CN112098549B - 一种测定盐酸阿比多尔溶液中杂质含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明旨在提出一个简便、准确、灵敏地检测盐酸阿比多尔溶液中杂质含量的方法。本发明提出了一种测定盐酸阿比多尔溶液中杂质含量的方法，通过高效液相色谱分析方法对所述盐酸阿比多尔溶液进行分析，以便获得色谱图，以及基于所述色谱图，确定所述盐酸阿比多尔溶液中杂质的含量。

Description

一种测定盐酸阿比多尔溶液中杂质含量的方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体的，本发明涉及测定盐酸阿比多尔溶液剂中杂质含量的方法。
背景技术
阿比多尔是一种抗病毒药物，主要适应症是A类、B类流感病毒引起的流行性感冒，由某药物化学研究中心研制，1993年在俄罗斯首次上市。其分子结构为：
Figure GDA0003752297830000011
具有易溶于甲醇，溶于乙腈，难溶于水的特性。
在盐酸阿比多尔溶液的生产过程中，会产生降解杂质，从而影响盐酸阿比多尔溶液的质量和疗效。如何准确测定盐酸阿比多尔溶液中杂质的含量，进而有效控制盐酸阿比多尔溶液产品的质量，成为需要解决的关键问题。
发明内容
本发明旨在提出一个简便、准确、灵敏地检测盐酸阿比多尔溶液中杂质含量的方法。
一方面，本发明提出了一种测定盐酸阿比多尔溶液中杂质含量的方法，通过高效液相色谱分析方法对所述盐酸阿比多尔溶液进行分析，以便获得色谱图，以及基于所述色谱图，确定所述盐酸阿比多尔溶液中杂质的含量，其中，所述高效液相色谱采用以下条件：
色谱柱：Extend-C18,4.6×250mm，5μm，
检测器：DAD，
检测波长：255nm，
柱温：30-40℃，
流动相A：1％三乙胺溶液，所述三乙胺溶液的pH为2.0--3.0，
流动相B：甲醇，
流速：1mL/min
洗脱梯度为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 43 57
17 43 57
32 20 80
37 20 80
38 43 57
43 43 57
运行时间为43min。
利用本发明描述的检测方法，可以简便、准确、灵敏地检测盐酸阿比多尔溶液中杂质含量，从而有效控制盐酸阿比多尔溶液的质量。
根据本发明的实施例，所述三乙胺溶液的pH为3.0。在pH值为2.0-3.0的缓冲液中，主峰峰型、杂质峰型、辅料峰型及其保留时间基本不变，且各杂质之间分离度均大于1.5，所述三乙胺溶液的pH为3.0时，待分离杂质化合物存在形态单一，峰单一、峰型尖锐及可实现杂质峰保留时间重现的分离效果。
根据本发明的实施例，所述pH调节剂为磷酸。
根据本发明的实施例，所述柱温为35℃。
根据本发明的实施例，所述杂质为
Figure GDA0003752297830000021
Figure GDA0003752297830000022
所述三个杂质都是盐酸阿比多尔溶液的降解杂质。利用本发明实施例的测定盐酸阿比多尔溶液剂中讲解杂质含量的方法，盐酸阿比多尔主峰与上述三种杂质峰分离度较好，上述三种杂质峰的分离度也较好，杂质峰的形态单一，可实现对上述三种杂质峰的有效分离和含量的测定。
根据本发明的实施例，所述盐酸阿比多尔溶液是以供试品溶液的形式提供的，其中，所述供试品溶液为盐酸阿比多尔溶液与1％三乙胺--甲醇--乙腈溶液的混合溶液，并且基于每毫升供试品溶液，其中盐酸阿比多尔的浓度为0.25mg/mL。所述1％三乙胺--甲醇--乙腈溶液是所述A相、B相和乙腈的混合溶液，其中A相、B相和乙腈的体积比为2:3:5。
根据本发明的实施例，所述供试品溶液的用量为20μl，对杂质含量的测定更加真实、可靠、准确。
根据本发明的实施例，所述基于所述色谱图，确定所述盐酸阿比多尔溶液杂质含量是通过以下公式确定的：杂质含量(％)＝(A杂/A总)*100％，其中A杂：杂质峰面积，A总：总峰面积—苯甲酸钠的峰面积。
在本发明的第二方面，更为具体的提出了一种测定盐酸阿比多尔溶液中杂质含量的方法。根据本发明的实施例，所述方法具体包括：
(1)色谱条件
色谱柱：Extend-C18,4.6×250mm，5μm，
检测器：DAD，
检测波长：255nm，
柱温：35℃，
流动相A：1％三乙胺溶液，所述三乙胺溶液的pH为3.0，
