MX2012014535A

MX2012014535A - Anticuerpos anti-axl y metodos de uso.

Info

Publication number: MX2012014535A
Application number: MX2012014535A
Authority: MX
Inventors: Yan Wu; Lin Pei; Xiaofen Ye
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2010-06-18
Filing date: 2011-06-17
Publication date: 2013-01-29
Also published as: RU2013102225A; CN103080136A; US8853369B2; HK1179636A1; USRE47761E1; KR20130032896A; TW201204388A; CA2794731C; MX336001B; JP2013538553A; AR082017A1; RU2577986C2; CA2794731A1; EP3098240B1; EP3098240A3; KR101885388B1; JP5940061B2; CN103080136B; WO2011159980A1; BR112012027995A2

Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos anti-Axl y métodos de uso de los mismos.

Description

ANTICUERPOS ANTI-AXL Y MÉTODOS DE USO SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica prioridad en virtud del título 35 del USC artículo 119 respecto de la Solicitud Provisoria N.° 61/356.508, presentada el 18 de junio de 2010, los contenidos de la cual se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad.

LISTADO DE SECUENCIAS La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias que se ha presentado en formato ASCII a través del EFS-Web y se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con anticuerpos anti-Axl y métodos de uso de los mismos.

ANTECEDENTES AxI es un miembro de la familia TAM (Tyro3, AxI, y er) del receptor de tirosina quinasas (O'Bryan et al, 1991 ; Lai et al, 1991 ). Inicialmente se identificó como un gen de trasnformación en las malignidades hematológicas (O'Bryan et al, 1991 ; Janssen et al, 1991 ). La desregulación de AxI o su ligando Gas6 está implicada en la patogénesis de una variedad de cánceres humanos. La sobre expresión de AxI se ha informado en una amplia variedad de cánceres humanos (Berclaz et al, 2001 ; Craven et al, 1995; Shieh et al, 2005; Sun et al, 2004; Ito et al, 1999) y se asocia con la invasión y metástasis en cánceres de pulmón (Shieh et al, 2005), de próstata (Sainaghi et al, 2005), de mama (Meric et al, 2002; Zhang et al, 2008), gástricos (Wu et al, 2002), y pancreáticos (Koorstra et al, 2009), carcinoma de célula renal (Chung et al, 2003), así como glioblastoma (Hutterer et al, 2008). Recientemente, mediante la caracterización de la señalización de fosfotirosina, se detectó la proteína de Axl activada en aproximadamente 5% de los tumores primarios de NSCLC (Rikova et al, 2007). La expresión de Axl inducida por fármacos de quimioterapia y blanco y expresión de Axl inducida por fármaco confiere resistencia a la quimioterapia en la leucemia mieloide aguda (Hong et al, 2008), así como también resistencia a imatinib y Lapatinib/Herceptina en tumores estromales gastrointestinales (Mehadevan, et al, 2007) y cáncer de mama (Liu et al, 2009), respectivamente. Otras publicaciones que se relacionan con anticuerpos Axl y anti-Axl incluyen WO2004/039955, WO2009/063965; cotitularidad del número de solicitud de os Estados Unidos 61/228.915 presentada el 27 de julio de 2009; WO2009/062690; WO2004/008 47; 5.468.634.

Claramente continúa habiendo una necesidad de agente que tengan atributos clínicos que sean óptimos para el desarrollo como agentes terapéuticos. La invención descripta en la presente satisface esta necesidad y proporciona otros beneficios.

Todas las referencias citadas en la presente, incluidas las solicitudes de patente y publicaciones se incorporan a modo de referencia en su totalidad.

SÍNTESIS La invención proporciona anticuerpos anti-Axl y métodos de uso de los mismos.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado que se une a Axl humano, en donde el anticuerpo se une a Axl humano con una afinidad de= 600 pM, en donde el anticuerpos se une a Axl de ratón con una afinidad de= 1 nM. En algunas realizaciones, el anticuerpo promueve la regulación descendente del receptor de Axl. En algunas realizaciones, el anticuerpo inhibe la activación de Axl constitutiva. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un polipéptido que comprende, que consta esencialmente de o que consta de las siguientes secuencias de aminoácidos: MAWRCPRMGRVPLAWCLALCGWACMAPRGTQAEESPFVGNPGNITGARGLTG TLRCQLQVQGEPPEVHWLRDGQILELADSTQTQVPLGEDEQDDWIWSQLRITSL QLSDTGQYQCLVFLGHQTFVSQPGYVG (SEQ ID N.°:1 11 ).

En otras realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo, humano, humanizado o quimérico. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que se une a Axl. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI, en donde el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende GFXiX2X3X4XsX6X7H, en donde Xi es S o T; X2 es L, F o V; X3 es S, T, o R; X4 es G o S; X5 es S, H, T o I; X6 es W o G; X7 es I o L (SEQ ID N.°:112), (b) HVR-H2 que comprende X1X2lX3PX4X5X6X7X8X9XioYYADSVKG) en donde X1 es G o A; X2 es W o G; X3 es N, S, A o P; X4 es Y, A o V; X5 es R, G, o S; X6 es G R o S; X7 es Y, S, H o Y; Xa es A, ?,? P (SEQ ID N.°:1 13) y/o HVR-H2 que comprende XiXalXaP^XsXeXyXeXgXioYYADSVKG, en donde Xi es G o A; X2 es W o G; X3 es N, S, A o P; X4 es Y, A o V; Xs es R, G, o S; Xe es G R o S; X7 es Y, S, H o Y; X8 es A, ?,? P; X9 es cualquier aminoácido o está ausente; X10 es cualquier aminoácido o está ausente (SEQ ID N.°:166); (c) HVR-H3 que comprende ARX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13MDY, en donde X1 es E o W; X2 es Y o R; X3 es S, N o P; X4 es G, D, o L; X5 es W o S; X6 es G, R, A, o S; X7 es G o S; Xa es S o está ausente; X9 es S, Y o está ausente; X10 es V, I o está ausente; Xn es G o está ausente; X12 es Y o está ausente; X13 es A, E o está ausente (SEQ ID N.°:1 14); (d) HVR-L1 que comprende RASQX^Xs tXsXeA, en donde X1 es D, I o S; X2 es V o I; X3 es S, G o R; X4 es T, I, N o R; X5 es A o S; X6 es V o L (SEQ ID N.°:115); (e) HVR-L2 que comprende XiASX2LX3S, en donde X1 es S, A, o V; X2 es F, N o S; X3 es Y o A (SEQ ID . N.°:1 16); y (f) HVR-L3 que comprende QQX1X2X3X4X5X6T, en donde X1 es S o A; X2 es Y, K o N; X3 es T, S, Y, M, R o A; X4 es T, N, S, o F; X5 es P o R; X6 es P, Y, S o L (SEQ ID N.°:1 17).

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-Axl en donde el, anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende GFX1X2X3GX4WIH, en donde Xi es T o S, X2 es F o L, X3 es T o S, X4 es H, S o T (SEQ ID N.°:1 18); (b) HVR-H2 que comprende GWIX1PYX2X3X4X5YYADSVKG, en donde X^ es S, N o A; X2 es G, R o S; Xs es G o R; X4 es S, Y o H; X5 es T, A o P (SEQ ID N.°:1 19); (c) HVR-H3 que comprende AREYX1X2WX3X4SX5X6GYX7MDY, en donde X! es S. N o P; X2 es G o D; X3 es G, R, o A; X4 es G o S; X5 es S o Y; X6 es V o I; X7 es A o E (SEQ ID N.°:120); y (d) HVR-L3 que comprende QQS ??? X2X3X4T, en donde X1 es T, S o Y; X2 es T, N, S o F; X3 es P o R; X4 es P, Y o S (SEQ ID N.°:121 ).

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende (a) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:9, (b) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:12, y (c) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:8.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:7, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:8, y (c) HVR- H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:9.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:10, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:11 , y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:12.

En algunas realizaciones, el anticuerpo además comprende una secuencia marco de dominio variable de cadena liviana o dominio variable de cadena pesada como se muestra en la Figura 3A-B, 4, 5 o 6.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-Axl que comprende (a) una secuencia VH que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:103; (b) una secuencia VL que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:104; o (c) una secuencia VH como en (a) y una secuencia VL como en (b). En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia VH de SEQ ID N.°:103. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia VL de SEQ ID N.°:104. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia VH de SEQ ID N.°:103 y una secuencia VL de SEQ ID N.°:104.

En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo lgG1 de longitud completa.

La invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos de la invención.

La invención además proporciona células huésped que comprenden ácidos nucleicos de la invención.

La invención además proporciona métodos de producción de un anticuerpo que comprende el cultivo de la célula huésped de la invención de manera que se produzca el anticuerpo. En algunas realizaciones, los métodos además comprenden la recuperación del anticuerpo de la célula huésped.

La invención además proporciona un inmunoconjugado que comprende cualquiera de los anticuerpos anti-Axl de la invención y un agente citotóxico.

La invención además proporciona una formulación farmacéutica que comprende cualquiera de los anticuerpos anti-Axl de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica que además comprende un agente terapéutico adicional. En algunas 5 realizaciones, el agente terapéutico adicional se selecciona de un antagonista de VEGF, un antagonista de EFGR, y un agente quimioterapéutico.

La invención además proporciona cualquiera de los anticuerpos anti-Axl descriptos en la presente para el uso como un medicamento. En algunas realizaciones, el uso es para tratar cáncer. En algunas realizaciones, el uso es para tratar un !0 trastorno Inmune, un trastorno cardiovascular, trombosis o diabetes. En algunas realizaciones, el uso es para inhibir la proliferación celular. En algunas realizaciones, el uso es para promover la regulación descendente de Axl. En algunas realizaciones, el uso es para inhibir angiogénesis.

La invención además proporciona cualquiera de los anticuerpos anti-Axl descriptos !5 para la producción de un medicamento. En algunas realizaciones, el medicamento es para el tratamiento del cáncer. En algunas realizaciones, el medicamento es para el tratamiento de un trastorno inmune, un trastorno cardiovascular, trombosis o diabetes. En algunas realizaciones, el medicamento es para inhibir la proliferación celular, inhibir angiogénesis, promover la regulación descendente de 0 AxL, inhibir la metástasis, inhibir la angiogénesis.

La invención además proporciona métodos para tratar un individuo que padece cáncer que comprende la administración al individuo de una cantidad efectiva de cualquiera de los anticuerpos anti-AxI descriptos en la presente. En algunas realizaciones; los métodos comprenden la administración de un agente terapéutico adicional a un individuo. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional se selecciona de un grupo que consta de antagonista de VEGF, un antagonista de EFGR, y un agente quimioterapéutico.

La invención además proporciona métodos para tratar un individuo que padece trastorno inmune, trastorno cardiovascular, trombosis o diabetes que comprende la administración al individuo de una cantidad efectiva de cualquiera de los anticuerpos anti-AxI descriptos en la presente.

La invención además proporciona métodos de inhibir la angiogénesis, inhibir la proliferación celular, promover la regulación descendente del receptor de. Axl o inhibir la metástasis en un individuo que comprende la administración a un individuo de una cantidad efectiva de cualquier anticuerpo anti-AxI descripto en la presente para inhibir la angiogénesis, inhibir la proliferación celular, promover la regulación descendente del receptor de Axl o inhibir la metástasis.

La invención además proporciona métodos para inhibir la activación de Axl constitutiva que comprende la administración al individuo de una cantidad efectiva de cualquiera de los anticuerpos anti-AxI descriptos en la presente para inhibir el Axl constitutivo.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para tratar a un sujeto que padece de un cáncer asociado con la mutación de activación de EGFR o una amplificación de genes de EGFR, en donde el sujeto a desarrollado resistencia al tratamiento con un antagonista de EGFR, que comprende determinar si el sujeto presenta expresión de AxI, una mutación de activación de AxI o una amplificación de genes de AxI, y administrar a aquellos sujetos que tienen una mutación de activación de AxI o una amplificación de genes de AxI un antagonista de EGFR y cualquiera de los anticuerpos anti-Axl descriptos en la presente.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para tratar un sujeto que padece de un cáncer asociado con una mutación de activación de EGFR o una amplificación de genes de EGFR, que comprende: (i) monitorear a un sujetos que se trata con un antagonista de EGFR para determinar si el sujeto desarrolla expresión de AxI, una mutación de activación de AxI o una amplificación de genes de AxI, y (i¡) modificar el régimen de tratamiento de un sujeto para incluir cualquiera de los anticuerpos anti-Axl descriptos en la presente además del antagonista de EGFR donde el sujeto ha desarrollado mutación de activación de AxI o una amplificación de genes de AxI.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para tratar un sujeto que padece de un cáncer asociado con una mutación de activación de EGFR o una amplificación de genes de EGFR, que comprende: (i) monitorear a sujeto que se trata con antagonista de EGFR para determinar si el sujeto desarrolla una resistencia al inhibidor, (ii) evaluar al sujeto para determinar si el sujeto presenta la expresión de AxI, una mutación de activación de AxI o una amplificación de genes de AxI, y (iii) modificar el régimen de tratamiento del sujeto para incluir cualquiera de los anticuerpos anti-Axl descriptos en la presente además del antagonista de EGFR donde el sujeto tiene una mutación de activación de AxI o una amplificación de genes de AxI.

En un aspecto, la invención proporciona métodos de evaluar un antagonista de EGFR, que comprende: (i) monitorear a una población de sujetos que se trata con antagonista de EGFR para identificar aquellos sujetos que desarrollan una resistencia al agente terapéutico, (ii) evaluar los sujetos resistentes para determinar si los sujetos presentan expresión de AxI, una mutación de activación de AxI o una amplificación de genes de AxI, y (iii) modificar el régimen de tratamiento de los sujetos para incluir cualquiera de los anticuerpos anti-Axl descriptos en la presente además del antagonista de EGFR donde los sujetos tienen expresión de AxI, una mutación de activación de AxI o una amplificación de genes de AxI.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para reducir la fosforilación de EGFR en una célula cancerígena, en donde dicha célula cancerígena ha adquirido resistencia a un antagonista de EGFR, y en donde dicha célula comprende una mutación de activación de AxI o una amplificación de genes de AxI, que comprende la etapa de poner en contacto la célula con cualquiera de los anticuerpos anti-Axl descriptos en la presente y un antagonista de EGFR.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para reducir la señalización mediada por PI3K en una célula cancerígena, en donde dicha célula cancerígena ha adquirido resistencia a un antagonista de EGFR, y en donde dicha célula comprende expresión de AxI, una mutación de activación de AxI o una amplificación de genes de AxI, que comprende la etapa de poner en contacto la célula con cualquiera de los anticuerpos anti-AxI descriptos en la presente y un antagonista de EGFR.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para reducir la señalización mediada por EGFR en una célula cancerígena, en donde dicha célula cancerígena ha adquirido resistencia a un antagonista de EGFR, y en donde dicha célula comprende expresión de AxI, una mutación de activación de AxI o una amplificación de genes de AxI, que comprende la etapa de poner en contacto la célula con cualquiera de los anticuerpos anti-AxI descriptos en la presente y un antagonista de EGFR.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para restaurar la sensibilidad de una célula cancerígena a un antagonista de EGFR, en donde dicha célula cancerígena ha adquirido resistencia a un antagonista de EGFR, y en donde dicha célula comprende expresión de AxI, una mutación de activación de AxI o una amplificación de genes de AxI, que comprende poner en contacto la célula con cualquiera de los anticuerpos anti-AxI descriptos en la presente y un antagonista de EGFR.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para reducir el crecimiento o proliferación de una célula cancerígena, en donde dicha célula cancerígena ha adquirido resistencia a un antagonista de EGFR, y en donde dicha célula comprende expresión de AxI, una mutación de activación de AxI o una amplificación de genes de AxI, que comprende la etapa de poner en contacto la célula con cualquiera de los anticuerpos ant¡-Axl descriptos en la presente y un antagonista de EGFR.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para aumentar la apoptosis de una célula cancerígena, en donde dicha célula cancerígena ha adquirido resistencia a un antagonista de EGFR, y en donde dicha célula comprende expresión de Axl, una mutación de activación de Axl o una amplificación de genes de Axl, que comprende la etapa de poner en contacto la célula con cualquiera de los anticuerpos ant¡-Axl descriptos en la presente y un antagonista de EGFR.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para reducir la resistencia de una célula cancerígena a un antagonista de EGFR, en donde dicha célula cancerígena ha adquirido resistencia a un antagonista de EGFR, y en donde dicha célula comprende una mutación de activación de Axl o una amplificación de genes de Axl, que comprende la etapa de poner en contacto la célula con cualquiera de los anticuerpos ant¡-Axl descriptos en la presente y un antagonista de EGFR.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para tratar resistencia adquirida a un antagonista de EGFR en una célula cancerígena, en donde dicha célula comprende una mutación de activación de Axl o un amplificación de genes de Axl, que comprende poner en contacto la célula con cualquier a de los anticuerpos anti-Axl descriptos en la presente y un antagonista de EGFR.

En algunas realizaciones, la célula cancerígena es cualquier cáncer generado por EGFR. En algunas realizaciones, la célula cancerígena comprende una mutación de activación de EGFR. En algunas realizaciones, la célula cancerígena comprende una amplificación de genes de EGFR. En algunas realizaciones, la amplificación de genes de EGFR es al menos 2 veces. En algunas realizaciones, la amplificación de Axl es al menos 2 veces. En algunas realizaciones, la célula cancerígena comprende una mutación de genes de EGFR asociada con una mayor resistencia a un antagonista de EGFR. En algunas realizaciones, la mutación de genes de EGFR asociada con una mayor resistencia a una antagonista de EGFR es una mutación T790M de EGFR. En algunas realizaciones, el antagonista de EGFR es un agente terapéutico de molécula pequeña, agente terapéutico de ácido nucleico, o un agente terapéutico de proteína. En algunas realizaciones, el antagonista de EGFR es un anticuerpo, una molécula antisentido, o un inhibidor de quinasa de molécula pequeña. En algunas realizaciones, el antagonista de EGFR es un inhibidor de quinasa de EGFR seleccionado del grupo que consta de: gefitinib, erlotinib, cetuximab, pantinumumab. En algunas realizaciones, el antagonista de EGFR es un anticuerpo anti-EGFR seleccionado del grupo que consta de: cetuximab, panitumumab. En algunas realizaciones, el agente terapéutico de ácido nucleico es una molécula de ARNip.

En un aspecto, la invención proporciona métodos de identificación de un sujeto como un candidato para el tratamiento con un antagonista de EGFR y cualquiera de los anticuerpos anti-AxI descriptos en la presente, en donde dicho sujeto se ha tratado con un antagonista de EGFR y padece de cáncer que ha adquirido resistencia a dicho antagonista de EGFR, que comprende detectar la expresión de AxI, una mutación de activación de AxI o una amplificación de genes de AxI en una célula cancerígena de dicho sujeto.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para identificar un sujeto que se trata con un antagonista de EGFR y que tiene riesgo de adquirir resistencia a dicho antagonista de EGFR, que comprende detectar la presencia de la expresión de AxI, una mutación de activación de AxI o un amplificación de genes de AxI en una célula cancerígena de dicho sujeto, en donde la presencia de dicha expresión de AxI, mutación de activación de AxI o una amplificación de genes de AxI indica riesgo de adquirir dicha resistencia.

En ün aspecto, la invención proporciona métodos para tratar a un sujeto que padece de un cáncer que es resistente a tratamiento con un antagonista de EGFR, que comprende la administración a un sujeto de una antagonista de EGFR y cualquiera de los anticuerpos anti-Axl descriptos en la presente.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para tratar a un sujeto que padece de un cáncer asociado con la mutación de activación de EGFR o una amplificación de genes de EGFR, en donde el sujeto a desarrollado resistencia al tratamiento con un antagonista de EGFR, que comprende determinar si el sujeto presenta expresión de AxI, como niveles y/o actividad de AxI elevados, y administrar a aquellos sujetos que tienen expresión de AxI, como antagonista de EFGR de actividad de AxI elevada y cualquiera de los anticuerpos anti-Axl descriptos en la presente.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para tratar un sujeto que padece de un cáncer asociado con una mutación de activación de EGFR o una amplificación de genes de EGFR, que comprende: (i) monitorear a un sujeto que se trata con un antagonista de EGFR para determinar si el sujeto desarrolla expresión de AxI, como actividad de AxI y/o niveles elevados, y (ii) modificar el régimen de tratamiento del sujeto para incluir cualquiera de los anticuerpos anti-Axl descriptos en la presente además del antagonista de EGFR donde el sujeto ha desarrollado expresión de AxI, como actividad y/o niveles de AxI elevados.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para tratar un sujeto que padece de un cáncer asociado con una mutación de activación de EGFR o una amplificación de genes de EGFR, que comprende: (i) monitorear a sujeto que se trata con antagonista de EGFR para determinar si el sujeto desarrolla una resistencia al inhibidor, (ii) evaluar al sujeto para determinar si el sujeto presenta la expresión de AxI, como actividad y/o niveles elevados de AxI, y (Ni) modificar el régimen de tratamiento del sujeto para incluir cualquiera de los anticuerpos anti-Axl descriptos en la presente además del antagonista de EGFR donde el sujeto tiene actividad y/o niveles elevados de AxI.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para (i) restaurar a sensibilidad de una célula cancerígena a un antagonista de EGFR, (ii) reducir la resistencia de una célula cancerígena a un antagonista de EGFR, y/o (iii) tratar la resistencia adquirida a antagonista de EGFR en una célula cancerígena, mediante poner en contacto la célula con una antagonista de EGFR y cualquiera de los anticuerpos anti-Axl descriptos en la presente. En realizaciones ejemplares, la célula cancerígena ha adquirido una resistencia a una antagonista de EGFR y comprende niveles elevados de expresión y/o actividad de Axl, por ejemplo, asociados con una mutación de activación en el gen de Axl, y una amplificación de genes de Axl, o una activación de Axl mediada por Gas6. Los métodos descriptos en la presente pueden utilizarse para restaurar la sensibilidad, reducir la resistencia y/o tratar una resistencia adquirida de una célula cancerígena.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para reducir el crecimiento y/o proliferación de una célula cancerígena, o aumentar apoptosis de una célula cancerígena, al poner en contacto la célula con un antagonista de EGFR y cualquiera de los anticuerpos anti-Axl descriptos en la presente. En realizaciones ejemplares, la célula cancerígena ha adquirido una resistencia a una antagonista de EGFR y comprende expresión y/o actividad elevada de Axl, por ejemplo, asociados con una mutación de activación en el gen de Axl, y una amplificación de genes de Axl, o una activación de Axl mediada por Gas6.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIGURAS 1A-F: Las secuencias bucle de HVR de cadena liviana y cadena pesada de anticuerpos anti-FGFR3. Las figuras muestran las secuencias HVR de cadena pesada, H1 , H2, y H3, y secuencias HVR de cadena liviana, L1 , L2, y L3. Las posiciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat como se describe en la presente.

FIGURA 2: mostrar las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y regiones variables de cadena liviana de anticuerpos anti-Axl. FIGURAS 3A-B y 4: muestra secuencias marco consenso humanas aceptantes ejemplares para el uso en la práctica de la presente invención con los identificadores de secuencia de la siguiente manera: Marcos consenso pesada variable (VH) (FIG. 3A-B) marco consenso de subgrupo I VH humana menos CDRs de Kabat (SEQ ID N.°:131 -133 y 125, respectivamente, en orden de aparición) marco consenso de subgrupo I VH humana menos regiones hipervariables extendidas (SEQ ID N.°:134-135, 133, 125, 134-136, 125, 134-135, 137, y 125, respectivamente, en orden de aparición) marco consenso de subgrupo II VH humana menos CDRs Kabat (SEQ ID N.°:138-140, y 125, respectivamente, en orden de aparición) marco consenso de subgrupo II VH humana menos regiones hipervariables extendidas (SEQ ID N.°:141-142, 140, 125, 141-143, 125, 141-142, 144, y 125, respectivamente, en orden de aparición) marco consenso de subgrupo II VH humana menos marco consenso de subgrupo III VH humana extendida menos CDRs Kabat (SEQ ID N.°: 145-147 y 125, respectivamente, en orden de aparición) marco consenso de subgrupo III VH humana menos regiones hipervariables extendidas (SEQ ID N.°: 122-123, 147, 125, 122-123, 148, 125, y 122-125, respectivamente, en orden de aparición) marco aceptante VH humana menos CDRs Kabat (SEQ ID N.°:149, 146, 150, y 125, respectivamente, en orden de aparición) marco aceptante VH humana menos las regiones hipervariables extendidas (SEQ ID N.°:122-123, 150, 125, 122-123, 151 , y 125, respectivamente, en orden de aparición) marco 2 aceptante VH humana menos CDRs Kabat (SEQ ID N.°:149, 146, 152, y 125, respectivamente, en orden de aparición) marco 2 aceptante humana VH menos regiones hipervariables extendidas (SEQ ID N.°:122-123, 152, 125, 122-123, 153, 125, 122-123, 154, y 125, respectivamente, en orden de aparición) Marcos consenso variable liviana (VL) (FIG. 4) marco consenso de subgrupo I kappa VL (SEQ ID N.°:126-129, respectivamente, en orden de aparición) marco consenso de subgrupo II kappa humana VL (SEQ ID N.°:155-157 y 129, respectivamente, en orden de aparición) marco consenso dé subgrupo III kappa VL humana (SEQ ID N.°:158-160 y 129, respectivamente, en orden de aparición) marco consenso de subgrupo IV kappa VL humana (SEQ ID N.°: 161-163 y 129, respectivamente, en orden de aparición) FIGURA 5: Muestra las secuencia de región marco de liviana huMAb4D5-8 (SEQ ID N.°: 126-127, 164, y 129, respectivamente, en orden de aparición) y cadenas pesadas (SEQ ID N.°:122-123, 154, y 125, respectivamente, en orden de aparición). Los números en superíndice/negrita indica posiciones de aminoácidos de acuerdo con Kabat.

