JP2000512981A - ａＰＬ免疫応答性ペプチド、その結合体およびａＰＬ抗体媒介病理のための処置方法 - Google Patents

ａＰＬ免疫応答性ペプチド、その結合体およびａＰＬ抗体媒介病理のための処置方法

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Abstract

(57)【要約】 （ａ）aPLエピトープが結合するＢ細胞に特異的に結合するaPLアナログを開示する。Ｔ細胞エピトープ（単数または複数）を欠失する最適化されたアナログは、aPL抗体媒介疾患を処置するための結合体として有用である。aPLアナログおよび非免疫原性原子価プラットホーム分子を含む結合体が、新規の非免疫原性原子価プラットホーム分子およびリンカーとして提供される。このアナログを調製および同定する方法、このアナログを用いる処置方法、このアナログの結合体を調製するための方法および組成物ならびにこのaPL抗体についての診断イムノアッセイを開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 aPL免疫応答性ペプチド、その結合体およびaPL抗体媒介病理のための処置方法 相互参照出願 本出願は、1996年６月６日に出願された米国出願番号08/660,092号の一部継続 出願である。米国出願番号08/660,092号は、1995年６月７日に出願された米国出 願番号08/482,651号の一部継続出願である。 技術分野 本発明は免疫学の分野にあり、そして抗リン脂質(aPL)抗体媒介病理を処置し そして診断するための組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、化 学的に定義された非免疫原性原子価プラットホーム分子（valency platform mol ecule）およびaPL結合エピトープの免疫特異的アナログならびにこれらの結合体 を生成するための方法および組成物に関する。最適化されたアナログは、Ｔ細胞 エピトープを欠損する。さらに、本発明は、生物学的サンプル中の抗リン脂質抗 体の存在を検出し、そしてその量を定量するための診断アッセイに関する。本発 明はまた、aPL結合エピトープの免疫特異的アナログを同定するためにランダム ペプチドライブラリーを利用する方法に関する。 発明の背景 抗リン脂質抗体は、全身性エリテマトーデス(SLE)および抗リン脂質抗体症候 群(APS)のような自己免疫疾患において、ならびに感染および薬物治療に関連し て生じる。APSは、動脈性または静脈性の血栓症、血小板減少症、および胎児死 亡(fetal loss)のような１つ以上の臨床的特徴によって特徴づけられる。APSは 、原発性であり得るか、または他の状態、主にSLEに関連し得る(PHOSPHOLIPID-B INDING ANTIBODIES(Harrisら編、CRC Press，Boca Raton，FL，1991);McNeilら 、ADVANCES IN IMMUNOLOGY，第49巻、193-281頁(Austenら編、Academic Press， San Diego，CA，1991))。SLEを有する患者の約30〜40％がaPLを有するが、aPL抗 体 を有する患者の50％はSLEを有さない。この50％は他の自己免疫リウマチ的疾患 、雑多な状態を有し得、またはこれらは薬物療法、特にクロルプロマジンに供さ れた可能性がある。原発性のAPS(PAPS)を有するが、SLEを有する証拠のない70人 の患者（26人の男性および44人の女性）の１つの研究において、以下の特徴が観 察された：31人に深部静脈血栓(DVD)；31人に動脈閉塞、特に発作または一過性 虚血；15人に心筋梗塞；24人に再発性の胎児死亡；32人に血小板減少症(TCP)；1 0人がCoombs試験に陽性；７人にEvans症候群；32人に抗核抗体(ANA)、しかし29 人が１:160未満；および約24人に抗ミトコンドリア抗体(AMA)(McNeilら、前出) 。推定値はばらつくが、全ての発作患者の約５％において、aPL抗体は重要な寄 与因子であると考えられる。 VDRL試験において検出される抗体のような一過性のaPL抗体は、多くの感染の 間に起こる。持続的なaPL抗体を有する患者の約30％が血栓症的事象を経験して いる。aPL抗体の存在は、血栓症、TCP、および胎児死亡の一つ以上からなる臨床 的特徴を有する症候群を呈する患者の群をSLE内に規定する。SLE全体におけるこ の症候群の危険性は、約25％である；この危険性は、aPL抗体の存在下で40％に 増加し、そしてその非存在下では15％に減少する。aPL抗体は細胞膜のリン脂質 に指向されると考えられていたため、それらは血小板または内皮のような細胞の リン脂質膜で起こる止血のプロセスを妨害することによって、インビボで直接的 な病原性の影響を及ぼし得ると推論されてきた。PAPSを有する患者において、aP L抗体が、存在する唯一の危険因子のようであるという事実は、これらの抗体が 直接的な病原的役割を有するというさらなる証拠である。マウスをヒト抗カルジ オリピン抗体で免疫化することによるPAPSの誘導は、aPL抗体が直接的に病原性 であるという、これまでで最高の証拠である(Bakimerら、1992 J.Clin.Invest.8 9:1558-1563;Blankら、1991 Proc.Natl.Acad.Sci．88:3069-3073)。 臨床的環境におけるaPL抗体の測定は、未だに不完全な技術である。標準的な 抗血清の市販のセット(APL Diagnostics，Inc.，Louisville，KY)は、種々の研 究室において行われるアッセイの比較のための標準曲線の作成を可能にする。し かし、正確なGPLおよびMPL（それぞれ、所与の血清を評価するIgGおよびIgM抗リ ン脂質抗体の測定の単位）、ならびに高力価、中力価、または低力価と分類され るGPLおよびMPLのレベルに関してこれらの研究室で得られる結果の間にかなりの 不一致が存在する。市販のキットは、市販の標準物質に割り当てられる値が大き く変化する(Reberら、(1995)Thrombosis and Haemostat．73:444-452)。これら の制限にもかかわらず、APS、PAPS、ならびに再発性の発作および再発性の胎児 死亡を含む他のPL抗体媒介疾患において、抗体によって認識されるエピトープは 、β2-GPIの第５ドメイン内に位置し、そしてβ2-GPIのカルジオリピンへの結合 の後に、抗体に曝されるという一般的な同意が存在する。 aPL抗体が、β2-糖タンパク質(β2-GPI)および負に荷電したリン脂質、例えば カルジオリピン(McNeilら、(1990)Proc．Natl．Acad．Sci．87:4120-4124;Galli ら、(1990)Lancet I:1544-1547)(本明細書中以下で「aPL免疫原」))からなる抗 原複合体を認識することは、今では一般的に受け入れられている。β2-GPIは、 遊離で見出され、そしてリポタンパク質脂質（ここでは、アポリポタンパク質Ｈ (apoＨ)としてもまた知られる）に関連して見出される微量の血漿糖タンパク質 である。これは、Sushiといわれる５つの独立した折り畳みドメイン、または他 のタンパク質における類似のドメインに類似する短いコンセンサス反復ドメイン からなる。β2-GPIは、リン脂質に結合すると、抗原性変化および立体配座変化 を起こすことが報告されている(Wagenknecktら、(1991)Thromb．Haemostas.69:3 61-365;Jonesら、(1992)Proc．5th Intl．Symp．Antiphospholipid Antibosies( 要約S5))。第５ドメインは、脂質結合およびaPL抗体結合の推定の部位を含む(Hu nt J.およびS.Krilis,(1994)J.Immunol．152:653-659;Lauerら、（1993）Immuno l.80:22-28)。aPLの病理学的メカニズムは未知である(McNeilら、前出)。ほとん どの説明は内皮細胞機能または血小板の関与を請う(Haselaarら、(1990)Thromb ．Haemostas.63:169-173)。これらの説明は、血管内皮細胞傷害または血小板活 性化の後、陰イオンリン脂質の血漿に曝されている表面への曝露または二重層貫 通移動が、β2-GPI結合を導き、そしてaPL抗体形成を誘因するということを示唆 する。 aPL抗体は、プロスタサイクリン形成を減少させることによって(Vermylen，J ．およびJ．Arnout(1992)J.Clin.Lab.Med.120:10-12)；凝固タンパク質の作用に よる直接的妨害によって；または内因性の血液凝固経路を阻害するβ2-GPIの能 力、 血小板のプロトロンビナーゼ活性、およびADP媒介血漿板凝集をブロックするこ とによって(Arvieuxら、(1993)Thromb．Haemostas．60:336-341)、直接的にプロ トロンビン性であり得る。 リード化合物を探求する医薬品化学における主要な新たな道具は、広範な分子 の多様性を提供するコンビナトリアルライブラリーの出現であった。分子の多様 性は、化学合成または生物学的系から生じ得る(Scott.,J.K．RATIONAL DRUG DES IGN(CRC Press，Weiner，D．B.およびW.V．Williams編、Boca，Raton，FL.，199 4);Moosら、(1993)Ann.Reports Med．Chem．28:315-324)。繊維状ファージの表 面にランダムペプチドを表示することによって、臨床的に重要な抗体によってプ ローブするための数億個のクローンを含むエピトープライブラリーが作製された (Scott，J.K.およびG.P.Smoth(1990)Science 249:286-390;Cesarenl,G.(1992)FE BS Lett．307:66-70)。このようなファージライブラリーは、ランダム化された オリゴヌクレオチド配列をファージのゲノムに取り込むことによって調製される 。このファージゲノムは通常pIII遺伝子であり、これは各ファージの表面の単一 のペプチド配列をコードする。アフィニティー精製および増幅の連続的なラウン ドの後、抗体に結合するこれらのファージはE.coli中で増殖され、そして結合ペ プチドは、ウイルスDNAの対応するコード領域の配列決定を行うことにより同定 される。ほとんどの場合、引き続く研究は、抗体に結合する能力を確立した後、 対応する合成ペプチドに関する。ファージベースのライブラリーは、不連続のエ ピトープを模倣するために用いられてきた(Luzzagoら、(1993)Gene 128:51-57;B aLassら、(1993)Proc.Natl.Acad.Sci．90:10638-10642)。ペプチドベースの薬物 の潜在的な血漿不安定性は、Ｎ末端ブロッキングにより、またはアミノ酸アナロ グの思慮深い使用によって首尾良く克服されてきた(Powell，M.F.(1993)Ann.Rep orts Med.Chem．28:285-293)。 現在のところ、aPL抗体の高力価を示す患者のための選択的、免疫特異的療法 はない。多くの場合、アスピリン、ステロイド、およびワルファリンのような薬 物の使用は、非常に不適切であることが証明されている(PH0SPH0LIPID-BINDINGA NTIBODIES(Harrisら編、CRC Press，Boca Raton，FL，1991);McNeilら、前出)。 (i)Ｔ細胞を活性化し得ない一方、(ii)免疫Ｂ細胞に結合する能力を保持するこ とによって特徴づけられる合成模倣ペプチドは、Ｂ細胞を抗原特異的な様式で寛 容化するために使用される。この技術は、共有に係る同時係属中の米国特許出願 番号第08/118,055号(1993年９月８日出願)および米国特許第5,268,454号に開示 され、これらは本明細書中で参考としてその全体が援用される。上記の特許出願 および特許中に開示されるように、Ｂ細胞寛容は、Ｂ細胞アネルギー、または表 面のイムノグロブリンに架橋した後でのクローンの欠失を介して抗体産生を抑止 するために、多価の、安定な、非免疫原性の原子価プラットホームに結合したこ のようなペプチドを投与することを必要とする。 aPL抗体によって認識される標的エピトープの正確な分子的性質は未知である が、エピトープライブラリー由来のペプチドの使用は、成功した寛容原の構築を 可能にする。ヒト全身性エリテマトーデス関連腎炎の処置のためのＢ細胞寛容原 はまた、共有に係る米国特許第5,276,013号および同第5,162,515号に開示され、 これらはその全体が本明細書中で参考として援用される。 発明の開示 本発明は、再発性発作および再発性胎児死亡のような、PAPS、APS、および他 のaPL抗体媒介疾患にかかっている患者においてaPL抗体によって認識される重要 なエピトープのアナログを、ランダムペプチドファージライブラリーを使用して 同定する方法の発見にある。 従って、本発明の１つの局面は、aPL抗体によって認識されるエピトープを最 もよく模倣するペプチド配列を同定するために、ランダムペプチドファージライ ブラリーをスクリーニングする改良された方法である。この方法は、以下の工程 を包含する：(a)当該分野で公知の方法から改変された方法を使用してライブラ リーを生物選抜（biopanning）する工程；(b)(i)プロテインＧに結合したaPL抗 体で被覆されたマイクロプレートウェル中でファージをインキュベートすること 、(ii)結合していないファージを取り除くためにマイクロプレートウェルを洗浄 すること、(iii)結合したファージを溶出すること、および(iv)溶出したファー ジでE．coliのような微生物を感染させ、そして寒天上に播種することによって 感染した微生物の数を計数することにより、工程(a)からスクリーニングされた フ ァージをマイクロ選抜（micropanning）することによって非常に弱く結合するフ ァージを除去する工程；(c)(i)aPL抗体でマイクロプレートのウェルを被覆する こと、(ii)被覆されたウェル中で工程(b)のマイクロ選抜によって同定された最 も強く結合するクローンをインキュベートし、そして結合していないファージを 洗い流すこと、(iii)比色ELISAアッセイにおいて酵素結合したヤギ抗ファージ抗 体を使用して抗体に結合したファージの数を定量することによる、ファージ捕獲 ELISAを介する評価によって、(b)で回収された最も強く結合するクローンを決定 する工程、および、いくつかの等しい強さで結合するクローンが同定される場合 は、(d)最も強く結合するファージ捕獲ELISAクローンでのファージELISA、の追 加の繰り返し。 これについては、本発明は、aPL抗体媒介疾患にかかっているヒトから単離さ れたaPL抗体を特異的に結合するエピトープのアナログを同定する方法を包含し 、この方法は以下の工程を包含する：(a)ファージランダムペプチドライブラリ ーを調製する工程；(b)aPL模倣エピトープを同定するためにaPL抗体でこのライ ブラリーをスクリーニングする工程であって、このスクリーニングが、(i)生物 選抜によってこのライブラリーをスクリーニングすること；(ii)(i)での生物選 抜により単離されたファージをマイクロ選抜によってさらにスクリーニングする こと；および(iii)(ii)で回収されたaPL抗体高親和性結合ペプチドを含むファー ジをイムノアッセイによって同定すること、を包含する工程。 本発明はまた、aPL抗体に結合するペプチドを同定および単離するためにファ ージランダムペプチドライブラリーを生物選抜する方法を包含し、この方法は以 下の工程を包含する：(a)アフィニティー精製したaPL抗体を、ランダムペプチド インサートを有するファージと反応させる工程；(b)aPL抗体に結合するランダム ペプチドインサートを有するファージを回収する工程；(c)(b)で回収されたファ ージで微生物を感染させる工程；および(d)ファージを単離するために抗生物質 含有培地中で感染微生物を培養する工程。 本発明はさらに、aPL抗体への高い結合親和性を有するペプチドを同定および 単離するためにファージランダムペプチドライブラリーをマイクロ選抜する方法 を包含し、この方法は以下の工程を包含する：(a)ランダムペプチドインサート を有するファージを生物選抜によって単離する工程；(b)プロテインＧに結合し たaPL抗体で被覆されたマイクロプレートウェル中で、工程(a)で回収されたファ ージをインキュベートする工程；(c)結合していないファージを除去するために マイクロプレートウェルを洗浄する工程；(d)結合したファージを溶出する工程 ；および(e)(d)で回収されたファージで微生物を感染させる工程；および(f)フ ァージを単離するために、抗生物質含有培地中で感染微生物を培養する工程。 本発明はまた、イムノアッセイがファージ捕獲ELISAである上記の方法を包含 し、この方法は以下の工程を包含する：(a)aPL抗体で被覆されたマイクロプレー トウェルでのマイクロ選抜によって単離されたランダムペプチドインサートを有 するファージをインキュベートする工程；(b)結合していないファージを洗い流 す工程；(c)ウェル中で酵素標識した抗ファージ抗体をインキュベートする工程 ；(d)結合していない酵素標識した抗ファージ抗体を洗い流す工程；(e)比色基質 を添加する工程；および(f)高親和性結合ファージを同定するために基質の吸光 度を測定する工程。 本発明はまた上記方法を包含し、そしてさらに高親和性結合ファージのさらな るファージ-捕獲ELISAアッセイを行う工程を包含し、この工程は以下の工程を包 含する：(a)マイクロプレートウェル上に均一量のファージを被覆する工程；(b) ウェル中でaPL抗体をインキュベートする工程；(c)結合していない抗体を洗い流 す工程；(e)酵素標識した抗aPL抗体を結合aPL抗体とインキュベートする工程；( f)結合していない酵素標識した抗aPL抗体を洗い流す工程；(g)比色基質をウェル に添加する工程；および(h)ファージの相対的結合親和性を測定するために基質 の吸光度を測定する工程。 本発明はまた、イムノアッセイがコロニーブロットイムノアッセイである上記 の方法を包含し、この方法は以下の工程を包含する：(a)寒天含有培養培地の上 のニトロセルロースメンブラン上で、ランダムペプチドインサートを有するファ ージで感染した微生物を培養する工程；(b)寒天含有培養培地の上の第２のニト ロセルロースメンブラン上で微生物をブロッティングすることによって、(a)で 培養された微生物を複製転写する工程；(c)転写した微生物をインキュベートす る工程；(d)微生物を溶解する工程；(e)リゾチームで微生物を消化する工程； (f)ゼラチン溶液でメンブランをブロックする工程；(g)メンブランをaPL抗体と インキュベートする工程；(h)結合していないaPL抗体を洗い流す工程；(i)酵素 標識した抗aPL抗体をニトロセルロースメンブランとインキュベートする工程；( j)結合していない酵素標識した抗aPL抗体を洗い流す工程；(k)比色基質を添加す る工程；および(l)高親和性結合ファージを同定するために基質の吸光度を測定 する工程。 aPL抗体媒介疾患にかかっているヒトから単離されたaPL抗体を特異的に結合す るエピトープを、親和性結合特徴について、アッセイおよびランク付けする方法 も包含し、この方法は以下の工程を包含する：(a)マイクロタイトレーションプ レートのウェルをカルジオリピンで被覆する工程；(b)カルジオリピンに結合し 、そしてプレートのウェルへの非特異的結合を防ぐために、β2-GPIの供給源と して成熟ウシまたはヒトの血清を添加する工程；(c)所定の時間、モノマーアナ ログおよび高力価のaPL抗体の溶液をインキュベートする工程；(d)aPL抗体／ア ナログ混合物をマイクロタイトレーションプレートのウェルに添加し、そして所 定の時間インキュベートする工程；(e)結合していないaPL抗体を洗い流すために ウエルを洗浄する工程；(f)標識（例えば、酵素）と結合した抗ヒトIgGをプレー トのウェルに添加し、そして所定の時間インキュベートする工程；(g)結合して いない抗ヒトIgG結合体を洗い流すためにウェルを洗浄する工程；(h)標識した結 合体に対する基質を添加し、そして所定の時間、基質／標識反応を展開させる工 程；(i)ウェルに結合したaPL抗体の量を定量するために、基質／標識反応の最終 産物を測定する工程；(j)もしあるならば、aPL抗体へのアナログの親和性を決定 するために、aPL抗体の結合の阻害の割合を算出する工程。 本発明の別の局面は、aPL抗体に結合するペプチドについての解離定数を決定 する蛍光偏光ペプチド結合アッセイを包含する。本アッセイは、aPL抗体へのペ プチドの直接の結合を検出する。 本発明はまた、aPL抗体媒介疾患にかかっている疑いのある被験体から得られ た体液中のaPL抗体の存在を決定するための診断イムノアッセイを包含し、これ は以下の工程を包含する：aPL抗体を特異的に結合するエピトープのアナログと 体液のサンプルを接触させる工程、およびaPL抗体が体液中に存在するかどうか を当該分野で周知の方法によって決定する工程、および、もし存在するならば、 体液中に存在するaPL抗体の量を定量する工程。１つのこのようなイムノアッセ イは以下の工程を包含する：(a)aPL抗体を特異的に結合するエピトープのアナロ グでマイクロタイトレーションプレートのウェルを被覆する工程；(b)結合して いないアナログを洗い流すためにウェルを洗浄する工程；(c)体液の試験サンプ ルをウェルに添加し、そして所定の時間インキュベートする工程；(d)結合して いない試験サンプルを除去するためにウェルを洗浄する工程；(e)標識が結合し た抗ヒトIgGをプレートのウェルに添加して、そして所定の時間インキュベート する工程；(f)結合していない抗ヒトIgG結合体を洗い流すためにウェルを洗浄す る工程；(g)標識した結合体に対する基質を添加し、そして所定の時間、基質／ 標識反応を展開させる工程；(h)試験サンプル中の抗aPL抗体の存在を決定するた めに、基質／標識反応の最終産物を測定する工程。イムノアッセイが定量的であ る上記の診断イムノアッセイもまた包含される。 ファージELISAアッセイは、以下の工程からなる：(i)マイクロタイトレーショ ンプレートのウェル上に種々のクローンの均一量を被覆する工程、次いで(ii)抗 体をウェルに添加することによって最も強くaPL抗体を結合するペプチドインサ ートを同定し、そして酵素標識した抗ヒトIgG結合体との反応を展開させる工程 。ファージELISA、コロニーブロット、またはファージ捕獲ELISAによって測定さ れるようなaPL抗体への高い結合親和性を有するファージによって示されるラン ダムペプチドは、aPL特異的エピトープのアナログを示す。次いで、これらのペ プチドを合成し、そして競合アッセイを使用して結合の強さをランク付けする。 本発明の他の局面は、aPLエピトープが結合するＢ細胞に特異的に結合するaPL 抗体結合性アナログである。最適化されたアナログは、１つまたは複数のＴ細胞 エピトープを欠失する。 本発明のさらに他の局面は、aPL免疫原に対して特定のＢ細胞寛容を誘導する ための組成物であり、これは、非免疫原性原子価プラットホーム分子と、(a)aPL 免疫原が結合するＢ細胞に特異的に結合し、そして(b)１つまたは複数のＴ細胞 エピトープを欠失するaPL抗体結合アナログ、との結合体を含む。図面の簡単な説明 図１は、成熟ウシ血清の代わりに魚ゼラチンの使用が、市販のaPL抗体標準品 のELISA分析において全ての抗カルジオピリン(ACA)活性を完全に消失させたこと を示す。この結果は、ACAの標的エピトープを決定する際のβ2-糖タンパク質Ｉ （β2-GPI）の重要性に関するMcNeilら（前出）およびGalliら（前出）の発見を 支持した。 図２は、樹脂に結合したアナログ5A12が、免疫特異的に、ACA-6501と特定され るアフィニティー精製されたIgGと結合することを示す。 図３は、ACA-6626を用いてスクリーニングして得られたaPL抗体結合アナログ が、aPL抗血清には結合するが、標準血清に結合しなかったことを示す。 図４はまた、ACA6501/5A12アナログが、免疫特異的にACA-6501抗血清に結合し 、ACA-6626と交叉反応することを示す。 図４および５は、本発明における方法でスクリーニングされて得られたACA650 1/5A12およびACA6626/4D3のaPL抗体結合アナログが、スクリーニング抗体に優先 的に結合する一方、かなりの程度の交叉反応が検出されたことを示す。 図6は、ACA-6501 aPL抗体に対するGPL値の計算方法を示す。 図7は、アフィニティー単離されたACA-6501とGPL標準血清との活性の比較を示 す。 図８は、4回の生物選抜により単離されたクローンの配列の多様性が、急激に 減少していることを示す。 図９は、試験された全てのクローンが通常のIgGに対して反応を示さなかった にもかかわらず、ACA-6635を用いたファージ捕獲ELISAで、３つのクローン(3A12 、3B3、3A5)が非常に強い免疫特異的なシグナルを呈したことを示す。 図10は、ACA-6501を用いたファージELISAにおいて、７つのクローンが強いシ グナルを呈したことを示す。 図11は、ペプチド5A12、CB2、および3B10で得られた、ACA-6501を用いた競合 結合ELISAの結果を示す。50％阻害するために、0.08μｇのCB2および0.5μgの3B 10が必要であったにもかかわらず、0.16μｇのペプチド5Al2は、ACA6501 aPL抗 体の、ポリスチレンマイクロプレートウェルに結合した４価のペプチドACA6501/ 3B 10への結合を50％阻害した。 図12は、修飾ACA6641/3G3アナログの活性の比較を示す。 図13は、ACA-6501 aPL抗体を用いた競合結合ELISAにおけるペプチド139、142 および143の50％阻害値は、それぞれ6.9、0.7および0.9μｇであったことを示す 。 図14は、ペプチド3B10の位置3、9、および3と9との両方におけるα-Me-Proの 置換効果を示す。位置9でのα-Me-Proの置換効果は「ネイティブな」ペプチドと 比較し、ペプチド活性が４倍増加した。 図15は、ペプチド6641/3G3(LJP688)が、9つのアフィニティー精製されたACA抗 体と高い交叉反応があることを示す。 図16および17は、それぞれ、100μＭ、20μＭ、および4μＭのLJP685-MTU-DAB A-PEG結合体(化合物36)およびLJP685-ATU-MTU-AHAB-TEG結合体(化合物35)を用い て、LJP685-KLHで免疫したマウスの脾臓細胞を各2時間インキュベートした後、L JP685-KLHで免疫したマウスの脾臓細胞を用いる108Mでの抗685抗体ABCの用量依 存的減少を示す。 図18は、ペプチド925に関して解明された９つの構造のうち、最も重心に近いN MR構造を示しており、ペプチド925分子の形態の合理的説明である。 図19は、ペプチド925(図の下部に3G3と標識)の構造とペプチド5A12の構造とを 比較する。