MX2011005411A - Anticuerpos de il-6 y uso de los mismos. - Google Patents

Anticuerpos de il-6 y uso de los mismos.

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cancer
abl
heavy chain
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MX2011005411A
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Brian Kovacevich
Katie Olson
Anne Elisabeth Carvalho Jensen
Ben Dutzar
Leon Garcia Martinez
Jeffrey T L Smith
Mark Litton
Randall Schatzman
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Alder Biopharmaceuticals Inc
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Abstract

La presente invención se dirige a métodos terapéuticos que usan antagonistas de IL-6, tales como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo Ab1 que tiene especificidad de unión a IL-6 para prevenir o tratar la enfermedad o mejorar la capacidad de supervivencia o la calidad de vida de un paciente que lo necesita. En modalidades preferidas, estos pacientes comprenderán aquellos que presentan (o se encuentran en riesgo de desarrollar) un nivel de proteína C-reactiva en suero elevado, un nivel de albúmina en suero reducido, dímero-D u otra proteína o proteínas relacionadas con la cascada de coagulación elevadas, caquexia, fiebre, debilidad y/o fatiga antes del tratamiento. Las terapias objeto de la presente también pueden incluir la administración de otros activos como agentes quimioterapéuticos, anticoagulantes, estatinas y otros.

Description

ANTICUERPOS DE IL-6 Y USO DE LOS MISMOS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente provisional de EUA No. 61/117,839, 61/117,861, y 61/117,811, todas presentadas el 25 de noviembre de 2008 y, además, es una continuación en parte de la solicitud de EUA 12/502, 581 presentada el 14 de julio de 2009, No. de serie de EUA 12/399,156, presentada el 6 de marzo de 2009, No. de serie de EUA 12/391,717 presentada el 24 de febrero de 2009 y No. de serie de EUA 12/366,567 presentada el 5 de febrero de 2009, cuyas descripciones se incorporan a la presente en su totalidad a modo de referencia .
El listado de secuencias en el archivo denominado "67858o706002.txt" con un tamaño de 332,081 bites, creado el 24 de noviembre de 2009, se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención La presente invención es una extensión de una invención anterior de los solicitantes descrita en las solicitudes de patente referidas anteriormente que se relacionan a anticuerpos anti-IL-6 novedosos, a terapias y protocolos terapéuticos novedosos que utilizan anticuerpos anti-IL-6, y a formulaciones farmacéuticas que contienen anticuerpos anti-IL-6. En modalidades preferidas, un anticuerpo anti-IL-6 es Abl, que incluye formas de ratón o humanizadas del mismo, asi como cadenas pesadas, cadenas ligeras, fragmentos, variantes y CDRs del mismo o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente al mismo o a los mismos epítopos lineales o conformacionales en un fragmento de polipéptido de IL-6 humana intacta de los mismos como Abl. La aplicación objeto de la presente se refiere, en particular, a formulaciones preferidas y a usos terapéuticos de un anticuerpo humanizado de ejemplo referido en la presente como Abl y variantes del mismo. En modalidades preferidas, el anticuerpo anti-IL-6 tiene una semivida in vivo de al menos, aproximadamente, 25 días, un efecto de aumento de albúmina in vivo, un efecto de disminución de la proteína C-reactiva in vivo, un efecto de restauración de un perfil de coagulación normal in vivo, posee una afinidad de unión (Kd) con respecto a IL-6 menor a aproximadamente 50 picomolar y/o tiene una tasa de disociación (Koff) de IL-6 menor o igual a 10"4 S"1. : La invención también se refiere a métodos de análisis de enfermedades y trastornos asociados con IL-6 y a métodos de prevención o tratamiento de enfermedades o trastornos asociados con IL-6, mediante la administración de dicho anticuerpo o un fragmento o una variante del mismo.
En un aspecto, la presente invención se refiere a métodos de mejora de la capacidad de supervivencia o la calidad de vida de un paciente que lo necesite, que comprende administrar al paciente un anticuerpo IL-6, tal como Abl o un fragmento o variante del mismo, mediante lo cual se disminuye el nivel de proteina C-reactiva del paciente ("CRP") y/o se aumenta el nivel de albúmina del paciente y, opcionalmente, controlar al paciente para determinar el nivel de CRP y/o de albúmina del paciente .
En otro aspecto, la presente invención se relaciona a métodos para disminuir el nivel de proteina C-reactiva 1 en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente un antagonista de IL-6, como Abl, mediante lo cual se disminuye el nivel de CRP del paciente y controlar al paciente para evaluar el nivel de CRP. En otro aspecto, la presente invención se relaciona con métodos para aumentar el nivel de albúmina en un paciente que lo necesita, los cuales comprenden administrar al paciente un antagonista de IL-6, como Abl, mediante lo cual se aumenta el nivel de albúmina en suero del paciente y controlar al paciente para evaluar el nivel de albúmina.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a métodos para prevenir o tratar la caquexia, la debilidad, la fatiga y/o la fiebre en un paciente que lo necesite, por ejemplo, un paciente que presente niveles elevados de CRP, que comprenden la administración de un anticuerpo anti-IL-ß o un fragmento de anticuerpo o variante del mismo a un paciente, mediante lo cual se mejora la caquexia, la debilidad, la fatiga y/o la fiebre del paciente o se vuelve a un estado normal y, opcionalmente, controlar al paciente para evaluar la caquexia, el debilidad, la fatiga y/o la fiebre.
En otra realización, la presente invención se refiere a métodos de prevención o tratamiento de trombosis en un paciente que se encuentra en un estado de hipercoagulación, que comprenden administrar al paciente un anticuerpo anti-IL-6, tal como Abl o un fragmento o variante del mismo, mediante lo cual se mejora el perfil de coagulación del paciente o se restablece a un estado normal y, opcionalmente controlar al paciente para evaluar el perfil de coagulación.
En otro aspecto de la invención se proporcionan nuevas composiciones farmacéuticas y su uso en terapias de combinación novedosas y que comprenden la administración de un anticuerpo anti-IL-6, tal como Abl o un fragmento o variante del mismo y al menos otro compuesto terapéutico como una estatina, un anticoagulante, antiemético, agente antináuseas, anticaquexia, un agente quimioterapéutico, un agente anticitocina, etc.
La pérdida de peso, la fatiga y la debilidad muscular son síntomas muy comunes en pacientes con formas avanzadas de cáncer y estos síntomas pueden empeorar a medida que el cáncer avanza. La fatiga, la pérdida de peso y la debilidad muscular pueden tener efectos negativos considerables en la recuperación de pacientes con formas avanzadas de cáncer, por ejemplo, alterando estilos de vida y relaciones y afectando la voluntad o la capacidad de los. pacientes de continuar tratamientos contra el cáncer. Los métodos conocidos para ocuparse de la fatiga, la pérdida de peso y la debilidad muscular incluyen rutinas regulares de entrenamiento y ejercicio, métodos para conservar la energía de los pacientes y tratamientos que abordan la fatiga y la debilidad muscular inducidas por anemia. Sin embargo, sigue habiendo una necesidad en la técnica de métodos y/o tratamientos para mejorar la fatiga, la pérdida de peso y la debilidad muscular en pacientes con cáncer.
La trombosis es una causa significativa de mortalidad en pacientes con cáncer. Bick, N Engl J Med 349:109-111 (2003). A modo de ejemplo, los eventos trombóticos graves y potencialmente letales ocurren en, aproximadamente, un 6% de los pacientes con cáncer de pulmón. Alguire et al., J Clin Oncol 2004 Vol 22 (Suplemento del 15 de julio) No. 14S: 8082. Los pacientes con cáncer a menudo presentan hipercoagulación, donde el sistema de coagulación tiene una mayor tendencia a la coagulación. Rickles y Edwards, Blood 62:14-31 (1983). Los marcadores de hipercoagulación tienen correlación con 1 malos resultados para los pacientes en al menos algunos cánceres. Bick, Semin Thromb Hemostat 18:353-372 (1992); Buccheri et al., Cáncer 97:3044-3052 (2003); Woj tukiewicz, Blood Coagul Fibrinolysis 3:429-437 (1992). Las causas de hipercoagulación incluyen el cáncer en sí mismo y los tratamientos del cáncer (por ejemplo, quimioterapia) . La hipercoagulación da' como resultado un mayor riesgo de eventos trombóticos, lo cual se puede exacerbar adicionalmente cuando los pacientes quedan postrados. En los casos en que no estaba contraindicado, la terapia anticoagulante confirió beneficios de supervivencia en algunos cánceres. Lebeau et al., Cáncer 74:38-45 (1994); Chahinian et al., J Clin Oncol 7:993-1002 (1989). No obstante, las opciones terapéuticas a menudo son limitadas debido a que muchos pacientes con cáncer tienen un riesgo elevado de hemorragia importante, lo que impide la administración de anticoagulantes que, de otra forma, se suministraría a modo de profilaxis para reducir el riesgo de trombosis. En resumen, los métodos disponibles para la prevención de la trombosis en pacientes con cáncer no son satisfactorios y, por consiguiente, existe la necesidad de nuevas terapias. Tales terapias mejorarían la supervivencia de pacientes con cáncer y darían una mejora calidad de vida.
La trombosis también puede ser una causa significativa de eventos adversos y mortalidad en otros grupos de paciente, incluyendo aquellos con enfermedades crónicas o inflamación crónica, pacientes quirúrgicos, personas postradas y pacientes ortopédicos. En los casos en que no están contraindicados de otra forma, los métodos preventivos incluyen la compresión de la pantorrilla y anticoagulantes (por ejemplo, heparina de bajo peso molecular) . Estos métodos preventivos pueden reducir, pero no eliminar, el riesgo de trombosis. Debido a que tales métodos preventivos no siempre son eficaces y están contraindicados en algunos pacientes y debido también a que los anticoagulantes pueden provocar efectos secundarios potencialmente letales, como hemorragia mayor, se necesitan métodos alternativos para prevenir la trombosis en estos pacientes. Tales métodos deberían mejorar los resultados de los pacientes.
La interleucina-ß (en lo sucesivo "IL-ß") (también conocida como interferón- 2, factor de diferenciación de linfocitos B, factor estimulador-2 de linfocitos B, factor estimulador de hepatocitos, factor de crecimiento del hibridoma y factor de crecimiento de plasmacitoma) es una citocina multifuncional involucrada en numerosos procesos biológicos, tales como la regulación de la respuesta inflamatoria aguda, la modulación de respuestas inmunológicas específicas, incluyendo la diferenciación de linfocitos B y T, el metabolismo óseo, la trombopoyesis , la proliferación epidérmica, el menstruo, la diferenciación de células neuronales, la neuroprotección, el envejecimiento, el cáncer y la reacción inflamatoria que ocurre en la enfermedad de Alzheimer. Véase A. Papassotiropoulos et al, Neurobiology of Aging, 22:863-871 (2001).
La IL-6 es un miembro de una familia de citocinas que promueven las respuestas celulares a través de un complejo de receptores que consiste en al menos una subunidad de la glicoproteína transductora de señales gpl30 y el receptor de IL-6 ("IL-6R") (también conocido como gp80). La IL-6R también puede estar presente en una forma soluble ("sIL-6R") . La IL-6 se une a la IL-6R, que luego dimeriza el receptor transductor de señales gpl30. Véase Jones, SA, J. Immunology, 175:3463-3468 (2005) .
En los seres humanos, el gen que codifica la IL-6 se organiza en cinco exones y cuatro intrones y mapea el brazo corto del cromosoma 7 en 7p21. La traducción del ARN de IL-6 y el procesamiento postraduccional da como resultado la formación de una proteina de 21 a 28 kDa con 184 aminoácidos en su: forma madura. Véase A. Papassotiropoulos, et al, Neurobiology of Aging, 22:863-871 (2001).
Como se expresa con mayor detalle en la presente, se cree que la IL-6 tiene un papel importante en el desarrollo de una multitud de enfermedades y trastornos que incluyen pero no se limitan a fatiga, caquexia, enfermedades autoinmunes, enfermedades del sistema óseo, cáncer, enfermedades coronarias, obesidad, diabetes, asma, enfermedad de Alzheimer y esclerosis múltiple. Debido a la participación percibida de la IL-6 en una gran variedad de enfermedades y trastornos, persiste la necesidad en la técnica de composiciones y métodos útiles para prevenir o tratar enfermedades asociadas con la IL-6, asi como métodos de análisis para identificar pacientes con enfermedades o trastornos asociados con la IL-6. Las composiciones anti-IL-6 particularmente preferidas son aquellas que poseen reacciones adversas mínimas o reducidas al mínimo cuando se administran al paciente. Las composiciones o los métodos que reducen o inhiben las enfermedades o trastornos asociados con la IL-6 son beneficiosos para el paciente que los necesita.
La función de la IL-6 no está restringida a la respuesta inmunológica, ya que actúa en la hematopoyesis, la trombopoyesis, la formación de osteoclastos y la provocación de respuesta hepática de fase aguda, lo que da como resultado el aumento de la proteina C-reactiva (CRP) y la proteina amiloide A sérica (SAA) . Se sabe que es un factor de crecimiento para los queratinocitos epidérmicos, las células mesangiales renales y las células de mieloma y plasmacitoma (Grossman et al., 1989 Prot Nati Acad Sci., 86, (16) 6367-6371; Horii et al., 1989, J Immunol, 143, 12, 3949-3955; Kawano et al., 1988, Nature 332, 6159, 83-85) . La IL-6 es producida por una gran variedad de tipos de células, incluyendo los monocitos/macrófagos, los fibroblastos, los queratinocitos epidérmicos, las células endoteliales vasculares, las células mesangiales renales, las células gliales, los condrocitos, los linfocitos T y B y algunas células tumorales (Akira et al, 1990, FASEB J. , 4, 11, 2860-2867). Salvo las células tumorales que producen constitutivamente la IL-6, las células normales no expresan la IL-6 a menos que se estimulen de manera adecuada.
Se han observado niveles elevados de IL-6 en diversos tipos de cáncer que incluyen cáncer de mama, leucemia, •cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, linfoma, cáncer de pulmón, carcinoma de células renales, ; cáncer colorrectal y mieloma múltiple (por ejemplo, Chopra et al., 2004, MJAFI 60:45-49; Songur et al., 2004, Tumori 90:196-200; Blay et al., 1992, Cáncer Research 52:3317-3322; Nikiteas et al., 2005, World J. Gasterenterol . 11:1639-1643; analizado en Heikkila et al., 2008, Eur J Cáncer, 44:937-945). Cómo se describió anteriormente, se sabe o se sospecha que la IL-6 tiene un papel importante en la promoción de la proliferación o la supervivencia de al menos algunos tipos de cáncer. Asimismo, algunos de estos estudios han demostrado correlación entre los niveles de IL-6 y la evolución del paciente. En su conjunto, estos resultados sugieren la posibilidad de que la inhibición de la IL-6 puede ser beneficiosa desde el punto de vista terapéutico. De hecho, estudios clínicos (analizados en Trikha et al., 2003, Clinical Cáncer Research 9:4653-4665) han mostrado alguna mejoría en la evolución de los pacientes debido a la administración de diversos anticuerpos anti-IL-6, particularmente, en aquellos cánceres en los que la IL-ß· tiene una incidencia directa al promover la proliferación o supervivencia de células cancerígenas.
Como se describió anteriormente, la IL-6 estimula la respuesta hepática de fase aguda, lo que da como resultado un aumento en la producción de CRP y niveles elevados de CRP en suero. Por esta razón, se ha informado que la proteína C-reactiva (CRP) comprende un marcador sustituto de la actividad de la IL-6. Por consiguiente, es posible detectar la actividad elevada de la IL-6 mediante la medición de la CRP en suero. Por el contrario, es posible detectar la supresión eficaz, de la actividad de la IL-6, por ejemplo, mediante la administración de un anticuerpo anti-IL-6 neutralizante, mediante la disminución resultante de los niveles de CRP en suero.
Un reciente estudio clínico demostró que la administración de rosuvastatina a individuos aparentemente sanos que poseen CRP elevada (mayor a 2.0 mg/1) redujo sus niveles de CRP en un 37% y disminuyó considerablemente la incidencia de infarto de miocardio, apoplejía, revascularización arterial, hospitalización debido a angina inestable o muerte por causas cardiovasculares. Ridker et al., N Engl J Med. 9 de noviembre de 2008 [Publicación electrónica antes de su impresión] .
Además de su incidencia directa en la patogénesis de algunos cánceres y otras enfermedades, los niveles de IL-6 elevados de manera crónica parecen afectar desfavorablemente el bienestar y la calidad de vida de los pacientes. Por ejemplo, se ha informado que los niveles elevados de IL-6 están asociados con caquexia, fiebre y disminución de la albúmina en suero. Gauldie et al., 1987, PNAS 84:7251-7253; Heinric et al., 1990, 265:621-636; Zamir et al., 1993, Metabolism 42:204-208; Zamir et al., 1992, Arch Surg, 127:170-174. Se ha informado que la inhibición de la IL-6 mediante un anticuerpo neutralizante mitiga la fiebre y la caquexia en pacientes con cáncer, aunque no se ha informado la mejora del nivel de albúmina en suero de estos pacientes (Emille et al., 1994, Blood, 84:2472-2479; Blay et al., 1992, Cáncer Research 52:3317-3322; Bataille et al., 1995, Blood, 86: 685-691) .
Numerosos estudios han sugerido que la CRP es un valioso factor de pronóstico en pacientes con cáncer y los niveles elevados de CRP predicen un mal resultado clínico. Véase, por ejemplo, Hefler et al, Clin Cáncer Res, 1° de febrero de 2008;14 (3) :710-4; Nagaoka et al, Liver Int, 27 de octubre de 2007 (8) : 1091-7; Heikkilá et al, J Epidemiol Community Health, septiembre de 2007 ; 61 ( 9) : 824-33, Review; Hará et al, Anticancer Res, 27 de julio-agosto de 2007 (4C) : 3001- ; Polterauer et al, Gynecol Oncol, octubre de 2007 ; 107 ( 1 ): 114-7 , publicación electrónica del 6 de julio de 2007; Tingstedt et al, Scand J Gastroenterol, junio de 2007 ; 42 ( 6) : 754-9; Suh et al, Support Care Cáncer, junio de 2007; 15 ( 6) : 613-20 , publicación electrónica del 18 de enero de 2007; Gerhardt et al, World J Gastroenterol, 14 de septiembre de 2006 ; 12 ( 34 ): 5495-500 ; McArdle et al, Urol Int, 2006; 77 (2) : 127-9; Guillem et al, Dis Esophagus, 2005; 18 (3) : 146-50; Brown et al, Cáncer, 15 de enero de 2005; 103 (2) : 377-82. La disminución de la albúmina en suero (hipoalbuminemia) también está asociada con el aumento de la morbilidad y la mortalidad en diversas enfermedades graves, incluyendo cánceres (por ejemplo, Vigano et al., Arch Intern Med, 27 de marzo de 2000; 160 ( 6) : 861-8 ; Hauser et al., Support Care Cáncer, octubre de 2006; 14 (10) : 999-1011; Seve et ! al., Cáncer, 1° de diciembre de 2006; 107 (11) : 2698-705) . El vinculo aparente entre la hipoalbuminemia y el mal resultado clínico del paciente puede sugerir que la restauración de los niveles de albúmina mediante la infusión directa de albúmina podría promover la supervivencia de los pacientes, no obstante, la infusión de albúmina por sí sola no ha mejorado la supervivencia de pacientes con cáncer avanzado ( Demirkazik et al., Proc Am Soc Clin Oncol 21: 2002 (resurtí. 2892)) u otros grupos de pacientes gravemente enfermos (analizado en Wilkes et al., Ann Intern Med, 7 de agosto de 2001; 135 ( 3 ) : 1 9-64 ) .
La Glasgow Prognostic Score [Escala de Pronóstico de Glasgow] (GPS) es una escala de pronóstico basada en la inflamación que combina niveles de albúmina (< 35 mg/L = 1 punto) y CRP (> 10 mg/L = 1 punto) (Forrest et al., Br J Cáncer, 4 de mayo de 2004 ; 90 ( 9) : 1704-6) . Desde su introducción en 2004, ya se ha demostrado que la escala de pronóstico de Glasgow posee valor pronóstico como un indicador de la mortalidad en numerosos cánceres, incluyendo cáncer gastro-esofágico, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer broncogénico y cáncer renal metastático (Forrest et al., Br J Cáncer, 4 de mayo de 2004; 90 (9) : 1704-6; Sharma et al., Clin Colorectal Cáncer, septiembre de 2008; 7(5): 331-7; Sharma et al., Eur J Cáncer, enero de 2008; 44(2):251-6; McMillan et al., Nutr Cáncer, 2001;41 (1-2) : 64-9; McMillan, Proc Nutr Soc, agosto de 2008; 67 ( 3 ) : 257-62 Ramsey et al., Cáncer, 15 de enero de 2007;109 (2) :205-12) .
La publicación de la solicitud de patente de EUA No. 20080081041 (relacionada con el tratamiento del cáncer utilizando un anticuerpo anti-IL-6) describe que, debido a que la IL-6 está asociada con la actividad de la enfermedad y dado que CRP es un marcador sustituto de la actividad de la IL-6, se puede suponer que la supresión sostenida de CRP mediante la neutralización de la IL-6 a través de su anticuerpo anti-IL-6 (CNTO 328, Zaki et al., Int J Cáncer, 10 de septiembre de 2004; 111 ( ) : 592-5 ) es necesaria para lograr actividad biológica. La misma solicitud de patente indica que la relación entre la IL-6 y CRP en pacientes con enfermedad de próstata benigna y maligna fue examinada previamente por McArdle (McArdle et al. 2004 Br J Cáncer 91 (10) : 1755-1757 ) . Se estima que McArdle no encontró diferencias considerables entre las concentraciones de IL-6 y CRP en los pacientes con enfermedad benigna en comparación con los pacientes con cáncer de próstata; en los pacientes con cáncer hubo un aumento considerable tanto en la concentración de IL-6 como en la de CRP con grado creciente de tumor. El valor medio de CRP en suero para los 86 sujetos con cáncer de próstata fue de 1.8 mg/L. Basándose en esto, los inventores de la solicitud de patente mencionada con anterioridad postulan una dosis y un cronograma propuestos donde se administran 6 mg/kg de un anticuerpo anti-IL-6 (CNTO 328) cada 2 semanas y afirman que de esta forma probablemente se alcance la supresión sostenida de CRP en sujetos con HRPC metastático.
La señalización de la IL-6 está mediada por la familia Jak-Tyk de tirosina cinasas citoplasmáticas, incluyendo JAK1, JAK2 y JAK3 (analizado en Murray J Immunol. 1° de marzo de 2007; 178 (5) : 2623-9) . Sivash et al. informan la abrogación de la señalización JAK mediada por IL-6 por la prostaglandina ciclopentenona 15d-PGJ2 en los carcinomas de células escamosas orales. British Journal of Cáncer (2004) 91, 1074-1080. , Estos resultados sugieren que los inhibidores de JAK1, JAK2 o JAK3 podrían emplearse como antagonistas de IL-6.
Ulanova et al. informan que la inhibición de la proteína tirosina cinasa no receptora Syk (usando ARNsi) disminuyó la producción de IL-6 por parte de las células epiteliales. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol marzo de 2005; 288 ( 3 ): L497-507. Estos resultados sugieren que se podría emplear un inhibidor de Syk como un antagonista de IL-6.
Kedar et al. informan que el tratamiento con talidomida reduce considerablemente los niveles de CRP e IL-6 en suero hasta niveles normales o casi normales en una parte importante de los pacientes con carcinoma de células renales. Int J Cáncer. 10 de junio de 2004; 110 ( 2 ) : 260-5. Estos resultados sugieren que la talidomida y posiblemente los derivados ele la misma, tales como lenalidomida, podrían ser útiles antagonistas de IL-6.
Asimismo, otra solicitud de patente publicada, EUA 20070292420 enseña un estudio de dosis escalada de Fase I usando un anticuerpo anti-IL-6 (cCLB-8) para tratar pacientes refractarios con mieloma múltiple en etapa avanzada (N=12) e indica que este estudio demuestra que algunos pacientes presentaron una estabilización en su enfermedad. La solicitud también informa que luego de la interrupción del tratamiento se produjo una aceleración en el incremento de los niveles de proteina M, lo que sugiere un rebote de la enfermedad luego del cese del tratamiento. El anticuerpo anti-IL-6 cCLB-8 inhibió la IL-6 que circula libremente.
La solicitud también indica que en este ensayo de anticuerpos no se observaron reacciones tóxicas (excepto trombocitopenia transitoria en dos pacientes previamente tratados de forma intensiva) o alérgicas y se disminuyó la proteina C-reactiva (CRP) por debajo del nivel de detección en todos los pacientes. Su anticuerpo (anticuerpo cCLB-8) supuestamente poseía una semivida circulante de 17.8 días y no se observó ninguna respuesta inmunológica al anticuerpo humano anti-quimérico (HACA) (van Zaanen et al. 1998). 1998). Ellos afirman que la administración de CNTO 328 no provocó cambios en la presión sanguínea, las pulsaciones, la temperatura, la hemoglobina, las funciones hepáticas y las funciones renales. Salvo por la trombocitopenia transitoria en dos pacientes previamente tratados de forma intensiva, no se observaron supuestamente reacciones tóxicas o alérgicas y no se observó respuesta inmunológica alguna al anticuerpo humano antiquimérico (HACA) . Tres pacientes en su estudio supuestamente desarrollaron complicaciones relacionadas con la infección durante la terapia, no obstante, los inventores concluyeron que no era probable una posible relación con el anticuerpo anti-IL-6 cCLB-8 debido a que las complicaciones infecciosas son supuestamente comunes en el mieloma múltiple en etapa final y son una causa principal de muerte. Basándose en sus resultados, concluyeron que este anticuerpo anti-IL-6 cCLB-8 era seguro en los pacientes con mieloma múltiple.
Algunos de los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente también se describieron en las siguientes solicitudes de patente publicadas y no publicadas, las cuales son de propiedad conjunta de la cesionaria de la presente solicitud: EUA 2009/0028784, WO 2008/144763, No. de serie EUA 12/391,717 presentada el 24 de febrero de 2009 (No. de expediente del representante 67858.702201) y No. de serie de EUA 12/3é6,567 presentada el 5 de febrero de 2009 (No. de expediente del representante 67858.702101).
Otros anticuerpos anti-IL-6 se describieron en, las siguientes patentes y solicitudes de patente publicadas de EUA: 7,482,436; 7,291,721; 6,121,423; 2008/0075726; 2007/0178098; 2007/0154481; 2006/0257407 y 2006/0188502. ' Como se expresó anteriormente, la IL-6 elevada se implicó en la patogénesis de la caquexia, el debilidad, la fatiga y la fiebre. Las enfermedades y los trastornos asociados con la fatiga incluyen, pero no se limitan a, fatiga general, fatiga inducida por estrés, fatiga inducida por ejercicio, fatiga relacionada con cáncer, fatiga relacionada con enfermedad inflamatoria y síndrome de fatiga crónica. Véase, por ejemplo, Esper DH, et al, The cáncer cachexia syndrome: a review of metabolic and clinical manifestations, Nutr Clin Pract., agosto de 2005;20 (4) :369-76; Vgontzas AN, et al, IL-6 and its circadian secretion in humans, Neuroimmunomodulation, 2005/12 (3) .-131-40; Robson-Ansley, PJ, et al, Acute interleukin-6 administration impairs athletic performance in healthy, trained male runners, Can J Appl Physiol., agosto de 2004;29 (4) : 11-8; Shephard RJ., Cytokine responses to physical activity, with particular reference to IL-6: sources, actions, and clinical implications , Crit Rev Immunol . , 2002 22 (3) : 165-82; Arnold, MC, et al, Using an interleukin-6 challenge to evalúate neuropsychological performance in chronic fatigue syndrome, Psychol Med., agosto de 2002; 32 ( 6) : 1075-89; Kurzrock R. , The role of cytokines in cancer-related fatigue, Cáncer, 15 de septiembre de 2001/92(6 Suppl) : 1684-8 ; Nishimoto N, et al, Improvement in Castleman' s disease by humanized ;anti-interleukin-6 receptor antibody therapy, Blood, Io de enero de 2000; 95 (1) : 56-61; Vgontzas AN, et al, Circadian interleukin-6 secretion and quantity and depth of sleep, J Clin Endocrinol Metab., agosto de 1999; 84(8):2603-7 y Spath-Schwalbe E, et al, Acute effects of recombinant human interleukin 6 on endocrine and central nervous sleep functions in healthy men, J Clin Endocrinol Metab., mayo de 1998; 83 (5) : 1573-9, cuyas descripciones se incorporan en su totalidad a la presente a modo de referencia.
Las enfermedades y los trastornos asociados con la caquexia incluyen, pero no se limitan a, caquexia cancerosa, caquexia cardíaca, caquexia respiratoria, caquexia renal y caquexia relacionada con la edad. Véase, por ejemplo, Barton, BE., Interleukin-ß and new strategies for the treatment of cáncer, hyperproliferative diseases and paraneoplastic syndromes, Expert Opin Ther Targets, agosto de 2005; 9(4):737-52; Zaki MH, et al, CNTO 328, a monoclonal antibody to IL-6, inhibits human tumor-induced cachexia in nude mice, Int J Cáncer, 10 de septiembre de 2004; 111 (4 ): 592-5; Trikha .M, et al, Targeted anti-interleukin-6 monoclonal antibody therapy for cáncer: a review of the rationale and clinical evidence Clin Cáncer Res., 15 de octubre de 2003; 9 (13) .-4653-65; LellüG, et al, Treatment of the cáncer anorexia-cachexia syndrome: a critical reappraisal, J Chemother., junio de 2003; 15(3):220-5; Argües JM, et al, Cytokines in the pathogenesis of cáncer cachexia, Curr Opin Clin Nutr Metab Care, julio de 2003; 6(4):401-6; Barton BE., IL-6-like cytokines and cáncer cachexia: consequences of chronic inflammation, Immunol ; Res . , 2001/23(1) :41-58; Yamashita JI, et al, Medroxyprogesterone acétate and cáncer cachexia: interleukin-6 involvement , Breast Cáncer, 2000; 7 (2) .-130-5; Yeh SS, et al, Geriatric cachexia: the role of cytokines, Am J Clin Nutr., agosto de 1999; 70(2): 183-97; Strassmann G, et al, Inhibition of experimental cáncer cachexia by anti-cytokine and anti-cytokine-receptor therapy, Cytokines Mol Ther., junio de 1995; 1(2): 107-13; Fujita J, et al, Anti-interleukin-6 receptor antibody prevents rauscle atrophy in colon-26 adenocarcinoma-bearing mice with modulation of lysosomal and ATP-ubiquitin-dependent proteolytic pathways, Int J Cáncer, 27 de noviembre 1996; 68 (5) : 637-43; Tsujinaka T, et al, Interleukin 6 receptor antibody inhibits muscle atrophy and modulates proteolytic systems in interleukin 6 transgenic mice, J Clin Invest., 1° de enero de 1996; 97 (1) : 244-9; Emilie D, et al, Administration of an anti-interleukin-6 monoclonal antibody to patients with acquired immunodeficiency syndrome and lymphoma: effect on lymphoma growth and on B clinical Symptoms, Blood, 15 de octubre de 1994 ; 84 (8):2472-9'; and Strassmann G, et al, Evidence for the involvement of interleukin 6 in experimental cáncer cachexia, J Clin Invest., mayo de 1992; 89 ( 5) : 1681-4 ; cuyas descripciones se incorporan en su totalidad a la presente como referencia.
Otra enfermedad relacionada con la caquexia es el síndrome del declive, también conocido como retraso del crecimiento, donde un niño presenta una tasa de aumento de peso menor a la esperada. El síndrome del declive se define típicamente como un peso inferior al tercer percentil o una disminución en el rango de percentil de 2 parámetros de crecimiento principales en un período acotado. El síndrome del declive se produce como resultado de causas psicosociales y médicas heterogéneas y, algunas veces, la causa elude el diagnóstico. Un estudio reciente (con un total de 34 pacientes) indicó un crecimiento considerable desde el punto de vista estadístico en los niveles de IL-6 en pacientes diagnosticados con síndrome del declive. Shaoul et al. J Pediatr Gastroenterol Nutr., octubre de 2003;37 (4) : 87-91. ! BREVE COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención es una extensión de la invención anterior de los solicitantes dirigida a anticuerpos específicos, anticuerpos humanizados, quiméricos o de cadena simple y fragmentos y variantes de los mismos que poseen especificidad de unión para la IL-6, en particular, anticuerpos que poseen especificidad epitópica específica y/o propiedades funcionales y terapias novedosas que utilizan estos y : otros anticuerpos anti-IL-6. Una modalidad de la invención comprende anticuerpos humanizados específicos y fragmentos y variantes de los mismos que pueden unirse a la IL-6 y/o al complejo IL-6/IL-6R. Estos anticuerpos pueden unir la IL-6 soluble o IL-6 expresada en la superficie celular. Asimismo, estos anticuerpos pueden inhibir la formación o los efectos biológicos de ¦ una o más de IL-6, complejos IL-6/IL-6R, complejos IL-6/IL-6R/gpl30 y/o multimeros de IL-6/IL-6R/gpl30. La presente invención se relaciona con terapias y protocolos terapéuticos novedosos que utilizan anticuerpos anti-IL-6, preferentemente, aquellos descritos en la presente. En particular, la presente invención se refiere a métodos para prevenir o tratar la trombosis en un paciente que lo necesite, por ejemplo, un paciente que presente niveles elevados de dimero-D y/o CRP antes del tratamiento, que comprenden administrar a un paciente un antagonista de IL-6, como los identificados anteriormente, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-6 (como Abl) o un fragmento o variante de anticuerpo del mismo, mediante lo cual se mejora o se restablece el perfil de coagulación del paciente hasta un estado normal. En algunas modalidades, estos métodos también pueden incluir la administración de otros activos tales como estatinas que pueden ayudar adicionalmente (sinergizar) con el antagonista de IL-6, como Abl y, de ese modo, tratar o prevenir de manera más eficaz la trombosis. : La presente invención también se relaciona con métodos para mejorar la capacidad de supervivencia o la calidad de vida de un paciente que lo necesite, por ejemplo, un paciente que muestre niveles elevados de CRP y/o niveles disminuidos de albúmina, que comprenden administrar al paciente un antagonista de IL-6, tal como aquellos que se identifican más adelante, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-6 (por ejemplo, Abl) : o un fragmento o una variante de anticuerpo del mismo, mediante lo cual se disminuye el nivel de proteina C-reactiva ("CRP") y/o se aumenta el nivel de albúmina del paciente. En algunas modalidades, estos métodos también pueden incluir la administración de otros activos tales como estatinas que pueden ayudar adicionalmente (sinergizar) con el antagonista de IL-6, como Abl y, de ese modo, tratar de manera más eficaz al paciente.
Otra modalidad de la invención se relaciona con Abl, incluyendo las formas de ratón y humanizadas del mismo, asi como las cadenas pesadas, las cadenas ligeras, los fragmentos, las variantes y las CDR del mismo. En los datos de los estudios clínicos presentados, se administra una forma humanizada de Abl.
En una modalidad preferida, esto se lleva a cabo mediante la administración de los anticuerpos descritos en la presente, que comprenden las secuencias de los polipéptidos de VH, VL y CDR descritas en la presente o versiones humanizadas, quiméricas o de cadena simple de los mismos que contienen ;una o más de las CDR de las secuencias de anticuerpo anti-IL-6 ejemplificadas y las secuencias de anticuerpos y los polinucleótidos que los codifican. Preferentemente, ;estos anticuerpos serán aglicosilados. En modalidades más específicas de la invención, estos anticuerpos bloquearán la activación de gpl30 y/o poseerán afinidades de unión (Kds) menores 'a 50 picomolar y/o valores Koff menores o iguales a 10"4 S"1.
En otra modalidad de la invención, estos anticuerpos y versiones humanizadas se derivarán de células inmunes de conejo (linfocitos B) y se pueden seleccionar basándose en su homología (identidad de secuencia) con las secuencias de línea germinal humana. Estos anticuerpos pueden necesitar modificaciones mínimas de secuencias o pueden no necesitar modificación alguna, por lo cual se facilita la retención de propiedades funcionales luego de la humanización. En ejemplos de modalidades, estos anticuerpos humanizados comprenderán regiones flanqueantes humanas altamente homologas (poseen altos niveles de identidad de secuencia) a aquellas de un anticuerpo progenitor (por ejemplo, conejo), como se describe más adelante.
En otra modalidad de la invención, los anticuerpos objeto de la presente pueden seleccionarse según su actividad en ensayos funcionales, tales como ensayos de proliferación de T1165 conducidos por IL-6, ensayos de producción de haptoglobina de células HepG2 simulada por IL-6 y similares. Una modalidad adicional de la invención está dirigida a fragmentos de anticuerpos anti-IL-6 que comprenden polipéptidos de VH, VL y CDR o variantes o fragmentos de los mismos, por ejemplo, derivados de células inmunes de conejo y los polinucleótidos que los codifican, así como también al uso de estos fragmentos de anticuerpos y los polinucleótidos que los codifican en la creación de nuevos anticuerpos y composiciones de polipéptidos que pueden reconocer complejos IL-6 y/o IL-6/IL-6R o complejos IL-6/IL-6R/gpl30 y/o multímeros de los mismos .
La invención también contempla la administración de conjugados de anticuerpos anti-IL-6 y versiones humanizadas, quiméricas o de cadena simple de los mismos y otros fragmentos de unión y variantes de los mismos conjugados con uno o más restos funcionales o detectables. La invención también contempla métodos para realizar dichos anticuerpos anti-IL-6 humanizados o anticuerpos de complejo anti-IL-6/IL-6R y fragmentos de unión y variantes de los mismos. En una modalidad, los fragmentos de unión incluyen pero no se limitan a fragmentos Fab, Fab', F(ab' )2, Fv y scFv.
Las modalidades de la invención se relacionan con el uso de anticuerpos anti-IL-6 para' el diagnóstico, la evaluación y el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con la IL-6 o la expresión aberrante de la misma. La invención también contempla el uso de fragmentos o variantes de anticuerpos : anti-IL-6 para el diagnóstico, la evaluación y el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con la IL-6 o la expresión aberrante de la misma. Los usos preferidos de los anticuerpos objeto de la presente, especialmente anticuerpos humanizados, quiméricos y de cadena simple son el tratamiento y la prevención de la fatiga asociada con cáncer y/o caquexia y artritis reumatoide.
Otras modalidades de la invención se relacionan con la producción de anticuerpos anti-IL-6 en células hospedadoras recombinantes , preferentemente levadura diploide, tal como Pichia diploide y otras cepas de levadura.
Otra modalidad de la invención se relaciona con métodos para mejorar la capacidad de supervivencia y la calidad de vida de un paciente al que se le diagnosticó cáncer, que comprenden administrar al paciente un anticuerpo anti-IL-6 o un fragmento o una variante del mismo, mediante lo cual se estabiliza y, preferentemente, se disminuye el nivel de proteína C-reactiva ("CRP") en suero del paciente y controlar al paciente para evaluar la reducción en el nivel de CRP en suero del paciente, donde el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante del mismo puede unirse específicamente al mismo a los mismos epítopos lineales o conformacionales y/o competir para unirse al mismo o a los mismos epítopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 intacta humana o un fragmento [o una variante del mismo, como un anticuerpo anti-IL-6 que comprende Abl y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos del mismo (que contienen una o más CDR de los anticuerpos mencionados anteriormente) que se unen específicamente a IL-6, que preferentemente son aglicosilados .
Otra modalidad de la invención se relaciona con métodos para mejorar la fuerza muscular de un paciente al que se le diagnosticó cáncer, que comprenden administrar al paciente un anticuerpo anti-IL-6 o un fragmento o una variante del mismo, mediante lo cual se mejora la fuerza muscular del paciente y controlar al paciente para evaluar la fuerza muscular, donde el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante del ' mismo puede unirse específicamente al mismo o a los mismos epítopos lineales o conformacionales y/o competir para unirse al mismo o a los mismos epítopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 intacta humana o un fragmento del mismo, como un anticuerpo anti-IL-6 que comprende Abl y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos del mismo (que contienen una o más CDR de los anticuerpos mencionados anteriormente) que se unen específicamente a IL-6, que preferentemente son aglicosilados . En tales métodos se mejora preferentemente la fuerza muscular del paciente en al menos alrededor de un 15% en un período de aproximadamente 4 semanas a partir de la administración del anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante del mismo, como lo mide la prueba Hand Grip Strength [de fuerza de prensión] y, más preferentemente, la fuerza muscular de los pacientes mejora en al menos alrededor de un 20% en un período de aproximadamente 4 semanas a partir de administración del anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo, como lo mide la prueba de fuerza de presión. ' Otra modalidad de la invención se relaciona con métodos para aumentar la albúmina en suero de un paciente que lo necesite, los cuales comprenden administrar al paciente un anticuerpo anti-IL-6 o un fragmento o una variante de anticuerpo del mismo, mediante lo cual se mejora el nivel de albúmina en suero del paciente y controlar al paciente para evaluar el nivel de albúmina en suero, donde el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo pueden unirse específicamente al mismo o a los mismos epítopos lineales o conformacionales y/o competir para unirse al mismo o a los mismos epítopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 intacta humana o un fragmento o variante de anticuerpo del mismo, como un anticuerpo anti-IL-6 que comprende Abl y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos del mismo (que contienen una o más CDR de los anticuerpos mencionados anteriormente) que se unen específicamente a IL-6, que preferentemente son aglicosiíados . Preferentemente, estos métodos se llevan a cabo en condiciones mediante las que se mejora la capacidad de supervivencia del paciente y/o en condiciones donde se aumenta el nivel de albúmina en suero en alrededor de 5-10 g/L, preferentemente 7-8 g/L, en aproximadamente 6 semanas a partir de la administración del anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo. Estos pacientes incluirán, a modo no taxativo, aquellos a los que se les diagnosticó artritis reumatoide, cáncer, cáncer avanzado, enfermedad hepática, enfermedad renal, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad celiaca, traumatismotismo, quemaduras, otras enfermedades asociadas con la disminución de la albúmina en suero o cualquier combinación de las mismas.
En una modalidad de la invención, al paciente ; puede habérsele diagnosticado artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, psoriasis, artropatia psoriática, espondilitis anquilosante, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, pénfigo, dermatomiositis , polimiositis , polimialgia reumática, arteritis de células gigantes, vasculitis, poliarteritis nodosa, granulomatosis de egener, enfermedad de Kawasaki, vasculitis aislada del sistema nervioso central, arteritis de Churg-Strauss, poliarteritis microscópica, poliangiitis microscópica, púrpura de Henoch-Schonlein, vasculitis crioglobulinémica esencial, vasculitis reumatoide, crioglobulinemia, policondritis recidivante, enfermedad de Behcet, arteritis de Takayasu, enfermedad cardiaca isquémica, apoplejía, esclerosis múltiple, sepsis, vasculitis causada por infecciones virales (por ejemplo, hepatitis B, hepatitis C, VIH, citomegalovirus, virus Epstein-Barr, virus Parvo B19, etc.), enfermedad de Buerger, cáncer, cáncer avanzado, osteoartritis, esclerosis sistémica, síndrome de CREST, enfermedad de Reiter, enfermedad ósea de Paget, síndrome de Sjogran, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, fiebre mediterránea familiar, trombocito'penia autoinmune, anemia hemolitica autoinmune, enfermedad tiroidea autoinmune, anemia perniciosa, vitíligo, alopecia areata, cirrosis biliar primaria, hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis alcohólica, hepatitis viral incluyendo hepatitis B y C, otras enfermedades autoinmunes específicas de órganos, quemaduras, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma alérgico, otras afecciones alérgicas o cualquier combinación de las mismas.
En una modalidad de la invención, el paciente puede tener un nivel elevado de proteína C-reactiva (CRP) en suero antes del tratamiento.
Otra modalidad de la invención se relaciona con métodos para mejorar la capacidad de supervivencia o la calidad de vida de un paciente que lo necesita, que comprenden administrar al paciente un antagonista de IL-6, como Abl, mediante lo cual se disminuye el nivel de proteína C-reactiva ("CRP") en suero del paciente y controlar al paciente para evaluar la reducción del nivel de CRP en suero del paciente.
Otra modalidad de la invención se relaciona con métodos para mejorar la capacidad de supervivencia o la calidad dé vida de un paciente que lo necesita, que comprenden administrar al paciente un antagonista de IL-6, como Abl, mediante lo cual se aumenta el nivel de albúmina en suero del paciente y controlar al paciente para evaluar el aumento del nivel de albúmina en suero del paciente.
Otra modalidad de la invención se relaciona con métodos para mejorar la capacidad de supervivencia o la calidad de vida de un paciente que lo necesita, que comprenden administrar al paciente un antagonista de IL-6, como Abl, mediante lo cual se disminuye el nivel de CRP en suero del paciente y se aumenta el nivel de albúmina en suero del paciente y controlar al paciente para evaluar la disminución del nivel de CRP en suero del paciente y el aumento del nivel de albúmina en suero del paciente .
Otra modalidad de la invención se relaciona con métodos para prevenir o tratar la trombosis en un paciente en estado de hipercoagulación, que comprenden administrar al paciente un antagonista de IL-6, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-6 (por ejemplo, Abl) y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos de los mismos (que contienen una o más CDRs de los anticuerpos mencionados previamente) que se unen de forma especifica a la IL-6, que preferente son aglicosilados , mediante lo cual se mejora o restablece el perfil de coagulación del paciente hasta un estado normal y controlar al paciente para evaluar el perfil de coagulación. Como se expone a continuación, en un ejemplo de modalidad preferido, el anticuerpo anti-IL-6 comprenderá un anticuerpo humanizado que contiene las CDR de Abl y, más preferentemente, comprenderá la cadena ligera y pesada variable de la SEQ ID NO: 657 y SEQ ID NO: 709, respectivamente y las regiones constantes de la SEQ ID NO: 588 y 586, respectivamente o variantes de las mismas, donde uno o más aminoácidos están modificados por sustitución o deleción sin alterar la afinidad de unión a la IL-6 de forma sustancial.
En tales métodos, si el antagonista de IL-6 es un anticuerpo anti-IL-6 o un fragmento o variante de anticuerpo del mismo, preferentemente, este anticuerpo se puede unir específicamente al mismo o a los mismos epitopos lineales o conformacionales y/o competir para unirse al mismo o a los mismos epitopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 humana intacta o un fragmento del mismo, como un anticuerpo anti-IL-ß que comprende Abl y fragmentos y variantes del mismo. En los métodos de la invención para prevenir o tratar la trombosis, el perfil de coagulación del paciente se evalúa mediante la medición del nivel de uno o más de dimero-D, Factor II, Factor V, Factor VIII, Factor IX, Factor XI, Factor XII, productos de la degradación de F/fibrina, complejo trombina-antitrombina III, fibrinógeno, plasminógeno, protombina y factor de von Willebrand en suero del paciente y, preferentemente, mediante un método que incluye medir el ¡ nivel de dimero-D en suero del paciente antes de la administración del anticuerpo anti-IL-6 y administrar el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo, si el nivel de dimero-D en suero del paciente es elevado. Adicionalmente, los niveles de proteina C-reactiva del paciente se pueden evaluar antes del tratamiento y, en caso de ser elevados, esto se puede utilizar como un indicador adicional de un aumento en el riesgo de trombosis para el paciente.
Una modalidad de la invención se relaciona con métodos para tratar a un paciente que tiene una enfermedad o afección asociada con la hipercoagulación, que puede comprender administrar al paciente un antagonista de IL-6, como Abl, mediante lo cual se mejora o se restituye el perfil de coagulación del paciente hasta la normalidad y controlar al paciente para evaluar el perfil de coagulación.
En una modalidad de la invención, el paciente puede tener niveles de dimero-D en suero elevados antes del tratamiento.
En una modalidad de la invención, el paciente puede tener un nivel reducido de albúmina en suero antes del tratamiento.
En una modalidad de la invención, la Escala de Pronóstico de Glasgow (GPS) del paciente se puede mejorar después del tratamiento.
En una modalidad de la invención, el paciente puede tener un nivel de CRP en suero elevado antes del tratamiento.
En una modalidad de la invención, el método ¦ puede comprender, adicionalmente, la administración de al menos una estatina.
En una modalidad de la invención, el antagonista de IL-6 puede dirigirse a la IL-6, al receptor de IL-6 alfa, a gpl30, a la p38 MAP cinasa, a JAK1, JAK2, JAK3, SYK o a cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, el antagonista de IL-6 puede comprender un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un péptido, un glucoalcaloide, un ácido nucleico antisentido, una ribozima, un retinoide, un avemir, una molécula pequeña o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, el antagonista de IL-6 puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo- anti-IL-6R, anti-gpl30, anti-p38 MAP cinasa, anti-JAKl, anti-JAK2, anti-JAK3 o anti-SYK.
En una modalidad de la invención, el antagonista dé IL-6 puede comprender una molécula pequeña que comprende talidomida, lenalidomida o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, el antagonista puede comprender un anticuerpo anti-IL-6 (por ejemplo, Abl) o un fragmento o una variante de anticuerpo del mismo.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo se pude unir de forma especifica al mismo o a los mismos epítopos lineales o conformacionales y/o competir para unirse al mismo o a los mismos epítopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 humana intacta o un fragmento del mismo, como un anticuerpo anti-IL-6 que comprende Abl y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos del mismo (que contiene una o más CDR de los anticuerpos mencionados previamente) que se une de forma especifica a la IL-6, que preferente es aglicosilado .
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 puede unirse al mismo o a los mismos epitopos lineales o conformacionales y/o competir por unirse al mismo o a los mismos epitopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 intacta humana o un fragmento del mismo como Abl.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo se pueden unir de forma especifica al mismo o a los mismos epitopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 humana intacta o un fragmento del mismo, como un anticuerpo anti-IL-6 que comprende Abl y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos del mismo (que contiene una o más CDR de los anticuerpos mencionados previamente) que se une de forma especifica a la IL-6, que preferente es aglicosilado.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo sé usen específicamente al mismo o a los mismos epitopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 humana intacta o un fragmento del mismo como Abl. ; En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo pueden unirse específicamente a los mismos epitopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 intacta o fragmento del mismo que esté/estén específicamente unidos por Abl y, donde dicho o dichos epítopos, cuando se establecen por mapeo epitópico usando fragmentos de péptidos lineales superpuestos que abarcan toda la longitud del polipéptido de IL-6 humana nativa, incluyen uno o más residuos comprendidos en fragmentos de IL-6 que se seleccionan de aquellos que comprenden respectivamente los residuos de aminoácidos 37-51, los residuos de aminoácidos 70-84, los residuos de aminoácidos 169-183, los residuos de aminoácidos 31-45 y/o los residuos de aminoácidos 58-72.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o el anticuerpo o la variante de anticuerpo del mismo pueden comprender al menos 2 regiones determinantes de complementariedad (CDRs) en cada una de la región pesada variable y la región ligera variable que sean idénticas a las que están contenidas en un anticuerpo anti-IL-6 que comprende Abl y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos del mismo (que contiene una o más CDR de los anticuerpos previamente mencionados) que se unen de forma específica a la IL-6, que preferentemente están aglicosilado . En algunas modalidades, los anticuerpos que contienen estas CDR pueden crearse usando regiones flanqueantes humanas apropiadas basadas en los métodos de humanización descritos en la presente.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo pueden comprender al menos 2 regiones determinantes de complementariedad (CDR) en cada región ligera variable y pesada variable que sea idéntica a aquellas contenidas en Abl.
En una modalidad de la invención, todas las CDR en el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo pueden ser idénticas a las CDR que contiene un anticuerpo anti-IL-6 que comprende Abl y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos del mismo (que contienen una o más CDR de los anticuerpos antedichos) que se unen específicamente a la IL-6, que preferentemente son aglicosilados .
En una modalidad de la invención, todas las CDR en el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo pueden ser idénticas a una o más de las CDR que contiene Abl.
En un ejemplo de modalidad preferida, el anticuerpo anti-IL-6 comprenderá todas las CDR en Abl. En una modalidad más preferida, el anticuerpo anti-IL-6 comprenderá las secuencias de cadena ligera y pesada variable de la SEQ ID NO: 657 y la SEQ ID NO: 709 o variantes de las mismas.
En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-IL-6 humanizado comprenderá las secuencias de cadena ligera variable y pesada variable contenidas respectivamente en la SEQ ID NO: 657 y la SEQ ID NO: 709 y, preferentemente, comprende adicionalmente las regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada contenidas respectivamente en la SEQ ID NO: 588 y la SEQ ID NO: 586 y variantes de las mismas que comprenden una o más sustituciones o eliminaciones de aminoácidos que no afectan de forma sustancial la unión a IL- 6 y/o la función efectora deseada. Esta modalidad también contempla polinucleótidos que comprenden o alternativamente consisten en uno o más de los ácidos nucleicos que codifican las secuencias de cadena pesada variable (SEQ ID NO: 700) y de cadena ligera variable (SEQ ID NO: 723) y las secuencias de cadena pesada de región constante (SEQ ID NO: 589) y de cadena ligera de región constante (SEQ ID NO: 587). Esta modalidad contempla, adicionalmente, ácidos nucleicos que codifican variantes que comprenden una o más sustitución o eliminación de aminoácidos de las secuencias de cadena ligera variable y pesada variable contenidas, respectivamente, en la SEQ ID NO: 657 y la SEQ ID NO: 709 y las regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada contenidas respectivamente en la SEQ ID NO: 588 y la SEQ ID NO: 586, que no afectan de manera sustancial la unión a IL-6 y/o la función efectora deseada.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmentó o la variante de anticuerpo del mismo pueden estar aglicosilados .
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo pueden contener una región Fe que ha sido modificada para alterar la función efectora, la semivida, la proteólisis y/o la glicosilació . Preferentemente, la región Fe se modifica para eliminar la glicosilación.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo pueden ser un anticuerpo humano, humanizado, de cadena simple o quimérico.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo pueden ser un anticuerpo humanizado derivado de un anticuerpo anti-IL-6 de conejo (progenitor) .
En una modalidad de la invención, las regiones flanqueantes (FR) en la región ligera variable y las regiones pesadas variables de dicho anticuerpo anti-IL-6 o fragmento o variante de anticuerpo del mismo pueden ser, respectivamente, FRs humanas sin modificar o que han sido modificadas mediante la sustitución de como máximo 2 o 3 residuos de FR humana en la región de cadena pesada o ligera variable con los residuos de FR correspondientes del anticuerpo de conejo progenitor y las FR humanas se pueden haber derivado de secuencias de anticuerpo de cadena ligera y pesada variable humana que se han seleccionado de una biblioteca de secuencias de anticuerpo germinales humanas basándose en su alto nivel de homología con las correspondientes regiones de cadena ligera o pesada variable de conejo correspondientes con relación a otras secuencias de anticuerpo germinales humanas contenidas en la biblioteca. Como se describe en detalle más adelante, en una modalidad preferida, el anticuerpo comprenderá FRs humanas que se seleccionan basándose en su alto nivel de homología (grado de identidad de secuencia) con aquellas del anticuerpo principal que es humanizado.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo pueden administrarse al paciente con una frecuencia de como máximo una vez por período de aproximadamente cuatro semanas, aproximadamente ocho semanas, aproximadamente doce semanas, aproximadamente dieciséis semanas, aproximadamente veinte semanas o aproximadamente veinticuatro semanas.
En una modalidad de la invención, se puede mantener la mejora en el perfil de coagulación del paciente durante un período completo entre dos administraciones consecutivas del anticuerpo anti-IL-6.
En una modalidad de la invención, el nivel de CRP en suero del paciente puede permanecer disminuido y/o el nivel de albúmina en suero puede permanecer elevado durante todo un período entre dos administraciones consecutivas del anticuerpo anti-IL-6.
En una modalidad de la invención, se puede mantener la mejora en la caquexia, el debilidad, la fatiga y/o la fiebre del paciente durante un período completo entre dos administraciones consecutivas del anticuerpo anti-IL-6.
En una modalidad de la invención, al paciente se le pudo haber diagnosticado cáncer que se selecciona de acantoma, carcinoma de células acinicas, neuroma acústico, melanoma lentiginoso acral, acrospiroma, leucemia eosinofilica aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia megacarioblástica aguda, leucemia monocitica aguda, leucemia mieloblástica aguda con maduración, leucemia mieloide aguda de células dendriticas , leucemia mieloide aguda, leucemia promielocitica aguda, adamantinoma, adenocarcinoma, carcinoma quistico adenoide, adenoma, tumor odontogénico adenomatoide, carcinoma adrenocortical, leucemia de linfocitos T del adulto, leucemia agresiva de células NK, cánceres relacionados con SIDA, linfoma relacionado con SIDA, sarcoma alveolar de la parte blanda, fibroma ameloblástico, cáncer anal, linfoma anaplásico de células grandes, cáncer anaplásico de tiroides, linfoma angioinmunoblástico de linfocitos T, angiomiolipoma, angiosarcoma, cáncer de apéndice, astrocitoma, tumor rabdoide teratoide atipico, carcinoma de células básales, carcinoma de tipo basal, leucemia de linfocitos B, linfoma de linfocitos B, carcinoma del conducto Bellini, cáncer del tracto biliar, cáncer de vejiga, blastoma, cáncer de hueso, tumor de hueso, glioma de tronco cerebral, tumor cerebral, cáncer de ^mama, tumor de Brenner, tumor bronquial, carcinoma bronquioloalveolar, tumor de Brown, linfoma de Burkitt, cáncer de sitio primario desconocido, tumor carcinoide, carcinoma, carcinoma in situ, carcinoma de pene, carcinoma de sitio primario desconocido, carcinosarcoma, enfermedad de Castleman, tumor embrionario del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral, cáncer cervical, colangiocarcinoma, condroma, condrosarcoma, cordoma, coriocarcinoma, papiloma del plexo coroideo, leucemia linfocitica crónica, leucemia monocitica crónica, le,ucemia mielógena crónica, enfermedad mieloproliferativa crónica, leucemia neutrofilica crónica, tumor de células claras, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craniofaringioma, linfoma cutáneo de linfocitos T, enfermedad de Degos, dermatofibrosarcoma protuberans, quiste dermoide, tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, linfoma difuso de linfocitos B grandes, tumor neuroepitelial disembrioplásico, carcinoma embrionario, tumor de seno endodérmico, cáncer endometrial, cáncer uterino endometrial, tumor endometrioide, linfoma de linfocitos T asociado a enteropatia, ependimoblastoma, ependimoma, sarcoma epitelioide, eritroleucemia, cáncer de esófago, estesioneuroblastoma, tumor de la familia de Ewing, sarcoma de la familia de Ewing, sarcoma de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer de ducto biliar extrahepático, enfermedad de Paget extramamaria, cáncer de tubo falopiano, Fetus in fetu, fibroma, fibrosarcoma, linfoma folicular, cáncer folicular de tiroides, cáncer de vesícula biliar, cáncer de vesícula biliar, ganglioglioma, ganglioneuroma, cáncer gástrico, linfoma gástrico, cáncer gastrointestinal, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor carcinoide, tumor del estroma gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal, tumor de células germinales, germinoma, coriocarcinoma gestacional, tumor trofoblástico gestacional, tumor óseo de células gigantes, glioblastoma multiforme, glioma, gliomatosis cerebri, tumor glómico, glucagonoma, gonadoblastoma, tumor de células granulosas, leucemia de células vellosas, leucemia de células vellosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, hemangioblastoma, hemangiopericitoma, hemangiosarcoma, malignidad hematológica, carcinoma hepatocelular , linfoma hepatoesplénico de linfocitos T, síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario, linfoma de Hodgkin, linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, , glioma hipotalámico, cáncer de mama inflamatorio, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes, tumor de células de los islotes, leucemia juvenil mielomonocítica, sarcoma de Kaposi, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon, tumor de Klatskin, tumor de Krukenberg, cáncer de laringe, cáncer de laringe, melanoma léntigo maligno, leucemia, leucemia, cáncer del labio y la cavidad oral, liposarcoma, cáncer de pulmón, luteoma, linfangioma, linfangiosarcoma, linfoepitélioma, leucemia linfoide, linfoma, macroglobulinemia, histiócitoma fibroso maligno, histiocitoma fibroso maligno, histiocitoma fibroso maligno óseo, glioma maligno, mesotelioma maligno, tumor maligno de vaina nerviosa periférica, tumor rabdoide maligno, tumor tritón maligno, linfoma MALT, linfoma de células del manto, leucemia de mastocitos, tumor mediastinal de células germinales, tumor mediastinal, cáncer medular de tiroides, meduloblastoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, melanoma, meningiorna, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, mesotelioma, cáncer escamoso metastásico del cuello con tumor primario oculto, carcinoma urotelial metastásico, tumor Mülleriano mixto, leucemia monocitica, cáncer de boca, tumor mucinoso, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, mieloma múltiple, micosis fungoides, micosis fungoides, enfermedad mielodisplásica, síndromes mielodisplásicos , leucemia mieloide, sarcoma mieloide, enfermedad mieloproliferativa, mixoma, cáncer, de la cavidad nasal, cáncer nasofaríngeo, carcinoma nasofaríngeo, neoplasma, neurinoma, neuroblastoma, neuroblastoma, neurofibroma, neuroma, melanoma nodular, linfoma no Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de piel no melanoma, cáncer de pulmón no microcítico, oncología ocular, oligoastrocitoma, oligodendroglioma, oncocitoma, meningiorna de la vaina del nervio óptico, cáncer oral, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario, tumor de células germinales del ovario, tumor de ovario de bajo potencial maligno, enfermedad de Paget de la mama, tumor de Pancoast, cáncer pancreático, cáncer pancreático, cáncer papilar de tiroides, papilomatosis , paraganglioma, cáncer de seno paranasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, tumor perivascular de células epitelioides, cáncer faríngeo, feocromocitoma, tumor parénquima pineal de diferenciación intermedia, pineoblastoma, pituicitoma, adenoma pituitario, tumor pituitario, neoplasma de células plasmáticas, blastoma pleuropulmonar, poliembrioma, linfoma precursor linfoblástico de linfocitos T, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma de efusión primaria, cáncer hepatocelular primario, cáncer hepático primario, cáncer peritoneal primario, tumor neuroectodermal primitivo, cáncer de próstata, pseudomixoma peritoneal, cáncer rectal, carcinoma de células renales, carcinoma del tracto respiratorio relacionado con el gen NUT en el croomosoma 15, retinoblastoma, rabdomioma, rabdomiosarcoma, transformación de Richter, teratoma sacrococcígeo, cáncer de la glándula salival, sarcoma, Schwannomatosis, carcinoma de glándulas sebáceas, neoplasma secundario, seminoma, tumor seroso, tumor de células de Sertoli-Leydig, tumor del estroma de los cordondes sexuales, síndrome de Sézary, carcinoma de células en anillo de , sello, cáncer de piel, tumor de células pequeñas, redondas y azules, carcinoma de células pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, linfoma de células pequeñas, cáncer del intestino delgado, sarcoma de tejido blando, somatoestatinoma, verruga del deshollinador, tumor de la médula espinal, tumor espinal, linfoma de la zona marginal esplénica, carcinoma de células escamosas, cáncer de estómago, melanoma superficial diseminante, tumor neuroectodermal primitivo supratentorial, tumor epitelial de ovario, sarcoma sinovial, leucemia aguda de linfocitos T, leucemia linfocitica granular grande de linfocitos T, leucemia de linfocitos T, linfoma de linfocitos T, leucemia prolinfocitica de linfocitos T, teratoma, ' cáncer linfático terminal, cáncer testicular, tecoma, cáncer de garganta, carcinoma timico, timoma, cáncer de tiroides, cáncer de células de transición de la pelvis renal y el uréter, carcinoma de células de transición, cáncer uracal, cáncer uretral, neoplasma urogenital, sarcoma uterino, melanoma uveal, cáncer vaginal, síndrome de Verner Morrison, carcinoma verrugoso, glioma de la vía visual, cáncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstróm, tumor de Warthin, tumor de Wilms, o cualquier combinación de los mismos. ' En una modalidad de la invención, al paciente pudo habérsele diagnosticado un cáncer que se selecciona de cáncer colorrectal, cáncer de pulmón no microcítico, colangiocarcinoma, mesotelioma, enfermedad de Castleman, carcinoma de células renales o cualquier combinación de los mismos. : En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo puede comprender una secuencia de polipéptido de cadena pesada que comprende: las SEQ ID NO: 3, 18, 19, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 704 o 708 y que puede comprender, adicionalmente, una secuencia de polipéptido de VL que comprende: las SEQ ID ¡NO: 2, 20, 647, 651, 660, 666, 699, 702, 706 o 709 o una variante de la misma, donde uno o más de los residuos flanqueantes (residuos FR) en dicho polipéptido VH o VL se puede sustituir con otro residuos de aminoácido, lo que da como resultado un anticuerpo anti-IL-6 o un fragmento o una variante del mismo que se une de forma especifica a la IL-6 humana o puede comprender un polipéptido, donde las CDR en la presente se incorporan a la región flanqueante humana homologa a dicha secuencia. Preferentemente, las secuencias ligera y pesada variable comprenden aquellas en las SEQ ID NO: 657 y 709.
En una modalidad de la invención, uno o más de idichos residuos de FR pueden sustituirse con un aminoácido presente en el sitio correspondiente en un anticuerpo anti-IL-6 de 'conejo progenitor desde donde se derivaron las regiones determinantes de complementariedad (CDR) contenidas en dichos polipéptidos de VH o VL o mediante una sustitución de aminoácidos conservadora.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo :pueden estar humanizados. · En una modalidad de la invención, dicho anticuerpo: anti-IL-6 o fragmento o variante de anticuerpo del mismo pueden ser quiméricos.
En una modalidad de la invención, dicho anticuerpo anti-IL-6 o fragmento o variante de anticuerpo del mismo' puede además comprender una Fe humana, por ejemplo, una región Fe compuesta por las regiones constantes de cadenas ligeras y pesadas variables contenidas en las SEQ ID NO: 704 y 702.
En una modalidad de la invención, dicha Fe humana se puede derivar de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7,: IgG8, IgG9, IgGlO, IgGll, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, ; IgG17, IgG18 o IgG19.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo pueden comprender un polipéptido que tiene al menos 90% de homología de secuencia con una o más de las secuencies de polipéptidos de las SEQ ID NO: 3, 18, 19, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 704, 708, 2, 20, 647, 651, 660, 666, 699, 702, 706 y 709.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo pueden tener una semivida de eliminación de al menos alrededor de 22 días, al menos alrededor de 25 días o al menos alrededor de 30 días.
En una modalidad de la invención, el antagonista de IL-6, como Abl, puede administrarse con untamente con un agente quimioterapéutico . En una modalidad de la invención, el i agente quimioterapéutico incluye, a modo no taxativo: antagonistas de VEGF, antagonistas de EGFR, platinos, taxoles, irinotecano, 5-fluorouraciloo, gemcitabina, leucovorina, esteroides, ciclofosfamida, melfalán, alcaloides de la vinca (por ejemplo, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina) , mustinas, inhibidores de tirosina cinasa, radioterapia, antagonistas de hormonas sexuales, moduladores selectivos del receptor de andrógeno, moduladores selectivos del receptor de estrógeno, antagonistas de PDGF, antagonistas de TNF, antagonistas de IL-1, interleucinas (por ejemplo, IL-12 o IL-2), antagonistas de IL-12R, anticuerpos monoclonales conjugados con toxinas, anticuerpos- monoclonales específicos contra antígenos tumorales, Erbitux™, Avastin™, Pertuzumab, anticuerpos anti-CD20, Rituxan®, ocrelizumab, ofatumumab, DXL625, Herceptin® o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, el otro compuesto terapéutico puede ser una estatina.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo pueden estar directa o indirectamente unidos a un agente terapéutico o una etiqueta detectable.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo anti-IL-ß puede ser Abl o un anticuerpo humanizado, quimérico, de cadena simple o fragmento del mismo, que comprende todas o la mayoría de las CDR de Abl.
En una modalidad de la invención, la enfermedad o afección se puede seleccionar de trombosis venosa aguda, embolia pulmonar, trombosis durante el embarazo, necrosis cutánea hemorrágica, coagulación intravascular diseminada aguda o crónica (DIC) , formación de coágulos por cirugía, reposo prolongad, inmovilización prolongada, trombosis venosa, meningococcemia fulminante, apoplejía trombótica aguda, oclusión coronaria aguda, oclusión arterial periférica , aguda, embolia pulmonar masiva, trombosis venosa axilar, trombosis venosa iliofemoral masiva, oclusión de cánulas arteriales, colusión de cánulas venosas, cardiomiopatía, enfermedad venooclusiva hepática, hipotensión, disminución del rendimiento cardíaco, disminución de la resistencia vascular, hipertensión pulmonar, disminución de la distensibilidad pulmonar, leucopenia, trombocitopenia, trombocitopenia inducida por heparina (HITT) , fibrilación auricular, implante de una válvula cardiaca prostética, propensión genética a padecer trombosis, factor V Leiden, mutación del gen de la protrombina, polimorfismo de la metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) , polimorfismo del receptor plaquetario, traumatismo, fracturas, quemaduras o cualquier combinación de las mismas.
En una modalidad de la invención, la enfermedad o afección se puede seleccionar de cáncer, artritis reumatoide, : SIDA, enfermedad coronaria, deshidratación, desnutrición, exposición al plomo, malaria, enfermedad respiratoria, : vejez, hipotiroidismo, tuberculosis, hipopituitarismo, neurastenia, hipernatremia, hiponatremia, enfermedad renal, esplénica, espondilitis anquilosante, síndrome del declive (retraso del crecimiento) o cualquier combinación de las mismas.
En una modalidad de la invención, el método puede incluir la administración de un antagonista de un factor asociado con la caquexia, un factor asociado con el debilidad, un factor asociado con la fatiga y/o un factor asociado con la fiebre. El factor asociado con la caquexia, el factor asociado con el debilidad, factor asociado con la fatiga y/o factor asociado con la fiebre se puede seleccionar de factor de necrosis tumoral alfa, interferón gama, interleucina 1 alfa, interleucina 1 beta, interleucina 6, factor que induce la proteólisis, factor que inhibe la leucemia o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, el método puede incluir la administración de un agente anti-caquexia seleccionado de cannabis, dronabinol ( arinol™) , nabilona (Cesamet) , cannabidiol, cannabicromeno, tetrahidrocannabinol , Sátivex, acetato de megestrol o cualquier combinación de los mismos.
En una realización de la invención, el método puede incluir la administración de un agente antináusea o antiemético seleccionado de antagonistas del receptor 5-HT3, ajwain, alizaprida, anticolinérgicos, antihistaminas, aprepitant, benzodiazepinas, cannabicromeno, cannabidiol, cannabinoides, cannabis, casopitant, clorpromazina, ciclizina, dexametasona, dexametasona, dimenhidrinato (Gravol™) , difenhidramina, dolasetrón, domperidona, antagonistas de dopamina, doxilamina, dronabinol (Marinol™) , droperidol, emetrol, jehjibre, granisetrón, haloperidol, hidroxizina, hioscina, lorazepam, meclizina, metoclopramida, midazolam, muscimol, nabilona (Cesamet) , antagonistas del receptor nkl, ondansetrón, palonosetrón, menta, Fenergam, proclorperazina, Promacot, prometazina, Pentazina, propofol, sátivex, tetrahidrocannabinol, trimetobenzamida, tropisetrón, nandrolona, stilbestrol, talidomida, lenalidomida, agonistas de grelina, antagonistas de miostatina, antcuerpos anti-miostatina, moduladores selectivos del receptor de andrógenos, moduladores selectivos del receptor de estrógeno, antagonistas de angiotensina AII, agonistas del receptor adenérgico beta dos, agonistas del receptor adenérgico beta tres o cualquier combinación de los mismos. [ En una realización de la invención, el método puede incluir la administración de un agente antináusea o antiemético seleccionado de antagonistas del receptor 5-HT3, ajwain, alizaprida, anticolinérgicos, antihistaminas, aprepitant, benzodiazepinas, cannabicromeno, cannabidiol, cannabinoides, cannabis, casopitant, clorpromazina, ciclizina, dexametasona, dexametasona, dimenhidrinato (Gravol™) , difenhidramina, dolasetrón, domperidona, antagonistas de dopamina, doxilamina, dronabinol (Marinol™) , droperidol, emetrol, jenjibre, granisetrón, haloperidol, hidroxizina, hioscina, lorazepam, raeclizina, metoclopramida, midazolam, muscimol, nabilona (Cesamet), antagonistas del receptor nkl, ondansetrón, palonosetrón, menta, Fenergam, proclorperazina, Promacot, prometazina, Pentazina, propofol, sativex, tetrahidrocannabinol, trimetobenzamida, tropisetrón, nandrolona, stilbestrol, talidomida, lenalidomida, agonistas de grelina, antagonistas de miostatina, antcuerpos anti-miostatina, moduladores selectivos del receptor de andrógenos, moduladores selectivos del receptor de estrógeno, antagonistas de angiotensina AII, agonistas del receptor adenérgico beta dos, agonistas del receptor adenérgico beta tres o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, la fiebre del paciente se puede evaluar mediante la medición de la temperatura corporal del paciente.
En una modalidad de la invención, el método puede incluir la medición de la temperatura corporal del paciente antes de la administración del anticuerpo anti-IL-ß y administrar el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo si la temperatura corporal del paciente es mayor a aproximadamente 38 ?.
En una modalidad de la invención, el método puede incluir la medición de la temperatura corporal del paciente dentro de las 24 horas antes de la administración del anticuerpo anti-IL-6 y administrar el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmentó o la variante de anticuerpo del mismo si la temperatura corporal del paciente indica la presencia de fiebre.
En una modalidad de la invención, el método puede incluir, adicionalmente, la medición del peso corporal del paciente antes de la administración del anticuerpo anti-IL-6 y administrar el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo si el peso del paciente disminuyó en más de aproximadamente 5% dentro de aproximadamente 30 días o si el índice de masa corporal magra del paciente es menor a aproximadamente 17 kg / m2 (paciente masculino) o menor a aproximadamente 14 kg / m2 (paciente femenina) .
En una modalidad de la invención, el método puede incluir la medición de la fuerza muscular del paciente antes ( de la administración del anticuerpo anti-IL-6 y administrar el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo si la fuerza muscular del paciente disminuyó! en un porcentaje mayor a aproximadamente el 20% dentro de aproximadamente 30 dias.
En una modalidad de la invención, el método puede dar como resultado una mejora prolongada de la caquexia, el debilidad, la fatiga y/o la fiebre del paciente.
En una modalidad de la invención, la masa corporal del paciente se puede aumentar en aproximadamente 1 kilogramo dentro de aproximadamente 4 semanas desde la administración del anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante del mismo.
En una modalidad de la invención, la caquexia del paciente se puede mejorar de forma medible dentro de aproximadamente 4 semanas desde la administración del anticuerpo anti-IL-6.
En una modalidad de la invención, la caquexia del paciente se puede evaluar mediante la medición de la masa corporal total del paciente, la masa corporal magra, el índice de masa corporal magra y/o la masa corporal magra apendicular.
En una modalidad de la invención, la medición de la masa corporal del paciente puede descontar (restar) el peso estimado del o de los tumores del paciente y/o la o las recolecciones de fluido extravascular .
En una modalidad de la invención, la caquexia del paciente se puede mantener mejorada de forma medible aproximadamente 8 semanas después de la administración del anticuerpo anti-IL-6.
En una modalidad de la invención, la debilidad del paciente se puede mejorar de forma medible dentro de aproximadamente 4 semanas desde la administración del anticuerpo anti-IL-6.
En una modalidad de la invención, la debilidad del paciente se puede medir mediante la prueba de fuerza de presión .
En una modalidad de la invención, la fuerza presión del paciente se puede mejorar en al menos aproximadamente un 15% o al menos aproximadamente un 20%.
En una modalidad de la invención, la debilidad del paciente se puede mantener mejorada de forma medible aproximadamente 8 semanas después de la administración del anticuerpo anti-IL-6.
En una modalidad de la invención, la fatiga del paciente se puede mejorar de forma medible dentro de aproximadamente 1 semana desde la administración del anticuerpo anti-IL-6. ¦ En una modalidad de la invención, la fatiga del paciente se puede medir mediante la prueba FACIT-F FS .
En una modalidad de la invención, el valor de FACIT-F FS del paciente se pude mejorar en al menos aproximadamente 10 puntos.
En una modalidad de la invención, la fatiga del paciente se puede mantener mejorada de forma medible aproximadamente 8 semanas después de la administración del anticuerpo anti-IL-6.
En una modalidad de la invención, la fiebre del paciente se puede mejorar de forma medible dentro de aproximadamente 1 semana desde la administración del anticuerpo anti-IL-6.
En una modalidad de la invención, la fiebre del paciente se puede mantener mejorada de forma medible aproximadamente 8 semanas después de la administración del anticuerpo anti-IL-6.
En una modalidad de la invención, la calidad de vida del paciente se puede mejorar. : En una modalidad de la invención, se puede incljuir la administración de uno o más anticoagulantes o estatinas. I En una modalidad de la invención, el o los anticoagulantes se pueden seleccionar de abciximab (ReoPro™) , acenocoumarol, antitrombina III, argatrobán, aspirina, bivalirudina (Angiomax™) , clopidogrel, dabigatrán, etexilato de dabigatrán (Pradaxa™/Pradax™) , desirudina (Revasc™/Iprivask™) , dipiridamol, eptifibatida ( Integrilin™) , fondaparinux, heparina, hirudina, idraparinux, lepirudina (Refludan™) , heparina de bajo peso molecular, melagatrán, fenindiona, fenprocoumón, ticlopidina, tirofibán (Aggrastat™) , warfarina, ximelagatrán, ximelagatrán (Exanta™/ Exarta™) o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, la o las estatinas se pueden seleccionar de atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina o cualquier combinación de las mismas.
En una modalidad de la invención, el perfil de coagulación del paciente se puede evaluar mediante la medición del nivel de uno o más de dimero-D, Factor II, Factor V, Factor VIII, Factor IX, Factor XI, Factor XII, productos de la degradación de F/fibrina, complejo de trombina-antitrombina III, fibrinógeno, plasminógeno, protrombina y factor de von Willebrand en suero del paciente. ! En una modalidad de la invención, el perfil de coagulación del paciente se puede evaluar mediante la medición funcional de la capacidad de coagulación.
En una modalidad de la invención, la medición funcional de la capacidad de coagulación se puede seleccionar del tiempo de protrombina (PT), la tasa de protrombina (PR), la tasa normalizada internacional (INR) o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, el método puede incluir la medición de la tasa normalizada internacional del paciente (INR) antes de la administración del antagonista de IL-6 y administrar al paciente un antagonista del IL-6 como Abl si la INR del paciente es menor a aproximadamente 0.9.
En una modalidad de la invención, la invención; puede incluir la medición de la tasa normalizada internacional del paciente (INR) antes de la administración del antagonista de IL-6 y administrar al paciente un antagonista de la IL-6 como Abl si la INR del paciente es menor a aproximadamente 0.5.
En una modalidad de la invención, la INR del paciente se puede aumentar hasta más de aproximadamente 0.9 dentro dé las 4 semanas desde el inicio de la administración de un antagonista de IL-6 al paciente.
En una modalidad de la invención, el método puede incluir la medición del nivel de dimero-D en suero del paciente antes de la administración del antagonista de IL-6 y administrar el antagonista de IL-6, como Abl, si el nivel de dimero-D en suero del paciente supera el rango de referencia normal. ; En una modalidad de la invención, el nivel de dimero-D en suero del paciente se puede disminuir hasta ser menor al, limite superior del rango de referencia normal dentro de las 4 semanas desde el inicio de la administración del antagonista de IL-6 al paciente.
En una modalidad de la invención, el método puede dar como resultado una mejora prolongada del perfil de coagulación del paciente.
En una modalidad de la invención, el perfil de coagulación del paciente se puede mejorar de forma medible dentro de aproximadamente 2 semana desde el inicio de la administración del anticuerpo anti-IL-6.
En una modalidad de la invención, el perfil de coagulación del paciente se puede mantener mejorado de forma medible aproximadamente 12 semanas luego del inicio de la administración del anticuerpo anti-IL-6 al paciente.
En una modalidad de la invención, la capacidad de supervivencia del paciente se puede mejorar.
En una modalidad de la invención, el antagonista de IL-6 puede ser un ácido nucleico antisentido.
En una modalidad de la invención, el antagonista de IL-6 puede ser un ácido nucleico antisentido, por ejemplo, que comprende al menos aproximadamente 10 nucleótidos de una secuencia que codifica la IL-6, un receptor IL-6 alfa, un gpl30, una p38 MAP cinasa, un JAK1, JAK2, JAK3 o un SYK. : En una modalidad de la invención, el ácido nucleico antisentido puede comprender ADN, ARN, ácido nucleico peptidico, ácido nucleico bloqueado, morfolino (oligómero fosforodiamidato morfolino), ácido nucleico glicólico,: ácido nucleico treósico o cualquier combinación de los mismos. · En una modalidad de la invención, el antagonista de IL-6 puede comprender Actemra™ (Tocilizumab) , Remicade®, Zénapax™ (daclizumab) o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, el antagonista de IL-6 puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia que comprende un fragmento de IL-6, un receptor IL-6 alfa, un gpl30, una p38 MAP cinasa, un JAK1, JAK2, JAK3, un SYK o cualquier combinación de los mismos, como un fragmento o un polipéptido de longitud completa que tiene al menos 40 aminoácidos de longitud.
En una modalidad de la invención, el antagonista de IL-6 puede comprender una IL-6 soluble, un receptor IL-6 alfa, un gpl30, una p38 MAP cinasa, un JAK1, JAK2, JAK3, un SYK o cualquier combinación de los mismos.
En una modalidad de la invención, el antagonista de IL-6 puede estar acoplado a un resto de aumento de la semivida.
En una modalidad de la invención, el método puede incluir la medición del nivel de CRP en suero del paciente antes de la administración del anticuerpo anti-IL-6 y administrar el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo si el nivel de CRP en suero del paciente es de al menos aproximadamente 5 mg/L.
En una modalidad de la invención, el nivel de CRP en suero del paciente puede reducirse a menos de aproximadamente : 5 mg/L dentro de 1 semana a partir del inicio de la administración del antagonista de IL-6.
En una modalidad de la invención, el nivel de CRP en suero del paciente puede reducirse a menos de 1 mg/L dentro de 1 semana a partir del inicio de la administración del antagonista de IL-6. : En una modalidad de la invención, el tratamiento puede dar como resultado una reducción prolongada del nivel de CRP en suero del paciente.
En una modalidad de la invención, el nivel de CRP en suero del paciente puede reducirse a menos de 10 mg/L dentro de aproximadamente 1 semana a partir del inicio de la administración del antagonista de IL-6. , En una modalidad de la invención, 14 días luego ' de la administración del antagonista de IL-6, el nivel de CRP en suero del paciente puede permanecer por debajo de los 10 mg/L.
En una modalidad de la invención, 21 dias luego ¡ de la administración del antagonista de IL-6, el nivel de CRP en suero del paciente puede permanecer por debajo de los 10 mg/L.
En una modalidad de la invención, 28 días luego de la administración del antagonista de IL-6, el nivel de CRP en suero del paciente puede permanecer por debajo de los 10 mg/L.
En una modalidad de la invención, 35 días luego de administración del antagonista de IL-6, el nivel de CRP suero del paciente puede permanecer por debajo de los 10 mg/L En una modalidad de la invención, 42 días luego de la administración del antagonista de IL-6, el nivel de CRP en suero del paciente puede permanecer por debajo de los 10 mg/L.
En una modalidad de la invención, 49 días luego de la administración del antagonista de IL-6, el nivel de CRP en suero del paciente puede permanecer por debajo de los 10 mg/L.
En una modalidad de la invención, 56 días luego de administración del antagonista de IL-6, el nivel de suero del paciente puede permanecer por debajo de los 10 mg/L.
En una modalidad de la invención, se mejora la capacidad supervivencia del paciente.
En una modalidad de la invención, el método puede incluir medición del nivel de albúmina en suero del paciente antes de la administración del antagonista de IL-6 y administrar el antagonista de IL-6, como Abl, si el nivel de albúmina en suero del paciente es menor a aproximadamente 35 g/L.
En una modalidad de la invención, el nivel de albúmina en suero del paciente se puede aumentar a más de aproximadamente 35 g/L dentro de aproximadamente 5 semanas a partir del ' inicio de la administración del antagonista de IL-6. , En una modalidad de la invención, el tratamiento puede dar como resultado un aumento prolongado del nivel de albúmina en suero del paciente.
En una modalidad de la invención, 42 días luego de la administración del antagonista de IL-6, el nivel de albúmina en suero del paciente puede permanecer por encima de los 35 ,g/L.
En una modalidad de la invención, 49 días luego : de la administración del antagonista de IL-6, el nivel de albúmina en suero del paciente puede permanecer por encima de los 35 Ig/L.
En una modalidad de la invención, 56 días luego ; de la administración del antagonista de IL-6, el nivel de albúmina en suero del paciente puede permanecer por encima de los 35 g/L.
En una modalidad de la invención, el nivel de albúmina en suero del paciente puede aumentarse en aproximadamente, 5 g/L dentro de aproximadamente 5 semanas a partir del inicio de la administración del antagonista de IL-6.
En una modalidad de la invención, al paciente; puede habérsele diagnosticado artritis reumatoide, cáncer, cáncer avanzado, enfermedad hepática, enfermedad renal, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad celiaca, traumatismptismo, quemaduras, otras enfermedades asociadas con la disminución de la albúmina en suero o cualquier combinación de las mismas.
En una modalidad de la invención, el método puede comprender además la administración de una o más estatinas al paciente, incluyendo, a modo no taxativo, atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina o cualquier combinación de los mismas.