FIGURA 6: muestra las secuencias de región marco variante/ modificada de huMAb4D5-8 liviana (SEQ ID N.°: 126-129, respectivamente, en orden de aparición) y cadenas pesadas (SEQ ID N.°:122-125, respectivamente, en orden de aparición). Los números en superíndice/negrita indica posiciones de aminoácidos de acuerdo con Kabat.

FIGURAS 7A-H: La caracterización de AxI mAb YW327.6S2. A-B. La medición de afinidad de YW327.6S2 utilizando BIAcore. Las tasas de asociación (kon) y tasas de disociación (koff) se calcularon utilizando el modelo de unión Langmuir uno a uno. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se derivó de la relación ml n, C. Reactividad cruzada de YW327.6S2. YW327.6S2 reacciona en forma cruzada con el AxI cinomologo y murino, pero no con Tyro3 o Mer. Las placas se recubrieron con IgG Fe antihumano, y luego se incubaron con AxI, Mer, Tyro3 Fes humano, AxIFcs murino o cinomologo. Luego del lavado, el anticuerpo de control de isótopo o YW327.6S2 se agregó seguido de HRP conjugado IgG antihumano. D-E. YW327.6S2 bloquea Gas6 que se une a AxI. Fig. 7D: ELISA. Las placas se recubrieron con IgG Fe antihumano y se incubaron con Axl-Fc humano. Luego del lavado, Gas6 se agregó con anticuerpos o sin éstos. Unión de Gas6 se detectó mediante anticuerpo anti-Gas6 biotilinado y conjugado de estreptavidina-HRP. Fig. 7E: FACS. HUVECs se recolectaron y trataron con YW327.6S2 o anticuerpo de control y luego se incubaron con Gas6 durante 30 minutos sobre hielo. La unión de Gas6 a superficie celular se detectó con anticuerpo anti-Gas6 biotinilado y conjugado de estreptavidina-PE. F. YW327.6S2 regula en forma descendente la expresión de AxI. Las células A549 se incubaron con 1 pg/ml YW327.6S2 durante el tiempo indicado, y una expresión de AxI de la superficie celular se determinó mediante FACS (panel superior), y expresión de proteína total mediante análisis Western Blotting (panel inferior). G. YW327.6S2 inhibe señalización y fosforilación de AxI inducida por Gas6. Las células H1299 se cultivaron en medio libre de suero durante la noche, se preincubaron con YW327.6S2 durante 4 hrs, y se trataron con Gas6 durante 30 minutos. AxI fosforilado se midió mediante ELISA (panel superior), y Akt fosforilado mediante análisis Western Blotting (panel inferior). H. YW327.6S2 inhibe el crecimiento celular de Baf3Axl. Las células Baf3Axl se cultivaron en un medio que contiene 200 ng/ml Gas6, y se trataron con YW327.6S2 en las concentraciones indicadas durante 72 hrs. La viabilidad celular se midió mediante ensayo CelITiter.

FIGURAS 8A-F: YW327.6S2 atenúa el crecimiento de tumor de xenoinjerto A549 y mejora el efecto de anti-VEGF. A. La curva del crecimiento de tumor. mAbs se administraron IP a 10 mg/kg (YW327.6S2 y anticuerpo de control de isótopo) o 1 mg/kg (anti-VEGF), dos veces a la semana, comenzando cuando el tamaño de tumor promedio alcance 100 mm3 (día 0). Las barras de error representan el error estándar del promedio (n=10 para cada grupo en cada experimento). p=0,0003 (YW327.6S2 versus control), p=10"11 (YW327.6S2 versus combinación). B. Curva de Kaplan-Meier de varios grupos de tratamiento. Los ratones se retiraron del estudio cuando el tamaño del tumor alcanzó 800 mm3, y los animales restantes en cada grupo (% restante) se graficaron. C. 12A11 aumenta el efecto de anti-VEGF. 12A11 y anti-VEGF se administraron IP a 30 mg/kg y 1 mg/kg, respectivamente, dos veces por semana, comenzando cuando el tamaño del tumor promedio alcanzó 100 mm3 (día 0). Las barras de error representan el error estándar del promedio (n=10 para cada grupo en cada experimento). p=0,006 (12A11 versus control); p=0,0001 (12A11 versus combinación). D. YW327.6S2 regula en forma descendente la expresión de AxI. Los ratones se trataron con YW327.6S2 a 10 mg/kg y los tumores se extirparon en los puntos de tiempo indicados. Los lisados celulares de tumores se analizaron mediante Western blot para la expresión de Axl. E. YW327.6S2 induce apoptosis. Los tumores se trataron con control o YW327.6S2 durante 2 semanas se extirparon y CC3 IHC se llevó a cabo para medir apoptosis. F. YW327.6S2 aumenta el efecto de anti-VEGF en la reducción de la densidad vascular intra-tumoral. Los tumores de ratones se trataron como se mencionó anteriormente en D se extirparon a 0 y 72 hr con posterioridad a la dosis y la vasculatura de tumor se visualizó mediante la tinción con inmunohistoquímica MECA32 mediante análisis de imagen (expresada como micrones cuadrados). El ensayo de Student se llevó a cabo para cada par (p<0,05 para control vs combinación).

FIGURAS 9A-B: YW327.6S2 aumenta el efecto antitumor de erlotinib y quimioterapia en el modelo de xenoinjerto A549. A. YW327.6S2 aumenta el efecto de erlotinib. La administración de anticuerpo fue la misma que en la Fig. 2. Erlotinib se administró por sonda oral a 100 mg/kg/día. n=10 para cada grupo. p=1 ,7X10"9 (YW327.6S2 versus control), p=2,3X10"10 (YW327.6S2 versus combinación). B. YW327.6S2 mejora la quimioterapia. La administración del anticuerpo fue la misma que en la Fig.2. Paclitaxel y carboplatino se administraron en forma subcutánea a 6,25 mg/kg/día durante 5 días, y 100 mg/kg por una solo dosis al comienzo del tratamiento (día 0), respectivamente. n=10 para cada grupo. p=3X10"5 (YW327.6S2 versus control), p=10"9 (quimioterapia versus control), p=10' 5 (combinación versus quimioterapia sola).

FIGURAS 10A-G: YW327.6S2 atenúa crecimiento de tumor de xenoinjerto MDA-MB-231 mediante las modulación de las funciones estromales del tumor. A & B.

YW327.6S2 pero no 12A11 reduce el crecimiento de tumor MDA-MB-231 y mejora el efecto de anti-VEGF. mAbs se administraron IP a 20 mg/kg (YW327.6S2 y anticuerpo de control de isótopo) o 30 mg/kg (12A11 ) y 2 mg/kg (anti-VEGF), dos veces a la semana, comenzando cuando el tamaño de tumor alcanzó 100 mm3 (día 0). Las barras de error representan el error estándar del promedio (n=10 para cada grupo en cada experimento). p=8,5X10"6 (YW327.6S2 versus control), p=2,8X10"8 (YW327.6S2 versus combinación), p=0,05 (12A11 vs control), p= 0,145 (anti-VEGF vs combinación). C & D. YW327.6S2 regula en forma descendente la expresión de AxI. Los tumores que tiene tumores xenoinjerto MDA-MB231 (tamaño promedio 500 mm3) se trataron con mAbs a 20 mg/kg y los tumores se extirparon en los puntos de tiempo indicados. Los lisados celulares de tumores se utilizaron en el análisis Western blot para la expresión del AxI. E. YW327.6S2 reduce la densidad de la vasculatura asociada con tumor. Los tumores de ratones se trataron como se mencionó anteriormente en C se extirparon a 0 hr y 1 semana con posterioridad a la dosis y la vasculatura de tumor se visualizó mediante la tinción con inmunohistoquímica MECA32 y se cuantificó mediante análisis de imagen (expresada como micrones cuadrados). La prueba t de Student se llevó a cabo para cada par (p<0,05 para YW327.6S2 vs control, anti-VEGF vs control, y anti-VEGF vs combinación). F. AxI es altamente expresando en la infiltración de macrófagos de cáncer de mama humano primario. La inmunohistoquímica se utilizó para examinar 79 tumores primarios. 21 % de estos tumores expresaron altos niveles de AxI en los macrófagos de infiltración. Los macrófagos se identificaron mediante la tinción con anti-CD68, y la expresión de AxI sobre macrófagos se determinó mediante anti-Axl/CD68 dual IHC. Las secciones en serie se utilizaron. G. YW327.6S2 inhibe la secreción de citoquina/ quimiocina inflamatoria de macrófagos asociados con tumor. Los ratones que tienen tumores xenoinjerto MDA-MB231 (tamaño promedio 500 mm3) se trataron con anticuerpo de control, YW327.6S2 o 12A11 a 20 mg/kg y los tumores se extirparon luego de I semana de tratamiento. Los macrófagos asociados con tumor se aislaron mediante la selección de células positivas F4/80 y se cultivaron durante la noche. Las citoquinas y quimiocinas se segregaron en el medio se midieron utilizando kit de ensayo de citoquina de ratón Bio-Plex.

FIGURAS 11A-B: YW327.6S2 reduce la metástasis de MDA-MB-231 células de cáncer de mama al hueso. A. Imagen de bioluminiscencia 4 semanas después de la inyección en la vena de la cola de células de tumor. Los ratones se inyectaron en forma intraperitoneal (i.p.) con 200 µ? de 25 mg/ml D-luciferina (Invitrogen) en PBS y se anestesiaron durante la formación de la imagen utilizando isoflurano a través de la via nasal. Las imágenes de bioluminiscencia se adquirieron en el Photon Imager (Biospace Lab, Paris, Francia) que tiene una cámara dispositivo acoplada a carga intensificada. B. H & E tinción de las secciones de tibia. Los tejidos se recolectaron al final de los experimentos y se fijaron en 4% e formaldehído, se dividieron en secciones y se tiñeron con H & E. El círculo en el panel superior muestra las células de tumor que invaden el hueso. El panel inferior muestra detalles de células neoplásicas en la, médula ósea.

FIGURA 12: Una secuencia de Axl human ejemplar de RefSeq NM_001699. (SEQ ID N.°:165).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES DE LA INVENCIÓN DEFINICIONES Un "marco humano aceptante" a los fines de la presente es un marco que comprende la secuencia de aminoácidos de un marco de dominio variable de cadena liviana (VL) o un marco de dominio variable de cadena pesada (VH) derivado de un marco de inmunoglobulina o un marco consenso humano, como se define a continuación. Un marco humano aceptante "derivado de" un marco de inmunoglobulina humano o marco consenso humano puede comprender la misma secuencia de aminoácidos del mismo, o puede contener cambios de secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, el número de cambios de aminoácidos es 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos. En algunas realizaciones, el marco humano aceptante VL es idéntico en secuencia a la secuencia marco de inmunoglobulina humana VL o secuencia marco consenso humana.

"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). Salvo que se indique del modo contrario, como se utiliza en la presente "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1 :1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, un anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X para su compañero Y puede representarse generalmente por la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse por métodos comunes conocidos en la técnica, con inclusión de aquellos descriptos en la presente. Las realizaciones ejemplares e ilustrativas para medir la afinidad de unión se describen a continuación.

Un anticuerpo de "afinidad madura" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVRs), en comparación con un anticuerpo progenitor que no posee dichas alteraciones, tales alteraciones que dan por resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo para el antígeno.

Un "trastorno angiogénico" se refiere a una desregulación de angiogénesis, con inclusión de condiciones no neoplásicas y neoplásicas. Las condiciones neoplásicas incluyen, a título ilustrativo, aquellas descriptas a continuación (véase, por ejemplo, "Cáncer"). Los trastornos no neoplásicos incluyen a título ilustrativo hipertrofia no deseada o aberrante, artritis, artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), psoriasis, placas psoriáticas, sarcoidosis, aterosclerosis, placas ateroscleróticas, diabetes y otras retinopatías proliferativas con inclusión de retinopatía de premadurez, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneración macular relacionada con la edad, edema macular diabético, neovascularización de cornea, neovascularización de injerto de cornea, rechazo de injerto de cornea, neovascularización de retina/ de coroide, neovascularización de ángulo (rubeosis), enfermedad neovascular ocular, restenosis vascular, malformaciones arteriovenosas (AVM, por sus siglas en inglés), meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias de tiroide (con inclusión de la enfermedad de Grave), trasplante de cornea y otro tejido, inflamación crónica, inflamación de pulmón, lastimadura de pulmón aguda /ARDS, sepsis, hipertensión pulmonar primaria, efusiones pulmonares malignas, edema cerebral (por ejemplo, asociada con accidente cerebro vascular agudo / herida de cabeza cerrada / trauma), inflamación sinovial, formación de pannus en RA, miositis osificante, formación ósea hipertrófica, osteoartritis (OA), ascitis refretaria, enfermedad de ovario poliquístico, endometriosis, tercer espacio de enfermedad de fluido (pancreatitis, síndrome de compartimiento, quemaduras, enfermedad de intestino), fibroides uterinos, parto prematuro, inflamación crónica, como IBD (enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa), rechazo de aloinjerto renal, enfermedad de intestino inflamatoria, síndrome nefrótico, crecimiento de masa de tejido no deseado aberrante (no-cáncer), articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, inhibición de crecimiento capilar, síndrome de Osler-Weber, granuloma piogénico fibroplasias retrolentales, esclerodermia, tracoma, adhesiones vasculares, sinovitis, dermatitis, preeclampsia, ascitis, efusión pericardial (como la asociada con pericarditis), y efusión pleural.

Un agente antiangiogénico se refiere a un compuesto que bloquea o interfiere en cierto grado con el desarrollo de los vasos sanguíneos. Un agente antiangiogénico puede, por ejemplo, ser una molécula pequeña o un anticuerpo que se une a un factor de crecimiento o receptor de factor de crecimiento involucrado en la promoción de angiogénesis. En una realización, el agente antiangiogénico es un anticuerpo que se une a un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), como bevacizumab (AVASTIN7).

Los términos "anticuerpo anti-AxI" o "anticuerpo que se une a AxI" se refieren a un anticuerpo que es capaz de unirse a AxI con suficiente afinidad de manera que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o agente terapéutico para atacar a Axl. En una realización, la extensión de la unión de un anticuerpo anti-Axl a una proteína non-Axl no relacionada es menos de aproximadamente 10% de la unión del anticuerpo a Axl como se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en inglés). En ciertas realizaciones, un anticuerpo que se une a Axl tiene una consta de disociación (Kd) de= 1 µ?, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, = 0,1 nM,= 0,01 nM, o= 0,001 nM (por ejemplo, 10"8 M o menos, por ejemplo, de 10"8 M a 10"13 M, por ejemplo, de 10"9 M a 10~13 M). En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-Axl se une a un epítopo de Axl que se conserva dentro de Axl de especies diferentes.

El término "anticuerpo" en la presente se utiliza en el sentido más amplio y abarca varias estructuras de anticuerpo, con inclusión a título ilustrativo de anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpo siempre que presente la actividad de unión al antígeno deseada.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta del anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une el antígeno al que el anticuerpo intacto se une. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen a título ilustrativo, fragmentos Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena única (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo.

Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" como un anticuerpo de referencia se refiere a una anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competición en 50% o más, y por el contrario, el anticuerpo de referencia bloque la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competición en un 50% o más. Un ensayo de competición ejemplar se proporciona en la presente.

El término "AxI," como se utiliza en la presente, se refiere a AxI nativo de cualquier fuente vertebrada, con inclusión de mamíferos como primates (por ejemplo, humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), salvo que se indique de otro modo. El término abarca "longitud completa", AxI no procesado así como cualquier forma de AxI que resulta del procesamiento en una célula. El término también abarca variantes que ocurren naturalmente de AxI, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de un AxI humano ejemplar se muestra en la Figura 12.

"Activación de AxI" se refiere a la activación, o fosforilación, del receptor AxI. Generalmente, la activación de AxI da por resultado en la transducción de señal (por ejemplo, que es provocada por un dominio quinasa intracelular de residuos de tirosina fosforilantes del recepto de AxI en AxI o un polipéptido de sustrato). La activación de AxI puede estar mediada por unión de ligando de AxI (Gas6) a un receptor de AxI de interés. La unión de Gas6 a AxI puede activar el dominio de quinasa de AxI y de este modo dar por resultado la fosforilación de los residuos de tirosina en el AxI y/o fosforilación de residuos de tirosina en polipéptidos de sustrato adicionales.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la afección patológica en mamíferos que es típicamente caracterizada por la proliferación/ crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, a título ilustrativo, carcinoma, linfoma (por ejemplo, linfoma de Hodgkin y linfoma de no Hodgkin), blastema, sarcoma, y leucemia. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer celular escamoso, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, adenocarcinoma del pulmón, carcinoma escamoso de pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de endometrial o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, leucemia y otros trastornos linfoproliferativos, y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello.

Los términos "trastorno proliferativo celular" y "trastorno proliferativo" se refiere a trastornos que están asociados en cierto grado a la proliferación celular anormal. En una realización, el trastorno proliferativo celular es cáncer.

Un "agente quimioterapéutico" se refiere a un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes, como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN®); alquil sulfonatos, como busulfan, improsulfan y piposúlfan; aziridinas, como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas con inclusión de altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacin y bullatacinona); delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapacona; lapacol; colchicinas; ácido betulínico; una camptotecina (con inclusión del análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®), CPT-1 1 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, scopolectin, y 9-aminocamptotecina); briostatina; callistatina; CC-1065 (con inclusión de sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (con inclusión de los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1 ); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; spongistatina; mostazas nitrogenadas, como clorambucil, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas, como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimnustina; antibióticos, como antibióticos de enedina (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gammal l y calicheamicina omegah (véase, por ejemplo, Nicolaou ef ai, Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); CDP323, un inhibidor alpha-4 integrina oral; dinemicina, con inclusión de dinemicina A; una esperamicina; así como neocarzinostatin cromofor y cromoforos de antibiótico de cromoproteina enedina relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (con inclusión de ADRIAMYCIN®, morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina, inyección de doxorubicin HCI liposoma (DOXIL®), liposomal doxorubicina TLC D-99 (MYOCET®), liposomal doxorubicina pegilada (CAELYX®), y deoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, streptonigrina, streptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos, como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), una epotilona, y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico, como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos pirimidina, como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales, como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico, como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfomitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides, como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; pfenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazonica; triaziquona; 2,2',2,-triclorotrietilamina; tricotecenes (especialmente toxina T-2, verracurin A, roridin A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); tiotepa; taxoide, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®), formulación de nanopartícula diseñada con albúmina de paclitaxel (ABRAXANE™), y docetaxel (TAXOTERE®); cloranbucil; 6-tioguanina; mercaptopurlna; metotrexato; agentes de platinio, como cisplatina, oxaliplatina (por ejemplo, ELOXATIN®), y carboplatina; vincas, que previenen que la polimerización de tubuliná forme microtúbulos, con inclusión de vinblastina (VELBAN®), vincristina (ONCOVIN®), vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®), y vinorelbina (NAVELBINE®); etoposido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; leucovorina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluormetilornitina (DMFO); retinoides, como ácido retinoico, con inclusión de bexaroteno (TARGRETIN®); bisfosfonatos, como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® o OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, ácido zoledronico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®), o risedronato (ACTONEL®); troxacitabina (un análogo de citosina de nucleósido de 1 ,3-dioxolano); oligonucleotidos antisentido, particularmente aquéllos que inhiben la expresión de genes en los trayectos de señalización implicados en la proliferación celular aberrante, como PKC-alpha, Raf, H-Ras, y receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGF-R, por sus siglas en inglés); vacunas, como vacuna THERATOPE® y vacunas de terapia de gen, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN®, y vacuna VAXID®; inhibidor de topoisomerasa 1 (por ejemplo , LURTOTECAN®); rmRH (por ejemplo, ABARELIX®); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-11248 (sunitinib, SUTENT®, Pfizer); perifosina, inhibidor COX-2 (por ejemplo, celecoxib o etoricoxib), inhibidor de proteosoma (por ejemplo, PS341 ); bortezomib (VELCADE®); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; inhibidor Bcl-2, como sodio de oblimersen (GENASENSE®); pixantrona; inhibidores de EGFR (ver definición a continuación); inhibidores de tirosina quinasa (ver definición a continuación); inhibidores de serina-treonina quinasa, como rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®); inhibidores de farnesiltransferas, como lonafarnib (SCH 6636, SARASAR™); y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores, como CHOP, una abreviación para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, y prednisolona; y FOLFOX, una abreviación para un régimen de tratamiento con oxaliplatina (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovorina.

Agentes quimioterapéuticos como se define en la presente incluyen "agentes antihormonales" o "terapéuticos endocrino" que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos que las hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer. Pueden ser hormonas mismo, incluidas sin limitación: anti-estrógenos con perfil agonista/antagonista mezclado, con inclusión de tamoxifen (NOLVADEX®), 4-hidroxitamoxifen, toremifeno (FARESTON®), idoxifeno, droloxifeno, raloxifeno (EVISTA®), trioxifeno, keoxifeno, y moduladores de receptor de estrógeno receptivos (SERMs), como SERM3; a ti-estrógenos puros sin propiedades agonistas, como fulvestrant (FASLODEX®), y EM800 (dichos agentes pueden bloquear la dimerización del receptor de estrógeno (ER, por sus siglas en inglés), inhibir la unión a ADN, aumentar el rendimiento de ER, y/o suprimir los niveles de ER); inhibidores de aromatasa, con inclusión de aromatasa esteroide, como formestano y exemestano (AROMASIN®), e inhibidores de aromatasa sin esteroide, como anastrazol (ARIMIDEX®), letrozol (FEMARA®) y aminoglutetimida, y otros inhibidores de aromatasa incluyen vorozol (RIVISOR®), acetato de megestrol (MEGASE®), fadrozol, y 4(5)-imidazoles; agonistas de hormona de liberación de hormona leuteinizante, con inclusión de leuprolida (LUPRON® y ELIGARD®), goserelin, buserelin, y tripterelin; estereoides sexuales, con inclusión de progestinas, como acetato de megestrol y acetato de medroxiprogesterona, estrógenos, como dietilstilbestrol y premarin, y andrógenos/retinoides, como fluoximesterona, todo ácido transretionico y fenretinida; onapristona; anti-progesteronas; reguladores por disminución de receptor de estrógeno (ERD, por sus siglas en inglés); anti-andrógenos, como flutamida, nilutamida y bicalutamida; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores.

El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de cadena pesada y/o liviana deriva de una especie o fuente particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o liviana deriva de una especie o fuente diferente.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio contante o región constante poseída por su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos. IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varias otras de éstas pueden además dividirse en subclases (isotipos), por ejemplo, Igd, lgG2, lgG3, lgG4, IgA^ y lgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden con diferentes clases de inmunoglobulinas son llamados a, d, e, ?, y µ, respectivamente.

El término "constitutivo" como se utiliza en la presente, aplicado a la actividad de quinasa de recepto, se refiere a la actividad de señalización continua de un receptor que no es dependiente de la presencia de un ligando u otras moléculas activadoras. Según la naturaleza del receptor, toda las actividad puede ser constitutiva o la actividad del receptor puede además activarse mediante la unión de otras moléculas (por ejemplo, ligandos). Los eventos celulares que llevan a la activación de receptores son muy conocidos dentro de aquellos con experiéncia normal en la técnica. Por ejemplo, la activación puede incluir oligomerización, por ejemplo, dimerización, trimerización, etc. en complejos de receptor de orden superior. Los complejos pueden comprender una sola especie de proteína, es decir, un complejo homomérico. En forma alternativa, los complejos pueden comprender al menos dos especies de proteína diferentes, es decir, un complejo heteromérico. La formación del complejo puede provocarse, por ejemplo, por la sobreexpresion de formas normales o mutantes de receptor en la superficie de una célula. La formación del complejo también puede ser provocada por una mutación o mutaciones específicas en un receptor.

