CN103080136A - 抗Axl抗体及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了抗Axl抗体及其使用方法。

Description

抗Axl抗体及使用方法
相关申请
本申请依据35USC§119要求2010年6月18日提交的美国临时申请号61/356,508的优先权，通过述及完整收录其内容。
序列表
本申请含有序列表，已经以ASCII格式经EFS-Web提交且通过述及完整收入本文。
发明领域
本发明涉及抗Axl抗体及其使用方法。
发明背景
Axl是TAM（Tyro3，Axl，和Mer）受体酪氨酸激酶家族的一个成员（O’Bryan等人，1991；Lai等人，1991）。它最初鉴定为血液学恶性肿瘤中的一种转化因子（O’Bryan等人，1991；Janssen等人，1991）。Axl或其配体Gas6的失调涉及多种人癌症的发病机理。已经报告了Axl在极其多种人癌症中过表达（Berclaz等人，2001；Craven等人，1995；Shieh等人，2005；Sun等人，2004；Ito等人，1999）且与肺癌（Shieh等人，2005）、***癌（Sainaghi等人，2005）、乳腺癌（Meric等人，2002；Zhang等人，2008）、胃癌（Wu等人，2002）、和胰腺癌（Koorstra等人，2009），肾细胞癌（Chung等人，2003），以及成胶质细胞瘤（Hutterer等人，2008）中的侵入和转移有关。最近，通过磷酸酪氨酸信号传导序型分析，在约5%的NSCLC原发性肿瘤中检测到活化的Axl蛋白（Rikova等人，2007）。Axl表达受靶向和化疗药物诱导，而且药物诱导的Axl表达在急性髓样白血病中赋予对化疗的抗性（Hong等人，2008），以及在胃肠基质肿瘤（Mehadevan，et al，2007）和乳腺癌（Liu等人，2009）中分别赋予对伊马替尼(imatinib)和拉帕替尼(Lapatinib)/Herceptin的抗性。涉及Axl和抗Axl抗体的其它出版物包括WO2004/039955；WO2009/063965；2009年7月27日提交的共同拥有的美国申请No.61/228,915；WO2009/062690；WO2004/008147；5,468,634。
清楚的是仍然需要具有最适于开发成治疗剂的临床属性的药剂。本文所述发明满足了此需求并提供了其它好处。
通过述及而完整收录本文中引用的所有参考文献（包括专利申请和出版物）。
发明概述
本发明提供抗Axl抗体及其使用方法。一方面，本发明提供了与人Axl结合的分离的抗体，其中该抗体以≤600pM的亲和力结合人Axl，其中该抗体以≤1nM的亲和力结合小鼠Axl。在一些实施方案中，该抗体促进Axl受体下调。在一些实施方案中，该抗体抑制组成性Axl激活。在一些实施方案中，该抗体结合包含下述氨基酸序列、基本上由下述氨基酸序列组成或由下述氨基酸序列组成的多肽：MAWRCPRMGRVPLAWCLALCGWACMAPRGTQAEESPFVGNPGNITGARGLTGTLRCQLQVQGEPPEVHWLRDGQILELADSTQTQVPLGEDEQDDWIVVSQLRITSLQLSDTGQYQCLVFLGHQTFVSQPGYVG（SEQ ID NO:111）。
在又一些实施方案中，该抗体为单克隆抗体。在一些实施方案中，该抗体为人抗体、人源化抗体、或嵌合抗体。在一些实施方案中，该抗体为结合Axl的抗体片段。在一些实施方案中，该抗体为人抗体。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其中该抗体包含(a)HVR-H1，其包含GFX1X2X3X4X5X6X7H，其中X1为S或T；X2为L，F或V；X3为S，T，或R；X4为G或S；X5为S，H，T或I；X6为W或G；X7为I或L（SEQ ID NO:112），(b)HVR-H2，其包含X1X2IX3PX4X5X6X7X8X9X10YYADSVKG，其中X1为G或A；X2为W或G；X3为N，S，A或P；X4为Y，A或V；X5为R，G，或S；X6为G，R或S；X7为Y，S，H或Y；X8为A，T，或P（SEQ ID NO:113）和/或HVR-H2，其包含X1X2IX3PX4X5X6X7X8X9X10YYADSVKG，其中X1为G或A；X2为W或G；X3为N，S，A或P；X4为Y，A或V；X5为R，G，或S；X6为G，R或S；X7为Y，S，H或Y；X8为A，T，或P；X9为任何氨基酸或缺失；X10为任何氨基酸或缺失（SEQ ID NO:166）；(c)HVR-H3，其包含ARX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13MDY，其中X1为E或W；X2为Y或R；X3为S，N或P；X4为G，D，或L；X5为W或S；X6为G，R，A，或S；X7为G或S；X8为S或缺失；X9为S，Y或缺失；X10为V，I或缺失；X11为G或缺失；X12为Y或缺失；X13为A，E或缺失（SEQ ID NO:114）；(d)HVR-L1，其包含RASQX1X2X3X4X5X6A，其中X1为D，I或S；X2为V或I；X3为S，G或R；X4为T，I，N或R；X5为A或S；X6为V或L（SEQ ID NO:115）；(e)HVR-L2，其包含X1ASX2LX3S，其中X1为S，A，或V；X2为F，N或S；X3为Y或A（SEQID NO:116）；和(f)HVR-L3，其包含QQX1X2X3X4X5X6T，其中X1为S或A；X2为Y，K或N；X3为T，S，Y，M，R或A；X4为T，N，S，或F；X5为P或R；X6为P，Y，S或L（SEQ ID NO:117）。
另一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其中该抗体包含(a)HVR-H1，其包含GFX1X2X3GX4WIH，其中X1为T或S，X2为F或L，X3为T或S，X4为H，S或T（SEQ ID NO:118）；(b)HVR-H2，其包含GWIX1PYX2X3X4X5YYADSVKG，其中X1为S，N或A；X2为G，R或S；X3为G或R；X4为S，Y或H；X5为T，A或P（SEQ ID NO:119）；(c)HVR-H3，其包含AREYX1X2WX3X4SX5X6GYX7MDY，其中X1为S，N或P；X2为G或D；X3为G，R，或A；X4为G或S；X5为S或Y；X6为V或I；X7为A或E（SEQ IDNO:120）；和(d)HVR-L3，其包含QQSYX1X2X3X4T，其中X1为T，S或Y；X2为T，N，S或F；X3为P或R；X4为P，Y或S（SEQ ID NO:121）。
另一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含(a)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:9，(b)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:12，和(c)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8。
另一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:7，(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8，和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:9。
另一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:10；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:11；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:12。
另一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:10；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:11；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:12。
在一些实施方案中，该抗体进一步包含图3A-B，4，5或6中所示重链可变域或轻链可变域框架序列。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含(a)VH序列，其与氨基酸序列SEQ ID NO:103具有至少95%序列同一性；(b)VL序列，其与氨基酸序列SEQID NO:104具有至少95%序列同一性；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。在一些实施方案中，该抗体包含VH序列SEQ ID NO:103。在一些实施方案中，该抗体包含VL序列SEQ ID NO:104。在一些实施方案中，该抗体包含VH序列SEQ ID NO:103和VL序列SEQ ID NO:104。
在一些实施方案中，该抗体为全长IgG1抗体。
本发明还提供了分离的核酸，其编码本发明的任何抗体。
本发明还提供了宿主细胞，其包含本发明的核酸。
本发明还提供了生产抗体的方法包括培养本发明的宿主细胞使得生成该抗体。在一些实施方案中，该方法进一步包括自该宿主细胞回收该抗体。
本发明还提供了免疫偶联物，其包含本发明的任何抗Axl抗体和细胞毒剂。
本发明还提供了药物配制剂，其包含本发明的任何抗Axl抗体和药学可接受载体。在一些实施方案中，该药物配制剂进一步包含其它的治疗剂。在一些实施方案中，该其它的治疗剂选自VEGF拮抗剂、EGFR拮抗剂、和化疗剂。
本发明还提供了本文所述任何抗Axl抗体，其用作药物。在一些实施方案中，用途为治疗癌症。在一些实施方案中，用途为治疗免疫病症、心血管病症、血栓形成或糖尿病。在一些实施方案中，用途为抑制细胞增殖。在一些实施方案中，用途为促进Axl下调。在一些实施方案中，用途为抑制血管发生。
本发明还提供了本文所述任何抗Axl抗体，其用于制备药物。在一些实施方案中，该药物用于治疗癌症。在一些实施方案中，该药物用于治疗免疫病症、心血管病症、血栓形成或糖尿病。在一些实施方案中，该药物用于抑制细胞增殖、抑制血管发生、促进Axl下调、抑制转移、抑制血管发生。
本发明还提供了治疗具有癌症的个体的方法，包括对个体施用有效量的本文中公开的任何抗Axl抗体。在一些实施方案中，该方法进一步包括对个体施用其它的治疗剂。在一些实施方案中，该其它的治疗剂选自下组：VEGF拮抗剂，EGFR拮抗剂和化疗剂。
本发明还提供了治疗具有免疫病症、心血管病症、血栓形成或糖尿病的个体的方法，包括对个体施用有效量的本文中公开的任何抗Axl抗体。
本发明还提供了在个体在抑制血管发生、抑制细胞增殖、促进Axl受体下调或抑制转移的方法，包括对个体施用有效量的本文中公开的任何抗Axl抗体以抑制血管发生、抑制细胞增殖、促进Axl受体下调或抑制转移。
本发明还提供了抑制组成性Axl激活的方法，包括对个体施用有效量的本文中公开的任何抗Axl抗体以抑制组成性Axl。
一方面，本发明提供了用于治疗患有与EGFR激活突变或EGFR基因扩增有关的癌症的受试者的方法，其中该受试者已经对EGFR拮抗剂治疗形成抗性，包括确定该受试者是否具有Axl表达、Axl激活突变或Axl基因扩增，并对那些具有Axl激活突变或Axl基因扩增的受试者施用EGFR拮抗剂和本文所述任何抗Axl抗体。
一方面，本发明提供了用于治疗患有与EGFR激活突变或EGFR基因扩增有关的癌症的受试者的方法，包括:（i）监测正在用EGFR拮抗剂治疗的受试者以确定该受试者是否形成Axl表达、Axl激活突变或Axl基因扩增，并（ii）在该受试者已经形成Axl激活突变或Axl基因扩增的情况中，修改该受试者的治疗方案以在该EGFR拮抗剂之外还包括本文所述任何抗Axl抗体。
一方面，本发明提供了用于治疗患有与EGFR激活突变或EGFR基因扩增有关的癌症的受试者的方法，包括:（i）监测正在用EGFR拮抗剂治疗的受试者以确定该受试者是否形成对该抑制剂的抗性，（ii）测试该受试者以确定该受试者是否具有Axl表达、Axl激活突变或Axl基因扩增，并（iii）在该受试者具有Axl激活突变或Axl基因扩增的情况中，修改该受试者的治疗方案以在该EGFR拮抗剂之外还包括本文所述任何抗Axl抗体。
一方面，本发明提供了用于评估EGFR拮抗剂的方法，包括:（i）监测正在用EGFR拮抗剂治疗的受试者群体以鉴定那些对该治疗剂形成抗性的受试者，（ii）测试抗性受试者以确定该受试者是否具有Axl表达、Axl激活突变或Axl基因扩增，并（iii）在该受试者具有Axl表达、Axl激活突变或Axl基因扩增的情况中，修改该受试者的治疗方案以在该EGFR拮抗剂之外还包括本文所述任何抗Axl抗体。
一方面，本发明提供了用于降低癌细胞中EGFR磷酸化的方法，其中所述癌细胞已经对EGFR拮抗剂获得了抗性，且其中所述细胞包含Axl激活突变或Axl基因扩增，包括使该细胞与本文所述任何抗Axl抗体和EGFR拮抗剂接触的步骤。
一方面，本发明提供了用于降低癌细胞中PI3K介导的信号传导的方法，其中所述癌细胞已经对EGFR拮抗剂获得了抗性，且其中所述细胞包含Axl表达、Axl激活突变或Axl基因扩增，包括使该细胞与本文所述任何抗Axl抗体和EGFR拮抗剂接触的步骤。
一方面，本发明提供了用于降低癌细胞中EGFR介导的信号传导的方法，其中所述癌细胞已经对EGFR拮抗剂获得了抗性，且其中所述细胞包含Axl表达、Axl激活突变或Axl基因扩增，包括使该细胞与本文所述任何抗Axl抗体和EGFR拮抗剂接触。
一方面，本发明提供了用于恢复癌细胞对EGFR拮抗剂的敏感性的方法，其中所述癌细胞已经对EGFR拮抗剂获得了抗性，且其中所述细胞包含Axl表达、Axl激活突变或Axl基因扩增，包括使该细胞与本文所述任何抗Axl抗体和EGFR拮抗剂接触。
一方面，本发明提供了用于降低癌细胞生长或增殖的方法，其中所述癌细胞已经对EGFR拮抗剂获得了抗性，且其中所述细胞包含Axl表达、Axl激活突变或Axl基因扩增，包括使该细胞与本文所述任何抗Axl抗体和EGFR拮抗剂接触的步骤。
一方面，本发明提供了用于提高癌细胞凋亡的方法，其中所述癌细胞已经对EGFR拮抗剂获得了抗性，且其中所述细胞包含Axl表达、Axl激活突变或Axl基因扩增，包括使该细胞与本文所述任何抗Axl抗体和EGFR拮抗剂接触的步骤。
一方面，本发明提供了用于降低癌细胞对EGFR拮抗剂的抗性的方法，其中所述癌细胞已经对EGFR拮抗剂获得了抗性，且其中所述细胞包含Axl激活突变或Axl基因扩增，包括使该细胞与本文所述任何抗Axl抗体和EGFR拮抗剂接触的步骤。
一方面，本发明提供了用于治疗癌细胞中获得性EGFR拮抗剂的方法，其中所述细胞包含Axl激活突变或Axl基因扩增，包括使该细胞与本文所述任何抗Axl抗体和EGFR拮抗剂接触。
在一些实施方案中，该癌细胞为任何EGFR衍生癌症。在一些实施方案中，该癌细胞包含EGFR激活突变。在一些实施方案中，该癌细胞包含EGFR基因扩增。在一些实施方案中，该EGFR基因扩增为至少2倍。在一些实施方案中，该Axl扩增为至少2倍。在一些实施方案中，该癌细胞包含与对EGFR拮抗剂的抗性升高有关的EGFR基因突变。在一些实施方案中，该与对EGFR拮抗剂的抗性升高有关的EGFR基因突变为EGFR的T790M突变。在一些实施方案中，该EGFR拮抗剂为小分子治疗剂、核酸治疗剂、或蛋白质治疗剂。在一些实施方案中，该EGFR拮抗剂为抗体、反义分子、或小分子激酶抑制剂。在一些实施方案中，该EGFR拮抗剂为选自下组的EGFR激酶抑制剂：吉非替尼(gefitinib)，厄洛替尼，西妥昔单抗(cetuximab)，pantinumumab。在一些实施方案中，该EGFR拮抗剂为选自下组的抗EGFR抗体：西妥昔单抗，panitumumab。在一些实施方案中，该核酸治疗剂为siRNA分子。
一方面，本发明提供了用于鉴定作为EGFR拮抗剂和本文所述任何抗Axl抗体治疗候选者的受试者的方法，其中所述受试者已经用EGFR拮抗剂治疗过且患有已经对所述EGFR拮抗剂获得了抗性的癌症，包括检测来自所述受试者的癌细胞中的Axl表达、Axl激活突变或Axl基因扩增。
一方面，本发明提供了用于鉴定正在用EGFR拮抗剂治疗且有风险对所述EGFR拮抗剂获得抗性的受试者的方法，包括检测来自所述受试者的癌细胞中Axl表达、Axl激活突变或Axl基因扩增的存在，其中所述Axl表达、Axl激活突变或Axl基因扩增的存在指示获得所述抗性的风险。
一方面，本发明提供了用于治疗患有对EGFR拮抗剂治疗有抗性的癌症的受试者的方法，包括对该受试者施用EGFR拮抗剂和本文所述任何抗Axl抗体。
一方面，本发明提供了用于治疗患有与EGFR激活突变或EGFR基因扩增有关的癌症的受试者的方法，其中该受试者已经对EGFR拮抗剂治疗形成抗性，包括确定该受试者是否具有Axl表达，诸如升高的Axl水平和/或活性，并对那些具有Axl表达，诸如升高的Axl活性的受试者施用EGFR拮抗剂和本文所述任何抗Axl抗体。
一方面，本发明提供了用于治疗患有与EGFR激活突变或EGFR基因扩增有关的癌症的受试者的方法，包括:（i）监测正在用EGFR拮抗剂治疗的受试者以确定该受试者是否形成Axl表达，诸如升高的水平和/或Axl活性，并（ii）在该受试者已经形成Axl表达，诸如升高的Axl水平和/或活性的情况中，修改该受试者的治疗方案以在该EGFR拮抗剂之外还包括本文所述任何抗Axl抗体。
一方面，本发明提供了用于治疗患有与EGFR激活突变或EGFR基因扩增有关的癌症的受试者的方法，包括:（i）监测正在用EGFR拮抗剂治疗的受试者以确定该受试者是否形成对该抑制剂的抗性，（ii）测试该受试者以确定该受试者是否具有Axl表达，诸如升高的Axl水平和/或活性，并（iii）在该受试者具有升高的Axl水平和/或活性的情况中，修改该受试者的治疗方案以在该EGFR拮抗剂之外还包括本文所述任何抗Axl抗体。
另一方面，本发明提供了用于（i）恢复癌细胞对EGFR拮抗剂的敏感性，（ii）降低癌细胞对EGFR拮抗剂的抗性，和/或（iii）治疗癌细胞中获得性EGFR拮抗剂的方法，其通过使该细胞与EGFR拮抗剂和本文所述任何抗Axl抗体接触来进行。在例示性实施方案中，该癌细胞已经对EGFR拮抗剂获得了抗性且包含升高的Axl活性和/或表达水平，例如与Axl基因中的激活突变、Axl基因扩增、或Gas6介导的Axl激活有关的。本文中公开的方法可用于恢复癌细胞的敏感性、降低癌细胞的抗性、和/或治疗癌细胞的获得性抗性。
另一方面，本发明提供了用于降低癌细胞生长和/或增殖或提高癌细胞凋亡的方法，其通过使该细胞与EGFR拮抗剂和本文所述任何抗Axl抗体接触来进行。在例示性实施方案中，该癌细胞已经对EGFR拮抗剂获得了抗性且包含升高的Axl活性和/或表达，例如与Axl基因中的激活突变、Axl基因扩增、或Gas6介导的Axl激活有关的。
附图简述
图1A-F：抗FGFR3抗体的重链和轻链HVR环序列。该图显示重链HVR序列，H1，H2，和H3，和轻链HVR序列，L1，L2，和L3。氨基酸位置依照Kabat编号***来编号，如本文中描述的。
图2：描绘抗Axl抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
图3A-B和4：描绘在实施本发明中使用的例示性受体人共有框架序列，序列标示符如下：
可变重（VH）共有框架（图3A-B）
人VH亚组I共有框架减去Kabat CDR（以出现的次序分别为SEQ IDNO:131-133和125）
人VH亚组I共有框架减去延伸的高变区（以出现的次序分别为SEQ IDNO:134-135，133，125，134-136，125，134-135，137和125）
人VH亚组II共有框架减去Kabat CDR（以出现的次序分别为SEQ IDNO:138-140和125）
人VH亚组II共有框架减去延伸的高变区（以出现的次序分别为SEQ IDNO:141-142，140，125，141-143，125，141-142，144和125）
人VH亚组II共有框架减去延伸的人VH亚组III共有框架减去Kabat CDR（以出现的次序分别为SEQ ID NO:145-147和125）
人VH亚组III共有框架减去延伸的高变区（以出现的次序分别为SEQ IDNO:122-123，147，125，122-123，148，125和122-125）
人VH受体框架减去Kabat CDR（以出现的次序分别为SEQ ID NO:149，146，150和125）
人VH受体框架减去延伸的高变区（以出现的次序分别为SEQ IDNO:122-123，150，125，122-123，151和125）
人VH受体2框架减去Kabat CDR（以出现的次序分别为SEQ ID NO:149，146，152和125）
人VH受体2框架减去延伸的高变区（以出现的次序分别为SEQ IDNO:122-123，152，125，122-123，153，125，122-123，154和125）
可变轻（VL）共有框架s（图4）
人VL卡帕亚组I共有框架（以出现的次序分别为SEQ ID NO:126-129）
人VL卡帕亚组II共有框架（以出现的次序分别为SEQ ID NO:155-157和129）人VL卡帕亚组III共有框架（以出现的次序分别为SEQ ID NO:158-160和129）人VL卡帕亚组IV共有框架（以出现的次序分别为SEQ ID NO:161-163和129）
图5：描绘huMAb4D5-8轻链（以出现的次序分别为SEQ ID NO:126-127，164和129）和重链（以出现的次序分别为SEQ ID NO:122-123，154和125）的框架区序列。以上标/粗体表示的数字指出依照Kabat的氨基酸位置。
图6：描绘huMAb4D5-8轻链（以出现的次序分别为SEQ ID NO:126-129）和重链（以出现的次序分别为SEQ ID NO:122-125）的修饰的/变异的框架区序列。以上标/粗体表示的数字指出依照Kabat的氨基酸位置。
图7A-H：Axl单抗YW327.6S2的表征。A-B。使用BIAcore进行的YW327.6S2的亲和力测量。使用一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型来计算结合速率（kon）和解离速率（koff）。以比率kon/koff推导平衡解离常数（Kd）。C。YW327.6S2的交叉反应性。YW327.6S2与鼠和猕猴Axl但不与Tyro3或Mer交叉反应。将板用抗人IgG Fc包被，然后与人Axl、Mer、Tyro3Fcs、小鼠或猕猴AxlFcs一起温育。清洗后，添加同种型对照抗体或YW327.6S2，接着是HRP偶联的抗人IgG。D-E。YW327.6S2阻断Gas6结合Axl。图7D：ELISA。将板用抗人IgG Fc包被，并与人Axl-Fc一起温育。清洗后，在有或无抗体的情况中添加Gas6。通过生物素化抗Gas6抗体和链霉亲合素-HRP偶联物来检测Gas6的结合。图7E：FACS。收获HUVEC，并用YW327.6S2或对照抗体处理，然后与Gas6一起在冰上温育30分钟。通过生物素化抗Gas6抗体和链霉亲合素-PE偶联物来检测Gas6对细胞表面的结合。F。YW327.6S2下调Axl表达。将A549细胞与1μg/ml YW327.6S2一起温育所示时间，并通过FACS来测定细胞表面Axl表达（上部小图），通过Western印迹分析来测定总蛋白质表达（下部小图）。G。YW327.6S2抑制Gas6诱导的Axl磷酸化和信号传导。将H1299细胞在无血清培养基中培养过夜，与YW327.6S2一起预温育4小时，并用Gas6处理30分钟。通过ELISA来测量磷酸化的Axl（上部小图），并通过Western印迹分析来测量磷酸化的Akt（下部小图）。H。YW327.6S2抑制Baf3Axl细胞生长。使Baf3Axl细胞在含有200ng/ml Gas6的培养基中生长，并以所示浓度用YW327.6S2处理72小时。通过CellTiter Glo测定法来测量细胞存活力。
图8A-F：YW327.6S2削弱A549异种移植物肿瘤生长且增强抗VEGF的效果。A。肿瘤生长曲线。在均值肿瘤尺寸达到100mm3时（第0天）开始，每周两次，以10mg/kg（YW327.6S2和同种型对照抗体）或1mg/kg（抗VEGF）IP施用单抗。误差棒代表均值的标准误差（每项实验中的每个组n=10）。p=0.0003（YW327.6S2对对照），p=10-11（YW327.6S2对组合）。B。各个处理组的Kaplan-Meier曲线。当小鼠的肿瘤尺寸达到800mm3时，自研究移除小鼠，并对每组中剩余的动物（%剩余）绘图。C。12A11增强抗VEGF的效果。在均值肿瘤尺寸达到100mm3时（第0天）开始，每周两次，分别以30mg/kg和1mg/kg IP施用12A11和抗VEGF。误差棒代表均值的标准误差（每项实验中的每个组n=10）。p=0.006（12A11对对照）；p=0.0001（12A11对组合）。D。YW327.6S2下调Axl表达。以10mg/kg用YW327.6S2处理小鼠，并在所示时间点取出肿瘤。通过Western印迹对来自肿瘤的细胞裂解物分析Axl表达。E。YW327.6S2诱导凋亡。取出用对照或YW327.6S2处理2周的肿瘤，并实施CC3IHC以测量凋亡。F。YW327.6S2增强抗VEGF在降低肿瘤内血管密度方面的效果。在给药后0和72小时自如上文D中所述处理的小鼠取出肿瘤，并且肿瘤血管***通过MECA32免疫组织化学染色来显现并通过图像分析来定量（表述成平方微米）。对每一对实施Student’s t检验（对照对组合为p<0.05）。
图9A-B：YW327.6S2在A549异种移植物模型中增强厄洛替尼和化疗的抗肿瘤效果。A。YW327.6S2增强厄洛替尼的效果。抗体施用与图2中的相同。通过口腔管饲法以100mg/kg/d施用厄洛替尼。每组n=10。p=1.7X10-9（YW327.6S2对对照），p=2.3X10-10（YW327.6S2对组合）。B。YW327.6S2增强化疗。抗体施用与图2中的相同。分别以持续5天6.25mg/kg/d及处理开始时（第0天）单剂100mg/kg皮下施用帕利他赛和卡铂。每组n=10。p=3X10-5（YW327.6S2对对照），p=10-9（化疗对对照），p=10-5（组合对单独的化疗）。
图10A-G：YW327.6S2通过调控肿瘤基质功能来削弱MDA-MB-231异种移植物肿瘤生长。A和B。YW327.6S2而非12A11降低MDA-MB-231肿瘤生长且增强抗VEGF的效果。在均值肿瘤尺寸达到100mm3时（第0天）开始，每周两次，以20mg/kg（YW327.6S2和同种型对照抗体）、30mg/kg（12A11）和2mg/kg（抗VEGF）IP施用单抗。误差棒代表均值的标准误差（每项实验中的每个组n=10）。p=8.5X10-6（YW327.6S2对对照），p=2.8X10-8（YW327.6S2对组合），p=0.05（12A11对对照），p=0.145（抗VEGF对组合）。C和D。YW327.6S2下调Axl表达。以20mg/kg用单抗处理携带MDA-MB231异种移植物肿瘤（平均尺寸500mm3）的小鼠，并在所示时间点取出肿瘤。在Axl表达的Western印迹分析中使用来自肿瘤的细胞裂解物。E。YW327.6S2降低肿瘤相关血管***的密度。在给药后0小时和1周取出如上文C中所述处理的小鼠的肿瘤，并且肿瘤血管***通过MECA32免疫组织化学染色显现并通过图像分析来定量（表述成平方微米）。对每一对实施Student’s t检验（YW327.6S2对对照、抗VEGF对对照、和抗VEGF对组合为p<0.05）。F。Axl在原发性人乳腺癌的浸润巨噬细胞中高表达。使用免疫组织化学来检查79份原发性肿瘤。这些肿瘤中21%在浸润巨噬细胞中表达高水平的Axl。通过抗CD68染色来鉴定巨噬细胞，并通过抗Axl/CD68双重IHC来测定巨噬细胞上的Axl表达。使用连续切片。G。YW327.6S2抑制来自肿瘤相关巨噬细胞的炎性细胞因子/趋化因子分泌。以20mg/kg用对照抗体、YW327.6S2或12A11处理携带MDA-MB231异种移植物肿瘤（平均尺寸500mm3）的小鼠，并在I周处理后取出肿瘤。通过分选F4/80阳性细胞来分离肿瘤相关巨噬细胞，并培养过夜。使用Bio-Plex小鼠细胞因子测定试剂盒来测量分泌入培养基中的细胞因子和趋化因子。
图11A-B：YW327.6S2降低MDA-MB-231乳腺癌细胞对骨的转移。A。尾静脉注射肿瘤细胞后4周的生物发光成像。给小鼠腹膜内（i.p.）注射200μL含25mg/ml D-萤光素（Invitrogen）的PBS，并在成像期间使用异氟烷经鼻锥麻醉。在具有加强式电荷耦合器件照相机的Photon Imager（Biospace Lab，Paris，France）上捕捉生物发光图像。B。胫骨切片的H&E染色。在实验结束时收集组织，在4%甲醛中固定，切片并用H&E染色。上部小图中的圆圈显示侵入骨的肿瘤细胞。下部小图显示骨髓中赘生性细胞的详情。
图12：一种例示性人Axl序列，RefSeq NM_001699（SEQ ID NO:165）。
发明详述
I.定义
出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。
“亲和力”指分子（例如抗体）的单一结合位点与其结合配偶体（例如抗原）之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员（例如抗体和抗原）之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。
“血管发生病症”指血管发生的任何失调，包括非新生物的和新生物的疾患。新生物疾患包括但不限于下文所描述的那些（见例如“癌症”）。非新生物病症包括但不限于不想要的或异常的肥大、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、银屑病、银屑病斑块、结节病、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、糖尿病性和其它增殖性视网膜病包括早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生、新血管性青光眼(neovascular glaucoma)、年龄相关黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移植片排斥、视网膜/脉络膜新血管形成、眼角的新血管形成（发红）、眼新血管疾病、血管再狭窄、动静脉畸形(AVM)、脑脊膜瘤、血管瘤、血管纤维瘤、甲状腺增生（包括格雷夫斯氏(Graves)病）、角膜和其它组织移植、慢性炎症、肺炎、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺动脉高压、恶性肺积液(malignant pulmonaryeffusion)、脑水肿（例如与急性中风/闭合性头部外伤/创伤有关的）、滑膜炎症(synovial inflammation)、RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥大性骨形成、骨关节炎(OA)、顽固性腹水、多囊卵巢病、子宫内膜异位症、第三空间流体病(3rd spacing of fluid diseases)（胰腺炎、间隔综合征、烧伤、肠病）、子宫纤维瘤(uterine fibroids)、早产、慢性炎症诸如IBD（克罗恩氏(Crohn)病和溃疡性结肠炎）、肾同种异体移植物排斥、炎性肠病、肾病综合征、不想要的或异常的组织块生长（非癌性的）、血友病性关节、肥厚性瘢痕、毛发生长的抑制、奥-韦二氏(Osler-Weber)综合征、脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生、硬皮病、沙眼、血管粘连、滑膜炎、皮炎、先兆子痫、腹水、心包积液（诸如与心包炎有关的）和胸腔积液。
“抗血管发生剂”指阻断或在某种程度上干扰血管发育的化合物。抗血管发生因子可以是例如结合涉及促进血管发生的生长因子或生长因子受体的小分子或抗体。在一个实施方案中，抗血管发生剂是结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体，诸如贝伐单抗
Figure BDA00002838785000131
术语“抗Axl抗体”和“结合Axl的抗体”指能够以足够亲和力结合Axl，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向Axl的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(RIA)的测量，抗Axl抗体结合无关的、非Axl的蛋白质的程度小于该抗体对Axl的结合的约10%。在某些实施方案中，结合Axl的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM（例如10-8M或更少，例如10-8M到10-13M，例如10-9M到10-13M）的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗Axl抗体结合在来自不同物种的Axl中保守的Axl表位。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体）、和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体结合的抗原的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子（例如scFv）；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50%或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50%或更多。本文中提供了例示性的竞争测定法。