Otra modalidad de la invención se relaciona con una composición que comprende un antagonista de IL-6 como Abl y un anticoagulante. En una modalidad de la invención, el' o los anticoagulantes se pueden seleccionar de abciximab (ReoPro™) , acenocoumarol, antitrombina III, argatrobán, aspirina, bivalirudina (Angiomax™) , clopidogrel, dabigatrán, etexilato de dabigatrán (Pradaxa™/Pradax™) , desirudina (Revasc™/Iprivask™) dipiridamol, eptifibatida ( Integrilin™) , fondaparinux heparina, hirudina, idraparinux, lepirudina (Refludan™) heparina de bajo peso molecular, melagatrán, fenindiona fenprocoumón, ticlopidina, tirofibán (Aggrastat™) , warfarina ximelagatrán, ximelagatrán (Exanta™/ Exarta™) o cualquier combinación de los mismos.
Otra modalidad de la invención se relaciona con una composición que comprende un antagonista de IL-6 como Abl y un agente quimioterapéutico . En una modalidad de la invención, el agente quimioterapéutico se puede seleccionar de antagonistas de VEGF, antagonistas de EGFR, platinos, taxoles, irinotecano, 5-fluorouraciloo, gemcitabina, leucovorina, esteroides, ciclofosfamida, melfalán, alcaloides de la vinca (por ejemplo, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina) , mustinas, inhibidores de tirosina cinasa, radioterapia, antagonistas de hormonas sexuales, moduladores selectivos del receptor de andrógeno, moduladores selectivos del receptor de estrógeno, antagonistas de PDGF, antagonistas de TNF, antagonistas , de IL-1, interleucinas (por ejemplo, IL-12 o IL-2), antagonistas de IL-12R, anticuerpos monoclonales conjugados con toxinas, anticuerpos monoclonales específicos contra antígenos tumorales, Erbitux™, Avastin™, Pertuzumab, anticuerpos anti- CD20, Rituxan®, ocrelizumab, ofatumumab, DXL625, Herceptin® o cualquier combinación de los mismos. : BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Fig. 1 muestra que se reconoció una variedad de epitopos únicos mediante la recolección de anticuerpos anti-IL-6 preparados según el protocolo de selección de anticuerpos. La variabilidad de los epitopos se confirmó por medio de estudios de competencia de unión a anticuerpos anti-IL-6 (ForteBio Octet) .
La Fig. 2 muestra alineaciones de secuencias de 'cadena ligeras y pesadas variables entre secuencias de cadena ligeras y pesadas variables de anticuerpo de conejo y secuencias humanas homologas y las secuencias humanizadas. Las regiones flanqueantes se identifican como FR1-FR4. Las regiones determinantes de complementariedad se identifican como CDR1-CDR3. Los residuos de aminoácidos se numeran como se muestra. Las secuencias iniciales de conejo se denominan RbtVL y RbtVH para las secuencias de cadenas ligeras y pesadas variables, respectivamente. Tres de las secuencias de anticuerpo germinales humanas más similares, que abarcan desde la ; Región Flanqueante 1 hasta el extremo de la Región Flanqueante 3, se alinean por debajo de las secuencias de conejo. La secuencia humana que se considera como la más similar a la secuencia de conejo se muestra en primer lugar. En el presente ejemplo, aquellas secuencias más similares son L12A para la ; cadena ligera y 3-64-04 para la cadena pesada. No se muestran las I secuencias CDR3 humanas. La secuencia de Región Flanqueante humana 4 más cercana se alinea por debajo de la secuencia de Región Flanqueante de conejo 4. Los guiones verticales indican un residuo donde el residuo de conejo es idéntico a uno o más de los residuos humanos en la misma posición. Los residuos en negrita indican que el residuo humano en esa posición es idéntico al residuo de conejo en la misma posición. Las secuencias finales humanizadas se denominan VLh y VHh para las secuencias de cadenas ligeras y pesadas variables, respectivamente. Los residuos subrayados indican que el residuo es igual al residuo de conejo en esa posición, pero distinto a los residuos humanos en esa posición en las tres secuencias humanas alineadas.
La Fig. 3 muestra la alta correlación entre la IgG producida y la especificidad de antigeno para un ejemplo de protocolo de IL-6. 9 de 11 pocilios mostraron correlación especifica de IgG con el reconocimiento de antigenos.
La Fig. 4 proporciona la curva de respuesta a la dosis de alfa-2-macroglobulina (A2M) para el anticuerpo Abl administrado por vía intravenosa en diferentes dosis, una hora luego de una dosis de 100 µg/k;g s.c. de IL-6 humano.
La Fig. 5 proporciona datos de supervivencia para los grupos de progresión del anticuerpo Abl contra los grupos de control. ; La Fig. 6 proporciona datos adicionales de supervivencia para los grupos de regresión del anticuerpo Abl contra los grupos de control.
La Fig. 7 proporciona datos de supervivencia para IgG humana, policlonal a 10 mg/kg i.v. cada tres días (tamaño del tumor de 270-320 mg) contra el anticuerpo Abl a 10 mg/kg i.v. cada tres días (tamaño del tumor de 270-320 mg) .
La Fig. 8 proporciona datos de supervivencia para la IgG humana policlonal a 10 mg/kg i.v. cada tres días (tamaño del tumor de 400-527 mg) contra el anticuerpo Abl a 10 mg/kg i.v. cada tres dias (tamaño del tumor de 400-527 mg) .
La Fig. 9 proporciona un perfil farmacocinético del anticuerpo Abl en monos macacos. Los niveles del anticuerpo Abl en plasma se cuantificaron mediante ELISA de captura de antigenos. Esta proteina muestra una semivida de entre 12 y 17 dias que es coherente con otros anticuerpos humanizados de longitud completa.
La Fig. 10 (A-D) proporciona datos de unión pata los anticuerpos Ab4, Ab3, Ab8 y Ab2, respectivamente. La Fig. 10 E proporciona datos de unión para los anticuerpos Abl, Ab6 y Ab7.
La Fig. 11 resume los datos de unión de la Fig. 10 (A-E) de forma tabular.
La Fig. 12 presenta las secuencias de los 15 péptidos de aminoácidos usados en el experimento de mapeo de péptidos del Ejemplo 14.
La Fig. 13 presenta los resultados de las : bandas preparadas en el Ejemplo 14.
La Fig. 14 presenta los resultados de las bandas preparadas en el Ejemplo 14.
La Fig. 15A muestra la cinética de afinidad y unión, de Abl para IL-6 de varias especies. ; La Fig. 15B muestra la inhibición de la IL-6 mediante Abl en el ensayo de proliferación celular de T1165.
La Fig. 16 muestra la concentración media de Abl en; plasma que resulta de la administración única de Abl a sujetos masculinos saludables en varios grupos de dosificación.
La Fig. 17 muestra el área promedio bajo la curva de tiempo de concentración de Abl en plasma (AUC) para los grupos de dosificación de la Fig. 16.
La Fig. 18 muestra el pico promedio de concentración de Abl en plasma (Cmáx) para los grupos de dosificación de la Fig. 16. ; La Fig. 19 resume las mediciones farmacocinéticas 'de Abl de los grupos de dosificación de la Fig. 16.
La Fig. 20 muestra la concentración promedio de :Abl en plasma que resulta de la administración única de . Abl a pacientes con cáncer avanzado.
La Fig. 21 ilustra la semivida de eliminación sin precedentes de Abl en comparación con otros anticuerpos anti-IL-6. ; La Fig. 22 muestra el aumento de la concentración de hemoglobina luego de la administración de Abl a pacientes con cáncer avanzado.
La Fig. 23 muestra las concentraciones promedio de lipidos en plasma luego de la administración de Abl a pacientes con cáncer avanzado.
La Fig. 24 muestra los conteos promedio de neutrófilos luego de la administración de Abl a pacientes con cáncer avanzado.
La Fig. 25 muestra la supresión de los niveles de ; CRP en suero en individuos saludables.
La Fig. 26 (A-B)' muestra la supresión de los niveles de CRP en suero en pacientes con cáncer avanzado.
La Fig. 27 muestra la prevención de la pérdida de peso mediante Abl en un modelo de caquexia cancerosa de ratón.
La Fig. 28 muestra la apariencia física de ratones de control y tratados con Abl representativos en un modelo de caquexia cancerosa.
La Fig. 29 muestra que el Abl promueve el aumento de peso en pacientes con cáncer avanzado.
La Fig. 30 muestra que el Abl disminuye la fatiga en pacientes con cáncer avanzado.
La Fig. 31 muestra que el Abl promueve la fuerza de prensión en pacientes con cáncer avanzado.
La Fig. 32 muestra que el Abl suprime una proteína de fase aguda (amiloide A sérica) en ratones. : La Fig. 33 muestra que el Abl aumenta la concentración de albúmina en plasma en pacientes con cáncer avanzado.
Las Figs. 34 y 35 muestran alineaciones entre secuencias pesadas variables y ligeras de anticuerpo de conejo y secuencias humanas homologas y las secuencias humanizadas. Las regiones flanqueantes se identifican como FR1-FR4. Las regiones determinantes de complementariedad se identifican como CDR1-CDR3. , Las Figs. 36 y 37 muestran alineaciones entre las secuencias pesadas y ligeras variables, de diferentes formas de Abl, respectivamente. Las regiones flanqueantes se identifican como FR1-FR4. Las regiones determinantes de complementariedad se identifican como CDR1-CDR3. Las diferencias de las secuencias dentro de las regiones CDR se encuentran destacadas.
La Fig. 38 muestra los valores medios de CRP para cada concentración de dosis (placebo, 80 mg, 160 mg y 320 mg) del anticuerpo monoclonal Abl.
La Fig. 39 muestra el cambio en los valores medios de CRP de cada grupo de concentración de dosis correspondientes a la Fig. 38.
La Fig. 40 muestra una reducción en los niveles de CRP en suero en pacientes con diversos cánceres luego de dosificaciones de 80, 160 o 320 mg durante 12 semanas.
La Fig. 41 muestra una reducción en los niveles de CRP en suero en la población de pacientes con artritis reumatoide luego de dosificaciones de 80, 160 y 320 mg durante 12 semanas.
La Fig. 42 muestra que el Abl aumenta la hemoglobina promedio a 80, 160 y 320 mg luego de 12 semanas de dosificación.
La Figura 43 muestra el cambio promedio desde la hemoglobina de referencia para los datos presentados en la Figura 42.
La Figura 44 muestra que el Abl aumenta la hemoglobina promedio a 160 y 320 mg luego de 12 semanas de dosificación en pacientes que tienen la hemoglobina de referencia por debajo de 11 g/1.
La Figura 45 muestra que el Abl aumenta la hemoglobina promedio a 80, 160 y 320 mg luego de 16 semanas de dosificación .
La Figura 46 muestra que el Abl aumenta la concentración de albúmina promedio a 80, 160 y 320 mg luego de 12 semanas de dosificación. ] La Figura 47 muestra el cambio con respecto al punto de referencia para la concentración promedio de albúmina de cada grupo de concentración de dosis correspondiente a la Figura 46.
La Figura 48 muestra que el Abl proporciona aumentos sostenidos en la concentración promedio de albúmina a 160 y 320 mg luego de 12 semanas de dosificación en pacientes que tienen la albúmina de referencia por debajo de 35 g/1.
La Figura 49 muestra los datos de cambio de peso promedio de cada grupo de concentración de dosis (placebo, 80 mg, 160 mg y 320 mg) del anticuerpo monoclonal Abl en el transcurso de 12 semanas .
La Fig. 50 muestra el cambio porcentual promedio, en el peso corporal de cada grupo de concentración de dosis correspondiente a la Fig. 49.
La Figura 51 muestra el cambio en los datos de masa corporal magra promediados para los grupos de concentración de dosis correspondientes a la Figura 49.
La Figura 52 muestra aumentos en el valor de la subescala Facit-F FS promedio para algunos de los grupos de concentración de dosis en la población de pacientes luego de una dosificación de 80, 160 y 320 mg después de 8 semanas.
La Fig. 53 muestra el cambio del valor de la subescala Facit-F FS con respecto al punto de referencia, correspondiente a la Fig. 52.
La Figura 54 muestra que el Abl baja los niveles de dimero-D con respecto al placebo a 80, 160 y 320 mg luego de 16 semanas de dosificación.
La Figura 55 muestra el cambio porcentual con respecto al punto de referencia para la concentración de dimero-D de cada grupo de concentración de dosis correspondiente a la Figura 54.
La Fig. 56 muestra que el tratamiento de pacientes con artritis reumatoide produjo una mejora considerable con respecto al placebo, con base en las mediciones de ACR.
La Fig. 57 muestra pacientes que alcanzan un ACR 20 con respecto al placebo a 80, 160 y 320 mg, luego de 16 semanas de dosificación .
La Fig. 58 muestra pacientes que alcanzan un ACR 50 con respecto al placebo a 80, 160 y 320 mg, luego de 16 semanas de dosificación.
La Fig. 59 muestra pacientes que alcanzan un ACR 70 con respecto al placebo a 80, 160 y 320 mg, luego de 16 semanas de dosificación.
La Fig. 60 muestra el cambio con respecto al punto de referencia en los componentes de la medición de ACR para el los grupos de concentración de dosis de 80, 160 y 320 mg de placebo .
La Fig. 61 muestra el cambio en los valores de HAQ-DI en los grupos de concentración de dosis de 80, 160 y 320 mg de placebo.
La Fig. 62 muestra el cambio en los valores de DAS28 en los grupos de concentración de dosis de 80, 160 y 320' mg de placebo .
La Fig. 63 muestra el cambio en el porcentaje de pacientes que alcanzan respuestas EULAR moderadas o buenas en los grupos de concentración de dosis de placebo, 80, 180 y 320 mg. ; DESCRIPCIÓN DETALLADA Definiciones Se debe entender que la presente invención no se limita a la metodología, los protocolos, las lineas celulares, las especies o los géneros animales y los reactivos particulares descritos, ya que los mismos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente tiene el objeto de describir solamente modalidades particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitada solamente por las reivindicaciones adjuntas.
El término "variantes" (según se aplica a anticuerpos, incluyendo Abl) incluye anticuerpos de cadena simple, dimeros, multímeros, variantes de secuencias, variantes de sustitución de dominios, etc. Los anticuerpos de cadena simple incluyen los SMIP, los anticuerpos de tiburón y los nanocuerpos (por ejemplo, anticuerpos de camélidos) . Las variantes de secuencia se pueden especificar según la identidad porcentual ' (o la similitud), por ejemplo, 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%;, 60%, etc. o según la cantidad de sustituciones conservadoras o no conservadoras permitidas. Las variantes de sustitución de dominios incluyen los remplazos de un dominio de una proteína con un dominio similar de una proteína relacionada. Un dominio similar se puede identificar mediante la similitud de secuencia, estructura (real o prevista) o función. A modo de ejemplo, las variantes de sustitución de dominios incluyen la sustitución de una o más CDR y/o regiones flanqueantes, j Como se usan en la presente, las formas en singular "un/a", "y" y "el/la" incluyen referentes en plural, a menos que el contexto claramente exprese lo contrario. Por consiguiente, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de tales células y la referencia a "la próteina" incluye la referencia a una o más proteínas y equivalentes de la misma conocidos por los expertos en la técnica : y así sucesivamente. Todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como lo entiende normalmente un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención, a menos que se indique claramente lo contrario.
Interleucina-6 {IL-6) : Como se utiliza en la presente, la interleucina-6 (IL-6) comprende no solo la siguiente secuencia de 212 aminoácidos disponible como No. de acceso a la proteína de GenBank NP_000591: MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQÍRYILDG ISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYL EYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQ LQDM TTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM (SEQ ID NO: 1) sino también cualquier forma pre-pro, pro- y madura de esta secuencia de aminoácidos de IL-6, así como mutantes y variantes que incluyen variantes alélicas de esta secuencia.
Antagonista de IL-6: Como se utiliza en la presente, el término "antagonista de IL-6" y las variantes gramaticales del mismo incluyen cualquier composición que previene, inhibe o aminora el o los efectos de la señalización de IL-6. Generalmente, tales antagonistas pueden reducir los niveles o la actividad de la IL-6, del receptor IL-6 alfa, del gpl30 o de una molécula involucrada en la transducción de señalización de IL-6 o puede reducir los niveles o los complejos de actividad entre los anteriores (por ejemplo, reducir la actividad ¡de una IL-6/un complejo de receptores IL-6) . Los antagonistas incluyen ácidos nucleicos antisentido que incluyen ADN, ARN o un análogo de ácido nucleico, como un ácido nucleico peptidico, un ácido nucleico bloqueado, un morfolino (oligómero fosforodiamidato morfolino) , un ácido nucleico glicólico o un ácido nucleico treósico. Véase Heasman, Dev Biol. 15 de marzo de' 2002; 243 (2) : 209-14 ; Hannon and Rossi, Nature 16 de septiembre de 2004; 431 (7006) : 371-8; Paul et al., Nat Biotechnol. mayo de 2002; 20(5) :505-8; Zhang et al., J Am Chem Soc. 30 de marzo de 2005; 127 (12) :4174-5; ahlestedt et al., Proc Nati Acad Sci E.U.A. 9 de mayo de 2000; 97 ( 10 ) : 5633-8 ; Hanvey et al.,: 21 de noviembre de 1992; 258 (5087) : 1481-5; Braasch et' al., Biochemistry 9 de abril de 2002; 41 (14) : 4503-10; Schorting et al., Science 17 de noviembre de 2000; 290 (5495) : 1347-51. Adicionalmente , los antagonistas de IL-6 específicamente incluyen péptidos que bloquean la señalización de IL-6, como los descritos en cualquiera de las patentes de EUA No. 6,599,875; 6,172, 042; 6,838,433; 6,841,533; 5,210,075 et al. Asimismo, los antagonistas de IL-6 de acuerdo con la invención pueden incluir inhibidores de p38 MAP cinasa, como los informados en la patente EUA20070010529 et al. dado este rol de la cinasa en la producción de citosina y, más particularmente, en la producción de IL-6. Adicionalmente , los antagonistas de IL-6 de acuerdo con la invención incluyen los compuestos glucoalcaloides indicados en el documento US20050090453, asi como otros compuestos antagonistas de IL-6 que se pueden ' aislar usando los ensayos de análisis de antagonistas de IL-6 indicados en el mismo documento. Otros antagonistas de IL-6 incluyen anticuerpos, tales como anticuerpos anti-IL-6, anticuerpos anti-IL-6 del receptor alfa, anticuerpos anti-gpl30 y anticuerpos anti-p38 MAP cinasa que incluyen (a modo no taxativo) los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente, Actemra™ (Tocilizumab) , Remicade®, Zenapax™ (daclizumab) o cualquier combinación de los mismos. Otros antagonistas de IL-6 incluyen porciones o fragmentos de moléculas involucradas en la señalización de IL-6, como IL-6, receptor de IL-6 alfa y!gpl30, que pueden ser secuencias nativas, mutantes o variantes y pueden estar opcionalmente acopladas a otros restos (tales como restos de aumento de la semivida, por ejemplo, un dominio Fe). A modo de ejemplo, un antagonista de IL-6 puede ser un receptor o un fragmento de IL-6 soluble, un receptor IL-6 soluble, una proteina de fusión Fe, un inhibidor de molécula pequeña de IL-6, un anticuerpo del receptor anti-IL-6 o un fragmento o una variante del mismo, un ácido nucleico antisentido, etc. Otros antagonistas de IL-6 incluyen avemires, como C326 (Silverman et al., Nat Biotechnol. diciembre de 2005; 23 (12 ): 1556-61 ) y moléculas pequeñas, como retinoide A 80 sintético ( tamibaroteno) (Takeda et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. mayo de 2006; 26 (5) : 1177-83) . Tales antagonistas de IL-6! pueden administrarse de cualquier manera conocida en la técnica, que incluye poner en contacto a un sujeto con ácidos nucleicos que codifican o hacen que se exprese cualquiera de los polipéptidos o las secuencias antisentido que anteceden.
Trombosis : Como se utiliza en la presente, trombosis se refiere a un trombo (coágulo sanguíneo) dentro de un vaso sanguíneo. El término comprende, a modo no taxativo, trombosis venosa y arterial, incluyendo trombosis venosa profunda, trombosis venosa portal, trombosis venosa yugular, trombosis venosa renal, apoplejía, infarto de miocardio, síndrome de Budd-Chiari, enfermedad de Paget-Schroetter y trombosis de senos venosos cerebrales. Las enfermedades y los trastornos asociados con la trombosis incluyen, a modo no taxativo, trombosis venosa aguda, embolia pulmonar, trombosis durante el embarazo, necrosis cutánea hemorrágica, coagulación intravascular diseminada aguda o crónica (DIC), formación de coágulos por cirugía, reposo prolongad, inmovilización prolongada, trombosis venosa, meningococcemia fulminante, apoplejía trombótica aguda, oclusión coronaria aguda, oclusión arteral periférica aguda, embolia pulmonar masiva, trombosis venosa axilar, trombosis venosa iliofemoral masiva, oclusión de cánulas arteriales, oclusión de cánulas venosas, cardiomiopatia, enfermedad venooclusiva hepática, hipotensión, disminución del rendimiento cardíaco, disminución de la resistencia vascular, hipertensión pulmonar, disminución de la distensibilidad pulmonar, leucopenia y trombocitopenia . Dímero-D: Como se utiliza en la presente, dímero-D se refiere a un producto de la degradación de la fibrina que se produce durante la descomposición de coágulos sanguíneos por parte de la plasmina enzimática. Los anticuerpos monoclonales específicamente reactivos contra el dímero-D se encuentran fácilmente disponibles, por ejemplo, DD-3B6/22 (Elms et al., 1986, Am J Clin Pathol . 85:360-4). Rutinariamente se realizan mediciones clínicas de los niveles de dímero-D, por ejemplo, utilizando un estudio de la aglutinación de glóbulos rojos, un ELISA, etc. (analizado en Dempfle, Semin Vasc Med, noviembre de 2005; 5 ( 4 ) : 315-20) . Las mediciones del dímero-D pueden¦ variar dependiendo del método de medición y el laboratorio de análisis. No obstante, se puede establecer fácilmente un "rango de referencia" normal para cualquier método y laboratorio de análisis particular, por ejemplo, mediante la realización de mediciones de individuos saludables. Por consiguiente, un experto en la técnica entiende que un nivel elevado de dimero-D se refiere a un nivel de dimero-D que supera el rango de referencia para un método y un laboratorio de análisis particulares.
Perfil de coagulación : Como se utiliza en la presente, el perfil de coagulación se refiere en general al funcionamiento del sistema de coagulación. Tanto la via del factor tisular (extrínseca) como la de la activación por contacto (intrínseca) de coagulación son componentes del perfil de coagulación. Un perfil de coagulación normal se refiere a una coagulación que funciona como en un individuo normal y saludable, es decir, se mantiene el equilibrio entre la capacidad de controlar la hemorragia y la tendencia hacia una coagulación excesiva (tendencia trombótica) . Un perfil de coagulación anormal puede ser una disminución o aumento en la tendencia de coagulación. Un perfil de coagulación particularmente anormal !es la hipercoagulación, que se refiere a un gran aumento en el riesgo de formación de coágulos excesiva, lo que da como resultado un alto riesgo de trombosis. El perfil de coagulación se! puede evaluar mediante diversas pruebas y análisis conocidos: en la técnica, como: la prueba de tiempo de tromboplastina parcial activado (aPTT) , la prueba de tiempo de protrombina (PT) j (rango de referencia típica de 12 a 15 segundos) , las mediciones derivadas de la prueba de PT, como la tasa de protrombina (PR) y la tasa normalizada internacional (INR) (rango de referencia típico de 0.8 a 1.2), la prueba del fibrinógeno (por ejemplo, el método de Clauss (Clauss A, "Rapid Physiological Coagulation Method for the Determination of Fibrinogen [Alemán] , "Acta Haematol, 1957, 17:237-46) o el método de Ellis (Ellis BC y Stransky A, "A Quick and Accurate Method for the Determination of Fibrinogen in Plasma, "J Lab Clin Med, 1961, 58:477-88), ensayos de resistencia a la proteína C activada, proteína C, proteína S y antitrombina, ensayos de anticuerpos antifosfolípidos (anticuerpos anticardiolipina y anticoagulante lúpico) , homocisteína elevada, ensayos de plasminógeno, disfibrinogenemia, cofactor II de la heparina o hiperagregabilidad plaquetaria. Otros ensayos útiles para evaluar el perfil de coagulación incluyen la medición de los factores de coagulación y/o los indicadores de coagulación, como los niveles de dímero-D, Factor II, Factor V, Factor VIII, Factor IX, Factor XI, Factor XII, productos de la degradación de F/fibrina, complejo de trombina-antitrombina ' III, trombocitosis, fibrinógeno, plasminógeno, protrombina y · factor de von Willebrand en suero. El empeoramiento del perfil de coagulación se refiere a un cambio medible de un indicador de coagulación, por ejemplo, cualquiera de los ensayos antemencionados, que refleja un deterioro de la tendencia de coagulación normal, de forma tal que el valor medido se torna anormal o se desvía aun más que antes del rango normal. La mejora del perfil de coagulación se refiere a un cambio medible de un indicador de coagulación, por ejemplo, cualquiera de los ensayos antemencionados, que refleja una restitución parcial o total de la tendencia de coagulación normal, es decir, luego de una intervención terapéutica, como la administración , de un anticuerpo anti-IL-6, el valor medible se encuentra en el rango normal o más cercano al rango normal que antes !de la intervención terapéutica.
Enfermedad o afección: Como se usa en la presente, "enfermedad o afección" refiere a una enfermedad o afección que se le diagnosticó a un paciente o que se sospecha que padezca, particularmente, una enfermedad o afección asociada con una IL-6 elevada. Una enfermedad o afección comprende, a modo no taxativo, los efectos secundarios de medicaciones o tratamientos (tales como terapia de radiación) , asi como afecciones idiopáticas caracterizadas por síntomas que incluyen una IL-6 elevada.
Caquexia: Como se utiliza en la presente, caquexia, también conocida como enfermedad consuntiva, se refiere a cualquier enfermedad marcada especialmente por demacración progresiva, debilidad, insalubridad general, desnutrición, pérdida de masa corporal, pérdida de masa muscular : o una pérdida acelerada de músculo esquelético en el contexto de una respuesta inflamatoria crónica (analizado en Kotler, Ann Intern Med. 17 de octubre de 2000; 133 ( 8 ): 622-34 ) . Las enfermedades y afecciones en las que se observa frecuentemente la caquexia incluyen cáncer, artritis reumatoide, SIDA, enfermedad coronaria, deshidratación, desnutrición, exposición al plomo, malaria, enfermedad respiratoria, vejez, hipotiroidismo, tuberculosis, hipopituitarismo, neurastenia, hipernatremia , hiponatremia, enfermedad renal, esplénica, espondilitis anquilosante, síndrome del declive (retraso del crecimiento) y otras enfermedades, particularmente, enfermedades crónicas. La caquexia también puede ser idiopática (que surge de una causa incierta) . Se entiende que la evaluación del peso en un paciente excluye los tumores o la acumulación de fluidos, por ejemplo, peso del tumor, acumulación de fluido extravascular, etc. La caquexia se puede evaluar mediante la medición; de la masa corporal total del paciente (excepto los tumores o la acumulación de fluidos) , la masa corporal magra total (sin grasa) , la masa magra de brazos y piernas (masa magra apendicular, por ejemplo, medida usando absorciometría de rayos x de energía dual o espectroscopia de impedancia bioeléctrica) y/o el índice de masa corporal magra (masa corporal magra dividida por la altura del paciente al cuadrado) . Véase Kotler, Ann Intern Med. 17 de octubre de 2000; 133 ( 8 ): 622-34 ; Marcora et al., Rheumatology (Oxford), noviembre 2006; 45 ( 11) : 1385-8.
Debilidad: Como se utiliza en la presente, la debilidad se refiere a fatiga física, que típicamente se manifiesta como una pérdida de fuerza muscular y/o resistencia. La debilidad puede ser central (afecta la mayoría o todos los músculos del cuerpo) o periférica (afecta un subgrupo de músculos) . La debilidad incluye la "debilidad verdadera", donde los músculos del paciente presentan una disminución en alguna medida del gasto de fuerza sostenido y la "debilidad percibida", donde un paciente percibe que se necesita un mayor esfuerzo para realizar una tarea aun si, objetivamente, la fuerza medida se mantiene prácticamente igual y la puede medir de forma objetiva o autoinformar el paciente. A modo de ejemplo, la debilidad se puede medir de manera objetiva utilizando la prueba de fuerza de prensión (una prueba reconocida en medicina para evaluar la fuerza muscular) , típicamente utilizando un dinamómetro prensión manual.
Fatiga: Como se usa en la presente, la fatiga se refiere a fatiga mental (para fatiga física véase "debilidad") . La fatiga incluye sopor (somnolencia) y/o disminución de la atención. La fatiga se puede medir usando una variedad de pruebas conocidas en la técnica, tales como la prueba FACIT-F (evaluación funcional para el tratamiento de enfermedades crónicas y de la fatiga) . Véase, por ejemplo, Celia, D., Lai, J.S., !chang, C.H., Peterman, A., & Slavin, M. (2002). Fatigue in cáncer patients compared with fatigue in the general population. Cáncer, 94(2), 528-538; Celia, D., Eton, D.T., Lai , F J-S., Peterman, A.H & Merkel, D.E. (2002). Combining anchor and distribution based methods to derive minimal clinically important differences on the Functional Assessment of Cáncer Therapy anemia and fatigue scales. Journal of Pain & Symptom Management, 24 (6) 547-561.).
Fiebre: Como se utiliza en la presente, "fiebre" se refiere al punto de referencia de temperatura corporal que se encuentra aumentado en al menos 1 a 2 grados Celsius. La fiebre se asocia comúnmente con un sentimiento subjetivo de hipotermia que se manifiesta como una sensación de frió, temblores, aumento de la frecuencia cardiaca y la frecuencia respiratoria, por lo que el cuerpo del individuo alcanza el punto de referencia aumentado. Como se entiende en medicina, la temperatura corporal normal típicamente varía según el nivel de actividad y el momento del día. Las temperaturas más altas se observan en las horas de la tarde y temprano en la noche y las temperaturas más bajas se observan durante la segunda mitad del ciclo de sueño. Las mediciones de temperatura pueden, estar influenciadas por factores externos tales como la respiración por la boca, el consumo de comida o bebida, el hecho de fumar o la temperatura ambiente (dependiendo del tipo de medición) .
Asimismo, el punto de referencia de temperatura normal para los individuos puede variar en hasta alrededor de 0.5 grados Celsius, por consiguiente, un profesional médico puede interpretar la temperatura de un individuo según estos factores para diagnosticar si tiene fiebre. En términos generales, la fiebre se diagnostica típicamente cuando hay una temperatura interna corporal por encima de los 38.0 grados Celsius, una temperatura oral por encima de los 37.5 grados Celsius o una temperatura axilar por encima de los 37.2 grados Celsius.
Mejorado/a: Como se usa en la presente, "mejorado/a", "mejoría" y otras variantes gramaticales incluyen cualquier cambio beneficioso que resulte de un tratamiento. Un cambio beneficioso es cualquier forma en la que el estado del paciente sea mejor de lo que sería sin el tratamiento. "Mejorado/a" incluye la prevención de una afección indeseada, la ralentización del ritmo de empeoramiento de la afección, el retardo del desarrollo de una afección indeseada ' y el restablecimiento de un estado esencialmente normal. Por ejemplo, la mejoría de la caquexia comprende cualquier aumento de la masa del paciente, tal como la masa corporal total (con exclusión del peso que normalmente se excluye durante la evaluación de la caquexia, por ejemplo, el peso del tumor, la acumulación de fluido extravascular, etc.), la masa corporal magra y/o la masa magra apendicular, así como cualquier retraso o ralentización del ritmo de pérdida de masa o prevención o ralentización de la pérdida de masa asociado a una enfermedad o afección que se diagnosticó al paciente. Para otro ejemplo, la mejoría en la debilidad comprende cualquier aumento en la fuerza del paciente, asi como cualquier retardo o ralentización del ritmo de pérdida de fuerza o prevención o ralentización de la pérdida de fuerza asociado con una enfermedad o afección que se diagnosticó al paciente. Como un ejemplo adicional, la mejoría en la fatiga comprende cualquier disminución : de la fatiga del paciente, así como cualquier retardo o ralentización del ritmo de aumento de la fatiga o prevención o ralentización del aumento de la fatiga asociado con una enfermedad o afección que se diagnosticó al paciente. Como otro ejemplo adicional, la mejoría en la fiebre comprende cualquier disminución de la fiebre del paciente, así como cualquier retardo o ralentización del ritmo de aumento de la fiebre o prevención o ralentización del aumento de la fiebre asociado con una enfermedad o afección que se diagnosticó al paciente.
Proteína C-reactiva (CRP) : Como se usa en la presente, la proteína C-reactiva (CRP) no solo comprende la siguiente secuencia de 224 aminoácidos disponible como No. De 'acceso GenBank a la proteína NP_000558: MEKLLCFLVLTSLSHAFGQTD SRKAFVFPKESDTSYVSLKAPLTKPLKAFTVCLHFY TELSSTRGYSIFSYATKRQDNEILIFWSKDIGYSFTVGGSEILFEVPEVTVAPVHICTSWESA SGIVEFWVDGKPRVRKSLKKGYTVGAEASIILGQEQDSFGGNFEGSQSLVGDIGNVNMWDFVL SPDEINTIYLGGPFSPNVLNWRALKYEVQGEVFTKPQL P (SEQ ID NO: 726), sino también cualquier forma pre-pro, pro- y madura de esta secuencia de aminoácidos de CRP, asi como mutantes y variantes que incluyen variantes alélicas de esta secuencia. Los niveles de CRP, por ejemplo en suero, hígado, tumor o en cualquier otra parte del cuerpo, pueden medirse fácilmente usando métodos de rutina y reactivos comercialmente disponibles, por ejemplo, ELISA, tira de prueba del anticuerpo, inmunoturbidimetría, inmunodifusión rápida, aglutinación visual, Western blot, Northern blot, etc. Como se mencionó anteriormente, los niveles de CRP también pueden medirse en pacientes que tienen o están en riesgo de desarrollar trombosis de acuerdo con la invención.
Receptor de interleucina-6 (IL-6R) , también denominado receptor de IL-6 alfa (IL-6RA) : Tal como se usa en la presente, "receptor de interleucina-6" ("IL-6R", también "receptor de IL-6 alfa" o "IL-6RA") no solo comprende la siguiente secuencia de 468 aminoácidos disponible como No. De acceso de Swiss-Prot a la proteína P08887: MLAVGCALLAALLAAPGAALAPRRCPAQEVARGVLTSLPGDSVTLTCPGVEPEDNATVHWVLR KPAAGSHPSRWAGMGRRLLLRSVQLHDSGNYSCYRAGRPAGTVHLLVDVPPEEPQLSCFRKSP LSNVVCEWGPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAEDFQEPCQYSQESQKFSCQLAVPEGDSSFYI VSMCVASSVGSKFSKTQTFQGCGILQPDPPANITVTAVARNPRWLSVTWQDPHSWNSSFYRLR FELRYRAERSKTFTTWMVKDLQHHCVIHDAWSGLRHVVQLRAQEEFGQGEWSE SPEAMGTPW TESRSPPAENEVSTPMQALTTNKDDDNILFRDSANATSLPVQDSSSVPLPTFLVAGGSLAFGT LLCIAIVLRFKKTWKLRALKEGKTSMHPPYSLGQLVPERPRPTPVLVPLISPPVSPSSLGSDN TSSHNRPDARDPRSPYDISNTDYFFPR (SEQ ID NO: 727), sino también cualquier forma pre-pro, pro- y madura de esta secuencia de aminoácidos, asi como mutantes y variantes que incluyen variantes alélicas de esta secuencia. gpl30: Como se utiliza en la presente, el gpl30 (también denominado receptor de interleucina-6 subunidad beta) no solo comprende la siguiente secuencia precursora de 918 aminoácidos disponible como No. de acceso de Swiss-Prot a la proteina: P40189: LTLQTWVVQALFIFLTTESTGELLDPCGYISPESPVVQLHSNFTAVCVLKEKCMDYFHVNAN YIVWKTNHFTIPKEQYTIINRTASSVTFTDIASLNIQLTCNILTFGQLEQNVYGITIISGLPP EKPKNLSCIVNEGKKMRCE DGGRETHLETNFTLKSEWATHKFADCKAKRDTPTSCT.VDYSTV YFVNIEV VEAENALGKVTSDHINFDPVYKVKPNPPHNLSVINSEELSSILKLT TNPSIKSV IILKYNIQYRTKDASTWSQIPPEDTASTRSSFTVQDLKPFTEYVFRIRCMKEDGKGYWSD SE EASGITYEDRPSKAPSF YKIDPSHTQGYRTVQLVWKTLPPFEANGKILDYEVTLTRWKSHLQ NYTVNATKLTVNLTNDRYLATLTVRNLVGKSDAAVLTIPACDFQATHPVMDLKAFPKDN L V E TTPRESVKKYILE CVLSDKAPCITD QQEDGTVHRTYLRGNLAESKCYLITVTPVYADGP GSPESIKAYLKQAPPSKGPTVRTKKVGKNEAVLEWDQLPVDVQNGFIRNYTIFYRTIIGNETA VNVDSSHTEYTLSSLTSDTLYMVRMAAYTDEGGKDGPEFTFTTPKFAQGEIEAIVVPVCLAFL LTTLLGVLFCFNKRDLIKKHI PNVPDPSKSHIAQ SPHTPPRHNFNSKDQ YSDGNFTDVSV VEIEANDKKPFPEDLKSLDLFKKEKINTEGHSSGIGGSSCMSSSRPSISSSDENESSQNTSST VQYSTVVHSGYRHQVPSVQVFSRSESTQPLLDSEERPEDLQLVDHVDGGDGILPRQQYFKQNC SQHESSPDISHFERSKQVSSVNEEDFVRLKQQISDHISQSCGSGQMK FQEVSAADAFGPGTE GQVERFETVGMEAATDEGMPKSYLPQTVRQGGYMPQ (SEQ ID NO : 728), sino también cualquier forma pre-pro, pro- y madura de esta secuencia de aminoácidos, tal como las formas maduras codificadas por los aminoácidos 23 a 918 de la secuencia mostrada, asi como mutantes y variantes que incluyen variantes alélicas de esta secuencia.
Escala de Pronóstico de Glasgow (GPS) : Como se usa en la presente, la escala de pronóstico de Glasgow (GPS) se refiere a un valor basado en la inflamación que otorga un punto a un nivel de albúmina en suero menor a < 35 mg/L y un punto a un nivel de CRP por encima de 10 mg/L. Por consiguiente, un GPS de 0 indica albúmina y CRP normales, un GPS de 1 indica menos albúmina o más CRP de lo normal y un GPS de 2 indica menos albúmina y más CRP de lo normal.
Cantidad eficaz: Como se usa en la presente, "cantidad eficaz", "cantidad eficaz para", "cantidad de X eficaz para" y similares, se refieren a una cantidad de un ingrediente ' activo eficaz para aliviar o reducir en alguna medida uno o más ' de los síntomas de la enfermedad que necesita tratamiento ó para retardar el inicio de síntomas o marcadores clínicos de una enfermedad que necesita prevención, cuando se administra el compuesto. Por consiguiente, una cantidad eficaz se refiere a una cantidad del ingrediente activo que presenta efectos tales como (i) revertir el ritmo de avance de una enfermedad, (ii) inhibir en alguna medida un mayor avance de la enfermedad y/o (iii) aliviar en alguna medida (o, preferentemente, eliminar) uno o más síntomas asociados con la enfermedad. La cantidad eficaz puede determinarse empíricamente mediante la experimentación con los compuestos implicados en sistemas modelo in vivo e in vitro conocidos para una enfermedad que necesita tratamiento. El contexto en el que se usa la frase "cantidad eficaz" puede indicar un efecto deseado particular. A modo de ejemplo, "una cantidad de un anticuerpo anti-IL-6 eficaz para prevenir o tratar un estado hipercoagulable" y frases similares se refieren a una cantidad de un anticuerpo anti-IL-6 que, cuando se administra a un sujeto, provoca una mejora medible en el perfil de coagulación del sujeto o previene, ralentiza, retarda o detiene un empeoramiento del perfil de coagulación que representa un riesgo para el sujeto. De manera similar, "una cantidad de un anticuerpo anti-IL-6 eficaz para reducir los niveles de CRP en suero" y frases similares se refieren a una cantidad de anticuerpo anti-IL-6 que, cuando se administra a un sujeto, provoca una disminución medible de los niveles de CRP en suero o previenen, ralentiza, retarda o detiene un aumento de los niveles de CRP en suero que ponen en riesgo al paciente. De manera similar, "una cantidad de un anticuerpo anti-IL-6 eficaz para aumentar los niveles de albúmina en suero" y frases similares se refieren a una cantidad de anticuerpo anti-IL-6 que, cuando se administra a un sujeto, provoca un aumento medible de los niveles de albúmina en suero o previene, ralentiza, retarda o detiene una disminución de los niveles de albúmina en suero que ponen en riesgo al paciente. De manera similar, "una cantidad de un anticuerpo anti-IL-6 eficaz para reducir la debilidad" y frases similares se refiere a una cantidad de anticuerpo anti-IL-6 que, cuando se administra a un sujeto, causa una disminución medible de la debilidad según lo determina la prueba de fuerza de prensión. De manera similar, "una cantidad de un anticuerpo anti-IL-6 eficaz para aumentar el peso" y frases similares se refieren a una cantidad de anticuerpo anti-IL-6 que, cuándo se administra a un sujeto, provoca un aumento medible en el peso del paciente. Una cantidad eficaz variará de acuerdo ,con el peso, el sexo, la edad y el historial médico del individuo, asi como la gravedad de la o las afecciones del paciente, él tipo de enfermedad o enfermedades, el modo de administración y similares. Una cantidad eficaz se puede determinar fácilmente usando experimentos de rutina, por ejemplo, mediante valoración (administración de dosis crecientes hasta que se encuentra una dosis eficaz) y/o referencia a cantidades que fueron eficaces en pacientes anteriores. En general, los anticuerpos anti-IL-6 de la presente invención se administrarán en dosis que , varíen entre alrededor de 0.1 mg/kg y alrededor de 20 mg/kg del peso corporal del paciente.
Mejora prolongada del perfil de coagulación : Como se utiliza en la presente, "mejora prolongada del perfil de coagulación" y frases similares se refieren a una mejora medible del perfil de coagulación del sujeto con respecto al perfil de codificación inicial (es decir, el perfil de coagulación antes del inicio del tratamiento) que se puede detectar aproximadamente una semana a partir del inicio del tratamiento (por ejemplo, administración de un antagonista de IL-6 como Abl) y permanece mejorado por un periodo prolongado, por ejemplo, al menos alrededor de 14 días, al menos alrededor de 21 días, al menos alrededor de 28 días, al menos alrededor de 35 días, al menos alrededor de 40 días, al menos alrededor de 50 días, al menos alrededor de 60 días, al menos alrededor de 70 días, al menos alrededor de 11 semanas o al; menos alrededor de 12 semanas a partir del inicio del tratamiento.
Reducción prolongada de la CRP en suero: Como se usa en la presente, "reducción prolongada de la CRP en suero" y frases similares se refieren a una disminución medible del nivel de CRP en suero con respecto al nivel inicial de CRP en suero (es decir, el nivel de CRP en suero antes del inicio del tratamiento) que se puede detectar aproximadamente una semana a partir del inicio del tratamiento (por ejemplo, administración de un anticuerpo anti-IL-ß) y permanece por debajo dei nivel inicial de CRP en suero durante un periodo prolongado, por ejemplo al menos alrededor de 14 días, al menos alrededor de 21 días, al menos alrededor de 28 días, al menos alrededor de 35 días, al menos alrededor de 40 días, al menos alrededor de 50 días, al menos alrededor de 60 días, al menos alrededor de 70 días, al menos alrededor de 11 semanas o al menos alrededor de 12 semanas a partir del inicio del tratamiento.
Aumento prolongado de la albúmina en suero: Como se utiliza en la presente, "aumento prolongado de la albúmina en suero" y frases similares se refieren a una disminución medible del nivel de albúmina en suero con respecto al nivel inicial de albúmina en suero (es decir, el nivel de albúmina en suero antes del inicio del tratamiento) que se puede detectar , dentro de aproximadamente una semana a partir del inicio del tratamiento (por ejemplo, administración de un anticuerpo anti-IL-6) y permanece por encima del nivel inicial de albúmina en suero durante un periodo prolongado, por ejemplo, al menos alrededor de 14 días, al menos alrededor de 21 días, al menos alrededor de 28 dias, al menos alrededor de 35 días, al menos alrededor de 40 dias, al menos alrededor de 50 dias, al menos alrededor de 60 dias, al menos alrededor de 70 dias, al menos alrededor de 11 semanas o al menos alrededor de 12 semanas a partir del inicio del tratamiento.
Mejoría prolongada de la caquexia: Como se usa en la presente, "mejoría prolongada de la caquexia" se refiere a una mejoría medible de la masa corporal, la masa corporal magra, la masa corporal magra apendicular y/o el índice de masa corporal magra del paciente, con respecto al nivel inicial (es decir, el nivel antes del inicio del tratamiento) que se puede detectar dentro de aproximadamente 4 semanas y permanece méjorado durante un período prolongado, por ejemplo, al menos alrededor de 35 días, al menos alrededor de 40 días, al menos alrededor de 50 días, al menos alrededor de 60 días, al menos alrededor de 70 días, al menos alrededor de 11 semanas o al menos alrededor de 12 semanas a partir del inicio del tratamiento Mejoría prolongada en la debilidad: Como se usa , en la presente, "mejoría prolongada de la debilidad" se refiere a una mejoría medible de la fuerza muscular, con respecto al nivel inicial (es decir, el nivel antes del inicio del tratamiento) que se puede detectar dentro de aproximadamente 2 semanas y permanece mejorada durante un período prolongado, por ejemplo, al menos alrededor de 21 días, al menos alrededor de 28 días, al menos alrededor de 35 días, al menos alrededor de 40 días, al menos alrededor de 50 días, al menos alrededor de 60 días, al menos alrededor de 70 días, al menos alrededor de 11 semanas o al menos alrededor de 12 semanas a partir del inicio del tratamiento .
Mejoría prolongada de la fatiga: Como se usa en la presente, "mejoría prolongada de la fatiga" se refiere' a una mejoría medible de la fatiga, con respecto al nivel inicial (es decir, el nivel antes del inicio del tratamiento) que se puede detectar durante aproximadamente 1 semana y permanece mejorada durante un período prolongado, por ejemplo, al . menos aproximadamente 14 días, al menos alrededor de 21 días, al menos alrededor de 28 días, al menos alrededor de 35 días, al menos alrededor de 40 días, al menos alrededor de 50 días, al menos alrededor de 60 días, al menos alrededor de 70 días, al menos alrededor de 11 semanas o al menos alrededor de 12 semanas a partir del inicio del tratamiento.
Mejoría prolongada de la fiebre: Como se usa ' en la presente, "mejoría prolongada de la fiebre" se refiere a una disminución medible de la fiebre (por ejemplo, la temperatura pico o la cantidad de tiempo en que la temperatura permanece alta) , con respecto al nivel inicial (es decir, el nivel antes del inicio del tratamiento) que se puede detectar dentro de aproximadamente 1 semana y permanece mejorada durante un período prolongado, por ejemplo, al menos alrededor de 14 días, al menos alrededor de 21 días, al menos alrededor de 28 días, menos alrededor de 35 días, al menos alrededor de 40 días menos alrededor de 50 días, al menos alrededor de 60 días menos alrededor de 70 días, al menos inicio del tratamiento.
Especies de levadura que pueden aparearse: La presente invención pretende comprender ampliamente cualquier levadura diploide o tetraploide que puede crecer en cultivo. Tales especies de levadura pueden existir en forma haploide, diploide o tetraploide- Las células de una determinada ploidía pueden, en condiciones apropiadas, proliferar en dicha forma por un número indeterminado de generaciones. Las células diploides también pueden esporular para formar células haploides. El apareamiento secuencial puede dar como resultado cepas tetraploides mediante apareamiento o fusión adicionales de cepas diploides. En la presente invención, las células de levadura diploides o poliploides son producidas preferentemente por apareamiento o fusión de esferoplastos .
En una modalidad de la invención, la levadura que puede aparearse es miembro de la familia Saccharomycetaceae, que incluye los géneros Arxiozyma, Ascobotryozyma, Cíteromyces, Debaryomyces, Dekkera, Eremothecium, Issatchenkia , Kazachstania , Kluyveromyces, Kodamaea , Lodderomyces, Pachysolen, Pichia, Saccharomyces, Saturnispora , Tetrapisispora , Torulaspora , Williopsis y Zygosaccharómyces .
Otros tipos de levadura potencialmente útiles en la invención incluyen Yarrowia, Rhodosporidium, Candida, Hansenula , Filobasíum, Filobasidellla, Sporidiobolus, Bullera, Leucosporidium y Filobasidella .
En una modalidad preferida de la invención, la levadura que puede aparearse es miembro del género Pichia. En una modalidad adicional preferida de la invención, la levadura que puede aparearse del género Pichia es una de las siguientes especies: Pichia pastoris, Pichia methanolica y Hansenula polymorpha (Pichia angusta) . En una modalidad particularmente preferida de la invención, la levadura del género Pichia que puede aparearse es la especie Pichia pastoris .
Célula de levadura haploide: Célula que tiene una opia única de cada gen de su complemento genómico (cromosómico) normal.
Célula de levadura poliploide: Célula que tiene más de una copia de su complemento genómico (cromosómico) normal.
Célula de levadura diploide: Célula que tiene dos ' copias (alelos) de esencialmente cada gen de su complemento genómico normal, típicamente formadas por el proceso de : fusión (apareamiento) de dos células haploides.
Célula de levadura tetraploide: Célula que tiene cuatro copias (alelos) de esencialmente cada gen de su complemento genómico normal, típicamente formadas por el proceso de fusión (apareamiento) de dos células haploides. Las tetraploides pueden tener dos, tres, cuatro o más casetes de expresión diferentes. Tales tetraploides podrían obtenerse en S. cerevisiae mediante apareamiento selectivo de diploides homocigóticos heterotálicos a/a y alfa/alfa y en Pichia mediante apareamiento secuencial de haploides para obtener diploides auxotróficos . Por ejemplo, una haploide [met his] puede aparearse con una haploide [ade his] para obtener una diploide [his] y una haploide [met arg] puede aparearse con una haploide [ade arg] para obtener una diploide [arg] y luego la diploide [his] x diploide [arg] para obtener un prototrofo tetraploide. Los expertos en la técnica entenderán que la referencia a los beneficios y usos de células diploides también pueden aplicarse a células tetraploides.
Apareamiento de levadura: Proceso por el cual dos células de levadura haploides se fusionan naturalmente para formar una célula de levadura diploide.
Meiosis : Proceso por el cual una célula de levadura iploide se somete a división reductora para formar . cuatro roductos de esporas haploides. Cada espora puede luego germinar y formar una linea celular haploide vegetativamente en crecimiento .
Marcador seleccionable: Un marcador selecciónatele es un gen o fragmento de gen que confiere un fenotipo de crecimiento (característica física de crecimiento) a una célula que recibe dicho gen, por ejemplo, mediante un evento de transformación. El marcador seleccionable permite que la célula sobreviva y crezca en un medio de crecimiento selectivo en condiciones en las que las células que no reciben dicho gen marcador seleccionable no pueden crecer. Los genes marcadores seleccionables generalmente están comprendidos en varios tipos, que incluyen genes marcadores seleccionables positivos, tales como un gen que confiere a una célula resistencia a un antibiótico u otro fármaco, temperatura cuando se cruzan dos mutantes ts o cuando se transforma un mutante ts; los genes marcadores seleccionables negativos, tales como un gen biosintético que confiere a una célula la capacidad de 1 crecer en un medio sin un nutriente específico que necesitan todas las células que no tienen dicho gen biosintético o un gen biosintético mutagenizado que confiere a una célula la incapacidad de crecer mediante células que no tienen el; gen de tipo salvaje y similares. Los marcadores adecuados incluyen pero no se limitan a: ZEO, G418, LYS3, METI, MET3a, ADE1 ^ ADE3, URA3 y similares.
Vector de expresión: Estos vectores de ADN contienen elementos que facilitan la manipulación para la expresión de una proteína extraña dentro de la célula hospedadora objetivo. Convenientemente, la manipulación de secuencias y la producción de ADN para la transformación se lleva a cabo en primer lugar en un huésped bacteriano, por ejemplo, E. coli y, en general, los vectores incluirán secuencias para facilitar dichas manipulaciones, que incluyen un origen bacteriano de replicación y un marcador de selección bacteriano apropiado. Los marcadores de selección codifican proteínas necesarias para la supervivencia o el crecimiento de células hospedadoras transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células hospedadoras no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) brindan resistencia a antibióticos u otras toxinas, (b) complementan deficiencias auxotróficas o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles a partir de medios complejos. Los ejemplos de vectores y métodos de transformación de levadura se describen, por ejemplo, en Burke, D., Dawson,. D., & Stearns, T. (2000). Methods in yeast genetics: :a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. Plainview, N.YJ: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Los vectores de expresión para uso en métodos ' de invención incluirán, adicionalmente, secuencias especificas de levadura que incluyen un auxotrófico o marcador de fármaco seleccionable para identificar las cepas de levadura transformadas. Un marcador de fármaco puede usarse adicionalmente para ampliar el número de copias del vector en una célula hospedadora de levadura.
La secuencia de interés que codifica el polipéptido está operativamente enlazada a secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales que proporcionan la expresión del polipéptido en células de levadura. Estos componentes de vectores pueden incluir, a modo no taxativo, uno o más de los siguientes: un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. También pueden estar incluidas secuencias para la secreción del polipéptido, por ejemplo, una secuencia de señal y similares. Un origen de replicación de levadura es opcional, ya que los vectores de expresión están comúnmente integrados al gerioma de la levadura.
En una modalidad de la invención, el polipéptido de interés está operativamente enlazado o fusionado a secuencias que proporcionan secreción optimizada del polipéptido a partir de células diploides de levadura.
Los ácidos nucleicos están "operativamente enlazados" cuando se colocan en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una secuencia de señal está operativamente enlazado a un ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteina que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente enlazado a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia. Generalmente, "operativamente enlazado" significa que las secuencias de ADN que están enlazadas son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. El enlace se logra mediante la ligadura en sitios de restricción convenientes o, de manera alternativa, mediante un método de PCR/recombinación conocido por aquellos expertos en la técnica (GatewayR Technology; Invitrogen, Carlsbad California) . Si dichos ; sitios no existen, los adaptadores o enlaces de oligonucléótidos sintéticos se usan de acuerdo con la práctica convencional.
Los promotores son secuencias sin traducir situadas corriente arriba (5') del codón inicial de un gen estructural (generalmente entre alrededor de 100 y 1000 bp) que controlan la . transcripción y la traducción de secuencias de ácidos nucleicos particulares a las que están operativamente enlazadas. Dichos promotores están comprendidos en [ varias clases: promotores inducibles, constitutivos y represibles (que aumentan los niveles de transcripción en respuesta a la ausencia de un represor) . Los promotores inducibles pueden iniciar los niveles aumentados de transcripción de ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura.
El fragmento promotor de levadura puede también servir como sitio para la recombinación y la integración homologas del vector de expresión en el mismo sitio en el genoma de levadura; de manera alternativa, se usa un marcador seleccionable como sitio para la recombinación homologa. La transformación de Pichia se describe en Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385.
Los ejemplos de promotores adecuados de Pichia incluyen el AOX1 y el promotor (Cregg et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:1316-1323), el promotor ICL1 (Menendez et al. (2003)· Yeast 20 (13) : 1097-108) , promotor de gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAP) ( aterham et al. (1997) Gene 186 ( 1 ) : 37-44 ) y promotor FLD1 (Shen et al. (1998) Gene 216 ( 1 ) : 93-102 ) . El promotor GAP es un promotor constitutivo fuerte y los promotores AOX y FLD1 son inducibles. : Otros promotores de levadura incluyen ADH1, alcohol deshidrogenasa II, GAL4, PH03, PH05, Pyk y promotores quiméricos derivados de los mismos. Adicionalmente, en la invención pueden usarse promotores que no son de , ales como promotores de mamíferos, insectos, vegetales, reptiles, anfibios, virales y de aves. Más típicamente, el promotor comprenderá un promotor de mamífero (potencialmente endógeno a los genes expresados) o comprenderá un promotor de levadura o viral que proporcione una transcripción eficaz a los sistemas de levadura.
Los polipéptidos de interés pueden producirse de forma recombinante no solo directamente, sino también cómo un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, por ejemplo, una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en la N-terminal del polipéptido o la proteína maduros. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector o puede ser una parte ' de la secuencia que codifica polipéptidos introducida en el vector. La secuencia de señal heteróloga seleccionada es preferentemente una que se reconoce y procesa a través de una de las vías estándar disponibles dentro de la célula hospedadora. La señal pre-pro del factor alfa de S. cerevisiae posee eficacia probada en la secreción de una variedad de proteínas recombinantes de P. pastoris . Otras secuencias de señal de levadura incluyen la secuencia de señal del factor de apareamiento alfa, la secuencia de señal de invertasa y las secuencias de señal derivadas de otros polipéptidos de levadura secretados. Adicionalmente, estas secuencias de péptidos de señal pueden diseñarse para proporcionar una secreción mejorada en los sistemas de expresión de levadura diploides. Otras señales de secreción de interés también incluyen secuencias de señal de mamíferos, que pueden ser heterólogas a la proteína que se secreta o pueden ser una secuencia nativa para la proteína que se secreta. Las secuencias de señal incluyen secuencias prepeptídicas y , en algunos casos, pueden incluir secuencias propeptídicas . Muchas de dichas secuencias de señal son conocidas en la técnica, incluyendo secuencias de señal encontradas en cadenas de inmunoglobulina, por ejemplo, secuencia de preprotoxina K28, PHA-E, FACE, MCP-1 humana, secuencias de señal de albúmina en suero humana, cadena , pesada Ig humana, cadena ligera Ig humana y similares. Por ejemplo, véase Hashimoto et. al. Protein Eng 11(2) 75 (1998) y Kobayashi et. al. Therapeutic Apheresis 2(4) 257 (1998).
La transcripción se puede aumentar insertando una secuencia activadora de la transcripción en el vector.1 Estos activadores son elementos de ADN que actúan en cis, en general, de alrededor de 10 a 300 bp, que actúan en un promotor para aumentar su transcripción. Los potenciadores de transcripción tienen posición y orientación relativamente independientes, habiéndose encontrado en posición 5' y 3' con respecto a la unidad de transcripción, dentro de un intrón, asi como dentro de la secuencia de codificación en si misma. El potenciador puede empalmarse en el vector de expresión en la posición 5' o 3' con respecto a la secuencia de codificación, pero está situado preferentemente en el sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión usados en células hospedadoras eucarióticas pueden también contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están comúnmente disponibles desde 3' hasta el codón de terminación de traducción, en regiones sin traducir de ADN o ADNc eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcriptos como fragmentos poliadenilados en la porción sin traducir del ARNm.
La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes enumerados anteriormente emplea técnicas de ligadura o métodos de PCR/recombinación estándar. Los plásmidos aislados o fragmentos de ADN están escindidos, hechos a medida y religados en la forma deseada para generar los plásmidos necesarios o mediante métodos de recombinación. Para el análisis para confirmar las secuencias correctas en plásmidos construidos, se usan mezclas de ligadura para transformar células hospedadoras y los transformadores satisfactorios seleccionados por resistencia a un antibiótico (por ejemplo, ampicilina o Zeocin™ (fleomicina) ) fueron los adecuados. Los plásmidos de los transformantes se preparan, analizan mediante digestión con endonucleasas de restricción y/o secuencian.
Como una alternativa a la restricción y la ligadura de fragmentos, pueden usarse métodos de recombinación basados en sitios att y enzimas de recombinación para insertar secúencias de ADN en un vector. Dichos métodos son descritos, por ejemplo, por Landy (1989) Ann. Rev. Biochem. 58:913-949' y son conocidos por los expertos en la técnica. Dichos métodos utilizan recombinación de ADN intermolecular mediada por una mezcla de proteínas de recombinación codificadas por lámbda y E.coli. La recombinación ocurre entre sitios de unión (att) específicos en las moléculas de ADN de interacción. Para una descripción de sitios att véase Weisberg and Landy (1983) Site-Specific Recombination in Phage Lambda, in Lambda II, Weisberg, ed. (Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Press), pp.211-250. Los segmentos de ADN que flanquean los sitios de recombinación se cambian, de modo que luego de la recombinación, los sitios att son secuencias híbridas que comprenden secuencias donadas por cada vector parental. La recombinación puede ocurrir entre los ADN de cualquier topología .
Los sitios att pueden introducirse en una secuencia de interés mediante la ligadura de la secuencia de interés; en un vector apropiado, la generación de un producto de PCR que contiene sitios att B mediante el uso de cebadores específicos, la generación de una biblioteca de ADNc clonada en un vector apropiado que contiene sitios att y similares.
El plegamiento, tal como se usa en la presente, se refiere a la estructura tridimensional de polipéptidos y proteínas, donde las interacciones entre los residuos de aminoácidos actúan para estabilizar la estructura. Mientras que las interacciones no covalentes son importantes para determinar la estructura, en general .las proteínas de interés tendrán enlaces de disulfuro covalentes intra- y/o intermoleculares formados por dos residuos de cisteína. Para las proteínas y los polipéptidos de origen natural o derivados y variantes ,de los mismos, el plegamiento apropiado es típicamente el arreglo que da como resultado una actividad biológica óptima y puede controlarse de manera conveniente mediante ensayos de actividad, por ejemplo, unión de ligando, actividad enzimática, etc . : En algunos casos, por ejemplo cuando el producto deseado es de origen sintético, los ensayos basados en actividad biológica serán menos significativos, El plegamiento adecuado de dichas moléculas puede determinarse basándose en propiedades físicas, consideraciones energéticas, estudios de modelado y similares .
El hospedador de expresión se puede modificar adicionalmente mediante la introducción de secuencias que codifican una o más enzimas que potencian el plegamiento y la formación de enlaces de disulfuro, es decir, foldasas, chaperoninas, etc. Tales secuencias se pueden expresar de forma constitutiva o inducible en la célula hospedadora de levadura utilizando vectores, marcadores, etc., según se conoce en la técnica. Preferentemente las secuencias, incluyendo elementos de regulación transcripcional suficientes para el patrón deseado de expresión están integrados de forma estable, en el genoma de levadura a través de una metodología dirigida. 1 Por ejemplo, la PDI eucariótica no solo es un catalizador eficaz de la oxidación de proteina cisteina e isomerización de unión de disulfuro, sino que también exhibe actividad chaperona. La expresión conjunta de PDI puede facilitar la producción de proteínas activas que poseen uniones múltiples de disulfuro. También es de interés la expresión de BIP (proteína de unión a cadena pesada de inmunoglobulina) , ciclofilina y similares. En una modalidad de la invención, cada una de las cepas parentales haploides expresa una enzima de plegamiento distintiva, por ejemplo, una cepa puede expresar BIP y la otra cepa puede expresar PDI o combinaciones de las mismas.
Los términos "proteína deseada" o "proteína objetivo" se usan de manera intercambiable y se refieren, generalmente, a un anticuerpo humanizado o a una porción de unión del' mismo descrito en la presente. El término "anticuerpo" pretende incluir cualquier estructura molecular que contiene una ' cadena de polipéptidos con forma especifica que se adecúa a y reconoce un epitopo, cuando una o más interacciones de unión no covalente estabilizan el complejo entre la estructura molecular y el epitopo. La molécula de anticuerpo arquetipica es la inmunoglobulina y todos los tipos de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, etc., de todas las fuentes, por ejemplo, de humano, roedor, conejo, vaca, oveja, cerdo, perro, , otros mamíferos, pollos, otras aves, etc., se consideran "anticuerpos". Una fuente preferida para producir anticuerpos útiles como material de partida de acuerdo con la invención son los conejos. Se han descrito numerosas secuencias de codificación de anticuerpos y otras pueden surgir mediante métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de las mismas incluyen anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos y otros anticuerpos mamíferos no humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena simple tales como scFvs, anticuerpos de camélidos, nanoanticuerpos, IgNAR (anticuerpos de cadena simple derivados de tiburones) , productos farmacéuticos inmunológicos de molécula pequeña (SMIP) y fragmentos de anticuerpo1 tales como los Fab, Fab' , F(ab' )2 y similares. Véase Streltsov VA, et al., Structure of a shark IgNAR antibody variable domain and modeling of an early-developmental isotype, Protein Sci noviembre de 2005; 14 (11) : 2901-9. Epub 2005 Sep 30; Greenberg AS, et al., A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks, Nature. 9 de marzo de 1995; 374 ( 6518 ): 168-73; Nuttall SD, et al., Isolation of the new antigen receptor from wobbegong sharks, and use as a scaffold for the display of protein loop librarles, Mol Immunol agosto de 2001; 38 ( 4 ): 313-26; Hamers-Casterman C, et al., Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature 3 de junio de 1993; 363 ( 6428 ): 6-8 ; Gilí DS, et al., Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds, Curr Opin Biotechnol. diciembre de' 2006; 17(6): 653-8. Publicación electrónica del 19 de octubre dé 2006.
Por ejemplo, los anticuerpos o los fragmentos de unión al antigeno o las variantes de los mismos se pueden producir mediante ingeniería genética. En esta técnica, al igual que con otros métodos, las células que producen anticuerpos se sensibilizan con el antígeno deseado o inmunógeno. El ARN mensajero aislado de las células que producen anticuerpos se usa como una plantilla para producir ADNc usando amplificación por PCR. Se produce una biblioteca de vectores, donde cada uno contiene un gen de cadena pesada y un gen de cadena ligera que retienen la especificidad inicial del antigeno, mediante inserción de secciones apropiadas del ADNc de inmunoglobulina amplificado en los vectores de expresión. Se construye una biblioteca combinatoria mediante la combinación de la biblioteca de genes de cadena pesada y la biblioteca de genes de cadena ligera. Esto da como resultado una biblioteca de clones que expresan conjuntamente una cadena ligera y pesada (que se asemeja al fragmento Fab o al fragmento de unión al antigeno de una molécula de anticuerpo) . Los vectores que llevan estos genes se cotransfectan en una célula hospedadora. Cuando la síntesis de gen de anticuerpos se induce . en el huésped transíectado, las proteínas de cadena pesada y ligera se ensamblan a sí mismas para producir anticuerpos activos que pueden detectarse mediante análisis con el antígeno o inmunógeno .
Las secuencias de interés que codifican anticuerpos incluyen aquellas codificadas por secuencias nativas, así como ácidos nucleicos que, debido a la degeneración del ' código genético, no son idénticos en secuencia a los ácidos nucleicos descritos y variantes de los mismos. Los polipéptidos variantes pueden incluir sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos (aa) . Las sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones de aminoácidos conservadoras o sustituciones para eliminar aminoácidos no esenciales, como para alterar un sitio de glicosilación o para minimizar el mal plegamiento mediante sustitución o eliminación de uno o más residuos de cisteína que no son necesarios para poder funcionar. Las variantes se pueden diseñar para retener o tener actividad biológica potenciada de una región particular de la proteina (por ejemplo, un dominio funcional, residuos de aminoácidos catalíticos, etc) . Las variantes también incluyen fragmentos de los polipéptidos descritos en la presente, en particular, fragmentos biológicamente activos y/o fragmentos correspondientes a dominios funcionales. Se conocen técnicas para mutagénesis in vitro de genes clonados. También se incluyen en la invención objeto de la presente polipéptidos que han sido modificados usando técnicas biológicas moleculares comunes para mejorar su resistencia a la degradación proteolítica, para optimizar las propiedades de solubilidad o para volverlos más adecuados como agentes terapéuticos.
Los anticuerpos quiméricos se pueden realizar a través de medios recombinantes combinando las regiones de cadena ligera y pesada variables (VL y VH) obtenidas de células que producen anticuerpos de una especie con las regiones constantes de cadena ligera y pesada de otras. Típicamente, los anticuerpos quiméricos utilizan regiones variables de roedores o conejos y regiones constantes humanas para producir un anticuerpo predominantemente con dominios humanos. La producción de dichos anticuerpos quiméricos es conocida en la técnica y puede lograrse a través de medios estándar (como se describe, por ejemplo, en la patente de EUA No. 5,624,659, incorporada en la presente en su totalidad a modo de referencia) . Adicionalmente, se contempla que las regiones constantes humanas de anticuerpos quiméricos de la invención pueden seleccionarse de las regiones constantes IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgGlO, IgGll, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 o IgG19.
Los anticuerpos humanizados están diseñados para contener aun más dominios de inmunoglobulina de tipo humano e incorporar solo las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo derivado de animal. Esto se logra examinando cuidadosamente la secuencia de los bucles hipervariables de las regiones variables del anticuerpo monoclonal y adecuándolos a la estructura de las cadenas de anticuerpo humanas. Aunque el proceso parezca complejo, es sencillo en la práctica. Véase, por ejemplo, la patente de EUA No. 6,187,287, incorporada a la presente en su totalidad a modo de referencia. En una modalidad preferida, la humanización puede afectarse según se describe en detalle más adelante. Este esquema injerta CDRs en FRs humanas altamente homologas al anticuerpo principal que se humaniza.
Además de inmunoglobulinas completas (o sus equivalentes recombinantes ) pueden sintetizarse fragmentos de inmunoglobulina que comprenden el sitio de unión al epitopo (por ejemplo, Fab' , F(ab' )2 u otros fragmentos). Se pueden diseñar "fragmentos" o inmunoglobulinas mínimas utilizando técnicas de inmunoglobulinas recombinantes . Por ejemplo, las inmunoglobulinas "Fv" para uso en la presente invención se pueden producir sintetizando una región de cadena ligera variable fusionada y una región de cadena pesada variable. También son de interés las combinaciones de anticuerpos, por ejemplo, los diacuerpos, que comprenden dos especificidades de Fv distintas. En otra modalidad de la invención, los SMIP (productos farmacéuticos inmunológicos de molécula pequeña) , los anticuerpos de camélidos, los nanocuerpos y los IgNAR están comprendidos en los fragmentos de inmunoglobulina.
Las inmunoglobulinas y los fragmentos de las mismas pueden modificarse postraduccionalmente, por ejemplo, para agregar restos efectores tales como enlaces químicos, restos detectables, tales como tintes fluorescentes, enzimas, toxinas, sustratos, materiales bioluminiscentes , materiales radiactivos, restos quimioluminiscentes y similares o pueden utilizarse los restos de unión específicos, tales como estreptavidina, avidina o biotina y similares en los métodos y las composiciones de la presente invención. En lo sucesivo se proporcionan ejemplos de moléculas efectoras adicionales.
El término "levadura poliploide que expresa de manera estable o expresa un polipéptido heterólogo secretado deseado durante un tiempo prolongado" se refiere a un cultivo de levadura que secreta dicho polipéptido durante al menos varios días hasta una semana, más preferentemente, al menos un mes, aun más preferentemente, al menos 1-6 meses y, aun más preferentemente, durante más de un año a niveles umbral de expresión, típicamente al menos 10-25 mg/litro y, preferentemente, considerablemente mayores.
El término "cultivo de levadura poliploide que secreta cantidades deseadas de polipéptido recombinante" se refiere a cultivos que secretan de manera estable o durante períodos prolongados al menos 10-25 mg/litro de polipéptido heterólogo, más preferentemente, al menos 50-500 mg/litro y, más preferentemente, 500-1000 mg/litro o más.
Una secuencia de polinucleótidos "se corresponde" con una secuencia de polipéptidos si la traducción de la secuencia de polinucleótidos de acuerdo con el código genético produce la secuencia de polipéptidos (es decir, la secuencia de polinucleótidos "codifica" la secuencia de polipéptidos); una secuencia de polinucleótidos "se corresponde" con otra secuencia de polinucleótidos si las dos secuencias codifican la misma secuencia de polipéptidos.
Una región o un dominio "heterólogo" de una construcción de ADN es un segmento identificable de ADN dentro de una molécula de ADN más grande que no se encuentra asociada a la molécula más grande en la naturaleza. Por consiguiente, cuando la región heteróloga codifica un gen de mamífero, el gen en general estará flanqueado por el ADN que no flanquea el ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo original. Otro ejemplo de una región heteróloga es una construcción en ; la que la secuencia de codificación misma no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, un ADNc donde la secuencia de codificación genómica contiene intrones o secuencias sintéticas que poseen codondes diferentes al gen nativo) . Las variaciones alélicas o los eventos mutacionales de origen natural no generan una región heteróloga de ADN como se define en la presente .
Una "secuencia de codificación" es una secuencia , dentro del marco de codondes que (en vista del código genético) se corresponde con o codifica una secuencia de péptido o prpteina.
Dos secuencias de codificación se corresponden entre si si las secuencias o sus secuencias complementarias codifican las mismas secuencias de aminoácidos. Una secuencia de codificación asociada a secuencias reguladoras apropiadas , puede transcribirse y traducirse en un polipéptido. Una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de transcripción en general estarán situadas 3' con respecto a la secuencia de codificación. Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN que puede unirse a la ARN polimerasa ,en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación corriente abajo (dirección 3' ) . Las secuencias promotoras típicamente contienen sitios adicionales para unir moléculas reguladoras (por ejemplo, factores de transcripción) que afectan la transcripción de la secuencia de codificación. Una secuencia de codificación está "bajo el control" de la secuencia promotora o "unida operativamente" al promotor , cuando la ARN polimerasa enlaza la secuencia promotora en una célula y transcribe la secuencia de codificación en ARNm, lo cual luego se traduce a su vez en la proteína codificada por la secuencia de codificación.
Los vectores se usan para introducir una sustancia extraña, tal como ADN, ARN o proteína en un organismo! o una célula hospedadora. Los vectores típicos incluyen1 virus recombinantes (para polinucleótidos ) y liposomas u otros agregados de lipidos (para polipéptidos y/o polinucleótidos ) . Un "vector de ADN" es un replicón, como plásmido, fago o cósmido, al que se le puede unir otro segmento de polinucleótido para provocar la replicación del segmento unido. Un "vector de expresión" es un vector de ADN que contiene secuencias reguladoras que dirigirán la síntesis de polipéptidos mediante una célula hospedadora apropiada. Esto en general significa que un promotor se une a la ARN polimerasa e inicia la transcripción de ARNm, así como los sitios de unión a ribosomas y las señales de iniciación para dirigir la traducción del ARNm en un o unos polipéptidos. La incorporación de una secuencia de polinucleótido en un vector de expresión en el sitio apropiado y en el marco de lectura correcto, seguido por la transformación de una célula hospedadora apropiada por el vector permiten la producción de un polipéptido codificado por dicha secuencia de polinucleótidos. Los ejemplos de vectores de expresión y técnicas para su uso se describen en las siguientes publicaciones: Oíd et al., Principies o'f Gene Manipulation : An Introduction to Genetic Engineering, Blackwell Scientific Publications, 4a edición, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold ' Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Edición, Cold Spring : Harbor Laboratory Press, 2001; Gorman, "High Efficiency Gene Transfer into Mammalian Cells," in DNA Cloning, Volumen II, Glover, D.
M . , Ed., IRL Press, Washington, D.C., pp. 143 190 (1985).
Por ejemplo, un liposoma u otro agregado lipidico puede comprender un lipido, tal como fosfatidilcolinas (lecitinas) (PC), fosfatidiletanolaminas (PE), lisolecitinas , lisofosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas (PS), fosfatidilgliceroles (PG) , fosfatidilinositol (PI), esfingomielinas, cardiolipina, ácidos fosfatidicos (PA), ácidos grasos, gangliósidos , glucolipidos, glicolipidos, mono-, di o triglicéridos , ceramidas, cerebrósidos y combinaciones de los mismos; un lipido catiónico (u otro anfifilo catiónico) tal como 1, 2-dioleiloxi-3- (trimetilamino) propano (DOTAP) , N-colesteriloxicarbaril-3, 7, 12-triazapentadecan-l, 15-diamina (CTAP) , bromuro de N-[l-(2,3, -ditetradeciloxi) propil] -N, -dimetil-N-hidroxietilamonio (DMRIE) , bromuro de N-[l-(2,3,-dioleiloxi) propil] -N, -dimetil-N-hidroxi etilamonio (DORIE) , cloruro de N- [ 1- (2 , 3-dioleiloxi ) propil ] -N, , N-trimetilamonio (DOTMA), 3 beta [N- (N ', ' -dimetilaminoetano) carb moilo] colesterol (DC-Choi) y dimetildioctadecilamonio (DDAB) , dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE) , DOPC que contiene colesterol y combinaciones de los mismos y/o un polímero hidrofílico tal como polivinilpirrolidona, polivinilmetiléter, polimetiloxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropiloxazolina, polihidroxipropilmetacriiamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, polihidroxipropilmetacrilato, polihidroxietilacrilato, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polietileneglicol, poliaspartamida y combinaciones de los mismos. Otros lipidos catiónicos adecuados se describen en Miller, Angew. Chem. Int. Ed. 37:1768 1785 (1998) y Cooper et al., Chem. Eur. J. 4(1): 137 151 (1998) . Los liposomas pueden estar reticulados, parcialmente reticulados o no reticulados. Los liposomas reticulados pueden incluir componentes reticulados asi como no reticulados. Las citofectinas o los liposomas catiónicos adecuados se encuentran comercialmente disponibles y también pueden prepararse según se describe en Sipkins et al., Nature Medicine, 1998, 4 (5): (1998), 623 626 o se describe en Miller, como obra anteriormente. Los ejemplos de liposomas incluyen un lipido neutral o zwiteriónico polimerizable, un lipido que se dirige a la integrina polimerizable y un lipido catiónico polimerizable adecuado para unión de un ácido nucleicp. Los liposomas pueden incluir opcionalmente péptidos que proporcionan mayor eficacia, por ejemplo, como se describe en la patente de EUA No. 7,297,759. Adicionalmente, los ejemplos de liposomas y otros agregados lipidíeos se describen, en la patente de EUA No. 7,166,298.
La "amplificación" de secuencias de polinucleótidos es la producción in vitro de copias múltiples de una secuencia de ácido nucleico particular. La secuencia amplificada están, en general, en forma de ADN. Una variedad de técnicas para llevar a cabo dicha amplificación se describe en una reseña de Van Brunt (1990, Bio/Technol . , 8 ( 4 ) : 291-29 ) . La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es un prototipo de amplificación de ácido nucleico y el uso de PCR en la presente debería considerarse un ejemplo de otras técnicas de amplificación adecuadas .
Actualmente, se entiende bien la estructura general de anticuerpos en vertebrados (Edelman, G. M. , Ann. N.Y.' Acad. Sci, 190: 5 (1971)). Los anticuerpos consisten en dos cadenas ligeras de polipéptidos idénticas con un peso molecular de aproximadamente 23,000 daltons (la "cadena ligera") y dos cadenas pesadas idénticas con un peso molecular de 53,000-70,000 (la "cadena pesada"). Las cuatro cadenas se juntan mediante uniones de disulfuro en una configuración "Y", donde las cadenas ligeras agrupan las cadenas pesadas que comienzan en la boca de la configuración "Y". La porción "rama"' de la configuración "Y" se designa como región Fab, la porción tallo de la configuración "Y" se designa como región Fe. La orientación de la secuencia de aminoácidos va desde el extremo N-terminal al comienzo de la configuración "Y" hasta el extremo C-terminal al final de cada cadena. El extremo N-terminai posee la región variable que tiene especificidad para el antigéno que lo provocó y tiene aproximadamente 100 aminoácidos de longitud.
No obstante, existen pequeñas variaciones entre la dena ligera y pesada, así como de anticuerpo a anticuerpo.
La región variable se enlaza en cada cadena a una región constante que se extiende en la longitud restante de la cadena y que dentro de una clase particular de anticuerpo no varía con la especificidad del anticuerpo (es decir, el antígeno que lo provoca) . Hay cinco clases principales conocidas de regiones constantes que determinan la clase de molécula de inmunoglobulina (IgG, IgM, IgA, IgD e IgE que corresponden a las regiones constantes de cadena pesada ?, µ, a, d, y e (gamma, mu, alfa, delta o epsilon) . La región o clase constante determina la función efectora posterior del anticuerpo, que incluye la activación del complemento (Kabat, E. A., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, 2a Ed., p. 413-436, Holt, Rinehart, Winston (1976)) y otras respuestas celulares (Andrews, D. W. , et al., Clinical Immunobiology, pp 1-18, . B. Sanders (1980); Kohl, S., ét al., Immunology, 48: 187 (1983)), mientras que la región variable determina el antígeno con el cual reaccionará. Las cadenas ligeras se clasifican como ? (kappa) o ? (lambda) . Cada clase de cadena pesada puede emparejarse con una cadena ligera kappa o lambda. Las cadenas ligera y pesada están covalentemente enlazadas entre sí y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas están enlazadas entre sí por medio de enlaces disulfuro covalentes cuando las inmunoglobulinas son generadas por hibridomas o por linfocitos B.
La expresión "región variable" o "VR" se refiere · a los dominios dentro de cada par de cadenas ligera y pesada en un anticuerpo que está directamente involucrado en la unión del anticuerpo al antigeno. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por una cantidad de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (VL) en un extremo y un dominio constante en su otro extremo, el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada.
Las expresiones "región determinante de complementariedad", "región hipervariable" o "CDR" se refieren a una o más de las regiones determinantes de complementariedad o hipervariables (CDRs) que se encuentran en las regiones variables de las cadenas ligera o pesada de un anticuerpo (Véase Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, d., (1987)). Estas expresiones incluyen regiones hipervariables como se define en Kabat et al. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat E . , et al., US Dept. of Health and Human Services, 1983) o los bucles hipervariables en estructuras tridimensionales de anticuerpos (Chothia and Lesk, J Mol. Biol. 196 901-917 (1987)). Las CDR de cada cadena se mantienen a gran proximidad mediante regiones flanqueantes y, con las CDR. de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antigeno. Dentro de las CDR hay aminoácidos selectos que han sido descritos como las regiones determinantes de selectividad (SDRs) que representan los residuos de contacto críticos usados por las CDR en la interacción anticuerpo-antígeno (Kashmiri, S., Methods, 36:25-34 (2005)). En la presente se proporcionan las CDR para ejemplos de anticuerpos anti-IL-6.
Las expresiones "región flanqueante" o "FR" se refieren a una o más de las regiones flanqueantes dentro de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo {Véase Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. , (1987)). Estas expresiones incluyen las regiones de secuencias de aminoácidos interpuestas entre las CDR dentro de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo. Como se menciona en las modalidades preferidas, las FR comprenderán FRs humanas altamente homologas al anticuerpo principal (por ejemplo, anticuerpo de conejo) .
Anticuerpos anti-IL-6 Abl y fragmentos de unión de los mismos La invención incluye anticuerpos que poseen especificidad de unión a IL-6 y secuencias de cadena ligera variable que comprende la secuencia establecida a continuación: MDTRAPTQLLGLLLL LPGARCAYDMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASQSINNELSWYQQKPG QRPKLLIYRASTLASGVSSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQQGYSLRNIDNAFGGG TEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN (SEQ ID NO: 2) o AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNELSWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSLRNIDNAFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 709) y versiones y variantes humanizadas de la misma que incluyen las que se exponen en las Figs. 2 y 34-37, asi como aquellas identificadas en la Tabla 1.
La invención también incluye anticuerpos que poseen especificidad de unión a IL-6 y secuencias de cadena 'pesada variable que comprende la secuencia establecida a continuación: ETGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSNYYVTWVRQAPGKGL EWIGIIYGSDETAYATWAIGRFTISKTSTTVDLK TSLTAADTATYFCARDDSSD DAKFNLW GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK (SEQ ID NO: 3) or EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYYVTWVRQAPGKGLE VGIIYGSDETAYATSA IGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDSSDWDAKFNLWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 657) y versiones y variantes humanizadas de la misma que incluyen las que se exponen en las Figs . 2 y 34-37, asi como aquellas identificadas en la Tabla 1.
La invención incluye, adicionalmente, anticuerpos que poseen especificidad de unión a IL-6 y una secuencia de cadena pesada variable que es una versión modificada de la SEQ ID NO: 3 donde el residuo de triptófano en la CDR2 se cambia a una serina como se expresa a continuación: ETGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSNYYVTWVRQAPGKGL EWIGIIYGSDETAYATSAIGRF ISKTSTTVDLKMTSLTAADTATYFCARDDSSDWDAKFNLW GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK (SEQ ID NO: 658) y versiones y variantes humanizadas de la misma que incluyen las que se exponen en las Figs. 2 y 34-37, asi como aquellas identificadas en la Tabla 1.
La invención contempla adicionalmente anticuerpos que comprenden una o más secuencias de polipéptidos de la SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 que corresponden1 a las regiones determinantes de complementariedad (CDRs o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2 y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de la SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8 o 120 y la SEQ ID NO: 9 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDRs o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3 o 19 o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos . En otra modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención incluyen combinaciones de las CDR y las secuencias de cadenas ligeras y pesadas variables establecidas anteriormente.
En otra modalidad, la invención contempla otros anticuerpos como, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, que comprenden una o más secuencias de polipéptidos de la ¡SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDRs ' o regiones hipervariables ) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2 y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de la SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8 o 120 y la SEQ ID NO: 9 que corresponden a las regiones determinantes de complementáriedad (CDRs o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3 o 19 o com inaciqnes de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad ' de la invención, los anticuerpos de la invención incluyen combinaciones de las CDR y versiones humanizadas de las secuencias de cadenas ligeras y pesadas variables establecidas anteriormente.
La invención también contempla fragmentos del anticuerpo que poseen especificidad de unión a IL-6. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpos de la invención comprenden o, de manera alternativa, consisten en versiones humanizadas de la secuencia de polipéptidos de las SEQ ID NO: 2, 20, 647, 651, 660, 666, 699, 702, 706 o 709. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden o, de manera alternativa, consisten en versiones humanizadas de una secuencia de polipéptidos de las SEQ ID NO: 3, 18, 19, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 704 o 708.
