KR102055390B1 - 혈전-표적성 펩타이드, 페리틴 단편 및 혈전 용해성 펩타이드를 포함하는 융합 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈전-표적성 펩타이드, 페리틴 단편 및 혈전 용해성 펩타이드를 포함하는 융합 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 혈전-표적성 펩타이드, 페리틴 단편 및 혈전 용해성 펩타이드가 차례로 연결된 융합 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 혈전성 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 CLT-sFt-μPn DCNC는 플라스민-기반의 새로운 혈전용해용 나노케이지로서 혈전이 존재하는 부위를 표적하는 효과, 순환계에 존재하는 저해제들에 대한 낮은 감수성, 동맥 혈전과 정맥 혈전 모두를 강력하게 파괴하는 약리학적 활성 및 출혈 부작용이 없다는 특징을 지니고 있어 혈전성 질환 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

혈전-표적성 펩타이드, 페리틴 단편 및 혈전 용해성 펩타이드를 포함하는 융합 펩타이드 및 이의 용도{Fusion peptide comprising clot-targeting peptide, ferritin fragment and thrombolytic peptide and its uses}

본 발명은 혈전-표적성 펩타이드, 페리틴 단편 및 혈전 용해성 펩타이드를 포함하는 융합 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 혈전-표적성 펩타이드, 페리틴 단편 및 혈전 용해성 펩타이드가 차례로 연결된 융합 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 혈전성 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

동맥과 정맥에 형성되는 혈전은 심근경색, 뇌졸중 및 혈전증의 병리기전에서 매우 중요한 역할을 담당하고 있으며, 전 세계적으로 네 명 중 한 명이 이러한 질환으로 사망하고 있다. 혈전은 일단 형성이 되면 심장, 뇌 또는 다른 필수적인 기관들로의 정상적인 혈류를 방해하거나 혈류의 속도를 늦추게 되며, 때때로 치명적인 손상을 입히기도 한다.

tPA(tissue plasminogen activator)의 개발은 혈전용해 요법에서 가장 중요한 성과중에 하나이다. tPA는 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시키는 역할을 하며, 플라스민은 피브린 덩어리를 분해하여 정상적인 혈류를 회복시키게 된다. 하지만, tPA 요법의 가장 큰 한계점은 순환하는 플라스미노겐에 대한 불특정한 활성화에 있으며, 결과적으로 정상적인 생리학적 항상성을 해치거나 체성 출혈을 야기할 수도 있다는 문제점이 있다. 실제로, tPA 요법을 받는 뇌졸중 환자들 중 20%는 생명에 위협이 되는 두개골 내 출혈을 경험하게 된다는 보고가 있다.

한편, 순환계에 존재하는 저해제로 인해 정맥주사로 투여할 수 없는 플라스민의 경우, 혈전이 발생한 부위에 카테터를 이용하여 국소적으로 플라스민을 투여하게 되면 혈전이 직접적으로 용해되는 효과가 발생하며, 이후 순환계에 존재하는 어떠한 플라스민도 재빨리 중성화되어 출혈과 같은 부작용의 발생이 감소하게 된다. 하지만, 이러한 카테터의 사용은 침습적인 수술 절차를 필요로 한다는 점에서 또 다른 한계점을 갖고 있다.

따라서, 우수한 혈전용해능을 나타내고, 혈전이 발생한 부위에 특이적으로 작용하며, 결과적으로 생명을 위협하는 출혈과 같은 문제가 발생하지 않는 새로운 개념의 혈전용해제의 개발이 시급한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 혈전이 발생한 부위를 특이적으로 표적하면서 우수한 혈전 용해능을 나타내는 융합 펩타이드를 개발하기 위해 예의 노력을 기울인 결과, 인간 페리틴 단편의 양 말단에 혈전-표적성 펩타이드(clot-targeting peptide) 및 마이크로플라스미노겐과 같은 혈전 용해성 펩타이드(thrombolytic peptide)를 결합한 융합펩타이드가 우수한 항혈전능을 나타낸다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 (a) 혈전-표적성 펩타이드(clot-targeting peptide); (b) 서열번호 3, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 페리틴 단편 및 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 펩타이드; 및 (c) 마이크로플라스미노겐(microplasminogen), 마이크로플라스민(microplasmin) 및 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 펩타이드가 차례로 연결된 융합 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 펩타이드로 이루어진 케이지(cage) 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈전성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 혈전-표적성 펩타이드(clot-targeting peptide); (b) 서열번호 3, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 페리틴 단편 및 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 펩타이드; 및 (c) 마이크로플라스미노겐(microplasminogen), 마이크로플라스민(microplasmin) 및 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 펩타이드가 차례로 연결된 융합 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 융합 펩타이드로 이루어진 케이지(cage) 단백질을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 융합 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈전성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 (a) 혈전-표적성 펩타이드(clot-targeting peptide); (b) 서열번호 3, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 페리틴 단편 및 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 펩타이드; 및 (c) 마이크로플라스미노겐(microplasminogen), 마이크로플라스민(microplasmin) 및 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 펩타이드가 차례로 연결된 융합 펩타이드를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어인 ‘혈전(Thrombus, Blood clot, 혈병)’이란 혈액 응고 과정을 통해 혈액이 지혈되어 생성된 최종 산물이다. 이 물질은 혈액의 응고 기전(즉, 응고 인자)이 활성화 되어 혈소판 및 피브린이 모여 응집을 일으킨 암적색을 띠는 덩어리이다. 채혈한 혈액을 별도의 처리 없이 방치할 경우 응고되어 생긴 것을 흔히 혈병이라고 하며 체내에서 생성된 것을 혈전이라고 한다. 체내에서 생성된 이 덩어리는 보통 섬유소 용해 과정을 통해 자연스럽게 소멸되나, 병적으로 생성된 경우에는 생성량이 증가하여 체내에서 모두 용해시킬 수 없어 온몸을 떠돌다 혈관을 막아 여러가지 혈전성 질병을 유발하는 위험한 물질이다.