在用于本文时，术语“Axl”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类（例如人）和啮齿类（例如小鼠和大鼠）的任何天然Axl，除非另有说明。该术语涵盖“全长”，未加工的Axl以及Axl因细胞中的加工所致的任何形式。该术语还涵盖Axl的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。一种例示性人Axl的氨基酸序列显示于图12。
“Axl活化”指Axl受体的活化或磷酸化。一般而言，Axl活化导致信号转导（例如由Axl受体的细胞内激酶结构域引起的，磷酸化Axl或底物多肽中的酪氨酸残基）。Axl活化可以由Axl配体（Gas6）结合感兴趣Axl受体来介导。Gas6对Axl的结合可活化Axl的激酶结构域并由此导致Axl中酪氨酸残基的磷酸化和/或其它的底物多肽中酪氨酸残基的磷酸化。
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中典型特征为细胞生长/增殖不受调控的生理疾患。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质瘤、***、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝肉瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌(liver cancer)、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、白血病和其它淋巴增殖性病症、及各种类型的头和颈癌。
术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)
Figure BDA00002838785000151
磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)（尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)）；δ-9-四氢***酚(tetrahydrocannabinol)（屈***酚(dronabinol)，
Figure BDA00002838785000152
）；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)（包括合成类似物托泊替康(topotecan)
Figure BDA00002838785000153
CPT-11（伊立替康(irinotecan)，）、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱）；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065（包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物）；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)（特别是隐藻素1和隐藻素8）；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin（包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1）；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)（如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1（参见例如Nicolaou等人.,Angew.ChemIntl.Ed.Engl.,33:183-186(1994)）；CDP323，一种口服α-4整联蛋白抑制剂；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团）、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)（包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射剂
Figure BDA00002838785000162
脂质体多柔比星TLC D-99
Figure BDA00002838785000163
PEG化脂质体多柔比星
Figure BDA00002838785000164
和脱氧多柔比星）、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤、吉西他滨(gemcitabine)
Figure BDA00002838785000165
替加氟(tegafur)
Figure BDA00002838785000166
卡培他滨(capecitabine)
Figure BDA00002838785000167
埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure BDA00002838785000171
多糖复合物（JHS NaturalProducts,Eugene,OR）；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)（尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin)）；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)（
Figure BDA00002838785000172
Figure BDA00002838785000173
）；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)（“Ara-C”）；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)
Figure BDA00002838785000174
清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕利他塞（ABRAXANETM）和多西他塞(doxetaxel)
Figure BDA00002838785000175
苯丁酸氮芥(chlorambucil)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)
Figure BDA00002838785000176
和卡铂(carboplatin)；长***类(vincas)，其阻止微管蛋白聚合形成微管，包括长春碱(vinblastine)
Figure BDA00002838785000177
长春新碱(vincristine)
Figure BDA00002838785000178
长春地辛(vindesine)
Figure BDA00002838785000179
和长春瑞滨(vinorelbine)依托泊苷(etoposide)（VP-16）；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；亚叶酸(leucovorin)；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)，包括贝沙罗汀(bexarotene)
Figure BDA000028387850001711
二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)（例如
Figure BDA000028387850001712
或
Figure BDA000028387850001713
依替膦酸钠(etidronate)NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronicacid/zoledronate)
Figure BDA000028387850001715
阿伦膦酸盐(alendronate)
Figure BDA000028387850001716
帕米膦酸盐(pamidronate)
Figure BDA00002838785000181
替鲁膦酸盐(tiludronate)
Figure BDA00002838785000182
或利塞膦酸盐(risedronate)
Figure BDA00002838785000183
以及曲沙他滨(troxacitabine)（1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物）；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如
Figure BDA00002838785000184
疫苗和基因疗法疫苗，例如
Figure BDA00002838785000185
疫苗、
Figure BDA00002838785000186
疫苗和
Figure BDA00002838785000187
疫苗；拓扑异构酶1抑制剂（例如
Figure BDA00002838785000188
）；rmRH（例如
Figure BDA00002838785000189
）；BAY439006(sorafenib;Bayer)；SU-11248(sunitinib,
Figure BDA000028387850001810
Pfizer)；哌立福辛(perifosine)，COX-2抑制剂（如塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib)），蛋白体抑制剂（例如PS341）；bortezomib
Figure BDA000028387850001811
CCI-779；tipifarnib（R11577）；orafenib，ABT510；Bcl-2抑制剂，诸如oblimersensodium
Figure BDA000028387850001812
pixantrone；EGFR抑制剂（见下文定义）；酪氨酸激酶抑制剂（见下文定义）；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，诸如雷帕霉素(rapamycin)(sirolimus,)；法尼基转移酶抑制剂，诸如lonafarnib(SCH6636,SARASARTM)；及任何上述各项的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或更多种上述各项的组合，诸如CHOP（环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和***龙联合疗法的缩写）和FOLFOX（奥沙利铂（ELOXATINTM）联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写）。
如本文中定义的化疗剂包括起调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素效果作用的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”类。它们自身可以是激素，包括但不限于：具有混合的激动剂/拮抗剂特性的抗***类，包括他莫昔芬(tamoxifen)(NOLVADEX)、4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)
Figure BDA000028387850001814
艾多昔芬(idoxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene)
Figure BDA000028387850001815
曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)，和选择性***受体调节剂类(SERM)，诸如SERM3；没有激动剂特性的纯的抗***类，诸如氟维司群(fulvestrant)
Figure BDA000028387850001816
和EM800（此类药剂可阻断***受体(ER)二聚化、抑制DNA结合、提高ER周转、和/或遏制ER水平）；芳香酶抑制剂类，包括类固醇芳香酶抑制剂类，诸如福美坦(formestane)和依西美坦(exemestane)
Figure BDA000028387850001817
和非类固醇芳香酶抑制剂类，诸如阿那曲唑(anastrozole)
Figure BDA000028387850001818
来曲唑(letrozole)
Figure BDA000028387850001819
和氨鲁米特(aminoglutethimide)，和其它芳香酶抑制剂类，包括伏氯唑(vorozole)
Figure BDA00002838785000191
醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)
Figure BDA00002838785000192
法倔唑(fadrozole)和4(5)-咪唑；促黄体生成激素释放激素激动剂类，包括亮丙瑞林(leuprolide)
Figure BDA00002838785000193
和
Figure BDA00002838785000194
戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)和曲普瑞林(triptorelin)；性类固醇类(sex steroids)，包括妊娠素类(progestine)，诸如醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate)，***类，诸如二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)和普雷马林(premarin)，和雄激素类/类视黄酸类，诸如氟***(fluoxymesterone)、所有反式视黄酸(transretionic acid)和芬维A胺(fenretinide)；奥那司酮(onapristone)；抗孕酮类；***受体下调剂类(ERD)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合。
术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。
抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类（同种型），例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ、和μ。
如本文中所使用的，如例如应用于受体激酶活性，术语“组成性”指受体不依赖配体或其它活化性分子的存在的持续信号传导活性。根据受体的性质，所有活性可以是组成性的，或者受体的活性可以通过其它分子（例如配体）的结合而进一步活化。导致受体活化的细胞事件是本领域普通技术人员公知的。例如，活化可包括寡聚化（例如二聚化，三聚化，等）成高级受体复合物。复合物可包含单一种类的蛋白质，即同聚复合物。或者，复合物可包含至少两种不同蛋白质种类，即异聚复合物。可以通过例如受体的正常或突变体形式在细胞表面上的过表达来引起复合物形成。也可以通过受体中的一处或多处特定突变来引起复合物形成。
术语“细胞抑制剂”指在体外或在体内阻滞细胞生长的化合物或组合物。如此，细胞抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞百分比的药剂。细胞抑制剂的其它的例子包括通过诱导G0/G1停滞或M期停滞来阻断细胞周期行进的药剂。人源化抗Her2抗体曲妥单抗
Figure BDA00002838785000195
是诱导G0/G1阻滞的细胞抑制剂的一个例子。经典的M期阻断剂包括长***类(vincas)（长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine)）、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。某些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、***(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见Mendelsohn和Israel编，《The Molecular Basis of Cancer》，第1章，题为“Cellcycle regulation,oncogenes,and antieioplastic drugs”，Murakaini等，W.B.Saunders，Philadelphia，1995，例如第13页。紫杉烷类（帕利他塞(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel)）是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(
Figure BDA00002838785000201
Rhone-Poulenc Rorer)是帕利他塞(
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Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。帕利他塞和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝***的抑制。
在用于本文时，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于：放射性同位素（例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素）；化学治疗剂或药物（例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)（长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide)）、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂）；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体（例如B细胞受体）下调；和B细胞活化。
药剂（例如药物配制剂）的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号***，又称作EU索引，如记载于Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个FR域组成：FR1、FR2、FR3、和FR4。因而，HVR和FR序列在VH（或VL）中一般以如下的顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”、和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中所限定的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”、和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第五版,NIH Publication91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR（例如，CDR）对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体，例如非人抗体的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
在用于本文时，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环（“高变环”）的每个区。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR；三个在VH中（H1、H2、H3），且三个在VL中（L1、L2、L3）。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识别。例示性的高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、和96-101(H3)。(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。例示性的CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65、和H3的95-102(Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。除了VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”，或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短的-CDR，或a-CDR的CDR区内。例示性的a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58、和H3的95-102(见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基（例如，FR残基）在本文中依照Kabat等，见上文编号。
“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子，包括但不限于细胞毒剂缀合的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物（例如，牛、绵羊、猫、犬、和马）、灵长类（例如，人和非人灵长类诸如猴）、家兔、和啮齿类（例如，小鼠和大鼠）。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“抑制细胞生长或增殖”意味着将细胞的生长或增殖降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或100%，而且包括诱导细胞死亡。
“分离的”抗体指已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95%或99%的纯度，如通过例如电泳（例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳）或层析（例如，离子交换或反相HPLC）测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，见例如Flatman等,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色***置不同的染色***置处存在。
“编码抗Axl抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链（或其片段）的一种或多种核酸分子，包括单一载体或不同载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。
如本文中所使用的，如例如应用于受体信号传导活性，术语“不依赖配体的”指不依赖配体的存在的信号传导活性。具有不依赖配体的激酶活性的受体不会必然排除配体结合该受体以产生额外的激酶活性活化。
在用于本文时，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
“裸抗体”指未与异源模块（例如细胞毒性模块）或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫化物键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域（CH1、CH2、和CH3）。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
关于参照多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定用于比对序列的合适参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，%氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office,Washington D.C.,20559)，其中其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech,Inc.,South San Francisco,California可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作***，包括数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性（或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A）如下计算：
分数X/Y乘100其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的%氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的%氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中所使用的所有%氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“药物配制剂”指处于如下的形式，使得容许其中含有的活性成分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的其它的组分的制剂。
“药学可接受载体”指药物配制剂中与活性成分不同的，且对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。
在用于本文时，“治疗/处理”（及其语法变型）指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态、和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。
术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域（分别为VH和VL）一般具有类似的结构，其中每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。（见例如Kindt等KubyImmunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)）。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。见例如，Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993);Clarkson等,Nature352:624-628(1991)。
在用于本文时，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及整合入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
“VH亚组III共有框架”包含自Kabat等人的可变重亚组III中的氨基酸序列获得的共有序列。在一个实施方案中，VH亚组III共有框架氨基酸序列包含下述序列每一项的至少部分或整个：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:122)-H1-WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO:123)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO:124)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:125)。“VL亚组I共有框架”包含自Kabat等人的可变轻卡帕亚组I中的氨基酸序列获得的共有序列。在一个实施方案中，VL亚组I共有框架氨基酸序列包含下述序列每一项的至少部分或整个：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:126)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:127)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:128)-L3-FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:129)。
II.组合物和方法
一方面，本发明部分基于多种Axl结合剂（诸如抗体及其片段）的鉴定。Axl代表一种重要且有利的治疗靶，而且本发明提供了基于药剂对Axl的结合的组合物和方法。如本文中描述的，本发明的Axl结合剂提供重要的治疗剂和诊断剂，用于靶向与Axl信号传导途径的表达和/或活性有关的病理状况。在某些实施方案中，提供了与Axl结合的抗体。本发明的抗体可用于例如癌症的诊断和治疗。
A.例示性抗Axl抗体
一方面，本发明提供了与Axl结合的分离的抗体。在某些实施方案中，抗Axl抗体以≤550pM的亲和力结合人Axl，而且在一些实施方案中，以≤1nM的亲和力结合小鼠Axl。在一些实施方案中，抗Axl抗体结合人和小鼠Axl。
在一些实施方案中，抗Axl抗体诱导细胞表面（例如肿瘤细胞表面）上的Axl受体表达下调。在一些实施方案中，细胞表面Axl表达降低至Axl抗体处理缺失下Axl细胞表面表达的80%。在一些实施方案中，细胞表面表达降低至Axl抗体处理缺失下Axl细胞表面表达的少于70%、少于60%、少于50%或少于40%。在一些实施方案中，细胞（例如肿瘤细胞）中的总Axl表达降低至少于Axl抗体处理缺失下总Axl表达的80%。在一些实施方案中，总Axl表达降低至Axl抗体处理缺失下总Axl表达的少于70%、少于60%、少于50%或少于40%。在一些实施方案中，Axl表达的下调快速发生且持续至少24小时。
在一些实施方案中，抗Axl抗体抑制组成性Axl活性。
在一些实施方案中，抗Axl抗体不与Sky或Mer发生显著交叉反应。在一些实施方案中，抗Axl抗体不与Sky或Mer发生显著结合，而且结合人和小鼠Axl。
在一些实施方案中，抗Axl抗体抑制Axl活性。
在一些实施方案中，抗Axl抗体促进细胞（例如肿瘤细胞，诸如A549肿瘤细胞）的凋亡。在一些实施方案中，抗Axl抗体抑制Axl配体（例如Gas6）与Axl结合。在一些实施方案中，抗Axl抗体抑制Axl下游信号传导。在一些实施方案中，抗Axl抗体抑制Gas-6依赖性细胞增殖。在一些实施方案中，抗Axl抗体抑制来自肿瘤相关巨噬细胞的炎性细胞因子表达。在一些实施方案中，抗Axl抗体通过调控肿瘤基质功能来抑制肿瘤生长和/或转移。
在一些实施方案中，抗Axl抗体结合包含下述氨基酸序列、基本上由下述氨基酸序列组成或由下述氨基酸序列组成的多肽：MAWRCPRMGRVPLAWCLALCGWACMAPRGTQAEESPFVGNPGNITGARGLTGTLRCQLQVQGEPPEVHWLRDGQILELADSTQTQVPLGEDEQDDWIVVSQLRITSLQLSDTGQYQCLVFLGHQTFVSQPGYVG(SEQ ID NO:111)。
在一些实施方案中，抗Axl抗体结合包含下述氨基酸序列、基本上由下述氨基酸序列组成或由下述氨基酸序列组成的多肽：ITVLPQQPRNLHLVSRQPTELEVAWTPGLSGIYPLTHCTLQAVLSDDGMGIQAGEPDPPEEPLTSQASVPPHQLRLGSLHPHTPYHIRVACTSSQGPSSWTHWL(SEQ ID NO:130)。
在一些实施方案中，该抗体结合包含成熟人Axl氨基酸序列氨基酸编号1-122、基本上由成熟人Axl氨基酸序列氨基酸编号1-122组成或由成熟人Axl氨基酸序列氨基酸编号1-122组成的多肽。
