CN114075548B

CN114075548B - 一种靶向axl的car-t细胞及其制备方法和应用

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Publication number: CN114075548B
Application number: CN202010813351.XA
Authority: CN
Inventors: 张振峰; 曹碧辉; 刘曼婷; 杨丽丽; 陈德基; 练辉; 周玉波; 彭韧; 李俊平; 冯云飞; 王露; 陈小佩; 田宇; 吴镜强; 刘敏; 刘玲
Original assignee: Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Current assignee: Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority date: 2020-08-13
Filing date: 2020-08-13
Publication date: 2023-11-21
Anticipated expiration: 2040-08-13
Also published as: CN114075548A

Abstract

本发明公开了一种靶向AXL的CAR‑T细胞的应用，利用靶向AXL的scFv蛋白制备靶向AXL的第三代CAR‑T细胞，并应用于肿瘤治疗中，解决CAR‑T治疗实体瘤难以找到肿瘤特异性靶点的问题，从而有效避免脱靶，降低发生副作用的概率，提高实体瘤治疗效果。且基于AXL在肺癌中高表达，能够对AXL阳性表达的肺癌组织具有特异性的杀伤作用，实现对肺癌的治疗；尤其是作用于因AXL上调而导致对EGFR‑TKI耐药的肺癌细胞，协同EGFR‑TKI药物治疗肺癌能显著提高肺癌治疗效果，克服耐药性导致的治疗效果不佳。

Description

一种靶向AXL的CAR-T细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及免疫学领域，更具体地，涉及一种靶向AXL的CAR-T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

肺癌是全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。根据中国国家肿瘤登记中心(National Central Cancer Registry of China,NCCR)的统计，肺癌的发病率和死亡率均排在我国第一位。近年来，尽管肺癌的治疗方法有了长足的发展，比如外科手术、放疗、化疗以及靶向治疗等。然而，由于很多患者在发现肺癌时即有局部或者广泛转移，因此肺癌的总体疗效仍十分有限，5年生存率只有约15％。所以亟需一种新的治疗策略或药物，以提高肺癌患者的治疗效果和生存率。

CAR-T疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，是一种新型的细胞疗法。其通过基因工程技术人工改造肿瘤患者的T细胞，在体外大量培养后生成肿瘤特异性CAR-T细胞，再将其回输入患者体内用以攻击癌细胞。现有技术中的CAR-T细胞治疗在血液***肿瘤中能够产生显著的治疗效果，如，靶向CD19的CAR-T细胞免疫治疗应用至B细胞起源白血病或淋巴瘤上取得了革命性的成功，在部分最晚期病例甚至取得完全治愈的效果。但在采用CAR-T疗法治疗实体瘤时，则存在诸多问题，包括：难以找到像治疗血液肿瘤中CD19一样特异性的肿瘤靶标，容易发生脱靶效应并带来副作用；实体瘤的异质性容易导致由于抗原丢失而产生的抗药性等状况；其治疗实体瘤的效果明显不如于治疗血液肿瘤的效果显著。但若能找寻到较为合适的靶标，或许能使得CAR-T细胞治疗显著提高治疗对应实体瘤(如肺癌)的效果，从而提供新的治疗方向。

AXL最初在慢性粒细胞白血病患者被发现，同其他两种激酶Tyros和MER一样，AXL属于TAM(Tyros，AXL，MER)RTK(受体酪氨酸激酶)家族。研究表明，AXL在肺癌中高表达，其对肺癌的发生发展以及耐药方面发挥了重要作用。如，日本学者Iida等用免疫组化检测了112例肺癌组织发现AXL的阳性表达率达到了59.8％。AXL或许能作为肺癌的治疗靶标，或许可以为免疫治疗提供稳定的靶细胞表面抗原，从而结合CAR-T细胞免疫治疗提供新的肺癌治疗策略或药物以提高肺癌治疗效果、提高生存率。

发明内容

本发明旨在克服上述现有技术的至少一种不足，提供一种靶向AXL的CAR-T细胞及其制备方法和应用，利用靶向AXL的scFv蛋白制备靶向AXL的CAR-T细胞，通过将靶向AXL的CAR-T细胞应用于肺癌上，有助于有效治疗肺癌以提高患者的生存率，突破现有技术CAR-T在治疗实体瘤上效果不佳的瓶颈，为治疗肺癌提供新的策略和方向。

本发明的目的之一是提供靶向AXL的CAR-T细胞在制备治疗表达AXL的肺癌的产品的应用；利用靶向AXL的CAR-T细胞能直接特异性识别、结合表达AXL的肿瘤细胞而被激活，通过释放穿孔素、颗粒酶素B等直接杀伤肿瘤细胞，同时还通过释放细胞因子募集人体内源性免疫细胞杀伤肿瘤细胞，从而***，具有良好的靶向性、杀伤性和持久性。在本发明的一个实施例中，靶向AXL的CAR-T细胞对表达AXL的肺癌具有显著的抑癌作用，对阳性表达AXL的肺癌细胞具有显著的杀伤作用以及明显的细胞因子分泌；即说明靶向AXL的CAR-T细胞能对肺癌起到有效治疗效果，且应用靶向AXL的CAR-T细胞于制备治疗表达AXL的肺癌的产品上市，能利用患者自身的免疫***进行肿瘤的杀伤，并可形成免疫记忆T细胞以获得特异性的抗肿瘤长效机制，有助于进一步提高治疗效果和患者生存率。

进一步的，所述肺癌为对EGFR-TKI耐药肺癌。部分研究发现，在表皮生长因子受体(EGFR)突变的非小细胞肺癌(NSCLC)中，AXL的激活可以导致第一代EGFR-TKI药物(如Erlotinib)的获得性耐药，因此靶向AXL的治疗可能能预防或克服EGFR突变型肺癌患者的TKIs耐药。而本发明的实施例中，证明AXL除了在肺癌组织中高表达外，在EGFR-TKI耐药肺癌中表达更明显，且靶向AXL的CAR-T细胞能够有效的作用于EGFR-TKI耐药肺癌以起到抑癌作用；所以，基于靶向AXL的CAR-T细胞有助于联合EGFR-TKI药物提供更为显著的肺癌治疗效果，克服耐药性导致的治疗效果不佳。为EGFR-TKI耐药患者的治疗提供了新的选择和应用策略。

进一步的，CAR-T细胞携带下调AXL表达的蛋白序列和/或蛋白，产品包括EGFR-TKI药物。即CAR-T细胞能表达下调AXL表达的蛋白，或直接携带作用于AXL以下调表达的蛋白，通过下调AXL表达能够降低对EGFR-TKI耐药肺癌的耐药性，从而便于结合EGFR-TKI药物实现联合治疗，提高治疗效果。更进一步的，所述EGFR-TKI药物包括Erlotinib。

进一步的，所述肺癌为非小细胞肺癌。在本发明的实施例中，AXL-CAR T细胞对AXL阳性的NSCLC细胞在体内外均有良好的抑瘤效果，所以靶向AXL的CAR-T细胞能对非小细胞癌实现有效的治疗。

进一步的，所述靶向AXL的CAR-T细胞为第三代CAR-T细胞。与第二代CAR-T细胞相比，同时包含了CD28和CD137的第三代CAR-T细胞有更好的体内持久性和杀伤功能。其结合了CD28和CD137的优点，能使得CAR-T细胞表现出更强的细胞毒性、持久性以及记忆T细胞的分化能力。

进一步的，所述靶向AXL的CAR-T细胞scFV蛋白选自3E3E8、20G7D9或YW327.6S2中的一种或多种。本发明的实施例中，基于该三种scFv构建的CAR T细胞对AXL阳性的NSCLC细胞均有较强的杀伤能力，三种AXL-CAR T细胞的杀伤效率随着E:T的增高而增高，且在三者之中以YW327.6S2-CAR-T细胞杀伤能力最强。进一步的，scFv蛋白采用YW327.6S2，其是完全人源化的抗体，使用该抗体构建CAR T可以减轻人体潜在的人抗鼠抗体的产生，避免CAR-T细胞被人体清除。