일반적인 상태에서 혈액이 응고되는 기전을 간략하게 요약하면 다음과 같다:

1.혈관이 손상되면 혈액이 공기 중에 노출되어 혈소판이 파괴된다.

2.혈소판 속 효소가 방출되어 칼슘이온과 함께 프로트롬빈(비활성 상태 효소)을 트롬빈(활성 상태 효소)으로 전환시켜 준다.

3.상기 단계에서 활성화된 트롬빈이 피브리노겐(원형단백질)을 피브린(선형단백질)의 형태로 전환시켜 준다.

4.피브린이 혈구와 엉키고 폴리머화 되어 혈병을 생성하고, 혈병 생성부위가 수축하여 혈액이 응고된다.

정상적인 출혈상태에서 상기한 기전에 따라 발생하는 혈액의 응고는 별다른 문제를 일으키지 않지만, 혈관 내피의 손상이나 염증, 동맥경화 등에 의한 이상, 혈액의 정체 및 여러 가지 원인에 따른 혈액 응고성 증가와 같은 병적 상태에서는 혈액이 혈관 내 특정 부위에서부터 응고하기 시작한다(혈전의 형성). 이렇게 병적 상태에서 생성된 혈전은 혈관을 좁히거나 또는 막아 정상적인 혈류 속도를 늦추거나 혈관을 완전히 폐색하게 된다. 즉, 심장의 관상동맥에 혈전이 생겨 심장으로의 혈류가 정상적이지 않을 때 발생하는 심근경색, 혈전이 뇌에 생긴 경우 발생하는 허혈성 뇌졸중(뇌경색) 등이 가장 대표적인 혈전성 질환의 예이다. 때로는 혈전이 생성된 혈관벽에서 떨어져 나와 혈관을 타고 이동하다가 하류의 혈관을 막아 말초장애를 유발하기도 한다.

본 발명에서 상기 (a)의 혈전-표적성 펩타이드(clot-targeting peptide, CLT)는 이러한 혈전을 특이적으로 표적할 수 있는 기능을 나타내는 펩타이드라면 제한 없이 본 발명에 포함이 될 수 있으며, 피브린-결합 펩타이드(fibrin-binding peptide)도 상기 혈전-표적성 펩타이드에 포함이 될 수 있다. 이의 비제한적인 예시는 다음과 같은 문헌에 제시되어 있다:

1) CN101,190,940호 : YIGSRRGDS, YIGSRRGDV, YIGSRRGDF, YIGSRYIGSK, YIGSRYIGSR, YIGSKRGDS, YIGSKRGDF, YIGSKRGDV, YIGSKYIGSK,YIGSKYIGSR, RGDSRGDS, RGDVRGDV, RGDFRGDF, RGDSYIGSR, RGDSYIGSK, RGDVYIGSR, RGDVYIGSK, RGDFYIGSR, RGDFYIGSK.

2) US6,984,373B2호 : CSDENWLWC, CPMSEWLYC, CPWESWTFC, CQEEPWLFC, CPGEDWLFC, CTGEPGPIC, CQLGYRTYC, CDGEPWLFC, CGWGSWKFC, CGWGSGKLC, CPGEPWTFC, CPGYLRSLC, CRGESWPYC.

3) US8,912,136B2호 : CREKA, CARSKNKDC, CRKDKC

4) EP1,986,682B1호 : CGLIIQKNEC, CNAGESSKNC

바람직하게는, 본 발명에서 상기 혈전-표적성 펩타이드는 서열번호 1(CNAGESSKNC) 또는 서열번호 2(CGLIIQKNEC)의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드 또는 이의 변이체일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 펩타이드 또는 이의 변이체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어 “변이체”란 상기 펩타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 의미한다. “동질의 생리활성”이란 이성화 능력이 있으며, 적어도 60% 이상의, 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 90%이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 것을 말한다. 또한 상기 "변이체"에는 천연형 단백질 아미노산 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe,Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp,Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한, 본 발명의 펩타이드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP와 같은 다른 단백질과 융합으로 만들어진 융합단백질 등이 이에 포함된다.

따라서, 본 발명에서 상기 “변이체”란 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드와 적어도 60% 이상의, 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 90%이상의 아미노산 서열 상동성을 갖으면서, 혈전을 표적하는 생리활성을 유지하는 펩타이드를 의미한다.

본 발명에서 상기 ‘페리틴(ferritin) 단백질’은 세포내 단백질의 일종으로 철을 저장하고, 방출하는 역할을 한다. 페리틴은 일반적으로 생체 내에서 속이 빈 구형의 케이지(cage) 형태를 하고 있으며, 상기 케이지는 24개의 페리틴 모노머(monomer)로 구성되며, 상기 페리틴 모노머는 그 구조에 따라 heavy chain과 light chain으로 구분된다.