El término "agente citostático" se refiere a un compuesto o composición que detiene el crecimiento de un célula ya sea in vitro o in vivo. Por lo tanto, un agente citostático puede ser uno que reduzca de manera significativa el porcentaje de células en fase S. Otros ejemplos de agentes citostáticos incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular mediante la inducción de la detención de G0/G1 o detención de la fase M. El anticuerpo anti-Her2 humanizado trastuzumab (HERCEPTIN®) es un ejemplo de un agente citostático que induce la detención de G0/G1. Los bloqueadores de fase M clásicos incluyen vincas (por ejemplo, vincristina y vinblastina), taxanos, y inhibidores II de toposisomerasa, como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposido, y bleomicina. Ciertos agentes que detiene G1 también se esparcen en la detención de la fase S; por ejemplo, agentes alquilantes ADN, como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C. Asimismo, puede encontrarse información en Mendelsohn and Israel, eds., The Molecular Basis of Cáncer, Capítulo 1 , titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995), por ejemplo, p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos contra el cáncer los cuales derivan del árbol tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado del tejo europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamblaje de microtubulos de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos mediante la prevención de la depolimerización, que da por resultado la inhibición de la mitosis en las células.

El término "agente citotóxico" como se utiliza en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa la muerte o destrucción de las células. Los agentes citotóxicos incluyen a título ilustrativo isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi2 2, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos o fármacos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca, vincristina, vinblastina, etoposido), doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorubicin u otros agentes intercalantes) agentes inhibidores de crecimiento; enzimas y fragmentos de los mismos como enzimas nucleotícas, antibióticos y toximas, como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacterial, fungicida, vegetal o animal, con inclusión de fragmentos o variantes e los mismos, y varios agentes antitumor y anticáncer descriptos a continuación.

"Funciones efectoras" se refiere a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe de un anticuerpo, que varia con e isótopo de anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: citotoxicidad dependiente de complemento (CDC, por sus siglas en inglés) y unión C1q; unión a receptor Fe; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B), y activación de célula B.

Una "cantidad efectiva" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad efectiva, en dosis y por periodos de tiempo necesario, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

El término "región Fe" en la presente se utiliza para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fe de secuencia nativa y regiones de Fe variantes. En una realización, una región Fe de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, a la terinal carboxilo de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina de C (Lys447) de la región Fe puede o no puede estar presente. Salvo que específicamente se determine de otro modo en la presente, la numeración de los residuos de aminoácido en la región Fe o la región constante están de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

"Marco" o "FR" se refiere a residuos de dominio variable distintos de los residuos de región hipervariable (HVR, por sus siglas en inglés). El FR de un dominio variable generalmente consta de cuatro dominios FR. FR1 , FR2, FR3, y FR4. Por consiguiente, los HVR y secuencias FR generalmente aparecen en la siguiente secuencia en VH (o VL). FR1-H1(L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Los términos "anticuerpo de longitud completa," "anticuerpo intacto," y "anticuerpo completo" como se utiliza en la presente se utilizan de manera indistinta para hacer referencia a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo nativo o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fe como se define en la presente.

Los términos "célula huésped," "línea de célula huésped," y "cultivo de célula huésped" se utilizan en la presente de manera indistinta y hacen referencia a las células en las que se ha introducido un ácido nucleico exógeno, con inclusión de la progenie de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y células transformadas" que incluyen la célula transformada primaria y progenie deriva da la misma independientemente del número de pasajes. La progenie puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a la célula progenitora, pero puede contener mutaciones. La progenie muíante que tienen la misma función o actividad biológica como se clasifica o selecciona en la célula originalmente transformada se incluye en la presente.

Un "anticuerpo humano" es aquél que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a aquella de un anticuerpo producido por un humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión al antígeno no humanos.

Un "marco consenso humano" es un marco que representa los residuos de aminoácidos que ocurren más comúnmente en una selección de secuencias marco VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991 ), vols. 1-3. En una realización, para la VL, el subgrupo es un subgrupo kappa I como en Kabat et al., supra. En una realización, para la VH, el subgrupo es un subgrupo III como en Kabat et al., supra.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácidos de HVRs no humanas y residuos de aminoácidos de FRs humanas. En ciertas realizaciones, un anticuerpo humanizado comprenderá sustanclalmente todos o al menos uno, y típicamente dos, dominios variables en los cuales todas o sustancialmente todas las HVRs (por ejemplo, CDRs) corresponden a aquellas de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FRs corresponden a aquellas de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado, en forma opcional, puede comprender al menos una porción de una región constante de un anticuerpo que deriva de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que ha sufrido la humanización.

El término "región hipervariable" o "HVR," tal como se utiliza en la presente, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable del anticuerpo las cuales son hipervariables en bucles definidos estructuralmente en secuencia y/o forma ("bucles hipervariables"). En general, los anticuerpos nativos de cuatro cadenas comprenden seis HVRs; tres en la VH (H1 , H2, H3), y tres en la VL (L1 , L2, L3). Las HVRs generalmente comprenden residuos de aminoácidos de los bucles hipervariables y/o de las "regiones que determinan la complementariedad" (CDRs), y las últimas son las que poseen la variabilidad de secuencia más alta y/o se involucran en el reconocimiento de antígenos. Los bucles hipervariables ejemplares ocurren en los residuos de los aminoácidos 26-32 (L1 ), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1 ), 53-55 (H2), y 96-101 (H3). (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) Las CDRs ejemplares (CDR-L1 , CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1 , CDR-H2, y CDR-H3) ocurren en los residuos de los aminoácidos 24-34 de L1 , 50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de H1 , 50-65 de H2, y 95-102 de H3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991 ).) Con la excepción de CDR1 en VH, las CDRs generalmente comprenden los residuos de los aminoácidos que forman los bucles hipervariables. Las CDRs también comprenden "residuos que determinan la especificidad," o "SDRs," que son residuos que contactan al antígeno. Las SDRs se encuentran dentro de las regiones de las CDRs llamadas CDRs abreviadas, o a-CDRs. Las a-CDRs ejemplares (a-CDR-L1 , a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1 , a-CDR-H2, y a-CDR-H3) ocurren en los residuos de los aminoácidos 31-34 de L1 , 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1 , 50-58 de H2, y 95-102 de H3. (Véase Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008).) Excepto indicación en contrario, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, residuos de FR) se enumeran en la presente de acuerdo a Kabat et al., supra.

Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado a una o más moléculas heterólogas, con la inclusión entre otros de un agente citotóxico.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, entre otros, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, humanos y primates no humanos como los monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En ciertas realizaciones, el individuo o sujeto es un humano.

"Inhibición del crecimiento o proliferación celular" significa la disminución del crecimiento o proliferación celular en al menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 100%, e incluye la inducción de la muerte celular. Un anticuerpo "aislado" es aquél que se ha separado de un componente de su medioambiente natural. En algunas realizaciones, un anticuerpo se purifica a una pureza mayor al 95% o 99% como se determinó, por ejemplo, mediante electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, intercambio de iones o HPLC de fase reversa). Para un resumen de los métodos para la evaluación de la pureza del anticuerpo, véase, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007). Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que ha sido separada de un componente de su medioambiente natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico dentro de células que normalmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico se encuentra presente en forma extracromosomática o en una ubicación cromosomal que es diferente de su ubicación cromosomal natural. "Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-Axl" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y livianas de los anticuerpos (o fragmentos de los mismos), con la inclusión de aquellas moléculas de ácido nucleico en un vector único o en vectores separados, y aquellas moléculas de ácido nucleico presentes en una o más ubicaciones en una célula huésped.

El término "independiente del ligando" tal como se utiliza en la presente, como por ejemplo se aplica a la actividad de señalización de los receptores, se refiere a la actividad de señalización que no depende de la presencia de un ligando. Un receptor que posee una actividad de quinasa independiente del ligando no imposibilitará necesariamente la unión del ligando a ese receptor para producir la activación adicional de la actividad de la quinasa.

El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen el mismo epítopo, excepto por los posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones que ocurren en forma natural o que surgen durante la producción de una preparación de un anticuerpo monoclonal. Dichas variantes generalmente se encuentran presentes en pequeñas cantidades. En contraste con las preparaciones de los anticuerpos policlonales, las cuales típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra distintos determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un determinante único en un antígeno. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo se obtuvo de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse que necesita la producción del anticuerpo mediante ningún método específico. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se utilizarán de acuerdo con la presente invención pueden realizarse mediante una variedad de técnicas, con la inclusión entre otras, del método de hibridoma, métodos de ADN recombinante, métodos de exhibición de fagos, y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o una parte de los lugares de inmunoglobina humana. Dichos métodos y otros métodos ejemplares para realizar anticuerpos monoclonales se describen en la presente.

Un "anticuerpo desnudo" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado a una porción heteróloga (por ejemplo, una porción citotóxica) o radiomarcada. El anticuerpo desnudo puede estar presente en una formulación farmacéutica.

"Anticuerpos nativos" se refiere a las moléculas de inmunoglobulina que ocurren en forma natural con estructuras que varían. Por ejemplo, los anticuerpos IgG nativos son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltones, compuestas por dos cadenas livianas idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que se encuentran enlazadas por disulfuro. Desde el N- al C-terminal, cada cadena pesada posee una región variable (VH), también llamada un dominio pesado variable o un dominio variable de cadena pesada, seguido de tres dominios constantes (CH1 , CH2, y CH3). En forma similar desde el N- al C-terminal, cada cadena liviana posee una región variable (VL), también llamada un dominio liviano variable o un dominio variable de cadena liviana, seguido de un dominio (CL) liviano constante. La cadena liviana de un anticuerpo puede asignarse a uno de dos tipos, llamados kappa (?) y lambda (?), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.

El término "prospecto" se utiliza para referirse a las instrucciones que normalmente se incluyen en los paquetes comerciales de los productos terapéuticos, que contiene información acerca de las indicaciones, uso, dosis, administración, terapia de combinación, contraindicaciones y/o advertencias con respecto al uso de dichos productos terapéuticos.

"Porcentaje (%) de identidad de la secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de polipéptidos de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia de polipéptidos de referencia, luego de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para obtener el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de la secuencia. La alineación a los fines de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos puede obtenerse de varias maneras que se encuentran dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, mediante la utilización de software disponible al público como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Aquellos expertos en el área pueden determinar parámetros apropiados para la alineación de secuencias, con la inclusión de todo algoritmo necesario para alcanzar la alineación máxima a lo largo de toda la longitud de las secuencias que se comparan. A los fines de la presente, sin embargo, los valores de % de la identidad de secuencia de aminoácidos se generan mediante el programa de computación de comparación de secuencias ALIGN-2. Genentech, Inc. es el autor del programa de computación de comparación de secuencias ALIGN-2 y el código fuente ha sido presentado con documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los Estados Unidos, Washington D.C., 20559, en donde se encuentra registrado bajo el Registro de Derechos de Autor de los Estados Unidos N° TXU510087. El programa ALIGN-2 se encuentra disponible al público en Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede compilarse del código fuente. El programa ALIGN-2 debe compilarse para su uso en un sistema operativo UNIX, con la inclusión de UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias son establecidos por el programa ALIGN-2 y no cambian.

En situaciones en donde se utiliza el ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una determinada secuencia de aminoácidos A en comparación o en relación a una determinada secuencia de aminoácidos B (que puede expresarse en forma alternativa como una secuencia de aminoácidos A determinada que posee o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos en comparación o en relación a una secuencia de aminoácidos B determinada) se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción X/Y en donde X es la cantidad de residuos de aminoácidos acumulados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación de ese programa de A y B, en donde Y es la cantidad total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no sea igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no será igual que el % de identidad de secuencia de aminoácidos B con respecto a A. Excepto indicación en contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos utilizados en la presente se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente anterior, mediante la utilización del programa de computación ALIGN-2.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a la preparación que se encuentra en una forma que permita la actividad biológica de un ingrediente activo incluido en ella para ser efectivo, y que no contiene componentes adicionales que son tóxicos en forma inaceptable para un sujeto al cual se administrará la formulación. Un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, el cual es no tóxico para un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, entre otros, un buffer, excipiente, estabilizador o conservante.

Tal como se utiliza en la presente, "tratamiento" (y las variantes gramaticales del mismo como "tratar" o "tratando") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar el curso natural del individuo que se está tratando, y puede llevarse a cabo para la profilaxis o durante el curso de una patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, entre otros, la prevención de la ocurrencia o recurrencia de una enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de toda consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de la metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejoría o alivio del estado de la enfermedad, y disminución o mejora del diagnóstico. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se utilizan para retrasar la enfermedad o para demorar la progresión de la enfermedad.

El término "tumor" se refiere al crecimiento y proliferación de todas las células neoplásticas, ya sean malignas o benignas, y todas las células y tejidos pre-cancerosos o cancerosos. Los términos "cáncer", "canceroso", "trastorno proliferativo celular", "trastorno prol iterativo" y "tumor" no son exclusivos entre sí, como se hace referencia en la presente.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de la cadena liviana o pesada de un anticuerpo involucrada en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena liviana (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo generalmente tiene estructuras similares, y cada dominio comprende cuatro regiones marco conservadas (FRs) y tres regiones hipervariables (HVRs). (Véase, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6ta ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007).) Un dominio VH o VL único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión al antígeno. Además, los anticuerpos que unen un antígeno específico pueden aislarse mediante la utilización de un dominio VH o VL de un anticuerpo que une el antígeno para examinar una biblioteca de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véase, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991 ).

El término "vector," tal como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al cual se encuentra enlazado. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico que se autoreplica así como también el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la cual se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los cuales se encuentran enlazados en forma operativa. En la presente se hace referencia a dichos vectores como "vectores de expresión." Un "marco de consenso del subgrupo III VH" comprende la secuencia de consenso obtenida de las secuencias de aminoácidos en el subgrupo III pesado de Kabat et al. En una realización, la secuencia de aminoácidos del marco de consenso del subgrupo III VH comprende al menos una porción o cada una de todas las siguientes secuencias: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID N.°:122)-H1-WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID N.°:123)-H2- RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID N.°:124)-H3-WGQGTLVTVSS (SEQ ID N.°:125).

Un "marco consenso de subgrupo I VL" comprende la secuencia consenso obtenida de las secuencias de aminoácidos en el subgrupo I kappa liviano variable de Kabat et al. En una realización, la secuencia de aminoácidos marco consenso del subgrupo I VH comprende al menos una porción o cada una de todas las siguientes secuencias: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID N.°:126)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID N.°:127)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID N.°:128)-L3- FGQGTKVEIK (SEQ ID N.°:129).

COMPOSICIONES Y MÉTODOS En un aspecto, la invención se basa, en parte, en la identificación de una variedad de agentes de unión a Axl (como anticuerpos y fragmentos de los mismos). Axl presenta un blanco terapéutico importante y ventajoso, y la invención proporciona composiciones y métodos en base a la unión a agentes de Axl. Los agentes de unión a Axl de la invención, como se describe en la presente, proporcionan agentes de diagnóstico y terapéuticos importantes para el uso en el ataque a afecciones patológicas asociadas con la expresión y/o actividad de las vías de señalización de Axl. En ciertas realizaciones, se proporcionan los anticuerpos que se unen a Axl. Los anticuerpos de la invención son útiles, por ejemplo, para el diagnóstico o tratamiento del cáncer.

Anticuerpos Anti-Axl Ejemplares En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos aislados que se unen a Axl. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-Axl une Axl humano con una afinidad de = 550 pM, y en algunas realizaciones, se une Axl de ratón con una afinidad de <1 nM. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Axl se une a Axl de ratón y humano.

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Axl induce la regulación descendente de la expresión del receptor de Axl en una superficie celular (por ejemplo, una superficie celular de tumor). En algunas realizaciones, la expresión Axl de superficie celular se reduce a menos de 80% de expresión de superficie celular de Axl en ausencia de tratamiento de anticuerpo Axl. En algunas realizaciones, la expresión de la superficie célula se reduce a menos de 70%, menos de 60%, menos de 50% o menos de 40% de expresión en superficie celular de AxI en ausencia de tratamiento de anticuerpo AxI. En algunas realizaciones, la expresión total de AxI en una célula (por ejemplo, una célula de tumor) se reduce a menos de 80% de la expresión de AxI total en ausencia de tratamiento de anticuerpo AxI. En algunas realizaciones, la expresión de AxI total se reduce a menos de 70%, menos de 60%, menos de 50% o menos de 40% de expresión de AxI total en ausencia de tratamiento de anticuerpo AxI. En algunas realizaciones, la regulación descendente de la expresión de AxI en ausencia de tratamiento de anticuerpo AxI. En algunas realizaciones, la regulación descendente de la expresión de AxI ocurre rápidamente y dura al menos 24 horas.

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-AxI inhibe la actividad de AxI constitutivo.

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-AxI no reacciona en forma cruzada significativamente con Sky o Mer. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-AxI no se une significativamente a Sky o Mer y se une a AxI de humano o de ratón. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-AxI inhibe la actividad de AxI.

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-AxI promueve la apoptosis de una célula, por ejemplo, una célula de tumor, como una célula de tumor A549. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-AxI inhibe el ligando e AxI (por ejemplo, gas6) que se une a AxI. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-AxI inhibe la señalización corriente debajo de AxI. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Axl inhibe la proliferación celular dependiente de Gas-6. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-AxI inhibe la expresión de citoquina inflamatoria de macrófagos asociados a tumor. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Axl inhibe el crecimiento y/o metástasis de tumor mediante la modulación de la función estromal del tumor.

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Axl se une a un polipéptido que comprende, que consta esencialmente de o que consta de las siguientes secuencias de aminoácidos: MAWRCPRMGRVPLAWCLALCGWACMAPRGTQAEESPFVGNPGNITGARGLTG TLRCQLQVQGEPPEVHWLRDGQILELADSTQTQVPLGEDEQDDWIWSQLRITSL QLSDTGQYQCLVFLGHQTFVSQPGYVG (SEQ ID N.°:111 ).

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Axl se une a un polipéptido que comprende, que consta esencialmente de o que consta de las siguientes secuencias de aminoácidos: ITVLPQQPRNLHLVSRQPTELEVAWTPGLSGIYPLTHCTLQAVLSDDGMGIQAGE PDPPEEPLTSQASVPPHQLRLGSLHPHTPYHIRVACTSSQGPSSWTHWL (SEQ ID N.°:130).

En algunas realizaciones, el anticuerpo une a un polipéptido que comprende, que consta esencialmente de o que consta de los aminoácidos número 1-122 de la secuencia de aminoácido de Axl humano maduro.

En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un polipéptido que comprende, que consta esencialmente de o que consta de los aminoácidos número 221-234 de la secuencia de aminoácido de Axl humano maduro.

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Axl une a una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98% de identidad de secuencia o similaridad con la secuencia MAWRCPRMGRVPLAWCLALCGWACMAPRGTQAEESPFVGNPGNITGARGLTG TLRCQLQVQGEPPEVHWLRDGQILELADSTQTQVPLGEDEQDDWIWSQLRITSL QLSDTGQYQCLVFLGHQTFVSQPGYVG (SEQ ID N.°:111).

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-AxI une a una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98% de identidad de secuencia o similaridad con la secuencia ITVLPQQPRNLHLVSRQPTELEVAWTPGLSGIYPLTHCTLQAVLSDDGMGIQAGE PDPPEEPLTSQASVPPHQLRLGSLHPHTPYHIRVACTSSQGPSSWTHWL (SEQ ID N.°:130).

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionados de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID N.°:1 ; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID N.°:2; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:3; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:4; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:5; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:6.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionados de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID N.°:7; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:8; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:9; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:10; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:11 ; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:12.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-Axl qúe comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:13; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:14; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:15; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:16; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:17; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:18.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-Axl que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID N.°:19; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID N.°:20; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:21 ; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:22; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:23; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:24.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-Axl que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:25; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:26; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:27; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:28; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:29; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:30.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:31 ; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:32; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:33; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:34; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:35; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:36.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionados de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:37; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:38; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:39; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:40; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:41 ; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:42.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:43; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:44; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:45; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:46; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:47; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:48.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:49; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:50; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:51 ; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:52; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:53; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:54.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:55; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:56; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:57; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:58; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:59; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:60.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:61 ; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:62; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:63; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:64; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:65; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:66.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:67; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:68; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:69; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:70; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:71 ; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:72.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:73; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:74; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:75; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:76; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:77; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:78.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-Axl que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:79; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID N.°:80; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:81 ; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:82; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:83; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:84.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-Axl que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:85; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:86; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:87; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:88; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:89; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:90.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-Axl que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:91 ; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:92; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:93; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:94; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:95; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:96.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionados de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:97; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:98; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:99; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:100; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:101 ; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:102.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos una, dos o las tres secuencias de HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:1 , (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:2, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:3.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos una, dos o las tres secuencias de HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:7, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:8, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:9.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos una, dos o las tres secuencias de HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:13, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:14, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:15.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos una, dos o las tres secuencias de HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:19, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:20, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:21.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos una, dos o las tres secuencias de HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:25, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:26, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:27.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos una, dos o las tres secuencias de HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:31 , (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:32, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:33.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos una, dos o las tres secuencias de HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:37, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:38, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:39.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos uno dos lo las tres secuencias de HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:43, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:44, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:45.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos una, dos o las tres secuencias de HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:49, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:50, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:51.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos una, dos o las tres secuencias de HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:55, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:56, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:57.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos una, dos o las tres secuencias de HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:61 , (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:62, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:63.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos una, dos o las tres secuencias de HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:67, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:68, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:69.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos una, dos o las tres secuencias de HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:73, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:74, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:75.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos una, dos o las tres secuencias de HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:79, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:80, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:81.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos uno dos lo las tres secuencias de HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:85, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:86, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:87.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI que comprende al menos una, dos o las tres secuencias de HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:91 , (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:92, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:93.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-Axl que comprende al menos una, dos o las tres secuencias de HVR VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:97, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:98, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:99.

En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:3. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID N.°:9. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:15. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:21. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:27. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:33. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:39. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:45. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:51. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:57. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:63. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:69. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:75. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:81. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID N.°:87. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:93. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:99.

En otra realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:3 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:6. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:9 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:12. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:15 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:18. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:21 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:24. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:27 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:30. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID N.°:33 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:36.

En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:39 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:42. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:45 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:48. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:51 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:54. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:57 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:60. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:63 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:66. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:69 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:72. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:75 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:78. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:81 and HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:84. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:87 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:90. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:93 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N:°:96. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:99 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 102.

En otra realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:3, HVR-L3 que comprende la secuencia dé aminoácidos de SEQ ID N.°:6 y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:2. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:9, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:12 y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:8. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:15, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:18 y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:14. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:21 , HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:24 y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:20. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:27, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:30 y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:26. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:33, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:36 y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:32. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:39, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:42 y HVR-H2 que. comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:38. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:45, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:48 y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:44. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:51 , HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:54 y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:50. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:57, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:60 y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:56. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID N.°:63, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:66 y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:62. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:69, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:72 y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:68. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:75, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:78 y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:74. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:81 , HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:84 y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:80. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:87, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:90 y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:86. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:93, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:96 y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:92. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:99, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:102 y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:98.

En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:1 ; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:2; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:3. En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:7; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:8; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:9. En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:13, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:14 y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:15. En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:19; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:20; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:21. En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:25; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 26 y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:27. En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:31 ; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:32; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:33. En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:37; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:38; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:39. En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:43; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:44; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:45. En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:49; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:50; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:51. En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:55; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:56; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:57. En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID N.°:61 ; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:62; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:63. En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:67; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:68; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:69. En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:73; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:74; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:75. En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:79; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:80; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:81. En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:85; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:86¡ y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:87. En una realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:91 ; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:92; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:93. En otra realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:97; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:98; y (c)HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:99.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos uno dos lo las tres secuencias de HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:4, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:5, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:6.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos uno dos lo las tres secuencias de HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:10, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:11 , y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:12.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos uno dos lo las tres secuencias de HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:16, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:17, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:18.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos uno dos lo las tres secuencias de HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:22, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:23, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:24.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos uno dos lo las tres secuencias de HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:28, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:29, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:30.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos uno dos lo las tres secuencias de HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:34, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:35, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:36.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos uno dos lo las tres secuencias de HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:40, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:41 , y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:42.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos uno dos lo las tres secuencias de HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:46, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:47, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:48.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos uno dos lo las tres secuencias de HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:52, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:53, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:54.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos uno dos lo las tres secuencias de HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:58, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:59, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:60.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos uno dos lo las tres secuencias de HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:64, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:65, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:66.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos uno dos lo las tres secuencias de HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:70, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:71 , y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:72.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos uno dos lo las tres secuencias de HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:76, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:77, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:78.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos uno dos lo las tres secuencias de HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:82, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:83, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:84.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos uno dos lo las tres secuencias de HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:88, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:89, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:90.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos uno dos lo las tres secuencias de HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:94, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:95, y (C) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:96.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos uno dos lo las tres secuencias de HVR VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:100, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:101 , y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:102.