本发明的再一目的在于提供一种治疗表达AXL的肺癌的产品，其特征在于，产品包括上述的靶向AXL的CAR-T细胞和EGFR-TKI药物。

本发明的再一目的在于提供一种制备靶向AXL的CAR-T细胞制备方法，包括步骤：

S1、构建含有CAR分子序列的慢病毒载体，所述CAR分子序列包括AXL scFv序列、铰链区-Hinge序列、跨膜区序列、共刺激结构域序列、CD3ζ序列，所述AXL scFv序列表达靶向AXL的scFv蛋白；

S2、对步骤S1获得的慢病毒载体进行慢病毒包装，获得包含慢病毒载体的慢病毒；

S3、对人的外周血单个核细胞PBMCs进行分离，从分离后的PBMCs分选出T细胞并对T细胞进行刺激；

S4、使用步骤S2中获得的慢病毒感染步骤S3刺激后的T细胞，获得靶向AXL的CAR-T细胞。

通过该方法能够快速而简单的构建出靶向AXL的CAR-T细胞，便于实际投入生产以基于靶向AXL的CAR-T细胞制备治疗肺癌的药物，从而提高肺癌治疗效果，为现有技术肺癌的治疗提供新的选择。

进一步的，所述靶向AXL的scFv序列为表达3E3E8、YW327.6S2或20G7D9蛋白的基因序列。

进一步的，所述铰链区-Hinge为CD8 hinge，跨膜区为CD28跨膜区，共刺激结构域为CD28和/或4-1BB共刺激结构域。

本发明的又一目的在于提供一种采用上述的制备靶向AXL的CAR-T细胞方法获得的CAR-T细胞，所述AXL CAR-T细胞能够特异性结合高表达AXL的癌细胞，从而激活其对癌细胞的杀伤性，从而抑制肿瘤生长，达到***的效果。且通过靶向作用于AXL，能够抑制AXL所引起的耐药性，从而进一步结合其他药物提高肿瘤治疗的效果。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：能够构建靶向作用于AXL基因的CAR-T细胞，从而解决现有技术中CAR-T治疗实体瘤难以找到肿瘤特异性的靶点问题，避免发生脱靶，也降低了发生副作用的概率，提高实体瘤的治疗效果，完善CAR-T的肿瘤治疗适用范围，为治疗癌症提供新的策略和方向。且基于AXL在肺癌中高表达，能够对AXL阳性表达的肺癌组织具有特异性的杀伤作用，从而实现对肺癌的治疗，有助于肺癌治疗技术的发展。同时，靶向AXL的CAR-T细胞还能作用于对EGFR-TKI耐药的肺癌细胞，有助于结合EGFR-TKI协同治疗肺癌从而显著提高肺癌治疗效果，克服耐药性导致的治疗效果不佳。通过本发明靶向AXL的CAR-T细胞能实现有效的肺癌治疗，提高患者的生存率，克服现有技术治疗药物、技术所存在的缺陷。

附图说明

图1显示本发明实施例AXL在人体正常组织免疫组化检测结果。

图2显示本发明实施例AXL在肺癌组织中的免疫组化检测结果。

图3显示本发明实施例WB检测EGFR-TKI药物耐药患者肺癌组织和其癌旁组织的AXL表达情况。

图4显示本发明实施例WB及流式检测AXL在肺癌细胞系A549、HCC827 ER3及HCC827中的表达情况。

图5显示本发明实施例AXL scFv亲和力的验证结果。

图6为本发明实施例CAR分子结构示意图。

图7显示本发明实施例CAR分子慢病毒载体的构建结果。

图8显示本发明实施例CAR T细胞的构建及其鉴定结果。

图9显示本发明实施例T细胞的表型分析结果(一)。

图10显示本发明实施例T细胞的表型分析结果(二)。

图11显示本发明实施例T细胞的表型分析结果(三)。

图12显示本发明实施例T细胞的表型分析结果(四)。

图13显示本发明实施例GL细胞系的构建结果。

图14显示本发明实施例AXL-CAR T，CD19-CAR T和T细胞的体外杀伤作用结果。

图15显示本发明实施例ELISA法检测体外杀伤实验细胞因子分泌结果。

图16显示本发明实施例YW327.6S2-CAR T细胞治疗A549细胞皮下瘤模型结果。

图17显示本发明实施例YW327.6S2-CAR T细胞治疗HCC827 ER3细胞皮下瘤模型结果。

图18显示本发明实施例YW327.6S2-CAR T联合Erlotinib治疗HCC827 ER3 GL细胞皮下瘤模型结果。

具体实施方式

本发明附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。为了更好说明以下实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对于本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。

实施例1

后续实施例的准备离工作(细胞培养、冻存及复苏)

一、细胞培养

(1)所有细胞均置于37℃、5％CO₂恒温培养箱进行培养。(2)HCC827、HCC827 ER3：使用10％RPMI-1640完全培养基进行培养。HCC827细胞按照1:2-1:3传代，2-3天进行换液、传代或冻存。HCC827 ER3细胞按照1:2传代，2-3天进行换液、传代或冻存。(3)A549：使用10％DMEM/F12完全培养基进行培养。按1:3-1:6进行传代，1-2天进行换液、传代或冻存。(4)293T：使用10％DMEM完全培养基进行培养。按1:3-1:6进行传代，1-2天进行换液、传代或冻存。293T细胞为半贴壁细胞，贴壁不牢固，培养过程切忌猛烈吹打或剧烈摇晃，且消化时间小于1min即可。(5)293F：用于AXL scFv蛋白纯化。按1:2-1:3进行传代，2-3天换液、传代或冻存。293F为悬浮细胞，采取半量换液法或者收集全部培养基离心后换液或传代。(6)T细胞：T细胞培养基使用德国美天旎配制好的完全培养基(自行添加IL-2)。T细胞为悬浮抱团生长，换液或传代亦采取半量换液法或者离心法换液及传代。因为T细胞扩增能力有限，一般T细胞在分选后培养时间不宜超过3周。

二、细胞冻存

(1)细胞冻存液：90％的血清+10％DMSO，应提前配制，并置于4℃冷藏保存。(2)新复苏的细胞传代3-4次后可进行冻存，一般选取状态较好的细胞保种可保证较高的复苏成功率。(3)贴壁细胞采用胰酶消化后计数，300g，离心5分钟；悬浮细胞不需消化，可直接计数后离心。为了保证复苏成功率，一般细胞冻存数量应在100万以上。(4)吸弃离心管上清，注意不要吸到细胞，加入1mL预冷的细胞冻存液重悬细胞，吸入冻存管。(5)将冻存管置于程序降温冻存盒内(冻存盒应先置于常温)。将冻存盒放于-80℃冰箱48小时后，将细胞转移到液氮中长期保存。

三、细胞复苏

(1)小心从液氮罐中取出冻存的细胞，将其迅速置于37℃水浴锅中。(2)快速摇晃(约200次)，直至完全融化，防止冰晶损伤细胞。(3)将细胞小心移至15mL离心管中，离心前应加入大于5倍体积提前预热的培养基，以减少细胞损伤，300g，离心5分钟。(4)弃上清，加入预热培养基重悬，并根据细胞多少将细胞转移到对应的培养瓶或皿中。(5)第二天由细胞状态决定是否需要换液或继续培养。

实施例2

检测肺癌及人体正常脏器或组织AXL的表达

为了验证AXL是一个理想的治疗肺癌的靶标以及规避潜在的“脱靶”现象，本实施例用免疫组化方法检测了90例肺癌(包括40例EGFR-TKI耐药患者)组织和19种人体正常器官或组织的AXL表达情况。同时，还利用Western-Blot检测了AXL在8对EGFR-TKI耐药肺癌及其对应癌旁肺组织的表达情况，从而进一步获取AXL的特异性表达关系。

具体的，本实施例中所述免疫组化操作步骤包括：(1)烤片：将组织切片置于65℃烘箱烤片1-2小时；(2)脱蜡：将烤架置入二甲苯脱蜡2次，每次10分钟；(3)水化：分别在100％，95％，75％，50％的乙醇中有序进行水化，每缸5分钟；然后在TBST中洗3次，每次5分钟；(4)抗原修复：将切片置于柠檬酸钠修复液(pH＝6.0)中进行微波抗原修复，修复后室温冷却20～30分钟；在TBST中洗3次，每次5分钟；(5)阻断内生过氧化物酶活性：室温下利用3％H2O2作用10分钟；在TBST中洗3次，每次5分钟；(6)封闭：室温下5％BSA封闭2小时；(7)孵育一抗：在室温下孵育1:500的兔抗人AXL一抗过夜。回收一抗，然后在TBST中洗3次，每次5分钟；(8)孵育二抗：在室温下孵育二抗溶液30分钟，在TBST中洗3次，每次5分钟；(9)DAB显色：利用DAB显色色原底物孵育3分钟或镜下观察至切片变黄终止显色；在TBST中洗3次，每次5分钟；(10)苏木素复染：苏木素染色2分钟，盐酸酒精分化15s，返蓝试剂(PBS)染15分钟；(11)脱水、封片，待树胶风干后置于显微镜下观察。

