidad en la presente medíante referencia. En un método, un hibridoma se produce mediante la fusión de una línea celular inmortal adecuada (por ejemplo, una línea celular de mieloma tal como, pero no limitada a, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1 , NS2, AE-1 , L5, > 243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1 , Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1 , JURKAT, WEHI, K- 562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL- 60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A, o similares, o heteromielomas, productos dé füsión de los mismos, o cualquier célula o célula de fusión derivada a partir de estos, o cualquier otra línea celular adecuada como se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, www.atcc.org, www.lifetech.com., y similares, con células productoras de anticuerpo, tales como, pero no limitadas a, células del bazo aisladas o clonadas, células de sangre periférica, células de linfa, células de amígdala, u otras células inmunes o células que contienen célula B, o cualesquiera otras células que expresan secuencias de regiones constantes o variables de cadena pesada o ligera o de regiones de armazón o de CDR, ya sea como ácido nucleico endógeno o heterólogo, como ADN recombinante o endógeno de virus, bacteria, alga, procarionte, anfibio, insecto, reptil, pez, mamífero, roedor, equino, ovino, cabra, oveja, primate, eucarionte, ADN genómico, ADNc, ADNr, ADN o ARN mitocondrial, ADN o ARN de cloroplasto, ARNhn, ARNm, ARNt, de una sola cadena, de doble cadena o de triple cadena, hibridado, y los similares o cualquier combinación de los mismos. Véase, por ejemplo, Ausubel, anteriormente mencionado, y Colligan, Immunology, anteriormente mencionado, capítulo 2, completamente incorporado aquí como referencia. Cualquier otra célula hospedera adecuada también puede ser utilizada para expresar ácido nucleico heterólogo o endógeno que codifica un anticuerpo, fragmento específico o variante del mismo, de la presente invención. Las células fusionadas (hibridomas) o células recombinantes pueden ser aisladas utilizando condiciones de cultivo selectivas u otros métodos conocidos adecuados, y pueden clonarse mediante dilución limitante o selección de célula, u otros métodos conocidos. Las células que producen anticuerpos con la especificidad deseada pueden ser seleccionadas mediante un ensayo adecuado (por ejemplo, ELISA). Los métodos para diseñar o humanizar anticuerpos que no son de humano o que son de humano también pueden utilizarse y son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado o diseñado tiene uno o más residuos de aminoácidos a partir de una fuente la cual no es de humano, por ejemplo, pero que no se limita a ratón, rata, conejo, primate no humano u otro mamífero. Estos residuos de aminoácidos de humano frecuentemente se refieren como residuos de "importación", los cuales típicamente se toman a partir de un dominio variable de "importación", dominio constante u otro dominio de una secuencia de humano conocida. Las secuencias conocidas de Ig de humano se describen, por ejemplo. en www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/~pedro/research_tools.html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.html; www.library.thinkquest.org/12429/lmmune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk ~mrc7/mikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/lmmunology.html. www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/~hcentéf/Íhdex.html; www.biotech.ufl.edu/~hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u. ac.jp/~yasuhito/Elisa. html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk axp/facs/davies/links.html; www.biotech.ufl.edu/~fccl/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximt1.imt.uni-marburg.de/~rek AEPStart.html; baserv.uci.kun.nl/~jraats/links1.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html; www.ibt.unam.mx vir/V_mice.html; ¡mgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cmv.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/~honegger/AHOseminar/Slide01 .html; www.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/~fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr_products.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html. Kabat et al., Secuencias y Proteínas de Interés en Immunología, Departamento de Salud de los Estados Unidos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S.

Dept. Health) (1983), cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia.

Dichas secuencias importadas púeden ser utilizadas para reducir la inmunogenicidad o reducir, mejorar o modificar la unión, afinidad, relación de unión, relación de separación, avidez, especificidad, vida media, o cualesquiera otras características adecuadas, como se conoce en la técnica. Generalmente se mantienen parte o todas las secuencias CDR de no humano y de humano mientras que las secuencias de no humano de las regiones variables y constantes se reemplazan con aminoácidos de humano u otros aminoácidos. Los anticuerpos también pueden humanizarse de manera opcional con la retención de alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, los anticuerpos humanizados pueden prepararse de manera opcional mediante un proceso de análisis de las secuencias parenterales y de varios productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parenterales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de ¡nmunoglobulina están comúnmente disponibles y son familiares a los expertos en la técnica. Están disponibles los programas de cómputo los cuales ilustran y exhiben estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulinas de candidatos seleccionados. La inspección de estas exhibiciones permiten el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de las secuencias de ¡nmunoglobulina candidato, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la ¡nmunoglobulina candidato para unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias consenso y secuencias importadas de manera que se logra la característica del anticuerpo deseado, tal como la afinidad incrementada para el antígeno(s) blanco. En general, los residuos de la CDR están implicados de manera directa y más substancialmente en la influencia de la unión al antígeno. La humanización o diseño de los anticuerpos de la presente invención puede lograrse mediante el uso de cualquier método conocido, tales como, pero no limitado a aquéllos descritos en, Winter (Jones et al., Nature 321 : 522 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151 : 2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901 (1987), Cárter et al., Proc. Nati Acad. Sci. U.S.A. 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151 : 2623 (1993); Patentes de E.U.A. Nos. 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5, 766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101 , 5585089, 5225539 4816569, PCT7: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, cada una incorporada por completo aquí como referencia, incluyendo referencias citadas aquí. El anticuerpo anti-IL-6 también puede generarse opcionalmente mediante la inmunización de un animal transgénico (por ejemplo, ratón, rata, hámster, primate no humano, y similares) capaz de producir un repertorio de anticuerpos de humano, como se describe aquí y/o como se conoce en la técnica. Las células que producen un anticuerpo anti-IL-6 de humano pueden ser aisladas a partir de dichos animales y se pueden inmortalizar utilizando métodos adecuados, tales como los métodos descritos aquí. Los anticuerpos de la presente invención también pueden prepararse utilizando al menos un ácido nucleico que codifica anticuerpo anti-IL-6 para producir animales o mamíferos transgénicos, tales como cabras, vacas, caballos, ovejas, y similares, que producen dichos anticuerpos en su leche. Dichos animales pueden ser mejorados utilizando métodos conocidos. Véase, por ejemplo, pero no limitados a, Patentes de E.U.A. Nos. 5, 827, 690; 5, 849, 992; 4, 873, 316; 5, 849, 992; 5, 994, 616; 5, 565, 362; 5, 304, 489, y similares, cada uno de los cuales se incorpora por completo aquí como referencia. Los anticuerpos de la presente invención pueden prepararse de manera adicional utilizando al menos un ácido nucleico que codifica anticuerpo anti-IL-6 para proveer plantas transgénicas y células vegetales cultivadas (por ejemplo, pero no limitados a tabaco y maíz) que producen dichos anticuerpos, porciones específicas o variantes en las partes vegetales o en células cultivadas a partir de éstas. Como un ejemplo no limitante, las hojas de tabaco transgénico que expresan proteínas recombinantes han sido utilizadas exitosamente para proveer grandes cantidades de proteínas recombinantes, por ejemplo, utilizando un promotor inducible. Véase, por ejemplo, Cramer et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 240: 95- 1 18 (1999) y referencias citadas aquí. También, el maíz transgénico ha sido utilizado para expresar proteínas de mamífero en niveles dé producción comercial, con actividades biológicas equivalentes a aquéllas producidas en otros sistemas recombinantes o purificadas a partir de fuentes naturales. Véase, por ejemplo, Hood et al., Adv. Exp. ed. Biol. 464: 127- 147 (1999) y referencias citadas aquí. Los anticuerpos también han sido producidos en grandes cantidades a partir de semillas de plantas transgénicas incluyendo fragmentos de anticuerpo, tales como anticuerpos de cadena sencilla (scFv's), incluyendo semillas de tabaco y tubérculos de patata. Véase, por ejemplo, Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38: 101 - 109 (1998) y referencias citadas aquí. Así, los anticuerpos de la presente invención también pueden producirse utilizando plantas transgénicas, de conformidad con los métodos conocidos. Véase también, por ejemplo, Fisher et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30: 99- 108 (octubre, 1999), Ma et al., Trends Biotechnol. 13: 522- 7 (1995); Ma et al., Plant Physíol. 109: 341 -6 (1995); Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans. 22: 940- 944 (1994); y referencias citadas aquí. Véase, también generalmente para expresión vegetal de anticuerpos, pero no limitadas a, cada una de las referencias anteriormente mencionadas que se incorporan por completo aquí como referencias. Los anticuerpos de la invención se pueden unir a IL-6 de humano con un amplio intervalo de afinidades (KD). En una modalidad preferida, al menos un mAb de humano de la presente invención se puede unir de manera opcional a IL-6 de humano con una alta afinidad. Por ejemplo, un mAb de humano se puede unir a IL-6 de humano con una KD igual a o menor que aproximadamente 10"7 M, tal como pero no limitadas a, 0.1-9.9 (o cualquier intervalo o valor de éste) X 1 fJ7, 10"8, 10"9, 10"10, 10'11, 10 "12, 10 13 o cualquier intervalo o valor de éste. La afinidad o avidez de un anticuerpo por un antígeno puede determinarse de manera experimental utilizando cualquier método adecuado. (Véase, por ejemplo, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," En Fundamental Immunology, Paul, W.E., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, NY (1992); y métodos descritos allí). La afinidad medida de una interacción anticuerpo-antígeno particular puede variar si se mide bajo condiciones diferentes (por ejemplo, concentración de sal, pH). Así, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión al antígeno (por ejemplo, KD, Ka, Kd) se hacen preferiblemente con soluciones estandarizadas de anticuerpo y antígeno, y un regulador de pH estandarizado, tal como el regulador de pH descrito aquí.

Moléculas de ácidos nucleicos Utilizando la información provista aquí, tales como las secuencias nucleotídicas que codifican al menos 70- 100% de los aminoácidos contiguos de al menos una de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, fragmentos específicos, variantes o secuencias consenso de los mismos, o un vector depositado que comprende al menos una de estas secuencias, se puede obtener una molécula de ácidos nucleicos de la presente invención que codifica al menos un anticuerpo anti-IL-6 utilizando métodos descritos aquí o como se conocen en la técnica.

Las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención pueden estar en la forma de ARN, tales como ARNm, ARNhn, ARNt o cualquier otra forma, o en la forma de ADN, incluyendo, pero no limitados a, ADNc y ADN genómico obtenido mediante clonación o producido de manera sintética, o cualesquiera combinaciones de los mismos. El ADN puede ser de triple cadena, doble cadena o cadena sencilla, o cualesquiera combinaciones de los mismos. Cualquier porción de al menos una cadena de ADN o del ARN puede ser la cadena codificante, también conocida como la cadena sentido, o puede ser la cadena no codificante, también referida como la cadena anti-sentido. Las moléculas de ácidos nucleicos aisladas de la presente invención puede incluir moléculas de ácidos nucleicos que comprenden un marco abierto de lectura (ORF), ocasionalmente con uno o más intrones, por ejemplo, pero no limitados a, al menos una porción específica de al menos un CDR, como CDR1 , CDR2 y/o CDR3 de al menos una cadena pesada (por ejemplo, SEQ ID NOS: 1 -3) o cadena ligera (por ejemplo, SEQ ID NOS: 4-6); moléculas de ácidos nucleicos que comprenden la secuencia codificante de un anticuerpo anti-IL-6 o región variable (por ejemplo, SEQ ID NOS: 7, 8); y moléculas de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia nucleotídica substancialmente diferente a partir de aquellas descritas anteriormente pero las cuales, debido a la degeneración del código genético, aún codifican al menos un anticuerpo anti-IL-6 como se describe aquí y/o como se conoce en la técnica. Por supuesto, el código genético se conoce bien en la técnica. Por lo tanto, podría ser rutinario para un experto en la técnica el generar dichas variantes degeneradas de ácidos nucleicos que codifican para anticuerpos anti-IL-6 específicos de la presente invención. Véase, por ejemplo, Ausubel, et al., anteriormente mencionado, y dichas variantes de ácidos nucleicos están incluidas en la presente invención. Los ejemplos no limitantes de moléculas de ácidos nucleicos aisladas de la presente invención incluyen SEQ ID NOS: 1 -8, que corresponden a los ejemplos no limitantes de un ácido nucleico que codifica, respectivamente, HC CDR1 , HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1 , LC CDR2, LC CDR3, región variable HC y región variable LC. Como se indica aquí, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que comprenden un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-IL-6 pueden incluir, pero no se limitan a, aquellas que codifican la secuencia de aminoácidos de un fragmento del anticuerpo, por sí mismo; la secuencia codificante para el anticuerpo completo o una porción del mismo; la secuencia codificante para un anticuerpo, fragmento o porción, así como secuencias adicionales, tales como la secuencia codificante de al menos una señal líder o péptido de fusión, con o sin las secuencias codificantes adicionales anteriormente mencionadas, tales como al menos un intrón, junto con secuencias adicionales, no codificantes, incluyendo pero no limitadas a, las secuencias 5' y 3' no codificantes, tales como las secuencias transcritas, no traducidas que desempeñan un papel en la transcripción, procesamiento del ARNm, incluyendo señales de procesamiento y de poliadenilación (por ejemplo - unión al ribosoma y estabilidad del ARNm); y secuencias codificantes adicionales que codifican para aminoácidos adicionales, tales como aquellas que proveen funcionalidades adicionales. Así, la secuencia que codifica un anticuerpo puede fusionarse a una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un péptido que facilitan la purificación del anticuerpo fusionado que comprende un fragmento o porción del anticuerpo.

Polinucleótidon que hibridan selectivamente con un polinucleótido como se describe aquí La presente invención provee ácidos nucleicos aislados que hibridan bajo condiciones de hibridación selectivas con un polinucleótido descrito aquí. Por lo tanto, los polinucleótido de esta modalidad pueden ser utilizados para aislar, detectar, y/o cuantificar ácidos nucleicos que comprenden dichos polinucleótidos. Por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención puede ser utilizados para identificar, aislar, o amplificar clonas parciales o de longitud total en una librería depositada. En algunas modalidades, los polinucleótidos son secuencias de ADN genómico o secuencias de ADNc aisladas, o complementarias de otra manera a, un ADNc a partir de una librería de ácido nucleico de humano o de mamífero. Preferiblemente, la librería de ADNc comprende al menos 80% de secuencias de longitud total, preferiblemente al menos 85% o 90% de secuencias de longitud total, y más preferiblemente al menos 95% de secuencias de longitud total. Las librerías de ADNc pueden ser normalizadas para incrementar la representación de secuencias raras. Típicamente, pero no exclusivamente, las condiciones de hibridación con severidad baja o moderada se emplean con secuencias que tienen una identidad de secuencia reducida con relación a las secuencias complementarias. Las condiciones de severidad de moderadas a altas pueden emplearse de manera opcional para secuencias con mayor identidad. Las condiciones de severidad baja permiten la hibridación selectiva de secuencias que tienen aproximadamente 70% de identidad de secuencia y pueden ser empleadas para identificar secuencias ortólogas o parálogas. Opcionalmente, los polinucleótidos de esta invención codifican al menos una porción de un anticuerpo codificado por los polinucleótidos descritos aquí. Los polinucleótido de esta invención abarcan secuencias de ácidos nucleicos que pueden ser empleadas para la hibridación selectiva a un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la presente invención. Véase, por ejemplo, Ausubel, anteriormente mencionado; Colligan, anteriormente mencionado, cada uno incorporado completamente aquí como referencia.

Construcción de ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención pueden elaborarse utilizando (a) métodos recombinantes, (b) técnicas sintéticas, (c) técnicas de purificación, o combinaciones de las mismas, como se conoce bien en la técnica. Los ácidos nucleicos pueden comprender convenientemente secuencias en adición a un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, un sitio de clonación múltiple que comprende uno o más sitios de endonucleasa de restricción pueden ser insertados dentro del ácido nucleico para ayudar al aislamiento del polinucleótido. También, las secuencias traducibles pueden ser insertadas para ayudar al aislamiento del polinucleótido traducido de la presente invención. Por ejemplo, una secuencia marcadora de hexa-histidina provee un medio conveniente para purificar las proteínas de la presente invención. El ácido nucleico de la presente invención - excluyendo la secuencia codificante - ocasionalmente es un vector, adaptador, o enlazador para clonación y/o expresión de un polinucleótido de la presente invención. Se pueden añadir secuencias adicionales a dichas secuencias de clonación y/o de expresión para optimizar su función en la clonación y/o expresión, para ayudar en el aislamiento del polinucleótido, o para mejorar la introducción del polinucleótido dentro de una célula. El uso de vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores, y enlazadores se conoce bien en la técnica. (Véase, por ejemplo, Ausubel, anteriormente mencionado; o Sambrook, anteriormente mencionado).

Métodos recombinantes para construcción de ácidos nucleicos Las composiciones de ácido nucleico aislado de esta invención, tales como ARN, ADNc, ADN genómico, o cualquier combinación de los mismos, pueden obtenerse a partir de fuentes biológicas utilizando cualquier número de metodologías de clonación conocidas por los expertos en la técnica. En algunas modalidades, las sondas oligonucleótidas que hibridan de manera selectiva, bajo condiciones severas, a los polinucleótidos de la presente invención son útiles para identificar la secuencia deseada en una librería de ADNc o de ADN genómico. El aislamiento del ARN, y la construcción de librerías de ADNc y de ADN genómico, se conoce bien por los expertos en la técnica. (Véase, por ejemplo Ausubel, anteriormente mencionado; o Sambrook, anteriormente mencionado).

Selección de ácido nucleico y métodos de aislamiento Una librería de ADNc o librería genómica puede seleccionarse utilizando una sonda basada en la secuencia de un polinucleótido de la presente invención, tales como aquellas descritas aquí. Las sondas pueden ser utilizadas para hibridarse con ADN genómico o con secuencias de ADNc para aislar genes homólogos en los mismos organismos o en organismos diferentes. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que se pueden emplear varios grados de severidad de la hibridación en el ensayo; y por lo tanto el medio de hibridación o el medio de lavado puede ser severo. Conforme las condiciones de hibridación se vuelvan más severas, debe haber un mayor grado de complementariedad entre las sondas y el blanco para que ocurra la formación del dúplex. El grado de severidad puede controlarse por una o más de las condiciones de temperatura, fuerza iónica, pH y la presencia de un solvente parcialmente desnaturalizante tal como formamida. Por ejemplo, la severidad de la hibridación varía de manera conveniente por el cambio de la polaridad de la solución del reactivo a través de, por ejemplo, la manipulación de la concentración de formamida dentro del intervalo de 0% a 50%. El grado de complementariedad (identidad de secuencia) requerido para la unión detectable variará de conformidad con la severidad del medio de hibridación y/o medio de lavado. El grado de complementariedad de manera óptima será del 100%, o del 70- 100%, o cualquier intervalo de valor entre éstos. Sin embargo, se entenderá que se pueden compensar variaciones menores en la secuencia en las sondas e iniciadores mediante la reducción de la severidad del medio de hibridación y/o medio de lavado. Los métodos de amplificación del ARN o ADN son bien conocidos en la técnica y pueden ser utilizados de conformidad con la presente invención sin llevar a cabo experimentación, basándose en las enseñanzas y guías presentadas aquí. Los métodos conocidos de amplificación de ADN o de ARN incluyen, pero no se limitan a, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y procesos de amplificación relacionados (véase, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 4, 683, 193, 4, 683, 202, 4, 800, 159, 4, 965, 188, a Mullís et al.; 4, 795, 699 y 4, 921 , 794 a Tabor et al; 5, 142, 033 a Innis; 5, 122, 464 a Wilson, et al.; 5, 091 , 310 a Innis; 5, 066, 584 a Gyllensten, et al; 4, 889, 818 a Gelfand, et al; 4, 994, 370 a Silver, et al; 4, 766, 067 a Biswas; 4, 656, 134 a Ringold) y amplificación mediada por ARN que utiliza ARN anti-sentido a la secuencia blanco como un molde para la síntesis de ADN de doble cadena (patente de E.U.A. No. 5, 130, 238 a Malek, et al, con el nombre registrado NASBA), los contenidos completos de dicha referencia se incorporan aquí como referencia. (Véase, por ejemplo, Ausubel, anteriormente mencionado; o Sambrook, anteriormente mencionado). Por ejemplo, la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) puede ser utilizada para amplificar las secuencias de polinucleótidos de la presente invención y genes relacionados directamente a partir de las librerías de ADN genómico y de ADNc. El PCR y otros métodos de amplificación in vitro también pueden ser útiles, por ejemplo, para clonar secuencias de ácidos nucleicos que codifican para proteínas a ser expresadas, para elaborar ácidos nucleicos para utilizarlos como sondas para detectar la presencia del ARNm deseado en las muestras, para secuenciación de ácido nucleico, o para otros propósitos. Los ejemplos de técnicas adecuadas para dirigir a personas expertas a través de los métodos de amplificación in vitro se encuentran en Berger, anteriormente mencionado, Sambrook, anteriormente mencionado, y Ausubel, anteriormente mencionado, así como en Mullís, et al., Patente de E.U.A. No. 4, 683, 202 (1987); e Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Los equipos comercialmente disponibles para amplificación de PCR genómico se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). Adicionalmente, por ejemplo, la proteína 32 del gen T4 (Boehringer Mannheim) puede ser utilizada para mejorar el rendimiento de los productos largos de PCR.

Métodos sintéticos para construcción de ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención también pueden prepararse mediante síntesis química directa por métodos conocidos (véase, por ejemplo, Ausubel, et al., anteriormente mencionado). La síntesis química generalmente produce un oligonucleótido de una sola cadena, el cual puede ser convertido hacia un ADN de doble cadena mediante hibridación con una secuencia complementaria, o mediante polimerización con una ADN polimerasa utilizando la cadena sencilla como un molde. Un experto en la técnica reconocerá que mientras que la síntesis química del ADN puede limitarse a secuencias de aproximadamente 100 o más bases, secuencias más largas se pueden obtener mediante la ligación de secuencias más cortas.

Cassettes de expresión recombinante La presente invención además provee cassettes de expresión recombinante que comprenden un ácido nucleico de la presente invención. Una secuencia de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo un ADNc o una secuencia genómica que codifica un anticuerpo de la presente invención, puede ser utilizada para construir un cassette de expresión recombinante que puede ser introducido dentro de al menos una célula hospedera deseada. Un cassette de expresión recombinante típicamente comprenderá un polinucleótido de la presente invención operativamente asociado a secuencias reguladoras del inicio de la transcripción que dirigirán la transcripción del polinucleótido en la célula hospedera pretendida. Tanto los promotores heterólogos como los no heterólogos (es decir, endógenos) pueden ser empleados para dirigir la expresión de los ácidos nucleicos de la presente invención. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos aislados que sirven como promotor, potenciador o como otros elementos pueden ser introducidos en la posición apropiada (hacia el extremo 5', hacia el extremo 3' o en el intrón) de una forma no heteróloga de un polinucleotido de la presente invención de manera que se sobre- o sub-regule la expresión de un polinucleotido de la presente invención. Por ejemplo, los promotores endógenos pueden ser alterados in vivo o in vitro mediante mutación, deleción y/o sustitución.