En una realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:4; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:5; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:6. En una realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:10; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:11 ; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:12. En una realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:16, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:17 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:18. En una realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:22; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:23; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:24. En una realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:28; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 29 y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:30. En una realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:34; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:35; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:36. En una realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:40; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:41 ; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:42. En una realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:46; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:47; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:48. En una realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:52; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:53; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:54. En una realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:58; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:59; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:60. En una realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID N.°:64; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:65; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:66. En una realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:70; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:71 ; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:72. En una realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:76; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:77; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:78. En una realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:82; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:83; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:84. En una realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:88; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:89; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:90. En una realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:94; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:95; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:96. En una realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:100; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:101 ; y (c)HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:102.

En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos uno, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:1 , (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:2, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:3; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:4, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:5, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:6. En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos uno, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VH seleccionadas de(i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:7, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:8, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:9; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:10, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:11 , y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:12.

En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos uno, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VH seleccionadas de(i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:13, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:14, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:15; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:16, (¡i) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:17, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SE ID NO:18.

En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos uno, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VH seleccionadas de(i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:19, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:20, y (¡ii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:21 ; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:22, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:23, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24.

En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos uno, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VH seleccionadas de(i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:25, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:26, y (iü) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:27; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:28, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:29, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30.

En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos uno, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:31 , (¡i) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:32, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:33; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:34, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:35, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36.

En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos uno, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:37, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:38, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:39; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:40, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:41 , y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42.

En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos uno, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VH seleccionadas de(¡) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:43, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:44, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:45; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:46, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:47, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48.

En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos uno, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:49, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:50, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:51 ; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:52, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:53, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54.

En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos uno, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:55, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:56, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:57; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:58, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:59, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:60.

En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos uno, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VH seleccionadas de(¡) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:61 , (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:62, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:63; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:64, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:65, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:66.

En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos uno, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:67, (i¡) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:68, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:69; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:70, (i¡) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:71 , y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:72.

En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos uno, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:73, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:74, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:75; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:76, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:77, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:78.

En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos uno, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VH seleccionadas de(¡) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:79, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:80, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:81 ; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:82, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:83, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:84.

En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos uno, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:85, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:86, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:87; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:88, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:89, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:90.

En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos uno, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:91 , (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:92, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:93; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:94, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:95, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:96.

En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos uno, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID IM.°:97, (¡i) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:98, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID N.°:99; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o todas las tres secuencias HVR VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:100, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:101 , y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:102.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:1; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:2; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:3; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:4; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:5; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:6.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:7; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:8; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:9; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:10; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:11 ; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:12.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:13; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:14; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:15; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:16; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:17; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:18.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:19; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:20; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:21 ; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:22; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:23; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:24.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:25; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:26; (c) HVR-H3 que comprende la , secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:27; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:28; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:29; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:30.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:31 ; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:32; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:33; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:34; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:35; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:36.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:37; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:38; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:39; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:40; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:41 ; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:42.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:43; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:44; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:45; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:46; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:47; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:48.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:49; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:50; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:51 ; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:52; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:53; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:54.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:55; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:56; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:57; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:58; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:59; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:60.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:61 ; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:62; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:63; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:64; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:65; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:66.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:67; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:68; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:69; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:70; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:71 ; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:72.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:73; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:74; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:75; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:76; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:77; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:78.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:79; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:80; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:81 ; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:82; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:83; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:84.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:85; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:86; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:87; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:88; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:89; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:90.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:91; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:92; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:93; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:94; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:95; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:96.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:97; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:98; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:99; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:100; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:101 ; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:102.

En ciertas realizaciones, cualquiera de uno o más aminoácidos del anticuerpo anti-Axl tal como se proporcionó con anterioridad, se sustituyen o están ausentes en las siguientes posiciones de HVR: -en HVR-H1 (SEQ ID N.°:7): posiciones 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10; -en HVR-H2 (SEQ ID N.°:8): posiciones 1 , 2, 4, 6, 7, 8, 9 y 10; -en HVR-H3 (SEQ ID N.°:9): posiciones 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 4 o 5; -en HVR-L1 (SEQ ID N.°:10): posiciones 5, 6, 7, 8, 9 y 10; -en HVR-L2 (SEQ ID N.°:11): posiciones 1 , 4, y 6; -en HVR-L3 (SEQ ID N.°:12): posiciones 3, 4, 5, 6, 7 y 8.

En ciertas realizaciones, las sustituciones son sustituciones conservadoras, tal como se establece en la presente. En ciertas realizaciones, una o más de las siguientes sustituciones pueden realizarse en cualquier combinación: -en HVR-H1 (SEQ ID N.°:7): S28T; L29F o V: S30T o R; G31S; S32H, T o I; W33G; I34L; - en HVR-H2 (SEQ ID N.°:8): G49A; W50G; N52S, A, o P; Y53A o V; R54G o S; G55S o R; Y56S o H; A57T o P; -en HVR-H3 (SEQ ID N.°:9): E95W; Y96R; S97N o P; G98D o L; W99S; G100R, A, o S; G100aS; S100b ausente; S100cY o ausente; VIOOdl o ausente; G100e o ausente; Y100f o ausente, A100gE o ausente; -en HVR-L1 (SEQ ID N.°:10): D28I o S; V29I; S30G o R; T31 I, N o R; A32S; V33L; -en HVR-L2 (SEQ ID N.°:11 ):S50A o V; F53N o S; Y55A; -en HVR-L3 (SEQ ID N.°:12): S91A; Y92K o N; T93S, Y, M, R, o A; T94N, F, o S; P95R; P96Y, S, o L.

En ciertas realizaciones, una o más de las siguientes sustituciones pueden realizarse en cualquier combinación: -en HVR-H1 (SEQ ID N.°:7): S28T; L29F o V: S30T; G31S; S32H, T o I; - en HVR-H2 (SEQ ID N.°:8): N52S, o A; R54G o S; G55R; Y56S, o H; A57T O P; -en HVR-H3 (SEQ ID N.°:9): S97N o P; G98D; G100 S; -en HVR-L3 (SEQ ID N.°:12): T93S, o Y; T94N, F, o S.

Todas las combinaciones posibles de las sustituciones anteriores se encuentran incluidas en las secuencias de consenso: -HVR-H1 (SEQ ID N.°:112): GFW2X3X4X5X6X7H, en donde X1 es S o T; X2 es L, F o V; X3 es S, T, o R; X4 es G o S; X5 es S, H, T o I; X6 es W o G; X7 es I o L; -en HVR-H2 (SEQ ID N.°:113): W2IX3PX4X5X6X7X8YYADSVKG, en donde X! es G o A; X2 es W o G; X3 es N, S, A o P; X4 es Y, A o V; X5 es R, G, o S; Xe es G R o S; X7 es Y, S, H o Y; Xa es A, T, o P; y/o (SEQ ID N.°:166): XiXzlXaPXtXsXeXy e X9X10YYADSVKG, en donde X1 es G o A; X2 es W o G; X3 es N, S, A o P; X4 es Y, A o V; X5 es R, G, o S; X6 es G R o S; X7 es Y, S, H o Y; X8 es A, T, o P; X9 es cualquier aminoácido o está ausente; X-io es cualquier aminoácido o está ausente; -en HVR-H3 (SEQ ID N.°:114): ARXi X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13MDY, en donde X, es E o W; X2 es Y o R; X3 es S, N o P; X4 es G, D, o L; X5 es W o S; X6 es G, R, A, o S; X7 es G o S; Xe es S o está ausente; X9 es S, Y o está ausente; X 0 es V, I o está ausente; Xn es G o está ausente; ??2 es Y o está ausente; X13 es A, E o está ausente; -en HVR-L1 (SEQ ID N.°:115): RASQXiX2X3X4X5X6A, en donde X-, es D, I o S; X2 es V o I; X3 es S, G o R; X4 es T, I, N o R; X5 es A o S; Xe es V o L; -en HVR-L2 (SEQ ID N.°:116): XiASX2LX3S, en donde X, es S, A, o V; X2 es F, N o S; X3 es Y o A; -en HVR-L3 (SEQ ID N.°:117): QQX^Xs X4 XsXeT, en donde X1 es S o A; X2 es Y, K o N; X3 es T, S, Y, M, R o A; X4 es T, N, S, o F; X5 es P o R; Xe es P, Y, S o L. En algunas realizaciones, se proveen las siguientes secuencias de consenso: -en HVR-H1 (SEQ ID N.°:118): GFXiX2X3GX4WIH, en donde X! es T o S, X2 es F o L, X3 es T o S, X4 es H, S o T; -en HVR-H2 (SEQ ID N.°:119): GWIXiPYX^WsYYADSVKG, en donde X! es S, N o A; X2 es G, R o S; X3 es G o R; X4 es S, Y o H; X5 es T, A o P; -en HVR-H3 (SEQ ID N.°:120): AREYXiX2WX3X4SX5X6GYX7MDY, en donde X1 es S, N o P; X2 es G o D; X3 es G, R, o A; X4 es G o S; X5 es S o Y; Xe es V o I; X7 es A o E; -en HVR-L3 (SEQ ID N.°:121 ): QQSYXiX2X3X4T, en donde Xi es T, S o Y; X2 es T, N, S o F; X3 es P o R; X es P, Y o S.

En otro aspecto, un anticuerpo anti-AxI comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:103, 105, 107 o 109. En ciertas realizaciones, una secuencia VH que tiene al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o eliminaciones relativas a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-AxI que comprende esa secuencia conserva la habilidad de unirse a Axl. En ciertas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en SEQ ID N.°:103, 105, 107 o 109. En ciertas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones ocurren en regiones fuera de las HVRs (es decir, en las FRs). En forma opcional, el anticuerpo anti-AxI comprende la secuencia VH en SEQ ID N.°:103, 105, 107 o 109, con la inclusión de modificaciones post-translacionales de esa secuencia. En una realización particular, VH comprende una, dos o tres HVRs seleccionadas de: (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:1 , 7, 13, 19, 25, 31 , 37, 43, 49, 55, 61 , 67, 73, 79, 85, 91, o 97, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:2, 8, 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, o 98, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:3, 9, 15, 21 , 27, 33, 39, 45, 51 , 57, 63, 69, 75, 81 , 87, 93 o 99. En una realización particular, VH comprende una, dos o tres HVRs seleccionadas de: (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:7, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N °:8, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:9.

En otro aspecto, se provee un anticuerpo anti-AxI, en donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena liviana (VL) que posee al merlos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:104, 106, 108 o 110. En ciertas realizaciones, una secuencia VL que posee al menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o eliminaciones a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-AxI que comprende esa secuencia conserva la habilidad de unirse a PRO. En ciertas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se ha sustituido, insertado y/o eliminado en SEQ ID N.°:104, 106, 108 o 110. En ciertas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones ocurren en regiones fuera de las HVRs (es decir, en las FRs). En forma opcional, un anticuerpo anti-AxI comprende la secuencia VL en SEQ ID N.°:104, 106, 108 o 110, con la inclusión de modificaciones post-translacionales de esa secuencia. En una realización particular, la VL comprende una, dos o tres HVRs seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:4, 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, o 100; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:5, 11 , 17, 23, 29, 35, 41 , 47, 53, 59, 65, 77, 83, 89, 95, o 101 ; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96 o 102. En una realización particular, la VL comprende una, dos o tres HVRs seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:10; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:11 ; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:12.

En otro aspecto, se provee un anticuerpo anti-AxI, en donde el anticuerpo comprende una VH como en cualquiera de las realizaciones que se proporcionaron con anterioridad. En algunas realizaciones, el anticuerpo además comprende una VL. En una realización, el anticuerpo comprende la secuencia VH en SEQ ID N.°:103. En una realización, el anticuerpo comprende la secuencia VH en SEQ ID N.°:105. En una realización, el anticuerpo comprende la secuencia VH en SEQ ID N.°:107. En una realización, el anticuerpo comprende la secuencia VH en SEQ ID N.°:109.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-AxI, en donde el anticuerpo comprende una VL como en cualquiera de las realizaciones que se proporcionaron con anterioridad. En algunas realizaciones, el anticuerpo además comprende una VH. En una realización, el anticuerpo comprende la secuencia VL en SEQ ID N.°:104. En una realización, el anticuerpo comprende la secuencia VL en SEQ ID N.°:106. En una realización, el anticuerpo comprende la secuencia VL en SEQ ID N.°:108. En una realización, el anticuerpo comprende la secuencia VL en SEQ ID N.°:110.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-AxI, en donde el anticuerpo comprende una VH como en cualquiera de las realizaciones que se proporcionaron con anterioridad, y una VL como en cualquiera de las realizaciones que se establecieron con anterioridad. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID N.°:103 y SEQ ID N.°:104, respectivamente, con la inclusión de modificaciones post-translacionales de dichas secuencias. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID N.°:105 y SEQ ID N.°:106, respectivamente, con la inclusión de modificaciones post-translacionales de dichas secuencias. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID N.°:107 y SEQ ID N.°:108, respectivamente, con la inclusión de modificaciones post-translacionales de dichas secuencias. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID N.°:109 y SEQ ID N.°:110, respectivamente, con la inclusión de modificaciones post-translacionales de dichas secuencias.

Los anticuerpos de la invención pueden comprender cualquier secuencia de dominio variable marco adecuada, siempre que se conserve en forma considerable la actividad de unión a Axl. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden comprender una secuencia consenso marco de cadena pesada del subgrupo III humana. En una realización de estos anticuerpos, la secuencia de consenso marco comprende una sustitución en la posición 71 , 73, y/o 78. En algunas realizaciones de estos anticuerpos, la posición 71 es A, 73 es T y/o 78 es A. En una realización, estos anticuerpos comprenden secuencias marco de dominio variable de cadena pesada de huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (a los cuales se hace referencia también en la Patente de los Estados Unidos N.° 6.407.213 & 5.821.337, y Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-1093). En una realización, estos anticuerpos además comprenden una secuencia de consenso marco de cadena liviana ? humana. En una realización particular, estos anticuerpos comprenden secuencias HVR de cadena liviana de huMAb4D5-8 tal como se describe en la Patente de los Estados Unidos N.° 6.407.213 & 5.821.337.) En una realización, estos anticuerpos comprenden secuencias de dominio variable de cadena liviana de huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (a los cuales también se hace referencia en la Patente de los Estados Unidos N.° 6.407.213 & 5.821.337, y Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-1093). En una realización, un anticuerpo anti-AxI comprende HVRs como en cualquiera de las realizaciones anteriores, y además comprende una VH y/o VL que comprende una secuencia FR1 , FR2, FR3 o FR4 que se muestra en las Figuras 2, 3A-B, 4, 5 o 6.

En un aspecto adicional, la invención provee un anticuerpo que se une al mismo epítopo como un anticuerpo anti-AxI que se proporciona en la presente. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo como un anticuerpo anti-AxI que comprende una secuencia VH de SEQ ID N.°:103 y una secuencia VL de SEQ ID N.°:104. En ciertas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo como un anticuerpo anti-AxI que comprende una secuencia VH de SEQ ID N.°:107 y una secuencia VL de SEQ ID NO108. En ciertas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo dentro de un fragmento de AxI que consta de aminoácidos MAWRCPRMGRVPLAWCLALCGWACMAPRGTQAEESPFVGNPGNITGARGLTG TLRCQLQVQGEPPEVHWLRDGQILELADSTQTQVPLGEDEQDDWIWSQLRITSL QLSDTGQYQCLVFLGHQTFVSQPGYVG (SEQ ID N.°:1 1 1 ). En ciertas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo dentro de un fragmento de Axl que consta de aminoácidos ITVLPQQPRNLHLVSRQPTELEVAWTPGLSGIYPLTHCTLQAVLSDDGMGIQAGE PDPPEEPLTSQASVPPHQLRLGSLHPHTPYHIRVACTSSQGPSSWTHWL (SEQ ID N.°:130).

En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo que compite por la unión al Axl humano con un anticuerpo anti-AxI que comprende una secuencia VH de SEQ ID N.°:103 y una secuencia VL de SEQ ID N.°:104. En ciertas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que compite por la unión al Axl humano con un anticuerpo anti-AxI que comprende una secuencia VH de SEQ ID N.°:107 y una secuencia VL de SEQ ID N.°:108.

En un aspecto adicional de la invención, un anticuerpo anti-AxI de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores es un anticuerpo monoclonal, con la inclusión de un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En una realización, un anticuerpo anti-AxI es un fragmento del anticuerpo, por ejemplo, Fv, Fab, Fab', scFv, diacuerpo, o fragmento F(ab')2. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo de IgG intacto u otra clase de anticuerpo o isótopo tal como se define en la presente.

En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-AxI de acuerdo a cualquiera de las realizaciones anteriores puede incorporar cualquiera de las características, por separado o en combinación, tal como se describe en las siguientes Secciones 1 -7: 1. Afinidad de Anticuerpo En ciertas realizaciones, un anticuerpo que se suministra en la presente posee una constante de disociación (Kd) de= 1 µ?,= 100 nM, < 10 nM,= 1 nM,= 0,1 nM, = 0,01 nM, o= 0,001 nM (por ejemplo, 10"8 M o menos, por ejemplo, desde 10"8 M a 10'13 M, por ejemplo, desde 10"9 M a 10"13 M).

En una realización, Kd se mide mediante un ensayo de unión al antígeno radiomarcado (RIA) realizado con lá versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno tal como se describe en el siguiente ensayo. La afinidad de unión de la solución de los Fabs para el antígeno se mide al equilibrar Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125l) en presencia de una serie de titulación de un antígeno sin marcar, y luego al capturar el antígeno unido con una placa cubierta de anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). A fin de establecer condiciones para el ensayo, se cubren placas multi-pocillo MICROTITER® (Thermo Scientific) durante la noche con 5 pg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en 50 mM de carbonato de sodio (pH 9,6), y en forma subsiguiente se bloqueó con 2% (p/v) de albúmina de suero bovino en PBS de dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). En una placa . no adsorbente (Nunc #269620), se mezclanlOO pM o 26 pM de [125l]-antígeno con diluciones seriales de un Fab de interés (por ejemplo, conforme a la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997)). El Fab de interés luego se incuba durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar por un período mayor (por ejemplo, alrededor de 65 horas) para garantizar que se alcance el equilibrio. Por lo tanto, las mezclas se transfieren a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). Luego se extrae la solución y se lava la placa ocho veces con 0,1 % de polisorbato 20 (TWEEN-20®) en PBS. Cuando se hayan secado las placas, se añaden 150 µ?/pocillo de producto centelleante (MICROSCINT-20™; Packard), y se cuentan las placas en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan menos o igual al 20% de unión máxima se seleccionan para la utilización en ensayos de unión competitiva.

De acuerdo con otra realización, Kd se mide mediante ensayos de resonancia de plasmon superficiales con un BIACORE®-2000 o un BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips CM5 de antígenos inmovilizados a -10 unidades de respuesta (RU). En resumen, se activan chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) con clorhidrato de N-etil-N'- (3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo a las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con 10 mM de acetato de sodio, pH 4,8, a 5 pg/ml (-0,2 µ?) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 µ?/minuto para obtener aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Luego de la inyección del antígeno, se inyecta 1 M de etanolamina para bloquear los grupos que no reaccionaron. Para las mediciones de cinética, se inyectan diluciones seriales dobles de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con 0,05% de polisorbato 20 (TWEEN-20™) agente tensoactivo (PBST) a 25°C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 µ?/min. Las tasas de asociación (kon) y las tasas de disociación (koff) se calculan mediante la utilización de un modelo de unión Langmuir individual simple (BIACORE Evaluation Software versión 3.2) al ajustar en forma simultánea los sensorgramas de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calcula como la proporción k0ff/kon Véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la tasa on excede 106 M-1 s-1 mediante el ensayo de resonancia de plasmon superficiales anterior, se puede determinar la tasa on por medio de una técnica de neutralización fluorescente que mide el aumento o disminución en la intensidad de la emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de pase de banda) a 25oC de un anticuerpo anti-antígeno de 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medido en un espectrómetro, como un espectrómetro equipado de flujo detenido (Aviv Instruments) o un espectrómetro 8000-series SLM-AMINCO™ (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada. 2. Fragmentos de Anticuerpos En ciertas realizaciones, un anticuerpo que se proporciona en la presente es un fragmento de un anticuerpo. Los fragmentos de un anticuerpo incluyen, entre otros, fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, y scFv, y otros fragmentos que se describen a continuación. Para un resumen de ciertos fragmentos de los anticuerpos, véase Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para un resumen de fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 1 13, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); véase también WO 93/16185; y Patente de los Estados Unidos N.° 5.571.894 y 5.587.458. Para la discusión de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos de epítopos de unión a receptores de reciclaje y que tienen un aumento de la vida media in vivo, véase Patente de los Estados Unidos N° 5.869.046.

Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véase, por ejemplo, EP 404,097; WO 1993/01161 ; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpos que comprenden todo o una porción del dominio variable de cadena pesada o todo o una parte del dominio variable de cadena liviana de un anticuerpo. En ciertas realizaciones, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos N° 6.248.516 B1 ).

Los fragmentos de anticuerpos pueden realizarse mediante varias técnicas, con la inclusión entre otros, de la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto así como también la producción mediante células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), tal como se describe en la presente. 3. Anticuerpos Quiméricos y Humanizados En ciertas realizaciones, un anticuerpo que se proporciona en la presente es un anticuerpo quimérico. Ciertos anticuerpos quiméricos se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos N° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Nati.

Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable que deriva de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano como un mono) y una región constante humana. En otro ejemplo, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "con cambio de clase" en el cual la clase o subclase se ha cambiado de aquella del anticuerpo progenitor. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión al antígeno de los mismos.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. En forma típica, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad a los humanos, y al mismo tiempo conservar la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano progenitor. Generalmente, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los cuales HVRs, por ejemplo, CDRs, (o sus porciones) derivan de un anticuerpo no humano, y FRs (o sus porciones) derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado, en forma opcional, también comprenderá al menos una porción de una región constante humana. En algunas realizaciones, algunos residuos FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen con los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del cual derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

Los anticuerpos humanizados y los métodos para realizarlos se resumen, por ejemplo, en Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), y se describen además, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); Patente de los Estados Unidos N.° 5. 821.337, 7.527.791 , 6.982.321 , y 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (que describe injertos SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991 ) (que describe "reepitelización (surfacing)"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que describe "reordenamiento (shuffling) de FR"); and Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J. Cáncer, 83:252-260 (2000) (que describe el enfoque de "selección guiada" del reordenamiento de FR).

Las regiones marco humanas que pueden utilizarse para la humanización incluyen, entre otras: regiones marco seleccionadas mediante el método de la que "mejor se ajuste" (véase, por ejemplo, Sims et al. J. Immunol. 151 :2296 (1993)); regiones marco que derivan de la secuencia consenso de los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena liviana o pesada (véase, por ejemplo, Cárter et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); y Presta et al. J. Immunol., 151 :2623 (1993)); las regiones marco maduras humanas (mutadas en forma somática) o las regiones marco germinales humanas (véase, por ejemplo, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); y a las regiones marco que derivan de la exploración de las bibliotecas de FR (véase, por ejemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271 :22611-22618 (1996)). 4. Anticuerpo Humanos En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos pueden producirse mediante varias técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen generalmente en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001 ) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).

Los anticuerpos humanos pueden preparase mediante la administración de un inmunogen a un animal transgénico que ha sido modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a un desafío antigénico. Dichos animales contienen típicamente toda o una porción de los lugares de inmunoglobina humana, que reemplazan a los lugares de inmunoglobina endógenos, o que se encuentran presentes extracromosomáticamente o integrados en forma aleatoria en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgénicos, los lugares de inmunoglobina endógenos en general se han desactivado. Para una reseña de los métodos de obtención de anticuerpos humanos de los animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Véase también, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos N.° 6.075.181 y 6.150.584 que describe la tecnología XENOMOUSE™; Patente de los Estados Unidos N.° 5.770.429 que describe la tecnología HUMAB®; Patente de los Estados Unidos N.° 7.041.870 que describe la tecnología K-M MQUSE®, y Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° US 2007/0061900, que describe la tecnología VELOCIMOUSE®). Las regiones variables humanas de los anticuerpos intactos generados por dichos animales pueden modificarse en forma adicional, por ejemplo, mediante la combinación con una región constante humana diferente.