En una modalidad adicional de la invención, los fragmentos del anticuerpo que poseen especificidad de unión a IL-6 comprenden o, de manera alternativa, consisten en una o más secuencias de polipéptidos de la SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDRs o regiones hipervariables ) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2 o ¡ SEQ ID NO: 709. ; En una modalidad adicional de la invención, los fragmentos del anticuerpo que poseen especificidad de unión a IL-6 comprenden o, de manera alternativa, consisten en una o más secuencias de polipéptidos de la SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 120 y SEQ ID NO: 9 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDRs o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3 y 657 o 19.
La invención también contempla fragmentos de anticuerpo que incluyen uno o más fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los fragmentos de los anticuerpos que poseen especificidad de unión a IL-6 comprenden o, de manera alternativa, consisten en uno, dos, tres o más fragmentos de anticuerpo, incluidos todos los siguientes: la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2, la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3, las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 4 ; SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6) de la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2 y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 120 y SEQ ID NO: 9) de la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3 y 657 o 19.
La invención también contempla variantes donde cualquiera de las secuencias de polipéptidos de cadena pesada de la : SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19 sustituyen a la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3 o 657, la secuencia de polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 20 sustituye a la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 709 y la secuencia de CDR de : cadena pesada de la SEQ ID NO: 120 sustituye a la secuencia de CDR de cadena pesada de la SEQ ID NO: 8.
En una modalidad preferida de la invención, el anticuerpo anti-IL-ß es Abl, que comprende la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 o, de manera más particular, un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 657 y SEQ ID NO: 709 (que están codificadas, respectivamente, por las secuencias de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 700 y SEQ ID NO: 723) o una compuesta de las SEQ ID NO alternativas establecidas en el párrafo anterior y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas ' en la presente. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-IL-6 comprenderá al menos una secuencia humanizada como se muestra en las Figuras 34-37.
Las secuencias de anticuerpos anti-IL-6 de la presente invención se muestran en la Tabla 1. Se muestran ejemplos de variantes de secuencias y otras formas alternativas de las cadenas pesada y ligera de Abl a Ab7. Los anticuerpos de la presente invención comprenden variantes de secuencia adicionales que incluyen sustituciones conservadoras, sustituciones de una o más secuencias de CDR y/o secuencias de FR, etc.
Ejemplos de modalidades de Abl incluyen un anticuerpo que comprende una variante de la cadena ligera y/o la ' cadena pesada. Ejemplos de variantes de la cadena ligera de Abl incluyen la secuencia de cualquiera de las cadenas ligeras de Abl que se muestran (es decir, cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 20, 647, 651, 660, 666, 699, 702, 706 o 709) donde se remplaza la totalidad de la secuencia de CDR1 o donde se sustituye uno o más residuos en la secuencia CDRl con el residuo en la posición correspondiente de cualquiera de las otras secuencias de CDRl de cadena ligera establecidas (es decir, cualquiera de las SEQ ID NO: 23, 39, 55, 71, 87, 103, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380;, 396, 412, 428, 444, 460, 476, 492, 508, 524, 540, 556 o 572) y/o donde la totalidad de la secuencia CDR2 se remplaza o donde uno o más residuos en la secuencia de CDR2 se sustituye con el residuo en la posición correspondiente de cualquiera de las otras secuencias de CDR2 de cadena ligera establecidas (es decir, cualquiera de las SEQ ID NO: 24, 40, 56, 72, 88, 104, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365, 381, 397, 413, 429, 445, 461, 477, 493, 509, 525, 541, 557 o 573) y/o donde se remplaza la totalidad de la secuencia de CDR3 o donde se sustituye uno o más residuos en la secuencia de CDR3 con el residuo en la posición correspondiente de cualquiera de las otras secuencias de CDR3 de cadena ligera establecidas (es decir, cualquiera de las SEQ ID NO: 25, 41, 57, 73, 89, 105, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382, 398, 414, 430, 446, 462, 478, 494, 510, 526, 542, 558 o 574) Ejemplos de variantes de la cadena pesada de Abl incluyen la secuencia de cualquiera de las cadenas pesadas de Abl que se muestran (es decir, cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 18, 19, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 704 o 708) donde se remplaza la totalidad de la secuencia de CDR1 o donde se sustituye uno o más residuos en la secuencia de CDR1 con el residuo ' en la posición correspondiente de cualquiera de las otras secüencias de CDR1 de cadena pesada establecidas (es decir, cualquiera de las SEQ ID NO: 26, 42, 58, 74, 90, 106, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367, 383, 399, 415, 431, 447, 463, 479, 495, 511, 527, 543, 559 o 575) y/o donde se remplaza la totalidad de la secuencia de CDR2 o donde se sustituye uno o más residuos en la secuencia de CDR2 con el residuo en la posición correspondiente de una CDR2 de cadena pesada de Abl, como se establece en la Tabla1 1 (es decir, cualquiera de las SEQ ID NO: 8 o 120) o cualquiera de las secuencias de CDR2 de cadena pesada establecidas (es decir, cualquiera de las SEQ ID NO: 27, 43, 59, 75, 91, 107, 121, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, 400, 416, 432, 448, 464, 480, 496, 512, 528, 544, 560 o 576) y/o donde se remplaza la totalidad de la secuencia de CDR3 o donde se sustituye uno o más residuos en la secuencia de CDR3 con el residuo en la posición correspondiente de cualquiera de las otras secuencias de CDR3 de cadena pesada establecidas (es decir, cualquiera de las SEQ ID NO: 28, 44, 60, 76, 92, 108, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369, 385, 401, 417, 433, 449, 465, 481, 497, 513, 529, 545, 561 o 577) .
En otra modalidad, la invención contempla otros anticuerpos como, por ejemplo, anticuerpos quiméricos o humanizados que comprenden una o más secuencias de polipéptidos de la SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: ¡ 6 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDRs o regiones hipervariables ) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2 y/o una o más de las ¦ secuencias de polipéptidos de la SEQ ID NO: 7 (CDR1); SEQ ID NO: 8 (CDR2); SEQ ID NO: 120 (CDR2); y SEQ ID NO: 9 (CDR3) que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDRs o regiones hipervariables) de la secuencia de 'cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 19 o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención incluyen combinaciones de las CDR y las secuencias de cadenas ligeras y pesadas variables establecidas anteriormente, incluidas aquellas establecidas en las Figuras: 2 y 34-37, asi como aquellas identificadas en la Tabla 1.
En otra modalidad, el anticuerpo anti-IL-6 de la invención es uno que comprende al menos una de las siguientes: una cadena ligera de CDRl codificada por la secuencia en SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 694, una cadena ligera de CDR2 codificada por la secuencia en SEQ ID NO: 13, una cadena ligera de CDR3 codificada por la secuencia en SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 695, una cadena pesada de CDRl codificada por la secuencia en1 SEQ ID NO: 15, una cadena pesada de CDR2 codificada por la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 696 y una cadena pesada de CDR3 codificada por la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 697. Adicionalmente, la invención abarca dichas secuencias de ácido nucleico y variantes de las mismas .
En otra modalidad, la invención se dirige a secuencias de aminoácidos que corresponden a las CDR de dicho anticuerpo anti-IL-6 que se seleccionan de la SEQ ID NO: 4 (CDRl), | SEQ ID NO: 5 (CDR2), SEQ ID NO: 6 (CDR3), SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 120 y SEQ ID NO: 9.
En otra modalidad, el anticuerpo anti-IL-6 de la invención comprende una secuencia de ácido nucleico de cadena ligera de la SEQ ID NO: 10, 662, 698, 701, 705, 720, 721, 722 o 723 y/o una secuencia de ácido nucleico de cadena pesada de las , SEQ ID NO: 11, 663, 700, 703, 707, 724 o 725. Adicionalmente, la invención se dirige a los polipéptidos correspondientes codificados por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico anteriores y combinaciones de las mismas.
En una modalidad especifica de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 o una porción de los mismos estarán codificados por una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las comprendidas en SEQ ID NO: 10, 12, 13, 14, 662, 694, 695, 698, 701, 705, 720, 721, 722, 723, 11, 15, 16, 17, 663, 696, 697, 700, 703, 707, 724 y 725. Por ejemplo, la CDR1 en la cadena ligera puede estar codificada por la SEQ ID NO: 12 o 694, la CDR2 en la cadena ligera puede estar codificada por la SEQ ID NO: 13, la CDR3 en la cadena ligera puede estar codificada por la SEQ ID NO: 14 o 695, la CDR1 en la cadena pesada puede estar codificada por la SEQ ID NO: 15, la CDR2 en la cadena pesada puede estar codificada por la SEQ ID NO: 16 o 696, la CDR3 en la cadena pesada puede estar codificada por la SEQ ID NO: 17 o 697. Como se discute a continuación, los anticuerpos que contienen estas CDR pueden crearse ! usando regiones flanqueantes humanas apropiadas basadas en métodos de humanización descritos en la presente.
En otra modalidad especifica de la invención, la : cadena ligera variable estará codificada por la SEQ ID NO: 10, 662, 698, 701, 705, 720, 721, 722 o 723 y la cadena pesada variable de los anticuerpos anti-IL-6 estará codificada por las SEQ ID NO: 11, 663, 700, 703, 707, 724 o 725.
En una modalidad más especifica, las cadenas pesada y ligeras variables del anticuerpo anti-IL-6 estarán codificadas por la SEQ ID NO: 10 y 11 o SEQ ID NO: 698 y SEQ ID NO: 700 o SEQ ID NO: 701 y SEQ ID NO: 703 o SEQ ID NO: 705 y SEQ ID NO: 707.
En otra modalidad especifica, la invención abarca construcciones de ácido nucleico que contienen cualquiera de las secuencias de ácido nucleico precedentes y combinaciones de las mismas, asi como células recombinantes que contienen estas secuencias y construcciones de ácido nucleico, donde' estas secuencias o construcciones de ácido nucleico pueden ser extracromosomales o pueden estar integradas en el genoma de la célula hospedadora.
En otra modalidad especifica, la invención abarca polipéptidos que contienen cualquiera de las CDR o combinaciones de las mismas descritas en la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 9 o polipéptidos que comprenden cualquiera de los polipéptidos de cadena ligera variable comprendidos en las SEQ ID NO: 2, 20, 647, 651, 660, 666, 699, 702, 706 o 709 y/o los polipéptidos de cadena pesada variable comprendidos . en las SEQ ID NO: 3, 18, 19, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 704 o 708. Estos polipéptidos pueden estar opcionalmente unidos, directa o indirectamente, a otros polipéptidos de inmunoglobulina o restos efectores, tales como entidades terapéuticas o detectables.
En otra modalidad, el anticuerpo anti-IL-6 es uno que comprende al menos una de las siguientes: una cadena , ligera variable codificada por la secuencia en SEQ ID NO: 10 o 'SEQ ID NO: 698 o SEQ ID NO: 701 o SEQ ID NO: 705 y una cadena variable codificada por la secuencia en SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 700 o SEQ ID NO: 703 o SEQ ID NO: 707.
En otra modalidad, el anticuerpo anti-IL-6 es una variante de las secuencias precedentes que incluye una o más sustituciones en las secuencias flanqueantes y/o de CDR, y que tiene una o más de las propiedades de Abl in vitro y/o luego de la administración in vivo.
Estas propiedades in vitro e in vivo se describen con más detalle en los ejemplos a continuación e incluyen: competir con Abl para la unión a IL-6 y/o a péptidos de esta, tener una afinidad de unión (Kd) para IL-6 o menor a alrededor, de 50 picomolar y/o una tasa de disociación (Koff) de IL-6 menor o igual a 10~4 S"1, tener una semivida in vivo de al menos alrededor de 22 días en un ser humano saludable, contar con capacidad para prevenir o tratar hipoalbuminemia, capacidad para prevenir o tratar una CRP elevada, capacidad para prevenir o tratar la coagulación anormal y/o capacidad para disminuir el riesgo de trombosis en un individuo con una enfermedad o afección asociada con el riesgo aumentado de trombosis. Ejemplos adicionales no limitantes de la actividad anti-IL-6 se establecen en la presente, por ejemplo, bajo el titulo "Actividad anti-IL-6".
En otra modalidad, el anticuerpo anti-IL-6 incluye' una o más de las secuencias de CDR de cadena ligera y/o pesada de Abl (véase Tabla 1) o una variante o variantes de las mismas que tiene una o más de las propiedades de Abl in vitro y/o luego de la administración in vivo (ejemplos de dichas propiedades se discuten en el párrafo anterior) . Un experto en la técnica entendería cómo combinar estas secuencias de CDR para formar una superficie de unión al antígeno, por ejemplo, por medio de un enlace a uno o más andamiajes que pueden comprender secuencias flanqueantes humanas o de mamífero o sus ortólogos funcionales derivados de un SMIP, anticuerpos de camélido, nanoanticuerpos, IgNAR u otra inmunoglobulina u otro anticuerpo diseñado. Por ejemplo, las modalidades pueden 'unirse específicamente a la IL-6 humana e incluyen una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de las siguientes secuencias de CDR o variantes de las mismas: un polipéptido que posee al menos una identidad de 72.7% (es decir, 8 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera de CDRl de la SEQ ID NO: 4; un polipéptido que posee al menos una identidad de 81.8% (es decir, 9 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera de CDRl de la SEQ ID NO: 4; un polipéptido que posee al menos una identidad de 90.9% (es decir, 10 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera de CDRl de la SEQ ID NO: 4 ; un polipéptido que posee al menos una identidad de 100% (es decir, 11 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera de CDRl de la SEQ ID NO: 4; un polipéptido que posee al menos una identidad de 85.7% (es decir, 6 de 7 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR2 de la SEQ ID NO: 5; un polipéptido que posee al menos una identidad de 100% (es decir, 7 de 7 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR2 de la SEQ ID NO: 5; ' un polipéptido que posee al menos una identidad del 50% (es decir, 6 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polipéptido que posee al menos una identidad del 58.3% (es decir, 7 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO: 6; ¡ un polipéptido que posee al menos una identidad del 66.6% (es decir, 8 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polipéptido que posee al menos una identidad del 75% (es decir, 9 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polipéptido que posee al menos una identidad del 83.3% (es decir, 10 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polipéptido que posee al menos una identidad del 91.6% (es decir, 11 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polipéptido que posee al menos una identidad del 100% (es decir, 12 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polipéptido que posee al menos una identidad del 80% decir, 4 de 5 aminoácidos) con la cadena pesada de CDRl de SEQ ID NO: 7; un polipéptido que posee al menos una identidad del 100% decir, 5 de 5 aminoácidos) con la cadena pesada de CDRl de SEQ ID NO: 7; un polipéptido que posee al menos una identidad del 50% decir, 8 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de SEQ ID NO: 120; un polipéptido que posee al menos una identidad del 56.2% (es decir, 9 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; ¡ un polipéptido que posee al menos una identidad del 62.5% (es decir, 10 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que posee al menos una identidad del 68.7% (es decir, 11 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que posee al menos una identidad del 75% (es decir, 12 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que posee al menos una identidad del 81.2% (es decir, 13 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que posee al menos una identidad del 87.5% (es decir, 14 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que posee al menos una identidad del 93.7% (es decir, 15 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que posee al menos una identidad del 100% (es decir, 16 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; : un polipéptido que posee al menos una identidad del 33.3% (es decir, 4 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos una identidad del 41.6% (es decir, 5 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos una identidad del 50% (es decir, 6 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos una identidad del 58.3% (es decir, 7 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos una identidad del 66.6% (es decir, 8 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos una identidad del 75% (es decir, 9 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos una identidad del 83.3% (es decir, 10 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos una identidad del 91.6% (es decir, 11 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos una identidad del 100% (es decir, 12 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos un 90.9% de similitud (es decir, 10 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera de CDRl de la SEQ ID NO: 4; un polipéptido que posee un 100% de similitud (es decir, 11 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera de CDRl de la SEQ ID NO: 4; un polipéptido que posee al menos un 85.7% de similitud (es decir, 6 de 7 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR2 de la SEQ ID NO: 5; un polipéptido que posee al menos un 100% de similitud (es decir, 7 de 7 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR2 de la SEQ ID NO: 5; un polipéptido que posee al menos un 66.6% de similitud (es decir, 8 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polipéptido que posee al menos un 75% de similitud (es decir, 9 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polipéptido que posee al menos un 83.3% de similitud (es decir, 10 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polipéptido que posee al menos un 91.6% de similitud (es decir, 11 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polipéptido que posee 100% de similitud (es decir, 12 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO: 6/ un polipéptido que posee al menos un 80% de similitud (es decir, 4 de 5 aminoácidos) con la cadena pesada de CDRl de la SEQ ID NO: 7; un polipéptido que posee al menos 100% de similitud (es decir, 5 de 5 aminoácidos) con la cadena pesada de CDRl de la SEQ ID NO: 7 ; un polipéptido que posee al menos 56.2% de similitud (es decir, 9 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que posee al menos 62.5% de similitud (es decir, 10 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que posee al menos 68.7% de similitud (es decir, 11 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que posee al menos 75% de similitud (es decir, 12 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; ; un polipéptido que posee al menos 81.2% de similitud (es decir, 13 de 16 aminoácidos) con- la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que posee al menos 87.5% de similitud (es decir, 14 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; : un polipéptido que posee al menos 93.7% de similitud (es decir, 15 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que posee 100% de similitud (es decir, 16 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polipéptido que posee al menos un 50% de similitud decir, 6 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos un 58.3% de similitud (es decir, 7 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos un 66.6% de similitud (es decir, 8 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos un 75% de similitud (es decir, 9 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos un 83.3% de similitud (es decir, 10 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee al menos un 91.6% de similitud (es decir, 11 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polipéptido que posee 100% de similitud (esto es, 12 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9.
Otros ejemplos de modalidades incluyen uno o más polinucleótidos que codifican cualquiera de las anteriores, por ejemplo, un polinucleótido que codifica un polipéptido que se une de manera especifica a la IL-6 humana e incluye una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de las siguientes variantes de CDR: : un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 72.7% de identidad (es decir, 8 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera de CDRl de la SEQ ID NO: 4; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 81.8% de identidad (es decir, 9 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera de CDRl de la SEQ ID NO: 4; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 90.9% de identidad (es decir, 10 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR1 de la SEQ ID NO: 4; un polinucleótido que codifica un polipéptido con 100% de identidad (es decir, 11 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR1 de la SEQ ID NO: 4; un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos 85.7% de identidad (es decir, 6 de 7 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR2 de la SEQ ID NO: 5; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene un 100% de identidad (es decir, 7 de 7 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR2 de la SEQ ID NO: 5; , un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 50% de identidad (es decir, 6 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 58.3% de identidad (es decir, 7 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO: 6; ! un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 66.6% de identidad (es decir, 8 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 75% de identidad (es decir, 9 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 83.3% de identidad (es decir, 10 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 91.6% de identidad (es decir, 11 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 100% de identidad (es decir, 12 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad (es decir, 4 de 5 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR1 de la SEQ ID NO: 7; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene un 100% de identidad (es decir, 5 de 5 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR1 de la SEQ ID NO: 7; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 50% de identidad (es decir, 8 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; · un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 56.2% de identidad (es decir, 9 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 62.5% de identidad (es decir, 10 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 68.7% de identidad (es decir, 11 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; ; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 75% de identidad (es decir, 12 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 81,2% de identidad (es decir, 13 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleót ido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 87,5% de identidad (es decir, 14 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 93,7% de identidad (es decir, 15 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 100% de identidad (es decir, 16 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 33,3% de identidad (es decir, 4 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 41,6% de identidad (es decir, 5 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 50% de identidad (es decir, 6 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 58,3% de identidad (es decir, 7 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 66,6% de identidad (es decir, 8 de 12 aminoácidos) con I la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; : un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 75% de identidad (es decir, 9 de 12 aminoácidds) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 83,3% de identidad (es decir, 10 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 91,6% de identidad (es decir, 11 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 100% de identidad (es decir, 12 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; ! un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 90,9% de similitud (es decir, 10 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR1 de la SEQ ID NO: 4; un polinucleotido que codifica un polipéptido que tiene 100% de similitud (es decir, 11 de 11 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR1 de la SEQ ID NO: 4; un polinucleotido que codifica un polipéptido que tiene al menos 85,7% de similitud (es decir, 6 de 7 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR2 de la SEQ ID NO: 5; un polinucleotido que codifica un polipéptido que tiene 100% de similitud (es decir, 7 de 7 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR2 de la SEQ ID NO: 5; 1 un polinucleotido que codifica un polipéptido que tiene al menos 66,6% de similitud (es decir, 8 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polinucleotido que codifica un polipéptido que tiene al menos 75% de similitud (es decir, 9 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polinucleotido que codifica un polipéptido que tiene al menos 83,3% de similitud (es decir, 10 de 12 aminoácidos) con cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 91,6% de similitud (es decir, 11 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 100% de similitud (es decir, 12 de 12 aminoácidos) con la cadena ligera de CDR3 de la SEQ ID NO: 6; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 80% de similitud (es decir, 4 de 5 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR1 de la SEQ ID NO: 7; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 100% de similitud (es decir, 5 de 5 aminoácidos) con la , cadena pesada de CDR1 de la SEQ ID NO: 7 ; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 56,2% de similitud (es decir, 9 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 62,5% de similitud (es decir, 10 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 68,7% de similitud (es decir, 11 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 75% de similitud (es decir, 12 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 81,2% de similitud (es decir, 13 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 87,5% de similitud (es decir, 14 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 93,7% de similitud (es decir, 15 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 100% de similitud (es decir, 16 de 16 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR2 de la SEQ ID NO: 120; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 50% de similitud (es decir, 6 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 58,3% de similitud (es decir, 7 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 66,6% de similitud (es decir, 8 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 75% de similitud (es decir, 9 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 83,3% de similitud (es decir, 10 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 91,6% de similitud (es decir, 11 de 12 aminoácidós) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9; un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 100% de similitud (es decir, 12 de 12 aminoácidos) con la cadena pesada de CDR3 de la SEQ ID NO: 9.
Tabla 1. Secuencias de ejemplos de anticuerpos anti-IL 665 7 15 120 696 9 17 704 703 7 15 120 696 9 697 708 707 7 15 120 696 9 697 Cadenas 653 716 717 pesadas humanas 654 716 717 usadas en la humanización de Ab1 655 74 82 718 Cadenas ligeras 21 29 23 31 24 32 25 33 de Ab2 667 669 23 31 24 32 25 33 Cadenas 22 30 26 34 27 35 28 36 pesadas de Ab2 668 670 26 34 27 35 28 36 Cadenas ligeras 37 45 39 47 40 48 41 49 de Ab3 671 673 39 47 40 48 41 49 Cadenas 38 46 42 50 43 51 44 52 pesadas de Ab3 672 674 42 50 43 51 44 52 Cadenas ligeras 53 61 55 63 56 64 57 65 de Ab4 675 677 55 63 56 64 57 65 Cadenas 54 62 58 66 59 67 60 68 pesadas de Ab4 676 678 58 66 59 67 60 68 Cadenas ligeras 69 77 71 79 72 80 73 1 81 de Ab5 679 681 71 79 72 80 73 81 Cadenas 70 78 74 82 75 83 76 84 pesadas de Ab5 680 682 74 82 75 83 76 84 Cadenas ligeras 85 93 87 95 88 96 89 97 de Ab6 683 685 87 95 88 96 89 97 Cadenas 86 94 90 98 91 99 92 \ 100 pesadas de Ab6 684 686 90 98 91 99 92 ' 100 Cadenas ligeras 101 109 103 111 104 1 12 105 : 113 de Ab7 119 103 111 104 1 12 105 : 113 687 689 103 111 104 112 105 113 693 103 111 104 112 105 1 13 102 110 106 114 107 115 108 1 16 117 106 114 107 115 108 1 16 Cadenas 1 18 106 114 121 108 1 16 pesadas de Ab7 688 690 106 114 107 115 108 116 691 106 114 107 1 15 108 1 16 692 106 114 121 108 116 Cadena ligera de Ab8 122 130 124 132 125 133 126 134 Cadena pesada de Ab8 123 131 127 135 128 136 129 137 Cadena ligera de Ab9 138 146 140 148 141 149 142 : 150 Cadena pesada de Ab9 139 147 143 151 144 152 145 153 Cadena ligera de Ab10 154 162 156 164 157 165 158 166 Cadena pesada de Ab10 155 163 159 167 160 168 161 169 Cadena ligera de Ab11 170 178 172 180 173 181 174 182 Cadena pesada de Ab11 171 179 175 183 176 184 177 185 Cadena ligera de Ab12 186 194 188 196 189 197 190 . 198 Cadena pesada de Ab12 187 195 191 199 192 200 193 201 Cadena ligera de Ab13 202 210 204 212 205 213 206 , 214 Cadena pesada de Ab13 203 211 207 215 208 216 209 217 Cadena ligera de Ab14 218 226 220 228 221 229 222 230 Cadena pesada de Ab14 219 227 223 231 224 232 225 233 Cadena ligera de Ab15 234 242 236 244 237 245 238 246 Cadena pesada de Ab15 235 243 239 247 240 248 241 : 249 Cadena ligera 250 258 252 260 253 261 254 262 de Ab16 Cadena pesada de Ab16 251 259 255 263 256 264 257 265 Cadena ligera de Ab17 266 274 268 276 269 277 270 278 Cadena pesada de Ab17 267 275 271 279 272 280 273 281 Cadena ligera de Ab18 282 290 284 292 285 293 286 294 Cadena pesada de Ab18 283 291 287 295 288 296 289 297 Cadena ligera de Ab19 298 306 300 308 301 309 302 310 Cadena pesada de A 9 299 307 303 31 1 304 312 305 313 Cadena ligera de Ab20 314 322 316 324 317 325 318 i 326 Cadena pesada de Ab20 315 323 319 327 320 328 321 329 Cadena ligera de Ab21 330 338 332 340 333 341 334 342 Cadena pesada de Ab21 331 339 335 343 336 344 337 345 Cadena ligera de Ab22 346 354 348 356 349 357 350 358 Cadena pesada de Ab22 347 355 351 359 352 360 353 361 Cadena ligera de Ab23 362 370 364 372 365 373 366 i 374 Cadena pesada de Ab23 363 371 367 375 368 376 369 377 Cadena ligera de Ab24 378 386 380 388 381 389 382 390 Cadena pesada de Ab24 379 387 383 391 384 392 385 393 Cadena ligera de Ab25 394 402 396 404 397 405 398 406 Cadena pesada de Ab25 395 403 399 407 400 408 401 409 Cadena ligera de Ab26 410 418 412 420 413 421 414 í 422 Cadena pesada de Ab26 411 419 415 423 416 424 417 425 Cadena ligera de Ab27 426 434 428 436 429 437 430 438 Cadena pesada de Ab27 427 435 431 439 432 440 433 441 Cadena ligera de Ab28 442 450 444 452 445 453 446 454 Cadena pesada de Ab28 443 451 447 455 448 456 449 457 Cadena ligera de Ab29 458 466 460 468 461 469 462 470 Cadena pesada de Ab29 459 467 463 471 464 472 465 473 Cadena ligera de Ab30 474 482 476 484 477 485 478 486 Cadena pesada de Ab30 475 483 479 487 480 488 481 489 Cadena ligera de Ab31 490 498 492 500 493 501 494 502 Cadena pesada de Ab31 491 499 495 503 496 504 497 505 Cadena ligera de Ab32 506 514 508 516 509 517 510 , 518 Cadena pesada de Ab32 507 515 511 519 512 520 513 521 Cadena ligera de Ab33 522 530 524 532 525 533 526 534 Cadena pesada de Ab33 523 531 527 535 528 536 529 ! 537 Cadena ligera de Ab34 538 546 540 548 541 549 542 : 550 Cadena pesada de Ab34 539 547 543 551 544 552 545 | 553 Cadena ligera de Ab35 554 562 556 564 557 565 558 ' 566 Cadena pesada de Ab35 555 563 559 567 560 568 561 569 Cadena ligera de Ab36 570 578 572 580 573 581 574 582 Cadena pesada de Ab36 571 579 575 583 576 584 577 ' 585 * Ejemplos de formas de variantes de secuencia de cadenas pesadas y ligeras se muestran en lineas separadas.
Secuencia de polipéptidos Ejemplos de secuencia de codificación Como referencia, los identificadores de secuencia distintos a los incluidos en la Tabla 1, se resumen en la Tabla 2.
Tabla 2. Resumen de los identificadores de secuencia en la presente solicitud. pesada constante gamma-1 (difiere de la SEQ ID NO: 518 en dos posiciones) Secuencia de polipéptido de la proteina 726 C-reactiva 727 Receptor de IL-6 alfa 728 Receptor de IL-6 beta / gpl30 Dichos fragmentos o variantes de anticuerpo pueden estar presentes en una o más de las siguientes formas no limitantes: Fab, Fab', F(ab')2, Fv y formas de anticuerpo de cadena simple Fv. En una modalidad preferida, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente comprenden adicionalmente la secuencia de cadena ligera constante kappa que comprende la secuencia establecida a continuación: VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 586) . i En otra modalidad preferida, los anticuerpos antd IL-6 descritos en la presente comprenden adicionalmente la secuencia de polipéptido de cadena pesada constante gamma-1 que comprende una de las secuencias establecidas a continuación: ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE TKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 588) y ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTL ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 719) .
Modalidades de los anticuerpos descritos en la presente pueden incluir una secuencia líder, tal como, un líder Ig de conejo, un prepéptido de albúmina, una secuencia líder de secreción pre o pro del factor de apareamiento de la levadura (tal como P. pastoris o Sa.ccharom.yces cerevisiae o factor alfa) o un líder HAS humano. Ejemplos de secuencias líder se muestran desalineados con respecto a FR1 en la N-terminal de los polipéptidos mostrados en las Figuras 36A y 37A como 'Sigue: Secuencias líder de Ig de ratón de la SEQ ID NOs: 2 y 660 (MD. . .) y SEQ ID NOs: 3 y 661 (ME. . .) y un prepéptido de albúmina en la SEQ ID NOs: 706 y 708, lo que facilita su secreción. También se pueden usar otras secuencias líder conocidas en la técnica para conferir propiedades deseadas, tales como secreción, estabilidad o semivida mejoradas, etc., solas o en combinaciones entre si, en las cadenas pesadas y/o ligeras, que pueden escindirse opcionalmente antes de la administración a un sujeto. Por ejemplo, se puede expresar un polipéptido en un sistema de expresión celular o libre de células, que también expresa o incluye (o se modifica para expresar o incluir) una proteasa, por ejemplo, una peptidasa de señal ligada a la membrana que escinde una secuencia líder.
En otra modalidad, la invención contempla un anticuerpo anti-IL-6 aislado que comprende una secuencia de polipéptido de VH que comprende: SEQ ID NO: 3, 18, 19, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 117, 118, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379, 395, 411, 427, 443, 459, 475, 491, 507, 523, 539, 555, 571, 652, 656, 657', 658, 661, 664, 665, 668, 672, 676, 680, 684, 688, 691, 692, 704 o 708 y comprende también una secuencia de polipéptido de ; VL que comprende: SEQ ID NO: 2, 20, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 119, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298,, 314, 330, 346, 362, 378, 394, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570, 647, 651, 660, 666, 667, 671, 675, 679, 683, 687, 693, 699, 702, 706 o 709 o una variante de las mismas, donde uno o más de los residuos flanqueantes (residuos FR) o residuos CDR en dicho polipéptido de VH 0 VL se sustituyó con otro residuo de aminoácido que da como resultado un anticuerpo anti-IL-6 que se une específicamente a IL:-6. La invención contempla formas humanizadas y quiméricas de estos anticuerpos, preferentemente donde el FR comprenderá FRs humanos altamente homólogos al anticuerpo principal. Los anticuerpos quiméricos pueden incluir un Fe derivado de las regiones constantes IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgGlO, IgGll, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 y IgG19 y, en particular, una región constante de cadena pesada y ligera variable según las contenidas en ,1a SEQ ID NO: 588 y SEQ ID NO: 586.
En una modalidad de la invención, los anticuerpos o los polipéptidos VH o VL se originan o se seleccionan de una o más poblaciones de linfocitos B de conejo antes del inicio del proceso de humanización nombrado en la presente.
En otra modalidad de la invención, los anticuerpos, anti-IL-6 y los fragmentos y las variantes de los mismos ^poseen especificidad de unión a homólogos de primate de la proteína IL-6 humana. Ejemplos no limitantes de homólogos de primate de la proteína IL-6 humana son IL-6 obtenidas a partir de Macaca fascicularis (también conocida como mono macaco) y el macaco Rhesus. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-ß y fragmentos y variantes de los mismos inhiben la asociación de IL-6 con IL-6R y/o la producción de complejos IL-6/IL-6R/gpl30 y/o la producción de multimeros IL-6/IL-6R/gpl30 y/o antagonizan los efectos biológicos de uno o más de los antemencionados .
Como se estableció anteriormente, los anticuerpos y los fragmentos y las variantes de los mismos pueden modificarse postraduccionalmente para agregar restos efectores tales como enlazadores químicos, restos detectables tales como', por ejemplo, tintes fluorescentes, enzimas, sustratos, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos y restos quimioluminiscentes o restos funcionales tales como', por ejemplo, estreptavidina, avidina, biotina, una citotoxina, un agente citotóxico y materiales radiactivos.
En cuanto a restos detectables, ejemplos adicionales de enzimas incluyen, a modo no taxativo, peroxidasa de rábano picante, acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina, betagalactosidasa y luciferasa. Ejemplos adicionales de materiales fluorescentes incluyen, a modo no taxativo, rodamina, fluoresceína, isocianato de fluoresceína, umbelliferona, diclorotriazinilamina, ficoeritrina y cloruro de dansilo. Ejemplos adicionales de restos quimioluminiscentes incluyen, a modo no taxativo, luminol. Ejemplos adicionales de materiales bioluminiscentes incluyen, a modo no taxativa, luciferina y aequorina. Ejemplos adicionales de materiales radiactivos incluyen, a modo no taxativo, Yodo 125 (125I), Carbono Azufre 35 (35S) , Tritio (3H) y Fósforo (32P) .
En cuanto a restos funcionales, ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, a modo no taxativo, metotrexato, aminopterina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo dacarbazina, agentes alquilantes tales, como mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalán, carmustina (BSNU) , mitomicina C, lomustina (CCNU) , 1-metilnitrosourea, ciclofosfamida, mecloretamina, busulfán, dibromomanitol , estreptozotocina, mitomicina C, cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino y carboplatino (paraplatino) ; las antraciclinas incluyen daunorubicina (antiguamente daunomicina) , doxorubicina (adriamicina ) , detorubicina, carminomicina, idarubicina, epirubicina, mitoxantrona y bisantreno; los antibióticos incluyen dactinomicina (actinomicina D) , bleomicina, caliqueamicina, mitramicina y antramicina (AMC) y agentes antimitóticos tales como los alcaloides de la vinca, vincristina y vinblastina. : Otros agentes citotóxicos incluyen paclitaxel (taxol) , ricina, pseudomonas exotoxina, gemcitabina, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, etoposida, tenoposida, colchicina, dihidroxi antracina diona, 1-dihidrotestosterona, glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propr nolol, puromicina, procarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, corticosteroides, mitotano (0, P ' - ( DDD) ) , interferones y mezclas de estos agentes citotóxicos.
Agentes citotóxicos adicionales incluyen, a modo no taxativo, agentes quimioterapéuticos tales como carboplatino, cisplatino, paclitaxel, gemcitabina, calicheamicina, doxorubicina, 5-fluorouraciloo, mitomicina C, actinomicina D, ciclofosfamida, vincristina, bleomicina, antagonistas de, VEGF, antagonistas de EGFR, platinos, taxoles, irinotecano, 5-fluorouraciloo, gemcitabina, leucovorina, esteroides, ciclofosfamida, melfalán, alcaloides de la vinca (por ejemplo, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina) , mustinas, inhibidores de tirosina cinasa, radioterapia, antagonistas de hormonas sexuales, moduladores selectivos del receptor de andrógeno, moduladores selectivos del receptor de estrógeno, antagonistas de PDGF, antagonistas de TNF, antagonistas ;de IL-1, interleucinas (por ejemplo, IL-12 o IL-2), antagonistas de IL-12R, anticuerpos monoclonales conjugados con toxinas, anticuerpos monoclonales específicos contra antígenos tumorales, Erbitux™, Avastin™, Pertuzumab, anticuerpos! anti-CD20, Rituxan®, ocrelizumab, ofatumumab, DXL625, Herceptin® o combinaciones de los mismos. Enzimas tóxicas de plantas y bacterias tales como ricina, toxina difteria y toxina Pseudomonas pueden conjugarse con los anticuerpos humanizados o unirse a fragmentos de los mismos para generar reactivos para la destrucción especifica de un tipo de células (Youle, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5483 (1980); Gilliland, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:4539 (1980); Krolick, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5419 (1980)).
Otros agentes citotóxicos incluyen ribonucleasas citotóxicas como describe Goldenberg en la Patente estadounidense No. 6,653,104. Modalidades de la invención también se refieren a radioinmunoconjugados donde un radionúclido que emite partículas alfa o beta se encuentra acoplado de manera estable al anticuerpo o fragmentos d unión del mismo, con o sin el uso de agentes formadores de complejos. Tales radionúclidos incluyen emisores beta tales como Fósforo-32 (32P), Escandio-47 (47Sc) , Cobre-67 (67Cu) , Galio-67 (67Ga) , Itrio-88 (88Y), Itrio-90 (90Y) , Yodo-125 (125I), Yodo-131 (131I), Samario-153 (153Sm) , Lutecio-177 (177Lu), Renio-186 (186Re) o Renio-188 (188Re) , y emisores alfa tales como Astatina-211 (211At) , Plomo-212 (212Pb) , Bismuto-212 (212Bi) o -213 ( 13Bi) o Actinio-225 (225Ac) .
Se conocen métodos en la técnica para la conjugación de un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo a un resto detectable y similares, tal como, por ejemplo, los métodos descritos por Hunter et al, Nature 144:945 (1962); David et al, Biochemistry 13:1014 (1974); Pain et al, J. Immunol. Meth. 40:219 (1981) y Nygren, J. , Histochem. y Cytochem. : 30:407 (1982) Modalidades descritas en la presente incluyen adicionalmente variantes y equivalentes sustancialraente homólogos a los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, diacuerpos, SMIPs, anticuerpos de camélido, nanoanticuerpos, IgNAR, polipéptidos , regiones variables y CDRs establecidos en la presente. Estos pueden contener, por ejemplo, mutaciones de sustitución conservadora (es decir, la sustitución de uno o más aminoácidos por medio de aminoácidos similares) . Por ejemplo, la sustitución conservadora se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro dentro de la misma clase general, por ejemplo, un aminoácido ácido con otro aminoácido ácido, un aminoácido básico con otro aminoácido básico o un aminoácido neutro con otro aminoácido neutro. Se conoce bien en la técnica lo que se pretende como sustitución conservadora de un aminoácido.
En otra modalidad, la invención contempla secuencias de polipéptidos que poseen al menos 90% o más de homología de secuencia con una cualquiera o más de las secuencias de fragmentos de anticuerpos, regiones variables y: CDRs establecidos en la presente. Más preferentemente, la invención contempla secuencias de polipéptidos que poseen al menos 95% o más de homología de secuencia, más preferentemente, aX menos 98% o más de homología de secuencia y, aun más preferentemente, al menos 99% o más de homología de secuencia con una cualquiera o más de las secuencias de fragmentos de anticuerpos, regiones variables y CDRs establecidos en la presente. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para determinar la homología entre las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos.
En otra modalidad, la invención contempla adicionalmente los homólogos de polipéptidos antemencionados de los fragmentos de anticuerpo, las regiones variables y las CDR establecidos en la presente que poseen adicionalmente actividad anti-IL-6. Ejemplos no limitantes de la actividad anti-IL-6 como se establece en la presente, por ejemplo, bajo el título "Actividad anti-IL-6" en lo sucesivo.
En otra modalidad, la invención contempla adicionalmente la creación y el uso de anticuerpos anti-idiotípicos que se unen a cualquiera de las secuencias precedentes. En un ejemplo de modalidad, este anticuerpo anti-idiotípico puede administrarse al sujeto que recibió un anticuerpo anti-IL-6 para modular, reducir o neutralizar el efecto del anticuerpo anti-IL-6. Dichos anticuerpos anti-idiotípicos también ¦ pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunes caracterizadas por la presencia de anticuerpos anti-IL-6. Un ejemplo adicional de uso de tales anticuerpos anti-idotipicos es la detección de anticuerpos anti-IL-6 de la presente invención, por ejemplo, para controlar los niveles de anticuerpos anti-IL-6 presentes en la sangre u otros fluidos corporales de un sujeto.
La presente invención también contempla anticuerpos anti-IL-6 que comprenden cualquiera de las secuencias de polipéptidos o polinucleotidos descritas en la presente que sustituyen a cualquiera de las otras secuencias de polinucleotidos descritas en la presente. A modo de ejemplo y no taxativamente, la presente invención contempla anticuerpos que comprenden la combinación de cualesquiera secuencias de cadena ligera variable y pesada variable descritas en la presente y contempla, adicionalmente, anticuerpos que resultan de la sustitución de cualquiera de las secuencias de CDR descritas en la presente por cualquiera de las otras secuencias de CDR descritas en la presente. Como se indicó, los anticuerpos anti-IL-6 o los fragmentos o las variantes .de los mismos preferidos pueden contener una secuencia ligera y/o pesada variable según se muestra en las Figs . 34 o 35, como en la SEQ ID NO: 651, 657, 709 o variantes de las mismas,^ donde uno o más residuos CDR o FR se encuentran modificados sin afectar de manera adversa la unión de antigeno a IL-6 'u otra actividad funcional deseada. ; Polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpo anti-IL-6 ; La invención se dirige adicionalmente a polinucleótidos que codifican polipéptidos de los anticuerpos que poseen una especificidad de unión a IL-6. En una modalidad de la invención, los polinucléotidos de la invención comprenden o, de manera alternativa, consisten en la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia de polipéptidos de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2: ' ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCAGATGTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCGGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAATTATCCTGGTATCAGCAGAAAC CAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGC GGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCG ATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAATATTGATAATGCTT;TCGGCG GAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCAT CTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTT (SEQ ID NO: 10) o la secuencia de polinucleótidos de las SEQ ?? NO: 662, 698, 701 o 705.
En otra modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden o, de manera alternativa, consisten en la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptido de cadena pesada variable de la SEQ ID NO : 3 : ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCA CAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAATGGATCGGAATCATTTATGGTAGTGATGAAACGGCCTACGCGACCTGGGCGATAG GCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAGCCG CGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAATTTAACT TGTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC CCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGG (SEQ ID NO: 11) o la secuencia de polinucleótidos de las SEQ ID NO: 663, 700, 703 o 707.
En una modalidad adicional de la invención, los polinucléotidos que codifican fragmentos o variantes del anticuerpo que poseen especificidad de unión a IL-6 comprenden o, de manera alternativa, consisten en una o más secuencias de polinucleótidos de la SEQ ID NO 12 o 694; SEQ ID NO: t13 y SEQ ID NO: 14 o 695 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDRs o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ; ligera variable de la SEQ ID NO: 2.
En una modalidad adicional de la invención, los polinucléotidos que codifican fragmentos o variantes del anticuerpo que poseen especificidad de unión a IL-6 comprenden o, de manera alternativa, consisten en una o más secuencias de polinucléotidos de la SEQ ID NO 15; SEQ ID NO: 16 o 696 y la SEQ ID NO: 17 o 697 que corresponden a polinucléotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDRs o regiones hipervariables ) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 661 o SEQ ID NO: 657 u otras representadas en las Fig. 34 o 35. ! La invención también contempla secuencias de polinucléotidos que incluyen una o más secuencias de polinucléotidos que codifican fragmentos o variantes de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los polinucléotidos que codifican fragmentos o variantes del anticuerpo que poseen especificidad de unión a IL-6 comprenden o, de manera alternativa, consisten en, uno, dos, tres o más incluidos todos los siguientes polinucléotidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinculeótido de la SEQ ID NO: 10 que codifica la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2, el polinculeótido de la SEQ ID NO: 11 que codifica la región de cadena pesada variable de la SEQ ¦ ID NO: 3, el polinculeótido de la SEQ ID NO: 720 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 20, el polinculeótido de la SEQ ID NO: 721 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 647, el polinculeótido de la SEQ ID NO: 662 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 660, el polinculeótido de la SEQ ID NO: 722 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 666, el polinculeótido de la SEQ ID NO: 698 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 699, el polinculeótido de la SEQ ID NO: 701 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 702, el polinculeótido de la SEQ ID NO: 705 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 706, el polinculeótido de la SEQ ID NO: 723 que codifica el polipéptido de cadena ligera de la SEQ ID NO: 709, el polinculeótido de la SEQ ID NO: 724 que codifica el polipéptido de cadena pesada de la SEQ ID NO: 19, el polinculeótido de la SEQ ID NO: 725 que codifica el polipéptido de cadena pesada de la SEQ ID NO: 652, el polinculeótido de la SEQ ID NO: 700 que codifica el polipéptido de cadena pesada de la SEQ ID NO: 657, el polinculeótido de la SEQ ID NO: 663 que codifica el polipéptido de cadena pesada de la SEQ ID NO: 661, el polinculeótido de la SEQ ID NO: 703 que codifica el polipéptido de cadena pesada de la SEQ ID NO: 704, el polinculeótido de la SEQ ID NO: 707 que codifica el polipéptido de cadena pesada de la SEQ ID NO: 708, los polinucleótídos de la SEQ ID NO: 12, 13, 14, 694 y 695 que codifican las regiones determinantes de complimentariedad de los polipéptidos de cadena ligera antemencionados y los polinucleótidos de ¡la SEQ ID NO: 15, 16, 17, 696 y 697 que codifican las reqiones determinantes de complimentariedad de los polipéptidos de cadena pesada antemencionados y los polinucleótidos de la SEQ ID NO: 657 y SEQ ID NO: 709, respectivamente, por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico en la SEQ ID NO: 700 y SEQ ;ID NO: 723 y fragmentos o variantes de las mismas, por ejemplo, con base en la degeneración del codón. Estas secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de cadenas pesadas y ligeras variables pueden expresarse solas o en combinación y estas secuencias preferentemente se fusionan a secuencias constantes variables adecuadas, por ejemplo, las de las SEQ ID NO: 589 y SEQ ID NO: 587.
En la Tabla 1 anterior se identifican ejemplos de secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos anti-IL-6 de la presente invención. Las secuencias de polinucleótidos que se muestran se deben entender como ilustrativas en lugar de limitantes. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente las secuencias de polinucleótidos que codificarían un polipéptido dado y pueden crear fácilmente secuencias de codificación adecuadas para la expresión en un sistema de expresión dado, como mediante la adaptación de las secuencias de polinucleótidos proporcionadas y/o la creación de las mismas de novo y pueden producir fácilmente secuencias de expresión optimizadas por codondes, por ejemplo, como se describe' en la solicitud de patente de EUA publicada No. 2008/0120732 o utilizando otros métodos conocidos en la técnica.
En otra modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden ' adicionalmente o, de manera alternativa, consisten en la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de cadena ligera constante kappa de la SEQ ID NO: 586: GTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGG TGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACA GCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCT ACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAG AGTGT (SEQ ID NO: 587) .
En otra modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden adicionalmente o, de 'manera alternativa, consisten en · la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptido de cadena pesada constante gamma-1 de la SEQ ID NO: 588: GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTG GGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGT GGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGAC TCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCT GCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTG ACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCC TCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGG TGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGG TGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCG TCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA AAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCAC AGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCC TGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGA ACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGC TCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGG CTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA (SEQ ID NO : 589) .
En una modalidad, la invención se dirige , a un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácido de anticuerpo VH anti-IL-6 seleccionada de la SEQ ID NO: 3, 18, 19, 652, 656, 657,, 658, 661, 664, 665, 704 y 708 o que codifican una variante- de la misma, donde al menos un residuo flanqueante (residuo FR) se sustituyó con un aminoácido presente en la posición correspondiente en un polipéptido VH de anticuerpo anti-IL-6 o una sustitución de aminoácido conservativa. Adicionalmente, la invención comprende de forma especifica anticuerpos anti--IL-6 o anticuerpos humanizados que unen fragmentos o variantes de los mismos y secuencias de ácido nucleico que codifican las que anteceden, que comprenden los polipéptidos de cadenas ligeras y/o cadenas pesadas variables representadas en las secuencias contenidas en las Fig. 2 o 34-37 o las identificadas en la Tabla 1 o variantes de las mismas, donde se pueden modificar uno o más residuos flanqueantes o CDR. Preferentemente, en caso de introducir cualquier modificación, esta no afectará de forma adversa la afinidad de unión del anticuerpo anti-IL-6 resultante o el fragmento o la variante del mismo.
En otra modalidad, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia de aminoácido de anticuerpo VL anti-IL-6 seleccionado de las SEQ ID NO: 2, 20, 647, 651, 660, 666, 699, 702, 706 y 708 o que codifican una variante de la misma, donde al menos un residuo flanqueante (residuo FR) se sustituyó con un aminoácido presente en la posición correspondiente en un polipéptido VL de anticuerpo anti-IL-6 de conejo o una sustitución de aminoácido conservativa.
En aun otra modalidad, la invención se dirige a uno o más polinucleótido heterólogo que comprende una secuencia que codifica los polipéptidos contenidos en la SEQ ID NO: 2; y SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 19.
En otra modalidad, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que expresa un polipéptido que contiene al menos un polipéptido de CDR derivado de un anticuerpo anti-IL-6, donde dicho polipéptido expresado se une solo de, forma especifica a IL-6 o se une específicamente a IL-6 cuando se expresa asociado con otra secuencia de polinucleótidós que expresa un polipéptido que contiene al menos un polipéptido de CDR derivado de un anticuerpo anti-IL-6, donde dicha al menos una de las CDR se selecciona de las contenidas én los polipéptidos VL o VH contenidos en la SEQ ID NO: 3, 18, 19, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 704, 708, 2, 20, 647, 651, 660, 666, 699, 702, 706 o709.
También se contemplan células y vectores hospedadores que comprenden dichos polinucleótidós.
En otra modalidad específica, la invención abarca construcciones de ácido nucleico que contienen cualquiera de las secuencias de ácido nucleico precedentes y combinaciones de las mismas, así como células recombinantes que contienen estas secuencias y construcciones de ácido nucleico, donde: estas secuencias o construcciones de ácido nucleico pueden ser extracromosomales o pueden estar integradas en el genoma de la célula hospedadora.
La invención contempla adicionalmente vectores que comprenden las secuencias de polinucleotidos que codifican las secuencias de polipéptidos de cadenas ligeras variables y pesadas variables, asi como las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) individuales establecidas en la presente, asi como células hospedadoras que comprenden dichas secuencias. En una modalidad de la invención, la célula hospedadora es una célula de levadura. En otra modalidad de la invención, la célula hospedadora de levadura pertenece al género Pichia.
En algunos casos se proporciona más de un ejemplo de polinucleótido que codifica una secuencia de polipéptidos determinada, como se resume en la Tabla 3.
Tabla 3. Múltiples ejemplos de polinucleotidos que codifican polipéptidos particulares. 5 13, 112, 389, 501 6 14, 113, 695 9 17, 116, 697 39 47, 260 40 48, 261 60 68, 265 72 80, 325, 565, 581 89 97, 134, 166 103 12, 111, 694 104 13, 112, 389, 501 105 14, 113, 695 108 17, 116, 697 126 97, 134, 166 158 97, 134, 166 190 198, 214 191 199, 215 205 213, 469, 485 206 198, 214 207 199, 215 252 47, 260 253 48, 261 257 68, 265 317 80, 325, 565, 581 333 341, 533 381 13, 112, 389, 501 415 423, 439 431 423, 439 461 213, 469, 485 475 483, 499 476 484, 500 477 213, 469, 485 478 486, 502 479 487, 503 480 488, 504 481 489, 505 491 483, 499 492 484, 500 493 13, 112, 389, 501 494 486, 502 495 487, 503 496 488, 504 497 489, 505 525 341, 533 545 553, 585 554 562, 578 556 564, 580 557 80, 325, 565, 581 558 566, 582 570 562, 578 572 564, 580 573 80, 325, 565, 581 574 566, 582 577 553, 585 En algunos casos, identificadores de secuencia múltiple se refieren a la misma secuencia de polipéptido o polinucleótido, tal como se resumen en la Tabla 4. Se entiende que las referencias a estos identificadores de secuencias son intercambiables, salvo cuando el contexto indique lo contrario.
Tabla 4. Secuencias repetidas. Cada celda enumera un grupo de secuencias repetidas incluidas en el listado de secuencias.
SEQ ID NO de secuencias \ repetidas 4, 103 5, 104, 381, 493 6, 105 9, 108 12, 111 13, 112 14, 113 17, 116 39, 252 40, 253 48, 261 60, 257 68, 265 72, 317, 557, 573 80, 325, 565, 581 89, 126, 158 97, 134, 166 120, 659 190, 206 191, 207 198, 214 199, 215 205, 461, 477 213, 469 333, 525 415, 431 423, 439 475, 491 476, 492 478, 494 479, 495 480, 496 481, 497 483, 499 484, 500 48 6 , 502 487 , 503 488 , 504 48 9 , 505 545 , 577 554 , 570 556 , 572 558 , 574 562 , 578 564 , 580 566 , 582 Algunos ejemplos de modalidades incluyen polinucleótidos que se hibridan en condiciones de hibridación de restricción moderada o alta a un polinucleótido que posee uno de los ejemplos de secuencias de codificación citadas en la Tabla 1 y también incluyen polinucleótidos que se hibridan en condiciones de hibridación de restricción moderada o alta a un polinucleótido que codifica el mismo polipéptido como un polinucleótido que posee uno de los ejemplos de secuencias de codificación citadas en la Tabla 1 o un polipéptido codificado por cualquiera de los polinucleótidos anteriores.
La expresión "condiciones de hibridación de restricción alta" se refiere a condiciones en las cuales una sonda se híbrida a su subsecuencia blanco, típicamente en una :mezcla compleja de ácido nucleico, pero no a otras secuencias. Las condiciones de restricción elevada dependen de las secuencias y serán diferentes en circunstancias distintas. Secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas superiores. Una guía amplia para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Ti ssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993) . En general, se establece que las condiciones de restricción alta se encuentran a alrededor de 5-10 °C menos que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a un pH y fuerza iónica definidos. La Tm es la temperatura , (según concentración nucleica, pH y fuerza iónica definidos) a la que el 50% de las sondas complementarias al objetivo se hibridan a la secuencia objetivo en equilibrio (como las secuencias objetivo están presentes en exceso, a Tm, el 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio) . Las condiciones de restricción alta serán aquellas donde la concentración salina es menor a aproximadamente 1.0 M de ión de sodio, típicamente alrededor de 0.01 a 1.0 M concentración de ión de sodio (u otras sales) a un pH de 7.0 a 8.3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, mayor a 50 nucleótidos) . También pueden lograrse condiciones de restricción alta con la adición de agentes desestabilizadores tales como formamida. Para una hibridación selectiva o especifica, una señal positiva es al menos dos veces la hibridación de fondo, opcionalmente 10 veces el fondo. Los ejemplos de condiciones de restricción alta pueden ser como se expresa a continuación: 50% de formamida, 5*SSC y 1% de SDS, incubación a 42 °C o 5*SSC, 1% de SDS, incubación a 65 °C con lavado en 0.2*SSC y 0.1% de SDS a 65 °C. Tales etapas de hibridación y lavado pueden realizarse durante, por ejemplo, 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60 o más minutos.
Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre : si en condiciones de restricción alta están aún sustancialmente relacionados si los polipéptidos que codifican ' están sustancialmente relacionados. Esto ocurre, por ejemplo, cuando se crea una copia de ácido nucleico utilizando la máxima degeneración del codón permitida por el código genético. En estos casos, los ácidos nucleicos se hibridan típicamente en condiciones de restricción moderada. Ejemplos de "condiciones de hibridación de restricción moderada" incluyen una hibridación en un tampón de 40% de formamida, 1 M de NáCl, 1% de SDS a 37 °C y un lavado en 1*SSC a 45 °C. Tales etapas de hibridación y lavado pueden realizarse durante, por ejemplo, 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60 o más minutos. Una hibridación positiva es al menos dos veces el fondo. Los expertos en la técnica rápidamente reconocerán que pueden utilizarse condiciones alternativas de hibridación y lavado para proporcionar condiciones de restricción similar.
Ejemplos de modalidades adicionales de la invención En otra modalidad, la invención contempla uno o más anticuerpos anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo que se pueden unir de forma especifica al mismo o a los mismos epitopos lineales o conformacional.es y/o competir para unirse al mismo o a los mismos epitopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 humana intacta o un fragmento del mismo, como un anticuerpo anti-ILf6 que comprende Abl y anticuerpos quiméricos, humanizados, de ' cadena simple y fragmentos del mismo (que contiene una o más CDR de los anticuerpos mencionados previamente) que se une dé forma especifica a la IL-6, que preferente es aglicosilado . En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de anticuerpo del mismo se pueden unir de forma especifica al mismo o a los mismos epitopos lineales o conformacionales y/o competir para unirse al mismo o a los mismos epitopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 humana intacta o un fragmento del mismo, como Abl y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos del mismo (que contienen una o más CDR de los anticuerpos mencionados previamente) que se une de forma especifica a la IL-6, que preferente es aglicosilado .
En otra modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 i que puede unirse específicamente a los mismos epítopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 intacta o un fragmento del mismo que están unidos específicamente por Abl pueden unirse a un o a unos epítopos de IL-6 determinados mediante el mapeo epitópico usando fragmentos de polipéptidos lineales superpuestos que abarcan todo el largo del polipéptido de IL-6 humana nativa. En una modalidad de la invención, el epítopo de IL-6 comprende o, de manera alternativa, consiste en uno o más residuos comprendidos en fragmentos de IL-6 seleccionados a partir de aquellos que comprenden respectivamente los residuos de aminoácidos 37-51, los residuos de aminoácidos 70-84, los residuos aminoácidos 169—18:3 , los residuos de aminoácidos 31-45 y /o los residuos de aminoácidos 58-72.
La invención también se dirige a un anticuerpo anti-IL-6 que se une con el mismo epítopo de IL-6 y/o compite con un anticuerpo anti-IL-6 para unirse a la IL-6 como un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo descrito en la presente, incluyendo, a modo no taxativo, un anticuerpo anti-IL-6 seleccionado de Abl y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos de el mismo (que contienen una o más CDR del anticuerpo antemencionado) que se une de forma especifica a la IL-6, que preferentemente son aglicosilados .
En otra modalidad, la invención también se dirige a un anticuerpo anti-IL-6 aislado o a un fragmento o una variante de anticuerpo del mismo que comprende una o más de las CDR contenidas en las secuencias de polipéptido de VH que comprenden: las SEQ ID NO: 3, 18, 19, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 117, 118, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379, 395, 411, 427, 443, 459, 475, 491, 507, 523, 539, 555, 571, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 668, 672, 676, 680, 684, 688, 691, 692, 704, o ,708 y/ una o más de las CDR contenidas en la secuencia de polipéptidos de VL que comprende: 2, 20, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 119, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 394, 410, 426, 442, 458, 474, 490v 506, 522, 538, 554, 570, 647, 651, 660, 666, 667, 671, 675, 679, 683, 687, 693, 699, 702, 706 o 709 y las secuencias de VH y VL representadas en las alineaciones de anticuerpos comprendidas en las Figuras 34-37 de la presente solicitud.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 indicado en los dos párrafos precedentes comprenden al menos 2 regiones determinantes de complementariedad (CDRs) en cada una de la región pesada variable y la región ligera variable que sean idénticas a las que están contenidas en un anticuerpo anti-IL-ß que comprende Abl y anticuerpos quiméricos, humanizados, de cadena simple y fragmentos del mismo (que contienen una o más CDR de los anticuerpos previamente mencionados) que se unen de forma especifica a la IL-6, que preferentemente están aglicosilado .
En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-IL-6 indicado anteriormente comprende al menos 2 regiones determinantes de complementariedad (CDR) en cada una ' de la región ligera variable y pesada variable que sean idénticas a aquellas contenidas en Abl. En una modalidad de la invención, todas las CDR del anticuerpo anti-IL-6 indicado anteriormente son idénticas a las CDR contenidas en un anticuerpo antii-IL-6 que comprende Abl y anticuerpos quiméricos, humanizadps, de cadena simple y fragmentos del mismo (que contienen una o más CDR de los anticuerpos antedichos) que se unen específicamente a la IL-6, que preferentemente son aglicosilados . En una modalidad preferida de la invención, todas las CDR del anticuerpo anti-IL-6 indicado anteriormente son idénticas a las CDR contenidas en Abl, por ejemplo, un anticuerpo que comprende las secuencias de VH y VL comprendidas en la SEQ ID NO: 657 y SEQ ID NO: 709 , respectivamente.
La invención contempla adicionalmente que el o los anticuerpos anti-IL- 6 indicados anteriormente son aglicosilados , que contienen una región Fe que se modificó para alterar la función efectora, la semivida, la proteólisis y/o la glicosilación, son humanos, humanizados, de cadena simple o quiméricos y son un anticuerpo humanizado derivado de un anticuerpo anti-IL- 6 de conejo (progenitor) . Los ejemplos de regiones constantes que prevén la producción de anticuerpos aglicosilados en Pichia se encuentran comprendidos en la SEQ ID NO: 588 y la SEQ ID NO: 586 que están codificadas, respectivamente, por las secuencias de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 589 y la SEQ ID NO: 587 .
La invención contempla adicionalmente uno ó más anticuerpos anti-IL- 6 donde las regiones flanqueantes (:FR) en la región ligera variable y las regiones pesadas variables de dicho anticuerpo son respectivamente FR humanas sin modificar o que han sido modificadas mediante la sustitución de como ( máximo 2 o 3 residuos FR humanos en la región de cadena ligera o pesada variables con los correspondientes residuos FR del anticuerpo de conejo progenitor y donde dichas FR humanas se derivaron de secuencias de anticuerpos de cadenas pesadas y ligeras variables humanas que se han seleccionado de una biblioteca de secuencias de' anticuerpo germinales humanas, basándose en su alto nivel de homología con las regiones de cadenas pesadas o ligeras variables de conejo correspondientes con relación a otras secuencias de anticuerpo germinales humanas contenidas en la biblioteca.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento la variante del mismo pueden unirse específicamente a células humanas que expresan la IL-6 y/o a moléculas de IL-6 solubles que circulan, incluyendo las IL-6 expresadas en o por células humanas en un paciente que padece una enfermedad asociada con células que expresan IL-6.
En otra modalidad, la enfermedad se selecciona de fatiga general, fatiga inducida por el ejercicio, fatiga relacionada con el cáncer, fatiga relacionada con enfermedad inflamatoria, síndrome de fatiga crónica, fibromialgia, caquexia cancerosa, caquexia cardíaca, caquexia respiratoria, caquexia 'renal, caquexia relacionada con la edad, artritis reumatoide,' lupus eritematoso sistémico (SLE) , artritis idiopática juvenil sistémica, psoriasis, artropatía psoriásica, espondilitis anquilosante, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), polimialgia reumática, arteritis de células gigantes, vasculitis autoinmune, enfermedad crónica de injerto , versus huésped (GVHD) , síndrome de Sjogren, enfermedad de Still de comienzo en el adulto, artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil sistémica, osteoartritis , osteoporosis , enfermedad ósea de Paget, osteoartritis, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no-Hodgkin, cáncer de próstata, leucemia, cáncer de células renales, enfermedad de Castleman multicéntrica, cáncer de ovario, tolerancia a fármacos en quimioterapia contra el cáncer, toxicidad de quimioterapia contra el cáncer, enfermedad cardíaca isquémica, ateroesclerosis, obesidad, diabetes,, asma, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad cerebrovascular, fiebre, respuesta de fase aguda, alergias, anemia, anemia de inflamación (anemia de enfermedad crónica) , hipertensión, depresión, depresión asociada con enfermedad crónica, trombosis, trombocitosis , insuficiencia cardíaca aguda, síndrome metabólico, abortos naturales, obesidad, prostatitis crónica, glomerulonefritis, enfermedad inflamatoria pélvica, lesión por reperfusión, rechazo de transplante, enfermedad de injerto versus huésped (GVHD), gripe gaviar, viruela, gripe pandémica, síndrome de distrés respiratorio del adulto (ARDS) , síndrome respiratorio agudo severo (SARS) , sepsis y síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) . En una modalidad preferida, la enfermedad se selecciona de cáncer, trastorno inflamatorio, trastorno viral o trastorno autoinmune. En una modalidad particularmente preferida, la enfermedad es artritis, caquexia y síndrome consuntivo. ¡ La invención contempla adicionalmente anticuerpos anti-IL-6 o fragmentos o variantes de anticuerpos del mismo directa o indirectamente unidos a una etiqueta detectable o a un agente terapéutico .
La invención también contempla una o más secuencias de ácido nucleico que dan como resultado la expresión ,de un anticuerpo anti-IL 6 o un fragmento o una variante de anticuerpo del mismo como se estableció anteriormente, incluidos aquellos que comprenden o, de manera alternativa, consisten en codondes preferidos de levadura o humanos. La invención también contempla vectores (incluidos vectores plásmidos o recombinantes virales) que comprenden dicha o dichas secuencias de ácido nucleico. La invención también contempla células hospedadoras o células hospedadoras recombinantes que expresan al menos uno de los anticuerpos establecidos anteriormente, incluidas células de mamíferos, de levadura, bacterianas y de insectos. En una modalidad preferida, la célula hospedadora es una célula de levadura. En una modalidad preferida adicional, la célula de levadura es una célula de levadura diploide. En una modalidad aún más preferida, la célula de levadura es una levadura Pichia.
La invención también contempla un método de tratamiento que comprende administrar a un paciente que padece una enfermedad o afección asociada con células que expresan IL-6 una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti-IL-6 o un fragmento o una variante del mismo. ; Las enfermedades que pueden tratarse se presentan en la lista no taxativa establecida anteriormente. En una modalidad preferida, la enfermedad se selecciona de cáncer, enfermedad autoinmune o afección inflamatoria. En una modalidad particularmente preferida, la enfermedad es cáncer o infección viral. En otra modalidad, el tratamiento incluye adicionalmente la administración de otro agente o régimen terapéutico seleccionado de quimioterapia, radioterapia, administración de citocina o terapia génica.
La invención contempla adicionalmente un método de imágenes in vivo que detecta la presencia de células que expresan IL-6 que comprende administrar una cantidad [ de al menos un anticuerpo anti-IL-6 eficaz desde el punto dé vista del diagnóstico. En una modalidad, dicha administración incluye adicionalmente la administración de un radionúclido o fluoróforo que facilita la detección del anticuerpo en ¦ sitios de la enfermedad que expresan IL-6. En otra modalidad' de la invención, el método de imágenes in vivo se utiliza para detectar tumores o metástasis que expresan IL-6 o se usa para detectar la presencia de sitios de trastornos autoinmunes asociados con células que expresan IL-6. En una modalidad adicional, los resultados de tal método de imágenes in vivo se usan para facilitar el diseño de un régimen terapéutico apropiado que incluye regímenes terapéuticos que incluyen radioterapia, quimioterapia o una combinación de estos.
Actividad anti-IL-6 Según se estableció previamente, la IL-6 es un miembro de la familia de las citocinas que promueve las respuestas celulares a través de un complejo de receptores que consiste en al menos una subunidad de la glicoproteína transductora de señales gpl30 y el receptor IL-6 (IL-6R) . La IL-6R también puede estar presente en forma soluble (sIL-6R) . La IL-6 se une a la IL-6R, que luego dimeriza el receptor transductor de señales gpl30. ; Se cree que los anticuerpos anti-IL-6 de la invención o los fragmentos o las variantes de unión a IL-6 de los ¡mismos son útiles al presentar actividad anti-IL-6. En una modalidad no limitante de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 de la invención o los fragmentos o las variantes de unión a la IL-6 de los mismos presentan actividad anti-IL-6 mediante la unión a IL-6 que puede ser IL-6 soluble o IL-6 expresada . en la superficie celular y/o pueden prevenir o inhibir la unión de IL-6 a IL-6R y/o la activación (dimerización) de la glicoproteina transductora de señales gpl30 y la formación de multímeros IL-6/IL-6R/gpl30 y los efectos biológicos de cualquiera de los anteriores. Los anticuerpos anti-IL-6 objeto de la presente pueden poseer distintas actividades antagonistas según dónde (es decir, epitopo) el anticuerpo particular se una a IL-6 y/o cómo afecte la formación de los complejos y/o multímeros de IL-6 anteriores y los efectos biológicos ,de los mismos. Como consecuencia, diferentes anticuerpos anti-IL-6 de acuerdo con la invención, por ejemplo, pueden ser más adecuados para prevenir o tratar afecciones que involucren la formación y acumulación de IL-6 soluble sustancial como artritis reumatoide, mientras que otros anticuerpos pueden ser favorables en tratamientos donde la prevención de IL-6/IL-6R/gpl30 o multímeros IL-6/IL-6R/gpl30 es un resultado terapéutico deseado. Esto puede determinarse en ensayos de unión y otros.
La actividad anti-IL-6 del anticuerpo anti-IL-6 ' de la presente invención y los fragmentos y las variantes del mismo que poseen especificidad de unión a IL-6 pueden también estar descritos según su fuerza de unión o su afinidad a IL-6. Esto también puede afectar sus propiedades terapéuticas. En una modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 de la presente invención y los fragmentos de los mismos que poseen especificidad de unión a IL-6 se unen a la IL-6 con una constante de disociación (KD) menor o igual a 5xl0~7, 10"7> 5x10" 8, 10~8, 5xl0~9, 10~9, 5xl0~10, 10~10, 5xl0~n, 10~n, 5xl0"12, 10~12, 5xl0~13, 10"13, 5xl0"14, 10"14, 5xl0"15 o 10"15. Preferentemente, los anticuerpos anti-IL-6 y los fragmentos y las variantes de los mismos se unen a la IL-6 con una constante de disociación menor o igual a 5xl0"10.
En otra modalidad de la invención, la actividad anti-IL-6 de los anticuerpos anti-IL-6 de la presente invención' y los fragmentos y las variantes de los mismos que poseen especificidad de unión a IL-6 se unen a la IL-6 con una tasa de disociación menor o igual a 10~4 S"1, 5xl0"5 S"1, 10"5 S"1, 5xl0"6 10"6 S"1, 5xl0~7 S"1 o 10"7 S"1. En una modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 de la invención y los fragmentos y las variantes de los mismos que ¡poseen especificidad de unión a la IL-6 se unen a un epitopo lineal o conformacional de IL-6.
En una modalidad adicional de la invención, la actividad anti-IL-6 de los anticuerpos anti-IL-6 de la presente invención y los fragmentos y las variantes de los mismos que poseen especificidad de unión a IL-6 presentan actividad anti-IL-6 mediante la mejoría o reducción de los síntomas o que, de manera alternativa, tratan o previenen enfermedades y trastornos asociados con IL-6. Se establecen en lo sucesivo ejemplos no limitantes de las enfermedades y los trastornos asociados con IL-6. Como se observó, la fatiga relacionada con cáncer, la caquexia y la artritis reumatoide son indicaciones preferidas de los anticuerpos anti-IL-6 objeto de la presente.
En otra modalidad de la invención, los anticuerpos' anti-IL-6 descritos en la presente o los fragmentos y las variantes de unión a IL-6 de los mismos no poseen especificidad de unión a IL-6R o a la glicoproteina transductora de señales gp-130.
Análisis y aislamiento de linfocitos B En una modalidad, la presente invención proporciona métodos de aislamiento de una población clonal de linfocitos B específicos para antígeno que pueden usarse para aislar al menos una célula específica para antígeno. Según se describe y ejemplifica más adelante, estos métodos contienen una serie de etapas de cultivo y selección que pueden utilizarse por separado, en combinación, de manera secuencial, repetitiva o periódica. Preferentemente, estos métodos se usan para aislar al menos una célula específica para antígeno que puede ; usarse para producir un anticuerpo monoclonal especifico de un anticuerpo deseado o una secuencia de ácido nucleico que se corresponde con tal anticuerpo.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método que comprende las etapas de: a. preparar una población celular que comprende al menos un linfocito B especifico para antigeno, b. enriquecer la población celular, por ejemplo, mediante cromatografía, para formar una población celular enriquecida que comprende al menos un linfocito B específico para antígeno, c. aislar un único linfocito B a partir de la población quecida de linfocitos B y d. determinar si el único linfocito B produce un anticuerpo específico para el antígeno.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una mejora a un método para aislar un único linfocito B productor de anticuerpos que comprende enriquecer la población de linfocitos B obtenida a partir de un hospedador que fue inmunizado o expuesto naturalmente a un antígeno, donde la etapa de enriquecimiento precede a cualquier etapa de selección, comprende al menos una etapa de cultivo y trae como resultado una población clonal de linfocitos B que producen un único anticuerpo monoclonal específico para dicho antígeno.
En toda la solicitud, una "población clonal de linfocitos B" se refiere a una población de linfocitos B que solo secreta un único anticuerpo especifico para un antigeno deseado. Esto significa que estas células producen solamente un tipo de anticuerpo monoclonal especifico para el antigeno deseado.
En la presente solicitud, "enriquecer" una población celular significa aumentar la frecuencia de células deseadas, típicamente, células especificas para antigeno, contenidas en una población, celular mixta, por ejemplo, un aislamiento que contiene linfocitos B derivado de un hospedador que se inmuniza contra un antigeno deseado. Por lo tanto, una población celular enriquecida comprende una población celular que posee una mayor frecuencia de células especificas para antigeno como resultado de una etapa de enriquecimiento, pero esta población de células puede contener y producir diferentes anticuerpos. ', El término general "población celular" comprende poblaciones celulares previas y posteriores al enriquecimiento, teniendo presente que cuando se llevan a cabo múltiples etapas de enriquecimiento una población celular puede ser tanto previa como posterior al enriquecimiento. Por ejemplo, en una modalidad, la presente invención proporciona un método: a . que cultiva una población celular a partir , de un hospedador inmunizado para obtener una población celular cultivada, b. que crea al menos una suspensión unicelular a partir de la población celular cultivada, c. que enriquece al menos una suspensión unicelular para formar una primera población celular enriquecida, d. que enriquece la primera población celular enriquecida para formar una segunda población celular enriquecida, e. que enriquece la segunda población celular enriquecida para formar una tercera población celular enriquecida y f. que selecciona un anticuerpo producido por una ¡ célula especifica para antigeno de la tercera población celular enriquecida. \ Cada población celular puede usarse directamente , en la etapa siguiente o puede congelarse parcial o totalmente para almacenamientos a corto o largo plazo o para ; etapas posteriores. Además, las células de una población celular pueden suspenderse individualmente para proporcionar suspensiones unicelulares. La suspensión unicelular puede enriquecerse de forma que una suspensión unicelular sirva como la población celular previa al enriquecimiento. Entonces, una o más de las suspensiones unicelulares especificas para el antigeno forman conjuntamente la población celular enriquecida; las suspensiones unicelulares especificas para el antigeno pueden agruparse, por ejemplo, pueden colocarse nuevamente en placas para su análisis adicional y/o producción de anticuerpos .
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para enriquecer una población celular para proporcionar una población celular enriquecida que posee una frecuencia celular especifica para el antigeno de entre alrededor de 50% y alrededor de 100% o incrementos de los mismos. Preferentemente, la población celular enriquecida posee una frecuencia celular especifica para el antigeno mayor o igual a alrededor de 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100%.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para enriquecer una población celular mediante el cual se aumenta la frecuencia de las células especificas para el antigeno al menos 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces o incrementos de los mismos.
En toda la solicitud, el término "incremento" se usa para definir un valor numérico en mayor o menor grado de precisión, por ejemplo, lo más cerca posible a 10, 1, 0.1, 0.01, etc. El incremento se puede redondear a cualquier grado de precisión medible y el incremento no debe redondearse al mismo grado de precisión en ambos extremos de un rango. Por ejemplo, el rango de 1 a 100 o incrementos en los mismos incluye rangos como 2 a 80, 5 a 50 y 0.4 a 98. Cuando un rango no tiene limite fijo, por ejemplo, un rango menor a 100, los incrementos en el mismo significan incrementos entre 100 y el limite mediblé. Por ejemplo, menos de 100 o incrementos en el mismo significa 0 a 100 o incrementos en el mismo, a menos que la propiedad, por ejemplo, la temperatura, no esté limitada por el 0.
La especificidad para antigeno puede medirse con respecto a cualquier antigeno. El antigeno puede ser cualquier sustancia a la que pueda unirse un anticuerpo incluyendo, a modo no taxativo, péptidos, proteínas o fragmentos de los mismos, carbohidratos, moléculas orgánicas e inorgánicas, receptores producidos por células animales, células bacterianas y' virus, enzimas, agonistas y antagonistas de las rutas biológicas, hormonas y citocinas. Los ejemplos de antígenos incluyen, a modo no taxativo, IL-2, IL-4, IL-ß, IL-10, IL-12, IL-13, ' IL-18 , IFN-á, IFN-á, BAFF, CXCL13, IP-10, VEGF, EPO, EGF, HRG, 1 factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y Hepcidina. Los antígenos preferidos incluyen IL-6,- IL-13, TNF-á, VEGF-á, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y Hepcidina. En un método que utiliza más de una etapa de enriquecimiento, el antigeno usado en cada etapa de enriquecimiento puede igual o diferente al otro. Las múltiples etapas de enriquecimiento con el mismo antigeno pueden proporcionar una población extensa y/o diversa de células especificas para antigeno; las múltiples etapas de enriquecimiento con distintos antigenos pueden proporcionar una población celular enriquecida con especificidad cruzada para los diferentes antigenos. , El enriquecimiento de una población celular puede realizarse mediante cualquier medio de selección celular conocido en la técnica para el aislamiento de células especificas para antigeno. Por ejemplo, una población celular puede enriquecerse por medio de técnicas cromatográficas, por ejemplo, tecnología de cuentas iltenyi o cuentas magnéticas. Las cuentas pueden unirse directa o indirectamente al antígeno de interés. En una modalidad preferida, el méto'do de enriquecimiento de una población celular incluye al menos una etapa de enriquecimiento cromatográfica .
Una población celular también puede enriquecerse mediante cualquier técnica de ensayo de especificidad para antígeno conocida en la técnica, por ejemplo, un ensayo ELISA o un ensayo de halógeno. Los ensayos ELISA incluyen, a modo no taxativo, la inmovilización selectiva de antígenos (por ejemplo, captura de antigeno biotinilado mediante placas revestidas con estreptavidina, avidina o neutravidina) , revestimiento de placa para antigeno no especifico y a través de una estrategia de concentración de antigeno (por ejemplo, captura selectiva de antigeno seguida de la adición de un compañero de unión para generar un complejo heterómérico proteina-antigeno) . El antigeno puede estar unido directa o indirectamente a una matriz o un soporte sólido, por ejemplo, una columna. Un ensayo de halógeno comprende poner en contacto las células con cuentas cargadas con antigeno y el anticuerpo anti-hospedador marcado especifico para el hospedador usado para el cultivo de linfocitos B. La marca puede ser, por ejemplo, un fluoróforo. En una modalidad, al menos una etapa de enriquecimiento del ensayo se realiza en al menos una suspensión unicelular. En otra modalidad, el método de enriquecimiento de una población celular incluye al menos una etapa de enriquecimiento cromatográfico y al menos una etapa de enriquecimiento del ensayo.
Se conocen en la técnica métodos de "enriquecimiento" de una población celular por tamaño o densidad. Véase, por ejemplo, la patentes estadounidense 5,627,052. Estas etapas se pueden utilizar en el presente método adicionalmenté para enriquecer la población celular por especificidad del antjígeno.
Las poblaciones celulares de la presente invención contienen al menos una célula que puede reconocer un antigeno. Las células que reconocen antigenos incluyen, a modo no taxativo, linfocitos B, células plasmáticas y progenies de las mismas. En una modalidad, la presente invención proporciona una población celular clonal que contiene un único tipo de linfocitos B específicos para antígeno, es decir, la población celular produce un único anticuerpo monoclonal específico para un antígeno deseado.
En tal modalidad, se cree que la población clonal de linfocitos B específica para antígeno consiste predominantemente en células específicas para antígeno que secretan anticuerpos y que se obtienen por medio del, nuevo cultivo y el protocolo de selección que se proporciona en la presente. Por consiguiente, la presente invención también proporciona métodos para la obtención de una población celular enriquecida que contiene al menos una célula especifica para antígeno y que secreta un anticuerpo. En una modalidad, la presente invención proporciona una población celular enriquecida que contiene de alrededor de 50% a alrededor de 100% o incrementos de los mismos o más de o igual a alrededor de 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de células especificas para antígeno y que secretan un anticuerpo.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para aislar un único linfocito B enriqueciendo una población celular obtenida a partir de un hospedador antes de cualquier etapa de selección, por ejemplo, selección , de un linfocito B particular a partir de una población celular y/o selección de un anticuerpo producido por una célula particular. La etapa de enriquecimiento puede realizarse en una, dos, tres o más etapas. En una modalidad, se aisla un único linfocito B a partir de una población celular enriquecida antes de confirmar si el único linfocito B secreta un anticuerpo con especificidad de antigeno y/o una propiedad deseada.
En una modalidad, se usa un método para enriquecer una población celular en un método para la producción y/o selección de anticuerpos. Por tanto, la presente invención proporciona un método que comprende enriquecer una población celular antes de seleccionar un anticuerpo. El método puede incluir las etapas de: preparar una población celular que comprende al menos una célula especifica para antigeno, enriquecer la población celular mediante el aislamiento de al menos una ¦ célula especifica para antigeno para formar una población celular enriquecida e inducir la producción de anticuerpos a partir de al menos una célula especifica para antigeno. En una modalidad preferida, la población celular enriquecida contiene más i de una célula especifica para antigeno. En una modalidad, cada ; célula especifica para antigeno de la población enriquecida se cultiva en condiciones que proporcionan una población clonal de linfocitos B específicos para antígeno antes de aislar una célula que produce anticuerpos de estos y/o de producir un anticuerpo usando dicho linfocito B o una secuencia de ácido nucleico que corresponde a ese anticuerpo. A diferencia de técnicas previas, donde los anticuerpos se producen a partir de una población celular con una baja frecuencia de células específicas para antígeno, la presente invención permite la selección de anticuerpos de entre una alta frecuencia de células especificas para antígeno. Debido a que se utiliza una etapa de enriquecimiento previo a la selección de anticuerpos, la mayoría de las células, de preferencia virtualmente todas las células usadas para la producción de anticuerpos, son específicas para antígeno. Mediante la producción de anticuerpos a partir de una población de células con una frecuencia aumentada de especificidad de antígeno, aumenta la cantidad y la variedad de anticuerpos.
En los métodos de selección de anticuerpos de la presente invención, se selecciona preferentemente un anticuerpo luego de una etapa de enriquecimiento y una etapa de cultivo que da como resultado una población clonal de linfocitos B específicos para antígeno. Los métodos pueden comprender adicionalmente una etapa de determinar la secuencia de un anticuerpo seleccionado o porciones de este a partir de una o más células especificas para antigeno aisladas. Se puede emplear cualquier método conocido en la técnica para determinar secuencias y este: puede incluir determinar la secuencia de la cadena pesada, la cadena ligera, la o las regiones variables y/o la o las regiones determinantes de complementariedad (CDR) .
Además de la etapa de enriquecimiento, el método de selección de anticuerpos también puede incluir una o más etapas de análisis de la población celular para el reconocimiento de antigenos y/o la funcionalidad del anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos deseados pueden tener características estructurales específicas, como unión a un epítopo particular o mimetismo de una estructura particular, actividad antagonista o agonista o actividad neutralizante, por ejemplo, inhibición de la' unión entre el antígeno y un ligando. En una modalidad, el análisis de la funcionalidad del anticuerpo depende del ligando. El análisis de la funcionalidad del anticuerpo incluye, a modo no taxativo, un ensayo de interacción proteína-proteína in' vitro que recrea la interacción natural del ligando antígeno |con la proteína recombinante receptora y una respuesta con base en la célula que depende del ligando y se controla fácilmente (por ejemplo, respuesta de proliferación) . En una modalidad, el método para la selección de anticuerpos incluye una etapa de análisis de la población celular para la funcionalidad del anticuerpo mediante la medición de la concentración inhibitoria (CI50) . En una modalidad, al menos una de las células especificas para antigeno aisladas produce un anticuerpo con una CI50 menor a aproximadamente 100, 50, 30, 25, 10 g/mL o incrementos de los mismos.
Además de la etapa de enriquecimiento, el método de selección de anticuerpos también puede incluir una o más etapas de análisis de la población celular para determinar la íuerza de unión al anticuerpo. La fuerza de unión al anticuerpo, puede medirse mediante cualquier método conocido en la técnica (por ejemplo, Biacore™) . En una modalidad, al menos una de las células aisladas y especificas para antigeno produce un anticuerpo que posee una elevada afinidad al antigeno, por ejemplo, una constante de disociación (Kd) menor a aproximadamente 5xl0~10 M-l, preferentemente alrededor de> entre lxlO"13 y 5xl0~10, lxlO-12 y lxlO"10, lxlO"12 y 7.5?10-11, IxlO-11 a 2xl0~u, alrededor de 1.5xl0-11 o menos o incrementos de los mismos. En esta modalidad, se dice que los anticuerpos son de afinidad madura. En una modalidad preferida, la afinidad de los anticuerpos se puede comparar con o es mayor a la afinidad de cualquiera de Panorex® (edrecolomab) , Rituxan® (rituximab) , Herceptin® ( traztuzumab) , ylotarg® (gentuzumab) , Campath® (alemtuzumab) , Zevalin™ ( ibritumomab) , Erbitux™ (cetuximab) , Avastin™ (bevicizumab) , Raptiva™ (efalizumab) , Remicade® (infliximab) , Humira™ (adalimumab) y Xolair™ (omalizumab) . Preferentemente, la afinidad de los anticuerpos se ¦ puede comparar con o es mayor a la afinidad de Humira™. La afinidad de un anticuerpo también puede aumentarse por medio de técnicas de maduración de afinidad conocidas. En una modalidad, se analiza al menos una población celular para determinar al menos una, preferentemente ambas, de la funcionalidad del anticuerpo y la fuerza de unión al antigeno. ', Además de la etapa de enriquecimiento, el método de selección de anticuerpos también puede incluir una o más etapas de análisis de una población celular para determinar la homología de secuencia de anticuerpos, en especial, la homología en humanos. En una modalidad, al menos una de las células aisladas y específicas para antígeno produce un anticuerpo que posee una homología con un anticuerpo humano de alrededor de 50% a alrededor de 100% o incrementos de estos o una homología mayor a alrededor de 60%, 70%, 80%, 85%,, 90% o 95%. Los anticuerpos pueden humanizarse para aumentar la homología con una secuencia humana mediante técnicas conocidas en el arte como injerto de CDR o injerto de residuo determinante de selectividad (SDR) .