Vectores y células hospederas La presente invención también se refiere a vectores que incluyen moléculas de ácidos nucleicos aislados de la presente invención, células hospederas que se diseñan de manera genética con los vectores recombinantes, y la producción de al menos un anticuerpo anti-IL-6 mediante técnicas recombinantes, como se conoce bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al., anteriormente mencionado; Ausubel, et al., anteriormente mencionado, cada uno completamente incorporado aquí como referencia. Los polinucleótidos pueden unirse opcionalmente a un vector que contenga un marcador de selección para la propagación en un hospedero. Generalmente, un vector plasmídico se introduce en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato de calcio, o en un complejo con un lípido cargado. Si el vector es un virus, éste se puede empaquetar in vitro utilizando una línea celular empaquetadora apropiada y luego se transduce dentro de las células hospederas. El inserto de ADN debe estar operativamente asociado a un promotor apropiado. Las construcciones de expresión contendrán adicionalmente sitios para el inicio de la transcripción, sitios para el término de la transcripción y, en la región transcrita, un sitio de unión al ribosoma para su traducción. La porción codificante de los transcritos maduros expresados por las construcciones incluirán preferiblemente un codón de inicio de la traducción en el inicio y un codón de término (por ejemplo, UAA, UGA o UAG) ubicado de manera apropiada en el extremo del ARNm a ser traducido, con UAA y UAG siendo preferidos para la expresión en mamífero o para la expresión en célula eucarionte. Los vectores de expresión preferiblemente pero opcionalmente incluirán al menos un marcador de selección. Dichos marcadores incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, metotrexato (MTX), dihidrofolato reductasa (DHFR, Patentes de E.U.A. Nos. 4, 399, 216; 4, 634, 665; 4, 656, 134, 4, 956, 288; 5, 149, 636; 5, 179, 017, resistencia a ampicilina, neomicina (G418), ácido micofenólico, o glutamina sintetasa (GS, Patentes de E.U.A. Nos. 5, 122, 464; 5, 770, 359; 5, 827, 739) para cultivo de célula eucarionte, y genes para resistencia a tetraciclina o ampicilina para cultivo en E. coli y otras bacterias o procariontes (las patentes anteriores se incorporan completamente aquí como referencias). Los medios de cultivo apropiados y las condiciones para las células hospederas descritas anteriormente se conocen en la técnica. Los vectores adecuados serán fácilmente aparentes a los expertos en la técnica. La introducción de una construcción de vector dentro de una célula hospedera puede efectuarse mediante transfección en fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrán, transfección mediada por lípido catiónico, electroporación, transducción, infección u otros métodos conocidos. Dichos métodos se describen en la técnica, tales como en Sambrook, anteriormente mencionado, Capítulos 1 -4 y 16-18; Ausubel, anteriormente mencionado, Capítulos 1 , 9, 13, 15, 16. Al menos un anticuerpo de la presente invención puede expresarse en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no solamente señales de secreción, sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. Por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, se puede añadir al N- terminal de un anticuerpo para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula hospedera, durante la purificación, o durante el manejo y almacenamiento subsecuentes. También, las porciones peptidicas pueden añadirse a un anticuerpo de la presente invención para facilitar la purificación. Dichas regiones pueden removerse antes de la preparación final de un anticuerpo o de al menos un fragmento del mismo. Dichos métodos se describen en muchos manuales estándares de laboratorio, tales como en Sambrook, anteriormente mencionado, capítulos 1 f .29- 17.42 y 18.1 - 18.74; Ausubel, anteriormente mencionado, Capítulos 16, 17 y 18. Los expertos en la técnica están bien informados en numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína de la presente invención. Alternativamente, los ácidos nucleicos de la presente invención pueden expresarse en una célula hospedera mediante activación (por manipulación) en una célula hospedera que contiene ADN endógeno que codifica un anticuerpo de la presente invención. Dichos métodos se conocen bien en la técnica, por ejemplo, como se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 5, 580, 734, 5, 641 , 670, 5, 733, 746, y 5, 733, 761 , completamente incorporadas aquí como referencias. Las células de mamífero son ilustrativas de los cultivos celulares útiles para la producción de los anticuerpos, porciones específicas o variantes de los mismos. Los sistemas de célula de mamífero frecuentemente están en la forma de monocapas de células aunque las suspensiones de células de mamífero o biorreactores también pueden ser utilizados. Varias líneas celulares hospederas adecuadas, capaces de expresar proteínas glucosiladas intactas, han sido desarrolladas en la técnica, e incluyen las líneas celulares COS-1 (por ejemplo, TACC CRL 1650), COS-7 (por ejemplo, ATCC CRL-1651 ), HEK293, BHK21 (por ejemplo, ATCC CRL- 10), CHO (por ejemplo, ATCC CRL 1610) y BSC- (por ejemplo, ATCC CRL-26), células Cos-7, células CHO, células hep G2, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, células 293, células HeLa y similares, las cuales ya están disponibles a partir de, por ejemplo, American Type Culture Collection, anassas, Va (www.atcc.org). Las células hospederas preferidas incluyen células de origen linfoide tales como células de mieloma y de linfoma. Las células hospederas particularmente preferidas son las células P3X63Ag8.653 (número de acceso ATCC CRL- 1580) y las células SP2/0-Ag14 (número de acceso ATCC CRL-1851 ). En una modalidad particularmente preferida, la célula recombinante es una célula P3X63Ag8.653 o una célula SP2/0-Ag 4. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir una o más de las siguientes secuencias control de la expresión, tales como, pero no limitadas a un origen de replicación; un promotor (por ejemplo, promotores SV40 tardíos o tempranos, el promotor CMV (Patentes de E.U.A. Nos. 5, 168, 062; 5, 385, 839), un promotor HSV tk, un promotor pgk (fosfoglicerato cinasa), un promotor EF-1 alfa (Patente de E.U.A. No. 5, 266, 491 ), al menos un promotor de inmunoglobulina de humano; un potenciador, y/o sitios de procesamiento de la información, tales como sitios de unión al ribosoma, sitios de procesamiento del ARN, sitios de poliadenilación (por ejemplo, un sitio grande T Ag de adición poli A de SV40), y secuencias terminadoras de la transcripción. Véase, por ejemplo, Ausubel et al., anteriormente mencionado; Sambrook, et al., anteriormente mencionado. Otra células útiles para la producción de ácidos nucleicos o proteínas de la presente invención se conocen y/o están disponibles, por ejemplo, a partir del catálogo de Líneas Celulares e Hibridomas de the American Type Culture Collectlon (www.atcc.org) u otras fuentes conocidas o comerciales. Cuando se emplean las células hospederas eucariontes, las secuencias de poliadenilación o las secuencias de terminación de la transcripción se incorporan típicamente dentro del vector. Un ejemplo de una secuencia terminadora es la secuencia de poliadenilación a partir del gen de la hormona de crecimiento de bovino. Las secuencias para el procesamiento adecuado del transcrito también pueden ser incluidas. Un ejemplo de una secuencia procesadora es el intrón VP1 a partir de SV40 (Sprague, et al., J. Virol. 45: 773- 781 (1983)). Adicionalmente, las secuencias génicas para controlar la replicación en la célula hospedera pueden incorporarse dentro del vector, como se conoce en la técnica.

Purificación de un anticuerpo Un anticuerpo anti-IL-6 puede recuperarse y purificarse a partir de los cultivos de célula recombinante por métodos bien conocidos incluyendo, pero no limitados a, purificación en proteína A, precipitación en sulfato de amonio o etanol, extracción de ácido, cromatografía de intercambio amónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de Interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxilapatita y cromatografía en lecitina. La cromatografía líquida de alta resolución ("HPLC") también puede emplearse para la purificación. Véase, por ejemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, o Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997- 2001 ), por ejemplo, Capítulos 1 , 4, 6, 8, 9, 10, cada uno completamente incorporado aquí como referencia. Los anticuerpos de la presente invención incluyen productos purificados de manera natural, productos purificados a partir de procedimientos sintéticos químicos, y productos producidos mediante técnicas recombinantes a partir de un hospedero eucarionte, incluyendo, por ejemplo, células de levadura, de planta superior, de insecto y de mamífero. Dependiendo del hospedero empleado en un procedimiento de producción recombinante, el anticuerpo de la presente invención puede estar glucosilado o puede no estar glucosilado, siendo preferida la forma glucosilada. Dichos métodos se describen en muchos manuales estándares de laboratorio, tales como Sambrook, anteriormente mencionado, Secciones 17.37- 17.42; Ausubel, anteriormente mencionado, Capítulos 10, 12, 13, 16, 18 y 20, Colligan, Protein Science, anteriormente mencionado, Capítulos 2- 14, todos incorporados en su totalidad aquí como referencias.

Anticuerpos anti-IL-6 Los anticuerpos aislados de la presente invención comprenden secuencias de aminoácidos del anticuerpo descrito aquí codificadas por cualquier polinucleótido adecuado, o cualquier anticuerpo aislado o preparado. Preferiblemente, el anticuerpo de humano o fragmentos de unión al antígeno se unen a la IL-6 de humano y, por lo tanto neutralizan de manera parcial o substancialmente al menos una actividad biológica de la proteína. Un anticuerpo, o porción específica o variantes del mismo, que neutralizan parcialmente o preferiblemente de manera sustancial al menos una actividad biológica de al menos una proteína IL-6 o fragmento puede unirse a la proteína o fragmento y por lo tanto inhibir las actividades mediadas a través de la unión de la IL-6 al receptor de IL-6 o a través de otros mecanismos mediados o dependientes de IL-6. Como se utiliza aquí, el término "anticuerpo neutralizante" se refiere a un anticuerpo que puede inhibir una actividad dependiente de IL-6 por aproximadamente 20- 120%, preferiblemente por al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% o más dependiendo del ensayo. La capacidad de un anticuerpo anti-IL-6 para inhibir una actividad dependiente de IL-6 preferiblemente se evalúa mediante al menos un ensayo de proteína o receptor de IL-6 adecuado, como se describe aquí y/o como se conoce en la técnica. Un anticuerpo de humano de la invención puede ser de cualquier clase (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, etc.) o isotipo y puede comprender una cadena ligera kappa o lambda. En una modalidad, el anticuerpo de humano comprende una cadena pesada IgG o fragmento definido, por ejemplo, al menos uno de los isotipos, lgG1 , lgG2, lgG3 o lgG4. En otra modalidad, el anticuerpo de humano anti-IL-6 del humano comprende una cadena pesada de lgG1 y una cadena ligera de lgG1 . Al menos un anticuerpo de la invención se une a al menos un epítope especificado específico para al menos una proteína IL-6, subunidad, fragmento, porción o cualquier combinación de los mismos. El al menos un epítope puede comprender al menos una región de unión al anticuerpo que comprende al menos una porción de dicha proteína, cuyo epítope preferiblemente comprende al menos una porción extracelular, soluble, hidrófila, externa o citoplásmica de dicha proteína. El al menos un epítope especificado puede comprender cualquier combinación de al menos una secuencia de aminoácidos de al menos 1 -3 aminoácidos a la porción especificada completa de los aminoácidos contiguos de lasSEQ ID NO: 9. Generalmente, el anticuerpo de humano o fragmento de unión al antígeno de la presente invención comprenderá una región de unión al antígeno que comprende al menos una región determinante de complementandad de humano (CDR1 , CDR2 y CDR3) o variante de al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región determinante de complementaridad de humano (CDR4, CDR5 y CDR6) o vahante de al menos una región variable de cadena ligera. Como un ejemplo no limitante, el anticuerpo o porción de unión al antígeno o variante puede comprender al menos uno de la CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y/o una CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En una modalidad particular, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno puede tener una región de unión al antígeno que comprende al menos una porción de al menos una CDR de cadena pesada (es decir, CDR1 , CDR2 y/o CDR3) que tiene la secuencia de aminoácidos de las CDRs 1 , 2 y/o 3 correspondientes (por ejemplo, SEQ ID NOS: 1 , 2, y/o 3). En otra modalidad particular, el anticuerpo o porción de unión al antígeno o variante puede tener una región de unión al antígeno que comprende al menos una porción de al menos una CDR de cadena ligera (por ejemplo, CDR4, CDR5 y/o CDR6) que tiene la secuencia de aminoácidos de las CDRs 4, 5 y/o 6 correspondientes (es decir, SEQ ID NOS: 4, 5, y/o 6). En una modalidad preferida las tres CDRs de cadena pesada y las tres CDRs de cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno tienen la secuencia de aminoácidos de la CDR correspondiente de al menos uno de mAb CLB-8c, Mab anti-IL-6 quimérico, como se describe aquí. Dichos anticuerpos puede prepararse mediante unión química de las varias porciones (es decir, CDRs, armazón) del anticuerpo utilizando técnicas convencionales, mediante la preparación y expresión de una (es decir, una o más) molécula de ácido nucleico que codifica al anticuerpo utilizando técnicas convencionales de tecnología de ADN recombinante o mediante el uso de otro método adecuado. El anticuerpo anti-IL-6 puede comprender al menos una de una región variable de cadena pesada o ligera que tiene una secuencia definida de aminoácidos. Por ejemplo, en una modalidad preferida, el anticuerpo anti-IL-6 comprende al menos una de al menos una región variable de cadena pesada, que opcionalmente tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y/o al menos una región variable de cadena ligera, que opcionalmente tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Los anticuerpos que se unen a la IL-6 de humano y que comprenden una región variable definida de cadena pesada o ligera pueden prepararse utilizando métodos adecuados, tales como exhibición de fago (Katsube, Y., el al., Int J Mol Med, 1 (5): 863- 868 (1998)) o métodos que emplean terminales transgénicos, como se conocen en la técnica y/o como se describe aquí. Por ejemplo, el anticuerpo, porción específica o variante se puede expresar utilizando el ácido nucleico codificante o una porción del mismo en una célula hospedera adecuada. La invención también se refiere a anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno, cadenas de inmunoglobulina y CDRs que comprenden aminoácidos en una secuencia que es substancialmente la misma que en una secuencia de aminoácidos descrita aquí. Preferiblemente, dichos anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno y anticuerpos que comprenden dichas cadenas o CDRs se pueden unir a la IL-6 de humano con alta afinidad (por ejemplo, KD menor que o igual a aproximadamente 10"9 M). Las secuencias de aminoácidos que son sustancialmente las mismas que las secuencias descritas aquí incluyen secuencias que comprende sustituciones de aminoácidos conservativos, así como deleciones y/ó inserciones de aminoácidos. Una sustitución de aminoácidos conservativos se refiere al reemplazo de un primer aminoácido por un segundo aminoácido que tiene propiedades químicas y/o físicas (es decir, carga, estructura, polaridad, hidrofobicidad/hidrofilicidad) que son similares a aquellas del primer aminoácido. Las sustituciones conservativas incluyen el reemplazo de un aminoácido por otro dentro de los siguientes grupos: lísina (K), arginina (R) e histidina (H); aspartato (D) y glutamato (E)¡ asparagina (N), glutamina (Q), serina (S), treonina (T), tirosina (Y), K, R, H, D y E; alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), prolina (P), fenilalanina (F), triptofano (W), metionina ( ), cisteína (C) y glicina (G); F, W e Y; C, S y T. Códigos de aminoácidos Los aminoácidos que elaboran los anticuerpos anti-IL-6 de la presente invención frecuentemente están abreviados. Las designaciones de los aminoácidos se pueden indicar mediante la designación del aminoácido por su código de una sola letra, su código de tres letras, nombre, o codón(es) de tres nucleótidos como se entiende bien en la técnica (véase Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, tercera Edición, Garland Publishing, Inc., New York, 1994): Un anticuerpo anti-IL-6 de la presente invención puede incluir una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, ya sea a partir de mutaciones naturales o a partir de manipulación humana, como se especifica aquí. Por supuesto, el número de sustituciones de aminoácidos que un experto la técnica puede hacer depende de muchos factores, incluyendo aquellos descritos anteriormente. Hablando de manera general, el número de sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos para cualquier anticuerpo anti-IL-6, fragfmento o variante no será mayor que 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 , 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 , tal como 1- 30 o En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de una cadena de inmunoglobulina, o porción de la misma (por ejemplo, región variable, CDR) tiene aproximadamente 70- 100% de identidad (es decir, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 3 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 o cualquier intervalo o valor de éstos) a la secuencia de aminoácidos de la cadena correspondiente de al menos una de SEQ ID NOS: 7, 8. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera puede compararse con la secuencia de SEQ ID NO: 8, o la secuencia de aminoácidos de un CDR3 de cadena pesada puede compararse con SEQ ID NO: 7. Preferiblemente, un 70- 100% de identidad de aminoácidos (por ejemplo, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 o cualquier intervalo o valor de éstos) se determine utilizando un algoritmo de computadora adecuado, como se conoce en la técnica. Las secuencias de regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera ejemplares se proveen en SEQ ID NOS: 7, 8. Los anticuerpos de la presente invención, o variantes específicas de los mismos, pueden comprender cualquier número de residuos de aminoácidos contiguos a partir de un anticuerpo de la presente invención, en donde ese número se selecciona a partir del grupo de enteros y consisten de 10- 100% del número de residuos contiguos en un anticuerpo anti-IL-6. Opcionalmente, esta subsecuencia de aminoácidos contiguos es al menos de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90,100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170,180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 o más aminoácidos en longitud, o cualquier intervalo o valor de éstos. Además, el número de dichas subsecuencias puede ser cualquier entero seleccionada a partir del grupo que consiste de 1 a 20, tal como al menos 2, 3, 4, ó 5. Como aquellos expertos en la técnica apreciarán, la presente invención incluye al menos un anticuerpo biológicamente activo de la presente invención. Los anticuerpos biológicamente activos tienen una actividad específica de al menos 20%, 30% o 40%, y preferiblemente de al menos 50%, 60%, ó 70%, y más preferiblemente de al menos 80%, 90% ó 95%- 1000% de la de un anticuerpo nativo (no sintético), endógeno o relacionado y conocido. Los métodos de ensayo y de cuantificación miden la actividad enzimática y la especificidad del substrato, como se conoce por aquellos expertos en la técnica. En otro aspecto, la invención se refiere a anticuerpos de humano y a fragmentos de unión al antígeno, como se describe aquí, los cuales se modifican por la unión covalente de una porción orgánica. Dicha modificación puede producir un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno con propiedades farmacocinéticas mejoradas (es decir, vida media en suero incrementada ¡n vivo). La porción orgánica puede ser un grupo polimérico hidrófilo, lineal o ramificado, un grupo de ácido graso, o un grupo de éster de ácido graso. En modalidades particulares, el grupo polimérico hidrófilo puede tener un peso molecular de aproximadamente 800 a aproximadamente 120,000 Daltones y puede ser un polialcano glicol (es decir, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol (PPG)), polímero de carbohidrato, polímero de aminoácido o polivinilpirrolidona, y el grupo de ácido graso o de éster de ácido graso puede comprender de aproximadamente ocho a aproximadamente cuarenta átomos de carbono. Los anticuerpos modificados y fragmentos de unión al antígeno de la invención pueden comprender una o más porciones orgánicas que están covalentemente unidas, ya sea directamente o indirectamente, al anticuerpo. Cada porción orgánica que está unida a un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la invención puede ser independientemente un grupo polimérico hidrófilo, un grupo de ácido graso o un grupo de éster de ácido graso. Como se utiliza aquí, el término "ácido graso" abarca ácidos mono- carboxílicos y ácidos di- carboxílicos. Un "grupo polimérico hidrófilo," como se utiliza el término aquí, se refiere a un polímero orgánico que es más soluble en agua que en octano. Por ejemplo, la polilisina es más soluble en agua que en octano. Por lo tanto, un anticuerpo modificado por la unión covalente de polilisina está abarcado por la invención. Los polímeros hidrófilos adecuados para modificar a los anticuerpos de la invención pueden ser lineales o ramificados e incluyen, por ejemplo, polialcano glicoles (por ejemplo, PEG, monometoxi- polietilenglicol (mPEG), PPG y los similares), carbohidratos (por ejemplo, dextrán, celulosa, oligosacáridos, polisacáridos y los similares), polímeros de aminoácidos hidrófilos (es decir, polilisina, poliarginina, poliaspartato y los similares), óxidos de polialcano (es decir, óxido de polietileno, óxido de polipropileno y los similares) y polivinilpirrolidona. Preferiblemente, el polímero hidrófilo que modifica al anticuerpo de la invención tiene un peso molecular de aproximadamente 800 a aproximadamente 150,000 Daltpnes como una entidad molecular separada. Por ejemplo, se pueden utilizar PEG5000 y PEG2o,ooo, en donde el subíndice es el peso molecular promedio del polímero en Daltones. El grupo polimérico hidrófilo puede ser sustituido con uno a aproximadamente seis grupos de alquilo, ácido graso o éster de ácido graso. Los polímeros hidrófilos que son sustituidos con un grupo de ácido graso o de éster de ácido graso puedan ser preparados mediante el empleo de métodos adecuados. Por ejemplo, un polímero que comprende un grupo amina puede ser acoplado a un carboxilato del ácido graso o éster de ácido graso, y un carboxilato activado (por ejemplo, activado con ?,?-carbonil diimidazol) en un ácido graso o éster de ácido graso puede ser acoplado a un grupo hidroxilo en un polímero. Los ácidos grasos y ésteres de ácido graso adecuados para modificar anticuerpos de la invención pueden ser saturados o pueden contener una o más unidades de saturación. Los ácidos grasos que son adecuados para modificar anticuerpos de la invención incluyen, por ejemplo, n- dodecanoato (C12, laurato), n- tetradecanoato (Cu, miristato), n-octadecanoato (C^, estearato), n- eicosanoato (C2o, araquidato), n-docosanoato (C22, behenato), n- triacontanoato (C3o), n- tetracontanoato (C4o), cis-A9- octadecanoato (C18> oleato), todos los cis-?d, 8, 11 , 14-eicosatetraénoato (C2o, araquidonato), ácido octanedioico, ácido tetradecanedioico, ácido octadecanedioico, ácido docosanedioico, y los similares. Los ésteres de ácido graso adecuados incluyen mono- ésteres de ácidos dicarboxílicos que comprenden un grupo alquilo inferior lineal o ramificado. El grupo alquilo inferior puede comprender de uno a aproximadamente doce, preferiblemente de uno a aproximadamente seis, átomos de carbono. Los anticuerpos modificados de humano y fragmentos de unión al antígeno pueden ser preparados utilizando métodos adecuados, tales como mediante la reacción con uno o más agentes modificadores. Un "agente modificador" como el término se utiliza aqúí, se refiere a un grupo orgánico adecuado (es decir, polímero hidrófilo, un ácido graso, un éster de ácido graso) que comprende un grupo activador. Un "grupo activador" es una porción química o grupo funcional que puede, bajo condiciones apropiadas, reaccionar con un segundo grupo químico formando así un enlace covalente entre el agente modificador y el segundo grupo químico. Por ejemplo, los grupos activadores reactivos a amina incluyen grupos electrofílicos tales como tosilato, mesilato, halógeno (cloro, bromo, flúor, yodo), ésteres de N-hidroxisuccinimidilo (NHS), y los similares. Los grupos activadores que pueden reaccionar con tioles incluyen, por ejemplo, maleimida, yodoacetilo, acri illo, piridil disulfuros, tiol del ácido 5- tiol-2- nitrobenzoico (TNB- tiol), y los similares. Un grupo funcional aldehido puede ser acoplado a las moléculas que contienen amina o hidrazida, y un grupo azida puede reaccionar con un grupo de fósforo trivalente para formar uniones fosforamidato o fosforimida. Los métodos adecuados para introducir grupos activadores dentro de moléculas se conocen en la técnica (véase por ejemplo, Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Acádemic Press: San Diego, CA (1996)). Un grupo activador puede unirse directamente al grupo orgánico (es decir, polímero hidrófilo, ácido graso, éster de ácido graso), o a través de una porción de unión, por ejemplo un grupo divalente C Ci2 en donde uno o más átomos de carbono pueden ser reemplazados por un heteroátomo tal como oxígeno, nitrógeno o azufre. Las porciones de unión adecuadas incluyen, por ejemplo, tetraetilenglicol, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- y -CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-. Los agentes modificadores que comprenden una porción de unión pueden producirse, por ejemplo, mediante la reacción de una mono-Boc-alquildiamina (es decir, mono-Boc- etilendiamina, mono-Boc-diaminohexano) con un ácido graso en la presencia de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) para formar un enlace amida entre el amino libre y el carboxilato de ácido graso. El grupo protector Boc puede removerse a partir del producto mediante tratamiento con ácido trifluoroacético (TFA) para exponer una amina primaria que puede estar acoplada a otro carboxilato como se describió, o se puede hacer reaccionar con anhídrido maléico y el producto resultante se cicliza para producir un derivado maleimido activado del ácido graso. (Véase, por ejemplo, Thompson, et al., WO 92/16221 las enseñanzas completas de la cual se incorporan aquí como referencias.) Los anticuerpos modificados de la invención pueden producirse mediante la reacción de un anticuerpo de humano o fragmento de unión al antígeno con un agente modificador. Por ejemplo, las porciones orgánicas puede unirse al anticuerpo de manera sitio no específico al emplear un agente modificador reactivo de amina, por ejemplo, un éster NHS o PEG. Los anticuerpos modificados de humano o fragmentos de unión al antígeno también pueden prepararse mediante la reducción de enlaces disulfuro (es decir, enlaces disulfuro intracadena) de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno. El anticuerpo reducido o el fragmento de unión al antígeno puede entonces hacerse reaccionar con un agente modificador de reactivo tiol para producir el anticuerpo modificado de la invención. Los anticuerpos modificados de humano y los fragmentos de unión al antígeno que comprenden una porción orgánica que está unida a sitios específicos de un anticuerpo de la presente invención pueden prepararse utilizando los métodos adecuados, tales como proteolisis reversa (Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3: 147- 153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5: 41 1 - 417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6 (10): 2233- 2241 (1997); Itoh et al,, Bioorg. Chem., 24 (1 ): 59-68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56 (4): 456- 463 ( 997)), y los métodos descritos en Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996).