Los anticuerpos humanos pueden realizarse también mediante métodos basados en hibridomas. Se han descripto las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véase, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991 ).) Los anticuerpos humanos generados mediante la tecnología de hibridoma de la célula B humana también se describen en Li et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Los métodos adicionales incluyen aquellos que se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos N° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales de las líneas celulares del hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que describe los hibridomas humano-humano). La tecnología del hibridoma humano (tecnología Trioma) también se describe en Vollmers and Brandiein, Histology & Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers and Brandiein, Methods & Findings in Exp. & Clin. Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).

Los anticuerpos humanos también pueden generarse mediante el aislamiento de las secuencias de dominio variable del clon Fv seleccionadas de bibliotecas de exhibición de fagos derivados de humanos. Dichas secuencias de dominio variable pueden luego combinarse con el dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de las bibliotecas de anticuerpos se describen a continuación. 5. Anticuerpos Derivados de Bibliotecas Los anticuerpos de la invención pueden aislarse al examinar las bibliotecas combinatorias en busca de anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, una variedad de métodos se conocen en la técnica para generar bibliotecas de exhibición de fagos y examinar dichas bibliotecas .en busca de anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Dichos métodos se resumen, por ejemplo, en Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1 -37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001 ) y se describen además, por ejemplo, en McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991 ); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581 -597 (1992); Marks and Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161 -175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101 (34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1 -2): 1 19-132(2004).

En ciertos métodos de exhibición de fagos, se clonan en forma separada repertorios de genes VH y VL mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan en forma aleatoria en bibliotecas de fagos, las cuales pueden examinarse luego en busca de fagos que se unen al antígeno tal como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Los fagos en forma típica, exhiben fragmentos de anticuerpos, ya sea como fragmentos (scFv) Fv de cadena única o como fragmentos Fab. Las bibliotecas de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad al inmunogen sin la necesidad de construir hibridomas. En forma alternativa, puede clonarse el repertorio naive (por ejemplo, de humanos) para proporcionar una fuente única de anticuerpos a una amplia gama de antígenos no propios y también propios sin ninguna inmunización tal como se describe en Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Por último, las bibliotecas naive pueden también realizarse en forma sintética al clonar segmentos de genes V sin reorganizar de células madre, y mediante la utilización de cebadores PCR que contienen una secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y obtener la reorganización in vitro, tal como se describe en Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Las publicaciones de patentes que describen bibliotecas de fagos de anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: Patente de los Estados Unidos N.° 5.750.373, y Publicación de Patente de los Estados Unidos N.° 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, y 2009/0002360.

Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos aislados de las bibliotecas de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpos humanos en la presente. 6. Anticuerpos Multiespecífícos En ciertas realizaciones, un anticuerpo que se proporciona en la presente es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecífícos son anticuerpos monoclonales que poseen especificaciones de unión para al menos dos sitios diferentes. En ciertas realizaciones, una de las especificaciones de unión es para AxI y la otra es para cualquier otro antígeno. En ciertas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epítopos diferentes de Axl. Los anticuerpos biespecíficos pueden utilizarse también para localizar agentes citotóxicos a células que expresan Axl. Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos.

Las técnicas de realización de anticuerpos biespecíficos incluyen entre otras, có-exprésión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena liviana de inmunoglobina que poseen diferentes especificaciones (véase Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, y Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991 )), e ingeniería de acoplamiento ("knob-in-hole") (véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos N.° 5.731 .168). Los anticuerpos multiespecíficos pueden realizarse también mediante el diseño de efectos de dirección electroestática para crear moléculas heterodiméricas Fe del anticuerpo (WO 2009/089004A1 ); enlace cruzado de dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos N.° 4.676.980, y Brennan et al., Science 229: 81 (1985)); utilización de cierres de leucína para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); utilización de tecnología de "diacuerpos" para crear fragmentos de anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); y la utilización de dímeros (sFv) Fv de cadena única (véase, por ejemplo, Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)); y la preparación de anticuerpos triespecíficos tal como se describe, por ejemplo, en Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991 ).

Los anticuerpos diseñados con tres o más sitios funcionales de unión al antígeno, con la inclusión de "anticuerpos pulpo," también se incluyen en la presente (véase, por ejemplo, US 2006/0025576A1 ).

El anticuerpo o fragmento de la presente también incluye un "FAb que actúa en forma dual" o "DAF" que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a Axl así como también otro antígeno diferente (véase, US 2008/0069820, por ejemplo). 7. Variantes de los Anticuerpos En ciertas realizaciones, se contemplan las variantes de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos que se proporcionan en la presente. Por ejemplo, puede ser recomendable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo pueden prepararse mediante la introducción de modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica al anticuerpo, o mediante la síntesis de péptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, las eliminaciones, y/o inserciones y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Toda combinación de eliminación, inserción y sustitución puede realizarse para llegar al constrúcto final, siempre que el constrúcto final posea las características deseadas, por ejemplo, unión al antígeno. a) Variantes de Sustitución, Inserción y Eliminación En ciertas realizaciones, se proporcionan las variantes de anticuerpos que poseen una o más sustituciones de aminoácidos. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen HVRs y FRs. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones conservadoras". Se proporcionan más cambios sustanciales en la Tabla 1 bajo el encabezado "sustituciones ejemplares" y tal como se describe a continuación, en referencia a las clases de cadena lateral de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden introducirse en un anticuerpo de interés y los productos pueden examinarse en busca de la actividad deseada, por ejemplo, conservación/mejora de unión al antígeno, disminución de la inmunogenicidad, o mejora de ADCC o CDC.

TABLA 1 Los aminoácidos pueden agruparse de acuerdo a las propiedades comunes de cadena lateral: (1 ) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrofílicos neutrales: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acídicos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras conllevarán el intercambio de un miembro de estas clases por otra clase.

Un tipo de variante de sustitución implica la sustitución de uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo progenitor (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la/las variante/s resultantes seleccionadas para su estudio adicional tendrán modificaciones (por ejemplo, mejoras) en ciertas propiedades biológicas (por ejemplo, aumento de la afinidad, reducción de la inmunogenicidad) relativas al anticuerpo progenitor y/o habrán conservado en forma sustancial ciertas propiedades biológicas del anticuerpo progenitor. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo de afinidad madura, que puede generarse convenientemente, por ejemplo, mediante la utilización de técnicas de maduración de afinidad basadas en la exhibición de fagos como aquellas que se describen en la presente. En resumen, uno o más residuos HVR se mutan y los anticuerpos de variantes se exhiben en fagos y se examinan en busca de una actividad biológica en particular (por ejemplo, afinidad de unión).

Pueden generarse alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en HVRs, por ejemplo, mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones pueden realizarse en las "zonas activas" de HVR, es decir, residuos codificados por codones que sufren una mutación a alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), y/o SDRs (a-CDRs), y se examinará la afinidad de unión del VH o VL variante resultante. La maduración de la afinidad mediante la construcción y reselección de las bibliotecas secundarias se ha descripto, por ejemplo, en Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1 -37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001 ).) En algunas realizaciones de maduración de afinidad, se introduce diversidad en los genes variables seleccionados para la maduración mediante una variedad de métodos (por ejemplo, PCR propenso a error, reordenamiento de cadena, o mutagénesis dirigida al oligonucleótido). Luego se crea una biblioteca secundaria. Luego se examina la biblioteca para identificar cualquiera de las variantes del anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad involucra enfoques dirigidos a HVR, en los cuales varios residuos HVR (por ejemplo, 4-6 residuos por vez) se aleatorizan. Los residuos HVR involucrados en la unión al antígeno pueden identificarse en forma específica, por ejemplo, mediante la mutagénesis de escaneo de alanina o modelado. En particular, los blancos son generalmente CDR-H3 y CDR-L3.

En ciertas realizaciones, las sustituciones, inserciones o eliminaciones pueden ocurrir dentro de uno o más HVRs siempre que dichas alteraciones no reduzcan en forma sustancial la habilidad del anticuerpo de unirse al antígeno. Por ejemplo, las alteraciones conservadoras (por ejemplo, las sustituciones conservadoras que se proporcionan en la presente) que no reducen en forma sustancial la afinidad de unión pueden realizarse en HVRs. Dichas alteraciones pueden ser fuera de las "zonas activas" de HVR o SDRs. En ciertas realizaciones de las secuencias VH y VL variantes que se proporcionaron con anterioridad, cada HVR no se altera o no contiene más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos.

Un método útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que pueden ser blanco para la mutagénesis se llama "mutagénesis de escaneo de alanina" tal como se describe en Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este método, se identifica un residuo o grupo de residuos blanco (por ejemplo, residuos cargados, como arg, asp, his, lys, y glu) y se reemplazan por un aminoácido neutral o con carga negativa (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Pueden introducirse sustituciones adicionales en las ubicaciones del aminoácido que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. En forma alternativa, o adicional, una estructura de cristal de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno puede obtenerse. Dichos residuos de contacto y residuos vecinos pueden ser blanco o eliminarse como candidatos para la sustitución. Las variantes pueden examinarse para determinar si contienen las propiedades deseadas.

Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones te terminales amino- y/o carboxil- que varían en su longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen un centenar o más residuos, así como también inserciones de intrasecuencias de residuos de aminoácidos únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones de terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N-terminal. Otras variantes de inserciones de la molécula del anticuerpo incluyen la fusión a los terminales N- o C-del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumente la vida media del suero del anticuerpo, b) Variantes de Glicosilación En ciertas realizaciones, un anticuerpo que se proporciona en la presente se altera para aumentar o disminuir la medida en la cual se glicosila el anticuerpo. La adición o eliminación de sitios de glicosilación a un anticuerpo puede obtenerse convenientemente mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos de manera tal que se creen o extraigan uno o más sitios de glicosilación.

En donde el anticuerpo comprende una región Fe, el carbohidrato que se acopla puede alterarse. Los anticuerpos nativos producidos por células mamíferas comprenden en forma típica, un oligosacárido ramificado biantenario que generalmente se acopla mediante un N-enlace a Asn297 del dominio CH2 de la región Fe. Véase, por ejemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir varios carbohidratos, por ejemplo, mañosa, glucosamina de N-acetilo (GIcNAc), galactosa, y ácido siálico, así como también una fucosa acoplada a GIcNAc en la "raíz" de una estructura del oligosacárido biantenario. En algunas realizaciones, pueden realizarse modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención a fin de crear variantes del anticuerpo con ciertas propiedades mejoradas.

En una realización, se proporcionan las variantes del anticuerpo con una estructura de carbohidratos que carece de fucosa acoplada (en forma directa o indirecta) a una región Fe. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser desde 1 % a 80%, desde 1 % a 65%, desde 5% a 65% o desde 20% a 40%. La cantidad de fucosa se determina al calcular la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297, en relación a la suma de todas las glicoestructuras acopladas a Asn 297 (por ejemplo, estructuras de mañosa complejas, híbridas y altas) tal como se miden mediante la espectrometría de masa MALDI-TOF, como se describe en WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina ubicado aproximadamente en la posición 297 en la región Fe (numeración Eu de los residuos de la región Fe); sin embargo, Asn297 puede también ubicarse aproximadamente en los aminoácidos ± 3, corriente arriba o corriente abajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia menores en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden haber mejorado la función ADCC. Véase, por ejemplo, Publicación de Patente de los Estados Unidos N.° US 2003/0157108 (Presta, L); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los ejemplos de publicaciones relacionadas de las variantes de anticuerpos "desfucosiladas" o "carentes de fucosa" incluyen: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621 ; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/01 10282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de las líneas celulares capaces de producir anticuerpos desfucosilados incluyen células Lec13 CHO que poseen fucosilación de proteínas deficiente (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° US 2003/0157108 A1 , Presta, L; y WO 2004/056312 A1 , Adams et al., esencialmente en el Ejemplo 11 ), y las líneas celulares knockout, como el gen alfa-1 ,6-fucosiltransferasa, FUT8, células knockout CHO (véase, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); y WO2003/085107).

Las variantes de anticuerpos se proporcionan en forma adicional con oligosacáridos divididos, por ejemplo, en donde un oligosacárido biantenario acoplado a la región Fe del anticuerpo se encuentra dividido por GleNAc. Dichas variantes de anticuerpos pueden haber reducido la fucosilación y/o mejorado la función ADCC. Los ejemplos de dichas variantes de anticuerpos se describen, por ejemplo, en WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); Patente de los Estados Unidos N.° 6.602.684 (Umana et al.); y US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proporcionan las variantes de anticuerpos con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido acoplado a la región Fe. Dichas variantes de los anticuerpos pueden haber mejorado la función CDC. Dichas variantes de los anticuerpos se describen, por ejemplo, en WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.). c) Variantes de la región Fe En ciertas realizaciones, pueden introducirse una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fe de un anticuerpo que se proporciona en la presente, y de ese modo se genera una variante de la región Fe. La variante de la región Fe puede comprender una secuencia de región Fe humana (por ejemplo, una región Fe lgG1 , lgG2, lgG3 o lgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácido (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos.

En ciertas realizaciones, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, lo cual lo hace un candidato recorriendable para las aplicaciones en las cuales la vida media del anticuerpo in vivo es importante, no obstante ciertas funciones efectoras (como el complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Los ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo pueden llevarse a cabo para confirmar la reducción/disminución de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, los ensayos de unión al receptor Fe (FcR) pueden conducirse a fin de garantizar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (por lo tanto, también carece de actividad ADCC), pero conserva la habilidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar las células ADCC, NK, expresan Fc(RIII solamente, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII. La expresión de FcR en las células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991 ). Ejemplos no limitativos de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés se describen en la Patente de los Estados Unidos N.° 5.500.362 (véase, por ejemplo, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5.821.337 (véase Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351 -1361 (1987)). En forma alternativa, pueden emplearse métodos de ensayos no radioactivos (véase, por ejemplo, ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para la citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, Wl). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células Asesinas Naturales (NK). En forma alternativa, o adicional, puede evaluarse in vivo la actividad ADCC de la molécula de interés, por ejemplo, en un modelo animal como el que se presenta en Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Los ensayos de unión a C1 q pueden llevarse a cabo también para confirmar que el anticuerpo es incapaz de unirse a C1q y por lo tanto carece de actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación de los complementos, puede llevarse a cabo un ensayo CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101 :1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). La unión a FcRn y las determinaciones de depuración/vida media in vivo pueden realizarse también mediante métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Intl. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)).

Los anticuerpos con una función efectora reducida incluyen aquellos con la sustitución de uno o más residuos de la región Fe 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (Patente de los Estados unidos N.° 6.737.056). Dichos mutantes de Fe incluyen mutantes de Fe con sustituciones en dos o más posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, con la inclusión del denominado muíante de Fe "DANA" con la sustitución de los residuos 265 y 297 a la alanina (Patente de los Estados Unidos N.° 7.332.581 ).

Se describen ciertas variantes de anticuerpos con una mejora o disminución de la unión a FcRs. (Véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos N.° 6.737.056; WO 2004/056312, y Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001 ).) En ciertas realizaciones, una variante de anticuerpo comprende una región Fe con una o más sustituciones de aminoácidos lo cual mejora la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333, y/o 334 de la región Fe (numeración EU de los residuos).

En algunas realizaciones, las alteraciones se realizan en la región Fe lo cual resulta en la unión alterada a C1 q (es decir, su mejora o disminución) y/o la Citotoxicidad Dependiente del Complemento (CDC), por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos N.° 6.194.551 , WO 99/51642, y Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Los anticuerpos con aumento de sus vidas medias y una mejora de la unión al receptor de Fe neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia del IgGs maternal al feto (Guyer et al., J. Immunol. 1 17:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), se describen en US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Dichos anticuerpos comprenden una región Fe con una o más sustituciones en la misma, lo cual mejora la unión de la región Fe a FcRn. Dichas variantes de Fe incluyen aquellas con sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fe: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311 , 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, sustitución del residuo 343 de la región Fe (Patente de los Estados Unidos N° 7.371.826).

Véase también Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); Patente de los Estados Unidos N.° 5.648.260; Patente de los Estados Unidos N° 5.624.821 ; and WO 94/29351 en relación a otros ejemplos de variantes de la región Fe. d) Variantes de anticuerpos diseñadas con cisteína En ciertas realizaciones, puede ser aconsejable crear anticuerpos diseñados con cisteína, por ejemplo, "tioMAbs," en los cuales uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína.- En realizaciones particulares, los residuos sustituidos ocurren en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir dichos residuos con cisteína, los grupos de tiol reactivos se ubican de ese modo en sitios accesibles del anticuerpo y pueden utilizarse para conjugar el anticuerpo a otras porciones, como porciones de fármaco o porciones enlace-fármaco, para crear un inmunoconjugado, tal como se describe en la presente. En ciertas realizaciones, uno o más de los siguientes residuos pueden sustituirse con cisteína: V205 (numeración Kabat) de la cadena liviana; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fe de cadena pesada. Los anticuerpos diseñados con cisteína pueden generarse tal como se describe, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos N° 7.521.541. e) Derivados de los Anticuerpos En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente puede modificarse en forma adicional para contener porciones no proteináceas adicionales conocidas en la técnica y disponibles fácilmente. Las porciones idóneas para la derivatización del anticuerpo incluyen, entre otras, polímeros solubles en agua. Ejemplos no limitativos de polímeros solubles en agua incluyen, entre otros, glicol de polietileno (PEG), copolímeros de glicol de etileno/glicol de propileno, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, pirrolidona polivinílica, poli-1 , 3-dioxolano, poli- ,3,6-trioxano, copolímero anhídrido maleico/ de etileno, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros ocopolímeros aleatorios), y dextrano o glicol de poli(n-vinil pirrolidona)polietileno, homopolímeros de glicol de propropileno, copolímeros de óxido de prolipropileno /óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico, y sus mezclas. El propionaldehído de glicol de polietlleno puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede poseer cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. La cantidad de polímeros acoplados al anticuerpo puede variar y si se acopla más de un polímero, pueden ser la misma o diferentes moléculas. En general, la cantidad y/o tipo de polímeros utilizados para la derivatización puede determinarse en base a consideraciones con la inclusión de, entre otras, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo a mejorar, si el derivado del anticuerpo se utilizará en una terapia bajo condiciones definidas, etc.

En otra realización, se proporcionan los conjugados de un anticuerpo y la porción no proteinácea que pueden calentarse en forma selectiva mediante la exposición a la radiación. En una realización, la porción no proteinácea es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, entre otras, longitudes de ondas que no dañan las células ordinarias, pero que calientan la porción no proteinácea a una temperatura en la cual se mata a las células próximas a la porción no proteinácea del anticuerpo.

B. Métodos y Composiciones Recombinantes Los anticuerpos pueden producirse mediante la utilización de métodos y combinaciones recombinantes, por ejemplo, tal como se describe en la Patente de los Estados Unidos N° 4.816.567. En una realización, se proporciona ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-Axl que se describe en la presente. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende la VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas livianas y/o pesadas del anticuerpo). En otra realización, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En otra realización, se proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. En una realización, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (1 ) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo. En una realización, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO) o célula linfoide (por ejemplo, YO, NSO, Sp20 cell). En una realización, se proporciona un método para realizar un anticuerpo anti-AxI, en donde el método comprende el cultivo de una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica al anticuerpo, tal como se proporcionó con anterioridad, bajo condiciones idóneas para la expresión del anticuerpo, y en forma opcional, se recupera al anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de células huésped).

Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-AxI, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, tal como se describió con anterioridad, se aisla y se inserta en uno o más vectores para la clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho ácido nucleico puede aislarse y secuenciarse fácilmente y mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante la utilización de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas livianas y pesadas del anticuerpo).

Las células huésped idóneas para la clonación o expresión de vectores que codifican anticuerpos incluyen las células procariotas o eucariotas que se describen en la presente. Por ejemplo, los anticuerpos pueden producirse en bacterias, cuando no se necesita la glicosilación y la función efectora Fe. Para la expresión de los fragmentos del anticuerpo y polipéptidos en las bacterias, véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos N.° 5.648.237, 5.789.199, y 5.840.523. (Véase también Charlton, ethods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, que describe la expresión de los fragmentos del anticuerpo en E. coli.) Luego de la expresión, el anticuerpo puede aislarse de la pasta de células bacteriana en una fracción soluble y además puede purificarse.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas como hongos filamentosos o levadura son huéspedes de clonación o expresión idóneos para los vectores que codifican anticuerpos, con la inclusión de cepas de hongos y levadura cuyas vías de glicosilación han sido "humanizadas", lo cual resulta en la producción de un anticuerpo con un patrón de glicosilación parcial o totalmente humano. Véase Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), y U et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).

Las células huésped idóneas para la expresión de anticuerpos glicosilados también derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células invertebradas incluyen células vegetales y de insectos. Se han identificado numerosas cepas baculovirales que pueden utilizarse en conjunto con células de insectos, en particular para la transfección de las células Spodoptera frugiperda.

Los cultivos de células vegetales pueden también utilizarse como huéspedes. Véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos N.° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978, y 6.417.429 (que describe la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).

Las células de vertebrados también pueden utilizarse como huéspedes. Por ejemplo, las células mamíferas que se adaptan para crecer en suspensión pueden ser útiles. Otros ejemplos de líneas celulares huésped mamíferas útiles son la línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñon embriónico humano (células 293 o 293 tal como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK); células de sertoli de ratón (células TM4 tal como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1 ); células de riñon de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical (HELA); células de riñon canino (MDCK; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); células pulmonares humanas (W138); células de hígado humano (Hep G2); tumor mamario de ratón (MMT 060562); células TRI, tal como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; y células FS4. Otras líneas celulares huésped de mamíferos útiles incluyen las células de (CHO) ovario de hámster chino, con la inclusión de células DHFR" CHO (Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma como YO, NSO y Sp2/0. Para una reseña de ciertas líneas celulares huésped mamíferas idóneas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).

C. Ensayos Los anticuerpos anti-Axl que se proporcionan en la presente pueden identificarse, examinarse o caracterizarse por sus propiedades y/o actividades biológicas físicas/químicas mediante varios ensayos conocidos en la técnica. 1. Ensayos de unión y otros ensayos En un aspecto, un anticuerpo de la invención se examina en busca de su actividad de unión al antígeno, por ejemplo, mediante métodos conocidos como ELISA, Western blot, etc.

En otro aspecto, pueden utilizarse los ensayos de competencia para identificar un anticuerpo que compite con uno o más anticuerpos 327.6, 327.6.S2, 327.6.S1 1 , 327.6.S50, 327.6.S52, 327.6.S65, 327.42, 327.42.S8, 327.42.S31 , 327.42.S13, 327.42.S43, 327.42.S52, 327.42.S63, 327.42.S73, 327.42.H2, 327.42.H4, y/o 327.42. H20 por la unión a AxI. En ciertas realizaciones, dicho anticuerpo que compite se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o conformacional) que se une mediante 327.6, 327.6.S2, 327.6.S11 , 327.6.S50, 327.6.S52, 327.6.S65, 327.42, 327.42.S8, 327.42.S31 , 327.42.S13, 327.42.S43, 327.42.S52, 327.42.S63, 327.42.S73, 327.42.H2, 327.42.H4, y/o 327.42.H20. Se proporcionan métodos de ejemplo detallados para el mapeo de un epítopo al cual se une un anticuerpo en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).

En un ensayo de competencia ejemplar, se incuba AxI inmovilizado en una solución que comprende un primer anticuerpo rotulado que se une a AxI (por ejemplo, 327.6, 327.6.S2, 327.6.S11 , 327.6.S50, 327.6.S52, 327.6.S65, 327.42, 327.42.S8, 327.42.S31 , 327.42.S13, 327.42.S43, 327.42.S52, 327.42.S63, 327.42.S73, 327.42.H2, 327.42.H4, y/o 327.42. H20) y un segundo anticuerpo no rotulado que se está examinando en busca de su habilidad para competir con el primer anticuerpo para unirse a AxI. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba AxI inmovilizado en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Luego de la incubación bajo condiciones propicias para la unión del primer anticuerpo a AxI, se extrae el exceso de anticuerpo no unido, y se mide la cantidad de marcación asociada al AxI inmovilizado. Si la cantidad de rmarcación asociada al AxI inmovilizado disminuye en forma sustancial en el modelo de examen relativo al modelo de control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo compite con el primer anticuerpo por la unión a AxI. Véase Harlow and Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). 2. Ensayos de actividad En un aspecto, se proporcionan los ensayos para la identificación de anticuerpos anti-Axl que poseen actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, la inhibición de Gas6 que se une a Axl, inhibición de la activación de Axl, inhibición de la señalización molecular descendente de Axl, inhibición de la expresión de Axl (por ejemplo, expresión de la superficie celular de Axl o expresión Axl total en una célula, como una célula tumoral), inhibición de la secreción de citoquina inflamatoria, promoción de apoptosis (por ejemplo, al inhibir la inhibición de la apoptosis mediada por Gas6), inhibición de la vasculatura intratumoral, inhibición de la actividad Axl estromal tumoral y/o inhibición de metástasis. También se proporcionan los anticuerpos que poseen dicha actividad biológica in vivo y/o in vitro.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la invención se examina en busca de dicha actividad biológica. En ciertas realizaciones, un anticuerpo se examina en busca de su habilidad para promocionar la apoptosis in vitro (por ejemplo, apoptosis de una célula tumoral). Los métodos ejemplares para la determinación del crecimiento y/o proliferación y/o apoptosis celular incluyen, por ejemplo, el ensayo de incorporación de BrdU, incorporación de MTT, [3H]-timidina (por ejemplo, ensayo TopCount (PerkinElmer)), ensayos de viabilidad celular (por ejemplo, CelITiter-Glo (Promega)), ensayos de fragmentación del ADN, ensayos de activación caspasa, exclusión con azul triptán, ensayos de morfología de la cromatina y similares.