在一些实施方案中，该抗体结合包含成熟人Axl氨基酸序列氨基酸编号221-234、基本上由成熟人Axl氨基酸序列氨基酸编号221-234组成或由成熟人Axl氨基酸序列氨基酸编号221-234组成的多肽。
在一些实施方案中，抗Axl抗体结合与序列MAWRCPRMGRVPLAWCLALCGWACMAPRGTQAEESPFVGNPGNITGARGLTGTLRCQLQVQGEPPEVHWLRDGQILELADSTQTQVPLGEDEQDDWIVVSQLRITSLQLSDTGQYQCLVFLGHQTFVSQPGYVG(SEQ ID NO:111)具有至少70%、80%、90%、95%、98%序列同一性或相似性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗Axl抗体结合与序列ITVLPQQPRNLHLVSRQPTELEVAWTPGLSGIYPLTHCTLQAVLSDDGMGIQAGEPDPPEEPLTSQASVPPHQLRLGSLHPHTPYHIRVACTSSQGPSSWTHWL(SEQ ID NO:130)具有至少70%、80%、90%、95%、98%序列同一性或相似性的氨基酸序列。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:1；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:2；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:4；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:7；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:9；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:10；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:11；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:12。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:13；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:14；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:15；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:16；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:17；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:18。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:19；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:20；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:21；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:22；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:23；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:24。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:25；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:26；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:27；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:28；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:29；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:30。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:31；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:32；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:33；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:34；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:35；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:36。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:37；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:38；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:39；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:40；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:41；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:42。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:43；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:44；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:45；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:46；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:47；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:48。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:49；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:50；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:51；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:52；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:53；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:54。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:55；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:56；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:57；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:58；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:59；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:60。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:61；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:62；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:63；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:64；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:65；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:66。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:67；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:68；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:69；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:70；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:71；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:72。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:73；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:74；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:76；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:77；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:78。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:79；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:80；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:81；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:82；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:83；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:84。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:85；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:86；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:87；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:88；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:89；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:90。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:91；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:92；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:93；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:94；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:95；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:96。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种、三种、四种、五种、或六种选自下述的HVR：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:97；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:98；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:99；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:100；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:101；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:102。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:2；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:7；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:9。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:13；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:14；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:15。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:19；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:20；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:21。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:25；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:26；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:27。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:31；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:32；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:33。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:37；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:38；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:39。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:43；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:44；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:45。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:49；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:50；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:51。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:55；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:56；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:61；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:62；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:63。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:67；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:68；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:69。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:73；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:74；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:79；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:80；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:81。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:85；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:86；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:87。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:91；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:92；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:93。
一方面，本发明提供了抗Axl抗体，其包含至少一种、两种或所有三种选自下述的VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:97；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:98；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:99。
在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:3。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:9。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:15。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:21。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:27。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:33。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:39。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:45。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:51。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:57。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:63。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:69。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:75。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:81。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:87。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:93。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:99。
在另一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3和HVR-L3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:3，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:6。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3和HVR-L3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQID NO:9，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:12。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3和HVR-L3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:15，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:18。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3和HVR-L3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:21，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:24。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3和HVR-L3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:27，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:30。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3和HVR-L3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:33，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQID NO:36。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3和HVR-L3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:39，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:42。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3和HVR-L3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:45，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:48。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3和HVR-L3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ IDNO:51，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:54。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3和HVR-L3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:57，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:60。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3和HVR-L3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:63，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:66。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3和HVR-L3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:69，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:72。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3和HVR-L3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:75，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQID NO:78。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3和HVR-L3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:81，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:84。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3和HVR-L3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:87，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:90。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3和HVR-L3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ IDNO:93，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:96。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3和HVR-L3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:99，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:102。
在又一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:3，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ IDNO:6，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:2。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ IDNO:9，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:12，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:8。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:15，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:18，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:14。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:21，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:24，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:20。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:27，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:30，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:26。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:33，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:36，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:32。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:39，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:42，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQID NO:38。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:45，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQID NO:48，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:44。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ IDNO:51，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:54，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:50。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:57，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:60，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:56。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:63，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:66，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:62。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:69，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:72，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:68。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:75，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:78，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:74。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:81，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:84，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQID NO:80。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:87，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQID NO:90，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:86。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ IDNO:93，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:96，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:92。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:99，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO:102，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO:98。