其中，对人体正常组织免疫组化检测的检测组织包括肝、脾、肺、肾、脑、食管、胃、结肠、直肠、阑尾、胰腺、胆囊、扁桃体、甲状腺、***、睾丸、乳腺、子宫、皮肤共19种组织，且每种组织均收集3例以上，检测结果如图1所示；且以A549为AXL阳性对照、HCC827为阴性对照(400×)，采用四级评分标准进行评分，四级评分统计结果如下表1所示：

表1人体正常组织AXL表达情况

免疫组化检测正常组织的结果显示，只有结直肠各有1例呈1+表达，其余正常组织均未见AXL表达。

本实施例中对肺癌组织的免疫组化检测共检测了90例肺癌，其中40例为EGFR-TKI药物耐药患者(400×)。采用四级评分标准评估AXL表达情况，四级对应的免疫组化检测结果如图2所示，四级评分统计结果如下表2所示，其中0级表示阴性表达，1到3级分别表示从弱到强表达。

表2肺癌组织AXL表达强度分级

免疫组化检测肺癌组织的结果显示，AXL在肺癌组织中高表达，总体表达率达到了69％。

具体的，本发明还采用Western-Blot检测了AXL在8对EGFR-TKI耐药肺癌及其对应癌旁肺组织的表达情况，其中Western-Blot检测步骤包括：(1)提取组织蛋白：人肺癌组织及肺癌旁组织冰盒运输，冰上用PBS清洗3次，洗净血液，吸干PBS，接着用组织剪将绿豆大小组织剪碎，加入RIPA裂解液冰上裂解15分钟。裂解完成后用超声粉碎仪彻底裂解组织。去掉***，离心，取上清；(2)用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，酶标仪读数后计算蛋白浓度。将蛋白样品体积按照4:1的比例加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×LoadingBuffer)，充分混匀，95℃金属浴5-10分钟使蛋白变性，制样；(3)电泳：按照碧云天SDS-PAGE凝胶配制试剂盒配方配置8％浓度胶。凝固后上样，每孔加40μg蛋白；多余孔加1×LoadingBuffer配平。加入电泳液，90V恒压电泳，直至溴酚蓝指示线跑至凝胶底部；(4)转膜：提前配好转膜液，4℃预冷备用。将阴极碳板-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-阳极碳板依次夹好。冰盒中恒流(250mA)转膜90分钟；(5)封闭：采用5％脱脂牛奶进行封闭，室温下于摇床上封闭2小时；(6)孵育一抗：按照1:1000比例，用一抗稀释液稀释AXL抗体(CST)，4℃摇床过夜；(7)孵育二抗：回收一抗后，用TBST清洗3次，每次5分钟。然后加入二抗(兔抗)。二抗采用5％脱脂牛奶或者BSA按照1:5000稀释比例配制；(8)蛋白检测(曝光)：用TBST清洗3次，每次5分钟。配置好超敏发光液后于显影仪上显影；(9)图像分析。

WB检测EGFR-TKI药物耐药患者肺癌组织和其癌旁组织的AXL表达的结果如图3A所示(其中T代表肿瘤组织，N代表癌旁组织)，从图中可以看出，EGFR-TKI耐药患者肺癌组织高表达AXL，而癌旁组织基本不表达AXL，图3B/C则为WB检测灰度分析结果图。

上述肿瘤组织高表达而正常组织基本不表达的结果表明，AXL非常有可能是肺癌患者，尤其是肺癌EGFR-TKI的耐药患者理想的治疗靶标，靶向AXL的免疫治疗可能具有良好的安全性，有助于基于靶向AXL以提供新的治疗肺癌的策略和药物。

实施例3

肺癌细胞系AXL表型检测

一、Western-Blot检测肺癌细胞系AXL表达

10cm培养皿培养A549、HCC827及HCC827 ER3细胞，无血清过夜后冰上提取总蛋白。后续步骤见上文，采用实施例1中WB检测步骤。

本实施例及下述实施例中人肺腺癌A549、HCC827细胞购买于ATCC。HCC827 ER3由本课题组实验室有保存，可参见Activation of the AXL kinase causes resistance toEGFR-targeted therapy in lung cancer，HCC827 ER3为HCC827的Erotinib耐药细胞模型。

WB检测如图4A所示，HCC827细胞系不表达AXL。与本发明人课题组既往研究相同，详见文献Activation of the AXL kinase causes resistance to EGFR-targetedtherapy in lung cancer。

二、流式细胞仪检测肺癌细胞系AXL表型

(1)培养A549、HCC827及HCC827 ER3细胞，各收集30-50万个细胞，用PBS清洗后用200μL含2％FBS的PBS重悬。(2)加入1μL PE-AXL流式单克隆抗体，冰上避光孵育30分钟。(3)PBS清洗两到三次，加入200μL含2％FBS的PBS重悬，准备流式上机。

(4)收集、分析信号。

图4B为流式分析结果，虚线所示为isotype，实线为肺癌细胞。

既往研究证明了HCC827是一个不表达AXL的肺癌细胞系，在此基础上，本发明人前期构建了HCC827的Erotinib耐药细胞模型HCC827 ER3，并揭示了AXL的表达上调是其耐药的重要机制。本实验的Western-Blot可以重复出上述HCC827不表达AXL而HCC827 ER3却高表达AXL的结果；此外，本研究还检测了肺癌细胞系A549的AXL表达情况，结果显示，A549同样高表达AXL(图4A)。流式结果表明，AXL在A549和HCC827 ER3的表达分别达到了97.7％和94.7％，而在HCC827则仅有1.86％(图4B)。这些结果再次说明AXL在多种肺癌细胞系高表达，因此AXL可以作为肺癌治疗的一个理想靶标。在后续的细胞和动物实验中，即后续实施例中，本研究选择A549及HCC827 ER3作为AXL阳性表达细胞系，而HCC827作为阴性对照。以验证AXL-CAR T细胞的靶向性和杀伤性。

实施例4

三种AXL scFv亲和力的验证

一、AXL scFv重组蛋白的提纯

1.AXL scFv表达质粒转染293F细胞(大规模培养/1L摇瓶)

三种AXL scFv的表达质粒pComb3-3E3E8，pComb3-YW327.6S2，pComb3-20G7D9构建成功后进行质粒提取，然后进行酶切及基因测序鉴定。鉴定后转染293F细胞进行AXL scFv蛋白的表达和纯化。具体步骤包括：(1)将300mL培养基(含0.5×106个293F细胞)加入1L摇瓶中；(2)在恒温摇床培养箱中(37℃，120rpm，5％CO2)培养24小时后，计数细胞，使其细胞数量控制在1×106为宜。(一般培养24h后细胞数量翻倍)；(3)吸取300μg用0.22μm滤膜过滤的质粒加到30mL的PBS中充分混匀，注意不要剧烈吹打或摇晃，以防止质粒DNA断裂；(4)将1.2mL过滤除菌后的PEI(0.5mg/mL)加入到PBS/质粒的混合液中，涡旋震荡3秒彻底混匀，室温静置20分钟；(5)20分钟后将质粒/PEI混合液加到293F细胞里；(6)共转染后，于37℃，120rpm，5％二氧化碳浓度的恒温摇床培养箱中孵育48h；(7)3000g，5分钟离心收获全部细胞沉淀，-80℃保存或直接提纯蛋白。

本实施例中293F细胞由澳门大学赵琦教授惠赠，用于AXL scFv蛋白提纯。三种AXLscFv的表达质粒(pComb3-3E3E8，pComb3-YW327.6S2，pComb3-20G7D9)由澳门大学赵琦教授课题组协助构建，三种scFv均带有His和Flag标签，以便于蛋白纯化。