Anticuerpos anti- idiotipo a composiciones de anticuerpo anti-IL-6 Además de los anticuerpos monoclonales o quiméricos anti-IL-6, la presente invención también se dirige a un anticuerpo anti- idiotipo (anti-ld) específico para dichos anticuerpos de la invención. Un anticuerpo anti-ld es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos generalmente asociados con la región de unión al antígéno de otro anticuerpo. El anti-ld puede prepararse mediante la inmunización de un animal de la misma especie y tipo genético (es decir cepa de ratón) como la fuente del anticuerpo Id con el anticuerpo o una región que contiene la CDR del mismo. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante y producirá un anticuerpo anti-ld. El anticuerpo anti-ld también puede ser utilizado como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmune incluso en otro animal, que produce un anticuerpo denominado anti- anti-ld.

Composiciones de anticuerpo anti-IL-6 La presente invención también provee al menos una composición de anticuerpo anti-IL-6 que comprenden menos un, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o más anticuerpos anti-IL-6 de los mismos, como se describe aquí y/o como se conoce en la técnica que se proveen en una composición, mezcla o forma que no ocurre de manera natural. Dichas composiciones comprenden composiciones que no ocurre de manera natural que comprenden al menos una o dos variantes, dominios, fragmentos, o variantes específicas de longitud total, deletadas C- y/o N- terminalmente de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-IL-6 seleccionada a partir del grupo que consiste del 70- 100% de los aminoácidos contiguos de SEQ ID NOS: 1 , 2, 3; 4, 5, 6, 7, 8, o fragmentos específicos, dominios o variantes de las mismas. Las composiciones preferidas de anticuerpo anti-IL-6 incluyen al menos uno o dos fragmentos, dominios o variantes de longitud total como al menos una porción que contiene la CDR o LBR de la secuencia del anticuerpo anti-IL-6 del 70-100% de SEQ ID NOS: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, o fragmentos específicos, dominios o variantes de las mismas. Las composiciones preferidas adicionales comprenden 40- 99% de al menos el 70- 100% de SEQ ID NOS: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, o fragmentos específicos, dominios o variantes de las mismas. Dichos porcentajes de la composición son por peso, volumen, concentración, molaridad, o molalidad como soluciones líquidas o soluciones secas, mezclas, suspensiones, emulsiones o coloides, como se conoce en la técnica o como se describe aquí. Las composiciones de anticuerpo anti-IL-6 de la presente invención pueden comprender adicionalmente al menos una de una cantidad, adecuada y efectiva de una composición o composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo anti-IL-6 a una célula, tejido, órgano, animal o paciente qué necesite de dicha modulación, tratamiento o terapia, comprendiendo además de manera opcional al menos uno seleccionado a partir de al menos un antagonista del TNF (es decir, pero no limitado a un anticuerpo del TNF o fragmento, un receptor del TNF soluble o un fragmento, proteínas de fusión de los mismos, o un antagonista del TNF de molécula pequeña), un antirreumático (es decir, metotrexato, auranofina, aurotioglucosa, azatioprina, etanercept, tiomalato sódico de oro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalzína), un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (NSAID), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano (es decir, aminoglucósido, un antifungal, un antiparasitario, un antiviral, un carbapenem, cefalosporina, una fluoroquinolona, un macrólido, una penicilina, una sulfonamida, una tetraciclina, otro antimicrobiano), un antisoriático, un corticosteroide, un esteroide anabólico, un agente relacionado con diabetes, un mineral, un nutricional, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada con calcio, un antidiarreico, un antitusivo, un antiemético, un antiulcerante, un laxante, un anticoagulante, una eritropoietina (por ejemplo, epoetina alfa), una filgastrima (por ejemplo, G-CSF, Neupogen), una sargramostima (GM-CSF, Leucina), una inmunización, una inmunoglobulina, un ¡nmunosupresor (es decir, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), una hormona de crecimiento, un fármaco de reemplazo hormonal, un modulador del receptor de estrógeno, un midriático, un cicloplégico, un agente de alquilación, un antimetabolito, un inhibidor mitótico, un radiofarmacéutico, un antidepresivo, un agente antimanía, un antisicótico, un ansiolítico, un hipnótico, un simpatomimético, un estimulante, donepezil, tacrina, un medicamento para asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrieno, una metilxantina, una cromolina, una epinefrina o análogo de epinefrina, dornasa alfa (Pulmozima), una citocina o un antagonista a citocina. Los ejemplos no limitantes de dichas citocinas incluyen, pero no se limitan a, cualesquiera de IL-1 a IL-23 Las dosis adecuadas se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2a Edición, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharniacopoeia, Tarascón Pocket Pharmacopoeia 2000, edición de lujo, Tarascón Publishing, Loma Linda, CA (2000), cada una de dicha referencias se incorpora completamente aquí como referencia. Dicha actividad anti-cáncer o anti-infección también puede incluir moléculas tipo toxina que están asociadas, unidas, co-formuladas o coadministradas con al menos un anticuerpo de la presente invención. La toxina puede actuar opcionalmente para eliminar selectivamente la célula o tejido patológico. La célula patológica puede ser una célula cancerosa u otra célula. Dichas toxinas pueden ser, pero no se limitan a, toxina purificada o recombinante o fragmento de toxina que comprende al menos un dominio citotóxico funcional de toxina, por ejemplo, seleccionar a partir de al menos una de ricina, toxina de difteria, toxina de veneno, o una toxina bacteriana. El término toxina también incluye tanto endotoxinas y exotoxinas producidas por cualesquiera baterías o virus que ocurren de manera natural, mutantes o recombinantes los cuales pueden ocasionar cualquier condición patológica en humanos y en otros mamíferos, incluyendo choque tóxico, el cual puede producir la muerte. Dichas toxinas pueden incluir, pero no se limitan a, enterotoxina lábil al calor (LT) enterotoxigénica de E. coli, enterotoxina estable al calor (ST), cítotoxina de Shigella, enterotoxinas de Aeromonas, toxina- 1 de síndrome de choque tóxico (TSST- ), enterotoxina A Staphilococal (SEA), B (SEB), o C (SEC), enterotoxinas estreptococal y similares. Dichas bacterias incluyen, pero no se limitan a, cepas de una especie de E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enterohemorrágica (por ejemplo, cepas de serotipo 0157:H7), especies de Staphylococcus (por ejemplo, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), especies de Shigella (por ejemplo, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, y Shigella sonnei), especies de Salmonella (por ejemplo, Salmonella typhi, Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), especies de Clostridium (por ejemplo, Clostndium períríngens, Clostridium dificile, Clostridium botulinium), especies de Camphlobacter (por ejemplo, Camphlobacter jejuni, Camphlobacter fetus), especies de Heliobacter (por ejemplo, Heliobacter pylori), especies de Aeromonas (por ejemplo, Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersinia enterocolitica, especies de Vibrios (es decir, Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), especies de Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa, y estreptococos. Véase, por ejemplo, Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3a ed., pp 1-13, Little, Brown and Co., Boston, (1990); Evans et al., eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2a Ed., pp 239-254, Plenum Medical Book Co., New York (1991 ); Mandell et al., Principies and Practice of Infectious Diseases, 3a Ed., Churchill Livingstone, New York (1990); Berkow et al, eds., The Merck Manual, 16a edición, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992; Wood et al., FEMS Microbiology Immunology, 76: 121- 134 (1991 ); Marrack et al., Science, 248: 705- 71 1 (1990), los contenidos de dichas referencias se incorporan completamente aquí corno referencias. Los compuestos de anticuerpo anti-IL-6, composiciones o combinaciones de la presente invención pueden comprender adicionalmente al menos uno de cualquier auxiliar adecuado, tal como, pero no limitado a, eluyente, aglutinante, estabilizante, reguladores de pH, sales, solventes lipófilos, conservador, adyuvante o los similares. Los auxiliares farmacéuticamente aceptables se prefieren. Los ejemplos no limitantes de, y métodos para preparar dichas soluciones estériles se conocen bien en la técnica, tales como, pero limitados a, Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edición, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser seleccionados de manera rutinaria de manera que sean adecuados para el modo de administración, solubilidad y/o estabilidad de la composición del anticuerpo anti-IL-6, fragmento o vanante como se conoce bien en la técnica o como se describe aquí. Los excipientes farmacéuticos y aditivos útiles en la presente composición incluyen pero no se limitan a proteínas, péptidos, aminoácidos, lípidos, y carbohidratos (es decir, azúcares, incluyendo monosacáridos, di-, tri-, tetra-, y oligosacáridos; azúcares derivadas tales como alditoles, ácidos aldónicos, azúcares esterificadas y los similares; y polisacáridos o polímeros de azúcar), los cuales pueden presentarse de manera única o en combinación, comprendiendo solo o en combinación 1- 99.99% en peso o volumen. Los excipientes de proteína ejemplares incluyen albúmina de suero tal como albúmina de suero de humano (HSA), albúmina recombinante de humano (rHA), gelatina, caseína y los similares. Los componentes de aminoácidos/anticuerpo representativos, los cuales también pueden funcionar con una capacidad reguladora de pH, incluyen alanina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartame, y los similares. Un aminoácido preferido es la glicina. Los excipientes de carbohidrato adecuados para uso en la invención incluyen, por ejemplo, monosacáridos tales como fructuosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa, y los similares; los disacáridos, tales como sacarosa, trehalosa, celobiosa, y los similares; polisacráridos, tales como rafinosa, melezitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones, y los similares; y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol), mioinositol y los similares. Los excipientes de carbohidrato preferidos para uso en la presente invención son manitol, trehalosa, y rafinosa. Las composiciones de anticuerpo anti-IL-6 también pueden incluir un regulador de pH o un agente para ajuste de pH; típicamente, el regulador de pH es una sal preparada a partir de un ácido o base inorgánica. Los reguladores de pH representativos incluyen sales de ácidos orgánicos tales como sales de ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucónico, ácido carbónico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético, o ácido ftálico; Tris, hidrocloruro de trometamina, o reguladores de pH de fosfato. Los reguladores de pH preferidos para uso en las presentes composiciones son sales de ácido orgánico tales como citrato.

Adicionalmente, las composiciones de anticuerpo anti-IL-6 de la invención pueden incluir excipientes/aditivos poliméricos tales como polivinilpirrolidonas, ficoles (un azúcar polimérica), dextratos (por ejemplo, ciclodextrinas, tales como 2- hidroxidopropil-ß- ciclodextrina), polietilenglicoles, agentes saborizantes, agentes antimicrobianos, edulcorantes, antioxidantes, agentes anti-estática, agentes tensioactivos (es decir, polisorbatos tales como "TWEEN 20" y "TWEEN 80"), lípidos (por ejemplo, fosfolípidos, ácidos grasos), esteroides (es decir, colesterol), y agentes quelantes (es decir, EDTA). Estos excipientes farmacéuticos conocidos y otros excipientes adicionales y/o aditivos adecuados para uso en las composiciones del anticuerpo, porción o variante anti-IL-6 de conformidad con la invención se conocen en la técnica, es decir, como se listan en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19a ed., Williams & Williams, (1995), y en la "Physician's Desk Reference", 52a ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), las descripciones de los cuales se incorporan completamente aquí como referencias. Los materiales vehículos o excipientes preferidos son carbohidratos (es decir, sacáridos y alditoles) y reguladores de pH (es decir, citrato) o agentes poliméricos.

Formulaciones Como se mencionó anteriormente, la invención se provee para formulaciones estables, las cuales son preferiblemente un regulador de pH con solución salina o una sal elegida, así como soluciones conservadas y formulaciones que contienen un conservador así como formulaciones conservadas de múltiples usos para uso farmacéutico y veterinario, que comprenden al menos un anticuerpo anti-IL-6 en una formulación farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones conservadas contienen al menos un conservador conocido o seleccionado opcionalmente a partir del grupo que consiste de al menos un fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, nitrito fenilmercúrico, fenoxietanol, formaldehído, clorobutanol, cloruro de magnesio (es decir, hexahidrato), alquilparaben (metil, etil, propil, butil y los similares), cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, dehidroacetato de sodio y timerosal, o mezclas de los mismos en un diluyente acuoso. Cualquier concentración o mezcla adecuada puede ser utilizada como se conoce en la técnica, tal como 0.001 -5% o cualquier intervalo o volumen del mismo, tal como, más no limitándose a 0.001 , 0.003, 0.005, 0.009, 0.01 , 0.02, 0.03, 0.05, 0.09, 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1 , 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1 , 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1 , 3.2, 3.3, 3.4, 3.5. 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.3, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, o cualquier intervalo o valor en éstos. Los ejemplos no limitantes incluyen, sin conservador, 0.1 - 2% de m-cresol (es decir, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.1-3% de alcohol benzílico (por ejemplo, 0.5, 0.9, 1 .1 , 1.5, 1 .9, 2.0, 2.5%), 0.001-0.5% de timerosal (es decir, 0.005, 0.01 ), 0.001-2.0% de fenol (es decir, 0.05, 0.25, 0.28, 0.5, 0.9, 1 .0%), 0.0005-1.0% de alquilparaben(os) (por ejemplo, 0.00075, 0.0009, 0.001 , 0.002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01 , 0.02, 0.05, 0.075, 0.09, 0.1 , 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0.9, 1.0%), y los similares. Como se mencionó anteriormente, la invención provee un articulo de fabricación, que comprende material de empaquetamiento y al menos un frasco que comprende una solución de al menos un anticuerpo anti-IL-6 con los reguladores y/o conservadores prescritos, opcionalmente en un diluyente acuoso, en donde dicho material de empaquetamiento comprende una etiqueta que indica que dicha solución puede mantenerse por un periodo de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 horas o más tiempo. La invención comprende además un artículo de fabricación, que comprende material de empaquetamiento, un primer frasco que comprende en forma liofilizada al menos un anticuerpo anti-IL-6, y un segundo frasco que comprende un diluyente acuoso del regulador de pH o conservador prescrito, en donde dicho material de empaquetamiento comprende una etiqueta que instruye al paciente a reconstituir el al menos un anticuerpo anti-IL-6 en el diluyente acuoso para formar una solución que puede mantenerse durante un periodo de 24 horas o más. Al menos un anticuerpo anti-IL-6 utilizado de conformidad con la presente invención puede producirse mediante métodos recombinantes, incluyendo a partir de célula de mamífero o de preparaciones transgénicas, o se puede purificar a partir de otras fuentes biológicas, como se describe aquí o como se conoce en la técnica.

El intervalo dé ai menos un ahilcüérpo anti-IL-6 en el producto de la presente invención incluye cantidades que se producen después de la reconstitución, si están en un sistema húmedo/seco, concentraciones de aproximadamente 1.0 µg/ml a aproximadamente 1000 mg/ml, aunque también son operables las concentraciones menores y mayores y son dependientes del vehículo de administración pretendido, por ejemplo, formulaciones en solución diferirán de los métodos de parche transdérmico, pulmonar, transmucosal, o bomba osmótica o microbomba. Preferiblemente, el diluyente acuoso comprende además opcionalmente un conservador farmacéuticamente aceptable. Los conservadores preferidos incluyen aquellos seleccionados a partir del grupo que consiste de fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol benzílico, alquilparaben (metil, etil, propil, butil y los similares), cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, dehidroacetato de sodio y timerosal, o mezcla de los mismos. La concentración del conservador utilizado en la formulación es una concentración suficiente para producir un efecto antimicrobiano. Dichas concentraciones son dependientes del conservador seleccionado y se determinan fácilmente por el experto la técnica. Otros excipientes, es decir, agentes de isotonicidad, reguladores de pH, antioxidantes, potenciadores conservadores, pueden añadirse de manera opcional y preferible al diluyente. Un agente de isotonicidad, tal como glicerina, se utiliza comúnmente a concentraciones conocidas. Un regulador de pH fisiológicamente tolerado preferiblemente se añade para proveer un control mejorado del pH. Lás formulaciones pueden abarcar un intervalo amplio de pHs, tal como de aproximadamente pH 4 a. aproximadamente pH 10, e intervalos preferidos de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 9, y un intervalo más preferido de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0. Preferiblemente las formulaciones de la presente invención tienen un pH entre aproximadamente 6.8 y aproximadamente 7.8. Los reguladores de pH preferidos incluyen reguladores de pH de fosfato, más preferiblemente fosfato de sodio, particularmente solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS). Otros aditivos, tales como solubilizantes farmacéuticamente aceptables como Tween 20 (monolaurato de polioxietilen (20) sorbitano), Tween 40 (monopalmitato de polioxietilen (20) sorbitano), Tween 80 (monooleato de polioxietilen (20) sorbitano), Pluronic F68 (copolímeros en bloque de polioxietilen polioxipropileno), y PEG (polietilenglicol) o agentes tensioactivos no iónicos tales como polisorbato 20 u 80 o poloxámero 184 o 188, polioles Pluronic®, otros co-. copolímeros en bloque, y quelantes tales como EDTA y EGTA se pueden añadir de manera opcional a las formulaciones o composiciones para reducir la agregación. Estos aditivos son particularmente útiles si se utiliza una bomba o contenedor plástico para administrar la formulación. La presencia del agente tensioactivo farmacéuticamente aceptable mitiga la propensión de la proteína a agregarse. Las formulaciones de la presente invención puede prepararse mediante un procedimiento que comprende la mezcla de al menos un anticuerpo anti-IL-6 y un conservador seleccionado a partir del grupo que consiste de fenol, m-cresól, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol benzílico, alquilparaben (metil, etil, propil, butil y los similares), cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, dehidroacetato de sodio y timerosal, o mezcla de los mismos en un diluyente acuoso. La mezcla de al menos un anticuerpo anti-IL-6 y del conservador en un diluyente acuoso se lleva , a cabo utilizando disolución convencional y procedimientos de mezclado. Para preparar una formulación adecuada, por ejemplo, una cantidad dosificada de al menos un anticuerpo anti-IL-6 en una solución reguladora de pH se combina con el conservador deseado en una solución reguladora de pH en cantidades suficientes para proveer a la proteína y el conservador a las concentraciones deseadas. Las variaciones de este proceso pueden ser reconocidas por un experto en la técnica. Por ejemplo, el orden en que los componentes se añaden, si se utilizan aditivos adicionales, la temperatura y pH a la cual se prepara la formulación, son todos factores que pueden ser optimizados para la concentración y para los modos de administración utilizados. Las formulaciones reclamadas pueden proveerse a los pacientes como soluciones claras o como frascos duales que comprende un frasco de al menos un anticuerpo liofilizado anti-IL-6 que se reconstituye con un segundo frasco que contiene agua, un conservador y/o excipientes, preferiblemente un regulador de pH con fosfato y/o solución salina y una sal elegida, en un diluyente acuoso. Ya sea un frasco con una solución particular o un frasco dual que requiere reconstitución, se puede reutilizar múltiples veces y pueden ser suficientes para un ciclo particular o múltiples ciclos de tratamiento al paciente y por lo tanto pueden proveer uri régimen de tratamiento más conveniente que el actualmente disponible. Los presentes artículos de fabricación reclamados son útiles para la administración durante un periodo inmediato o durante veinticuatro horas o mayor. Por consiguiente, los artículos de fabricación actualmente reclamados ofrecen ventajas significativas al paciente. Las formulaciones de la invención pueden opcionalmente almacenase de manera segura a temperaturas de aproximadamente 2 a aproximadamente 40°C y retener la actividad biológica de la proteína por períodos de tiempo extendidos, por lo tanto, permitiendo que una etiqueta del empaque indique que la solución puede mantenerse y/o utilizarse durante un período de 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72, ó 96 horas o mayor. Sí se utiliza el diluyente conservado, dicha etiqueta puede incluir el uso por hasta 1-12 meses, medio año, año y medio, y/o dos años Las soluciones de al menos un anticuerpo anti-IL-6 en la invención puede prepararse mediante un procedimiento que comprende mezclado de al menos un anticuerpo en un diluyente acuoso. La mezcla se lleva a cabo utilizando disolución convencional y procedimientos de mezclado. Para preparar un diluyente adecuado, por ejemplo, una cantidad medida de al menos un anticuerpo en agua o regulador de pH se combina en cantidades suficientes para proveer la proteína y opcionalmente un conservador o regulador de pH a las concentraciones deseadas. Las variaciones de este procedimiento podrían ser reconocidas por un experto en la técnica. Por ejemplo, el orden en el qué' sé añaden los componentes, si se utilizan aditivos adicionales, la temperatura y pH a la que se prepara la formulación, son todos factores que pueden ser optimizados para la concentración y para los modos de administración utilizados. Los productos reclamados pueden proveerse a pacientes como soluciones claras o como frascos duales que comprenden un frasco de al menos un anticuerpo liofilizado anti-IL-6 que se reconstituye con un segundo frasco que contiene el diluyente acuoso. Ya sea un frasco con una solución particular o un frasco dual que requiere reconstitución, se puede reutilizar múltiples veces y puede ser suficiente para un ciclo particular o ciclo múltiple de tratamiento al paciente y por lo tanto pueden proveer un régimen de tratamiento más conveniente que el actualmente disponible. Los productos reclamados pueden proveerse indirectamente a los pacientes mediante la provisión de éstos a farmacias, clínicas, u otras instituciones e instalaciones, como soluciones claras o frascos duales que comprenden un frasco de al menos un anticuerpo liofilizado de anti-IL-6 que se reconstituye con un segundo frasco que contiene el diluyente acuoso. La solución clara en este caso puede ser de hasta un litro o incluso más grande en tamaño, proveyendo un recipiente grande a partir del cual se pueden retirar pequeñas porciones de al menos una solución del anticuerpo, una o múltiples veces, para transferirlos dentro de frascos más pequeños y proveyéndolos a la farmacia o clínicas para sus clientes y/o pacientes.

Los dispositivos" reconocidos qué Comprenden estos sistemas de frasco particular incluyen aquellos dispositivos de inyector de pluma para administrar una solución tales como plumas BD, BD Autojector®, Humaject®, Novo Pen®, B-D® Pen, AutoPen®, y OptiPen®, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®, Humatro PEN®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, Biojector®, iject®, J-tip Needle-Free Injector®, Intraject®, Medi-Ject®, es decir, como se elaboraron o se desarrollaron por Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ, www.bectondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Suiza, www.disetronic.com; Bioject, Portland, Oregon (www.bioject.com); National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, RU, www.weston-medicál.com), Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, www.mediject.com). Los dispositivos reconocidos que comprenden un sistema de frasco dual incluyen aquellos sistemas de inyector en pluma para reconstituir un fármaco liofilizado en un cartucho para la administración de la solución reconstituida tal como el HumatroPen®. Los productos actualmente reclamados incluyen material de empaquetamiento. El material de empaquetamiento se provee, en adición a la información requerida por, las agencias reguladoras, las condiciones bajo las cuales el producto puede ser utilizado. El material de empaquetamiento de la presente invención provee instrucciones al paciente para reconstituir al menos un anticuerpo anti-IL-6 en el diluyente acuoso para formar una solución y para utilizar la solución durante un periodo de 2-24 horas o más para el frasco dos, producto húmedo/seco. Para el frasco único, el producto en solución, la etiqueta indica que dicha solución puede ser utilizada durante un periodo de 2- 24 horas o más. Los productos actualmente reclamados son útiles para el uso de productos farmacéuticos por humanos. Las formulaciones de la presente invención pueden prepararse mediante un procedimiento que comprende mezclado de al menos un anticuerpo anti-IL-6 y un regulador de pH seleccionado, preferiblemente un regulador de pH con fosfato que contiene solución salina o una sal elegida. La mezcla de al menos un anticuerpo y del regulador de pH en un diluyente acuoso se lleva a cabo utilizando procedimientos de disolución y de mezclado convencional. Para preparar una formulación adecuada, por ejemplo, una cantidad dosificada de al menos un anticuerpo en agua o regulador de pH, ésta se combina con el agente regulador de pH deseado en agua en cantidades suficientes para proveer la proteína y el regulador de pH a las concentraciones deseadas. Las variaciones de este procedimiento podrían ser reconocidas por un experto en la técnica. Por ejemplo, el orden en que se añaden los componentes, si se utilizan aditivos adicionales, la temperatura y pH a la cual se prepara la formulación, son todos factores que pueden ser optimizados para la concentración y modos de administración utilizados. Las formulaciones estables o conservadas reclamadas pueden proveerse a los pacientes como soluciones claras o como frascos duales que comprenden un frasco de al menos un anticuerpo liofilizado de anti-IL-6 que se reconstituye con un segundo frasco que contiene un conservador o regulador de pH y excipientes en un diluyente acuoso. Ya sea un frasco con una solución particular o un frasco dual que requiere reconstitución se puede reutilizar múltiples veces y pueden ser suficientes para un ciclo particular o ciclos múltiples de tratamiento al paciente y por lo tanto pueden proveer un régimen de tratamiento más conveniente que el actualmente disponible. Al menos un anticuerpo anti-IL-6 ya sea en formulaciones estables o conservadas o en las soluciones descritas aquí, se puede administrar a un paciente de conformidad con la presente invención por medio de una variedad de métodos de administración incluyendo inyección SC o IM; administración transdérmica, pulmonar, transmucosal, implante, bomba osmótica, cartucho, microbomba, u otros medios apreciados por el experto en la técnica, como se conocen bien en la técnica.