両ペプチドとも、ペプチド配列中のほぼ同じ位置にターンを持つ。 図20Aおよび20Bは、aPLアナログの薬剤伝達物が1つの小さな疎水基および正に 荷電した基として試験的に同定されたことを示す。図20Aに示すように、ペプチ ド925のgem-ジメチル基およびアミノ基は、このペプチドの薬剤伝達物と試験的 に同定される。薬剤伝達基を特定の骨格につなぐ炭化水素リンカーの長さを、こ れらのリンカーが骨格に結合する位置を隔てる距離と同様に図20Aで特定する。 図21は、希釈6501血清を用いた6501由来ペプチドによるβ2GPIの阻害を示す。 図22は、CB2*-F;FITCGPCILLARDRCGのACA-6701滴定を示す。 図23は、CB2*-F:FITCGPCILLARDRCGのACA-6501滴定を示す。 図24は、CB2*-F:FITCGPCILLARDRCGの完全なACA-6501滴定を示す。 図25は、CB2*の1.04当量を使用したACA-6701からのCB2*-Fの置換を示す。 図26は、CB2*を用いてACA6701からのCB2*-Fを置換するcFP滴定を示す。 図27は、3B10を用いてACA6701からのCB2*-Fを置換するcFP滴定を示す。 図28は、寛容活性についての(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG結合体の用量応答を示す 。 図29は、寛容活性についての(LJP685)4/MTU-DABA-TEG結合体の用量応答を示す 。 図30は、インビトロモデルにおいて試験した(LJP685)4/MTU-DABA-TEG結合体の 寛容活性の用量応答を示す。 図31は、インビトロモデルにおいて試験した(LJP685)4/MTU-DABA-TEG結合体の 寛容活性の用量応答を示す。 図32は、種々の投与経路および投薬量範囲を比較しながらの(LJP685)4/MTU-AH AB-TEG結合体の寛容効果を示す。 本発明を実施する態様 Ａ．定義 本明細書中で用いる用語“aPL抗体”は、疾患を媒介するβ2-GPIに特異的に結 合するあらゆる抗体を意味する。 本明細書中で用いる用語“Ｂ細胞アネルギー”は、抗体を産生および分泌する のにＴ細胞の助けを必要とするＢ細胞の非応答性を意図しており、そして、制限 されることなく、未成熟および/または成熟Ｂ細胞のクローンの欠損および/また はＢ細胞の抗体産生の不能を含む。 “非応答性”は、免疫原に対する体液性応答の治療学上の効果的な減少を意味 する。量的には、この減少（抗体産生の減少により測定される）は少なくとも50 ％、好ましくは少なくとも75％、および、最も好ましくは100％である。 “抗体”は、Ｔ細胞に依存する抗体を意味する。 本明細書中で用いる用語“免疫原”は、aPL抗体を含む体液性免疫応答を誘発 する物質を意味する。免疫原はＢ細胞エピトープとＴ細胞エピトープとの両者を 持つ。aPL抗体が媒在する病理に関係するaPL免疫原は、外部の（個体にとって外 来の）免疫原（例えば、それには、治療用のタンパク質、ペプチドおよび抗体な どの個体にとって外来のネイティブな生体物質を含む薬物）、または、抗体が媒 介する凝固能冗進（発作）に関連したものなどの自己免疫原であり得る。 免疫原の“アナログ”という用語は、(ａ)免疫原が特異的に結合する抗体に特 異的に結合する分子、および（ｂ）Ｔ細胞エピトープが欠損する分子、を意味す る。アナログは、通常、免疫原の断片または誘導体であり、従って、免疫原と同 じ化学的クラスにある（例えば、免疫原がポリペプチドであり、アナログもポリ ペプチドである）が、化学的類似性は不可欠ではない。従って、アナログは、そ れが上記の（ａ）および（ｂ）の機能的特徴を有する限りは、免疫原と異なる化 学的クラスであり得る（例えば、免疫原が炭水化物であり、アナログはポリペプ チドである）。アナログは、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ多糖、核酸または 他の生化学物質であり得る。さらに免疫原またはアナログのどちらの化学的構造 は、本発明のために定義される必要は無い。 免疫原の“アナログ”という用語はまた、“ミモトープ”という用語を含む。 “ミモトープ”という用語は、抗体が免疫原に結合するのを競合的に阻害する分 子を意味する。抗体に特異的に結合するために、ミモトープは免疫原の抗原決定 基に似ていると考えられている。 本明細書中で用いる“原子価プラットホーム分子（valency platform molecul e）”は、控えめな数の免疫原アナログの結合を促進する部位を含む非免疫性分 子を意味する。 本明細書中で用いる“非免疫性”とは、原子価プラットホーム分子を述べると きに用いられ、原子価プラットホーム分子が、それが単独で個体に投与されたと きに、実質的に免疫応答を誘発しないことを意味する。 本明細書中で用いる“個体”は、ほ乳動物種の一員を示し、そしてヒト、霊長 類、マウス、およびウシや羊のような家畜、馬のような競技動物、ならびに犬お よび猫のようなペットを含む。 本明細書中で用いる“薬剤伝達物（pharmacophore）”は、aPLアナログの抗体 標的への結合に関与する中心的な基の、三次元の配向と化学的性質を意味する。 Ｂ． aPL の抗体結合アナログの同定 aPL抗体結合アナログは、候補分子をスクリーニングすることにより、それら が（ａ）aPL抗体に特異的に結合するか、および（ｂ）Ｔ細胞エピトープが欠損 しているかどうかを、決定することにより同定され得る。aPL抗体への特異的な 結合は、以下の実施例に記すELISAアッセイのような日常的イムノアッセイを用 いて決定され得る。さらにＴ細胞エピトープが存在するか、欠損しているかを、 同様に、実施例に記した日常的Ｔ細胞活性化アッセイで決定し得る。この点から 、血清抗体に“特異的に結合”するアナログは、免疫原に対して、例えば107Ｍ- 1 の適度な親和性を示す。Ｔ細胞エピトープが存在するか、欠損しているかを、 米国特許出願第08/118,055号に開示されているトリチウム化チミジン取り込みア ッセイを用いて決定し得る。Ｔ細胞エピトープの存在はまた、Ｔ細胞由来のリン ホカインの分泌を当該分野で周知の方法で測定することによって決定され得る。 バックグラウンドよりも統計学的に有意のチミジン取り込みを誘発しないアナロ グは、Ｔ細胞エピトープが欠損していると考えられる。チミジンの取り込み量は 免疫原と共に変化し得ると理解されている。典型的には約2〜3、より一般的には 約1〜2より低い刺激指数が、Ｔ細胞エピトープが欠損していることを示す。 Ｃ． 結合体の調製 aPL抗体結合アナログを非免疫性の原子価プラットホーム分子と結合させるこ とにより、本発明の結合体を調製する。好ましい原子価プラットホーム分子は、 生物学的に安定しており、すなわち治療効率を上げるために、生体内で、数時間 〜数日〜数ヶ月の排出半減期を有し、そして、規定された組成の合成一本鎖で形 成されることが好ましい。それらは典型的には、約200〜約200,000の範囲の分子 量を持っており、通常は約200〜約20,000である。本発明における原子価プラッ トホーム分子の例としては、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ-D-リジン、ポ リビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンのようなポリマーが挙げられる 。好ましいポリマーは、ポリエチレングリコール(PEG)に基づき、約200から約8, 000の分子量を有する。 本発明での使用に適した他の原子価プラットホーム分子は、化学的に規定され た非ポリマー性重合体の原子価プラットホーム分子であり、これは、共同に係る 、同時係属中の米国特許出願第08/152,506号(1993年11月15日出願）に開示され 、その全体が本明細書中で参考として援用される。本発明での使用に適した、特 に好ましい均一の化学的に規定された原子価プラットホーム分子は、2,2'-エチ レ ンジオキシジエチルアミン(EDDA)およびトリエチレングリコール(TEG)の誘導体 である。 さらなる適した原子価プラットホーム分子には、テトラアミノベンゼン、ペプ タアミノβシクロデキストリン、テトラアミノペンタエリトリトール、1,4,8,11 -テトラアザシクロテトラデカン(Cyclam)、および1,4,7,10-テトラアザシクロド デカン(Cyclen)が含まれる。 aPL抗体結合アナログの原子価プラットホーム分子への結合は、種々の要因に よって影響され得るが、典型的には1つまたはそれ以上の架橋剤およびアナログ と原子価プラットホーム分子上の官能基とが関与する。 ポリペプチドアナログは、アナログをキャリアーと結合させるための部位とし て作用するアミノ基、カルボキシル基、またはスルフヒドリル基のような官能基 を含むアミノ酸側鎖部分を含む。アナログがこれらの官能基を持っていない場合 このような官能基を持った残基をアナログに加え得る。このような残基は、ペプ チド合成分野で両方とも周知の、固相合成法または組み換え法によって導入され 得る。炭水化物または脂質のアナログの場合、官能アミノ基およびスルフヒドリ ル基は、従来の合成により導入され得る。例えば、一級アミノ基はシアノ水素化 ホウ素ナトリウム存在下でエチレンジアミンを用いる反応により取り込まれ、そ して、スルフヒドリル基は、システアミン二塩酸塩での反応の後、標準的なジス ルフィド還元剤で還元することにより導入され得る。原子価プラットホーム分子 もまた、適切な官能基を既に持っていない場合には、類似した方法で官能基を持 つように誘導体化され得る。 様々な長さの親水性のリンカーは、ペプチドまたは他の生物活性分子を原子価 プラットホーム分子に結合するのに有用である。適切なリンカーとしては、エチ レングリコールの線状オリゴマーまたはポリマーが含まれる。このようなリンカ ーは、R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2という形のリンカーを含む。ここで、n =0〜200、m=1または2、R1=Hまたはトリチルのような保護基、R2=Hまたはアルキ ルまたはアリールであり、例えば4-ニトロフェニルエステルである。これらのリ ンカーは、ハロアセチル,マレイアミド等のようなチオール反応性基を含む分子 を、チオエーテルを介して、アミド結合を介したアミノ基を含む第二の分子に結 合さ せるのに有用である。これらのリンカーは結合順序に関しては柔軟性があり、即 ち、チオエーテルは最初または最後に形成され得る。 結合体は、通常、注射による投与のための調製される（たとえば、腹腔内、静 脈内、筋肉内、皮下）。従って、それらは、典型的には、生理食塩水、リンゲル 溶液、デキストロース溶液などのような、薬学的に受容可能なビヒクルと一緒に される。結合体は、通常、処方物の約0.01重量％から10重量％を構成する。結合 体は、個体に対して“治療有効量”、すなわち、関与する免疫原に対するＢ細胞 アネルギーを産生し、そして問題となっている抗体が媒介した状態の予防、改善 または排除を達成するのに十分な量が投与される。特定の投薬措置、即ち、用量 、タイミング、反復回数は、特定の個体とその個体の病歴とに依存する。通常、 投与量は、約1μｇから約100mg結合体/kg体重、好ましくは約100μｇから約10mg /kg体重を一週間に与える。他の適切な投与計画は、毎日、週三回、または週一 回、または二週間から四週間に一回、または一月に一回、または個体や疾患に応 じた、より低頻度のスケジュールである。通常、Ｂ細胞の代謝回転率によって時 機が決められる反復投与が、体液性アネルギー状態を達成および/または維持す るのに必要とされ得る。このような反復投与は、典型的には、抗体価の増加が検 知された場合、約1μｇから約10mg/kg体重またはそれ以上を、30から60日毎、ま たはより短い間隔での処置を必要とする。あるいは、いくつかの病理では、結合 体の連続的徐放性の処方が示唆され得る。当該分野では、徐放性を達成するため の様々な処方およびデバイスが知られている。 抗ヘルパーＴ細胞処置は結合体と共に投与され得る。このような処置は、通常 ステロイドまたはシクロスポリンのようなＴ細胞を抑制する薬剤を使用する。 Ｄ． aPL 抗体の抗原の性質 本発明者によるaPL抗体についての初期の研究は、これらの抗体により認識さ れる抗原部位の性質について追求した報告の発行と一致していた。当初は、これ らの抗体は、VDRL試験で検知された抗体と同様にカルジオリピン分子を認識する と考えられた。図１に示すように、抗カルジオリピン抗体(ACA)固相ELISAにおい て、成熟ウシ血清を魚ゼラチンに置換した場合、ACA標準として商業的に入手し た抗体調製物の全てのACA活性を消失させた。この知見は、McNeilら（前出）お よびGalliら（前出）によって提案されたように、ACA抗体がカルジオリピンその ものより、むしろ、血清の決定基を認識することを示した。このタンパク質は、 これらの著者によってβ2-GPIであることが示された。従って、“ACA”または“ 抗カルジオリピン抗体”という用語は、本来は誤称であるが、今日これらの抗体 について言及する際はまだ使用されている。 自己免疫性のIgG aPL抗体の多くは、β2-GPI分子上の決定基を認識する。これ らのエピトープは、カルジオリピンへの結合の際にのみβ2-GPI上で形成または 露出され得る(ネオエピトープ)。あるいは、β2-GPI上のエピトープは、β2-GPI 分子あたり1コピー存在し得、aPL抗体に対して低い親和性を持たない可能性があ る。カルジオリピンへの結合によって隣接するβ2-GPI分子上のこれらの部位が2 つ並ぶことによってのみ、抗体-抗原相互作用を維持するのに十分な親和力が生 じ得る。 ネイティブなβ2-GPIのエピトープを模倣する本発明におけるaPLアナログの核 磁気共鳴(NMR)解析から、β2-GPIエピトープの構造に関する更なる情報が得られ た。例えば、aPL抗体と高度に交叉反応的である２つのペプチドaPLアナログのNM R溶液構造の比較から、どちらのペプチドもペプチド配列のほぼ同じ位置にター ンを持つことが分かった(図18および19を参照のこと)。 Ｅ． ACA ELISA 臨床サンプルのGPL評価ならびに研究抗体およびβ2-GPIのクロマトグラフィー による精製に関連して、大規模での試験の必要性は、aPL抗体のELISAアッセイの 開発に繋がり、その機能は市販のキットと非常に一致し、そして、最も良い再現 性を有すると分かっている設計に類似する（Redder、前出）。改変ACA ELISAも また、実施されている。これは、特定のマイクロプレートウエルに直接結合した β2-GPIを使用して、aPL IgGを、予めマイクロプレートに添加されるカルジオリ ピンの非存在下で直接結合させる（Roubeyら(1996)Arthritis & Rheumatism 39: 1606-1607;R.A.S．Roubey（1996）ArthritiS & Rheumatism 39:1444-1454）を参 照のこと。 Ｆ． aPL 抗体の免疫アフィニティーによる精製 aPL抗体を単離するために、多重膜の、カルジオリピン含有分散物（リポソー ム：コレステロールおよびジセチルホスフェートも含む）をaPL血漿（または血 清）と共にインキュベートする。これらのリポソームは遠心分離によって血清か らペレット化される。洗浄後、リポソーム混合物を２％オクチルグルコシド界面 活性剤により破砕し、プロテインA-アガロースカラムに供した。十分な洗浄の後 、まず脂質を除去し、次に非IgG成分を除き、IgG aPL抗体を穏やかな酸でプロテ インAから溶出し、中和し、緩衝液交換を行い、ACA ELISAアッセイを行った。こ の手法により、aPL抗体は10,000倍に濃縮され、ウサギIgG抗ヒトβ2-GPI抗血清 を用いたウエスタンブロッティングによって示されるように、β2-GPIは全く混 入しない。さらなるアフィニティー精製工程は、固相β2-GPI上のアフィニティ ー精製抗体のクロマトグラフィーにより実施される。この第二のアフィニティー 精製工程は、β2-GPIへ直接結合するaPL抗体のより強い臨床的な関連に関する新 しい知見の結果、推奨される。これはまた、さらに、夾雑物（特に、β2-GPI） のない最終調製物を確実にするために供される。 Ｇ． 繊維状ファージランダムペプチドライブラリーの構築 p-IIIタンパク質の11の異なるfUSE5繊維状ファージランダムペプチドライブラ リー（ファージあたり5コピーのペプチドのp-III）を構築する。これらのライブ ラリーは、模倣エピトープを発見するための広大な配列の形態と構造を提供する 。「ｘ」ライブラリーと命名された4つのライブラリーは、それぞれ、8,10,12お よび15残基の長さのペプチドインサートを有し、アミノおよびカルボキシルの両 末端のプロリン残基が隣接している。これらのプロリン残基の目的は、ネイティ ブなp-IIIタンパク質から生じ得る二次構造への寄与を無くすこと、およびイン サートを溶媒に露出することである。「ｙ'」ライブラリーは、長さが6,7,8,9,1 1および13アミノ酸であるシステイン結合のインサートを含む。「ｙ」ライブラ リーは、「ｙ'」ライブラリーの6および8アミノ酸のインサートが無いことを除 けば、「ｙ'」ライブラリーと同じである。「ｙ」および「ｙ'」の両ライブラリ ーのこ れらのペプチドインサートは、環状で、より強固な構造を形成するためにアミノ およびカルボキシルの両末端にシステイン残基が隣接する。プロリン残基は、先 に述べた「ｘ」ライブラリーの場合と同様の理由により、これらのシステイン残 基の外側に組み込まれる。「ｘ」、「ｙ'」および「ｙ」ライブラリーは、ネイ ティブなp-IIIタンパク質のアミノ末端から5残基の所に位置している。「ｚ」ラ イブラリーは、p-IIIタンパク質のアミノ末端に位置するランダムな8アミノ酸の インサートからなっており、隣接するプロリンまたはシステイン残基を含まない 。「ｘ」、「ｙ'」および「ｚ」ライブラリーの組み合わせは、約1億の異なった ペプチドインサートを、それぞれが有する11の異なったライブラリーを表す。 これらのライブラリーは、所望の長さのインサートを与えるのに適した長さの ランダムなオリゴヌクレオチド配列を、標準的な分子生物学の技術を用いてfUSE 5のp-III遺伝子に取り込むことにより構築される。fUSE5 DNAの制限エンドヌク レアーゼ処理に続き、ギャップ二重鎖として提供されるキナーゼ処理した過剰の オリゴヌクレオチドを加え、連結する。その後、DNAを電気穿孔法を用いてE．co liに導入し、テトラサイクリン含有培地で培養することにより選択する。この培 地からのファージ（ペプチドインサートを含む）を上清より単離し、洗浄後、緩 衝液中に再懸濁する。代表的なライブラリーは、7×108の独立なクローンを8×1 012形質転換単位/mlで有することが示された。 Ｈ． ファージスクリーニングの方法論 ファージ提示ペプチドライブラリーのスクリーニングの本質は、何十億かの潜 在的な候補ファージを、目立った性質を有する比較的少数にする能力にある。元 のスクリーニングプロトコルは、Scott,J.KおよびG.P.Smith,(1990)Science 249 :315-324により推奨されるが、様々なaPL抗体の最良エピトープの選択を促進す るように、かなり改変されている。これらの手法は、最良の配列を提示する有用 な数のクローンが徹底的に調査される得る時点に達するまで、スクリーニングが 進行されるように、より大きなストリンジェシーの選択を行うように設計される 。いくつかの抗体に対しては、ライブラリーは非常に強く結合するアミノ酸配列 を持たないように思われ、そして高い程度のストリンジェンシーを有する方法を ス クリーニングに用いると、特異的なクローンがなくなってしまう。これに対して 、ライブラリーは、抗原の良好なアナログを示す多くのクローンをしばしば生じ 、そして高い程度のストリンジェンシーを有する方法の使用は最良のエピトープ を同定するのに必要となる。このことから、エピトープライブラリーのスクリー ニングから最良のエピトープを同定するために、種々の程度のストリンジェンシ ーを有するアッセイが開発された。ここに、それらのアッセイをストリンジェン シーの増大する順に示す:生物選抜＜マイクロ選抜＜ファージ捕獲ELISA＜ファー ジELISA＝コロニーブロット＝ペプチドELISA。 (i)生物選抜（Biopanning） ”生物選抜”は、アフィニティー精製されたaPL抗体および任意のペプチドイ ンサートを保持するファージを混合し、その後、抗体特異的な回収により結合フ ァージを捕獲する技術である。ファージはE.coliにテトラサイクリン耐性を与え るので、E.coliをテトラサイクリンを含む培地で培養し、そして単離する。生物 選抜を何度も行うことにより、サンプル中の免疫特異的なファージの数を増加さ せる。ファージは、3回目から5回目の選別の最後に常に回収されるが、それらは 選別している抗体に対して低い親和性で非特異的に結合した配列のみを表し得る 。これらのファージについてさらに評価する方法(マイクロ選抜)が必要である。 (ii)マイクロ選抜（Micropanning） ファージのaPL抗体に対する結合の相対的な強さを見積もることは、“マイク ロ選抜”によって決定することができる。マイクロ選抜は、3回以上の生物選抜 の後に実施され、そして生物選抜法で用いたのと同じ抗体を用いる。方法は、生 物選抜の最後の回で得られたファージの希釈、およびマイクロ選抜による50以上 のこれらのクローンの分析から成る。マイクロ選抜は、それぞれのクローンを同 じくらいの密度まで増幅させた後、前もって一定量の抗体で被覆したマイクロタ イトレーションのウェル内で最適単一濃度で希釈したファージをインキュベート することによって達成される。ファージの最適単一濃度は、最も広い範囲のマイ クロ選抜のスコア(0から4+)を最も示しそうな濃度により、試験中のクローンに ついて最大限の識別が行えるようにする濃度である。それは、一連の希釈によっ て得られた数種のファージ濃度のそれぞれにおいて、スコアが決定される場合、 任意に選ばれた6個のクローンのマイクロ選抜の挙動に基づく。抗体とインキュ ベートした後、非結合ファージを洗い流し、結合したファージ量が、ファージの インサートの抗体に対する親和性の指標となる。結合したファージの量を、穏や かな酸で溶出した後に中和し、E.coliに感染させて決定する。感染したE.coliの 数は、テトラサイクリンを含む寒天培地に微生物を塗り、各クローンについて達 成されたコロニーの密度を決定することにより定量化される。 （iii）ファージ捕獲（Phage-Capture）ELISA ファージ捕獲ELISA試験は、相対的に低いストリンジェンシーを持つマイクロ 選抜アッセイと高いストリンジェンシーを持つファージELISAあるいはペプチドE LISAアッセイとの間をつなぐ中間レベルのアッセイとして開発された。予備実験 では、いくつかの抗体の調製に際しては、マイクロ選抜を用いると陽性クローン が多すぎるが、ファージELISAあるいはペプチドELISAを用いると全くそれが得ら れないことが示される。ファージELISAの限界を以下に示すが、5コピーのp-III のみが各ファージに存在し、そして多数のファージを用いてウェルを被覆したと しても、インサートの産物はわずかしかなく、そして検出のためにインサートに 対して非常に高い親和性を有する抗体が必要となる。ファージ捕獲ELISAを用い れば、シグナルが何度も増幅されるので、抗体およびインサートの間のより低い 親和性の安定した相互作用の検出を容易にする。 ファージ捕獲ELISAは、次の工程から成る。マイクロタイトレーションウェル をaPL抗体で被覆し、そしてマイクロ選抜アッセイと同ようにファージクローン を加える。結合していないファージを洗い流し、結合ファージの量をファージの 主要被膜タンパク質に結合する酵素結合ヤギ抗血清を用いて定量する。ファージ 捕獲ELISAによってスクリーニングされたファージは、多くのaPL抗体と反応し、 その後のELISAアッセイにおいて強いシグナルを示す。マイクロ選抜陽性ファー ジは、ファージ捕獲ELISAにおいてほとんど陽性ではないので、この中間的な感 度のレベルはペプチド合成の試みをより大きく効率的にする。結果として、ファ ージ捕獲ELISAによって得られた陽性ファージから合成されたペプチドは、一般 的に免疫反応性を示す。 (iv)ファージELISA このファージ選択法は、インサートとスクリーニング抗体との非常に強い結合 を必要とする。マイクロタイトレーションプレートのウェルを直接ファージで被 覆し、スクリーニング抗体を加えてインキュベートする。洗浄して非結合抗体を 除いた後、抗ヒトIgGアルカリホスファターゼ結合体を加えると、これがファー ジに結合したaPL抗体と結合する。次いで、aPL抗体は、当該分野で周知の方法に 従ってアルカリホスファターゼと反応する発色基質をウェルに加えることにより 、検出される。 (v)コロニーブロット このアッセイは、生物選抜で選別されたファージに感染させたE．coliの大規 模でのコロニースクリーニングを可能にする。この手順は、免疫反応性クローン の同定として、ファージELISAに代わるものであり、同等の感度を示し、試験に 先だって各々のファージクローンを培養する必要もない。このアッセイでは、１ 回の生物選抜により得られたファージを感染させたE.coliを、大きな直径のニト ロセルロース(NC)メンブランに塗り広げ、テトラサイクリンを含む寒天培地上で 一晩培養する(Barbasら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7978-7982)。それぞ れのコロニーは、同一の配列を持ったファージによる感染から生じる。このNC「 マスター」を用いてNC上にブロットを移していくつかのの複製を作り、そして寒 天培地上で培養を行い得る。化学的および酵素的にブロット上のファージ感染コ ロニーを破壊に続いて、一般に用いられているウエスタンブロッティングの技術 （すなわち、染色およびイムノブロッティング）により、ファージはプローブさ れ得る。ブロックされたブロットをスクリーニングaPL抗体とともにインキュベ ートすることもできる。非結合抗体を洗い流した後、抗ヒトIgG西洋ワサビペル オキシダーゼ結合体を加えて、ファージと結合したaPL抗体に結合させる。発色 基質を加えることによって、以後の研究でクローニングされ得る免疫特異的な ファージを提示するマスタープレート上の別々のコロニーの位置を特定し得る。 (vi)ペプチドELISA これまでに述べたアッセイで最もよく反応するファージのペプチドインサート の配列を決定するDNA配列決定後に、対応するペプチドを当該分野で周知の標準 的なFmocペプチド化学を用いて作製する。ペプチドELISAアッセイに対しては、 例えば、ペプチドは分枝した４価分子として作製され得る、すなわち各分子は４ コピーのインサートを有する。そのような分子でマイクロタイトレーションプレ ートのウェルを被覆し、そしてエピトープを溶液に曝し、抗体を結合させる。