流动相B：甲醇，
流速：1mL/min
洗脱梯度为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 43 57
17 43 57
32 20 80
37 20 80
38 43 57
43 43 57
运行时间：43min。
(2)配制稀释剂
A相、B相和乙腈的体积比为2:3:5的混合溶液作为所述稀释剂。
(3)配制供试品溶液
精密移取盐酸阿比多尔溶液5ml，置10ml量瓶中，加少量稀释剂，超声约5min，再加入稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得所述供试品溶液。
(4)进样
将20μl供试品溶液注入色谱仪，得到色谱图。
(5)计算
根据所属色谱图计算得到供试品溶液中杂质的含量，其中，按以下公式计算供试品溶液中各个单杂的含量，杂质含量(％)＝(A杂/A总)*100％，其中，A杂：杂质峰面积，A总：总峰面积—苯甲酸钠的峰面积，其中苯甲酸钠是为唯一出峰的辅料，供试品总杂的含量等于所有单杂含量的总和。
利用根据本发明实施例的检测方法，可简便、准确、灵敏地测定盐酸阿比多尔溶液中杂质的含量，从而有效控制盐酸阿比多尔溶液的质量。
附图说明
图1为实施例1所述的A相为pH＝2的1％三乙胺溶液的条件下的盐酸阿比多尔溶液色谱图
图2为实施例1所述的A相为pH＝3的1％三乙胺溶液的条件下的盐酸阿比多尔溶液色谱图
图3为实施例1所述的A相为pH＝4的1％三乙胺溶液的条件下的盐酸阿比多尔溶液色谱图
图4为实施例1所述的A相为pH＝5的1％三乙胺溶液的条件下的盐酸阿比多尔溶液色谱图
图5为实施例1所述的A相为pH＝6的1％三乙胺溶液的条件下的盐酸阿比多尔溶液色谱图
图6为实施例1所述的A相为pH＝2的0.01mol/L磷酸二氢钾溶液的条件下的盐酸阿比多尔溶液色谱图
图7为实施例1所述的A相为pH＝3的0.01mol/L磷酸二氢钾溶液的条件下的盐酸阿比多尔溶液色谱图
图8为实施例1所述的A相为pH＝6的0.01mol/L磷酸二氢钾溶液的条件下的盐酸阿比多尔溶液色谱图
图9为实施例1所述的B相为乙腈的条件下的盐酸阿比多尔溶液色谱图
图10为实施例1所述的柱温为30℃的条件下的盐酸阿比多尔溶液色谱图
图11为实施例1所述的柱温为40℃的条件下的盐酸阿比多尔溶液色谱图
图12为实施例1所述的色谱柱为Waters Symmetry C18的条件下的盐酸阿比多尔溶液色谱图
图13为实施例1所述的色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C8的条件下的盐酸阿比多尔溶液色谱图
图14为实施例1所述的稀释剂比例为流动相A：甲醇：乙腈＝6:3:1的条件下的盐酸阿比多尔溶液色谱图
图15为实施例1所述的稀释剂比例为流动相A：甲醇：乙腈＝5:3:2的条件下的盐酸阿比多尔溶液色谱图
图16为实施例1所述的稀释剂比例为流动相A：甲醇：乙腈＝3:3:4的条件下的盐酸阿比多尔溶液色谱图
图17为实施例1所述的稀释剂比例为流动相A：甲醇：乙腈＝2:3:5的条件下的盐酸阿比多尔溶液色谱图
图18为实施例1所述的检测波长为220nm的条件下的盐酸阿比多尔溶液色谱图图19为实施例1所述的检测波长为220nm的条件下的空白溶液(稀释剂)色谱图
图20为实施例1所述的检测波长为255nm的条件下的盐酸阿比多尔溶液色谱图图21为实施例1所述的检测波长为316nm的条件下的盐酸阿比多尔溶液色谱图图22为实施例2***适用性溶液色谱图
图23为实施例2的供试品溶液色谱图
附图标记说明：1：杂质A出峰；2：杂质B出峰；3：杂质C出峰；4：苯甲酸钠出峰；5：阿比多尔出峰。
具体实施方式
为了便于理解，下面将对本申请进行更全面的描述，并给出了本申请的较佳实施例。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场获得的常规产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
在本实施例中，发明人详细介绍了测定盐酸阿比多尔溶液剂中杂质含量的方法的开发过程。在本实施例中，盐酸阿比多尔溶液是于40℃的条件下放置三天后再进行供试品溶液的配制的，目的是为了加速降解杂质的生成。
1.1缓冲盐种类及pH值确定