Aplicaciones terapéuticas La presente invención también provee un método para modular o tratar al menos una enfermedad relacionada con IL-6, en una célula, tejido, órgano, animal, o paciente, como se conoce en la técnica o como se describe aquí, utilizando al menos un anticuerpo de IL-6 de la presente invención. La presente invención también provee un método para modular o tratar al menos una enfermedad relacionada con IL-6, en una célula, tejido, órgano, animal, o paciente incluyendo, pero no limitados a, al menos una enfermedad de obesidad, una enfermedad relacionada con el sistema inmune, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad infecciosa, una enfermedad maligna o una enfermedad neurológíca.

La presente invención también provee un método para modular o tratar al menos una enfermedad relacionada con el sistema inmune, en una célula, tejido, órgano, animal, o paciente incluyendo, pero no limitada a, GG pero no limitada a, por lo menos una enfermedad de artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis reumatoide juvenil de inicio sistémico, artritis soriática, espondilitis anquilosante, úlcera gástrica, artropatías seronegativas, osteoartritis, enfermedad intestinal inflamatoria, colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico, síndrome de antifosfolípido, iridociclitis/uveitis/neuritis óptica, fibrosis pulmonar idiopática, vasculitis sistémica/granulomatosis de Wegener, sarcoidosis, procedimientos de reversión de orquitis/vasectomía, enfermedades alérgicas/atópicas, asma, rinitis alérgica, eczema, dermatitis alérgica por contacto, conjuntivitis alérgica, neumonitis por hipersensibilidad, transplantes, rechazo de transplante de órgano, enfermedad de injerto-contrahospedero, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, síndrome de sepsis, sepsis gram positiva, sepsis gram negativa, sepsis de cultivo negativo, sepsis fungal, fiebre neutropénica, urosepsis, meningococemia, trauma/hemorragia, quemaduras, exposición a radiación ionizante, pancreatitis aguda, síndrome de dificultad respiratoria de adulto, artritis reumatoide, hepatitis inducida por alcohol, patologías inflamatorias crónicas, sarcoidosis, patología de Crohn, anemia de célula falciforme, diabetes, nefrosis, enfermedades atópicas, reacciones de hipersensibilidad, rinitis alérgica, fiebre del heno, rinitis perenne, conjuntivitis, endometriosis, asma, urticaria, anafalaxis sistémica, dermatitis, anemia perniciosa, enfermedad hemolítica, trombocitopenia, rechazo al injerto de cualquier órgano o tejido, rechazo de transplante de riñon, rechazo de transplante de corazón, rechazo de transplante de hígado, rechazo de transplante de páncreas, rechazo de transplante de pulmón, rechazo de transplante de médula ósea (BMT), rechazo de aloinjerto de piel, rechazo de transplante de cartílago, rechazo de injerto de hueso, rechazo de transplante de intestino delgado, rechazo de implante de timo fetal, rechazo de transplante de paratiroide, rechazo de xenoinjerto de cualquier órgano o tejido, rechazo de aloinjerto, reacciones de hipersensibilidad anti-receptor, enfermedad de Graves, enfermedad de Raynoud, diabetes tipo B resistente a insulina, asma, miastenia gravis, citotoxicidad mediada por anticuerpo, reacciones de hipersensibilidad tipo III, lupus eritematoso sistémico, síndrome de POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gamopatía monoclonal, y síndrome de cambios en la piel), polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gamopatía monoclonal, síndrome de cambios en la piel, síndrome de antifosfolípido, pénfigo, escleroderma, enfermedad de tejido conectivo mezclado, enfermedad idiopática de Addison, diabetes mellitus, hepatitis activa crónica, cirrosis biliar primaria, vitíligo, vasculitis, síndrome post cardiotomía-MI, hipersensibilidad tipo IV, dermatitis por contacto, neumonitis por hipersensibilidad, rechazo de aloinjerto, granulomas debidos a organismos intracelulares, sensibilidad a fármaco, metabólico/idiopático, enfermedad de Wilson, hemacromatosis, deficiencia de antitripsina alfa-1 , retinopatía diabética, tiroiditis de Hashimoto, osteoporosis, evaluación de eje hipotalámico-pituitario-adrenal, cirrosis biliar primaria, tiroiditis, encefalomielitis, caquexia, fibrosis qUística, enfermedad pulmonar crónica neonatal, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), linfohistiocitosis hematofagocítica familiar, condiciones dermatológicas, soriasis, alopecia, síndrome nefrótico, nefritis, nefritis glomerular, insuficiencia renal aguda, hemodiálisis, uremia, toxicidad, preeclampsia, terapia okt3, terapia anti-cd3, terapia de citocina, quimioterapia, terapia por radiación (por ej., incluyendo pero no limitada a astenia, anemia, caquexia, y las similares), intoxicación crónica por salicilato, y las similares. Véase, por ejemplo, the Merck Manual, 12a-1 7a Ediciones, Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., eds., Segunda Edición, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000), cada uno completamente incorporado como referencia. La presente invención también provee un método para modular o tratar por lo menos una enfermedad infecciosa en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, incluyendo, pero no limitada a, por lo menos una de: infección bacteriana aguda o crónica, procesos parasitarios infecciosos agudos y crónicos, incluyendo infecciones bacterianas, virales y fúngales, infección por VIH/neuropatía por VIH, meningitis, hepatitis (A, B o C, o las similares), artritis séptica, peritonitis, neumonía, epiglotitis, e. coli 0 57:h7, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombocitopénica trombolítica, malaria, fiebre hemorrágica del dengue, leishmaniasis, lepra, síndrome de choque tóxico, miositis estreptococal, gangrena gaseosa, tuberculosis por micobacteria, micobacteria aviar intracelular, neumonía por Pneumocystis carinii, enfermedad inflámatoria pélvica, drquitis/epidídimitis, legionela, enfermedad de Lyme, influenza a, virus epstein-barr, síndrome hemafagocítico asociado a órgano vital, encefalitis vital/meningitis aséptica, y similares. La presente invención también provee un método para modular o tratar por lo menos una enfermedad maligna en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, incluyendo, pero no limitada a, por lo menos una de: leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), ALL de célula B, ALL de célula T o ALL de FAB, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielocítica crónica (CML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia de célula pilosa, síndrome mielodisplásico (MDS), un linfoma, enfermedad de Hodgkin, un linfoma maligno, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorectal, carcinoma pancreático, carcinoma nasofaríngeo, hístiocitosis maligna, síndrome paraneoplásíco/hípercalcemia de malignidad, tumores sólidos, adenocarcínomas, sarcomas, melanoma maligno, hemangioma, enfermedad metastásica, reabsorción de hueso relacionada con cáncer, dolor de hueso opcionalmente en combinación con, administrándolo relacionado con cáncer, y similares. Dicho método se puede usar antes, en forma simultánea o después de la administración de dicho anticuerpo IL-6, terapia de radiación, un agente anti-angíogéncio, un agente quimioterapéutico, in inhibidor de la farnesil transferasa o similares. En particular la presente invención proporciona un método para modular o tratar enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, y diabetes autoinmune dependiente de insulina; el tratamiento de infecciones bacterianas; el tratamiento de choque séptico debido a infecciones bacterianas; el tratamiento de infecciones virales; el tratamiento de cánceres tales como el mieloma múltiple; la supresión de metástasis de cáncer; el alivio de caquexia de cáncer; y el tratamiento de enfermedades inflamatorias como la glomerulonefritis proliferativa mesangial, mediante la administración del anticuerpo de la invención. Dicho método puede comprender opcionalmente la administración de una cantidad efectiva de por lo menos una composición o composición farmacéutica que comprenda por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que tenga necesidad de dicha modulación, tratamiento o terapia. Se describen indicaciones para el tratamiento con una terapia de anti-IL-6 en las siguientes referencias, que se incorporan en la presente solicitud como referencia: Van snick, "lnterleukin-6: An Overview" Ann. Rev. Immunol., 8:253-278 (1990); Campbell et al., "Essential Role for Interferon-gamma. And lnterleukin-6 in autoimmune Insulin-Dependent Diabetes in NOD/Wehi Mice", J. Clin. Invest., 87:739-742 (1991 ); Heinrich et al., "lnterleukin-6 Monoclonal Anibody Therapy for a Patient with Plasma Cell Leukemia", Blood, 78(5); 1 198-1204 (1991 ); Starnes et al., "Anti-IL-6 Monoclonal Antibodies Protect Against Lethal Escherichia coli Infection and Lethal Tumor Necrosis Factor-alpha. Challenge in Mice", J. Immunol., 145(12):4185-4191 (1990); Strassman et al., "Evidence for the Involvement of Interleukin 6 in experimental Cáncer Cachexia", J. Clin. Invest., 89:1681-1684 (1992).

Cualquier método de la presente invención puede comprender la administración de una cantidad efectiva de una composición o composición farmacéutica que comprende por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesite de dicha modulación, tratamiento o terapia. Dicho método puede comprender opcionalmente de manera adicional la co-administración o terapia de combinación para tratar dichas enfermedades inmunes o enfermedades malignas, en donde la administración de dicho por lo menos un anticuerpo anti-IL-6, porción específica o variante del mismo, comprende adicíonalmente la administración, previa, simultánea y/o posterior, a por lo menos uno seleccionado de por lo menos un antagonista del TNF (por ej., pero no limitado a un anticuerpo del TNF o un fragmento, un receptor soluble del TNF o un fragmento, proteínas de fusión de los mismos, o un antagonista del TNF de molécula pequeña), un anticuerpo de IL-18 o fragmento, un agonista de IL-18 de molécula pequeña o una proteína de enlace al receptor de IL-18, un anticuerpo IL-1 (incluyendo el IL-1 alfa y el IL-1 beta) o fragmento, un antagonista del receptor de IL-1 soluble, un antirreumático (por ej., metotrexato, auranofina, aurotioglucosa, azatioprina, etanercept, tiomalato sódico de oro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalzina, terapia de radiación, un agente anti-angiogénico, un agente quimioterapéutico, Talidomina), un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (NSAID), un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano (por ej., aminoglucósido, un anti-fungal, un antiparasitario, un antiviral, un carbapenem, cefalosporiria¡ una fluoroquinolona\ un macrólido, una penicilina, una sulfonamida, una tetraciclina, otro antimicrobiano), un antisoriático, un corticosteroide, un esteroide anabólico, un agente relacionado con diabetes, un mineral, un nutricional, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada con calcio, una eritropoietina (por ej., epoetina alfa), una filgrastima (por ej., G-CSF, Neupogen), una sargramostima (GM-CSF, Leucina), una inmunización, una inmunoglobulina, un ¡nmuríosupresor (por ej., basiliximab, ciclosporina, daclizumab), una hormona de crecimiento, un fármaco del reemplazo hormonal, un modulador del receptor estrógeno, un midriático, un cicloplégico, un agente alquilante, un antimetábolito, un inhibidor mitótico, un radiofarmacéutico, un antidepresivo, un agente antimaniaco, un antisicótico, un ansiolítico, un hipnótico, un simpatomimético, un estimulante, donepezil, tacrina, un medicamento para asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrieno, una metilxantina, un cromolina, una epinefrina o un análogo de epinefrina, dormase alfa (Pulmozyma), una citocina o antagonista de citocina. Dosis adecuadas se conocen bien la técnica. Véase, por ejemplo, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2a Edición, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascón Pocket Pharmacopoeia 2000, edición de lujo, Tarascón Publishing, Loma Linda, CA (2000), cada una de dichas referencias están completamente incorporadas aquí como referencias. Los antagonistas del TNF adecuados para composiciones, terapia de combinación, co- administración, dispositivos y/o métodos de la presente invención (qué comprenden adiciohalmente por lo menos un anticuerpo, porción específica y variante del mismo, de la presente invención), incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti-TNF, fragmentos de unión al antígeno de los mismos, y moléculas del receptor que se unen específicamente a TNF; compuestos los cuales previenen y/o inhiben la síntesis del TNF, liberación del TNF o su acción sobre la células blanco, tales como talidomida, tenidap, inhibidores de fosfodiesterasa (por ejemplo, pentoxifilina y rolipram), agonistas del receptor de adenosina A2b y potenciadores del receptor de adenosina A2b; compuestos que previenen y/o inhiben la señalización del receptor del TNF, tales como los inhibidores de la proteincinasa activada por mitógeno (MAP); compuestos que bloquean y/o inhiben la escisión del TNF de la membrana, tales como inhibidores de metaloproteinasa; compuestos que bloquean y/o inhiben la actividad del TNF, tales como inhibidores de enzima que convierte angiotensina (ACE) (por ejemplo, captopril); y compuestos que bloquean y/o inhiben la producción y/o síntesis del TNF, tales como inhibidores de MAP cínasa. Como se utiliza aquí, un "anticuerpo del factor de necrosis tumoral," "anticuerpo del TNF," "anticuerpo TNFa," o fragmento y similares disminuyen, bloquean, inhiben, impiden o interfieren con la actividad del TNFa in vitro, in situ y/o preferiblemente in vivo. Por ejemplo, un anticuerpo adecuado del TNF de humano de la presente invención se puede unir a TNFa e incluye anticuerpos anti-TNF, fragmentos de unión al antígeno del mismo, y mutantes específicos o dominios de los mismos que se unen específicamente al TNFoc. Un anticuerpo del TNF adecuado o fragmento también puede disminuir, bloquear, impedir, interferir, prevenir y/o inhibir al ARN del TNF, síntesis de ADN o síntesis de proteína, liberación del TNF, señalización del receptor del TNF, escisión del TNF de la membrana, actividad del TNF, producción y/o síntesis del TNF. El anticuerpo quimérico cA2 consiste de la región variable de unión al antígeno del anticuerpo lgG1 del TNF de ratón anti-humano que neutraliza la alta afinidad, designado A2, y las regiones constantes de una inmunoglobulina kappa lgG1 de humano. La región Fe de lgG1 de humano mejora la función efectora del anticuerpo alogéneico, incrementa la vida media en el suero circulante y disminuye la inmunogenicidad el anticuerpo. La avidez y especificidad del epítope del anticuerpo quimérico cA2 se deriva a partir de la región variable del anticuerpo A2 de murino. En una modalidad particular, una fuente preferida de ácidos nucleicos que codifican la región variable del anticuerpo A2 de murino es la línea celular de hibridoma A2. El A2 quimérico (cA2) neutraliza el efecto citotóxico tanto del TNFa natural de humano como del recombinante en una manera dosis dependiente. A partir de los ensayos de unión del anticuerpo quimérico cA2 y del TNFa recombinante de humano, la constante de afinidad del anticuerpo quimérico cA2 se calculó como del 1.04x1010M"1. Los métodos preferidos para determinar la especificidad del anticuerpo monoclonal y la afinidad por inhibición competitiva se pueden encontrar en Harlow, et al., antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Colligáh et al., eds., Currént Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, New York, (1992- 2000); Kozbor et al., Immunol. Today, 4: 72- 79 (1983); Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York (1987- 2000); y Muller, Meth. Enzymol., 92: 589- 601 (1983), cuyas referencias se incorporan en su totalidad aquí como referencias. En una modalidad particular, el anticuerpo monoclonal de murino A2 se produce por una línea celular designada c134A. El anticuerpo quimérico cA2 se produce por uña línea celular designada c168A. Ejemplos adicionales de anticuerpos monoclonales anti-TNF que puede ser utilizados en la presente invención se describen en la técnica (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5, 231 , 024; Móller, A. et al., Cytokine 2 (3): 162- 169 (1990); solicitud de Patente de E.U.A. No. 07/943, 852 (presentada el 11 de septiembre de 1992); Rathjen et al., Publicación de Patente Internacional No. WO 91/02078 (publicada el 21 de febrero de 1991 ); Rubin et al., Publicación de Patente EPO No. 0 218 868 (publicada el 22 de abril de 1987); Yone et al., Publicación de Patente EPO No. 0 288 088 (octubre 26 de 1988); Liang et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137: 847-854 (1986); Meager, et al., Hybridoma 6: 305- 31 1 (1987); Fendly et al., Hybridoma 6: 359- 369 (1987); Bringman, et al., Hybridoma 6: 489- 507 (1987); e Hirai, et al., J. Immunol. Meth. 96: 57- 62 (1987), dichas referencias se incorporan en su totalidad aquí como referencias).

Moléculas del receptor del TNF Las moléculas preferidas del receptor del TNF útiles en la presente invención son aquellas que se unen a TNFa con alta afinidad (véase, por ejemplo, Feldmann et al., Publicación de Patente Internacional No. WO 92/07076 (publicada el 30 de abril de 1992); Schall et al., Cell 61 : 361- 370 (1990); y Loetscher et al., Cell 61 : 351 - 359 (1990), dichas referencias se incorporan en su totalidad aquí como referencias) y ocasionalmente poseen una baja inmunogenicidad. En particular, los receptores de superficie celular del TNF de 55 kDa (p55 TNF-R) y de 75 kDa (p75 TNF-R) son útiles en la presente invención. Las formas truncadas de los receptores, que comprenden los dominios extracelu lares (ECD) de los receptores o de las proteínas funcionales de los mismos (véase, por ejemplo, Corcoran et al., Eur. J. Biochem. 223: 831 - 840 (1994)), también son útiles en la presente invención. Las formas truncadas de los receptores del TNF, que comprenden el ECD, han sido detectadas en proteínas de unión inhibidoras a TNFa de 30 kDa y de 40 kDa en orina y el suero (Engelmann, H. et al., J. Biol. Chem. 265: 1531-1536 (1990)). Las moléculas multiméricas del receptor del TNF y las moléculas de fusión del inmunoreceptor del TNF, y derivados y fragmentos o porciones de las mismas, son ejemplos adicionales de moléculas del receptor del TNF las cuales son útiles en los métodos y composiciones de la presente invención. Las moléculas del receptor del TNF que puede ser utilizadas en la invención se caracterizan por su capacidad para tratar pacientes por periodos extendidos con alivio de los síntomas de bueno a excelente y con baja toxicidad. La inmunogenicidad baja y/o elevada afinidad, así como otras propiedades no definidas, pueden contribuir a lograr los resultados terapéuticos. Las moléculas multiméricas del receptor del TNF útiles en la presente invención comprenden toda una porción funcional del ECD de dos o más receptores del TNF asociados mediante uno o más enlazadores polipeptídicos u otros enlazadores no peptídicos, tales como polietilenglicol (PEG). Las moléculas multiméricas puede comprender adicionalmente un péptido señal y una proteína secretada para dirigir la expresión de la molécula multimérica. Estas moléculas multiméricas y métodos para su producción han sido descritas en la solicitud de Patente de E.U.A. No. 08/437, 533 (presentada el 9 de mayo de 1995), el contenido de la cual se incorpora en su totalidad aquí como referencia. Las moléculas de fusión del inmunorreceptor del TNF útiles en los métodos y composiciones de la presente invención comprenden por lo menos una porción de una o más moléculas de inmunoglobulina y toda o una porción funcional de uno o más receptores del TNF. Estas moléculas de fusión del inmunorreceptor pueden ensamblarse como monómeros, o hetera- u homo- multímeros. Estas moléculas de fusión del inmunorreceptor también pueden ser monovalentes o multivalentes. Un ejemplo de dicha molécula de fusión del inmunorreceptor del TNF es la proteína de fusión receptor del TNF/lgG. Las moléculas de fusión del inmunorreceptor del TNF y métodos para su producción han sido descritos en la técnica (Lesslauer et al., Eur. J.

Immunol. 21 : 2883- 2886 (1991 ); Ashkenazi et al., Proc. Nati. Acad. Sc¡. USA 88: 10535- 10539 (1991 ); Peppel et al., J. Exp. Med. 174: 1483- 1439 (1991 ); Kolls et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 : 215- 219 (1994); Butler et al., Cytokine 6 (6): 616- 623 (1994); Baker et al., Eur. J. Immunol. 24: 2040- 2048 (1994); Beutler et al., Patente de E.U.A. No. 5, 447, 851 ; y Solicitud de Patente de E.U.A. No. 08/442, 133 (presentada el 16 de mayo de 1995), cada una de dichas referencias se incorporan en su totalidad como referencias). Los métodos para producir moléculas de fusión del inmunorreceptor también pueden encontrarse en Capón et al., Patente de E.U.A. No. 5, 1 16, 964; Capón et al., Patente de E.U.A. No. 5, 225, 538; y Capón et al., Nature 337: 525- 531 (1989), dichas referencias se incorporan en su totalidad aquí como referencias. Un equivalente funcional, derivado, fragmento o región de la molécula del receptor del TNF se refiere a la porción de la molécula del receptor del TNF, una porción de la secuencia de la molécula del receptor del TNF el cual codifica a la molécula del receptor del TNF, que es de un tamaño y secuencias suficientes para parecerse funcionalmente a las moléculas del receptor del TNF puede ser utilizado en la presente invención (por ejemplo, que se une a TNF con alta afinidad y que poseen baja inmunogenicidad). Un equivalente funcional de la molécula del receptor del TNF también incluye moléculas modificadas del receptor del TNF que se parecen funcionalmente a las moléculas del receptor del TNF que pueden ser utilizadas en la presente invención (por ejemplo, se unen a TNF con alta afinidad y poseen baja inmunogenicidad). Por ejemplo, un equivalente funcional de la molécula del receptor del TNF puede contener un codón "SILENCIOSO" o una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos (por ejemplo, sustitución de un aminoácido ácido por otro aminoácido ácido; o sustitución de un codón que codifica al mismo aminoácido hidrófobo o a un aminoácido hidrófobo diferente por otro codón que codifica un aminoácido hidrófobo). Véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience, New York (1987- 2000). Las citocinas incluyen cualquier citocina conocida. Véase, por ejemplo, CopewithCytokines.com. Los antagonistas de citocinas incluyen, pero no se limitan a, cualquier anticuerpo, fragmento o mimético, cualquier receptor soluble, fragmento o mimético, cualquier antagonista de molécula pequeña, o cualquier combinación de los mismos.