在又一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQID NO:1；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:2；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:7；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:9。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:13；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:14；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:15。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:19；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:20；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:21。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:25；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:26；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:27。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:31；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:32；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:33。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:37；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:38；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:39。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:43；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:44；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:45。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:49；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:50；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:51。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:55；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:56；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:61；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:62；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:63。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:67；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:68；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:69。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:73；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:74；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:79；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:80；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:81。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:85；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:86；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:87。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:91；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:92；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:93。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:97；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:98；和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:99。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:4；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:10；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:11；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:12。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:16；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:17；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:18。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:22；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:23；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:24。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:28；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:29；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:30。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:34；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:35；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:36。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:40；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:41；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:42。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:46；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:47；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:48。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:52；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:53；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:54。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:58；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:59；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:60。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:64；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:65；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:66。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:70；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:71；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:72。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:76；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:77；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:78。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:82；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:83；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:84。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:88；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:89；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:90。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:94；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:95；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:96。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:100；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:101；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:102。
在一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:4；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6。在一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:10；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:11；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:12。在一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:16；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:17；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:18。在一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQID NO:22；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:23；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:24。在一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:28；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:29；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:30。在一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:34；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:35；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:36。在一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:40；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:41；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:42。在一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:46；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:47；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:48。在一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:52；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:53；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:54。在一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:58；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:59；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:60。在一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:64；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:65；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:66。在一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQID NO:70；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:71；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:72。在一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:76；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:77；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:78。在一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:82；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:83；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:84。在一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:88；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:89；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:90。在一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:94；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:95；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:96。在一个实施方案中，该抗体包含(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:100；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:101；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:102。
另一方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQID NO:1，(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:2，和(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3；和(b)VL域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:4，(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5，和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6。
另一方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQID NO:7，(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8，和(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:9；和(b)VL域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:10，(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:11，和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:12。
另一方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQID NO:13，(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:14，和(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:15；和(b)VL域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:16，(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:17，和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:18。
另一方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQID NO:19，(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:20，和(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:21；和(b)VL域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:22，(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:23，和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:24。
另一方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQID NO:25，(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:26，和(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:27；和(b)VL域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:28，(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:29，和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:30。
另一方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQID NO:31，(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:32，和(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:33；和(b)VL域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:34，(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:35，和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:36。
另一方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQID NO:37，(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:38，和(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:39；和(b)VL域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:40，(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:41，和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:42。
另一方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQID NO:43，(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:44，和(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:45；和(b)VL域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:46，(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:47，和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:48。
另一方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQID NO:49，(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:50，和(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:51；和(b)VL域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:52，(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:53，和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:54。
另一方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQID NO:55，(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:56，和(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:57；和(b)VL域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:58，(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:60。
另一方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQID NO:61，(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:62，和(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:63；和(b)VL域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:64，(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:65，和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:66。
另一方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQID NO:67，(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:68，和(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:69；和(b)VL域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:70，(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:71，和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:72。
另一方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQID NO:73，(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:74，和(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75；和(b)VL域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:76，(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:77，和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:78。
另一方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQID NO:79，(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:80，和(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:81；和(b)VL域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:82，(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:83，和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:84。