４ 価ペプチドは、最初の２つのカップリングで分岐点としてリジンの取り込みによ って合成され、この方法は、多元抗原ペプチド(MAPS)に対して使われた方法(Pos nettら(1988)J.Biol.Chem.263：1719-1725)と類似する。グリシン-セリン-グリ シン-セリンから成るスペーサーをリジンの後の各アームに付加し、さらにファ ージ内に見出される骨格アミノ酸、カルボキシル末端のプロリン-グリシン、お よびアミノ末端のアラニン-グリシン-プロリンを含むインサートを付加する。こ の合成に用いる全てのアミノ酸を、標準的なFmoc法を用いて一度に加える。 これらのペプチドは、次いでマイクロタイトレーションウェルをペプチドで被 覆し、そして標準的なELISAの形式でaPL抗体との反応性をアッセイすることによ り実施されるELISAでアッセイされる。実施において、ペプチドは、通常、元の スクリーニング抗体と非常に強く結合し、そして他のaPL抗体ともいくらかの交 叉反応性を示す。非特異的に結合しているペプチドを排除するために、非aPL抗 体のコントロールを含める。 (vii)競合結合ペプチドELISA 一旦ELISA陽性のペプチドを同定したら、それらのaPL抗体に対する相対的結合 親和性を定量し、そして2つのペプチドが、与えられた患者の血清中で同じ数の 抗体に結合するかどうかをペプチド競合ELISAアッセイにより決めることが必要 である。このアッセイでは、種々のモノマーペプチドがマイクロタイトレーショ ンプレートウェルを被覆している4価ペプチドと競合する。アッセイを行うため に、評価の対象となるペプチドは、標準的Fmoc化学合成により、モノマーとして すなわち4価ペプチド合成において使われるリジンによる分枝のないように合成 する。モノマーペプチドを精製して既知濃度で溶解する。マイクロタイトレーシ ョンプレートウェルを、aPL抗体と結合することがわかっている4価ペプチドで被 覆する。モノマーペプチドの希釈系列を、一定希釈のaPL抗体を加えてインキュ ベートする。aPL抗体の希釈は、4価ペプチドに対する抗体力価測定を行い、力価 曲線の勾配が負になる希釈を選択することにより前もって決定される。抗体とモ ノマーペプチドとを1時間インキュベートした後、抗体/ペプチド溶液をマイクロ タイトレーションウェルに加え、標準的な比色ELISAを行う。aPL抗体と4価ペプ チドとの結合を低下させる各々のモノマーペプチドの濃度は、各ウェルの比色計 での読み取り値をプロットすることで求められる。50％阻害点がモノマーペプチ ドに対する結合の相対的強さの尺度として使われる。 このアッセイの変形は、ヒトβ2-糖タンパク質Ｉ／カルジオリピン(β2-GPI/C L)を4価ペプチドの代わりに被覆したマイクロタイトレーションプレートを用い て、β2-GPI/CL上のエピトープに対するaPL抗体の結合に対するモノマーペプチ ドの阻害能を試験する。このアッセイでは、濃度を最適化したIgG涸渇ヒト血清 をβ2-GPI源として用いる。プレート基質として4価ペプチドを用いるアッセイと 同様の様式で、最適濃度のaPL抗体と一緒に数種の濃度のモノマーペプチドをイ ンキュベートする。(β2-GPI/CL)プレートでのaPL/ペプチドのインキュベーショ ンの後、抗体の結合の50％阻害に必要なペプチド濃度を、4価ペプチドを用いた アッセイでの値の1/2の最大値の吸光度で決定する。 このアッセイのさらなる変形は、モノマーペプチドのNunc Maxisorpマイクロ タイトレーションプレートのウェル上に直接被膜したβ2-GPIに対するaPL抗体の 結合を阻害する能力を試験する。この変形物において、カルジオリピンの使用が 省略され、そして魚ゼラチン、試薬希釈物およびブロッカーのかわりに、脱脂乳 /Tweenを使用する。 (viii)蛍光偏光ペプチド結合アッセイ このアッセイは、aPL抗体に対するペプチドの直接の結合を検出する。aPL抗体 は、β2-GPI（抗原）に結合するので、ELISA競合阻害アッセイは、β2-GPIへの 結合に起因する阻害ならびにaPL抗体に対するペプチドの結合に起因する阻害を 示し得る。抗体に対する結合は、ペプチドがToleragenとして機能するために必 要とされるので、ペプチドがaPL抗体に直接結合し得ることが確立されているこ とが必須である。このアッセイを使用して、２つのaPL抗体、ACA-6501およびACA -6701に結合するペプチドについての解離定数を決定する。ELISAアッセイは、蛍 光偏光アッセイよりも少ない抗体を必要とするので、ハイスループットスクリー ニングに有用である一方で、しかし、ELISA陽性ペプチドは、蛍光偏光アッセイ によってさらに評価して、それらがaPL抗体と直接結合し得るかどうかを決定す るべきである。 （ix）置換および欠失合成による結合に対するアミノ酸の寄与の評価 寛容性誘導に対する所望のエピトープは、できるだけ多くのaPL抗体とのでき るだけ強い相互作用を有するべきであるが、不要な残基は含まないべきである。 エピトープの最小構成を推測するために、それぞれのペプチドのアナログを作製 する：(i)所定の残基を欠損するアナログ（例えば、カルボキシル末端および／ またはアミノ末端での骨格残基が欠失される）、または(ii)エピトープライブラ リーのスクリーニングにおいて見出される配列と異なるアミノ酸置換が行われた アナログ。これらのアミノ酸置換は、自然なもの（例えば、ロイシンに対してイ ソロイシン）、あるいは非自然なもの（例えば、プロリンに対してα-メチルプ ロリン）いずれかであり得る。これらの欠失および／または置換の効果は、次い でペプチド競合ELISAによって測定される。 (x)β2-GPIの第5ドメインの変異誘発によるaPL血清特異性の分類 寛容原が一般に有効であるためには、患者の大部分におけるaPL抗体の大半に それが結合しなければならない。異なる患者から得たいくつかの抗体が、標的エ ピトープを含有すると考えられるβ2-GPIの84アミノ酸の第5ドメイン中の同一の 残基に結合するかどうかを決めることは重要である。数種の抗体が同一残基に結 合する場合、ペプチドの構造データから誘導される、全ての抗体と反応する単一 のミモトープを設計し得る。それに対して、抗体が異なる残基と結合する場合、 それぞれの抗体に対して特異的な寛容原が必要となる。β2-GPIの第5ドメイン内 のaPL抗体結合残基内に重要な残基が関与しているかどうかを同定するために、 部位特異的変異誘発を行った。得られた変異β2-GPIを、数種のaPL抗体との反応 性についてアッセイした。結果は不確実であった。β2-GPIの第5ドメインとグル タチオンSトランズフェラーゼ(GST)とを含む融合タンパク質が、A.Steinkassere rから得られ、E.coliで発現された(Steinkassererら(1992)FEBS Lett．313: 193 -197)。ACA ELISAでは、この融合タンパク質はネイティブなβ2-GPIとうまく置 換された。アミノ酸置換は、標準的な部位特異的変異誘発を用いて行う。 Ｉ．合成aPLエピトープの単離 GPLスコアが151（高力価）で、再発性の発作や胎児死亡、狼蒼および3つの大 動脈弁の移植の経歴の患者から得られた抗体ACA-6501を、カルジオリピンリポソ ームでイムノアフィニティーにより精製し、xy、xyz、xy'z、および以前に行っ たスクリーニングに基づいて７位をアルギニンに固定した特別なpro/cys結合の7 -merライブラリーを用いて抗体を4つの異なるファージライブラリーのスクリー ニングにおいて使用した。表１に示すように、マイクロ選抜を行ったファージに おいて(試験した140から)36の配列が得られた。これらはかなりの相同性を示し 、そして、6および7位での保存されたDR残基が特に目をひく。コンセンサス配列 はCLLLAPDRCである。この相同性にもかかわらず、ファージELISAの比色試験後、 7つのファージのみが陽性であった。(表2参照)。アフィニティー精製されたACA- 6626(高いが、ACA−6501よりは低い力価の患者由来)を用いてxy'zファージをス クリーニングすると、ファージELISA試験された5つの独立の配列が得られた。ど れも比色陽性ではなかったが、化学発光基質によりELISA免疫結合体が発色され たとき、2つが陽性であった。ACA-6626と会合する配列のモチーフは、関連して いるようであるが、ACA-6501により認められたものとは異なる(表3参照)。両抗 体は、結合前の空いた配列を覆うcys結合の(おそらく環状化および束縛された) エピトープを好んだ。 表１ ACA-6501ファージライブラリー配列ACA-6501ファージライブラリー配列 表２ ACA-6501比色ELISA陽性ファージ *は、コンセンサスまたは平均配列に対応する。 表３ ACA-6626xy'zファージライブラリー配列 ACA-6644は、本明細書中において示された方法の従い、プールされたp-IIIフ ァージライブラリーをスクリーニングするために使用された別の高力価aPL抗体 である。次の配列が見い出された。 ACA-6644/CBe GILLNEFA ACA-6644/CBd GILTIDNL ACA-6644/CBf GILALDYV これらの配列はすべて、N末端でファージの骨格残基を欠失する“z”エピトープ ライブラリー成分から誘導された。ペプチドとして合成すると、その配列は、AC A-6644およびACA-6501を含む数種のACA血清と免疫反応性を示した。分析の結果 、表4に示すように、ACA-6501を用いてすでに得ていた配列と疑いのない相同性 を明らかにした。 表４ これらの二つのaPL抗体によってスクリーニングされた非常に異なる二つの源 のライブラリーに由来する集約された配列の相同性は、その配列が、本来の標的 抗原の主要な、おそらくはイムノドミナントな領域の模倣であり得ることを示唆 する。 p-IIIライブラリーのACA-6701によるスクリーニングでは、高い程度の内部の 相同性を有するが、他のaPL抗体を用いて以前に得られたものとは異なる二つの 独特の配列が得られた。配列は、以下に示すとおりである。 ACA-6701/3B1 LSDPGYVRNIFH ACA-6701/3E1 LTDPRYTRDISNFTD 樹脂に結合したペプチドとして、配列は、その親血清(ACA-6701)と強い免疫反 応性を有したが、他のaPL抗体とは最小に交叉反応性であった。 アフィニティー精製したACA抗体を用いて任意のp-IIIファージライブラリーの スクリーニングを続行した結果、はじめに試験した9つのアフィニティー精製さ れたACA抗体全てに対してかなりの交叉反応性を示すペプチドを見出した。この ペプチドおよび他の４つのペプチドの能力を、表５に示す。５つのペプチド全て のペプチド配列は表の直下にある。すべては、本明細書中に記載されるようにCL /β2-GPIプレートを用いる競合的結合ペプチドACA ELISAを用いて試験された。 表５ペプチドモノマーによるACAの阻害百分率 その後の試験から、AGP-CLGVLGKLC-PG(LJP688)の配列を有するこのペプチドAC A-6641/3G3は、多くのACA抗血清と交叉反応性であったことが決定された。この ペプチドの化学的最適化は、短縮化、系統的なアミノ酸の置換および非ジスルフ ィド環化の実験により行われた。 任意のファージライブラリーのスクリーニングにより選ばれた数種のペプチド のモチーフは以下に示す。 表６ J． アフィニティー精製されたIgG aPL抗体とaPL関連ペプチドとの免疫反応性 アフィニティー精製されたACA-6501を用いて得られ、そしてファージELISA陽 性と認められたファージ配列を、コンビナトリアル合成ペプチドライブラリーの ために最近開発された固体支持体上で合成し、Rapp樹脂のこの支持体は、高いペ プチド密度を有し、最初のアミノ酸のカップリング前に親水性のポリエチレング リコールのスペーサーを使用する。合成の結果、抗体結合実験に理想的に適した 樹脂結合のペプチドが得られた。図2に示すように、ペプチド5A12(CLILAPDRCの 配列)は、非関連のコントロールペプチドを劇的に上回る性能であったが、普通 のIgGとは有意に結合しなかった。同様の結果が、試験した他のファージELISA陽 性のペプチドを用いて得られた。実験で示されたように、樹脂ペプチド結合のア フィニティー精製されたACA-6501 aPL抗体を免疫結合体呈色反応により検出した 。 Ｋ． aPL 血清抗体の合成ペプチドとの反応性 血清を用いて、樹脂結合のペプチドがaPLに免疫特異的に結合し得ることがわ かり、aPL抗体を試験する能力は大幅に向上した。図3に示すように、ペプチドは 、ACA-6626結合のaPL抗血清を用いるスクリーニングから得られるが、普通の血 清との明確な結合は認められなかった。図３はまた、aPL血清に対するACA6501-5 A12ペプチドの免疫特異的な結合の挙動を示す。ペプチド5A12に対する通常の血 清との結合は無く、データは示さなかった。 Ｌ． ライブラリースクリーニング抗体の供給源でないaPL抗血清に対する合成 ペプチドの交叉反応性 aPL血清試験のために二つのペプチドを選択した。一つ(5A12)はACA-6501スク リーニングを表し、もう一つ(4D3)はACA6626スクリーニングを表す。図４と図５ に示すように、それぞれのペプチドは、スクリーニング抗体の元の血清と優先的 に反応した。しかしながら、有意な程度の交叉反応性が、特にACA-6501とACA-66 26との間で検出可能であった。GPLのスコアが低いかまたは無い１９の患者血清 、およびGPLが中程度から高い１３の病的血清の調査を、5A12樹脂結合ペプチド を用いて行った。１９のコントロールサンプル中のたった２例だけが低いペプチ ド結合を示したのに対して、１３の病的サンプルでは８例の検出可能なぺプチド 結合を示した。これらの結果は、合成ペプチドが発作患者の治療において診断ま たは予後のアッセイに有用であることを明らかにする。 上記の第I章で述べたように、合成ペプチド6641/3G3は、いくつかの高力価のA CA抗血清に対して試験された。このペプチドは、図14に示すように、試験された ACA抗血清の大多数と交叉反応することが判った。6641/3G3は、10個のACA抗体の すべてと用量依存的な交叉反応性を示し、1.8mg/mlで完全に阻害（>80％）し、 そしてこれらは、以下の表７に表したように、ACA抗体に対して特異的であった 。 表７ カルジオリピン／β2-GPI被覆プレートを用いる AGP-CLGVLGKLC-PG(LJP688) ACA血清の交叉反応性データＭ． 新しいペプチド合成方法論 aPLライブラリースクリーニングによる新たな候補配列の同定には、新たに合 成したペプチドを抗体の結合について試験することが必要であった。既知のペプ チドの代用のRapp樹脂を用いて、飽和結合アッセイのような定量的な結合研究、 および放射能標識したaPL IgGを用いる平衡測定を行うことが可能である。 ペプチドの合成は、選択的合成によるミモトープの分子的分割を可能にする。 これは、抗体結合を高める目的で鎖に沿う各アミノ酸の改変を含む。選択的合成 は、配列中のそれぞれのアミノ酸の相対的な重要性を明らかにする。もし必要で あれば、特定の残基位置での選択的な置換は、T細胞アッセイの間で発見されたT 細胞の増殖反応を無くしてしまうのに対して、B細胞の反応性は維持するように 設計され得る。 ペプチド6641/3G3(LJP688)は、多くのアッセイに用いられた。そのアッセイに は、以下のようなものを含んだ:N末端とC末端の両方での短縮型、ジスルフィド の置換体、2から8位のアミノ酸のグリシンおよびアラニンへの置換体、2,4,5,お よび8位での枝分かれした脂肪族アミノ酸への置換体、α-メチルアミノ酸への置 換を含む、ペプチドの立体配座に影響するアミノ酸への置換体、7位での塩基性 アミノ酸への置換体、2位から9位をでのD-アミノ酸への置換体、および1位から9 位でのN-α-メチルアミノ酸への置換体。これらの結果を、後の表９に示す。こ れらの置換および短縮の構造と活性の関係を、表８に示す。 表８ペプチド3G3の最適化 表９ 交叉反応性ACAエピトープの構造活性相関 Ｎ． ペプチドの免疫反応性を増強、およびプロテアーゼ攻撃に対する抵抗性を 付与するためのα-メチルアミノ酸置換および非天然のアミノ酸の使用 プロリン残基は、ポリペプチド鎖の立体配座に影響するために特別な意味を有 する。それらは、しばしば、球状タンパク質の表面の逆ターン中に存在する。本 発明のファージエピトープライブラリーにおいて、すべてのランダムペプチドイ ンサートは境界プロリンと隣接する。加えて、ACA-6501を用いて発見されたミノ トープのほとんどは、コンピューターベースの予測に基づいて、β-ターンの一 部として存在し得る第３のプロリンを持っている。β-ターンの模倣物は、小ペ プチドにおいて逆ターンの立体配座の安定性を高めるために使用され得る。その 様な模倣物には、プロリンアナログの(S)-α-メチルプロリン(α-MePro)があり 、これはターンの立体配座の安定化に加えて、プロテアーゼ分解に対する抵抗性 を付与する。プロテアーゼ抵抗性は、血漿内で作用するように設計される有望な 薬物に望ましい性質である。ペプチドACA-6501/3B10 AGPCLLLAPDRCPG(インサー ト を太字で示す)は、コンセンサスペプチドである。それは、他の35の相同的な配 列との比較をもとに、それぞれの位置に最も広く存在する残基を特徴とする配列 を有する。その代表的な特徴のために、その配列は多くの系統的な改変および欠 失がなされ、そして活性は、後にaPL抗体結合によって評価された。最も重要な 知見の１つは、3位と9位でのプロリンが活性に重要であるという発見である。プ ロリン-3は、ファージの骨格に由来するもので、ランダムインサートの一部では ない。最も劇的な効果は、9位のプロリンをα-MeProに置換することによって得 られた。この置換で、免疫反応性は6倍に高められた。 α-メチルアミノ酸およびN-α-メチルアミノ酸に置換した研究は、ペプチド66 41/3G3に関して行われ、その結果を上記の表８に示す。 20個の天然に生じるアミノ酸およびそのホモアナログおよび非アナログに加え て、いくつかの他のクラスのαアミノ酸が、本発明において利用され得る。これ らの他のクラスの例には、d-アミノ酸、Na-アルキルアミノ酸、α-アルキルアミ ノ酸、環状アミノ酸、キメラ（chirrieric）アミノ酸、および雑多（miscellane ous）アミノ酸が挙げられる。これらの非天然のアミノ酸は、生物活性ポリペプ チドを改変してタンパク質分解に対する耐性を増強するため、および/または立 体配座的な制約を与えて生物学的活性を改善するために広範に使用されている(H rubyら、(1990)Biochem．J 268:249-262;HrubyおよびBonner(1995)Methods in M olecular Biology 35:201-240)。 最も一般的なNa-アルキルアミノ酸は、Na-メチルアミノ酸（例えば、Na-メチ ルシステイン(nC)、Na-メチルグリシン(nG)、Na-メシルロイシン(nL)、Na-メチ ルリジン(nK)、およびNa-メチルバリン(nV)）である。α-アルキルアミノ酸の例 には、α-メチルアラニン(niA)、α-アミノイソブチル酸(aiB)、α-メチルプロ リン(mP)、α-メチルロイシン(mL)、α-メチルバリン(mV)、α-メチルα-アミノ ブチル酸(tv)、ジメチルグリシン(deG)、ジフェニルグリシン(dpG)、およびジシ クロヘキシルグリシン(dcG)が含まれる(Balararn(1992)Pure & Appl．Chem．64: 1061-1066; Tonioloら(1993)Biopolymers33:1061-1072:Hindsら（1991）Med Che m．34:1777-1789)。 環状アミノ酸の例には、1-アミノ-1-シクロプロパンカルボン酸(cG)、1-アミ ノ-1-シクロペンタンカルボン酸(Ac5 c)、1-アミノ-1-シクロヘキサンカルボン 酸(Ac6c)、アミノインダン(aminoin.dane)カルボン酸(ind)、テトラヒドロイソ キノリンカルボン酸(Tic)、およびピペコリン酸(Pip)が挙げられる（C．Toniolo (1990)Int'l．J．Peptide Protein Res．35:287-300; Burgessら(1995)J．Am．C hem．Soc．117:3808-3819)。キメラアミノ酸の例には、ペニシラミン(Pe)、シス テインとバリンと4R-と4S-メルカプトプロリン(Mpt)との組合せ、ホモシステイ ンとプロリンと4R-と4S-ヒドロキシプロリン(hyP)との組合せ、ならびにホモセ リンとプロリンとの組合せが挙げられる。雑多なαアミノ酸の例には、塩基性ア ミノ酸アナログ（例えば、オルニチン(Omithine)(Or)、Nε-メチルリジン(mK)、 4-ピリジルアラニン(pyA)、4-ピペリジノアラニン(piA)、および4-アミノフェニ ルアラニン）；酸性アミノ酸アナログ（例えば、シトルリン(cit)、および3-ヒ ドロキシバリン）；芳香性アミノ酸アナログ（例えば、1-ナフチルアラニン(1-N al)、2-ナフチルアラニン(2-Nal)、フェニルグリシン(pG)、3,3-ジフェニルアラ ニン(dpA)、3-(2-チエニル)アラニン(TE)、およびハロフェニルアラニン（例え ば、2-フルオロフェニルアラニンおよび4-クロロフェニルアラニン）；疎水性ア ミノ酸アナログ（例えば、t-ブチルグリシン（すなわち、三級ロイシン(tL)）、 2-アミノブチル酸(Abu)、シクロヘキシルアラニン(Cy)、4-テトラヒドロピラニ ルアラニン(tpA)、3,3-ジシクロヘキシルアラニン(dcA)、および3,4-ジヒドロプ ロリン）が挙げられる。 αアミノ酸に加えて、βアミノ酸のような他のものもまた、本発明に使用され 得る。これらの他のアミノ酸の例には、2-アミノ安息香酸(Abz)、β-アミノプロ パン酸(β-Apr)、γ-アミノ酪酸(γ-Abu)、および6-アミノヘキサン酸(ε-Ahx) が挙げられる。カルボン酸（例えば、4-クロロ酪酸(By)および3-クロロプロピオ ン酸(Pp)もまた、環状チオエーテルペプチドの合成においてＮ末端上の第一残基 として使用されている。 Ｏ． 環状チオエーテルアナログの調製 本発明の方法によって同定された模倣物ペプチドは、チオエーテル置換を含む さらに改変され得る。環状ジスルフィドアナログの環状チオエーテルアナログへ の改変は、アナログ結合体の血漿中の半減期を延ばし、そのためにより低い投与 量が必要である。環状チオエーテルアナログはまた、環状ジスルフィドペプチド と共にしばしば生じるジスルフィド結合の交換という問題を解消する。加えて、 環状チオエーテルアナログはまた、T細胞に対するMHCクラスII提示を妨げ得る。 従って、アネルギーの誘導を促進する。最終的に、環状チオエーテルアナログは 、原子価プラットホーム分子結合体生成において用いられるチオール依存性の結 合反応に有用である。 ４つの環状チオエーテルアナログを、その全体を本明細書中で援用される、代 理人整理番号252312006600の共有に係る、同時係属中の特許出願に記載される方 法論によって調製した。RinkTMアミド4-メチルベンゾヒドリルアミノ樹脂あるい はMBHA樹脂のどちらかを用いて、6641/3G3の全長のペプチドアナログを調製し、 クロロペプチドへ変換し、固体支持体から切断し、次いで環化した。以下にチオ エーテル反応のスキームを示す。適切なな環状チオエーテルアナログは以下に示 したアナログを含む。 環状チオエーテル反応スキームＩあるいは、チオエーテルアナログは以下の反応スキームで調製される。 環状チオエーテル反応スキーム２ 以下のアナログは、環状チオエーテル反応スキーム２によって作られるアナロ グの代表例である。 代表的な環状チオエーテルアナログを、ACA6501およびACA6701のACA抗体に対 する活性について試験した。その結果は以下の表10に示す。 表１０ IC50値(μｇ/0.1mL) HCTEアナログのLJP699が、LJP688を切り縮めたCLGVLGKLCの参照ペプチドのLJP 690、AGPCLGVLGKLCPGよりも優れていた。 本明細書中で引用されるすべての論文、文献、特許および特許出願は本明細書 中で参考としてその全体が援用される。以下の実施例は、本発明およびその独創 性をさらに示すことを意図する。これらの実施例は、本発明の範囲を決して限定 しているわけではない。 実施例 実施例１：血清6501中の抗カルジオリピン抗体(ACA)の測定 マイクロタイトレーションプレートImmulon I（Dynatech Laboratories，Inc. ,Chantilly，VA）の番号付けされたウェルを、ウェルあたり30μＬのエタノール 中の50μｇのカルジオリピン（Sigma Chemical，St．Louis，MO）で被覆した。 プレートを、４℃で一晩乾燥し、10％成熟ウシ血清（ABS）(Irvine Scientific Co.,Santa Ana，CA)を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ABS/PBS）の200μＬで２時 間室温（RT）ブロックした。プレートを、トリス緩衝化生理食塩水（TBS）で５ 回洗浄し、その後、10μＬの試験血清ACA-6501およびaPL標準物質を添加した。a PL標準物質（APL Diagnostics，Inc.,Louisville，KY）を、製造者の使用説明書 に基づいて再構成し、10%ABS-PBSで1:50に希釈した。試験血清ACA-6501を、1:50 から1:2000に10%ABS-PBSで連続希釈し、選択された二連のウェルに添加し、２時 間室温でインキュベートした。プレートをTBSで５回洗浄し、10%ABS-PBSで1000 倍に希釈したヤギ抗ヒトIgG/アルカリホスファターゼ結合体（Zymed，South San Francisco，CA，Cat．No．628422）の100μＬを加えて１時間室温でインキュベ ートした。再度、プレートを５回TBSで洗浄し、アッセイは、100μＬフェノール フタレインモノホスフェート(PPMP)基質溶液（Sigma，Cat．No．P-5758）を添加 することにより行った。基質溶液は、脱イオン水で1:26倍に希釈した後に塩酸で pH10.15に調節することにより、0.13M PPMPおよび7.8M 2-アミノ-2-メチル-1-プ ロパノールの保存溶液から調製した。約30分後、反応を、0.2M二塩基性リン酸ナ トリウム（dibasic sodium phosphate）(Mallinckrodt，Analytical Reagent)の 50μＬを各ウェルに添加して停止させた。光学密度は、マイクロプレート自動読 み取り 機（Bio-Tek Instruments，Winooski,VT，Model EL311）において550nmで読み取 った。奇数番号のコントロールウェル（ブランク、カルジオリピン(CL)なし）の 光学密度を、偶数番号のウェルの光学密度から差し引いた。