En algunas realizaciones, se examina un anticuerpo en busca de la inhibición de la expresión AxI, por ejemplo, mediante los métodos descriptos y ejemplificados en la presente. En una realización, se incuba un anticuerpo anti-Axl con células idóneas para el examen, por ejemplo, células NSCLC A549 y luego de un período de tiempo adecuado, se cultivan los lisatos celulares y se examinan en busca de niveles AxI totales. Puede utilizarse también el análisis FACS para examinar los niveles del receptor de AxI superficial luego de la incubación con anticuerpos anti-Axl candidatos. En una realización, se examina una muestra de tumor en busca de la expresión AxI luego del tratamiento con un anticuerpo anti-Axl.

En ciertas realizaciones, se examina un anticuerpo de la invención en busca de su habilidad para inhibir la sección de citoquina inflamatoria, por ejemplo, tal como se describe y ejemplifica en la presente.

En ciertas realizaciones, se examina un anticuerpo de la invención en busca de su habilidad para reducir la vasculatura intratumoral y/o inhibir la actividad y/o expresión de AxI estromal tumoral, por ejemplo, como se ejemplifica en la presente. En ciertas realizaciones, la actividad AxI estromal tumoral es metástasis o desarrollo de la vasculatura intratumoral.

En ciertas realizaciones, se examina un anticuerpo de la invención en busca de su habilidad para inhibir el crecimiento o proliferación celular in vitro. Los ensayos de inhibición del crecimiento o proliferación celular son muy conocidos en la técnica. Ciertos ensayos de proliferación celular, ejemplificados por los ensayos de "eliminación de células" que se describen en la presente, miden la viabilidad celular. Ese ensayo, es el ensayo CelITiter-Glo™ Luminescent Cell Viability Assay, el cual se encuentra disponible en Promega (Madison, Wl). Ese ensayo determina la cantidad de células viables en cultivo en base a la cuantificación de ATP presente, lo cual es una indicación de las células activas en términos de metabolismo. Véase Crouch et al (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88, Patente de los Estados Unidos N.° 6602677. El ensayo puede llevarse a cabo en un formato de 96 o 384 pocilios, lo cual lo hace apropiado para el tamizado de alto rendimiento automatizado (HTS). Véase Cree et al (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404. El procedimiento del ensayo implica la adición de un único reactivo (CelITiter-Glo® Reagent) directamente a las células cultivadas. Esto resulta en la lisis celular y la generación de una señal luminiscente producida por una reacción de luciferasa. La señal luminiscente es proporcional a la cantidad de ATP presente, la cual es directamente proporcional al número de células viables presentes en el cultivo. Los datos pueden registrarse mediante un luminómetro o un dispositivo de imágenes de cámara CCD. La salida de luminiscencia se expresa como unidades relativas de luz (RLU).

Otro ensayo de proliferación celular es el ensayo "MTT", un ensayo colorimétrico que mide la oxidación del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio al formazán mediante la reductasa mitocondrial. Al igual que en el ensayo CelITiter-Glo™, este ensayo indica la cantidad de células activas en términos de metabolismo presentes en un cultivo celular. Véase, por ejemplo, Mosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65:55-63, and Zhang et al. (2005) Cáncer Res. 65:3877-3882. Las células para la utilización en cualquiera de los ensayos in vitro anteriores incluyen las células o líneas celulares que expresan a AxI naturalmente o que se han diseñado para expresar a Axl. Dichas células incluyen células tumorales que sobre expresan a Axl en relación a células normales del mismo origen tisular. Dichas células también incluyen líneas celulares (con la inclusión de líneas celulares tumorales) que expresan Axl y líneas celulares que normalmente no expresan Axl pero que han sido transfectadas con ácido nucleico que codifica Axl. Las líneas celulares ejemplares que se proporcionan en la presente para su uso en cualquiera de los ensayos in vitro anteriores incluyen la línea celular NSCLC A549, línea celular NSCLC H1299, y la línea celular de cáncer de mama MDA-MB231.

En un aspecto, un anticuerpo anti-Axl del mismo se examina en busca de su habilidad para inhibir el crecimiento o proliferación celular in vivo. En ciertas realizaciones, se examina un anticuerpo anti-Axl de las mismas en busca de su habilidad para inhibir el crecimiento tumoral in vivo. Los sistemas de modelos in vivo, como los modelos de xenoinjertos, pueden utilizarse para dicho examen. En un sistema de xenoinjerto ejemplar, células tumorales humanas se introducen en un animal no humano inmunocomprometido idóneo, por ejemplo, un ratón "desnudo" atímico. Se administra un anticuerpo de la invención al animal. Se mide la habilidad del anticuerpo de inhibir o disminuir el crecimiento tumoral. En ciertas realizaciones del sistema de xenoinjerto anterior, las células tumorales humanas son células tumorales de un paciente humano. Dichos modelos de xenoinjerto se encuentran disponibles en Oncotest GmbH (Frieberg, Alemania). En ciertas realizaciones, las células tumorales humanas son células de una línea celular tumoral humana, como células de cáncer de mama MDA-MB-231 o células de cáncer de pulmón de células no pequeñas A549. En ciertas realizaciones, las células tumorales humanas se introducen en un animal no humano inmunocomprometido idóneo mediante inyección subcutánea o mediante el trasplante en un sitio adecuado, como un panículo adiposo mamario.

Se entiende que cualquiera de los ensayos anteriores pueden llevarse a cabo mediante un inmunoconjugado de la invención en lugar o además de un anticuerpo anti-Axl.

Se entiende que cualquiera de los ensayos anteriores pueden llevarse a cabo mediante un anticuerpo anti-Axl y un agente terapéutico adicional, como un antagonista de VEGF y/o un antagonista de EGFR y/o un agente quimioterapéutico.

D. Inmunoconjugados La invención también proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-Axl que en la presente se conjuga a uno o más agentes citotóxicos, como agentes o fármacos quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteicas, toxinas activas en términos enzimáticos de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal o fragmentos de ellos), o isótopos radioactivos.

En una realización, un inmunoconjugado es un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) en el cual un anticuerpo se conjuga a uno o más fármacos, con la inclusión entre otros, de un maitansinoide (véase Patente de los Estados Unidos N.° 5.208.020, 5.416.064 y Patente Europea EP 0 425 235 B1 ); una auristatina como porciones de fármaco de monometilauristatina DE y DF (MMAE y MMAF) (véase Patente de los Estados Unidos N.° 5.635.483 y 5.780.588, y 7.498.298); una dolastatina; una caliqueamicina o derivados de ella (véase Patente de los Estados Unidos N.° 5.712.374, 5.714.586, 5.739.1 16, 5.767.285, 5.770.701 , 5.770.710, 5.773.001 , y 5.877.296; Hinman et al., Cáncer Res. 53:3336-3342 (1993); y Lode et al., Cáncer Res. 58:2925-2928 (1998)); una antraciclina como daunomicina o doxorubicina (véase Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); y Patente de los Estados Unidos N° 6.630.579); metotrexato; vindesina; un taxano como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel, y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.

En otra realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en la presente, conjugado a una toxina o fragmento activo del mismo, con la inclusión entre otros, de la cadena A de difteria, fragmentos activos sin unión de la toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, and PAP-S), inhibidor de la momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de la sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos.

En otra realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo tal como se describe en la presente, conjugado a un átomo radioactivo para formar un radioconjugado. Se encuentra disponible una variedad de isótopos radioactivos para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando se utiliza el radioconjugado para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para los estudios cintigráficos, por ejemplo tc99m o 1123, o un rótulo spin para la imagen por resonancia magnética nuclear (NMR) (también conocida como imagen por resonancia magnética, mri), como yodo-123 nuevamente, yodo-131 , indio-1 11 , flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Los conjugados de un anticuerpo y agentes citotóxicos pueden crearse mediante una variedad de agentes de acoplamiento a proteínas bifuncionales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexan-1 -carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como Hcl de adpimidato de dimetilo), ésteres activos (como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (como glutaraldehído), compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina), derivados del bis-diazonio (como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (como 2,6-diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bis-activo (como 1 ,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de la ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido 1 -isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminpentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Véase WO94/11026. El enlace puede ser un "enlace escindible" que facilite la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede utilizarse un enlace lábil al ácido, un enlace sensible a la peptidasa, un enlace fotolábil, en enlace de dimetilo o un enlace que contenga disulfuro (Chari et al., Cáncer Res. 52:127-131 (1992); Patente de los Estados Unidos N.° 5.208.020).

Los inmunoconjugados o ADCs en la presente contemplan en forma expresa, entre otros, aquellos conjugados preparados con reactivos de enlaces cruzados con la inclusión, entre otros, de BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfon)benzoato) los cuales se encuentran disponibles al público (por ejemplo, en Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, U.S.A).

E. Métodos y Composiciones para el Diagnóstico y la Detección En ciertas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos anti-Axl que se proporcionan en la presente es útil para detectar la presencia de Axl en una muestra biológica. El término "detectar" tal como se utiliza en la presente abarca la detección cuantitativa o cualitativa. En ciertas realizaciones, una muestra biológica comprende una célula o tejido, como mama, páncreas, esófago, pulmón y/o cerebro.

En una realización, se proporciona un anticuerpo anti-Axl para su utilización en un método de diagnostico o detección. En otro aspecto, se proporciona un método para detectar la presencia de Axl en una muestra biológica. En ciertas realizaciones, el método implica poner la muestra biológica en contacto con un anticuerpo anti-Axl tal como se describe en la presente bajo condiciones propicias para la unión del anticuerpo anti-Axl a Axl, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-Axl y Axl. Dicho método puede ser un método in vitro o in vivo. En una realización, se utiliza un anticuerpo anti-Axl para seleccionar sujetos que reúnan las condiciones necesarias para la terapia con un anticuerpo anti-Axl, por ejemplo, en donde Axl es un biomarcador para la selección de pacientes.

Los trastornos ejemplares que pueden diagnosticarse mediante la utilización de un anticuerpo de la invención incluyen cáncer (por ejemplo, cáncer de mama, pulmón, páncreas, cerebro, riñon, ovario, estómago, leucemia, endometrio uterino, colon, próstata, tiroides, hígado, osteosarcoma y/o melanoma).

En ciertas realizaciones, se proporcionan los anticuerpos anti-Axl marcados. Los marcadores incluyen, entre otras, marcadores o porciones que se detectan directamente (como marcadores fluorescentes, cromofóricos, con densidad de electrones, quemiluminescentes, y radioactivo), así como también porciones, como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o una interacción molecular. Los marcadores ejemplares incluyen, entre otros, los radioisótopos 32P, 14C, 125l, 3H, and 131l, fluoroforos como quelatos de tierra rara o fluoresceina y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luceriferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (Patente de los Estados Unidos N.° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos, por ejemplo, oxidasa de glucosa, oxidasa de galactosa, y deshidrogenase de glucosa- 6-fosfato, oxidasas heterocíclicas como uricasa y oxidasa de xantina, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinción como HRP, lactoperoxidasa, o microperoxidasa, biotin/avidin, marcadores spin, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables y similares.

F. Formulaciones Farmacéuticas Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo anti-Axl tal como se describen en la presente se preparan mediante la mezcla del anticuerpo que posee el grado deseado de pureza con uno o más portadores opcionales aceptables en términos farmacéuticos (Remington's Pharmaceutical Sciences 16ta edition, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores aceptables en términos farmacéuticos son generalmente no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones que se emplean, e incluyen, entre otros: buffers como fosfato, citrato y otros ácido orgánicos; antioxidantes con la inclusión de ácido ascórbico y metionina; conservantes (como cloruro de amonio de octadecildimetilbenzilo; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de benzetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; parabenos de alquilo como parabeno de metilo o propilo; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular . (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos con la inclusión de glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales como sodio; complejos metales (por ejemplo, complejos de proteína Zn); y/o agentes tensoactivos no iónicos como glicol de polietileno (PEG). Los portadores ejemplares aceptables en términos farmacéuticos en la presente además incluyen agentes de dispersión intersticial de fármacos como glicoproteínas de hialuronidasa activas, neutrales y solubles (sHASEGP), por ejemplo, glicorpoteínas de hialuronidasa PH-20 soluble humana, como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Ciertas sHASEGPs ejemplares y métodos de uso, con la inclusión de rHuPH20, se describen en las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos N.° 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glicosaminoglicanasas adicionales como las condroitinasas.

Las formulaciones de anticuerpos liofilizados se describen en la Patente de los Estados Unidos N° 6.267.958. Las formulaciones acuosas de anticuerpos incluyen aquellas que se describen en la Patente de los Estados Unidos N° 6.171.586 y WO2006/044908, las últimas formulaciones incluyen un buffer de acetato de histidina.

La formulación en la presente puede contener también más de un ingrediente activo, como sea necesario para la indicación específica que se trate, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan entre ellos en forma negativa. Por ejemplo, puede ser aconsejable proporcionar otro antagonista de EGFR (como erlotinib), un agente anti-angiogénico (como un antagonista de VEGF, como un anticuerpo anti-VEGF) o agente quimioterapéutico (como un taxoide o un agente de platino). Dichos ingredientes activos se encuentran presentes en forma adecuada en combinación con cantidades que son efectivas para el propósito deseado.

Los ingredientes activos pueden encontrarse atrapados en micro cápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante la polimerización interfacial, por ejemplo, micro cápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y micro cápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, micro esferas de albúmina, micro emulsiones, nano-partículas y nano cápsulas) o en macro emulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16ta edición, Osol, A. Ed. (1980).

Pueden realizarse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices poseen la forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o micro cápsulas.

Las formulaciones a utilizarse para la administración in vivo son generalmente estériles. Las esterilidad puede obtenerse fácilmente, por ejemplo, mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles.

G. Métodos y Composiciones Terapéuticos Cualquiera de los anticuerpos anti-AxI que se proporcionan en la presente pueden utilizarse en métodos terapéuticos.

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-AxI para su utilización como medicamento. En otros aspectos, se proporciona un anticuerpo anti-AxI para su utilización en el tratamiento del cáncer (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer pancreáticos, cáncer de cerebro, cáncer de páncreas, cerebro, riñon, ovario, estómago leucemia, endometrio uterino, colon, próstata, tiroides, hígado, osteosarcoma, y/o melanoma). En ciertas realizaciones, se proporciona un anticuerpo anti-AxI para su uso en un método de tratamiento. En ciertas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo anti-Axl para su uso en un método de tratamiento de un individuo que tiene cáncer y comprende la administración al individuo de una cantidad efectiva del anticuerpo anti-AxI. En ciertas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI para su utilización en un método de tratamiento de un individuo que posee un trastorno de inmunidad (por ejemplo, un trastorno autoinmune), un trastorno cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis, hipertensión, trombosis), un trastorno infeccioso (por ejemplo, virus del Ebola, virus Marburg) o diabetes, que comprende la administración al individuo de una cantidad efectiva del anticuerpo anti-AxI. En dicha realización, el método además comprende la administración al individuo de una cantidad efectiva de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, tal como se describe a continuación. En otras realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI para su uso en la inhibición de la angiogénesis, la inhibición de la proliferación celular, inhibición de la función inmunológica, inhibición de la secreción de citoquina inflamatoria (por ejemplo, desde macrofagos asociados al tumor), inhibición de la vasculatura tumoral (por ejemplo, vasculatura intratumoral o vasculatura asociada al tumor), y/o la inhibición de la función estromal tumoral. En ciertas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo anti-AxI para su utilización en un método de inhibición de la angiogénesis, la inhibición de la proliferación celular, inhibición de la función inmunológica, inhibición de la secreción de citoquina inflamatoria (por ejemplo, desde macrofagos asociados al tumor), inhibición de la vasculatura tumoral (por ejemplo, vasculatura intratumoral o vasculatura asociada al tumor), y/o la inhibición de la función estromal tumoral en un individuo que comprende la administración al individuo de una cantidad efectiva de anticuerpo anti-Axl para inhibir la angiogénesis, inhibir la proliferación celular, inhibir la función inmunológica, inhibir la secreción de citoquina inflamatoria (por ejemplo, desde macrofagos asociados al tumor), inhibir el desarrollo de la vasculatura tumoral (por ejemplo, vasculatura intratumoral o vasculatura asociada al tumor), y/o inhibir la función estromal tumoral. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, es preferentemente un humano.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-Axl en la producción o preparación de un medicamento. En una realización, el medicamento es para el tratamiento del cáncer (en algunas realizaciones, cáncer de mama, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer pancreático, cáncer de cerebro, cáncer de páncreas, cerebro, riñon, ovario, estómago, leucemia, endometrio uterino, colon, próstata, tiroides, hígado, osteosarcoma, y/o melanoma). En otra realización, el medicamento es para el uso en un método de tratamiento de cáncer que comprende la administración a un individuo que tiene cáncer de una cantidad efectiva de un medicamento. En otra realización, el medicamento es para el uso en un método para el tratamiento de un trastorno de inmunidad (por ejemplo, un trastorno inmune), un trastorno cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis, hipertensión, trombosis), una enfermedad infecciosa (por ejemplo, virus del Ebola, virus de Marburg) o diabetes, que comprende la administración a un individuo de una cantidad efectiva del anticuerpo anti-Axl. En dicha realización, el método además comprende la administración a un individuo de una cantidad efectiva de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, tal como se describe a continuación. En otra realización, el medicamento es para la inhibición de la angiogénesis, la inhibición de la proliferación celular, la inhibición de la función inmunológica, la inhibición de la secreción de citoquina inflamatoria (por ejemplo, desde macrofagos asociados al tumor), inhibición de la vasculatura tumoral {por ejemplo, vasculatura intratumoral o vasculatura asociada al tumor), y/o la inhibición de la función estromal tumoral. En una realización adicional, el medicamento es para la utilización en un método de inhibición de la angiogénesis, la inhibición de la proliferación celular, la inhibición de la función inmunológica, la inhibición de la secreción de citoquina inflamatoria (por ejemplo, desde macrofagos asociados al tumor), inhibición de la vasculatura tumoral (por ejemplo, vasculatura intratumoral o vasculatura asociada al tumor), y/o la inhibición de la función estromal tumoral en un individuo, que comprende la administración a un individuo de una cantidad efectiva del medicamento para inhibir la angiogénesis, inhibir la proliferación celular, promover la función inmunológica, inducir la división de citoquina inflamatoria (por ejemplo, desde macrofagos asociados al tumor), inhibir el desarrollo de la vasculatura tumoral (por ejemplo, vasculatura intratumoral o vasculatura asociada al tumor), y/o inhibir la función estromal tumoral. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, puede ser un humano.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento del cáncer. En una realización, el método comprende la administración a un individuo que tiene cáncer de una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-Axl. En dicha realización, el método además comprende la administración a un individuo de una cantidad efectiva de al menos un agente terapéutico adicional, tal como se describe a continuación. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, puede ser un humano.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento de un trastorno inmunológico (por ejemplo, un trastorno autoinmune), un trastorno cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis, hipertensión, trombosis), una enfermedad infecciosa (por ejemplo, virus del Ebola, virus de arburg) o diabetes. En dicha realización, el método además comprende la administración a un individuo de una cantidad efectiva de al menos un agente terapéutico adicional, tal como se describe a continuación. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, puede ser un humano.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para la inhibición de la angiogénesis, la inhibición, de la proliferación celular, inhibición de la función inmunológica, inhibición de la secreción de citoquina inflamatoria (por ejemplo, desde macrofagos asociados al tumor), inhibición de la vasculatura tumoral (por ejemplo, vasculatura intratumoral o vasculatura asociada al tumor), y/o la inhibición de la función estromal tumoral en un individuo. En una realización, el método comprende la administración al individuo de una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-Axl para inhibir la angiogénesis, inhibir la proliferación celular, promover la función inmunológica, inducir la división de citoquina inflamatoria (por ejemplo, desde macrofagos asociados al tumor), inhibir el desarrollo de la vasculatura tumoral (por ejemplo, vasculatura intratumoral o vasculatura asociada al tumor), y/o inhibir la función estromal tumoral. En una realización, un "individuo" es un humano.

En otro aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-Axl que se proporcionan en la presente, por ejemplo, para su utilización en cualquiera de los métodos terapéuticos anteriores. En una realización, una formulación terapéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-Axl que se proporcionan en la presente y un portador aceptable en términos farmacéuticos. En otra realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-Axl que se proporcionan en la presente y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, tal como se describe a continuación.

Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse solos o en combinación con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede co-administrarse con al menos un agente terapéutico adicional. En ciertas realizaciones, un agente terapéutico adicional es un agente anti-angiogénico. En ciertas realizaciones, un agente terapéutico adicional es un antagonista de VEGF (en ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-VEGF, por ejemplo bevacizumab). En ciertas realizaciones, un agente terapéutico adicional es un antagonista de EGFR (en algunas realizaciones, erlotinib). En ciertas realizaciones, un agente terapéutico adicional es un agente quimioterapéutico y/o un agente citostático. En ciertas realizaciones, un agente terapéutico adicional es un taxoide (por ejemplo, paclitaxel) y/o agente de platino (por ejemplo, carboplatino).

Dichas terapias de combinación que se detallaron con anterioridad comprenden la administración combinada (en donde uno o más agentes terapéuticos se incluyen en la misma formulación o formulaciones separadas), y la administración separada, en cuyo caso, la administración del anticuerpo de la invención puede ocurrir en forma previa, simultánea y/o posterior a la administración del agente terapéutico adicional y/o adyuvante. Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse también en combinación con terapia de radiación.

Un anticuerpo de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) puede administrarse mediante cualquier medio idóneo, con la inclusión de tratamiento parenteral, intrapulmonar, e intranasal, y si se desea tratamiento local, administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, o subcutánea. La aplicación de la dosis puede realizarse mediante cualquier vía idónea, por ejemplo, mediante inyecciones, como inyecciones intravenosas o subcutáneas, de acuerdo en parte, a si la administración es breve o crónica. En la presente se contemplan varios cronogramas de aplicación de la dosis con la inclusión, entre otros, de administraciones únicas o múltiples a lo largo de varios puntos de tiempo, administración en bolo y la infusión en pulso.

Los anticuerpos de la invención se formularán, dosificarán y administrarán en una forma coherente con las buenas prácticas médicas. Los factores de consideración en este contexto incluyen el trastorno en particular que se está tratando, el mamífero en particular que se está tratando, la condición clínica del paciente, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, el cronograma de administración y otros factores conocidos para los practicantes de medicina. No es necesario formular al anticuerpo con uno o más agentes que se utilizan actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión, pero puede formularse de este modo en forma opcional. La cantidad efectiva de los otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores que se discutieron con anterioridad. Estos se utilizan generalmente en las misma dosis y con vías de administración como las que se describen en la presente, o aproximadamente desde 1 a 99% de las dosis que se describen en la presente, o en cualquier dosis y mediante cualquier vía que se determine apropiada en términos empíricos/clínicos.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, las dosis apropiadas de un anticuerpo de la invención (cuando se utilice solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad a tratar, el tipo de anticuerpo, la gravedad y curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra a los fines preventivos o terapéuticos, terapias previas, el historial clínico del paciente y la respuesta al anticuerpo, y el criterio del médico que atienda al paciente. El anticuerpo se administra en forma adecuada al paciente una vez o a lo largo de una serie de tratamientos. De acuerdo al tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 pg/kg a 40 mg/kg del anticuerpo puede ser una dosis candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante la infusión continua. Una dosis diaria típica puede variar desde aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, de acuerdo a los factores que se mencionaron con anterioridad. Para las administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, de acuerdo a la condición, el tratamiento generalmente se mantendrá hasta que ocurra un síntoma deseado de supresión de la enfermedad. Dichas dosis pueden administrarse en forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente reciba desde aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Puede administrarse una dosis de carga alta inicial, seguida de una o más dosis más bajas. Sin embargo, otros regímenes de dosis pueden ser útiles. El progreso de esta terapia se monitorea fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales. Se entiende que cualquiera de las formulaciones o métodos terapéuticos anteriores pueden llevarse a cabo mediante la utilización de un inmunoconjugado de la invención en lugar o además de un anticuerpo anti-Axl.