본 발명에서 상기 페리틴 단백질은 이들 각각이 단위체로써 cage 형태의 복합 단백질을 형성할 수 있는 활성이 있는 단백질이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 평균 분자량이 20kDa 내지 25kDa일 수 있으며, 보다 바람직하게는 GenBank accession No: AAA62259.1.(ferritin light chain, mouse,), NCBI accession No: NP_071945.3(ferritin light chain, rat), NCBI accession No: NP_001108012.1(ferritin light chain, horse). NCBI accession No: NP_002023.2(ferritin heavy chain, human). NCBI accession No: NP_034369.1(ferritin heavy chain, mouse). NCBI accession No: NP_036980.1(ferritin heavy chain, rat), 및 NCBI accession No: NP_001093883.1(ferritin heavy chain, horse)으로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상일 수 있다. 보다 바람직하게는 인간에서 유래된 페리틴 모노머 경쇄(서열번호 8) 또는 인간에서 유래된 페리틴 모노머 중쇄(서열번호 9)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 인간에서 유래된 페리틴 모노머 경쇄(서열번호 8)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

서열번호 8 (인간 유래 페리틴 모노머 경쇄):

mssqirqnys tdveaavnsl vnlylqasyt ylslgfyfdr ddvalegvsh ffrelaeekr egyerllkmq nqrggralfq dikkpaedew gktpdamkaa malekklnqa lldlhalgsa rtdphlcdfl ethfldeevk likkmgdhlt nlhrlggpea glgeylferl tlkhd

서열번호 9 (인간 유래 페리틴 모노머 중쇄):

MTTASTSQVR QNYHQDSEAA INRQINLELY ASYVYLSMSY YFDRDDVALK NFAKYFLHQS HEEREHAEKL MKLQNQRGGR IFLQDIKKPD CDDWESGLNA MECALHLEKN VNQSLLELHK LATDKNDPHL CDFIETHYLN EQVKAIKELG DHVTNLRKMG APESGLAEYL FDKHTLGDSD NES

본 발명에서 상기 (b)의 “페리틴 단편”은 cage 형태의 복합 단백질을 형성할 수 있는 활성이 유지되는 한 제한이 없으나, 야생형(wild type) 페리틴 단백질에서 A-helix, B-helix, C-helix 및 D-helix를 포함하는 것일 수 있다. 즉, 야생형 페리틴을 구성하고 있는 A, B, C, D 및 E-helix 중에서 E-helix가 제거된 형태의 짧은 페리틴을 의미한다. 바람직하게는 인간 유래 페리틴 모노머 경쇄(서열번호 8)의 아미노산 서열에서 160번째 이후 아미노산 잔기가 하나 이상 제거된 것 또는 인간 유래 페리틴 모노머 중쇄(서열번호 9)의 아미노산 서열에서 165번째 이후 아미노산 잔기가 하나 이상 제거된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 서열번호 8의 아미노산 서열에서 158번째 이후 아미노산 잔기가 하나 이상 제거된 것 또는 서열번호 9의 아미노산 서열에서 162번째 이후 아미노산 잔기가 하나 이상 제거된 것일 수 있다. 가장 바람직하게는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 것일 수 있다.

서열번호 3 (인간 유래의 페리틴 경쇄 단편):

mssqirqnys tdveaavnsl vnlylqasyt ylslgfyfdr ddvalegvsh ffrelaeekr egyerllkmq nqrggralfq dikkpaedew gktpdamkaa malekklnqa lldlhalgsa rtdphlcdfl ethfldeevk likkmgdhlt nlhrlgg

서열번호 4 (인간 유래의 페리틴 중쇄 단편):

MTTASTSQVR QNYHQDSEAA INRQINLELY ASYVYLSMSY YFDRDDVALK NFAKYFLHQS HEEREHAEKL MKLQNQRGGR IFLQDIKKPD CDDWESGLNA MECALHLEKN VNQSLLELHK LATDKNDPHL CDFIETHYLN EQVKAIKELG DHVTNLRKMG A

본 발명에서 상기 (b)의 “변이체”란 서열번호 3 또는 서열번호 4의 펩타이드와 적어도 60% 이상의, 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 90%이상의 아미노산 서열 상동성을 갖으면서, 케이지 형태의 복합 단백질을 형성할 수 있는 활성이 유지되는 펩타이드를 의미한다.

한편, 플라스미노겐은 포유류에서 기본적인 피브린분해 효소인 플라스민의 불활성의 전구체 형태이다. 또한, 플라스민은 세포 이동, 조직 리모델링, 및 세균 침투에서 중요한 역할을 한다. 플라스민은 트립신보다 선택성이 보다 높으며, Lys-Xaa와 Arg-Xaa 사이를 선호적으로 절단 세린 단백질분해효소이다. 플라스미노겐 활성자, 예컨대 플라스미노겐 활성자(tPA) 또는 뉴로키나제는, 인간 플라스미노겐 분자의 Arg560-Va1561 결합을 절단하여, 활성형의 플라스민을 생성한다. 제조된 플라스민의 2개의 체인은 체인간의 이황화 결합으로 결합된다. 경쇄(25 kDa)는 (촉매 삼분자(catalytic triad)를 포함하는) 촉매 센터를 가지고 있으며, 트립신과 그외 세린 단백질 분해효소와 서열 유사성을 공유하고 있다. 중쇄(60 kDa)는 크링글(kringle)이라고 하는 유사성이 높은 5개의 삼중-루프 구조를 이룬다. 일부 크링글은 피브린과 플라스미노겐/플라스민 상호작용을 매개하는 라이신 결합부를 포함하고 있다. 플라스민은 펩티다제 패밀리 S1에 속한다.