aPL標準物質の吸光 度の値を、Graph Pad Prizm(Graph Pad Software,Inc.,San Diego,CA)を使って プロットし、GPL(IgGリン脂質)の標準曲線を作成した。希釈した6501試験血清の 吸光度の値を用いて、GPLの標準曲線を基にしてGPLスコアを計算した。 改変ACAELISAにおいて、Nunc Maxisorpマイクロタイトレーションプレートを 、室温で１時間インキュベートした後、PBS中に作製した100μＬ/mLのβ2-GPIで 被膜した。この工程の後、マイクロプレートを２％脱脂乳および0.4％(w/v)Twee n80を含有するPBSで２時間室温でブロックした。脱脂乳/Tweenを試薬希釈剤およ びブロッキング剤として使用した以外は、β2-GPIを添加する前にカルジオリピ ンでまず被膜したDynatechマイクロプレートについて以前に記載されたように、 β2-GPIで直接被膜したNuncマイクロプレートをACA IgG結合研究のために使用し た。 実施例２：血清6501からの精製された抗カルジオリピン抗体(ACA) 25mL丸底フラスコ（Kontes Scientific Co.,Vineland,N.J.）に、1.2mlのカル ジオリピン（Sigma Chemical,St.Louis,MO,#C-1649）、0.464mLのコレステロー ル(Sigma Diag.,St.Louis,MO.,#965-25)、クロロホルム1mLあたり5mgジセチルホ スフェート(Sigma Chemical，St.Louis,MO，D-2631)の0.088mLの混合物をRotava p(Buchi，Switzerland)にて約５分間乾燥した。溶媒を除いた後、0.96%(w/v)NaC l（J.T.Baker，Inc.,Phillipsburg，NJ）Baker analyzed reagent）の2mLを添加 して、Vortex Genie Mixer(Scientific Industries，Inc.，Bohemia，NY)を用い て１分間混合した。リポソーム懸濁液を、37度で１時間インキュベートした。そ の間、血清6501を、８℃で、10分間、Sorvall RT 6000遠心分離(Dupont Co.Wilm ingtonn,DE)にて600ｘｇで遠心分離した。４mLの上清を、調製したリポソーム懸 濁液の1mLが入れた25mL丸底フラスコに移した。混合物を、旋回型振とう機Tekta tor(Scientific Products，McGraw Park，IL)で、中速の撹拌振とうしながらイ ンキュベーションを48時間４℃で行った。その後、引き続き２時間37℃でイン キュベートした。20mLの冷TBSを添加し、混合物を50mL容量のポリカーボネート 遠心管（Nalge Co.,Rochester,NY）に移した。そしてSS-34ローター（Sorvall-D upont，Washington，DE）で、RC3遠心分離機にて、15分間、４℃で、27000ｘｇ で遠心分離した。沈殿を、RC3遠心分離分機を用いて、25mLの冷0.96%NaClで３回 洗浄した。ペレットを、2%(w/v)n-オクチルーβ-D-グリコピラノシド(Calbioche m,Lajolla，CA)のTBS溶液の1mLに溶解し、そして、0.6mLのプロテインA/架橋ア ガロース(Repligen Corporation，Cambridge，MA)カラムに加えた。カラムは、 ｌM酢酸でベット量の15倍で予め洗浄し、15倍量のTBSで平衡化した。抗体-プロ テインA/アガロースカラムを、脂質を取り除くために、ベット量の40倍の2%オク チルグルコピラノシドで洗浄した。その後、280nmでの光学密度がベースライン に達するまで、TBSで十分に洗浄した。結合した抗体を、1M酢酸で溶出した。1mL のフラクションで分取して、フラクション毎に0.34mLの3M Tris(Bio-Rad,電気泳 動用試薬)で、直ちに中和して氷浴中に保存した。それぞれの光学密度を、分光 光度計（Hewlett-Packard，8452A Diode ArraySpectrophotometer，Palo Alto,C A)にて280nmで決定した。抗体を含んだフラクションを集め、Centricon-30濃縮 器（Amicon Division，W.R．Grace & Co.，Beverly，MA）を用いて、製造業者の プロトコルに従って、TBSで４回濃縮および洗浄した。4mLの血清6501から精製さ れた抗体の最終収量を、lmg=l.340D280をもとに、濃縮液のアリコート280nmでの 光学密度の値から決定した。得られた平均収量は、4mLの血清6501から抗体750μ ｇであった。精製された抗体を、ACA活性について試験し、Laemmli SDS-PAGEで 純度を調べた。製造者の指示に従ってCNBr活性化アガロース(Pharmacia，Inc.,P iscataway，N)またはAffi-Gel 10(BioRad，Richmond，CA)を使用して、市販の精 製β2-GPI（Perlmmune，Rockville，MD）を用いてβ2-GPIを含有するアフィニテ ィー吸着剤を調製した。β2-GPI吸着剤を含有する１mLのゲルカラムに、1mL TBS 中の100μｇまでのリポソーム精製aPL IgGを添加した。１時間の後、緩衝液でカ ラムを十分に洗浄し、混入物およびβ2-GPIに結合しなかった任意のIgGを置換し た。β2-GPI結合IgGをIM HOAcおよびTrisで中和した画分で上記のように置換し た。IgGを含有する画分を、以前に記載のようにプールし、濃縮し、そして緩衝 液交換に供した。 実施例３：P-III ライブラリーのベクター調製物の構築 fUSE 5 （Scott,J.K．およびG.Smith，前出）を、p-IIIライブラリーの構築の ためのベクターとして使用し、Holmes,D.S.およびM.Quigly(1981)，Anal．Bioch em.144:193)の変法を、二本鎖複製形態(RF)を生成するために用いた。簡単に説 明すると、fUSE 5を保持した800mlのE.coli K802培養物を、２YT培地(Difco Lab s，Ann Arbor，MI)に20μｇ/mLテトラサイクリンを加え、18時間、37℃で強く振 盪しながら培養した。菌体を遠心分離により集菌し、75ml STETに再懸濁した。S TETは、50mM Tris/HCl pH8.0に、8%スクロースと0.5%Triton X-100と50mM EDTA とを含む。リゾチーム（STET中で10mg/mL）を、終濃度1mg/mLになるように添加 した。室温で5分間後、3等分したアリコートを、ときどき撹拌しながら沸騰水中 に3.5分間置いた。粘りけのあるスラリーを、l8000xGで30分間遠心分離し、上清 に等量のイソプロパノールを添加した。溶液を-20℃に冷却し、核酸を遠心分離 によって集めた。RFを、Sambrookら、MOLECULAR CL0NINIG：A LAB0RAT0RY MANUA L(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor NY，2ded.,1989 )に記載されるように,塩化セシウム勾配から単離した。ランダムインサートの調製 挿入用のDNAを、Cwirlaら(1990)Proc.Natl.Acad.Scl．USA 87:6378-6382に記 載されている”ギャップ二重鎖（gapped duplex）”法で作製した。この方法で は、中央部に縮重領域を含むオリゴヌクレオチドは、それぞれの端での短い定常 領域によって囲まれている。二つのより短い相補的オリゴヌクレオチドを、ベク ターを消化するために用いられる制限エンドヌクレアーゼによって生成する粘着 末端に相補的な突出末端を持つ”ギャップ二重鎖”を形成するためにアニーリン グする。この場合、長い方の縮重オリゴヌクレオチドは以下の配列を持つ：5'GG GCTGGACCC(NNK)xCCGGGGGCTGCTG3'、ここで、NはAまたはCまたはGまたはTであり 、ＫはGまたはTであり、そしてｘはランダム領域におけるコドンの数である。Ep iGS2は、縮重オリゴヌクレオチドの5'末端で塩基対形成するように設計され、そ の配列は、5'GGGTCCAGCCCCGT3'である。同様に、EpiGS3は、縮重オリゴヌクレオ チ ドの3'末端とアニーリングするように設計され、5'CAGCCCCCGG3'の配列を持つ。 正確にアニーリングするとき、３つのオリゴヌクレオチドは”ギャップ二重鎖” を形成する。これらは、Sfi1で消化したfUSE 5に挿入した際に、5'末端付近のラ ンダムインサート断片を伴うp-IIIのリーディングフレームを保持する。 以上に述べたオリゴヌクレオチドを、ポリアクリルアミドゲルから切り出して 調製した。1nmolのEpiGS2とEpiGS3、および50pmolの縮重オリゴヌクレオチドを6 6μＬの容量で別々にリン酸化した。次いで３つのオリゴヌクレオチドをプール し、50mMになるようにNaclを加え、混合物を65℃で5分間加熱し、続いて室温へ ゆっくりと冷した。アニーリングしたオリゴヌクレオチドを、氷中で冷やし、直 ちにfUSE 5との連結反応に用いた。連結反応は、Sfi1で完全に消化した10μｇの fUSE5 DNA、30μＬの”ギャップ二重鎖”溶液、および1000U T4リガーゼから成 り、全量を450μＬとした。連結は、16℃で18時間インキュベーションした。混 合物を、次いでフェノール・クロロホルム抽出し、エタノールで沈殿させ、沈殿 物を20μＬの水に溶解した。ライブラリーの形成と増幅 連結したＤＮＡをエレクトロポレーション法(Dowerら、(1988)Nucleic Acid R es．16:6127-6145)によってE.coliに導入した。凍結エレクトロコンピテントMC1 061菌体(0.1mL)を、4μＬの連結DNAを2mmの冷キュベット内で混合し、BTXエレク トロポレーション装置(BTX Corp.,San Diego,CA)によって2.5kV，5.2mSのパルス を加えた。パルスをあてた後、直ちに菌体生育培地の1mL S0C（Dowerら、前出） を加えた。５つの別々のエレクトロポレーションを実行し、プールし、37℃で１ 時間インキュベートした。そのとき、サンプルを取り出し、生成されたコロニー んぼ総数を決めるために希釈した。残りの混台物を、20μg／mLテトラサイクリ ンを含む1L 2YT（1.6%ペプトン，140，1%酵母抽出物，0.5%NaCl，Difco Labs，A nn Arbor，MI）で希釈し、37℃で18時間、275rpmで振とう培養した。ファージを 、PEG/NaCl沈殿を２回行うことによって精製し、0.02%アジ化ナトリウムを含む1 .2mL TBSに再懸濁した。ファージ粒子数を、269nmの吸光度で決定した。ファー ジ力価を、飢餓状態のE.coliの10μＬにファージの希釈液の10μｌを混合するこ とに より決定した。 実施例４：aPL 抗体でのp-IIIライブラリーのスクリーニング アフィニティー精製したACA-6501（affACAA-6501，10μｇ;7μＬの1.44mg/mL ストック溶液）を1.4mLのシリコーン処理したポリプロピレン製マイクロフュー ジチューブに移し、X,Y,およびZライブラリー(epixyz)[それぞれ、11μＬ+8.5μ Ｌ+2μＬ;全量21.5μＬ、約1010のクローン]由来のプールされたファージをとも に、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むTBS（pH7.4）の100μＬの最終用量で室 温で２時間インキュベートした。このインキュベーションの間に、新鮮な飢餓状 態のE.coli K-91株の調製の最終段階を行った。2YT培地にて、37℃、250rpmで約 ５時間振とう培養したE．coli懸濁液を、50mlポリプロピレンチューブを用いて1 000×gで、10分間室温で遠心分離した。20mlの80mM NaclをパックしたE．coliペ レットに加え、37℃でl00rpmで45分間インキュベートした。上記の遠心分離に続 き、飢餓状態のE．coliペレットを1mLの50mMリン酸アンモニウム/80mM Naclに懸 濁し、後にファージ増幅に用いた。プロテインG-アガロースビーズをTBS/BSAで ２回洗浄し、TBS/0.5％Tween-20で２回洗浄し、TBS/Tween中で50％懸濁液として ４℃で保存した。 次いで、プロテインG-アガロースビーズ懸濁液の200μｌを、ACA-6501/ファー ジ混合物に加え、室温でさらに１時間インキュベートした。この時点で、混合物 を冷却し、冷えたTBS/Tweenで３回洗浄し、沈殿を低温室内で微量遠心分離で回 収した。洗浄済みのビーズを、非特異的な付着を防ぐ目的で、予めTBS/BSAおよ びTBS/Tweenで洗浄した新しい微量遠心チューブに移した。さらに３回TBS/Tween で洗浄した後、結合したACA-6501を保持したファージを有するビーズを、300μ ｌの0.2N HCl/グリシン、pH2.1で室温で10分間ひっくり返すことによって溶出し た。16000×ｇで遠心分離した後、酸性溶出液の上清を回収し、100μｌの溶出液 をさらにビーズペレットに加え、手順を繰り返した。10分後、ファージを含む溶 出液（増幅していない1回目のファージを指す）をプールし（〜400μｌ）、17× 100mmの滅菌済みポリスチレン細胞培養チューブに移し、これに50μｌの0.5M Na Clを加え、その後2.5M Tris塩基（通常約25-35μｌ）でpHを中性化した。等量の 飢餓状態のE．coli懸濁液を直ちに加え、37℃100rpmで10分間インキュベートし た。混合物を、20μｇ/mlテトラサイクリン（Tet）含有の25mlの2YT培地を含む 滅菌済み250ml培養フラスコに移し、その後37℃250rpmで一晩インキュベートし た。 一晩の培養から増幅ファージを単離するために、懸濁液をポリカーボネートチ ューブに入れ、12000×ｇで10分間遠心分離した。ペレットを捨てた。ポリプロ ピレンチューブ中で70℃で30分間上清を熱処理した後、材料を再度ポリカーボネ ートチューブで遠心分離し、上清を保存した。ファージを沈殿させるために、こ の上清に、1/4量の20％（w/v）ポリエチレングリコール（分子量8000(PEG 8000) ）を加えた。溶液を、100回上下反転させることで混ぜ、４℃で２時間インキュ ベートした。４℃で、35000×ｇで30分間遠心分離した後、ファージを含むペレ ットを約0.5mlのTBS/BSAに再懸濁し、1.4mlの微量遠心分離チューブに移した。1 6000×ｇで１分間マイクロフュージで遠心分離した後、上清はきれいなチューブ に移し、１回増幅したファージと標識した。 ２回、３回、および４回の生物選抜の間、その前の回の増幅ファージの75μｌ を、最終体積100μｌ中で、７μｌのaffACA-6501と共にインキュベートした。５ 回目のファージに関して、affACA-6501を、まず1：1000で希釈し、他の回の記載 のように処理した。後に続く全ての段階を、第１回目の記載のように行った。５ 回目の生物選抜で得られたファージを、ファージ濃度を決定するため、2YT/Tet プレート上で一時的に力価測定を行った。増幅したファージの一時的な力価測定 には、TBS/BSAまたは2YT培地中での1×106の最初のファージ希釈が必要である。 全ての回に関して、希釈した10μｌのファージを飢餓状態のE．coilの40μｌと 共に37℃で10分間、振とうすることなく、インキュベートした。950μｌの2YT/ 希釈Tet（0.2μｇ/ml）の添加後、混合物を37℃、250rpmの振とうで30-45分間イ ンキュベートした。1：10、1：100、および1：1000で希釈したファージ溶液およ び正味のファージ溶液の10μｌを20μｇ/mlテトラサイクリンを含む寒天プレー トを用いて、2YT/希釈Tetにスポットした。マイクロ選抜 Immulonタイプ２プレートを、プロテインGで被覆した。プロテインGを、0.1M NaHCO3中、10μｇ/mlで調製し、ウェルあたり100μｌをマイクロタイトレーショ ンプレートのウェルに加え、４℃で一晩インキュベートした。プレートから過剰 なプロテインG溶液を除いた後、それぞれのウェルを250-300μｌの2YTで、室温 で１時間振とう台上で振動させてブロックした。Tris緩衝化生理食塩水（pH7.4/ 0.5％ Tween 20(TBS/Tween)）を用いて、自動プレート洗浄機により、200μｌで ウェルを４回洗浄した。2YTを用いて2.5μｇ/mlに希釈したaffACA-6501（または 、対照としての標準IgG）の100μｌを洗浄ウェルに加えた。プレートを、室温で の回転台上で１時間インキュベートしたあたりで低温室の回転装置に移した。 マイクロ選抜により試験されるファージを、マイクロ選抜で生成された寒天プ レートから得た。試験されるそれぞれのクローンを、滅菌つま楊枝を用いて、ウ ェルあたり250μｌの2YT/Tetを含む丸底の96ウェルマイクロタイトレーションプ レート（Corning、Corning、NY）の別のウェルに移し、37℃で一晩培養した。ク ローンの命名は、スクリーニング抗体、起源の生物選抜の回数、一晩培養したプ レートのクローン位置に基づく。例えば、ACA-6501/3B10は、ACA-6501を用いて 、３回目で、マイクロタイトレーションプレートのB10と名付けられたウェルか ら単離されたクローンを指す。一晩インキュベートした後、ファージ培養液をマ イクロタイトレーションプレートホルダーを用いて、室温で1300×ｇ、10分間遠 心分離した。上清を“正味の”ファージ源とする。 最初のマイクロ選抜を、1：10から1：106の比率の希釈で試験した６個のクロ ーンに限定した。これらの試験的に用いたクローンの結果は、それぞれの回の供 給源となるプレートのクローンに十分な結果を与える適切な単一希釈を導くため に用いた。生物選抜の３回目、４回目、および５回目から無作為に選択し、培養 したクローンを表すプレートを、ウェル当たり最終容量250μｌで、マイクロタ イトレーションプレート中の2YTを用いて“正味の”溶液から、1：100,000に希 釈した。所望の希釈となった最終プレートからの100μｌを、上記の通り調製さ れたプロテインG結合のACA-6501および正常IgGを含むプレートに加えた。希釈し たファージをaPL抗体または対照IgGとともに、４℃で２時間水平回転装置上でイ ンキュベートした。自動プレート洗浄機中で、TBS/Tweenにより９回洗浄した後 、IgG結合のファージを、20μｌの0.2N HCl-グリシン/0.1％BSA、pH2.2で溶出し た。 溶出液のインキュベートを室温で10分間続け、その間に、新しい飢餓状態のE．c oliの20μｌをウェルに含む新しいCorningマイクロタイトレーションプレートを 準備し、冷却した。pHを中性にするために、140μｌの29mM Trisをファージ溶出 液を含むプレートに加え、その後、20μｌファージ懸濁液を、各ウェルから、飢 餓状態のE．coliを含むプレートの対応するウェルに移した。37℃で10分間イン キュベートした後、200μの2YT/希釈Tetを加え、さらに37℃で30分間インキュベ ートした。マルチチャンネル分注器を用いて、それぞれのウェルから10μｌを、 大きな2YT/Tet寒天プレートにスポットした。しかし、最後のマイクロタイトレ ーションプレートからの8×12ウェルのパターン、および配置は保ったままにし た。30分間スポットを乾燥させた後、プレートを37℃で一晩インキュベートした 。次の日、コロニーを半定量的に０から4+まで評価した、０は<10コロニーを表 し、+/-は10-20；1+は20-50；2+は50-70％コンフルエント；3+は70-90％コンフ ルエント；4+は>90％コンフルエントコロニーを表す。1：105の希釈で試験した9 4個のクローン[３回目のクローン81個、４回目の６個、５回目の７個]のうち、 ６個のクローンはマイクロ選抜のスコアが０であり、３個は1+、14個は2+、62個 は3+、9個は4+であった。２回目から５回目の生物選抜を表すプレートからの無 作為のクローンの調査を、後述するG-トラックDNA配列決定により行った。４回 目の生物選抜により、配列の多様性は劇的に減少するという結果が得られた（図 ８参照）。従って、２回目のプレートは、1：3×105の希釈でのファージを用い て、マイクロ選抜を行った。この際、それよりも以前（２回目）からのクローン を含む。総計94個のクローンを試験し、これは、1×105の希釈で高いスコアを有 する29個[３回目から26個、４回目から１個、および５回目から２個]、および２ 回目からの65個のクローン（以前には試験されなかった）を含む。1：3×105の 希釈で試験された94個のクローンのうち、26個のスコアは０，11個は+/-、10個 は1+、13個は2+、34個は3+、4+はなしであった。G- トラックDNA配列決定 一本鎖ウイルスDNAを、37℃で一晩インキュベートした培養から単離した。培 養物を調製するために、2YT/Tet（チューブでは2ml、またはマイクロタイトレ ーションプレートの丸底ウェルでは250μｌのいずれかとして）に、マイクロタ イトレーションプレートで予め培養した培養物を広げたプレートからの個々のフ ァージを接種した。培養上清の20％PEG/2.5M NaCl沈殿によるファージの精製、 ならびにフェノール-クロロホルム抽出またはアルカリ変性によるビリオンDNAの 単離または遊離の実施は、チューブでの培養液に関しては、Smith，G．P.および J.K．Scott，”繊維状ファージにおけるペプチドおよびタンパク質ライブラリー ”（1993）Meth．Enzymol．217:228-257、およびマイクロタイトレーションプレ ートでのファージに関しては、Haas，S.J.およびG.P．Smith G．P.，”繊維状フ ァージ由来ウイルスDNAの迅速配列決定”（1993）BioTechniques 15:422-431の 記載に従った。Sangerら(Sangerら”鎖停止阻害剤を用いたDNA配列決定”(1970) Proc．Natl．Acad．Sci．74:5463-5467)のジデオキシヌクレオチド鎖停止DNA配 列決定技術を、市販のSequenaseキット(U.S．Biochemical/Amersham，Arlington Heights，IL)を用いて行い、チューブ培養のファージDNAに関しては、Smithお よびScott(前述)、ならびにマイクロタイトレーションプレートからのファージD NAに関しては、HaasおよびSmith(前述)の通りに行った。ddCTP停止混合物のみを 用いて、7％ポリアクリルアミド/尿素配列決定ゲルでの電気泳動、オートラジオ グラフィーを用いることにより、ひとつの塩基(G)により示されるGトラッキング もしくは配列パターンを得た。標準的なゲル電気泳動およびオートラジオグラフ ィーの手順に従った(Sambrookら、前述)。 ACA-6501ライブラリースクリーニングからの1：1×105のファージ希釈で試験 したマイクロ選抜プレートに由来する76個のクローンのG-トラッキングにより、 11個の異なる配列が確認されたが、１：3×105のファージ希釈で試験した２回目 のマイクロ選抜プレートに由来する64個のクローンは、30個の異なる配列が確認 された。４つの全てジデオキシヌクレオチド三リン酸を用いる従来のDNA配列決 定を、最高のマイクロ選抜スコアおよび独特の配列のファージクローンに適用し 、xyzライブラリーに関して表１に示した12個の配列を得た。ファージ捕獲ELISA クローン、ACA-6635/3A12、3B3、3C8、3A5、3C9、および3B7を、３mlの培養物 として培養した。アフィニィティー精製されたACA-6635を、リン酸緩衝化生理食 塩水、pH7.2で2.5μｇ/mlに希釈し、100μｌをImmulon-2マイクロタイトレーシ ョンプレートウェルに加えた。２時間後、プレートを、振とうせずに自動プレー ト洗浄機を用いて３回TBS/Tweenで洗浄した。次いで、プレートを、ウェル当た り150μｌの0.1％BSA(グロブリンを含まない)のPBS溶液でブロックした。４℃で １時間後、プレートを前述の通り３回洗浄した。それぞれのファージ培養液を17 000×g、３分間遠心分離した後、それぞれの上清を0.1％BSA/PBSで1：10に希釈 し、100μｌを、アフィニティー精製したACA-6635で被覆した各ウェルに加えた 。次いで、４℃で２時間インキュベートした。次いで、プレートを前述のように TBS/Tweenで洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヒツジIgG抗M13ファー ジ抗体(Pharmacia，Inc.，Piscataway，NJ)を、0.1％BSA/PBSで1：5000に希釈し 、100μｌを、それぞれのウェルに加えた。４℃で１時間インキュベーションし た後、プレートを前述のように４回洗浄した。結合体の製造者の説明書に従い調 製した基質100μｌをそれぞれのウェルに加えた。19分後、それぞれのウェルの4 05nmの光学密度を、自動マイクロプレート吸光度読み取り機(Biotek，Winooski ，VT)で読みとった。ACA-6635ファージライブラリースクリーン由来の試験され た７個のクローンを、高いマイクロ選抜スコアおよび負のファージELISAスコア のために選択した（以下参照）。図９に示すように、試験した７個のクローンの うち３個(3A12、3B3、および3A5)は、ファージ捕獲ELISAで非常に強い免疫特異 的シグナルを呈した。ファージELISA 3ml培養物を35クローン（いくつかのファージライブライリースクリーニング でアフィニティー精製されたACA-6501親和性で以前に単離された）ならびに１つ のfUSE２ファージークローン（ペプチドインサートを欠損しておりコントロール をして用いた）から調製した。17000×gで３分間遠心分離した後、それぞれのフ ァージ上清(吸光度をもとに、約2×1011粒子/mlに調整)の100μｌをマイクロタ イトレーションプレート(Falcon，Becton-Dickinson Labware，Lincoln Park，N Y)のウェルに加えて、４℃で一晩インキュベートした。TBS 7.4で４回洗浄した 後、室温下プレートを125μｌの0.5％ BSA/TBSで１時間ブロックした。さらに４ 回TBSで洗浄した後、TBS/BSAにて2.5μｇ/mlに予め希釈した100μｌのaffACA-65 01をそれぞれのウェルに加え、37℃で１時間インキュベートした。さらに４回の 洗浄の後、TBS/0.5％Tweenにて1：1000に希釈した100μｌの抗ヒトIgGをそれぞ れのウェルに加えた。室温で1時間後、酵素基質を加え、２時間インキュベート を続けた。反応を停止させるために50μｌの0.2M Na2HPO4を添加した後、自動プ レート吸光度読取り機により550nmの吸光度を測定した。図10に示したように、A CA-6501を用いて、７個のクローンから、ファージELISAで有意なシグナルが確認 された。