阿比多尔共轭酸的pKa为6.05，呈弱酸性，阿比多尔羧酸降解杂质及辅料苯甲酸钠酸性较强且主要降解杂质极性较弱，因此需要选择一个合适pH值的缓冲液以确保分离过程中待分离化合物存在形态单一，从而实现峰的单一、峰型的尖锐、及保留时间重现的分离效果。因此，方法开发初期，发明人考察了相同梯度条件下，不同A相下(缓冲盐种类或缓冲溶液pH不同)，盐酸阿比多尔溶液中阿比多尔及相应杂质的分离效果。具体考察方法如下所述：
方法A：A相(水相)为1％三乙胺溶液(85％磷酸调节pH值)，pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，B相为甲醇。
方法B：A相(水相)为10mM pH值分别为2.0、3.0、6.0的磷酸二氢钾溶液(85％磷酸或氢氧化钾溶液调节pH值)，B相为甲醇。
考察结果如图1-图5，图6-图8所示，其中图1-图5结果显示，在pH值为2.0-7.0三乙胺溶液体系条件下，阿比多尔保留时间随pH值变大而变大，辅料苯甲酸钠与相邻降解杂质之间分离度随pH值升高而变小，而且在pH值7.0时，主要降解杂质C未被洗脱。结合阿比多尔以及杂质结构分析，可能原因为：在pH值为2.0-7.0的缓冲溶液中，阿比多尔降解杂质A、杂质B与辅料苯甲酸钠中酸性基团可能完全电离，且随着pH值升高，离子化程度变大，导致其极性越来越大，保留时间减少；阿比多尔由于其pKa值为6.05，故随缓冲液pH值变大，保留时间增大。由图可知，在pH值为2.0-3.0的缓冲液中，主峰峰型、杂质峰型、辅料苯甲酸钠峰型及其保留时间基本不变，且各杂质之间分离度均大于1.5，可能原因是在此条件下，杂质与主峰酸性基团电离程度达到一个相对稳定的状态。如图6-图8所示，在磷酸二氢钾缓冲盐溶液体系下，结果与1％三乙胺溶液体系下结果基本相同。
综合图1-图5，图6-图8的结果，说明所考察上述各条件下阿比多尔、各杂质与辅料苯甲酸钠结构中酸性基团电离程度不一致，保留能力不一致，其中在pH为7.0的1％三乙胺溶液体系下，阿比多尔保留能力最强，辅料苯甲酸钠与杂质A、杂质B保留能力最弱，且与溶剂峰重叠。采用方法B(pH值2.0-3.0)，各杂质之间分离度均达到1.5，主峰保留时间稳定，但其主峰峰型与理论塔板数皆劣与方法A。
基于上述考察分析，得出结论，阿比多尔在pH2-3范围内，阿比多尔的存在形态单一。优选1％pH＝3的三乙胺溶液(85％磷酸调节pH值)作为测定盐酸阿比多尔溶液降解杂质含量方法的A相缓冲溶液。后续试验均采用1％pH＝3的三乙胺溶液(85％磷酸调节pH值)作流动相A。
1.2有机相种类、柱温及梯度条件的确定
上述缓冲盐种类及pH值的考察中，均选择甲醇为有机相改良剂，在所选缓冲溶液及初始梯度条件下，阿比多尔及杂质均获得了较好的峰型。考察使用乙腈代替甲醇为有机相改良剂，并开发相应的梯度洗脱方法，如图9所示，所获得的分离效果不如甲醇，且主峰峰型较宽，此外，甲醇相较于乙腈更加实惠、毒性较低。因此，发明人选择甲醇作为有机相。
甲醇为B相，使用不同柱温考察，分别在30℃与40℃考察，如图10和图11所示，所获得各杂质与主峰分离效果无明显变化，主峰峰型无明显变化。因此，柱温可在30-40℃选择。
甲醇作B相，35℃为柱温，使用Extend-C18(4.6*250mm，5μm)色谱柱基础上，进一步优化梯度，确定为适宜梯度的原则为分离时间尽可能短，但主峰与杂质及各杂质之间充分分离。最终优化洗脱条件为：
Figure GDA0003752297830000071
Figure GDA0003752297830000081
1.3色谱柱选择与优化
上述考察已确定了使用pH3.0，1％三乙胺溶液(85％磷酸调节pH值)作缓冲液，除上述已考察的Extend C18(4.6*250,5μm)色谱柱外，发明人还考察了Waters SymmetryC18、ZORBAX Eclipse Plus C8等常见不同品牌的相同粒径的色谱柱分离效果，考察的主要指标为阿比多尔主峰的拖尾因子、理论塔板数以及主峰相邻杂质峰的分离情况，具体考察结果如图12、图13所示，汇总如表1所示：
表1
色谱柱 拖尾因子 主峰塔板数 与相邻杂质分离度
ExtendC18 1.597 5334 4.26
WatersSymmetryC18 1.415 8548 3.88
ZORBAXEclipsePlusC8 1.272 3652 2.97