Tratamientos terapéuticos Cualquier método de la presente invención puede comprender un método para tratar un trastorno mediado por IL-6, que comprende la administración de una cantidad efectiva de una composición o composición farmacéutica que comprende por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesite de dicha modulación, tratamiento o terapia. Dicho método puede comprender opcionalmente de manera adicional la co-administración o terapia de combinación para tratar dichas enfermedades inmunes, en donde la administración de dicho por lo menos un anticuerpo anti-IL-6, porción específica o vanante del mismo, comprende adicionalmente la administración, previa a, concurrentemente, y/o posterior, de por lo menos uno seleccionado a partir de por lo menos un antagonista TNF (por ej., pero no limitado a un anticuerpo TNF o fragmento, un receptor TNF soluble o un fragmento, proteínas de fusión de los mismos, o un antagonista del TNF de molécula pequeña), un antirreumático (por ej., metotrexato, auranofina, aurotioglucosa, azatioprina, etanercept, tiomalato sódico de oro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalzina), un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (NSAID), un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antímicrobiano (por ej., aminoglucósido, un antifungal, un antiparasitario, un antiviral, un carbapenem, cefalosporina, una fluoroquinolona, un macrólido, una penicilina, una sulfonamida, una tetraciclina, otro antimicrobiano), un antisoriático, un corticosteroide, un esteroide anabólico, un agente relacionado con diabetes, un mineral, un nutricional, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada con calcio, un antidiarreico, un antitusivo, un antiemético, un antiulcerante, un laxante, un anticoagulante, una eritropoietina (por ej., epoetina alfa), una fílgastrima (por ej., G-CSF, Neupogen), una sargramostima (GM-CSF, Leucina), una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor (por ej., basilíximab, ciclosporina, daclizumab), una hormona de crecimiento, un fármaco de reemplazo hormonal, un modulador del receptor de estrógeno, un midriático, un cicloplégico, un agente de alquilación, un antimetabolito, un inhibidor mitótico, un radiofarmacéutico, un antidepresivo, un agente antimaniaco, un antisicótico, un ansiolítico, un hipnótico, un simpatomimético, un estimulante, donepezil, tacrina, un medicamento para asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrieno, una metilxantina, una cromolina, una epinefrina o análogo de epinefrina, dornasa alfa (Pulmozima), una citocina o un antagonista de citocina. Típicamente, el tratamiento de condiciones patológicas se efectúa con la administración de una cantidad efectiva o dosis de por lo menos una composición de anticuerpo ant¡-IL-6 que en total, en promedio, en una escala de por lo menos aproximadamente 0.01 a 500 miligramos de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 por kilogramo de paciente por dosis, y preferiblemente de por lo menos aproximadamente 0.1 a 100 miligramos de anticuerpo/kg de paciente por administración única o múltiple, dependiendo de la actividad específica contenida en la composición. Alternativamente, la concentración efectiva en suero puede comprender de 0.1-5000 µg/ml de concentración en suero por administración única o múltiple. Las dosis adecuadas se conocen por los practicantes médicos y dependerán, por supuesto, del estado particular de la enfermedad, actividad específica de la composición a ser administrada, y del tratamiento particular a que se someta el paciente. En algunos casos, para lograr la cantidad terapéutica deseada, puede ser necesario proveer administración repetida, es decir, administraciones individuales repetidas de una dosis monitoreada particular o dosis medida, en donde las administraciones individuales se repiten hasta que se logra la dosis diaria deseada o efecto. Las dosis preferidas pueden incluir opcionalmente 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9. 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 63, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 y/o 100-500 mg/kg/administración, o cualesquiera escala, valor o fracción de los mismos, para lograr una concentración en suero de 0.1 , 0.5, 0.9, 1.0, 1.1 , 1 .2, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5, 2.9, 3.0, 3.5, 3.9, 4.0, 4.5, 4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10, 10.5, 10.9, 1 1 , 1 1.5, 11.9, 20, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14.0, 14.5, 4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10, 10.5, 1 1 , 1 1.5, 11.9, 12, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14, 14.5, 15, 15.5, 15.9, 16, 16.5, 16.9, 17, 17.5, 17.9, 18, 18.5, 18.9, 19, 19.5, 19.9, 20, 20.5, 20.9, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96,100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, y/o 5000 µ?/??? de concentración en suero por administración única o múltiple, o cualquier escala, valor o fracción de los mismos. Alternativamente, la dosis administrada puede variar dependiendo de los factores conocidos, tales como las características farmacodinámicas del agente particular, y su modo y ruta de administración; edad, salud, y peso del recipiente; naturaleza y grado de los síntomas, tipo de tratamiento concurrente, frecuencia del tratamiento, y el efecto deseado. Usualmente una dosis de ingrediente activo puede ser de aproximadamente 0.1 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal. Ordinariamente de 0.1 a 50, y preferiblemente de 0.1 a 10 miligramos por kilogramo por administración o en una forma de liberación sostenida que es efectiva para obtener resultados deseados. Como un ejemplo no limitante, los tratamientos de humanos o de animales pueden proveerse a una dosis de una sola vez o una dosis periódica de por lo menos un anticuerpo de la presente invención de 0.1 a 100 mg/kg, tal como 0.5, 0.9, 1 .0, 1.1 , 1 .5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg, por día, en por lo menos uno del día 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ó 40, o alternativamente o de manera adicional, por lo menos uno de la semana 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , ó 52, o alternativamente o de manera adicional, por lo menos uno de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ó 20 años, o cualquier combinación de los mismos, utilizando dosis únicas, por infusión o repetidas. Las formas de dosis (de la composición) adecuadas para la administración Interna generalmente contienen de aproximadamente 0.1 miligramos a aproximadamente 500 miligramos de ingrediente activo por unidad o por contenedor. En estas composiciones farmacéuticas el ingrediente activo ordinariamente estará presente en una cantidad de aproximadamente 0.5-99.999% en peso basado en el peso total de la composición. Para la administración parenteral, el anticuerpo puede formularse como una solución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado en asociación, o se puede proveer de manera separada, con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de dichos vehículos son agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, y 1 -10% de albúmina de suero de humano. Los liposomas y los vehículos no acuosos tales como aceites fijados también pueden ser utilizados. El vehículo o polvo liofilizado puede contener aditivos que mantienen la isotonicidad (por ejemplo, cloruro de sodio, manitol) y estabilidad química (por ejemplo, reguladores de pH y conservadores). La formulación se esteriliza mediante técnicas conocidas o adecuadas. Los vehículos farmacéuticos adecuados se describen en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, un texto de referencia estándar en este campo.

Administración alternativa Muchos modos conocidos y desarrollados se pueden utilizar de conformidad con la presente invención para la administración de cantidades farmacéuticamente efectivas de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 de acuerdo con la presente invención. Mientras que la administración pulmonar se utiliza en la siguiente descripción, otros modos de administración pueden ser utilizados de conformidad con la presente invención con resultados adecuados. Los anticuerpos a IL-6 de la presente invención se pueden administrar en un vehículo, como una solución, emulsión, coloide, o suspensión, o como un polvo seco, utilizando cualesquiera de una variedad de dispositivos y métodos adecuados para administración mediante inhalación u otros modos descritos aquí o conocidos en la técnica.

Formulaciones parenterales y administración Las formulaciones para administración parenteral pueden contener como excipientes comunes agua estéril o solución salina, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares. Las suspensiones acuosas u oleosas para inyección puede prepararse mediante el uso de un emulsificante apropiado o humidificante y un agente de suspensión, de conformidad con los métodos conocidos. Los agentes para inyección pueden ser un agente diluyente no tóxico, que no se administra de manera oral tal como una solución acuosa o una solución estéril inyectable o una suspensión en un solvente. Como el vehículo o solvente utilizando, se permite el agua, solución de Ringer, solución salina isotónica, etcétera; como un solvente ordinario, o solvente de suspensión, se puede utilizar aceite no volátil estéril. Para estos propósitos, cualquier tipo de aceite no volátil y ácido graso puede ser utilizado, incluyendo aceites grasos o ácidos grasos naturales o sintéticos o semisintéticos; mono- o di- o tri- glicéridos naturales o sintéticos o semisintéticos. La administración parenteral se conoce en la técnica e incluye, pero no se limita, a métodos de inyección convencional, un dispositivo para inyección sin aguja con gas presurizado como se describe en la Patente de E.U.A. No. 5,851 ,198, y un dispositivo perforador de láser que se describe en la patente de E.U.A. No. 5, 839, 446 incorporada por completo aquí como referencia.

Administración alternativa La invención además se refiere a la administración de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 mediante modos parenterales, subcutáneos, intramusculares, intravenosos, intraarticulares, intrabronquiales, intraabdominales, intracapsulares, intracartilaginosos, intracavitarios, intraceliales, intracerebelares, intracerebroventriculares, ¡ntracólicos, intracervicales, intragástricos, intrahepáticos, intramiocardiales, intraosteales, intrapélvicos, intrapericardiacos, intraperitoneales, intrapleurales, intraprostáticos, intrapulmonares, ¡ntrarrectales, intrarrenales, intraespinales, intrasinoviales, intratorácicos, intrauterinos, intravesicales, en bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, ¡ntranasal, o transdérmico. Por lo menos una composición de anticuerpo anti-IL-6 puede prepararse para uso para administración parenteral (subcutánea, intramuscular o intravenosa) o cualquier otra administración particularmente en la forma de soluciones o suspensiones líquidas; para uso en la administración vaginal o rectal particularmente en formas semisólidas tales como, pero no limitadas a, cremas y supositorios; para administración bucal o sublingual tal como, pero no limitada a, en la forma de tabletas o cápsulas; o intranasalmente tal como, pero no limitada a, la forma de polvos, gotas nasales o aerosoles o ciertos agentes; o en forma transdérmica tal como pero no limitada a un gel, ungüento, loción, suspensión o sistema de administración de parche con potenciadores químicos tales como sulfóxido de dimetilo ya sea para modificar la estructura de la piel o para incrementar la concentración del fármaco en el parche transdérmico (Junginger, et al. En "Drug Permeation Enhancement"; Hsieh, D. S., Eds., pp. 59- 90 (Marcel Dekker, Inc. New York 1994, completamente incorporado aquí como referencia), o con agentes oxidantes que permiten la aplicación de formulaciones que contienen proteínas y péptidos sobre la piel (WO 98/53847), o aplicaciones de campos eléctricos para crear rutas de transporte transitorias tales como electroporación, o para incrementar la movilidad de fármacos cargados a través de la piel tal como iontoforesis, o aplicación de ultrasonido tal como sonoforesis (Patentes de E.U.A. Nos. 4, 309, 989 y 4, 767, 402) (las publicaciones y patentes anteriormente mencionadas estando completamente incorporadas aquí como referencias).

Administración pulmonar/nasal Para la administración pulmonar, preferiblemente por lo menos una composición de anticuerpo anti-IL-6 se administra en un tamaño de partícula efectivo para alcanzar las vías respiratorias inferiores del pulmón o de los sinus. De conformidad con la invención, por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 puede ser administrado mediante cualesquiera de una variedad de dispositivos de inhalación o dispositivos nasales conocidos en la técnica para la administración de un agente terapéutico mediante inhalación. Estos dispositivos son capaces de depositar formulaciones en aerosol en la cavidad del seno o alveolos de un paciente que incluyen inhaladores de dosis medida, nebulizadores, generadores de polvo seco, aspersores, y similares. Otros dispositivos adecuados para dirigir la administración pulmonar o nasal de anticuerpos también se conocen en la técnica. Todos estos dispositivos pueden utilizar formulaciones adecuadas para la administración para la dispersión del anticuerpo en un aerosol. Dichos aerosoles pueden estar comprendidos ya sea de soluciones (tanto acuosas como no acuosas) o partículas sólidas. Los inhaladores de dosis medida como el inhalador de dosis medida Ventolín®, típicamente utilizan un gas propelente y requieren activación durante la inspiración (véase, por ejemplo, WO 94/16970, WO 98/35888). Los inhaladores de polvo seco como Turbuhaler™ (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), inhalador Spíros™ (Dura), dispositivos comercializados por Inhale Therapeutics, y el inhalador de polvo Spinhaler® (Fisons), utilizan activación por aspiración de un polvo mezclado (EUA 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, EUA 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons, incorporados por completo aquí como referencias). Los nebulizadores como AERx™ Aradigm, el nebulizador Ultravent® (Mallinckrodt), y el nebulizador Acom II® (Marquest Medical Products) (EUA 5404871 Aradigm, WO 97/22376), las referencias anteriormente mencionadas que se incorporan por completo aquí como referencias, producen aerosoles a partir de soluciones, mientras que los inhaladores de dosis medida, inhaladores de polvo seco, etc. generan aerosoles de partícula pequeña. Estos ejemplos específicos de dispositivos de inhalación comercialmente disponibles se pretende que sean una representación de los dispositivos específicos adecuados para la práctica de esta invención, y no se pretenden como limitantes de la invención. Preferiblemente, una composición que contiene por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 se administra mediante un inhalador o un aspersor de polvo seco. Hay varias características deseables de un dispositivo de inhalación para administrar por lo menos un anticuerpo de la presente invención. Por ejemplo, la administración por el dispositivo de inhalación de manera ventajosa es confiable, reproducíble, y precisa. El dispositivo de inhalación puede administrar ocasionalmente partículas secas pequeñas, por ejemplo de menos aproximadamente 10 µ?t?, preferiblemente de aproximadamente 1-5 µ??, para una buena respiración.

Administración de composiciones de anticuerpo de IL-6 como una aspersión Una aspersión incluye una composición proteica de anticuerpo de IL-6 que puede producirse mediante forzamiento de una suspensión o solución de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 a través de una boquilla bajo presión. El tamaño y configuración de la boquilla, la presión aplicada, la velocidad de alimentación del líquido pueden elegirse para lograr una salida y un tamaño de partícula deseado. Un electroaspersor puede ser producido, por ejemplo, mediante un campo eléctrico en conexión con una alimentación por capilar o por boquilla. De manera ventajosa, las partículas de por lo menos una composición proteica de anticuerpo anti-IL-6 administrada mediante un aspersor, tienen un tamaño de partícula menor de aproximadamente 10 µ??, preferiblemente en la escala de aproximadamente 1 µ?t? a aproximadamente 5 µ??, y más preferiblemente de aproximadamente 2 µ?t? a aproximadamente 3 µ?t?. Las formulaciones de por lo menos una composición proteica de anticuerpo anti-IL-6 adecuadas para uso con un aspersor típicamente incluyen composiciones proteicas de anticuerpo en una solución acuosa a una concentración de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 100 mg de por lo menos una composición proteica de anticuerpo anti-IL-6 por mi de solución o mg/gm, o cualquier escala o valor en estos, por ejemplo, pero no limitado a, .1 , .2, .3, .4, .5, .6, .7, .8, .9, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100 mg/ml o mg/gm. La formulación puede incluir agentes tales como un excipiente, un regulador, un agente de isotonicidad, un conservador, un agente tensioactivo, y, preferiblemente, zinc. La formulación también puede incluir un excipiente o agente para estabilización de la proteína de la composición del anticuerpo, tal como un regulador de pH, un agente reductor, una proteína para volumen, o un carbohidrato. Las proteínas para volumen útiles para la formulación de composiciones proteica de anticuerpo incluyen albúmina, protamina, o las similares. Los carbohidratos típicos útiles en la formulación de composiciones proteicas de anticuerpo incluyen sacarosa, manitol, lactosa, trehalosa, glucosa, o las similares. Las formulaciones de composición proteica de anticuerpos también pueden incluir un agente tensioactivo, el cual puede reducir o prevenir la degradación inducida por la superficie de la composición proteica del anticuerpo ocasionada por la atomización de la solución al formar un aerosol. Varios agentes tensioactivos convencionales pueden ser empleados, tales como ésteres de ácido graso de polioxietileno y alcoholes, y ésteres de ácido graso de polioxietileno sorbitol. Las cantidades generalmente tendrán una escala entre 0.001 y 14% en peso de la formulación. Los agentes tensioactivos especialmente preferidos para propósitos de esta invención son monooleato de polioxietileno sorbitan, polisorbato 80, polisorbato 20, o los similares. Los agentes adicionales conocidos en la técnica para la formulación de una proteína tal como anticuerpos a IL-6, o porciones o variantes específicas, también puede incluirse en la formulación.

Administración de composiciones de anticuerpo para IL-6 mediante un nebulizador La composición proteica del anticuerpo puede ser administrada mediante un nebulizador, tal como un nebulizador a chorro o un nebulizador ultrasónico. Típicamente, en un nebulizador a chorro, una fuente de aire comprimido se utiliza para crear una corriente de aire a alta velocidad a través de un orificio. Conforme el gas se expande más allá de la boquilla, se crea una región de baja presión, la cual lleva consigo una solución de la composición proteica del anticuerpo a través de un tubo capilar conectado a un reservorio de líquido. La corriente de líquido a partir del tubo capilar se divide hacia filamentos inestables y gotas conforme sale del tubo, creando el aerosol. Una escala de configuraciones, velocidades de flujo, y tipos de deflectores pueden ser empleados para lograr las características de desempeño deseadas a partir de un nebulizador a chorro dado. En un nebulizador ultrasónico, se utiliza energía eléctrica a elevada frecuencia para crear energía mecánica, vibracional, que típicamente emplea un transductor de piezoeléctrico. Esta energía se transmite a la formulación de la composición de anticuerpo ya sea directamente o a través de un fluido acoplante, creando un aerosol incluyendo la composición proteica del anticuerpo. De manera ventajosa, las partículas de composición proteica del anticuerpo tienen un tamaño de partícula menor que aproximadamente 10 µ??, preferiblemente en la escala de aproximadamente 1 µ?t? a aproximadamente 5 µ??, y más preferiblemente de aproximadamente 2 µ?t? a aproximadamente 3 µ??. Las formulaciones de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 adecuadas para uso con un nebulizador, ya sea a chorro o ultrasónico, incluyen típicamente una concentración de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 100 mg de por lo menos un anticuerpo proteico anti-IL-6 por mi de solución. La formulación puede incluir agentes tales como un excipiente, un regulador de pH, un agente de isotonicidad, un conservador, un agente tensioactivo, y, preferiblemente, zinc. La formulación también puede incluir un excipiente o un agente para estabilización de por lo menos una composición proteica de anticuerpo anti-IL-6, tal como un regulador de pH, un agente reductor, una proteína para volumen, o un carbohidrato. Las proteínas para volumen útiles para la formulación de por lo menos una composición proteica de anticuerpo anti-IL-6 incluyen albúmina, protamina, o las similares. Los carbohidratos típicos útiles en la formulación de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 incluyen sacarosa, manitol, lactosa, trehalosa, glucosa, o las similares. La por lo menos una formulación anti-IL-6 también puede incluir un agente tensioactivo, el cual puede reducir o prevenir la agregación inducida por la superficie de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 ocasionada por la atomización de la solución al formar un aerosol. Varios agentes tensioactivos convencionales pueden ser empleados, tales como ésteres de ácido graso de polioxietileno y alcoholes, y ésteres de ácido graso de polioxietileno sorbitol. Las cantidades generalmente tendrán una escala entre 0.001 y 4% en peso de la formulación. Los agentes tensioactivos especialmente preferidos para propósitos de esta invención son mono-oleato de polioxietileno sorbitan, polisorbato 80, polisorbato 20, o los similares. Los agentes adicionales conocidos en la técnica para la formulación de una proteína tal como anticuerpo proteico también pueden incluirse en la formulación.

Administración de composiciones de anticuerpo para IL-6 mediante un inhalador de dosis medida En un inhalador de dosis medida (MDI), un propelente, por lo menos un anticuerpo anti-IL-6, y cualesquiera excipientes u otros aditivos están contenidos como una mezcla en una lata pequeña que incluyen un gas comprimido licuado. La activación de la válvula de medición libera la mezcla como un aerosol, preferiblemente conteniendo partículas en la escala de tamaño de menos de aproximadamente 10 µ??, preferiblemente de aproximadamente 1 p? ? aproximadamente 5 µ??, y más preferiblemente de aproximadamente 2 ?? 3 aproximadamente 3 µ?t?. El tamaño de partícula del aerosol deseado puede obtenerse mediante el empleo de una formulación de composición proteica del anticuerpo producida mediante varios métodos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo molienda a chorro, secado mediante aspersión, condensación a punto crítico, o los similares. Los inhaladores preferidos de dosis medida incluyen aquellos elaborados por 3M o Glaxo y que emplean propelente de hidrofluorocarbono.

Las formulaciones de por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 para uso con un dispositivo inhalador de dosis medidas generalmente incluirán un polvo finamente dividido que contiene por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 como una suspensión en un medio no acuoso, por ejemplo, suspendido en un propelente con la ayuda de un agente tensioactivo. El propelente puede ser cualquier material convencional empleado para este propósito, tal como clorofluorocarbono, un hidroclorofluorocarbono, un hidrofluorocarbono, o un hidrocarbono, incluyendo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol y 1 ,1 ,1 ,2-tetrafluoroetano, HFA-134a (hidrofluoroalcano-134a), HFA-227 (hidrofluoroalcano-227), o los similares. Preferiblemente el propelente es un hidrofluorocarbono. El agente tensioactivo puede elegirse para estabilizar el por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 como una suspensión en el propelente, para proteger al agente activo en contra de la degradación química, y similares. Los agentes tensioactivos adecuados incluyen trioleato de sorbitan, lecitina de soya, ácido oleico, o los similares. En algunos casos para los aerosoles en solución se prefieren utilizar solventes tales como etanol. Los agentes adicionales conocidos en la técnica para la formulación de una proteína tal como una proteína también puede ser incluidos en la formulación. Un experto en la técnica reconocerá que los métodos de la presente invención pueden lograrse mediante la administración pulmonar de por lo menos una composición de anticuerpo anti-IL-6 por medio de dispositivos no descritos aquí.

Formulaciones orales y administración Las formulaciones para administración oral dependen de la coadministración de adyuvantes (por ejemplo, resorcinoles y agentes tensioactivos no iónicos tales como oleil éter de polioxietileno y éter de n-hexadecilpolietileno) para incrementar artificialmente la permeabilidad de las paredes intestinales, así como la co-administración de inhibidores enzimáticos (por ejemplo, inhibidores de tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato (DFF) y trasilol) para inhibir la degradación enzimática. El compuesto constituyente activo de la forma de dosis de tipo sólido para la administración oral puede mezclarse con al menos un aditivo, incluyendo sacarosa, lactosa, celulosa, manitol, trehalosa, rafinosa, maltitol, dextranos, almidones, agar, arginatos, quitinas, quitosanos, pectinas, goma tragacanto, goma arábiga, gelatina, colágeno, caseína, albúmina, polímero sintético o semisintético, y glicérido. Estas formas de dosis también pueden contener otro tipo(s) de aditivos, por ejemplo, agente diluyente inactivo, lubricante tal como estearato de magnesio, parabeno, agente conservador tal como ácido sórbico, ácido ascórbico, alfa-tocoferol, antioxidante tal como cisteína, desintegrante, aglutinantes, espesante, agente de regulación de pH, agente edulcorante, agente saborizante, agente de perfume, etcétera. Las tabletas y pildoras pueden ser procesadas adiclonalmente hacia preparaciones con cubierta entérica. Las preparaciones líquidas para administración oral incluyen preparaciones en emulsión, jarabe, elixir, suspensión y solución que se permiten para uso médico. Estas preparaciones pueden contener agentes diluyente inactivos ordinariamente utilizados en dicho campo, por ejemplo, agua. Los liposomas también han sido descritos como sistemas para administración de fármaco para insulina y heparina (Patente de E.U.A. No. 4, 239, 754). Más recientemente, las microesféras de polímeros artificiales de aminoácidos mezclados (proteinoides) han sido utilizadas para administrar compuestos farmacéuticos (Patente de E.U.A. No. 4, 925, 673). Además, los compuestos vehículo descritos en la Patente de E.U.A. No. 5, 879, 681 y Patente de E.U.A. No. 5, 5, 871 , 753 se utilizan para administrar agentes biológicamente activos de manera oral como se conoce en la técnica.

Formulaciones mucosales y administración Para la absorción a través de las superficies mucosales, las composiciones y métodos de administración de al menos un anticuerpo anti-IL-6 incluyen una emulsión que comprende una pluralidad de partículas de tamaños menores a una miera, una macromolécula mucoadhesiva, un péptido bioactivo, una fase acuosa continúa, la cual promueve la absorción a través de las superficies mucosales mediante la ejecución de mucoahesión de las partículas de la emulsión (Patente de E.U.A. No. 5, 514, 670). Las superficies mucosas adecuadas para la aplicación de las emulsiones de la presente invención pueden incluir rutas de administración corneales, conjuntivas, bucales, sublinguales, nasales, vaginales, pulmonares, estomacales, intestinales, y rectales. Las formulaciones para administración vaginal o rectal, por ejemplo supositorios, pueden contener; excipientes, por ejemplo, polialquilenglicoles, vaselina, mantequilla de cocoa, y los similares. Las formulaciones para administración intranasal pueden ser sólidas y contienen como excipientes, por ejemplo, lactosa o puede ser soluciones de gotas nasales acuosas u oleosas. Para la administración bucal los excipientes incluyen azúcares, estearato de calcio, estearato de magnesio, almidones pregelatinizados, y los similares (Patente de E.U.A. No. 5, 849, 695).

Formulaciones transdermérmicas y administración Para la administración transdérmica, el al menos un anticuerpo anti-IL-6 se encapsula en un dispositivo de administración tal como un liposoma o nanopartículas poliméricas, micropartícula, microcápsula, o microesféras (referidas colectivamente como micropartículas a menos que se establezca de otra manera). Se conocen varios dispositivos adecuados, incluyendo micropartículas elaboradas de polímeros sintéticos tales como polihidroxiácidos tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico y copolímeros de los mismos, poliortoésteres, polianhídridos, y polifosfazenos, y polímeros naturales tales como colágeno, poliaminoácidos, albúmina y otras proteínas, alginato y otros polisacáridos, y combinaciones de los mismos (Patente de E.U.A. No. 5, 814, 599).