2.从293F细胞中提取AXL scFv纯化蛋白

具体步骤包括：(1)冰上用预冷的细胞裂解液(40mL裂解液/1000mL培养基)裂解细胞；(2)吹打细胞，使其充***解，注意不要涡旋或者起泡沫；(3)玻璃匀浆器重悬细胞。超声粉碎仪彻底裂解细胞(3个循环)，30000g，4℃离心25分钟，弃沉淀，留上清；(4)每1000mL细胞培养基添加1.25mL含Flag标签的琼脂糖凝胶树脂，用树脂平衡缓冲液洗三次；(5)将步骤(3)得到的上清与带Flag标签的亲和树脂进行孵育，50mL离心管，4℃摇床30-120分钟；(6)4℃，3000g离心一分钟，弃上清；(7)用45mL预冷的缓冲液(含100mM乙酸钾，50mM Tris pH7.5，5％甘油，0.3％Triton×100)冲洗亲和树脂，3000g，离心一分钟，弃上清；(8)分别用高盐缓冲液(300mM乙酸钾，50mM Tris pH 7.5，5％甘油)、低盐缓冲液(50mM乙酸钾，50mMTris pH 7.5，5％甘油)及TEV酶切缓冲液(50mM乙酸钾，50mM Tris pH 7.5，0.5mM TCEP)重复步骤(7)；(9)使用非变性胶，收集10μL亲和树脂样品做卡马斯亮蓝染色；(10)使用8-10mL预冷的TEV酶切缓冲液重悬亲和树脂，然后将其转移到15mL离心管；(11)加入约40ug的TEV蛋白酶(1mg/mL)，吹匀；(12)将15mL离心管内气体换成100％的N2，防止蛋白的氧化；(13)4℃摇床过夜；(14)3000g，离心10分钟，将上清液转移至具有适当分子量截留值的超离心过滤器中浓缩至500μL；(15)使用非变性胶，取10μL浓缩蛋白的样品做考马斯亮蓝检测，使用TEV洗出液作为对照；(16)使用非变性胶，取10μL树脂样品做考马斯亮蓝检测，使用TEV阳性树脂做对照；(17)用等量凝胶过滤缓冲液(50mM乙酸钾，50mM Tris pH 7.5，0.5mM TCEP)排阻色谱柱；(18)用0.22μm滤膜过滤蛋白,将样品上样至色谱柱，收集样品，行考马斯亮蓝染色检测是否收集到目的蛋白；(19)从以上(9)、(15)、(16)、(18)步中取样做考染检测。且在凝胶过滤之前需做步骤(9)、(15)、(16)的考染检测以确保目的蛋白的表达。

二、间接法ELISA检测AXL scFv的亲和力

蛋白收集完成后，采用间接法ELISA检测AXL三种scFv结合AXL抗原的亲和力。具体步骤包括：(1)包被AXL抗原：100ng/well(需设置对照组，每组2～3个复孔)，每孔加100μL体积，4℃过夜；(2)弃包被液，TBST洗3次，5％脱脂牛奶封闭(每孔加满)，室温1h；(3)弃封闭液，TBST洗3次，分别加入不同浓度待检测的三种AXL scFv及对照抗体100μL/well，室温1h；(4)弃液体，TBST洗3次，加入对应的酶标二抗100μL/well，加盖避光，37℃温育1h；(5)弃液体，TBST洗3次，加入100μL/well TMB显色液，暗处显色5～10分钟；(6)加入终止液50μL/well，酶标仪测定450nm各孔的吸光值，绘制曲线。

scFv是属于CAR分子胞外区的结构，其亲和力对于CAR T细胞识别肿瘤抗原具有决定性作用。因此，为了筛选最优化的scFv，本实施例验证了三种AXL scFv的亲和力。这三种scFv的氨基酸或核苷酸序列均来自专利，其亲和力分别为：3E3E8(1.6×10^-9M)，YW327.6S2(1×10^-9M)，20G7D9(5.3×10^-8M)。

为了验证其亲和力强弱，本实施例构建了三种AXL scFv的表达载体：pComb3-3E3E8，pComb3-YW327.6S2，pComb3-20G7D9，酶切及测序结果显示载体构建成功，如图5A所示。然后，采用293F细胞表达并纯化了这三种scFv，并用ELISA证实了这三种scFv的亲和力从强到弱分别为YW327.6S2，3E3E8及20G7D9，如图5B所示，这和专利(所述专利见实施例5)已知的亲和力趋势吻合。因此，本研究在后续实施例的细胞杀伤实验中分别用这三种scFv构建了3E3E8-CAR-T，YW327.6S2-CAR-T，20G7D9-CAR-T细胞，并探索了不同亲和力的scFv对CAR-T细胞的杀伤效率是否有影响。具体的，图5A琼脂糖凝胶电泳结果表明pComb3-3E3E8，pComb3-YW327.6S2，pComb3-20G7D9表达载体构建成功；图5B则是用间接ELISA法检测三种scFv对AXL抗原的结合能力的检测结果。本实施例结果为三次独立实验所得，数据用均数±标准误表示。

实施例5

AXL-CAR T细胞的构建

一、三种pWPXLd-CAR-AXL-GFP慢病毒载体的构建

三种AXL scFv序列均来自于专利，专利号分别为：WO2012/175692A1(3E3E8)，US8853369B2(YW327.6S2)，US9249228B2(20G7D9)。具体步骤包括：

(1)设计CAR分子基因序列：包括AXL scFv序列，CD8 hinge，CD28跨膜区，CD28及CD137共刺激结构域，CD3ζ胞内结构域。前后分别加入酶切位点PmeI及SpeI，以便克隆载体的酶切；

(2)由南京金斯瑞公司合成出相应的CAR分子序列，并分别将其克隆到pUC57载体(三种AXL scFv的克隆质粒pUC57-3E3E8、pUC57-YW327.6S2、pUC57-20G7D9，由南京金斯瑞公司合成)获得：pUC57-3E3E8-CAR、pUC57-YW327.6S2-CAR及pUC57-20G7D9-CAR；本实施例中还合成有pUC57-CD19-CAR克隆载体作为实验对照；

(3)使用PmeI及SpeI分别双酶切pUC57-3E3E8-CAR、pUC57-YW327.6S2-CAR及pUC57-20G7D9-CAR的AXL CAR分子基因片段并切胶回收，同时用PmeI及SpeI双酶切pWPXLd-GFP骨架质粒，回收大片段骨架；(pWPXLd-GFP由李鹏教授课题组惠赠，包含GFP及质粒骨架，用于克隆CAR分子慢病毒载体，GFP可以作为后续检测慢病毒是否包装成功及转染T细胞阳性率的标记。)

(4)使用T4连接酶16℃连接1小时，将三种AXL CAR分别克隆到pWPXLd-GFP骨架质粒，分别构建成pWPXLd-3E3E8-CAR-GFP，pWPXLd-YW327.6S2-CAR-GFP及pWPXLd-20G7D9-CAR-GFP慢病毒载体；

(5)转化TOP10感受态细胞；本实施例中感受态细胞TOP10，购买于南京诺维赞公司，用于质粒提取和载体构建。

(6)挑取3-5个单克隆，摇菌过夜；

(7)用质粒小提试剂盒提取质粒，包括步骤：a)使用离心机将菌液离心(3500g，10分钟)；b)吸弃旧培养液，在培养管中加入500μL Solution I/RNase A(裂解，4℃)。重悬细胞；c)将细胞悬液移至新的2mL微离心管。加500μL Solution II(释放核酶)并轻柔来回(7-10次)混匀以彻底裂解。在室温下放置2分钟。避免剧烈的振动，因为这会导致染色体DNA的破裂并降低质粒纯度(Solution II应密封)；d)将250μL冰冻Buffer N3加入到细胞悬液，轻轻地、彻底地摇匀直到出现白色絮状沉淀。室温下(最好是4℃)离心≥12000g，10分钟。温馨提示：Buffers必须彻底摇匀。假如摇匀过程中出现粘稠、褐色及球状沉淀，需要进一步混匀中和，混匀是获得较好结果的关键；e)小心将上清移至1.5mL离心管中。取等量ETR BindingBuffer加入溶解产物。将离心管来回摇匀7-10次；f)取700μL上述混合液加入一个干净的2mL HiBindTM收集管。室温下10000g，离心1分钟。用Column过滤溶液。丢弃flow-through并重复使用收集管；g)重复步骤6直到所有的清亮裂解液通过微管；h)加500μL ETR WashBuffer I至mini column，10000g，离心1分钟，废弃flow-through，重复利用collectiontube；i)加500μL Buffer EHB进入mini column。10000g，离心1分钟。废弃flow-through，重复利用collection tube；j)加700μL DNA Wash Buffer稀释乙醇。10000g，离心1分钟。废弃flow-through，重复利用collection tube；k)加700μL DNA Wash Buffer，重复步骤10一次；l)丢弃离心管内的液体，以最大速度(≥13000g)离心empty column 3分钟，烘干columnMatrix。此步对于消除column内的乙醇至关重要；m)将column放入一个新的1.5mL微离心管中。加60-100μL(以目标终浓度而定)Endotoxin-Free Elution Buffer到column matrix，并在室温下直立放置2分钟。≥13000g离心1分钟来洗脱DNA。此时大概有70-85％的DNA残留，再洗涤一次可以洗脱几乎大部分的DNA；n)测质粒浓度和纯度；