En otra modalidad, la presente invención también proporciona los anticuerpos mismos de acuerdo con cualquiera de las modalidades descritas anteriormente en cuanto a CI50, Kd y/o homología.
El protocolo de selección de linfocitos B descrito ; en la presente tiene varias ventajas intrínsecas con respecto a otros métodos para la obtención de linfocitos B que secretan anticuerpos y anticuerpos monoclonales específicos para los antígenos objetivo deseados. Estas ventajas incluyen, a modo no taxativo, las siguientes: En primer lugar, se ha descubierto que cuando se utilizan estos procedimientos de selección con un antígeno deseado como IL-6 o TNF-á, estos métodos traen como resultado, de manera reproducible, linfocitos B específicos para antígeno que pueden generar lo que parece ser un complemento sustancialmente integral de anticuerpos, es decir, anticuerpos que se unen a los distintos epítopos del antígeno. Sin limitarse, a la teoría, se plantea la hipótesis de que el complemento integral sea atribuible a la etapa de enriquecimiento del antígeno que se realiza antes de la recuperación del linfocito B inicial. Adicionalmente, esta ventaja permite el aislamiento ; y la selección de anticuerpos con diferentes propiedades, ya que estas propiedades pueden variar dependiendo de la especificidad epitópica del anticuerpo particular.
En segundo lugar, se ha descubierto que el protocolo de selección de linfocitos B produce de manera reproducible un cultivo clonal de linfocitos B que contiene un único linfocito B o su progenie secretando un único anticuerpo monoclonal que en general se une al antigeno deseado con una afinidad de unión relativamente alta, es decir, afinidades de unión al antigeno picomolares o mejores. En cambio, los métodos de selección de anticuerpos anteriores tienden a producir relativamente' pocos anticuerpos de alta afinidad y, por lo tanto, requieren procedimientos de análisis exhaustivo para aislar un anticuerpo con potencial terapéutico. Sin limitarse a la teoría, se plantea la hipótesis de que el protocolo trae como resultado la inmunización in vivo de linfocitos B del hospedador (inmunización primaria) seguida de una segunda estimulación in vitro de linfocitos B (etapa secundaria de cebado del antígeno) que puede mejorar la capacidad y la propensión de los linfocitos B clónales recuperados a secretar un único anticuerpo monoclonal de afinidad alta específico para el antígeno objetivo.
En tercer lugar, se ha observado (como se muestra en la presente con linfocitos B específicos para IL-6) que el protocolo de selección de linfocitos B proporciona de manera reproducible linfocitos B enriquecidos que producen IgG que son, en promedio, altamente selectivos (específicos para antigeno) para el objetivo deseado. Se cree que los linfocitos B enriquecidos por antigeno recuperados mediante estos métodos contienen linfocxtos B que pueden producir el complemento total deseado de especificidades epitópicas según se expreso anteriormente .
En cuarto lugar, se ha observado que los protocolos de selección de linfocitos B, aun cuando se utilizan con antigenos pequeños, es decir, péptidos de 100 aminoácidos o menos, por ejemplo, 5-50 aminoácidos de longitud, generan de manera reproducible un cultivo clonal de linfocitos B que secreta un único anticuerpo de afinidad alta al antigeno pequeño, por ejemplo, un péptido. Esto causa sorpresa ya que, en general, es considerablemente difícil, cuesta mucho trabajo y a veces ni siquiera es posible producir anticuerpos de alta afinidad a péptidos pequeños. Por consiguiente, se puede usar la invención para producir anticuerpos terapéuticos para los objetivos péptidos deseados, por ejemplo, péptidos virales, bacterianos o autoantígenos y, de esta manera, permitir la producción de anticuerpos monoclonales con propiedades de unión muy específicas o incluso la producción de un cóctel de anticuerpos monoclonales para diferentes objetivos péptidos, por ejemplo, diferentes cepas virales. Esta ventaja puede ser especialmente útil en el contexto de la producción de una vacuna terapéutica o profiláctica que posee una valencia deseada, como una vacuna contra el HPV que induce la inmunidad protectora para distintas cepas del HPV.
En quinto lugar, el protocolo de selección de linfocitos B, en particular cuando se usa con linfocitos B derivados de conejos, tiende a producir de manera reproducible secuencias de anticuerpos específicos para antígeno que son muy similares a las inmunoglobulinas humanas endógenas (alrededor de 90% similares al nivel de aminoácidos) y que contienen CDRs que poseen una longitud muy similar a las inmunoglobulinas humanas y, por lo tanto, requieren poca o ninguna modificación de secuencias (típicamente, a lo sumo solo unos pocos residuos de CDR pueden modificarse en la secuencia de anticuerpo principal y no se introducen residuos exógenos flanqueantes) para poder eliminar posibles problemas de inmunogenicidad . En particular, preferentemente el anticuerpo recombinante contendrá solo los residuos CDR1 y CDR2 del hospedador (conejo) necesarios para el reconocimiento del antígeno y la totalidad de la CDR3. De ese modo, la alta afinidad de unión al antígeno de las secuencias de anticuerpo recuperadas producidas de acuerdo con el protocolo de selección de linfocitos B y anticuerpos permanece intacta o sustancialmente intacta aun con humanización.
En resumen, estos métodos se pueden utilizar para producir anticuerpos que exhiban mayores afinidades de unión a epítopos más distintos mediante el uso de un protocolo más eficaz que el previamente conocido.
En una modalidad específica, la presente invención proporciona un método para identificar un único linfocito B que secreta un anticuerpo específico para un antígeno deseado y que, opcionalmente, posee al menos una propiedad funcional deseada como afinidad, avidez, actividad citolítica y similares, por medio de un proceso que incluye las siguientes etapas: ; a. inmunizar un hospedador contra un antígeno, | b. cultivar linfocitos B del hospedador, c. enriquecer los linfocitos B cultivados para aumentar la frecuencia de las células específicas para antígeno, d. crear al menos una suspensión unicelular, e. cultivar una subpoblación a partir de la suspensión unicelular en condiciones que favorecen la supervivencia de un único linfocito B específico para antígeno por pocilio de cultivo, : f. aislar linfocitos B de la subpoblación y g. determinar si el único linfocito B produce un anticuerpo específico para el antígeno.
Típicamente, estos métodos comprenderán adicionalmerite una etapa adicional de aislamiento y determinación de secuencia, parcial o total, de las secuencias de polipéptidos y ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo deseado. Estas secúencias o versiones modificadas o porciones de las mismas pueden expresarse en células hospedadoras deseadas para producir anticuerpos recombinantes de un antigeno deseado.
Según se observó anteriormente, se cree que la población clonal de linfocitos B comprende predominantemente linfocitos B que secretan anticuerpos que producen un anticuerpo contra el antigeno deseado. También se cree, con base en resultados experimentales obtenidos con diversos antigenos y diferentes poblaciones de linfocitos B, que los linfocitos B producidos por clonación y los linfocitos B aislados específicos para antígeno que provienen de estos, producidos de acuerdo con la invención, secretan un anticuerpo monoclonal que típicamente tiene alta afinidad y además puede producir de manera eficaz y reproducible una selección de anticuerpos monoclonales de mayor variabilidad epitópica en comparación con otros métodos para derivar anticuerpos monoclonales a partir de linfocitos B cultivados específicos para antígeno. En un ejemplo de modalidad, la población de células inmunes usada en dichos métodos de selección de linfocitos B será derivada de un conejo. Sin embargo, pueden utilizarse como fuente de linfocitos B inmunes otros hospedadores que producen anticuerpos, incluyendo hospedadores no humanos y humanos. Se cree que el uso de conejos como fuente de linfocitos B puede mejorar la diversidad de los anticuerpos monoclonales que pueden derivarse por medio de estos métodos. Asimismo, las secuencias de anticuerpos derivadas de conejos de acuerdo con la invención típicamente poseen secuencias con un alto grado de identidad de secuencia con secuencias de anticuerpos humanos, lo que las hace favorables para su uso en humanos, dado que deberían poseer poca antigenicidad. En el transcurso .de la humanización, el anticuerpo humanizado final posee un contenido mucho menor de residuo extraño/hospedador , normalmente limitado a un subgrupo de los residuos de CDR del hospedador que difieren dramáticamente debido a su naturaleza en comparación con la secuencia objetivo humana usada en el injerto. Esto mejora la probabilidad de recuperación completa de actividad en la proteína de anticuerpo humanizada.
Los métodos de selección de anticuerpos que usan una etapa de enriquecimiento descrita en la presente incluyen una etapa para la obtención de una población celular que contiene células inmunes a partir de un hospedador inmunizado. Los métodos para la obtención de una población celular que contiene células inmunes a partir de un hospedador inmunizado son conocidos en la técnica y en general incluyen inducir una respuesta inmune en un hospedador y cultivar células a partir del hospedador para obtener una o más poblaciones celulares. La respuesta puede provocarse mediante la inmunización del hospedador 1 contra un antígeno deseado. De manera alternativa, el hospedador usado como fuente de tales células inmunes puede exponerse de forma natural al antigeno deseado, como un individuo que fue infectado con un patógeno particular tal como una bacteria o un virus o, de manera alternativa, ha montado una respuesta de anticuerpo especifica para el cáncer que padece el individuo.
Los animales hospedadores son bien conocidos en la técnica e incluyen, a modo no taxativo, cobayos, conejos, ratones, ratas, primates no humanos, humanos, asi como otros mamíferos y roedores, pollos, vacas, cerdos, cabras y ovejas. Preferentemente el hospedador es un mamífero, i más preferentemente, un conejo, un ratón, una rata o un humano. Al exponerse a un antígeno, el hospedador produce anticuerpos como parte de la respuesta inmune natural al antígeno. Como se mencionó, la respuesta inmune puede ser de origen natural, como resultado de una enfermedad o puede ser inducida por la inmunización con el antígeno. La inmunización puede realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como, mediante una o más inyecciones del antígeno con o sin un agente para mejorar la respuesta inmune, como un adyuvante de !Freund completo o incompleto. En otra modalidad, la invención también contempla la inmunización intraesplénica . Como una alternativa a la inmunización de un animal hospedador in vivo, el ¡método puede comprender la inmunización de un cultivo de células hospedadoras in vitro.
Luego de esperar que se produzca a la respuesta inmune (por ejemplo, según las mediciones de la detección de anticuerpos en suero) , las células hospedadoras de animales se cultivan para obtener una o más poblaciones celulares. En una modalidad preferida, se analiza una población celular cultivada para determinar la fuerza de unión al anticuerpo y/o funcionalidad de anticuerpo. Preferentemente, una población celular cultivada proviene de al menos uno del bazo!, los nodulos linfáticos, la médula ósea y/o las células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Las células pueden cultivarse a partir de más de una fuente y acumularse. Se pueden preferir algunas fuentes para algunos antigenos. Por ejemplo, para la IL-6 se prefieren el bazo, los nodulos linfáticos y las PBMC y para la TNF se prefieren los nodulos linfáticos . La población celular se cultiva durante alrededor de 20 a alrededor de 90 dias o incrementos de los mismos! luego de la inmunización, preferentemente durante alrededor de 50 a alrededor de 60 dias. Una población celular cultivada y/o una suspensión unicelular de la misma se puede enriquecer, analizar y/o cultivar para la selección de anticuerpos. La frecuencia de células especificas para antigeno dentro de una población celular cultivada es normalmente de alrededor del ,1% a alrededor del 5% o incrementos de los mismos.
En una modalidad, una suspensión unicelular de una población celular cultivada se enriquece, preferentemente, usando cuentas Miltenyi. A partir de la población celular cultivada con una frecuencia de células especificas: para antigeno de alrededor del 1% a alrededor del 5% se obtiene una población celular enriquecida con una frecuencia de células especificas para antigeno que se acerca al 100%.
El método de selección de anticuerpos que usa una etapa de enriquecimiento incluye una etapa de producción de anticuerpos de al menos una célula especifica para antigeno de una población celular enriquecida. Los métodos de producción de anticuerpos in vitro son bien conocidos en la técnica y puede usarse cualquier método adecuado. En una modalidad, una población celular enriquecida, como una suspensión unicelular especifica para antigeno de una población celular cultivada, se colocó en placas a diversas densidades celulares, tal como 50, 100, 250, 500 u otros incrementos entre 1 y 1000 células por pocilio. Preferentemente, la subpoblación comprende no más de alrededor de 10,000 células que secretan anticuerpos especificas para el antigeno, más preferentemente, alrededor de 50-10,000, alrededor de 50-5,000, alrededor de 50-1,000, alrededor de 50-500, alrededor de 50-250 células que secretan anticuerpos especificas para el antigeno o incrementos de los mismos. Entonces, se cultivan estas subpoblaciones con un medio adecuado (por ejemplo, un medio acondicionado de linfocitos T activado, en particular, 1-5% de un medio acondicionado de linfocitos T de conejo activado) en una capa de alimentación, preferentemente en condiciones que favorecen la supervivencia de una única célula de proliferación que secreta anticuerpos por pocilio de cultivo. La capa de alimentación, que en general comprende material celular irradiado, por ejemplo, células EL4B, no constituye parte! de la población celular. Las células se cultivan en un medio adecuado durante un periodo suficiente para la producción de anticuerpos, por ejemplo, alrededor de 1 día a alrededor de 2 semanas, alrededor de 1 dia a alrededor de 10 días, al' menos alrededor de 3 días, alrededor de 3 a alrededor de 5 días, alrededor de 5 días a alrededor de 7 días, al menos alrededor de 7 días u otros incrementos de los mismos. En una modalidad, se cultiva simultáneamente más de una subpoblación . Preferentemente, sobrevive una única célula que produce anticuerpos y progenie de esta en cada pocilio, lo que proporciona una población clonal de linfocitos B específicos para antígeno en cada pocilio. En esta etapá, la inmunoglobulina G (IgG) producida por la población clonal es altamente correlativa con la especificidad del antígeno. 'En una modalidad preferida, las IgG exhiben una correlación con la especificidad del antígeno mayor a alrededor del 50%, más preferentemente, mayor al 70%, 85%, 90%, 95%, 99% o incrementos de los mismos. Véase la Figura 3 que muestra un ejemplo de correlación para la IL-6. Las correlaciones se mostraron colocando cultivos de linfocitos B en condiciones limitantes para establecer productos únicos de anticuerpos específicos para antígeno por pocilio. Se compararon las síntesis específicas para antígeno con las de IgG generales. Se observaron tres poblaciones: la IgG que reconoció un formato único de antígeno (revestimiento biotinilado y directo) , la IgG detectable y el reconocimiento de antígeno sin tomar en cuenta la inmovilización y la producción de IgG únicamente. La producción de IgG fue altamente correlativa con la especificidad para antígeno.
Opcionalmente se recoge un sobrenadante que contiene I anticuerpos que pueden enriquecerse, analizarse y/o cultivarse para la selección de anticuerpos de acuerdo con las ¡etapas descritas anteriormente. En una modalidad, el sobrenadante se enriquece (preferentemente por medio de un ensayo de especificidad del antígeno, en especial un ensayo ELISA) y/o se analiza para determinar la funcionalidad del anticuerpo.
En otra modalidad, la población enriquecida, preferentemente clonal, de linfocitos B específicos; para antígeno a partir de la cual se analiza opcionalmente un supernadante descrito anteriormente para detectar la presencia del anticuerpo monoclonal secretado deseado se utiliza para el aislamiento de unos pocos linfocitos B, preferentemente un único linfocito B que luego se prueba en un ensayo apropiado para confirmar la presencia de un único linfocito B que produce anticuerpos en la población clonal de linfocitos B. En una modalidad, se aislan alrededor de 1 a alrededor de 20 células a partir de la población clonal de linfocitos B, preferentemente, menos de alrededor de 15, 12, 10, 5 o 3 células o incrementos de los mismos, más preferentemente, una única célula. El ensayo se efectúa preferentemente mediante un ensayo de especificidad del antígeno, en especial un ensayo de halógeno. El ensayo de halógeno se puede realizar con la proteína de longitud completa o un fragmento de esta. El sobrenadante que contiene anticuerpos puede también analizarse para determinar al menos uno de: afinidad de unión al antígeno, agonismo o antagonismo de unión del ligando al antígeno, inducción o inhibición de la proliferación de un tipo celular objetivo específico, inducción o inhibición de la lisis de una célula objetivo e inducción o inhibición de una vía biológica que involucre el antígeno1.
La célula identificada específica para antígeno; puede usarse para derivar las secuencias correspondientes de ácido nucleico que codifican el anticuerpo monoclonal deseado. (Una digestión AluI puede confirmar que se produce solo un único tipo de anticuerpo monoclonal por pocilio) . Según se mencionó anteriormente, estas secuencias pueden mutarse, como mediante humanización, para hacerlas adecuadas para su uso en medicamentos para humanos.
Como se mencionó anteriormente, la población de linfocitos B enriquecida utilizada en el proceso también puede enriquecerse, analizarse y/o cultivarse adicionalmente para la selección de anticuerpos de acuerdo con las etapas descritas anteriormente que pueden repetirse o realizarse en distinto orden. En una modalidad preferida, se aisla, cultiva y utiliza para la selección de anticuerpos al menos una célula de una población celular enriquecida, preferentemente clonal y especifica para antiqeno.
Por lo tanto, en una modalidad, la presente invención proporciona un método que comprende: a. cultivar una población celular a partir ,de un hospedador inmunizado para obtener una población celular cultivada, ' b. crear al menos una suspensión unicelular a partir de una población celular cultivada, c. enriquecer al menos una suspensión unicelular, preferentemente por cromatografía, para formar una primera población celular enriquecida, d. enriquecer la primera población celular enriquecida, preferentemente por medio del ensayo ELISA, para formar una segunda población celular enriquecida que es preferentemente clonal, es decir, contiene solo un único tipo de linfocito B especifico para antigeno, e. enriquecer la segunda población celular enriquecida, preferentemente por medio del ensayo de halógeno, para ¡formar una tercera población celular enriquecida que contiene 1 uno o pocos linfocitos B que producen un anticuerpo especifico para un antigeno deseado y f. seleccionar un anticuerpo producido por una célula especifica para antigeno aislada de la tercera población celular enriquecida.
El método puede incluir adicionalmente una o más etapas de análisis de la población celular cultivada para determinar la fuerza de unión al anticuerpo (afinidad, avidez) y/o la funcionalidad del anticuerpo. Las etapas de análisis adecuado incluyen pero no se limitan a métodos de ensayo que detectan: si el anticuerpo producido por el linfocito B identificado específico para antígeno produce un anticuerpo que posee una mínima afinidad de unión al antígeno, si el anticuerpo agoniza o antagoniza la unión de un antígeno deseado al ligando; si el anticuerpo induce o inhibe la proliferación de un tipo celular especifico, si el anticuerpo- induce o provoca una reacción citolitica contra células objetivo, si el anticuerpo se [ une a un epitopo especifico y si el anticuerpo modula (inhibe o agoniza) una vía o vías biológicas especificas que involucren el antigeno.
De manera similar, el método puede incluir una o más etapas de análisis de la segunda población celular enriquecida para determinar la fuerza de unión al anticuerpo y/o la funcionalidad del anticuerpo. i El método puede incluir adicionalmente una etapa de determinar la secuencia de secuencias de polipéptidos o .de la secuencia de ácido nucleico correspondiente del anticuerpo seleccionado. El método también puede incluir una etapa de producción de un anticuerpo recombinante usando la secuencia, un fragmento de la misma o una versión genéticamente modificada del anticuerpo seleccionado. Los métodos para la mutación de secuencias de anticuerpos para retener las propiedades deseadas son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen humanización, quimerización, producción de anticuerpos de cadena simple; estos métodos de mutación pueden producir anticuerpos recombinantes que poseen la función efectora' , la inmunogenicidad, la estabilidad, la eliminación o la adición de glicosilación deseadas y similares. El anticuerpo recombinante puede producirse mediante cualquier célula recombinante adecuada que incluye, a modo no taxativo, células de mamíferos tales como CHO, COS, BHK, HEK-293, células bacterianas, células de levadura, células vegetales, células de insecto y células anfibias. En una modalidad, los anticuerpos se expresan en células poliploides de levadura, es decir, células diploides de levadura, en particular, Pichia.
En una modalidad, el método comprende: a. inmunizar un hospedador contra un antigeno para producir anticuerpos hospedadores, b. analizar los anticuerpos hospedadores para determinar la especificidad del antigeno y la neutralización, b. cultivar linfocitos B del hospedador, d. enriquecer los linfocitos B cultivados para crear una población celular enriquecida con una frecuencia aumentada de células especificas para antigeno, e. cultivar una o más subpoblaciones de la población celular enriquecida en condiciones que favorecen la supervivencia de un único linfocito B para producir una población clonal en al menos un pocilio de cultivo, ; f. determinar si la población clonal produce un anticuerpo especifico para el antigeno, g. aislar un linfocito B simple y h. determinar la secuencia la secuencia de ácido nucleico del anticuerpo producido por el único linfocito B.
Métodos de humanización de anticuerpos En otra modalidad de la invención, se proporciona un método para la humanización de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos. En esta modalidad, se sigue el siguiente método para la humanización de cadenas pesadas y ligeras: Cadena ligera 1. Identificar el primer aminoácido que le sigue a la secuencia de péptidos de señales. Este es el comienzo ; de la Región Flanqueante 1. El péptido de señales comienza len la primera metionina de iniciación y tiene típicamente, pero no necesariamente, 22 aminoácidos de longitud para las secuencias de proteínas de cadena ligera de conejo. El comienzo del polipéptido maduro también puede determinarse de manera experimental determinando la secuencia de la proteina N-terminal o se puede prever usando un algoritmo de previsión. Este también es el comienzo de la Región Flanqueante 1 como lo suelen definir los expertos en la materia.
Ejemplo: Residuo de aminoácido RbtVL 1 en la Figura 2 que comienza con "AYDM" . 2. Identificar el final de la Región Flanqueante 3'. Esta tiene típicamente 86-90 aminoácidos que siguen al comienzo de la Región Flanqueante 1 y es típicamente un residuo de cisteína precedido por dos residuos de tirosina. Este es el final de la Región Flanqueante 3 como lo suelen definir los expertos en la materia .
Ejemplo: Residuo de aminoácido RbtVL 88 en la Figura; 2 que termina con "TYYC". 3. Usar la secuencia de cadena ligera de conejo del polipéptido comenzando por el principio de la Región Flanqueante 1 hasta el final de la Región Flanqueante 3 como se definió anteriormente y realizar una búsqueda de homología de secuencias para determinar las secuencias de proteínas de anticuerpos más similares. Esta será típicamente una búsqueda contra secuencias de línea germinal humanas antes de la maduración del anticuerpo para reducir la posibilidad de inmunogenicidad, sin embargo, se puede usar cualquier secuencia humana. Típicamente se puede usar un programa del estilo de BLAST para buscar en una base de datos de secuencias las más homologas. Las bases de datos de secuencias de anticuerpos humanos pueden encontrarse en varias fuentes tales como NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnologica) .
Ejemplo: La secuencia de aminoácidos RbtVL de los residuos numerados 1 a 88 en la Figura 2 se compara en BLAST con una base de datos de líneas germinales de anticuerpos humanos. Las tres primeras secuencias únicas recuperadas se muestran en la Figura 2 como L12A, VI y Vx02. 4. En general, la secuencia de cadena ligera variable de la línea germinal humana más homologa luego se usa como base de la humanización. Sin embargo, los expertos en la técnica pueden decidir utilizar otra secuencia sin ser la de mayor homología según lo determina el algoritmo de homología, basado en. otros factores que incluyen los espacios de secuencias y las similitudes en la región flanqueante. \ Ejemplo: En la Figura 2, L12A era la secuencia de cadena ligera variable de línea germinal humana más homologa y ¡se usa como base para humanización de RbtVL. i 5. Determinar la Región Flanqueante y el arreglo de CDR (FR1, FR2 , FR3 , CDR1 y CDR2) para el homólogo humano usado para humanización de cadena ligera. Esto se lleva a cabo utilizando la distribución tradicional tal como se describe en la materia. Alinear la secuencia de cadena ligera variable de conejo 'con el homólogo humano, mientras que se mantiene la distribución de las regiones flanqueantes y CDR.
Ejemplo: En la Figura 2, la secuencia RbtVL se alinea con la secuencia homologa humana L12A y se indican los dominios flanqueante y CDR. 6. Remplazar las regiones de CDR1 y CDR2 de la secuencia de cadena ligera homologa humana con las secuencias de CDR1 y CDR2 de la secuencia de conejo. Si existen diferencias de longitud entre las secuencias de CDR humana y de conejo, entonces se debe usar la totalidad de las secuencias de 'CDR de conejo y sus longitudes. Es posible que la especificidad, la afinidad y/o la inmunogenicidad del anticuerpo humanizado resultante puedan no alterarse si se realizan intercambios de secuencias mayores o menores o si se alteran résiduos específicos, sin embargo los intercambios según descritos han sido usados exitosamente, pero no se excluye la posibilidad de que se permitan otros cambios.
Ejemplo: En la Figura 2, los residuos de aminoácidos de CDR1 y CDR2 de la cadena ligera variable homologa humana L12A se remplazan con las secuencias de aminoácidos de CDR1 y CDR2 de la secuencia de cadena ligera de anticuerpo de conejo RbtVL. Las regiones flanqueantes 1, 2 y 3 de L12A humanas no se modifican. La secuencia humanizada resultante se muestra a continuación como VLh desde los residuos enumerados l a 88. Nótese que solo se subrayan los residuos que son distintos a la secuencia humana L12A y, por lo tanto, son los residuos de aminoácidos derivados de conejo. En este ejemplo, solo 8 de los 88 residuos son diferentes a la secuencia humana. 7. Luego de la región flanqueante 3 de la nueva secuencia híbrida creada en la Etapa 6, se debe unir la totalidad, de la CDR3 de la secuencia de anticuerpos de cadena ligera de conejo. La secuencia de CDR3 puede tener diversas longitudes; pero tiene típicamente de 9 a 15 residuos de aminoácidos de longitud. Los expertos en la técnica definen la región CDR3 y el comienzo de la siguiente región de la región flanqueante 4 clásicamente y de manera que se pueden identificar. Típicamente, el comienzo de la región flanqueante 4 y, por tanto, la continuación del final de la CDR3 consiste : en la secuencia "FGGG...", no obstante, puede existir alguna variación en estos residuos.
Ejemplo: En la Figura 2, la CDR3 de RbtVL (residuos de aminoácidos enumerados del 89 al 100) se agrega al final de la región flanqueante 3 en la secuencia humanizada indicada como VLh. 8. La Región Flanqueante 4 de la cadena ligera de conejo que constituye típicamente los últimos 11 residuos de aminoácidos de la cadena ligera variable y comienza como se indica en la Etapa 7 anterior y termina típicamente con la secuencia de aminoácidos "...VVKR" se remplaza con el homólogo de la Región Flanqueante 4 de cadena ligera humana más cercano, normalmente de la secuencia germinal. Frecuentemente, esta región flanqueante 4 de cadena ligera humana es de la secuencia ? FGGGTKVEIKR' . Es posible que otras secuencias de la Región Flanqueante 4 de cadena ligera humana que no sean las más homologas o de otra manera sean diferentes puedan usarse sin afectar la especificidad, la afinidad y/o la inmunogenicidad del anticuerpo humanizado resultante. Esta secuencia de la Región Flanqueante 4 de cadena ligera humana se agrega al: final de la secuencia humanizada de cadena ligera variable que1 sigue inmediatamente a la secuencia de CDR3 de la Etapa 7 anterior. Este es el final de la secuencia de aminoácidos humanizados de cadena ligera variable. : Ejemplo: En la Figura 2, la región flanqueante 4 (FR4) de la secuencia de cadena ligera de conejo RbtVL se muestra sobre una secuencia de FR4 humana homologa. La secuencia de FR4 humana se agrega a la secuencia de cadena ligera variable humanizada (VLh) inmediatamente después del final de la región CD3 agregada en la Etapa 7 anterior.
Adicionalmente, las Figuras 34 y 35 representan secuencias de cadenas ligeras variables y pesadas variables anti-IL-6 humanizadas que fueron humanizadas a partir de regiones ligeras y pesadas variables en Abl de acuerdo con la invención.. Estas regiones de cadena pesada y ligera humanizadas . están contenidas, respectivamente, en los polipéptidos contenidos en la SEQ ID NO: 647 o 651 y en las SEQ ID NO: 652, 656, 657 o 658. La CDR2 de la región pesada variable humanizada en la SEQ ID NO: 657 (contiene una sustitución de serina en la CDR2) está contenida en la SEQ ID NO: 658. Las alineaciones que ilustran variantes de las cadenas pesadas y ligeras se muestran en las Figuras 36 y 37, respectivamente, con diferencias de secuencia entre las regiones de CDR resaltadas. Los identificadores de secuencia de las secuencias de CDR y de los ejemplos de secuencias de codificación se encuentran resumidos en la Tabla 1 anteriormente.
Cadena pesada 1. Identificar el primer aminoácido que le sigue a la secuencia de péptidos de señales. Este es el comienzo de la Región Flanqueante 1. El péptido de señales comienza en la primera metionina de iniciación y tiene típicamente 19 aminoácidos de longitud para las secuencias de proteínas de cadena pesada de conejo. Típicamente, pero no necesariamente siempre, los últimos 3 residuos de aminoácidos de un péptido de señales de cadena pesada de conejo son "...VQC", seguidos por el comienzo de la Región Flanqueante 1. El comienzo del polipéptido maduro también se puede determinar de manera experimental determinando la secuencia de la proteína N-terminal o se puede prever usando un algoritmo de previsión. Este también es el comienzo de la Región Flanqueante 1 como lo suelen definir los expertos en la materia.
Ejemplo: Residuo de aminoácido RbtVH 1 en la Figura 2 que comienza con "QEQL... " 2. Identificar el final de la Región Flanqueante 3. Este tiene típicamente 95-100 aminoácidos que siguen al comienzo de la Región Flanqueante 1 y típicamente tiene la secuencia final de "...CAR" (aunque la alanina también puede ser una valina) . Este es el final de la Región Flanqueante 3 como lo !suelen definir los expertos en la materia. '¦ Ejemplo: Residuo de aminoácido RbtVH 98 en la Figura' 2 que termina con "... FCVR" . 3. Usar la secuencia de cadena pesada de conejo del polipéptido comenzando por el principio de la Región Flanqueante 1 hasta el final de la Región Flanqueante 3 como se definió anteriormente y realizar una búsqueda de homología de secuencias para las secuencias de proteínas de anticuerpos humanos más similares. Esta se realizará típicamente contra una base de datos de secuencias germinales humanas antes de la maduración del anticuerpo para reducir la posibilidad de inmunogenicidad, no obstante, se puede usar cualquier secuencia humana. Típicamente, se puede usar un programa del estilo de BLAST para buscar en una base de datos de secuencias las más homologas. Las bases de datos de secuencias de anticuerpos humanos pueden encontrarse en diversas fuentes tales como NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) .
Ejemplo: La secuencia de aminoácidos RbtVH de los residuos numerados 1 a 98 en la Figura 2 se compara en BLAST con una base de datos de líneas germinales de anticuerpos humanos. Las tres primeras secuencias únicas recuperadas se muestran en la Figura 2 como 3-64-04, 3-66-04 y 3-53-02. \ 4. En general, la secuencia de cadena pesada variable de la línea germinal humana más homologa luego se usa como base de la humanización. Sin embargo, los expertos en la técnica pueden decidir usar otra secuencia sin ser la más homologa según lo determina el algoritmo de homología, basado en otros factores que incluyen los espacios de secuencias y las similitudes de región flanqueante.
Ejemplo: 3-64-04 en la Figura 2 era la secuencia de cadena pesada variable de la línea germinal humana más homologa y se usa como base para la humanización de RbtVH. 5. Determinar la región flanqueante y el arreglo de CDR (FR1, FR2, FR3, CDR1 y CDR2) para el homólogo humano usado para humanización de cadena pesada. Esto se lleva a cabo utilizando la distribución tradicional según se describe en la materia. Alinear la secuencia de cadena pesada variable de conejo :con el homólogo humano, mientras que se mantiene la distribución de las regiones flanqueantes y CDR.
Ejemplo: En la Figura 2, la secuencia RbtVH se alinea con la secuencia homologa humana 3-64-04 y se indican los dominios flanqueantes y de CDR. 6. Remplazar las regiones CDR1 y CDR2 de la secuencia de cadena pesada homologa humana con las secuencias de CDR1 y CDR2 de la secuencia de conejo. Si existen diferencias de longitud entre las secuencias de CDR humana y de conejo, entonces se debe usar la totalidad de las secuencias de CDR de conejo. y sus longitudes. Adicionalmente, puede ser necesario remplazar los últimos tres aminoácidos de la región flanqueante 1 de cadena pesada humana con los últimos tres aminoácidos de la región flanqueante 1 de cadena pesada de conejo. Típicamente, pero no siempre, en la región flanqueante 1 de cadena pesada de conejo, estos tres residuos siguen un residuo de glicina precedido por un residuo de serina. Además, puede ser necesario remplazar el aminoácido final de la región flanqueante 2 de cadena pesada humana con el aminoácido final de la región flanqueante 2 de cadena pesada de conejo. Típicamente, pero no necesariamente siempre, este es un residuo de glicina precedido por un residuo de isoleucina en la región flanqueante 2 de cadena pesada de conejo. Es posible que la especificidad, la afinidad y/o la inmunogenicidad del anticuerpo humanizado resultante puedan no modificarse si se realizan intercambios de secuencia más pequeños o más grandes o si se modifican residuos específicos, no obstante, los intercambios según descritos fueron usados exitosamente, pero no excluyen la posibilidad de que se permitan otros cambios. Por ejemplo, un residuo de aminoácido de triptófano tiene lugar, típicamente, cuatro residuos' antes del final de la región CDR2 de cadena pesada de conejo, mientras que en la CDR2 de cadena pesada humana este residuo es típicamente un residuo de serina. Se ha demostrado que el hecho de cambiar este residuo de triptófano de conejo por un residuo de serina humana en esta posición tiene un efecto mínimo o inexistente sobre la especificidad o afinidad del anticuerpo humanizado y, por lo tanto, minimiza adicionalmente el contenido de los residuos de aminoácidos derivados de la secuencia de conejo en la secuencia humanizada.
Ejemplo: En la Figura 2, los residuos de aminoácidos de CDR1 y CDR2 de la cadena pesada variable homologa humana se remplazan por las secuencias de aminoácidos de CDR1 y CDR2 de la secuencia de cadena ligera de anticuerpo de conejo RbtVH, salvo por el residuo secuenciado que es triptófano en la secuencia de conejo (número de posición 63) y serina en la misma posición en la secuencia humana y se mantiene como el residuo de serina humano. Además de los cambios de CDR1 y¡CDR2, los últimos tres aminoácidos de la región flanqueante 1 (posiciones 28-30) , así como el residuo final de la región flanqueante 2 (posición 49) se retienen como residuos de aminoácidos de conejo en lugar de humanos. La secuencia humanizada resultante se muestra a continuación como VHh de residuos numerados del 1 al 98. Nótese que solo se subrayan los residuos que son distintos a la secuencia humana 3-64-04 y, por lo tanto, son residuos de aminoácidos derivadas de conejo. En este ejemplo, solo 15 de los 98 residuos son diferentes a la secuencia humana. 7. Luego de la región flanqueante 3 de la nueva secuencia híbrida creada en la Etapa 6, se debe unir la totalidad de la CDR3 de la secuencia de anticuerpos de cadena pesada de conejo. La secuencia de CDR3 puede tener diversas longitudes pero tiene, típicamente, de 5 a 19 residuos de aminoácidos de longitud. Los expertos en la técnica definen la región de CDR3 y el comienzo de la siguiente región flanqueante 4 se definen clásicamente y de manera que pueden identificarse. Típicamente, el comienzo de la región flanqueante 4 y, por lo tanto, la continuación del final de la CDR3 consiste en la secuencia "WGXG..." (donde X es normalmente Q o P) , no obstante, puede existir alguna variación en estos residuos.
Ejemplo: La CDR3 de RbtVH (residuos de aminoácidos numerados del 99 al 110) se agrega al final de la 'región flanqueante 3 en la secuencia humanizada indicada como VHh. 8. La región flanqueante 4 de la cadena pesada de conejo que consiste típicamente en los últimos 11 residuos de aminoácidos de la cadena pesada variable y comienza como se indica en la Etapa 7 anterior y termina típicamente con la secuencia de aminoácidos "...TVSS" se remplaza con el homólogo de la región flanqueante 4 de cadena pesada humana más cercano, normalmente, de la secuencia germinal. Frecuentemente, esta región flanqueante 4 de cadena pesada humana es de la secuencia XWGQGTLVTVSS" . Es posible que otras secuencias de la región flanqueante 4 de cadena pesada humana que no son las más homologas o de otra manera diferente puedan usarse sin afectar la especificidad, la afinidad y/o la inmunogenicidad del anticuerpo humanizado resultante. Esta secuencia de la región flanqueante 4 de cadena pesada humana se agrega al final1 de la secuencia humanizada de cadena pesada variable que ' sigue inmediatamente a la secuencia de CDR3 de la Etapa 7 anterior. Este es el final de la secuencia de aminoácidos humanizados de cadena pesada variable.
Ejemplo: En la Figura 2, la región flanqueante 4 (FR4) de la secuencia de cadena pesada de conejo RbtVH se muestra, sobre una secuencia de FR4 pesada humana homologa. La secuencia de FR4 humana se agrega a la secuencia de cadena pesada variable humanizada (VHh) inmediatamente al final de la región de CD3 que se agrega en la Etapa 7 anterior.
Métodos para la producción de anticuerpos y fragmentos de los mismos La invención también se dirige a la producción de anticuerpos descritos en la presente o fragmentos de los mismos. Los polipéptidos recombinantes que corresponden a los anticuerpos descritos en la presente o fragmentos de los mismos se secretan a partir de cepas poliploides, preferentemente, diploides o tetraploides de levadura que pueden aparearse. En un ejemplo de modalidad, la invención se dirige a métodos para la producción de estos polipéptidos recombinantes en . forma secretada por periodos prolongados usando cultivos que comprenden levadura poliploide, es decir, al menos varios días a una semana, más preferentemente, al menos un mes o varios meses y aun más preferentemente al menos 6 meses a un año o más. Estos cultivos de levadura poliploide expresarán al menos 10-25 mg/litro del polipéptido, más preferentemente, al menos 50-250 mg/litro, aun más preferentemente, al menos 500-1000 mg/litro y, más preferentemente, un gramo por litro o más del o de los polipéptidos recombinantes. , En una modalidad de la invención, un par de células haploides de levadura marcadas genéticamente se transforman con vectores de expresión que comprenden subunidades de una proteina heteromultimérica deseada. Una célula haploide comprende un primer vector de expresión y una segunda célula haploide comprende un segundo vector de expresión. En otra modalidad, las células diploides de levadura serán transformadas con uno o más vectores de expresión que proporcionan la expresión y secreción de uno o más de los polipéptidos recombinantes . En aun otra modalidad, una única célula haploide puede transformarse con uno o más vectores y puede usarse para producir una levadura poliploide mediante estrategias de fusión o apareamiento. En aun otra modalidad, un cultivo de levadura diploide puede transformarse con uno o más vectores que proporcionan la expresión y secreción de uno o unos polipéptidos deseados. Estos vectores pueden comprender vectores, por ejemplo, plásmidos linealizados u otros productos de ADN lineal que integran al genoma de la célula de levadura al azar, a través de la recombinación homologa o utilizando una recombinasa tal como Cre/Lox o Flp/Frt. Opcionalmente, se pueden introducir vectores de expresión adicionales en las células haploides o diploides o el primer o segundo vector de expresión pueden comprender secuencias de codificación adicionales para la síntesis de heterotrímeros, heterotetrámeros, etc. Los niveles de expresión de los polipéptidos no idénticos pueden calibrarse individualmente y ajustarse a través de la selección apropiada, el número de copia de vector, la fuerza del promotor y/o la inducción y similares. Las células haploides transformadas se cruzan o fusionan genéticamente. Las cepas diploides o tetrapíoides resultantes se utilizan para producir y secretar proteínas totalmente ensambladas y funcionales biológicamente, anticuerpos humanizados descritos en la presente o fragmentos de los mismos.
El uso de células diploides o tetraploides para la producción de proteínas proporciona beneficios inesperados. Las células se pueden cultivar con fines de producción, es decir, aumentadas a escala y por períodos prolongados de tiempo, en condiciones que pueden ser perjudiciales para el cultivo de células haploides, cuyas condiciones pueden incluir una alta densidad celular, cultivo en medios mínimos, cultivo a: bajas temperaturas, cultivo estable en ausencia de presión selectiva y que puede proporcionar el mantenimiento de una integridad de secuencia de genes heterólogos y mantenimiento del alto nivel de expresión en el tiempo. Sin ánimo de limitarse a esto, los inventores teorizan acerca de que esos beneficios pueden surgir, al menos en parte, de la creación de cepas diploides a partir de dos cepas haploides parentales distintas. Talesi cepas haploides pueden comprender varias mutaciones autotróficas de poca importancia; estas mutaciones se complementan 'en la diploide o tetraploide, lo que posibilita el crecimiento y la producción mejorada en condiciones altamente selectivas.
Las células haploides de levadura transformadas que pueden aparearse proporcionan un método genético que permite el apareamiento de subunidades de una proteína deseada. Lasj cepas haploides de levadura se transforman con cada uno de los dos i vectores de expresión, un primer vector para dirigir la síntesis de una cadena de polipéptido y un segundo vector para dirigir la síntesis de una segunda cadena de polipéptidos no idénticos. Las dos cepas haploides se aparean para proporcionar un hospedador diploide donde se puede obtener una producción de proteínas objetivo optimizadas.
Opcionalmente, se proporcionan secuencia/s de codificación no idénticas. Tales secuencias pueden estar presentes en vectores de expresión adicionales o en el primer o segundo vector de expresión. Como se conoce en la técnica, pueden expresarse independientemente múltiples secuencias de codificación a partir de promotores individuales o se pueden expresar de manera coordinada a través de la inclusión de un "sitio interno de entrada al ribosoma" o "IRES" que es un elemento que promueve una entrada directa interna del ribosoma al codón de iniciación, tal como ATG, de un cistrón (una >región que codifica una proteína) , mediante lo cual se produce la traducción del gen independiente de cap. Se describen elementos IRES funcionales en levadura en Thompson et al. (2001) P . N . A. S . 98: 12866-12868.
En una modalidad de la invención, las secuencias de anticuerpo se producen en combinación con una cadena secretora J, que proporciona estabilidad mejorada de IgA (véanse las patentes estadounidenses N° 5,959,177 y 5,202,422) En una modalidad preferida, las dos cepas haploides de levadura son cada una auxotrófica y requiere de un complemento de medios para el cultivo de las células haploides. El par de auxotrófos es complementario, de manera que el producto diploide crecerá en ausencia de los complementos requeridos para las células haploides. Muchos de estos marcadores genéticos son conocidos en la levadura e incluyen requisitos de aminoácidos (por ejemplo, met, lys, his, arg, etc.), nucleósidos (por ejemplo, ura3, adel, etc.) y similares. Se pueden preferir marcadores de aminoácidos para los métodos de la invención. De manera alternativa, las células diploides que contienen los vectores deseados pueden seleccionarse mediante otros medios, por ejemplo, mediante el uso de otros marcadores tales como proteína verde fluorescente, genes resistentes a antibióticos, diversos marcadores seleccionables dominantes y similares .
Se pueden cruzar genéticamente dos células haploides transformadas y se pueden seleccionar cepas diploidés que surgen de este evento de apareamiento por sus requisitos nutricionales híbridos y/o espectros de resistencia a antibióticos. De manera alternativa, las poblaciones de las dos cepas haploides transformadas se someten a esferoplasto y se fusionan y se regenera y selecciona la progenie diploide. Por medio de cualquier método, se pueden identificar cepas diploides y cultivarse de forma selectiva basándose en su capacidad de crecer en medios distintos a los de sus progenitores. Por ejemplo, las células diploides se pueden cultivar en un medio mínimo que puede incluir antibióticos. La estrategia de síntesis diploide tiene algunas ventajas. Las cepas diploides tienen el potencial de producir niveles mejorados de proteína heteróloga a través de: una complementacion más amplia de mutaciones subyacentes que pueden impactar en la producción y/o secreción de proteína recombinante . Además, una vez que se obtienen las cepas estables, cualquier antibiótico usado para seleccionar esas cepas no deben necesariamente estar presentes continuamente en el medio de cultivo.
Como se observó anteriormente, en algunas modalidades, se puede transformar una levadura haploide con uno o múltiples vectores y aparearse o fusionarse con una célula no transformada para producir una célula diploide que contiene el o los vectores. En otras modalidades, se puede transformar una célula diploide de levadura con uno o más vectores que proporcionan la expresión y secreción de un polipéptido heterólogo deseado por medio de la célula diploide de levadura.
En una modalidad de la invención, se transforman dos cepas haploides con una biblioteca de polipéptidos, por ejemplo, una biblioteca de anticuerpo de cadenas pesadas o ligeras. Las células haploides transformadas que sintetizan los polipéptidos se aparean con las células haploides complementarias. Las células diploides resultantes se analizan para determinar la proteína funcional. Las células diploides proporcionan un medio para reunir rápida, conveniente y económicamente una gran cantidad de combinaciones de polipéptidos para pruebas funcionales. Esta tecnología es aplicable en especial para la creación de productos de proteína heterodimérica, donde los niveles de síntesis de subunidad optimizados son críticos para la expresión y secreción de proteínas funcionales.
En otra modalidad de la invención, la relación del nivel de expresión de las dos subunidades se regula para ; poder maximizar la creación de productos. Se ha demostrado anteriormente que los niveles de proteína de subunidad heterodimérica impactan en la creación de productos finales (Simmons LC, J Immunol Methods. 1° de mayo de 2002;263(1-2): 133-47). La regulación puede lograrse antes de la etapa de apareamiento mediante la selección de un marcador presente en el vector de expresión. Se puede aumentar el nivel de expresión aumentando de forma estable la cantidad de copias del vector. En algunos casos, se puede desear aumentar el nivel de una cadena con relación a otra de manera de alcanzar una proporción balanceada entre las subunidades del polipéptido . Los marcadores de resistencia a antibióticos son útiles pará este fin, por ejemplo, el marcador de resistencia a Z ocin™ ( fleomicina) , resistencia a G418, etc. y proporcionan uní medio de enriquecimiento para cepas que contienen múltiples copias integradas de un vector de expresión en una cepa seleccionando transformantes resistentes a mayores niveles de Zeocin™ (fleomicina) o G418. La relación adecuada, por ejemplo^ 1:1, 1:2, etc. de los genes de la subunidad pueden resultar importantes para la producción eficaz de proteínas. Aun cuando se usa el mismo promotor para transcribir ambas subunijdades , muchos otros factores contribuyen con el nivel final de proteína expresada y, por lo tanto, puede ser útil: para aumentar la cantidad de copias de un gen codificado con relación al otro. De manera alternativa, se crean ; cepas diploides que producen niveles más altos de un polipéptido con relación a cepas de vector de copia simple, apareando dos' cepas haploides que poseen múltiples copias de los vectoras de expresión. ' Las células hospedadoras se transforman con los ve tores de expresión antemencionados, apareados para formar : cepas diploides y cultivados en medios nutritivos convencionales modificados según corresponda para la inducción de promotores, la selección de transformadores o la amplificación de genes que codifican las secuencias deseadas. Se conoce en la técnica una cantidad de medios mínimos adecuados para el cultivo de levadura. Cualquiera de estos medios puede complementarse según sea necesario con sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como fosfato, HEPES) , nucleósidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos, elementos traza y glucosa o una fuente de energía equivalente. También puede incluirse cualquier otro complemento necesario en concentraciones apropiadas conocidas por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, como la temperatura, el pH y similares son aquellas previamente utilizadas con la célula hospedadora seleccionada para la expresión y serán evidentes para los expertos en la técnica.
Las proteínas secretadas se recuperan del medio de cultivo. Un inhibidor de proteasa, tal como fluoruro de^ fenil metil sulfonilo (PMSF) puede ser útil para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación y se pueden incluir antibióticos para prevenir el cultivo de contaminantes adventicios. La composición puede concentrarse, filtrarse, dializarse, etc. usando métodos conocidos en la técnica. , Las células diploides de la invención se cultivan con fines de producción. Tales fines de producción incluyen de forma deseada el cultivo en medios mínimos que carecen de aminoácidos preformados y otras biomoléculas complejas, por ejemplo, medios que comprenden amoniaco como fuente de nitrógeno y glucosa como fuente de energía y carbono y sales como fuente de fosfato, calcio y similares. Preferentemente, tales medios de producción carecen de agentes selectivos tales como antibióticos, aminoácidos, purinas, pirimidinas, etc. Las células diploides pueden cultivarse a una alta densidad celular, por ejemplo, al menos alrededor de 50 g/L, más normalmente, al menos de alrededor de 100 g/L y al menos alrededor de 300, alrededor de 400, alrededor de 500 g/L o más.
En una modalidad de la invención, el cultivo de las células objeto de la presente para los fines de producción se realiza a temperaturas bajas que pueden bajarse durante la fase logarítmica, durante la fase estacionaria o ambas. El término "baja temperatura" se refiere a temperaturas de al : menos alrededor de 15 °C, más normalmente al menos alrededor dé 17 °C y pueden ser de alrededor de 20 °C y normalmente no mayores a alrededor de 25 °C, más normalmente no mayores a alrededor de 22 °C. En otra modalidad de la invención, la baja temperatura normalmente no es mayor a alrededor de 28 °C. La temperatura de cultivo puede impactar en la producción de proteínas secretadas de longitud completa en cultivos de producción y el hecho de reducir las temperaturas de crecimiento del cultivo puede potenciar fuertemente el rendimiento del producto intacto. La temperatura disminuida parece asistir en el tráfico intracelular a través de las vías de procesamiento de plegamiento y postraduccionales que usa el hospedador para generar el producto objetivo ' junto con la reducción de la degradación de proteasa celular.
Los métodos de la invención proporcionan la expresión de proteina secretada activa, preferentemente una proteina de mamífero. En una modalidad, los "anticuerpos activos" secretados, como se usa en la presente, se refiere a un multímero correctamente plegado de al menos dos cadenas arregladas apropiadamente en pares y que se une con corrección a su antígeno cognado. Los niveles de expresión de proteínas activas son normalmente de al menos alrededor de 10-50 mg/litro del cultivo, más normalmente al menos alrededor de 100 mg/litro, preferentemente al menos alrededor de 500 mg/litro y pueden ser de 1000 mg/litro o más.
Los métodos de la invención pueden proporcionar una estabilidad aumentada de las secuencias hospedadoras y heterólogas de codificación durante la producción. La estabilidad se demuestra, por ejemplo, mediante el mantenimiento de altos niveles de expresión de tiempo, donde el nivel de expresión inicial disminuye en no más de alrededor de un 20%, normalmente no más de alrededor de un 10% y puede disminuir en no más de un 5% más alrededor de 20 duplicaciones, 50 duplicaciones, 100 duplicaciones o más.
La estabilidad de las cepas también proporciona el mantenimiento de la integridad de las secuencias de genes heterólogos con el paso del tiempo, donde se mantiene la secuencia de la secuencia de codificación activa y los elementos necesarios de regulación transcripcional en al; menos alrededor del 99% de las células diploides, normalmente 1 en al menos alrededor del 99.9% de las células diploides y preferentemente en al menos alrededor del 99.99% de las células diploides en aproximadamente 20 duplicaciones, 50 duplicaciones, 100 duplicaciones o más. Preferentemente, sustancialmente todas las células diploides mantienen la secuencia de la secuencia de codificación activa y los elementos necesarios de regulación transcripcional.
Otros métodos para la producción de anticuerpos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los métodos para la producción de anticuerpos quiméricos son ahora bien conocidos en la técnica (Véase, por ejemplo, la patente estadounidense N° 4,816,567 de Cabilly et al.; orrison ét al., P.N.A.S. USA, 81:8651-55 (1984); Neuberger, M.S. et al., Nature, 314:268-270 (1985); Boulianne, G.L. et al., Nature, 312:643-46 (1984), cuyas descripciones se incorporan a la presente en su totalidad a modo de referencia) .
Asimismo, otros métodos para la producción de anticuerpos humanizados son ahora bien conocidos en la técnica (Véase, por ejemplo, la patente estadounidense N° 5,530,101, 5,585,089, 5,693,762 y 6,180,370 de Queen et al; Patente estadounidense N° 5,225,539 y 6,548,640 de Winter; Patente estadounidense N° 6,054,297, 6,407,213 y 6,639,055 de Cárter et al; Patente estadounidense N° 6,632,927 de Adair; Jones, P.T. ét al, Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann, L., et al, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen, M, et al, Science, 239:1534-36 (1988), cuyas descripciones se incorporan a la presente en su totalidad como referencia) .
Los polipéptidos de anticuerpo de la invención que ¡poseen especificidad de unión a IL-6 también pueden producirse mediante la construcción, usando técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica, de un vector de expresión que contiene un operón y una secuencia de ADN que codifica una cadena pesada de anticuerpo donde la secuencia de ADN que codifica las CDR necesarias para la especificidad del anticuerpo se deriva de una fuente celular no humana, preferentemente una fuente de linfocitos B de conejo, mientras que la secuencia de ADN que codifica las partes restantes de la cadena de anticuerpo se derivan de una fuente celular humana.
Un segundo vector de expresión se produce usando los mismos medios convencionales bien conocidos por los expertos en la técnica; dicho vector de expresión contiene un operón y una secuencia de ADN que codifica una cadena ligera de anticuerpo donde la secuencia de ADN que codifica las CDR necesarias para la especificidad del anticuerpo se deriva una fuente celular no humana, preferentemente una fuente de linfocitos B de conejo, mientras que la secuencia de ADN que codifica las partes restantes de la cadena de anticuerpo se derivan de una fuente celular humana Los vectores de expresión se transfectan en una célula hospedadora mediante técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica para producir una célula hospedadora transfectada ; esta célula hospedadora transfectada cultivada mediante técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica para producir dichos polipéptidos de anticuerpos. ; La célula hospedadora puede transfectarse conjuntamente con los dos vectores de expresión descritos anteriormente, el primer vector de expresión contiene ADN que codifica un operón y un polipéptido derivado de una cadena ligera y el segundo vector contiene ADN que codifica un operón y un polipéptido derivado de una cadena pesada. Los dos vectores contienen diferentes marcadores seleccionables, pero preferentemente alcanzan sustancialmente la misma expresión de los polipéptidos de cadena pesada y ligera. De manera alternativa, se puede usar un único vector, este vector incluye ADN que codifica tanto los polipéptidos de cadena pesada como los de ligera. Las secuencias de codificación para las cadenas pesadas y ligeras pueden comprenden ADNc.
Las células hospedadoras utilizadas para expresar los polipéptidos de anticuerpo pueden ser una célula bactériana, como E.coli o una célula eucariota. En una modalidad particularmente preferida de la invención, se puede usar una célula de mamífero de un tipo bien definido para este fin, tal como una célula de mieloma o una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) .
Los métodos generales por los cuales se pueden construir los vectores, los métodos de transfección requeridos para producir la célula hospedadora y los métodos de cultivo requeridos para producir los polipéptidos de anticuerpo a partir de dichas células hospedadoras, todos incluyen técnicas convencionales. Aunque preferentemente la línea celular j usada para producir el anticuerpo es una línea celular de mamífero, puede usarse, de manera alternativa, cualquier otra linea celular adecuada, tal como una linea celular de bacteria como una cepa bacteriana derivada de E.coli o una linea celular de levadura, .
De manera similar, una vez que se produjeron los polipéptidos de anticuerpo estos pueden purificarse de acuerdo con los procedimientos estándar de la técnica tal ' como, por ejemplo, filtración de flujo cruzado, precipitación de sulfato de amonio, cromatografía de afinidad de columna y similares.
Los polipéptidos de anticuerpo descritos en la presente también pueden usarse para el diseño y la síntesis de miméticos peptídicos o no peptídicos que serían útiles para las ;mismas aplicaciones terapéuticas que los polipéptidos de anticuerpo de la invención. Véase, por ejemplo, Saragobi et al, Science, 253:792-795 (1991), cuyo contenido se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia. ' Ejemplos de modalidades de polipéptidos y polinucleótidos de cadena pesada y ligera ; Esta sección describe ejemplos de modalidades de polipéptidos de cadena pesada y ligera, así como ejemplos de polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos. Estos ejemplos de polinucleótidos son adecuados para su expresión en el sistema de expresión Pichia descrito.
En algunas modalidades, la presente invención comprende polinucleótidos que poseen al menos 70%, como al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad con los polinucleótidos descritos en esta solicitud o que codifican polipéptidos descritos en la presente solicitud o que se hibridan con dichos polinucleótidos en condiciones de restricción baja, restricción moderada o restricción alta, preferentemente aquellos que codifican polipéptidos (por ejemplo, una cadena pesada y ligera de inmunoglobulina, un anticuerpo de cadena simple, un fragmento de anticuerpo, etc.) que poseen al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente, incluyendo, a modo no taxativo, la unión especifica a un polipéptido de IL-6. En otro aspecto, la invención comprende una composición que comprende tal polinucleótido y/o un polipéptido codificado por' tal polinucleótido . En aun otro aspecto, la invención comprende un método para el tratamiento de una enfermedad o afección asociada con la IL-6 o que puede prevenirse, tratarse o mejorarse con un antagonista de IL-6 tal como Abl (por ejemplo, caquexia, fatiga por cáncer, artritis, etc.) que comprende la administración de una composición que comprende tal polinucleótido y/o polipéptido.
En algunas modalidades preferidas, un polipéptido de cadena pesada comprenderá una o más secuencias de CDR 'de los polipéptidos de cadena pesada y/o ligera descritos en la presente (incluidos los contenidos en los polipéptidos de cadena pesada y ligera descritos en la presente) y uno: o más polipéptidos de la región flanqueante descritos en la presente, incluidos aquellos representados en las Figuras 2 y 34-37 o en la Tabla 1 y contenidos en las secuencias de polipéptidos de cadena pesada y ligera descritas en la presente. En algunas modalidades preferidas, un polipéptido de cadena pesada comprenderá una o más secuencias de región flanqueante 4 como se representa en las Figuras 2 y 34-37 o en la Tabla 1 o como se encuentra contenido en polipéptidos de cadena pesada o ligera descritos en la presente.
En algunas modalidades preferidas, un polipéptido de cadena ligera comprenderá una o más de las secuencias de CDR de los polipéptidos de cadena pesada y/o ligera descritos : en la presente (incluidos los contenidos en los polipéptidos de cadena pesada y ligera descritos en la presente) y uno o itiás de los polipéptidos de la región flanqueante descritos en la presente, incluidos aquellos representados en las Figura's 2 y 34-37 o en la Tabla 1 y contenidos en las secuencias de polipéptidos de cadena pesada y ligera descritas en la presente. En algunas modalidades preferidas, un polipéptido de cadena ligera comprenderá una o más secuencias de región flanqueante 4 como se representa en las Figuras 2 y 34-37 o en la Tabla 1 o como se encuentra contenido en polipéptidos de cadena pesada o ligera descritos en la presente.
En cualquiera de las modalidades descritas en la presente, algunas secuencias descritas pueden ser sustituidas entre ellas, a menos que el contexto indique lo contrario. El hecho de que secuencias particulares puedan sustituirse entre ellas, en caso de que esto ocurriera, se entiende que es de carácter ilustrativo y no limitante y también se entiende que dichas sustituciones se encuentran comprendidas aun cuando no se describieran ejemplos ilustrativos de sustituciones:, por ejemplo, cuando se describen uno o más de los polipéptidos de cadena ligera de Abl, por ejemplo, cualquiera de las SEQ!lD NO: 2, 20, 647, 651, 660, 666, 699, 702, 706 o 709; otro polipéptido de cadena ligera de Abl puede sustituirse a menos que el contexto indique lo contrario. De manera similar, .cuando se describe uno de los polipéptidos de cadena pesada de Abl, por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 18, 19, 652, 656, 657, 658, 661, 664, 665, 704 o 708, otro polipéptido de ¡cadena pesada de Abl puede sustituirse a menos que el contexto indique lo contrario. Asimismo, cuando se describe uno de los polinucleótidos de cadena ligera de Abl, por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO: 10, 662, 698, 701 o 705, puede sustituirse otro polinucleótido de cadena ligera de Abl, a menos que el contexto indique lo contrario. De manera similar, cuando se describe uno de los polinucleótidos de cadena pesada de Abl, por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO: 11, 663, 700, 703 o 707, puede sustituirse otro polinucleótido de cadena pesada de Abl, a menos que el contexto indique lo contrario. Adicionalmente, se entiende que la descripción de cualquier miembro de cualquiera de los siguientes grupos comprende la sustitución mediante cualquier otro miembro del grupo, como sigue : polipéptidos de cadena ligera de Ab2 (SEQ ID NO: 21 y 667) , polinucleótidos de cadena ligera de Ab2 (SEQ ID NO: 29 y 669) , polipéptidos de cadena pesada de Ab2 (SEQ ID NO: 22 y 668) , polinucleótidos de cadena pesada de Ab2 (SEQ ID NO:: 30 y 670) , polipéptidos de cadena ligera de Ab3 (SEQ ID NO: 37 y 671) , polinucleótidos de cadena ligera de Ab3 (SEQ ID NO!: 45 y 673) , polipéptidos de cadena pesada de Ab3 (SEQ ID NO: 38 y 672) , polinucleótidos de cadena pesada de Ab3 (SEQ ID NO;: 46 y 674) , polipéptidos de cadena ligera de Ab4 (SEQ ID NO: 53 y 675) , polinucleótidos de cadena ligera de Ab4 (SEQ ID NO:: 61 y 677) , polipéptidos de cadena pesada de Ab4 (SEQ ID NO: 54 y 676) , polinucleótidos de cadena pesada de Ab4 (SEQ ID NO:: 62 y 678) , polipéptidos de cadena ligera de Ab5 (SEQ ID NO :| 69 y 679) , polinucleótidos de cadena ligera de Ab5 (SEQ ID NO: 77 y 681) , polipéptidos de cadena pesada de Ab5 (SEQ ID NO: 70 y 680) , polinucleótidos de cadena pesada de Ab5 (SEQ ID NÓ: 78 y 682) , polipéptidos de cadena ligera de Ab6 (SEQ ID NO: 85 y 683) , polinucleótidos de cadena ligera de Ab6 (SEQ ID NO: 93 y 685) , polipéptidos de cadena pesada de Ab6 (SEQ ID NO; 86 y 684) , polinucleótidos de cadena pesada de Ab6 (SEQ ID NO: 94 y 686) , polipéptidos de cadena ligera de Ab7 (SEQ ID NO': 101, 119, 687, 693), polinucleótidos de cadena ligera de Ab7 (SEQ ID NO: 109 y 689), polipéptidos de cadena pesada de Ab7 (SEQ ID NO: 102, 117, 118, 688, 691, y 692), polinucleótidos de cadena pesada de Ab7 (SEQ ID NO: 110 y 690), polinucleótidos CDR1 de cadena ligera de Abl (SEQ ID NO: 12 y 694), polinucleótidos de CDR3 de cadena ligera de Abl (SEQ ID NO: 14 y 695) , polinucleótidos de CDR2 de cadena pesada de Abl (SEQ ID NO: 16 y 696) y polinucleótidos de CDR3 de cadena pesada de Abl (SEQ ID NO: 17 y 697) . ¡ Los ejemplos de secuencias de polinucleótidos que codifican Abl se expresan como sigue: SEQ ID NO: 662: ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGA TGTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCGGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACC ATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAATTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGG CAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTC AAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCT GCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAATATTGATAATGCT SEQ ID NO: 663: ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCG CTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGCC TCTGGATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTG GAATGGATCGGAATCATTTATGGTAGTGATGAAACGGCCTACGCGACCTGGGCGATAGGCCGA TTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGAC ACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAATTTAACTTG SEQ ID NO: 698: GCTATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATC ACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAA GCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGC GGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGAT TTGCA ACTTATTACTGCCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAACATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACC AAGGTGGAAATCAAACGTACG ? SEQ ID NO: 700: GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGG AAGGGGCTGGAGTGGGTCGGCATCATCTATGGTAGTGATGAAACCGCCTACGCTACCTCCGCT ATAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGÁACAGC CTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGCA AAGTTCAACTTGTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC SEQ ID NO: 701: GCTATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATC ACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAA GCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGC GGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCA ACTTATTACTGCCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAACATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACC AAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAG CAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCC AAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAG CAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTAC GAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAG AGCTTCAACAGGGGAGAGTGT SEQ ID NO: ; 703: GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGG AAGGGGCTGGAGTGGGTCGGCATCATCTATGGTAGTGATGAAACCGCCTACGCTACCTCCGCT ATAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGC CTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGCA AAGTTCAACTTGTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCA TCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGC CTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGC GGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTG ACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGC AACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCG TGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGAC CCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCG CGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCAGCAGGAC TGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCGATCGAG AAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC CGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATÍCCCAGC GACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAG AAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA SEQ ID NO: , 705: ATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTGTTTCTCTTTAGCAGCGCTTATTCCGCTATCCAG ATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAG GCCAGTCAGAGCATTAACAATGAGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAG CTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGA TCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTAC TGCCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAACATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAA ATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAA TCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAG TGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGC AAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACAC AAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAAC AGGGGAGAGTGT SEQ ID NO: 707: ATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTGTTTCTCTTTAGCAGCGCTTATTCCGAGGTGCAG CTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCC TCTGGATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTG GAGTGGGTCGGCATCATCTATGGTAGTGATGAAACCGCCTACGCTACCTCCGCTATAGGCCGA TTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCT GAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAGTTCAAC TTGTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTC CCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAG GACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCC TCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAG GTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCA CCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCiCTCATG ATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAG CAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAAT GGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATC TCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAG ATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGAC TCGCC GTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGG AACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC TCCCTGTCTCCGGGTAAA SEQ ID NO: 720: ATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACT TGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCC CCTAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGC AGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACT TATTACTGCCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAACATTGATAATGCT SEQ ID NO: 721: GCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCGGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATC AAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAATTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAG CGTCCCAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAA GGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATiGCTGCC ACTTACTACTGTCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAATATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACC GAGGTGGTGGTCAAACGT SEQ ID NO: 722: ATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACT TGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCC CCTAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGC AGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACT TATTACTGCCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAACATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCAAG GTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAG TTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAA GTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAG GACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAG AAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGC TTCAACAGGGGAGAGTGT SEQ ID NO: 723: GCTATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATC ACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAA GCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGC GGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCA ACTTATTACTGCCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAACATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACC AAGGTGGAAATCAAACGT SEQ ID NO: . 724: GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGAGTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGG AAGGGGCTGGAGTGGGTCGGCATCATCTATGGTAGTGATGAAACCGCCTACGCTACCljcCGCT ATAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGC CTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGCA AAGTTCAACTTG SEQ ID NO: 725: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGC ACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAG GGGCTGGAATGGATCGGAATCATTTATGGTAGTGATGAAACGGCCTACGCGACCTGGGCGATA GGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAGCC GCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAATTTAAC TTGTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGC Ensayos de análisis La invención también incluye ensayos de análisis diseñados para asistir a la identificación de enfermedades y trastornos asociados con IL-6 en pacientes que presentan síntomas de una enfermedad o trastorno asociado con IL-6.
En una modalidad de la invención, los anticuerpos ariti-IL-6 de la invención o los fragmentos o las variantes de unión a IL-6 de los mismos se usan para detectar la presencia de IL-6 en una muestra biológica obtenida de un paciente que presenta síntomas de una enfermedad o un trastorno asociado con IL-6. La presencia, de IL-6 o los niveles elevados de esta en comparación con los niveles de IL-6 previos a la enfermedad en una muestra biológica comparable pueden ser beneficiosos para el diagnóstico de una enfermedad o un trastorno asociado con IL-6.
Otra modalidad de la invención proporciona un ensáyo de diagnóstico o análisis para asistir al diagnóstico de enfermedades o trastornos asociados con IL-6 en pacientes que presentan síntomas de una enfermedad o un trastorno asociado con IL-ß identificado en la presente que comprende someter a ensayo el nivel de expresión de IL-6 en una muestra biológica de dicho paciente usando un anticuerpo anti-IL-6 modificado postraduccionalmente o un fragmento o una variante de unión del mismo. El anticuerpo anti-IL-6 o el fragmento o la variante de unión del mismo pueden estar modificados postraduccionalmente para incluir un resto detectable tal como se estableció previamente en la descripción.
El nivel de IL-6 en la muestra biológica se determina usando un anticuerpo anti-IL-6 modificado o un fragmento o una variante de unión del mismo como se establece en la presente y comparando el nivel de IL-6 en la muestra biológica con un nivel estándar de IL-6 (por ejemplo, el nivel en muestras biológicas normales) . El médico experto entenderá que puede existir determinada variabilidad entre las muestras biológicas normales y lo tomará en cuenta al evaluar los resultados.; El ensayo mencionado anteriormente también puede ser útil en el control de una enfermedad o un trastorno donde el nivel de IL-6 obtenido en una muestra biológica de un paciente ;que se cree tiene una enfermedad o un trastorno asociado con IL-6 se compara con el nivel de IL-6 en muestras biológicas anteriores del mismo paciente, para poder establecer si el nivel de IL-6 en dicho paciente cambió, por ejemplo, con un régimen de tratamiento .
La invención también se dirige a un método de diagnóstico por imágenes in vivo que detecta la presencia de células que expresan IL-6, que comprende administrar una cantidad de una composición de diagnóstico es eficaz desde el punto de vista del diagnóstico. Dichos diagnósticos por imágenes in vivo son útiles para la detección y el diagnóstico por imágenes de tumores o metástasis que expresan IL-6 y sitios inflamatorios que expresan IL-6, por ejemplo y pueden usarse como partet de un régimen de planificación para diseñar un protocolo de tratamiento eficaz para la artritis o el cáncer. El protocolo de tratamiento puede incluir, por ejemplo, uno o más de radiación, quimioterapia, terapia con citocina, terapia genética y terapia con anticuerpos, asi como un anticuerpo anti-IL-ß o un fragmento o una variante del mismo. ; Un médico experto entenderá que una muestra biológica incluye, a modo no taxativo, suero, plasma, orina, saliva, mucosa, fluido pleural, fluido sinovial y fluido espinal.
Métodos para tratar o prevenir enfermedades y trastornos asociados con IL-6 o mejorar o reducir sus síntomas.
En una modalidad de la invención, los antagonistas de IL-6 como Abl descritos en la presente son útiles para tratar o prevenir enfermedades y trastornos asociados con IL-6 o para mejorar o reducir sus síntomas. Los antagonistas de IL-6 descritos en la presente (por ejemplo, Abl) también pueden administrarse en una cantidad terapéuticamente eficaz a pacientes que necesitan un tratamiento para enfermedades y trastornos asociados con IL-6 en forma de una composición farmacéutica como se describe en mayor detalle a continuación.
En una modalidad de la invención, los antagonistas de IL-6 descritos en la presente (por ejemplo, Abl) son útiles para tratar o prevenir enfermedades y trastornos asociados con la proteína C-reactiva (CRP) elevada o para mejorar o reducir sus síntomas. Tales enfermedades incluyen cualquier enfermedad que presenta inflamación crónica, por ejemplo, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, psoriasis, artropatía psoriática, espondilitis anquilosante, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, pénfigo, dermatomiositis, polimiositis , polimialgia reumática, arteritis de células gigantes, vasculitis, poliarteritis nodosa, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Kawasaki, vasculitis aislada del sistema nervioso central, arteritis de Churg-Strauss, poliarteritis microscópica, poliangiitis microscópica, púrpura de Henoch-Schonlein, vasculitis crioglobulinémica esencial, vasculitis reumatoide, crioglobulinemia, policondritis recidivante, enfermedad de Behcet, arteritis de Takayasu, enfermedad cardiaca isquémica, apoplejía, esclerosis múltiple, sepsis, vasculitis causada por infecciones virales (por ejemplo, hepatitis B, hepatitis C, VIH, citomegalovirus , virus Epstein-Barr, virus Parvo B19, etc. ) , enfermedad de Buerger, cáncer, cáncer avanzado, osteoartritis, esclerosis sistémica, síndrome de CREST, enfermedad de Reiter, enfermedad ósea de Paget, síndrome de Sjogran, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, fiebre mediterránea familiar, trombocitopenia autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, enfermedad tiroidea autoinmune, anemia perniciosa, vitíligo, alopecia areata, cirrosis biliar primaria, hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis alcohólica, hepatitis viral incluyendo hepatitis B y C, otras enfermedades autoinmunes específicas de órganos, quemaduras, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma alérgico, otras afecciones alérgicas o cualquier combinación de las mismas.
En una modalidad de la invención, los antagonistas' de la IL-6 descritos en la presente, como los anticuerpos anti-IL-6 (por ejemplo, Abl) o las variantes o los fragmentos de los mismos son útiles para tratar o prevenir enfermedades y trastornos asociados con albúmina en suero disminuida, por ejemplo, artritis reumatoide, cáncer, cáncer avanzado, enfermedad hepática, enfermedad renal, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad celiaca, traumatismotismo, quemaduras, otras enfermedades asociadas con albúmina en suero disminuida o cualquier combinación de las mismas o para mejorar o reducir sus síntomas. ~ En otra modalidad de la invención, los antagonistas de IL-6 descritos en la presente se administran a un paciente en combinación con otro agente activo. Por ejemplo, el antagonista de IL-6 como Abl también puede administrarse conjuntamente con uno o más agentes quimioterapéuticos , tales como antagonistas de VEGF, antagonistas de EGFR, platinos, taxoles, irinotecano, 5-fluorouraciloo, gemcitabina, leucovorina, esterjoides, ciclofosfamida, melfalán, alcaloides de la vinca (por ej:emplo, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina) , mustinas, inhibidores de tirosina cinasa, radioterapia, antagonistas de hormonas sexuales, moduladores selectivos del recept,or de andrógeno, moduladores selectivos del receptor de estrogeno, antagonistas de PDGF, antagonistas de TNF, antagonistas de IL-1, interleucinas (por ejemplo, IL-12 o IL-2), antagonistas de IL-12R, anticuerpos monoclonales conjugados con toxinas, anticuerpos monoclonales específicos contra antígenos tumorales, Erbitux™, Avastin™, Pertuzumab, anticuerpos ¡ anti- i CD20, Rituxan®, ocrelizumab, ofatumumab, DXL625, Herceptin® o combinaciones de los mismos. j En una modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente o los fragmentos o las variantes de los mismos son útiles para tratar o prevenir enfermedades y trastornos asociados con la fatiga o para mejorar o reducir sus síntomas. Las enfermedades y los trastornos asociados con la fatiga incluyen, a modo no taxativo, fatiga general, fatiga inducida por ejercicio, fatiga relacionada con cáncer, fibromialgia, fatiga relacionada con enfermedad inflamatoria y síndrome de fatiga crónica. Véase, por ejemplo, Esper DH, et al, The cáncer cachexia syndrome: a review of metabolic and clinical manifestations, Nutr Clin Pract . , agosto de 2,005; 20 (4):369-76; Vgontzas ??, et al, IL-6 and its circadian secretion in humans, Neuroimmunomodulation, 2005 ; 12 (3 ): 131-40 ; Robson-Ansley, PJ, et al, Acute interleukin-6 administration impairs athletic performance in healthy, trained male ruhners, Can J Appl Physiol., agosto de 2004/29 (4) : 11-8; Shephard RJ., Cytokine responses to physical activity, with particular reference to IL-6: sources, actions, and clinical implications , Crit Rev Immunol . , 2002 ; 22 ( 3) : 165-82 ; Arnold, MC, et al, '; Using an interleukin-6 challenge to evalúate neuropsycholbgical performance in chronic fatigue syndrome, Psychol Med., agosto de 2002; 32 (6) : 1075-89; Kurzrock R. , The role of cytokines in cancer-related fatigue, Cáncer, 15 de septiembre de 2001; 2 (6 Suppl ): 1684-8 ; Nishimoto N, et al, Improvement in Castl^man' s disease by humanized anti-interleukin-6 receptor antibody therapy, Blood, 1° de enero de 2000; 95 (1):56-61; Vgontzas AN, et al, Circadian interleukin-6 secretion and quantit'y and depth of sleep, J Clin Endocrinol etab., agosto de 1999; 84(8),:2603-7 y Spath-Schwalbe E, et al, Acute effects of recombinant human interleukin 6 on endocrine and central nervous sleep functions in healthy men, J Clin Endocrinol Metab., mayo de : 1998; 83 (5) : 1573-9, cuyas descripciones se incorporan en su totalidad a la presente a modo de referencia.
En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente o los fragmentos o las variantes de los mismos son útiles tratar o prevenir la caquexia o para mejorar o reducir sus síntomas. Las enfermedades y los trastornos asociados con la caquexia incluyen, a modo no taxativo, caquexia cancerosa, caquexia cardíaca, caquexia respiratoria, caquexia renal y caquexia relacionada con la edad. Véase, por ejemplo, Barton,! BE., Interleukin-ß and new strategies for the treatment of cáncer, hyperproliferative diseases and paraneoplastic syndromes, Expert Opin Ther Targets, agosto de 2005; 9(4):737-52; Zaki MH, et al, CNTO 328, a monoclonal antibody to IL-6, inhibits human tumor-induced cachexia in nude mice, Int J Cáncer, I 10 de septiembre de 2004; 111 ( ): 592-5; Trikha M, et al, Targeted anti-interleukin-6 monoclonal antibody therapy for cáncer: a review of the rationale and clinical evidence, Clin Cáncer Res., 15 de octubre de 2003/ 9 ( 13 ) : 4653-65 ; Lelli G, et al, Treatment of the cáncer anorexia-cachexia syndrome: a critical reappraisal, J Chemother., junio de 2003; 15 ( 3 ) : 220-5 ; Argües JM, et al, Cytokines in the pathogenesis of cáncer cachexia, Curr Opin Clin Nutr Metab Care, julio de 2003; 6(4) :401-6; Barton BE., IL-6-like cytokines and cáncer cachexia: consequences of chronic inflammation, Immunol Res., 2001;23 (1) : 41-58; Yamashita JI, et al, Medroxyprogesterone acétate and cáncer cachexia: interleukin-6 involvement , Breast Cáncer, 2000 ; 7 (2 ) : 130-5 ; Yeh SS, et al, Geriatric cachexia: the role of cytokines, Am J Clin Nutr., agosto de 1999; 70(2) : 183-97; Strassmann G, et al, Inhibition of experimental cáncer cachexia by anti-cytokine and anti-cytokine-receptor therapy, Cytokines Mol Ther., junio de 1995; 1(2) : 107-13; Fujita J, et al, Anti-interleukin-6 receptor antibody prevents muscle atrophy in colon-26 adenocarcinoma-bearing mice with modu!lation of lysosomal and ATP-ubiquitin-dependent proteolytic pathways, Int J Cáncer, 27 de noviembre 1996; 68 (5) : 637-43; Tsujin ka T, et al, Interleukin 6 receptor antibody inhibits muscle a'trophy and modulates proteolytic systems in interleukin 6 transgenic mice, J Clin Invest., 1° de enero de 1996; 97(l) :244-9; Emilie D, et al, Administration of an anti-interleukin-6 monoclonal antibody to patients with acquired immunodeficiency syndrome and lymphoma: effect on lymphoma growth and on B clinical Symptoms, Blood, 15 de octubre de 1994;84 (8) :2472-9; and Strassmann G, et al, Evidence for the involvement of interleukin 6 in experimental cáncer cachexia, J Clin Invest., mayo de 1992; 89 (5) : 1681-4, cuyas descripciones se incorporan en su totalidad a la presente a modo de referencia.
En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente o los fragmentos o las variantes de los mismos son útiles para tratar o prevenir enfermedades y trastornos autoinmunes o para mejorar o reducir sus síntomas. Las enfermedades y los trastornos asociados con la autoinmunidad incluyen, a modo no taxativo, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE) , artritis idiopática juvenil sistémica, psoriasis, artropatía psoriática, espondilitis anquilosante, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), polimialgia reumática, arteritis de células gigantes, vasculitis autoinmune, enfermedades de injerto versus huésped (GVHD) , síndrome de Sjogren, enfermedad de Still de comienzo en el adulto. En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 humanizados descritos en la presente o los fragmentos o las variantes de los mismos son útiles para tratar o prevenir artritis reumatoide y artritis idiopática juvenil sistémica o para mejorar o reducir sus síntomas. Véase, por ejemplo, Nishimoto N., Clinical studies in patients: with Castleman's disease, Crohn' s disease, and rheumatoid arthritis in Japan, Clin Rev Allergy Immunol., junio de 2005;28 (3)! : 221-30; Nishimoto N, et al, Treatment of rheumatoid arthritis with humanized anti-interleukin-6 receptor antibody: a multicenter, double-blind, placebo-controlled trial, Arthritis Rheum. ,¦ junio de 2004; 50 (6) : 1761-9; Choy E . , Interleukin 6 receptor as a target for the treatment of rheumatoid arthritis, Ann i Rheum Dis., noviembre de 2003;62 Suppl 2:ii68-9; Nishimoto N, et al, Toxicity, pharmacokinetics , and dose-finding study of repetitive treatment with the humanized anti-interleukin 6 receptor antibody MRA in rheumatoid arthritis. 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En otra modalidad de la invención, los anticuerpos' anti-IL-6 descritos en la presente o los fragmentos o las variantes de los mismos son útiles para tratar o prevenir enfermedades y trastornos asociados con el sistema óseo o para mejorar o reducir sus síntomas. Las enfermedades y los trastornos asociados con el sistema óseo incluyen, a modo no taxativo, osteoartritis, osteoporosis y enfermedad ósea de Paget . En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 humanizados descritos en la presente o los fragmentos o las variantes de los mismos son útiles para tratar o prevenir la osteoartritis o para mejorar o reducir sus síntomas. Véase, por ejemplo, Malemud CJ. , Cytokines as therapeutic targets for osteoarthritis, BioDrugs, 2004 ; 18 ( 1 ): 23-35 ; Westacott ,CI, et al, Cytokines in osteoarthritis: mediators or markers of joint destruction? , Semin Arthritis Rheum. , febrero de 1996;25 (4) :254-72; Sugiyama T . , Involvement of interleukin-6 and prostaglandin E2 in particular osteoporosis of postmenopausal women with rheumatoid arthritis, J Bone Miner Metab., 2001; 19 (2) : 89-96; Abrahamsen B, et al, Cytokines and bone loss in a 5-year longitudinal study - hormone replacement therapy suppresses serum soluble interleukin-6 receptor and increases interleukin-l-receptor antagonist: the Danish Osteoporosis Prevention Study, J Bone Miner Res., agosto de 2000;15(8) :1545-54; Straub RH, et al, Hormone replacement therapy and interrelation between serum interleukin-6 and body mass índex in postmenopausal women: a population-based study, J Clin Endocrinol Metab., marzo de 2000 ; 85 (3 ): 1340-4 ; Manolagas SC, The role of IL-6 type cytokines and their receptors in bone, Ann N Y Acad Sci., 1° de mayo de 1998; 840 : 19,4-204; Ershler B, et al, Immunologic aspeets of osteoporosis, Dev Comp Immunol., noviembre-diciembre de 1997 ; 21 ( 6) : 487-99; Jilka RL, et al, Increased osteoclast development after estrogen loss: mediation by interleukin-6, Science, 3 de julio de 1992;257 (5066) :88-91; Kallen KJ, et al, New developments in IL-6 dependent biology and therapy: where do we stand and whát are the options?, Expert Opin Investig Drugs, septiembre de 1999;8 (9) :1327-49; Neale SD, et al, The influence of ¡serum cytokines and growth factors on osteoclast formation in Paget's disease, QJM, abril de 2002;95 (4):233 - 40; Roodman GD, Osteoclast function In Paget's disease and múltiple myeloma, Bone, agosto de 1995; 17 (2° Supl) : 57S-61S; Hoyland JA, et al, Interleukin-6, IL-6 receptor, and IL-6 nuclear factor gene expression in Paget's disease, J Bone iner Res., enero de 1994;9 (1) :75-80 y Roodman GD, et al, Interleukin 6. A potential autocrine/paracrine factor in Paget's disease of bone, J Clin Invest., enero de 1992; 89 (1) : 6-52; cuyas descripciones se incorporan en la presente en su totalidad a modo de referencia.