비활성화된 효소인 플라스미노겐(plasminogen)은 총 810개의 아미노산으로 이루어진 단백질로(GenBank: AAA60113.1) N-말단의 PAP(pre-activation peptide), 다섯 개의 크링글 도메인(kringle domain) 및 C-말단의 세린 프로테아제 도메인으로 이루어져 있다. 크링글 도메인-1에 피브린 또는 다른 수용체가 최초로 접촉하면 다섯 개의 크링글 도메인이 그들의 열린 구조(open conformation)로 재배열을 하게 되고, 이러한 재배열에 의해 tPA 및 유로키나제(urokinase)와 같은 플라스미노겐 활성화제가 접근할 수 있게 된다.

마이크로플라스미노겐(microplasminogen)(또는 마이크로플라스민(microplasmin))은 플라스미노겐(또는 플라스민)의 짧은 형태로서, 플라스미노겐(또는 플라스민)의 프로테아제 도메인은 그대로 보유하고 있으나, 피브린과 항-플라스민의 1차적인 결합 부위를 구성하고 있는 다섯 개의 크링글(kringle) 도메인은 결여되어 있는 짧은 형태의 플라스미노겐(또는 플라스민)을 의미한다. 본 발명에서 상기 마이크로플라스미노겐(또는 마이크로플라스민)은 혈전 용해능을 나타내어 혈전 생성 부위에서 혈전을 제거하는 효과를 나타낸다.

본 발명에서 상기 마이크로플라스미노겐 또는 마이크로플라스민은 야생형 플라스미노겐 또는 플라스민에서 다섯 개의 크링글(kringle) 도메인이 제거된 형태는 제한 없이 포함이 될 수 있으며, 이의 변이체 또한 본 발명의 융합 펩타이드에 이용이 될 수 있다. 본 발명에서 상기 “변이체”란 마이크로플라스미노겐 또는 마이크로플라스민과 적어도 60% 이상의, 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 90%이상의 아미노산 서열 상동성을 갖으면서, 혈전을 용해하는 생리활성을 유지하고 있는 펩타이드를 의미한다.

상기 마이크로플라스미노겐의 변이체에 대한 구체적인 예시는 선행문헌을 통해 통상의 기술자가 그 내용을 용이하게 파악할 수 있으며, 예를 들어, Wang et al.(1995, Protein Science 4, 1758-1767 및 1768-1779)은 545, 548, 550, 555, 556, 558, 560~564, 585, 740 및 788번 아미노산 위치에서 돌연변이가 발생한 광범위한 마이크로플라스미노겐 돌연변이체 시리즈를 보고한 바 있다. 558번 및 566번 아미노산 위치에서 세린이 시스테인으로 치환된 이중 돌연변이체는 Linde et al.(1998, Eur J Biochem 251, 472-479)에 의해 보고된 바 있다. Jespers et al.(1998, Biochemistry 37,6380-6386)은 Ala-스캔에서 일련의 파지 전시된 마이크로플라스미노겐 단일 위치 돌연변이체인 H569A, R610A, K615A, D660A, Y672A, R712A, R719A, T782A, R789A를 생산한 바 있다.

본 발명에서 상기 마이크로플라스미노겐은 바람직하게는 인간의 야생형 플라스미노겐을 구성하는 810개의 아미노산 중 561 내지 810번째 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 보다 바람직하게는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 마이크로플라스민은 바람직하게는 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.

서열번호 5 (마이크로플라스미노겐):

AAPSFDCGKP QVEPKKCPGR VVGGCVAHPH SWPWQVSLRT RFGMHFCGGT LISPEWVLTA AHCLEKSPRP SSYKVILGAH QEVNLEPHVQ EIEVSRLFLE PTRKDIALLK LSSPAVITDK VIPACLPSPN YVVADRTECF ITGWGETQGT FGAGLLKEAQ LPVIENKVCN RYEFLNGRVQ STELCAGHLA GGTDSCQGDS GGPLVCFEKD KYILQGVTSW GLGCARPNKP GVYVRVSRFV TWIEGVMRNN

서열번호 6 (마이크로플라스민):

VVGGCVAHPH SWPWQVSLRT RFGMHFCGGT LISPEWVLTA AHCLEKSPRP SSYKVILGAH QEVNLEPHVQ EIEVSRLFLE PTRKDIALLK LSSPAVITDK VIPACLPSPN YVVADRTECF ITGWGETQGT FGAGLLKEAQ LPVIENKVCN RYEFLNGRVQ STELCAGHLA GGTDSCQGDS GGPLVCFEKD KYILQGVTSW GLGCARPNKP GVYVRVSRFV TWIEGVMRNN