:5A12、3B6、3E7、3B10(2D7と同じ配列)、2G11、2H1、2H2。これらのク ローンの配列を表２に示した。ペプチドELISA 標準的なプロトコルで、ジメチルホルムアミド中の四量体ペプチドの保存溶液 を、pH9.5の炭酸緩衝液にて10μｇ/mlに1000倍に希釈した。それぞれのマイクロ タイトレーションプレートウェルを、100μｌの希釈したペプチド溶液で4℃で一 晩被覆した後、緩衝化アルブミンでブロックされる。ペプチド被覆されたマイク ロタイトレーションプレートを、１：50を始めとするいくつかの希釈度のaPL血 清で1-2時間室温でインキュベートした。洗浄の後、ペプチドが結合したヒトIgG の存在を、標準的なELISA手順に従い、酵素結合抗ヒトIgGにより決定した。競合的結合ペプチドELISA (A)Immulon IIプレート(Dynatech Laboratories，Inc.，Chantilly VA)のウェ ルのうちブランクコントロールとして用いる３個のウェルを除く、各ウェルに35 mMの重炭酸ナトリウム(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA，reagent grade)を 含む50mM炭酸ナトリウム（pH9.5）中に10μｇの４価ペプチドACA 6501/3B10を含 む溶液100μｌで、少なくとも１時間室温で被覆した。次いで、液体をウェルか ら除き、TBS中に0.5％（wt/vol）BSA(Sigma Chemical，St．Louis，MO，#A7638) を含む溶液を１ウェルあたり200μｌを加えた（ブロッキングのためにブランク ウェルも含む）。そして、室温で少なくとも１時間インキュベートした。４個 の1.5ml微量遠心管に１から４の番号を付けた。以下の試薬を１番の微量遠心管( Brinkman Instruments，Westbury，NY)中で混ぜた:30μｌの5％BSA; 284μｌのT BS;TBS中に約400-500μｇ/mlのモノマーペプチド(ACA-5A12または-CB2または-3B 10、または負のコントロールとしての乱雑にされた（scrambled）-3B10)を含む 保存溶液の8μｌ；および0.5％ BSA-TBSで1：10希釈の8.2μｌの血清6501。以下 の試薬を２番の微量遠心管中で混ぜた:30μｌの5％BSA;290μｌのTBS;TBS中に約 400-500μｇ/mlのモノマーペプチド(ACA-5A12または-CB2または-3B10、または負 のコントロールとしての乱雑にされた-3B10)を含む保存溶液の２μｌ；および0. 5％ BSA-TBSで1：10の希釈の8.2μｌの血清6501。以下の試薬を３番の微量遠心 管中で混ぜた：30μｌの5％BSA;約400-500μｇ/mlのモノマーペプチド（5A12ま たは-CB2または-3B10、またはコントロールとしての乱雑にされた配列-3B10）の １：10希釈の287μｌ;予め0.5％ BSA-TBSで1：10希釈したACA-6501血清溶液の8. 2μｌ。以下の試薬を４番のEppendorf微量遠心管中で混ぜた:60μの５％BSA;584 μｌのTBS; 0.5％ BSA-TBSで1：10希釈した血清6501の16.5μｌ。ブロックされ たプレートをTBSで５回洗浄した。１番目の微量遠心管の溶液を１ウェルあたり1 00μｌずつ３連で加えた。２番、３番、４番の微量遠心管中の溶液の同量を３連 のウェルに加えた。４番目の微量遠心管中の100μｌのアリコートの溶液をマイ クロタイトレーションプレートの３つのブロックしたそれぞれのブランクウェル に加えた。プレートを旋回振とう機(American Dade，Miami，Fl，Rotator Ｖ)中 で40rpmの振動で室温で１時間インキュベートし、次いでTBSで５回洗浄した。0. 5％ BSA-TBS中で1：1000に希釈したヤギ抗ヒトIgG/アルカリホスファターゼ結合 体(Zymed，South San Francisco，CA，Cat．no．62-8422)の100μｌのアリコー トを加え、室温で１時間インキュベートした。次いでプレートをTBSで５回洗浄 した後、実施例１で記述したように100μｌの希釈したPPMPの基質溶液を加える ことで、アッセイを行った。20分後、ウェル当たり50μｌの0.2M Na2HPO4(Malli nckrodt，St．Louis，MO.，reagent grade)を添加することで反応を停止した。 光学密度を、マイクロプレートリーダーで550nmにて読んだ(Bio-Tek Instrument s,Winooski,VT,Model EL311)。ウェルあたりのペプチドの量に対する550nmの光 学密度をGraph Pad Prizm(Graph Pad Software，Inc.，San Diego)で 描いた。血清6501が４価3B10と結合することを50％阻害するために必要なペプチ ドの量をグラフから計算した。ート(Dynatech Laboratories，Inc.，Chantilly，VA)を、エタノール中にカルジ オリピン(CL，50μｇ;Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO)を含む溶液30μｌで ウェルを被覆した。２個のコントロール用のウェルには、30μｌのエタノールの みを満たした。４℃で一晩エバポレーションした後、それぞれのウェルを5％(w/ v)魚ゼラチンを含むPBS200μｌで、室温で２時間ブロックした。CL被覆の、ブロ ックしたプレートをTBSで５回洗浄し、それぞれのウェルに2.3％(v/v PBS中)IgG 涸渇化ヒト血清(Sigma Chemlcal Co.，St．Louis，MO)100μｌとしてβ2-GPIを 加え、室温で２時間インキュベートした。 インキュベーションの間、3％魚ゼラチンを含む1:1 TBS/PBSで希釈した22μｌ ACA6501血清(最終希釈度1:400)と種々の量の各６種類のペプチドを、Eppendorf 微量遠心管を用いて最終容量220μｌとして混ぜた。特に、チューブ番号１番は 、３％魚ゼラチンTBS-PBS溶液の181.3μｌ、16.7μｌのペプチド保存溶液および ３％魚ゼラチン／TBS-PBSで40倍希釈したACA6501血清22μｌを混合した。ペプチ ド＃951(ジセリン非環状陰性コントロール)、＃952(LJP690の１つのブロット)、 チオエーテルCCTE-3G3、CHTE-3G3、HCTE-3G3、およびHHTE-3G3について、保存溶 液を450〜800μｇ/mlの範囲とした。２番のチューブに関しては、次のものを加 えた：148μｌの魚ゼラチン/TBS-PBS、50μｌのペプチド保存溶液、ACA6501血清 を40倍に希釈した溶液22μｌ。３番のチューブには、48μｌの魚ゼラチン/TBS-P BS、50μｌのペプチド保存溶液、およびACA6501血清を40倍に希釈した溶液22μ ｌを加えた。４番のコントロールチューブには、396μｌの魚ゼラチン/TBS-PBS 、ACA6501血清を40倍に希釈した溶液（ペプチドを含まず）44μｌを入れた。そ れぞれのチューブは室温で約１時間インキュベートした。 CL/β2-GPIマイクロタイトレーションプレートをTBSで５回洗浄し、抗体ペプ チド(またはペプチドを含まない混合物)を含む番号１、２、３、４番のEppendor fチューブから２連で、100μｌのアリコートのウェルに加えた。４番のチューブ から100μｌを分取したものを、カルジオリピンを含まない二連のコントロー ルウェルに加えた。マイクロタイトレーションプレートを、室温下旋回振とう機 (American Scientific，Rotator Ｖ)にて40rpmで振とうしながら、１時間インキ ュベートした。その後、TBSにて５回洗浄した後、0.5％(w/v)BSA-TBSで1：1000 希釈したヤギ抗ヒトIgGアルカリファターゼ結合体(Zymed，Cat No．62-8422)100 μｌを加えた。室温で１時間インキュベートした後、マイクロタイトレーション プレートを再度TBSで５回洗浄し、100μｌのPMPP溶液(水で１：26に希釈した、 水100mlの7.8gのフェノールフタレインモノホスフェートおよび69.5gの2-アミノ -2-メチル-1-プロパノールの保存溶液)を加えることで比色酵素検出を行った。2 1分後、50μｌの0.2M Na2HPO4(Mallinckrodt)をそれぞれのウェルに加えること で、反応を停止させた。550nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(Bio-Tek In struments，Model EL 311)にて読みとった。加えたペプチドに対する吸光度は、 図12に示したようにGraph Pad Prism(Graph Pad Software，Inc.)で描いた。ACA 6501の結合を50％阻害するペプチドの量（IC50）は、加えたペプチドの量と極大 となる吸光度の半分の値の交点としてグラフから計算した。 の10μｇ/ウェルで100μＬ/ウェルの精製ヒトP2糖タンパク質Ｉ（PerImmune，Ro ckville，MD）で被膜した。２つのコントロールウェルは、100μＬ PBSのみを受 けとった。室温での２時間のインキュベーションの後、液体を除去した。被膜し たプレートを、２％(w/v)脱脂粉乳(Carnation，Glendale，CA)および0.4％(w/v) Tween 80(Calbiochem，San Diego，CA)を含有する200μＬ/ウェルのPBSで２時間 室温でブロックした。ブロッキング溶液をまた、試薬希釈剤として用いた。 インキュベーションの２時間目の間に、様々な量の４つの試験ペプチドの各々 を、220μＬの最終（fmal）容量中のサンプル希釈液で希釈した22μＬのACA-650 1血清と、エッペンドルフ微量遠心分離チューブを用いて混合した。詳細には、 チューブ#Iには、188μＬのサンプル希釈液、10μＬのペプチドストック溶液（2 mg〜4mg/mL希釈液）、およびサンプル希釈液中に1:35で希釈した22μＬのAC-650 1血清を添加した。チューブ#2には、158μＬのサンプル希釈液、40μＬのペプチ ドストック溶液、および22μＬの1:35希釈ACA-6501血清を添加した。チューブ#3 は、381iLのサンプル希釈液、160μＬのペプチドストック溶液、および22μＬの 1:35希釈A CA-6501血清（sertim）を含有した。コントロールチューブ、チューブ94は、396 μＬのサンプル希釈液、および44μＬの1:35希釈ACA-6501血清（ペプチドなし） を含有した。チューブの各々を、約１時間室温でインキュベートした。 β2-GPIマイクロプレートをTBSで５回洗浄し、そしてエッペンドルフチューブ 91、２、３、および４に含まれた100μＬの混合物を、マイクロプレートの２連 ウェル中に添加した。チューブ#4の100μＬの内容物を、β2-GPIで被膜していな い２連コントロールウェルの各々に添加した。プレートを１時間室温でインキュ ベートし、TBSで５回洗浄し、そしてサンプル希釈液中で1:1000に希釈した100μ Ｌのヤギ抗ヒトIgG/A-P結合体（Zymed，Cat．No．62-8422）を添加した。室温で の１時間のインキュベートの後、プレートを再びTBSで５回洗浄し、そして熱量 測定酵素検出を、100μＬのPPMP溶液（水で1:26に希釈した100mLの水ストック溶 液中の7.8gのフェノールフタレインモノホスフェートおよび69.5gの2-アミノ-2- メチル-1-プロパノール）を添加することによって行った。22分間の後、反応を 、ウェル当たり50μＬの0.2M Na2HPO4(Mallinckrodt)を添加することによって停 止した。A550nmをマイクロプレートリーダー（Bio-Tek Instruments，Model EL 311）で読んだ。吸光度対添加したペプチドをGraph Pad Prism(Graph Pad Softw are，Inc.)上に図21に示すようにプロットした。ACA-6501結合を50％阻害したペ プチドの量（IC-50）を、添加したペプチドの量と最大値の半分の吸光度との交 点でグラフから計算した。 実施例５：ペプチド3B10の短縮実験およびその得られるペプチドの競合ELISAの 結果 マイクロタイトレーションプレート(96ウェル、平底ポリスチレン製、Immulon -2 Dynatech Laboratories，Inc.，Chantilly，VA)を、カーボネート緩衝液、pH 9.6(15mM Na2CO3/35mM NaHCO3)中に10μｇ/mlの四量体ACA-6501/3B10ペプチドに て100μｌ/ウェルで、室温で１時間被覆した。ウェルから液体を除いた後、それ ぞれのウェルを0.5％(wt/vol)BSA(グロブリン非含有，cat．no．A7638，Sigma C hemical Co.，St Louis,MO)を含有するTBS200μｌで、室温で１時間ブロックし た。プレートの３個のウェルはブランクコントロールのウェルとして使用す るため、４価ペプチドで被覆しなかった。 ブロッキング工程の間、試験すべきそれぞれの可溶性のモノマーペプチドを、 ３つのテストチユーブ(Eppendorf micro test tubes，Brinkmann Instruments,W estbury,NY)に調製した。各々のテストチューブには、30μｌの5％BSA/TBS、8.2 μｌのACA-6501血清(0.5％BSA/TBSで1：10で希釈)、および種々の容量のペプチ ド/FBSストックおよび最終容量が330μｌとなるように必要な容量のTBS緩衝溶液 を含む。この330μｌ容量は、ACA-6501が４価ペプチドで被覆されたプレートに 結合することをブロックする能力について、試験された各ペプチド濃度について ３連の100μｌのサンプルを作成するのに十分な量であった。アミノ末端が短縮 し、通常試験されるala-gly骨格の寄与が欠失したペプチド139に関しては、スト ック溶液の濃度は、約340-400μｇ/ml TBSであり、そして3種のペプチド濃度の チューブを調製するために19μｌ、75μｌ、292μｌのアリコートを取り出した 。ペプチド42(Ｎ末端のalaのみ欠失したもの)およびペプチド143(短縮していな いもの)に関しては、ストック溶液の濃度を400〜500μｇ/ml TBSであった。それ ぞれのペプチドに対して３種の濃度を調製するため、それぞれの保存溶液から１ μｌ、４μｌ、16μｌのアリコートを取り出した。ペプチドモノマーコントロー ルチューブ(ペプチドを欠いたもの)に関しては、最終容量660μｌを有するチュ ーブを次のものを含むように調製した：60μｌの５％BSA、16.5μｌの1：10の希 釈度のACA-6501、および583.5μｌのTBS、すなわち、330μｌチューブと同一の 最終濃度(0.5％BSA、および1：400のACVA-6501血清)であるが、体積は２倍で、 ペプチドは含まない。 ブロッキングインキュベーション後、４価ペプチドで被覆したプレートをTBS で５回洗浄した。ペプチド139、142および143を異なる濃度で含有する330μｌの 各チューブから、100μｌを被覆した３連のウェルに加えた。ペプチドを含まな い660μｌコントロールチューブからの３つの100μｌのアリコートを、被覆した ウェルにそれぞれ加えて、そして３つのさらなる100μｌのアリコートを、被覆 していないブランクウェルにそれぞれ加えた。プレートを、旋回振とう機(Rotat or Ｖ，American Dade，Miami，FL)上で、室温下にて40rev/分で１時間インキュ ベートし、次いでTBSで５回洗浄した。BSA/TBS中に1：1000に希釈したヤギ抗ヒ トIgG/アルカリホスファターゼ結合体(Cat．no．62-8422，Zymed，South San Fr ancisco，CA)を１ウェルあたり100μｌでマイクロプレートに添加した。室温で １時間のインキュベーションの後、プレートを再びTBSで５回洗浄した。新しく 調製した希釈PPMP基質溶液の100μｌ/ウェルの添加の後に、発色が起こった。PP MP(フェノールフタレインモノホスフェート、cat．no．P-5758，Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO)希釈溶液を、PPMP保存溶液(0.13M PPMP、7.8Mアミノ-2-メ チル-1-プロパノールをHClにてpH10.15に調整したもの)の水での1：26希釈物を 作製することによって調製した。30分後、50μｌ/ウェルの0.2M Na2HPO3(reagen t grade，Mallinckrodt，St．Louis，MO)を加えることにより、反応を停止させ た。マイクロプレートリーダー(Bio-Tek Instruments，Winooski，VT)にて550nm での吸光度の測定を行い、そして１ウェルあたりの加えたペプチドに対するA550 nm の結果をGraph Pad Prizm(Graph Pad Software，Inc.，San Diego，CA)を用い てプロットした。図11に示したように、水平の線は、モノマーペプチドの競合の 非存在下で得られた結合反応の最大半減に対応するように描かれた。50％阻害に 必要なペプチドの量を、試験したそれぞれのペプチドをプロットしたこの線の交 点から読みとり得る。50％阻害値を図12に示す。この結果は、N末端のAlaの欠失 は負の結果を有さなかったが、さらにGlyのさらなる欠失は、50％阻害を達成す るのに必要な濃度を約８倍に増大させたことを示す。 実施例６：αメチルプロリンの3B10への置換およびその結果得られるELISA ペプチドACA-6501/3B10、および３位、９位のプロリンをα-Me-Proに置換した そのアナログの試験を、実施例５に示した方法論を用いて行った。ペプチド3B10 、726(３位をα-Me-Proに置換したもの)、727(９位をα-Me-Proに置換したもの) 、728(３位、９位共にα-Me-Proに置換したもの)を、可溶性モノマーペプチドと して、４量体ペプチド3B10で被覆したマイクロタイトレーションプレートおよび ACA-6501血清を用いる競合結合ELISAで試験した。 マイクロタイトレーションプレートを、実施例５で記述したように４量体3B10 ペプチドで被覆した。試験される４個のペプチドそれぞれに対して、３種のペプ チド濃度をチューブに調製した。実施例５にあるように、これらの12個のチュー ブは、330μｌの最終容量において、0.5％ BSA/TBS、および1：400の最終的な希 釈度のACA-6501血清の最終濃度を有した。全てのペプチドストック溶液は、400- 500μｇ/ml TBSであった。30μｌの0.5％BSA/TBSおよび8.2μｌのACA-6501血清( 0.5％BSA/TBSにて1：10の比で希釈したもの)を含むチューブに、４種のペプチド ストック溶液のそれぞれから１μｌ、４μｌ、または16μｌのアリコートを加え た。さらに最終容量が330μｌとなるように、適切な容量のTBSを加えた。競合ペ プチドを含まないコントロールチューブを、最終容量660μｌとなるように実施 例５に記載した通りに調製した。 ４価のペプチド被覆プレートのブロッキングインキュベーションを行った後、 ４種のペプチドのそれぞれのペプチド濃度のチューブ、ならびにペプチドを含ま ないコントロールチューブ、さらにブランクコントロールのチューブから３つの 100μｌのアリコートを、実施例５に示したように試験した。マイクロタイトレ ーションプレートELISA手順ならびにデータ運用を、実施例５に記載のように行 った。図13に示したように、９位をα-Me-Proに置換したペプチド727は、非改変 ペプチド3B10、または両方のプロリンを変えたアナログ(ペプチド728)よりも有 意に活性であった。３位を置換したペプチド726は、置換の結果として活性を失 った。 実施例７：6626 抗体およびそれに対応する配列を用いるスクリーニングの簡単な 説明 アフィニティー精製したACA-6626(AffACA-6626)を、以前に記載されたように8 mlのACA-6626血漿からアフィニィティー精製により単離した。AffACA-6626(10μ ｇ)を、ACA-6501生物選択に関して前述したように、最終容量100μｌの全てのp- III成分ライブラリーのプールからなるエピトープxy'zファージライブラリーと ともにインキュベートした。３回の生物選択の後、２回目、３回目の試料から無 作為に選択したファージを、マイクロ選択により試験した。わずかなクローンの みが、１：1000の希釈度で弱いながらも免疫陽性であった。さらに４回目の生物 選択を行った。94個の４回目のクローンのマイクロ選択により、43個の免疫陽性 が明らかとなり、いくつかは1：100,000程の高いファージ希釈度でも陽性であっ た。ACA-6501に関して前述したように、43個の免疫陽性クローンのG-トラッキン グDNA配列決定を行ったところ、５個の独特の配列が明らかとなった。慣習的な ４塩基DNA配列決定の後、表３の翻訳アミノ酸配列を得た。 実施例８：患者6644由来のACAに特異的な配列の同定 epixy'zファージディスプレイライブラリーを、患者番号6644からACAアフィニ ィティー精製した抗体を用いて実施例４と同様の方法でスクリーニングした。ペ プチド合成の前に、最終的な同定工程段階として前述のコロニーブロットアッセ イを用いた。約150個のコロニーを元のニトロセルロースメンブラン上にプレー トし、そしてアッセイした。患者6644由来の抗体を、1μｇ/mlの濃度で用いた。 ニトロセルロースメンブラン上にプレートし、そしてアッセイした150個のコロ ニーのうち、このスクリーニングにおいて４個だけが強力な陽性であり、２個が 弱い陽性であった。このスクリーニングにより選択された６個の陽性ファージの インサートの配列決定により、インサートが、以下の遊離アミノ末端(epiz)を有 する８merライブラリーに由来することを示した： 実施例９：ACA-6641 を用いるファージライブラリースクリーニングの要旨 AffACA-6641を、患者番号6641から採取した4mlの血漿から単離した。前述のよ うに、最終容量100μｌで、AffACA-6641(10μｇ)をプールしたp-IIIファージラ イブラリーと共にインキュベートした。４回の生物選択後、３回目および４回目 からの45個のクローンを、マイクロ選択により試験した。45個のうち、23個は陰 性であった。３回目のファージは、２個のクローンが4+のスコアであり、２個が 3+のスコアであり、そして２個が2+のスコアであった。４回目からは、１個のク ローンが4+のスコアであり、１個が3+のスコアであり、そして３個が2+のスコア で あった。G-トラッキングDNA配列決定により、６個の独特の配列が示された。ク ローン3G3の一つだけが、ファージ捕獲ELISAで強い陽性であった。４塩基DNA配 列決定から、次のような翻訳ペプチド配列を得た。 CLGVLGKLC. 実施例10：非免疫原性多価キャリアーへのペプチド結合 B細胞寛容原の発生のためのいくつかの４価プラットフォームは、共同所有さ れ、そして同時係属中の米国特許出願番号第08/118,055号（1993年９月８日出願 ）、同第08/152,506号（1993年11月15日出願）、米国特許第5,268,454号、同第5 ,276,013号および同第5,162,515号（これらは全体が本明細書中に参考として援 用される）に記載されるように開発した。エピトープライブラリーのaPL抗体ス クリーニングにより選択された候補ペプチドを結合させ、抗体結合のような免疫 化学的挙動の変化について試験した。 アミン基を有する非免疫原性多価プラットフォームを、次のスキームに示され るように合成する。プラットフォーム上のアミン-ペプチド上のカルボキシル 化台物２： 無水エタノール50ml中に8.0g(5.7mmol)の１の溶液および35mlのシ クロヘキセンの溶液を窒素下に配置し、そして炭素上の10％Pd 500mgを加えた。 混合物を、撹拌しながら２時間還流した。冷却する際に、混合物をセライトを通 遊離カルボキシル基で保護されたペプチド(PHN-peptide-CO2H ペプチドを、トリフルオロ酢酸(TFA)安定性保護基(カルボキシル基上のベンジ ルエステルまたはシクロヘキシエステルおよびアミノ基上のカルボベンジルオキ シ(CBZ))を用いて、Wang(p-アルコキシベンジル)樹脂におけるFMOC化学を用いて 、標準的な固相法で合成する。アミノ酸残基をアミノ末端に逐次添加する。ペプ チドを、TFAで樹脂から取り出し、カルボキシル末端に１つの遊離カルボキシル 基を有するペプチドを提供し、そして他の全てのカルボキシル基およびアミンを ブロックする。保護されたペプチドは逆相HPLCにより精製する。 ペプチド-プラットフオーム結合,４ 保護されたペプチド(0.3mmol)を、１mlのジメチルホルムアミド（DMF）に溶解 し、そしてその溶液に0.3mmolのジイソプロピルカルボジイミドおよび0.3mmolの 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(HOBT)を加える。この溶液を、1ml DMF 中の0.025mmolのテトラアミノプラットフォーム２の溶液を加える。完了後、粗 製の完全に保護された結合体３を得るために、真空下でDMFを取り出す。結合体３ を１時間0℃でアニソールの存在下でフッ化水素酸(HF)と反応させることで結 合体４を得る。精製を調製用逆相HPLCにより達成する。 以下のスキームは、プラットフォーム上のカルボキシル基へのペプチドのアミ ノ基の結合を示す。 化合物５-４個のカルボキシル酸基を有するプラットフォーム コハク酸無水物(1.0g，10mmol)を、861mg(1.0mmol)の２および252mg(3.0mmol) のNaHCO3を含む1/1ジオキサン/H2O 20ml溶液に加え、そしてその混合物を室温で 16時間撹拌する。混合物を1N HClで酸性にし、そして濃縮する。濃縮物を、シ リカゲルクロマトグラフィーにより精製して５を提供する。 遊離アミンで保護されたペプチド（H2N-ペプチド-CONH2） ペプチドを、アミド樹脂上で標準的な固相法を用いて合成する。これは、TFA 安定性保護基(カルボキシル基上のベンジルエステルまたはシクロヘキシルエス テルおよびアミノ基上のCBZ)を用いて樹脂から切断した後にカルボキシ末端アミ ドを得る。アミノ酸残基を、標準的なFMOC化学を用いてアミノ末端に逐次付加す る。トリフルオロ酢酸を用いてペプチドを樹脂から取り出し、遊離アミンリンカ ーを有する保護されたペプチドを提供する。保護されたペプチドを、逆相HPLCを 用いて精製する。 ペプチド-プラットフォーム結合体,７ 1mlのDMF中に、0.05mmolの遊離アミンで保護されたペプチド(H2N-ペプチド-CO NH2)、0.1mmolのジイソプロピルエチルアミン、および0.01mmolの５を含む溶液 を調製する。