另一方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQID NO:85，(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:86，和(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:87；和(b)VL域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:88，(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:89，和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:90。
另一方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQID NO:91，(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:92，和(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:93；和(b)VL域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:94，(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:95，和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:96。
另一方面，本发明的抗体包含(a)VH域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VH HVR序列：(i)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQID NO:97，(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:98，和(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:99；和(b)VL域，其包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL HVR序列：(i)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:100，(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:101，和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:102。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:2；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:4；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:7；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:9；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:10；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:11；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:12。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:13；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:14；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:15；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:16；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:17；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:18。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:19；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:20；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:21；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:22；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:23；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:24。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:25；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:26；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:27；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:28；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:29；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:30。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:31；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:32；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:33；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:34；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:35；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:36。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:37；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:38；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:39；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:40；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:41；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:42。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:43；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:44；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:45；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:46；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:47；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:48。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:49；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:50；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:51；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:52；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:53；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:54。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:55；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:56；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:57；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:58；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:59；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:60。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:61；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:62；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:63；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:64；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:65；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:66。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:67；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:68；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:69；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:70；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:71；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:72。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:73；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:74；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:76；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:77；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:78。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:79；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:80；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:81；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:82；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:83；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:84。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:85；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:86；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:87；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:88；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:89；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:90。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:91；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:92；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:93；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:94；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:95；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:96。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:97；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:98；(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:99；(d)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:100；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:101；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:102。
在某些实施方案中，上文提供的抗Axl抗体中下述HVR位置处的任何一个或多个氨基酸被替代或缺失：
-在HVR-H1(SEQ ID NO:7)中：位置2、3、4、5、6、7、8、9、和10；
-在HVR-H2(SEQ ID NO:8)中：位置1、2、4、6、7、8、9、和10；
-在HVR-H3(SEQ ID NO:9)中：位置3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15；
-在HVR-L1(SEQ ID NO:10)中：位置5、6、7、8、9、和10；
-在HVR-L2(SEQ ID NO:11)中：位置1、4、和6；
-在HVR-L3(SEQ ID NO:12)中：位置3、4、5、6、7、和8。
在某些实施方案中，所述替代是保守替代，如本文中提供的。在某些实施方案中，任何一项或多项下述替代可以以任意组合进行：
-在HVR-H1(SEQ ID NO:7)中：S28T；L29F或V；S30T或R；G31S；S32H、T、或I；W33G；I34L；
-在HVR-H2(SEQ ID NO:8)中：G49A；W50G；N52S、A、或P；Y53A或V；R54G或S；G55S或R；Y56S或H；A57T或P；
-在HVR-H3(SEQ ID NO:9)中：E95W；Y96R；S97N或P；G98D或L；W99S；G100R、A、或S；G100aS；S100b缺失；S100cY或缺失；V100dI或缺失；G100e或缺失；Y100f或缺失，A100gE或缺失；
-在HVR-L1(SEQ ID NO:10)中：D28I或S；V29I；S30G或R；T31I、N或R；A32S；V33L；
-在HVR-L2(SEQ ID NO:11)中：S50A或V；F53N或S；Y55A；
-在HVR-L3(SEQ ID NO:12)中：S91A；Y92K或N；T93S、Y、M、R、或A；T94N、F、或S；P95R；P96Y、S、或L。
在某些实施方案中，任何一项或多项下述替代可以以任意组合进行：
-在HVR-H1(SEQ ID NO:7)中：S28T；L29F或V；S30T；G31S；S32H、T或I；
-在HVR-H2(SEQ ID NO:8)中：N52S或A；R54G或S；G55R；Y56S或H；A57T或P；
-在HVR-H3(SEQ ID NO:9)中：S97N或P；G98D；G100S；
-在HVR-L3(SEQ ID NO:12)中：T93S、或Y；T94N、F、或S。
下述共有序列涵盖上述替代的所有可能组合：
-在HVR-H1(SEQ ID NO:112)中：GFX1X2X3X4X5X6X7H，其中X1为S或T；X2为L、F或V；X3为S、T、或R；X4为G或S；X5为S、H、T或I；X6为W或G；X7为I或L；
-在HVR-H2(SEQ ID NO:113)中：X1X2IX3PX4X5X6X7X8YYADSVKG，其中X1为G或A；X2为W或G；X3为N、S、A或P；X4为Y、A或V；X5为R、G、或S；X6为G R或S；X7为Y、S、H或Y；X8为A、T、或P；和/或(SEQ ID NO:166)中：X1X2IX3PX4X5X6X7X8X9X10YYADSVKG，其中X1为G或A；X2为W或G；X3为N、S、A或P；X4为Y、A或V；X5为R、G、或S；X6为G R或S；X7为Y、S、H或Y；X8为A、T、或P；X9为任何氨基酸或缺失；X10为任何氨基酸或缺失；
-在HVR-H3(SEQ ID NO:114)中：ARX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13MDY，其中X1为E或W；X2为Y或R；X3为S、N或P；X4为G、D、或L；X5为W或S；X6为G、R、A、或S；X7为G或S；X8为S或缺失；X9为S、Y或缺失；X10为V、I或缺失；X11为G或缺失；X12为Y或缺失；X13为A、E或缺失；
-在HVR-L1(SEQ ID NO:115)中：RASQX1X2X3X4X5X6A，其中X1为D、I或S；X2为V或I；X3为S、G或R；X4为T、I、N或R；X5为A或S；X6为V或L；
-在HVR-L2(SEQ ID NO:116)中：X1ASX2LX3S，其中X1为S、A、或V；X2为F、N或S；X3为Y或A；
-在HVR-L3(SEQ ID NO:117)中：QQX1X2X3X4X5X6T，其中X1为S或A；X2为Y、K或N；X3为T、S、Y、M、R或A；X4为T、N、S、或F；X5为P或R；X6为P、Y、S或L。
在一些实施方案中，提供下述共有序列：
-在HVR-H1(SEQ ID NO:118)中：GFX1X2X3GX4WIH，其中X1为T或S，X2为F或L，X3为T或S，X4为H、S或T；
-在HVR-H2(SEQ ID NO:119)中：GWIX1PYX2X3X4X5YYADSVKG，其中X1为S、N或A；X2为G、R或S；X3为G或R；X4为S、Y或H；X5为T、A或P；
-在HVR-H3(SEQ ID NO:120)中：AREYX1X2WX3X4SX5X6GYX7MDY，其中X1为S、N或P；X2为G或D；X3为G、R、或A；X4为G或S；X5为S或Y；X6为V或I；X7为A或E；
-中HVR-L3(SEQ ID NO:121)中：QQSYX1X2X3X4T，其中X1为T、S或Y；X2为T、N、S或F；X3为P或R；X4为P、Y或S。
另一方面，抗Axl抗体包含重链可变域(VH)序列，其与氨基酸序列SEQID NO:103、105、107或109具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的VH序列相对于参照序列含有替代（例如保守替代）、***或删除，但是包含该序列的抗Axl抗体保留与Axl结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ IDNO:103、105、107或109中替代、***和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代、***、或删除发生在HVR以外的区域（即FR）。任选地，抗Axl抗体包含SEQ ID NO:103、105、107或109中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特其它的实施方案中，VH包含一种、两种或三种选自下述的HVR：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1、7、13、19、25、31、37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、或97，(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:2、8、14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74、80、86、92、或98，和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3、9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、87、93或99。在一个特其它的实施方案中，VH包含一种、两种或三种选自下述的HVR：(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:7，(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8，和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:9。
另一方面，提供了抗Axl抗体，其中该抗体包含轻链可变域(VL)，其与氨基酸序列SEQ ID NO:104、106、108或110具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的VL序列相对于参照序列含有替代（例如保守替代）、***或删除，但是包含该序列的抗Axl抗体保留与Axl结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:104、106、108或110中替代、***和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代、***、或删除发生在HVR以外的区域（即FR）。任选地，抗Axl抗体包含SEQ ID NO:104、106、108或110中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特其它的实施方案中，VL包含一种、两种或三种选自下述的HVR：(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:4、10、16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76、82、88、94、或100；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5、11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、77、83、89、95、或101；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96或102。在一个特其它的实施方案中，VL包含一种、两种或三种选自下述的HVR：(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:10；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:11；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:12。
另一方面，提供了抗Axl抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH。在一些实施方案中，该抗体进一步包含VL。在一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:103中的VH序列。在一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:105中的VH序列。在一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:107中的VH序列。在一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:109中的VH序列。
另一方面，提供了抗Axl抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VL。在一些实施方案中，该抗体进一步包含VH。在一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:104中的VL序列。在一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:106中的VL序列。在一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:108中的VL序列。在一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:110中的VL序列。
另一方面，提供了抗Axl抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:104中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:106中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
本发明的抗体可包含任何合适的框架可变域序列，前提条件是基本上保留了对Axl的结合活性。例如，在一些实施方案中，本发明的抗体包含人亚组III重链框架共有序列。在这些抗体的一个实施方案中，框架共有序列包含在第71、73和/或78位的替代。在这些抗体的一些实施方案中，第71位是A、第73位是T和/或第78位是A。在一个实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8(
Figure BDA00002838785000521
Genentech,Inc.,South San Francisco,CA,USA)(也参见美国专利No.6,407,213和5,821,337，和Lee等,J.Mol.Biol.(2004),340(5):1073-1093)的重链可变域框架序列。在一个实施方案中，这些抗体进一步包含人κI轻链框架共有序列。在一个特其它的实施方案中，这些抗体包含如美国专利No.6,407,213和5,821,337中所描述的huMAb4D5-8的轻链HVR序列。在一个实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8(Genentech,Inc.,South San Francisco,CA,USA)的轻链可变域序列(也参见美国专利No.6,407,213和5,821,337，和Lee等,J.Mol.Biol.(2004),340(5):1073-1093)。在一个实施方案中，抗Axl抗体包含任何上述实施方案中的HVR，且进一步包含VH和/或VL，其包含图2、3A-B、4、5或6中所示FR1、FR2、FR3或FR4序列。
又一方面，本发明提供了一种抗体，其与本文中提供的抗Axl抗体结合相同表位。例如，在某些实施方案中，提供了一种抗体，其与包含VH序列SEQ ID NO:103和VL序列SEQ ID NO:104的抗Axl抗体结合相同表位。在某些实施方案中，提供了一种抗体，其与包含VH序列SEQ ID NO:107和VL序列SEQ ID NO108的抗Axl抗体结合相同表位。在某些实施方案中，提供了一种抗体，其结合由氨基酸MAWRCPRMGRVPLAWCLALCGWACMAPRGTQAEESPFVGNPGNITGARGLTGTLRCQLQVQGEPPEVHWLRDGQILELADSTQTQVPLGEDEQDDWIVVSQLRITSLQLSDTGQYQCLVFLGHQTFVSQPGYVG(SEQ ID NO:111)组成的Axl片段内的表位。在某些实施方案中，提供了一种抗体，其结合由氨基酸ITVLPQQPRNLHLVSRQPTELEVAWTPGLSGIYPLTHCTLQAVLSDDGMGIQAGEPDPPEEPLTSQASVPPHQLRLGSLHPHTPYHIRVACTSSQGPSSWTHWL(SEQ ID NO:130)组成的Axl片段内的表位。
又一方面，本发明提供了一种抗体，其与包含VH序列SEQ ID NO:103和VL序列SEQ ID NO:104的抗Axl抗体竞争对人Axl的结合。在某些实施方案中，提供了一种抗体，其与包含VH序列SEQ ID NO:107和VL序列SEQ IDNO:108的抗Axl抗体竞争对人Axl的结合。
在本发明的又一个方面，依照任何上述实施方案的抗Axl抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗Axl抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体、或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整IgG抗体或其它抗体类或同种型，如本文中定义的。
在又一个方面，依照任何上述实施方案的抗Axl抗体可单一地或组合地掺入下文1-7节中描述的任何特征：
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM（例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M）的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，Kd是通过如下述测定法所述用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原实施的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的。通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力（见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)）。为了建立测定法的条件，将
Figure BDA00002838785000531
多孔板(Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，随后用PBS中的2%(w/v)牛血清清蛋白于室温（约23°C）封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM125I-抗原与连续稀释的感兴趣Fab（例如与Presta等,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致）混合。然后将感兴趣的Fab温育过夜；然而，温育可持续更长时间（例如约65小时）以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板，于室温温育（例如1小时）。然后除去溶液，并用PBS中的0.1%聚山梨酯20