H. Artículos de Producción En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos que se describieron con anterioridad. El artículo de fabricación comprende un envase y una etiqueta o grabado en el envase o en relación a éste.

Los envases ¡dóneos incluyen, por ejemplo, botellas, ampollas, jeringas, bolsas de solución IV, etc. Los envases pueden estar hechos de una variedad de materiales como vidrio o plástico. El envase contiene una composición que por sí misma o en combinación con otra composición es efectiva para el tratamiento y/o prevención y/o diagnóstico de la condición y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o una ampolla que posee un tapón que puede perforarse con una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo de la composición es un anticuerpo de la invención. La etiqueta o grabado del envase indica que la composición se utiliza para tratar la condición seleccionada. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer envase que contenga una composición, en donde la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo envase que contenga una composición, en donde la composición comprende otro agente citotóxico o un agente terapéutico. El artículo de producción en esta realización de la invención puede además comprender un prospecto que indique que las composiciones pueden utilizarse para tratar una condición en particular. En forma alternativa, o adicional, el artículo de fabricación puede además comprender un segundo (o tercer) envase que comprenda un buffer aceptable en términos farmacéuticos, como agua bacteriostática para la inyección (BWFI), una solución salina con buffer de fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Además puede incluir otros materiales aconsejables desde un punto de vista comercial y del usuario, con la inclusión de otros buffers, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

Se entiende que cualquiera de los artículos de fabricación anteriores pueden incluir un inmunoconjugado de la invención en lugar o además de un anticuerpo anti-Axl.

III. EJEMPLOS Materiales y Métodos Anticuerpos y líneas celulares. Los anticuerpos se obtuvieron de los siguientes proveedores: Anticuerpo monoclonal de ratón (mAb) contra AxI humano (Abnova, Taiwan), mAb de ratón fosfo-Akt y anticuerpo policlonal Akt (Señalización Celular). El kit de Gas6 recombinante de ratón y ELISA para fosfo-Axl se adquirieron en el R&D System. Las líneas celulares de carcinoma humano se obtuvieron de ATCC, y se cultivaron en medio PRMI1640 complementado con 10% FBS. Los anticuerpos 12A11 y 3G9 AxI anti-humanos de hibridoma fueron proporcionados por Genentech (véase L¡ (2009)).

Generación de anticuerpos monoclonales anti-Axl de fagos. Para la generación de anticuerpos, se utilizaron bibliotecas de anticuerpos de fagos humanos con diversidades sintéticas en las regiones determinantes complementarias seleccionadas (H1 , H2, H3), que imitaban la diversidad natural del repertorio IgG humano para la adsorción. Se exhibieron fragmentos de Fab en forma bivalente en la superficie de las partículas del bacteriófago M13 (Lee et al, 2004). Las bibliotecas de anticuerpos de fagos se sometieron a adsorción contra ECD AxI de murina y humano en rondas alternativas. Los anticuerpos de fagos que se unen a la proteína de fusión del AxI ECD-His humano y AxI ECD-Fc de murina se identificaron mediante ELISA y el secuenciamiento de ADN, y se reformatearon clones del anticuerpo para expresar IgGs (Liang et al, 2007) de longitud completa. Se expresaron en forma transitoria clones individuales en células mamíferas y se purificaron con columnas de proteína A (Cárter et al, 1992).

Los clones de fagos se examinaron en busca de su habilidad para inhibir la proliferación dependiente de Gas6 de las células Baf3-Axl. Dos clones que exhibían la potencia más alta en la inhibición de la proliferación de las células Baf3Axl fueron seleccionados para la maduración de la afinidad.

Para la maduración de la afinidad, un fagémido que exhibía Fab monovalente en la superficie del bacteriófago M13 ( Liang et al, 2007) sirvió como la plantilla de biblioteca para injertar los dominios variables de cadena liviana (VL) y cadena pesada (VH) del fago Ab. Se adoptó una estrategia de aleatorización suave para la maduración de la afinidad como se describió (Liang et al, 2007),y se utilizó un ELISA de fago competitivo de punto único y alto rendimiento para examinar rápidamente en busca de clones de alta afinidad, tal como se describió (Sidhu et al, 2004).

Medición de la Afinidad de los anticuerpos anti-Axl. Para la determinación de la afinidad de unión de los anticuerpos anti-Axl, se utilizó la medición de Resonancia de Plasmones superficiales (SRP) con un instrumento BIAcore™-3000. Para medir la afinidad entre los anticuerpos anti-Axl y la proteína Axl ECD-His humana, se capturó IgG humano Anti-Axl mediante chips biosensores CM5 cubiertos con IgG anti-humano de ratón para obtener aproximadamente 250 unidades de respuesta (RU). Para las mediciones de cinética, se inyectaron dilusiones seriales dobles de AxI ECD-His (440nM - 28nM) humano en buffer PBT (PBS con 0,05% de Tween 20) a 25°C con una velocidad de flujo de 30µ?/?7???. Los flujos de asociación (kon) y los flujos de disociación (koff) se calcularon mediante un modelo de unión Langmuir individual simple (Bl Acore Evaluation Software versión 3.2). La constante de disociación de equilibrio (KD) se calculó como la proporción koff kon- Para medir la afinidad de los anticuerpos ant¡-Axl a la proteína de fusión AxI ECD-Fc de murina, se capturó proteína de fusión IgG humana AxI ECD de murina mediante chips biosensores CM5 cubiertos con IgG anti-humano de ratón para obtener aproximadamente 150 unidades de respuesta (RU). Para las mediciones de cinética, se inyectaron dilusiones seriales dobles del fragmento de Fag anti-Axl (200nM - 12nM) en buffer de PBST (PBS con 0,05% de Tween 20) a 25°C con una velocidad de flujo de 30µ?/?t???.

Ensayo de proliferación celular. Las células se sembraron a 5000 células/pocilio en placas de 96 pocilios y se trataron con AxI mAb en varias concentraciones durante 72 horas. La proliferación celular se midió mediante la utilización del ensayo CelITiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

ELISA y separación celular activada por la fluorescencia (FACS). Los ensayos ELISA se llevaron a cabo de la siguiente manera: se bloquearon placas cubiertas con Fe de IgG anti-humano de cabra con 0,5% BSA, PBS, 0,05% de Tween 20 (PBST). Para el ensayo de reacción cruzada, se incubaron placas cubiertas con AxI.Fc humano, AxI.Fc de ratón o Mer.Fc humano, Tyro-3.Fc durante 1 hr a temperatura ambiente, se lavaron cuatro veces en PBST, se incubaron con mAbs anti-Axl y Ig anti-ratón conjugado con HRP. Para el ensayo de unión, las placas cubiertas se incubaron con AxI.Fc humano durante 1 hr a temperatura ambiente, se lavaron cuatro veces en PBST, se incubaron con rmGas 6 y anti-Axl mAbs durante 1 hr a temperatura ambiente. Las placas se lavaron cuatro veces en PBST, se incubaron con anti-mGas6 biotinilado y estrepavidina-HRP. Se midió el Ang-2 y DKK3 segregado mediante el kit R&D ELISA, de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La expresión de Axl en la superficie celular se determinó mediante FACS por medio de técnicas estándar. En resumen, las células se extrajeron, se tiñeron con mAb anti-Axl (12A11 , 10ug/ml) durante 30 mins en hielo, se lavaron dos veces en PBS, y luego se tiñó con el segundo anticuerpo conjugado con PE. Para determinar el bloqueo de los anticuerpos de la unión de Gas6 a Axl en la superficie celular, se extrajeron las células, se tiñeron con mAbs anti-Axl durante 30-mins y se incubaron con rmGas6 durante 30-mins en hielo. Se lavaron dos veces en PBS, y se tiñeron con anti-Gas6 biotinilado y estrepavidina conjugada con PE. Las muestras se analizaron en el BD FACScalibur Flow Cytometer.

Experimentos con xenoinjertos. Todos los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" (NIH), y fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales (IACUC). Un total de 5X106 (A549) o 107 células en matrigel (MDA-MB-231 ) se implantaron en forma subcutánea en el costado derecho de los ratones desnudos (A549) o SCID (MDA-MB-231 ), respectivamente. Cuando el tamaño de tumor promedio alcanzó 100 mm3, los ratones se aleatorizaron y dividieron en diferentes grupos de tratamiento (n=10 para cada grupo). Se administraron anticuerpos anti-Axl o lgG1 de control a 10-30 mg/kg, anti-VEGF a 1-2 mg/kg, mediante una inyección intraperitoneal (IP), dos veces por semana. Se administró Erlotinib mediante la alimentación oral forzada a 100 mg/kg/día. Se administraron paclitaxel y carboplatino en forma subcutánea a 6,25 mg/kg/día durante 5 días, y 100 mg/kg para una dosis única, respectivamente, al comienzo del tratamiento. Se llevaron a cabo análisis estadísticos mediante el Anova bidireccional para la comparación del crecimiento tumoral en diferentes grupos de tratamiento.

Para los estudios farmacodinámicos (PD), los ratones se trataron con anticuerpos durante 0, 24, 72 y 168 horas. En cada punto de tiempo, los tumores se extirparon, procesaron para la coloración inmunohistoquímica y el análisis de imagen y se utilizaron para generar lisatos de células para el análisis de Western blot.

Para los estudios de metástasis, las células 5X105 MDA-MB-231 trasnsfectadas en forma estable con un gen reportero de luciferasa (Li et al, 2009) se implantaron en ratones SCID mediante una inyección en la vena de la cola. Se monitoreó la metástasis de las células tumorales a varios órganos mediante la detección de bioluminiscencia como se describió (Li et al, 2009).

Inmunohistoquímica. Las muestras de tumores de xenoinjertos se fijaron en 0% de formalina regulada por buffer neutral, procesadas, embebidas en parafina, y divididas a 4µ??. Luego se trataron secciones delgadas con anticuerpos primarios para K¡67, caspasa 3 escindida y MECA32, seguido de anticuerpos secundarios biotinilados y cromagen DAB.

Se obtuvo tejido de cáncer de mama humano primario de Cureline Inc, con la inclusión de adenocarcinomas ductales y metastáticos. Se llevó a cabo Axl IHC mediante el anticuerpo monoclonal anti-Axl descripto en forma previa (Li et al, 2009), y se tiñeron los macrofagos con CD68. Para la IHC Axl/CD68 dual, se llevó a cabo la tinción de Axl primero a 2 pg/ml mediante reactivos Vector ABC Elite HRP y sustrato de DAB. La tinción de CD68 se llevó a cabo en forma secuencial a 0,5 pg/ml, también mediante reactivos ABC Elite-HRP pero el cromogen de Vector SG (Azul/Verde) en su lugar. Se llevó a cabo un segundo paso de recuperación del antígeno blanco entre los dos complejos para extraer el primer complejo a fin de evitar la reactividad cruzada de los dos marcadores.

Medición de ia densidad vascular y análisis de datos. Las muestras de tumores se tiñeron con MECA32, un marcador de células endoteliales de adsorción. Las imágenes se adquirieron mediante la plataforma de escaneo de portaobjetos automatizada Ariol SL-50 (Genetix Ltd.; Hampshire, UK) a una magnificación final de 100x. Las áreas específicas del tumor se exportaron para el análisis en el paquete de software Metamorph (MDS Analytical Technologies; Ontario, Canadá) como imágenes individuales de 8 bits. La tinción marrón específica de DAB se aisló de la contra tinción con hematoxilina mediante un algoritmo de normalización azul como se describió (Brey et al, 2003). Un algoritmo de segmentación identificó vasos, y extrajo el ruido en base al tamaño y la forma. Las células se identificaron como tumorales o no tumorales en base al tamaño, forma y densidad de la tinción de hematoxilina. Las áreas no tumorales se identificaron por la densidad de las células no tumorales versus las células tumorales. Luego de que se completó el análisis, las imágenes se revisaron en forma manual para extraer los objetos identificados incorrectamente como vasos o áreas tumorales. Las mediciones de área se registraron para los vasos individuales, así como también áreas tumorales y no tumorales en cada imagen. Los valores brutos basados en el análisis de imágenes se analizaron mediante el software JMP 8.0 (SAS Institute, Inc. North Carolina, USA). Se llevó a cabo una prueba t de Student para comparar cada par depromedios, con p < 0,05.

Aislamiento de macrófagos asociados al tumor (TAM) y detección de citoquinas segregadas. Se diseccionaron los tumores, se picaron en pequeños trozos y se incubaron en medio RPMI1640 con 2,5% FBS, 0,2 unidades/ml Liberase Blendzymes II y 5 unidades/ml DNasel, (Roche). Las células tumorales se diasociaron mediante un Disociador MACS (Miltenyi Biotec) y se conservaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se añadió EDTA (concentración final 0,002%) para detener la reacción. Se prepararpn suspensiones de células únicas y se extrajeron los glóbulos rojos mediante buffer de lisis RBC (eBioscience). Las células se resuspendieron a 107células/ml en PBS con 1 % de FBS y se incubaron con 20Dg/ml FcRII, III y IV durante 20 minutos. Se añadieron anti-F4/80-PE (eBioscience) y anti-CD11c-APC (BD Pharmingen) (0,2 pg/106 células) y se incubaron durante 30 minutos en hielo. Las células positivas F4/80 y CD1 1 c se separaron mediante FACSAria (BD Biosciences). Un total de 2x105 de células positivas F4/80 y CD1 1c se sembraron en una placa de 96 pocilios y se cultivaron durante la noche. Se recolectó el medio de cultivo y se determinaron los niveles de citoquinas y quemoquinas mediante ensayos de citoquina de ratón Bio-Plex (Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Mapeo de Epítopos Los constructos de plásmidos Axl-2 (PRK HuAxl(1 -134Aa)/HulgG1 Fe), Axl-3 (PRK HuAxl(1-221 Aa)/HulgG1 Fe), Axl-4 (PRK HuAxl(1-324Aa)/HulgG1 Fe), y Axl-5 (PRK HuAxl(1-435Aa)/HulgG1 Fc) se realizaron mediante técnicas de biología molecular estándar. Todos los plásmidos se confirmaron mediante el secuenciamiento directo y/o digestión de restricción. Los plásmidos que codifican varias porciones del dominio extracelular de AxI (aa1-134, aa1-221 , aa1-324, aa1-435) se transcribieron in vitro y se trasladaron mediante el kit de sistemas de transcripción/traslación Promega L2080 TNT SP6 Quick y se utilizaron como antígenos en ELISA. Las porciones de AxI utilizadas en estos experimentos incluyeron: Aminoácidos 1-134 del AxI humano (que comprende Ig1 de AxI): MAWRCPRMGRVPLAWCLALCGWACMAPRGTQAEESPFVGNPGNITGARGLTG TLRCQLQVQGEPPEVHWLRDGQILELADSTQTQVPLGEDEQDDWIWSQLRITSL QLSDTGQYQCLVFLGHQTFVSQPGYVG (SEQ ID N.°:1 11 ), y aminoácidos 221-324 del AxI humano (que comprende el dominio de fibronectina de AxI): ITVLPQQPRNLHLVSRQPTELEVAWTPGLSGIYPLTHCTLQAVLSDD GMGIQAGEPDPPEEPLTSQASVPPHQLRLGSLHPHTPYHIRVACTSSQGPSSWT HWL (SEQ ID N.°:130).

Experimentos de competencia de los anticuerpos. Para determinar si los YW327 o YW327.42 mabs anti-Axl de los fagos compitieron con los 12A11 y 3G9 mAbs anti-Axl de los hibridomas, las células A549 se co-tiñeron con un anticuerpo de fagos anti-Axl (cada uno a 50 pg/ml) y un anticuerpo anti-Axl de hibridomas (cada uno a 10 pg/ml) durante 30 minutos. Las células, se lavaron dos veces en PBS, y se tiñeron con Ig-PE anti-ratón: Las muestras se analizaron en el BD FACScalibur Flow Cytometer (BD Biosciences) tal como se describió con anterioridad para el análisis FACS.

Resultados Generación de un anticuerpo monoclonal derivado de fagos que bloquea la función Axl. Para identificar los anticuerpos que presentan una reacción cruzada a la murina y al Axl humano, empleamos bibliotecas de anticuerpos con exhibición de fagos con diversidades sintéticas en las regiones determinantes complementarias seleccionadas, que imitaban la diversidad natural de los anticuerpos IgG humanos (Lee et al, 2004). Los anticuerpos de fagos que se unieron al Axl ECD humano y de murina se identificaron mediante ELISA y el secuenciamiento de ADN, y los clones del anticuerpo se reformatearon para expresar IgGs de longitud completa (Liang et al, 2007). Luego se examinó un panel de IgGs de longitud completa en busca de su habilidad para inhibir el crecimiento de las células Baf3Axl dependiente de Gas6 (Li et al, 2009), y se maduró la afinidad de uno de los clones YW327.6 y se purificó.

El Axl mAb YW327.6S2 con afinidad madura se une al Axl humano y de murina con una alta afinidad, con un Kd de aproximadamente 1 nM, y 545 pM, respectivamente (Fig. 7A-B). Específicamente, Ka fue 1 ,7 X 105, kd fue 1 ,7 X 104, y KD fue 9,9 X 10 ~10. Este anticuerpo también se une al AxI cinomolgo, pero no presenta reacción cruzada con los receptores relacionados Tyro3 y Mer (Fig. 7C). YW327.6S2 bloquea la unión del ligando Gas6 a AxI como se demostró en el ELISA libre de células y en la superficie celular mediante FACS, en una forma dependiente de la dosis (Fig. 7D-E).

Los Mabs de AxI con afinidad madura YW327.6S11 , YW327.42S8 y YW327.42S31 también se caracterizaron. YW327.6S11 , YW327.42S8 y YW327.42S31 se unen al AxI humano y de murino con una alta afinidad. Por ejemplo, el análisis biacore de los anticuerpos que se unen al AxI humano resultó de la siguiente manera: Hu Axl . Ka kd KD YW327.6S11 1,7 X 105 1 ,7 X 104 1 ,3 X 109 YW327.42S8 5,2.X 104 1 ,3X 104 2,5 X 109 YW327.42S31 6,3 X 104 1 ,5 XI O4 2,4 X I O9 Estos anticuerpos no presentan una reacción cruzada con Tyro3 y Mer. YW327.6S2 (y el anticuerpo progenitor YW 327.6) bloquea la unión del ligando Gas6 a Axl, mientras que YW327.42S8 y YW327.42S31 (y Mab YW327.42 progenitor) no bloquean la unión del ligando Gas6 a Axl.

Análisis de epítopos de Axl. La unión de los anticuerpos Axl a varias porciones del dominio extracelular del Axl humano se analizó mediante ELISA. Se obtuvieron los resultados.

YW327.6 YW327.42 Axl2 (aal-134) + Axl-3 (aal-221) + Axl-4 (aal-324) + + YW327.6 se unió a las fusiones Axl-Fc que comprenden los aminoácidos 1-134 del AxI humano. Por contraste, YW327.42 unió una fusión Axl-Fc que comprende los aminoácidos 1-324 del AxI humano, pero no unió las fusiones AxI Fe que comprenden los aminoácidos 1-134, y 1-221. Por lo tanto, concluimos que YW327.6 se une un polipéptido que consta de los aminoácidos 1-134 del AxI humano, y que el AxI humano de los aminoácidos 222-234 era necesario para la unión de YW327.42. Los aminoácidos 1-134 contienen el dominio Igl del AxI, y los aminoácidos 222-234 contienen el dominio de la fibronectina del AxI.

Experimentos de competencia con anticuerpos del hibridoma anti-Axl. Determinamos si los anticuerpos YW326.6 y YW327.42 pudieron competir por la unión al AxI humano con los anticuerpos 12A11 y 3G9 del hibridoma anti-Axl (Li, (2009), solicitud de patente de los Estados Unidos 61/228.915 presentada el 27 de julio de 2009). En los experimentos de unión de competencia de los anticuerpos al AxI humano, el Anticuerpo YW327.6 no compitió por la unión al AxI humano con los anticuerpos del hibridoma 12A11 o 3G9, lo cual demuestra que estos anticuerpos no reconocen los mismo epítopos. El anticuerpo YW327.42 compitió por la unión al AxI humano con el anticuerpo 12A 1 del hibridoma, pero no compitió por la unión al AxI humano con el anticuerpo 3G9 del hibridoma.

YW327.6S2 regula en forma descendente la expresión AxI, inhibe su activación, señalización y proliferación celular Baf3Axl dependiente de Gas6. Para examinar si YW327.6S2 afecta las funciones biológicas de AxI, primero evaluamos su efecto sobre la expresión y señalización de AxI. El tratamiento de la línea celular A549 NSCLC con YW327.6S2 resultó en la regulación descendente rápida de la expresión de AxI en la superficie celular (Fig. 7F, panel superior) y esta regulación descendente se conserva durante 24 hrs (Fig. 7F, panel inferior). El tratamiento Gas6 de las células H1299 NSCLC conduce a la fosforilación de AxI que se inhibió cuando las células se pre incubaron con YW327.6S2 (Fig. 7G, panel superior). En consecuencia, la pre incubación de las células H1299 con YW327.6S2 bloquea la fosforilación inducida mediante Gas6 de la molécula akt de señalización descendente (Fig. 7G, panel inferior). La regulación descendente de la expresión AxI y la desactivación de su señalización mediante YW327.6S2 inhibió potentemente el crecimiento dependiente de Gas6 de las células Baf3Axl, con un IC50 de 340 ng/ml (Fig. 7H).

YW327.6S2 reduce el crecimiento del xenoinjerto A549 y mejora el efecto de Anti-VEGF. En un estudio previo, demostramos que la inhibición de AxI por ARNi o por el tratamiento con anticuerpos monoclonales del hibridoma AxI anti-humano atenuó en forma significativa el crecimiento tumoral de A549 NSCLC (Li et al, 2009). Por lo tanto, primero examinamos el efecto de YW327.6S2 sobre el crecimiento tumoral en este modelo. YW327.6S2 solo, a 10 mg/kg, con un régimen de dosis de dos veces por semana redujo en forma significativa el crecimiento tumoral de A549 (Fig. 8A), y este efecto inhibidor se compara a aquél de los anticuerpos del hibridoma AxI anti-humano (Fig. 8C).

AxI se expresa en las células endoteliales y mejora la formación de os túbulos endoteliales inducida por VEGF (Li et al, 2009; Holland et al, 2005); examinamos si los mAb anti-Axl podían mejorar la propiedad de crecimiento anti tumoral del anti-VEGF (Liang et al, 2006). El anticuerpo anti-VEGF solo y YW327.6S2 solo tuvieron efectos similares sobre el crecimiento tumoral de A549 (Fig. 8A). La combinación de los dos anticuerpos juntos resultó en la mejora de la inhibición del crecimiento tumoral en comparación con cualquiera de los dos anticuerpos solos, con 30% de inhibición mediante un agente único versus 60% de inhibición mediante el tratamiento de combinación (Fig. 8A).

Los animales en este estudio recibieron dosis dos veces por semana durante 60 días y se controlaron hasta el día 85 para examinar el retraso en el crecimiento tumoral (los animales se extrajeron del estudio cuando los tamaños del tumor excedían los 800 mm3; no se extrajo ningún animal por causa de toxicidad). YW327.6S2 en combinación con anti-VEGF retrasó en forma significativa el crecimiento tumoral en comparación con un agente único (Fig. 8A). No existió un nuevo crecimiento tumoral en el grupo de tratamiento de combinación durante el tiempo que transcurrió desde la última dosis hasta el final del experimento (día 85), lo cual condujo a que todos los animales en este grupo sobrevivieran al final del experimento, tal como se muestra en el gráfico Kaplan-Meier (Fig. 8B).

El anticuerpo 12A11 monoclonal del hibridoma AxI, que no presenta una reacción cruzada con el AxI de la murina, atenuó en forma significativa el crecimiento tumoral del xenoinjerto A549 (L¡ et al, 2009), también mejora el efecto de anti-VEGF tal como se muestra en Fig. 8C. Esto se espera, ya que 12A1 1 inhibe directamente el crecimiento de las células tumorales y anti-VEGF afecta la vasculatura tumoral.