En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente o los fragmentos o las variantes de los mismos son útiles para tratar o prevenir enfermedades y trastornos asociados con cáncer o para mejorar o reducir sus síntomas. Las enfermedades y los trastornos asociados con el cáncer incluyen, a modo no taxativo, acantoma, carcinoma de células acínicas, neuroma acústico, melanoma lentiginoso acral, acrospiroma, leucemia eosinofílica aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia megacarioblástica aguda, leucemia monocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda con maduración, leucemia mieloide aguda de células dendríticas, leucemia mieloide aguda, leucemia promielocítica aguda, adamantinoma, adenocarcinoma, carcinoma quístico adenoide, adenoma, ; tumor odontogénico adenomatoide, carcinoma adrenocortical , leucemia de células T del adulto, leucemia agresiva de células NK, cánceres relacionados con SIDA, linfoma relacionado con SIDA, sarcoma alveolar de la parte blanda, fibroma ameloblástico , cáncer anal, linfoma anaplásico de células grandes, cáncer anaplásico de tiroides, linfoma angioinmunoblástico de células T, angiomiolipoma, angiosarcoma, cáncer de apéndice, astrocitoma, tumor rabdoide teratoide atipico, carcinoma de células básales, carcinoma de tipo basal, leucemia de células B, linfoma de células B, carcinoma de los conductos Bellini, cáncer del tracto biliar, cáncer de vejiga, blastoma, cáncer de hueso, tumor de hueso, glioma de tronco cerebral, : tumor cerebral, cáncer de mama, tumor de Brenner, tumor bronquial, carcinoma bronquioloalveolar , tumor de Brown, linfoma de Burkitt, cáncer de sitio primario desconocido, tumor carcinoide, carcinoma, carcinoma in situ, carcinoma de< pene, carcinoma de sitio primario desconocido, carcinosarcoma, enfermedad de Castleman, tumor embrionario del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral, 'cáncer cervical, colangiocarcinoma, condroma, condrosarcoma, co'rdoma, coriocarcinoma, papiloma del plexo coroideo, leucemia linfocitica crónica, leucemia monocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastorno mieloproliferativo crónico, leucemia neutrofilica crónica, tumor de células claras, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craniofaringioma, linfoma cutáneo de células T, enfermedad de Degos, dermatofibrosárcoma protuberans, quiste dermoide, tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, linfoma difuso de células B grandes,, tumor neuroepitelial disembrioplásico, carcinoma embrionario,' tumor de seno endodérmico, cáncer endometrial, cáncer uterino endometrial, tumor endometrioide, linfoma de células T asociado a enteropatia, ependimoblastoma, ependimoma, sarcoma epitelioide, eritroleucemia, cáncer de esófago, estesioneuroblastoma, tumor de la familia de Ewing, sarcoma de la familia de Ewing, sarcoma de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer de ducto biliar extrahepático, enfermedad de Paget extramamaria, cáncer de tubo falopiano, Fetus in fetu, fibroma, fibrosarcoma, linfoma folicular, cáncer folicular de tiroides, cáncer de vesícula biliar, cáncer de vesícula biliar, ganglioglioma, ganglioneuroma, cáncer gástrico, linfoma gástrico, cáncer gastrointestinal, tumor cardinoide gastrointestinal, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal, tumor de células germinales, germinoma, coriocarcinoma gestacional, tumor trofoblástico gestacional, tumor óseo de células gigantes, glioblastoma multiforme, glioma, gliomatosis cerebri, tumor glómico, glucagonoma, gonadoblastoma, tumor de células granulosas, leucemia de células vellosas, leucemia de células vellosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, hemangioblastoma, hemangiopericitoma, hemangiosarcoma, malignidad hematológica, carcinoma hepatocelular , linfoma hepatoesplénico de células T, síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario, linfoma Hodgkin, linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, glioma hipotalámico, cáncer de mama inflamatorio, mélanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes, tumor de células de los islotes, leucemia juvenil mielomonocítica, sarcoma Kaposi, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon, tumor de Klatskin, tumor de Krukenberg, cáncer de laringe, cáncer de laringe, melanoma léntigo maligno, leucemia, leucemia, cáncer del labio y la cavidad oral, liposarcoma, cáncer de pulmón, luteoma, linfangioma, linfangiosarcoma, linfoepitelioma, leucemia linfoide, linfoma, macroglobulinemia, histiocitoma fibroso maligno, histiocitoma fibroso maligno, histiocitoma fibroso maligno óseo, glioma maligno, mesotelioma maligno, tumor maligno de vaina nerviosa periférica, tumor rabdoide maligno, tumor tritón maligno, linfoma MALT , linfoma de células del manto, leucemia de mastocitos, tumor mediastinal de células germinales, tumor mediastinal, cáncer medular de tiroides, meduloblastoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, melanoma, meningioma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, mesotelioma, cáncer escamoso metastásico del cuello con tumor primario oculto, carcinoma urdtelial metastásico, tumor Mülleriano mixto, leucemia monocítica, cáncer de boca, tumor mucinoso, enfermedad de Castleman multicéntrico, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, mieloma múltiple, micosis fungoides, micosis fungoides, enfermedad mielodisplásica, síndromes mielodisplásicos , leucemia mieloide, sarcoma mieloide, enfermedad mieloproliferativa, mixoma, cáncer de la cavidad nasal, cáncer nasofaríngeo, carcinoma nasofaríngeo, neoplasma, neurinoma, neuroblastoma, neuroblastoma, neurofibroma, neuroma, melanoma nodular, linfoma no Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de piel no melanoma, cáncer de pulmón no microcítico, oncología ocular, oligoastrocitoma, oligodendroglioma, oncocitoma, meningioma de la vaina del nervio óptico, ' cáncer oral, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario, tumor de células germinales del ovario, tumor de ovario de bajo potencial maligno, enfermedad dé Paget de la mama, tumor de Pancoast, cáncer pancreático, ¡cáncer pancreático, cáncer papilar de tiroides, papilomátosis , paraganglioma, cáncer de seno paranasal, cáncer de paratiroides , cáncer de pene, tumor perivascular de células epitelioides, cáncer faríngeo, feocromocitoma, tumor parénquima pineal de diferenciación intermedia, pineoblástoma, pituicitoma, adenoma pituitario, tumor pituitario, neoplasma de células plasmáticas, blastoma pleuropulmonar, poliembrioma, linfoma precursor linfoblástico de células T, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma de efusión primaria, cáncer hepatocelular primario, cáncer hepático primario, ' cáncer peritoneal primario, tumor neuroectodermal primitivo, cáncer de próstata, pseudomixoma peritoneal, cáncer rectal, carcinoma de células renales, carcinoma del tracto respiratorio relacionado con el gen NUT en el cromosoma 15, retinoblastoma, rabdomioma, rabdomiosarcoma, transformación de Richter, teratoma sacrococcigeo, cáncer de la glándula salival, sarcoma, Schwannomatosis, carcinoma de glándulas sebáceas, neoplasma secundario, seminoma, tumor seroso, tumor de células de Sertoli-Leydig, tumor del estroma de los cordondes sexuales, síndrome de Sézary, carcinoma de células en anillo de .sello, cáncer de piel, tumor de células pequeñas, redondas y azules, carcinoma de células pequeñas, cáncer de pulmón microcítico, linfoma de células pequeñas, cáncer del intestino delgado, sarcoma de tejido blando, somatoestatinoma, verruga del deshollinador, tumor de la médula espinal, tumor espinal, linfoma de la zona marginal esplénica, carcinoma de células escamosas, cáncer de estómago, melanoma superficial diseminante, tumor neuroectodermal primitivo supratentórial, tumor epitelial de ovario, sarcoma sinovial, leucemia aguda de células T, leucemia linfocítica granular grande de células T, leucemia de células T, linfoma de células T, leucemia prolinfocítica de células T, teratoma, cáncer linfático terminal, cáncer testicular, tecoma, cáncer de garganta, carcinoma tímico, timoma, cáncer de tiroides, cáncer de cé'lulas de transición de la pelvis renal y el uréter, carcinoma de células de transición, cáncer uracal, cáncer uretral, neoplasma urogenital, sarcoma uterino, melanoma uveal, cáncer vaginal, síndrome de Verner orrison, carcinoma verrugoso, glioma de la vía visual, cáncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Warthin, tumor de ilms o cualquier combinación , de los mismos, así como resitencia a los fármacos en quimioterapia contra el cáncer y toxicidad de quimioterapia contra el cáncer. Véase, por ejemplo, Hirata T, et al, Humanized anti-interleukin-6 receptor monoclonal antibody induced apoptosis of fresh and cloned human myeloma cells in vitro, Leuk Res., abril de 2003;27 (4) : 343-9, Bataille R, et al, Biologic effects of anti-interleukin-6 murine monoclonal antibody in advanced múltiple myeloma, Blood, 15 de julio de 1995;86 (2):685-91; Goto H, et al, Mouse anti-human interleukin-6 receptor monoclonal antibody inhibits proliferation of fresh human myeloma cells in vitro, Jpn J Cáncer Res., septiembre de 1994;85 (9) : 958-65; Klein B, et al, Murine anti-interleukin-6 monoclonal antibody therapy for a patient with plasma cell leukemia, Blood, Io de septiembre de 1991; 78 (5) : 1198-204 ; Mauray S, et al, Epstein-Barr virus-dependent lymphoproliferative disease: critical role of IL-6, Eur J Immunol., julio de 2000 ; 30 (7 ): 2065-73; Tsunenari T, et al, New xenograft model of múltiple myeloma and efficacy of a humanized antibody against human interleukin-6 receptor, Blood, 15 de septiembre de 1997 ; 90 ( 6) : 2437-44 ; Emilie D, et al, Interleukin-6 production in high-grade B lymphomas: correlation with the presence of malignant immunoblasts in acquired immunodeficiency syndrome and in human immunodeficiency virus-seronegative patients, Blood, 15 de julio de 1992; 80 (2) : 498-50 ; Emilie D, et al, Administration of an anti-i'nterleukin-6 monoclonal antibody to patients with acquired immunodeficiency syndrome and lymphoma: effect on lymphoma growth and on B clinical Symptoms, Blood, 15 de octubre de 1994; 84 (8 ): 2472-9; Smith PC, et al, Anti-interleukin-6 monoclonal antibody induces regression of human prostate cáncer xenografts in nude mice, Prostate, 15 de junio de 2001 ; 48 ( 1 ): 47-53 ; Smith PC, et al, Interleukin-6 and prostate cáncer progression, Cytokine Growth Factor Rev., marzo de 2001; 12 (1) : 33-40; Chung TD, et al, Characterization of the role of IL-6 in the progression of prostate cáncer, Prostate, 15 de febrero de 1999; 38 (3) : 199-207; Okamoto M, et al, Interleukin-6 as a paracrine and autocrine growth factor in human prostatic carcinoma cells in itro, Cáncer Res., Io de enero de 1997 ; 57 ( 1) : 141-6; Reittie JE, et al, Interleukin-6 inhibits apoptosis and tumor necrosis factor induced proliferation of B-chronic lymphocytic leukemia¿ Leuk Lymphoma, junio de 1996;22 (1-2) : 83-90, seguir 186, placa de color VI; Sugiyama H, et al, The expression of IL-6 and its related genes in acute leukemia, Leuk Lymphoma, marzo de 1996;21 (1-2) : 49-52; Bataille R, et al, Effects of an ! 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En otra modalidad de la invención, los anticuerpos, anti-IL-6 descritos en la presente o los fragmentos o las variantes de los mismos son útiles para tratar o prevenir enfermedad cardiaca isquémica, ateroesclerosis , obesidad, diabetes, asma, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad cerebrovascular, fiebre, respuesta de fase aguda, alergias, anemia, anemia de inflamación (anemia de enfermedad crónica) , hipertensión, depresión, depresión asociada con enfermedad crónica, trombosis, trombocitosis , insuficiencia cardiaca aguda, síndrome metabólico, abortos naturales, obesidad, prostatitis crónica, glomerulonefritis, enfermedad inflamatoria pélvica, lesión por reperfusión y rechazo de transplante ¡ y para mejorar o reducir sus síntomas. Véase, por ejemplo, Tzoulaki I, et al, C-reactive protein, interleukin-6, and soluble adhesión molecules as indicadors of progressive peripheral atherosclerosis in the general population: Edinburgh Artery Study, Circulation, 16 de agosto de 2005 ; 112 ( 7 ) : 976-83 , Publicación electrónica del 8 de agosto de 2005; Rattazzi , et al, C-reactive protein and interleukin-6 in vascular disease: culprits or passive bystanders?, J Hypertens., octubre de 2003;21 (10) : 1787-803; Ito T, et al, HMG-CoA reductase inhibitors reduce interleukin-6 synthesis in human vascular smooth muscle cells, Cardiovasc Drugs Ther., , 2002 Mar; 16 (2) : 121-6; Stenvinkel P, et al, Mortality, malnutrition, and atherosclerosis in ESRD: what is the role of interleukin-6?, Kidney Int Suppl . , mayo de 2002 ; ( 80) : 103-8 ; Yudkin JS, et al, Inflammation, obesity, stress and coronary heart disease: is interleukin-6 the link?, Atherosclerosis, febrero de 2000; 148 (2) :209-14; Huber SA, et al, Interleukin-6 exacerbates early atherosclerosis in mice, Arterioscler Thromb Vasc ,Biol., octubre de 1999; 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En otra modalidad de la invención, los anticuerpos1 anti-IL-6 descritos en la presente o los fragmentos o las variantes de los mismos son útiles para tratar o prevenir enfermedades y trastornos asociados con una crisis de citocina o para mejorar o reducir sus síntomas. Las enfermedades y los trastornos asociados con una crisis de citocina incluyen, a modo no taxativo, enfermedad de injerto versus huésped (GVHD) , i gripe aviar, viruela, gripe pandémica, síndrome de distrés respiratorio del adulto (ARDS) , síndrome respiratorio agudo severo (SARS) , sepsis y síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) . Véase, por ejemplo, Cecil, R. L., Goldman, L., & Bennett, J. C. (2000). Cecil textbook of medicine. Philadelphia : W.B. Saunders; Ferrara JL, et al., Cytokine storm of graft-versus-host disease: a critical effector role for interleukin-l, Transplant Proc. febrero de 1993;25,(1 Pt 2):1216-7; Osterholm T, Preparing for the Next Pandemic, N Engl J Med. 5 de mayo de 2005; 352 (18 ): 1839-42; Huang KJ, et al., An interferon-gamma-related cytokine storm in SARS patients, J Med Virol. febrero de 2005; 75 (2) : 185-94 y Cheung CY, et al., Induction of proinflammatory cytokines in human macrophages by influenza A (H5N1) viruses: a mechanism for the unusual severity of human disease? Lancet. 7 de diciembre de 2002;360 (9348) : 1831-7.
En otra modalidad de la invención, los anticuerpos, anti-IL-6 descritos en la presente o los fragmentos o las variantes de los mismos son útiles como una ayuda para el insomnio.
Administración En una modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente o los fragmentos o las variantes de unión a IL-ß de los mismos, asi como las combinaciones de dichos fragmentos o variantes de anticuerpo se administran a un sujeto en una concentración de entre alrededor de 0.1 y 20 mg/kg, como alrededor de 0.4 mg/kg, alrededor de 0.8 ' mg/kg, alrededor de 1.6 mg/kg o alrededor de 4 mg/kg, del peso corporal del sujeto que los recibe. En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente o los fragmentos o las variantes de unión a IL-6 de los mismos, asi como las combinaciones de dichos fragmentos de anticuerpo, se administran a un sujeto a una concentración de alrededor de 0.4 mg/kg del peso corporal del sujeto que los recibe. En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente o los fragmentos o las variantes de unión a IL-6 de los mismos, asi como las combinaciones de dichos fragmentos o variantes de anticuerpo, se administran a un sujeto receptor con una frecuencia 'de una vez cada veintiséis semanas o menos, tal como una vez cada dieciséis semanas o menos, una vez cada ocho semanas o menos o una vez cada cuatro semanas o menos. En otra modalidad preferida de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente o los fragmentos o las variantes de unión a IL-6 de los mismos, asi como las combinaciones de los mismos, se administran a un sujeto receptor con una frecuencia de como máximo una vez durante un periodo de aproximadamente una semana, como ser, como máximo una vez durante un periodo de aproximadamente dos semanas como ser, como máximo una vez durante un periodo de aproximadamente cuatro semanas, como ser, como máximo una vez durante un periodo de aproximadamente ocho semanas, como ser, como máximo una vez durante un periodo de aproximadamente doce semanas, como ser, como máximo vina vez durante un periodo de aproximadamente dieciséis semanas, como ser, como máximo una vez durante un periodo de aproximadamente veinticuatro semanas.
Se entiende que la dosis eficaz dependerá de los atributos del sujeto receptor, tales como, por ejemplo, la edad, el sexo, el estado de gravidez, el índice de masa corporal, la masa corporal magra, la afección o afecciones para las que se proporciona la composición, otras afecciones médicas del sujeto receptor que puedan afectar el metabolismo o la tolerancia de la composición, los niveles de IL-6 en el sujeto receptor y la resistencia a la composición (por ejemplo, que surgen cuando el paciente desarrolla anticuerpos contra la composición) . Un experto en la técnica podría determinar una dosis 'y una frecuencia de administración eficaces a través de experimentos de rutina, por ejemplo, guiándose por las descripciones de la presente y las enseñanzas en Goodman, L. S., Gilman, A., Brunton, L. L., Lazo, J. S., & Parker, K. L. (2006). Goodman & Gilman' s the pharmacological basis of therapeutics. Nueva York: McGraw-Hill; Howland, R. D. , Mycek, M. J., Harvey, R. A., Champe, P. C, & Mycek, M. J. (2006). Pharmacology . Lippincott's illustrated reviews. Philadelphia : Lippincott Williams & Wilkins; and Golan, D. E. (2008) . Principies of pharmacology: the pathophysiologic basis of drug therapy. Philadelphia, Pa., [etc.]: Lippincott Williams & Wilkins.
En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente o los fragmentos o las variantes de unión a IL-6 de los mismos, asi como las combinaciones de dichos fragmentos o variantes de anticuerpo, se administran a un sujeto en una formulación farmacéutica.
Una "composición farmacéutica" se refiere a una composición química o biológica adecuada para administración a un mamífero. Tales composiciones pueden formularse específicamente para la administración mediante una o ma>s vías que incluyen, a modo no taxativo, bucal, epicutánea, epídural, inhalación, intraarterial, intracardíaca, intracerebroventricular, intradermal, intramuscular, intranasal, infraocular, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intravenosa, oral, parenteral, rectal mediante un enema o supositorio, subcutánea, subdermal, sublingual, transdermal y transmucosal . Además, la administración puede ocurrir por medio de inyección, polvo, líquido, gel, gotas u otros medios de administración.
En una modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-6 descritos en la presente o los fragmentos o las variantes de unión a IL-6 de los mismos, asi como las combinaciones de dichos fragmentos o variantes de anticuerpo, se pueden administrar opcionalmente en combinación con uno o más agentes activos. Dichos agentes activos incluyen agentes analgésicos, antipiréticos, antiinflamatorios, antibióticos, antivirales y anticitocina . Los agentes activos incluyen agonistas, antagonistas y moduladores de TNF-á, IL-2, IL-4, IL-6, .IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-á, IFN-á, BAFF, CXCL13, IP-10,' VEGF, EPO, EGF, HRG, factor de crecimiento de hepatocitos |(HGF), Hepcidina, incluyendo anticuerpos reactivos contra cualquiera de los anteriores y anticuerpos reactivos contra cualquiera de sus receptores. Los agentes activos también incluyen ácidos 2-Arilpropiónicos, Aceclofenac, Acemetacina, ácido Acetilsalicilico (Aspirina) , Alclofenac, Alminoprofeno, Amoxiprina, Ampirona, ácidos Arilalcanoicos , Azapropazona, Benorilato/Benorilato, Benoxaprofeno, Bromfenac, Carprofeno, Celecoxib, salicilato de magnesio y colina, Clofezona, inhibidores de COX-2, Dexibuprofeno, Dexketoprófeno, Diclofenac, Diflunisal, Droxicam, Etenzamida, Etodolac, Etoricoxib, Faislamina, ácidos fenámicos, Fenbüfeno, Fenoprofeno, ácido Flufenámico, Flunoxaprofeno, Flurbiprófeno, Ibuprofeno, Ibuproxam, Indometacina, Indoprofeno, Kebuzona, Ketoprofeno, Ketorolac, Lornoxicam, Loxoprofeno, Lumiracoxib, salicilato de Magnesio, ácido Meclofenámico, ácido Mefenámico, Meloxicam, Metamizol, salicilato de Metilo, Mofebutazona, Nabumetona, Naproxeno, ácidos N-Arilantranílieos , Oxametacina, Oxaprozin, Oxicams, Oxifenbutazona, Parecoxib, Fenazona, Fenilbutazona, Fenilbutazona, Piroxicam, Pirprofeno, profenos, Proglumetacina, derivados de Pirazolidina, Rofecoxib, salicilato de Salicilo, Salicilamida, Salicilatos, Sulfinpirazona, Sulindac, Suprofeno, Tenoxicam, ácido Tiaprófenico, ácido Tolfenámico, Tolmetin y Valdecoxib. Los antibióticos incluyen Amikacina, Aminoglicosidas , Amoxicilina, Ampicilina, Ansamicinas, Arsfenamina, Azitromicina, Azlocilina, Aztreonam, Bacitracina, Carbacefem, Carbapenems, Carbenicilina, Cefaclor, Cefadroxil, Cefalexina, Cefalotina, Cefalotina, Cefamandol, Cefazolina, Cefdinir, Cefditoren, Cefepima, Cefixima, Cefoperazona, Cefotaxima, Cefoxitin, Cefpodoxima, Cefprozil, Ceftazidima, Ceftibuten, Ceftizoxima, Ceftobiprol, Ceftriaxona, Cefuroxima, Cefalosporinsa, Cloramfe|nicol , Cilastatina, Ciprofloxacina, Claritromicina, Clindam'icina, Cloxacilina, Colistina, Co-trimoxazol , Dalfopri'stina, Demeclociclina, Dicloxacilina, Diritromicina, Doripenem, Doxiciclina, Enoxacina, Ertapenem, Eritromicina, Etambutol, Flucloxacilina, Fosfomicina, Furazolidona, ácido Fusidico, Gatifloxacina, Geldanamicina, Gentamicina, Glicopéptidos , Herbimicina , Imipenem, Isoniazida, Kanamicina, Levofloxacina, Lincomicina , Linezolida, Lomefloxacina, Loracarbef, Macrolidas, Mafenida, Meropenem, Meticilina, Metronidazol , Mezlocilina, Minociclina, Monobactams, oxifloxacina, upirocina, Nafcilina, Neomicina, Netilmicina, Nitrofurantoina, Norfloxacina, Ofloxacina, Oxacilina, Oxitetraciclina, Paromomicina, Penicilina, Penicilinas, Piperacilina, Platensimicina , Polimixina B, Polipéptidos, Prontosil, Pirazinamida, Quinolonas, Quinupristina, Rifampicina, Rifámpina, Roxitromicina, Espectinomicina, Estreptomicina, Sulfacetamida, Sulfametizol, Sulfanilimida, Sulfasalazina, Sulfisoxazol, Sulfonamidas , Teicoplanina, Telitromicina , Tetraciclina, Tetraciclinas, Ticarcilina, Tinidazol, Tobramicina, Trimetoprim, Trimetoprim-Sulfametoxazol, Troleandomicina, Trovafloxacina y Vancomicina. Los agentes activos también incluyen Aldosterona, Beclometasona, Betametasona, Corticosteroides, Cortisol, acetato de Cortisona, acetato de Desoxicorticosterona, Dexametasona, acetato de Fludrocortisona, Glucocorticoides , Hidrocortisona, Metilprednisolona, Prednisolona, Prednisona, Esteroides y Triamcinolona . Los agentes antivirales incluyen abacavir, aciclovir, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, una combinación de dosis fija antiretroviral, un potenciador sinérgico antiretroyiral, arbidol, atazanavir, atripla, brivudina, cidofovir, combivir, darunavir, delavirdina, didanosina, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtida, entecavir, inhibidores de entrada, famciclovir, fomivirsen, fosamprenavir , foscarnet, fosfonet, inhibidor de fusión, ganciclovir, gardasil, ibacitabina, idoxuridina, imiquimod, imunovir, indinavir, inosina, inhibidor de integrasa, interferón, interferón tipo I, interferón tipo II, interferón tipo III, lamivudina, lopinavir, lovirida, maraviroc, MK-0518, moroxidina, nelfinavir, nevirapina, nexavir, análogos de nucleósido, oseltamivir, penciclovir, peramivir, pleconaril, podofilotoxina, inhibidor de proteasa, inhibidor de transcriptasa inversa, ribavirina, rimantadina, ritonavir, saquinavir, stavudina, tenofovir, tenofovir disoproxilo, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir, valganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina, zalcitabina, zanamivir y zidovudina. Se contempla también cualquier combinación adecuada de estos agentes activos.
Un "excipiente farmacéutico" o un "excipiente farmacéuticamente aceptable" es un portador, normalmente un liquido, donde se formula un agente terapéutico activo. En una modalidad de la invención, el agente terapéutico activo es un anticuerpo humanizado descrito en la presente o uno ó más fragmentos o variantes del mismo. El excipiente en general no proporciona ninguna actividad farmacológica a la formulación aunque puede proporcionar estabilidad química y/o biológica y características de liberación. Se pueden encontrar ejemplos de formulaciones, por ejemplo, en Remington' s Pharmaceutical Sciences, 19* Ed. , Grennaro, A., Ed., 1995, que se incorpora en la presente a modo de referencia.
Como se usa en la presente, un "portador farmacéuticamente aceptable" o un "excipiente" incluye cualesquiera y todos los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción que sean fisiológicamente compatibles. En una modalidad, el portador es adecuado para administración parenteral. De manera alternativa, el portador puede ser adecuado para administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o sublingual. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Salvo en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención. También se pueden incorporar compuestos activos complementarios a las composiciones. ' En una modalidad de la invención, estos pueden usarse para administrar anticuerpos de la invención de forma intravenosa, incluyendo Abl, para indicaciones en cáncer; la formulación de administración comprende o, de manera alternativa, consiste en alrededor de 10.5 mg/mL de anticuerpo, 25 mM de base de histidina, ácido fosfórico c.s. a pH 6 y 250 mM de sorbitol.
En otra modalidad de la invención que puede usarse para administrar anticuerpos de la invención de forma intravenosa, incluyendo Abl, para indicaciones en cáncer, la formulación de administración comprende o, de manera alternativa, consiste en alrededor de 10.5 mg/mL de anticuerpo, 12.5 mM de base de histidina, 12.5 mM de histidina HC1 (o 25 mM de base de histidina y ácido clorhídrico c.s. a pH 6), 250 mM de sorbitol y 0.015% (p/p) de polisorbato 80.
En una modalidad de la invención que puede usarse para administrar anticuerpos de la invención de forma subcutánea, incluido Abl, para indicaciones en artritis reumatoide, la formulación de administración comprende o, de manera alternativa, consiste en alrededor de 50 o 100 mg/mL de anticuerpo, alrededor de 5 mM de base de histidina, alrededor de 5 mM de histidina HC1 para alcanzar un pH final de 6, 250 mM de sorbitol y 0.015% (p/p) de polisorbato 80.
En otra modalidad de la invención que puede usarse' para administrar anticuerpos de la invención de forma subcutánea, incluido Abl, para indicaciones en artritis reumatoide, la formulación de administración comprende o, de manera alternativa, consiste en alrededor de 20 o 100 mg/mL de anticuerpo, alrededor de 5 mM de base de histidina, alrededor de 5 mM de histidina HCl para alcanzar un pH final de 6,, 250 a 280 mM de sorbitol (o sorbitol en combinación con sucrosa) y 0.015% (p/p) de polisorbato 80; dicha formulación posee un espacio libre de nitrógeno en los recipientes de envió. , Las composiciones farmacéuticas típicamente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La invención contempla que la composición farmacéutica esté presente en una forma liofilizada. La composición puede formularse como una solución,, una microemulsión, un liposoma u otra estructura ordenada adecuada para altas concentraciones del fármaco. El portador puede ser un solvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglícol y polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos. La invención contempla adicionalmente la inclusión de un estabilizador en la composición farmacéutica.
En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tal como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ocasionarse mediante la inclusión en la composición de un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Además, el polipéptido alcalino puede formularse en una formulación de liberación en el tiempo, por ejemplo, en una composición que incluya un polímero de liberación lenta. Los compuestos activos pueden prepararse con portadores que protegerán el compuesto de la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada incluyendo implantes y sistemas microencapsulados de liberación. Pueden usarse polímeros biodegradables y biocompatibles, tal como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico y copolímeros polilácticos y poliglicólicos (PLG) . Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones son conocidos por los expertos en la técnica. : Para cada una de las modalidades descritas, los compuestos pueden administrarse mediante una variedad de formas de dosificación. Se contempla toda forma de dosificación biológicamente aceptable conocida por expertos en la técnica y combinaciones de las mismas. Los ejemplos de dichas formas de dosificación incluyen, a modo no taxativo, polvos reconstituibles, elíxires, líquidos, soluciones, suspensiones, emulsiones, polvos, gránulos, partículas, micropartículas, gránulos dispersables, sellos, inhalantes, inhalantes en aerosol, parches, inhalantes en partículas, implantes, implantes de depósito, inyectables (incluyendo subcutáneos, intramusculares, intravenosos e intradermales) , infusiones y combinaciones de los mismos.
La descripción anterior de varias modalidades ilustradas de la invención no pretende ser taxativa ni limitar la invención a la forma concreta descrita. Mientras que modalidades específicas y ejemplos de la invención se describen en la presente con fines ilustrativos, es posible realizar diversas modificaciones equivalentes dentro del alcance de la invención, como lo reconocerán los expertos en la técnica correspondiente. Las enseñanzas de la invención proporcionadas en la presente pueden aplicarse con otros fines distintos a los ejemplos descritos anteriormente.
Se pueden realizar estos y otros cambios a la invención a la luz de la descripción detallada antemencionada. En general, en las reivindicaciones a continuación, no deberá entenderse que los términos utilizados limitan la invención a las modalidades- específicas descritas en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones. Por consiguiente, la descripción no limita la invención sino que, en cambio, el alcance de la invención estará determinado totalmente por ] las reivindicaciones a continuación.
La invención puede ponerse en práctica en formas distintas a aquellas descritas particularmente en la descripción anterior y en los ejemplos. Son posibles diversas modificaciones y variaciones de la invención en vista de las enseñanzas anteriores y, por lo tanto, se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Algunas enseñanzas relacionadas con métodos para obtener una población clonal de linfocitos B específicos para antígeno fueron descritas en la solicitud de patente provisional estadounidense No. 60/801,412 presentada el 19 de mayo de 2006, cuya descripción se incorpora en su totalidad a la presente a modo de referencia.
Algunas enseñanzas relacionadas con la humanización de anticuerpos monoclonales derivados del conejo y modificaciones preferidas de secuencias para mantener la afinidad de unión al antígeno fueron descritas en la solicitud internacional No. 12/124,723, correspondiente al No. de expediente; del representante 67858.704001, titulado "Novel Rabbit Antjibody Humanization Method and Humanized Rabbit Antibodies" [Nuevo método de humanización de anticuerpo de conejo y anticuerpos de conejo humanizados], presentada el 21 de mayo, 2008, : cuya I descripción se incorpora en su totalidad a la presente a modo de referencia.
Algunas enseñanzas relacionadas con la producción de anticuerpos o fragmentos de los mismos usando levadura que puede aparearse y métodos correspondientes fueron descritos en la solicitud de patente estadounidense No. 11/429,053 presentada el 8 de mayo de 2006, (publicación de solicitud de patente estadounidense No. US2006/0270045) , cuya descripción se incorpora en su totalidad a la presente a modo de referencia.
Algunas enseñanzas relacionadas con anticuerpos anti-IL-6, métodos para la producción de anticuerpos o fragmentos de estos usando levadura que puede aparearse y métodos correspondientes fueron descritos en la solicitud de patente provisional estadounidense No. 60/924,550 presentada el 21 de mayo de.2007, cuya descripción se incorpora en su totalidad a la presente a modo de referencia.
Algunas enseñanzas relacionadas con anticuerpos anti-IL-6 y métodos de uso de dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos para abordar algunas enfermedades y/o afecciones fueron descritos en las patentes provisionales estadounidenses: Nos. 61/117, 839, 61/117, 861 y 61/117,811, todas presentadas el ;25 de noviembre de 2008, cuyas descripciones se incorporan a la presente en su totalidad a modo de referencia.
Algunos polinucleótidos y polipéptidos de anticuerpos anti-IL-ß se describen en el listado de secuencias que acompaña la presente presentación de solicitud de patente y la descripción de dicho listado de secuencias se incorpora en su totalidad a la presente a modo de referencia.
La totalidad de la descripción de cada documento citado en la presente (incluyendo patentes, solicitudes de patente, artículos de periódicos, resúmenes, manuales, libros u; otras descripciones) se incorpora a la presente a modo de referencia.
Los siguientes ejemplos se proponen para proporcionar a los expertos en la técnica una descripción completa de cómo realizar y usar la invención objeto de la presente y ,no se pretende que limiten el alcance de lo que se entiende cómo la invención. Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a las cifras utilizadas (por ejemplo, cantidades, temperaturas, concentraciones, etc.) pero se deberán tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura se da en grados centígrados . y la presión es la atmosférica o cercana a esta.
EJEMPLOS En los siguiente ejemplos, el término "Abl" se refiere a un anticuerpo que contiene la secuencia de cadena ligera1 de la SEQ ID NO: 702 y la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 704, salvo en los casos en que el contexto indique lo contrario .
Ejemplo 1 Producción de cultivos enriquecidos de anticuerpos de linfocitos B específicos para antígeno Los paneles de anticuerpos se derivan inmunizando animales hospedadores de anticuerpos tradicionales para explotar la respuesta inmunitaria nativa a un antígeno objetivo de interés. Típicamente, el hospedador usado para la inmunización es un conejo u otro hospedador que produce anticuerpos usando un proceso de maduración similar y proporciona una población de linfocitos B específicos para antígeno produciendo anticuerpos de diversidad comparable, por ejemplo, diversidad epitópica. La inmunización de antígeno inicial puede realizarse usando un adyuvante de Freund completo (CFA) y los refuerzos posteriores se pueden efectuar con un adyuvante incompleto. Alrededor de 50-60 días después de la inmunización, preferentemente en el día 55, se prueban las valoraciones de anticuerpos y se inicia el proceso de Selección de Anticuerpos (ABS) si se establecen valoraciones apropiadas. Los dos criterios clave para la iniciación de ABS son el reconocimiento de antigenos poténtes y la actividad modificadora de funciones en el suero policlonal.
En el momento en que se establecen valoraciones de anticuerpos positivas, se sacrifican los animales y se aislan las fuentes de linfocitos B. Estas fuentes incluyen: el bazo, los nodulos linfáticos, la médula espinal y las células mononucleares de sangre periférica (PB C) . Se generan suspensiones unicelulares y las suspensiones celulares se. lavan para hacerlas compatibles para almacenamientos a largo plazo a baja temperatura. Luego las células se congelan típicamente.
Para iniciar el proceso de identificación de anticuerpos, una pequeña fracción de las suspensiones celulares congeladas se descongela, se lava y se coloca en un medio de cultivo tisular. Estas suspensiones luego se mezclan con una j forma biotinilada del antígeno usada para generar la respuesta inmunitaria del animal y se recuperan células específicas para antígeno usando los métodos de selección de células con cuentas magnéticas de iltenyi. Se lleva a cabo un enriquecimiento específico usando cuentas de estreptavidina . La población enriquecida se recupera y se desarrolla en la siguiente fase de aislamiento de linfocitos B específicos.
Ejemplo 2 Producción de cultivos clónales que contienen linfocitos B específicos para antígeno Los linfocitos B enriquecidos producidos de acuerdo con el Ejemplo 1 luego se colocan en placas a diversas densidades celulares por pocilio en una placa de microtitulación ; de 96 pocilios. En general esto se realiza a 50, 100, 250 o 500 células por pocilio con 10 placas por grupo. El medio se complementa con un medio acondicionado de 4% de linfocitos T activados de conejo junto con 50K de fibroblastos: EL4B irradiados y congelados. Estos cultivos permanecen inalterados durante 5-7 días, en ese momento se recoge el anticuerpo secretado que contiene sobrenadante y se evalúa para determinar propiedades objetivo en un marco de ensayo separado. El sobrenadante remanente se deja intacto y la placa se congela a -70 °C. En estas condiciones, el proceso de cultivo típicamente da como resultado pocilios que contienen una población celular mixta que comprende una población clonal de linfocitos B específicos para antígeno, es decir, un solo pocilio contendrá solamente un único anticuerpo monoclonal específico para el antígeno deseado.
Ejemplo 3 Análisis de los sobrenadantes del anticuerpo para el anticuerpo monoclonal de especificidad deseada y/o propiedades funcionales Los sobrenadantes que contienen anticuerpos derivados del pocilio que contiene una población clonal de linfocitos B específicos para antígeno producida de acuerdo con el Ejemplo 2 se analizan inicialmente para reconocer antígenos usando métodos ELISA. Esto incluye la inmovilización selectiva de antígenos (por ejemplo, captura de antígeno biotinilado mediante placas revestidas con estreptavidina) , revestimiento de placa para antígeno no específico o, de manera alternativa, a través de una estrategia de concentración de antígeno (por ejemplo, captura de antígeno selectiva seguida por la adición de un compañero de unión para generar un complejo heteromérico proteína-antígeno) . Luego los sobrenadantes de pocilio positivo para antígeno opcionalmente se someten a prueba en un ensayo de modificación de función que depende estrictamente del ligando. Un ejemplo de esto es un ensayo de interacción proteína-proteína in vitro que recrea la interacción natural del ligando del antígeno con la proteína receptora recombinante . De manera alternativa, se utiliza una respuesta basada en la célula que depende del ligando y se controla fácilmente (por ejemplo, respuesta de proliferación) . El sobrenadante que muestre un reconocimiento significativo y potencia de antígeno se considera un pocilio positivo. Las células derivadas del pocilio positivo original luego efectúan una transición' a la i fase de recuperación del anticuerpo.
Ejemplo 4 Recuperación de un único linfocito B que produce anticuerpos de especificidad para antigeno deseada Las células se aislan de un pocilio que contiene una población clonal de linfocitos B específicos para antígeno (producidos de acuerdo con el Ejemplo 2 o 3) que secretan una única secuencia de anticuerpo. Las células aisladas luego se ensayan para aislar una única célula que secreta anticuerpos. Las cuentas de estreptavidina Dynal se recubren con antígenos objetivo biotinilados en un medio tamponado para preparar microcuentas que contienen antígenos compatibles con viabilidad celular. Luego, las cuentas cargadas de antígeno, las células que producen anticuerpos a partir de un pocilio positivo y un anticuerpo IgG H&L anti-hospedador marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (como se observa, el hospedador puede ser cualquier hospedador mamífero, por ejemplo, conejo, ratón, rata, etc.) se incuban juntos a 37 °C. Esta mezcla luego se coloca nuevamente en una pipeta en alícuotas en un portaobjetos de vidrio de manera tal que cada alícuota tenga como promedio un único linfocito B que produce anticuerpos. Las células específicas para antígeno y que secretan anticuerpos luego se detectan a través de microscopía de fluorescencia. El anticuerpo secretado se concentra localmente en cuentas adyacentes debido al antígeno unido y proporciona información de localización basándose en la señal fluorescente fuerte. Las células que secretan anticuerpos se identifican mediante detección de FITC de complejos anticuerpo-antigeno formados adyacente a la célula secretora. La célula simple encontrada en el centro de este complejo luego se recupera usando un micromanipulador . La célula se congela instantáneamente en un tubo PCR de Eppendorf para almacenamiento a -80 °C hasta que se inicie la recuperación de la secuencia de anticuerpos.
Ejemplo 5 Aislamiento de secuencias de anticuerpos a partir de linfocitos B específicos para antígeno Las secuencias de anticuerpos se recuperan . usando un método combinado basado en RT-PCR a partir de un único linfocito B aislado producido de acuerdo con el Ejemplo 4 o un linfocito B específico para antigénico aislado a partir de la población clonal de linfocitos B obtenidos de acuerdo con el Ejemplo 2. Se diseñan cebadores para templarse en regiones conservadas y constantes de los genes de inmunoglobulina objetivo (pesada y ligera) , como secuencias de inmunoglobulina de conejo y se usa una etapa de recuperación de PCR anidado en dos etapas para obtener la secuencia del anticuerpo. Se analizan amplicones de cada pocilio para determinar la integridad de recuperación y tamaño. Los fragmentos resultantes luego se digieren con AluI para identificar genéticamente la clonación de la secuencia. Las secuencias idénticas presentan un patrón de fragmentación común en su análisis electroforético. Significativamente, este patrón común de fragmentación que prueba la clonación de células se obsérva en general aun en los pocilios originalmente colocados en placas de hasta 1000 células/pocilio. Los fragmentos de amplicón original de cadena pesada y ligera se digieren por enzima de restricción con HindIII y Xhol o HindIII y BsiWI para preparar las piezas respectivas de ADN para clonación. Las digestiones resultantes luego se ligan en un vector de expresión y se transforman en bacterias para la propagación y producción de plásmidos. Se seleccionan colonias para la caracterización de secuencias.
Ejemplo 6 Producción recombinante de anticuerpo monoclonal de especificidad para antigeno y/o propiedades funcionales deseadas Se establecen secuencias de anticuerpo de longitud completa correcta para cada pocilio que contienen un ' único anticuerpo monoclonal y se prepara una miniprep de ADN jusando metodología de fase sólida de Qiagen. El ADN luego se usa para transfectar células de . mamíferos para producir anticuerpos recombinantes de longitud completa. Se prueba el producto de anticuerpo bruto para determinar el reconocimiento de antígeno y las propiedades funcionales para confirmar qué las características originales se encuentran en la proteína recombinante de anticuerpo. Cuando resulta apropiado, se completan las transfecciones mamíferas transitorias a gran escala y se purifica el anticuerpo a través de cromatografía de afinidad de Proteína A. Se evalúa la Kd usando métodos estándar (por ejemplo, Biacore™) , así como IC50 en un ensayo de potencia.
Ejemplo 7 Preparación de anticuerpos que unen la IL-6 humana Usando el protocolo de selección de anticuerpos descrito en la presente, se puede generar un panel extenso de anticuerpos. Los anticuerpos poseen una alta afinidad para IL-6 (pM Kd de uno o dos dígitos) y demuestran un potente antagonismo de IL-6 en múltiples sistemas de análisis basados en células (T1165 y HepG2). Además, la recolección de anticuerpos presenta distintos modos de antagonismo hacia los procesos conducidos por IL-6.
Estrategia de inmunización Se inmunizaron conejos con huIL-6 (R&R) . La inmunización consistió en una primera inyección subcutánea (se) de 100 ^g en un adyuvante de Freund completo (CFA) (Sigma) seguido de dos refuerzos, con dos semanas de separación, de 50 µg cada uno en adyuvante de Freund incompleto (IFA) (Sigma) . Los animales se desangraron en el día 55 y se determinaron las valoraciones de suero mediante ELISA (reconocimiento de antígeno) y médiante ensayo de proliferación no radiactivo (Promega) usando la línea celular T1165.
Evaluación de la valoración en la selección de anticuerpos El reconocimiento del antígeno se determinó mediante el revestimiento de placas Immulon 4 (Thermo) con 1 g/ml de huIL-6 (50 µ?/pocillo) en solución salina tamponada de fosfato (PBS, Hyclone) durante la noche a 4 °C. El día del ensayo, las placas se lavaron 3 veces con PBS /Tween 20 (tabletas PBST, Calbiochem) . Las placas luego se bloquearon con 200 µ?/pocillo de 0.5% de gelatina de piel de pescado (FSG, Sigma) en PBS durante 30 minutos a 37 °C. La solución de bloqueo se eliminó y las placas se transfirieron. Se realizaron las muestras de suero (hemorragias y prehemorragias ) en una dilución inicial de 1:100 (todas las diluciones se realizaron en FSG 50 µ?/pocillo) seguida de diluciones 1:10 a través de la placa (la columna 12 se dejó en blanco para control de fondo) . Las placas se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. Las placas se lavaron 3 veces con PBS/Tween 20. Se agregó Fc-HRP de cabra anti-conejo (Pierce) diluido 1:5000 a todos los pocilios (50 µ?/pocillo) y las placas se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. Las¦ placas se lavaron tal como se describió anteriormente. Se agregaron a las placas 50 µ?/pocillo de detención TMB-Stable (Fitzgerald Industries) y se dejó desarrollar el color, en general, durante 3 a 5 minutos. La reacción de desarrollo se detuvo con 50 µ?/pocillo de 0.5 M de HC1. Las placas se leyeron a 450 nm. La densidad óptica (OD) contra la dilución se gráfico usando un software Graph Pad Prism y se determinaron las valoraciones.
Evaluación de la valoración funcional La actividad funcional de la muestras se determinó mediante un ensayo de proliferación T1165. Las células T1165 se mantuvieron de manera rutinaria en un medio RPMI modificado (Hyclone) complementado con Hepes, piruvato de sodio, bicarbonato de sodio, L-glutamina, glucosa I alta, penicilina/estreptomicina, 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) (todos complementos de Hyclone) , 2-mercaptoetanol (Sigma) y 10 ng/mL de huIL-ß (R&D) El dia del ensayo, la viabilidad celular se determinó mediante azul de tripano (Invitrogen) y las células se sembraron a una densidad fija de 20,000 células/pocilio. Antes del sembrado, las células se lavaron dos veces en el medio descrito anteriormente sin IL-6 humana (centrifugando a 13000 rpm durante 5 minutos y eliminando el sobrenadante) . Luego del último lavado, las células se volvieron a suspender en el mismo medio usado para el lavado en un volumen equivalente a 50 µ?/pocillo. Las células se separaron a temperatura ambiente.
En una placa de fondo redondo de 96 pocilios (Costar) , se agregaron muestras de suero comenzando en 1:100, seguido de una dilución de 1:10 a través de la placa (columnas 2 a 10) a 30 µ?/pocillo en replicas de 5 (filas B a F: dilución llevada a cabo en el medio descrito anteriormente sin huIL-6) . La columna 11 solo sirvió como medio para control de IL-6. Se agregaron a todos los pocilios 30 µ?/pocillo de huIL-6 a una concentración de 4x de la CE50 final (concentración previamente determinada) (la huIL-6 se diluyó en el medio descrito anteriormente) . Los pocilios se incubaron durante 1 hora a 37 °C para permitir que ocurra la unión al anticuerpo. Luego de 1 hora, se transfirieron a una placa de fondo plano de 96 pocilios (Costar) 50 µ?/pocillo de complejo anticuerpo-antigeno (Ab-Ag) siguiendo el formato de mapa de la placa dispuesto en la placa de fondo redondo. En la fila G, se agregaron 50 µ?/pocillo de medio a todos los pocilios (columnas 2 a 11) para control de fondo. Se agregaron 50 µ?/pocillo de la suspensión celular separada a todos los pocilios (columnas 2 a 11, filas B; a G) . En las columnas 1 y 12 y en las filas A y H, se agregaron 200 µ?/pocillo de medio para prevenir la evaporación de pocilios de prueba y para minimizar el efecto borde. Las placas se incubaron durante 72 h a 37 °C en 4% de C02. A las 72 h, se agregaron 20 µ?/pocillo de reactivos CellTiter96 (Promega) a todos los pocilios de prueba de acuerdo con el protocolo del fabricante y las placas se incubaron durante 2 h a 37 °C. A las 2 h, las placas se mezclaron delicadamente en un agitador orbital para dispersar las células y permitir la homogéneidad en los pocilios de prueba. Las placas se leyeron a 490 nm de longitud de onda. Se gráfico la densidad óptica (OD) versus la dilución usando un software Graph Pad Prizm y se determinaron las valoraciones funcionales. Se realizó una placa de control de ensayo positivo como se describió anteriormente, usando MAB2061 (R&D Systems) a una concentración inicial de 1 g/ml (concentración final) seguido de diluciones 1:3 a través de la placa .
Cultivo de tejidos Una vez que se establecieron las valoraciones aceptables, se sacrificó el o los conejos. El bazo, los nodulos linfáticos y la sangre se cultivaron y procesaron de la siguiente manera: El bazo y los nodulos linfáticos se procesaron en una suspensión unicelular mediante disociación del tejido y apertura de un camino mediante una tela metálica estéril a 70 µ?? (Fisher) con un émbolo de una jeringa de 20 ce. Las células se recogieron en el medio RP I modificado descrito anteriormente sin huIL-6 pero con baja glucosa. Las células se lavaron dos veces mediante centrifugación. Luego del último lavado, la densidad celular se determinó mediante azul de tripano. Las células se centrifugaron a 1500 rpm durante 10 minutos; se eliminó el sobrenadante. Las células se volvieron a suspender en el volumen apropiado de 10% de dimetilsulfóxido (D SO, Sigma) en FBS (Hyclone) y se dispensaron a 1 ml/recipiente . Los recipientes luego se almacenaron a -70 °C durante 24 h antes de colocarlos en un tanque de nitrógeno liquido (LN2) para su almacenamiento a largo plazo.
Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron mezclando sangre con partes iguales del medio de baja glucosa descrito anteriormente sin FBS. Se colocaron en capas cuidadosamente 35 mi de la mezcla de sangre sobre 8 mi de Lympholyte Rabbit (Cedarlane) en un tubo cónico de ,45 mi (Corning) y se centrifugó por 30 minutos a 2500 rpm a temperatura ambiente sin detenerse. Luego de la centrifugación, las capas de PBMC se eliminaron cuidadosamente usando una pipeta de vidrio Pasteur (VWR) , se combinaron y colocaran en un recipiente limpio de 50 mi. Las células se lavaron dos, veces con el medio modificado descrito anteriormente mediante centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente y la densidad celular se determinó mediante teñido con azul de tripano. Tras el último lavado, las células se volvieron a suspender en un medio de 10% DMSO/FBS de volumen apropiado y se congelaron tal como se describió anteriormente.
Cultivo de linfocitos B El dia en que se establece el cultivo de linfocitos B, se descongelaron recipientes de PBMC, esplenocito o nodulos linfáticos para su uso. Los recipientes se eliminaron del tanque LN2 y se colocaron en un baño de agua a 37 °C hasta descongelarse. El contenido de los recipientes se transfirió a un tubo de centrifugado cónico de 15 mi (Corning) y se agregaron al tubo lentamente 10 mi de RP I modificado descrito anteriormente. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a 1.5K rpm y se eliminó el sobrenadante. Las células se volvieron a suspender en 10 mi de un medio nuevo. La densidad y la viabilidad celular se determinaron mediante azul de tripano. Las células se lavaron nuevamente y se volvieron a suspender en medio de células 1E07/80 µL. Se agregó huIL-6 biotinilada (B huIL-6) a la suspensión celular a la concentración final de 3 µg/mL y se incubó durante 30 minutos a 4 °C. La B huIL-6 sin unir se eliminó con dos lavados de 10 mL de PBS libre de Ca/Mg: (PBF) tamponado con fosfato (Hyclone) , 2 mM de ácido etilendiamina tetraacético, 0.5% de albúmina de suero bovino (BSA) (Sigma-libre de biotina) . Luego del segundo lavado, las células se volvieron a suspender en PBF de células 1E07/80 µ? .
Se agregaron a la supensión celular 20 µ? de células 10E7/cuentas MACS® de estreptavidina (Milteni) . Las células se incubaron a 4 °C durante 15 minutos. Las células se lavaron una vez con 2 mi de PBF/células 10E7. Luego de lavarse, las células se volvieron a suspender en células 1E08/500 µ? de PBF y se separaron. Se enjuagó una columna MACS® MS (Milteni) con 500 mi de PBF en un mecano magnético (Milteni). La suspensión celular se aplicó a la columna a través de un prefiltro y se recogió una fracción sin unir. La columna se lavó con 1.5 mi de !tampón PBF. La columna se eliminó del mecano magnético y se colocó en un tubo limpio estéril de 5 mi de polipropileno tipo Falcon. Se agregó 1 mi de tampón PBF a la parte superior de la columna y se recogieron células seleccionadas positivas. El rendimiento y la viabilidad de las fracciones celulares positivas y negativas se determinaron mediante teñido de azul de tripano. La selección positiva proporcionó un promedio de 1% ,de la concentración celular inicial. ; Se estableció un análisis celular piloto para proporcionar información acerca de los niveles de siembra para el cultivo. Se sembraron tres grupos de 10 placas (un total de 30 placas) a 50, 100 y 200 linfocitos B enriquecidos/pocilio. Adicionalmente, cada pocilio contenia 50K células/pocilio de células EL-4.B5 irradiadas (5,000 Rads) y un nivel apropiado de sobrenadante de linfocitos T (que variaba de 1-5% dependiendo de la preparación) en un medio modificado de alta glucosa RPMI a un volumen final de 250 µ?/pocillo. Los cultivos se incubaron durante 5 a 7 días a 37 °C en 4% de C02.
Identificación de linfocitos B que secretan anticuerpos selectivos Los cultivos se probaron entre los días 5 y 7 para determinar el reconocimiento de antigeno y la actividad funcional. ¡ Análisis de reconocimiento de antigeno El formato ELISA utilizado es como se describió anteriormente, salvo porque se usaron 50 µ? de sobrenadante de los pocilios de cultivos de linfocitos B (BCC) (todas las 30 placas) como fuente del anticuerpo. El medio acondicionado se transfirió a placas revestidas de antigeno. Luego de jque se identificaran placas positivas, el sobrenadante se eliminó y se transfirió a una o varias placas principales de 96 pocilios. Luego las placas de cultivo originales se congelaron eliminando todos los sobrenadantes salvo 40 µ?/pocillo y agregando 60 µ?/pocillo de 16% de DMSO en FBS. Las placas se envolvieron en toallas de papel para enlentecer el congelamiento ; y se colocaron a -70 °C.
Análisis de actividad funcional Luego se analizaron las placas principales para determinar la actividad funcional en el ensayo de proliferación T1165 como se describió anteriormente, salvo por la fila B que fue medio solo para control de fondo, la fila C que fue medio + IL-6 para control positivo de proliferación y las filas D-G y columnas 2-11 que fueron los pocilios de BCC (50 µ?/pocillo, .puntos únicos) . Se agregaron 40 µ? de IL-6 a todos los pocilios, salvo a la fila de medio, a 2.5 veces la concentración de CE50 determinada para el ensayo. Luego de 1 h de incubación, el complejo Ab/Ag se transfirió a una placa de fondo redondo de 96 pocilios tratada con cultivo tisular (TC) . Se agregaron a todos los pocilios 20 µ? de suspensión celular en un medio RPMI modificado sin huIL-6 (T1165 a 20,000 células/pocilio) (100 µ? de volumen final por pocilio) . Se sustrajo el fondo <' y los valores de OD observados se transformaron en % de inhibiqión.
Recuperación de linfocitos B Las placas que contenían pocilios de interés se eliminaron a -70 °C y las células de cada pocilio se recuperaron cori 5-200 µ? lavados de medio/pocilio. Los lavados se acumularon en un tubo de centrifugado estéril de 1.5 mi y las células se granularon durante 2 minutos a 1500 rpm. : El tubo se invirtió, el giro se repitió y el sobrenadante se eliminó cuidadosamente. Las células se volvieron a suspender en 100 µ?/tubo del medio. Se agregaron a la suspensión celular 100 µ? de dynabeads biotiniladas M280 de estreptavidina revestidas con IL-6 (Invitrogen) y 16 µ? de IgG-FITC H&L de cabra anti-conejo diluido 1:100 en el medio.
Se eliminaron 20 µ? de una suspensión de célula/cuentas/FITC y se prepararon 5 µ? de gotas en un portaobjetos (Corning) previamente tratado con Sigmacote (Sigma) , 35 a 40 gotas/portaobjetos. Se agregó una barrera impermeable de queroseno (JT Baker) para sumergir las gotas y se incubó el portaobjetos durante 90 minutos a 37 °C con 4% de C02 en la oscuridad.
Los linfocitos B específicos que producen anticuerpos pueden identificarse mediante el anillo fluorescente a su alrededor debido a la secreción de anticuerpo, el reconocimiento del antígeno biotinilado asociado con cuentas y la detección subsiguiente mediante el reactivo de detección fluorescente IgG. Una vez que la célula de interés se identificó, la célula en el centro del anillo fluorescente se recuperó a través de un micromanipulador (Eppendorf) . La ¡única célula que sintetizaba y exportaba el anticuerpo se trans1firió a un tubo de microcentrifugado de 250 L y se colocó en hielo seco. Luego de recuperar todas las células de interés, estas se transfirieron a -70 °C para almacenamiento a largo plazo.; Ejemplo 8 Expresión de células de levadura Genes de anticuerpos: Los genes se clonaron y se interpretó que dirigieron la síntesis de un anticuerpo monoclonal de conejo humanizado quimérico.
Vector de expresión: El vector contiene los siguientes componentes funcionales: 1) un origen mutante ColEl de replicación que facilita la replicación del vector plásmido en células de la bacteria Escherichia coli, 2) un gen bacteriano Sh ble que confiere resistencia al antibiótico Zeocin™ (fleomicina) y sirve como marcador seleccionable para transformaciones tanto de E. coli como de P. pastoris, ;3) un cassette de expresión compuesto por el promotor del gen de gliceraldehído deshidrogenase' (gen GAP) fusionado a las secuencias que codifican la secuencia líder de secreción pre pro del factor de apareamiento alfa de Saccharomyces cerevisiae, seguido de secuencias que codifican una señal transcripcional de terminación del gen de alcohol oxidasa I de P. pastoris (AOX1). El gen marcador de resistencia Zeocin™ (fleomicina) proporciona un medio de enriquecimiento para ¡cepas que contienen múltiples copias integradas de un vector de expresión en una cepa mediante la selección de transformantes resistentes a altos niveles de Zeocin™ (fleomicina) .
Cepas P. pastoris: Se pueden usar las cepas de P.pástoris metí, lys3, ura3 y adel. Aunque pueden usarse cualesquiera dos conjuntos complementarios de cepas auxotróficas para la construcción y el mantenimiento de cepas diploides, estás dos cepas son especialmente adecuadas para este método por dos razones. Primero, crecen más despacio que las cepas diploides que son el resultado de su apareamiento o fusión. Por tanto, si una pequeña cantidad de células haploides adel o ura3 siguen presentes en un cultivo o surgen a través de la meiosis u otro mecanismo, la cepa diploide debería crecer más en el cultivo.
Segundo, es fácil controlar el estado sexual de estas cepas, dado que las colonias diploides Ade+ que surgen .de su apareamiento son de color blanco o crema regular, mientras que las células de cualquier cepa mutantes haploides adel formarán una colonia con un color rosado distintivo. Además, todas las cepas mutantes haploides ura3 son resistentes al fármaco 'ácido 5-fluoro-orótico (FOA) y pueden identificarse sensiblemente colocando en placas muestras de un cultivo en un medio mínimo + placas de uracilo con FOA. En estas placas, solo las cepas del mutante ura3 que requiere uracilo (supuestamente haploides) pueden crecer y formar colonias. Por tanto, con cepas progenitoras haploides marcadas con adel y ura3, se puede controlar fácilmente el estado sexual de las cepas diploides resultantes que producen anticuerpos (haploide contra diploide) .
Métodos Construcción de vectores de expresión pGAPZ-alfa para la transcripción de genes de anticuerpo de cadena ligera y pesada. Los fragmentos de cadena ligera y pesada humanizada se clonaron en los vectores de expresión pGAPZ a través de un proceso dirigido a PCR. Las construcciones humanizadas recuperadas se sometieron a amplificación en condiciones de un kit de polimerasa KOD estándar (Novagen) ((1) 94 °C, 2 minutos; (2) 94 °C, 30 segundos (3) 55 °C, 30 segundos; (4) 72 °C, 30 segundos, alternados a través de las etapas 2-4 35 veces; (5) 72 °C 2 minutos) usando los siguientes cebadores (1) AGCGCTTATTCCGCTATCCAGATGACCCAGTC directos de cadena ligera-solo se subraya el sitio Afel . El final de la secuencia de', señal HSA se subraya dos veces, seguido de la secuencia para la secuencia de cadena ligera variable madura (no se subraya) ; la CGTACGTTTGATTTCCACCTTG inversa.
Cebador inverso de cadena ligera variable. Se subraya el sitio BsiWI, seguido del complemento inverso para el extremo 3' de la cadena ligera variable. Tras la digestión de la enzima de restricción con Afel y BsiWI se permite la inserción dentro del marco con el vector pGAPZ usando la secuencia líder HAS humana dentro del marco con la región constante de cadena ligera kappa humana para exportar. (2) Se realiza una estrategia similar para la cadena pesada. El cebador directo empleado es AGCGCTTATTCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC. Solo se subraya el sitio Afel. El final de la secuencia de señal HSA se subraya dos veces, seguido de la secuencia para la cadena pesada variable madura (no se subraya) . El cebador de cadena pesada inverso es CTCGAGACGGTGACGAGGGT . Se subraya el sitio Xhol, seguido del complemento inverso para el extremo 3' de la cadena pesada variable. Esto permite la clonación de la cadena pesada dentro del marco con la región IgG-Dl CH1-CH2-CH3 previamente insertada dentro de pGAPZ usando una estrategia de clonación direccional comparable.
Transformación de vectores de expresión en > cepas hospedadoras haploides adel ura3, metí y lys3 de P. pastoris. Todos los métodos usados para la transformación de . cepas haploides de P. pastoris y la manipulación genética del ciclo sexual de P. pastoris se describen en Higgins, D. R., and Cregg, J. M. , Eds . 1998. Pichia Protocols. ethods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ.
Antes de la transformación, cada vector de expresión se linealiza dentro de las secuencias promotoras GAP con 'Avrll para dirigir la integración de los vectores en el locus promotor GAP del genoma P. pastoris. Las muestras dé cada vector se transforman individualmente en cultivos electrocompetentes de cepas adel, ura3, metí y lys3 mediante electroporación y se seleccionaron transformantes exitosos en placas YPD Zeocin™ (fleomicina) por sus resistencia a este antibiótico. Las colonias resultantes se seleccionan, se estrian para colonias únicas en placas de YPD Zeocin™ (fleomicina) y luego se examinaron para determinar la presencia del inserto del gen de anticuerpo mediante un ensayo de PCR en ADN genómico extraído de cada cepa para el inserto de gen de anticuerpo adecuado y/o mediante la habilidad de cada cepa de sintetizar una cadena de anticuerpo mediante un método de transferencia de colonias/inmunotransferencia (Wung et al. Biotechniques 21 808-812 (1996). Las cepas haploides adel, metí y lys3 que expresan una de las tres construcciones de cadena pesada se recogen para construcciones diploides junto con una cepa haploide ura3 que expresa un gen de cadena ligera. Los genes de cadena pesada que expresan haploides se aparean con la cadena ligera haploide ura3 apropiada para generar una proteína secretora diploide.
Apareamiento de cepas haploides que sintetizan una única cadena de anticuerpo y selección de derivados diploides que sintetizan anticuerpos funcionales tetraméricos . Para aparear cepas haploides de P. pastoris, cada cepa que produce una cadena pesada adel (o metí o lys3) que se desea cruzar se estría a través de una placa rica en YPD y la cepa que produce una cadena ligera ura3 se estría a través de una segunda placa YPD (~10 estrías por placa) . Luego de uno o dos días de incubación a 30 °C, las células de una placa que contiene cepas de cadena pesada y una placa que contiene cepas de cadena ligera ura3 se transfieren a una tela de terciopelo estéril en un bloque de placas réplica en un patrón cruzado de incubación de manera que cada cepa de cadena pesada contenga un parche de células mezcladas con cada cepa de cadena ligera. Luego las células colocadas en placas réplica con estrias cruzadas se transfieren a una placa de apareamiento y se incuban a 25 °C para estimular el inicio del apareamiento entre las cepas. Luego de dos días, las células en las placas de apareamiento se transfieren nuevamente a un terciopelo estéril en un bloque de placas réplica y luego se transfieren a placas de medio mínimo. Estas placas se incuban a 30 °C durante tres días para permitir el crecimiento selectivo de colonias de cepas diploides prototróficas . Las colonias que surgieron se eligen y se estrían sobre una segunda placa de medio mínimo para aislar la única colonia y purificar cada cepa diploide. Luego las líneas celulares diploides resultantes se examinan para determinar la producción de anticuerpos.
Las supuestas cepas diploides se prueban para demostrar que son diploides y que contienen ambos vectores de expresión para la producción de anticuerpos. Para la diploidia, las muestras de una cepa se propagan en placas de apareamiento para estimularlas a someterse a meiosis y formar esporas. Los productos de esporas haploides se recogen y se prueben para determinar el fenotipo. Si un porcentaje significativo de los productos de espora resultantes son auxótrofos simples o dobles, se puede concluir que la cepa original debe haber sido diploide. Las cepas diploides se examinan para determinar la presencia de ambos genes de anticuerpo extrayendo el ADN genómico de cada uno y utilizando este ADN en reacciones PCR especificas para cada gen.
Fusión de cepas haploides que sintetizan una única cadena de anticuerpo y selección de derivados diploides que sintetizan anticuerpos funcionales tetraméricos . Como una alternativa al procedimiento de apareamiento descrito anteriormente^ los cultivos individuales de anticuerpo de cadena simple que producen cepas haploides de adel y ura3 se someten a esferoplasto y sus esferoplastos resultantes se fusionan usando polietilenglicol/CaCl2 - Las cepas haploides fusionadas luégo se colocan en agar que contiene 1 M de sorbitol y un medio mínimo para permitir que las cepas diploides regeneren su 'pared celular y desarrollen colonias visibles. Las colonias resultantes se recogen del agar y se estrian en una placa de medio mínimo y las placas se incuban durante dos días a 30 °C para generar colonias a partir de células únicas de líneas celulares diploides. Las supuestas líneas celulares diploides resultantes luego se examinan para determinar la diploidía y la producción de anticuerpo como se describió anteriormente.' Purificación y análisis de anticuerpos. Se deriva una cepa diploide para la producción de anticuerpo de longitud total a través del apareamiento de la cadena ligera metí y la 'cadena pesada lys3 usando los métodos descritos anteriormente. Los medios de cultivo de los cultivos del frasco agitador o termentador de cepas de expresión diploide de P. pastoris se recogen y examinan para determinar la presencia de la proteína de anticuerpo a través de SDS-PAGE e inmunotransferencia, usando anticuerpos dirigidos contra cadenas pesadas y ligeras de IgG humana o específicamente contra la cadena pesada de IgG.
Para purificar los anticuerpos secretados de levadura, los medios clarificados de cultivos que producen anticuerpo se pasan a través de una columna de proteína A y luego de lavarse con 20 mM de fosfato de sodio a pH 7.0 y tampón de unión, la proteína unida a la proteína A se eluye usando 0.1 M de tampón de glicina HC1, pH 3.0. Las fracciones que contienen la mayoría total de proteínas se examinan mediante SDS-PAGE teñido con azul de Coomasie e inmunotransferencia para proteínas de anticuerpos. El anticuerpo se caracteriza usando el ELISA descrito anteriormente para reconocimiento de IL-6.
Ensayo de actividad de anticuerpo El anticuerpo recombinante derivado de levadura se evalúa para determinar la actividad funcional a través del ensayo de proliferación celular T1165 conducido por IL-6 y el ensayo de haptoglobina HepG2 estimulada con IL-6 descritos anteriormente.
Ejemplo 9 Neutralización de la respuesta en fase aguda mediante administración intravenosa de Abl de anticuerpo- anti- La IL-6 humana puede provocar una respuesta de fase- aguda en ratas y una de las proteínas de fase aguda más relevantes que se estimula en la rata es la macroglobulina á-2 (A2M) . Se diseñó un estudio para evaluar la dosis de anticuerpo Abl requerida para erradicar la respuesta de A2M a una única inyección s.c. de 100 µg de IL-6 humana administrada una hora después de las diferentes dosis (0.03, 0.1, 0.3, 1 y 3 mg/kg) del anticuerpo Abl administrado de forma intravenosa (n=10 ratas/nivel de dosis) o IgGl humana policlonal como control (n=10 ratas) . Se recuperó el plasma y la A2M se cuantificó mediante un kit intercalado de ELISA comercial (ICL ¡Inc., Newberg OR; cat . no . - E-25A2M) . El criterio de valoración fue la diferencia en la concentración de A2M en plasma en el punto de la hora 24 (luego de Abl) . Los resultados se muestran en la Figura 4.
La ID50 para el anticuerpo Abl fue de 0.1 mg/kg con supresión completa de la respuesta de A2M a 0.3 mg/kg. Esto establece firmemente que la neutralización in vivo de la IL-6 humana puede lograrse mediante el anticuerpo Abl.
Ejemplo 10 Estudio modelo 1 de caquexia RXF393 Introducción La linea celular de cáncer renal humano, RXF393, produce una gran pérdida de peso al transplantarse a ratones lampiños atimicos. La pérdida de peso comienza alrededor del dia 15 luego del transplante y el 80% de los animales pierden al menos el 30% del peso corporal total alrededor de los dias .18-20 luego del transplante. La RXF393 secreta la IL-6 humana, y la concentración de IL-6 humana en plasma en estos animales és muy alta, alrededor de 10 ng/mL. La IL-6 humana puede unir el receptor de IL-6 soluble murino y activar las respuestas de IL-6 en el ratón. La IL-6 humana es aproximadamente 10 veces menos potente que la IL-6 murina en la activación de respuestas de IL-6 en el ratón. Los objetivos de este estudio fueron determinar el efecto del anticuerpo Abl en los parámetros de supervivencia, peso corporal, proteina A amiloide sérica, hematología y crecimiento tumoral en ratones lampiños atímicos transplantados con la línea celular de cáncer renal humano RXF393.
Métodos A ochenta ratones lampiños atímicos macho de 6 semanas de edad se les implantaron fragmentos de tumor RXF393 (30-40 mg) de forma subcutánea en el lado derecho. Los animales luego se dividieron en ocho grupos de diez ratones. A tres grupos se les dio 3 mg/kg, 10 mg/kg o 30 mg/kg de anticuerpo Abl de forma intravenosa semanalmente el día 1, día 8, día 15 y día 22 luego del transplante (grupos de evolución) . A otros tres grupos se les dio 3 mg/kg, 10 mg/kg o 30 mg/kg de anticuerpo Abl de forma intravenosa semanalmente el día 8, día 15 y día 22 luego del transplante (grupos de regresión) . Finalmente, a un grupo de control se le dio 30 mg/kg de IgG humano policlonal y a un segundo grupo de control se le dio solución salina tamponada con fosfato de forma intravenosa semanalmente el día 1, el día 8, día 15 y día 22 luego del transplante.
Los animales se sometieron a eutanasia el día 28, cuando el tumor alcanzó los 4,000 mm3 o cuando se debilitaron (>30% de pérdida de peso corporal) . Los animales se pesaron en los, días 1 y 6 y luego diariamente desde el día 9 al 28 luego del transplante. Se usó el promedio de porcentaje de peso corporal (MPBW) como parámetro principal para controlar la pérdida de peso durante el estudio. Se calculó de esta manera: (peso corporal-peso del tumor) /peso corporal de referencia x 100. El peso del tumor se midió en los días 1, 6, 9, 12, 15, 18, 22, 25 y 28 luego del transplante. Bajo anestesia se extrajo sangre de cinco ratones en cada grupo en los días 5 y 13 y cuando los diez ratones en cada grupo se sometieron a eutanasia (en la mayoría de los casos el día 28) . Se analizó la sangre para determinar la concentración de proteína A amiloide hematológica y sérica (SAA) . A un grupo adicional de 10 ratones lampiños atímicos de 6 semanas de edad sin tumor se le extrajeron muestras de sangre para estimar la concentración hematológica y de SAA para actuar como conjunto de valores de referencia.
Resultados - Supervivencia No se sometieron a eutanasia ni murieron animales en ningún grupo de anticuerpo Abl antes de la fecha de finalización del estudio en el día 28. En dos de los grupos de control, 15 animales (7/9 en el grupo de IgG humana policlonal y 8/10 en el grupo de solución salina tamponada con fosfato) se encontraron muertos o fueron sometidos a eutanasia debido ' a gue estaban muy debilitados (>30% de pérdida de peso corporal) . El tiempo medio de supervivencia en ambos grupos de control fue de 20 días.
Las curvas de supervivencia para los dos grupos de control y los grupos de evolución del anticuerpo Abl (dosificados a partir del día 1 del estudio) se presentan en la Figura 5.
Las curvas de supervivencia de los dos grupos de control y los grupos de regresión del anticuerpo Abl (dosificados a partir del día 8 del estudio) se presentan en la Figura 6.
Hubo una diferencia estadísticamente significativa entre las curvas de supervivencia de los grupos de control de IgG humana policlonal (p=0.0038) y de solución salina tamponada con fosfato (p=0.0003) y la curva de supervivencia de los seis grupos del anticuerpo Abl. No hubo ninguna diferencia estadísticamente significativa entre los dos grupos de control (p=0.97) .
Resultados - Tamaño del tumor El tamaño del tumor en los ratones supervivientes se estimó por palpación. En los primeros 15 días del estudio, ninguno de los ratones de ningún grupo se encontró muerto , ni se sometió a eutanasia y por tanto la comparación de tamaños de tumor entre grupos en estos días estuvo libre de sesgos de muestreo. No se observó diferencia alguna en el tamaño del tumor entre los grupos de evolución o regresión del anticuerpo Abl y los grupos de control hasta el día 15. No se realizó una comparación de los tamaños de tumor entre los ratones supervivientes en los grupos de control y tratamiento luego del comienzo de la mortalidad en los controles (el día 15), : dado que el tamaño del tumor en ratones de control supervivientes estaba supuestamente sesgado y por lo tanto los resultados de esa comparación no serian significativos.
Como la administración del anticuerpo Abl promovió la supervivencia sin reducción aparente del tamaño del tumor, la IL-6 sérica elevada puede contribuir a la mortalidad mediante mecanismos independientes de crecimiento tumoral. · Estas observaciones avalan la hipótesis de que el anticuerpo Abl puede promover la supervivencia del paciente con cáncer sin afectar directamente el crecimiento tumoral, posiblemente potenciando el bienestar general del paciente.
Resultados - Pérdida de peso El promedio del porcentaje de peso corporal (MPBW) (? SEM) contra el tiempo se muestra en la Figura 27. En comparación con los controles, los ratones dosificados con Abl se protegieron contra la pérdida de peso. El dia 18, el MPBW en ratones de control era de 75%, correspondiente a una pérdida de' peso promedio del 25%. En contraste, el mismo dia, el MPBW en grupos de tratamiento con Ab-1 había cambiado mínimamente (entre 97% y 103%). Hubo una diferencia estadísticamente significativa ientre las curvas de MPBW en los controles (que reciben IgG humana policlonal o PBS) y el de grupo de 10 mg/kg de dosificación (p<0.0001) o los grupos de dosificación de 3 mg/kg y 30 mg/kg (p<0.0005) . No hubo ninguna diferencia estadísticamente significativa entre los dos grupos de control.
Las fotografías representativas de los ratones de control y tratados con Abl (Figura 28) ilustran la condición demacrada de los ratones de control comparados con la apariencia normal del ratón tratado con Abl al final del estudio (nótense los sitios de tumor visibles externamente en el lado derecho) .
Estos resultados sugieren que el Abl puede ser útil para prevenir o tratar la caquexia causada por una IL-6 elevada en humanos .
Resultados - Plasma amiloide sérica A La concentración promedio en plasma amiloide sérica A (+ SEM) contra el tiempo en los dos grupos de control y los grupos de evolución (dosificados desde el día 1 del estudio) y de regresión (dosificados desde el día 8 del estudio) del anticuerpo Abl se presentan en la Tabla 5 y gráficamente en la Figura 32.
Tabla 5: Plasma promedio SAA-anticuerpo Abl, todos los grupos contra los grupos de control Plasma Plasma Plasma promedio promedio promedio SAAiSEM Día 5 SAAiSEM Día 13 SAAISEM ( g/ml) ( g/ml) hemorragia terminal IgG 675 ± 240 3198 ± 628 13371 ± policlonal iv (n=5) (n=4) 2413 (n=4) semanalmente desde el día 1 PBS iv 355 i 207 4844 ± 15826 ± semanalmente (n=5) 1126 (n=5) 802 (n=3) desde el día 1 Abl 30 246 ± 100 2979 ± 170 841 ± 469 mg/kg iv (n=5) (n=5) (n=10); semanalmente desde el día 1 Abl 10 3629 i 624 3096 ± 690 996 ± 348 mg/kg iv (n=5) (n=5) (n=10) semanalmente desde el día 1 Abl 3 106 ± 9 1623 ± 595 435 ± 70 mg/kg iv (n=5) (n=4) (n=9) semanalmente desde el día 1 Abl 30 375 ± 177 1492 ± 418 498 ± 83 mg/kg iv (n=5) (n=4) (n=9) semanalmente desde el día 8 Abl 10 487 ± 170 1403 ± 187 396 ± 58 mg/kg iv (n=5) (n=5) (n=10) ' semanalmente desde el día 8 Abl 3 1255 ± 516 466 ± 685 ±: 350 mg/kg iv (n=5) 157 (n=5) (n=5) semanalmente desde el día 8 El SAA se sobre-regula a través de la estimulación de hlL-6 y esta respuesta se correlaciona directamente con los niveles circulantes de hIL-6 derivados del tumor implantado. El marcador sustituto proporciona una lectura indirecta de la hlL-6 activa. Por lo tanto, en los dos grupos de tratamiento descritos anteriormente existen niveles significativamente disminuidos de SAA debido a la neutralización de la hIL-6 derivada de un tumor. Esto avala adicionalmente el argumento de que el anticuerpo Abl muestra eficacia in vivo.
Ejemplo 11 Estudio modelo 2 de caquexia RXF393 Introducción Se realizó un segundo estudio en el modelo de caquexia RXF-393 donde el tratamiento con el anticuerpo Abl comenzó en una etapa posterior (dias 10 y 13 luego del transplante) y con una fase de tratamiento más prolongada (hasta 49 dias luego del transplante) . El intervalo de dosificación con el anticuerpo Abl se acortó a 3 dias de 7 y también se midió el consumo diario de alimentos. También hubo un intento de estandarizar los tamaños de tumor al momento de iniciar la dosificación con el anticuerpo Abl.
Métodos A ochenta ratones lampiños atimicos macho de 6 semanas de edad se les implantaron fragmentos de tumor RXF393 (30-40 mg) de forma subcutánea en el lado derecho. Se seleccionaron 20 ratones cuyos tumores hablan alcanzado entre 270-320 mg de tamaño y se dividieron en dos grupos. Un grupo recibió el anticuerpo Abl a 10 mg/kg i.v. cada tres dias y el otrc grupo recibió 10 mg/kg de IgG humana policonal cada 3 dias desde ese momento (dia 10 luego del transplante) . Se seleccionaron otros 20 ratones cuando su tamaño de tumor había alcanzado 400-527 mg de tamaño y se dividieron en dos grupos. Un grupo recibió el anticuerpo Abl a 10 mg/kg i.v. cada tres días y el otro grupo recibió 10 mg/kg de IgG humana policonal cada 3 días desde ese momento (día 13 luego del transplante) . Los 40 ratones restantes no fueron más parte del estudio y se sometieron a eutanasia el día 49, cuando el tumor alcanzó los 4,000 mm3 o cuando se volvieron muy debilitados (>30% de pérdida de peso corporal ) . : Los animales se pesaron cada 3-4 días a partir del día 1 al día 49 luego del transplante. Se usó el promedio de porcentaje de peso corporal (MPBW) como parámetro principal para controlar la pérdida de peso durante el estudió. Se calculó de esta manera: ( (peso corporal - peso del tumor)/peso corporal de referencia) x 100. El peso del tumor se midió cada 3-4 días a partir del día 5 al día 49 luego del transplante. El consumo de alimentos se midió cada día (cantidad consumida en 24 horas por peso (g) en cada grupo de tratamiento) a partir del día 10 en los grupos tumorales de 270-320 mg y del día 13 en los grupos tumorales de 400-527 mg.
Resultados - Supervivencia Las curvas de supervivencia para el anticuerpo Abl a 10 mg/kg i.v. cada tres días (tamaño del tumor de 270-320 mg) y de 10 mg/kg i.v de la IgG humana policlonal i.v. cada tres días (tamaño del tumor de 270-320 mg) se presentan en la Figura 7.
La supervivencia mediana para el anticuerpo Abl a 10 mg/kg i.v. cada tres días (tamaño del tumor de 270-320 mg) fue ¡de 46 días y para los 10 mg/kg i.v de IgG humana policlonal cada tres días (tamaño del tumor de 270-320 mg) fue de 32.5 días (p=0.0071).
Las curvas de supervivencia para el anticuerpo Abl a 10 mg/kg i.v. cada tres días (tamaño del tumor de 400-527 mg) y para los 10 mg/kg i.v de la IgG humana policlonal cada< tres días (tamaño del tumor de 400-527 mg) se presentan en la Figura 8. La supervivencia mediana para el anticuerpo Abl a 10 mg/kg i.v. cada tres días (tamaño del tumor de 400-527 mg) fue de 46.5 días y para los 10 mg/kg i.v de IgG humana policlonal cada tres días (tamaño del tumor de 400-527 mg) fue de 27 dias (p=0.0481) .
Ejemplo 12 Evaluación de dosificación múltiple farmacocinética de anticuerpo Abl en primates no humanos ; El anticuerpo Abl se dosificó en una única infusión de bolo a un único mono macaco masculino y un único femenino en solución salina tamponada con fosfato. Se eliminaron muestras de plasma en intervalos de tiempo fijos y el nivel de anticuerpo Abl se cuantificó a través del uso de un ensayo ELISA de captura de antigeno. Se capturó la IL-6 (50 DI de 3 ?g/mL) en placas de microtitulación de 96 pocilios recubiertas con estreptavidina . Las placas se lavaron y bloquearon con 0.5% de gelatina de piel de pescado. Las muestras de plasma diluida apropiadamente se agregaron e incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Los sobrenadantes se eliminaron y se aplicó un segundo anticuerpo anti-hFc-HRP conjugado y se dejó a temperatura ambiente.
Las placas luego se aspiraron y se agregó TMB para visualizar la cantidad de anticuerpo. Luego se determinaron los niveles específicos mediante el uso de una curva estándar. Una segunda dosis de anticuerpo Abl se administró el dia 35 a los dos mismos monos macacos y se replicó el experimento usando un plan de muestreo idéntico. Las concentraciones resultantes son entonces gráfico contra tiempo, como se muestra en la Figura 9. anticuerpo aglicosilado humanizado de longitud, total expresado y purificado Pichia pastoris muestra características comparables con la proteina mamifera expresada. Además, las dosis múltiples de este producto muestran semividas reproducibles , lo que infiere que esta plataforma de producción no genera productos que muestran inmunogenicidad mejorada.
Ejemplo 13 Caracterización mecánica del octeto de proteínas de anticuerpo La señalización de IL-6 depende de las interacciones ; entre IL-6 y dos receptores, IL-6R1 (CD126) y gpl30 ; (IL-6 transductora de señales) . Para determinar el mecanismo de acción del anticuerpo, se realizaron estudios mecánicos usando interferometría de biocapas con un instrumento Octet QK (ForteBio; Menlo Park, CA) . Se realizaron estudios en dos configuraciones diferentes. En esta primera orientación, la IL-6 biotinilada (número de partes de sistemas R&D 2Ó6-IL-001MG/CF, biotinilada usando Pierce EZ-link sulfo-NHS-LC-LC-biotina, número de producto 21338 de acuerdo con los protocolos del fabricante) se unió inicialmente a un biosensor recubierto con estreptavidina (número de parte ForteBiol8-5006) . La unión se controla como un aumento de señal.
La IL-6 unida al sensor luego se incubó con el anticuerpo en cuestión o con la solución diluyente sola. El sensor; luego se incubó con una molécula de IL-6R1 soluble (número de producto de sistemas R&D 227-SR-025/CF) . Si la molécula de IL-6R1 no pudo unirse, se entendió que el anticuerpo bloqueaba las interacciones de IL-6/IL-6R1. Estos complejos se incubaron con gpl30 (sistemas R&D 228-GP-010/CF) en presencia de IL-6R1 con fines de estabilidad. Si gpl30 no se unió, se concluyó que el anticuerpo bloqueó las interacciones de gpl30 con IL-6.
En la segunda orientación, el anticuerpo se unió a un biosensor recubierto con un reactivo especifico de Fd IgGl anti-humano (número de parte ForteBiol8-5001) . La IL-6 se unió al anticuerpo inmovilizado y el sensor se incubó con IL-6R1. Si la IL-6R1 no interactuó con la IL-6, entonces se concluyó que el anticuerpo de unión a IL-6 bloqueó las interacciones de IL-6/IL-6R1. En las situaciones en que se observa el anticuerpo/IL-6/IL-6Rl, el complejo se incubó con gpl30 en presencia de IL-6R1. Si gpl30 no interactuó, se concluyó entonces que el anticuerpo bloqueó las interacciones IL-6/gpl30. Todos los estudios se realizaron en un volumen final de 200 DL a 30C y 1000 rpm. Para estos estudios, se diluyeron todas las proteínas usando una muestra de tampón diluyente ForteBio (número de parte 18-5028).
Los resultados se presentan en la Fig. 10 (A-E) y en la Fig. 11.