Figure BDA00002838785000532
洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20TM;Packard)，然后在TOPCOUNTTM伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20%的浓度用于竞争性结合测定法。
依照另一个实施方案，Kd是使用表面等离振子共振测定法使用
Figure BDA00002838785000533
-2000或
Figure BDA00002838785000534
-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)于25°C使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简言之，依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH4.8稀释至5μg/ml（约0.2μM），然后以5μl/分钟的流速注射以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，于25°C以约25μl/分钟的流速注入在含0.05%聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab（0.78nM至500nM）。使用简单一对一朗格缪尔结合模型(
Figure BDA00002838785000541
Evaluation Software version3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。以比率koff/kon计算平衡解离常数(Kd)。见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1S-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(AvivInstruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBS pH7.2中20nM抗抗原抗体（Fab形式）于25℃的荧光发射强度（激发=295nm；发射=340nm，16nm带通）的升高或降低。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、和scFv片段，及下文所描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，见Hudson等Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，见例如Pluckthün,于The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994);还可见WO93/16185;及美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基，并且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，见美国专利No.5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。见例如EP404,097;WO1993/01161;Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003);及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)。
单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体（Domantis,Inc.,Waltham,MA；见例如美国专利No.6,248,516B1）。
可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞（例如大肠杆菌或噬菌体）的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。
3.嵌合的和人源化的抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567;及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区（例如，自小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区）和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR（或其部分）自非人抗体衍生，而FR（或其部分）自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体（例如衍生HVR残基的抗体）的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmann等,Nature332:323-329(1988);Queen等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989);美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409;Kashmiri等,Methods36:25-34(2005)（描述了SDR(a-CDR)嫁接）；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)（描述了“重修表面”）；Dall’Acqua等,Methods36:43-60(2005)（描述了“FR改组”）；及Osbourn等,Methods36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer，83:252-260(2000)（描述了FR改组的“引导选择”方法）。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区（见例如Sims等J.Immunol.151:2296(1993)）；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区（见例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);及Presta等J.Immunol.,151:2623(1993)）；人成熟的（体细胞突变的）框架区或人种系框架区（见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)）；和通过筛选FR文库衍生的框架区（见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996)）。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了
Figure BDA00002838785000561
技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M
Figure BDA00002838785000562
技术，和美国专利申请公开文本No.US2007/0061900，其描述了技术）。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系（见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991)）。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些例如记载于美国专利No.7,189,826（其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体）和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)（其描述了人-人杂交瘤）的。人杂交瘤技术（Trioma技术）也记载于Vollmers和Brandlein,Histology&Histopathology,20(3):927-937(2005)及Vollmers和Brandlein,Methods&Findings in Exp.&Clin.Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等于Methods in Molecular Biology178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,2001)，并且进一步记载于例如McCafferty等,Nature348:552-554;Clackson等,Nature352:624-628(1991);Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Marks和Bradbury,于Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003);Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004);及Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)的。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以（例如自人）克隆天然全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373、和美国专利公开文本No.2005/0079574,2005/0119455,2005/0266000,2007/0117126,2007/0160598,2007/0237764,2007/0292936和2009/0002360。
认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对Axl，而另一种针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合Axl的两个不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达Axl的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达（见Milstein和Cuello,Nature305:537(1983))、WO93/08829、和Traunecker等,EMBO J.10:3655(1991)）、和“突起-入-空穴”工程化（见例如美国专利No.5,731,168）。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段（见例如美国专利No.4,676,980,及Brennan等,Science,229:81(1985)）；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体（见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)）；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术（见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)）；及使用单链Fv(sFv)二聚体（见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994)）；及如例如Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中所描述的，制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”（见例如US2006/0025576A1）。
本文中的抗体或片段还包括包含结合Axl及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”（见例如US2008/0069820）。
7.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除、和/或***和/或替代。可以进行删除、***、和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如，抗原结合。
a)替代、***、和删除变体
在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表1中在“保守替代”的标题下显示。更实质的变化在表1中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。
表1
初始残基 例示性替代 优选的替代
Ala(A) Val;Leu;Ile Val
Arg(R) Lys;Gln;Asn Lys
Asn(N) Gln;His;Asp,Lys;Arg Gln
Asp(D) Glu;Asn Glu
Cys(C) Ser;Ala Ser
Gln(Q) Asn;Glu Asn
Glu(E) Asp;Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn;Gln;Lys;Arg Arg
Ile(I) Leu;Val;Met;Ala;Phe;正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸;Ile;Val;Met;Ala;Phe Ile
Lys(K) Arg;Gln;Asn Arg
Met(M) Leu;Phe;Ile Leu
Phe(F) Trp;Leu;Val;Ile;Ala;Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val;Ser Ser
Trp(W) Tyr;Phe Tyr
Tyr(Y) Trp;Phe;Thr;Ser Phe
Val(V) Ile;Leu;Met;Phe;Ala;正亮氨酸 Leu
依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；
(3)酸性的：Asp,Glu；
(4)碱性的：His,Lys,Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly,Pro；
(6)芳香族的：Trp,Tyr,Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类其它的。
一类替代变体牵涉替代亲本抗体（例如人源化或人抗体）的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变（例如改善）（例如升高的亲和力、降低的免疫原性）和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性（例如结合亲和力）。
可以对HVR做出变化（例如，替代），例如以改善抗体亲和力。可以对HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基（见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008)），和/或SDR(a-CDR)做出此类变化，其中对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom等于Methods in Molecular Biology178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法（例如，易错PCR、链改组、或寡核苷酸指导的诱变）将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的方法，其中将几个HVR残基（例如，一次4-6个残基）随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代、***、或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对HVR做出保守变化（例如，保守替代，如本文中提供的），其不实质性降低结合亲和力。此类变化可以在HVR“热点”或SDR外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的，或者含有不超过1、2或3处氨基酸替代。
一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述的。在此方法中，将残基或靶残基的组（例如，带电荷的残基诸如arg、asp、his、lys、和glu）鉴定，并用中性或带负电荷的氨基酸（例如，丙氨酸或多丙氨酸）替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列***包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它***变体包括抗体的N或C端与酶（例如对于ADEPT）或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。
在抗体包含Fc区的情况中，可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的、双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。见例如Wright等TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供了抗体变体，其具有缺乏附着（直接或间接）于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构（例如，复合的、杂合的和高甘露糖的结构）的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位（Fc区残基的Eu编号方式）的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。见例如美国专利公开文本No.US2003/0157108(Presta,L.);US2004/0093621(KyowaHakko Kogyo Co.,Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：US2003/0157108;WO2000/61739;WO2001/29246;US2003/0115614;US2002/0164328;US2004/0093621;US2004/0132140;US2004/0110704;US2004/0110282;US2004/0109865;WO2003/085119;WO2003/084570;WO2005/035586;WO2005/035778;WO2005/053742;WO2002/031140;Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004);Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986);美国专利申请No US2003/0157108A1,Presta,L；及WO2004/056312A1,Adams等，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞（见例如Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004);Kanda,Y等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006);及WO2003/085107）。
进一步提供了具有两分型寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO2003/011878（Jean-Mairet等）；美国专利No.6,602,684（Umana等）；及US2005/0123546（Umana等）。还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO1997/30087（Patel等）；WO1998/58964(Raju,S.)；及WO1999/22764(Raju,S.)。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰（例如替代）的人Fc区序列（例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区）。
在某些实施方案中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能（诸如补体和ADCC）是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合（因此有可能缺乏ADCC活性），但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利No.5,500,362（见例如Hellstrom,I.等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA83:7059-7063(1986)）和Hellstrom,I等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA82:1499-1502(1985);5,821,337（见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987)）。或者，可以采用非放射性测定方法（见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.MountainView,CA；和CytoTox
Figure BDA00002838785000631
非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI)）。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA95:652-656(1998)的。也可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。见例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定法（见例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods202:163(1996);Cragg,M.S.等,Blood101:1045-1052(2003);及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004)）。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定（见例如Petkova,S.B.等,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006)）。
具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238,265,269,270,297,327和329中的一个或多个的替代的（美国专利No.6,737,056）。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体（美国专利No.7,332,581）。
描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体（见例如美国专利No.6,737,056;WO2004/056312，及Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)）。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区的位置298、333、和/或334（残基的EU编号方式）的替代的Fc区。
在一些实施方案中，对Fc区做出改变，其导致改变的（即，改善的或降低的）C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于美国专利No.6,194,551、WO99/51642、及Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)的。
具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)，新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)及Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238,256,265,272,286,303,305,307,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380,382,413,424或434中的一处或多处具有替代，例如，Fc区残基434的替代的（美国专利No.7,371,826）。
还可见Duncan和Winter,Nature322:738-40(1988);美国专利No.5,648,260;美国专利No.5,624,821;及WO94/29351，其关注Fc区变体的其它例子。
d)经半胱氨酸工程化改造的抗体变体
在某些实施方案中，可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如，“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方案中，替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块缀合，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个：轻链的V205（Kabat编号方式）；重链的A118（EU编号方式）；和重链Fc区的S400（EU编号方式）。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三
Figure BDA00002838785000651
烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸（均聚物或随机共聚物）、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇（例如甘油）、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，并且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。
B.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物来生成抗体，例如，如记载于美国专利No.4,816,567的。在一个实施方案中，提供了编码本文中所描述的抗Axl抗体的分离的核酸。此类核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列（例如，抗体的轻和/或重链）。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的一种或多种载体（例如，表达载体）。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含（例如，已经用下列载体转化）：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞（例如，Y0、NS0、Sp20细胞）。在一个实施方案中，提供了生成抗Axl抗体的方法，其中该方法包括在适合于表达抗体的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，如上文提供的，并且任选地，自宿主细胞（或宿主细胞培养液）回收抗体。
对于抗Axl抗体的重组生成，将编码抗体的核酸（例如如上文所描述的）分离，并***一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程将此类核酸容易地分离并测序（例如，通过使用寡核苷酸探针来进行，所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码抗体的重和轻链的基因）。
适合于克隆或表达抗体编码载体的宿主细胞包括本文中所描述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生成抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见例如美国专利No.5,648,237,5,789,199和5,840,523（还可见Charlton,Methods in MolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254页，其描述了抗体片段在大肠杆菌(E.coli.)中的表达）。表达后，可以将抗体在可溶性级分中自细菌细胞团糊分离，并可以进一步纯化。
在原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是适合于抗体编码载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株。见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),及Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也自多细胞生物体（无脊椎动物和脊椎动物）衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞一起使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主。见例如美国专利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429（其描述了用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术）。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适合于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系（293或293细胞，如记载于例如Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977)的）；幼年仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞（TM4细胞，如记载于例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)的）；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠***肿瘤(MMT060562)；TRI细胞，如记载于例如Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)的；MRC5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。
C.测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗Axl抗体鉴定、筛选、或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
1.结合测定法和其它测定法
一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA、Western印迹等来进行。