如表1所示，采用Extend C18与Waters Symmetry C18都具有较好的峰型，但Extend C18分离效果要优于Waters Symmetry C18，Waters Symmetry C18塔板数要高于Extend C18。采用ZORBAX Eclipse Plus C8，峰型较Extend C18与Waters Symmetry C18好，但其塔板数以及分离效果劣与Extend C18与Waters Symmetry C18都具有较好的峰型。综上所述分析，采用Extend C18与Waters Symmetry C18均可，发明人选择Extend C18作所建方法的分析柱。
1.4供试品制备方法确定
理想的供试品稀释剂为流动相溶液，上述确定的洗脱梯度的初始有机相比例为57％，但对杂质C研究发现，其易溶于乙腈，微溶于甲醇，因此，发明人在稀释剂中加入乙腈，同时为防止产生溶剂效应，适当降低了甲醇比例，发明人对供试品稀释剂的选择，结果如图14-图17所示，汇总如表2所示：
表2
Figure GDA0003752297830000082
Figure GDA0003752297830000091
如表2所示，当乙腈比例达50％与40％时所得结果相当，主峰峰型良好，未产生溶剂效应，因此发明人选择流动相∶甲醇∶乙腈(2∶3∶5)作为稀释剂的选择。
供试品浓度确定及进样量确定，原则为一方面提供良好的杂质检测灵敏度，同时保证主峰不因浓度过载而出现平头峰及不在UV的线性响应范围(确保主峰纯度因子合格)，最终确定的供试品溶液浓度为0.25mg/ml。进样量为20μl。
1.5检测波长的确定
阿比多尔及典型杂质的结构与理化性质如图18-图20所示，汇总如表3所示：
表3
Figure GDA0003752297830000092
Figure GDA0003752297830000101
在选择的三个波长(220nm、255nm、316nm)下，各杂质与主峰在均有较大吸收，进行检测的结果如表4所示：
表4
Figure GDA0003752297830000102
说明：低于0.01％杂质未纳入考察
经考察：如表4所示，在316nm波长下，杂质检出量与杂质总量最少，在220nm波长下，杂质个数与杂质总量较多，但其空白背景峰干扰多，而255nm波长下，杂质个数最多，杂质总量也多，空白干扰小，有利于对盐酸阿比多尔溶液的质量控制，最终选用波长为255nm。
实施例2
在本实施例中，发明人考察了实施例1所确定的测定盐酸阿比多尔溶液剂中降解杂质含量的方法的***适用性，并详细介绍了如何基于实施例1所确定的色谱条件下获得色谱图，计算得到杂质的含量。
2.1相关溶液的配制
稀释剂：A相、B相和乙腈的体积比为2:3:5的混合溶液。
供试品溶液：精密移取盐酸阿比多尔溶液5ml，置10ml容量瓶中，加少量稀释剂，超声约5min，再加入稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得所述供试品溶液。
***适用性溶液的配制：将盐酸阿比多尔溶液于40℃条件下放置三天，便于降解杂质的生成，精密移取已经放置三天的盐酸阿比多尔溶液5ml，置10ml容量瓶中，加少量稀释剂，超声约5min，再加入稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得所述***适用性溶液。
2.2色谱条件
色谱柱：Extend-C18,4.6×250mm，5μm，
检测器：DAD，
检测波长：255nm，
柱温：35℃，
流动相A：1％三乙胺溶液，所述三乙胺溶液的pH为3.0，
流动相B：甲醇，
流速：1mL/min，
洗脱梯度为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 43 57
17 43 57
32 20 80
37 20 80
38 43 57
43 43 57
运行时间：43min。
2.3***适用性试验
将20μl用于***适用性溶液注入色谱仪，观察得到的色谱图。***适用性的接受标准为：杂质A与杂质B之间分离度不得低于1.5，苯甲酸钠与杂质B之间分离度不得低于1.5，主峰理论塔板数不得低于3000。如图22所示，主峰拖尾因子1.33，主峰理论塔板数为6027，杂质A与杂质B、杂质B与苯甲酸钠峰分离度分别为2.86、2.73，结果显示方法的分离能力达到了检测要求，***适用性合格。