Ejemplo 14 Mapeo peptídico Para determinar el epítopo reconocido por Abl en la IL-6 humana, se usó el anticuerpo en un ensayo basado en Western blot. La forma de la IL-6 humana utilizada en este ejemplo tuvo una secuencia de 183 aminoácidos de longitud (mostrado a continuación) . Se sintetizó comercialmente una biblioteca de 57 miembros de 15 péptidos de aminoácidos superpuestos que comprende esta secuencia y se unió covalentemente a una membrana de nitrocelulosa PepSpots (JPT Peptide technologies , Berlín, Alemania) . Las secuencias de los péptidos de aminoácidos superpuestos se muestran en la Fig. 12 y corresponden a las SEQ ID NO: 590-646. Las bandas se prepararon y sondaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
En resumen, las bandas se premojaron en metanol, se enjuagaron con PBS y se bloquearon por más de 2 horas en 10% de leche descremada en PBS/0.05% Tween (solución bloqueante:). El anticuerpo Abl se usó en una dilución final de 1 mg/mL y se usó el anticuerpo secundario Anti-Humano-Kappa de ratón conjugado con HRP (Southern BioTech #9220-05) en una dilución de 1:5000. Las diluciones/incubaciones del anticuerpo se realizaron en una solución bloqueante. Las transferencias se realizaron usando reactivos previos de Amersham ECL (GE# RPN2135) y señal quimioluminiscente documentados usando una cámara CCD (Alphalnnotec) . Los resultados de las transferencias se muestran en las Figuras 13 y 14.
La secuencia de la forma de IL-6 humana utilizada para generar una biblioteca de péptidos se establece a continuación: VPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSN CESSKEALAE NNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKI ITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVL IQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQ (SEQ ID NO: 1) . ! Ejemplo 15 Abl tiene afinidad alta para IL-6 Se usó una resonancia de plasmones superficiales para medir la tasa de asociación (Ka) , la tasa de disociación (Kd) y la constante de disociación (KD) de Abl a IL-6 de rata, ratón, perro, humano y mono macaco a 25 °C (Figura 15A) . La constante de disociación de la IL-6 humana fue de 4 pM, lo que indica una afinidad muy alta. Como se esperaba, la afinidad en general disminuyó con la distancia filogenética del humano. Las constantes de disociación de Abl para IL-6 de monos macacos, ratas y ratones fueron de 31 pM, 1.4 nM y 0.4 nM, respectivamente. La afinidad de Abl para IL-6 de perro está por debajo del limite de cuantificación del experimento.
La afinidad alta de Abl para IL-6 de ratón, rata y mono macaco sugiere que el Abl puede usarse para inhibir la IL-6 de estas especies. Esta hipótesis se probó usando un ensayo de proliferación celular. En resumen, cada IL-6 de estas especies se usó para estimular la proliferación de células T1165 y se midió la concentración a la que Abl podía inhibir el 50% de la proliferación (CI50) . La inhibición coincidió con las constantes de disociación medidas (Figura 15B) . Estos resultados demuestran que el Abl puede inhibir la IL-6 nativa de estas especies y sugieren el uso de estos organismos, para realizar modelos in vitro o in vivo de inhibición de\ IL-6 mediante Abl.
Ejemplo 16 Evaluación de dosificación múltiple farmacocinética del anticuerpo Abl en voluntarios humanos sanos.
El anticuerpo Abl se dosificó a voluntarios humanos sanos en una única infusión de bolo en histidina y sorbitol Las dosis de 1 mg, 3 mg, 10 mg, 30 mg o 100 mg se administraron a cada individuo en grupos de dosificación que contenían cinco a seis individuos. Las muestras de plasma se eliminaron en intervalos de tiempo fijos por hasta doce semanas. El plasma humano se recogió a través de venipunción en un tubo de recolección al vacío que contiene EDTA. El plasma se separó y se usó para evaluar los niveles de circulación de Abl usando un anticuerpo monoclonal específico para Abl, como sigue. Se recubrió una placa de microtitulación de 96 pocilios durante la noche con el anticuerpo monoclonal específico para Abl en IX de PBS durante la noche a 4 °C. Las etapas restantes se realizaron a temperatura ambiente. Los pocilios se aspiraron y se bloquearon posteriormente usando 0.5% de gelatina de piel de pescado (FSG) (Sigma) en IX de PBS durante 60 minutos. Las muestras de plasma humano luego se agregaron e incubaron durante 60 minutos, luego se aspiraron, posteriormente se agregaron 50 µL de 1 ug/mL de IL-6 biotinilada a cada pocilio y se incubaron durante 60 minutos. Los pocilios se aspiraron y se agregaron 50 µL de estreptavidina-HRP (Pharmingen) diluidos 1:5,000 en 0.5% FSG/PBS y se incubaron durante 45 minutos. El desarrollo se realizó usando métodos estándar empleando TMB para detección. Los niveles luego se determinaron mediante comparación con una curva estándar preparada en un formato comparable .
La concentración de Abl en plasma promedio para cada grupo de dosificación versus tiempo se muestra en la Figura 16. Los promedios de AUC y Cmax se aumentaron de forma lineal con la dosificación (Figuras 17 y 18, respectivamente) . Para dosis de 30 mg y más, el promedio de la semivida de Abl en cada grupo de dosificación fue aproximadamente de entre 25 y 30 días (Figura 19) .
Ejemplo 17 Farmacocinética Abl en pacientes con cáncer avanzado El anticuerpo Abl se dosificó en una única infusión de bolo en solución salina tamponada con fosfato a cinco individuos con cáncer avanzado. Cada individuo recibió una dosis de 80 mg (n=2) o 160 mg (n=3) de Abl. Las muestras de plasma se extrajeron semanalmente y el nivel de anticuerpo Abl se cuantificó como en el Ejemplo 16.
La concentración de Abl en plasma promedio en '. estos individuos como función del tiempo se muestra en la Figura 20. El promedio de semivida de Abl fue de aproximadamente 31 días.
Ejemplo 18 Semivida de Abl sin precedentes En general, la semivida promedio de Abl fue de aproximadamente 31 días en humanos (para dosificaciones de 10 mg y más) y de aproximadamente 15-21 días en monos macacos. La semivida de Abl en humanos y monos macacos no tiene precedentes cuando se compara con la semivida de otros anticuerpos anti-IL-6 (Figura 21) . Como se describió anteriormente, el Abl se derivó de la humanización de un anticuerpo de conejo y se produce a partir de Pichia pastoris en forma aglicosilada . Estas características dan como resultado un anticuerpo con muy poca inmunogenicidad en humanos. Además, la falta de glicosilación evita que el Abl interactúe con el receptor o complemento de Fe. Sin ánimo de limitarse a la teoría, se cree que la semivida de Abl sin precedentes es al menos parcialmente atribuible a la humanización y/o a la falta de glicosilación. La secuencia y/o la estructura particular de las superficies de unión al antígeno también pueden contribuir a la semivida de Abl.
Ejemplo 19 Efecto de Abl en la concentración de hemoglobina, la concentración de lípidos en plasma y los conteos de neutrófilos en pacientes con cáncer avanzado El anticuerpo Abl se dosificó en una única infusión de bolo en solución salina tamponada de fosfato a ocho individuos con cáncer avanzado (NSCLC, cáncer colorrectal, colangiocarcinoma, o mesotelioma) . Cada individuo recibió una dosis de 80 mg, 160 mg, o 320 mg de Abl. Se extrajeron muéstras de sangre antes de la infusión y a intervalos de tiempo fijos durante seis semanas, y se determinaron la concentración de hemoglobina, la concentración de lipidos en plasma y los conteos de neutrófilos. La concentración promedio de hemoglobina aumentó levemente (Figura 22), asi como el colesterol total y los triglicéridos (Figura 23), mientras que los conteos promedio de neutrófilos disminuyeron levemente (Figura 24) .
Estos resultados demuestran adicionalmente algunos de los efectos beneficiosos de la administración de Abl a individuos con enfermedades crónicas. Debido a que la IL-6 es la principal citocina responsable de la anemia en enfermedades crónicas (incluida la anemia relacionada con el cáncer) , la neutralización de la IL-6 mediante Abl aumenta la concentración de hemoglobina en estos individuos. De manera similar, debido a que la IL-6 es muy importante en el aumento de los conteos de neutrófilos en la inflamación, la leve reducción observada en los conteos de neutrófilos confirma adicionalmente que el Abl inhibe la IL-6. Finalmente, la IL-6 causa anorexia asi' como caquexia en estos pacientes; la neutralización de IL-6 mediante Abl hace que se recupere el apetito y se revierta la caquexia. El incremento de las concentraciones de lipidos en plasma refleja el estado nutricional mejorado de los pacientes. En su conjunto, estos resultados demuestran adicionalmente que él Abl revierte de forma eficaz estas consecuencias adversas de la IL-6 en estos pacientes.
Ejemplo 20 El Abl suprime la CRP en suero en voluntarios sanos y en pacientes con cáncer avanzado Introducción Las concentraciones de CRP en suero han sido descritas como un fuerte indicador pronóstico en pacientes con algunas formas de cáncer. Por ejemplo, Hashimoto et al. llevó a cabo un análisis univariado y multivariado de concentraciones de CRP en suero preoperatorias en pacientes con carcinoma hepatocelular para identificar factores que afectan la supervivencia y la recurrencia de la enfermedad (Hashimoto, K. , et al., Cáncer, 103 (9) : 1856-1864 (2005)). Se clasificó a los pacientes en dos grupos, aquellos con niveles de CRP en suero > 1.0 ¿ng/dL ("grupo con CRP positiva") y aquellos con niveles de CRP en suero < 1.0 mg/dL ("grupo con CRP negativa") . Los autores describieron "una correlación importante entre el nivel de CRP en suero preoperatorio y el tamaño del tumor". Id. Adicionalmente, los autores encontraron que "[l]as tasas de supervivencia general y supervivencia sin recurrencia en el grupo con CRP positiva fueron significativamente más bajas en comparación con las tasas del grupo con CRP negativa" . Id'. Los autores concluyeron que el nivel de CRP preoperatorio de los pacientes es un importante indicador predictivo independiente de mala prognosis y recurrencia temprana en pacientes con carcinoma hepatocelular.
Otros investigadores han identificado correlaciones similares. Por ejemplo, Karakiewicz et al. determinaron que la CRP en suero era un indicador independiente e informativo de la mortalidad especifica del carcinoma de células renales (Karakiewicz, P.I., et al., Cáncer, 110 ( 6) : 1241-1247 (2007)). Por consiguiente, sigue habiendo necesidad en la técnica de métodos y/o tratamientos que reduzcan las concentraciones de proteina C-reactiva (CRP) en suero en pacientes con cáncer y, particularmente, en aquellos con cánceres avanzados.
Métodos Los voluntarios sanos recibieron una única infusión intravenosa (IV) de 1 hora de 100 mg (5 pacientes), 30 mg (5 pacientes), 10 mg (6 pacientes), 3 mg (6 pacientes) o 1 mg (6 pacientes) del anticuerpo monoclonal Abl, mientras que otros 14 voluntarios sanos recibieron placebo intravenoso. De manera comparativa, 2 pacientes con formas avanzadas de cáncer colorrectal recibieron una única infusión intravenosa (IV)¡ de 1 hora de 80 mg del anticuerpo monoclonal Abl. No se administraron dosis adicionales del anticuerpo monoclonal Abl a la población de prueba.
Los pacientes se evaluaron antes de la administración de la dosis y a partir de ese momento semanalmente durante al menos 5 semanas luego de la dosis. Al momento de; cada evaluación, se analizó la concentración de CRP en suero en los pacientes.
Resultados Voluntarios sanos Como se mencionó anteriormente, los niveles de CRP en suero son un marcador de inflamación, por consiguiente, los niveles de CRP de referencia son típicamente bajos en los individuos sanos. Los niveles de CRP de referencia bajos pueden hacer que sea difícil de detectar una reducción adicional en los niveles de CRP . No obstante, se detectó una reducción considerable de las concentraciones de CRP en suero en voluntarios sanos que recibieron todas las concentraciones del anticuerpo monoclonal Abl, en comparación con los controles (Figura 25) . La reducción de los niveles de CRP en suero fue rápida, ocurrió al cabo de una semana de administración del anticuerpo y se prolongó al menos hasta que se realizó la medición final (8 o 12 semanas a partir de la administración del anticuerpo) .
Pacientes con cáncer A cinco pacientes con cáncer avanzado (cáncer colorrectal, colangiocarcinoma o NSCLC) con niveles elevados de CRP en suero se les dosificaron 80 mg o 160 mg de Abl. Los niveles de CRP en suero se redujeron en gran medida en estos pacientes (Figura 26A) . La reducción de los niveles de CRP en suero fue rápida, 90% de reducción ocurrió dentro de una semana a partir ; de la administración de Abl y se prolongó al menos hasta que se realizó la medición final (hasta doce semanas) . En la Figura 26B se muestran los niveles de CRP de dos individuos representativos. En esos individuos, los niveles de CRP se disminuyeron por debajo del rango de referencia normal (menos de 5 - 6 mg/1) dentro de una semana. Por consiguiente, la administración de Abl a pacientes con cáncer avanzado <puede causar una supresión rápida y sostenida de los niveles de CRP en suero.
Ejemplo 21 El Abl mejoró la fuerza muscular, mejoró el peso y redujo la fatiga en pacientes con cáncer avanzado Introducción La pérdida de peso y la fatiga (acompañadas por debilidad muscular) son síntomas muy comunes en pacientes con formas avanzadas de cáncer y estos síntomas pueden empeorar a medida que el cáncer avanza. La fatiga, la pérdida de peso: y la debilidad muscular pueden tener efectos negativos considerables en la- recuperación de los pacientes con formas avanzadas de cáncer, por ejemplo, alterar estilos de vida y relaciones y afectar la voluntad o la capacidad de los pacientes de continuar tratamientos contra el cáncer. Los métodos conocidos para abordar la fatiga, la pérdida de peso y la debilidad muscular incluyen rutinas regulares de entrenamiento y ejercicios, métodos para conservar la energía de los pacientes y tratamientos que abordan la fatiga inducida por anemia y la debilidad muscular. No obstante, sigue habiendo necesidad en la técnica de métodos y/o tratamientos para mejorar la fatiga, la pérdida de peso y la debilidad muscular en pacientes con cáncer.
Métodos Cuatro pacientes con formas avanzadas de cáncer (cáncer colorrectal (2), NSCLC (1), colangiocarcinoma (1)) recibieron una única infusión intravenosa (IV) de 1 hora de 80 mg o 1:60 mg del anticuerpo monoclonal Abl . No se administraron dosis adicionales del anticuerpo monoclonal Abl a la población de prueba .
Los pacientes se evaluaron antes de la administración de la dosis y a partir de ese momento durante al menos 6 semanas luego de la dosis. Al momento de cada evaluación, se analizó a los pacientes para determinar lo siguiente: a.) cualquier cambio en el peso, b.) fatiga medida usando el cuestionario de la subescala de fatiga Facit-F, una prueba reconocida a nivel médico para evaluar la fatiga (Véase, por ejemplo, Celia, D., Lai, J.S., Chang, C.H., Peterman, A., & Slavin, M . (2002) . Fatigue in cáncer patients compared with fatigue in the general population. Cáncer, 94(2), 528-538; Celia, D. , Eton, . D.T., Lai, F J-S., Peterman, A.H & Merkel, D.E. (2002) . Combining anchor and distribution based methods to derive minimal clinically important differences on the Functional Assessment of Cáncer Therapy anemia and fatigue scales. Journal of Pain & Symptom Management, 24 (6) 547-561.) y la fuerza de pr nsión (una prueba reconocida a nivel médico para evaluar la fuerza muscular, típicamente empleando un dinamómetro de prensión) .
Resultados Cambio en el peso Los datos promediados para ambas concentraciones del dosis (80 mg y 160 mg) del anticuerpo monoclonal Abl demostraron un aumento de aproximadamente 2 kilogramos de peso por paciente durante el periodo de 6 semanas (Figura 29) .
Fatiga Los datos promediados para ambas concentraciones de dosis (80 mg y 160 mg) del anticuerpo monoclonal Abl demostraron un aumento en el resultado medio de la subescala de Facit-F FS de al menos aproximadamente 10 puntos en la población de pacientes durante el periodo de 6 semanas (Figura 30) .
Fuerza de prensión Los datos promediados para ambas concentraciones de dosis (80 mg y 160 mg) del anticuerpo monoclonal Abl demostraron un aumento en la fuerza de prensión media de al menos aproximadamente 10 por ciento en la población de pacientes durante el periodo de 6 semanas (Figura 31) . ! ; Ejemplo 22 Abl para la prevención de la trombosis Estudios previos han mostrado que la administración de un anticuerpo anti-IL-6 puede dar como resultado conteos de plaquetas disminuidos. Emilie, D. et al., Blood, 84(8):2472-9 (1994); Blay et al., Int J Cáncer, 72(3):424-30 (1997). Estos resultados, aparentemente, se han visto como un indicador del peligro potencial, debido a que las disminuciones adicionales de los conteos de plaquetas podrían ocasionar complicaciones como hemorragias. No obstante, los solicitantes ahora han apreciado que la inhibición de la IL-6 restaura un perfil de coagulación normal, lo que dichos solicitantes prevén que evitará la trombosis. Los conteos de plaquetas disminuidbs que resultan de la inhibición de la IL-6 no representan un signo de peligro potencial sino más bien reflejan la restauración beneficiosa de la coagulación normal.
El mecanismo mediante el cual se restaura la coagulación normal se cree que resulta de la interacción entre la IL-6 y la reacción de fase adecuada. En respuesta a los niveles de IL-6 elevados como, por ejemplo, en un paciente con cáncer, el hígado produce proteínas de fase aguda. Estas proteínas dé fase aguda incluyen factores de coagulación como el Factor ÍI, el Factor V, el Factor VIII, el Factor IX, el Factor XI, el Factor XII, los productos de la degradación de la F/fibrina, el complejo de trombina-antitrombina III, fibrinógenos, plasminógenos, protrombinas y factor de von Willebrand. Este aumento en los factores de coagulación se puede medir de 'forma directa o se puede inferir de las mediciones funcionales ; de la capacidad de coagulación. Los antagonistas de IL-6 como Abl suprimen las proteínas de fase aguda, por ejemplo, Amiloide A Sérica (véase la Figura 32 y el Ejemplo 10) . Los solicitantes ahora prevén que esta supresión de proteínas de fase , aguda restaurará el perfil de coagulación normal y, por lo tanto, prevendrá la trombosis. La restauración de la coagulación normal puede causar un leve descenso en los conteos de plaquetas, pero el paciente, no obstante, mantendrá la capacidad de coagulación normal y, por lo tanto, no presentará un riesgo aumentado de hemorragia. Tal tratamiento representará una vasta mejora con respecto a las terapias anticoagulación disponibles cuya utilidad está limitada por el riesgo de efectos secundarios adversos como hemorragia importante.
Los solicitantes contemplan que se obtendrán los mismos efectos beneficiosos de la inhibición de la IL-6 independientemente del método de inhibición. Los métodos de inhibición de la IL-6 adecuados incluyen la administración de anticuerpos anti-IL-ß, terapias antisentido, receptor de' IL-6 soluble, etc., de forma individual o en combinaciones.
Ejemplo 23 El Abl aumenta la concentración de albúmina en plasma en pacientes con cáncer avanzado Introducción Las concentraciones de albúmina en suero son reconocidas como indicadores predictivos de supervivencia y/o éxito en la recuperación en pacientes con cáncer. La hipoalbumineniá tiene una fuerte correlación con una mala evolución del paciente en diversas formas de cáncer. Por ejemplo, en un estudio !ningun paciente sometido a quimioterapia sistémica por adenocarcinoma pancreático metastásico y con niveles de albúmina en^ suero menores a 3.5 g/dL respondió de forma satisfactoria1 a la quimioterapia sistémica (Fujishiro, M., et al., Hepatogastroenterology, 47 (36) : 1744-46 (2000)). Los áutores concluyen que "[placientes con ... hipoalbuminemia ... podrían ser candidatos inapropiados para la quimioterapia sistémica y podrían tratarse con otros enfoques experimentales o cuidados paliativos". Id.
De manera similar, Sénior y Maroni expresan que ; "[l]a reciente apreciación acerca de que la hipoalbuminemia ; es el indicador más poderoso de la mortalidad en enfermedades renales en etapa terminal destaca la importancia crítica de asegurar el consumo adecuado de proteínas para esta población de pacientes". (J.R. Sénior and B.J. Maroni, Am. Soc. Nutr. Sci., 129: 313S-314S (1999)).
En al menos un estudio, los intentos por rectificar la hipoalbuminemia en 27 pacientes con cáncer metastásico mediante la infusión de albúmina intravenosa diaria de 20 g hasta que se alcanzaron los niveles de albúmina en suero normales (>3.5 g/dL) no tuvieron mucho éxito. Los autores mencionan que "[l]a infusión de albúmina en pacientes con cáncer en etapa avanzada tiene valor limitado en la práctica clínica. Los pacientes con PS 4 e hipoalbuminemia tienen una peor prognosis". (Demirkazik, A., et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 21:Abstr 2892 (2002)).
Por consiguiente, sigue habiendo necesidad en la técnica de métodos y/o tratamientos que mejoren las concentraciones de albúmina en suero en pacientes con cáncer y que se ocupen de estados hipoalbuminémicos en pacientes con cáncer, particularmente, aquellos con cánceres avanzados.
Métodos Cuatro pacientes con formas avanzadas de cáncer (cáncer colorrectal (2), NSCLC (1), colangiocarcinoma (1)) recibieron una única infusión intravenosa (IV) de 1 hora de 80 mg o 160 mg del anticuerpo monoclonal Abl. No se administraron ; dosis adicionales del anticuerpo monoclonal Abl a la población de prueba .
Los pacientes se evaluaron antes de la administración de la dosis y a partir de ese momento durante al menos 6 semanas luego de la dosis. Al momento de cada evaluación, se analizó la concentración de albúmina en plasma en los pacientes.
Resultados Los datos promediados para ambas concentraciones de dosificación (80 mg y 160 mg) del anticuerpo monoclonal Abl demostraron un aumento de aproximadamente 5 g/L de concentración de albúmina en plasma por paciente durante el periodo de 6 semanas (Figura 33) .
Ejemplo 24 El Abl suprime la CRP en suero en pacientes con cáncer avanzado Introducción ! Las concentraciones de CRP en suero han sido descritas como un fuerte indicador pronóstico en pacientes con algunas formas de cáncer. Por ejemplo, Hashimoto et al. llevaron á cabo un análisis univariado y multivariado de concentraciones de CRP en suero preoperatorias en pacientes con carcinoma hepatocelular para identificar factores que afectan la supervivencia y la recurrencia de la enfermedad (Hashimoto1, K. , et al., Cáncer, 103 ( 9 ): 1856-1864 (2005)). Se clasificó a los pacientes en dos grupos, aquellos con niveles de CRP en suero > 1.0 mg/dL ("grupo con CRP positiva") y aquellos con niveles de CRP en suero < 1.0 mg/dL ("grupo con CRP negativa"). Los autores describieron "una correlación importante entre el nivel de CRP en suero preoperatorio y el tamaño del tumor". Id. Adicionalmente, los autores encontraron que "[l]as tasas de supervivencia general y supervivencia sin recurrencia . en el grupo con CRP positiva fueron significativamente más bajas en comparación con las tasas del grupo con CRP negativa". Id. Los autores concluyeron que el nivel de CRP preoperatorio en pacientes es un indicador predictivo importante e independiente de mala prognosis y recurrencia temprana en pacientes con carcinoma hepatocelular .
Otros investigadores han identificado correlaciones similares. Por ejemplo, Karakiewicz et al. determinaron que la CRP en suero era un indicador independiente e informativo de la mortalidad especifica del carcinoma de células renales (Karakiewicz, P.I., et al., Cáncer, 110 ( 6) : 1241-1247 (2007)). Por consiguiente, sigue habiendo necesidad en la técnica de métodos y/o tratamientos que reduzcan las concentraciones de proteina C-reactiva (CRP) en suero en pacientes con cáncer y, particularmente, en aquellos con cánceres avanzados.
Métodos Se dividieron ciento veinticuatro pacientes con cáncer de pulmón no microcitico (NSCLC) en 4 grupos de tratamiento. Los pacientes de un grupo recibieron una infusión intravenosa (IV) de 1 hora de placebo (n=31), 80 mg (n=29) , 160 mg (n=32) o 320 mg (n=32) del anticuerpo monoclonal Abl cada 8 semanas durante 24 semanas en un total de 3 dosis. La concentración de CRP se cuantificó mediante un ensayo inmunoturbidimétrico potenciado con partículas de proteína C-reactiva usando anticuerpos anti-CRP unidos con látex (es decir, Roche CRP Tinaquant®) . En resumen, se recogió aproximadamente 1.0 mL del suero de muestra de los pacientes y se almacenó en un tubo de recolección de plástico. La muestra se colocó en un tampón adecuado , y el anticuerpo anti-CRP acoplado a micropartículas de látex se agregó a una muestra para comenzar la reacción. Estos anticuerpos anti-CRP con micropartículas de látex conjugadas reaccionan con antígenos en la muestra para formar un complejo de antígeno/anticuerpo . Luego de la aglutinación, esto se 'midió de forma turbidimétrica usando un analizador Roche/Hitachi Modular P.
Los pacientes fueron evaluados antes de la administración de la dosis y, a partir de entonces, en las semanas 2, 4,' 8 y 12. Al momento de cada evaluación, se analizó la concentración de CRP en suero de los pacientes.
Resultados Los datos promediados para cada concentración de dosis (placebo, 80 mg, 160 mg y 320 mg) del anticuerpo monoclorial Abl se graficaron en la Figura 38. Todos los niveles de dosis del anticuerpo Abl demostraron una caída inmediata en las concentraciones de CRP con relación al placebo durante un período de 12 semanas. Los niveles de CRP mostraron avances al cabo de 8 semanas luego de la dosis. Los niveles de CRP cayeron por debajo de 5 mg/L en la semana 12. Los valores promedio de CRP demostraron disminuciones rápidas y sostenidas para todas las concentraciones de dosis con relación al placebo (Figura 39) . Por consiguiente, la administración de Abl a pacientes con cáncer avanzado puede causar una supresión rápida y sostenida de los niveles de CRP en suero.
Ejemplo 25 El Abl suprime la CRP en suero en pacientes con cánceres avanzados Introducción Las concentraciones de CRP en suero han sido descritas como un fuerte indicador pronóstico en pacientes con algunas formas de cáncer. Por ejemplo, Hashimoto et al. llevaron a cabo un análisis univariado y multivariado de concentraciones de CRP en suero preoperatorias en pacientes con carcinoma hepatocelular para identificar factores que afectan la supervivencia y la recurrencia de la enfermedad (Hashimoto, K., et al., Cáncer, 103 ( 9) : 1856-1864 (2005)). Se clasificó a los pacientes en dos grupos, aquellos con niveles de CRP en suero > 1.0 mg/dL ("grupo con CRP positiva") y aquellos con niveles de CRP en suero < 1.0 mg/dL ("grupo con CRP negativa"). Los autores describieron "una correlación importante entre el nivel de CRP en suero preoperatorio y el tamaño del tumor". Id. Adicionalmente, los autores encontraron que "[l]as tasas de supervivencia general y supervivencia sin recurrencia en el grupo con CRP positiva fueron significativamente más bajas en comparación con las tasas del grupo con CRP negativa". Id. Los autores concluyeron que el nivel de CRP preoperatorio en pacientes es un indicador predictivo importante e independiente de mala prognosis y recurrencia temprana en pacientes con carcinoma hepatocelular.
Otros investigadores han identificado correlaciones similares. Por ejemplo, Karakiewicz et al. determinaron que la CRP en suero era un indicador independiente e informativo de la mortalidad especifica del carcinoma de células renales (Karakiewicz, P.I., et al., Cáncer, 110 ( 6) : 1241-1247 (2007)). Por consiguiente, sigue habiendo necesidad en la técnica de métodos y/o tratamientos que reduzcan las concentraciones de proteina C-reactiva (CRP) en suero en pacientes con cáncer y, particularmente, en aquellos con cánceres avanzados.
Métodos Ocho pacientes con diferentes formas avanzadas de cáncer (cáncer colorrectal (3), NSCLC (1), colangio (1) y mesotelioma (2) ) recibieron una única infusión intravenosa de 1 hora de 80 mg (2 pacientes), 160 mg (3 pacientes) o 320 mg (3 pacientes) del anticuerpo monoclonal Abl. No se administraron . dosis adicionales del anticuerpo monoclonal Abl a la población de prueba .
Los pacientes se evaluaron antes de la administración de la dosis y a partir de ese momento semanalmente durante al menos 8 semanas luego de la dosis. Al momento deí cada evaluación, se analizó la concentración de CRP en suero en los pacientes. La concentración de CRP se cuantificó mediante un ensayo inmunoturbidimétrico potenciado con partículas de proteína C-reactiva usando anticuerpos anti-CRP unidos con látex (es decir, Roche CRP Tinaquant®) . En resumen, se recogió aproximadamente 1.0 mL del suero de muestra de los pacientes y se almacenó en un tubo de recolección de plástico. La muestra se colocó en un tampón adecuado y el anticuerpo anti-CRP acoplado a micropartículas de látex se agregó a una muestra para comenzar la reacción. Estos anticuerpos anti-CRP con microparticulas de látex conjugadas reaccionan con antigenos en la muestra para formar un complejo de antigeno/anticuerpo. Luego de la aglutinación, esto se midió de forma turbidimétrica usando un analizador Roche/Hitachi Modular P.
Resultados Los niveles de CRP en suero se redujeron en gran medida en todos los pacientes estudiados (Figura 40) . La reducción de los niveles de CRP en suero fue rápida, con aproximadamente 90% de la reducción dentro de una semana a partir de la administración de Abl y los niveles disminuidos prolongados continuaron al menos hasta que se realizó la medición final (hasta doce semanas). En todos los casos, excepto en un paciente con cáncer colorrectal, los niveles de CRP cayeron al rango de referencia normal o por debajo de este (menos que 5-6 mg/L) dentro de una semana. El paciente con cáncer colorrectal alcanzó niveles normales similares en la semana 4 del estudio. Por consiguiente, la administración de Abl a pacientes con cáncer avanzado puede causar una supresión rápida y sostenida de los niveles de CRP en suero.
Ejemplo 26 El Abl suprime la CRP en suero en pacientes con artritis reumatoide Introducción Las concentraciones de CRP en suero han sido descritas como un fuerte indicador pronóstico en pacientes con artritis reumatoide. Los pacientes que padecen artritis reumatoide con niveles altos de CRP demostraron un deterioro casi total. Amos et al., 1 Br. ed. J. 195-97 (1977). Por el contrarió, los pacientes con niveles bajos de CRP no mostraron progreso; de la enfermedad, lo que sugiere que es necesario mantener bajos los niveles de CRP para tratar la artritis reumatoide de forma eficaz. Id. El seguimiento de la CRP durante los regímenes de tratamiento de la artritis reumatoide de oro, la D-penicilamina, la cloroquina o la dapsona indicó que se dificultó el deterioro radiológico luego de los primeros 6 meses de tratamiento cuando se controlaron de manera constante los niveles de CRP. Dawes et al., 25 Rheumatology 44-49 (1986). Se identificó una correlación altamente significativa entre la producción de CRP y la progresión radiológica, van Leeuwen et al., 32 (Supp. 3) Rheumatology 9-13 (1997). Otro estudio reveló que en pacientes con artritis reumatoide activa, la supresión de CRP elevada de manera anormal produjo una mejoría en métricas funcionales de prueba, mientras que la elevación de CRP continua se asocia con el deterioro en las mismas métricas. Devlin et al., 24 J. Rheumatol. 9-13 (1997). No se observó deterioro adicional sin una nueva elevación de la CRP, lo que indica la supresión de la CRP como un candidato viable para el tratamiento de la artritis reumatoide . Id. Por consiguiente, sigue existiendo la necesidad en la técnica de métodos y/o tratamientos para reducir las concentracionés de proteina C-reactiva (CRP) en pacientes con artritis reumatoide.
Métodos S.e dividieron ciento veintisiete pacientes con artritis reumatoide activa y CRP =10 mg/L en 4 grupos de tratamiento. Los pacientes de un grupo recibieron una infusión intravenosa (IV) de 1 hora de placebo (n=33) , 80 mg (n=32) , 160 mg (n 34) o 320 mg (n=28) del anticuerpo monoclonal Abl una vez al comienzo del ensayo de 16 semanas y nuevamente en la semana 8. La concentración de CRP se cuantificó mediante un ensayo inmunoturbidimétrico potenciado con partículas de proteina C-reactiva usando anticuerpos anti-CRP unidos con látex (es decir, Roche CRP Tinaquant®) . En resumen, se recogió aproximadamente 1.0 mL del suero de muestra de los pacientes y se almacenó en un tubo de recolección de plástico. La muestra se colocó en un tampón adecuado y el anticuerpo anti-CRP acoplado a micropartículas de látex se agregó a una muestra para comenzar la reacción. Estos anticuerpos anti-CRP con micropartículas de látex conjugadas reaccionan con antígenos en la muestra para formar un complejo de antigeno/anticuerpo . Luego de la aglutinación, esto se midió de forma turbidimétrica usando un analizador Roche/Hitachi Modular P. Se recogieron los datos de la concentración de CRP cada semana durante las primeras 4 semanas, cada dos semanas entre las semanas 4 y 12 y al término de la prueba a la semana 16.
Resultados Los niveles de CRP en suero se redujeron en gran medida en todos los pacientes estudiados (Figura 41) . La reducción de los niveles de CRP en suero fue rápida, con una reducción inmediata de los niveles de CRP con relación al placebo dentro de una semana a partir de la administración de Abl y los niveles disminuidos prolongados continuaron al menos hasta que se realizó la medición final (hasta dieciséis semanas). En, todos los casos, los niveles de CRP cayeron al rango de referencia normal o por debajo de este (menos de 5-6 mg/L) dentro de una semana. Por consiguiente, la administración de Abl a pacientes con artritis reumatoide puede causar una supresión rápida y sostenida de los niveles de CRP en suero y presenta un régimen eficaz de tratamiento.
Ejemplo 27 El Abl aumenta la hemoglobina en pacientes con cáncer avanzado El anticuerpo Abl se dosificó a 93 individuos con carcinoma pulmonar no microcitico a 80 mg, 160 mg o 320( mg de Abl en solución salina tamponada con fosfato. El grupo ' de 31 individuos con carcinoma pulmonar no microcitico tratado con placebo se dosificó solo con solución salina tamponada con fosfato. Se extrajeron muestras de sangre justo antes , de la dosificación (semana cero) y en las semanas dos, cuatro, ocho y doce y se determinó la concentración de hemoglobina. La concentración promedio de hemoglobina aumentó en aquellos que recibían el anticuerpo Abl, mientras que la concentración promedio de hemoglobina de aquellos que reciben placebo no aumentó luego de las doce semanas al compararla con la concentración inmediatamente antes de la dosificación (semana cero) (Figuras 42 y 43) .
Un subgrupo de la población de estudio comenzó el estudio con niveles bajos de hemoglobina, definidos como' una concentración de hemoglobina de referencia por debajo de 11 g/1. La concentración promedio de hemoglobina aumentó por encima de 11 g/1 luego de ocho semanas en aquellos que recibieron el anticuerpo Abl en dosis de 160 mg y 320 mg, mientras que la concentración promedio de hemoglobina de aquellos que reciben anticuerpo Abl en dosis de 80 mg o placebo no aumentó por encima de 11 g/1 luego de ocho semanas (Figura 44) Estos resultados demuestran adicionalmente algunos de los efectos beneficiosos de la administración de Abl a individuos con enfermedades crónicas. Debido a que la IL-6 es la principal citocina responsable de la anemia en enfermedades crónicas (incluida la anemia relacionada con el cáncer);, la neutralización de la IL-6 mediante Abl aumenta la concentración de hemoglobina en estos individuos.
Ejemplo 28 El Abl aumenta la hemoglobina en pacientes con artritis reumatoide Los niveles de hemoglobina se analizaron en pacientes con artritis reumatoide durante el tratamiento con anticuerpo Abl. El anticuerpo Abl se dosificó a 94 individuos con artritis reumatoide a 80 mg, 160 mg o 320 mg en solución ¡salina tamponada con fosfato. El grupo tratado con placebo de 33 individuos con artritis reumatoide se dosificó solo con solución salina tamponada con fosfato. Se extrajeron muestras de sangre inmediatamente antes de la dosificación (semana cero) y a las semanas uno, dos, tres, cuatro, seis, ocho, diez, doce y dieciséis y se determinó la concentración de hemoglobina. La concentración promedio de hemoglobina aumentó en aquellos que recibían el anticuerpo Abl, mientras que la concentración promedio de hemoglobina de aquellos que recibían placebo no aumentó perceptiblemente luego de las dieciseis semanas en comparación con la concentración inmediatamente antes de la dosificación (semana cero) (Figura 45) .
Estos resultados demuestran adicionalmente algunos de los efectos beneficiosos de la administración de Abl a individuos con enfermedades crónicas. Debido a que la IL-6 es la citocina principal responsable de la anemia de enfermedades crónicas (incluida la anemia relacionada con el cáncer), la neutralización de IL-6 mediante Abl aumenta la concentración de hemoglobina .
Ejemplo 29 El Abl aumenta la albúmina en pacientes con cáncer avanzado Introducción ; Las concentraciones de albúmina en suero son reconocidas como indicadores predictivos de supervivencia y/o éxito en la recuperación en pacientes con cáncer. La hipoalbuminenia tiene una fuerte correlación con una mala evolución del paciente en diversas formas de cáncer. Por ejemplo, en un estudio ningún paciente sometido a quimioterapia sistémica por adenocarcinoma pancreático metastásico y con niveles de albúmina en ¡ suero menores a 3.5 g/dL respondió de forma satisfactoria a la quimioterapia sistémica (Fujishiro, M., et al., Hepatogastroenterology, 47 (36) : 1744-46 (2000)). Los autores concluyen que " [p] acientes con ... hipoalbuminemia ... podrían ser candidatos inapropiados para la quimioterapia sistémica y podrían tratarse con otros enfoques experimentales o cuidados paliativos". Id.
De manera similar, Sénior y Maroni expresan que "[l]a reciente apreciación acerca de que la hipoalbuminemia ,es el indicador más poderoso de la mortalidad en enfermedades renales en etapa terminal destaca la importancia crítica de asegurar el consumo adecuado de proteínas para esta población de pacientes". (J.R. Sénior and B.J. Maroni, Am. Soc. Nutr. Sci., 129:313S-314S (1999)).
En al menos un estudio, los intentos por rectificar la hipoalbuminemia en 27 pacientes con cáncer metastásico mediante la infusión diaria de albúmina intravenosa de 20 g hasta que se alcanzaran los niveles de albúmina en suero normales , (>3.5 g/dL) no tuvieron mucho éxito. Los autores mencionan que:"[l]a infusión de albúmina en pacientes con cáncer en etapa avanzada tiene valor limitado en la práctica clínica. Los pacientes con PS 4 e hipoalbuminemia tienen una peor prognosis". (Demirkazik, A., et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 21:Abstr 2892 (2002)).
Por consiguiente, sigue habiendo necesidad en la técnica de métodos y/o tratamientos que mejoren las concentraciones de albúmina en suero en pacientes con cáncer y que se ocupen de estados hipoalbuminémicos en pacientes con cáncer, particularmente, aquellos con cánceres avanzados.
Métodos El anticuerpo Abl se dosificó a 93 individuos con carcinoma pulmonar no microcitico a 80 mg, 160 mg o 320 mg de Abl en solución salina tamponada con fosfato. Cada individuo recibió una dosificación de El grupo de 31 individuos con carcinoma pulmonar no microcitico tratado con placebo se dosificó solo con solución salina tamponada con fosfato. Se extrajeron muestras' de sangre inmediatamente antes de la dosificación (semana cero) y en las semanas dos, cuatro, ocho y doce y se determinó la concentración de albúmina. : Resultados La concentración promedio de albúmina aumentó en aquellos que recibieron el anticuerpo Abl, mientras que la concentración promedio de albúmina de aquellos que recibieron placebo no aumentó luego de las doce semanas al compararla con la concentración inmediatamente antes de la dosificación (semana cero) (Figura 46) . El cambio en los valores de albúmina de referencia para todos los grupos de concentración de dosis se gráfica en la Figura 47.
Un subgrupo de la población del estudio comenzó el estudio con niveles bajos de albúmina definidos como una concentración de albúmina de referencia menor o igual a 35 g/L. La concentración promedio de albúmina inicialmente aumentó con todas las dosificaciones del anticuerpo Abl con respecto al placebo, pero solo los pacientes que recibieron 160 mg o 320 mg demostraron niveles de albúmina sostenidos sobre 35 g/L tras 8 semanas de estudio (Figura 48) . El grupo de dosificación de 80 mg demostró un aumento inicial pero disminuyó gradualmente luego de la semana 2 y no aumentó a más que 35 g/L durante las 8 semanas en las que los datos se encontraban disponibles (Id.).
Ejemplo 30 El Abl mejoró el peso y redujo la fatiga en pacientes con cáncer avanzado Introducción La perdida de peso y la fatiga son síntomas muy comunes en pacientes con formas avanzadas de cáncer y estos síntomas pueden empeorar a medida que el cáncer avanza. La fatiga ¡ y la pérdida de peso pueden tener efectos negativos considerables en la recuperación de los pacientes con formas avanzadas de cáncer, por ejemplo, alterar estilos de vida y relaciones y afectar la voluntad o capacidad de los pacientes de continuar tratamientos contra el cáncer. Los métodos conocidos para abordar la fatiga y la pérdida de peso incluyen rutinas regulares de entrenamiento y ejercicios, métodos para conservar la energía de los pacientes y tratamientos que abordan la fatiga inducida por anemia. No obstante, sigue habiendo necesidad en la técnica de métodos y/o tratamientos para mejorar la fatiga y la pérdida de peso en pacientes con cáncer.
Métodos Se dividieron ciento veinticuatro pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) en 4 grupos de tratamiento. Los pacientes de un grupo recibieron una infusión intravenosa (IV) de 1 hora de placebo (n=31) , 80 mg (n=29) , 160 mg (n=32) o 320 mg (n=32) del anticuerpo monoclonal Abl cada 8 semanas durante 24 semanas en un total de 3 dosis.
Los pacientes se evaluaron antes de la administración de la dosis y a partir de ese momento durante al menos 12 semanas luego de la dosis. Al momento de cada evaluación, se analizó a los pacientes para determinar lo siguiente: a.) cualquier cambio en el peso y b.) fatiga medida usando el cuestionario de la subescala de Facit-F fatiga, una prueba reconocida a. nivel médico para evaluar la fatiga (Véase, por ejemplo, Celia, D., Lai, J.S., Chang, C.H., Peterman, A., & Slavin, M. (2002). Fatigue in cáncer patients compared with fatigue in the general population. Cáncer, 94(2), 528-538; Celia, D. , Eton, D.T., Lai , F J-S., Peterman, A.H & erkel, D.E. (2002). Combining anchor and distribution based methods to derive minimal clinically important differences on the Functional Assessment of Cáncer Therapy anemia and fatigue scales. Journal of Pain & Symptom Management, 24 (6) 547-561.).
Resultados Cambio en el peso Los datos promediados de cambio en el peso de cada grupo de concentración de dosis (placebo, 80 mg, 160 mg y 320 mg) del anticuerpo monoclonal Abl durante 12 semanas se grafican en la Figura 49. El cambio de porcentaje promedio en el peso corporal de cada concentración de dosis se gráfica en la Figura 50;. Los datos promediados de masa corporal magra para los grupos de concentración de dosis se grafican en la Figura 51. ; Fatiga i La fatiga promediada de cada grupo de concentración de dosis (placebo, 80 mg, 160 mg y 320 mg) del anticuerpo monoclonal Abl demostró aumentos en la puntuación de subescala Facit-F FS promedio para algunos de los grupos de concentración de dosis en la población de pacientes durante un periodo de 8 semanas (Figura 52). El cambio de la puntuación de la subescala Facit-F de referencia se gráfica en la Figura 53.
Ejemplo 31 El Abl disminuye los niveles del dimero-D en pacientes con cáncer avanzado Introducción Las concentraciones del dimero-D se reconocen como herramientas de diagnóstico útiles para predecir los riesgos de eventos trombóticos en pacientes. (Adam et al., 113 Blood 2878-87 (2009) ) Los pacientes negativos para el dimero-D tienen una baja probabilidad de trombosis. Por ejemplo, el análisis del dimero-D puede descartar trombosis venosa profunda de extremidad inferior en pacientes. (Wells et al., 349 N. ;Engl. J. Med. 1227-35 (2003) ) La evaluación clínica en combinación con la prueba del dimero-D negativa puede disminuir de 1 forma eficaz la instancia de embolismo pulmonar a 0.5%. (Van Belle et al., 295 JAMA 172-79 (2006); Kruip et al., 162 Arch. Intern. Med. 1631-35 (2002); Wells et al., 135 Ann. Intern. Med. 98-107 (2001) ) Los análisis del dimero-D pueden tener utilidad en el progreso del tratamiento de trastornos de coagulación. Un estudio indicó que el tratamiento anticoagulación para tromboembolismo dio como resultado una disminución gradual de las concentraciones del dimero-D. (Adam et al., 113 Blood 2878-87 (2009); Schutgens et al., .144 J. Lab. Clin. ed. 100-07 (2004) ) . Este descubrimiento llevó a la conclusión de que se podría utilizar el control de los niveles del dímero-Q para evaluar la respuesta al tratamiento. (Adam et al., 113 Blood en 2883).
En los pacientes con cáncer, los análisis del dímero-D pueden tener significación adicional, ya que el cáncer aumenta la prevalencia de la trombosis. (Adam et al., 113 Blood 2878-87 (2009) ) . Un estudio con pacientes oncológicos indicó qu'e las concentraciones del dímero-D tienen un valor de predicción negativa alto y una alta sensibilidad en el diagnóstico de embolia pulmonar. (King et al., 247 Radiology 854-61 (2008)). La trombosis venosa profunda se puede excluir de forma similar en pacientes con cáncer con bajas probabilidades de desarrollar trombosis venosa profunda y una prueba negativa para el dímero-D, si bien tal combinación en menos probable en pacientes oncológicos. (Lee et al., 123 Thromb. Res. 177-83 (20?8)).
Puede ser necesario un umbral más alto de resultado del dimero-D negativo en pacientes con cáncer. (Righini et al., 95 Haemost. 715-19 (2006)).
Por consiguiente, sigue habiendo necesidad en la técnica de métodos y/o tratamientos para la trombosis que mejoren las concentraciones de D-dimero en pacientes con cáncer y que se ocupen de estados de dimero-D elevado en pacientes con cáncer, particularmente, aquellos con cánceres avanzados.
Métodos Se dividieron ciento veinticuatro pacientes con cáncer de pulmón no microcitico (NSCLC) en 4 grupos de tratamiento. Los pacientes de un grupo recibieron una infusión intravenosa (IV) de 1 hora de placebo (n=31), 80 mg (n=29) , 160 mg (n=32) ¡o 320 mg (n=32) del anticuerpo monoclonal Abl cada 8 semanas durante 24 semanas en un total de 3 dosis. Se recogieron los datos de la concentración del dimero-D de las primeras 8 semanas de tratamiento. La concentración de los datos del dimero-D se cuantificó mediante un ensayo inmunoturbidimétrico del dimero-D. En resumen, el ensayo se basa en el cambio de la turbidez de una suspensión de microparticulas que se mide mediante fotometría. Se recogió aproximadamente 1.5 mL de la muestra de plasma de citrato de sodio del paciente y se almacenó en un tubo de recolección de plástico. Se mezcló una suspensión de microparticulas de látex recubiertas por enlace covalente con anticuerpos monoclonales específicos para el dímero-D con el plasma de prueba cuyo nivel de dímero-D se pretendía ensayar. Las reacciones anticuerpo-antígeno que llevan a una aglutinación de las microparticulas de látex indujeron un aumento en la turbidez del medio de reacción. Este aumento en la turbidez se reflejó mediante un aumento en la absorbencia y esta última se midió de forma fotométrica utilizando un analizados STAGO STA. .El aumento en la absorbancia fue una función del nivel del dímero-D presente en la muestra de prueba .
Resultados Los datos promediados de cada concentración de , dosis (placebo, 80 mg, 160 mg y 320 mg) del anticuerpo monoclonál Abl se grafican en la Figura 54. Las barras de error se omitieron de la gráfica por motivos de claridad. El cambio porcentual con respecto a la concentración de referencia del dímero-D se gráfica en la Figura 55. Todos los niveles de dosificación del anticuerpo Abl demostraron una disminución en los niveles de dímero-D con respecto al placebo durante el período de 8 semanas.
Ejemplo 32 El Abl alcanzó ACR 20/50/70 en pacientes con artritis reumatoide Introducción La artritis reumatoide es un trastorno inflamatorio sistémico crónico que ataca principalmente el sinovio de las articulaciones. La enfermedad causa inflamación dolorosa y potencialmente incapacitante, con una aparición que ocurre típicamente entre los 40 y 50 años de edad. La interpretación de la eficacia del tratamiento con fármaco en artritis reumatoide se vuelve difícil debido a la cantidad de herramientas de evaluación objetivas y subjetivas qúe se pusieron a disposición con el tiempo. El American College of Rheumatology [Colegio Estadounidense de Reumatología] ("ACR") emitió un conjunto estandarizado de medidas para la artritis reumatoide para facilitar la evaluación de la mejora de la enfermedad en pruebas clínicas. Felson et al., 36 Arthritis & Rheumatism 729-40 (1993) .
Métodos Se dividieron ciento veintisiete pacientes con artritis reumatoide activa y CRP =10 mg/L en 4 grupos de tratamiento. Los pacientes en un grupo recibieron una infusión intravenosa (IV) de una hora de placebo (n=33) , 80 mg (n=32), 160 mg (n=34) o 320 mg (n=28) del anticuerpo monoclonal Abl, una vez al inicio del ensayo de 16 semanas y nuevamente a la semana 8. Los datos de la concentración de CRP se recogieron cada semana durante las primeras 4 semanas, cada dos semanas entre las semanas 4 y 12 y al término de la prueba a la semana 16.
Se realizó la evaluación de acuerdo con los protocolos estandarizados del Colegio Estadounidense de Reumatología para determinar el porcentaje de mejora de pacientes durante el ensayo clínico y fue realizada por una persona capacitada en la técnica de evaluación de artritis reumatoide. La evaluación se basó en las mediciones de actividad, incluyendo el conteo de articulaciones débiles, el conteo de articulaciones inflamadas, la evaluación del dolor del paciente, las evaluaciones globales de la actividad de la enfermedad realizadas por el médico y la evaluación de laboratorio de la tasa de sedimentación de eritrocitos o el nivel de CRP. Id. La evaluación de dolor del paciente se basó en el Stanford Health Assessment Questionnaire Disability Index [índice de discapacidad del cuestionario de evaluación de la salud de Stanford] (HAQ DI) . Los pacientes que alcanzan un aumento del 20% en las medidas de actividad de la artritis reumatoide durante un ensayo clínico se categorizan como que alcanzaron un ACR 20. De manera similar, los pacientes que alcanzan una mejora del 50% y 70% se categorizan como ACR 50 y ACR 70, respectivamente.
Resultados Una cantidad considerable de pacientes que padecen artritis reumatoide alcanzó un ACR 20 o mayor durante el transcurso del estudio (Figura 56) . Los pacientes presentaron una mejora rápida en los sistemas dentro de las priméras 4 semanas del estudio, asi como una mejora estable y continua a lo largo del transcurso de las 16 semanas de evaluación (Figuras 57, 58 y 59) . Los mayores resultados se presentaron en pacientes que recibieron el nivel de dosis de 320 mg, donde el 43% alcanzó un estado de ACR 70 durante el estudio (Figura 59) .
El análisis de los componentes individuales de la evaluación de ACR demostró ganancias en todos los componentes (Figura 60). Los resultados del HAQ DI demostraron un cambio clínicamente significativo con relación el placebo durante el transcurso de la evaluación (Figura 61) . Los niveles de CRP en suero se redujeron en gran medida en todos los pacientes estudiados (Figura 41) . La reducción de los niveles de CRP en suero fue rápida, con una reducción inmediata de los niveles de CRP con relación al placebo dentro de una semana a partir de la administración de Abl y los niveles disminuidos prolongados continuaron al menos hasta que se realizó la medición ; final (hasta dieciseis semanas) . En todos los casos, los niveles de CRP cayeron al rango de referencia normal o por debajo de este (menos de 5-6 mg/L) dentro de una semana. Por consiguiente, la administración de Abl puede causar una mejora rápida y sostenida de los pacientes con artritis reumatoide, según se prueba mediante la mejora significativa en los valores de ACR durante la evaluación clínica y, asimismo, presenta un régimen de tratamiento eficaz.
Ejemplo 33 El Abl alcanzó mejores valores de DAS28 y EULAR en pacientes con artritis reumatoide Introducción La artritis reumatoide es un trastorno inflamatorio sistémico crónico que ataca principalmente el sinovio de las articulaciones. La enfermedad causa inflamación dolorosa y potencialmente incapacitante, con una aparición que ocurre típicamente entre los 40 y 50 años de edad. La interpretación de la eficacia del tratamiento con fármaco en artritis reumatoide se vuelve difícil debido a la cantidad de herramientas de evaluación objetivas y subjetivas que se pusieron a disposición con el tiempo. El American College of Rheumatology [Colegio Estadounidense de Reumatología] ("ACR") emitió un conjunto estandarizado de medidas para la artritis reumatoide para facilitar la evaluación de la mejora de la enfermedad en pruebas clínicas. Felson et al., 36 Arthritis & Rheumatism 729-40 (1993) .
La actividad inflamatoria asociada con la artritis reumatoide se mide utilizando diversas variables a través de criterios de respuesta validados como el Disease Activity Score [índice de actividad de la enfermedad] (DAS) , DAS28 y EULAR. El DAS es un índice clínico de la actividad de enfermedad : de la artritis reumatoide que combina información de articulaciones inflamadas, articulaciones débiles, la respuesta de fase aguda y la salud general. Fransen, J. , et al., Clin. Exp. Rheumatol., 23 (Supl. 39): S93-S99 (2005). El DAS 28 es un índice similar al DAS original, pero utiliza un conteo de articulaciones débiles 28 (rango 0-28), un conteo 28 de articulaciones inflamadas (rango 0-28), la ESR (tasa de sedimentación de eritrocitos) y una evaluación opcional de la salud general en una escala análoga visual (rango 0-100) . Id. Los criterios de respuesta de la European League against Rheumatism , [Liga europea contra el reumatismo] (EULAR) clasifican a los pacientes utilizando la cantidad individual de cambio en el DAS y en los valores de DAS (bajos, moderados, altos) que alcanzaron en una de las siguientes clasificaciones: buena, moderada o sin respuesta. Id.
Métodos Se dividieron ciento veintisiete pacientes con artritis reumatoide activa en 4 grupos de tratamiento. Los pacientes en un grupo recibieron una infusión intravenos (IV) de una hora de placebo (n=33) , 80 mg (n=32), 160 mg (n=34) o 320 mg (n=28) del anticuerpo monoclonal Abl, una vez al inicio del ensayo de 16 semanas y nuevamente a la semana 8. Los datos de los valores de DAS28 y EULAR se recogieron cada semana durante las primeras 4 semanas, cada dos semanas entre las semanas 4 y 12 y al término del análisis a la semana 16. Se utilizó la evaluación según los protocolos de DAS28 y EULAR estandarizados para determinar los valores respectivos de pacientes durante la prueba clínica y fue realizada por una persona capacitada en la técnica de evaluación de artritis reumatoide.
Resultados 1 Los pacientes que reciben 80 mg, 160 mg o 320 mg de Abl demostraron mejores valores de DAS28 con relación a los pacientes que reciben placebo durante el transcurso de las 16 semanas, como se presenta en la Figura 62 como un cambio promedio con respecto al valor DAS28 de referencia. Adicionalmente, una cantidad considerable de pacientes que reciben 80 mg, 160 mg o 320 mg de Abl alcarizaron clasificaciones de "buena" o "moderada" con relación a los pacientes que reciben placebo durante el transcurso de las 16 semanas. (Figura 63).
Por lo tanto, la administración de Abl puede dar como resultado mejores valores de DAS28 y EULAR en artritis reumatoide en comparación con los pacientes que reciben placebo.
LISTADO DE SECUENCIAS Las secuencias biológicas referidas en la presente se proporcionan a continuación.
SEQ ID NO: 1 VPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAE NNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVL IQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQD TTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM SEQ ID NO: 2 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASQSINNELSWY QQKPGQRPKLLIYRASTLASGVSSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQQGYSLRNIDN AFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN j SEQ ID NO: 3 ETGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSNYYVT VRQA PGKGLE IGIIYGSDETAYATWAIGRFTISKTSTTVDLK TSLTAADTATYFCARDDSSD DA KFNLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK SEQ ID NO: 4 QASQSINNELS SEQ ID NO: 5 RASTLAS SEQ ID NO: 6 QQGYSLRNIDNA SEQ ID NO: 7 NYYVT SEQ ID NO: 8 I IYGSDETAYATWAIG SEQ ID NO: 9 DDSSDWDAKFNL SEQ ID NO: 10 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCAGATGTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCGGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAATTATCCTGGTATCAGCAGAAAC CAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGC GGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCG ATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAATATTGATAATGCTTTCGGCG GAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCAT CTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTT SEQ ID NO: 11 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCA CAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAATGGATCGGAATCATTTATGGTAGTGATGAAACGGCCTACGCGACCTGGGCGATAG GCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAGCCG CGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAATTTAACT TGTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC CCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGG SEQ ID NO: 12 CAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAATTATCC SEQ ID NO: 13 AGGGCATCCACTCTGGCATCT SEQ ID NO: 14 CAACAGGGTTATAGTCTGAGGAATATTGATAATGCT SEQ ID NO: 15 AACTACTACGTGACC SEQ ID NO: 16 ATCATTTATGGTAGTGATGAAACGGCCTACGCGACCTGGGCGATAGGC SEQ ID NO: 17 GATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAATTTAACTTG ; SEQ ID NO: 18 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYYVTWVRQAPGKGLEWVGIIYGSDETA YATWAIGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDSSDWDAKFNL SEQ ID NO: 19 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYYVT VRQAPGKGLE VGIIYGSDETA YATSAIGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDSSD DAKFNL SEQ ID NO: 20 IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNELSWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSLRNIDNA SEQ ID NO: 21 DTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPASVEVAVGGTVTINCQASETIYSWLSWY QQKPGQPPKLLIYQASDLASGVPSRFSGSGAGTEYTLTISGVQCDDAATYYCQQGYSGSNVDN VFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK SEQ ID NO: 22 ETGLR LLLVAVLKGVQCQEQLKESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLNDHAMGWVRQ APGKGLEYIGFINSGGSARYASWAEGRFTISRTSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCVRGGAVWSI HSFDP GPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK SEQ ID NO: 23 QASETIYSWLS SEQ ID NO: 24 QASDLAS SEQ ID NO: 25 QQGYSGSNVDNV SEQ ID NO: 26 DHA G : SEQ ID NO: 27 FINSGGSARYASWAEG SEQ ID NO: 28 GGAVWSIHSFDP SEQ ID NO: 29 '[ ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCAGATGTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAATTGCCAGGCCAGTGAGACCATTTACAGTTGGTTATCCTGGTATCAGCAGAAGC CAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACCAGGCATCCGATCTGGCATCTGGGGTCCCATCGC GATTCAGCGGCAGTGGGGCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACG ATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATAGTGGTAGTAATGTTGATAATGTTTTCGGCG GAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCAT CTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCA GAGAGGCCAAAG SEQ ID NO: 30 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGGAGCAGCTGAAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTTACCT GCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAATGACCATGCAATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGA AGGGGCTGGAATACATCGGATTCATTAATAGTGGTGGTAGCGCACGCTACGCGAGCTGGGCAG AAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAA CCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGTCAGAGGGGGTGCTGTTTGGAGTATTCATAGTTTTG ATCCCTGGGGCCCAGGGACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCT TCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCA AG SEQ ID NO: 31 ? CAGGCCAGTGAGACCATTTACAGTTGGTTATCC ¦ SEQ ID NO: 32 ' CAGGCATCCGATCTGGCATCT SEQ ID NO: 33 CAACAGGGTTATAGTGGTAGTAATGTTGATAATGTT SEQ ID NO: 34 I GACCATGCAATGGGC i SEQ ID NO: 35 TTCATTAATAGTGGTGGTAGCGCACGCTACGCGAGCTGGGCAGAAGGC SEQ ID NO: 36 GGGGGTGCTGTTTGGAGTATTCATAGTTTTGATCCC SEQ ID NO: 37 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQASQSVYDNNYLS WFQQKPGQPPKLLIYGASTLASGVPSRFVGSGSGTQFTLTITDVQCDDAATYYCAGVYDDDSD NAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF SEQ ID NO: 38 METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSVYYMN VRQA PGKGLEWIGFIT SDNINYASWAKGRFTISKTSTTVDLKMTSPTTEDTATYFCARSRG GTMG RLDLWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK SEQ ID NO: 39 QASQSVYDNNYLS SEQ ID NO: 40 GASTLAS i SEQ ID NO: 41 ' AGVYDDDSDNA ' SEQ ID NO: 42 VYYMN SEQ ID NO: 43 FITMSDNINYASWAKG SEQ ID NO: 44 ' SRG GTMGRLDL ¡ SEQ ID NO: 45 : ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCACATTTGCCGCCGTGCTGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCAGCATCAGTTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGACAACAACTACTTATCCTGGTTTCAGC AGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCC CATCGCGGTTCGTGGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCACAGACGTGCAGT GTGACGATGCTGCCACTTACTATTGTGCAGGCGTTTATGATGATGATAGTGATAATGCCTTCG GCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGC CATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCT SEQ ID NO: 46 ¡ ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTGGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACCCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCA CAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTGTCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAATGGATCGGATTCATTACAATGAGTGATAATATAAATTACGCGAGCTGGGCGAAAG GCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCCGACAACCG AGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGGAGTCGTGGCTGGGGTACAATGGGTCGGTTGGATC TCTGGGGCCCAGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC CCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGG SEQ ID NO: 47 CAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGACAACAACTACTTATCC SEQ ID NO: 48 GGTGCATCCACTCTGGCATCT SEQ ID NO: 49 GCAGGCGTTTATGATGATGATAGTGATAATGCC SEQ ID NO: 50 GTCTACTACATGAAC ' SEQ ID NO: 51 TTCATTACAATGAGTGATAATATAAATTACGCGAGCTGGGCGAAAGGC SEQ ID NO: 52 AGTCGTGGCTGGGGTACAATGGGTCGGTTGGATCTC SEQ ID NO: 53 DTRAPTQLLGLLLLWLPGAICDPVLTQTPSPVSAPVGGTVSISCQASQSVYENNYLS WFQQKPGQPPKLLIYGASTLDSGVPSRFKGSGSGTQFTLTITDVQCDDAATYYCAGVYDDDSD DAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN SEQ ID NO: 54 ETGLRWLLLVAVLKGVQCQEQLKESGGGLVTPGGTLTLTCTASGFSLNAYY N VRQ APGKGLEWIGFITLNNNVAYAN AKGRFTFSKTSTTVDLKMTSPTPEDTATYFCARSRGWGAM GRLDL GHGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK SEQ ID NO: 55 QASQSVYENNYLS SEQ ID NO: 56 GASTLDS SEQ ID NO: 57 AGVYDDDSDDA SEQ ID NO: 58 AYYMN SEQ ID NO: 59 FITLNNNVAYANWAKG SEQ ID NO: 60 SRG GAMGRLDL SEQ ID NO: 61 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCATATGTGACCCTGTGCTGACCCAGACTCCATCTCCCGTATCTGCACCTGTGGGAGGCACAG TCAGCATCAGTTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGAGAACAACTATTTATCCTGGTTTCAGC AGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTGGATTCTGGGGTCC CATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATTACAGACGTGCAGT GTGACGATGCTGCCACTTACTATTGTGCAGGCGTTTATGATGATGATAGTGATGATGCCTTCG GCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGC CATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTT SEQ ID NO: 62 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTGGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGGAGCAGCTGAAGGAGTCCGGAGGAGGCCTGGTAACGCCTGGAGGAACCCTGACACTCACCT GCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAATGCCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCGAGGGA AGGGGCTGGAATGGATCGGATTCATTACTCTGAATAATAATGTAGCTTACGCGAACTGGGCGA AAGGCCGATTCACCTTCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCCGACAC CCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGGAGTCGTGGCTGGGGTGCAATGGGTCGGTTGG ATCTCTGGGGCCATGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCT TCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCA AGG SEQ ID NO: 63 CAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGAGAACAACTATTTATCC SEQ ID NO: 64 GGTGCATCCACTCTGGATTCT SEQ ID NO: 65 GCAGGCGTTTATGATGATGATAGTGATGATGCC ; 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QASKLAS SEQ ID NO: 89 : LGGYDDDADNA SEQ ID NO: 90 ¡ DYA S SEQ ID NO: 91 I IYAGSGSTWYASWAKG SEQ ID NO: 92 \ DGYDDYGDFDRLDL i SEQ I D NO : 93 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCACATTTGCAGCCGTGCTGACCCAGACACCATCGCCCGTGTCTGTACCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAAGTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAATAATTTCTTATCGTGGTATCÁGCAGA AACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACCAGGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCAG ATAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTG ACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCGGTTATGATGATGATGCTGATAATGCTTTCGGCG GAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCAT CTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTC · SEQ I D NO : 94 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACGCTCACCTGCA CAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTGACTATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAATGGATCGGAATCATTTATGCTGGTAGTGGTAGCACATGGTACGCGAGCTGGGCGA AAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAA CCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGATGGATACGATGACTATGGTGATTTCGATC GATTGGATCTCTGGGGCCCAGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCAT CGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCC TGGTCAAGGACT.
SEQ I D NO : 95 j CAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAATAATTTCTTATCG SEQ I D NO : 96 CAGGCATCCAAACTGGCATCT SEQ I D NO : 97 i CTAGGCGGTTATGATGATGATGCTGATAATGCT ! SEQ ID NO: 98 GACTATGCAATGAGC SEQ ID NO: 99 ATCATTTATGCTGGTAGTGGTAGCACATGGTACGCGAGCTGGGCGAAAGGC SEQ ID NO: 100 GATGGATACGATGACTATGGTGATTTCGATCGATTGGATCTC SEQ ID NO: 101 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASQSINNELSWY QQKSGQRPKLLIYRASTLASGVSSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQQGYSLRNIDN AFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF SEQ ID NO: 102 ETGLRWLLLVAVLSGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSNYYMTWVRQA PGKGLEWIGMIYGSDETAYANWAIGRFTISKTSTTVDLKMTSLTAADTATYFCARDDSSDWDA KFNL GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK SEQ ID NO: 103 QASQSINNELS SEQ ID NO: 104 ' RASTLAS SEQ ID NO: 105 QQGYSLRNIDNA SEQ ID NO: 106 NYYMT SEQ ID NO: 107 MIYGSDETAYAN AIG SEQ ID NO: 108 · : DDSSDWDAKFNL SEQ ID NO: 109 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCAGATGTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCGGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAAATGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAATTATCCTGGTATCAGCÁGAAAT CAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGC GGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCG ATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAATATTGATAATGCTTTCGGCG GAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCGGCCAT CTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTC SEQ ID NO: 110 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCTCAGGTGTCCAGTGTC AGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCA CAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTACTACATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAATGGATCGGAATGATTTATGGTAGTGATGAAACAGCCTACGCGAACTGGGCGATAG GCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAGCCG CGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAATTTAACT TGTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC CCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGG SEQ ID NO: 111 : CAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAATTATCC SEQ ID NO: 112 AGGGCATCCACTCTGGCATCT SEQ ID NO: 113 [ CAACAGGGTTATAGTCTGAGGAATATTGATAATGCT 1 SEQ ID NO: 114 AACTACTACATGACC SEQ ID NO: 115 ATGATTTATGGTAGTGATGAAACAGCCTACGCGAACTGGGCGATAGGC SEQ ID NO: 116 GATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAATTTAACTTG SEQ ID NO: 117 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYYMT VRQAPGKGLEWVGMIYGSDETA YANWAIGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDSSDWDAKFNL : SEQ ID NO: 118 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYY TWVRQAPGKGLEWVGMIYGSDETA YANSAIGRFTISRDNSKNTLYLQ NSLRAEDTAVYYCARDDSSDWDAKFNL SEQ ID NO: 119 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSINNELSWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGV PSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSLRNIDNA SEQ ID NO: 120 I IYGSDETAYATSAIG [ SEQ ID NO: 121 MIYGSDETAYANSAIG SEQ ID NO: 122 MDTRAPTQLLGLLLL LPGATFAAVLTQTPSPVSAAVGGTVTISCQSSQSVGNNQDLS WFQQRPGQPPKLLIYEISKLESGVPSRFSGSGSGTHFTLTISGVQCDDAATYYCLGGYDDDAD NA SEQ ID NO: 123 METGLR LLLVAVLKGVQCHSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSRTMSWVRQA PGKGLE IGYIWSGGSTYYATWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARLGDTGGHA YATRLNL SEQ ID NO: 124 QSSQSVGNNQDLS SEQ ID NO: 125 EISKLES SEQ ID NO: 126 LGGYDDDADNA SEQ ID NO: 127 SRTMS SEQ ID NO: 128 YI SGGSTYYAT AKG SEQ ID NO: 129 LGDTGGHAYATRLNL SEQ ID NO: 130 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCACATTTGCAGCCGTGCTGACCCAGACACCATCACCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAGTTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTGGTAATAACCAGGACTTATCCTGGTTTCAGC AGAGACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACGAAATATCCAAACTGGAATCTGGGGTCC CATCGCGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACACTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTACAGT GTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCGGTTATGATGATGATGCTGATAATGCT SEQ ID NO: 131 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC ACTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCA CAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGTCGTACAATGTCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAGTGGATCGGATACATTTGGAGTGGTGGTAGCACATACTACGCGACCTGGGCGAAAG GCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGAGAACCG AGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGATTGGGCGATACTGGTGGTCACGCTTATGCTACTC GCTTAAATCTC SEQ ID NO: 132 CAGTCCAGTCAGAGTGTTGGTAATAACCAGGACTTATCC SEQ ID NO: 133 : GAAATATCCAAACTGGAATCT : SEQ ID NO: 134 CTAGGCGGTTATGATGATGATGCTGATAATGCT SEQ ID NO: 135 AGTCGTACAATGTCC SEQ ID NO: 136 TACATTTGGAGTGGTGGTAGCACATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGC SEQ ID NO: 137 TTGGGCGATACTGGTGGTCACGCTTATGCTACTCGCTTAAATCTC SEQ ID NO: 138 : MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAAVLTQTPSSVSAAVGGTVSISCQSSQSVYSNKYLA WYQQKPGQPPKLLIYWTSKLASGAPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGAYDDDAD NA SEQ ID NO: 139 ETGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVKPDETLTLTCTASGFSLEGGYMT VRQA PGKGLEWIGISYDSGSTYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCVRSLKYPTV TSDDL SEQ ID NO: 140 '< QSSQSVYSNKYLA SEQ ID NO: 141 WTSKLAS SEQ ID NO: 142 LGAYDDDADNA ; SEQ ID NO: 143 GGY T SEQ ID NO: 144 ISYDSGSTYYASWAKG SEQ ID NO: 145 SLKYPTVTSDDL SEQ ID NO: 146 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCACATTTGCAGCCGTGCTGACCCAGACACCATCGTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCAGCATCAGTTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAGTAATAAGTACCTAGCCTGGTATCAGC AGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACTGGACATCCAAACTGGCATCTGGGGCCC CATCACGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAATTCACTCTCACCATCAGCGGCGT¡GCAGT GTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCGCTTATGATGATGATGCTGATAATGCT SEQ ID NO: 147 ; ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGGTGGAAGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCAAGCCTGACGAAACCCTGACACTCACCTGCA CAGCCTCTGGATTCTCCCTGGAGGGCGGCTACATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAATGGATCGGAATCAGTTATGATAGTGGTAGCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAG GCCGATTCACCATCTCCAAGACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAA CCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGCGTCAGATCACTAAAATATCCTACTGTTACTTCTGATG ACTTG SEQ ID NO: 148 CAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAGTAATAAGTACCTAGCC SEQ ID NO: 149 TGGACATCCAAACTGGCATCT SEQ ID NO: 150 CTAGGCGCTTATGATGATGATGCTGATAATGCT SEQ ID NO: 151 GGCGGCTACATGACC SEQ ID NO: 152 ATCAGTTATGATAGTGGTAGCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGC SEQ ID NO: 153 TCACTAAAATATCCTACTGTTACTTCTGATGACTTG SEQ ID NO: 154 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAAVLTQTPSPVSAAVGGTVTISCQSSQSVYNNNDLA WYQQKPGQPPKLLIYYASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCDDAAAYYCLGGYDDDAD NA SEQ ID NO: 155 METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGLSLSSNTINWVRQA PGKGLEWIGYIWSGGSTYYASWVNGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGGYASGGY PYATRLDL SEQ ID NO: 156 QSSQSVYNNNDLA j SEQ ID NO: 157 ; YASTLAS ¡ SEQ ID NO: 158 LGGYDDDADNA SEQ ID NO: 159 SNTIN SEQ ID NO: 160 YI SGGSTYYASWVNG SEQ ID NO: 161 GGYASGGYPYATRLDL SEQ ID NO: 162 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCACATTTGCAGCCGTGCTGACCCAGACACCATCACCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAGTTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAATAATAACGACTTAGCCTGGTATCAGC AGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTCCTGATCTATTATGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCC CATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGT GTGACGATGCTGCCGCTTACTACTGTCTAGGCGGTTATGATGATGATGCTGATAATGCT SEQ ID NO: 163 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCA CAGTATCTGGATTATCCCTCAGTAGCAATACAATAAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAGTGGATCGGATACATTTGGAGTGGTGGTAGTACATACTACGCGAGCTGGGTGAATG GTCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCG AGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGGGTTACGCTAGTGGTGGTTATCCTTÁTGCCA CTCGGTTGGATCTC ' SEQ ID NO: 164 : CAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAATAA AACGACTTAGCC SEQ ID NO: 165 TATGCATCCACTCTGGCATCT SEQ ID NO: 166 CTAGGCGGTTATGATGATGATGCTGATAATGCT SEQ ID NO: 167 AGCAATACAATAAAC SEQ ID NO: 168 TACATTTGGAGTGGTGGTAGTACATACTACGCGAGCTGGGTGAATGGT SEQ ID NO: 169 ! GGGGGTTACGCTAGTGGTGGTTATCCTTATGCCACTCGGTTGGATCTC . j SEQ ID NO: 170 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAAVLTQTPSSVSAAVGGTVTINCQSSQSVYNNDYLS WYQQRPGQRPKLLIYGASKLASGVPSRFKGSGSGKQFTLTISGVQCDDAATYYCLGDYDDDAD NT SEQ ID NO: 171 METGLR LLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFTLSTNYYLSWVRQ APGKGLE IGIIYPSGNTYCAKWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSPTTEDTATYFCARÑYGGDE SL SEQ ID NO: 172 \ QSSQSVYNNDYLS SEQ ID NO: 173 GASKLAS SEQ ID NO: 174 \ LGDYDDDADNT ; SEQ ID NO: 175 i TNYYLS i SEQ ID NO: 176 I IYPSGNTYCAKWAKG SEQ ID NO: 177 NYGGDESL ' SEQ ID NO: 178 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCGAGGTG CCACATTTGCAGCCGTGCTGACCCAGACACCATCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAATTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAATAACGACTACTTATCCTGGTATCAAC AGAGGCCAGGGCAACGTCCCAAGCTCCTAATCTATGGTGCTTCCAAACTGGCATCTGGGGTCC CGTCACGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGAAACAGTTTACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGT GTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTGGGCGATTATGATGATGATGCTGATAATACT SEQ ID NO: 179 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACTTGCA CAGTCTCTGGATTCACCCTCAGTACCAACTACTACCTGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGA AGGGGCTAGAATGGATCGGAATCATTTATCCTAGTGGTAACACATATTGCGCGAAGTGGGCGA AAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCCGA CAACCGAGGACACAGCCACGTATTTCTGTGCCAGAAATTATGGTGGTGATGAAAGTTTG SEQ ID NO: 180 I CAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAATAACGACTACTTATCC SEQ ID NO: 181 '; GGTGCTTCCAAACTGGCATCT SEQ ID NO: 182 ! CTGGGCGATTATGATGATGATGCTGATAATACT I SEQ ID NO: 183 ACCAACTACTACCTGAGC : SEQ ID NO: 184 ATCATTTATCCTAGTGGTAACACATATTGCGCGAAGTGGGCGAAAGGC SEQ ID NO: 185 AATTATGGTGGTGATGAAAGTTTG SEQ ID NO: 186 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCDVVMTQTPASVEAAVGGTVTIKCQASETIGNALAWY QQKSGQPPKLLIYKASKLASGVPSRFKGSGSGTEYTLTISDLECADAATYYCQWCYFGDSV SEQ ID NO: 187 METGLRWLLLVTVLKGVQCQEQLVESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFDFSSGYYMC VR QAPGKGLEWIACIFTITTNTYYAS AKGRFTISKTSSTTVTLQ TSLTAADTATYLCARGIYS DNNYYAL SEQ ID NO: 188 QASETIGNALA SEQ ID NO: 189 KASKLAS ' SEQ ID NO: 190 QWCYFGDSV SEQ ID NO: 191 ' SGYYMC SEQ ID NO: 192 CIFTITTNTYYASWAKG '> SEQ ID NO: 193 \ GIYSDNNYYAL SEQ ID NO: 194 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCAGATGTGATGTTGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGACCATTGGCAATGCATTAGCCTGGTATCAGCAGAAAT CAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAAGGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCGATCGC GGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCG ATGCTGCCACTTACTACTGTCAATGGTGTTATTTTGGTGATAGTGTT SEQ ID NO: 195 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCACTGTGCTCAAAGGTGTCCÁGTGTC AGGAGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCCAGCCTGAGGGATCCCTGACACTCACCT GCACAGCCTCTGGATTCGACTTCAGTAGCGGCTACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAG GGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCGTGTATTTTCACTATTACTACTAACACTTACTACGCGAGCT GGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAGACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCA GTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATCTCTGTGCGAGAGGGATTTATTCTGATAATAATT ATTATGCCTTG SEQ ID NO: 196 ' CAGGCCAGTGAGACCATTGGCAATGCATTAGCC '< SEQ ID NO: 197 AAGGCATCCAAACTGGCATCT SEQ ID NO: 198 CAATGGTGTTATTTTGGTGATAGTGTT SEQ ID NO: 199 AGCGGCTACTACATGTGC SEQ ID NO: 200 TGTATTTTCACTATTACTACTAACACTTACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGC SEQ ID NO: 201 GGGATTTATTCTGATAATAATTATTATGCCTTG SEQ ID NO: 202 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCDVVMTQTPASVEAAVGGTVTIKCQASESIGNALAWY QQKPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISGVQCADAAAYYCQWCYFGDSV SEQ ID NO: 203 METGLRWLLLVAVLKGVQCQQQLVESGGGLVKPGASLTLTCKASGFSFSSGYYMCWVR QAPGKGLESIACIFTITDNTYYANWAKGRFTISKPSSPTVTLQ TSLTAADTATYFCARGIYS TDNYYAL SEQ ID NO: 204 ' QASESIGNALA SEQ ID NO: 205 KASTLAS SEQ ID NO: 206 QWCYFGDSV SEQ ID NO: 207 SGYYMC i SEQ ID NO: 208 CIFTITDNTYYANWAKG SEQ ID NO: 209 GIYSTDNYYAL SEQ ID NO: 210 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCAGATGTGATGTTGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGAGCATTGGCAATGCATTAGCCTGGTATCAGCAGAAAC CAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGC GGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGCCG ATGCTGCCGCTTACTACTGTCAATGGTGTTATTTTGGTGATAGTGTT SEQ ID NO: 211 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGCAGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCGGGGGCATCCCTGACACTCACCT GCAAAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCGGCTACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAG GGAAGGGGCTGGAGTCGATCGCATGCATTTTTACTATTACTGATAACACTTACTACGCGAACT GGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAGCCCTCGTCGCCCACGGTGACTCTGCAAATGACCA GTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGGGGGATTTATTCTACTGATAATT ATTATGCCTTG SEQ ID NO: 212 CAGGCCAGTGAGAGCATTGGCAATGCATTAGCC SEQ ID NO: 213 AAGGCATCCACTCTGGCATCT SEQ ID NO: 214 , CAATGGTGTTATTTTGGTGATAGTGTT ' SEQ ID NO: 215 ! AGCGGCTACTACATGTGC SEQ ID NO: 216 ! TGCATTTTTACTATTACTGATAACACTTACTACGCGAACTGGGCGAAAGGC SEQ ID NO: 217 , GGGATTTATTCTACTGATAATTATTATGCCTTG SEQ ID NO: 218 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCDVVMTQTPASVEAAVGGTVTIKCQASQSVSBYLNWY QQKPGQPPKLLIYRASTLESGVPSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQCTYGTSSSYG AA ; SEQ ID NO: 219 METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGISLSSNAISWVRQA PGKGLEWIGIISYSGTTYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARDDPTTVM VMLIPFGAGMDL SEQ ID NO: 220 QASQSVSSYLN ; SEQ ID NO: 221 RASTLES SEQ ID NO: 222 QCTYGTSSSYGAA SEQ ID NO: 223 SNAIS : SEQ ID NO: 224 I I SYSGTTYYASWAKG SEQ ID NO: 225 ; DDPTTVMVMLI PFGAGMDL SEQ ID NO: 226 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCAGATGTGATGTTGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCGTTAGTAGCTACTTAAACTGGTATCAGCAGAAAC CAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGAATCTGGGGTCC,'CATCGC GGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCG ATGCTGCCACTTACTACTGTCAATGTACTTATGGTACTAGTAGTAGTTATGGTGCTGCT SEQ ID NO: 227 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCA CCGTCTCTGGTATCTCCCTCAGTAGCAATGCAATAAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAATGGATCGGAATCATTAGTTATAGTGGTACCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAG GCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACTAGTCCGACAA CCGAGGACACGGCCACCTACTTCTGTGCCAGAGATGACCCTACGACAGTTATGGTTATGTTGA TACCTTTTGGAGCCGGCATGGACCTC : SEQ ID NO: 228 CAGGCCAGTCAGAGCGTTAGTAGCTACTTAAAC SEQ ID NO: 229 AGGGCATCCACTCTGGAATCT SEQ ID NO: 230 CAATGTACTTATGGTACTAGTAGTAGTTATGGTGCTGCT SEQ ID NO: 231 AGCAATGCAATAAGC SEQ ID NO: 232 ATCATTAGTTATAGTGGTACCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGC SEQ ID NO: 233 GATGACCCTACGACAGTTATGGTTATGTTGATACCTTTTGGAGCCGGCATGGÁCCTC SEQ ID NO: 234 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQVLTQTASPVSAAVGGTVTINCQASQSVYKNNYLS WYQQKPGQPPKGLIYSASTLDSGVPLRFSGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGS|YDCSSG DCYA ; SEQ ID NO: 235 METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGDLVKPEGSLTLTCTASGFSFSSYWMCWVRQA PGKGLE IACIVTGNGNTYYANWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCAKAYDL SEQ ID NO: 236 1 QASQSVYKNNYLS SEQ ID NO: 237 SASTLDS SEQ ID NO: 238 : LGSYDCSSGDCYA SEQ ID NO: 239 SYWMC SEQ ID NO: 240 CIVTGNGNTYYANWAKG SEQ ID NO: 241 AYDL SEQ ID NO: 242 ' ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCACATTTGCCCAAGTGCTGACCCAGACTGCATCGCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAACTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGC AGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAAGGCCTGATCTATTCTGCATCGACTCTAGATTCTGGGGTCC CATTGCGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGT GTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTAGTGGTGATTGTTATG CT ; SEQ ID NO: 243 : ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCAAGCCTGAGGGATCCCTGACACTCACCTGCA CAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCTACTGGATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAGTGGATCGCATGCATTGTTACTGGTAATGGTAACACTTACTACGCGAACTGGGCGA AAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGA CAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTTTGTGCGAAAGCCTATGACTTG SEQ ID NO: 244 CAGGCCAGTCAGAGTGTTTATAAGAACAACTACTTATCC SEQ ID NO: 245 TCTGCATCGACTCTAGATTCT j SEQ ID NO: 246 CTAGGCAGTTATGATTGTAGTAGTGGTGATTGTTATGCT SEQ ID NO: 247 AGCTACTGGATGTGC SEQ ID NO: 248 TGCATTGTTACTGGTAATGGTAACACTTACTACGCGAACTGGGCGAAAGGC SEQ ID NO: 249 GCCTATGACTTG SEQ ID NO: 250 ! DTRAPTQLLGLLLLWLPGSTFAAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQASQSVYDNNYLS WYQQKPGQPPKLLIYGASTLASGVPSRFKGTGSGTQFTLTITDVQCDDAATYYCAGVFNDDSD DA ' SEQ ID NO: 251 ; METGLRWLLLVAVPKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTLSGFSLSAYYMSWVRQA PGKGLEWIGFITLSDHISYARWAKGRFTISKTSTTVDLKMTSPTTEDTATYFCARSRGWGAMG RLDL ' SEQ ID NO: 252 ; QASQSVYDNNYLS SEQ ID NO: 253 GASTLAS SEQ ID NO: 254 AGVFNDDSDDA SEQ ID NO: 255 AYYMS SEQ ID NO: 256 FITLSDHISYARWAKG SEQ ID NO: 257 SRGWGAMGRLDL SEQ ID NO: 258 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTT CCACATTTGCCGCCGTGCTGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCAGCATCAGTTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGACAACAACTATTTATCCTGGTATCAGC AGAAACCAGGACAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCC CATCGCGGTTCAAAGGCACGGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCACAGACGTGCAGT GTGACGATGCTGCCACTTACTATTGTGCAGGCGTTTTTAATGATGATAGTGATGATGÓC SEQ ID NO: 259 ' ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCCCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCA ¡ CACTCTCTGGATTCTCCCTCAGTGCATACTATATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG i GGCTGGAATGGATCGGATTCATTACTCTGAGTGATCATATATCTTACGCGAGGTGGGCGAAAG i GCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCCGACAACCG AGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGGAGTCGTGGCTGGGGTGCAATGGGTCGGTTGGATC C SEQ ID NO: 260 CAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGACAACAACTATTTATCC ? SEQ ID NO: 261 GGTGCATCCACTCTGGCATCT SEQ ID NO: 262 GCAGGCGTTTTTAATGATGATAGTGATGATGCC SEQ ID NO: 263 ; GCATACTATATGAGC SEQ ID NO: 264 TTCATTACTCTGAGTGATCATATATCTTACGCGAGGTGGGCGAAAGGC SEQ ID NO: 265 AGTCGTGGCTGGGGTGCAATGGGTCGGTTGGATCTC SEQ ID NO: 266 1 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAAVLTQTPSPVSAAVGGTVTISCQASQSVYNNKNLA WYQQKSGQPPKLLIYWASTLASGVSSRFSGSGSGTQFTLTVSGVQCDDAATYYCLGVFDDDAD NA SEQ ID NO: 267 METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSSYS WVRQA PGKGLEYIGVIGTSGSTYYATWAKGRFTISRTSTTVALKITSPTTEDTATYFCVRSLSSITFL SEQ ID NO: 268 QASQSVYNNKNLA j SEQ ID NO: 269 , ASTLAS ' ; SEQ ID NO: 270 I LGVFDDDADNA SEQ ID NO: 271 SYSMT SEQ ID NO: 272 VIGTSGSTYYATWAKG SEQ ID NO: 273 SLSSITFL SEQ ID NO: 274 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCACATTCGCAGCCGTGCTGACCCAGACACCATCGCCCGTGTCTGCGGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAGTTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATAACAACAAAAATTTAGCCTGGTATCAGC AGAAATCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACTGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCT CATCGCGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCGTCAGCGGCGTGCAGT GTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCGTTTTTGATGATGATGCTGATAATGCT SEQ ID NO: 275 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAATGTC i AGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCAGCTGCA CAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTACTCCATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAATATATCGGAGTCATTGGTACTAGTGGTAGCACATACTACGCGACCTGGGGGAAAG GCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGACCACGGTGGCTCTGAAAATCACCAGTCCGAGAACCG AGGACACGGCCACCTATTTCTGTGTCAGGAGTCTTTCTTCTATTACTTTCTTG SEQ ID NO: 276 CAGGCCAGTCAGAGTGTTTATAACAACAAAAATTTAGCC SEQ ID NO: 277 TGGGCATCCAGTCTGGCATCT SEQ ID NO: 278 CTAGGCGTTTTTGATGATGATGCTGATAATGCT SEQ ID NO: 279 AGCTACTCCATGACC SEQ ID NO: 280 GTCATTGGTACTAGTGGTAGCACATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGC SEQ ID NO: 281 AGTCTTTCTTCTATTACTTTCTTG ; SEQ ID NO: 282 J MDTRAPTQLLGLLLL LPGARCAFELTQTPASVEAAVGGTVTINCQASQNIYRYLAWY QQKPGQPPKFLIYLASTLASGVPSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQSYYSSNSVA SEQ ID NO: 283 ETGLRWLLLVAVLKGVQCQEQLVESGGDLVQPEGSLTLTCTASELDFSSGYWIC VR QVPGKGLE IGCIYTGSSGSTFYASWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARGYS GFGYFKL SEQ ID NO: 284 QASQNIYRYLA SEQ ID NO: 285 : LASTLAS SEQ ID NO: 286 ! QSYYSSNSVA SEQ ID NO: 287 SGY IC ; SEQ ID NO: 288 ; CIYTGSSGSTFYASWAKG SEQ ID NO: 289 GYSGFGYFKL SEQ ID NO: 290 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCAGATGTGCATTCGAATTGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAACATTTATAGATACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAAC i CAGGGCAGCCTCCCAAGTTCCTGATCTATCTGGCATCTACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGC GGTTTAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCG ATGCTGCCACTTACTACTGTCAAAGTTATTATAGTAGTAATAGTGTCGCT SEQ ID NO: 291 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGGAGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCCAGCCTGAGGGATCCCTGACAGTCACCT GCACAGCTTCTGAGTTAGACTTCAGTAGCGGCTACTGGATATGCTGGGTCCGCCAGGTTCCAG GGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATGCATTTATACTGGTAGTAGTGGTAGCACTTTTTACGCGA GTTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGGAAATGA CCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGGTTATAGTGGCTTTGGTT ACTTTAAGTTG ! SEQ ID NO: 292 CAGGCCAGTCAGAACATTTATAGATACTTAGCC SEQ ID NO: 293 ! CTGGCATCTACTCTGGCATCT SEQ ID NO: 294 CAAAGTTATTATAGTAGTAATAGTGTCGCT i SEQ ID NO: 295 AGCGGCTACTGGATATGC SEQ ID NO: 296 TGCATTTATACTGGTAGTAGTGGTAGCACTTTTTACGCGAGTTGGGCGAAAGGC SEQ ID NO: 297 GGTTATAGTGGCTTTGGTTACTTTAAGTTG SEQ ID NO: 298 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQ PASVEVAVGGTVTIKCQASEDIYRLLAWY QQKPGQPPKLLIYDSSDLASGVPSRFKGSGSGTEFTLAISGVQCDDAATYYCQQAWSYSDIDN A SEQ ID NO: 299 METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSSYYMS VRQA PGKGLEWIGIITTSGNTFYASWAKGRLTISRTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARTSDIFYYR NL SEQ ID NO: 300 QASEDIYRLLA SEQ ID NO: 301 DSSDLAS SEQ ID NO: 302 ; QQAWSYSDIDNA i SEQ ID NO: 303 , SYYMS SEQ ID NO: 304 IITTSGNTFYAS AKG SEQ ID NO: 305 TSDIFYYRNL SEQ ID NO: 306 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCAGATGTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGGACATTTATAGGTTATTGGCCTGGTATCAACAGAAAC CAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGATTCATCCGATCTGGCATCTGGGGTCCCATCGC GGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCGCCATCAGCGGTGTGCAGTGTGACG ATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGCTTGGAGTTATAGTGATATTGATAATGCT : SEQ ID NO: 307 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCGGGGACACCCCTGACACTCAtCTGCA CAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAATGGATCGGAATCATTACTACTAGTGGTAATACATTTTACGCGAGCTGGGCGAAAG GCCGGCTCACCATCTCCAGAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGÁCAACCG AGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAACTTCTGATATTTTTTATTATCGTAACT.TG SEQ ID NO: 308 CAGGCCAGTGAGGACATTTATAGGTTATTGGCC SEQ ID NO: 309 GATTCATCCGATCTGGCATCT SEQ ID NO: 310 ! CAACAGGCTTGGAGTTATAGTGATATTGATAATGCT I SEQ ID NO: 311 AGCTACTACATGAGC : SEQ ID NO: 312 : ATCATTACTACTAGTGGTAATACATTTTACGCGAGCTGGGCGAAAGGC SEQ ID NO: 313 í ACTTCTGATATTTTTTATTATCGTAACTTG SEQ ID NO: 314 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAAVLTQTASPVSAAVGATVTINCQSSQSVYNDMDLA WFQQKPGQPPKLLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISGVQCDDAATYYCLGAFDDDAD NT SEQ ID NO: 315 METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLTRHAIT VRQA PGKGLEWIGCI SGGSTYYATWAKGRFTISKTSTTVDLRITSPTTEDTATYFCARVIGDTAGY AYFTGLDL ; SEQ ID NO: 316 QSSQSVYNDMDLA SEQ ID NO: 317 SASTLAS SEQ ID NO: 318 LGAFDDDADNT SEQ ID NO: 319 RHAIT ; SEQ ID NO: 320 CI SGGSTYYATWAKG SEQ ID NO: 321 ; VIGDTAGYAYFTGLDL [' SEQ ID NO: 322 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCGAGGTG CCACGTTTGCAGCCGTGCTGACCCAGACTGCATCACCCGTGTCTGCCGCTGTGGGAG'CCACAG TCACCATCAACTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAATGACATGGACTTAGCCTGGT!TTCAGC AGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCC CATCGCGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGT GTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCGCTTTTGATGATGATGCTGATAATACT SEQ ID NO: 323 •ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCA CAGTCTCTGGATTCTCCCTCACTAGGCATGCAATAACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAATGGATCGGATGCATTTGGAGTGGTGGTAGCACATACTACGCGACCTGGGCGAAAG GCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTCAGAATCACCAGTCCGACAACCG AGGACACGGCCACCTACTTCTGTGCCAGAGTCATTGGCGATACTGCTGGTTATGCTTÁTTTTA CGGGGCTTGACTTG SEQ ID NO: 324 CAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAATGACATGGACTTAGCC SEQ ID NO: 325 TCTGCATCCACTCTGGCATCT SEQ ID NO: 326 CTAGGCGCTTTTGATGATGATGCTGATAATACT SEQ ID NO: 327 AGGCATGCAATAACC SEQ ID NO: 328 TGCATTTGGAGTGGTGGTAGCACATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGC SEQ ID NO: 329 GTCATTGGCGATACTGCTGGTTATGCTTATTTTACGGGGCTTGACTTG SEQ ID NO: 330 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSVYN LSWY QQKPGQPPKLLIYTASSLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISGVECADAATYYCQQGYTSDVDNV SEQ ID NO: 331 METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEEAGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSYAMG VRQA PGKGLEYIGIISSSGSTYYATWAKGRFTISQASSTTVDLKITSPTTEDSATYFCARGGAGSGG VWLLDGFDP SEQ ID NO: 332 QASQSVYNWLS SEQ ID NO: 333 TASSLAS SEQ ID NO: 334 QQGYTSDVDNV SEQ ID NO: 335 SYAMG SEQ ID NO: 336 IISSSGSTYYATWAKG SEQ ID NO: 337 GGAGSGGVWLLDGFDP SEQ ID NO: 338 j ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCGAGGTG CCAGATGTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATAATTGGTTATCCTGGTATCAGCAGAAAC CAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATACTGCATCCAGTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGC GGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGGAGTGTGCCG ATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATACTAGTGATGTTGATAATGTT ; SEQ ID NO: 339 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCA'GTGTC AGTCGCTGGAGGAGGCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCA CAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTAGCTATGCAATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAATACATCGGAATCATTAGTAGTAGTGGTAGCACATACTACGCGACCTGGGCGAAAG GCCGATTCACCATCTCACAAGCCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATTACCAGTCCGACAA CCGAGGACTCGGCCACATATTTCTGTGCCAGAGGGGGTGCTGGTAGTGGTGGTGTTTGGCTGC TTGATGGTTTTGATCCC SEQ ID NO: 340 CAGGCCAGTCAGAGTGTTTATAATTGGTTATCC SEQ ID NO: 341 ACTGCATCCAGTCTGGCATCT SEQ ID NO: 342 CAACAGGGTTATACTAGTGATGTTGATAATGTT SEQ ID NO: 343 AGCTATGCAATGGGC SEQ ID NO: 344 ATCATTAGTAGTAGTGGTAGCACATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGC SEQ ID NO: 345 GGGGGTGCTGGTAGTGGTGGTGTTTGGCTGCTTGATGGTTTTGATCCC SEQ ID NO: 346 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGA CADVVMTQTPASVSAAVGGTVTINCQASENIYN LAW YQQKPGQPPKLLIYTVGDLASGVSSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQQGYSSSYVD NV ¦ SEQ ID NO: 347 METGLRWLLLVAVLKGVQCQEQLKESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLNDYAVGWFRQ APGKGLE IGYIRSSGTTAYATWAKGRFTISATSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGGÁGSSG VWILDGFAP SEQ ID NO: 348 QASE IYNWLA SEQ ID NO: 349 TVGDLAS SEQ ID NO: 350 QQGYSSSYVDNV SEQ ID NO: 351 DYAVG SEQ ID NO: 352 YIRSSGTTAYATWAKG SEQ ID NO: 353 GGAGSSGVWILDGFAP SEQ ID NO: 354 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCAAATGTGCCGATGTTGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCA CAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTGAGAACATTTATAATTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGA AACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATACTGTAGGCGATCTGGCATCTGGGGTCTCAT CGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTG CCGATGCTGCCACTTACTATTGTCAACAGGGTTATAGTAGTAGTTATGTTGATAATGTT SEQ ID NO: 355 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGGAGCAGCTGAAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCT GCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAATGACTATGCAGTGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGA AGGGGCTGGAATGGATCGGATACATTCGTAGTAGTGGTACCACAGCCTACGCGACCTGGGCGA AAGGCCGATTCACCATCTCCGCTACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCGGACAA CCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGGGTGCTGGTAGTAGTGGTGTGTGGATCC TTGATGGTTTTGCTCCC SEQ ID NO: 356 CAGGCCAGTGAGAACATTTATAATTGGTTAGCC SEQ ID NO: 357 ACTGTAGGCGATCTGGCATCT : SEQ ID NO: 358 ; CAACAGGGTTATAGTAGTAGTTATGTTGATAATGTT SEQ ID NO: 359 GACTATGCAGTGGGC SEQ ID NO: 360 TACATTCGTAGTAGTGGTACCACAGCCTACGCGACCTGGGCGAAAGGC SEQ ID NO: 361 GGGGGTGCTGGTAGTAGTGGTGTGTGGATCCTTGATGGTTTTGCTCCC SEQ ID NO: 362 , DTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQVLTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASQSVYQNNYLS WFQQKPGQPPKLLIYGAATLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCAGAYRDVDS SEQ ID NO: 363 METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGDLVKPGASLTLTCTASGFSFTSTYYIYWVRQ APGKGLE IACIDAGSSGSTYYAT VNGRFTISKTSSTTVTLQ TSLTAADTATYFCAK DYG GNVGWGYDL ; SEQ ID NO: 364 i QASQSVYQNNYLS SEQ ID NO: 365 : GAATLAS SEQ I D NO : 366 AGAYRDVDS SEQ I D NO : 367 STYYIY : SEQ I D NO : 368 CI DAGSSGSTYYATWVNG SEQ I D NO : 369 j WDYGGNVGWGYDL · SEQ I D NO : 370 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCACATTTGCTCAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCAGAACAACTACTTATCCTGGTTTCAGC AGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCGGCCACTCTGGCATCTGGGGTCC CATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGT GTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGCTTATAGGGATGTGGATTCT SEQ I D NO : 371 : ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCAAGCCTGGGGCATCCCTGACACTCACCTGCA CAGCCTCTGGATTCTCCTTTACTAGTACCTACTACATCTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGA AGGGGCTGGAGTGGATCGCATGTATTGATGCTGGTAGTAGTGGTAGCACTTACTACGCGACCT GGGTGAATGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCA GTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAAATGGGATTATGGTGGTAATGTTG GTTGGGGTTATGACTTG SEQ I D NO : 372 ! CAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCAGAACAACTACTTATCC SEQ ID NO: 373 GGTGCGGCCACTCTGGCATCT SEQ ID NO: 374 GCAGGCGCTTATAGGGATGTGGATTCT ; SEQ ID NO: 375 AGTACCTACTACATCTAC SEQ ID NO: 376 TGTATTGATGCTGGTAGTAGTGGTAGCACTTACTACGCGACCTGGGTGAATGGC SEQ ID NO: 377 TGGGATTATGGTGGTAATGTTGGTTGGGGTTATGACTTG SEQ ID NO: 378 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAFELTQTPSSVEAAVGGTV IKCQASQSISSYLAWY QQKPGQPPKFLIYRASTLASGVPSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQSYYDSVSNP SEQ ID NO: 379 METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGDLVKPEGSLTLTCKASGLDLGTYWFMCWVRQ APGKGLEWIACIYTGSSGSTFYASWVNGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARGYSG YGYFKL SEQ ID NO: 380 QASQSISSYLA SEQ ID NO: 381 RASTLAS , SEQ ID NO: 382 .