另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与抗体327.6、327.6.S2、327.6.S11、327.6.S50、327.6.S52、327.6.S65、327.42、327.42.S8、327.42.S31、327.42.S13、327.42.S43、327.42.S52、327.42.S63、327.42.S73、327.42.H2、327.42.H4、和/或327.42.H20中一种或多种竞争对Axl的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与327.6、327.6.S2、327.6.S11、327.6.S50、327.6.S52、327.6.S65、327.42、327.42.S8、327.42.S31、327.42.S13、327.42.S43、327.42.S52、327.42.S63、327.42.S73、327.42.H2、327.42.H4、和/或327.42.H20所结合表位相同的表位（例如线性或构象表位）。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法见Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,Methods in MolecularBiology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)。
在一种例示性竞争测定法中，在包含第一经标记抗体（其结合Axl，例如327.6、327.6.S2、327.6.S11、327.6.S50、327.6.S52、327.6.S65、327.42、327.42.S8、327.42.S31、327.42.S13、327.42.S43、327.42.S52、327.42.S63、327.42.S73、327.42.H2、327.42.H4、和/或327.42.H20）和第二未标记抗体（其要测试与第一抗体竞争对Axl的结合的能力）的溶液中温育固定化Axl。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一经标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定化Axl。在允许第一抗体结合Axl的条件下温育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定化Axl联合的标记物的量。如果测试样品中与固定化Axl联合的标记物的量与对照样品相比实质性降低，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对Axl的结合。参见Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory ,Cold Spring Harbor,NY)。
2.活性测定法
一方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的抗Axl抗体的测定法。生物学活性可包括例如抑制Gas6结合Axl、抑制Axl激活、抑制Axl下游分子信号传导、抑制Axl表达（例如Axl细胞表面表达或细胞中的总Axl表达，诸如肿瘤细胞）、抑制炎性细胞因子分泌、促进凋亡（例如通过抑制Gas6介导的凋亡抑制）、抑制肿瘤内血管***、抑制肿瘤基质Axl活性和/或表达和/或抑制转移。还提供了在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。
在某些实施方案中，对本发明的抗体测试此类生物学活性。在某些实施方案中，对抗体测试其在体外促进凋亡（例如肿瘤细胞的凋亡）的能力。用于测定细胞生长和/或增殖和/或凋亡的例示性方法包括例如BrdU掺入测定法、MTT、[3H]-胸苷掺入（例如TopCount测定法（PerkinElmer））、细胞存活力测定法（例如CellTiter-Glo（Promega））、DNA片段化测定法、胱天蛋白酶激活测定法、台盼蓝(tryptan blue)排斥、染色质形态测定法等等。
在某些实施方案中，对抗体测试抑制Axl表达，例如使用本文中描述和例示的方法。在一个实施方案中，将抗Axl抗体与合适的测试细胞（例如NSCLC细胞A549）一起温育，并在合适的一段时间后，收获细胞裂解物并检查总Axl水平。也可以在与候选抗Axl抗体一起温育之后使用FACS分析来检查表面Axl受体水平。在一个实施方案中，在用抗Axl抗体处理之后对肿瘤样品检查Axl表达。
在某些实施方案中，对本发明的抗体测试其抑制炎性细胞因子分泌的能力，例如如本文中描述和例示的。
在某些实施方案中，对本发明的抗体测试其降低肿瘤内血管***和/或抑制肿瘤基质Axl活性和/或表达的能力，例如如本文中例示的。在一些实施方案中，肿瘤基质Axl活性为转移或肿瘤内血管***形成。
在某些实施方案中，对本发明的抗体测试其在体外抑制细胞生长或增殖的能力。抑制细胞生长或增殖的测定法是本领域公知的。细胞增殖的某些测定法，以本文所述“细胞杀伤”测定法为例，测量细胞存活力(viability)。这样的一种测定法是CellTiter-GloTM发光细胞存活力测定法，其可购自Promega(Madison,WI)。该测定法基于存在的ATP（有代谢活性的细胞的一项指标）的量化来测定培养物中的可存活细胞数。参见Crouch等(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88;美国专利No.6602677。该测定法可以以96孔或384孔形式进行，使之适应自动化高通量筛选(HTS)。参见Cree等(1995)AntiCancer Drugs6:398-404。该测定法规程牵涉直接向培养细胞添加单一试剂（
Figure BDA00002838785000691
试剂）。这导致细胞溶解和通过萤光素酶反应产生的发光信号的生成。发光信号与存在的ATP的量成正比，后者直接与培养物中存在的可存活细胞数成正比。可以通过光度计或CCD照相机成像装置来记录数据。发光输出表述成相对光单位(RLU)。
细胞增殖的另一种测定法是“MTT”测定法，一种测量3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑氮溴化物被线粒体还原酶氧化成甲
Figure BDA00002838785000692
(formazan)的比色测定法。像CellTiter-GloTM测定法一样，此测定法指示细胞培养物中存在的有代谢活性的细胞的数目。参见例如Mosmann(1983)J.Immunol.Meth.65:55-63;及Zhang等(2005)Cancer Res.65:3877-3882。
用于任何上述体外测定法的细胞包括天然表达Axl或经改造而表达Axl的细胞或细胞系。此类细胞包括相对于同一组织起源的正常细胞过表达Axl的肿瘤细胞。此类细胞还包括表达Axl的细胞系（包括肿瘤细胞系）和在正常情况下不表达Axl但经编码Axl的核酸转染的细胞系。本文中提供的、供任何上述体外测定法中使用的例示性细胞系包括NSCLC细胞系A549、NSCLC细胞系H1299、和乳腺癌细胞系MDA-MB231。
一方面，对本发明的抗Axl抗体测试其在体内抑制细胞生长或增殖的能力。在某些实施方案中，对本发明的抗Axl抗体测试其在体内抑制肿瘤生长的能力。体内模型***，诸如异种移植物模型，可用于此类测试。在一种例示性异种移植物***中，将人肿瘤细胞导入适当免疫受损的非人动物，例如无胸腺的“裸”小鼠。将本发明的抗体施用于所述动物。测量抗体抑制或降低肿瘤生长的能力。在上述异种移植物***的某些实施方案中，所述人肿瘤细胞是来自人类患者的肿瘤细胞。此类异种移植物模型可购自OncotestGmbH(Frieberg,Germany)。在某些实施方案中，上述人肿瘤细胞是来自人肿瘤细胞系的细胞，诸如MDA-MB-231乳腺癌细胞或A549非小细胞肺癌细胞。在某些实施方案中，通过皮下注射或通过移植入合适的位点（诸如***脂肪垫），将人肿瘤细胞导入适当免疫受损的非人动物。
要理解，任何上述测定法可以使用本发明的免疫偶联物替换或补充抗Axl抗体来进行。
要理解，任何上述测定法可以使用抗Axl抗体和其它的治疗剂，诸如VEGF拮抗剂和/或EGFR拮抗剂和/或化疗剂来进行。
D.免疫缀合物
本发明还提供了包含与一种或多种细胞毒剂，诸如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素（例如，蛋白质毒素、细菌、真菌、植物、或动物起源的酶活性毒素、或其片段）、或放射性同位素缀合的本文中的抗Axl抗体的免疫缀合物。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，包括但不限于美登木素生物碱（见美国专利No.5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP0425235B1）；auristatin诸如单甲基auristatin药物模块DE和DF（MMAE和MMAF）（见美国专利No.5,635,483和5,780,588及7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物（见美国专利No.5,712,374,5,714,586,5,739,116,5,767,285,5,770,701,5,770,710,5,773,001和5,877,296;Hinman等,Cancer Res.53:3336-3342(1993);及Lode等,Cancer Res.58:2925-2928(1998)）；蒽环类抗生素诸如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)（见Kratz等,CurrentMed.Chem.13:477-523(2006);Jeffrey等,Bioorganic&Med.Chem.Letters16:358-362(2006);Torgov等,Bioconj.Chem.16:717-721(2005);Nagy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:829-834(2000);Dubowchik等,Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532(2002);King等,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002);及美国专利No.6,630,579）；甲氨蝶呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)诸如多西他赛(docetaxel)、帕利他塞、larotaxel、tesetaxel、和ortataxel；单端孢霉素(trichothecene)；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文中所描述的抗体，所述酶活性毒素包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链（来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)）、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S）、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的如本文中所描述的抗体。多种放射性同位素可用于生成放射性缀合物。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在使用放射性缀合物进行检测时，它可以包含供闪烁法研究用的放射性原子，例如tc99m或I123，或供核磁共振(NMR)成像（又称为磁共振成像，mri）用的自旋标记物，诸如再一次的碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白质偶联剂来生成抗体和细胞毒剂的缀合物，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺）、二异硫氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta等,Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感性接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等,Cancer Res52:127-131(1992);美国专利No.5,208,020)。
本文中的免疫缀合物或ADC明确涵盖，但不限于用交联试剂制备的此类缀合物，所述交联试剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC、和sulfo-SMPB，及SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们是商品化的（例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A）。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文中提供的任何抗Axl抗体可用于检测生物学样品中Axl的存在。在用于本文时，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物学样品包含细胞或组织，诸如乳腺/***、胰、食管、肺和/或脑。
在一个实施方案中，提供了在诊断或检测方法中使用的抗Axl抗体。在又一方面，提供了检测生物学样品中Axl的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括在容许抗Axl抗体结合Axl的条件下使生物学样品与抗Axl抗体接触，如本文中所描述的，并检测是否在抗Axl抗体与Axl之间形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗Axl抗体来选择适合用抗Axl抗体治疗的受试者，例如其中Axl是一种用于选择患者的生物标志。
可使用本发明的抗体来诊断的例示性病症包括癌症（例如乳腺癌、肺癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、胃癌、白血病、子宫内膜癌、结肠癌、***癌、甲状腺癌、肝癌、骨肉瘤、和/或黑素瘤）。
在某些实施方案中，提供了经标记的抗Axl抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块（诸如荧光、发色、电子致密、化学发光、和放射性标记物）、及例如经由酶反应或分子相互作用间接检测的模块，诸如酶或配体。例示性的标记物包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H、和131I、荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明(rhodamine)及其衍生物、丹酰、伞形酮、萤光素酶，例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶（美国专利No.4,737,456）、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶（其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP偶联）、乳过氧化物酶、或微过氧化物酶、生物素/亲合素、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定的自由基、等等。
F.药物配制剂
通过混合具有期望纯度的此类抗体与一种或多种任选的药学可接受载体(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))混合以冻干配制剂或水性溶液形式制备如本文中所描述的抗Axl抗体的药物配制剂。一般地，药学可接受载体在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂（诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚）；低分子量（少于约10个残基）多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物（例如Zn-蛋白质复合物）；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性的药学可接受载体进一步包含间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(
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Baxter International,Inc.)。某些例示性的sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20记载于美国专利公开文本No.2005/0260186和2006/0104968。在一方面，将sHASEGP与一种或多种其它的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。
例示性的冻干抗体配制剂记载于美国专利No.6,267,958。水性抗体配制剂包括那些记载于美国专利No.6,171,586和WO2006/044908的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性组分，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的化合物。例如，可能希望进一步提供EGFR拮抗剂（诸如厄洛替尼）、抗血管发生剂（诸如VEGF拮抗剂，诸如抗VEGF抗体）、化疗剂（诸如紫杉烷类或铂剂）。此类活性组分适于以有效用于所需目的的量而组合存在。
活性成分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中（例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊），在胶状药物投递***中（例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊），或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington′sPharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形商品形式，例如膜，或微胶囊。
用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。
G.治疗性方法和组合物
可以在治疗性方法中使用本文中提供的任何抗Axl抗体。
在一方面，提供了作为药物使用的抗Axl抗体。在其它的方面，提供了在治疗癌症（例如乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、脑癌，胰腺癌、脑癌、肾癌、胃癌、白血病、子宫内膜癌、结肠癌、***癌、甲状腺癌、肝癌、骨肉瘤、和/或黑素瘤）中使用的抗Axl抗体。在某些实施方案中，提供了在治疗方法中使用的抗Axl抗体。在某些实施方案中，本发明提供了在治疗具有癌症的个体的方法中使用的抗Axl抗体，所述方法包括对个体施用有效量的抗Axl抗体。在某些实施方案中，本发明提供了在治疗具有免疫病症（例如自身免疫性病症）、心血管病症（例如动脉粥样硬化、高血压、血栓形成）、传染病（例如埃博拉病毒、马尔堡(Marburg)病毒）或糖尿病的个体的方法中使用的抗Axl抗体，所述方法包括对个体施用有效量的抗Axl抗体。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种其它的治疗剂，例如如下文所描述的。在又一些实施方案中，本发明提供了在抑制血管发生、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制炎性细胞因子分泌（例如来自肿瘤相关巨噬细胞）、抑制肿瘤血管***（例如肿瘤内血管***或肿瘤相关血管***）、和/或抑制肿瘤基质功能中使用的抗Axl抗体。
在某些实施方案中，本发明提供了在个体在抑制血管发生、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制炎性细胞因子分泌（例如来自肿瘤相关巨噬细胞）、抑制肿瘤血管***（例如肿瘤内血管***或肿瘤相关血管***）、和/或抑制肿瘤基质功能的方法中使用的抗Axl抗体，所述方法包括对个体施用有效量的抗Axl抗体以抑制血管发生、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制炎性细胞因子分泌（例如来自肿瘤相关巨噬细胞）、抑制肿瘤血管***发育（例如肿瘤内血管***或肿瘤相关血管***）、和/或抑制肿瘤基质功能。依照任何上述实施方案的“个体”优选是人。
在又一方面，本发明提供了抗Axl抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗癌症（在一些实施方案中，乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、脑癌，胰腺癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃癌、白血病、子宫内膜癌、结肠癌、***癌、甲状腺癌、肝癌、骨肉瘤、和/或黑素瘤）。在又一个实施方案中，所述药物用于治疗癌症的方法，包括对具有癌症的个体施用有效量的药物。在又一个实施方案中，药物在治疗免疫病症（例如自身免疫性病症）、心血管病症（例如动脉粥样硬化、高血压、血栓形成）、传染病（例如埃博拉病毒、马尔堡(Marburg)病毒）或糖尿病的方法中使用，所述方法包括对个体施用有效量的抗Axl抗体。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种其它的治疗剂，例如如下文所描述的。在又一个实施方案中，药物用于抑制血管发生、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制炎性细胞因子分泌（例如来自肿瘤相关巨噬细胞）、抑制肿瘤血管***（例如肿瘤内血管***或肿瘤相关血管***）、和/或抑制肿瘤基质功能。在又一个实施方案中，药物用于在个体中抑制血管发生、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制炎性细胞因子分泌（例如来自肿瘤相关巨噬细胞）、抑制肿瘤血管***（例如肿瘤内血管***或肿瘤相关血管***）、和/或抑制肿瘤基质功能的方法，所述方法包括对个体施用有效量的药物以抑制血管发生、抑制细胞增殖、促进免疫功能、诱导炎性细胞因子分泌（例如来自肿瘤相关巨噬细胞）、抑制肿瘤血管***发育（例如肿瘤内血管***或肿瘤相关血管***）、和/或抑制肿瘤基质功能。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在又一方面，本发明提供了治疗癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括对具有此类癌症的个体施用有效量的抗Axl抗体。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种其它的治疗剂，如下文所描述的。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在又一方面，本发明提供了治疗免疫病症（例如自身免疫性病症）、心血管病症（例如动脉粥样硬化、高血压、血栓形成）、传染病（例如埃博拉病毒、马尔堡(Marburg)病毒）或糖尿病的方法。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种其它的治疗剂，如下文所描述的。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在又一个方面，本发明提供了用于在个体中抑制血管发生、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制炎性细胞因子分泌（例如来自肿瘤相关巨噬细胞）、抑制肿瘤血管***（例如肿瘤内血管***或肿瘤相关血管***）、和/或抑制肿瘤基质功能的方法。在一个实施方案中，所述方法包括对个体施用有效量的抗Axl抗体以抑制血管发生、抑制细胞增殖、促进免疫功能、诱导炎性细胞因子分泌（例如来自肿瘤相关巨噬细胞）、抑制肿瘤血管***发育（例如肿瘤内血管***或肿瘤相关血管***）、和/或抑制肿瘤基质功能。在一个实施方案中，“个体”是人。
在又一方面，本发明提供了药物配制剂，其包含本文中提供的任何抗Axl抗体，例如在任何上述治疗性方法中使用。在一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗Axl抗体和药学可接受载体。在另一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗Axl抗体和至少一种其它的治疗剂，例如如下文所描述的。
可以单独或与疗法中的其它药剂组合使用本发明的抗体。例如，可以与至少一种其它的治疗剂共施用本发明的抗体。在某些实施方案中，其它的治疗剂是抗血管发生剂。在某些实施方案中，其它的治疗剂是VEGF拮抗剂（在一些实施方案中，抗VEGF抗体，例如贝伐单抗）。在某些实施方案中，其它的治疗剂是EGFR拮抗剂（在一些实施方案中，厄洛替尼）。在某些实施方案中，其它的治疗剂是化学治疗剂和/或细胞抑制剂。在某些实施方案中，其它的治疗剂是紫杉烷类（例如帕利他赛）和/或铂剂（例如卡铂）。
上文记录的此类联合疗法涵盖联合施用（其中两种或更多种治疗剂包含在相同或不同配制剂中），和分开施用，在该情况中，可以在施用其它的治疗剂和/或佐剂之前、同时、和/或之后发生本发明的抗体的施用。也可以与放射疗法组合使用本发明的抗体。
可以通过任何合适的手段，包括胃肠外、肺内、和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用来施用本发明的抗体（和任何其它的治疗剂）。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适的路径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施用、推注施用、和脉冲输注。
本发明的抗体应当以一种符合良好的医学实践的方式配制、确定剂量及给药。关于这一点考虑的因素包括在治疗的特定病症、在治疗的特定哺乳动物、患者个体的临床状态、病因、药物递送部位、给药方法、服药日程以及其它为开业医生所知的因素。抗体无需但可任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所述病症的药物一起配制。上述其它药物的有效量取决于配方中所存在的抗体的量、所治疗病症的类型、以及其它上述讨论的因素。这些药物通常以相同的剂量使用并具有本文中所描述的给药途径，或以约1-99%的本文所描述的剂量使用，或以任何剂量并通过任何途径使用，所述剂量和途径是凭经验确定的/经临床测定合适的。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体(当单独或与一种或多种其它其它的治疗剂联合使用时)的合适剂量应取决于所要治疗的疾病的类型、抗体的种类、疾病的严重性和病程、所给予抗体的预防或治疗目的、之前的治疗、患者的临床史和对抗体的应答、以及主治医师的斟酌决定。抗体适合于在一次或一系列的治疗中给予患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg-40mg/kg的抗体可作为首次候选用量给予患者，无论是例如通过一次或多次单独的给药或通过连续输注。取决予上述提及的因素，一个典型的日剂量可在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间的重复给药，取决于病情，治疗应通常持续直至出现病症得到期望的抑制为止。上述剂量可间歇给予，如每周或每三周给予一次(如使得患者得到约2-约20个，或例如约6个剂量的抗体)。可给予初始较高的负荷剂量，接着给予一个或多个较低的剂量。然而，可使用其它给药方案。通过常规技术和测定方法易于监测该治疗的进展。
应当理解，可以替换抗Axl抗体或在抗Axl抗体外使用本发明的免疫缀合物实施任何上述配制剂或治疗性方法。
H.制品
在本发明的另一方面，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上文所描述的病症的材料。制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、管形瓶、注射器、IV溶液袋、等等。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳单独或与另一种组合物组合有效治疗、预防和/或诊断状况的组合物，并且可以具有无菌存取口（例如，容器可以是具有由皮下注射针可穿过的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋）。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示使用组合物来治疗选择的状况。此外，制品可以包含(a)具有其中含有的组合物的第一容器，其中组合物包含本发明的抗体；和(b)具有其中含有的组合物的第二容器，其中组合物包含其它的细胞毒性或其它方面治疗性的药剂。在本发明的此实施方案中的制品可以进一步包含包装插页，其指示可以使用组合物来治疗特定的状况。或者/另外，制品可以进一步包含第二（或第三）容器，其包含药学可接受缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针、和注射器。
应当理解，任何上述制品可包括本发明的免疫缀合物来代替或补充抗Axl抗体。
III.实施例
材料和方法
抗体和细胞系。抗体得自下述供应商：针对人Axl的小鼠单克隆抗体（单抗）（Abnova，Taiwan），磷酸-Akt小鼠单抗和Akt多克隆抗体（Cell Signaling）。小鼠重组Gas6和用于磷酸-Axl的ELISA试剂盒购自R&D System。人癌瘤细胞系得自ATCC，并在补充有10%FBS的PRMI1640培养基中培养。杂交瘤抗人Axl单克隆抗体12A11和3G9由Genentech提供（参见Li（2009））。
噬菌体抗Axl单克隆抗体的生成。为了生成抗体，使用在选定互补决定区（H1、H2、H3）中具有合成多样性、模拟人IgG全集天然多样性的人噬菌体抗体文库进行淘选。在M13噬菌体颗粒的表面上二价展示Fab片段（Lee等人，2004）。在交替轮次中针对人和鼠Axl ECD淘选噬菌体抗体文库。通过ELISA和DNA测序来鉴定结合至人Axl ECD-His和鼠Axl ECD-Fc融合蛋白的噬菌体抗体，并将抗体克隆重定格式以表达全长IgG（Liang等人，2007）。个别克隆在哺乳动物细胞中瞬时表达并用蛋白A柱纯化（Carter等人，1992）。
对噬菌体克隆筛选它们抑制Baf3-Axl细胞的Gas6依赖性增殖的能力。选择两个在抑制Baf3Axl细胞增殖方面展现出最高效力的克隆进行亲和力成熟。
为了亲和力成熟，在M13噬菌体的表面上展示单价Fab的噬菌粒（Liang等人，2007）充当文库模板来嫁接噬菌体抗体的轻链（VL）和重链（VH）可变域。如（Liang等人，2007）所述采用软随机化策略进行亲和力成熟，并如（Sidhu等人，2004）所述使用高通量单点竞争性噬菌体ELISA来快速筛选高亲和力克隆。
抗Axl抗体的亲和力测量。对于抗Axl抗体的结合亲和力测定，使用表面等离振子共振（SRP）测量，用BIAcoreTM-3000仪器。为了测量抗Axl抗体和人Axl ECD-His蛋白之间的亲和力，通过用小鼠抗人IgG包被以实现大约250个响应单位（RU）的CM5生物传感器芯片来捕捉抗Axl人IgG。对于动力学测量，于25°C以流速30μl/min在PBT缓冲液（含0.05%Tween20的PBS）中注射人Axl ECD-His的两倍连续稀释液（440nM–28nM）。使用简单一对一朗格缪尔（Langmuir）结合模型（BIAcore Evaluation Software version3.2）计算结合速率（kon）和解离速率（koff）。以koff/kon比计算平衡解离常数（KD）。为了测量抗Axl抗体对鼠Axl ECD-Fc融合蛋白的亲和力，通过用小鼠抗人IgG包被以实现大约150个响应单位（RU）的CM5生物传感器芯片来捕捉鼠Axl ECD人IgG融合蛋白。对于动力学测量，于25°C以流速30μl/min在PBST缓冲液（含0.05%Tween20的PBS）中注射抗Axl Fab片段的两倍连续稀释液（200nM–12nM）。
细胞增殖测定法。在96孔板中以5000个细胞/孔接种细胞，并用多种浓度的Axl单抗处理72小时。使用CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法（Promega）依照制造商的说明书测量细胞增殖。