BOP試薬(ベンゾトリアゾル-1-イルオキシ-トリス(ジメチルアミノ) ホスホニウムヘキサフルロホスフェート)(0.1mmol)を加え、そして混合物を分析 HPLCにより証明されるように、反応が完了するまで撹拌する。ペプチド保護基を 、0℃でアニソールの存在下でHFで処理することにより除去し、保護基が除去さ れた結合体の７を得る。化合物７を、調製用逆相HPLCにより精製する。 以下のスキームは、如何にしてメルカプト基リンカーをペプチドのアミノ末端 に結合させ、次に、如何にしてペプチド/リンカーをテトラブロモアセチル化プ ラットフォームに結合させて、化合物13を得るか示す。プラットフォーム上のハロアセチルおよびペプチド上のスルフヒドリル 化合物９ 濃硫酸(100μｌ)を、4.48g(17.2mmol)のトリフェニルメタノールおよび1.62g( 15.3mmol，1.3ml)の3-メルカプトプロピオン酸を含有する60℃の35mlのEtOAc溶 液に加えた。混合物を60℃で10分間撹拌し、室温(RT)に冷却して、１時間氷上に 置いた。得られた白色固体を、濾過により回収して4.52g(75％)の９を得た。化合物10 ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(2.41g，11.7mmol)を、2.72g（7.8mmol )の９および1.08g(7.8mmol)のp-ニトロフェノールを含有する０℃の41mlのCH2Cl2 溶液に加えた。混合物を16時間撹拌し、室温まで戻した。混合物を濾過してN,N -ジシクロヘキシルウレア(DCU)を除去し、濾過物を濃縮した。残渣をヘキサン/C H2Cl2から結晶化させて、淡い黄色の結晶として3.17g(86％)の10を得た。化合物11−結合したメルカプトプロピオニルリンカーを有する環状チオエーテル ペプチド 環状チオエーテルペプチド(一つのイオウをCH2に置換した環状ジスルフィドペ プチドのアナログ)および炭酸ナトリウムを含む水ならびにジオキサンを、p-ニ トロフェニルエステル10で試験した。ペプチドがリジンを含む場合、それは適切 にブロックされなければならない。生じた修飾ペプチドをトリフルオロ酢酸と反 応させて、チオールリンカー修飾ペプチド11を得た。化合物13−環状チオエーテルペプチドとブロモアセチル化プラットフォームとの 結合体 0.10mmolのチオール修飾ペプチド11を含有するHe散布された100mMホウ酸ナト リウムpH9溶液に、9/1 MeOH/H2O中の40mg/mlとして0.025のブロモアセチル化プ ラットフォーム12を加えた。溶液を、HPLCにより証明されるような結合が完了す るまで、N2窒素雰囲気下で撹拌した。結合体を逆相HPLCにより精製した。 実施例12：LJP685 の合成 γ-ブロモ-N-BOC-α-アミノブチル酸t-ブチルエステル、化合物14：40mlの乾燥T HF中に4.03g(13.3mmol)のN-BOC-グルタミン酸-α-t-ブチルエステルおよび1.61m l (1.48g，14.6mmol)のN-メチルモルホリンを含む溶液を、N2雰囲気下で15℃ま で冷却した。この混合物にイソブチルクロロホルメート(1.73ml，1.82g，13.3mm ol)を滴下した。混合物を10分間撹拌し、そして8mlのTHF中に2.03g(16.0mmo l)のN-ヒドロキシ-2-メルカプトピリジンを含む溶液を加え、さらに2.23ml Et3N (1.62g，16.0mmol)を加えた。光を遮るために混合物をホイルで覆い、そして室 温で１時間撹拌した。混合物を濾過し、そして濾過物を光に極力曝さないように 注意しながらロータリーエバポレーターで濃縮した。濃縮物を20mlのBrCCl3に溶 解させ、そして溶液を−70℃まで冷却した。固体を真空下に置き、次いでN2でパ ージし、室温に戻し、20℃の水浴に置いた。その後上方近距離から500Wの太陽灯 を５分間照射した。混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、シリカゲルク ロマトグラフィー(40mm×150mm，トルエンをUV活性物質が溶出し終わるまで溶離 剤として用いた。2％ EtOAc/トルエン(500ml)，5％ EtOAc/トルエン(500・l))に よって精製した。未精製の分画を再度精製した。TLC(Rf0.23，5％ EtOAc/トルエ ン)による精製画分を混合し、そして濃縮して、油状固体として3.23g（72％)の 化合物14を得た。N-BOC- グリシルプロリン-4-ニトロフェニルエステル，化合物15 ：82mlの乾燥THF 中に3.0g(11.6mmol)のN-BOC-グリシルプロリンおよび1.93g(13.9mmol)の4-ニト ロフェノールを含有する溶液を0℃まで冷却し、3.34g(16.2mmol)のDCCを加えた 。混合物を0℃で１時間撹拌し、氷浴を取り除き、混合物を室温で16時間撹拌し た。混合物にHOAc(579μｌ)を加え、そして30分間撹拌した。混合物をフリーザ ーに30分間置いた後、真空濾過した。濾過物を濃縮し、そしてシリカゲルクロマ トグラフィー(18×150mmベッド，2.5％ EtOAc/97.5％ CH2Cl2/1％ HOAc)を用い て精製した。微量の酢酸を、ロータリーエバポレーターで数回ジオキサンから濃 縮することで除去した。濃縮物を、3/1ヘキサン-Et2Oを加えて摩砕し、生じた白 色固体を濾過により回収して4.1g(90％)の化合物15を白色固体として得た；T N-FMOC-S-t- ブチルチオシステインアミド、化合物16： 115mlのTHF中に、5.0g( 11.6mmol)のFMOC-S-t-ブチルチオシステインおよび1.33g(11.6mmol)のN-ヒド ロキシスクシンイミドを含む溶液を0℃に冷却した。溶液に3.58g(17.37mmol)のD CCを加えた。混合物を、0℃で1時間攪拌し、50mlの水中に1.6gの(NH4)HCO3を含 む水溶液を42.9ml加えた。この混合物を4.5時間攪拌し、氷浴から徐々に室温に 戻しロータリーエバポレーターで濃縮してTHFを除去し、白色固体を有する水相 を生じた。この混合物に200mlのCH2Cl2を加え固体がほとんど溶解するまで攪拌 し、100mlの1N HClを加えて振った。CH2Cl2層を100mlの飽和NaHCO3溶液で洗浄し 、(Na2SO4)で乾燥し、濾過した。濾液をホットプレート上で沸騰させ、CH2Cl2ヘ キサン300mlから結晶化させて4.36g(87％)の白色固体の化合物16を得 化合物17：2.91g(6.75mmol)の化合物16を含有する33.8mLのジオキサンに水（16. 9mL）を添加し、そしてこの溶液を窒素を5〜10分間導入した。この混合物を窒素 雰囲気下で保持し、そしてこの混合物に1.13gのNaHCO3（13.5mmol）を添加し、 その後1.77mLのPBu3（1.44g、7.09mmol）を添加した。この混合物を室温で1時間 攪拌し、1×100mLの1N NaClと2×100mLのCH2Cl2との間で分配した。CH2Cl2層を 組み合わせ、濃縮し、そして生じた白色個体を33.8mLのジオキサンに部分的に溶 解した。水（９mL）を添加し、5〜10分窒素でパージした。混合物を窒素雰囲気 で保持し、2.17gのK2CO3（16.9mmol）を添加し、その後2.63g（8.1mmol）の化合 物14を添加した。混合物を16時間攪拌し、そして1×100mLの1N HCl水溶液と2×1 00mLの10％ MeOH/CH2Cl2との間で分配した。CH2Cl2層を組み合わせ、NaSO4で乾 燥し、濾過し、そして濃縮して半固体の残渣を得た。シリカゲルクロマトグラフ ィー（1/3 CH3CN/CH2Cl2）での精製により、3.2g（80％）の化合物17を白色固体 として得た；TLC Rf0.27、1/3 CH3CN/CH2Cl2。分析サンプルのさらなる精製をヘ キサン-EtOAcから再結晶することにより行った；融点104〜106.5℃； 化合物18： 20/1/1 TFA/H2O/メルカプトエタノールの溶液（23.2mL）を1.27g（ 2.11mmol）の化合物17に添加した。混合物を室温で1時間攪拌し、約3mL容量に濃 縮した。50mLのエーテルを添加して生成物を沈殿させた。生じた固体をさらに２ 倍のエーテルで洗浄し、そして減圧下で乾燥して812mgの固体を得た。固体を10. 6mLのジオキサンおよび10.6mLのH2Oに懸濁した。NaHCO3（355mg、4.22mmol）を この混合物に添加し、その後1.33g（3.38mmol）の化合物15を含む10.5mLのジオ キサンの溶液を添加した。この混合物を室温で20時間攪拌し、そして100mLの1N HClと3×100mLのCH2Cl2との間で分配した。組み合わせたCH2Cl2層を乾燥し（Na2 SO4）、濾過し、そして濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによる精製（3 5×150mm、段階的勾配、5/95/1〜10/95/1のMeOH/CH2CL2/HOAc（1L））。純粋な 画分を濃縮し、残渣をエーテルで摩砕して881mg（60％）の化合物18を得た。TLC Rf0.59、10/90/1 MeOH/CH2Cl2/HOAc;融点116〜117.5℃； N-FMOC-L- アラニル-L-2-メチルプロリン、化合物19：2-メチルプロリン（Seebac hら（1983） J．Am．Chem．Soc．105:5390-5398）（1.00g、54.75mmol）、4.00 g（47.6mmol）のNaHCO3、および31mg（0.23mmol）のHOBTを含有する6.9mLのDMF 溶液を０℃に冷却し、そして3.18g（6.66mmol）のN-FMOC-L-アラニンを添加した 。反応物を、０℃で1時間、次いで室温で18時間攪拌した。混合物を50mLのEtOAc と3×50mLの1N HClとの間で分配した。EtOAc層を乾燥し（MgSO4）、濾過し、そ して濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（段階的勾配45/55/1 EtOAc/ヘキ サン/HOAc〜47/53/1 EtOAc/ヘキサン/HOAc〜50/50/1 EtOAc/ヘキサン/HOAc）に よる精製によって、1.72g（86％）の化合物19を白色固体として得た。生成物を 、微量の酢酸を除去するためジオキサンから数回濃縮した：融点59〜60℃； N-FMOC-L- ロイシニル-HMPB-MBHA樹脂：N-FMOC-L-ロイシンを含む22.5mLのCH2Cl2 の溶液および数滴のDMFを調製し、そして０℃に冷却した。この溶液に、1.71mL （1.38g、10.9mmol）のジイソプロピルカルボジイミド（DIC）を添加し、そして 混合物を０℃で20分間攪拌した。混合物を濃縮して油状にした；その間に、十分 なDMF（約3mL）を2.5ｇ（0.87mmol/g、2.18mmol）のHMPB-MBHA樹脂（Nova Bioch em）に添加して樹脂を膨潤させた。濃縮した油を最小量のDMF（約1mL）に溶解 し、そして膨潤させた樹脂に添加し、続いて266mg(2.18mmol)のDMAPを約1mLのDM Fに溶解した。混合物を1時間穏やかに振盪し、そして洗浄した（2×DMF、2×MeO H、2×DMF、2×MeOH）。樹脂を減圧下で乾燥させて2.77g（85％）を得、そして 置換量をGeisen試験によって0.540mmol/gであると決定した。アスパラギン酸にt-ブチルエステルおよびアルギニンにPmc基を有し、そしてチ オエーテル挿入を有する、N-FMOC-直鎖状ペプチド、 化合物20：このペプチドを 、N-FMOC-L-ロイシニル-HMPB-MBHA樹脂上での標準的なFMOC合成法により調製し た。化合物18のカップリング工程を除いて３等量のアミノ酸、HOBT、および（DI C）を各々のカップリング工程に使用した。化合物18の２等量を、３等量のHOBT およびジイソプロピルカルボジイミドとともに使用した。各工程を、10μＬのブ ロモフェノールブルー指示薬を使用することによってモニターした。反応の完了 をまた、ニンヒドリン試験（1mgを、ピリジン１滴、および５％のニンヒドリン を含有するEtOH１滴、および80％フェノリンEtOH１滴とともに100℃で2分加熱す ると、反応が完結していないビーズが青色に変化する）により評価した。従って 、1.13mg（0.613mmol）の樹脂をペプチドを調製するために使用した。最後のカ ップリング工程後、１％トリフルオロ酢酸を含有するCH2Cl2溶液15mLでの２分間 の処理によって樹脂からの切断を達成した。２分後、溶液を、30mLの10％ピリジ ン含有MeOH溶液に、加圧下で濾過した。これを10回繰り返し、そしてHPLC（C18 、勾配、60/40/0.1 CH3CH/H2O/TFA〜90/10/0.1、CH3CN/H2O/TFA 210mn、1mL/分 、4.6mm×250mmカラム）で確認されるようにペプチドを含む濾液を組合せ、そし て濃縮した。濃縮物を、10％のHOAc溶液40mLに溶解し、そしてHPLCで精製して0. 528g（49％）のペプチド20を得た。ペプチド20の環状ペプチド21への変換（FMOC基の除去、保護基の環化および除去 ）： 99μＬのDBUを含む10mLのCH3CN溶液（5mL）を、96mg（0.052mmol）のペプ チド20に添加した。この溶液を1時間攪拌し、そして残渣に濃縮した。この残渣 を2×10ｍLのEt2Oで摩砕して白色固体を得た。固体を100mLのCH3CNおよび0.1Mの ジフェニルフォスフォリルアジド（DPPA）を含有するCH3CN溶液312mL（0.312m mol）に溶解した。混合物を20時間攪拌し、ロータリーエバポレーターで濃縮し た。残渣を2×50mLのEt2Oで摩砕し、そして不透明の白色の残渣を、92/3/2/3 TF A/アニソール/EDT/Me2S ５mLで1時間処理した。生成物を、50mLのポリプロピレ ン遠心分離管中で、混合物を40mLのEt2Oに添加することによって沈殿させた。沈 殿物を０℃に冷却し、そして2000rpmで５分間遠心分離した。上清をデカントし 、ペレットをEt2Oで洗浄し、そして再び遠心分離した。ペレットを乾燥させ、４ mLの50/50 CH3CN/H2Oに溶解した。この混合物を36mLのH2O/0.1％ TFAで希釈し、 濾過し、そしてHPLC（1”C18カラム、勾配、10/90/0/1 CH3CN/H2O/TFA〜35/65/0 .1、CH3CN/H2O/TFA 230nm）によって精製した。HPLCで確認しされるような純粋 な画分を凍結乾燥して52mg（90％）の化合物21を得た。 実施例13:LJP 685の結合体の合成 LJP 685（化合物21とも呼ばれる）を、3-トリチルメルカプトプロピオン酸のP NPエステルで処理し、そして生じた生成物を脱トリチル化して遊離のチオールリ ンカーを有するペプチドである化合物22を得た。原子価プラットフォーム分子12 との過剰な化合物22の反応により、４価の結合体25が生じた。化合物21のより長 いリンカー（化合物33(以下の反応スキームを参照)）での処理、続く脱トリチ ル化により、化合物24を得た。化合物24は原子価プラットフォーム分子12と反応 して４価結合体26を生じた。両方の結合反応がHPLCにより非常にはっきりと示さ れた。LJP 685 へのMTUリンカーの結合、化合物24の合成： 15mg（0.013mmol）の化合物2 1 を、29.5mgの化合物23および17.5μＬのジイソプロピルエチルアミンを含む0.5 mLのDMF溶液160μＬに添加した。この混合物を２時間攪拌し、Et2Oによって沈殿 させた。沈殿を乾燥し、650μＬの1/1/0.056/0.040 TFT/CH2Cl2/チオフェノール /Me2Sに溶解し、そしてこの溶液を1時間放置した。Et2Oによる沈殿は、HPLC（C1 8 、15-45％ CH3CN/H2O/H2O、0.1％TFA）によって精製された粗化合物24を生じた 。純粋な生成物を含む画分を凍結乾燥して、8.6mgの化合物24を白色固体として 得た。LJP 685-MTU-AHAB-TEG 、化合物26： 8.6mg(6.3×10-6mol)の化合物24を含む、He を導入したpH8.5、200mMホウ酸緩衝液630μＬの溶液に、化合物12の40mg/mLの溶 液を含有する40μＬの9/1 MeOH/H2Oを添加した。この混合物を24時間攪拌し、そ して１mLの10％ HOAc/H2O溶液を添加した。混合物をHPLC（C18、勾配25-55％ CH3 CN/H2O/水、0.1％TFA）で精製して、8.3mgの化合物26（LJP 685-MTU-AHAB-TEG ）を得た。 実施例14：拡張SHリンカーの作製 チオ安息香酸エステル（化合物28）を化合物27から調製した。化合物28を部分 的に化合物29に変換した。チオ安息香酸をエタノール分解によって除去し、得ら れたチオールをトリチル化した。次いでエチルエステルを加水分解して化合物29 を得た。ニトロフェニルホスフェート（PNP）エステル（化合物30）を化合物29 から調製した。アミノトリオキソウデカン酸エチルエステル（化合物31）を、化 合物27をアジ化ナトリウムでの処理およびアミンへの還元によって調製した。ア ミン3-1を化合物3-0でアシル化して化合物32を提供した。化合物32の加水分解を 、水酸化ナトリウムでの処理によって行い、遊離のカルボン酸を得た。中間体の カルボン酸をp-ニトロフェノールと縮合させてパラ-ニトロフェニル（PNP）エス テ ル（化合物33）を得た。リンカー33をペプチドに結合させ、そしてトリチル基を 除去して化合物34を得た。これを、MTU-ATU-AHAB-TEG結合体の生成に使用した。 実施例15：(LJP685)4/MTU-ATU-AHAB-TEG 結合体（化合物35）の合成 ４価結合体35を以下に示すように調製した。結合させたリンカーを有するペプ チド（化合物34）を、Heを導入したpH8.5、200niMのホウ酸緩衝液に溶解した。 この混合物に、0.3モル当量のプラットフォーム化合物1-2を添加した。この混合 物を１時間攪拌し、そして生成物をHPLCによって精製した。実施例16：(LJP685)4/DABA-PEG 結合体（化合物36）の合成 8.5ホウ酸緩衝液中でIA-DABA-PEGを化合物24で処理して結合体36を得た。 実施例17：活性化についてのＴ細胞アッセイ ペプチドで刺激されたＴ細胞によるトリチウム化チミジンの取り込みを、96ウ ェル丸底プレート中でモニターした。5×105個の、排出するリンパ節細胞（マウ ス）または単離した抹消血液リンパ球（ヒト）の単一細胞懸濁液を、１ウェルあ たり150μｌの最終容量で１〜30jigの間のペプチドと混合し、５％のCO2中で37 ℃で５日間インキュベートした。この時点で、１マイクロキュリーの標識化した チミジンを添加し、そしてさらに15〜24時間インキュベートした。回収した細胞 をフィルター上に集め、そして液体シンチレーション分光測定機で計数した。 実施例18：耐性のインビトロ誘導 ５匹のC57B1/6マウスをそれぞれ含む８つの群を、ミョウバンおよびアジュバ ンドとしてのB．pertussisワクチンについて、10μｇ/マウスのLJP685-KLHの結 合体で初回抗原刺激した。３週間後、脾臓を採取し、そして単一細胞懸濁液を調 製して、平衡化塩溶液で3回洗浄し、そして1.5mL培地あたり1個の脾臓に相当す る濃度で完全RPMI-1640培地に再懸濁した。細胞懸濁液をペトリ皿あたり2.5mLの アリコートに等分し、そして(LJP685)4-DABA-PEG（化合物36）および(LJP685)4- TEG（化合物35）とともに（濃度はそれぞれ100μＭ、20μＭ,および4μＭ）、37 ℃で２時間インキュベートした。細胞の１つの群を寛容原なしでインキュベート し、そして陽性コントロールとして作用した。次いで細胞を大容量の平衡化塩溶 液で洗浄し、そして2.5mLの平衡化塩溶液に再懸濁した。次いで、細胞を、所定 の処理群由来の全ての細胞をそれぞれ５つのレシピエントに分ける様式で、650R 照射同系レシピエントマウスに注射した。次いで、陽性コントロールを含むすべ てのレシピエントマウスを、生理食塩水中の10μｇのLJP 685-KLHを腹膜内に追 加免疫を行った。追加免疫の７日後にマウスを採血し、そしてそれらの血清を抗 LJP 685抗体の存在について試験した。両方のの結合体での処理が、図16および1 7に示されるような、抗LJP 685抗体の有意な投与量依存性の減少を生じた。これ は、HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY、第２巻、Cellular Immunology（We ir,D.M.編、Blackwell Scientific Publications、Palo Alto、CA、1986）のIve rson,G.Mの「Assay for invivo adoptive immune responses」に記載の、Antig en Bi nding Capacity（ABC）によって測定される。 実施例19：5A12 、CB2、3G3ペプチドのNMR溶液構造の分析 先の実施例に記載の方法論を使用するファージライブラリースクリーニングに より単離した２つのペプチドを、NMR分析に供した。元のペプチドは最後から２ 番目の位置にプロリンを有するが、二次元（2D）２量子フィルター相関分光法（ DQF-COSY）NMRデータがこの位置でシスおよびトランスアイソマーに由来する２ つの異なる構造の存在を示唆するために、このアミノ酸を除去した。プロリンの 除去は、ACA抗体への結合について50-100nMの範囲のKDを有するペプチドを生じ 、そしてDQF-COSYスペクトルのフィンガープリント領域内のピークの数が予想さ れる。得られた環状ペプチドは5A12（GPCLILAPDRCG）およびCB2（GPCILLARDRCG ）である。これらのペプチド間の主要な差異は、８位でのアルギニンのプロリン への置換であった。これは、CB2の1D 1H NMRスペクトルでの分散がずっと小さく 、これは5A12がより堅固なペプチドであることと一致した。アルギニン置換はま た、pKa値において反映されるようなイオン化したアスパルチルカルボキシル基 の0.55kcal/molの安定性を生じた。構造分析をより高次の5A12ペプチドについて 行った。重水素交換および温度係数のデータは水素結合の形跡を示さないが、核 オーバーハウザー効果（Nuclear Overhauser Effect，NOE）、回転オーバーハウ ザー効果（Rotating Overhauser Effect、ROE）、およびカップリングデータは １つの構造と一致している。距離幾何計算では50の構造のファミリーを得た。上 位15のものは、2.1±0.2オングストロームのすべての原子について平均の根平均 二乗偏差（RMSD）を有した。本発明者らは、このペプチドが分子の両方の末端、 ジスルフィド、およびシスであるプロリン８でターンを有する卵形を有すること を決定した。骨格のLIL領域にはよじれもまた存在する。最後に、残基のみが陽 性の残基内NOEを有するので、カルボキシ末端のグリシンは非常に可動性である 。これはβ2-GPI上のACAエピトープを模倣するペプチドについて決定された最初 の構造情報を示す。 距離幾何計算と合わせたNMRデータを、ペプチド925（CLGVLAKLC）、925ペプチ ドの６位でアラニンがグリシンに置換された短縮型のペプチド3G3（AGP CLGVLGK LCPG）の3次元構造を決定するために使用した。ペプチド925の構造をpH3.8およ び25℃の水中で決定した。９つの構造の組立が計算され、そのすべてがNMRデー タと一致した。水素でない全ての原子についてのRMSDは、それぞれの構造を重心 と比較した場合、2.45±0.36オングストロームであった。図18は、組立の重心に 最も近い構造、つまりペプチド925分子の形状を合理的に表す構造を示す。図19 は、ペプチド925（図の下に3G3として標識される）とペプチド5A12の構造とを比 較する。両方のペプチドが、ペプチド配列のほぼ同じ位置にターンを有する。 ペプチドの薬物伝達物が小さな疎水性基および正に帯電した基としておよそ見 当がつけられている。図20に示すように、ペプチド925の、gem-ジメチル基およ びアミノ基がこのペプチドの薬物伝達物基としてほぼ見当がつけられている。い くつかの骨格に薬物伝達基をつなぎ止める炭化水素リンカーは図20で特定される 長さを有し、そしてこれらのリンカーが骨格に結合される点は特定された距離で 離される。最後に、二つのリンカーの相対的な方向を規定する二面角は22°であ ることを決定した。 実施例20：TEG カルバメートリンカーの合成 2-[2-(2-tert- ブチルチオエトキシ)エトキシ]エタノール、化合物38：氷浴中で 冷却した2-[2-(2-クロロエトキシ)エトキシ]エタノール（11.0g、65.24mmol）お よびtert-ブチルチオール（7.35mL、65.23mmol）の混合物に、1,8-ジアザビシク ロ[5.40]ウンデカ-7-エン（DBU,9.75mL，65.23mmol）をゆっくりと添加した。反 応混合物を室温まで暖め、そして一晩撹拌した。次いで、この混合物を酢酸エチ ルで希釈しそして濾過した。濾液中の粗生成物を、酢酸エチルで溶出した濾過カ 2-[2-(2-tert- ブチルチオエトキシ)エトキシ]エチルp-ニトロフェニルカーボネ ート、化合物39 : 氷浴中で冷却した５mLの乾燥THF中の化合物38（2.0g、8.98mmol）およびp-ニト ロフェノールクロロホルメート（1.81g、8.98mmol）の溶液に、１mLの乾燥THF中 の乾燥ピリジン（0.73mL、8.98mmol）をゆっくり添加した。白色沈殿が、すぐに 生成した。室温で15分撹拌した後、反応混合物を10mLのエーテルで希釈し、そし て濾過した。濾液を濃縮し、そしてさらに精製を行わずにペプチド合成に直接使 用した。 実施例21：四価プラットホーム１A/DABA/ATEGの合成、46 ビス-Ｎ-(ｔ-ブトキシカルボニル)-ジアミノ安息香酸、化合物40 :5.5mLのMeOH中 の7.18g(32.9mmol)のジ-t-ブチルジカーボネートの溶液を、44.5mLのH2Oおよび2 2.5mLのMeOH中の2.5g(16.4mmol)の3,5-ジアミノ安息香酸および2.76g(32.9mmol) のNaHCO3の溶液にゆっくりと添加し、そして混合物を室温で24時間撹拌した。混 合物を０℃に冷却し、そして6.53gのクエン酸を添加し、そして混合物をEtOAcで 抽出した。混合したEtOAc層を乾燥(MgSO4)し、濾過し、そして濃縮した。残渣を 40mLのEt2Oに溶解し、そして溶液をCeliteを通して濾過した。Et2O層を40mLのHC lで２回抽出した。Et2O層を乾燥(MgSO4)し、濾過し、そして濃縮し、ピンク色の 泡沫状固体として3.81g(66％)の40を得た。