(8)用PmeI及SpeI对提取质粒进行酶切鉴定，将正确的克隆加甘油保存到-80℃冰箱中。为了保证克隆序列的正确性，行基因测序鉴定CAR分子载体序列；

(9)接着用质粒大提试剂盒对正确的pWPXLd-3E3E8-CAR-GFP，pWPXLd-YW327.6S2-CAR-GFP、pWPXLd-20G7D9-CAR-GFP及pWPXLd-CD19-CAR-GFP慢病毒载体质粒进行大量提取，同时大量提取慢病毒包装的辅助质粒(pSPAX2及pMD2.G)。再次测序确保各基因序列的正确性。-20℃保存，用于后续慢病毒包装。

为了构建AXL-CAR-T细胞，本实施例先构建了三种包含AXL scFv(3E3E8，YW327.6S2，20G7D9)的CAR分子慢病毒载体以及CD19-CAR分子慢病毒载体(用于实验对照)；本实施例中CAR分子结构示意图如图6所示，VH和VL分别为scFv重链和轻链，TM为跨膜区，CD28、4-1BB及CD3为胞内区，eGFP为增强型绿色荧光蛋白。图7的酶切及测序结果表明CAR分子慢病毒载体构建成功。

二、CAR分子慢病毒包装

包括步骤：(1)使用293T细胞(购买于ATCC)进行慢病毒包装：第一天将293T细胞接种到10cm皿，接种密度约40-50％，确保过夜后细胞密度长到约80-90％；(2)去掉培养基，用含1％FBS的DMEM培养基饥饿处理2小时；(3)将目的质粒，pSPAX2及pMD2.G按照3:4:1的比例加入到含有Opti-MEM培养基的15mL离心管中，标记为A；吸取三倍总质粒量的PEI加入到另一15mL离心管中，标记为B；静置5分钟后，将A和B混匀，室温静置20分钟；(4)将A+B混合液加入293T细胞中，每皿加入1mL，37℃培养箱感染6-10小时；(5)感染后去除A+B混合液，加入1％FBS的DMEM新鲜培养基，继续培养；(6)可在荧光显微镜下观察感染效率；(7)48及72小时各收集一次病毒上清，用0.22μm滤膜过滤，可直接感染目的细胞。4℃可保存一周。长期保存需要置于-80℃；

三、慢病毒滴度测量

包括步骤：(1)第1天，用293T细胞铺96孔板，每孔加入5000-10000个细胞，100μL/well。细胞培养箱培养，使得第二天能长到30-50％的密度；(2)第2天，用10个EP管配置倍比稀释的慢病毒液。每管加入90μL 10％DMEM培养基，第一管加入10μL待测慢病毒原液，从第一管取10μL加入到第二管中，以此类推，直到最后一管，则第一管有10^-3mL病毒原液，最后一管有10^-12mL病毒原液；(3)依次将以上10个稀释梯度的病毒稀释液(90μL)加入96孔板中进行慢病毒感染；(4)第3天(或感染12-24小时后)，根据细胞状态决定是否换液；(5)第4天，在荧光显微镜下观察各孔中荧光细胞数量，病毒滴度为表达荧光的细胞数量除以相应稀释倍数。例如，第五个孔中观察到表达GFP的细胞数量为10个，则对应病毒滴度为10TU/(10^-7mL)＝1×10⁸/mL；(6)反复冻融会降低病毒滴度(每次冻融会降低病毒滴度10％-50％)；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，可对病毒进行分装(200μL/tube)，直接放置-80℃保存即可；(8)如果病毒储存时间超过6个月，在使用前需重新测定病毒滴度。

慢病毒载体构建成功后，本实施例用293T细胞包装了慢病毒，并检测了慢病毒的滴度。四种慢病毒滴度如下表3所示，TU：病毒滴度单位。

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表3CAR分子慢病毒滴度

四、人外周血单个核细胞(PBMCs)的分选与刺激(以美天旎阳选试剂盒为例)

包括步骤：(1)将淋巴细胞分离液和外周血按照1:1混合，注意先加分离液，再逐滴、缓慢加血，可见到血液在上层，分离液在下层，两者分界明显；(2)然后用平角离心机将其离心(升4降0，25℃，800g，25-30分钟)；(3)离心后管内分为三层，上层为血浆和PBS，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为Ficoll，在上、中层界面处有一白色云雾层狭窄带(白膜层)，小心吸取白膜层至15mL离心管；(4)用10mL PBS轻轻吹打成单细胞悬液，用30μm滤膜过滤细胞，防止血凝块堵塞分选柱，300g，10分钟；(5)弃上清，加入4-6mL红细胞裂解液重悬，裂解红细胞(5分钟)；(6)加入10mL PBS清洗红细胞裂解液，离心。如裂解不彻底，可再次加红细胞裂解液裂解；(7)弃上清，加入10mL MACS PBS重悬PBMC，取10μL细胞悬液计数。500g，5分钟离心细胞；(8)弃上清，加入美天旎MACS buffer重悬细胞(40μL buffer/10⁷细胞)，加入生物素标记的CD3磁珠抗体(20μL/10⁷细胞)。冰上或者4℃冰箱孵育15分钟。每1-2分钟涡旋振荡一次；(9)同时安装并预处理美天旎分选柱，加MACS buffer，使其在重力作用下流尽；(10)细胞孵育完成后，将其用MACS buffer重悬，500g，5分钟；(11)去除MACS buffer，再次用3-5mL MACS buffer重悬，将细胞加入分选柱内，使其在重力作用下流尽，丢弃过柱后的液体。本试剂盒为阳选试剂盒，因此T细胞会残留在管壁上；(12)MACS buffer流尽后，加入MACS buffer 5mL，将柱子里的T细胞洗脱下来；(13)重复上一步骤；(14)将分选得到的T细胞离心，并用PBS洗一次，计数；(15)每500万T细胞用25μL美天旎CD3/CD28磁珠抗体进行激活。加T细胞培养基接种于48孔板或T25培养瓶进行培养。一共刺激24-48小时；(16)取少量T细胞进行流式检测CD3/4/8表型。

本实施例中外周血来源：无菌采血室采集发明人及同实验小组成员健康捐献者的外周血，每次约10-20mL，收集于采血管或采血袋中4℃保存。且完成采血后尽快分离单个核细胞(PBMC)。

五、T细胞的慢病毒感染

包括步骤：(1)第1天，T细胞经过刺激后，离心去除磁珠抗体和旧培养基，计数；(2)根据T细胞数量及感染复数(MOI值)计算所需慢病毒量，每mL培养基添加6-8μg助转染试剂Polybrene，感染12-24小时；(3)第2天，T细胞感染后，去病毒感染液，继续加T细胞培养基培养；(4)第3-5天，可于荧光显微镜下观察感染情况以及用流式检测GFP阳性率确定转染效率；(5)用上述同样的方法构建CD19-CAR-T细胞作为实验对照。

CAR分子慢病毒包装好了以后，接着进行了T细胞的CAR分子慢病毒感染。感染后3-5天荧光显微镜下可以见到T细胞有绿色荧光的表达。为了进一步明确CAR分子的表达，本研究进行了一系列实验。