ELISA和荧光激活细胞分选（FACS）。如下实施ELISA测定法：用0.5%BSA、PBS、0.05%Tween20（PBST）封闭山羊抗人IgG Fc包被的板。对于交叉反应测定法，将经过包被的板与人Axl.Fc、小鼠Axl.Fc或人Mer.Fc、Tyro-3.Fc一起于室温温育1小时，在PBST中清洗四次，与抗Axl单抗和HRP偶联的抗小鼠Ig一起温育。对于结合测定法，将经过包被的板与人Axl.Fc一起于室温温育1小时，在PBST中清洗四次，与rmGas6和抗Axl单抗一起于室温温育1小时。将板在PBST中清洗四次，与生物素化抗mGas6和链霉亲合素-HRP一起温育。使用R&D ELISA试剂盒依照制造商的说明书测量分泌的Ang-2和DKK3。通过FACS使用标准技术测定细胞表面上的Axl表达。简言之，收获细胞，用抗Axl单抗（12A11，10ug/ml）在冰上染色30分钟，在PBS中清洗两次，然后用PE偶联的二抗染色。为了测定阻断Gas6结合细胞表面上Axl的抗体，收获细胞，用抗Axl单抗染色30分钟，并与rmGas6一起在冰上温育30分钟。将它们在PBS中清洗两次，并用生物素化抗Gas6和PE偶联的链霉亲合素染色。在BD FACScalibur流式细胞仪上分析样品。
异种移植物实验。所有研究依照“实验动物护理和使用指南”（NIH）进行，并得到了科研动物护理和使用委员会（IACUC）批准。将Matrigel（MDA-MB-231）中的总共5X106（A549）或107个细胞分别皮下植入裸（A549）或SCID小鼠（MDA-MB-231）的右体侧中。当平均肿瘤尺寸达到100mm3时，将小鼠随机分入不同处理组（n=10只每组）。每周两次，经腹膜内注射（IP），以10-30mg/kg施用抗Axl或对照IgG1抗体，以1-2mg/kg施用抗VEGF。通过口腔管饲法以100mg/kg/d施用厄洛替尼。分别以持续5天6.25mg/kg/d及处理开始时单剂100mg/kg皮下施用帕利他赛和卡铂。使用双向Anova实施统计分析，比较不同处理组中的肿瘤生长。
对于药效学（PD）研究，将小鼠用抗体处理0、24、72和168小时。在每一个时间点，取出肿瘤，为免疫组织化学染色和图像分析进行加工，并用于生成细裂解物进行Western印迹分析。
对于转移研究，经尾静脉注射将5X105个经萤光素酶报告基因（Li等人，2009）稳定转染的MDA-MB-231细胞植入SCID小鼠中。如（Li等人，2009）所述，通过生物发光检测来监测肿瘤细胞对各器官的转移。
免疫组织化学。异种移植物肿瘤样品在10%中性缓冲的***中固定，加工，在石蜡中包埋，并以4μm切片。然后将薄切片用针对Ki67、经过切割的胱天蛋白酶3和MECA32的一抗处理，接着是生物素化二抗和DAB发色团。
自Cureline Inc获得原发性人乳腺癌组织微阵列，包括导管和转移性腺癌。使用先前（Li等人，2009）描述的抗Axl单克隆抗体实施Axl IHC，并使用CD68对巨噬细胞染色。对于双重Axl/CD68IHC，首先使用Vector ABC EliteHRP试剂和DAB底物以2μg/ml实施Axl染色。序贯地以0.5μg/ml运行CD68染色，也使用ABC Elite-HRP试剂，但是改用Vector SG色原体（Blue/Grey）。在两种复合物之间实施一个第二靶抗原修复步骤以洗掉第一复合物，从而避免两种标志物的交叉反应性。
血管密度测量和数据分析。用MECA32，一种泛内皮细胞标志物对肿瘤样品染色。通过Ariol SL-50自动化载玻片扫描平台（Genetix Ltd.；Hampshire，UK）以100倍最终放大倍数获取图像。输出肿瘤特异性区域，在Metamorph软件包（MDS Analytical Technologies；Ontario，Canada）中作为个体8位图像进行分析。如（Brey等人，2003）描述的，使用蓝色标准化算法自苏木精复染色分离出褐色DAB特异性染色。一种分段算法基于尺寸和形状来鉴定血管并除去噪声。细胞基于尺寸、形状、和苏木精染色密度而鉴定为肿瘤或非肿瘤。非肿瘤区域通过非肿瘤细胞对肿瘤细胞的密度来鉴定。分析完成后，人工检查图像以除去不正确地鉴定为血管或肿瘤区域的伪像。对各个血管，以及每一幅图像中的肿瘤和非肿瘤区域记录面积测量。使用JMP8.0软件（SAS Institute，Inc.，North Carolina，USA）分析了基于图像分析的原始值。实施了Student’s t检验来比较每一对均值，p<0.05。
肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的分离和分泌性细胞因子的检测。解剖肿瘤，切成小块，并在含2.5%FBS、0.2U/ml Liberase Blendzymes II和5U/mlDNA酶I，（Roche）的RPMI1640培养基中温育。使用MACS Dissociator（Miltenyi Biotec）解离肿瘤细胞，并于室温维持20分钟。添加EDTA（终浓度0.002%）以终止反应。制备单细胞悬浮液，并使用RBC裂解缓冲液（eBioscience）除去红细胞。将细胞以107个细胞/ml在含有1%FBS的PBS中重悬浮，并与20μg/ml FcRII、III和IV一起温育20分钟。添加抗F4/80-PE（eBioscience）和抗CD11c-APC（BD Pharmingen）（0.2μg/106个细胞），并在冰上温育30分钟。通过FACSAria（BD Biosciences）分选F4/80和CD11c阳性细胞。在96孔板中接种总共2x105个F4/80和CD11c阳性细胞并温育过夜。收集培养液，并使用Bio-Plex小鼠细胞因子测定法（Bio-Rad）依照制造商的说明书测定细胞因子和趋化因子水平。
表位作图
通过标准分子生物学技术生成Axl-2（PRK HuAxl（1-134Aa）/HuIgG1Fc）、Axl-3（PRK HuAxl（1-221Aa）/HuIgG1Fc）、Axl-4（PRK HuAxl（1-324Aa）/HuIgG1Fc）、和Axl-5（PRK HuAxl（1-435Aa）/HuIgG1Fc）质粒构建物。通过直接测序和/或限制性消化验证了所有质粒。使用PromegaL2080TNT SP6快速转录/翻译***试剂盒体外转录和翻译编码Axl胞外域各个部分（aa1-134，aa1-221，aa1-324，aa1-435）的质粒，并在ELISA中用作抗原。这些实验中使用的Axl各部分包括：人Axl的氨基酸1-134（包含Axl的Ig1）：MAWRCPRMGRVPLAWCLALCGWACMAPRGTQAEESPFVGNPGNITGARGLTGTLRCQLQVQGEPPEVHWLRDGQILELADSTQTQVPLGEDEQDDWIVVSQLRITSLQLSDTGQYQCLVFLGHQTFVSQPGYVG（SEQ ID NO:111），和人Axl的氨基酸221-324（包含Axl纤连蛋白域）：ITVLPQQPRNLHLVSRQPTELEVAWTPGLSGIYPLTHCTLQAVLSDDGMGIQAGEPDPPEEPLTSQASVPPHQLRLGSLHPHTPYHIRVACTSSQGPSSWTHWL（SEQ ID NO:130）。
抗体竞争实验。为了测定噬菌体抗Axl单抗YW327.6或YW327.42是否与杂交瘤抗Axl单抗12A11和3G9竞争，将A549细胞用抗Axl噬菌体抗体（每种50μg/ml）和杂交瘤抗Axl抗体（每种10μg/ml）共染色30分钟。将细胞在PBS中清洗两次，并用抗小鼠Ig-PE染色。如上文关于FACS分析所述，在BDFACScalibur流式细胞仪（BD Biosciences）上分析样品。
结果
阻断Axl功能的噬菌体衍生单克隆抗体的生成。为了鉴定与鼠和人Axl交叉反应的抗体，我们采用了在选定互补决定区中具有合成多样性、模拟人IgG抗体天然多样性的噬菌体展示抗体文库（Lee等人，2004）。通过ELISA和DNA测序鉴定了结合人和鼠Axl ECD二者的噬菌体抗体，并抗体克隆重定格式以表达全长IgG（Liang等人，2007）。然后对一组全长IgG筛选它们抑制Baf3Axl细胞的Gas6依赖性生长的能力（Li等人，2009），并对克隆之一YW327.6进行亲和力成熟和纯化。
亲和力成熟的Axl单抗YW327.6S2以高亲和力与人和鼠Axl二者结合，Kd分别为约1nM和545pM（图7A-B）。具体而言，Ka为1.7X105，kd为1.7X104，而KD为9.9X10-10。此抗体还与猕猴Axl结合，但是它不与相关受体Tyro3和Mer交叉反应（图7C）。YW327.6S2以剂量依赖性方式（图7D-E）阻断配体Gas6结合Axl，如无细胞ELISA和细胞表面FACS二者中证明的。
还表征了亲和力成熟的Axl单抗YW327.6S11、YW327.42S8和YW327.42S31。YW327.6S11、YW327.42S8和YW327.42S31以高亲和力结合人和鼠Axl二者。例如，抗体结合人Axl的Biacore分析产生下述结果：
Figure BDA00002838785000821
这些抗体不与Tyro3和Mer交叉反应。YW327.6S2（和亲本抗体YW327.6）阻断配体Gas6结合Axl，而YW327.42S8和YW327.42S31（和亲本单抗YW327.42）不阻断配体Gas6结合Axl。
Axl表位分析。使用ELISA分析了结合人Axl胞外域各部分的Axl抗体。获得了结果。
Figure BDA00002838785000822
Figure BDA00002838785000831
YW327.6结合包含人Axl氨基酸1-134的Axl-Fc融合物。比较而言，YW327.42结合包含人Axl氨基酸1-324的Axl-Fc融合物，但是不结合包含氨基酸1-134和1-221的Axl Fc融合物。如此，我们得出结论，YW327.6结合由人Axl氨基酸1-134组成的多肽，而且人Axl氨基酸222-234是YW327.42结合所需要的。氨基酸1-134含有Axl IgI域，而氨基酸222-234含有Axl纤连蛋白域。
与抗Axl杂交瘤抗体的比较实验。我们测定了抗体YW326.6和YW327.42是否能够与抗Axl杂交瘤抗体12A11和3G9（Li，（2009），2009年7月27日提交的美国专利申请No.61/228,915）竞争人Axl结合。在对人Axl的抗体竞争结合实验中，抗体YW327.6不与杂交瘤抗体12A11或3G9竞争人Axl结合，证明这些抗体不识别相同表位。抗体YW327.42与杂交瘤抗体12A11竞争人Axl结合，但是不与杂交瘤抗体3G9竞争人Axl结合。
YW327.6S2下调Axl表达，抑制其激活、信号传导和Gas6依赖性Baf3Axl细胞增殖。为了测试YW327.6S2是否影响Axl生物学功能，我们首先评估了它对Axl表达和信号传导的影响。用YW327.6S2处理NSCLC细胞系A549导致细胞表面上的Axl表达快速下调（图7F，上部小图），而且此下调持续24小时（图7F，下部小图）。H1299NSCLC细胞的Gas6处理诱导Axl磷酸化，其在细胞与YW327.6S2一起预温育时受到抑制（图7G，上部小图）。因此，H1299细胞与YW327.6S2一起预温育阻断Gas6诱导的下游信号传导分子Akt磷酸化（图7G，下部小图）。YW327.6S2对Axl表达的下调和对其信号传导的灭活有力地抑制Baf3Axl细胞的Gas6依赖性生长，IC50为340ng/ml（图7H）。
YW327.6S2降低A549异种移植物生长且增强抗VEGF的效果。在一项先前的研究中，我们显示了通过RNAi或抗人Axl杂交瘤单克隆抗体处理来抑制Axl显著削弱A549NSCLC肿瘤生长（Li等人，2009）。因此，我们首先在此模型中测试了YW327.6S2对肿瘤生长的影响。YW327.6S2单独10mg/kg、每周两次给药方案显著降低A549肿瘤生长（图8A），而且此抑制效应与抗人Axl杂交瘤抗体相当（图8C）。
Axl在内皮细胞上表达且增强VEGF诱导的内皮小管形成（Li等人，2009；Holland等人，2005），我们测试了抗Axl单抗是否能够增强抗VEGF的抗肿瘤生长特性（Liang等人，2006）。单独的抗VEGF抗体和单独的YW327.6S2对A549肿瘤生长具有相似影响（图8A）。两种抗体一起的组合导致与单独的任一抗体相比增强的肿瘤生长抑制，单一药剂的30%抑制对组合处理的60%抑制（图8A）。
给这些研究中的动物在60天里每周服药两次并跟踪至第85天以检查肿瘤生长的延迟（当肿瘤尺寸超过800mm3时，自研究移除动物；没有动物因毒性而移除）。YW327.6S2在与抗VEGF组合时与单一药剂相比显著延迟肿瘤生长（图8A）。自最后一剂至实验结束（第85天）的时间期间组合处理组中没有肿瘤再生长，这导致实验结束时这组中的所有动物存活，如Kaplan-Meier图中所示（图8B）。
抗人Axl杂交瘤单克隆抗体12A11不与鼠Axl交叉反应，显著削弱A549异种移植物肿瘤生长（Li等人，2009），还增强抗VEGF的效果，如图8C中所示。这符合预期，因为12A11直接抑制肿瘤细胞生长而抗VEGF影响肿瘤血管***。
YW327.6S2下调受体表达且诱导A549肿瘤细胞凋亡。为了开始了解介导YW327.6S2降低肿瘤生长的效果的机制，我们实施了药效学研究。用YW327.6S2处理携带A549肿瘤的小鼠，并在给药后0、24、72、和168小时取出肿瘤。肿瘤裂解物的Western印迹分析显示了Axl表达在抗体施用后24小时下调并持续168小时（图8D），提示YW327.6S2的抗肿瘤生长效果部分地通过下调Axl表达来介导。
为了测定YW327.6S2是否对肿瘤细胞增殖和凋亡具有直接影响，取出用对照或YW327.6S2处理两周的A549异种移植物肿瘤，并实施了经过切割的胱天蛋白酶3（CC3）和Ki67IHC。用YW327.6S2处理的肿瘤展现出与对照相比升高的CC3（图8E），提示YW327.6S2诱导肿瘤细胞凋亡。在对照和YW327.6S2处理的肿瘤之间Ki67阳性核没有显著差异，提示YW327.6S2不直接影响肿瘤细胞增殖。
为了调查YW327.6S2是否影响肿瘤相关血管***，我们用单独的或与抗VEGF组合的YW327.6S2处理携带A549肿瘤的小鼠。取出肿瘤，并用MECA32（一种泛内皮标志物）染色以检查肿瘤内血管密度。单独的YW327.6S2与对照相比没有显著降低血管密度，但是与抗VEGF的组合导致肿瘤相关血管密度显著降低（图8F）。比较而言，12A11自身或与抗VEGF组合对肿瘤内血管密度没有显著影响。
YW327.6S2增强厄洛替尼和化疗的效果。为了测试YW327.6S2是否能够增强NSCLC标准护理的治疗指数，我们实施了YW327.6S2与EGFR小分子抑制剂（SMI）厄洛替尼和化疗的组合处理。
A549含有野生型EGFR且对厄洛替尼只是中度敏感（Yauch等人，2005）；因此，我们调查了抗Axl单抗是否能使这些细胞变得对EGFR SMI敏感。YW327.6S2和厄洛替尼在作为单一药剂施用时导致肿瘤生长降低30%，但是组合将肿瘤生长速率降低多于50%（图9A），提示抗Axl单抗增强厄洛替尼的抗肿瘤生长效果。
然后，我们调查了抗Axl单抗是否能够增强NSCLC标准护理的治疗指数。用一个周期的化疗处理携带A549异种移植物的小鼠，该化疗由在处理开始（第0天，图9B）时施用的帕利他赛（6.25mg/kg/d，5天）和卡铂（100mg/kg，一剂）组成。单独的化疗与单独施用的YW327.6S2对肿瘤生长具有相似效果，而二者的组合导致增强的肿瘤生长抑制（图9B）。
YW327.6S2在MDA-MB-231乳腺癌异种移植物模型中降低血管密度且抑制来自肿瘤相关巨噬细胞的炎性细胞因子分泌。由于通过shRNA实现的Axl敲低对MDA-MB-231异种移植物肿瘤生长只具有中等效果（Li等人，2009），因此我们想问YW327.6S2在此模型中是否有效。单独的YW327.6S2能够降低肿瘤生长（25%），而且在此模型中与作为单一药剂使用的抗VEGF具有相似效果（图10A）。组合疗法导致肿瘤生长降低50%，提示YW327.6S2加强抗VEGF的效果（图10A）。比较而言，抗Axl杂交瘤抗体12A11（Li等人，2009）不与鼠Axl交叉反应，在此模型中作为单一药剂对肿瘤生长没有显著影响，也不影响抗VEGF（图10B）。Western印迹分析显示了YW327.6S2和12A11都下调肿瘤中的Axl表达（图10C和D）。这些结果提示YW327.6S2的抗肿瘤生长效果可能通过调控肿瘤基质功能来介导。
为了进一步调查YW327.6S2如何调控肿瘤基质功能，我们用单独的或与抗VEGF组合的YW327.6S2处理携带MDA-MB-231肿瘤的小鼠。在施用抗体后的多个时间点，取出肿瘤，并用MECA32染色以检查肿瘤内血管密度。YW327.6S2和抗VEGF都与对照相比显著降低血管密度（图10E）。而且，两种抗体的组合导致肿瘤相关血管密度进一步降低。这些结果提示YW327.6S2部分地通过改变血管功能来降低MDA-MB-231肿瘤生长。
在原发性人乳腺癌标本中，我们发现了Axl蛋白在浸润巨噬细胞中强表达（图10F），因此想问Axl单抗YW327.6S2是否影响肿瘤相关巨噬细胞（TAM）功能。将MDA-MB-231异种移植物肿瘤用YW327.6S2、12A11或对照抗体处理一周，并通过分选F4/80阳性细胞来分离TAM。将细胞在无血清培养基中培养过夜，收集上清液并测定多种细胞因子和趋化因子的存在。来自用YW327.6S2和12A11处理的肿瘤的TAM生成与用对照抗体处理的TAM相比水平低得多的炎性细胞因子和趋化因子（图10G）。任一Axl单抗处理不影响TAM上的Axl表达水平（数据未显示），与这些抗体对肿瘤细胞上Axl表达的下调不同（图10C和D）。这些结果提示Axl单抗最有可能以间接方式调控来自TAM的炎性细胞因子/趋化因子分泌，可能是通过阻断肿瘤和基质细胞之间的交流(crosstalk)。
YW327.6S2降低MDA-MB-231乳腺癌细胞转移至骨。在一项先前的研究中，我们显示了在正位模型中通过shRNA实现的Axl敲低抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞转移至肺（Li等人，2009），因此我们测试YW327.6S2是否影响这些细胞的转移。经尾静脉将稳定表达萤光素酶报告基因的MDA-MB-231细胞（20）注射入SCID小鼠中。注射后四周，在对照抗体处理组中的所有五只动物的颅面区、胫骨和股骨检测到强发光信号。在对照组中通过生物发光检测到的位点为每只动物中5、5、4、3和1个，总共18个（图11A）。在用YW327.6S2处理的小鼠中，通过生物发光检测到的位点显著减少，每只动物中0、1、2、3、和1个位点，整个组总共7个（图11A）。骨中转移灶的存在得到了组织学分析的验证（图11B）。这些结果提示YW327.6S2能够降低MDA-MB-231乳腺癌细胞转移至远端器官。
讨论
我们开发并表征了人抗Axl单克隆抗体（YW327.6S2），其展现跨物种反应性且阻断Axl在肿瘤发生中的各种功能。在作为对Axl报告的第一种完全人源化阻断性抗体之外，YW327.6S2不仅充当用于剖析Axl激活/信号传导在癌症形成和进展的多个方面中的影响的一种有力工具，而且代表用于治疗多种癌症的一种潜在治疗剂。
我们的结果显示了YW327.6S2阻断Axl功能，这通过下调Axl表达以及抑制配体Gas6结合受体，导致Axl及其下游信号传导灭活来实现（图7）。YW327.6S2下调癌细胞中Axl表达的能力代表它的抑制效果的一种重要机制，因为多种癌症组成性表达活化的Axl且不再响应外源Gas6（Li等人，2009）。
在A549NSCLC模型中，YW327.6S2在作为单一药剂施用时显著削弱肿瘤生长（图8A）。此抑制效果与抗Axl杂交瘤抗体在此模型中的抑制效果相当（Li等人（2009）；图8C）。YW327.6S2快速下调异种移植物中的Axl表达（图8D），且诱导肿瘤细胞凋亡（图8E），这很可能是介导它对肿瘤生长的抑制效果的机制之一。我们先前的发现，即Axl通过调节DKK3和血管生成素/Tie2途径来调控内皮细胞功能（Li等人，2009），提出了抗Axl单抗增强抗VEGF在降低肿瘤生长方面的效果的可能性。我们的结果（图8A和F）与这种假说一致，即YW327.6S2通过增强抗VEGF降低肿瘤内血管密度的效果来影响肿瘤血管***。确实，A549模型中YW327.6S2和抗VEGF的共施用导致肿瘤停滞，在处理停滞后维持至少4周（图8B）。杂交瘤抗体12A11在此模型中还增强抗VEGF的抗肿瘤效果（图8C）。然而，与YW327.6S2不同，12A11对肿瘤血管***不具有直接影响；而是直接抑制肿瘤细胞增殖及诱导凋亡（Li等人。2009）。12A11对肿瘤生长和抗VEGF对肿瘤血管***的效果在两种药剂一起使用时导致升高的效果。
EGFR小分子抑制剂诸如厄洛替尼有效治疗包含EGFR突变或扩增的NSCLC肿瘤（Lynch等人，2004；Paez等人，2004；Eberhard等人，2005；Giaccone等人，2005；Tsao等人，2005）。还知道用Her2/EGFR小分子抑制剂拉帕替尼或抗Her2抗体Herceptin处理乳腺癌细胞导致诱导Axl表达和因此导致癌细胞对这些疗法的抗性（Liu等人，2009）。我们最近发现了Axl表达在已经对厄洛替尼获得了抗性的HCC827NSCLC（一种包含EGFR突变和扩增二者的细胞系）细胞中得到诱导，而且抗性细胞中的Axl敲低恢复它们对厄洛替尼的敏感性，提示Axl在NSCLC中的厄洛替尼抗性中发挥作用。由于A549细胞含有野生型EGFR且只是在体外对EGFR抑制中度敏感（Yauch等人，2005），因此我们想问抗Axl单抗是否会使这些细胞对厄洛替尼敏感。我们的结果显示了YW327.6S2强化厄洛替尼在降低肿瘤生长方面的效果（图9A），提示抗Axl单抗增强EGFR抑制剂在对单独的EGFR抑制不应的肿瘤中的功效，可能是通过直接降低肿瘤细胞中的Axl表达。
***化疗在NSCLC的治疗范例中占最大部分。对于复发性或晚期疾病，用由卡铂/帕利他赛组成的化疗治疗的患者具有15%的响应率和10.3个月的中值存活（Sandley等人，2006）。我们在A549NSCLC模型中得到的结果显示了YW327.6S2能够增强卡铂/帕利他赛的抗肿瘤功效（图9B），提示阻断Axl功能改善化疗在此疾病中的治疗指数。我们的结果与一份最近的报告一致，该报告证明了在4T1乳腺癌正位模型中Axl小分子抑制剂与顺铂协同来遏制肝微转移（Holland等人，2010）。
在MDA-MB-231乳腺癌模型中，单独的YW327.6S2能够显著削弱肿瘤生长（图10A）。该抗Axl杂交瘤抗体不与鼠Axl交叉反应且因此只会影响肿瘤细胞，在此模型中对肿瘤生长没有显著影响（图10B）。这些结果提示YW327.6S2很可能经由它对肿瘤基质的作用来发挥它的抗肿瘤效果。我们的结果显示了YW327.6S2降低肿瘤内血管密度（图10E）且增强抗VEGF的效果。经由它对肿瘤血管***的作用，YW327.6S2影响肿瘤生长。
早就认识到癌症形成和炎症之间的关联（Balkwill和Mantovani，2001；Coussens和Werb，2002）。与感染和刺激有关的慢性炎症可产生促成基因组损害和肿瘤启动的环境。越来越多的证据证明TAM在肿瘤进展中具有因果作用，包括促进血管发生和基质再塑（Balkwill等人，2005；Pollard，2004）。认为负责这个的信号是炎性细胞因子，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素6（IL-6）和趋化因子过剩。这些细胞因子和趋化因子不仅将免疫细胞募集至刺激肿瘤进展的特定部位，而且显示了它们的受体在肿瘤细胞上表达，它们在那里能提高肿瘤生长和迁移（Haghnegahdar等人，2000）。在原发性人乳腺癌中，Axl蛋白在肿瘤相关巨噬细胞（TAM）上以高水平表达（图10F）。我们在这里提供了证据来证明抗Axl单抗能经由一种间接机制来调控这些细胞的功能。我们的数据显示了用YW327.6S2或12A11（其不与鼠Axl交叉反应且因此不应对TAM具有直接影响）处理MDA-MB-231异种移植物抑制来自TAM的炎性细胞因子和趋化因子分泌（图10G）。由于Axl单抗似乎对TAM上的Axl表达没有显著影响但下调肿瘤细胞上的受体表达，很可能抗Axl单抗通过阻断肿瘤和基质细胞之间的交流来调控来自TAM的细胞因子/趋化因子分泌。这些结果与最近的报告一致，即肿瘤细胞能通过教导浸润白细胞来诱导Gas6表达来促进它们的生长（Loges等人，2010）；而且Axl的小分子抑制剂降低4T1乳腺肿瘤细胞中的GM-CSF表达（Holland等人，2010）。
先前的研究已经确立了Axl在促进肿瘤细胞迁移、侵入和转移中的作用（Zhang等人，2008；Li等人，2009；Tai等人，2008；Vajkoczy等人，2006；Gjerdrum等人，2010）。我们在这里显示了YW327.6S2能够降低MDA-MB-231乳腺癌细胞对骨的转移。这些结果与我们先前的数据一致，即在一种正位模型中乳腺癌细胞中通过RNAi实现的Axl沉默抑制它们对肺的转移（Li等人，2009；Gjerdrum等人，2010），提示此抗Axl抗体不仅在原发性肿瘤的治疗中，而且在转移性疾病中具有治疗潜力。
总之，我们开发了一种阻断Axl功能的人单克隆抗体。此抗Axl单抗经由多种机制来发挥它的抗肿瘤效果，包括诱导肿瘤细胞凋亡、调节血管发生和调控肿瘤相关免疫细胞功能。另外，此抗Axl单抗增强抗VEGF、EGFR SMI以及化疗的抗肿瘤功效，因此代表这些疗法作为标准护理的临床设置中的一种新的治疗办法。
部分参考文献列表
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虽然出于清楚理解的目的，前述发明已经作为例示和例子相当详细地进行了描述，但是说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过提及而明确将本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容完整收录。
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Claims (34)

1.与人Axl结合的分离的抗体，其中该抗体以≤600pM的亲和力结合人Axl，其中该抗体以≤1nM的亲和力结合小鼠Axl。
2.权利要求1的抗体，其中该抗体促进Axl受体下调和/或抑制组成性Axl激活。
3.权利要求1-2任一项的抗体，其中该抗体结合包含氨基酸序列SEQ IDNO:111、基本上由氨基酸序列SEQ ID NO:111组成或由氨基酸序列SEQID NO:111组成的多肽。
4.权利要求1-3任一项的抗体，其为单克隆抗体。
5.权利要求1-4任一项的抗体，其为全长IgG1抗体。
6.权利要求1-5任一项的抗体，其为人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、或结合Axl的抗体片段。
7.权利要求1-6任一项的抗体，其中该抗体包含(a)HVR-H1，其包含GFX1X2X3X4X5X6X7H，其中X1为S或T；X2为L，F或V；X3为S，T，或R；X4为G或S；X5为S，H，T或I；X6为W或G；X7为I或L（SEQ ID NO:112），(b)HVR-H2，其包含X1X2IX3PX4X5X6X7X8YYADSVKG，其中X1为G或A；X2为W或G；X3为N，S，A或P；X4为Y，A或V；X5为R，G，或S；X6为G，R或S；X7为Y，S，H或Y；X8为A，T，或P（SEQ ID NO:113）；(c)HVR-H3，其包含ARX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13MDY，其中X1为E或W；X2为Y或R；X3为S，N或P；X4为G，D，或L；X5为W或S；X6为G，R，A，或S；X7为G或S；X8为S或缺失；X9为S，Y或缺失；X10为V，I或缺失；X11为G或缺失；X12为Y或缺失；X13为A，E或缺失（SEQID NO:114）；(d)HVR-L1，其包含RASQX1X2X3X4X5X6A，其中X1为D，I或S；X2为V或I；X3为S，G或R；X4为T，I，N或R；X5为A或S；X6为V或L（SEQ ID NO:115）；(e)HVR-L2，其包含X1ASX2LX3S，其中X1为S，A，或V；X2为F，N或S；X3为Y或A（SEQ ID NO:116）；和(f)HVR-L3，其包含QQX1X2X3X4X5X6T，其中X1为S或A；X2为Y，K或N；X3为T，S，Y，M，R或A；X4为T，N，S，或F；X5为P或R；X6为P，Y，S或L（SEQID NO:117）。
8.权利要求1-7任一项的抗体，其中该抗体包含(a)HVR-H1，其包含GFX1X2X3GX4WIH，其中X1为T或S，X2为F或L，X3为T或S，X4为H，S或T（SEQ ID NO:118）；(b)HVR-H2，其包含GWIX1PYX2X3X4X5YYADSVKG，其中X1为S，N或A；X2为G，R或S；X3为G或R；X4为S，Y或H；X5为T，A或P（SEQ ID NO:119）；(c)HVR-H3，其包含AREYX1X2WX3X4SX5X6GYX7MDY，其中X1为S，N或P；X2为G或D；X3为G，R，或A；X4为G或S；X5为S或Y；X6为V或I；X7为A或E（SEQ ID NO:120）；和HVR-L3，其包含QQSYX1X2X3X4T，其中X1为T，S或Y；X2为T，N，S或F；X3为P或R；X4为P，Y或S（SEQ ID NO:121）。
9.权利要求1-8任一项的抗体，其中该抗体包含(a)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:9，(b)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:12，和(c)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8。
10.权利要求1-9任一项的抗体，其中该抗体包含(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:7，(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8，和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:9。
11.权利要求1-10任一项的抗体，进一步包含(a)HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:10；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:11；和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:12。
12.权利要求1-11任一项的抗体，进一步包含图3A-B、4、5或6中所示重链可变域框架序列或轻链可变域框架序列。
13.权利要求1-12任一项的抗体，包含(a)VH序列，其与氨基酸序列SEQ IDNO:103具有至少95%序列同一性；(b)VL序列，其与氨基酸序列SEQ IDNO:104具有至少95%序列同一性；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
14.权利要求13的抗体，包含VH序列SEQ ID NO:103和/或VL序列SEQ IDNO:104。
15.分离的核酸，其编码权利要求1-14任一项的抗体。
16.宿主细胞，其包含权利要求15的核酸。
17.生产抗体的方法，包括培养权利要求16的宿主细胞使得生成该抗体。
18.权利要求17的方法，进一步包括自该宿主细胞回收该抗体。
19.免疫偶联物，其包含权利要求1-14任一项的抗体和细胞毒剂。
20.药物配制剂，其包含权利要求1-14任一项的抗体和药学可接受载体。
21.权利要求20的药物配制剂，进一步包含其它的治疗剂。
22.权利要求21的药物配制剂，其中该其它的治疗剂选自VEGF拮抗剂、EGFR拮抗剂，和化疗剂。
23.权利要求1-14任一项的抗体，其用作药物。
24.权利要求1-14任一项的抗体，其用于治疗癌症、免疫病症、心血管病症、血栓形成、或糖尿病。
25.权利要求1-14任一项的抗体，其用于抑制细胞增殖、促进Axl下调、抑制转移、和/或抑制血管发生。
26.权利要求1-14任一项的抗体在制备药物中的用途。
27.权利要求26的用途，其中该药物用于治疗癌症、免疫病症、心血管病症、血栓形成、或糖尿病。
28.权利要求26的用途，其中该药物用于抑制细胞增殖、抑制血管发生、促进Axl下调、和/或抑制转移。
29.治疗具有癌症的个体的方法，包括对该个体施用有效量的权利要求1-14任一项的抗体。
30.权利要求29的方法，进一步包括对该个体施用其它的治疗剂。
31.权利要求30的方法，其中该其它的治疗剂选自下组：VEGF拮抗剂，EGFR拮抗剂和化疗剂。
32.治疗具有免疫病症、心血管病症、血栓形成或糖尿病的个体的方法，包括对该个体施用有效量的权利要求1-14任一项的抗体。
33.在个体中抑制血管发生、抑制细胞增殖、促进Axl受体下调或抑制转移的方法，包括对该个体施用有效量的权利要求1-14任一项的抗体以抑制血管发生、抑制细胞增殖、促进Axl受体下调或抑制转移。
34.抑制组成性Axl激活的方法，包括对该个体施用有效量的权利要求1-14任一项的抗体以抑制组成性Axl。
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