化合物40のＮ-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、化合物41： ジシクロヘキシルカルボジイミド(3.34g、16.2mmol)を、０℃に冷却した55mL のEtOAc中の3.8g(10.8mmol)の化合物40および1.24g(10.8mmol)のＮ-ヒドロキシ スクシンイミドの溶液に添加し、そして得られた混合物を、室温まで上昇させな がら18時間撹拌した。混合物を0.55mLの酢酸に添加した。混合物を30分間撹拌し 、そして２時間フリーザー中に配置した。混合物を濾過して固体を除去し、そし て濾液を濃縮し、5.80gのピンク色の泡沫状固体を得た。シリカゲルクロマトグ ラフィー（60/40/1 ヘキサン/EtOAc/HOAc）による精製により、4.30g(89％)の化 合物41を、薄いピンク色の固体として得た。モノ-Ｎ-（ｔ-ブトキシカルボニル）-エチレンジアミン、化合物42 ：15mLのCH2C l2中の1.5g(25.0mmol)のエチレンジアミンの溶液を０℃に冷却し、そして1.82g( 8.33mmol)のジ-t-ブチルジカーボネートの溶液を混合物にゆっくり添加した。混 合物を室温で18時間撹拌し、そして濾過し、濾液を濃縮した。シリカゲルクロマ トグラフィー(90/10/1 CH2Cl2/MeOH/HOAc)による精製により、0.98g(67％)の化 合物42を油として得た。ビス-Ｎ-(ｔ-ブトキシカルボニル)-アミノ-TEG、化合物43 ：６mLのCH2Cl中の750 mg(4.25mmol)の化合物42および345uL(337mg、4.25mmol)のピリジンの溶液に、44 5uL(559mg、2.02mmol)のトリエチレングリコールビス-クロロホルメートを添加 した。混合物を3.5時間撹拌し、そして混合物を、35mLのCH2Cl2と35mLの１Ｎ HC lとの間で分配した。CH2Cl2層をH2Oで洗浄し、そして乾燥し(Na2SO4)、濾過し、 そして濃縮し、1.14gの粗製化合物43を得、これを次の工程に直接使用した。ジアミノ-TEGビス-トイフルオロ酢酸塩、化合物44 ：300mg(0.57mmol)の化合物43 を3.5gのCH2Cl2に溶解し、そして3.5mLのトリフルオロ酢酸を添加した。混合物 を３時間室温で撹拌し、そして溶液を濃縮し、398mgの粗製化合物44を得、これ を次の工程に直接使用した。化合物45 ：6mLのジオキサン中の567mgの化合物41の溶液を、398mgの粗製、化合 物44(約316mg,0.57mmol)および193mg(2.30mmol)のNaHCO3の溶液に添加した。混 合物を３時間撹拌し、そして１Ｎ HClで酸性化し、そして20mLの１Ｎ HClと30mL のEtOAcとの間で分配した。混合したEtOAc層を飽和NAHCO3溶液で洗浄し、乾燥(M gSO4)し、濾過し、そして濃縮し、490mg(86％)の粗製化合物45を白色泡沫状固体 として得る。シリカゲルクロマトグラフィー(EtOAC)による精製により、276mg(4 8％)の化合物45を白色泡沫状固体として得た。IA/DABA/ATEG 、化合物46 ：100mg（0.1mmol）の化合物45の溶液を調製し、そし て１mLのトリフルオロ酢酸を添加し、そして混合物を１時間室温で撹拌した。混 合物を減圧下で濃縮した。残渣をEt2Oで粉末化し、そして減圧下で乾燥し、白色 結晶性固体を得た。固体を１mLのDMFに溶解し、104uL(77mg,0.6mmol)のジイソプ ロピルエチルアミンを添加し、混合物を０℃に冷却し、そして212mg(0.6mmol)の 無水ヨード酢酸を添加した。氷浴を除去し、そして混合物を室温で２時間撹拌し た。混合物を０℃に冷却し、１Ｎ H2SO4で酸性化し、そして10mLの１Ｎ H2SO4と ６×20mLの8/2 CH2Cl2/MeOHの溶液との間で分配した。混合した有機層を乾燥(Mg SO4)し、濾過し、そして濃縮し、330mgのオレンジ色の油を得た。分取HPLC(25cm ×22.4mm Ｃ18、勾配：30％Ｂ〜40％Ｂ 0〜40分,Ａ＝H2O/0.1％TFA,B=CH3CN/0.1 ％TFA,12mL/分)により精製し、19mgの化合物46を白色固体として得た。 実施例22：四価プラットホームBA/PABA/DT/TEGの合成、51。 Ｎ-(t-ブトキシカルボニル)PABA、化合物47 ：60mLのH2O中の3.0g(21.9mmol)のｐ -アミノ安息香酸の溶液を調製した。Na2CO3(2.16g,25.7mmol)、続いて30mLのMeO Hをゆっくり添加した。全ての固体が溶解した場合、10mLのMeOH中の4.77g(21.9m mol)のジ-t-ブチルジカーボネートの溶液を添加し、そして混合物を室温で18時 間撹拌した。混合物に4.92g(25.6mmol)のクエン酸を添加し、そして得られた濁 った混合物を、200mLのH2Oと200mLのEtOAcとの間で分配した。EtOAc層を、200mL の0.1Ｎ HClおよび200mLのH2Oで連続して洗浄し、乾燥(Na2SO4)し、濾過し、そ して濃縮し、3.0g(58％)の化合物47を白色固体として得た。Ｎ-(t-ブトキシカルボニル)PABA Ｎ-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、化 合物48 ：DCC(2.61g、12.6mmol)を、50mLのEtOAc中の2.0g(8.43mmol)の化合物47 および0.97g(8.43mmol)のＮ-ヒドロキシスクシンイミドの０℃溶液に添加した。 氷浴を除去し、混合物を室温で16時間撹拌し、そして0.5mLの酢酸を添加した。 混合物をさらに30分撹拌し、1.5時間フリーザー中に配置し、濾過し、そして濃 縮し、3.75gの粗製物48を得た。シリカゲルクロマトグラフィー(50/50ヘキサン/ EtOAc)による精製により、2.53g（90％）の化合物48を白色固体として得た。化合物49 ：50mLのCH2Cl2中の3.00g(8.97mmol)の化合物48の溶液を、30分間にわ たり、氷浴中で冷却した30uLのCH2Cl2中の485uL(4.49mmol)のジエチレントリア ミン溶液に滴下した。混合物を５〜７℃で30分、次いで室温で16時間撹拌した。 乳状混合物を200mLのH2Oと共に分液漏斗中に配置し、そして３Ｍ NaOH溶液でH2O 層のpHを10に調整し、そして混合物を200mLの4/1 CH3Cl/MeOHで抽出した。有機 層を乾燥(Na2SO4)し、そして濃縮し、0.971g(40％)の化合物49を得た。これは以 下の工程で使用するに充分純粋であった。水層を100mLの4/1CH3Cl/MeOHで６回抽 出した。有機層を混合し、乾燥(Na2SO4)し、そして濃縮し、別の1.08g(44％)の 化合物49を得た。これはさらに精製が必要であった。さらなる精製をシリカゲル クロマトグラフィー(勾配、80/20〜70/30 CH3Cl/MeOH)により達成し得た。化合物50 ：0.3mLのTHF中の135uL(0.66mmol)のトリエチレングリコールビス-クロ ロホルメートの溶液を、13mLのTHF中の855mg(1.58mmol)の化合物49および275uL( 1.mmol)のジイソプロピルエチルアミンの０℃溶液に添加した。氷浴を除去した 場合、濁った混合物は透明になった。塩基性pHを維持するために、さらなる70uL のジイソプロピエチルアミンを添加した。混合物を室温で合計３時間撹拌し、そ して25mLのH2Oと25mLのEtOAcとの間で分配した。水層を第２の25mLのEtOAcで抽 出し、そして混合したEtOAc層を乾燥(Na2CO3)し、濾過し、そして濃縮し、0.986 gの粗製物50を得た。シリカゲルクロマトグラフィー(80/4/16 CH3Cl/ジオキサン /イソプロパノール)による精製により、516mg(61％)の化合物50を白色固体とし て得た。BA/PABA/DT/TEG の調製、化合物51 ：化合物50(487mg,8.79mmol)を、９mLのCH2Cl2 および５mLのトリフルオロ酢酸に溶解した。混合物を1.5時間撹拌し、そして濃 縮した。残渣を７mLのEt2Oで粉末化し、そして５mLのMeOHおよび1mLの48％HBr溶 液に溶解した。混合物を濃縮し、そして乾燥するまで減圧下に配置した。生成し たHBr塩を10mLのH2Oに溶解し、そして191mg(2.27mmol)のNaHCO3を添加した。10m Lのジオキサン中の591mg(2.27mmol)の無水ブロモ酢酸の溶液を混合物に添加した 。リンスのために、さらなる２mLのジオキサンを使用した。塩基性pHを維持する ために、必要なだけさらにNaHCO3を添加した。混合物を室温で２時間撹拌し、そ して１Ｎ H2SO4で酸性化した。混合物を３×25mLのEtOAcで抽出した。混合しEtO Ac層を乾燥(Na2SO4)し、濾過し、そして濃縮し、773mgの油を得た。精製をシリ カゲルクロマトグラフィー(勾配、90/10〜85/15 CH3Cl/MeOH)により達成し、401 mg(77％)の51を白色固体として得た。実施例23：四価プラットホームBMP/TEGの合成、55。 ジメチル-５-ヒドロキシイソフタレート、化合物52 ：30mLのMeOH中の2.00g(11mm ol)の５-ヒドロキシイソフタル酸および0.5mLの濃HClの溶液を５時間還流した。 混合物を濃縮し、そして生成残渣を100mLのEtOAcに溶解した。EtOAc溶液を、50m Lの５％NaHCO3溶液で２回、および50mLの飽和NaCl溶液で２回連続して洗浄し、 乾燥(Na2CO3)し、濾過し、そして濃縮し、2.09g(90％)の52を白色結晶固体とし て得た。化合物53 ：546mg(1.19mmol)のトリエチレングリコールジトシレートを、11mLのC H3CN中の500mg(2.38mmol)の化合物52および395mg(2.86mmol)のK2CO3の懸濁液に 添加し、そして混合物をN2下で16時間還流した。混合物を濃縮し、そして残渣を 25mLのCHCl3に溶解し、そして25mLのH2Oおよび25mLの飽和NaCl溶液で洗浄した。 CHCl3層を乾燥(Na2SO4)し、濾過し、そして濃縮した。シリカゲルクロマトグラ フィー(勾配、50/50ヘキサン/EtOAc〜100％EtOAc)による精製により、93mg(41％ )の 化合物53を得た。化合物54 ：４mLのTHF中の93mg(0.18mmol)の化合物53の懸濁液を、1.82mL(1.82mm ol)のLiBHEt3の１Ｍ溶液を混合物に滴下する間、Ｎ2雰囲気下で撹拌した。18時 間撹拌し、pHが酸性になるまで水中のHOAcの10％溶液を添加した場合、透明な溶 液を得た。混合物を減圧下で濃縮し、そして残渣を10mLの水に溶解した。混合物 を３×10mLのEtOAcで抽出し、そして混合したEtOAc層を乾燥(Na2SO4)し、濾過し 、そして濃縮した。精製をシリカゲルクロマトグラフィー(勾配、90/10〜85/15 CH3Cl/MeOH)により達成し、20mg(27％)の54を白色固体として得た。化合物55 ：５mLのEt2Oおよび1mLのTHF中の20mg(0.048mmol)の54の懸濁液に、9.6 uL(0.1mmol)のPBr3を添加する。混合物を３時間撹拌し、そしてEtOAcで分配する 。EtOAc層を乾燥(Na2SO4)し、濾過し、そして濃縮し、そして残渣をシリカゲル クロマトグラフィー(CH3Cl/MeOH)により精製し、化合物55を得る。 実施例24：４価プラットホームBA/PIZ/IDA/TEG,60の合成 化合物56 ：０℃に冷却した50mLの乾性THF中の1.02g(4.37mmol)のN-(t-ブトキシ カルボニル)-イミノ二酢酸（米国特許第5,552,391号（Chemically-Defined Non- Polymeric Valency Platform Molecules and Conjugates Thereof）中の化合物 ５）の溶液および1.01g(8.75mmol)のN-ヒドロキシスクシンイミドへ、2.26g(10. 94mmol)のジシクロヘキシルカルボジイミドを添加した。混合物を16時間撹拌し て、室温まで徐々に温めた。そして25mLのTHF中の2.22g(10.1mmol)のモノCBZピ ペラジンの溶液、続いて1.22mL(887mg，8.75mmol)のEt3Nを混合物へ添加した。 混合物を７時間室温で撹拌し、濾過した。濾液を濃縮し、そして残渣を125mLのE tOAcに溶解し、そして２×125mL分の1N HCL、125mLの飽和NaHCO3溶液とともに振 盪し、乾燥（MgSO4濾過、および濃縮）することにより2.39gの粘着性の固体を得 た。シリカゲルクロマトグラフィー(95/5 CH2Cl2/MeOH)による精製で、1.85g(66 ％)の56を得た。化合物57 ：10mLのCH2Cl2中の1.74g(2.74mmol)の化合物56の溶液へ10mLのトリフ ルオロ酢酸を添加し、そしてその混合物を、室温で３時間撹拌した。混合物を濃 縮し、そして残渣を5mLのCH2Cl2中へ溶解した。混合物を０℃まで冷却し、そし て100mLの飽和NaHCO3を添加した。次に、混合物を４つの100mL分のCH2Cl2で抽出 した。CH2Cl2層を合せ、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮して粘着性の吸湿 性固形物として1.46g(99％)の57を得た。これを次の工程で直接使用した。化合物58 ：０℃での0.7g(1.3mmol)の化合物57の溶液および226uL(168mg，1.30mm ol)のジイソプロピルエチルアミンへ４mLのCH2Cl2中の127uLのトリエチレングリ コールビスクモロホリネート(biscmoroforinate)を添加し、そして混合物を室温 で３時間撹拌した。混合物を、80mLのCH2Cl2と80mLの1N HClとの間で分配した。CH2Cl2 層を２つの80mL分の水と共に洗浄し、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃 縮して結晶性固形物として736mg(93％)の化合物58を得た。化合物60 ：化合物58(61 mg，0.48mmol)を3mLの30％のHBr/HOAc中に溶解し、そし て生じた混合物を室温で１時間撹拌し、その時間に5mLのEt2Oを添加した。混合 物を、冷凍庫に１時間置き、そして遠心分離した。生じたペレットを、Et2Oを用 いて洗浄し、そして乾燥してテトラレイドロブロミド(tetralaydrobromide)塩59 を得た。これを１mLのH2O中へ溶解した。この混合物へ49mg(0.58mmol)のNaHCO3 および3mLのジオキサンを添加する。必要ならば、さらにNaHCO3を添加して混合 物を塩基性にする。混合物を０℃まで冷却し、そして748mg(2.89mmol)の無水ブ ロモ酢酸を添加する。混合物を２時間撹拌し、20mLの１N H2SO4と20mLの80/20 C H2Cl2/MeOHとの間で分配する。有機層を乾燥し(Na2SO4)、濾過し、そして濃縮し て粗製の60を得る。これをシリカゲルクロマトグラフィ(CH2Cl2/MeOH)により精 製して60を得る。 実施例25：４価プラットホームテトラキス-BAIPIZ/PMA,63の合成 化合物61 ：50mLのTHF中の640mg(2.52mmol)のピロメリト酸および1.16g(10.1mmol )のN-ヒドロキシスクシンイミドの０℃溶液へ、2.6g(12.6mmol)のジシクロヘキ シルカルボジイミドを添加し、そしてこの混合物を16時間撹拌する間に室温まで 温めた。25mLのTHF中の2.5g(11.3mmol)のモノ-CBZ-ピペラジンの溶液を混合物に 添加し、次に1.4mL(1.02g，10.1mmol)のEt3Nを添加した。混合物を濾過し、そし て濾液を濃縮した。残渣を100mLのEtOAcと2×100mLの1N HClとの間で分配し、そ してEtOAc層を100mLの飽和NaHCO3、100mLのH2O、100mLの飽和NaHCO3を用いて洗 浄し、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮した。精製を、シリカゲルクロマト グラフィ(97.5/2.5 CH2Cl2/MeOH)により達成し、白い結晶性固形物として1.78g( 66％)の63を得た。化合物63 ：化合物61は、実施例23の58から60への変換について記載したような方 法と本質的に同じように化合物63へ変換される。精製を、シリカゲルクロマトグ ラフィを用いて達成する。 実施例26：４価プラットホームBA/PIZ/IDA/HB/TEG,68の合成 化合物64 ：２トシル化トリエチレングリコール(1.0g，2.18mmol)を、725mg(4.36 mmol)の4-ヒドロキシ安息香酸エチルおよび723mg(5.23mmol)のK2CO3の溶液に添 加し、そして混合物を16時間還流した。混合物を濃縮し、そして残渣を20mLの水 と3×20mLのEt2Oとの間で分配した。合わせた有機層を2×40mLの飽和NaHCO3溶液 、40mL(in L)の飽和NaCl溶液を用いて洗浄した。水層をEt2Oで洗浄し、そして合 わせたEt2O層を乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮した。シリカゲルクロマト グラフィ（70/30ヘキサン/EtOAc)による精製により、結晶性固形物として902mg( 93％)の64を得る(have)。化合物65 ：化合物64を、2.2当量のLiOHを含むアセトン中に溶解し、そして混合 物を３時間撹拌（TLCにより証明されるように完全に溶解するまで）する。混合 物を酢酸で酸性化し、そして濃縮し、そして残渣をシリカゲルクロマトグラフィ により精製し65を得る。化合物66 ：化合物66を、実施例23中の化合物56の調製の方法と同様に調製する。 化合物65をN-BOC-イミノ二酢酸の代わりに用い、そして化合物57をモノ-CBZ-ピ ペラジンの代わりに用いる。精製をシリカゲルクロマトグラフィを用いて達成す る。化合物68 ：化合物66を、実施例23の58から60への変換について記載したような方 法と本質的に同じように化合物68へ変換する。精製を、シリカゲルクロマトグラ フィを用いて達成する。 実施例27：４価プラットホームBA/PIZ/HIP/TEG,72の合成 化合物69 ：化合物53は、4.4等量のLiOHを用いることを除いて、実施例25の64の 加水分解について記載したような方法と本質的に同じようにLiOHを用いて加水分 解する。化合物70 ：四酸(tetra-acid)、化合物69を、69をピロメリト酸の代わりに用いる ことを除いて実施例24でピロメリト酸から61への変換について記載したような方 法と本質的に同じように化合物70へ変換する。化合物72 ：化合物70を、実施例23で58から60への変換について記載したような方 法と本質的に同じように化合物72へ変換する。精製を、シリカゲルクロマトグラ フィを用いて達成する。実施例28：ハロアセチル化４価化合物の結合体の合成 (LJP685)4/MTU/A/DABA/ATEG 結合化合物73の合成 ： ヘリウム散布したpH8.5の200mMホウ酸緩衝液中の21mg(15.5umol)の化合物24で 溶液を調製した。溶液へ、396uLのMeOH中に溶解した3.25mg(2.6umol)のIA/DABA/ ATEG、化合物46からなる第２の溶液を添加した。沈殿が形成され、そして1mLのM eOHを全ての固体へ添加して溶解した。混合物を室温で18時間撹拌し、そして6mL の9/1 H2O/HOAcを添加した。混合物を50MLのH2O/CH3CNで希釈し、HPLC分取カラ ム上へロードした。精製を、分取HPLC(25cm×2.24mm C18、勾配：35％Ｂから45 ％Ｂへ 0-40分、Ａ=H2O/0.1％ TFA Ｂ=CH3CN/0.1％TFA、12mL/分)により達成 し、凍結乾燥後に固体として10.8mg(67％)の化合物73を得た。 (LJP685)4/MTU 結合体、化合物74、75、76、77、および78の合成： これらの結合体を、プラットホーム化合物46に対して適切なプラットホーム化 合物に置換することによる結合体73の合成のための上記のような同じ反応条件に より、それぞれプラットホーム化合物51、60、63、68、および72から調製する。 Pepは、LJP685または他の関連ペプチドであり得る。実施例29：結合体４価プラットホーム55、結合化合物79、(LJP685)4/MP/TEGの合 成 ： DMF中の４当量の化合物24および５当量のCs2C3の溶液を調製する。プラットホ ーム化合物55である１当量のBMP/TEGを混合物へ添加し、次いで１時間撹拌する 。混合物を80/20/10 H2O/CH3CN/HOAcで希釈し、分取HPLCカラム上へロードした 。精製を、分取HPLC(C18、Ａ＝H2O/0.1％ TFA、Ｂ＝CH3CN/0.1％ TFA)により達 成し、凍結乾燥後に化合物79を生じる。PepはLJP685または他の関連ペプチドで あり得る。実施例30：結合体４価プラットホームテトラキス-BMB、結合化合物80、（LJP685 ）4/MTU/テトラキス-MBの合成 ： DMF中の４当量の化合物24および５当量のCs2C3で溶液を調製する。１当量のテ トラキスブロモメチルベンゼンを混合物に添加し、次いで、この混合物を１時間 撹拌する。混合物を80/20/10 H2O/CH3CN/HOAcで希釈し、分取HPLCカラム上へロ ードした。精製を、分取HPLC(C18、Ａ＝H2O/0.1％ TFA、Ｂ＝CH3CN/0.1％ TFA) により達成し、凍結乾燥後に化合物80を得る。PepはLJP685または他の関連ペプ チドであり得る。実施例30：FITC-GPCILLARDRCG(CB2*) の蛍光偏光ペプチド結合アッセイ合成 20mgの炭酸ナトリウム(Na2CO3、pH約10.5)を含む20mLのACN/水(1:1)中の環状 ジスルフィドペプチドGPCILLARDRCG(20.0mg，14.4μｍｏｌ)およびフルオレセイ ンイソチオシアネート(FITC)(5.6mg、14.4μｍｏｌ)の溶液を、室温で撹拌した 。反応を、分析用HPLCでモニターした。蛍光標識化試薬を消費した後、粗製の物 質を、10mL/分での40分にわたるＢの30％から55％への直線勾配で溶出する分取H PLCで精製した。ここでＡはH2O中の0.1％(v/v)TFAであり、ＢはCAN中の0.085％( v/v)TFAであった。FITCペプチドを、凍結乾燥後に明るい黄色の粉末として得た （3.7mg，15％生成）：MS(ESI):m/e(M＋1)計算値C73H102N19O21S3：1661、観察 値:1661。直接的結合蛍光偏光結合アッセイ(dbFP) 方法論はPan Vera Application Guide(1994)、Pan Vera Corporationに記載さ れる。簡単には、微量のフルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識化ペプチ ド(CB2*-F)を抗体(ACA 6501または6701)でタイトレートし、そしてサンプルにつ いての偏光を、抗体濃度に対してプロットする。偏光は、Pan Vera Beacon機器 で測定した。データを式１へ適合した。ここで、ＹはＹ軸値(ミリ偏光単位、mP)であり、Ｒは抗体レセプターの総濃度で あり、PLは遊離FITC標識ペプチド(F)についての偏光であり、そしてPHはＲと結 合するＦ（FR）についての偏光である。KDは、FR結合体由来のＦについての解離 定数（相互結合定数）である。正当であるべきこれらの式について、F<<Rである ことは正確でなければならない。CB2*-FのACA-6701およびACA-6501抗体への結合 についてタイトレーションを、それぞれ図22および図23に示す。図23に示すよう に、ACA-6501を用いて完全なタイトレーションは得られなかったが、図24に示さ れる上記のタイトレーションは、241nMのKDを示した。6701からCB2*-Fを置換す るために（図25を参照のこと）、僅かに過剰の抗体6701中のCB2*（GPCILLARDRCG ）を添加することにより、CB2*-Fについて、Koff=0.0184秒-1の解離速度定数（t1/2 =38秒に該当する）を決定した。256nMのKDと仮定すると、これはKon=3.6×104 M-1秒-1（抗体の二価性について補正した後）の結合速度定数に対応する。従っ て、ACA-6701に結合するCB2*-Fは、これらの２つの分子がともに拡散することに よるものだけに限られる。競合的蛍光偏光アッセイ(cFP) 上記のdbFPアッセイは、FITC-標識ペプチドの結合定数を提供し、そして0.5mg オーダーの精製抗体を必要とする。cFPアッセイは、FITC基を欠くペプチドの結 合定数を提供し、そしてそれは、10μｇオーダーという、より少ない抗体を消費 する。cFPアッセイは、それが50分の１の、より少ない抗体を消費するようにPan Vera Applications Guide（1994）Pan Vera Corporation中で報告されたアッセ イから改変される。手短には、抗体(ACA 6701)を微量のFITC標識ペプチド(CB2*- F)と混合し、そして平衡が達成されるまで十分な時間放置する。これは、ACA 67 01およびCB2*-Fについては１時間だった。次いで、漸増濃度の試験される非標識 ペプチド(CB2*または3B10)をチューブに添加した。各添加後、平衡が達成される (F)の濃度が、Ｆ<<Ｒとなるように選択することが必要であるが、Ｒの濃度は、 測定される偏光(PH)がPLより有意に高くなる（図22を参照のこと）のに十分なほ ど高くさえあればよい。このΔ(mP)値は、信頼性のある結果を保証するためには 、20以上のmP値であるべきである。 方程式２ Δ(mP)=PH-PI 非標識(FITCなし)ペプチド(I)を、FがRと結合するのを阻害するために添加する ので、Yは、その最大値のPHから、方程式１を満たすはずであるプラトーのPLに まで減少する。CB2*および3B10による、ACA-6701からのCB2*-F置換に関するこれ らのタイトレーションを、図26および図27にそれぞれ示す。このタイトレーショ ンを説明する方程式を得た。それは以下である： ここで、PLは方程式１中と同じで、Iは非標識ペプチド競合剤の濃度であり、そ してKI'はそのペプチドの見かけの解離定数である。これらのパラメータ値を、c FPタイトレーションデータを上記の方程式にフィッティングすることによって得 た。 Iの真の解離定数は、方程式４から得られる。 方程式４ KI=KI'(1.0+R/KD) ここで、ＲおよびKDは方程式１で定義される。R/KD比はPH'（方程式３より）お よびPHおよびPL（方程式１より）の値、ならびに方程式５を使用することによっ て 得られる。 方程式５ R/KD=(PH'-PL)/(PH-PH') 一般的に、一旦方程式１で定義するタイトレーションを「標準曲線」として実施 する場合、方程式５を、aPL抗体濃度を決定するために使用し得る。