본 발명에서 상기 (a), (b) 및 (c)의 펩타이드가 “차례로”연결되어 있다는 것은, 페리틴 단편의 N-말단에 상기 (a)의 펩타이드가 연결된 경우 C-말단에는 (c)의 펩타이드가 연결이 되어 있는 것을 의미하며, 이 반대의 경우도 포함된다. 바람직하게는, 상기 융합 펩타이드에서 (a)의 혈전-표적성 펩타이드는 (b)의 페리틴 단편 또는 이의 변이체 N-말단에 연결되어 있으며, 상기 (c)의 마이크로플라스미노겐, 마이크로플라스민 및 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택된 펩타이드는 (b)의 페리틴 단편 또는 이의 변이체 C-말단에 연결되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 펩타이드를 얻기 위한 유전자는 어떤한 공급원의 게놈 DNA 또는 cDNA로부터도 분리가능 하며 바람직하게는 사람 또는 생쥐의 cDNA 또는 게놈 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 유전자를 획득하기 위한 일반적인 방법은 종래 기술에 잘 나타나 있다(참조: Sambrook, Fitsch & Manatis, Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, Second Edition(1989)). 또한 어떠한 동물 세포든지 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 유전자의 분자 클로닝을 위한 핵산 공급원으로써 제공될 수 있다. DNA는 클론된 DNA로부터 공지의 기술에 의해 획득될 수 있으며, 바람직하게는 화학합성, cDNA 클로닝 또는 게놈 DNA의 클로닝 또는 그들의 단편의 클로닝 또는 원하는 세포로부터 정제된 단편의 클로닝에 의해 단백질을 고수준으로 발현하는 세포로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 획득될 수 있다[Sambrook et al., 1989, supra: Glover, D.M.(ed). 1985, DNA Cloning; A Practical Approach. MRL Press. Ltd., Oxford. U. K. Vol. I.II]. 게놈 DNA로부터 클로닝된 유전자는 암호화 영역에 부가되어 조절 영역과 인트론 DNA영역을 포함한다. cDNA로부터 클로닝된 유전자는 인트론 서열을 포함하지 않는다. 공급원이 무엇이든지 간에, 유전자는 유전자의 전달을 위한 적합한 벡터로 분자적으로 클로닝되어야 한다.

본 발명의 펩타이드들은 당해 분야의 숙련가가 공지된 방법에 의하여 제조할 수 있다. 이러한 펩타이드는, 흔히 보다 큰 폴리펩타이드의 일부로서 본 발명의 펩타이드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 원핵 또는 진핵 세포에서 생성시킬 수 있다.

다른 방법으로는, 이러한 펩타이드는 화학적 방법에 의해 합성할 수 있다. 재조합 숙주내의 이종성 단백질의 발현, 폴리펩티드의 화학적 합성 및 시험관내 전사를 위한 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며 문헌(참조 문헌: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., Cold Sprin Harbor, N.Y.; Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91:501; Chaiken I.M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11: 255; Kaiser et al. (1989) Ann. Rev. Biochem. 57:957; and Offord, R.E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing)에 추가로 기재되어 있다.

본 발명에서 상기 (a)의 혈전-표적성 펩타이드는 또는 (c)의 마이크로플라스미노겐, 마이크로플라스민 및 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택된 펩타이드는 (b)의 페리틴 단편 또는 이의 변이체에 링커를 통해 연결될 수 있다.

상기 링커는 천연 유래의 펩타이드 링커 또는 합성 유래의 펩타이드 링커를 의미한다. 상기 펩타이드 링커는 선형 아미노산 쇄로 구성되고, 이때 20종의 천연 발생 아미노산은 단량체 빌딩 블록이다. 링커는 반복적 아미노산 서열을 가질 수 있거나 천연 발생 폴리펩티드, 예컨대, 힌지 기능을 갖는 폴리펩티드의 서열을 가질 수 있다. 모든 펩타이드 링커가 핵산 분자에 의해 코딩될 수 있으므로 재조합적으로 발현될 수 있다. 링커는 그 자체가 펩타이드이기 때문에 각각의 펩타이드들은 펩타이드 결합을 통해 링커에 연결된다.

상기 링커는 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산, 바람직하게는 펩타이드 결합에 의해 연결된 1 내지 20개의 아미노산으로 구성되며, 이때 아미노산은 20개의 천연 아미노산 중에서 선택된다. 이들 아미노산 중 하나 이상은 당해 분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이 글리코실화된다. 이에 제한되는 것은 아니지만 바람직하게는, 1 내지 20개의 아미노산은 글리신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민 및 리신 중에서 선택된다.

본 발명의 일실시예에서는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 융합 펩타이드를 제작하여 그 활성을 평가하였다.

서열번호 7 (융합 펩타이드):

MGGTCNAGESSKNCASGHMSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEK REGYERLLKMQNQRGGRIFLQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFL DEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGGSEFVDGGGSGTSAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTR FGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVI TDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGT DSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNNLEHHHHH

(밑줄 :CLT2 peptide / 이탤릭체: s-ferritin / 볼드체: microplasminogen)

본 발명은 상기 융합 펩타이드로 이루어진 케이지(cage) 단백질을 제공한다.

단백질 케이지(Protein cage)는 저분자량 단일체들의 정밀한 자가조립 성질에 의하여 형성되며, 내부에 공간을 가지는 단백질로 된 케이지이다. 바이러스 capsid 단백질, 페리틴, heat shock protein, Dps 단백질이 이에 해당된다. 본 발명의 단백질 케이지는 본 발명의 융합 펩타이드를 상기 단백질 케이지를 구성하는 단일체(모노머, monomer)로 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 사용되는 용어인 “자가조립(self-assembly)”이란 어떤 분자들이 외부의 특별한 자극이나 인위적인 유도없이, 스스로 알아서 특정한 나노구조를 형성하는 성질을 의미한다.

본 발명의 단백질 케이지는 본 발명의 상기 융합 펩타이드의 결합에 의해 만들어지는 것으로 일반적으로 생체 내에서 구형의 케이지 형태를 하고 있다.