CAR分子慢病毒包装好了以后，接着进行了T细胞的CAR分子慢病毒感染。感染后3-5天荧光显微镜下可以见到T细胞有绿色荧光的表达。

六、CAR分子表达的检测

1.提取CAR-T细胞RNA

包括步骤：

(1)采用TRIZOL法提取三种AXL-CAR T细胞、CD19-CAR T细胞及新鲜T细胞的总RNA；

(2)按照Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)逆转录试剂盒的说明书将提取到的总RNA逆转成cDNA。

a)去除总RNA中的DNA，反应体系如下：

b)混匀离心后，42℃反应2分钟。

c)逆转录，体系如下：

d)反应程序：50℃15分钟→85℃2分钟。

七、qPCR检测CAR分子的表达

为了进一步定量CAR分子的表达，本实施例将步骤六中逆转所得的cDNA按照 qPCR/> Green Master Mix(High ROX Premixed)试剂盒中提供的说明书进行qPCR实验。

(1)引物合成：本实验qPCR反应所用引物均由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成，所有目的基因的相对表达量均以GAPDH为内参基因。引物序列如表4所示：

表4qPCR引物序列

(2)qPCR反应体系如下所示：

(3)qPCR反应条件如下所示：

(4)使用ABI QuantStudio 7Flex反应仪收集荧光信号，获得相应的Ct值，所有目的基因均以GAPDH为内参基因，根据2^-△△Ct法计算相关基因mRNA的相对表达量。

(5)使用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

首先提取了CAR T细胞的总RNA，逆转录后进行了qPCR实验。qPCR结果表明CAR T细胞组的CAR分子相对表达量明显高于T细胞组，且结果有统计学差异，如图8A所示。

八、Western-Blot检测CAR分子的表达

(1)无血清过夜后冰上提取三种AXL-CAR T细胞、CD19-CAR T细胞及新鲜T细胞蛋白样品。用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，酶标仪读数后计算蛋白浓度。将蛋白样品体积按照4:1的比例加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×Loading Buffer)，充分混匀，95℃金属浴5-10分钟使蛋白变性，制样。(2)电泳：按照碧云天SDS-PAGE凝胶配制试剂盒配方配置12％浓度胶。凝固后上样，每孔加40ug蛋白。多余孔加1×Loading Buffer配平。加入电泳液，90V恒压电泳，直至溴酚蓝指示线跑至凝胶底部。(3)转膜：提前配好转膜液，4℃预冷备用。将阴极碳板-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-阳极碳板依次夹好。冰盒中恒流(200mA)转膜90分钟。(4)封闭：采用5％脱脂牛奶进行封闭，室温下于摇床上封闭2小时。(5)孵育一抗：按照1:500比例，用一抗稀释液稀释CD3抗体，4℃摇床过夜。(6)孵育二抗：回收一抗后，用TBST清洗3次，每次5分钟。然后加入二抗(兔抗)。二抗采用5％脱脂牛奶按照1:4000稀释比例配制。(7)蛋白检测(曝光)：用TBST清洗3次，每次5分钟。配置好超敏发光液(1:1配制)后于显影仪上显影。(8)图像分析。

本实施例还提取了CAR-T细胞以及未感染T细胞(对照)的总蛋白，Western-Blot在T细胞及CAR-T细胞检测到固有的内源性CD3蛋白的表达，而CAR-T细胞除了内源性CD3蛋白外，还可检测到导入的外源性CD3基因的表达。说明CAR分子成功导入了T细胞，如图8B所示。

九、流式细胞术检测CAR分子的表达

(1)离心收集AXL-CAR T、CD19-CAR T及新鲜T细胞。(2)用含2％FBS的PBS清洗两次，最后用200μL含2％FBS的PBS重悬细胞，准备流式上机。(3)用流式细胞仪检测细胞的GFP阳性率，此阳性率即为CAR分子慢病毒的感染效率。

本实施例中还采用流式细胞术检测CAR分子的表达，结果如图8C所示(数据用均数±标准差表示)，CAR-T细胞在总T细胞的阳性率分别为：3E3E8-CAR-T 25.3％，YW327.6S2-CAR-T 29.1％，20G7D9-CAR-T 30.5％，CD19-CAR-T 35.8％。

以上多种结果均说明本研究成功构建了CAR T细胞。

十、CAR T细胞表型检测

CAR-T细胞在构建成功后分别对第0天和激活后14天的T细胞表型做了流式检测，以判断其激活和分化的情况。

(1)分别收集第0天分选的新鲜T细胞及激活后培养了14天的AXL-CAR T细胞。(2)分别加入CD3、CD4、CD8、CD45RO、CD62L、PD-1、CTLA-4、TIM-3等不同组合的流式单克隆抗体或非特异性同型单抗(1μL)，冰上或4℃避光孵育30分钟。(3)PBS清洗两到三次，加入200μL含2％FBS的PBS重悬，接着准备流式上机。(4)设置相应荧光通道，以非特异性同型单抗为对照组设门，检测实验组细胞荧光表达情况。

从三名健康志愿者的外周血分选得到T细胞后，本研究进行了流式鉴定CD3、CD4、CD8等T细胞表型的鉴定。结果显示三个健康捐献者的CD3阳性率分别为96.8％，98.7％及99.2％，可以用来进行CAR-T构建，如图9所示。

无论是未改造的T细胞，还是改造过的CAR T细胞，其记忆细胞表型CD45RO及CD62L表型则明显上调，提示CAR T细胞往记忆型T细胞分化，且CAR T细胞经过改造后表型和未改造的T细胞并无明显差异，如图10、11所示。更重要的是，随着T细胞体外培养时间的增加，抑制性相关的分子PD-1，CTLA-4和TIM3有所上调，提示T细胞耗竭，如图12所示。

图9：流式检测新鲜T细胞CD3/4/8表型；图10和11：分别流式检测未感染T细胞及CAR T细胞在第0天及第14天的CD45RO及CD62L表型变化；图12：分别流式检测未感染T细胞及CAR T细胞在第0天及第14天的TIM-3，CTLA4及PD1的表型变化。表明构建好的CAR T细胞能够大量活化、增殖，并可表现出迁移、细胞杀伤毒性、记忆及衰竭细胞表型。

实施例6

AXL-CAR-T细胞的体外杀伤实验

一、GFP及Luciferase双阳性(GL)细胞系的建立

(1)第一天，将A549，HCC827，HCC827 ER3铺6孔板，具体铺板密度以第二天长到约50％为宜。

(2)第二天，根据(细胞MOI值×细胞个数)/病毒滴度计算需要病毒量，加入LV5-LUC–GFP–Puro慢病毒及Polybrene(6-8ug/mL培养基)。本实施例中包含荧光素酶的慢病毒质粒(LV5-LUC-GFP-Puro)购买于上海吉玛制药技术有限公司，其包含荧光素酶Luciferase及GFP，用于构建荧光素酶的肺癌细胞系，可用Puromycin筛选阳性感染细胞。

(3)第三天，根据细胞状态决定是否换液以及继续感染，一般感染时间不超过24小时。

(4)感染结束后，用嘌呤霉素(2ug/培养基)筛选7-14天。

(5)筛选结束后可以进行流式检测GFP阳性率，如果阳性率偏低或者感染强度不均匀，可再次感染或者进行流式分选(以GFP为分选指标)。

(5)GL细胞构建成功后可以直接进行体内、外实验。

为了使用荧光素酶法进行体外杀伤实验，本实施例构建了表达GFP和Luciferase(荧光素酶)的肺癌GL细胞系，流式结果显示三种肺癌细胞的GL表达比例均在97.9％以上，如图13所示，图中GFP为检测marker。荧光素酶可以将底物荧光素钠盐氧化，其在氧化的过程中会发出生物荧光。只有活的细胞荧光素酶才能氧化荧光素，由荧光强度可以大致反应活细胞的比例，从而可以计算出细胞实验的杀伤比例。