従って、KI を決定するための方法を提供することに加えて、本方法は、cFPアッセイあたり わずか５〜10μｇの抗体を使用して、すべてのaPL抗体ストック溶液濃度を標準 化する手段、およびそれらの結合活性／安定性を時間経過で分析する手段を提供 する。dbFP およびcFPによって決定される解離定数 ペプチド 抗体 配列 KDaまたはKI CB2*-F 6501 FITC-GPCILLARDRCG 482nMa CB2*-F 6701 FITC-GPCILLARDRCG 512nMa CB2* 6701 GPCILLARDRCG 35nM 3B10 6701 AGPCLLLAPDRCPG 313nM a 抗体の２価性を考慮しない、方程式１から決定したKD値を修正するために、KD 値に２を乗じた。 これらの結果は、CB2*-Fが、２つの非常に異なるaPL抗体(ACA-6501およびACA-67 01)と交叉反応して両方に等しい高親和性で結合することを実証する。FITC基の 除去は、ACA-6701へのCB2*の結合を14倍改良した。関連するペプチド3B10の結合 は、CB2*のACA-6701への結合よりも、９分の１の少ない結合だった。この結果は 、3B10上のさらなる骨格残基に起因し得るが、この結果はまた、CB2*における８ 位のアルギニンのプロリン置換に起因し得る。3B10に類似のペプチドである5A12 の以前のNMR構造研究は、代わりに位置するこのプロリンが構造硬性を与えるこ とを示した。CB2は、ずっとより可撓性のあるペプチドであり、そしてこの位置 でアルギニンを有する。CB2のようなより可撓性のペプチドは、より交叉反応性 で ある。なぜなら、それは、所定の抗体結合サイトに合うようにその形状をより容 易に調節し得るからである。結合親和性に関する薬物剛性化(drug rigidificati on)の示唆が、Koehlerら,251頁,GUIDEBOOK ON MOLECULER MODELING IN DRUG DES IGN(Academic Press，N．Cohen編，1996)で考察されている。 実施例31：ペプチド結合体の寛容活性 同じペプチドを含む２個の異なる結合体を、インビボでの抗原特異的寛容を誘 導するそれらの能力について試験した。簡単には、マウスを、ペプチド特異的記 憶Ｂ細胞を産生するために、免疫原性キャリアキーホールリンペットヘモシアニ ン(KLH)に結合したペプチドで免疫した。３週間後、１グループあたり５匹のマ ウスの複数のグループを、種々の用量の試験結合体で処置し、１つのグループの マウスを処置せず、コントロールとした。５日後、コントロールグループを含む すべてのマウスをKLHに結合したペプチドで追加免疫し、７日後、すべてのマウ スから採血して、そしてそれらの血清を、改変Farrアッセイを使用して抗ペプチ ド抗体についてアッセイをした。抗原結合能(ABC)を、G.M．Iverson，「Assay f or in vivo adoptive immue response,」第２巻,第67章,HANDBOOK OF EXPERIMEN TAL IMMUNOLOGY（Blackwell Scientific Publications,Weirら編,第４版，Oxfor d，1986)に記載される方法に従って、各個々の血清試料について計算した。次い で、これらの値を使用して、グループのすべての個体について平均および標準偏 差を決定した。 結合体のうちの一方は寛容を誘導したが、他方の結合体は、試験した量の範囲 にわたって、抗ペプチド抗体を阻害しなかった。この差違についての最も可能性 のある説明は、後者の結合体が短いインビボの半減期を有することである。この 問題に取り組むために、インビトロで寛容を誘導し、それによって半減期の考慮 を否定し、その後細胞を照射レシピエントに移すという系を使用した。簡単には 、KLHに結合したペプチドで初回抗原刺激したマウス由来の脾臓細胞を回収し、 そして完全なRPMI-1640培地中、37℃で２時間、種々の用量の試験結合体ととも にインキュベートした。細胞の１つのグループを、寛容原(toleragen)なしでイ ンキュベートして、そして陽性コントロールとした。細胞を洗浄し、照射同系レ シ ピエントに移し、そしてKLHに結合したペプチドで迫加免疫した。７日後、すべ てのマウスから採血し、そしてそれらの血清を抗タンパク質抗体についてアッセ イした。インビボモデルで試験した場合に全く検出可能な寛容を誘導しなかった 結合体は、このインビトロモデルで試験した場合は、寛容を誘導した。この結果 は、結合体間の差違が結合体の短い半減期によるという推測を支持する。この仮 定を直接的に試験するために、結合体を移植された浸透圧ポンプによって、長期 間連続的に投与した。これらの結果は、明らかに、徐放で注入した場合この結合 体は寛容を誘導し、図32で示されるように、ボーラスで注入した場合では誘導し なかったことを示す。インビボモデルにおける寛容活性に関する(LJP685)4/MTU-AHAB-TEGの試験 マウスを、ミョウバン＋百日咳のLJP-685-KLHをアジュバントとして使用して 初回抗原剌激した。３週間後、マウスを一定の範囲の用量の(LJP685)4/MTU-AHAB -TEG結合体を用いて処置した。１つのグループは処置せず、そしてコントロール グループとした。５日後、コントロールグループを含むすべてのマウスを10μｇ のLJP685-KLHで追加免疫し、そして７日後、マウスから採血した。それらの血清 を、上記の改変したFarrアッセイによって、抗LJP685抗体に関して分析した。図 28に示す結果は、１〜50nmoleの用量範囲にわたる(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG結合 体を用いる処置が抗LJP685応答に検出可能な効果を全く有さなかったことを示す 。インビボモデルにおける寛容誘導に関する(LJP685)4/MTU-DABA-TEG結合体の試験 マウスを、ミョウバン＋百日咳のLJP685-KLHで初回抗原刺激した。３週間後、 マウスを、５nmol、10nmol、または50nmolの(LJP685)4/MTU-DABA-TEG結合体で処 置した。１つのグループは処置せず、そしてコントロールグループとした。５日 後、コントロールグループを含むすべてのマウスを10μｇのLJP685-KLHで追加免 疫し、そして７日後、マウスから採血した。それらの血清を、改変したFarrアッ セイによって、抗LJP685抗体について分析した。図29に示す結果は、(LJP685)4/ MTU-DABA-TEG結合体が、５nmolのED50を用いたインビボモデルにおいて寛容を誘 導することを示す。インビトロモデルにおける寛容誘導に関する(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG結合体の試 験 ３週間前にLJP685-KLHで初回抗原刺激したマウス由来の脾臓細胞を回収し、完 全なRPMI-1640培地中で、37℃で２時間、４μＭ、20μＭ、または100μＭの(LJP 685)4/MTU-AHAB-TEG結合体を用いてインキュベートした。細胞の１つのグループ を、寛容原なしでインキュベートし、そして陽性コントロールグループとした。 細胞を洗浄し、照射レシピエントに移し、そして10μｇのLJP685-K-LHで追加免 疫した。７日後、マウスから採血し、そしてそれらの血清を、改変Farrアッセイ によって抗LJP685抗体について分析した。図30に示す結果は、明らかに、(LJP68 5)4/MTU-AHAB-TEG結合体が、インビトロモデルで試験した場合、４μＭ未満のIC50 を達成する寛容を誘導し得ることを示す。インビトロモデルにおける寛容誘導に関する(LJP685)4/MTU-DABA-TEG結合体の試 験 ３週間前にLJP685-KLHで初回抗原刺激したマウス由来の脾臓細胞を回収し、完 全なRPMI-1640培地中で、37℃で２時間、0.4μＭ、1.3μＭ、または４μＭの(LJ P685)4/MTU-DABA-TEG結合体を用いてインキュベートした。細胞の１つのグルー プを、寛容原なしでインキュベートし、そして陽性コントロールグループとした 。細胞を洗浄し、照射レシピエントに移し、そして10μｇのLJP685-KLHを用いて 追加免疫した。７日後、マウスから採血し、そしてそれらの血清を、改変したFa rrアッセイによって抗LJP685抗体について分析した。図31に示す結果は、(LJP68 5)4/MTU-DABA-TEG結合体が、インビトロモデルで試験した場合、４μＭ未満のIC50 を達成する寛容を誘導し得ることを示す。連続送達ポンプを使用した、インビボにおける寛容誘導に関する(LJP685)4/MTU- AHAB-TEG結合体の試験 マウスを、ミョウバン＋百日咳のLJP-685-KLHで初回抗原刺激した。３週間後 、マウスを各グループあたり５マウスの、５つのグループに分けた。１日目、１ つ のグループを生理食塩水のボーラスで処置し、別のグループを50nmolの(LJP685)4 /MTU-AHAB-TEG結合体のボーラスで処置した。残りの３つのグループに浸透圧ポ ンプを移植した。１つのグループでは、ポンプを生理食塩水で満たし、そして１ μＬ/時間で３日間送達した。残りの２つのグループは、(LJP685)4/MTU-AHAB-TE G結合体(50nmol)で満たしたポンプを設置した。一方のグループには、１μＬ/時 間で３日間送達するポンプを設置し、そして他方には、0.5μＬ/時間で７日間送 達するポンプを設置した。５日目に、３日間送達するポンプを外科的に取り除い た。７日目に、コントロールグループを含むすべてのマウスを10μｇのLJP685-K LHで追加免疫した。10日目に、７日間送達するポンプを外科的に取り除いた。14 日目に、すべてのマウスから採血した。それらの血清を、改変Farrアッセイによ って、抗LJP685抗体について分析した。結果を、図32に示す。インビボモデルにおける寛容誘導に関する(LJP-ペプチド)4/MTU-BMP-TEG結合体 の試験 マウスを、ミョウバン＋百日咳のペプチド-KLHで初回抗原刺激した。３週間後 、マウスを(LJP-ペプチド)4/MTU-BMP-TEG結合体で処置した。１つのグループは 処置せず、そしてコントロールグループとした。５日後、コントロールグループ を含むすべてのマウスを10μｇのペプチド-KLHで追加免疫し、そして７日後、マ ウスから採血した。それらの血清を、改変Farrアッセイによって、抗ペプチド抗 体について分析した。結果は、(LJP-ペプチド)4/MTU-BMP-TEG結合体が、インビ ボモデルでの寛容を、(LJP685)4/MTU-AHAB-TEG結合体の効力以上の効力で誘導す ることを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ 39/00 Ｃ０７Ｋ 16/44 Ｃ０７Ｋ 16/44 Ｃ１２Ｑ 1/70 Ｃ１２Ｑ 1/70 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｓ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/531 Ａ 33/531 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ジョンズ，デイビッド エス. アメリカ合衆国 カリフォルニア 92127, サン ディエゴ，フロリンド ロード 11265 (72)発明者 ユー，リン アメリカ合衆国 カリフォルニア 92122, サン ディエゴ，ロンバード プレイス 8933，アパートメント 228

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．aPLエピトープが結合するＢ細胞に特異的に結合するaPLアナログ。 ２．前記アナログがＴ細胞エピトープを欠失する、請求項１に記載のアナログ。 ３．前記アナログがペプチドである、請求項１に記載のアナログ。 ４．前記ペプチドが、CLILAPDRC、CLILTPDRC、CLLLAPDRC、CTILTLDRC、CLVLALDR C、CTILTPDRC、CILLAHDRC、CGNAADARC、CTNWADPRC、CGNIADPRC、CTNLTDSRC、CGN PTDVRC、GILLNEFA、GILTIDNL GILNALDYV、LSDPGYVRNIFH、またはLTDPRYTRDISNFT Dの配列を含む、請求項３に記載のアナログ。 ５．前記ペプチドが、AGPCLGVLGKLCPG、GPCLGVLGKLCPG、PCLGVLGKLCPG、CLGVLGK LCPG、AGPCLGVLGKLCG、CLGVLGKLC、GPCILLARDRCG、またはAGPILLARDRCPGの配列 を含む、請求項３に記載のアナログ。 ６．前記ペプチドが少なくとも１つのプロリンを含み、そしてさらに少なくとも １つの該プロリンがαメチルプロリンに置換された、請求項３に記載のアナログ 。 ７．少なくとも１つのＬアミノ酸がＤアミノ酸に置換された、請求項３に記載の アナログ。 ８．前記ペプチドがジスルフィド結合によって環化された、請求項３に記載のア ナログ。 ９．前記ジスルフィド結合がチオエーテル結合に置換された、請求項８に記載の アナログ。 １０．前記ペプチドが少なくとも１つのロイシンを含み、そしてさらに少なくと も１つの該ロイシンがイソロイシンに置換された、請求項３に記載のアナログ。 １１．非免疫原性原子価プラットホーム分子の結合体、および(a)aPL免疫原が結 合するＢ細胞に特異的に結合し、そして(b)該免疫原のＴ細胞エピトープを欠失 するaPL抗体結合アナログ、を含むaPL免疫原に対して特異的なＢ細胞寛容を誘導 するための組成物。 １２．前記aPL抗体結合アナログが、CLILAPDRC、CLILTPDRC、CLLLAPDRC、CTILTL DRC、CLVLALDRC、CTILTPDRC、CILLAHDRC、CGNAADARC、CTNWADPRC、CGNIADPRC、C TNLTDSRC、CGNPTDVRC、GILLNEFA、GILTIDNL、GILNALDYV、LSDPGYVRNIFH、または LTDPRYTRDISNFTDの配列を含むペプチドである、請求項１１に記載の組成物。 １３．前記aPL抗体結合アナログが、AGPCLGVLGKLCPG、GPCLGVLGKLCPG、PCLGVLGK LCPG、CLGVLGKLCPG、AGPCLGVLGKLCG、CLGVLGKLC、GPCILLARDRCG、またはAGPILLA RDRCPGの配列を含むペプチドである、請求項１１に記載の組成物。 １４．前記aPL抗体結合アナログが、請求項６に記載のアナログである、請求項 １１に記載の組成物。 １５．前記aPL抗体結合アナログが、請求項７に記載のアナログである、請求項 １１に記載の組成物。 １６．前記aPL抗体結合アナログが、請求項８に記載のアナログである、請求項 １１に記載の組成物。 １７．前記aPL抗体結合アナログが、請求項９に記載のアナログである、請求項 １１に記載の組成物。 １８．前記aPL抗体結合アナログが、請求項１０に記載のアナログである、請求 項１１に記載の組成物。 １９．前記非免疫原性原子価プラットホーム分子がトリエチレングリコールを含 む、請求項１１に記載の組成物。 ２０．前記原子価プラットホーム分子がAHAB-TEGを含む、請求項１９に記載の組 成物。 ２１．前記原子価プラットホーム分子が化合物46、A-DABA-ATEGを含む、請求項 １９に記載の組成物。 ２２．前記原子価プラットホーム分子が化合物51、A-PABA-DT-TEGを含む、請求 項１９に記載の組成物。 ２３．前記原子価プラットホーム分子が化合物55、MP-TEGを含む、請求項１９に 記載の組成物。 ２４．前記原子価プラットホーム分子が化合物60、A-PIZ-IDA-TEGを含む、請求 項１９に記載の組成物。 ２５．前記原子価プラットホーム分子が化合物68、A-PIZ-IDA-HB-TEGを含む、請 求項１９に記載の組成物。 ２６．前記原子価プラットホーム分子が化合物72、A-PIZ-MP-TEGを含む、請求項 １９に記載の組成物。 ２７．前記非免疫原性原子価プラットホーム分子がポリエチレングリコールを含 む、請求項１１に記載の組成物。 ２８．前記原子価プラットホーム分子がDABA-PEGを含む、請求項２８に記載の組 成物。 ２９．前記非免疫原性原子価プラットホーム分子がテトラアミノベンゼンを含む 、請求項１１に記載の組成物。 ３０．前記非免疫原性原子価プラットホーム分子がヘプタアミノβシクロデキス トリンを含む、請求項１１に記載の組成物。 ３１．前記非免疫原性原子価プラットホーム分子がテトラアミノペンタエリトリ トールを含む、請求項１１に記載の組成物。 ３２．前記非免疫原性原子価プラットホーム分子が1,4,8,11-テトラアザシクロ テトラデカン(Cyclam)を含む、請求項１１に記載の組成物。 ３３．前記非免疫原性原子価プラットホーム分子が1,4,7,10-テトラアザシクロ ドデカン(Cyclen)を含む、請求項１１に記載の組成物。 ３４．前記非免疫原性原子価プラットホーム分子が化合物63、テトラキス-A-PIZ -PMAを含む、請求項１１に記載の組成物。 ３５．前記非免疫原性原子価プラットホーム分子が化合物55、MP-TEGを含む、請 求項１１に記載の組成物。 ３６．前記結合体がテトラキス-BMB由来である、請求項１１に記載の組成物。 ３７．AHAB-TEGを含む非免疫原性原子価プラットホーム分子。 ３８．化合物46、IA-DABA-ATEGを含む非免疫原性原子価プラットホーム分子。 ３９．化合物51、BA-PABA-DT-TEGを含む非免疫原性原子価プラットホーム分子。 ４０．化合物55、BMP-TEGを含む非免疫原性原子価プラットホーム分子。 ４１．化合物60、BA-PIZ-IDA-TEGを含む非免疫原性原子価プラットホーム分子。 ４２．化合物68、BA-PIZ-IDA-HB-TEGを含む非免疫原性原子価プラットホーム分 子。 ４３．化合物72、BA-PIZ-HIP-TEGを含む非免疫原性原子価プラットホーム分子。 ４４．化合物63、テトラキス-BA-PIZ-PMAを含む非免疫原性原子価プラットホー ム分子。 ４５．有効量の請求項１１に記載の組成物をそれが必要な個体に投与する工程を 含む、aPL抗体媒介疾患を患う個体を処置する方法。 ４６．前記aPL抗体媒介疾患が発作である、請求項４５に記載の方法。 ４７．前記aPL抗体媒介疾患が胎児死亡である、請求項４５に記載の方法。 ４８．前記aPL抗体媒介疾患が抗リン脂質抗体症候群(APS)である、請求項４５に 記載の方法。 ４９．前記aPL抗体媒介疾患が原発生抗リン脂質抗体症候群(PAPS)である、請求 項４５に記載の方法。 ５０．前記aPL抗体媒介疾患が血栓症である、請求項４５に記載の方法。 ５１．aPL抗体媒介疾患を患うヒトから単離されたaPL抗体に特異的に結合するエ ピトープのアナログを同定する方法であって、以下： (a)ファージランダムペプチドライブラリーを調製する工程； (b)aPL模倣エピトープを同定するために該ライブラリーをaPL抗体でスクリー ニングする工程であって、ここで、該スクリーニング工程が、以下の工程を包含 する工程： (i)該ライブラリーを生物選抜によってスクリーニングする工程； （ii）(i)における生物選抜によって単離されたファージをマイクロ選抜に よってさらにスクリーニングする工程；および (iii)(ii)で回収したaPL抗体高親和性結合ペプチドを含むファージをイムノ アッセイによって同定する工程、 を包含する方法 ５２．ファージランダムペプチドライブラリーを生物選抜し、aPL抗体に結合す るペプチドを同定および単離する方法であって： (a)アフィニティー精製されたaPL抗体をランダムペプチドインサートを有する ファージと反応させる工程； (b)該aPL抗体に結合するランダムペプチドインサートを有するファージを回収 する工程； (c)微生物を(b)で回収したファージで感染させる工程；および (d)該ファージを単離するために、該感染微生物を抗生物質を含む培地で培養 する工程、 を包含する、方法。 ５３．ファージランダムペプチドライブラリーをマイクロ選抜し、aPL抗体に高 い結合親和性を有するペプチドを同定および単離する方法であって： (a)ランダムペプチドインサートを有するファージを生物選抜により単離する 工程； (b)工程(a)で回収した該ファージを、プロテインＧに結合したaPL抗体で被覆 されたマイクロプレートウェル中でインキュベートする工程； (c)マイクロプレートウェルを洗浄し、未結合のファージを除去する工程； (d)結合したファージを溶出する工程；および (e)微生物を(d)で回収したファージで感染させる工程；および (f)該感染微生物を抗生物質を含む培地で培養し、該ファージを単離する工程 、 を包含する、方法。 ５４．前記イムノアッセイがファージ捕獲ELISAである、請求項５１に記載の方 法であって： (a)aPL抗体で被覆されたマイクロプレートウェル中で、マイクロ選抜によって 単離されたランダムペプチドインサートを有するファージをインキュベートする 工程； (b)未結合のファージを洗い流す工程； (c)該ウェルに対する標識された抗ファージ抗体をインキュベートする工程； (d)未結合の標識抗ファージ抗体を洗い流す工程； (e)標識基質を添加する工程；および (f)該基質のシグナル発生を測定して高親和性結合ファージを同定する工程、 を包含する、方法。 ５５．前記標識が酵素である、請求項５４に記載の方法。 ５６．前記基質が比色性である、請求項５４に記載の方法。 ５７．高親和性結合ファージのファージ捕獲ELISAアッセイをさらに行う工程を さらに包含する、請求項５４に記載の方法であって： (a)マイクロプレートウェル上で均一な量のファージを被覆する工程； (b)aPL抗体を該ウェル中でインキュベートする工程、 (c)未結合の抗体を洗い流す工程、 (e)標識された抗aPL抗体を該結合aPL抗体と共にインキュベートする工程； (f)未結合の標識抗aPL抗体を洗い流す工程； (g)基質を該ウェルに添加する工程；および (h)前記基質のシグナル発生を測定し、該ファージの相対的結合親和性を測定 する工程、 を包含する、方法。 ５８．前記標識が酵素である、請求項５７に記載の方法。 ５９．前記基質が比色性である、請求項５７に記載の方法。 ６０．前記イムノアッセイがコロニーブロットイムノアッセイである請求項５１ に記載の方法であって： (a)ランダムペプチドインサートを有するファージで感染された微生物を、寒 天含有培養培地上のメンブラン上で培養する工程； (b)(a)で培養された該微生物を、該微生物を寒天含有培養培地上のメンブラン 上でブロットすることにより複製転写する工程； (c)該転写微生物をインキュベートする工程； (d)該微生物を溶解する工程； (e)該微生物を消化する工程； (f)該メンブランをブロックする工程； (g)該メンブランをaPL抗体でインキュベートする工程； (h)未結合のaPL抗体を洗い流す工程； (i)標識された抗aPL抗体を該メンブランとともにインキュベートする工程； (j)未結合の標識された抗aPL抗体を洗い流す工程； (k)基質を添加する工程；および (l)該基質のシグナル発生を測定し、高親和性結合ファージを同定する工程、 を包含する、方法。 ６１．前記メンブランがニトロセルロースである、請求項６０に記載の方法。 ６２．前記微生物がリゾチームで消化される、請求項６０に記載の方法。 ６３．前記ブロック溶液がゼラチンである、請求項６０に記載の方法。 ６４．前記標識が酵素である、請求項６０に記載の方法。 ６５．前記基質が比色性である、請求項６０に記載の方法。 ６６．aPL抗体媒介疾患を患うヒトから単離されたaPL抗体に特異的に結合する親 和性結合特性エピトープをアッセイしそしてランクづける方法もまた包含されて おり、 (a)マイクロタイトレーションプレートのウェルをカルジオリピンで被覆する 工程； (b)該カルジオリピンに結合しそして該プレートの該ウェルへの非特異的結合 を防止するために、成熟ウシまたはヒトの血清をβ２-GPIの供給源として添加す る工程； (c)モノマーアナログおよび高力価aPL抗体の溶液を所定時間インキュベートす る工程； (d)該aPL抗体/アナログ混合物を該マイクロタイトレーションプレートのウエ ルに添加し、そして所定時間インキュベートする工程； (e)該ウェルを洗浄し、未結合のaPL抗体を洗い流す工程； (f)標識と結合した抗ヒトIgGを該プレートの該ウェルに添加し、そして所定時 間インキュベートする工程； (g)該ウェルを洗浄し、未結合の抗ヒトIgG結合体を洗い流す工程； (h)該標識結合体の基質を添加し、そして基質/標識反応を所定時間行う工程； (i)該基質/標識反応の最終産物を測定し、該ウェルに結合したaPL抗体の量を 定量化する工程； (j)該aPL抗体の結合の阻害が、もしあればその割合を計算し、該アナログの該 aPL抗体に対する親和性を決定する工程、 を包含する、方法。 ６７．前記結合体が酵素で標識される、請求項６６に記載の方法。 ６８．前記基質が比色性である、請求項６６に記載の方法。 ６９．aPL抗体媒介疾患を患っていると疑われる被験体から採取された体液中のa PL抗体の存在を決定する診断イムノアッセイであって、 (a)体液のサンプルを特異的にaPL抗体に結合するエピトープのアナログと接触 させる工程； (b)該アナログが結合したaPL抗体を検出する工程、 を包含する、診断イムノアッセイ。 ７０．請求項６９に記載のイムノアッセイであって、 (a)マイクロタイトレーションプレートのウェルを、aPL抗体に特異的に結合す るエピトープのアナログで被覆する工程； (b)該ウェルを洗浄し、未結合のアナログを洗い流す工程； (c)体液の試験サンプルを該ウェルに添加し、所定時間インキュベートする工 程； (d)該ウェルを洗浄し、未結合の試験サンプルを除去する工程； (e)標識と結合した抗ヒトIgGを該プレートの該ウェルに添加し、そして所定時 間インキュベートする工程； (f)該ウェルを洗浄し、未結合の抗ヒトIgG結合体を洗い流す工程； (g)該標識された結合体の基質を添加し、そして該基質/標識反応を所定時間行 う工程； (h)該基質/標識反応の該最終産物を測定し、該試験サンプル中の抗aPL抗体の 存在を決定する工程、 を包含する、イムノアッセイ。 ７１．前記標識が酵素であり、そして前記基質が比色性である、請求項７０に記 載のイムノアッセイ。 ７２．ペプチドまたは他の生物活性分子を式 Ｒ1Ｓ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2Ｏ（ＣＨ2）mＣＯ2Ｒ2 を用いて原子価プラットホーム分子に結合するための親水性のリンカー、ここで ｎ＝０〜200、ｍ＝０〜１０、Ｒ1＝Ｈまたはトリチルのような保護基、Ｒ2＝Ｈ または４-ニトロフェニルエステルのようなアルキルまたはアリールである。 ７３．ｍ＝０〜２である、請求項７２に記載のリンカー。 ７４．前記aPLアナログが、非免疫原性原子価プラットホーム分子とスルフヒド リル含有部分により結合している、請求項１１に記載の結合体。
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