본 발명의 단백질 케이지는 본 발명의 융합 펩타이드가 단위체로서 규칙적으로 배열된 복합 단백질일 수 있으며, 더 바람직하게는 본 발명의 융합 펩타이드 24개가 3차원적으로 규칙적으로 배열하여 형성된 것일 수 있다. 한편, 본 발명의 융합 펩타이드가 자가조립에 의해 단백질 케이지를 형성할 경우, 페리틴 단편의 C-말단 및 N-말단에 각각 연결되어 있는 혈전-표적성 펩타이드와 마이크로플라스미노겐 등은 각각의 생리학적 활성을 그대로 유지한다.

본 발명의 일실시예에서는 혈전-표적성 펩타이드(CLT), 인간 유래 페리틴 경쇄 단편(sFt) 및 마이크로플라스미노겐(μPg)이 차례로 연결된 융합 펩타이드(CLT-sFt-μPg)를 제작하였고, 상기 융합 펩타이드를 모노머로 하여 24개가 3차원적인 배열을 통해 케이지 단백질을 형성하는 것을 확인하였다. sFt의 N-말단에 연결된 CLT 펩타이드는 케이지 단백질의 바깥쪽으로 노출이 되어 있음을 확인하였고, C-말단에 융합되어 있는 마이크로플라스미노겐은 4-fold 대칭으로 뭉쳐져 꽃잎과 유사한 외형으로 케이지 단백질 외부로 노출이 되어 있음을 확인하였다. 한편, 케이지 단백질 외부로 노출된 마이크로플라스미노겐은 활성화 절단 위치(Arg-Val)를 보유할 수 있는 방향으로 향하고 있음을 확인하였다.

즉, 본 발명의 융합 펩타이드는 야생형 페리틴 모노머가 자가조립 성질에 의해 페리틴 케이지 단백질을 형성하는 특성에 아무런 간섭을 나타내지 않아 여전히 케이지 단백질을 잘 형성하는 것을 알 수 있었다.

본 발명은 상기 융합 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 융합 펩타이드를 암호화 하는 것이면 제한 없이 사용될 수 있으며, DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 천연에서 분리되거나 당업계에 공지된 유전공학적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 발현벡터로서, 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 본 발명의 벡터는 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 핵산을 숙주 세포에 전달하는데 사용되는 모든 수단으로 바람직한 벡터는 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노관련 바이러스와 같은 바이러스 벡터이다. 따라서, 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 유전자는 바이러스 벡터를 사용하여 또는 직접적인 DNA 도입을 통해 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 도입시킨다. 표적 조직내에서의 발현은 돌연변이 벡터를 바이러스 벡터 또는 수용체 리간드 등을 이용하여 특정 세포에 대해 표적화하거나 또는 조직 특이적 프로모터를 사용하거나, 또는 그 두 방법 모두를 사용하여 실시할 수 있다.

한편, 본 발명에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T. J.,Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)).

본 발명은 또한 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

숙주 세포는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 또는 바람직한 특정 방식으로 유전자 생성물을 진행시키는 것을 선택할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질의 해독 및 해독후 프로세싱과 변형에 대한 특징적이고 특이적인 기작을 갖고 있다. 적합한 세포주 또는 숙주 시스템으로는 발현된 이종 단백질의 바람직한 변형 및 프로세싱을 제공하는 것을 선택할 수 있다. 효모에서의 발현은 생물학적 활성 생성물을 생산할 수 있다. 진핵 세포에서의 발현은 " 천연" 폴딩의 가능성을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21DE, E. coli DH5, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110 등이 사용될 수 있으며, 또한 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있다.

벡터를 숙주세포 내로 전달하여 숙주세포를 형질전환 시키는 방법은 공지의 방법이면 어떠한 것이든 가능하며 특별히 제한되지 아니한다. 예를 들어, 인산칼슘침전법(calcium phosphate precipitation), DEAE-dextran법, 전기천공법(electroporation), 직접 미세주입법(direct microinjection), DNA-로딩 리포좀(DNAloaded liposome)법, 리포펙타민-DNA복합체(liofectamine-DNA complex)법, 세포 음파분쇄법(cell sonication), 고속미세분사(high velocity microprojectile)를 이용한 유전자 폭격법(gene bombardment), 다양이온(polycation)법 및 수용체 매개 형질전이법(receptor-mediated transfection)에 의하여 형질전환 할 수 있다. 이 기술들 중 일부는 생체 내 또는 생체 외 사용을 위해 개량될 수 있다.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 대량의 재조합 펩타이드 또는 단백질을 얻게 된다. 예를 들어, 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 형질전환된 숙주세포의 배양은 당업계에서 통상적으로 이용되는 배지를 이용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 숙주세포가 원핵세포(예컨대, E. coli)인 경우, LB(Luria-Bertani) 배지를 이용하여 숙주세포를 배양할 수 있다. 숙주세포가 동물세포인 경우에는, 예컨대, Eagles's MEM(Eagle's minimumessential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959))을 이용하여 형질전환체를 배양할 수 있다. 숙주세포의 다양한 배양방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, Sambrook et al., Molecular Cloning, ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있고, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 융합 펩타이드는 혈전을 표적하여 용해하는 효과가 매우 우수하다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 융합 펩타이드는 (i) 혈전-표적능, (ii) 혈전 용해능이 매우 우수할 뿐만 아니라 (iii) 항-플라스민(anti-plasmin)에 의한 마이크로플라스민의 불활성화에 대한 감수성이 낮은 것을 확인할 수 있었다.