QSYYDSVSNP i SEQ ID NO: 383 j TYWFMC SEQ ID NO: 384 CIYTGSSGSTFYASWVNG SEQ ID NO: 385 GYSGYGYFKL SEQ ID NO: 386 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCC.AGGTG CCAGATGTGCATTCGAATTGACCCAGACTCCATCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGTAGTTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAAC CAGGGCAGCCTCCCAAGTTCCTGATCTACAGGGCGTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGC GATTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCG ATGCTGCCACTTACTACTGTCAAAGCTATTATGATAGTGTTTCAAATCCT SEQ ID NO: 387 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCAAGCCTGAGGGATCCCTGACACTCACCTGCA AAGCCTCTGGACTCGACCTCGGTACCTACTGGTTCATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGA AGGGGCTGGAGTGGATCGCTTGTATTTATACTGGTAGTAGTGGTTCCACTTTCTACGCGAGCT GGGTGAATGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCA GTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACTTATTTTTGTGCGAGAGGTTATAGTGGTTATGGTTATT TTAAGTTG SEQ ID NO: 388 CAGGCCAGTCAGAGCATTAGTAGTTACTTAGCC SEQ ID NO: 389 AGGGCGTCCACTCTGGCATCT SEQ ID NO: 390 ! CAAAGCTATTATGATAGTGTTTCAAATCCT .
SEQ ID NO: 391 ACCTACTGGTTCATGTGC SEQ ID NO: 392 TGTATTTATACTGGTAGTAGTGGTTCCACTTTCTACGCGAGCTGGGTGAATGGC SEQ ID NO: 393 GGTTATAGTGGTTATGGTTATTTTAAGTTG SEQ ID NO: 394 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGVTFAIEMTQSPFSVSAAVGGTVSISCQASQSVYKNNQLS WYQQKSGQPPKLLIYGASALASGVPSRFKGSGSGTEFTLTISDVQCDDAATYYCAGAÍTGSID TDG SEQ ID NO: 395 METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGDLVKPGASLTLTCTTSGFSFSSSYFICWVRQ APGKGLE IACIYGGDGSTYYASWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCAREWAYS QGYFGAFDL ; SEQ ID NO: 396 QASQSVYKNNQLS ' SEQ ID NO: 397 GASALAS SEQ ID NO: 398 AGAITGSIDTDG SEQ ID NO: 399 ' SSYFIC i SEQ ID NO: 400 CIYGGDGSTYYASWAKG [ SEQ ID NO: 401 EWAYSQGYFGAFDL SEQ ID NO: 402 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG TCACATTTGCCATCGAAATGACCCAGAGTCCATTCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCAGCATCAGTTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATAAGAACAACCAATTATCCTGGTATCAGC AGAAATCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCGGCTCTGGCATCTGGGGTCC CATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGT GTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGCTATTACTGGTAGTATTGATACGGATGGT SEQ ID NO: 403 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCAAGCCTGGGGCATCCCTGACACTCACCTGCA CAACTTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCAGCTACTTCATTTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGA AGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTTATGGTGGTGATGGCAGCACATACTACGCGAGCTGGG CGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACGCTGCAAATGACCAGTC TGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGAATGGGCATATAGTCAAGGTTATT TTGGTGCTTTTGATCTC ; SEQ ID NO: 404 CAGGCCAGTCAGAGTGTTTATAAGAACAACCAATTATCC SEQ ID NO: 405 GGTGCATCGGCTCTGGCATCT , ; SEQ ID NO: 406 GCAGGCGCTATTACTGGTAGTATTGATACGGATGGT SEQ ID NO: 407 AGCAGCTACTTCATTTGC ; SEQ ID NO: 408 TGCATTTATGGTGGTGATGGCAGCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGC SEQ ID NO: 409 GAATGGGCATATAGTCAAGGTTATTTTGGTGCTTTTGATCTC SEQ ID NO: 410 MDTRAPTQLLGLLLL LPGARCDVVMTQTPASVEAAVGGTVTIKCQASEDISSYLAWY QQKPGQPPKLLIYAASNLESGVSSRFKGSGSGTEYTLTISDLECADAATYYCQCTYGTISISD GNA SEQ ID NO: 411 ! METGLR LLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYFMT VRQA PGEGLEYIGFINPGGSAYYASWVKGRFTISKSSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARVLIVSYGA FTI SEQ ID NO: 412 QASEDISSYLA SEQ ID NO: 413 AASNLES SEQ ID NO: 414 QCTYGTISISDGNA ? SEQ ID NO: 415 SYFMT ! SEQ ID NO: 416 ' FINPGGSAYYAS VKG SEQ ID NO: 417 VLIVSYGAFTI SEQ ID NO: 418 ; ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCAGATGTGATGTTGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGGATATTAGTAGCTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAAC CAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAATCTGGAATCTGGGGTCTGATCGC GATTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCG ATGCTGCCACCTATTACTGTCAATGTACTTATGGTACTATTTCTATTAGTGATGGTAATGCT SEQ ID NO: 419 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAATGTC AGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCA CAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTACTTCATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGGAGG GGCTGGAATACATCGGATTCATTAATCCTGGTGGTAGCGCTTACTACGCGAGCTGGGTGAAAG GCCGATTCACCATCTCCAAGTCCTCGACCACGGTAGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCG AGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGGGTTCTGATTGTTTCTTATGGAGCCTTTACCATC SEQ ID NO: 420 CAGGCCAGTGAGGATATTAGTAGCTACTTAGCC SEQ ID NO: 421 ' GCTGCATCCAATCTGGAATCT SEQ ID NO: 422 CAATGTACTTATGGTACTATTTCTATTAGTGATGGTAATGCT SEQ ID NO: 423 AGCTACTTCATGACC : SEQ ID NO: 424 TTCATTAATCCTGGTGGTAGCGCTTACTACGCGAGCTGGGTGAAAGGC SEQ ID NO: 425 ' GTTCTGATTGTTTCTTATGGAGCCTTTACCATC i SEQ ID NO: 426 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCDVVMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASEDIESYLAWY QQKPGQPPKLLIYGASNLESGVSSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQCTYGIISISD GNA ! SEQ ID NO: 427 METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYFMTWVRQA PGEGLEYIGFMNTGDNAYYAS AKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARVLVVAYGA FNI ' ' SEQ ID NO: 428 , QASEDIESYLA SEQ ID NO: 429 GASNLES SEQ ID NO: 430 QCTYGIISISDGNA SEQ ID NO: 431 SYF T SEQ ID NO: 432 ! FMNTGDNAYYASWAKG SEQ ID NO: 433 VLVVAYGAFNI SEQ ID NO: 434 ; ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCÁGGTG CCAGATGTGATGTTGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGGACATTGAAAGCTATCTAGCCTGGTATCAGCAGAAAC CAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGAATCTGGGGTCTCATCGC GGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCG ATGCTGCCACTTACTATTGTCAATGCACTTATGGTATTATTAGTATTAGTGATGGTAATGCT SEQ ID NO: 435 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCÁGTGTC AGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCA CAGTGTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTACTTCATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGGAGG GGCTGGAATACATCGGATTCATGAATACTGGTGATAACGCATACTACGCGAGCTGGGGGAAAG GCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCG AGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGGGTTCTTGTTGTTGCTTATGGAGCCTTTAÁCATC SEQ ID NO: 436 ! CAGGCCAGTGAGGACATTGAAAGCTATCTAGCC SEQ ID NO: 437 GGTGCATCCAATCTGGAATCT SEQ ID NO: 438 CAATGCACTTATGGTATTATTAGTATTAGTGATGGTAATGCT SEQ ID NO: 439 AGCTACTTCATGACC ' SEQ ID NO: 440 '< TTCATGAATACTGGTGATAACGCATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGC SEQ ID NO: 441 ' GTTCTTGTTGTTGCTTATGGAGCCTTTAACATC SEQ ID NO: 442 DTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAAVLTQTPSPVSEPVGGTVSISCQSSKSV NNNYLA WYQQKPGQPPKLLIYGASNLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCQGGYTGYSD HGT SEQ ID NO: 443 ETGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVKPDETLTLTCTVSGIDLSSYPMNWVRQA PGKGLE IGFINTGGTIVYASWAKGRFTISKTSTTVDLKMTSPTTEDTATYFCARGSYVSSGY AYYFNV ; SEQ ID NO: 444 QSSKSV NNNYLA SEQ ID NO: 445 GAS LAS SEQ ID NO: 446 QGGYTGYSDHGT SEQ ID NO: 447 SYPMN SEQ ID NO: 448 FINTGGTIVYASWAKG SEQ ID NO: 449 GSYVSSGYAYYFNV ; SEQ ID NO: 450 : ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCACATTTGCCGCCGTGCTGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGAACCTGTGGGAGGCACAG TCAGCATCAGTTGCCAGTCCAGTAAGAGTGTTATGAATAACAACTACTTAGCCTGGTATCAGC AGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGCATCTGGGGTCC CATCACGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGT GTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAGGCGGTTATACTGGTTATAGTGATCATGGGACT SEQ ID NO: 451 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCAAGCCTGACGAAACCCTGACACTCAGCTGCA CAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTAGCTATCCAATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAATGGATCGGATTCATTAATACTGGTGGTACCATAGTCTACGCGAGCTGGGCAAAAG GCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCCGACAACCG AGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGCAGTTATGTTTCATCTGGTTATGCCTACTATT TTAATGTC SEQ ID NO: 452 CAGTCCAGTAAGAGTGTTATGAATAACAACTACTTAGCC SEQ ID NO: 453 GGTGCATCCAATCTGGCATCT SEQ ID NO: 454 CAAGGCGGTTATACTGGTTATAGTGATCATGGGACT SEQ ID NO: 455 AGCTATCCAATGAAC SEQ ID NO: 456 TTCATTAATACTGGTGGTACCATAGTCTACGCGAGCTGGGCAAAAGGC SEQ ID NO: 457 GGCAGTTATGTTTCATCTGGTTATGCCTACTATTTTAATGTC SEQ ID NO: 458 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSQSVYNNN LS WFQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDVATYYCAGGYLDSVI SEQ ID NO: 459 METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSTYSINWVRQA PGKGLEWIGIIANSGTTFYANWAKGRFTVSKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARESGMYNEY GKFNI Í SEQ ID NO: 460 QSSQSVYNNNWLS SEQ ID NO: 461 KASTLAS SEQ ID NO: 462 AGGYLDSVI SEQ ID NO: 463 TYSIN SEQ ID NO: 464 IIANSGTTFYANWAKG SEQ ID NO: 465 ESGMYNEYGKFNI SEQ ID NO: 466 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCACATTTGCCGCCGTGCTGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCAGCATCAGTTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAATAACAACTGGTTATCCTGGTT|TCAGC AGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCC CATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGT GTGACGATGTTGCCACTTACTACTGTGCGGGCGGTTATCTTGATAGTGTTATT SEQ ID NO: 467 ! ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCA CAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTACCTATTCAATAAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GCCTGGAATGGATCGGAATCATTGCTAATAGTGGTACCACATTCTACGCGAACTGGGCGAAAG GCCGATTCACCGTCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCG AGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGAGAGTGGAATGTACAATGAATATGGTAAATTTA ACATC SEQ ID NO: 468 CAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAATAACAACTGGTTATCC SEQ ID NO: 469 AAGGCATCCACTCTGGCATCT SEQ ID NO: 470 GCGGGCGGTTATCTTGATAGTGTTATT SEQ ID NO: 471 : ACCTATTCAATAAAC SEQ ID NO: 472 ; ATCATTGCTAATAGTGGTACCACATTCTACGCGAACTGGGCGAAAGGC SEQ ID NO: 473 GAGAGTGGAATGTACAATGAATATGGTAAATTTAACATC SEQ ID NO: 474 DTRAPTQLLGLLLLWLPGARCASDMTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASENIYSFLAWY QQKPGQPPKLLIFKASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCQQGATVYDIDN N ? SEQ ID NO: 475 METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSAYAMI VRQA PGEGLEWITIIYPNGITYYANWAKGRFTVSKTSTAMDLKITSPTTEDTATYFCARDAESSKNA YWGYFNV SEQ ID NO: 476 QASENIYSFLA SEQ ID NO: 477 ' KASTLAS SEQ ID NO: 478 QQGATVYDIDNN SEQ ID NO: 479 AYAMI SEQ ID NO: 480 IIYPNGITYYAN AKG SEQ ID NO: 481 DAESSKNAYWGYFNV SEQ ID NO: 482 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCAGATGTGCCTCTGATATGACCCAGACTCCATCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAATTGCCAGGCCAGTGAGAACATTTATAGCTTTTTGGCCTGGTATCAGCAGAAAC CAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTTCAAGGCTTCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGC GGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACG ATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTGCTACTGTGTATGATATTGATAATAAT SEQ ID NO: 483 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCA CAGTTTCTGGAATCGACCTCAGTGCCTATGCAATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGGAGG GGCTGGAATGGATCACAATCATTTATCCTAATGGTATCACATACTACGCGAACTGGGCGAAAG GCCGATTCACCGTCTCCAAAACCTCGACCGCGATGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCG AGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGATGCAGAAAGTAGTAAGAATGCTTATTGGGGCT ACTTTAACGTC ' SEQ ID NO: 484 ; CAGGCCAGTGAGAACATTTATAGCTTTTTGGCC SEQ ID NO: 485 AAGGCTTCCACTCTGGCATCT SEQ ID NO: 486 : CAACAGGGTGCTACTGTGTATGATATTGATAATAAT 1 SEQ ID NO: 487 GCCTATGCAATGATC SEQ ID NO: 488 ATCATTTATCCTAATGGTATCACATACTACGCGAACTGGGCGAAAGGC SEQ ID NO: 489 GATGCAGAAAGTAGTAAGAATGCTTATTGGGGCTACTTTAACGTC SEQ ID NO: 490 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCASDMTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASENIYSFLAWY QQKPGQPPKLLIFRASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCQQGATVYDIDN N SEQ ID NO: 491 METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSAYAMI VRQA PGEGLEWITIIYPNGITYYANWAKGRFTVSKTSTAMDLKITSPTTEDTATYFCARDAESSKNA YWGYFNV : SEQ ID NO: 492 QASENIYSFLA SEQ ID NO: 493 RASTLAS SEQ ID NO: 494 QQGATVYDIDNN | SEQ ID NO: 495 AYA I SEQ ID NO: 496 I IYPNGITYYAN AKG SEQ ID NO: 497 DAESSKNAYWGYFNV SEQ ID NO: 498 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCAGATGTGCCTCTGATATGACCCAGACTCCATCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAATTGCCAGGCCAGTGAGAACATTTATAGCTTTTTGGCCTGGTATCAGCAGAAAC CAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTTCAGGGCTTCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGC GGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACG ATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTGCTACTGTGTATGATATTGATAATAAT SEQ ID NO: 499 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACPTGCA CAGTTTCTGGAATCGACCTCAGTGCCTATGCAATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGGAGG GGCTGGAATGGATCACAATCATTTATCCTAATGGTATCACATACTACGCGAACTGGGCGAAAG GCCGATTCACCGTCTCCAAAACCTCGACCGCGATGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCG AGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGATGCAGAAAGTAGTAAGAATGCTTATTGGGGCT ACTTTAACGTC SEQ ID NO: 500 CAGGCCAGTGAGAACATTTATAGCTTTTTGGCC SEQ ID NO: 501 AGGGCTTCCACTCTGGCATCT ' SEQ ID NO: 502 CAACAGGGTGCTACTGTGTATGATATTGATAATAAT SEQ ID NO: 503 GCCTATGCAATGATC SEQ ID NO: 504 i ATCATTTATCCTAATGGTATCACATACTACGCGAACTGGGCGAAAGGC SEQ ID NO: 505 GATGCAGAAAGTAGTAAGAATGCTTATTGGGGCTACTTTAACGTC ; SEQ ID NO: 506 ' MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAIEMTQTPSPVSAAVGGTVTINCQASESVFNNMLSW YQQKPGHSPKLLIYDASDLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISGVECDDAATYYCAGYKSDSNDG DNV SEQ ID NO: 507 : METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLNRNSITWVRQA PGEGLEWIGIITGSGRTYYANWAKGRFTISKTSTTVDLKMTSPTTEDTATYFCARGHPGLGSG NI : SEQ ID NO: 508 ; QASESVFNNMLS .
SEQ ID NO: 509 ' DASDLAS SEQ ID NO: 510 AGYKSDSNDGDNV ; SEQ ID NO: 511 ! RNSIT SEQ ID NO: 512 '· I ITGSGRTYYAN AKG SEQ ID NO: 513 GHPGLGSGNI SEQ ID NO: 514 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCACATTTGCCATTGAAATGACCCAGACTCCATCCCCCGTGTCTGCCGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAATTGCCAGGCCAGTGAGAGTGTTTTTAATAATATGTTATCCTGGTATCAGCAGA AACCAGGGCACTCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCGATCTGGCATCTGGGG CCCAT CGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGTGGCGTGGAGTGTG ACGATGCTGCCACTTACTATTGTGCAGGGTATAAAAGTGATAGTAATGATGGCGATAATGTT SEQ ID NO: 515 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCA CAGTCTCTGGATTCTCCCTCAACAGGAATTCAATAACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGGAGG GGCTGGAATGGATCGGAATCATTACTGGTAGTGGTAGAACGTACTACGCGAACTGGGCAAAAG GCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCCGAC;AACCG AGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGCCATCCTGGTCTTGGTAGTGGTAACATC SEQ ID NO: 516 CAGGCCAGTGAGAGTGTTTTTAATAATATGTTATCC SEQ ID NO: 517 GATGCATCCGATCTGGCATCT SEQ ID NO: 518 GCAGGGTATAAAAGTGATAGTAATGATGGCGATAATGTT SEQ ID NO: 519 AGGAATTCAATAACC SEQ ID NO: 520 ATCATTACTGGTAGTGGTAGAACGTACTACGCGAACTGGGCAAAAGGC SEQ ID NO: 521 GGCCATCCTGGTCTTGGTAGTGGTAACATC SEQ ID NO: 522 i MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQVLTQTASSVSAAVGGTVTINCQSSQSVYNNYLSW YQQKPGQPPKLLIYTASSLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISEVQCDDAATYYCQGYYSGPIIT SEQ ID NO: 523 ; METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLNNYYIQ VRQA PGEGLEWIGIIYAGGSAYYATWANGRFTIAKTSSTTVDLK TSLTTEDTATYFCARG FDGYE L SEQ ID NO: 524 QSSQSVYNNYLS SEQ ID NO: 525 TASSLAS SEQ ID NO: 526 QGYYSGPIIT SEQ ID NO: 527 NYYIQ SEQ ID NO: 528 I IYAGGSAYYAT ANG SEQ ID NO: 529 GTFDGYEL SEQ ID NO: 530 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCÁGGTG CCACATTTGCGCAAGTGCTGACCCAGACTGCATCGTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAATTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAATAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGA AACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATACTGCATCCAGCCTGGCATCTGGGGTCCCAT CGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGAAGTGCAGTGTG ACGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAGGCTATTATAGTGGTCCTATAATTACT SEQ ID NO: 531 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCA CAGCCTCTGGATTCTCCCTCAATAACTACTACATACAATGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGGAGG GGCTGGAATGGATCGGGATCATTTATGCTGGTGGTAGCGCATACTACGCGACCTGGGCAAACG GCCGATTCACCATCGCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAGATGACCAGTCTGACAA CCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGACATTTGATGGTTATGAGTTG SEQ ID NO: 532 CAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAATAACTACTTATCC SEQ ID NO: 533 ACTGCATCCAGCCTGGCATCT SEQ ID NO: 534 : CAAGGCTATTATAGTGGTCCTATAATTACT SEQ ID NO: 535 AACTACTACATACAA SEQ ID NO: 536 ATCATTTATGCTGGTGGTAGCGCATACTACGCGACCTGGGCAAACGGC SEQ ID NO: 537 GGGACATTTGATGGTTATGAGTTG SEQ ID NO: 538 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQVLTQTPSPVSVPVGDTVTISCQSSESVYSNNLLS YQQKPGQPPKLLIYRASNLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISGAQCDDAATYYCQGYYSGVIN S SEQ ID NO: 539 ETGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYF SWVRQA PGEGLEYIGFINPGGSAYYASWASGRLTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARILIVSYGA FTI SEQ ID NO: 540 QSSESVYSNNLLS SEQ ID NO: 541 ¦ RASNLAS SEQ ID NO: 542 QGYYSGVINS ; SEQ ID NO: 543 SYF S SEQ ID NO: 544 FINPGGSAYYAS ASG ! SEQ ID NO: 545 i ILIVSYGAFTI ' SEQ ID NO: 546 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCACATTTGCCCAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCTGTGTCTGTCCCTGTGGGAGACACAG TCACCATCAGTTGCCAGTCCAGTGAGAGCGTTTATAGTAATAACCTCTTATCCTGGTATCAGC AGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAGGGCATCCAATCTGGCATCTGGTGTCC CATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGGACAGT GTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAGGCTATTATAGTGGTGTCATTAATAGT SEQ ID NO: 547 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCAGCTGCA CAGTGTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTACTTCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGGAGG GGCTGGAATACATCGGATTCATTAATCCTGGTGGTAGCGCATACTACGCGAGCTGGGGGAGTG GCCGACTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTAGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCG AGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGGATTCTTATTGTTTCTTATGGAGCCTTTACCATC SEQ ID NO: 548 CAGTCCAGTGAGAGCGTTTATAGTAATAACCTCTTATCC SEQ ID NO: 549 AGGGCATCCAATCTGGCATCT SEQ ID NO: 550 CAAGGCTATTATAGTGGTGTCATTAATAGT .
SEQ ID NO: 551 AGCTACTTCATGAGC SEQ ID NO: 552 ', TTCATTAATCCTGGTGGTAGCGCATACTACGCGAGCTGGGCGAGTGGC SEQ ID NO: 553 ATTCTTATTGTTTCTTATGGAGCCTTTACCATC SEQ ID NO: 554 : MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPASVEVAVGGTV IKCQATESIGNELSWY QQKPGQAPKLLIYSASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTITGVECDDAATYYCQQGYSSANIDN A ; SEQ ID NO: 555 : METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSKYY SWVRQA PEKGLKYIGYIDSTTVNTYYATWARGRFTISKTSTTVDLKITSPTSEDTATYFCARGSTYFTD GGHRLDL SEQ ID NO: 556 QATESIGNELS SEQ ID NO: 557 SASTLAS SEQ ID NO: 558 QQGYSSA IDNA SEQ ID NO: 559 KYYMS SEQ ID NO: 560 YIDSTTVNTYYATWARG SEQ ID NO: 561 GSTYFTDGGHRLDL SEQ ID NO: 562 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCAGATGTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAAGTGCCAGGCCACTGAGAGCATTGGCAATGAGTTATCCTGGTATCAGCAGAAAC CAGGGCAGGCTCCCAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGC GGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCACCGGCGTGGAGTGTGATG ATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATAGTAGTGCTAATATTGATAATGCT SEQ ID NO: 563 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCA CCGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAAGTACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGAGAAGG GGCTGAAATACATCGGATACATTGATAGTACTACTGTTAATACATACTACGCGACCTGGGCGA GAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAGATCACCAGTCGGACAA GTGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGAAGTACTTATTTTACTGATGGAGGCCATC GGTTGGATCTC SEQ ID NO: 564 CAGGCCACTGAGAGCATTGGCAATGAGTTATCC SEQ ID NO: 565 TCTGCATCCACTCTGGCATCT SEQ ID NO: 566 CAACAGGGTTATAGTAGTGCTAATATTGATAATGCT SEQ ID NO: 567 AAGTACTACATGAGC SEQ ID NO: 568 TACATTGATAGTACTACTGTTAATACATACTACGCGACCTGGGCGAGAGGC SEQ ID NO: 569 GGAAGTACTTATTTTACTGATGGAGGCCATCGGTTGGATCTC SEQ ID NO: 570 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQATESIGNELS Y QQKPGQAPKLLIYSASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTITGVECDDAATYYCQQGYSSANIDN A SEQ ID NO: 571 METGLR LLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSTYNMG VRQA PGKGLEWIGSITIDGRTYYASWAKGRFTVSKSSTTVDLKMTSLTTGDTATYFCARILIVSYGA FTI ; SEQ ID NO: 572 QATESIGNELS SEQ ID NO: 57.3 SASTLAS SEQ ID NO: 574 QQGYSSANIDNA SEQ ID NO: 575 TYNMG ; SEQ ID NO: 576 SITIDGRTYYAS AKG SEQ ID NO: 577 ILIVSYGAFTI SEQ ID NO: 578 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCAGATGTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAAGTGCCAGGCCACTGAGAGCATTGGCAATGAGTTATCCTGGTATCAGCAGAAAC CAGGGCAGGCTCCCAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGC GGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCACCGGCGTGGAGTGTGATG ATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATAGTAGTGCTAATATTGATAATGCT SEQ ID NO: 579 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTAACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCA CAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTACCTACAACATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAATGGATCGGAAGTATTACTATTGATGGTCGCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAG GCCGATTCACCGTCTCCAAAAGCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAACCG GGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGGATTCTTATTGTTTCTTATGGGGCCTTTAGCATC SEQ ID NO: 580 CAGGCCACTGAGAGCATTGGCAATGAGTTATCC SEQ ID NO: 581 TCTGCATCCACTCTGGCATCT SEQ ID NO: 582 CAACAGGGTTATAGTAGTGCTAATATTGATAATGCT .
SEQ ID NO: 583 ACCTACAACATGGGC SEQ ID NO: 584 AGTATTACTATTGATGGTCGCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGC SEQ ID NO: 585 ATTCTTATTGTTTCTTATGGGGCCTTTACCATC SEQ ID NO: 586 VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ; SEQ ID NO: 587 GTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGG TGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACA i GCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCT ACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAG AGTGT ; SEQ ID NO: 588 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS NSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM KNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR QQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 589 GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTG GGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGT GGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGAC TCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCT GCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTG ACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCC TCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGG TGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGG TGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCG TCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA AAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCAC AGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCC TGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGA ACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGC TCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGG CTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA SEQ ID NO: 590 VPPGEDSKDVAAPHR SEQ ID NO: 591 GEDSKDVAAPHRQPL SEQ ID NO: 592 SKDVAAPHRQPLTSS SEQ ID NO: 593 VAAPHRQPLTSSERI SEQ ID NO: 594 PHRQPLTSSERIDKQ SEQ ID NO: 595 QPLTSSERIDKQIRY SEQ ID NO: 596 TSSERIDKQIRYILD SEQ ID NO: 597 ERIDKQIRYILDGIS SEQ ID NO: 598 DKQIRYILDGISALR SEQ ID NO: 599 IRYILDGISALRKET SEQ ID NO: 600 ILDGISALRKETCNK SEQ ID NO: 601 GISALRKETCNKSNM SEQ ID NO: 602 ALRKETCNKSNMCES SEQ ID NO: 603 KETCNKSNMCESSKE SEQ ID NO: 604 CNKSNMCESSKEALA SEQ ID NO: 605 SNMCESSKEALAENN SEQ ID NO: 606 CESSKEALAENNLNL SEQ ID NO: 607 SKEALAENNLNLPKM SEQ ID NO: 608 ALAENNLNLPKMAEK SEQ ID NO: 609 ENNLNLPKMAEKDGC SEQ ID NO: 610 LNLPKMAEKDGCFQS SEQ ID NO: 611 PKMAEKDGCFQSGFN SEQ ID NO: 612 AEKDGCFQSGFNEET SEQ ID NO: 613 DGCFQSGFNEETCLV SEQ ID NO: 614 FQSGFNEETCLVKI I SEQ ID NO: 615 GFNEETCLVKI ITGL SEQ ID NO: 616 EETCLVKIITGLLEF SEQ ID NO: 617 CLVKIITGLLEFEVY SEQ ID NO: 618 KIITGLLEFEVYLEY SEQ ID NO: 619 TGLLEFEVYLEYLQN SEQ ID NO: 620 LEFEVYLEYLQNRFE SEQ ID NO: 621 EVYLEYLQNRFESSE SEQ ID NO: 622 LEYLQNRFESSEEQA SEQ ID NO: 623 LQNRFESSEEQARAV SEQ ID NO: 624 RFESSEEQARAVQMS SEQ ID NO: 625 SSEEQARAVQMSTKV SEQ ID NO: 626 EQARAVQMSTKVLIQ SEQ ID NO: 627 RAVQMSTKVLIQFLQ SEQ ID NO: 628 QMSTKVLIQFLQKKA SEQ ID NO: 629 TKVLIQFLQKKAKNL SEQ ID NO: 630 LIQFLQKKAKNLDAI SEQ ID NO: 631 FLQKKAKNLDAITTP SEQ ID NO: 632 KKAKNLDAITTPDPT SEQ ID NO: 633 KNLDAITTPDPTTNA SEQ ID NO: 634 DAITTPDPTTNASLL SEQ ID NO: 635 TTPDPTTNASLLTKL SEQ ID NO: 636 DPTTNASLLTKLQAQ SEQ ID NO: 637 TNASLLTKLQAQNQW SEQ ID NO: 638 SLLTKLQAQNQWLQD SEQ ID NO: 639 TKLQAQNQWLQDMTT SEQ ID NO: 640 QAQNQWLQDMTTHLI SEQ ID NO: 641 NQWLQDMTTHLILRS SEQ ID NO: 642 LQDMTTHLILRSFKE SEQ ID NO: 643 MTTHLILRSFKEFLQ SEQ ID NO: 644 HLILRSFKEFLQSSL SEQ ID NO: 645 LRSFKEFLQSSLRAL SEQ ID NO: 646 FKEFLQSSLRALRQM SEQ ID NO: 647 AYDMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASQSINNELSWYQQKPGQRPKLLIYRASTLASGV SSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQQGYSLRNIDNAFGGGTEVVVKR SEQ ID NO: 648 AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC SEQ ID NO: 649 : DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC SEQ ID NO: 650 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGV PSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC SEQ ID NO: 651 . AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNELSWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYSLRNIDNAFGGGTKVEIKR SEQ ID NO: 652 QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSNYYVTWVRQAPGKGLEWIGIIYGSDETAY ATWAIGRFTISKTSTTVDLKMTSLTAADTATYFCARDDSSDWDAKFNLWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 653 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSNY SWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSTY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR SEQ ID NO: 654 EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSSNYMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSTY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR SEQ ID NO: 655 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK SEQ ID NO: 656 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYYVTWVRQAPGKGLEWVGIIYGSDETA YATWAIGRFTISRDNSKNTLYLQ NSLRAEDTAVYYCARDDSSDWDAKFNLWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 657 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYYVTWVRQAPGKGLEWVGIIYGSDETA YATSAIGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDSSDWDAKFNLWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 658 METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSNYYVT VRQA PGKGLE IGIIYGSDETAYATSAIGRF ISKTSTTVDLKMTSLTAADTATYFCARDDSSDWDA KFNLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK SEQ ID NO: 659 IIYGSDETAYATSAIG ¡ SEQ ID NO: 660 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASQSINNELSWY QQKPGQRPKLLIYRASTLASGVSSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQQGYSLRNIDN A : SEQ ID NO: 661 METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSNYYVTWVRQA PGKGLEWIGIIYGSDETAYATWAIGRFTISKTSTTVDLKMTSLTAADTATYFCARDDSSD DA KFNL : SEQ ID NO: 662 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCAGATGTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCGGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAATTATCCTGGTATCAGCAGAAAC CAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGC GGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCG ATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAATATTGATAATGCT SEQ ID NO: 663 ; ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCA CAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAATGGATCGGAATCATTTATGGTAGTGATGAAACGGCCTACGCGACCTGGGCGATAG GCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAGCCG CGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAATTTAACT TG SEQ ID NO: 664 · EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYYVTWVRQAPGKGLEWVGIIYGSDETA YATWAIGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDSSDWDAKFNLWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 665 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYYVTWVRQAPGKGLEWVGIIYGSDETA YATSAIGRFTISRDNSKNTLYLQ NSLRAEDTAVYYCARDDSSDWDAKFNLWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK ; SEQ ID NO: 666 IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNELSWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSLRNIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 667 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPASVEVAVGGTVTINCQASETIYS LSWY QQKPGQPPKLLIYQASDLASGVPSRFSGSGAGTEYTLTISGVQCDDAATYYCQQGYSGSNVDN V : SEQ ID NO: 668 METGLRWLLLVAVLKGVQCQEQLKESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLNDHAMG VRQ APGKGLEYIGFINSGGSARYAS AEGRFTISRTSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCVRGGAV SI HSFDP SEQ ID NO: 669 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCAGATGTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAATTGCCAGGCCAGTGAGACCATTTACAGTTGGTTATCCTGGTATCAGCAGAAGC CAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACCAGGCATCCGATCTGGCATCTGGGGTCCGATCGC GATTCAGCGGCAGTGGGGCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACG ATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATAGTGGTAGTAATGTTGATAATGTT SEQ ID NO: 670 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGGAGCAGCTGAAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTTACCT GCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAATGACCATGCAATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGA AGGGGCTGGAATACATCGGATTCATTAATAGTGGTGGTAGCGCACGCTACGCGAGCTGGGCAG AAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAA CCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGTCAGAGGGGGTGCTGTTTGGAGTATTCATAGTTTTG ATCCC SEQ ID NO: 671 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQASQSVYDNNYLS WFQQKPGQPPKLLIYGASTLASGVPSRFVGSGSGTQFTLTITDVQCDDAATYYCAGVYDDDSD NA SEQ ID NO: 672 METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSVYYMNWVRQA PGKGLEWIGFITMSDNINYASWAKGRFTISKTSTTVDLKMTSPTTEDTATYFCARSRGWGTMG RLDL SEQ ID NO: 673 ; ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCGAGGTG CCACATTTGCCGCCGTGCTGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCAGCATCAGTTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGACAACAACTACTTATCCTGGTTTCAGC AGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCC CATCGCGGTTCGTGGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCACAGACGTGCAGT GTGACGATGCTGCCACTTACTATTGTGCAGGCGTTTATGATGATGATAGTGATAATGCC SEQ ID NO: 674 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTGGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACCCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCA CAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTGTCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAATGGATCGGATTCATTACAATGAGTGATAATATAAATTACGCGAGCTGGGCGAAAG GCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCCGACAACCG AGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGGAGTCGTGGCTGGGGTACAATGGGTCGGTTGGATC TC : SEQ ID NO: 675 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGAICDPVLTQTPSPVSAPVGGTVSISCQASQSVYENNYLS WFQQKPGQPPKLLIYGASTLDSGVPSRFKGSGSGTQFTLTITDVQCDDAA YYCAGVYDDDSD DA SEQ ID NO: 676 : METGLRWLLLVAVLKGVQCQEQLKESGGGLVTPGGTLTLTCTASGFSLNAYYMNWVRQ APGKGLE IGFITLNNNVAYANWAKGRFTFSKTSTTVDLKMTSPTPEDTATYFCARSRGWGA GRLDL i SEQ ID NO: 677 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCATATGTGACCCTGTGCTGACCCAGACTCCATCTCCCGTATCTGCACCTGTGGGAGGCACAG TCAGCATCAGTTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGAGAACAACTATTTATCCTGGTTTCAGC AGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTGGATTCTGGGGTCC CATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATTACAGACGTGCAGT GTGACGATGCTGCCACTTACTATTGTGCAGGCGTTTATGATGATGATAGTGATGATGCC SEQ ID NO: 678 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTGGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGGAGCAGCTGAAGGAGTCCGGAGGAGGCCTGGTAACGCCTGGAGGAACCCTGACACTCACCT GCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAATGCCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCGAGGGA AGGGGCTGGAATGGATCGGATTCATTACTCTGAATAATAATGTAGCTTACGCGAACTGGGCGA AAGGCCGATTCACCTTCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCCGACAC CCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGGAGTCGTGGCTGGGGTGCAATGGGTCGGTTGG ATCTC SEQ ID NO: 679 ¡ MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQVLTQTPSPVSAAVGGTVTINCQASQSVDDNN LG WYQQKRGQPPKYLIYSASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCAGGFSGNIF A ^ ; SEQ ID NO: 680 ; METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMSWVRQA PGKGLEWIGIIGGFGTTYYAT AKGRFTISKTSTTVDLRITSPTTEDTATYFCARGGPGNGGD I SEQ ID NO: 681 ¡ ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCÁGGTG CCACATTTGCCCAAGTGCTGACCCAGACTCCATCGCCTGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAACTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTGATGATAACAACTGGTTAGGCTGGTÁTCAGC AGAAACGAGGGCAGCCTCCCAAGTACCTGATCTATTCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCC CATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGT GTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGGTTTTAGTGGTAATATCTTTGCT SEQ ID NO: 682 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCA CAGTCTCTGGCTTCTCCCTCAGTAGCTATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGG GGCTGGAGTGGATCGGAATCATTGGTGGTTTTGGTACCACATACTACGCGACCTGGGCGAAAG GCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAGAATCACCAGTCCGACAACCG AGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGTGGTCCTGGTAATGGTGGTGACATC , SEQ ID NO: 683 MDTRAPTQLLGLLLL LPGATFAAVLTQTPSPVSVPVGGTVTIKCQSSQSVYNNFLSW YQQKPGQPPKLLIYQASKLASGVPDRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGGYDDDADN A SEQ ID NO: 684 ' METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSDYA S VRQA PGKGLE IGIIYAGSGSTWYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARDGYDDYG DFDRLDL SEQ ID NO: 685 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTG CCACATTTGCAGCCGTGCTGACCCAGACACCATCGCCCGTGTCTGTACCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAAGTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAATAATTTCTTATCGTGGTATCAGCAGA AACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACCAGGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCAG ATAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTG ACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCGGTTATGATGATGATGCTGATAATGCT SEQ ID NO: 686 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTC AGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACGCTCACCTGCA CAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTGACTATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAATGGATCGGAATCATTTATGCTGGTAGTGGTAGCACATGGTACGCGAGCTGGGCGA AAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAA CCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGATGGATACGATGACTATGGTGATTTCGATC i GATTGGATCTC SEQ ID NO: 687 MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASQSINNELSWY QQKSGQRPKLLIYRASTLASGVSSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQQGYSLRNIDN A ; SEQ ID NO: 688 METGLRWLLLVAVLSGVQCQSLEESGGRLV PGTPLTLTCTASGFSLS YYMTWVRQA PGKGLEWIGMIYGSDETAYANWAIGRFTISKTSTTVDLKMTSLTAADTATYFCARDDS'SD DA KFNL : SEQ ID NO: 689 ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCÁGGTG CCAGATGTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCGGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAG TCACCATCAAATGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAATTATCCTGGTATCAGCAGAAAT CAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGC GGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCG ATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAATATTGATAATGCT SEQ ID NO: 690 ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCTCAGGTGTCCAGTGTC AGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCA CAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTACTACATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAATGGATCGGAATGATTTATGGTAGTGATGAAACAGCCTACGCGAACTGGGGGATAG GCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAGCCG CGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAATTTAACT TG : SEQ ID NO: 691 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYYMTWVRQAPGKGLE VGMIYGSDETA YANWAIGRFTISRDNSKNTLYLQ NSLRAEDTAVYYCARDDSSDWDAKFNLWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVySVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK . '; SEQ ID NO: 692 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYYMTWVRQAPGKGLEWVGMIYGSDETA YANSAIGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDSSDWDAKFNLWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV HEALH NHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 693 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSINNELSWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGV PSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSLRNIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF P SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 694 CAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAGTTATCC SEQ ID NO: 695 CAACAGGGTTATAGTCTGAGGAACATTGATAATGCT SEQ ID NO: 696 ' ATCATCTATGGTAGTGATGAAACCGCCTACGCTACCTCCGCTATAGGC SEQ ID NO: 697 GATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAGTTCAACTTG SEQ ID NO: 698 GCTATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCA CCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAG GGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGT TCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAÍTGATT TTGCAACTTATTACTGCCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAACATTGATAATGCTTTCGGCGGAG GGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACG SEQ ID NO: 699 AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNELS YQQKPGKAPKLLIYRASTLASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSLRNIDNAFGGGTKVEIKRT : SEQ ID NO: 700 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGAC TCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGTCÁGGCTC CAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGCATCATCTATGGTAGTGATGAAACCGCCTACGCTACCT CCGCTATAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGA ACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGATGATAGTAGTGACTGGG ATGCAAAGTTCAACTTGTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC \ SEQ ID NO: 701 ! GCTATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCA CCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAG GGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATOAAGGT TCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATT TTGCAACTTATTACTGCCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAACATTGATAATGCTTTCGG,CGGAG GGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTG ATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAG ACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCA CAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT SEQ ID NO: 702 ! AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNELS YQQKPGKAPKLLIYRASTLASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSLRNIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ' SEQ ID NO: 703 ; GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGAC TCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGTCAGGCTC CAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGCATCATCTATGGTAGTGATGAAACCGCCTACGCTACCT CCGCTATAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGA ACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGATGATAGTAGTGACTGGG ATGCAAAGTTCAACTTGTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCAGCAAGG GCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGG GCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGA CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCG TGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCÁCAAGC CCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACAGATGCC CACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCA AGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACG AAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAA AGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACC AGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCA TCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCC CATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATC CCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGC CTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCA GGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACA CGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA [ SEQ ID NO: 704 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYYVTWVRQAPGKGLE VGIIYGSDETA YATSAIGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDSSD DAKFNL GQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR QQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK i SEQ ID NO: 705 ' ATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTGTTTCTCTTTAGCAGCGCTTATTGCGCTA TCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTT GCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCC CTAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCA GTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTT ATTACTGCCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAACATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGG TGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGT TGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAG TACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGG ACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTA GAGA AACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCT TCAACAGGGGAGAGTGT SEQ ID NO: 706 MKWVTFISLLFLFSSAYSAIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNELSWYQQKP GKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSLRNIDÑAFGG GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 707 ; ATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTGTTTCTCTTTAGCAGCGCTTATTCGGAGG TGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTG CAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAGTGGGTCGGCATCATCTATGGTAGTGATGAAACCGCCTACGCTACCTCCGGTATAG GCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGA GAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGCAAAGT TCAACTTGTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGG TCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGG TCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCG TGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGG GACCG TGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACA CCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCC CAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTG AGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG AGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGC TGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAA CCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGG AGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGC TGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGC AGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGA GCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA SEQ I D NO : 7 08 MKWVT FI SLLFLFS SAY SEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYYVTWVRQA PGKGLE VGI I YGS DETAYATSAI GRFT I SRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCARDDS S DW DAKFNLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYASTYRVVSVLTVLHQD LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 709 AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNELSWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSLRNIDNAFGGGTKVEIKR SEQ ID NO: 710 i RASQGIRNDLG SEQ ID NO: 711 RASQGISNYLA SEQ ID NO: 712 RASQSISSWLA SEQ ID NO: 713 AASSLQS i SEQ ID NO: 714 ; AASTLQS ! SEQ ID NO: 715' KASSLES SEQ ID NO: 716 ! SNYMS SEQ ID NO: 717 ; VIYSGGSTYYADSVKG i SEQ ID NO: 718 VIYSGGSSTYYADSVKG SEQ ID NO: 719 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPÉLLGGP SVFLFPPKPKDTL ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK \ SEQ ID NO: 720 ATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGA AAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAG'GTTCA GCGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGA TTTG CAACTTATTACTGCCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAACATTGATAATGCT SEQ ID NO: 721 GCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCGGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCA CCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAATTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAG GGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGT TCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATG CTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAATATTGATAATGCTTTCGGCGGAG GGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT SEQ ID NO: 722 ' ATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCÁGGGA AAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCA GCGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTG CAACTTATTACTGCCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAACATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGA CCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATG AGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGG CCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAG AGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACT ACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAA AGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT SEQ ID NO: 723 GCTATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCA CCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAACAATGAGTTATCCTGGTATCAGCAGAÁACCAG GGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGT TCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGÁTGATT TTGCAACTTATTACTGCCAACAGGGTTATAGTCTGAGGAACATTGATAATGCTTTCGGCGGAG GGACCAAGGTGGAAATCAAACGT SEQ ID NO: 724 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCT!GAGAC TCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGTCAGGCTC CAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGCATCATCTATGGTAGTGATGAAACCGCCTACGCTACCT CCGCTATAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGA ACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGATGATAGTAGTGÁCTGGG ATGCAAAGTTCAACTTG SEQ ID NO: 725 CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCA CCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTACTACGTGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAG GGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAATCATTTATGGTAGTGATGAAACGGCCTACGCGACCTGGG CGATAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGA CAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGATGATAGTAGTGACTGGGATGGAAAAT TTAACTTGTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGC SEQ ID NO: 726 EKLLCFLVLTSLSHAFGQTD SRKAFVFPKESDTSYVSLKAPLTKPLKAFTVCLHFY TELSSTRGYSIFSYATKRQDNEILIFWSKDIGYSFTVGGSEILFEVPEVTVAPVHICTS ESA SGIVEFWVDGKPRVRKSLKKGYTVGAEASIILGQEQDSFGGNFEGSQSLVGDIGNVNMWDFVL SPDEINTIYLGGPFSPNVLNWRALKYEVQGEVFTKPQLWP SEQ ID NO: 727 MLAVGCALLAALLAAPGAALAPRRCPAQEVARGVLTSLPGDSVTLTCPGVEPEDNATV HWVLRKPAAGSHPSRWAGMGRRLLLRSVQLHDSGNYSCYRAGRPAGTVHLLVDVPPEEPQLSC FRKSPLSNVVCEWGPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAEDFQEPCQYSQESQKFSCQLAVPEGD SSFYIVS CVASSVGSKFSKTQTFQGCGILQPDPPANITVTAVARNPRWLSVTWQDPHS NSS FYRLRFELRYRAERSKTFTT MVKDLQHHCVIHDAWSGLRHVVQLRAQEEFGQGE SEWSPEA MGTP TESRSPPAENEVSTPMQALTTNKDDDNILFRDSANATSLPVQDSSSVPLPTFLVAGGS LAFGTLLCIAIVLRFKKTWKLRALKEGKTSMHPPYSLGQLVPERPRPTPVLVPLISPPVSPSS LGSDNTSSHNRPDARDPRSPYDISNTDYFFPR , SEQ ID NO: 728 MLTLQTWVVQALFIFLTTESTGELLDPCGYISPESPVVQLHSNFTAVCVLKEKC DYF HVNANYIVWKTNHFTIPKEQYTIINRTASSVTFTDIASLNIQLTCNILTFGQLEQNVYGITII SGLPPEKPKNLSCIVNEGKKMRCEWDGGRETHLETNFTLKSEWATHKFADCKAKRDTPTSCTV DYSTVYFVNIEVWVEAENALGKVTSDHINFDPVYKVKPNPPHNLSVINSEELSSILKLTWTNP SIKSVIILKYNIQYRTKDASTWSQIPPEDTASTRSSFTVQDLKPFTEYVFRIRCMKEDGKGYW SD SEEASGITYEDRPSKAPSF YKIDPSHTQGYRTVQLVWKTLPPFEANGKILDYEVTLTRW KSHLQNYTVNATKLTVNLTNDRYLATLTVRNLVGKSDAAVLTIPACDFQATHPVMDLKAFPKD NML VE TTPRESVKKYILE CVLSDKAPCITDWQQEDGTVHRTYLRGNLAES CYLÍTVTPV YADGPGSPESIKAYLKQAPPSKGPTVRTKKVGKNEAVLEWDQLPVDVQNGFIRNYTIFYRTII GNETAVNVDSSHTEYTLSSLTSDTLYMVRMAAYTDEGGKDGPEFTFTTPKFAQGEIEAIVVPV CLAFLLTTLLGVLFCFNKRDLIKKHIWPNVPDPSKSHIAQWSPHTPPRHNFNSKDQMYSDGNF TDVSVVEIEANDKKPFPEDLKSLDLFKKEKINTEGHSSGIGGSSC SSSRPSISSSDÉNESSQ NTSSTVQYSTVVHSGYRHQVPSVQVFSRSESTQPLLDSEERPEDLQLVDHVDGGDGILPRQQY FKQNCSQHESSPDISHFERSKQVSSVNEEDFVRLKQQISDHISQSCGSGQMKMFQEVSAADAF GPGTEGQVERFETVGMEAATDEGMPKSYLPQTVRQGGYMPQ ?

Claims (200)

REIVINDICACIONES
1. Un método para prevenir, tratar o diagnosticar una enfermedad o afección asociada con la IL-6, que comprende la administración de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo Abl a un sujeto que lo necesita, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl comprende: un polipéptido de cadena ligera que comprendé: un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad con la SEQ ID NO: 709, un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos 75% de identidad con el polinucleótido de la SEQ ID NO: 723, un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de restricción media a un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 723 o un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de restricción alta a un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 723 y ' un polipéptido de cadena pesada que comprende: un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad con la SEQ ID NO: 657, un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos 75% de identidad con el polinucleótido de la SEQ ID NO: 700, un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de restricción media a un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 700 o un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de restricción alta a un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 700; : donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo Abl se unen de forma específica a la IL-6 y antagonizan una o más actividades asociadas con la IL-6.
2. El método de la reivindicación 1, donde el polipéptido de cadena ligera incluye una o más sustituciones en la región o las regiones flanqueantes de cadena ligera con relación a las secuencias de la región flanqueante de cadena ligera de la SEQ ID NO: 709.
3. El método de la reivindicación 2 donde una ;o más sustituciones en la región o las regiones flanqueantes de cadena ligera es una sustitución con la secuencia de una posición correspondiente de una secuencia donante, donde la secuencia donante comprende: la SEQ ID NO: 2, una secuencia de cadena ligera humana, de conejo o de primate no humano y una cadena ligera de cualquiera de Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, Abl3, Abl4, Abl5, Abl6, Abl7, ;Abl8, Abl9, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, :Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35 o Ab36, ; donde la sustitución da como resultado el remplazó, la inserción y/o la eliminación de uno o más aminoácidos y donde la posición correspondiente está determinada por el alineamiento de secuencia entre la región flanqueante de la SEQ ID NO: 709 y la secuencia donante. '
4. El método de la reivindicación 1, donde el polipéptido de cadena pesada incluye una o más sustituciones en la región o las regiones flanqueantes de cadena pesada con relación a las secuencias de la región flanqueante de cadena pesada de la SEQ ID NO: 657.
5. El método de la reivindicación 4 donde una o más sustituciones en la región o las regiones flanqueantes de cadena pesada es una sustitución con la secuencia de una posición correspondiente de una secuencia donante, donde la secuencia donante comprende: la SEQ ID NO: 3, una secuencia de cadena pesada humana, de conejo o de primate no humano y una cadena pesada de cualquiera de Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7 , Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, Abl3, Abl4, Abl5, Abl6, Abl7, Abl8, Abl9, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35 o Ab36, donde la sustitución da como resultado el remplazó, la inserción y/o la eliminación de uno o más aminoácidos y donde la posición correspondiente está determinada por el alineamiento de secuencia entre la región flanqueante de la SEQ ID NO: 657 y la secuencia donante.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el polipéptido de cadena ligera comprende uno ó más polipéptidos de CDR de cadena ligera de Abl que comprenden < una CDR1 de cadena ligera que tiene al menos 72.7;% de identidad (idéntica en hasta al menos 8 de 11 residuos) con la SEQ ID NO: 4; una CDR2 de cadena ligera que tiene al menos 85.7% de identidad (idéntica en hasta al menos 6 de 7 residuos) con la SEQ ID NO: 5; una CDR3 de cadena ligera que tiene al menos 50% de identidad (idéntica en hasta al menos 6 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 6; una CDR1 de cadena ligera que tiene al menos 90.:9% de similitud (similar en hasta al menos 10 de 11 residuos) con la SEQ ID NO: 4; una CDR2 de cadena ligera que tiene al menos 10Q% de similitud (similar en hasta al menos 7 de 7 residuos) con la SEQ ID NO: 5 o una CDR3 de cadena ligera que tiene al menos 66.6% de similitud (similar en hasta al menos 8 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 6; ', y donde el polipéptido de cadena pesada comprende uno o más polipéptidos de CDR de cadena pesada de Abl que comprenden: una CDR1 de cadena pesada que tiene al menos 80% de identidad (idéntica en hasta al menos 4 de 5 residuos) con la SEQ ID NO: 7; j i una CDR2 de cadena pesada que tiene al menos 50% de identidad (idéntica en hasta al menos 8 de 16 residuos) con la SEQ ID NO: 120; una CDR3 de cadena pesada que tiene al menos 33.3% de identidad (idéntica en hasta al menos 4 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 9; una CDR1 de cadena pesada que tiene al menos 100% de similitud (similar en hasta al menos 5 de 5 residuos) con la SEQ ID NO: 7 ; una CDR2 de cadena pesada que tiene al menos 56.!2% de similitud (similar en hasta al menos 9 de 16 residuos) con la SEQ ID NO: 120 o : una CDR3 de cadena pesada que tiene al menos 50% de similitud (similar en hasta al menos 6 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 9.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1- 5, donde el polipéptido de cadena ligera comprende uno o más polipéptidos de CDR de cadena ligera de Abl que comprenden: una CDR1 de cadena ligera que tiene al menos 81.8% de identidad (idéntica en hasta al menos 9 de 11 residuos) con la SEQ ID NO: 4; una CDR2 de cadena ligera que tiene al menos 71.4% de identidad (idéntica en hasta al menos 5 de 7 residuos) con la SEQ ID NO: 5 o [ una CDR3 de cadena ligera que tiene al menos 83.3% de identidad (idéntica en hasta al menos 10 de 12 residuos) cón la SEQ ID NO: 6; ¡ y donde el polipéptido de cadena pesada comprende Uno o más polipéptidos de CDR de cadena pesada de Abl que comprenden: una CDR1 de cadena pesada que tiene al menos 60% de identidad (idéntica en hasta al menos 3 de 5 residuos) con la SEQ ID NO: 7; una CDR2 de cadena pesada que tiene al menos 87.5% de identidad (idéntica en hasta al menos 14 de 16 residuos) con la SEQ ID NO: 120 o una CDR3 de cadena pesada que tiene al menos 83.3% de identidad (idéntica en hasta al menos 10 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 9.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6-7, donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo Abl comprende al menos dos de dichos polipéptidos de CDR de cadena ligera y al menos dos de dichos polipéptidos de CDR de cadena pesada.
9. Un método para prevenir o tratar una enfermedad o afección asociada con la IL-6, que comprende la administración de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo Abl a un sujeto que lo necesita, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl comprende: ' dos o más polipéptidos de CDR de cadena ligera de Abl que comprenden: una CDR1 de cadena ligera que tiene al menos 72.7% de identidad (idéntica en hasta al menos 8 de 11 residuos) con la SEQ ID NO: 4; i una CDR2 de cadena ligera que tiene al menos 85.;7% de identidad (idéntica en hasta al menos 6 de 7 residuos) con la SEQ ID NO: 5 o una CDR3 de cadena ligera que tiene al menos 5.0% de identidad (idéntica en hasta al menos 6 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 6; y dos o más polipéptidos de CDR de cadena pesada de Abl que comprenden: una CDR1 de cadena pesada que tiene al menos 80% de identidad (idéntica en hasta al menos 4 de 5 residuos) con la SEQ ID NO: 7 ; una CDR2 de cadena pesada que tiene al menos 50% de identidad (idéntica en hasta al menos 8 de 16 residuos) con la SEQ ID NO: 120 o una CDR3 de cadena pesada que tiene al menos 33.3% de identidad (idéntica en hasta al menos 4 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 9; donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo Api se unen de forma especifica a la IL-6 y antagonizan una ó más actividades asociadas con la IL-6. :
10. Un método para prevenir o tratar una enfermedad o afección asociada con la IL-6, que comprende la administración de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo Abl a un sujeto que lo necesita, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl comprende: ! dos o más polipéptidos de CDR de cadena ligera de Abl que comprenden: una CDR1 de cadena ligera que tiene al menos 90.9% de similitud (similar en hasta al menos 10 de 11 residuos) con la SEQ ID NO: 4; ; una CDR2 de cadena ligera que tiene al menos 10!0% de similitud (similar en hasta al menos 7 de 7 residuos) con la SEQ ID NO: 5 o , una CDR3 de cadena ligera que tiene al menos 66.6% de similitud (similar en hasta al menos 8 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 6; ¡ y dos o más polipéptidos de CDR de cadena pesada de Abl que comprenden: una CDR1 de cadena pesada que tiene al menos 100% de similitud (similar en hasta al menos 5 de 5 residuos) con la SEQ ID NO: 7; una CDR2 de cadena pesada que tiene al menos 56.2% de similitud (similar en hasta al menos 9 de 16 residuos) con la SEQ ID NO: 120 o ! una CDR3 de cadena pesada que tiene al menos 50% de similitud (similar en hasta al menos 6 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 9; ; donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo Abl se unen de forma especifica a la IL-6 y antagonizan una ó más I actividades asociadas con la IL-6. ;
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9- 10 donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl comprende dicha CDR1 de cadena ligera, dicha CDR3 de cadena ligera, dicha CDR2 de cadena pesada y dicha CDR3 de cadena pesada. ;
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-10 donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl comprende dicha CDR1 de cadena ligera, dicha CDR2 de cadena ligera, dicha CDR3 de cadena ligera, dicha CDRl de cadena pesada, dicha CDR2 de cadena pesada y dicha CDR3 de cadena pesada.
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9- 12 donde dichos polipéptidos de CDR de cadena pesada y ligera están comprendidos en un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende Fab, Fab1, F(ab' )2, Fv, scFv, IgNAR, SMIP, anticuerpo de camélido o nanoanticuerpo.
14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-12 donde las regiones flanqueantes (FRs) 1, 2, 3 y 4 en las regiones pesadas y ligeras variables de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl, respectivamente, son FRs humanas no modificadas o modificadas por la sustitución de como máximo 2 o 3 residuos FR humanos con los correspondientes residuos FR de la cadena pesada o ligera de anticuerpo de conejo progenitor de la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3, respectivamente, i donde dichas FR de cadena ligera humana 1, 2 y ¡3 se derivaron de una secuencia de anticuerpo de cadena ligera variable humana que se seleccionó de una biblioteca o base de datos de secuencias de anticuerpo de lineas germinales humanas con base en su alto nivel de homología (con respecto a ¡otras secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas contenidas en la biblioteca o en la base de datos) con la subsecuencia de la cadena ligera de anticuerpo de conejo progenitor de la SEQ ID NO: 2 que se extiende desde el comienzo de la FR1 hasta el final de la FR3 y i donde dicha FR4 de cadena ligera humana se derivó de una secuencia de anticuerpo de cadena ligera variable humana que se seleccionó de una biblioteca o base de datos de secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas con base en su alto nivel de homología (con respecto a otras secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas contenidas en la biblioteca o en la base de datos) con la FR4 de cadena ligera de anticuerpo de conejo progenitor contenida en la SEQ ID NO: 2 y : donde dichas FR de cadena pesada humana 1, 2 y se derivaron de una secuencia de anticuerpo de cadena pesada variable humana que se seleccionó de. una biblioteca o base de datos de secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas con base en su alto nivel de homología (con respecto a otras secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas contenidas en la biblioteca o en la base de datos) con la subsecuencia de la cadena pesada de anticuerpo de conejo progenitor de la SEQ ID NO: 3 que se extiende desde el comienzo de la FR1 hasta el final de la FR3 y donde dicha FR4 de cadena pesada humana se derivó de una secuencia de anticuerpo de cadena pesada variable humana que se seleccionó de una biblioteca o base de datos de secuencias de anticuerpo de lineas germinales humanas con base en sü alto nivel de homología (con respecto a otras secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas contenidas en la biblioteca o en la base de datos) con la FR4 de cadena pesada de anticuerpo de conejo progenitor contenida en la SEQ ID NO: 3.
15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1- 14, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl tiene una semivida in vivo de al menos aproximadamente 22 días en un sujeto humano saludable.
16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl tiene una semivida in vivo de al menos aproximadamente 25 días en un sujeto humano saludable.
17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl tiene una semivida in vivo de al menos aproximadamente 30 días en un i sujeto humano saludable.
18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl tiene una afinidad de unión (Kd) a IL-6 menor a aproximadamente 50 picomolar o una tasa de disociación (Koff) de IL-6 menor o igual a 10"4 S"1. i
19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1- 18, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl sé unen de forma especifica al mismo o a los mismos epitopos lineales o conformacionales y/o compiten para unirse al mismo o a los mismos epitopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 humana intacta o un fragmento del mismo como un anticuerpo anti-IL-6 que consiste esencialmente en los polipéptidos de la SEQ ID NO: 702 y la SEQ ID NO: 704 ;o los polipéptidos de la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3.
20. El método de la reivindicación 19, donde ¡dicha unión al mismo o a los mismos epitopos lineales o conformacionales y/o competición de unión al mismo o á los mismos epitopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 humana intacta o un fragmento del mismo se establece mediante mapeo epitópico utilizando fragmentos de péptidos lineales superpuestos que abarcan toda la longitud^ del polipéptido de IL-6 humana nativa e incluye uno o más residuos comprendidos en los fragmentos de IL-6 seleccionados de aquellos que comprenden respectivamente los residuos de aminoácidos 37-51, los residuos de aminoácidos 70-84,; los residuos de aminoácidos 169-183, los residuos de aminoácidos 31-45 y/o los residuos de aminoácidos 58-72 de la SEQ ID NO: 1.
21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1- 20, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl es aglicosilado .
22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1- 21, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl contiene una región Fe que ha sido modificada para alterar la función efectora, la semivida, la proteólisis y/o la glicosilación'.
23. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-22, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl es un anticuerpo humano, humanizado, de cadena simple o quimérico.
24. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1- 23, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl comprende Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv.
25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1- 24, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl comprende adicionalmente una Fc humana.
26. El método de la reivindicación 25, donde dicha Fc humana está derivada de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, ;IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgGlO, IgGll, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 o IgG19.
27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-26, donde el o las actividades asociadas con la IL-ß son una actividad in vivo que comprende: albúmina en suero disminuida, proteina C-reactiva elevada ("CRP"), fatiga, fiebre, anorexia (pérdida de apetito), pérdida de peso, caquexia, debilidad, escala de pronóstico de Glasgow ("GPS") disminuida, dimero-D en suero elevado, perfil de coagulación anormal o cualquier combinación de los mismos.1
28. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-26, donde una o más de la o las actividades asociadas con la IL-6 es una actividad in vitro que comprende: estimulación de la proliferación de células T1165, 'unión de IL-6 a IL-6R, activación (dimerización) de la glicopróteina transductora de señales gpl30, formación de multimeros IL-6/IL-6R/gpl30, estimulación de la producción de haptoglobina mediante células HepG2 modificadas para expresar el receptor de IL-6 humana o cualquier combinación de los mismos.
29. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-28, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl se expresa a partir de una célula recombinante. '
30. El método de la reivindicación 29 donde la célula se selecciona de una célula de insecto, bacteriana, de levadura y de mamífero.
31. El método de la reivindicación 30 donde la célula es una célula de levadura. ¡
32. El método de la reivindicación 31 donde la célula es una célula de levadura diploide.
33. El método de la reivindicación 31 donde la célula de levadura es una levadura Pichia.
34. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1- 33 donde la enfermedad o afección asociada con la IL-6 comprende: cáncer, una enfermedad o afección asociada con la hipercoagulación, una enfermedad o afección asociada con una CRP en suero elevada, una enfermedad o afección asociada con hipoalbuminemia, un trastorno inflamatorio, un trastorno viral, un síndrome consuntivo, un trastorno autoinmunitario o una combinación de los mismos.
35. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-33 donde la enfermedad o afección asociada con la ; IL-6 comprende: fatiga general, fatiga inducida por el ejercicio, fatiga relacionada con el cáncer, fatiga relacionada con enfermedad inflamatoria, síndrome de fatiga crónica, caquexia cancerosa, caquexia cardíaca, caquexia respiratoria, caquexia renal, caquexia relacionada con la edad, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE) , artritis idiopática juvenil sistémica, psoriasis, artropatía psoriásica, espondilitis anquilosante, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) , polimialgia reumática, arteritis de células gigantes, vasculitis autoinmune, enfermedad de injerto versus huésped (GVHD) , síndrome de Sjogren, enfermedad de Still de comienzo en el adulto, artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil sistémica, osteoartritis, osteoporosis, enfermedad ósea de Paget, osteoartritis, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no-Hodgkin, cáncer de próstata, leucemia, cáncér de células renales, enfermedad de Castleman multicéntrica, cáncer de ovario, tolerancia a fármacos en quimioterapia contra el cáncer, toxicidad de quimioterapia contra el cáncer, enfermedad cardiaca isquémica, ateroesclerosis , obesidad, diabetes, , asma, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad cerebrovascular, fiebre, respuesta de fase aguda, alergias, anemia, anemia de inflamación (anemia de enfermedad crónica) , hipertensión, depresión, depresión asociada con enfermedad crónica, trombosis, trombocitosis, insuficiencia cardiaca aguda, síndrome metabólico, abortos naturales, obesidad, prostatitis crónica, glomerulonefritis , enfermedad inflamatoria pélvica, lesión por reperfusión, rechazo de transplante, enfermedad de injerto versus huésped (GVHD) , crisis de citocina, gripe aviar, gripe H1N1, gripe porcina, gripe H5N1, viruela, gripe pandémica, síndrome de distrés respiratorio del adulto (ARDS) , síndrome respiratorio agudo severo (SARS) , sepsis y síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) .
36. El método de la reivindicación 34 donde la enfermedad o afección asociada con la hipercoagulación comprende: cáncer, trombosis venosa aguda, embolia pulmonar, trombosis durante el embarazo, necrosis cutánea hemorrá'gica, coagulación intravascular diseminada aguda o crónica (DIC) , formación de coágulos por cirugía, reposo prolongado, inmovilización prolongada, trombosis venosa, meningococcemia fulminante, apoplejía trombótica aguda, oclusión coronaria aguda, oclusión arterial periférica aguda, embolia pulmonar masiva, trombosis venosa axilar, trombosis venosa iliofemoral masiva, oclusión de cánulas arteriales, colusión de cánulas venosas, cardiomiopatia, enfermedad venooclusiva hepática, hipotensión, disminución del rendimiento cardiaco, disminución de la resistencia vascular, hipertensión pulmonar, disminución de la distensibilidad pulmonar, leucopenia, trombocitopenia, trombocitopenia inducida por heparina (HIT) , trombocitopenia y trombosis inducida por heparina (HITT) , fibrilación auricular, implante de una válvula cardiaca prostética, propensión genética a padecer trombosis, factor V Leiden, mutación del gen de la protrombina, polimorfismo de la metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) , polimorfismo del receptor plaquetario, traumatismotismo, fracturas, quemaduras o cualquier combinación de las mismas.
37. El método de la reivindicación 34 donde la enfermedad o afección asociada con la CRP en suero elevada comprende: enfermedades inflamatorias crónicas, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, psoriasis, artropatia psoriática, espondilitis anquilosante, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, pén'figo, dermatomiositis , polimiositis , polimialgia reumática, arte'ritis de células gigantes, vasculitis, poliarteritis nodosa, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Kawasaki, vasculitis aislada del sistema nervioso central, arteritis de Churg-Strauss, poliarteritis microscópica, poliangiitis microscópica, púrpura de Henoch-Schonlein, vasculitis crioglobul némica esencial, vasculitis reumatoide, crioglobulinemia, policondritis recidivante, enfermedad de Behcet, arteritis de Takayasu, enfermedad cardiaca isquémica, apoplejía, esclerosis múltiple, sepsis, vasculitis causada por infecciones virales, enfermedad de Buerger, cáncer, cáncer avanzado, osteoartritis, esclerosis sistémica, síndrome de CREST, enfermedad de Reiter, enfermedad ósea de Paget, síndrome de Sjogran, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, fiebre mediterránea familiar, trombocitópenia autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, enfermedades tiroideas autoinmunes, anemia perniciosa, vitíligo, alopecia areata, cirrosis biliar primaria, hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis alcohólica, hepatitis viral, hepatitis B, hepatitis C, otras enfermedades autoinmunes específicas de órganos, quemaduras, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma alérgico, otras afecciones alérgicas o cualquier combinación de las mismas.
38. El método de la reivindicación 34 donde la enfermedad o afección asociada con la hipoalbuminemia comprende: cáncer, cáncer avanzado, artritis reumatoide, ;SIDA, enfermedad cardíaca, enfermedad hepática, deshidrata'ción, desnutrición, exposición al plomo, malaria, enfermedad respiratoria, vejez, hipotiroidismo, tuberculosis, hipopituitarismo, neurastenia, hipernatremia, hiponatrlemia, enfermedad renal, espléníca, espondilitis anquilosante, síndrome del declive ' (retraso del crecimiento) , enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad celíaca, traumatismotismo, quemaduras o cualquier combinación de las mismas.