Administración prolongada y formulaciones Algunas veces es deseable administrar compuestos de la presente invención al sujeto durante periodos prolongados de tiempo, por ejemplo, por periodos de una semana a un año a partir de una administración única. Varias formas de dosis de liberación lenta, depósito o implante pueden ser utilizadas. Por ejemplo, una forma de dosis puede contener una sal farmacéuticamente aceptable no tóxica de los compuestos que tiene un bajo grado de solubilidad en los fluidos corporales, por ejemplo, (a) una sal de adición ácida como un ácido polibásico, tal como el ácido sulfúrico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido tánico, ácido pamoico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácidos mono- o di-naftalensulfónico, ácido poligalacturónico, y los similares; (b) una sal con un catión metálico polivalente tal como zinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio y los similares, o un catión orgánico formado partir de, por ejemplo, N,N'-dibencil-etilendiamina o etilendiamina; o (c) combinaciones de (a) y (b) por ejemplo una sal de tanato de zinc. Adicionalmente, los compuestos de la presente invención o, preferiblemente, una sal relativamente insoluble tal como aquellas recientemente descritas, puede formularse en un gel, por ejemplo, un gel de monoestearato de aluminio con, por ejemplo, aceite de ajonjolí, adecuado para inyección. Las sales particularmente preferidas son sales de zinc, sales de tanato de zinc, sales de pamoato, y las similares. Otro tipo de formulación de depósito de liberación lenta para inyección podría contener el compuesto o sal dispersado para el encapsulado en un polímero de degradación lenta, no tóxico, no antigénico tal como un polímero de ácido poliláctico/ácido poliglicólico, por ejemplo como se describe en la Patente de E.U.A. No. 3, 773, 919. Los compuestos o, preferiblemente, las sales relativamente insolubles tales como aquellas descritas anteriormente también pueden formularse en pastillas de silastic de matriz de colesterol, particularmente para uso en animales. Las formulaciones de liberación lenta, depósito o implante adicionales, por ejemplo, liposomas en gas o líquido se conocen en la literatura (Patentes de E.U.A. Nos. 5, 770, 222 y "Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978).

Clonación y expresión de anticuerpo IL-6 en células de mamíferos Un vector de expresión típico en mamífero contiene al menos un elemento promotor, el cual media el inicio de la transcripción del ARNm, la secuencia codificante del anticuerpo, y señales requeridas para el término de la transcripción y la poliadenilación del transcrito. Elementos adicionales incluyen potenciadores, secuencias Kozak y secuencias interventoras flanqueadas por los sitios del donante del aceptor para el procesamiento del ARN. La transcripción altamente eficiente puede lograrse con los promotores tempranos y tardíos a partir de SV40, los repetidos termínales largos (LTRS) a partir de los Retrovirus, por ejemplo, RSV, HTLV1 , HIVI y el promotor temprano del citomegalovirus (CMV). Sin embargo, los elementos celulares también pueden ser utilizados (por ejemplo, el promotor de actina de humano). Los vectores de expresión adecuados para uso en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, los vectores tales como pIRESI neo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN, o pLNCX (Clontech Labs, Palo Alto, CA), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-) o pcDNA3.1/Hygro (+/-) (Invitrogen), PSLV y PMSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) y pBC12MI (ATCC 67109). Las células hospederas de mamífero que puede ser utilizadas incluyen células Hela 293 de humano, células H9 y Jurkat, células NIH3T3 y C127 de ratón, Cis 1 , Cos 7 y CV1 , células QC1-3 de codorniz, células L de ratón y células de ovario de hámster chino (CHO). Alternativamente, el gen puede ser expresado en las líneas celulares estables que contienen el gen integrado dentro de un cromosoma. La co-transfección con un marcador de selección tal como dhfr, gpt, neomicina, o higromicina permite la identificación y aislamiento de las células transfectadas. El gen transfectado también puede ser amplificado para expresar grandes cantidades del anticuerpo codificado. El marcador DHFR (dihidrofolato reductasa) es útil para desarrollar líneas celulares que portan varios cientos o incluso varios miles de copias del gen de interés. Otro marcador de selección útil es la enzima glutamina sintasa (GS) (Murphy, et al., Biochem. J. 227: 277- 279 (1991 ); Bebbington, et al., Bio/Technology 10: 169-175 (1992)). Utilizando estos marcadores, las células de mamífero se crecen en medio selectivo y las células con la mayor resistencia se seleccionan. Estas líneas celulares contienen el gen(es) amplificado integrado dentro de un cromosoma. Las células de ovario de hámster chino (CHO) y NSO frecuentemente se utilizan para la producción de anticuerpos. Los vectores de expresión pC1 y pC4 contienen el promotor fuerte (LTR) del virus de sarcoma de Rous (Cullen, et al., Molec. Cell. Biol. 5: 438- 447 (1985)) más un fragmento del potenciador de CMV (Boshart, et al., Cell 41 : 521 - 530 (1985)). Los sitios múltiples de clonación, por ejemplo, con los sitios de escisión para enzima de restricción BamHI, Xbal y Asp718, facilitan la clonación del gen de interés. Los vectores contienen además el intrón 3', la señal de poliadenilación y la señal de terminación del gen de preproinsulina de rata.

Clonación y expresión en células CHO El vector pC4 se utiliza para expresión del anticuerpo de -IL-6. El plásmido pC4 es un derivado del plásmido pSV2-dhfr (ATCC No. de acceso 37146). El plásmido contiene el gen de DHFR de ratón bajo el control del promotor temprano de SV40. Las células de ovario de hámster chino - u otras células que carecen de actividad de dihidrofolato que han sido transfectadas con estos plásmidos pueden seleccionarse mediante crecimiento de las células en un medio selectivo (por ejemplo, alfa menos MEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD) complementado con el agente quimioterapéutico metotrexato. La amplificación de los genes de DHFR en las células resistentes a metotrexato (MTX) ha sido bien documentada (véase, por ejemplo, F.W. Alt, et al., J. Biol. Chem. 253: 1357- 1370 (1978); J. L. Hamlin y C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097: 107- 143 (1990); y M. J. Page y M. A. Sydenham, Biotechnology 9: 64- 68 (1991 )). Las células que crecen en concentraciones crecientes de MTX desarrollan resistencia al fármaco, mediante la sobreproducción de la enzima objetivo, DHFR, como un resultado de la amplificación del gen de DHFR. Si un segundo gen se asocia con el gen de DHFR, usualmente éste se co-amplifica y se sobre-expresa. Se conoce en la técnica que este método puede ser utilizado para desarrollar líneas celulares que portan más que 1000 copias del gen(es) amplificado. Subsecuentemente, cuando el metotrexato se retira, se obtienen la líneas celulares que contienen el gen amplificado integrado en uno o más cromosoma(s) de la célula hospedera. El plásmido pC4 contiene para la expresión del gen de interés el promotor fuerte del repetido terminal largo (LTR) del virus de sarcoma de Rous (Cullen, et al., Molec. Cell. Biol. 5: 438- 447 (1985)) más un fragmento aislado a partir del potenciador del gen temprano inmediato del citomegalovirus de humano (CMV) (Boshart, et al., Cell 41 : 521- 530 (1985)). Corrientes abajo del promotor están los sitios de escisión para enzima de restricción BamHI, Xbal, y Asp718 que permiten la integración de los genes. Atrás de estos sitios de clonación el plásmido contiene el intrón 3' y el sitio de poliadenilación del gen de preproinsulina de rata. Otros promotores altamente eficientes también pueden ser utilizados para expresión, por ejemplo, el promotor de actina-b de humano, los promotores tempranos o tardíos de SV40 o los repetidos terminales largos a partir de otros retrovirus, por ejemplo, VIH y HTLVI. Los sistemas de expresión Tet-Off y Tet-On de Clontech y los sistemas similares pueden ser utilizados para expresar la -IL-6 de un modo regulado en células de mamífero (M. Gossen, y H. Bujard, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 5547- 5551 (1992)). Para la poliadenilación del ARNm otras señales, por ejemplo, a partir de los genes de hormona de crecimiento de humano o de globina también pueden ser utilizadas. Las líneas celulares estables que portan un gen de interés integrado dentro de los cromosomas también pueden seleccionarse después de la co-transfección con un marcador de selección tal como gpt, G418 o higromicina. Es ventajoso utilizar más de un marcador de selección al inicio, por ejemplo, G418 más metotrexato. El plásmido pC4 se digiere con las enzimas de restricción y luego se defosforila utilizando fósfatasa intestinal de ternera mediante procedimientos conocidos en la técnica. El vector se aisla entonces a partir de un gel de agarosa al 1 %. La secuencia de ADN que codifica el anticuerpo completo de -IL-6 se utiliza, por ejemplo, cuando se presenta en SEQ ID Nos 7 y 8, el cual corresponde a las regiones variables HC y LC de un anticuerpo de -IL-6 en la presente invención, de conformidad con los pasos del método conocido. El ácido nucleico aislado que codifica una región constante adecuada de humano (es decir, regiones HC y LC) también se utiliza en este caso.

El ADN aislado que codifica la región variable y constante y el vector defosforilado se ligan entonces con T4 ADN ligasa. Las células E. coli HB101 o XL-1 Blue se transforman entonces y se identifican las bacterias que contienen el fragmento insertado dentro del plásmido pC4 utilizando, por ejemplo, análisis de enzima de restricción. Las células de ovario de hámster chino (CHO) que carecen de un gen DHFR activo se utilizan para la transfección. 5 µg del plásmido para expresión pC4 se co- transfectan con 0.5 µg del plásmido pSV2-neo utilizando lipofectina. El plásmido pSV2neo contiene un marcador de selección dominante, el gen neo a partir de Tn5 codifica una enzima que confiere resistencia a un grupo de antibióticos incluyendo G418. Las células se siembran en alfa menos MEM complementado con 1 µg de G418. Después de 2 días, las células se tripsinizan y se siembran en placas para clonación del hibridoma (Greiner, Alemania) en alfa menos MEM complementado con 10, 25, o 50 ng/ml de metotrexato más 1 µg/ml de G418. Después de aproximadamente 10- 14 días las clonas particulares se tripsinizan y luego se siembran en cajas de petri de seis pozos o en matraces de 10 mi utilizando concentraciones diferentes de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Las clonas en crecimiento a las mayores concentraciones de metotrexato se transfieren entonces a placas nuevas de seis pozos que contienen concentraciones incluso mayores de metotrexato (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). El mismo procedimiento se repite hasta que se obtienen las clonas que crecen a una concentración de 100- 200 mM, La expresión del producto del gen deseado se analiza, por ejemplo, mediante SDS-PAGE y manchado Western o mediante análisis de HPLC en fase inversa.

Abreviaturas: BSA - albúmina de suero de bovino C02 - dióxido de carbono DMSO - dimetilsulfóxido EIA - inmunoensayo de enzima FBS - suero bovino fetal H202 - peróxido de hidrógeno HC - cadena pesada HRP - peroxidasa del rábano Ig - ¡nmunoglobulina IP- intraperitoneal IV - intravenoso Mab - anticuerpo monoclonal DO - densidad óptica OPD - dihidrocloruro de o-fenilendiamina PEG - polietilenglicol PSA - penicilina, estreptomicina, amfotericina RT - temperatura ambiente TBS - solución salina regulada en su pH con Tris v/v - volumen por volumen p/v - preso por volumen EJEMPLO 1 Generación de Mab CLB8 de murino Inmunización El hibridoma proporciona el incremento al anticuerpo CLB-IL6-8 de murino que es derivado de una fusión realizada en un laboratorio de Dr. Luden Aarden, Laboratory of the Netherlands Red Cross Transfusión Service (CLB) según se refiere (Brackenhoff et al. J. Immunol. (1990) 145: 561-568). Ratones Balb/c hembra de ocho semanas de edad obtenidos de crías libres de patógeno de CLB's especificados, se inmunizaron intramuscularmente (IM) con 10 µg de interleucina-6 (rlL-6) recombinante purificada (CLB) emulsionada en adyuvante de Freund completo. Tres inyecciones IM posteriores con 10 µ9 cada una de rlL-6 en adyuvante de Freund incompleto se realizaron en intervalos de 4 a 8 semanas.

Fusión celular Cuatro días después de la última inyección de refuerzo IM, un ratón es sacrificado; el bazo es removido y finamente desmenuzado. Una suspensión celular individual es obtenida en una solución salina balanceada de Earle ambiental. Las células son lavadas y contabilizadas. Se realiza una fusión en una proporción 1 :3 de células de bazo viables con células de mieloma de murino (SP2/0-Ag14) en presencia de polietilenglicol al 42% p/v en medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM). El SP2/0 madre de fusión de secreción sin-lg es estabilizado a partir de un conjunto celular mantenido en CLB. Después de la fusión, las células son suspendidas nuevamente en IMDM, complementadas con suero bovino fetal al 5%, penicilina 50 µ??/estreptomicina, 2-mercaptoetanol (2-ME) 5X10-5 M y HAT (hipoxantina6X10-4 M, aminopterina 6.5x10-7 M, timidina 6.4x10-5 M). La proliferación de estos hibridomas inmediatamente después de la fusión es dependiente de IL-6, por lo tanto, 100 U/mL de IL-6 de murino purificado (Van Smick, Brussels) se añade al medio de solución. Las células fusionadas entonces son distribuidas en placas en 96 pozos en 1x105 células/pozo de 100 microL.

Caracterización primaria de hibridomas Anti IL-6 de murino Los híbridos de secreción Anti-IL-6 son seleccionados a través de un ensayo de inmunosorbente ligado por enzima (ELISA) y un radioinmunoensayo (RIA) (Brackenhoff et al. (1990) 145: 561-568). Un ELISA de fase sólida es empleado para clasificar los anticuerpos monoclonales específicos para IL-6 de humano. rlL-6 (0.5 µg/mL) purificado es cubierto durante la noche a temperatura ambiente en solución salina (PBS) regulada con fosfato en placas (Dynatech) de fondo plano, 100 µ?/????. Las placas son lavadas con PBS, Tween 20 0.02% (v/v) (PBS/Tween) y después incubadas con diluciones 1 :2 de sobrenadantes de cultivo en PBS/Tween complementado con 0.2% de gelatina (PTG) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después del lavado, las placas son incubadas con cadena ligera 226 kappa antiratón anti-ratón de rata monoclonal conjugado con peroxidasa de rábano (Einstein University, NY) en PTG (2 µg/mL) durante 1 hora. Las placas son lavadas y la peroxidasa enlazada es detectada con 100 µ?/???? de 3,5,3,5tetrametilbenzidina/ peróxido de hidrógeno 0.003% en acetato de sodio 0.1 -M, pH 5.5. La reacción de color es interrumpida con H2S04 2M y las placas son leídas a 450 nM en un lector Titertek, Multiscan. Los pozos que dieron OD's positivos, son seleccionados. Un RIA de fase sólida entonces se emplea para clasificar hibridomas anti-IL-6. Los anticuerpos de Ig de anti-murino de cabra están acoplados a sefarosa activada con cianogeno/bromuro CL-4B (Pharmacia). La sefarosa es lavada y suspendida nuevamente en 10 mg/mL en PBS, Tween 20 0.1 %, azida de sodio 0.1 %. Los sobrenadantes de hibridoma se añaden a las perlas de sefarosa en presencia de aproximadamente 20,000 conteos/minuto de 125yodina-rlL-6 (CLB) durante 6 horas con un mezclado constante. Las perlas son lavadas exhaustivamente en PBS/Tween y contadas en un contador gamma. Los pozos producen actividades más altas especificas que fueron seleccionadas. Los hibridomas que dieron positivos en ambos sistemas de ensayo se establecieron y fueron subclonados dos veces en diluciones limitadas en I DM complementario con M 2-ME 2x10"5 y FBS 5% (IMDM completo). El sub-clon independiente de IL-6 CLB-IL6-8 es seleccionado y mantenido en IMDM completo. Para los cultivos de muestra analizados como negativos para micoplasma se uso una cepa de Hoescht indirecta después de 4 días de cultivo en células objetivo Vero76. La determinación del isotipo del sobrenadante a través de un estuche de isotipo de anticuerpo monoclonal de ratón de un inmunoensayo de línea de innogenéticos (INN-LIA) que produce kappa IgGi de isotipo de murino individual. Esta determinación del isotipo se confirma a través de EIA de captura. El hibridoma de murino y la línea celular son producidos de esta manera CLBIL-6/8 es llamado CLB8. Este es quimerizado y además caracterizado como se describe posteriormente.

EJEMPLO 2 Quimerización y secuenciación Clonación y expresión de los genes de región variable cCLB8 El ADN genómico es aislado del hibridoma de murino C143A que secreta un anticuerpo monoclonal de murino específico para IL-6 de humano. Para la cadena ligera, el ADN es digerido con Hind III endonucleasa de restricción y sometido a electrofóresis a través de un gel de agarosa al 0.8%. La porción del gel que contiene los fragmentos de ADN aproximadamente tiene 3.4 Kb de longitud y es dividido, y el ADN es eluido. Los fragmentos son ligados en vector8caron27, y empacados en partículas de bacteriófago. Para la cadena pesada, el ADN es digerido con endonucleasa de restricción EcoRI y sometida a electroforesis a través de un gel de agarosa al 0.8%. La porción del gel que contiene fragmentos de ADN tiene aproximadamente 3.6 Kb de longitud y es dividido y el ADN es eluido. Los fragmentos son ligados en un vector8gt10, y empacados en partículas de bacteriófago. La cadena pesada y ligera de librerías de bacteriófago son colocadas en placas en E. Coli, y crecen durante la noche. Las placas son transferidas a filtros de nitrocelulosa, y sondeadas con fragmentos de ADN marcadas con 32P que corresponden a murino Jk (cadena ligera) o secuencias de murino JH- Las placas positivas son identificadas y purificadas. El ADN fago es aislado, y los insertos decHind III (cadena ligera) o Eco Rl (cadena pesada) son asilados y clonados en vectores de expresión de ¡nmunoglobulina. Los plásmidos de expresión de cadena pesada y ligera se usan para co-transfectar células SP2/0, y se aplica la selección de ácido micofenólico. Los clones individuales que producen anticuerpos quiméricos son identificados y subclonados para asegurar la monoclonalidad y para generar productores más superiores. El anticuerpo purificado de líneas celulares individuales es analizado para su capacidad de neutralización en un ensayo de proliferación celular B9 dependiente de IL-6. El anticuerpo es referido como CLB8 o cCLB8 quimérico en toda esta aplicación.

Región variable de cadena pesada cCLB8 E V Q L V E S G G K L L K P G G S L K L GAG GTG CAA CAA GTG GAA TCT GGA GGA AAA TTA CTG AAG CCT GGA GGG TCC CTG AAA CTC S C A A S G F T F S S F A S W F R Q S TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC TTT GCC ATG TCT GG TTT CGC CAG TCT CD 1 P E K R L E W V A E I S S G G S Y T Y Y CCA GAG AAG AGG CTG GAG TGG GTC GCA GAA ATT AGT AGT GGT GGG AGT TAC ACC TAC TAT CDR 2 P D T V T G R F T I S R D N A K N T L Y CCT GAC ACT GTG ACG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT GCC AAG AAC ACC CTG TAC L E M S S L R S E D T A M Y Y C A R G L CTG GAA ATG AGC AGT CTG AGG TCT GAG GAC ACG GCC ATG TAT TAT TGT GCA AGG GGT TTA W G Y Y A L D Y W G Q G T S V T V S S TGG GGG TAC TAT GCT CTT GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA CDR 3 Región variable de cadena ligera cCDLB8 Q I V L I Q S P A I M S A S P G E K V T CAA ATT GTT CTC ATA CAG TCT CCA GAC ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC M T C S A S S S V S Y Y W Y Q Q K P G ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC TGG TAC CAG CAG AGG CCA GGA CDR 1 S S P R L L I Y D T S N . . L A S G V P V R TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CTT GTT CGC CD 2 F S G S G S G T S Y S L T I S R E A E TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAC D A A T Y Y C Q Q W S G Y P Y T F G G G GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT GGT TAC CCA TAC ACG TTC GGA GGG GGG CDR3 T K L E I K ACC AAG CTG GAA ATA AAA EJEMPLO 3 Medición de unión de cCLB8 a IL-9 de humano a través de EIA en fase sólida Un EIA fase sólida se usa para valorar el enlace de Mab CCLB8 a IL-6 de humano. Brevemente, las placas son cubiertas con IL-6 (RDI) de humano recombinante en 1 ^g/ml en PBS durante la noche a 4°C. Después del lavado en solución salina 0.15M que contiene Tween 200.02% (v/v), los pozos son bloqueados con BSA 1% (p/v) en PBS, 200 µ?_/???? por 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo purificado es incubado en diluciones seriales dos veces a partir de una concentración de inicio de 5 pg/mL durante 1 hora a 37°C. La placa es lavada y después sondeada con 50 pL/ pozo IgG(Tago) de anti-humano de cabra marcado con HRP diluido 1 :20,000 en BSA-PBS al 1 % durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa es lavada nuevamente y 100 pL/pózo de la solución de substrato de citrato-fosfato (ácido cítrico 0.1 M y fosfato de sodio 0.2M, H202 al 0.01% y OPD 1 mg/mL) es añadida durante 15 minutos a temperatura ambiente. La solución se interrumpe (ácido sulfúrico 4N) y después se añade en 25 pL/pozo y la absorción a 490 nm es cuantificada usando un fotómetro de placa automatizado. La figura 1 muestra la unión de cCLB8 a IL-6 medido como OD 490 nm que demuestra que cCLB8 se une a IL-6 de humano recombinante de una manera dependiente de la concentración.

EJEMPLO 4 Ensayos de neutralización in vitro Bloqueo de IL-6 a través de cCLB8 inhibiendo la secreción de IqM y MCP-1 El anticuerpo monoclonal quimérico cCLB8 es valorado en dos formatos de bioensayo simple para determinar su bioactividad de neutralización en IL-6 inducida por secreción de IgM de humano y MCP-1 de quimiocina. Dos líneas celulares de humano se usan en estos estudios. La línea celular SKW6.4 es originalmente derivada de un linforma de célula B de Burkitt transformado con EBV y secreta IgM soluble en respuesta a IL6. La línea celular U937 es monoblástica, depositada a diferenciación de monocito y es originalmente aislada de un paciente con linfoma histiocítico difuso. Las células U937 secretan MCP-1 en respuesta a IL-6. la inhibición de cCLB8 de estas bioactividades particulares se evalúa debido a que es más fácil su monitoreo usando un formato de EIA. Antes del ensayo, las células son congeladas con suero durante la noche y después cultivadas el siguiente día, con IL-6 o con IL-6 preincubada con diversas concentraciones de anticuerpo o un anticuerpo de control negativo. En la conclusión de una incubación de 72 horas, los sobrenadantes son recolectados y usados en IgM específico y EIA específico de MCP-1 . Los resultados se muestran en las figuras 2 y 3, demostrando que cCLB8 inhibe de manera significativa la secreción mediada por IL-6 de IgM y MCP-1 in vitro. En el experimento representado por la figura 2, las placas de EIA son cubiertas con fragmento especifico IgM Fc5 de antihumano de cabra en regulador carbonato 10 mM, pH 9.6, durante la noche a 4°C. Las placas son lavadas con solución salina 0.15 M con Tween 20 0.02% v/v y bloqueadas con PBS/BSA 1 % p/v durante 1 hora. El sobrenadante de cultivo celular es añadido en diluciones dobles seriales. Después de la incubación y los lavados subsiguientes con Tween 0.02%, y solución salina 0.15M, la placa es sondeada con especifico de cadena IgMp de antihumano de cabra marcado con HRP. El substrato OPD entonces es añadido y posteriormente es desarrollado el color, la lectura OD en 490 nm. Los datos indican que cCLB8, pero no así el isotipo con un control negativo igual cK931 , inhibe la secreción de IgM mu. En el experimento representado por la figura 3, las placas EIA son cubiertas con MCP-1 de anti-humano de cabra en regulador de carbonato 10 mM, pH 9.6 durante la noche a 4°C. Las placas son lavadas con solución salina al 0.15 M con Tween 20 0.02% v/v y bloqueadas con PBS/BSA 1 % p/v durante 1 hora. El sobrenadante de cultivo celular se añade en diluciones dobles seriales. Después de una incubación de dos horas y lavados posteriores con Tween al 0.02% y solución salina al 0.15M, la placa es sondeada con MCP-1 de anti-humano tratada con biotina tal como las instrucciones del fabricante. Las placas son lavadas otra vez y estreptividina marcada con HRP se añade durante 1 hora. El desarrollo del color se realiza con substrato TMB. Se realiza la lectura OD a 450. Los datos indican que cCLB8, pero no cK931 , inhibe la producción de MCP-1 mediado por IL-6.