구체적으로, 본 발명의 일실시예에 따르면 혈전-표적능과 관련하여 CLT-sFt-μPg 모노머가 형성한 케이지 단백질의 혈전 결합력은 CLT-μPg 융합 단백질보다 현저히 높았으며, 이는 곧 케이지 표면의 CLT 펩타이드가 케이지 구조에 의한 결합 활성 증진에 의해 혈전을 더 높은 친화력으로 표적한다는 것을 의미한다.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 순환하는 α2-안티플라스민의 양을 모니터링함으로써, 혈액 내에서 활성화된 μPn 이 안티-플라스민에 의해 분해되는 것을 나노케이지 구조가 방어해줄 수 있는지 여부를 확인하였다. 그 결과, 유리된 형태의 μPn을 투여한 경우와 비교하였을 때 활성화된 CLT-sFt-μPn DCNC을 정맥으로 투여한 이후, 순환하는 α2-안티플라스민의 양이 더 천천히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 곧, 활성화된 μPn이 항-플라스민에 의해 분해되는 것을 나노케이지 구조가 보호해 줬다는 것을 의미한다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 상기 융합 펩타이드의 혈전 용해능을 in vivo 동맥성 혈전 동물모델 및 정맥성 혈전 동물모델에서 평가하였다. 그 결과, 본 발명의 CLT-sFt-μPg 모노머가 형성한 케이지 단백질은 동맥 혈전과 정맥 혈전을 매우 효과적으로 용해하는 것을 확인할 수 있었다. 한편, sFt에 연결이 되지 않은 형태인 CLT-μPg의 경우에는 in vitro 표적성 평가와는 달리 in vivo에서는 혈전을 표적하는 효과를 나타내지 못했으며, 결과적으로 혈전용해활성이 매우 낮게 나타났다. 즉, 혈전용해활성을 나타내는 μPg에 혈전을 표적하는 CLT를 융합한다고 하더라도 혈전 표적성 용해능이 나타나는 것은 아니며, sFt에 의한 케이지 단백질의 형성이 CLT 펩타이드의 혈전 표적성 뿐만 아니라 μPn의 우수한 혈전 용해능을 유지시켜 준다는 것을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명은 상기 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈전성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 “혈전성 질환”은, 혈전에 의해 발생되는 모든 질환을 의미하는 것으로서, 특히 혈전에 의해 동맥 혈관 또는 정맥 혈관이 막힘으로써 발생하는 모든 질환을 의미한다. 상기 질환의 원인으로는 느린 혈류, 응고 과다, 혈관 손상 등의 요인이 단독 또는 복합적으로 작용하여 발병하는 것으로 알려져 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 혈전성 질환으로는 혈전증, 고혈압, 뇌졸중, 뇌경색, 협심증, 심근경색, 동맥경화증, 말초동맥폐쇄증, 신장정맥폐쇄증, 중심 망막정맥 폐쇄증, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 뇌 정맥동 혈전증, 뇌 동맥경화증, 심장병, 허혈성 심질환, 두개내출혈, 동맥류, 죽상혈전증, 신경화증 등이 있으며, 바람직하게는 혈전 및 혈소판 응집으로 인한 혈전증, 고혈압, 뇌졸중, 뇌경색, 협심증, 심근경색, 동맥경화증 또는 허혈성 심질환을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 융합 펩타이드를 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명의 상기 융합 펩타이드는 다양한 혈전성 질환을 치료하는데 있어서 시너지(synergistic) 효과를 이루기 위해 적당한 항응고제(anti-coagulant) 또는 플리스미노겐(plasminogen) 활성제, 또는 스트렙토키나제 같은 혈전제(thrombotic agent)와 함께 투약 될 수 있다.

본 발명의 융합 펩타이드는 혈전을 표적하여 용해하는 효과가 매우 우수하며, 출혈부작용이 없기 때문에, 부작용이 적은 혈전성 질환 예방 또는 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