39. El método de cualquiera de las reivindicaciones 34-38, donde el cáncer comprende: acantoma, carcinoma de células acínicas, neuroma acústico, melanoma lentiginoso acral, acrospiroma, leucemia eosinofílica aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia megacarioblástica aguda, leucemia monocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda con maduración, leucemia mieloide aguda de células dendríticas, leucemia mieloide aguda, leucemia promielocítica aguda, adamantinoma, adenocarcinoma, carcinoma quistico adenoide, adenoma, tumor odontogénico adenomatoide, carcinoma adrenocortical, leucemia de células T del adulto, leucemia agresiva de células NK, cánceres relacionados con SIDA, linforna relacionado con ;SIDA, sarcoma alveolar de partes blandas, fibroma ameloblástico, cáncer anal, linfoma anaplásico de células grandes, cáncer anaplásico de tiroides, linfoma angioinmunoblástico de células T, angiomiolipoma, angiosarcoma, cáncer de apéndice, astrocitoma, tumor rabdoide teratoide atípico, carcinoma de células básales, carcinoma de tipo basal, leucemia de células B, linfoma de células B, carcinoma de los conductos de Bellini, cáncer del tracto biliar, cáncer de vejiga, blastoma, cáncer de hueso, tumor de hueso, glioma de tronco cerebral, ¡tumor cerebral, cáncer de mama, tumor de Brenner, tumor bronquial, carcinoma bronquioloalveolar , tumor de Brown, linfoma de Burkitt, cáncer de sitio primario desconocido, tumor carcinoide, carcinoma, carcinoma in situ, carcinoma de, pene, carcinoma de sitio primario desconocido, carcinosarcoma, enfermedad de Castleman, tumor embrionario del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral, cáncer cervical, colangiocarcinoma, condroma, condrosarcoma, cordoma, coriocarcinoma, papiloma del plexo coroideo, leucemia linfocitica crónica, leucemia monocitica crónica, leucemia mielógena crónica, enfermedad mieloproliferativa crónica, leucemia neutrofilica crónica, tumor de células claras, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craniofaringioma, linfoma cutáneo de células T, enfermedad de Degos, dermatofibrosarcoma protuberans, quiste dermoide, tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, linfoma difuso de células B grandes, > tumor neuroepitelial disembrioplásico, carcinoma embrionario, ¡ tumor de seno endodérmico, cáncer endometrial, cáncer uterino endometrial, tumor endometrioide, linfoma de células T asociado a enteropatía, ependimoblastoma, ependimoma, sarcoma epitelioide, eritroleucemia, cáncer de esófago, estesioneuroblastoma, tumor de la familia de Ewing, sarcoma de la familia de Ewing, sarcoma de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer de ducto biliar extrahepático, enfermedad- de j Paget extramamaria, cáncer de tubo falopiano, Fetus in fetu, fibroma, fibrosarcoma, linfoma folicular, cáncer folicular de tiroides, cáncer de vesícula biliar, cáncer de vesícula biliar, ganglioglioma, ganglioneuroma, cáncer gástrico, linfoma gástrico, cáncer gastrointestinal, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal, tumor de células germinales, germinoma, coriocarcinoma gestacional, tumor trofoblástico gestacional, tumor óseo de células gigantes, glioblastoma multiforme, glioma, gliomatosis cerebri, tumor glómico, glucagonoma, gonadoblastoma, tumor de células granulosas, leucemia de células vellosas, leucemia de células vellosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, hemangioblastoma, hemangiopericitoma, hemangiosarcoma, malignidad hematológica, carcinoma hepatocelular, linfoma hepatoesplénico de células T, síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario, linfoma Hodgkin, linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, glioma hípotalámico, cáncer de mama inflamatorio, melanoma infraocular, carcinoma de células de los islotes, tumor de células de los islotes, leucemia juvenil mielomonocítica, sarcoma Kaposi, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon, tumor de Klatskin, tumor de Krukenberg, cáncer de laringe, cáncer de laringe, melanoma léntigo maligno, leucemia, leucemia, cáncer del labio y la cavidad oral, liposarcoma, cáncer de pulmón, luteoma, linfangioma, linfangiosar!coma, linfoepitelioma, leucemia linfoide, linfoma, macroglobulinemia, histiocitoma fibroso maligno, histiocitoma fibroso maligno, histiocitoma fibroso maligno óseo, glioma maligno, mesotelioma maligno, tumor maligno de vaina nerviosa periférica, ; tumor rabdoide maligno, tumor tritón maligno, linfoma MALT , linfoma de células del manto, leucemia de mastocitos, tumor media'stinal de células germinales, tumor mediastinal, cáncer medular de tiroides, meduloblastoma, meduloblastoma, meduloepitelioma , melanoma, melanoma, meningioma, carcinoma de células de erkel, mesotelioma, mesotelioma, cáncer escamoso metastásicó del cuello con tumor primario oculto, carcinoma urotelial metastásicó, tumor Mülleriano mixto, leucemia monocitica, cáncer de boca, tumor mucinoso, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, mieloma múltiple, micosis fungoides, ' micosis fungoides, enfermedad mielodisplásica, síndromes mielodisplásicos, leucemia mieloide, sarcoma mieloide, enfermedad mieloproliferativa, mixoma, cáncer de la cavidad nasal, cáncer nasofaríngeo, carcinoma nasofaríngeo, neoplasma, neurinoma, neuroblastoma, neuroblastoma, neurofibroma, neuroma, melanoma nodular, linfoma no Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de piel no melanoma, cáncer de pulmón no microcítico, oncología ocular, oligoastrocitoma, oligodendroglioma, oncocitoma, meningioma de la vaina, del nervio óptico, cáncer oral, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario, tumor de células germinales del ovario, tumor de ovario de bajo potencial maligno, enfe'rmedad de Paget de la mama, tumor de Pancoast, cáncer pancreático, cáncer pancreático, cáncer papilar de tiroides, papilomatosis , paraganglioma, cáncer de seno paranasal, cáncer de paratiroides , cáncer de pene, tumor perivascular de células epitelioides, cáncer faríngeo, feocromocitoma, tumor parénquima pineal de diferenciación intermedia, pineoblastoma, pituicitoma, adenoma pituitario, tumor pituitario, neoplasma de células plasmáticas, blastoma pleuropulmonar, poliembrioma, linfoma precursor linfoblástico de células T, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma de efusión primaria, cáncer hepatocelular primario, cáncer hepático primario, cáncer peritoneal primario, tumor neuroectodermal primitivo, cáncer de próstata, pseudomixoma peritoneal, cáncer rectal, carcinoma de células renales, carcinoma del tracto respiratorio relacionado con el gen NUT en el cromosoma 15, retinoblastoma, rabdomioma, rabdomiosarcoma, transformación de Richter, teratoma sacrococcígeo, cáncer de la glándula salival, sarcoma, Schwannomatosis , carcinoma de glándulas sebáceas, neoplasma secundario, seminoma, tumor seroso, tumor de células de Sertoli-Leydig, tumor del estroma de los cordondes sexuales, síndrome de Sézary, carcinoma de células en anillo de sello, cáncer de piel, tumor de células pequeñas, redondas y azules, carcinoma de células pequeñas, cáncer de pulmón microcítico, linfoma de células pequeñas, cáncer del intestino delgado, sarcoma de tejido blando, somatoestatinoma, verruga del deshollinador, tumor de la médula espinal, tumor espinal, linfoma de la zona marginal esplénica, carcinoma de células escamosas, cáncer de estómago, melanoma superficial diseminante, tumor neuroectodermal primitivo supratentprial , tumor epitelial superficial del ovario, sarcoma sinovial , leucemia linfoblástica aguda de células T, leucemia linfocitica granular grande de células T, leucemia de células T, linfoma de células T, leucemia prolinfocitica de células T, teratoma, cáncer linfático terminal, cáncer testicular, tecoma, cáncer de garganta, carcinoma timico, timoma, cáncer de tiroides, cáncer de células de transición de la pelvis renal y el uréter, carcinoma de células de transición, cáncer uracal, cáncer uretral, neoplasma urogenital, sarcoma uterino, melanoma uveal, cáncer vaginal, síndrome de Verner Morrison, carcinoma verrugoso, glioma de la vía visual, cáncer vülvar, macroglobulinemia de Waldenstróm, tumor de Warthin, tumor de Wilms o cualquier combinación de los mismos.
40. El método de la reivindicación 39, donde el cáncer comprende: cáncer colorrectal, cáncer de pulmón no microcitico, colangiocarcinoma, mesotelima, enfermedad de Castleman, carcinoma de células renales o cualquier combinación de las mismas. :
41. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-40 donde antes de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl el sujeto presentaba o se encontraba en riesgo de desarrollar uno o más de los siguientes síntomas: albúmina en suero disminuida, proteína C-reactiva elevada ("CRP") , fatiga, fiebre, anorexia (pérdida de apetito) , perdida de peso, caquexia, debilidad, escala de pronóstico de Glasgow ("GPS") disminuida, dímero-D en suero elevado, perfil de coagulación anormal y cualquier combinación de los mismos .
42. El método de la reivindicación 41 donde > dicho síntoma es un efecto secundario de otro agente terapéutico administrado al sujeto antes de, junto con o luego de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl.
43. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-40 donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz para la prevención o el tratamiento de uno o más síntomas asociados con una IL-6 elevada.
44. El método de la reivindicación 43 donde la cantidad terapéuticamente eficaz se encuentra entre aproximadamente 0.1 y 20 mg/kg de peso corporal del sujeto que la recibe.
45. El método de la reivindicación 41 que comprende además controlar al sujeto para evaluar dichos síntomas luego de la administración del anticuerpo Abl. ¡
46. El método de la reivindicación 41 donde ' 'dicho síntoma se presenta antes de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl.
47. El método de la reivindicación 46 donde dicho síntoma se mejora o restaura a un estado normal dentro de aproximadamente 1-5 semanas desde la administración del anticuerpo Abl.
48. El método de la reivindicación 47 donde . dicho síntoma luego se mantiene mejorado durante todo el período entre dos administraciones consecutivas del anticuerpo Abl. I
49. El método de la reivindicación 41, donde el perfil de coagulación, del sujeto se evalúa mediante la medición del nivel de uno o más del dímero-D, Factor II, Factor V, Factor VIII, Factor IX, Factor XI, Factor XII, productos de la degradación de F/fibrina, complejo de trombina-antitrombina III, fibrinógeno, plasminógeno, protrombina y factor de von illebrand en suero del sujeto.
50. El método de la reivindicación 41, donde el perfil de coagulación del sujeto se evalúa mediante una medición funcional de la capacidad de coagulación. i
51. El método de la reivindicación 50, donde la medición funcional de la capacidad de coagulación se selecciona del tiempo de protrombina (PT) , la tasa de protrombina (PR), la tasa normalizada internacional (INR) o cualquier combinación de los mismos.
52. El método de la reivindicación 41, que comprende adicionalmente : medir la tasa normalizada internacional ilNR) del sujeto antes de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl y administrar al sujeto el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl si la INR del sujeto es menor a aproximadamente 0.9.
53. El método de la reivindicación 41, que comprende adicionalmente : medir la tasa normalizada internacional; (INR) del sujeto antes de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl y administrar al sujeto el i anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl si la INR del sujeto es menor a aproximadamente 0.5.
5 . El método de cualquiera de las reivindicaciones 52-53, donde la INR del sujeto se aumenta a más de aproximadamente 0.9 dentro de las 4 semanas desde el inicio de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl al sujeto.
55. El método de la reivindicación 41, que comprende adicionalmente: medir el nivel de dimero-D en suero del sujeto antes de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl y administrar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl si el nivel de dimero-D en suero del sujeto es mayor al rango de referencia normal.
56. El método de la reivindicación 55, donde el nivel de dimero-D en suero del sujeto se disminuye a menos del limite superior del rango de referencia normal dentro de las 4 semanas desde el inicio de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl al sujeto.
57. El método de la reivindicación 41 que da como resultado una mejora prolongada en el perfil de coagulación del sujeto.
58. El método de la reivindicación 41 donde , el perfil i de coagulación del sujeto se mejora de manera medible dentro de aproximadamente 2 semanas desde el inicio de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl.
59. El método de la reivindicación 58, donde el perfil de coagulación del sujeto se mantiene mejorado de manera medible aproximadamente 12 semanas luego de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl al sujeto.
60. El método de la reivindicación 41, que comprende adicionalmente : medir la temperatura corporal del sujeto antes de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl y administrar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl si la temperatura corporal del sujeto es mayor a aproximadamente 38 °C. ~ ¡
61. El método de la reivindicación 41, que comprende adicionalmente: medir el peso corporal del sujeto antes de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl y administrar el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo Abl si el peso del sujeto disminuyó en aproximadamente un 5% o más dentro de aproximadamente 30 dias o si el índice de masa corporal magra del sujeto es menor a aproximadamente 17 kg / m2 (sujeto masculino) o menor a aproximadamente 14 kg / m2 (sujeto femenina) .
62. El método de la reivindicación 41, que comprende adicionalmente : medir la fuerza muscular del sujeto antes: de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo ;Abl y administrar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl ;si la fuerza muscular del sujeto disminuyó en un porcentaje mayor a aproximadamente el 20% dentro de aproximadamente 30 días.
63. El método de la reivindicación 41, que da; como resultado una mejora prolongada de la caquexia, la debilidad, la fatiga y/o la fiebre en el sujeto.
64. El método de la reivindicación 41, donde la' masa corporal del sujeto se aumenta en aproximadamente 1 kilogramo dentro de aproximadamente 4 semanas desde el inicio de la administración del anticuerpo o fragmento del anticuerpo Abl.
65. El método de la reivindicación 41, donde la caquexia del sujeto se puede mejorar de forma medible dentro de aproximadamente 4 semanas desde el inicio de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl.
66. El método de la reivindicación 65, donde la caquexia del sujeto se evalúa mediante la medición de la masa corporal total, la masa corporal magra, el índice de masa corporal magra y/o la masa corporal magra apendicular del sujeto. ;
67. El método de la reivindicación 66, donde la medición de la masa corporal del sujeto descuenta (resta) el peso estimado del o de los tumores del paciente y/o la, o las recolecciones de fluido extravascular .
68. El método de la reivindicación 66, donde la caquexia del sujeto se mantiene mejorada de forma medióle aproximadamente 8 semanas luego de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl.
69. El método de la reivindicación 41, donde la debilidad del sujeto se mejora de forma medible dentro de aproximadamente 2 semanas desde el inicio de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl.
70. El método de la reivindicación 69, donde la debilidad del sujeto se mantiene mejorada de forma medible aproximadamente 12 semanas luego de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl.
71. El método de la reivindicación 41, donde la fatiga del sujeto se mejora de forma medible dentro de aproximadamente 1 semana desde el inicio de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl. ¡
72. El método de la reivindicación 71, donde la fatiga del sujeto se mide a través de la prueba FACIT-F FS .
73. El método de la reivindicación 72, donde el resultado del FACIT-F FS del sujeto se mejora en al menos aproximadamente 10 puntos.
74. El método de la reivindicación 71, donde la f'atiga del paciente permanece mejorada de forma medible aproximadamente 12 semanas después de la administración del anticuerpo anti-IL-6.
75. El método de la reivindicación 41, donde la fiebre del sujeto se mejora de forma medible dentro de aproximadamente 1 semana desde el inicio de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl.
76. El método de la reivindicación 75, donde la fiebre del sujeto se mantiene mejorada de forma medible aproximadamente 12 semanas luego de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl.
77. El método de la reivindicación 41, donde .dicho sujeto presenta un nivel de CRP en suero elevado antes de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl.
78. El método de la reivindicación 41, donde dicho sujeto presenta un nivel de albúmina en suero reducido antes de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Abl .
79. El método de la reivindicación 41, mediante el cual mejora la Escala de Pronóstico de Glasgow (GPS) del paciente.
80. El método de la reivindicación 41, que comprende adicionalmente : medir el nivel de CRP en suero del sujeto antes de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl y administrar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl si el nivel de CRP en suero del sujeto es de al menos aproximadamente 5 mg/L.
81. El método de la reivindicación 41, donde el nivel de CRP en suero del sujeto se reduce a menos de aproximadamente 10 mg/L dentro de 1 semana desde el inicio de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl.
82. El método de la reivindicación 41, donde el ; nivel de CRP en suero del sujeto se reduce a menos de aproximadamente 5 mg/L dentro de 1 semana desde el inicio de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl.
83. El método de la reivindicación 41, donde el ; nivel de CRP en suero del sujeto se reduce a menos de aproximadamente 1 mg/L dentro de 1 semana desde el inicio de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl.
84. El método de la reivindicación 41 que da, como resultado una reducción prolongada del nivel de CRP en suero del sujeto.
85. El método de la reivindicación 81, donde 14; días luego de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl el nivel de CRP en suero del sujeto se mantiene inferior a aproximadamente 10 mg/L.
86. El método de la reivindicación 81, donde 21 días luego de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl el nivel de CRP en suero del sujeto se mantiene inferior a aproximadamente 10 mg/L.
87. El método de la reivindicación 81, donde 28 : días luego de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl el nivel de CRP en suero del sujeto se mantiene inferior a aproximadamente 10 mg/L. '
88. El método de la reivindicación 81, donde 35 días luego de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl el nivel de CRP en suero del sujeto se mantiene inferior a aproximadamente 10 mg/L.
89. El método de la reivindicación 81, donde 42 días luego de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl el nivel de CRP en suero del sujeto se mantiene inferior a aproximadamente 10 mg/L. ;
90. El método de la reivindicación 81, donde 49 días luego de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl el nivel de CRP en suero del sujeto se mantiene inferior a aproximadamente 10 mg/L.
91. El método de la reivindicación 81, donde 56 días luego de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl el nivel de CRP en suero del sujeto se mantiene inferior a aproximadamente 10 mg/L. '
92. El método de la reivindicación 41, que comprende adicionalmente : medir el nivel de albúmina en suero . del sujeto antes de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl y administrar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl si el nivel de albúmina en suero del sujeto es menor a aproximadamente 35 g/L.
93. El método de la reivindicación 92, donde el nivel de albúmina en suero del sujeto se aumenta hasta más de aproximadamente 35 g/L dentro de aproximadamente 5 semanas desde el inicio de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl.
94. El método de la reivindicación 41 que da como resultado un aumento prolongado del nivel de albúmina en suero del sujeto.
95. El método de la reivindicación 94, donde 42 días luego de ¦ la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl el nivel de albúmina en suero del sujeto se mantiene superior a 35 g/L.
96. El método de la reivindicación 94, donde 49 días luego de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl el nivel de albúmina en suero del sujeto se mantiene superior a 35 g/L.
97. El método de la reivindicación 94, donde 56, días luego de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl el nivel de albúmina en suero del sujeto se mantiene superior a 35 g/L.
98. El método de la reivindicación 41, donde el nivel de albúmina en suero del sujeto se aumenta en aproximadamente 5 g/L dentro de aproximadamente 5 semanas desde el inicio de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl.
99. El método de la reivindicación 41 que comprende adicionalmente el control del sujeto para evaluar el perfil de coagulación.
100. El método de la reivindicación 41 donde el ^sujeto presentó un nivel de dímero-D en suero elevado antes del tratamiento.
101. El método de la reivindicación 41 donde el .sujeto presentó un nivel de proteína C-reactiva (CRP) en suero elevado antes del tratamiento.
102. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-101, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-IL-6 se administra al sujeto con una frecuencia de como máximo una vez por período de aproximadamente cuatro semanas. :
103. El método de la reivindicación 102, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-IL-6 se administra al sujeto con una frecuencia de como máximo una vez por período de aproximadamente ocho semanas.
104. El método de la reivindicación 103, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-IL-6 se administra al sujeto con una frecuencia de como máximo una vez por período de aproximadamente doce semanas.
105. El método de la reivindicación 104, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-IL-6 se administra al sujeto con una frecuencia de como máximo una vez por período de aproximadamente dieciséis semanas. ;
106. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-40, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl se administra en una cantidad eficaz desde el punto de vista del diagnóstico para la detección de sitios de enfermedad que expresen IL-6.
107. El método de la reivindicación 106, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl se acopla de , forma directa o indirecta a un radioisótopo, fluoróforo u otra etiqueta detectable que facilita la detección del anticuerpo en sitios de enfermedad que expresan la IL-6.
108. El método de la reivindicación 106, que se utiliza para detectar tumores o metástasis que expresan la IL-6.
109. El método de la reivindicación 106, que se utiliza para detectar la presencia de sitios de inflamación asociados con células que expresan la IL-6.
110. El método de la reivindicación 106, dondé los resultados se utilizan para facilitar el diseño de un régimen terapéutico apropiado.
111. El método de la reivindicación 106, donde dicho régimen terapéutico incluye radioterapia, quimioterapia ó una combinación de las mismas.
112. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-101, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl se administra conjuntamente con otro agente terapéutico; que comprende: agentes quimioterapéuticos , estatinas, citocinas, agentes inmunosupresores , agentes de terapia géhica, anticoagulantes, agentes anticaquexia, agentes anti-debilidad, agentes anti-fatiga, agentes anti-fiebre, agentes anti-riáusea, agentes antieméticos, antagonistas de IL-6, agentes citotóxicos, analgésicos, antipiréticos, agentes antiinflamatorios, antibióticos, agentes antivirales, agentes anti-citocina, otros agentes terapéuticos o cualquier combinación de los mismos.
113. El método de la reivindicación 112, donde el agente quimioterapéutico comprende: antagonistas de VEGF, antagonistas de EGFR, platinos, taxoles, irinotecano, 5-fluorouraciloo, gemcitabina, leucovorina, esteroides, ciclofosfamida, melfalán, alcaloides de la vinca, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, mustinas, inhibidores de tirosina cinasa, radioterapia, antagonistas de hormonas sexuales, moduladores selectivos del receptor de andrógeno, moduladores selectivos del receptor de estrógeno, antagonistas de PDGF, antagonistas de TNF, antagonistas de IL-1, interleucinas, IL-12, ;IL-2, antagonistas de IL-12R, anticuerpos monoclonales conjugados con i toxinas, anticuerpos monoclonales específicos contra antígenos tumorales, Erbitux™, Avastin™, Pertuzumab, anticuerpos :anti-CD20, Rituxan®, ocrelizumab, ofatumumab, DXL625, Herceptin® o cualquier combinación de los mismos.
114. El método de la reivindicación 112, donde el anticoagulante comprende: abciximab (ReoPro™) , acenocoumarol, antitrombina III, argatrobán, aspirina, bivalirjudina (Angiomax™) , clopidogrel, dabigatrán, etexilato de dabigatrán (Pradaxa™/Pradax™) , desirudina (Revasc™/Iprivask™) , dipiridamol, eptifibatida ( Integrilin™) , fondaparinux, heparina, hirudina, idraparinux, lepirudina (Reflüdan™) , heparina de bajo peso molecular, melagatrán, fenindiona, fenprocoumón, ticlopidina, tirofibán (Aggrastat™) , warfarina, ximelagatrán, ximelagatrán (Exanta™/Exarta™) o cualquier combinación de los mismos.
115. El método de la reivindicación 112, donde la estatina comprende: atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina o cualquier combinación de las mismas.
116. El método de la reivindicación 112, donde el otro agente terapéutico es un antagonista de un factor que comprende factor de necrosis tumoral alfa, interferón gama, interleucina 1 alfa, interleucina 1 beta, interleucina 6, factor que induce la proteólisis, factor que inhibe la leucemia o cualquier combinación de los mismos.
117. El método de la reivindicación 112, donde el agente anti-caquexia comprende: cannabis, dronabinol (Marinol™) , nabilona (Cesamet) , cannabidiol, cannabicromeno, tetrahidrocannabinol, Sativex, acetato de megestrol o cualquier combinación de los mismos.
118. El método de la reivindicación 112, donde el dgente anti-náusea o agente antiemético comprende: antagonistas del receptor 5-HT3, ajwain, alizaprida, anticolinérgicos, antihistaminas , aprepitant, benzodiazepinas , cannabicromeno, cannabidiol, cannabinoides , cannabis, casopitant, clorpromazina, ciclizina, dexametasona, dexametasona, dimenhidrinato (Gravol™) , difenhidramina, dolasetrón, domperidona, antagonistas de dopamina, doxilamina, dronabinol (Marinol™) , droperidol, emetrol, jenjibre, granisétrón, haloperidol, hidroxizina, hioscina, lorazepam, meclizina, metoclopramida, midazolam, muscimol, nabilona (Cesamet) , antagonistas del receptor nkl, ondansetrón, palonosetrón, menta, Fenergam, proclorperazina, Promacot, prometazina, Pentazina, propofol, sativex, tetrahidrocannabinol , trimetobenzamida, tropisetrón, nandrolona, stilbestrol, talidomida, lenalidomida, agonistas de grelina, antagonistas de miostatina, anticuerpos anti-miostatina, moduladores selectivos I del receptor de androgenos, moduladores selectivos del receptor de estrógeno, antagonistas de angiotensina AII, agonistas del receptor adrenérgico beta dos, agonistas del receptor adrenérgico beta tres o cualquier combinación de los mismos.
119. El método de la reivindicación 112, donde el otro agente terapéutico comprende tamoxifeno, antagonistas de BCL-2, estrógenos, bisfosfonatos, teriparatida, ranelato de estroncio, alendronato de sodio (Fosamax), risedronato (Actonel) , raloxifeno, ibandronato (Boniva) , Obatoclax, ABT-263, goslpol, gefitinib, receptor del factor de crecimiento epidérmico, inhibidores de tirosina cinasa, erlotinib, inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico, psoralenos, trioxisaleno, metoxsaleno, bergapteno, retinoides, etretinato, acitretina, infliximab (Remicade®) , adalimumab, inflíximab, etanercept, Zenapax™, Ciclosporina, Metotrexato, factor de estimulación de colonias de granulocitos, filgrastim, lenograstim, Neupogen, Neulasta, ácidos 2-Arilpropiónicos , Aceclofenac, Acemetacina, Ácido acetilsalicilico (Aspirina) , Alclofenac, Alminoprofeno, Amoxiprina, Ampirona, Ácidos arilalcanoicos , Azapropazona, Benorilato/Benorilato, Benoxaprofeno, Bromfenac, Carprofeno, Celecoxib, salicilato de magnesio y colina, Clofezona, inhibidores de COX-2, Dexibuprofeno, Dexketoprofeno, Diclofenac, Diflunisal, Droxicam, Etenzamida, Etodolac, Etoricoxib, Faislamina, ácidos fenámicos, Fenbufeno, Fenoprofeno, ácido Flufenámico, Flunoxaprofeno, Flurbiprofeno, Ibuprofeno, Ibuproxam, Indometacina, Indoprofeno, Kebuzona, Ketoprofeno, Ketorolac, Lornoxicam, Loxoprofeno, Lumiracoxib, salicilato de Magnesio, ácido Meclofenámico, ácido Mefenámico, Meloxicam, Metamizol, salicilato de Metilo, Mofebutazona, Nabumetona, Naproxeno, ácidos N-Arilantranilicos, Oxametacina, Oxaprozin, Oxicamos, i Oxifenbutazona, Parecoxib, Fenazona, Fenilbutazona, Fenilbutazona, Piroxicam, Pirprofeno, profenos, Proglumetacina, derivados de Pirazolidina, Rofecoxib, salicilato de Salicilo, Salicilamida, Salicilatos, Sulfinpirazona, Sulindac, Suprofeno, Tenoxicam, ácido Tiaprófenico, ácido Tolfenámico, Tolmetin y Valdecoxib. Los antibióticos incluyen Amikacina, Aminoglicosidas, Amoxicilina, Ampicilina, Ansamxcinas , Arsfenamina, Azitromicina, Azlocilina, Aztreonam, Bacitracina, Carbacefem, Carbapenems , Carbenicilina, Cefaclor, Cefadroxil, Cefalexina, Cefalotina, Cefalotina, Cefamandol, Cefazolina, Cefdinir, Cefditoren, Cefepima, Cefixima, Cefoperazona , Cefotaxima, Cefoxitin, Cefpodoxima, Cefprozil, Ceftazidima, Ceftibuten, Ceftizoxima, Ceftobiprol, Ceftriaxona, Cefuroxima, Cefalosporina, Cloramfenicol , Cilastatina, Ciprofloxacina, Claritromicina, Clindamicina, Cloxacilina, Colistina,! Co-trimoxazol, Dalfopristina, Demeclociclina, Dicloxacilina, Diritromicina, Doripenem, Doxiciclina, Enoxacina, Ertapenem, Eritromicina, Etambutol, Flucloxacilina, Fosfomicina, Furazolidona, ácido Fusidico, Gatifloxacina, Geldanamicina, Gentamiciña, Glicopéptidos , Herbimicina, Imipenem, Isoniazida, Kanamicina, Levofloxacina, Lincomicina, Linezólida, Lomefloxacina, Loracarbef, Macrolidas , Mafenida, Meropenem, Meticilina, etronidazol , Mezlocilina, inociclina, Monobactams , oxifloxacina, Mupirocina, Nafcilina, Neomicina, Netilmicina, Nitrofurantoina, Norfloxacina, Ofloxacina, Oxacilina, Oxitetraciclina, Paromomicina, Penicilina, Penicilinas, Piperacilina, Platensimicina, Polimixina B, Polipéptidos, Prontosil, Pirazinamida, Quinol nas, Quinupristina, Rifampicina, Rifampina, Roxitromicina, Espectinomicina, Estreptomicina, Sulfacetamida, Sulfametizol, Sulfanilimida, Sulfasalazina, Sulfisoxazol, Sulfonamidas, Teicoplanina, Telitromicina, Tetraciclina , Tetraciclinas , Ticarcilina, Tinidazol, Tobramicina, Trimetoprim, Trimetoprim-Sulfametoxazol , Troleandomicina, Trovafloxacina y Vancomicina . Los agentes activos también incluyen Aldosterona, Beclometasona, Betametasona, Corticosteroides, Cortisol, acetato de Cortisona, acetato de Desoxicorticostérona, Dexametasona, acetato de Fludrocortisona, Glucocorticoides, Hidrocortisona, Metilprednisolona, Prednisolona, Prednísona, Esteroides y Triamcinolona . Los agentes antivirales incluyen abacavir, aciclovir, aciclovir, adefovir, amantádina, amprenavir, una combinación de dosis fija antiretroviral, un potenciador sinérgico antiretroviral, arbidol, atazanavir, atripla, brivudina, cidofovir, combivir, daruriavir, delavirdina, didanosina, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtida, entecavir, inhibidores de entrada, famciclovir, fomivirsen, fosamprenavir, foscarnet, fosfonet, inhibidor de fusión, ganciclovir, gardasil, ibacitabina, idoxuridina, imiquimod, imunovir, indinavir, inosina, inhibidor de integrasa, interferón, interferón tipo I, interferón ; tipo II, interferón tipo III, lamivudina, lopinavir, lovirida, maraviroc, MK-0518, moroxidina, nelfinavir, nevirapina, nexavir, análogos de nucleósido, oseltamivir, penciclóvir, peramivir, pleconaril, podofilotoxina, inhibidor de próteasa, inhibidor de transcriptasa inversa, ribavirina, rimantadina, ritonavir, saquinavir, stavudina, tenofovir, tenofovir disopróxilo, tipranavir, trifluridina , trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir , valganciclovir , vicriviroc, vidarabina, viraraidina, zalcitabina, zanamivir, zidovudina o cualquier combinación de los mismos. i
120. El método de la reivindicación 112, donde el agente citotóxico, agente quimioterapéutico o agente inmunosupresor comprende: 1-deshidrotestosterona, 1-metilnitrosourea, 5-fluorouraciloo, 6-mercaptopurina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, Abatacept, abraxano, acitretina, aclarubicina, Actinio-225 (225Ac) , actinomicina, Adalimumab, inhibidores de la desaminasa de adenosina, Afelimomab, Aflibercept, Afutuzumab, Alefacept, alitretinoina, alquil sulfonatos, agentes alquilantes, altretamina, alvocidib, .ácido aminolevulínico/metil aminolevulinato, aminoptérina, aminopterina, amrubicina, amsacrina, amsacrina, anagrelida, Anakinra, antracenedionas, antraciclinas, antraciclinas, antraciclinas , antramicina (AMC) ; agentes antimitóticos , antibióticos, anticuerpos anti-CD20, antifolatos, globulina Anti-linfocitos, Antimetabolitos , globulina Anti-timocitos , trióxido arsénico, Aselizumab, asparaginasa, destructorés de asparagina, Astatina-211 (211At) , Atlizumab, Atorolimumab, atrasentán, Avastin™, azacitidina, Azatioprina, azelasítina, aziridinas, Basiliximab, anticuerpos BAYX, Belatacept, Belimumab, belotecán, bendamustina, Bertilimumab, bexaroteno, bisantreno Bismut -213 (213Bi), Bismut-212 ( 12Bi) , bleomicina, bleomicina, bleomicina, anticuerpos BLyS, bortezomib, busulfán, busulfán, inhibidores de Calcineurina, caliqueamicina, camptotecina, camptotecinas, capecitabina, carboplatina (paraplatina) , carbocuona, carminomicina, carmofur, carmüstina, carmustina (BSNU) , anticuerpos CAT, anticuerpos CDlla, anticuerpos CD147/Basigina, anticuerpos CD154, anticuerpos CD18, anticuerpos CD20, anticuerpos CD23, anticuerpos CD3, anticuerpos CD4, anticuerpos CD40, anticuerpos CD.62L/L-selectina, anticuerpos CD80, inhibidores de CDK, Cedeli'zumab, celecoxib, Certolizumab pegol, clorambucilo, clorambucilos , Ciclosporina, cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatinos, cladribina, Clenoliximab, clofarabina, colquicina, anticuerpos del componente complemento 5, Cobre-67 (67Cu) , corticosteroides, anticuerpos CTLA-4, proteínas de fusión a CTLA-4, inhibidores de Ciclofilina, ciclofosfamidas , ciclotosfamida, citarabina, citarabina, citocalasiná B, ribonucleasas citotóxicas, dacarbazina, Daclizumab, dactinomicina, dactinomicina (actinomicina D) , daunorubicina, daunorubicina, daunorubicina (anteriormente daunomicina) , decitabina, Deforolimus, demecolcina, detorubicina, dibromomanitol, dietilcarbamazina, inhibidores de: la dihidrofolato reductasa, dihidroxi antracina diona, toxina de la difteria, inhibidores de la ADN polimerasa, docetaxel, Dorlimomab aritox, Dorlixizumab, doxorrubicina (adriamicina) , DXL625, Eculizumab, Efalizumab, efaproxiral, antagonistas de EGFR, elesclomol , elsamitrucina, Elsilimomab, emetina, antagonistas del receptor de endotelina, epipodofilotoxinas, epirubicina, epotilonas, Erbitux™, Erlizumab, estramustina, Etanercept, bromuro de etidio, etoglucid, etoposida, fosfato de etoposida, Everolimus, Faralimomab, inhibidores¡ de farnesiltransferasa, inhibidores de FKBP, floxuridina, fludarabina, fluorouraciloo, Fontolizumab, fotemustina, Galiximab, Galio-67 (67Ga) , Gantenerumab, Gavilimomab, gemcitabina, glucocorticoides , Golimumab, Gomiliximab, gramicidina D, Gusperimus, Herceptin®, hidrazinas, hidroxiurea, agentes hipometilantes, idarubicina, Idarubicina, ifosfamida, antagonistas de IL-1, antagonistas del receptor de IL-1, IL-12, anticuerpos IL-12, antagonistas de IL-12R, anticuerpos IL-13, IL-2, inhibidores de IL-2, receptor de IL-2/anticuerpos 'CD25, anticuerpos IL-6, imatinib mesilato, anticuerpos' de Inmunoglobulina E, inhibidores de IMP deshidrogenasa, Infliximab, Inolimomab, anticuerpos de Integrina, anticuerpos de Inferieron, interferones, anticuerpos de Interleucina 5, anticuerpos del receptor de Interleucina-6, interleucinas , Yodo-125 (125I), Iodo-131 (131I), Ipilimumab, irinotecano, ixabepilona, Keliximab, larotaxel, Plomo-212 (212Pb) , Lebrilizumab, Leflunomida, Lenalidomida, Lerdelim'umab, leucovorina, anticuerpos LFA-1, lidocaína, inhibidores de lipoxigenasa, lomustina (CCNU) , lonidamina, lucantona, Lumiliximab, Lutetio-177 (177Lu) , Macrolidas, manosúlfano, Maslimomab, masoprocol, mecloretamina, melfalano, epolizumab, mercaptopurina, Metelimumab, Metotrexato, inhibidores del ensamblaje de microtúbulos , potenciadores de la estabilidad de microtúbulos, mitramicina, mitobronitol, mitogüazona, mitomicina, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, Moroliraumab, inhibidores de mTOR, Muromonab-CD3 , mustinas, ¡ ácido icofenólico, mitotano (0, P ' - ( DDD) ) , Natalizumab, nedaplatina, Nerelimomab, nimustina, mostazas de nitrógeno, nitrosoureas , ácido nordihidroguaiarético, oblimersén, ocrelizumab, Ocrelizumab, Odulimomab, ofatumumab, olaparib, Omalizumab, ortataxel, Otelixizumab, oxaliplatina, oxaliplatina, paclitaxel (taxol) , Pascolizumab, antagonistas de PDGF, pegaspargasa, pemetrexed, Pentostatina, Pertuzumab, Pexelizumab, inhibidores de fosfodiesterasa, Fosforo-32 (32P) , Pimecrolimus Abetimus, pirarubicina, pixantrona, platinas, plicamicina, inhibidores de poli-ADP ribosa polimerasa, sodio porfimer, derivados de porfirina, prednimustina, procaina, procarbazina, procarbazina, propranolol, inhibidores de proteasoma, exotoxinas pseudomonas, toxina Pseudomonas, inhibidores de la síntesis de pürina, puromicina, inhibidores de la síntesis de pirimidina, radioisótopos, radioterapia, raltitrexed, ranimustina, Reslizumab, agonistas del receptor retinoide X, retinpides, Renio-186 (186Re) , Renio-188 (188Re) , inhibidores de ribonucleótido reductasa, ricina, Rilonacept, Rituxan®, Rovelizumab, rubitecano, Ruplizumab, Samario-153 (153Sm) , satraplatina, Scandio-47 ( 7Sc) , moduladores del receptor selectivo de androgeno, seliciclib, semustina, antagonistas de las hormonas sexuales, Siplizumab, Sirolimus, inhibidores de esteroides aromatasa, esteroides, estreptozocina, estreptozotocina, Tacrolimus, talaporfina, Talizumab, táxanos, taxoles, tegafur, Telimomab aritox, temoporfina, temozoíomida, temsirolimus , Temsirolimus, Teneliximab, teniposida, Teplizumab, Teriflunomida, tesetaxel, testolactona, tetracaina, Talidomida, tioepa clorambucilo, tiopurinas tioguanina, TioTEPA, inhibidores de timidilato sintasa, tiazofurina, tipifarnib, anticuerpos de linfocitos T, antagonistas de TNF, anticuerpos de TNF, proteínas fusión de TNF, proteínas del receptor de fusión de TNF, inhibidores TNF-alpha, Tocilizumab, inhibidores de topoisomerasa, topotecano, Toralizumab, trabectedina, Tremelimumab, treosulfano, tretinoina, triazenos, triazicuona, trietilenomelamina, tetranitrato de triplatina , trofosfamida, anticuerpos monoclonales específicos de antígenos tumoral, inhibidores de tirosina cinasa, uramustina, Ustekinumab, valrubicina, Valrubicina, Vapaliximab, antagonistas de VEGF, Vepalimomab, verteporfina, vinblastina, alcaloides de la vinca, vincristina, vindesina, vinflunina, vinorelbina, Visilizumab, vorinostat, Ytrio-88 (88Y) , Ytrio-90 ( Y) , Zanolimumab, zileutón, Ziralimumab, Zolimomab aritox, zorubicina, Zotarolimus o cualquier combinación de los mismos.
121. El método de la reivindicación 112, donde el otro agente activo es uno o más agonistas, antagonistas o moduladores de un factor que comprende: TNF-á, IL-2, IL- , IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-á, IFN-á, BAFF, CXCL13 , IP-10, VEGF, EPO, EGF, HRG, factor de crecimiento de hepatócitos (HGF) , Hepcidina o cualquier combinación de los mismos.
122. El método de la reivindicación 112, donde el antagonista de IL-6 comprende: anticuerpos anti-IL-6 o fragmentos de los mismos, ácidos nucleicos antisentido, polipéptidos , moléculas pequeñas o cualquier combinación de los mismos. :
123. El método de la reivindicación 122, donde el 'ácido nucleico antisentido comprende al menos aproximadamente 10 nucleótidos de una secuencia que codifica la IL-6, el reqeptor de IL-6 alfa, el gpl30, la p38 AP cinasa, JAK1, JAK2, JÁK3 o SYK. ;
124. El método de la reivindicación 122, donde el ácido nucleico antisentido comprende ADN, ARN, ácido nucleico peptidico, ácido nucleico bloqueado, morfolino (oligómero fosforodiamidato morfolino) , ácido nucleico glicólico, ácido nucleico treósico o cualquier combinación de los mismos.
125. El método de la reivindicación 122, donde el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento del mismo comprende: Abl,¡Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, ¡Abl3, Abl4, Abl5, Abl6, Abl7, Abl8, Abl9, Ab20, Ab21, Ab22, ;Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, (Ab33, Ab34, Ab35, Ab36, un fragmento de unión a la IL-ß de cualquiera de los anteriores, una variante de cualquiera de los anteriores o cualquier combinación de los mismos.
126. EL método de la reivindicación 122, donde el polipéptido del antagonista de IL-6 comprende un fragmento de un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del ¡grupo que consiste en IL-6, receptor de IL-6 alfa, gpl30 MAP cinasa, JAK1, JAK2, JAK3 y SYK.
127. El método de la reivindicación 126, donde el fragmento tiene al menos 40 aminoácidos de longitud.
128. El método de la reivindicación 122, donde el antagonista de IL-6 comprende una IL-6 soluble, un receptor de IL-6 alfa, un gpl30, una p38 MAP cinasa, JAK1, JAK2, JAK3, SYK o cualquier combinación de los mismos.
129. El método de la reivindicación 112, donde el antagonista de IL-6 está acoplado a un resto de aumento de la semivida.
130. El método de cualquiera de las reivindicaciones 112-129, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl,está directa o indirectamente acoplado a uno o más de dichos agentes terapéuticos adicionales. '¦
131. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-101, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl' está directa o indirectamente acoplado o una etiqueta detectable.
132. El método de la reivindicación 131, donde la etiqueta detectable comprende: tintes fluorescentes, materiales bioluminiscentes, materiales radioactivos, restos quimioluminiscentes , estreptavidina, avidina, biótina, materiales radioactivos, enzimas, sustratos, peroxidasa de rábano picante, acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, luciferasa, rodamina, fluoresceina, fluoresceina isotiocianato, umbeliferota, díclorotriazinilámina, ficoeritrina, cloruro de dansilo, luminol, luciferina, aecuorina, Yodo 125 (125I) , Carbono 14 (14C) , Azufre 35 :(35S) , Tritio (3H) , Fósforo 32 (32P) o cualquier combinación de los mismos.
133. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-30 o las reivindicaciones 34-128, donde el anticuerpo Abl se administra al sujeto en forma de uno o más ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo Abl. !
134. El método de la reivindicación 133, donde el o los ácidos nucleicos se introducen al sujeto que los recibe como un virus, un liposoma, un complejo de lipido catiónico, un complejo de polímero catiónico o un complejo de nanopartículas .
135. El método de la reivindicación 133 donde el o los ácidos nucleicos están compuestos por codondes preferidos humanos o de levadura.
136. El método de la reivindicación 133 donde el o los ácidos nucleicos están comprendidos en un vector.
137. El método de la reivindicación 136 donde el vector es un vector viral plásmido o recombinante .
138. El método de la reivindicación 133 donde el o los ácidos nucleicos comprenden las secuencias de polinucleótído de cadena pesada y ligera de la SEQ ID NO: 723 y la SEQ ID NO: 700; SEQ ID NO: 701 y la SEQ ID NO: 703; SEQ ID NO: 705. y la SEQ ID NO: 707; SEQ ID NO: 720 y la SEQ ID NO: 724 y SEQ ID NO: 10 y la SEQ ID NO: 11.
139. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el anticuerpo Abl comprende: (a) polipéptidos de cadena pesada y ligera ¡ que comprenden: la SEQ ID NO: 709 y la SEQ ID NO: 657; SEQ ID NO: 702 y la SEQ ID NO: 704; SEQ ID NO: 706 y la SEQ ID NO: 708; SEQ ID NO: 20 y la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3; '¦ (b) un polipéptido que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con cualquiera de! los polipéptidos de (a) , (c) un polinucleótído que se híbrida en condiciones de hibridación de restricción alta o moderada a cualquiera dé las secuencias de polinucleótidos de cadena ligera y pesada de la SEQ ID NO: 723 y la SEQ ID NO: 700; SEQ ID NO: 701 y la SEQ ID NO: 703; SEQ ID NO: 705 y la SEQ ID NO: 707; SEQ ID NO: 720 y la SEQ ID NO: 724 y SEQ ID NO: 10 y la SEQ ID NO: 11; (d) un polinucleótido que tiene al menos 80%, 85%,', 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de polinucleótido de cadena ligera y pesada e la SEQ ID NO: 723 y la SEQ ID NO: 700; SEQ ID NO: 701 y la SEQ ID NO: 703; SEQ ID NO: 705 y la SEQ ID NO: 707; SEQ ID NO: ¡720 y la SEQ ID NO: 724 y SEQ ID NO: 10 y la SEQ ID NO: 11; (e) un polipéptido codificado por cualquiera de los polinucleótidos de (c) o (d) .
140. Una composición terapéutica que comprende un anticuerpo Abl y otro compuesto terapéutico, donde el anticuerpo Abl comprende: un polipéptido de cadena ligera que comprende.: un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad con la SEQ ID NO: 709, un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos 75% de identidad con el polinucleótido de la SEQ ID NO: 723, un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de restricción media a un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 723 o un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de restricción alta a un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 723 y ] un polipéptido de cadena pesada que comprende;: un polipéptido que tiene al menos 75% de identidad con la SEQ ID NO: 657, un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos 75% de identidad con el polinucleótido de la SEQ ID NO: 700, un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de restricción media a un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 700 o un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de restricción alta a un polinucleótido que tiene la secuencia del complemento inverso de la SEQ ID NO: 700; ; donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo Abl se unen de forma específica a la IL-6 y antagonizan una o más actividades asociadas con la IL-6 y donde el otro compuesto terapéutico comprende: agentes quimioterapéuticos, estatinas, citocinas, agentes de terapia génica, anticoagulantes, agentes anticaquexia, agentes 'antidebilidad, agentes anti-fatiga, agentes anti-fiebre, agentes anti-náusea, agentes antieméticos, antagonistas de IL-6, un agente citotóxico, otro compuesto terapéutico o cualquier combinación de los mismos.
141. La composición de la reivindicación 140, donde el polipéptido de cadena ligera incluye una o más sustituciones en la región o las regiones flanqueantes de cadena ligera con relación a las secuencias de la región flanqueante de cadena ligera de la SEQ ID NO: 709.
142. El método de la reivindicación 141 donde una o más de las sustituciones en la región o las regiones flanqueantes de cadena ligera es una sustitución con la secuencia de una posición correspondiente de una secuencia donante, donde la secuencia donante comprende: la SEQ ID NO: 2, una secuencia de cadena ligera humana, de conejo o de primate no humano y una cadena ligera de cualquiera de Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6 | Ab7, Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, Abl3, Abl4, Abl5, Abl6, Abl7, Abl8, Abl9, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35 o Ab36, donde la sustitución da como resultado el remplazo, la inserción y/o la eliminación de uno o más aminoácidos y ) donde la posición correspondiente está determinada por el alineamiento de secuencia entre la región flanqueante de la SEQ ID NO: 709 y la secuencia donante.
143. La composición de la reivindicación 142, donde el polipéptido de cadena pesada incluye una o más sustituciones en la región o las regiones flanqueantes de cadena pesada con relación a las secuencias de la región flanqueante de cadena pesada de la SEQ ID NO: 657. ;
144. La composición de la reivindicación 143 donde una o más de las sustituciones en la región o las regiones flanqueantes de cadena pesada es una sustitución con la secuencia de una posición correspondiente de una secuencia donante, donde la secuencia donante comprende: la SEQ ID NO: 3, una secuencia de cadena pesada humana, de conejo o de primate no humano y una cadena pesada de cualquiera de Ab2, Ab3„ Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, Abl3, Abl4, Abl5, Abl6, Abl7, Abl8, Abl9, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35 o Ab36, : donde la sustitución da como resultado el remplazo, la inserción y/o la eliminación de uno o más aminoácidos y donde la posición correspondiente está determinada por el alineamiento de secuencia entre la región flanqueante de la SEQ ID NO: 657 y la secuencia donante.
145. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-144, donde el polipéptido de cadena ligera comprende uno o más polipéptidos de CDR de cadena ligera de Abl que comprenden: una CDR1 de cadena ligera que tiene al menos 72.7% de identidad (idéntica en hasta al menos 8 de 11 residuos) con la SEQ ID NO: 4; una CDR2 de cadena ligera que tiene al menos 85.7% de identidad (idéntica en hasta al menos 6 de 7 residuos) con la SEQ ID NO: 5; una CDR3 de cadena ligera que tiene al menos 50% de identidad (idéntica en hasta al menos 6 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 6; ' una CDR1 de cadena ligera que tiene al menos 90.9% de similitud (similar en hasta al menos 10 de 11 residuos) con la SEQ ID NO: 4; ; una CDR2 de cadena ligera que tiene al menos 100% de similitud (similar en hasta al menos 7 de 7 residuos) con la SEQ ID NO: 5 o una CDR3 de cadena ligera que tiene al menos 66.6% de similitud (similar en hasta al menos 8 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 6; ' y donde el polipéptido de cadena pesada comprende uno o más polipéptidos de CDR de cadena pesada de Abl que comprenden: una CDR1 de cadena pesada que tiene al menos 80% de identidad (idéntica en hasta al menos 4 de 5 residuos) con la SEQ ID NO: 7; una CDR2 de cadena pesada que tiene al menos 50% de identidad (idéntica en hasta al menos 8 de 16 residuos) con la SEQ ID NO: 120; una CDR3 de cadena pesada que tiene al menos 33.3% de identidad (idéntica en hasta al menos 4 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 9; una CDR1 de cadena pesada que tiene al menos 100% de similitud (similar en hasta al menos 5 de 5 residuos) con la SEQ ID NO: 7; ' una CDR2 de cadena pesada que tiene al menos 56.2% de similitud (similar en hasta al menos 9 de 16 residuos) con la SEQ ID NO: 120 o ¡ una CDR3 de cadena pesada que tiene al menos 50;% de similitud (similar en hasta al menos 6 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 9.
146. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-144, donde el polipéptido de cadena ligera comprende uno o más polipéptidos de CDR de cadena ligera de Abl que comprenden: i una CDRl de cadena ligera que tiene al menos 81.8% de identidad (idéntica en hasta al menos 9 de 11 residuos) con la SEQ ID NO: 4; una CDR2 de cadena ligera que tiene al menos 71.4% de identidad (idéntica en hasta al menos 5 de 7 residuos) con la SEQ ID NO: 5 o una CDR3 de cadena ligera que tiene al menos 83.3% de identidad (idéntica en hasta al menos 10 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 6; y donde el polipéptido de cadena pesada comprende uno o más polipéptidos de CDR de cadena pesada de Abl que comprenden: una CDRl de cadena pesada que tiene al menos 60% de identidad (idéntica en hasta al menos 3 de 5 residuos) cpn la SEQ ID NO: 7; ; una CDR2 de cadena pesada que tiene al menos 87.5% de identidad (idéntica en hasta al menos 14 de 16 residuos) con la SEQ ID NO: 120 o una CDR3 de cadena pesada que tiene al menos 83.3% de identidad (idéntica en hasta al menos 10 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 9.
147. La composición de cualquiera de : las reivindicaciones 145-146, donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo Abl comprende al menos dos de dichos polipéptidos de CDR de cadena ligera y al menos dos de dichos polipéptidos de CDR de cadena pesada.
148. Una composición terapéutica que comprende un anticuerpo Abl y otro compuesto terapéutico, ! donde el anticuerpo Abl comprende: dos o más polipéptidos de CDR de cadena ligera de Abl que comprenden: una CDR1 de cadena ligera que tiene al menos 72.7% de identidad (idéntica en hasta al menos 8 de 11 residuos) con la SEQ ID NO: 4; una CDR2 de cadena ligera que tiene al menos 85.7% de identidad (idéntica en hasta al menos 6 de 7 residuos) con la SEQ ID NO: 5 o ! una CDR3 de cadena ligera que tiene al menos 50% de identidad (idéntica en hasta al menos 6 de 12 residuos) c'pn la SEQ ID NO: 6; y dos o más polipéptidos de CDR de cadena pesada de Abl que comprenden: una CDR1 de cadena pesada que tiene al menos 80% de identidad (idéntica en hasta al menos 4 de 5 residuos) con la SEQ ID NO: 7; una CDR2 de cadena pesada que tiene al menos 50% de identidad (idéntica en hasta al menos 8 de 16 residuos) con la SEQ ID NO: 120 o una CDR3 de cadena pesada que tiene al menos 33.3% de identidad (idéntica en hasta al menos 4 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 9; donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo Abl se unen de forma especifica a la IL-6 y antagonizan una o más actividades asociadas con la IL-6 ¡ y donde el otro compuesto terapéutico comprende: agentes quimioterapéuticos , estatinas, citocinas, agentes de terapia génica, anticoagulantes, agentes anticaquexia, agentes 'antidebilidad, agentes anti-fatiga, agentes anti-fiebre, agentes anti-náusea, agentes antieméticos, antagonistas de IL-6, un agente citotóxico, otro agente terapéutico o cualquier combinación de los mismos.
149. Una composición terapéutica que comprende un anticuerpo Abl y otro compuesto terapéutico, donde el anticuerpo Abl comprende: una CDR1 de cadena ligera que tiene al menos 90.9% de similitud (similar en hasta al menos 10 de 11 residuos) con la SEQ ID NO: 4; : una CDR2 de cadena ligera que tiene al menos 100% de similitud (similar en hasta al menos 7 de 7 residuos) con la SEQ ID NO: 5 y \ una CDR3 de cadena ligera que tiene al menos 66.6% de similitud (similar en hasta al menos 8 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 6; y dos o más polipéptidos de CDR de cadena pesada de Abl que comprenden: ] una CDR1 de cadena pesada que tiene al menos 100% de similitud (similar en hasta al menos 5 de 5 residuos) qon la SEQ ID NO: 7 ; una CDR2 de cadena pesada que tiene al menos 56.2% de similitud (similar en hasta al menos 9 de 16 residuos) con la SEQ ID NO: 120 o una CDR3 de cadena pesada que tiene al menos 50% de similitud (similar en hasta al menos 6 de 12 residuos) con la SEQ ID NO: 9; donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo Abl se unen de forma especifica a la IL-6 y antagonizan una o más actividades asociadas con la IL-6 y donde el otro compuesto terapéutico comprende: agentes quimioterapéuticos, estatinas, citocinas, agentes de terapia génica, anticoagulantes, agentes anticaquexia, agentes ,anti-debilidad, agentes anti-fatiga, agentes anti-fiebre, agentes anti-náusea, agentes antieméticos, antagonistas de IL-6, un agente citotóxico, otro agente terapéutico o cualquier combinación de los mismos.
150. La composición de cualquiera de ¡ las reivindicaciones 148-149 donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl comprende dicha CDR1 de cadena ligera, : dicha CDR3 de cadena ligera, dicha CDR2 de cadena pesada y dicha CDR3 de cadena pesada. '
151. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 148-149 donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl comprende dicha CDR1 de cadena ligera, dicha CDR2 de cadena ligera, dicha CDR3 de cadena ligera, dicha CDR1 de cadena pesada, dicha CDR2 de cadena pesada y dicha CDR3 de cadena pesada.
152. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 144-147 donde dichos polipéptidos de GDR de cadena pesada y ligera están comprendidos en un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende Fab, Fab', F(ab')¿> Fv, scFv, IgNAR, SMIP, anticuerpos de camélido o nanoanticuerpos.
153. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 148-151 donde las regiones flanqueantes' (FRs) 1, 2, 3 y 4 en las regiones pesadas y ligeras variables de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl, respectivamente, son FRs humanas no modificadas o modificadas por la sustitución de como máximo 2 o 3 residuos FR humanos con los correspondientes residuos FR de la cadena pesada o ligera de anticuerpo de conejo progenitor de la SEQ ID NO: 2 y ía SEQ ID' NO: 3, respectivamente, donde dichas FR de cadena ligera humana 1, 2 y 1 3 se derivaron de una secuencia de anticuerpo de cadena ligera variable humana que se seleccionó de una biblioteca o base de datos de secuencias de anticuerpo de lineas germinales humanas con base en su alto nivel de homología (con respecto a otras secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas contenidas en la biblioteca o en la base de datos) con la subsecuencia de la cadena ligera de anticuerpo de conejo progenitor de la SEQ ID NO: 2 que se extiende desde el comienzo de la FR1 hasta el final de la FR3 y | donde dicha FR4 de cadena ligera humana se derivó de una secuencia de anticuerpo de cadena ligera variable humana que se seleccionó de una biblioteca o base de datos de secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas con base en su alto nivel de homología (con respecto a otras secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas contenidas en la biblioteca o en la base de datos) con la FR4 de cadena ligera i de anticuerpo de conejo progenitor contenida en la SEQ ID'NO: 2 donde dichas FR de cadena pesada humana 1, 2 y , 3 se derivaron de una secuencia de anticuerpo de cadena pesada variable humana que se seleccionó de una biblioteca o base de datos de secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas con base en su alto nivel de homología (con respecto a ;otras secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas contenidas en la biblioteca o en la base de datos) con la subsecuencia de la cadena pesada de anticuerpo de conejo progenitor de la SEQ ID NO: 3 que se extiende desde el comienzo de la FR1 hasta el final de la FR3 y donde dicha FR4 de cadena pesada humana se derivó de una secuencia de anticuerpo de cadena pesada variable humana que se seleccionó de una biblioteca o base de datos de secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas con base en su alto nivel de homología (con respecto a otras secuenciás de anticuerpo de líneas germinales humanas contenidas en la biblioteca o en la base de datos) con la FR4 de cadena pesada de anticuerpo de conejo progenitor contenida en la SEQ ID NO: 3. I
154. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-153, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl tiene una semivida in vivo de al menos aproximadamente 22 días en un sujeto humano saludable.
155. La composición de cualquiera de ; las reivindicaciones 140-153, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl tiene una semivida in vivo de al menos aproximadamente 25 días en un sujeto humano saludable.
156. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-153, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl tiene una semivida in vivo de al menos aproximadamente 30 días en un sujeto humano saludable.
157. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-156, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl tiene una afinidad de unión (Kd) a IL-6 menor a aproximadamente 50 picomolar o una tasa de disociación (K¿ff) de IL-6 menor o igual a 10"4 S"1. i
158. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-157, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl se une de forma especifica al mismo o ¡a los mismos epitopos lineales o conformacionales y/o compite para unirse al mismo o a los mismos epitopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 humana intacta o un fragmento del mismo como un anticuerpo anti-IL-6 que consiste esencialmente en los polipéptidos de la SEQ ID NO: 702 y la SEQ ID NO: 704 o los polipéptidos de la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3.
159. La composición de la reivindicación 158, .donde dicha unión al mismo o a los mismos epitopos lineales o conformacionales y/o competición de unión al mismo o a los mismos epitopos lineales o conformacionales en un polipéptido de IL-6 humana intacta o un fragmento del mismo se establece mediante mapeo epitópico utilizando fragmentos de péptidos lineales superpuestos que abarcan toda la longitud: del polipéptido de IL-6 humana nativa e incluye uno o más residuos comprendidos en los fragmentos de IL-6 seleccionado¡s de aquellos que comprenden respectivamente los residuois de aminoácidos 37-51, los residuos de aminoácidos 70-84, los residuos de aminoácidos 169-183, los residuos de aminoácidos 31-45 y/o los residuos de aminoácidos 58-72 de la SEQ ID NO: 1.
160. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-159, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl es aglicosilado . !
161. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-160, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl contiene una región Fe que ha sido modificada para alterar la función efectora, la semivida, la proteólisis y/o la glicosilación.
162. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-161, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl es un anticuerpo humano, humanizado, de cadena simple o quimérico.
163. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-162, donde el anticuerpo o fragmerito de anticuerpo Abl comprende Fab, Fab', F(ab' )2/ Fv o scFv. ¦
164. La composición de cualquiera de '; las reivindicaciones 140-163, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl comprende adicionalmente una Fc humana.
165. La composición de la reivindicación 164, donde dicha Fc humana está derivada de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgGlO, IgGll, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 o IgG19. i
166. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-165, donde el o las actividades asociadas con la IL-6 son una actividad in vivo que comprende: albúmina en suero disminuida, proteina C-reactiva elevada ("CRP") , fatiga, fiebre, anorexia (pérdida de apetito) , pérdida de peso, caquexia, debilidad, escala de pronóstico de Glasgow ("GPS") disminuida, dimero-D en suero elevado, perfil de coagulación anormal o cualquier combinación de los mismos.
167. La composición de cualquiera de ¦ las reivindicaciones 140-165, donde una o más de la o las actividades asociadas con la IL-6 es una actividad in vivo que comprende: estimulación de la proliferación de células T1165, unión de IL-6 a IL-6R, activación (dimerización) de la glicoproteina transductora de señales gpl30, formación de multimeros IL-6/IL-6R/gpl30, estimulación de la producción de haptoglobina mediante células HepG2 modificadas para expresar el receptor de IL-6 humana o cualquier combinación de los mismos.
168. La composición de cualquiera de ¦ las reivindicaciones 140-167, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl se expresa a partir de una célula recombinante.
169. La composición de la reivindicación 168 donde la célula se selecciona de una célula de insecto, bacteriana, de levadura y de mamífero.
170. La composición de la reivindicación 169 donde la célula es una célula de levadura.
171. La composición de la reivindicación 170 donde la célula es una célula de levadura diploide.
172. La composición de la reivindicación 171 doride la célula de levadura es una levadura Pichia. i
173. La composición de cualquiera de , las reivindicaciones 140-172, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl se administra conjuntamente con otro agente terapéutico que comprende: agentes quimioterapéuticos, estatinas, citocinas, agentes inmunosupresores, agentes de terapia génica, anticoagulantes, agentes anticaquexia, agentes anti-debilidad, agentes anti-fatiga, agentes anti-fiebre, agentes anti-náusea, agentes antieméticos, antagonistas de IL-6, agentes citotóxicos, analgésicos, antipiréticos, agentes antiinflamatorios, antibióticos, agentes antivirales, agentes anti-citocina, otros agentes terapéuticos o cualquier combinación de los mismos. ?
174. La composición de la reivindicación 173, donde el agente quimioterapéutico comprende: antagonistas de VEGF, antagonistas de EGFR, platinos, taxoles, irinotecano, 5-fluorouraciloo, gemcitabina, leucovorina, esferoides, ciclofosfamida, melfalán, alcaloides de la vinca, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, mustinas, inhibidores de tirosina cinasa, radioterapia, antagonistas de hormonas sexuales, moduladores selectivos del receptor de andrógeno, moduladores selectivos del receptor de estrógeno, antagonistas de PDGF, antagonistas de TNF, antagonistas de : IL-1, interleucinas, IL-12, IL-2, antagonistas de IL-12R, anticuerpos monoclonales conjugados con toxinas, anticuerpos monoclonales específicos contra antígenos tumorales, Erbitux™, Ava'stin™, Pertuzumab, anticuerpos anti-CD20, Rituxan®, ocreli'zumab, ofatumumab, DXL625, Herceptin® o cualquier combinación de los mismos.
175. La composición de la reivindicación 173, donde el anticoagulante comprende: abciximab (ReoPro™) , acenocoumarol, antitrombina III, argatrobán, aspirina, bivalirudina (Angiomax™) , clopidogrel, dabigatrán, etexilato de dabigatrán (Pradaxa™/Pradax™) , desirudina (Revasc™/Iprivask™) , dipiridamol, eptifibatida ( Integrilin™) , fondaparinux, heparina, hirudina, idraparinux, lepirudina (Refludan™) , heparina de bajo peso molecular, melagatrán, fenindiona, fenprocoumón, ticlopidina, tirofibán (Aggrastat™) , warfárina, ximelagatrán, ximelagatrán (Exanta™/Exarta™) o cualquier combinación de los mismos.
176. La composición de la reivindicación 173, donde la estatina comprende: atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina o cualquier combinación de las mismas. ;
177. La composición de la reivindicación 173, donde el otro agente terapéutico es un antagonista de un factor que comprende factor de necrosis tumoral alfa, interferón gama, interleucina 1 alfa, interleucina 1 beta, interleucina 6, factor que induce la proteólisis, factor que inhibe de la leucemia o cualquier combinación de los mismos.
178. La composición de la reivindicación 173, donde el agente anti-caquexia comprende: cannabis, dronabinol (Marinol™) , nabilona (Cesamet), cannabidiol, cannabicrpmeno, tetrahidrocannabinol, Sativex, acetato de megestrol o cualquier combinación de los mismos.
179. La composición de la reivindicación 173, donde el agente anti-náusea o agente antiemético comprende: antagonistas del receptor 5-HT3, ajwain, alizaprida, anticolinérgicos , antihistaminas , aprepitant, benzodiazepinas, cannabicromeno, cannabidiol, cannabinoides, cannabis, casopitant, clorpromazina, ciclizina, dexametasona, dexametasona, dimenhidrinato (Gravol™) , difenhidramina, dolasetrón, domperidona, antagonistas de dopamina, doxilamina, dronabinol (Marinol™), droperidol, emetrol, jenjibre, granisetrón, haloperidol, hidroxizina, hioscina, lorazepam, meclizina, metoclopramida, midazolam, muscimol, nabilona (Cesámet), antagonistas del receptor nkl, ondansetrón, palonosetrón, menta, Fenergam, proclorperazina, Promacot, prometazina, Pentazina, propofol, sativex, tetrahidrocannabinol, trimetobenzamida, tropisetrón, nandrolona, stilbestrol, talidomida, lenalidomida, agonistas de grelina, antagonistas de miostatina, anticuerpos anti-miostatina, moduladores selectivos del receptor de andrógenos, moduladores selectivos del receptor de estrógeno, antagonistas de angiotensina AII, agonistas del receptor adrenérgico beta dos, agonistas del receptor adrenérgico beta tres o cualquier combinación de los mismos. I
180. La composición de la reivindicación 173, donde el I otro agente terapéutico comprende tamoxifen, antagonistas de BCL-2, estrógenos, bisfosfonatos , teriparatida, ranelato de estroncio, alendronato de sodio (Fosamax), risedronato í (Actonel) , raloxifeno, ibandronato (Boniva) , Obatoclax ABT-263, gosipol, gefitinib, receptor del factor de crecimiento epidérmico, inhibidores de tirosina cinasa, erlotinib, inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico, psoralenos, trioxisaleno, metoxsaleno, bergapteno, retinoides, etretinato, acitretina, infliximab (Remicade®) , adalimumab, i infliximab, etanercept, Zenapax™, Ciclosporina, etotrpxato, factor de estimulación de colonias de granulocitos, filgrastim, lenograstim, Neupogen, Neulasta, ácidos 2-Arilpropióhicos, Aceclofenac, Acemetacina, Ácido acetilsalicílico (Aspirina) , Alclofenac, Alminoprofeno, Amoxiprina, Ampirona, Ácidos arilalcanoicos, Azapropazona, Benorilato/Benor'ilato, ! Benoxaprofeno, Bromfenac, Carprofeno, Celecoxib, salicil to de magnesio y colina, Clofezona, inhibidores de pOX-2, Dexibuprofeno, Dexketoprofeno, Diclofenac, Difluhisal, Droxicam, Etenzamida, Etodolac, Etoricoxib, Faislamina, ácidos fenámicos, Fenbufeno, Fenoprofeno, ácido Flufenámico, Flunoxaprofeno, Flurbiprofeno, Ibuprofeno, Ibuproxam, Indometacina, Indoprofeno, ebuzona, Ketoprofeno, Ketorolac, Lornoxicam, Loxoprofeno, Lumiracoxib, salicilato de Magnesio, ácido Meclofenámico, ácido Mefenámico, Meloxicam, Metamizol, salicilato de Metilo, Mofebutazona, Nabumetona, Naproxeno, ácidos N-Arilantranilicos, Oxametacina, Oxaprozin, Oxicamos, Oxifenbutazona, Parecoxib, Fenazona, Fenilbutazona, Fenilbutazona, Piroxicam, Pirprofeno, profenos, Proglumetacina, derivados de Pirazolidina, Rofecoxib, salicilato de Salicilo, Salicilamida, Salicilatos, Sulfinpirazona, Sulindác, Suprofeno, Tenoxicam, ácido Tiaprófenico, ácido Tolfenámico, Tolmetin y Valdecoxib. Los antibióticos incluyen Amikácina, Aminoglicosidas, Amoxicilina, Ampicilina, Ansamicinas, Arsfenamina, Azitromicina, Azlocilina, Aztreonam, Bacitrácina, Carbacefem, Carbapenems, Carbenicilina, Cefaclor, Cefadroxil, Cefalexina, Cefalotina, Cefalotina, Cefamandol, Cefazolina, Cefdinir, Cefditoren, Cefepima, Cefixima, Cefoperazona, Cefotaxima, Cefoxitin, Cefpodoxima, Cefprozil, Ceftazidima, Ceftibuten, Ceftizoxima, Ceftobiprol, Ceftriaxona, Cefuróxima, Cefalosporinas , Cloramfenicol, Cilastatina, Ciprofloxacina, Claritromicina, Clindamicina, Cloxacilina, Colistina,' Co-trimoxazol, Dalfopristina, Demeclociclina, Dicloxacilina, Diritromicina, Doripenem, Doxiciclina, Enoxacina, Ertapenem, Eritromicina, Etambutol, Flucloxacilina, Fosfomicina, Furazolidona, ácido Fusidico, Gatifloxacina, Geldanamicina, Gentamicina, Glicopéptidos, Herbimicina, Imipenem, Isoniazida, Kanamicina, Levofloxacina, Lincomicina, Linezolida, i Lomefloxacina, Loracarbef, acrolidas, Mafenida, Meropenem, i eticilina, Metronidazol , Mezlocilina, Minociclina, Monobactams, Moxifloxacina, Mupirocina, Nafcilina, Neomicina, Netilmicina, Nitrofurantoina, Norfloxacina, Ofloxacina, Oxacilina, Oxitetraciclina, Paromomicina, Penicilina, Penicilinas, Piperacilina, Platensimicina, Polimixina B, Polipéptidos , Prontosil, Pirazinamida, Quinolonas, Quinupristina, Rifampicina, Rifampina, Roxitromicina, Espectinomicina, Estreptomicina, Sulfacetamida, Sulfamétizol , Sulfanilimida, Sulfasalazina, Sulfisoxazol, Sulfonamidas, Teicoplanina, Telitromicina, Tetraciclina, Tetraciclinas , Ticarcilina, Tinidazol, Tobramicina, Trimetoprim, Trimetoprim-Sulfametoxazol, Troleandomicina, Trovafloxacina y Vancomicina. Los agentes activos también incluyen Aldosterona, Beclometasona, Betametasona, Corticosteroides, Cortisol, acetato de Cortisona, acetato de Desoxicorticosterona, Dexametasona, acetato de Fludrocortisona, Glucocorticoides, Hidrocortisona , Metilprednisolona, Prednisolona, Prednisona, Esteroides y Triamcinolona . Los agentes antivirales incluyen abacavir, aciclovir, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, una combinación de dosis fija antiretrovital, un potenciador sinérgico antiretroviral, arbidol, atazanavir, atripla, brivudina, cidofovir, combivir, darunavir, delavirdina, didanosina, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtida, entecavir, inhibidores de entrada, famciclovir, fomivirsen, fosamprenavir, foscarnet, fo§fonet, inhibidor de fusión, ganciclovir, gardasil, ibacitabina , idoxuridina, imiquimod, imunovir, indinavir, inosina, inhibidor de integrasa, interferón, interferón tipo I, interferón tipo II, interferón tipo III, lamivudina, lopinavir, lovirida, maraviroc, MK-0518, moroxidina, nelfinavir, nevirapina, nexavir, análogos de nucleósido, oseltamivir, penciclovir, peramivir, pleconaril, podofilotoxina, inhibidor de proteasa, inhibidor de transcriptasa inversa, ribavirina, rimantadina, ritonavir, saquinavir, stavudina, tenofovir, tenofovir disoproxilo, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir, valganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina, zalcitabina, zanaraivir, zidovudina o cua'lquier combinación de los mismos.
181. La composición de la reivindicación 173, donde el agente citotóxico, agente quimioterapéutico o agente inmunosupresor comprende: 1-deshidrotestosterona, 1-metilnitrosourea, 5-fluorouraciloo, 6-mercaptopurina; 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, Abatacept, abraxano, acitretina, aclarubicina, Actinio-225 (225Ac) , actinomicina, Adalimumab, inhibidores de la desaminasa de adenosina, Afelimomab, Aflibercept, Afutuzumab, Alefacept, alitretinoina, alquil sulfonatos, agentes alquilantes, altretamina, alvocidib,< ácido aminolevulínico/metil aminolevulinato, aminopterina, aminopterina , amrubicina, amsacrina, amsacrina, anagrelida, Anakinra, antracenedionas, antraciclinas, antraciclinas, antraciclinas , antramicina (AMC) ; agentes antimitoticos , antibióticos, anticuerpos anti-CD20, antifolatos, globulina Anti-linfocitos, Antimetabolitos , globulina Anti-timqcitos, trióxido arsénico, Aselizumab, asparaginasa, destructores de asparagina, Astatina-211 (211At) , Atlizumab, Atorolimumab, atrasentán, Avastin™, azacitidina, Azatioprina, azelastina, aziridinas, Basiliximab, anticuerpos BAYX, Belatacept, Belimumab, belotecán, bendamustina, Bertilimumab, bexaroteno, bisantreno Bismut -213 (213Bi) , Bismut-212 (212Bi) , bleomicina, bleomicina, bleomicina, anticuerpos BLyS, bortezomib, busulfán, busulfán, inhibidores de Calcineurina, caliqueamicina, camptotecina, camptotecinas , capecitabina, carboplatina (paraplatina) , carbocuona, carminomicina, carmofur, carmústina, carmustina (BSNU) , anticuerpos CAT, anticuerpos 'CDlla, anticuerpos CD147/Basigina, anticuerpos CD154, anticuerpos CD18, anticuerpos CD20, anticuerpos CD23, anticuerpos CD3, anticuerpos CD4, anticuerpos CD40, anticuerpos' CD62L/L-selectina, anticuerpos CD80, inhibidores de CDK, Cedelizumab, celecoxib, Certolizumab pegol, clorambucilo, clorambucilos , Ciclosporina, cis-diclorodiamina platino (II) ' (DDP) cisplatinos, cladribina, Clenoliximab, clofarabina, colquicina, anticuerpos del componente complemento 5, Cobre-67 :(67Cu) , corticosteroides, anticuerpos CTLA-4, proteínas de fusión a CTLA-4, inhibidores de Ciclofilina, ciclofosfamidas , ciclotosfamida, citarabina, citarabina, citocalasina B, ribonucleasas citotóxicas, dacarbazina, Daclizumab, dactinomicina, dactinomicina (actinomicina D) , daunorubicina, daunorubicina, daunorubicina (anteriormente daunomicina) , decitabina, Deforolimus, demecolcina, detorubicina, dibromomanitol, dietilcarbamazina, inhibidores de la dihidrofolato reductasa, dihidroxi antracina diona, toxina de la difteria, inhibidores de la ADN polimerasa, doc taxel, Dorlimomab aritox, Dorlixizumab, doxorrubicina (adriamicina) , DXL625, Eculizumab, Efalizumab, efaproxiral, antagonistas de EGFR, elesclomol, elsamitrucina, Elsilimomab, emetina, antagonistas del receptor de endotelina, epipodofilotoxinas , epirubicina, epotilonas, Erbitux™, Erlizumab, estramustina, Etanercept, bromuro de etidio, etoglucid, etoposida, fosfato de etoposida, Everolimus, Faralimomab, inhibidores de farnesiltransferasa, inhibidores de FKBP, floxuridina, fludarabina, fluorouraciloo, Fontolizumab, fotemústina, Galiximab, Galio-67 (67Ga) , Gantenerumab, Gavilamomab, gemcitabina, glucocorticoides, Golimumab, Gomiliximab, gramicidina D, Gusperimus, Herceptin®, hidrazinas, hidro'xiurea, agentes hipometilantes, idarubicina, Idarubicina, ifosifamida, antagonistas de IL-1, antagonistas del receptor de IL-1, 'IL-12, anticuerpos IL-12, antagonistas de IL-12R, anticuerpos 'IL-13, IL-2, inhibidores de IL-2, receptor de IL-2/anticuerpos CD25, anticuerpos IL-6, imatinib mesilato, anticuerpos de Inmunoglobulina E, inhibidores de I P deshidrogenasa, Infliximab, Inolimomab, anticuerpos de Integrina, anticuerpos de Interferón, interferones, anticuerpor de Interleucina 5, anticuerpos del receptor de Interleucina-6, interleúcinas , Yodo-125 (125I), Iodo-131 (131I), Ipilimumab, irinotecano, ixabepilona, Keliximab, larotaxel, Plomo-212 (212Pb) , Lebrilizumab, Leflunomida, Lenalidomida, Lerdelimumab, leucovorina, anticuerpos LFA-1, lidocaina, inhibidores de lipoxigenasa, lomustina (CCNU) , lonidamina, lucantona, Lumiliximab, Lutetio-177 (177Lu) , Macrolidas, manosúlfano, Maslimomab, masoprocol, mecloretamina, melfalano, Mepolizumab, mercaptopurina, etelimumab, Metotrexato, inhibidores del ensamblaje de microtúbulos, potenciadores de la estabilidad de microtúbulos, mitramicina, mitobronitol, mitoguazona, mitoraicina, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, Morolimumab, inhibidores de mTOR, Muromonab-CD3 , mustinas, ácido Micofenólico, mitotano (0, P ' - ( DDD) ) , Natalizumab, nedap(latina, Nerelimomab, nimustina, mostazas de nitrógeno, nitrosoureas , ácido nordihidroguaiarético, oblimersén, ocrel'izumab, Ocrelizumab, Odulimomab, ofatumumab, olaparib, Omaiizumab, ortataxel, Otelixizumab, oxaliplatina, oxaliplatina, paclitaxel (taxol) , Pascolizumab, antagonistas de PDGF, pegaspargasa, pemetrexed, Pentostatina, Pertuzumab, Pexelizumab, inhibidores de fosfodiesterasa, Fósforo-32 (32P) , Pimecrolimus Abetimus, pirarubicina, pixantrona, platinas, plicamicina, inhibidores de poli-ADP ribosa polimerasa, sodio porfimer, derivados de porfirina, prednimustina, procaína, procarbazina, procarbazina, propranolol, inhibidores de proteasoma, exotoxinas pseudomonas, toxina Pseudomonas, inhibidores de la síntesis de purina, puromicina, inhibidores de la síntesis de pirimidina, radioisótopos, radioterapia, raltitrexed, ranimustina, Reslizumab, agonistas del receptor retinoide X, retinoides, Renio-186 (186Re) , Renio-188 (188Re) , inhibidores de ribonucleótido reductasa, ricina, Rilonacept, Rituxan®, Rovelizumab, rubitecano, Ruplizumab, Samario-153 (153Sm) , satraplatina, Scandio-47 (47Sc) , moduladores del receptor selectivo de andrógeno, seliciclib, semustina, antagonistas de las hormonas sexuales, Siplizumab, Sirolimus, inhibidores de esteroides aromatasa, esteroides, estreptozocina, estreptozotocxna, Tacrolimus, talaporfina, Talizumab, taxanos, taxoles, tegafur, Telimomab aritox, temoporfina, temozolomida, temsirolimus, Temsirolimus, Teneliximab, teniposida, Teplizumab, Teriflunomida, tesetaxel, testolactona, tetracaina, Talidomida, tioepa clorambucilo, tiopurinas tiogúanina, TioTEPA, inhibidores de timidilato sintasa, tiazofurina, tipifarnib, anticuerpos de linfocitos T, antagonistas de TNF, anticuerpos de TNF, proteínas fusión de TNF, proteínas del receptor de fusión de TNF, inhibidores TNF-alpha, Tocilizumab, inhibidores de topoisomerasa, topotecano, Toralizumab, trabectedina, Tremelimumab, treosulfano, tretinoina, triazenos, triazicuona, trietilenomelamina, tetranitrato de triplatina , trofosfamida, anticuerpos monoclonales específicos del antígenos tumoral, inhibidores de tirosina cinasa, uramustina, Ustekinumab, valrubicina, Valrubicina, Vapaliximab, antagonistas de VEGF, Vepalimomab, verteporfina, vinblastina, alcaloides de la vinca, vincristina, vindesina, vinflunina, vinorelbina, Visilizumab, vorinostat, Ytrio-88 (88Y) , Ytrio-90 (90Y) , Zanolimumab, zileutón, Ziralimumab, Zolimomab aritox, zorubicina, Zotarolimus o cualquier combinación de los mismos.
182. La composición de la reivindicación 173, donde el otro agente activo es uno o más agonistas, antagonistas o moduladores de un factor que comprende: TNF-á, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-á, IFN-a, BAFF, CXCL13, IP-10, VEGF, EPO, EGF, HRG, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y Hepcidina o cualquier combinación de los mismos. ¦
183. La composición de la reivindicación 173, donde el antagonista de IL-6 comprende: anticuerpos anti-ÍL-6 o fragmentos de los mismos, ácidos nucleicos antisentido, polipéptidos , moléculas pequeñas o cualquier combinación de los mismos .
184. La composición de la reivindicación 183, dónde el ácido nucleico antisentido comprende al menos aproximadamente 10 nucleótidos de una secuencia que codifica la IL-6, el receptor de IL-6 alfa, el gpl30, la p38 MAP cinasa, JAK1 , ; JAK2 , JAK3 o SYK.
185. La composición de la reivindicación 183, donde el ácido nucleico antisentido comprende ADN, ARN, ácido nucleico peptidico, ácido nucleico bloqueado, morfolino (oligómero fosforodiamidato morfolino) , ácido nucleico glicólico, ácido nucleico treósico o cualquier combinación de los mismos.
186. La composición de la reivindicación 183, donde el anticuerpo anti-IL-6 o fragmento del mismo comprende: Abl, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, : Abl3, Abl4, Abl5, Abl6, Abl7, Abl8, Abl9, Ab20, Ab21, Ab22,! Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33, Ab34, Ab35, Ab36, un fragmento de unión a la IL-6 o cualquiera de los anteriores, una variante de cualquiera de los anteriores o cualquier combinación de los mismos. :
187. La composición de la reivindicación 183, donde el polipéptido del antagonista de IL-6 comprende un fragmento de un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en IL-6, receptor de IL-6 alfa, gpl30 MAP cinasa, JAK1, JAK2, JAK3 y SYK.
188. La composición de la reivindicación 187, donde el fragmento tiene al menos 40 aminoácidos de longitud.
189. La composición de la reivindicación 183, donde el antagonista de IL-6 comprende una IL-6 soluble, un receptor de IL-6 alfa, un gpl30, una p38 MAP cinasa, JAK1, JAK2, JAK3, SYK o cualquier combinación de los mismos.
190. La composición de la reivindicación 173, donde el antagonista de IL-6 está acoplado a un resto de aumento de la semivida. '
191. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 170-190, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl está directa o indirectamente acoplado a uno o más de dichos agentes terapéuticos adicionales.
192. La composición de cualquiera de ' las reivindicaciones 140-167, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo Abl está directa o indirectamente acoplado o una etiqueta detectable. 1
193. La composición de la reivindicación 192, dónde la etiqueta detectable comprende: tintes fluorescentes, materiales bioluminiscentes, materiales radioactivos, : restos quimioluminiscentes , estreptavidina, avidina, biotina, materiales radioactivos, enzimas, sustratos, peroxidása de rábano picante, acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina,! beta-galactosidasa, luciferasa, rodamina, fluoresceina, fluoresceina isotiocianato, umbeliferota, diclorotriazinilamina, ficoeritrina, cloruro de dansilo, luminol, lucijferina, aecuorina, Yodo 125 (12 I), Carbono 14 (1C) , Azufre 35: (35S), Tritio (3H) , Fósforo 32 (32P) o cualquier combinación 'de los mismos.
194. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 140-193, donde el anticuerpo Abl se administra al sujeto en forma de uno o más ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo Abl.
195. La composición de la reivindicación 194, donde el o los ácidos nucleicos se introducen al sujeto que los 'recibe como un virus, un liposoma, un complejo de lipido catiónico, un complejo de polímero catiónico o un complejo de nanoparticulas.
196. La composición de la reivindicación 194 donde el o los ácidos nucleicos están compuestos por codondes preferidos humanos o de levadura.
197. La composición de la reivindicación 194 donde el o los ácidos nucleicos están comprendidos en un vector.
198. La composición de la reivindicación 194 donde el vector es un vector viral plásmido o recombinante .
199. La composición de la reivindicación 194 donde el o los ácidos nucleicos comprenden las secuencias de polinucleótido de cadena pesada y ligera de la SEQ ID NO: 723 y la SEQ ID NO: 700; SEQ ID NO: 701 y la SEQ ID NO: 703; SEQ ID NO: 705 y la SEQ ID NO: 707; SEQ ID NO: 720 y la SEQ ID NO: 724 y SEQ ID NO: 10 y la SEQ ID NO: 11.
200. La composición de cualquiera de; las reivindicaciones 140-193, donde el anticuerpo Abl comprende: (a) polipéptidos de cadena pesada y ligera que comprenden: la SEQ ID NO: 709 y la SEQ ID NO: 657; SEQ ID NO: 702 y la SEQ ID NO: 704; SEQ ID NO: 706 y la SEQ ID NO: 708; SEQ ID NO: 20 y la SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3; (b) un polipéptido que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con cualquiera de los polipéptidos de (a) , i (c) un polinucleótido que se híbrida en condiciones de hibridación de restricción alta o moderada a cualquiera ¡ de las secuencias de polinucleótidos e cadena ligera y pesada de la SEQ ID NO: 723 y la SEQ ID NO: 700; SEQ ID NO: 701 y la SEQ ID NO: 703; SEQ ID NO: 705 y la SEQ ID NO: 707; SEQ ID NO: 720 y la SEQ ID NO: 724 y SEQ ID NO: 10 y la SEQ ID NO: 11; (d) un polinucleótido que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de polinucleótido de cadena ligera y pesada de la SEQ ID NO: 723 y la SEQ ID NO: 700; SEQ ID NO: 701 y la^SEQ ID NO: 703; SEQ ID NO: 705 y la SEQ ID NO: 707; SEQ ID NO: 720 y la SEQ ID NO: 724 y SEQ ID NO: 10 y la SEQ ID NO: 11; (e) un polipéptido codificado por cualquiera de los polinucleótidos de (c) o (d) . :
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