Neutralización de fosforilación mediada por IL6 de STAT3 El receptor IL6 consiste de una subunidad de unión de 80 kD, IL6Rcc y la subunidad de transducción de señal, gp130. IL6 se une a la subunidad IL6Ra e inicia la asociación de IL6Ra y gp130 resultando en un receptor de gran afinidad y transducción de señal. IL6Roc también existe en una forma soluble. IL6 puede unirse a IL6R(slL6R) soluble y el complejo puede actuar en células de expresión gp130. IL6 ha mostrado que activa STAT3. Una línea celular de leucemia de monocito aguda de humano, THP-1 se usa para demostrar la inhibición de la fosforilación de STAT3 a través de cCLB8. Las células son estimuladas con (IL6+slL6R) +/- cCLB8 o anticuerpo irrelevante (K931 ) como el control negativo. Los lisados celulares son inmunoprecipitados con anti-STAT3, las muestras son resueltas en SDS-PAGE al 7.5% y transferidas a la membrana Hybond-P, seguido por el machado Western usando anti-fosfotirosina-HRP. ECLplus se usa para la detección. Los datos representados en la figura 4 muestran que cCLB8 puede inhibir la fosforilación de STAT3 cuando es a) permitido unirse a rhlL6 antes de la adición de slL6R, b) permitido unirse a slL6R antes de la adición de rhlL6 o c) permitido unirse rhlL6 a slL6R antes de la adición de cCLB8 y células. Las células THP-1 incubadas en lo medios sin suero durante 16 horas, se remueven de los matraces y se vuelven a suspender en franjas 2 a 6 de medio 0.5 mi, +/- anticuerpo incubado de IL6 durante 15 minutos, entonces slL6R se añade e incuba durante 15 minutos. Las células son añadidas e incubadas durante 15 minutos adicionales. En la franja 7, IL6 es incubado con slL6R durante 15 minutos, después se añade CLB-IL6 y se incuba durante 15 minutos. Se añaden e incuban células durante 15 minutos adicionales. El inmunoprecipitado de las muestras con anti-STAT3 [^g/mlj, resuspendido en Laemmli que es un regulador de muestra y se resuelven en SDS-PAGE 7.5% y transfieren a Hybond-P. La membrana es incubada con anti-fosfotirosina-HRP. cCLB8 inhibe la producción de amiloide A de suero I L-1 ß es un potente inductor de la producción de amiloide A de suero (SAA) de células de hepatoma de humano HepG2 en presencia de IL-6 (Smith and McDonald, Clin Exp. Immunol, 90:293-9(1992)) de humano. Por tanto, Mab cCLB8 es analizado por su capacidad para inhibir IL- p/IL-6 inducida por la producción de SAA de esta células. Brevemente, las células HepG2 son sembradas en 2.25 x 105/pozo durante 24 horas. IL-6 (100ng/ml, RDI) e IL-68R (200ng/ml, S & D) y preincubadas durante 30 minutos y mezclado con IL-1 ß (1 ng/ml, R&D). El Mab cCLB8 y un Mab (cSF25) de control de isotipo es diluido en forma serial y después preincubado con la mezcla anterior durante 30 minutos adicionales. Los resultados experimentales muestran en la figura 5, diluciones seriales de cCLB8 o cSF25 (un Mab ¡rrelevante de igual isotipo) son preincubadas con IL-6sR e ??_-1 ß y después se cultivan con células HepG2 durante 24 horas. El sobrenadante celular entonces es analizado para la producción de niveles de amiloide A de suero por ELISA. (Human SAA ELISA kit, Biosource, desarrollado de acuerdo a las instrucciones del fabricante). Las barras de error indican SEM de muestras por duplicado. Los datos en la figura 5 indican que cCLB8 es capaz de inhibir IL-i p/IL-6 inducido por la producción SAA de células HepG2 de una manera dependiente a la dosis.

Inhibición de proliferación celular inducida por IL-6 mediante Mab cCLB8 La línea celular de mieloma B de murino, 7TD1 , es inducida para proliferar en presencia de IL-6. Para demostrar la capacidad de Mab cCLB8 para neutralizar la actividad de IL-6, las células son incubadas a 37°C durante 72 horas en IMDM que contiene FBS al 10% y 0.5 ng/ml de IL-6 de humano recombinante (R&D Systems), y con diluciones seriales de Mab cCLB8 Mab 17-1 A de control negativo. La proliferación celular se mide por un ensayo de ATP luminiscente (ATPLite, Packard Bioscience) que se correlaciona directamente con el número de células. Los datos mostrados en la Figura 6 demuestran que IL-6 estimula dramáticamente la proliferación de células 7TD1 y cCLB8 inhibe esta proliferación celular de una manera dependiente de la dosis con una EC5o de 7.2ng/mL. Las barras de error indican SEM de muestras por duplicado, * representa proliferación de células en ausencia de rlL-6.

EJEMPLO 5 delineado de epítope Los epítopes de diversos Mabs anti-IL-6 de neutralización incluyen CLB8 que ha sido caracterizado usando anticuerpo de unión a proteínas mutantes de IL-6 de humano como se describe en (Brakenhoff, J. et al, (1990) J. Immunology 145: 561-568). Los mutantes de supresión de terminal amino y carboxilo se preparan y el panel de anticuerpos a IL-6 se analiza a través de experimentos de competición de anticuerpo. En la base de los estudios de competición los Mabs de neutralización están divididos en dos grupos (I y II). En este método, los residuos incluidos en el epítope de un Mab dado están delineados por sus omisión de reconocimiento de las variantes de substitución aminoácido individual especifico del sitio, correspondientes, de la proteína antigénica. CLB.IL-6/8 es delineado al sitio 1 en la molécula IL-6 de humano que esta compuesta de aminoácidos Gin29-Leu34 en proximidad cercana de la terminal carboxilo de la molécula. Los estudios adicionales (Kalai, M, et al., Eur. J. Biochem 249, 690-700 (1997)) muestran que los residuos de aminoácido reconocidos con CLB. IL-6/8 son cruciales para la unión de IL-6 a IL-6R(gp80). Estos estudios también indican que este epítope. cubre los extremos de la línea AB y las regiones helicoidales D de la molécula IL-6.

EJEMPLO 6 Caracterización in-vivo Tratamiento con IL-6 (cCLB8) anti-humano y Mabs de ratón de IL-6 anti-ratón que retardan la caquexia de cáncer Las células de melanoma humano (A37552) están inoculadas en ratones sin pelo, hembra y la terapia con Mab es iniciada el mismo día. Los anticuerpos son inyectados intraperitonealmente en una dosis de 10 mg/kg. (2x/semana) y C57 (anti-CMV) se usa como Mab de control. La combinación de cCLB8 (IL-6 antihumano) y MP520F3 (Mab a IL-6 de ratón, R&D Systems) se usa para crear una perdida de peso inhibida significativamente por el bloqueo combinado del tumor de melanoma humano que porta los animales en comparación al anticuerpo C57 de control tratado con animales (Figura 7). La terapia de anticuerpo no afecta el crecimiento del tumor o al peso final del tumor. Estos hallazgos indican que IL-6 participa en la pérdida de peso del animal inducida por el tumor, y el bloqueo de IL-6 que puede retardar la caquexia de cáncer en este modelo. La Figura 7 muestra el bloqueo combinado IL-6 de humano y de ratón (cCLB8 mAbs de anti-IL6 y MP520F3) que resulta en una inhibición significativa de pérdida de peso del animal. La pérdida de peso del animal corregida en el eje Y es (peso del animal-peso del tumor al final del estudio) menos el peso del animal al inicio del estudio. Cada barra es el promedio de datos de al menos 14 animales/grupo y las barras de error indican la desviación estándar. Dos análisis de prueba-t ajustado indican que el grupo IL-6 inhibe de manera significativa la pérdida de peso corporal con p=0.007.

EJEMPLO 7 Mediciones de afinidad BIAcore 2000, Sensor Chip CM-5 (superficie de oro sobre el chip cubierto con una matriz de dextrano carboximetilada), HBS (HEPES 10mM con NaCI 0.15M, EDTA 3.4mM, y agente tencioactivo al 0.05% P20 a pH 7.4), reactivos de acoplamiento amina (N-hidroxisuccimida (NHS), N-etil N'- (3-metilaminopropil) carbodiimida (EDC) y etanolamina-HCL 1 M) se obtuvieron a partir de BIAcore y se prepararon de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Fe ánti-humano (Jackson AffiniPure Goat antihumano IgG, FcD, Cat# 109-005-098, Lot #48646) es adquirido de Jackson ImmunoResearch. Anticuerpo monoclonal IgG (Lot # PD1 F03) de CLB8 quimérico en 5ml de cloruro de sodio 0.15M, fosfato de sodio 0.01 M, pH 7.2 es fabricado por Centocor. IL-6 de humano recombinante (Lot# A11971 1 1 ) es adquirido de R&D Systems. Un Fe de antihumano (1.8mg/ml) es diluido a una concentración de 50µg/ml en regulador NaOAc (10mM, pH 4.8) y acoplado a la matriz de dextrano carboximetilada de un chip sensor CM-5 usando la química de acoplamiento de amina del fabricante como se describe en el manual BIAcore systems. Usando la gran preparación superficial objetivo para 10000 RU, los grupos carboxilo en las superficies del sensor primero se activan con NHS/EDC seguido por la adición de Fe anti-humano. Los grupos activados restantes están bloqueados por la inyección de etanolamina 1 M. Cada una de las células que fluyen están acopladas en forma individual. Empleando estás condiciones, las 4 superficies de células de flujo que contienen unidades de resonancia (RU) 7554-9571 de Fe anti-humano se preparan. En experimentos preliminares se determina que tres inyecciones (15ul at 30µ?/G??? ) H3P04 100mM/CHAPS al 0.05% pueden retirar de manera eficiente el enlace de inmunoglobulina y conservar la capacidad de enlace del Fe anti-humano inmovilizado. Dos experimentos se realizan en BIAcore 2000 a 25°C con un gasto de 30µ?????. cCLB8 es disuelto en HBS a 5ug/ml. El analito, IL-6 es disuelto en HBS a 0.25, 0.125, 0.062, 0.031 , y 0.015 µ^ ?\. Una cantidad designada de anticuerpo es fluida sobre la célula de flujo respectiva seguida por inyecciones de 30µ? de cada concentración de IL-6 a 30µ?/????. (fase de asociación) y una interrupción de 800 segundos de flujo del regulador (fase de disociación). La superficie del chip es regenerada por tres inyecciones secuenciales de 15µ? cada una con H3P04 100mM/CHAPS al 0.05%. Las inyecciones de HBS sirven como referencia (sensograma blanco) para la substracción de índices de refracción de volumen para el análisis. Usando el modelo 1 : 1 en un análisis BIA 3.0, un ajuste local se realiza para la disociación (kd, [s-1]) y asociación (ka, [M-1 s-1 ]) y la constante de disociación (KD, [M]) calculada (kd/ka). El análisis se realiza usando una evaluación BIA versión 3.0. Las constantes cinéticas se derivan de los datos del sensograma mediante ajuste de las curvas experimentales a las ecuaciones de proporción derivadas de los modelos del mecanismo de interacción. Un análisis global usando un modelo de enlace 1 :1 con un ajuste local de RU máximo, la ka, kd, KD, se determinan (cuadro 1 ).

CUADRO 1 Mediciones de afinidad para Mab cCLB8 mediante Biacore EJEMPLO 8 Anticuerpos de anti-idiotipo El desarrollo de sistemas de ensayo efectivos (inmunohistoquimica y detección de suero) para cCLB8 que requiere de uso de anticuerpos anti-idiotipicos. Por tanto los ratones Balb/c son inmunizados cCLB8 para generar anticuerpos anti-idiotipicos para cCLB8 que se pueden utilizar como sondas farmacocinéticas en la detección de suero y en los ensayos ¡nmunohistoquímicos.

Inmunización Se inmunizaron cinco ratones Balb/c (Charles River Laboratories) a las 6-7 semanas de edad durante un período de 12 semanas con cCLB8 (Centocor, PD1 F03) dado a razón de 50 µg IP y 25 µg SC. Cada ratón recibió inyecciones IP y SC. Las inyecciones ocurrieron a intervalos de 2 semanas a través de todo el régimen de inmunización. Se emulsificó el material de inyección administrado IP con un volumen igual de adyuvante de Freund (Sigma). La primera inyección IP utilizó adyuvante completado de Freund en un volumen total de 200 µ?. Las inyecciones IP subsecuentes contenían adyuvante completo de Freund. Se diluyó el material de inyección administrado SC en PBS y se dividió entre dos sitios de inyección a razón de 100 µ?/sitío. Se sangraron los ratones en los días 0, 21 , 47 y 77. Se realizaron recolecciones de sangre en ratones anestesiados por función retroorbital y se recolectó suero para la determinación de título por EIA en fase sólida de cCLB8. Tres semanas después del término del protocolo de inmunización, el ratón # 1 recibió una inyección IV final de refuerzo de 100 µg de cCLB8 diluido en 125 µ? de PBS (2).

Detección de anticuerpos IqG anti-cCLB8 de ratón en suero de ratón Se usó EIA en fase sólida para seleccionar los sueros de ratón para anticuerpos específicos para cCLB8. Brevemente, se revistieron las placas (Costar, 9018) durante una noche con cCLB8 a 10 µ9/?t?? en PBS.

Después de lavar en solución salina a 0.15 M que contenía Tween 20 al 0.02% (p/v), se bloquearon los pozos con BSA al 1 % (p/v) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Se congelaron las placas a -20°C para uso futuro. Se incubaron dilusiones de suero de ratón a razón de 50 µ?/???? sobre placas revestidas de cCLB8 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron las placas y se ensayaron luego a temperatura ambiente durante 30 minutos con 50 µ?/???? de IgG Fe de cabra contra ratón marcado con HRP (Sigma), diluido 1 :20,000 en PBS/BSA al 1 %. Se lavaron nuevamente las placas y se incubaron luego durante 15 minutos a temperatura ambiente con 50 µ?/???? de solución de substrato de citrato/ substrato de fosfato (ácido cítrico a 0.1 M y fosfato de sodio a 0.2M, H202 al 0.01 % y 1 mg/ml de OPD). Se detuvo el desarrollo del substrato mediante la adición de ácido sulfúrico 4N a razón de 50 µ?/???? y se determinaron los DO a 490 nm mediante un espectrofotómetro con placas automatizado (3).

Función de células Tres días después dé haber recibido la inyección IV final, se eutanizó el ratón #1 por asfixia con C02, se extirpó el bazo asépticamente y se sumergió en 10 mi de PBS/PSA frío (PBS que contiene PSA el cual es 100U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina y 0.25 µ9/??? de aminopterina B). Se aislaron las células de bazo haciéndolas pasar a través de un recolector estéril de células, mientras se enjuagaba con medio RPMI (RPMI, FBS al 20%, piruvato de sodio a 1 mM, L-glutamina a 4 mM, aminoácidos no esenciales MEM al 1 %). Luego se lavaron las células una vez. y se enumeraron en un contador Coulter. Se llevó a cabo la fusión en una relación 5:1 de células de bazo viables a las células de mieloma murino (Centocor's Cell Biology Services, P3x63Ag8.653). Se colocó la mezcla de células de bazo y mieloma en un tubo de 50 mi y se convirtió a pella. Se resuspendió la pella lentamente con 2 mi de solución de PEG al 50% (p/v) {5 g de PEG con peso molecular de 3000, 5 mi de dH20 estéril con pH 8.0, 500 µ? de DMSO (Sigma)} a 37°C. Se permitió que la fusión de células ocurriera durante 2 minutos a temperatura ambiente. Se detuvo la fusión añadiendo lentamente 15 mi de RPMI (sin adiciones) a 37°C. Se centrifugaron las células fundidas durante 10 minutos a 1000 rpm, se succionaron a una pipeta de 25 mi y se expelieron a un matraz de 225 cm2 (Costar 431082) que contenía 100 mi de medio de fusión (RPMI, FBS al 20%, piruvato de sodio al 1 mM, L-glutamina a 4 mM, aminoácidos no esenciales MEM al 1 %, 25 µg/ml de gentamicina, hipoxantina a 100 µ?, aminopterina a 0.4 µ? y timidina a 16 µ?). Se permitió que se asentaran las células durante una noche a 37°C, se añadieron 100 mi adicionales de medio de fusión a 37°C al matraz y se arremolinó el matraz para resuspender las células. Se sembraron luego las células a 200 µ?/???? en nueve placas de cultivo de tejido, de fondo plano, de 96 pozos (Costar, 3595). Se colocaron las placas de fusión en una incubadora humedecida a 37°C con C02 al 5% durante 7-10 días. Se cambió el medio en la fusión después de 7 días (4).

Detección de anticuerpos IgG anti-cCLB8 de ratón en sobrenadante de hibridoma Se evaluaron por EIA hibridomas que surgieron de la fusión de linfocitos inmunizados de ratón CCLB8, con células de mieloma murino (Centocor's Cell Biology Services, P3X63Ag8.653), en cuanto a su capacidad de secretar anticuerpos de región antivariables. Brevemente, se revistieron las placas con 100 µg ml de cCLB8 en PBS durante una noche a 4°C. Se lavaron y bloquearon las placas como se describe anteriormente y se refrigeraron luego hasta su uso. Se incubaron sobrenadantes no diluidos de hibridoma procedentes del cultivo de fusión de 12 días sobre placas de cCLB8 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se sometieron a prueba los 1824 pozos de las placas de fusión. Se lavaron las placas y luego se ensayaron con IgG Fe de cabra antirratón marcadas con HRP diluido a 1 :20,000 en PBS/BSA al 1 %. Se lavaron nuevamente las placas y se incubaron luego con solución de citrato/substrato de fosfato como se describe previamente. Las células en pozos positivos se transfirieron a placas de 24 pozos y se sometieron a prueba los sobrenadantes en otros anticuerpos quiméricos de ratón/humano, tales como C207A (anti-Facxtoer VII), C128A (anti-CD4), C1 16J (antiplaqueta GPIIb/llla), C168J (anti-TNFa) y C300A/C301A (dos diferentes antígenos antipróstata de tumor). Se clonaron las células en pozos negativos a >80% de homogeneidad y se les dieron códigos C. Sé prepararon Research Cell Banks de 12 frascos cada uno y se sometieron a prueba en cuanto a micoplasma y esterilidad para Mabs C433A-C437A (5).

Determinación de isotipos Se efectúa la determinación de isotipos de los anticuerpos mediante el uso de equipo de determinación de isotipos en anticuerpos monoclonales de ratón (Life Technologies) en formato de varilla de sonda. Se incubó una mezcla de regulador de pH de dilución, sobrenadante de hibridoma y producto conjugado de rata antirratón durante una noche a temperatura ambiente con agitación en tubos que contenían varillas prerrevestidas con varios isotipos de anticuerpos murinos de captura. Se retiraron las varillas de los tubos, se enjuagaron suavemente en dH20 y se determinaron los isotipos (6).

Ensayos de inhibición de suero Se efectuó por EIA en fase sólida la devaluación de los efectos inhibitorios de inmunoglobulina circulantes competitivas en NHS en la capacidad de 7 anticuerpos anti-id para unir cCLB8. Se incubaron los 7 anticuerpos antiidiotípicos purificados en soluciones seriadas dobles comenzando la concentración final de 50 g/ml en presencia de suero humano normal combinado al 0%, 0.5%, 5%, y 50% (v/v) durante 30 minutos a 37°C. Se transfirieron las mezclas a placas revestidas de cCLB8, se incubaron durante 30 minutos a 37°C y se lavaron luego. Se ensayaron las placas durante 30 minutos a 37°C con IgG Fc*HRP de cabra antirratón a 1 :20,000 en PBSI/BSA al 1 % y se lavaron. Se permitió que ocurriera el desarrollo de substrato OPD en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadió ácido sulfúrico 4N a las placas para detener el desarrollo del substrato. Se examinaron las placas en cuanto a inhibición de unión por la medida de DO a 490 mm (7).

Inhibición de la unión de cCLB8 a HulL-6 por Mabs anti-id Se efectuó por EIA en fase sólida el análisis de la capacidad de 7 anticuerpos anti-id en la inhibición de la unión de cCLB8 a HulL-6 de HulL-6. Se revistieron placas durante una noche a 4°C con HulL-6 a 1 µ?/??? en PBS y se bloquearon con PBS/BSA al 1 % durante 1 hora a temperatura ambiente, se preincubó 2 g/ml de cCLB8 de concentración final durante 30 minutos a 37°C con diluciones seriadas dobles de los 7 anticuerpos anti-id comenzando a razón de 50 µ9/?t??. Se añadieron luego las mezclas de preincubación a placas de HulL-6, se incubaron durante 30 minutos a 37°C y se lavaron. Se ensayaron las placas con IgG Fc*HRP de cabra antihumano (preciso), a 1 :25,000 durante 30 minutos a 37°C y luego se lavaron. Se permitió que ocurriera el desarrollo del substrato OPD en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se detuvo el desarrollo del substrato mediante la adición de ácido sulfúrico 4N. Se evaluaron las placas por la medida de OD a 490 nm (8).

Unión de anticuerpos monoclonales anti-id a cCLB8 preunido a HulL-6 Se determinó la capacidad de 7 anticuerpos anti-id para unirse a cCLB8 ya unido a HulL-6. Se revistieron las placas con HulL-6 a 1 µ9/??? en PBS durante una noche a 4°C y se bloquearon. Se incubó cCLB8 a razón de 10 µ9 ??? en PBS en las placas de HulL-6 durante 30 minutos a 37°C. Se lavaron las placas, se añadieron diluciones seriadas triples comenzando a razón de 10 µ9/??? de Mabs anti-id y se incubaron a 37°C durante 30 minutos. Se lavaron las placas y luego se ensayaron durante 30 minutos a 37°C con IgG FC de cabra antirratón marcado con HRP a 1 :20,000 en PBS/BSA al 1 %. Se lavaron nuevamente las placas, se desarrollaron luego con substrato de OPD durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se midieron los DO a 490 nm (9).

Generación de anticuerpos monoclonales antiidiotípicos de cCLB8 de ratón Una fusión en que se utiliza un bazo de ratón Balb/c inmunizado de cCLB8 dio por resultado la multiplicación de 7 anticuerpos anti-id específicos para cCLB8 por EIA. Se demostró que los 7 anticuerpos anti-id no se unen a otros anticuerpos quiméricos de ratón/humano, tales como C207A, C128A, C168J, C116J, C300A, y C301A. Seis de los siete anticuerpos fueron del isotipo IgGl K y un anticuerpo del lgG2bi . El cuadro 1 resume los resultados de la fusión. Cabe mencionar que se logró el título máximo en suero de 1 :800 en el ratón después de 47 días que permaneció constante en toda la duración de la inmunización.

CUADRO 1 Propiedades de anticuerpo monoclonales antiidiotípicos de cCLB8 de ratón Ensayos de inhibición de suero Se determinó el efecto de suero humano normal combinado en la capacidad de 7 anticuerpos anti-id para unirse a cCLB8. No se evitó que algunos de los Mabs anti-id se unieran a cCLB8 en 0% y 0,5% de NHS. Tres Mabs (C433A, C435A, y C437A) exhibieron inhibición parcial de unión en 5% de NHS. Todos, excepto C434A y C436A, fueron afectados significativamente por la concentración de NHS al 50%. Las figuras 8A-G muestran los perfiles de unión de inhibición de suero de los 7 anticuerpos anti-id. Figuras 8A-G. Se incubaron diluciones en duplicación de Mabs anti-id comenzando a razón de 50 µ/ml, en presencia de NHS al 0%, 0.05%, 5% y 50% durante 30 minutos a 37°C. Se transfirieron las mezclas a placas revestidas de cCLB8 y se incubaron durante 30 minutos a 37°C. Se lavaron las placas y se ensayaron luego con IgG Fc*HRP de cabra antirratón. (A) C433A; (B) C434A, (C) C435A, (D) C4336A, (E) C437A, (F) C438A, y (G) C439A.

Inhibición de la unión de cCLB8 a HulL-6 por Mabs anti-id Se evaluó la capacidad de los 7 anticuerpos anti-id de inhibir la unión de cCLB8 a HulL-6. Estudios previos por EIA demostraron que cCLB8 se une muy débilmente a placas revestidas de HulL-6 (10). Dos Mabs (C435A y C437A) a excesos de concentración de 6-25 veces demostraron virtualmente la inhibición completa de la unión de cCLB8 a HulL-6. C434A expresó un efecto inhibitorio para cCLB8 solamente al exceso de 25 veces. Los dos mejores anticuerpos en inhibir la unión de cCLB8 a HulL-6 fueron C436A y C339A. Estos dos anticuerpos fueron capaces de inhibir completamente la unión de cCLB8 sobre un intervalo de concentración en exceso de 3 a 25 veces. C433A y C438A no mostraron actividad inhibitoria alguna. Este ensayo confirmó los resultados obtenidos en el estudio preliminar (1 1 )· Figura 9. cCLB8 a razón de 2 µ9/??? incubado con titulaciones en duplicación de Mabs anti-id comenzando a razón de 50 µ9/??? durante 30 minutos a 37°C. Se transfirieron las mezclas a placas revestidas de HulL-6 y se incubaron durante 30 minutos a 37°C. Se lavaron las placas y se ensayaron luego con IgG Fc*HRP de cabra antihumano.