二、荧光素酶法检测AXL-CAR T细胞的体外杀伤效率

(1)准备AXL-、CD19-CAR T细胞及对照T细胞，根据流式检测的GFP阳性率算出每批CAR T细胞的实际CAR T细胞数，以此得出需要加入的效应细胞。

(2)根据预先计划好的效靶比(E:T)比例，依次加入效应细胞(CAR T细胞或T细胞)，以及靶细胞(GL肿瘤细胞)，比如靶细胞为10000个，效靶比为8:1，4:1…，则效应细胞需要加入,80000个及40000个…以此类推，将以上细胞铺入圆底不透光的96孔板，并设置三个复孔。

(3)将共培养的细胞放入细胞培养箱培养24个小时。

(4)共培养结束后，用排枪轻轻吸取100μL上清至新的96孔板，可用于细胞因子的检测。

(5)往96孔板中加入荧光素钠盐，每孔加入100μL的Luciferin底物溶液(150ug/mL)，反应5-10分钟后在荧光照度计中检测荧光值。

(6)计算杀伤效率：以不加T细胞的靶细胞孔为对照孔，荧光值降低的比例即为杀伤百分比，杀伤百分比＝(对照孔荧光值－目的孔荧光值)/对照孔×100％(不含GL靶细胞的孔的荧光值可以忽略不计)。

为了验证AXL-CAR T细胞的靶向性，本实施例将3E3E8-,YW327.6S2-、20G7D9-CART分别和CD19-CAR T及未感染的T细胞分组检测其杀伤靶细胞的能力。本实施例继续采用不同效靶比(8:1，4:1，2:1，1:1)，以A549，HCC827 ER3及HCC827作为靶细胞进行了杀伤实验。结果显示YW327.6S2-CAR T对AXL阳性表达的A549及HCC827 ER3具有明显的杀伤效果，并且其杀伤效果随着效靶比的上升而明显上升；但是YW327.6S2-CAR T对AXL阴性表达HCC827细胞则基本没有杀伤作用。此外，靶向CD19的CAR T细胞和未感染的T细胞均对靶细胞没有杀伤作用，如图14所示。以上这些结果表明三种AXL-CAR T对AXL阳性表达的肺癌细胞均具有高度的特异性(靶向性)和较强的杀伤能力，这其中，以YW327.6S2作为scFv构建的CAR T细胞具有最强的体外杀伤能力，并且和另外两种AXL-CAR-T细胞所呈现的杀伤比例具有统计学差异。这有可能是在这三种scFv中，YW327.6S2对AXL具有最强的亲和力所致，这种杀伤差异与本研究用ELISA验证的三种scFv对AXL的亲和力趋势是吻合的。且考虑到YW327.6S2是完全人源化的抗体，其在人体应用可能具有更低的免疫源性，避免人抗鼠抗体的产生，从而减少宿主对CAR T细胞的免疫排斥。因此，在后续的实施例都是使用以YW327.6S2作为scFv构建的CAR T(YW327.6S2-CAR T)细胞作为效应细胞，以进行进一步的细胞杀伤和体内实验。

本结果为三次独立实验所得，图中数据用平均值±标准误表示，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

三、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞因子

(1)杀伤实验结束时，收集96孔板中的E:T为1:1孔的上清，可立即检测或者储存于-20℃。(2)离心上清，1000g，15分钟。(3)实验前按照说明书将Wash Buffer，SubstrateSolution以及细胞因子标准品在室温下配好。(4)从板框上去除多余的微孔板条，将其放回装有干燥剂包装的铝箔袋中，然后重新密封。(5)加入100μL稀释试剂RD1W到检测孔。(6)每孔添加100μL标准液，对照液或样品，遮盖避光。在室温下孵育2小时。标记标准品和测定的样品孔。(7)吸出每个孔内液体，并使用清洗缓冲液(400μL/well)进行3次清洗。在每个步骤中彻底清除液体对于获得良好检测结果至关重要。最后一次洗涤后，通过抽吸或倾倒除去孔内所有剩余的清洗缓冲液。将板倒置，并用干净的纸巾将其吸干。(8)向每个孔中添加200μL相应的人细胞因子偶联物。遮盖避光。在室温下孵育2小时。(9)孵育结束后按照步骤(7)清洗孔板。(10)每孔加入200μL Substrate Solution，避光条件下，室温孵育20分钟。(11)每孔加入50μL Stop Solution，加入后孔中的颜色应从蓝色变为黄色。如果孔中的颜色是绿色或颜色变化不均匀，请轻轻敲打板以确保充分混合。(12)30分钟内在450nm波长下的酶标仪读数，读取每个孔的OD值。如果可以进行波长校正，则波长设置为540nm或570nm进行校正。如果无法进行波长校正，则需将450nm的读数减去540nm或570nm的读数。此法可以修正板中的光学缺陷。未经校正直接在450nm波长的读数值可能偏高，以致精准度更低。(13)根据OD值做出标准曲线，计算样品浓度。如果样品有稀释，最终结果则要乘以稀释倍数。

T细胞在杀伤肿瘤细胞的过程中，会释放大量的细胞因子。为了进一步验证T细胞的杀伤功能，本研究检测了T细胞和靶细胞共培养时细胞因子的分泌情况。将YW327.6S2-CAR-T，CD19-CAR T和T细胞这三种效应细胞，分别和A549，HCC827 ER3及HCC827这三种靶细胞按照1:1的效靶比共培养24小时，并取上清用ELISA试剂盒检测其细胞因子的分泌。结果显示，相比于AXL阴性表达细胞系，YW327.6S2-CAR T在和AXL阳性表达细胞系A549，HCC827ER3共培养时，IL-2，TNF-α，IFN-γ，GM-CSF，Perforin以及Granzyme B这六种细胞因子的分泌量明显增加，并且其差异具有统计学意义。此外，CD19-CAR T及T细胞在和靶细胞共培养后，均未见到明显的细胞因子分泌，如图15所示。以上结果从侧面证明了YW327.6S2-CAR T对AXL阳性靶细胞的特异性识别及杀伤能力。

本结果为三次独立实验所得，图15中*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

上述实施例中，实验结果以平均值±SD或SEM表示。通过单因素ANOVA方法检测组间差异。使用Kruskal-Wallis检验非正态分布数据。使用Graph-pad Prism 7.0进行全部统计学分析。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001被认为具有统计学意义。

实施例7

YW327.6S2-CAR T细胞对非小细胞肺癌的体内杀伤实验

实验小鼠为雌性3-4周NSG小鼠，购于北京百奥赛图公司(NOD-Prkdc^scidIL2rg^tm1/Bcgen，BIOCYTOGEN)，该小鼠为三系敲除的小鼠，体内检测不到成熟的T/B/NK细胞，因此不会有内源性T/B/NK细胞对CAR T细胞的干扰。所有小鼠饲养在SPF环境中，提供高压灭菌的食物和水供其自由取食，每天光照和黑暗时间各12小时。

本实施例中所使用的实验材料包括：4％多聚甲醛固定液(南京诺唯赞生物科技有限公司)、Ki-67单克隆抗体(美国CST公司)、小动物活体光学成像***(美国PerkinElmerIVIS)、解剖器械(上海玉研科学仪器有限公司)、游标卡尺(北京航天峰光电子技术有限责任公司)，其余所需实验试剂、仪器及耗材如上述实施例所述。

一、NSCLC皮下瘤模型的构建及肿瘤生物学监测

(1)培养A549及HCC827 ER3这两种AXL阳性表达的NSCLC细胞，每只NSG小鼠(6-8周)准备2×10⁶个肿瘤细胞。

(2)将A549及HCC827 ER3这两种细胞用0.25％胰酶消化，每2×10⁶个肿瘤细胞用100μL PBS重悬，准备接种。

(3)消毒小鼠左侧腹股沟皮肤后，用1mL注射器吸取肿瘤细胞，轻轻挑起皮肤后进行接种，可见局部皮肤***一个小包块。注意不要注射到腹腔或者肌肉内，以免造成肿瘤粘连。A549及HCC827 ER3独立分组进行实验，分为：YW327.6S2-CAR T细胞组，CD19-CAR T细胞组及未感染T细胞组，每组6只小鼠。

(4)每三天测量小鼠体重变化，并观察肿瘤生长情况，用游标卡尺测量肿瘤的大小。肿瘤体积计算公式为：V＝ab²/2，V为体积，a为肿瘤长径，b为肿瘤短径。

二、NSCLC皮下瘤模型的CAR T细胞治疗

(1)用第一部分阐述的方法构建CAR T细胞后，培养7-14天，可用于体内实验。

(2)待肿瘤体积长到平均约50mm³时，将小鼠随机分成3组：YW327.6S2-CAR T细胞组，CD19-CAR T细胞组及未感染T细胞组，每组6只小鼠。分别进行尾静脉输注，每只小鼠输注1×10⁷个效应细胞(YW327.6S2-CAR T、CD19-CAR T或未感染T细胞)。