YW327.6S2 regula en forma descendente la expresión del receptor e induce la apoptosis de las células tumorales A549. Para comenzar a entender los mecanismos que median el efecto de YW327.6S2 sobre la reducción del crecimiento tumoral, llevamos a cabo un estudio farmacodinámico. Los ratones que portan el tumor A549 se trataron con YW327.6S2, y los tumores se extirparon a las 0, 24, 72, y 168 hrs luego de la aplicación de la dosis. El análisis de Western blot de los lisatos tumorales demostró que la expresión Axl se reguló en forma descendente 24hr luego de la administración del anticuerpo y se sostuvo durante 168 hrs (Fig. 8D), lo cual sugiere que el efecto de crecimiento anti-tumoral de YW327.6S2 es mediado en parte por la regulación descendente de la expresión Axl.

A fin de determinar si YW327.6S2 posee un efecto directo sobre la proliferación y apoptosis de las células tumorales, los tumores del xenoinjerto A549 tratados con control o YW327.6S2 durante dos semanas se extirparon y escindieron caspasa 3 (CC3) y se realizó Ki67 IHC. Los tumores tratados con YW327.6S2 exhibieron un aumento de CC3 en comparación con el control (Fig. 8E), lo cual sugiere que YW327.6S2 induce la apoptosis de las células tumorales. No existió una diferencia significativa en los núcleos positivos de Ki67 entre los tumores de control y YW327.6S2 tratados, lo cual sugiere que YW327.6S2 no afecta en forma directa la proliferación de las células tumorales.

Para investigar si YW327.6S2 afecta la vasculatura asociada al tumor, tratamos ratones portadores del tumor A549 con YW327.6S2 solo o en combinación con anti-VEGF. Los tumores se extirparon y se tiñeron con MECA32, un marcador endotelial de adsorción, para examinar la densidad vascular intratumoral. YW327.6S2 solo, no redujo en forma significativa la densidad vascular en comparación con el control pero la combinación con anti-VEGF resultó en la disminución significativa de la densidad vascular asociada al tumor (Fig. 8F). En contraste, 12A11 no posee un efecto significativo sobre la densidad vascular por sí mismo o en combinación con anti-VEGF.

YW327.6S2 mejora el efecto de eriotinib y la quimioterapia. Para examinar si YW327.6S2 puede mejorar el índice terapéutico de los tratamientos habituales para NSCLC, llevamos a cabo un tratamiento de combinación de YW327.6S2 con el inhibidor de las moléculas pequeñas de EGFR (SMI) eriotinib y quimioterapia. A549 contiene EGFR de tipo salvaje y es solo moderadamente sensible al eriotinib (Yauch et al, 2005); por lo tanto investigamos si el mAb anti-AxI puede hacer que estas células sean sensibles al EGFR SMI. YW327.6S2 y eriotinib cuando se administraron como un agente único resultó en un 30% de reducción del crecimiento tumoral pero en combinación redujeron la tasa de crecimiento tumoral en más del 50% (Fig. 9A), lo cual sugiere que mAb anti-AxI mejora el efecto de crecimiento anti-tumoral del eriotinib.

Luego investigamos si mAb anti-Axl era capaz de mejorar el índice terapéutico de la quimioterapia estándar para NSCLC. Los ratones portadores de injertos A549 se trataron con un ciclo de quimioterapia que consta de paclitaxel (6,25 mg/kg/día, 5 día) y carboplatino (100 mg/kg, una dosis) administrados al principio del tratamiento (día 0, Fig. 9B). La quimioterapia sola posee un efecto similar sobre el crecimiento tumoral al de YW327.6S2 administrado solo, y la combinación de los dos resultó en la mejora de la inhibición del crecimiento tumoral (Fig. 9B).

YW327.6S2 reduce la densidad vascular e inhibe la secreción de citoquina inflamatoria de los macrofagos asociados al tumor en el modelo de xenoinjerto de cáncer de mama MDA-MB-231. Debido a que el silenciamiento de AxI por parte de shRNA posee solo efecto moderado sobre el crecimiento tumoral del xenoinjerto MDA-MB-231 (Li et al, 2009), nos preguntamos si YW327.6S2 es eficaz en este modelo. YW327.6S2 solo, fue capaz de reducir el crecimiento tumoral (25%), y tuvo un efecto similar al anti-VEGF utilizado como un agente único en este modelo (Fig. 10A). La terapia de combinación conduce a una reducción del 50% en el crecimiento tumoral, lo cual sugiere que YW327.6S2 potencia el efecto del anti-VEGF (Fig. 10A). En contraste, el anticuerpo 12A11 del hibridoma anti-Axl (Li et al, 2009) el cual no presenta una reacción cruzada con el AxI de murino, no tiene un efecto significativo sobre el crecimiento tumoral como un agente único en este modelo, ni afecta al anti-VEGF (Fig. 10B). El análisis Western blot demostró que tanto YW327.6S2 como 12A11 regulan en forma descendente la expresión AxI en los tumores (Fig. 10C & D). Estos resultados sugieren que el efecto de crecimiento anti-tumoral de YW327.6S2 puede mediarse por la modulación de las funciones estromales tumorales.

Para seguir investigando cómo YW327.6S2 puede modular las funciones estromales del tumor, tratamos ratones portadores del tumor MDA-MB-231 con YW327.6S2 solo o en combinación con anti-VEGF. En varios puntos de tiempo luego de la administración de los anticuerpos, los tumores se extrajeron y se tiñeron con MECA32 para examinar la densidad vascular intra-tumoral. Tanto YW327.6S2 como anti-VEGF redujeron en forma significativa la densidad vascular en comparación con el control (Fig. 10E). y la combinación de los dos anticuerpos resultó en la reducción adicional del tumor asociado a la densidad vascular. Estos resultados sugieren que YW327.6S2 reduce el crecimiento del tumor MDA-MB-231 en parte al alterar las funciones vasculares.

En los ejemplares de cáncer de mama humano, encontramos que la proteína Axl se expresa fuertemente en los macrofagos infiltrantes (Fig. 10F) y por lo tanto nos preguntamos si Axl mAb YW327.6S2 puede afectar las funciones de los macrofagos asociados al tumor (TAMs). Los tumores del xenoinjerto MDA-MB-231 se trataron durante una semana con YW327.6S2, 12A11 o anticuerpo de control, y los TAMs se aislaron mediante la separación de las células positivas F4/80. Las células se cultivaron en medio libre de suero durante la noche, y el sobrenadante se recogió y se sometió a ensayo en busca de la presencia de varias citoquinas y quemoquinas. Los TAMs de los tumores tratados con YW327.6S2 y 12A11 produjeron niveles mucho más bajos de citoquinas y quemoquinas inflamatorias en comparación con los TAMs tratados con anticuerpo de control (Fig. 10G). El tratamiento con cualquier AxI-mAb no afecta los niveles de expresión Axl en los TAMs (no se muestran los datos) en contraste con la regulación descendente de la expresión Axl en las células tumorales por parte de estos anticuerpos (Fig 10C & D). Estos resultados sugieren que es más probable que los mAbs Axl modulen la secreción de citoquina/quemoquina de los TAMs de manera indirecta, quizás mediante el bloqueo de la comunicación entre las células tumorales y estromales. YW327.6S2 reduce la metástasis de las células del cáncer de mama MDA-MB-231 a los huesos. En un estudio previo demostramos que el silenciamiento de Axl por parte de shRNA inhibe la metástasis de las células del cáncer de mama MDA-MB-231 al pulmón en un modelo ortotópico (Li et al, 2009), entonces examinamos si YW327.6S2 afecta la metástasis de estas células. Las células MDA-MB-231 que expresaban en forma estable el gen reportero de luciferasa (20) se inyectaron mediante la vena de la cola en los ratones SCID. Cuatro semanas luego de la inyección, se detectaron señales luminiscentes fuertes en la región craneofacial, tibia y fémur de los cinco animales en el grupo tratado con el anticuerpo de control. Los sitios detectados por bioluminiscencia en los grupos de control son 5, 5, 4, 3 y 1 en cada animal, con un total de 18 (Fig. 11 A), en los ratones tratados con YW327.6S2, los sitios detectados por bioluminescencia se redujeron en forma significativa, con los sitios 0, 1 , 2, 3, y 1 en cada animal y un total de 7 para todo el grupo (Fig. 1 1 A). Se verificó la presencia de focos metastáticos en los huesos mediante el análisis histológico (Fig. 11 B). Estos resultados sugieren que YW327.6S2 es capaz de reducir la metástasis de las células del cáncer de mama MDA-MB-231 a órganos distantes.

Discusión Hemos desarrollado y caracterizado un anticuerpo monoclonal anti-AxI humano (YW327.6S2) que exhibe reactividad cruzada entre especies y bloquea varias funciones de AxI en la tumorigénesis. Además de ser el primer anticuerpo bloqueador reportado, humanizado en forma completa para AxI, YW327.6S2 no solo sirve como una herramienta poderosa para analizar el impacto de la activación/señalización de AxI en múltiples aspectos del desarrollo y progresión del cáncer, sino que también representa un terapéutico potencial para el tratamiento de varios cánceres.

Nuestros resultados muestran que YW327.6S2 bloquea las funciones de AxI mediante la regulación descendente de la expresión AxI así como también la inhibición del ligando Gas6 que se une al receptor, lo cual conduce a la desactivación de AxI y su señalización descendente (Fig. 7). La habilidad de YW327.6S2 de regular en forma descendente la expresión AxI en las células cancerígenas representa un mecanismo importante para sus efectos inhibidores, ya que muchos cánceres expresan AxI activado en forma constitutiva y ya no responden al Gas6 exógeno (Li et al, 2009).

En el modelo A549 NSCLC, YW327.6S2 atenuó en forma significativa el crecimiento tumoral cuando se administró como un agente único (Fig. 8A). Este efecto inhibidor se compara al de los anticuerpos del hibridoma anti-AxI en este modelo (Li et al (2009); (Fig. 8C). YW327.6S2 regula rápidamente en forma descendente la expresión AxI en los xenoinjertos (Fig.8D), e induce la apoptosis de las células tumorales (Fig. 8E), el cual es probablemente uno de los mecanismos que media su efecto inhibidor en el crecimiento tumoral. Nuestros descubrimientos previos acerca de que Axl modula las funciones de las células endoteliales mediante la regulación de DKK3 y las vías angiopoyetina/Tie2 (Li et al, 2009) plantearon la posibilidad de que el mAb anti-Axl podía mejorar el efecto del anti-VEGF al reducir el crecimiento del tumor. Nuestros resultados (Fig. 8A & F) son coherentes con esta hipótesis, en que YW327.6S2 impacta la vasculatura tumoral al mejorar el efecto del anti-VEGF para reducir la densidad vascular intra-tumoral. Efectivamente, la co-administración de YW327.6S2 y anti-VEGF en el modelo A549 resultó en la estasis del tumor que se mantuvo por al menos 4 semanas luego de la finalización del tratamiento (Fig. 8B). El anticuerpo 12A11 del hibridoma también mejora el efecto anti-tumoral de anti-VEGF en este modelo (Fig. 8C). Sin embargo, a diferencia de YW327.6S2, 12A11 no tiene un efecto directo sobre la vasculatura tumoral; en cambio, inhibe directamente la proliferación de las células tumorales e induce la apoptosis (Li et al. 2009). El efecto de 12A 1 sobre el crecimiento tumoral y el anti-VEGF sobre la vasculatura tumoral resultó en el aumento del efecto cuando los dos agentes se utilizan juntos. Los inhibidores de molécula pequeña de EGFR como erlotinib son eficaces en el tratamiento de los tumores NSCLC que albergan las mutaciones o amplificación de EGFR (Lynch et al, 2004; Paez et al, 2004; Eberhard et al, 2005; Giaccone et al, 2005; Tsao et al, 2005). También se sabe que el tratamiento de las células del cáncer de mama con el inhibidor Lapatinib de moléculas pequeñas Her2/EGFR o anticuerpo anti-Her2 Herceptin conduce a la inducción de la expresión Axl y en consecuencia resulta en la resistencia de las células cancerígenas a estas terapias (Liu et al, 2009). Recientemente, hemos descubierto que la expresión AxI se induce en las células HCC827 NSCLC (una línea celular que alberga tanto la mutación como la amplificación de EGFR) que ha adquirido resistencia al erlotinib, y el silenciamiento de AxI en las células resistentes restaura su sensibilidad al erlotinib, lo cual sugiere que AxI puede jugar un papel en la resistencia al erlotinib en NSCLC. Debido a que las células A549 contienen EGFR de tipo salvaje y son sensibles solo en forma moderada a la inhibición in vitro de EGFR (Yauch et al, 2005), nos preguntamos si mAb anti-Axl haría que estas células sean sensibles al erlotinib. Nuestros resultados demostraron que YW327.6S2 potencia el efecto del erlotinib en la reducción del crecimiento tumoral (Fig. 9A), lo cual sugiere que mAb anti-Axl puede mejorar la eficacia de los inhibidores de EGFR en los tumores que son refractarios a la inhibición de EGFR sola, quizás al reducir directamente la expresión AxI en las células tumorales.

La quimioterapia sistémica juega el papel más importante en los paradigmas de tratamiento para NSCLC. Para las enfermedades recurrentes o avanzadas, los pacientes tratados con quimioterapia que consta de carboplatino/paclitaxel poseen una tasa de respuesta del 15% y una supervivencia media de 10,3 meses (Sandley et al, 2006). Nuestros resultados en el modelo A549 NSCLC mostraron que YW327.6S2 es capaz de mejorar la eficacia anti-tumoral del carboplatino/paclitaxel (Fig. 9B), lo cual sugiere que las funciones AxI de bloqueo pueden mejorar el índice terapéutico de la quimioterapia en esta enfermedad. Nuestros resultados son coherentes con un informe reciente que demuestra que un inhibidor de molécula pequeña AxI sinergizó con cisplatino para suprimir la micrometastasis de hígado en el modelo ortotópico de cáncer de mama 4T1 (Holland et al, 2010).

En el modelo de cáncer de mama MDA-MB-231 , YW327.6S2 solo, es capaz de atenuar en forma significativa el crecimiento tumoral (Fig. 10A). El anticuerpo del hibridoma anti-Axl, el cual no presenta reacción cruzada con el Axl de murino y por lo tanto afectaría solo las células tumorales, no tuvo un efecto significativo sobre el crecimiento tumoral en este modelo (Fig. 10B). Estos resultados sugieren que es probable que YW327.6S2 ejerza su efecto anti-tumoral a través de sus acciones sobre el estroma pulmonar. Nuestros resultados muestran que YW327.6S2 reduce la densidad vascular intra-tumoral (Fig. 10E) y mejora el efecto de anti-VEGF. A través de su efecto sobre la vasculatura tumoral, YW327.6S2 puede tener un impacto sobre el crecimiento tumoral.

Se ha apreciado una asociación entre el desarrollo del cáncer y la inflamación desde hace mucho tiempo (Balkwill & Mantovani, 2001 ; Coussens & Werb, 2002). La inflamación crónica asociada a la infección e irritación puede conducir a entornos que fomenten las lesiones genómicas y el comienzo de un tumor. Existe evidencia creciente de que los TAMs tienen papeles causales en la progresión del tumor, con la inclusión de la promoción de la angiogénesis y el remodelado de la matriz (Balkwill et al, 2005; Pollard, 2004). Se cree que las señales responsables de esto son las citoquinas inflamatorias, con la inclusión del factor-a de necrosis tumoral (TNF-a), interleuquina 6 (IL-6) y una plétora de quemoquinas. Estas citoquinas y quemoquinas no solo reclutan células inmunes hacia los sitios específicos que estimulan la progresión del tumor, sino que se ha demostrado que sus receptores se expresan en las células tumorales en donde pueden aumentar el crecimiento y la migración tumoral (Haghnegahdar et al, 2000). En el cáncer de mama humano primario, la proteína Axl se expresa en altos niveles en los macrófagos asociados al tumor (TAMs) (Fig. 10F). Proporcionamos evidencia aquí acerca de que los mAbs anti-Axl pudieron modular las funciones de éstas células a través de un mecanismo indirecto. Nuestros datos mostraron que el tratamiento de los xenoinjertos MDA-MB-231 con YW327.6S2 o 12A11 (que no presenta una reacción cruzada con el Axl de murina y por lo tanto no debería tener un efecto directo sobre TAMs) inhibe la secreción de las citoquinas y quemoquinas inflamatorias desde los TAMs (Fig. 10G). Debido a que parece que los AxI-mAbs no tienen un efecto significativo sobre la expresión Axl en los TAMs pero regulan en forma descendente la expresión de los receptores en las células tumorales, es probable que los anti-AxI-mAbs modulen la secreción de citoquina/quemoquina desde los TAMs mediante el bloqueo de la comunicación entre las células tumorales y estromales. Estos resultados son coherentes con los informes recientes acerca de que las células tumorales pudo promover su crecimiento mediante la educación de los leucocitos infiltrantes para inducir la expresión de Gas6 (Loges et al, 2010); y un inhibidor de molécula pequeña de Axl redujo la expresión GM-CSF en las células del tumor de mama 4T1 (Holland et al, 2010). Los estudios previos han establecido el papel de de Axl en la promoción de la migración, invasión y metástasis de las células tumorales (Zhang et al, 2008; Li et al, 2009; Tai et al, 2008; Vajkoczy et al, 2006; Gjerdrum et al, 2010). Aquí mostramos que YW327.6S2 es capaz de reducir la metástasis de las células del cáncer de mama MDA- B-231 a los huesos. Estos resultados son coherentes con nuestros datos previos de que el silenciamiento Axl por parte del ARNi en las células de cáncer de mama inhibe su metástasis al pulmón en un modelo ortotópico (Li et al, 2009; Gjerdrum et al, 2010), lo cual sugiere que este anticuerpo anti-Axl podría tener potencial terapéutico no solo en el tratamiento de un tumor primario sino también en la enfermedad mestastática.

En conclusión, hemos desarrollado un anticuerpo monoclonal humano que bloquea las funciones Axl. Este mAb anti-Axl ejerce su efecto anti-tumoral a través de mecanismos múltiples con la inclusión de la inducción de la apoptosis de las células tumorales, regulación de la angiogénesis y modulación de las funciones de las células inmunes asociadas al tumor. En forma adicional, este mAb anti-Axl mejora la eficacia anti-tumoral del anti-VEGF, EGFR SMI así como también la quimioterapia, puede por lo tanto representar un enfoque terapéutico novedoso en los ambientes clínicos en donde estas terapias son tratamientos habituales.

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A pesar de que la invención que antecede se ha descripto en detalle a modo ilustrativo y ejemplificativo a los fines de la claridad de la comprensión, las descripciones y ejemplos no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención. Las descripciones de todas las patentes y bibliografía científica mencionada en la presente se incorporan expresamente en su totalidad a modo de referencia.

Claims

REIVINDICACIONES Habiendo así especialmente descripto y determinado la naturaleza de la presente invención y la forma como la misma ha de ser llevada a la práctica, se declara reivindicar como de propiedad y derecho exclusivo:

1. Un anticuerpo aislado que se une a Axl humano, en donde el anticuerpo se une a Axl humano con una afinidad de= 600 pM, en donde el anticuerpo se une a Axl de ratón con una afinidad de= 1 nM.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo promueve la regulación descendente del receptor de Axl y/o inhibe la activación de Axl constitutivo.

3. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el anticuerpo se une a un polipéptido que comprende, que consta esencialmente de o que consta de la siguiente secuencia de aminoácidos SEQ ID N.°:111.

4. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que es un anticuerpo monoclonal.

5. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que es un anticuerpo lgG1 de longitud completa.

6. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que es un anticuerpo humano, anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, o fragmento de anticuerpo que se une a Axl.

7. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende GFX1X2X3X4 5 6 7H, en donde X1 es S o T; X2 es L, F o V; X3 es S, T, o R; X4 es G o S; X5 es S, H, T o I; X6 es W o G; X7 es I o L (SEQ ID N.°:112), (b) HVR-H2 que comprende XiXsIXaPX^XsXeXyXeYYADSVKG, en donde Xi es G o A; X2 es W o G; X3 es N, S, A o P; X4 es Y, A o V; X5 es R, G, o S; X6 es G R o S; X7 es Y, S, H o Y; Xg es A, T, o P (SEQ ID N.°:113); (c) HVR-H3 que comprende ARX1 X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13 DY, en donde X, es E o W; X2 es Y o R; X3 es S, N o P; X es G, D, o L; X5 es W o S; X6 es G, R, A, o S; X7 es G o S; Xg es S o está ausente; Xg es S, Y o está ausente; X10 es V, I o está ausente; Xn es G o está ausente; X12 es Y o está ausente; X13 es A, E o está ausente (SEQ ID N.°:114); (d) HVR-L1 que comprende RASQX1X2X3X4X5X6A, en donde X1 es D, I o S; X2 es V o I; X3 es S, G o R; X4 es T, I. N o R; X5 es A o S; Xe es V o L (SEQ ID N.°:115); (e) HVR-L2 que comprende X1ASX2LX3S, en donde X1 es S, A, o V; X2 es F, N o S; X3 es Y o A (SEQ ID N.°:116); y (f) HVR-L3 que comprende QQX^Xs X XsXeT en donde X1 es S o A; X2 es Y, K o N; X3 es T, S, Y, M, R o A; X4 es T, N, S, o F; X5 es P o R; Xe es P, Y, S o L (SEQ ID N.°:117).

8. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende GFXÍX2X3GX4WIH, en donde X1 es T o S, X2 es F o L, X3 es T o S, X4 es H, S o T (SEQ ID N.°:1 18); (b) HVR-H2 que comprende GWIX1PYX2X3X4X5YYADSVKG, en donde X1 es S, N o A; X2 es G, R o S; X3 es G o R; X4 es S, Y o H; X5 es T, A o P (SEQ ID N °:1 19); (c) HVR-H3 que comprende AREYX^WXaXíSXsXeGYXzlvlDY, en donde X1 es S, N o P; X2 es G o D; X3 es G, R, o A; X4 es G o S; X5 es S o Y; Xe es V o I; X7 es A o E (SEQ ID N.°:120); y (d) HVR-L3 que comprende QQSYX1X2X3X4TI en donde X1 es T, S o Y; X2 es T, N, S o F; X3 es P o R; X4 es P, Y o S (SEQ ID N.°:121 ).

9. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el anticuerpo comprende (a) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:9, (b) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:12, y (c) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:8.

10. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:7, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:8, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:9.

11. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que además comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:10, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:11 , y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:12.

12. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 , que además comprende una secuencia marco de dominio variable de cadena liviana o dominio variable de cadena pesada que se muestra en la Figura 3A-B, 4, 5 o 6.

13. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que comprende (a) una secuencia VH que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:103; (b) una secuencia VL que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°:104; o (c) una secuencia VH como en (a) y una secuencia VL como en (b).

14. El anticuerpo de la reivindicación 13, que comprende una secuencia VH de SEQ ID N.°:103 y/o una secuencia VL de SEQ ID N.°:104.

15. Ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-14.

16. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 15.

17. Un método de producción de un anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 18 de manera que se produce el anticuerpo.

18. El método de la reivindicación 17, que además comprende la recuperación del anticuerpo de la célula huésped.

19. Un inmunconjugado que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-14 y un agente citotóxico.

20. Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-14 y un portador farmacéuticamente aceptable.

21. La formulación farmacéutica de la reivindicación 20, que además comprende un agente terapéutico adicional.

22. El agente farmacéutico de la reivindicación 20, en donde el agente terapéutico adicional se selecciona de un antagonista de VEGF, un antagonista de EFGR, y un agente quimioterapéutico.

23. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para el uso como un medicamento.

24. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para el uso en el tratamiento de cáncer, trastorno inmune, trastorno cardiovascular, trombosis, o diabetes.

25. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para el uso en la inhibición de la proliferación celular, promover la regulación descendente de Axl, inhibir la metástasis, y/o inhibir la angiogénesis.

26. Uso del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-14 en la producción de un medicamento.

27. El uso de la reivindicación 26, en donde el medicamento es para el tratamiento de cáncer, trastorno inmune, trastorno cardiovascular, trombosis, o diabetes.

28. El uso de la reivindicación 26, en donde el medicamento es para inhibir la proliferación celular, inhibir angiogénesis, promover la regulación descendente Axl, y/o inhibir la metástasis.

29. El uso de la reivindicación 27, donde el medicamento es para el tratamiento del cáncer.

30. El uso de la reivindicación 29 que además comprende la administración de un agente terapéutico adicional.

31. El uso de la reivindicación 30, en donde el agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consta de un antagonista de VEGF, un antagonista de EFGR y un agente quimioterapéutico.

32. El uso de la reivindicación 27, donde el medicamento es para el tratamiento de un trastorno inmune, trastorno cardiovascular, trombosis o diabetes.

33. Uso del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para manufactura de un medicamento para inhibir la activación de AxI constitutivo.