Unión anti-id a cCLB8 preunido a HulL-6 Se examinó la capacidad de 7 anticuerpos anti-id de unirse a cCLB8 que se había preunido a HulL-6. Como en estudios preliminares, C436A y C438A fueron los únicos anticuerpos capaces de unirse a cCLB8 que se habían preunido de HulL-6 (1 1 ). La figura 3 ¡lustra las capacidades de unión de los 7 anticuerpos anti-id a cCLB8 que se ha preunido a HulL-6. Figura 10. cCLB8 a 10 µ/ml incubado en placas de HulL-6 durante 30 minutos a 37°C. Se lavaron las placas y se incubaron luego con diluciones en triplicación de Mabs anti-id comenzando a razón de 10 µg/ml durante 10 minutos a 37°C. Se lavaron las placas y luego se ensayaron con IgG Fc*HRP de cabra antirratón. En resumen, debido a su actividad pleotrópica, IL-6 está implicada en la patología de una variedad de enfermedades. Por lo tanto, es conveniente usar un anticuerpo quimérico humano neutralizante, de alta afinidad, en IL-6 en enfermedades relacionadas con IL-6, tales como cáncer, caquexia, SLE, osteoporosis y CHF. Se puede usar cCLB8 o cualesquiera derivados de este Mab incluyendo fragmentos quiméricos o humanizados, en el alivio del dolor óseo, inhibiendo el crecimiento de tumores, tales como cáncer de próstata y mieloma múltiple y otras enfermedades en las cuales esté implicado IL-6. Se puede usar este anticuerpo ya como agente único ya en combinación con otros agentes terapéuticos. Además, se puede usar este Mab como quimiosensibilizador con lo cual puede aumentar la eficacia terapéutica de agentes citotóxicos.

Será evidente que se puede poner en práctica la invención de manera diferente de la descrita particularmente en la descripción y los ejemplos precedentes. Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas mencionadas anteriormente y, por lo tanto, están dentro del alcance de las reivindicaciones anexadas.

Conclusión Se produjeron siete anticuerpos antiidiotípicos monoclonales mediante la porción de células de mieloma y células de bazo murino de un ratón Balb/c con anticuerpos IL-6 quimérico (cCLB8). Cinco de los anticuerpos anti-id (C434A, C435A, C436A, C437A y C439A) fueron capaces de bloquear la unión de cCLB8 a HulL-6. Dos anticuerpos (C436A y C438A) poseían la capacidad de unirse a cCLB8 que se había preunido a HulL-6 y dos anticuerpos (C434A y C436A) no fueron afectados virtualmente al unirse a cCLB8 en cualquier concentración de NHS sometido a prueba. Los amplios perfiles de unión de estos anticuerpos antiidiotípicos de cCLB8 los convierte en candidatos potenciales para su uso como sondas farmacocinéticas en detección de suero y ensayos inmunohistoquímicos.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Centocor Inc. Giles-Komar, Jill Trikha, ohit ' Peritt, David Knight, David M <120> Anticuerpos Anti-IL-6, Composiciones, Métodos iy Usos <130> CEN0270 <140> 60/332743 1 <141> 2001-11-14 <150> 60/332743 <151> 2001-11-14 <160> 16 <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 , <211> 5 : <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Ser Phe Ala Met Ser 1 - 5 , <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 ' Glu lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 1 5 10 ? 15 í Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Gly Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr 1 5 10 i <210> 4 <211> 10 <212> P T <213> Mus musculus <400> 4 Ser Ala-Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Lys Leu Leu Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 ¦ Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 106 <212> PRT <213 Mus musculus <400> 8 Gln lie Val Leu lie Gln Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 . 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu lie Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 9 <211> 15 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 9 agctttgcca tgtct <210> 10 <211> 51 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 10 gaaattagta gtggtgggag ttacacctac tatcctgaca ctgtgacggg <210> 11 <211> 30 <212> ADN <213> Mus musculus <400 11 ggtttatggg ggtactatgc tcttgactac <210> 12 <211> 30 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 12 agtgccagct caagtgtaag ttacatgtac <210> 13 <211> 21 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 13 gacacatcca acctggcttc t <210> 14 <211> 27 <212> ADN <213> Mus rausculus <400> 14 cagcagtgga gtggttaccc atacacg <210> 15 <211> 357 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 15 gaggtgcaac tggtggaatc tggaggaaaa ttactgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctttgcca tgtcttggtt tcgccagtct 120 ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcagaa attagtagtg gtgggagtta cacctactat 180 cctgacactg tgacgggccg attcaccatc tccagagaca atgccaag'aa caccctgtac 240 ctggaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attattgtgc aaggggttta 300 tgggggtact atgctcttga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357 <210> 16 <211> 318 <212> ADN <213> ' Mus musculus <400> 16 caaattgttc tcatacagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgtact ggtaccagca gaagccagga 120 tcctccccca gactcctgat ttatgacaca tccaacctgg cttctggagt ccctgttcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgag 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtggttacc catacacgtt cggagggggg 300 accaagctgg aaataaaa . 318

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1. - Un anticuerpo quimérico, humanizado o con injerto de CDR capaz de inhibir IL-6 humana que comprende por lo menos una región de determinación de complementariedad (CDR) de cadena pesada o ligera derivada del anticuerpo CLB-8 monoclonal anti-IL-6 de murino y una región constante derivada de uno o más anticuerpos humanos. 2. - El anticuerpo de IL-6 de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende por lo menos una región variable de cadena pesada o de cadena ligera que comprende los SEQ ID Nos. 7 u 8. 3. - El anticuerpo de IL-6 de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque inhibe competitivamente in vivo la unión a IL-6 humana de CLB-8 anti-IL-6 de murino o un anticuerpo que tiene sustancialmente las mismas características de unión de los mismos. 4. - El anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificadas de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho anticuerpo o porción o variante especificadas une IL-6 con una afinidad (Kd) de por lo menos 10"9M. 5. - El anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificadas de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho anticuerpo o porción o variante especificadas une IL-6 con una afinidad (Kd) de por lo menos 10"11M. 6. - El anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificadas de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho anticuerpo o porción o variante especificadas une IL-6 con una afinidad (Kd) de por lo menos 10'12M. 7. - El anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificadas de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico que comprende por lo menos una región variable de cadena pesada o de cadena ligera derivada del anticuerpo CLB-8 monoclonal anti-IL-6 de murino y una región constante derivada de uno o más anticuerpos humanos. 8. - El anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificadas de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho anticuerpo o porción o variante especificadas neutraliza sustancialmente por lo menos una actividad de por lo menos una IL-6. 9. - El anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificadas de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque dicha actividad es por lo menos una seleccionada del grupo que consiste en inhibición de secreción murina de IgM a partir de células SKW6.4, inhibición de producción de MCP-1 mediada por IL-6, inhibición de señalización de IL-6 en células de leucemia monocíticas humanas de THP-1 , inhibición de producción A amiloide de suero inducida por IL-6 a partir de células HepG2, e inhibición de proliferación celular inducida pro rhlL-6. 10. - Un ácido nucleico que codifica un anticuerpo de IL-6 aislado, que comprende un ácido nucleico que híbrida bajo condiciones severas, o tiene por lo menos 95% de identidad, a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo quimérico, humanizado o con injerto de CDR o porción o variante especificadas del mismo, comprendiendo por lo menos una secuencia de codificación de región de determinación de complementariedad (CDR) correspondiente o complementaria a por lo menos 90-100% de los nucleótidos contiguos de por lo menos uno de SEQ ID Nos: 1 , 2, 3, 4, 5, 6. 1 1. - El ácido nucleico que codifica un anticuerpo de IL-6 aislado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque dicho ácido nucleico comprende por lo menos una secuencia de codificación de región de determinación de complementariedad (CDR) correspondiente o complementaria a por lo menos 90-100% de los nucleótidos contiguos de por lo menos uno de SEQ ID Nos; 1 , 2, 3, 4, 5, 6. 12. - El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque codifica por lo menos un anticuerpo anti-IL-6 que tiene por lo menos una región variable que comprende SEQ ID No. 7 u 8. 13. - Un anticuerpo de IL-6 aislado o porción o variante especificadas, que comprende un anticuerpo aislado o porción o variante S , 168 especificadas, codificado por un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 1 ó 12. 14. - Una composición de ácido nucleico que codifica un anticuerpo de lL-6, que comprende un ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 10 y un vehículo o diluyente. 15. - Un vector de anticuerpo que comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10. 16. - El vector de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho vector comprende por lo menos un promotor seleccionado del grupo que consiste en un promotor SV490 tardío o temprano, un promotor CMV, un promotor HSV tk, un promotor pgk (fosfogl ice rato cinasa), un promotor de inmunoglobulina humana, un promotor EF-1 alfa. 17. - El vector de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicho vector comprende por lo menos un gen o porción de selección del mismo, seleccionado de por lo menos uno de metotrexato (MTX), proteína verde fluorescente (GFP), dihidrofolato reductasa (DHF ), neomicina (G418) o glutamina síntetasa (GS). 18. - Una célula hospedera que comprende un ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 10. 19. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque dicha célula hospedera es por lo menos una de COS-1 , CQS-7, HEK293, BHK21 , CHO, BSC-1 , Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, células de mieloma, o de linfoma, o cualquier célula derivada, inmortalizada, o transformada de las mismas. 20. - Un método para producir por lo menos un anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificadas, que comprende traducir un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10 o un ácido nucleico endógeno que híbrida al mismo bajo condiciones severas, bajo condiciones in vitro, in vivo o situ, de manera que el anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificadas se expresa en cantidades detectables o recuperables. 21. - Una composición de anticuerpo de IL-6 o composición de porción o variante especificadas, que comprende un anticuerpo de IL-6 aislado o porción o variante especificadas de conformidad con la reivindicación 1 , y un vehículo o diluyente. 22. - La composición de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque también comprende por lo menos un compuesto o proteína seleccionados a partir de por lo menos uno de un antagonista de TNF, un antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (NSAID), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antisoriático, un córticosteroide, un esferoide anabólico, un agente relacionado con diabetes, un mineral, un nutricional, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada con calcio, un antidiarreico, un antitusivo, un antiemético, un antiulcerante, un laxante, un anticoagulante, una eritropoietina, una filgrastima, una sargramostima, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un fármaco de reemplazo hormonal, un modulador del receptor de estrógeno, un midriático, un cicloplégico, un agente de alquilación, un antimetabolito, un inhibidor mitótico, un radiofarmacéutico, un antidepresivo, un agente antimanía, un antisicótico, un ansiolítico, un hipnótico, un simpatomimético, un estimulante, donepezil, tacrina, un medicamento para asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrieno, una metilxantina, una cromolina, una epinefrina o análogo, dornasa alfa, una citocina o un antagonista de citosina. 23.- El uso de por lo menos un anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificadas de conformidad con la reivindicación 1 , para la preparación de un medicamento para tratar un trastorno o enfermedad inmune en una célula, tejido, órgano o animal. 24. - El uso como se reclama en la reivindicación 23, en donde dicho animal es un primate. 25. - El uso como se reclama en la reivindicación 24, en donde dicho primate es un mono o un humano. 26. - El uso como se reclama en la reivindicación 25, en donde dicha condición inmune es por lo menos una enfermedad seleccionada de artritis reumatoide/artropatías seronegativas, osteoartritis, enfermedad intestinal inflamatoria, lupus eritematoso sistémico, iridociclitis/uveitis/neuritis óptica, fibrosis pulmonar idiopática, vasculitis sistémica/granulomatosis de Wegener, sarcoidosis, procedimientos de reversión de orquitis/vasectomía, enfermedades alérgicas/atópicas, asma, rinitis alérgica, eczema, dermatitis alérgica por contacto, conjuntivitis alérgica, neumonitis por hipersensibilidad, transplantes, rechazo de transplante de órgano, enfermedad de injerto-contrahospedero, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, síndrome de sepsis, sepsis gram positiva, sepsis gram negativa, sepsis de cultivo negativo, sepsis fungal, fiebre neutropénica, urosepsis, meningococemia, trauma/hemorragia, quemaduras, exposición a radiación ionizante, pancreatitis aguda, síndrome de dificultad respiratoria de adulto, lupus eritematoso sistémico y artritis reumatoide, hepatitis inducida por alcohol, patologías inflamatorias crónicas, sarcoidosis, patología de Crohn, anemia de célula falciforme, diabetes, nefrosis, enfermedades atópicas, reacciones de hipersensibilidad, rinitis alérgica, fiebre del heno, rinitis perenne, conjuntivitis, asmas, urticaria, anafilaxis sistémica, dermatitis, anemia perniciosa, enfermedad hemolítica, trombocitopenia, rechazo al injerto de cualquier órgano o tejido, rechazo de transplante de riñon, rechazo de transplante de corazón, rechazo de transplante de hígado, rechazo de transplante de páncreas, rechazo de transplante de pulmón, rechazo de transplante de médula ósea (BMT), rechazo de aloinjerto de piel, rechazo de transplante de cartílago, rechazo de injerto de hueso, rechazo de transplante de intestino delgado, rechazo de implante de timo fetal, rechazo de transplante de paratiroide, rechazo de xenoinjerto de cualquier órgano o tejido, rechazo de aloinjerto, reacciones de hipersensibilidad anti-receptor, enfermedad de Graves, enfermedad de Raynoud, diabetes tipo B resistente a insulina, asma, miastenia gravis, citotoxicidad mediada por anticuerpo, reacciones de hipersensibilidad tipo III, lupus eritematoso sistémico, pénfigo, escleroderma, enfermedad de tejido conectivo mezclado, enfermedad idiopática de Addison, diabetes mellitus, hepatitis activa crónica, cirrosis biliar primaria, vitíligo, vasculitis, síndrome post cardiotomía-MI, hipersensibilidad tipo IV, dermatitis por contacto, neumonitis por hipersensibilidad, rechazo de aloinjerto, granulomas debidos a organismos intracelulares, sensibilidad a fármaco, metabólico/idiopático, enfermedad de Wilson, hemacromatosis, deficiencia de antitripsina alfa-1 , diabetes, tiroiditis de Hashimoto, osteoporosis, evaluación de eje hipotalámico-pituitaria-adrenal, cirrosis biliar primaria, tiroiditis, encefalomielitis, caquexia, fibrosis quística, linfohistiocitosis hematofagocítica familiar, condiciones dermatológicas, soriasis, alopecia, síndrome nefrótico, nefritis, hemodiálisis, uremia, toxicidad, terapia okt3, terapia anti-cd3, terapia de citocina, quimioterapia, terapia por radiación (por ejemplo, incluyendo pero no limitada a astenia, anemia, caquexia, y similares), intoxicación crónica por salicilato. 27.- El uso como se reclama en la reivindicación 23, en donde dicho medicamento proporciona de 0.001-50 mg/kilogramo de dichas células, tejido, órgano o animal. 28.- El uso como se reclama en la reivindicación 23, en donde dicho medicamento proporciona de 0.0001-50 mg/kilogramo de dichas células, tejido, órgano o animal. 29.- El uso de por lo menos un anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificada de conformidad con la reivindicación 1 , para la preparación de un medicamento para modular por lo menos un trastorno o condición infecciosa o cancerosa en una célula, tejido, órgano o animal. 30.- El uso como se reclama en la reivindicación 29, en donde dicho animal es un primate. 31 . - El uso como se reclama en la reivindicación 30, en donde dicho primate es un mono o un humano. 32. - El uso como se reclama en la reivindicación 29, en donde dicho trastorno o condición infecciosa o cancerosa es por lo menos seleccionada de (I) infección bacteriana aguda o crónica, procesos parasitarios o infecciosos agudos o crónicos, incluyendo infecciones bacterianas, virales y fúngales, infección por VIH/neuropatía por VIH, meningitis, hepatitis, artritis séptica, peritonitis, neumonía, epiglotitis, e. coli 0157:h7, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombocitopénica trombolítica, malaria, fiebre hemorrágica del dengue, leishmaniasis, lepra, síndrome de choque tóxico, miositis estreptococal, gangrena gaseosa, tuberculosis por micobacteria, micobacteria aviar intracelular, neumonía por Pneumocystis carinii, enfermedad inflamatoria pélvica, orquitis/epididimitis, legionela, enfermedad de Lyme, influenza a, virus epstein-barr, síndrome hemafagocítico asociado a órgano vital, encefalitis vital/meningitis aséptica, y similares; (II) leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), ALL de célula B, de célula T o de FAB, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielocítica crónica (CML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia de célula pilosa, síndrome mielodisplásico (MDS), un línfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma maligno, linfoma no de Hodgkin, línfoma de Burkitt, mieloma múltiple, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorectal, carcinoma pancreático, carcinoma nasofaríngeo, histiocitosis maligna, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia de malignidad, tumores sólidos, adenocarcínomas, sarcomas, melanoma maligno y similares. 33. - El uso como se reclama en la reivindicación 23, en donde dicho medicamento proporciona de 0.01 -100 mg/kílogramo de dichas células, tejido, órgano o animal. 34. - El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 23-33, en donde dicho medicamento es administrable mediante por lo menos un modo seleccionado de intravenoso, intramuscular, bolo, subcutáneo, respiratorio, inhalación, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmíca. 35. - El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 23-33, en donde por lo menos una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un compuesto o proteína seleccionados de por lo menos un antagonista de TNF, un antírreumático, un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroídeo (NSAID), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antísoriático, un corticosteroíde, un esferoide anabólico, un agente relacionado con diabetes, un mineral, un nutricional, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada con calcio, un antidiarreico, un antitusivo, un antiemético, un antiulcerante, un laxante, un anticoagulante, una eritropoietina, una filgrastima, una sargramostima, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un fármaco de reemplazo hormonal, un modulador del receptor de estrógeno, un midriático, un cicloplégico, un agente de alquilación, un antimetabolito, un inhibidor mitótico, un radiofarmacéutico, un antidepresivo, un agente antimanía, un antisicótico, un ansiolítico, un hipnótico, un simpatomimético, un estimulante, donepezil, tacrina, un medicamento para asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrieno, una metilxantina, una cromolina, una epinef na o análogo, dornasa alfa, una citocina o un antagonista de citosina. 36. - Un dispositivo médico que comprende por lo menos un anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificadas de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicho dispositivo es adecuado para poner en contacto o administrar dicho por lo menos un anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificada mediante por lo menos un modo seleccionado de intravenoso, intramuscular, bolo, subcutáneo, respiratorio, inhalación, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmíca. 37. - Un anticuerpo humano o porción o variante especificadas del mismo, en donde dicho anticuerpo o porción o variante especificadas une el mismo epítope o región antigénica como un anticuerpo de IL-6 o porción o vanante especificada de conformidad con la reivindicación 1 . 38. - Una formulación que comprende por lo menos un anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificadas de conformidad con la reivindicación 1 , y por lo menos uno seleccionado de agua esterilizada, agua esterilizada de pH regulado, o por lo menos un conservador seleccionado del grupo que consiste en fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, nitrito fenilmercúrico, fenoxietanol, formaldehído, clorobutanol, cloruro de magnesio, alquilparabeno, cloruro benzalconio, cloruro de bencetonio, dehidroacetato de sodio o timerosal, o mezclas de los mismos, en un diluyente acuoso. 39. - La formulación de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada además porque la concentración de anticuerpo de IL-6 o porción o vanante especificadas es aproximadamente 0.1 mg/ml a alrededor de 100 mg/ml. 40. - La formulación de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada además porque también comprende un agente de isotonicidad. 41 . - La formulación de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada además porque también comprende un regulador de pH fisiológicamente aceptable. 42. - Una formulación que comprende por lo menos un anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificadas de conformidad con la reivindicación 1 en forma liofilizada en un primer contenedor, y un segundo contenedor opcional comprende agua esterilizada, agua esterilizada de pH regulado, o por lo menos un conservador seleccionado del grupo que consiste en fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, nitrito fenilmercúrico, fenoxietanol, formaldehído, clorobutanol, cloruro de magnesio, alquilparabeno, cloruro benzalconio, cloruro de bencetonio, dehidroacetato de sodio y timerosal, o mezclas de los mismos, en un diluyente acuoso. 43. - La formulación de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la concentración de anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificadas está reconstituido a una concentración de aproximadamente 0.1 mg/ml a alrededor de 500 mg/ml. 44. - La formulación de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque también comprende un agente de isotonicidad. 45. - La formulación de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque también comprende un regulador de pH fisiológicamente aceptable. 46. - El uso de una formulación de conformidad con la reivindicación 42, para la preparación de un medicamento para tratar por lo menos una condición mediada por IL-6. 47. - Un artículo de fabricación para uso farmacéutico humano, que comprende material de empaque y un contenedor que comprende una solución o una forma liofilizada de por lo menos un anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificadas de conformidad con la reivindicación 1. 48.- El articulo de fabricación de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado además porque dicho contenedor es un contenedor de vidrio o plástico que tiene un obturador para administración multiuso. 49.- El artículo de fabricación de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado además porque dicho contenedor es un empaque de burbujas que puede ser perforado y utilizado en administración intravenosa, intramuscular, bolo, intraperitoneal, subcutánea, respiratoria, inhalación, nasal, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, subdérmica o transdérmica. 50. - El artículo de fabricación de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado además porque dicho contenedor es un componente de un dispositivo o sistema de suministro intravenoso, intramuscular, bolo, intraperitoneal, subcutáneo, respiratorio, inhalación, nasal, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, subdérmico o transdérmico. 51. - El artículo de fabricación de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado además porque dicho contenedor es un componente de un dispositivo o sistema inyector o inyector en forma de pluma para admnistración intravenosa, intramuscular, bolo, intraperitoneal, subcutánea, respiratoria, inhalación, nasal, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, subdérmica o transdérmica. 52. - Un método para preparar una formulación de por lo menos un anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificadas, que comprende intermezclar por lo menos un anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificadas de conformidad con la reivindicación 1 , en por lo menos un regulador de pH que contiene una solución salina o una sal. 53. - Un método para producir por lo menos un anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificadas de conformidad con la reivindicación 1 , que comprende proveer una célula hospedera o animal transgénico o planta transgénica o célula vegetal que tenga la capacidad de expresar dicho anticuerpo o porción o variante especificadas en cantidades recuperables. 54. - El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque dicha célula hospedera es una célula de mamífero, una célula vegetal o una célula de levadura. 55. - El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque dicho animal transgénico es un mamífero. 56. - El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque dicho mamífero transgénico se selecciona de una cabra, una vaca, una oveja, un caballo y un primate no humano. 57. - Un animal o planta transgénicos que expresan por lo menos un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 . 58. - Por lo menos un anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificadas producido por un método de conformidad con la reivindicación 54. 59. - Un anticuerpo quimérico, humanizado o con injerto de CDR de IL-6 aislado o porción o variante especificadas, que comprende una región constante de humano y variable de murino, en donde dicho anticuerpo o porción o variante especificadas une específicamente por lo menos un epítope que comprende por lo menos 1 -3 aminoácidos de los aminoácidos Gln29-Lev34 de IL-6 de humano. 60.- El anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificadas de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque dicho anticuerpo o porción o variante especificadas une IL-6 con una afinidad de por lo menos 10"9M. 61- El anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificadas de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque dicho anticuerpo o porción o variante especificadas une IL-6 con una afinidad de por lo menos 10"1 M. 62. - El anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificadas de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque dicho anticuerpo o porción o variante especificadas une IL-6 con una afinidad de por lo menos 10"12M. 63. - El anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificadas de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque dicho anticuerpo o porción o variante especificadas neutraliza porlo menos una actividad de por lo menos uno. 64. - El anticuerpo de IL-6 o porción o variante especificadas de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado además porque dicha actividad es por lo menos una seleccionada del grupo que consiste en inhibición de secreción IFN-gamma inducida por IL-6, inhibición de citotoxicidad de células LAK, inhibición de transcripción de ARNm IFN gamma, inhibición de células CD3+ IFN gamma intracelulares y expresión de CD95.