(3)接种后每三天监测小鼠体重及肿瘤体积变化情况。

(4)实验结束后安乐死小鼠，并解剖小鼠，剥离小鼠肿瘤组织拍照。

三、YW327.6S2-CAR-T联合Erlotinib治疗

部分研究表明AXL上调是导致肺癌对EGFR-TKI耐药的重要原因，且YW327.6S2单抗能够下调AXL的表达。为此，本发明还设计了YW327.6S2-CAR-T联合Erlotinib治疗的实验；

(1)培养EGFR-TKI耐药细胞HCC827 ER3，构建NSG小鼠(6-8周)皮下瘤模型。

(2)肿瘤长到约50mm³后，分组进行实验，分为：NC组，Erlotinib组，YW327.6S2-CART组，以及联合治疗组(Erlotinib+YW327.6S2-CART)。每组三只小鼠。

①NC组：不进行任何处理；

②Erlotinib组：Erlotinib灌胃，100mg/kg/天；

③YW327.6S2-CART组：尾静脉注射1×10⁷个YW327.6S2-CART细胞治疗HCC827 ER3皮下肿瘤；

④联合治疗组：尾静脉注射5×10⁶个YW327.6S2-CART细胞联合Erlotinib灌胃(100mg/kg/天)。

(3)定期监测小鼠体重及肿瘤体积变化。

(4)实验结束后安乐死小鼠，解剖小鼠剥离肿瘤，取一部分固定，石蜡包埋后切片行免疫组化检查，检测肿瘤CD3的浸润和AXL的表达情况。

实验结果以平均值±SD或SEM表示。通过单因素ANOVA或Bonferroni方法检测组间差异。使用Kruskal-Wallis检验非正态分布数据。使用Kaplan-Meier进行生存分析。使用Graph-pad Prism 7.0进行全部统计学分析。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001被认为具有统计学意义。

实验结果：

为了验证YW327.6S2-CAR T细胞是否能抑制NSCLC皮下瘤的生长，本实施例分别用A549及HCC827 ER3肿瘤细胞构建了皮下瘤，当肿瘤长到约50mm³时分组进行实验，分为YW327.6S2-CAR T、CD19-CAR T或未感染T细胞这三组，并分别尾静脉输注相应的效应细胞。从图16、17的肿瘤生长曲线及剥离肿瘤大小表明，YW327.6S2-CAR T细胞可以有效抑制A549及HCC827 ER3肿瘤在体内的生长，而CD19-CAR T或未感染T细胞则基本没有抑瘤效果；且YW327.6S2-CAR T组的肿瘤称重结果为(A549 0.10g，HCC827 ER3 0.13g)，明显低于CD19-CAR T组(A549 0.78，HCC827 ER3 0.60)及未感染T细胞组(A549 0.95，HCC827 ER3 0.68)。

图16为YW327.6S2-CAR T细胞治疗A549细胞皮下瘤模型的实验结果，A为实验流程图：第0天输注2×10⁶个A549细胞，构建小鼠皮下瘤(n＝6)，肿瘤长到约50mm³时分组进行实验，分别尾静脉输注YW327.6S2-CAR T、CD19-CAR T或未感染T细胞，在第39天结束实验；B为剥离肿瘤拍照示意图；C为CAR T输注后的肿瘤生长曲线；D为肿瘤称重结果。

图17为YW327.6S2-CAR T细胞治疗HCC827 ER3细胞皮下瘤模型，A为实验流程图：第0天输注2×10⁶个HCC827 ER3细胞，构建小鼠皮下瘤(n＝6)，肿瘤长到约50mm³时分组进行实验，第18天分别尾静脉输注YW327.6S2-CAR T、CD19-CAR T或未感染T细胞，在第45天结束实验；B为.剥离肿瘤拍照示意图；C为CAR T输注后的肿瘤生长曲线；D为肿瘤称重结果。

图18为YW327.6S2-CAR T细胞联合Erlotinib治疗实验的流程图和实验结果图，A为实验流程图；第0天输注2×10⁶个HCC827 ER3 GL细胞，构建小鼠皮下瘤(n＝3)。肿瘤长到约50mm³时分组进行实验，第15天分组进行治疗，分别在第22天及第36天进行活体成像监测；B为活体成像示意图。图18结果表明，相比于其他组，联合治疗组能够更好地消灭肿瘤。YW327.6S2-CAR-T细胞至少通过YW327.6S2抗体下调NSCLC细胞的AXL表达，并提高NSCLC细胞对Erlotinib的敏感性，从而可以减少非小细胞肺癌的对EGFR-TKI耐药，从而提高抗肿瘤疗效。且更进一步的，对于非对EGFR-TKI耐药癌细胞，YW327.6S2-CAR-T结合Erlotinib治疗可预期的具有更好的治疗效果，因为一方面抑制其产生耐药性，一方面两者实现协同治疗；C为AXL-CAR-T细胞治疗后下调了HCC827 ER3肿瘤模型AXL的表达，并恢复了HCC827 ER3对Erlotinib的敏感性，促进了治疗效果，而Erlotinib组及对照组均未出现AXL下调，肿瘤控制效果欠佳。

AXL在原发性肺癌和EGFR-TKI耐药患者组织中高表达，在人体19种正常组织中基本不表达，这些都提示了将AXL作为肺癌治疗靶点的重要性和可行性；

本研究成功构建了三种具有不同亲和力的靶向AXL的第三代(含CD28、CD137共刺激结构域)CAR T细胞，分别为：3E3E8-CAR T，YW327.6S2-CAR T，20G7D9-CAR T；

3E3E8-CAR T，YW327.6S2-CAR T，20G7D9-CAR T细胞对AXL阳性表达的NSCLC细胞系有靶向杀伤作用，而对AXL阴性表达的NSCLC细胞则基本没有杀伤能力。这其中，YW327.6S2-CAR T细胞对AXL阳性表达的NSCLC细胞表现出最强的杀伤能力；

YW327.6S2-CAR T细胞在杀伤AXL阳性表达的NSCLC细胞的同时，可以分泌大量的细胞因子IL-2，TNF-α，IFN-γ，GM-CSF，Perforin及Granzyme B。

上述实施例至少表明了：AXL在肺癌组织中高表达，阳性表达率达69％，而在人体正常组织中极少表达；AXL-CAR T细胞对AXL阳性的NSCLC细胞在体内外均有良好的抑瘤效果。且本发明利用下调AXL的YW327.6S2-CAR T细胞还能降低对EGFR-TKI耐药肺癌的耐药性，从而方便结合EGFR-TKI药物，如Erlotinib，针对非耐药肺癌以及对EGFR-TKI耐药以实现显著的治疗效果。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.靶向AXL的CAR-T细胞在制备治疗表达AXL的肺癌的产品的应用，其特征在于，CAR-T细胞携带下调AXL表达的蛋白序列和/或蛋白，即所述靶向AXL的CAR-T细胞的scFV蛋白选自3E3E8、20G7D9或YW327.6S2中的一种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肺癌为对EGFR-TKI耐药肺癌。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肺癌为非小细胞肺癌。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，产品包括EGFR-TKI药物。

5.一种靶向AXL的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤：

S1、构建含有CAR分子序列的慢病毒载体，所述CAR分子序列包括AXL scFv序列、铰链区-Hinge序列、跨膜区序列、共刺激结构域序列、CD3ζ序列，所述AXL scFv序列表达靶向AXL的scFv蛋白；所述靶向AXL的scFv序列为表达3E3E8、YW327.6S2或20G7D9蛋白的基因序列；

6. 根据权利要求5所述的一种靶向AXL的CAR-T细胞制备方法，其特征在于，所述铰链区-Hinge为CD8 hinge，跨膜区为CD28跨膜区，共刺激结构域包括CD28和/或4-1BB共刺激结构域。

7.一种根据权利要求5或6所述的靶向AXL的CAR-T细胞制备方法获得的CAR-T细胞。