2.4相关检测操作
将20μl供试品溶液注入色谱仪，得到色谱图。
2.5基于色谱图的杂质含量的计算方法
按以下公式计算供试品溶液中各个单杂的含量，其中，取两次测定结果的平均值作为测定结果：
杂质含量(％)＝(A杂/A总)*100％，
其中，A杂：杂质峰面积，A总：总峰面积—辅料苯甲酸钠的峰面积，供试品总杂的含量等于所有单杂含量的总和。
杂质限度的接受标准如表5所示：
表5
最大单个杂质 总杂质
≤0.5％ ≤1.5％
以上所述实施例仅表达了本申请的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.一种测定盐酸阿比多尔溶液中杂质含量的方法，其特征在于，通过高效液相色谱分析方法对所述盐酸阿比多尔溶液进行分析，以便获得色谱图，以及基于所述色谱图，确定所述盐酸阿比多尔溶液中杂质的含量，其中，所述高效液相色谱采用以下条件：
色谱柱：Extend-C18,4.6×250mm，5μm，
检测器：DAD，
检测波长：255nm，
柱温：35℃，
流动相A：1％三乙胺溶液，所述三乙胺溶液pH经磷酸调节为3.0，
流动相B：甲醇，
流速：1mL/min
洗脱梯度为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 43 57 17 43 57 32 20 80 37 20 80 38 43 57 43 43 57
运行时间：43min，
其中所述杂质为
Figure FDA0003752297820000011
Figure FDA0003752297820000012
其中所述盐酸阿比多尔溶液是以供试品溶液的形式提供的，所述供试品溶液为盐酸阿比多尔溶液与1％三乙胺--甲醇--乙腈溶液的混合溶液，并且基于每毫升供试品溶液，其中盐酸阿比多尔的浓度为0.25mg/mL。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述1％三乙胺--甲醇--乙腈溶液是所述流动相A、流动相B和乙腈的混合溶液，其中流动相A、流动相B和乙腈的体积比为2:3:5。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液的用量为20μl。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基于所述色谱图，确定所述盐酸阿比多尔溶液杂质含量是通过以下公式确定的：杂质含量(％)＝(A杂/A总)*100％，其中A杂：杂质峰面积，A总：总峰面积—辅料苯甲酸钠的峰面积。
5.一种测定盐酸阿比多尔溶液中杂质含量的方法，其特征在于，包括：
(1)色谱条件
色谱柱：Extend-C18,4.6×250mm，5μm，
检测器：DAD，
检测波长：255nm，
柱温：35℃，
流动相A：1％三乙胺溶液，所述三乙胺溶液的pH为3.0，
流动相B：甲醇，
流速：1mL/min
洗脱梯度为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 43 57 17 43 57 32 20 80 37 20 80 38 43 57 43 43 57
运行时间：43min；
(2)配制稀释剂
A相、B相和乙腈的体积比为2:3:5的混合溶液作为所述稀释剂；
(3)配制供试品溶液
精密移取盐酸阿比多尔溶液5ml，置10ml容量瓶中，加少量稀释剂，超声约5min，再加入稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得所述供试品溶液；
(4)进样
将20μl供试品溶液注入色谱仪，得到色谱图；
(5)计算
根据所属色谱图计算得到供试品溶液中杂质的含量，其中所述杂质为
Figure FDA0003752297820000031
Figure FDA0003752297820000032
其中，按以下公式计算供试品溶液中各个单杂的含量，杂质含量(％)＝(A杂/A总)*100％，其中，A杂：杂质峰面积，A总：总峰面积—辅料苯甲酸钠的峰面积，供试品总杂的含量等于所有单杂含量的总和。
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