모든 도면에서 사용된 약어는 다음과 같다:
CLT: 혈전-표적성 펩타이드, sFt: 페리틴 단편, μPg : 마이크로플라스미노겐, μPn : 마이크로플라스민, CLT-sFt-μ각 펩타이드가 연결된 융합 펩타이드
도 1a는 본 발명에 따른 융합펩타이드 모노머(CLT-sFt-μ와 상기 모노머가 형성한 케이지의 모식도를 나타낸 도면이다. CLT-sFt-μ의 3D 모델을 야생형 인간 페리틴(PDB 2FG4)과 마이크로플라스미노겐(PDB 1QRZ)의 구조를 기반으로 하여 MODELLER v9.12로 모델링한 것이다. CLT 펩타이드는 빨간색 리본, 마이크로플라스미노겐은 녹색 및 페리틴 단편은 연한 갈색으로 나타냈다. 플라스미노겐 활성화제에 의해 절단되는 위치(Arg⁵⁶¹-Val⁵⁶²)를 진홍색으로 나타냈으며, 마이크로플라스미노겐의 촉매의 트리아드 아미노산 잔기(His⁶⁰³, Asp⁶⁴⁶ 및 Ser⁷⁴¹)를 오렌지 색상으로 나타내었다.
도 1b는 CLT-sFt-μPg 모노머가 합체되는 형태를 도안화한 것이다. CLT-sFt-μPg 모노머 4합체가 6개 모여 케이지를 형성하며, 페리틴 단편의 C-말단에 융합된 마이크로플라스미노겐과 N-말단에 융합된 CLT 단백질이 케이지의 외부로 노출이 되어 있음을 확인할 수 있다. CLT-sFt-μPg 융합 펩타이드로 이루어진 케이지 단백질의 직경은 약 17nm로 계산이 되었다.
도 2a는 CLT-sFt-μPg와 sFt-μPg의 도식 다이아그램을 나타낸 것이며, 정제된 케이지를 SDS-PAGE에 적용한 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 CLT-sFt-μPg DCNC 및 sFt-μPg DCNC의 DLS 분석결과를 나타낸 것이다.
도 2c는 CLT-sFt-μPg DCNC 및 sFt-μPg DCNC의 투과전자현미경 (TEM) 분석결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 본 발명에서 사용한 단백질들의 도식 다이아그램을 나타낸 것이다. 유동적인 링커(GGGSG)가 페리틴 단편과 마이크로플라스미노겐 사이에 삽입되어 있다.
도 3b는 혈전을 생성한 후, FITC-라벨된 각각의 단백질들을 1.25μM의 농도로 혈전 위에 처리하여 혈전에 결합하는지 여부를 형광현미경으로 관찰한 결과이다. 혈전은 광학현미경 하에서 시각화 하였다.
도 3c는 FITC-라벨된 단백질(1 μM)을 혈전에 처리한 후, 결합한 단백질의 양을 형광 분광계를 이용하여 정량화한 결과이다(ANOVA test, ****: P<0.0001, ***: P=0.0003).
도 3d는 CLT-sFt-μPg와 sFt-μPg를 1 내지 4 μM의 농도로 혈전에 처리한 후, 혈전과 결합한 양을 정량화한 결과이다.
도 4a는 96-웰 플레이트에 위치한 혈전에 각각의 단백질을 7 μM의 농도로 표시된 시간동안 처리한 후, 405 nm에서 흡광도를 측정함으로써 혈전이 용해된 정도를 혼탁도로 평가한 결과이다.
도 4b는 CLT-sFt-μPn 또는 μPn을 마우스에 정맥투여한 후, 혈액 내 α2-항플라스민의 양을 측정한 결과이다.
도 4c는 CLT-sFt-μPn또는 μPn을 마우스에 정맥투여한 경우, 쥐 꼬리 끝 상처의 출혈이 멎는 시간을 측정한 결과이다.
도 5a는 마우스의 우측 경동맥에 혈전을 유도하여 혈관을 폐색한 후, 각각의 단백질을 처리하였을 때 혈전이 얼마나 용해되었는지를 혈관을 가로로 12절편하여 H/E 염색으로 관찰한 결과이다(RCCA: 우측 경동맥).
도 5b는 혈전이 혈관을 폐색한 정도를 inForm program(PerkinElmer)로 측정하고, 전체 혈관 단면영역 대비 각 절편에서 혈전이 차지하는 영역을 정량화하여 표준화한 결과이다.
도 5c는 심부정맥 혈전증 동물모델을 도안화하여 나타낸 것이다.
도 5d는 각 단백질을 처리한 이후에 남아있는 혈전을 육안으로 관찰한 결과이며(상), 각각의 혈전의 무게를 측정하여 나타낸 결과이다(하).

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험방법>

1. 혈전표적 펩타이드 ( CLT )/ 마이크로플라스미노겐이 컨쥬게이션된 이중 탑재된 나노케이지 및 CLT-마이크로플라스미노겐 융합 단백질의 제작

이중 탑재된 나노케이지(Double chambered Nanocage, DCNC) 및 대조군 단백질을 발현하는 재조합 플라스미드를 변형된 pET28 벡터(Novagen)을 이용하여 제작하였다. 변형된 pET28은 NcoI/NdeI 사이에 KpnI 및 NheI의 추가적인 절단부위를 포함하고 있으며, Sa1I/XhoI 사이에 SpeI의 추가적인 절단부위를 포함하고 있다. 짧은 단편 페리틴 경쇄(short ferritin light chain, sFt)를 인코딩 하는 유전자는 인간 페리틴 경쇄의 cDNA로부터 PCR을 통해 준비하였고, 종래 보고된 바와 같이(ACS nano 7, 7462-7471, 2013) 박테리아에서 발현시키기 위해 NdeI 및 BamH1 위치에 삽입하였다. CLT 단백질(CNAGESSKNC)를 인코딩하는 올리고뉴클레오티드는 합성이 된 후 KpnI 및 NheI 사이에 삽입하였다. 마이크로플라스미노겐(μPg)은 PCR을 통해 준비하였고, Spe1 및 XhoI 사이에 삽입하였다. 유동성 있는 링커(GGGSG)는 합성이 된 후 Sa1I 및 SpeI 사이에 삽입이 되었고, 최종적으로 CLT-sFt-μPg 구조체 내에서 μPg과 페리틴 사이에 링커(GSEFVDGGGSGTA)를 생성하였다. sFt-μPg는 CLT 펩타이드를 삽입하는 것만 제외하면 상기한 방법과 동일한 방법을 통해 제작하였다. 유리 μPg(free μPg) 및 CLT가 컨쥬게이트된 μPg은 상기와 동일한 벡터 및 동일한 절단위치를 이용하여 제작하였다.

2. CLT - sFt - μPg 이중탑재 나노케이지(DCNC)의 특성

단백질을 발현, 정제한 이후에, 이중탑재 나노 케이지 단백질(CLT-sFt-μPg 및 sFt-μPg)를 DLS(dynamic light scattering) 장치(ELS-Z, Otzuka Electronics, Japan)를 이용하여 분석하였다. 상기 이중탑재 나노 케이지들의 모양과 크기를 투과전자현미경(transmission electron microscopy, TEM)을 이용하여 관찰하였다.

각 샘플을 0.2 mg/mL로 희석하고, CF-200-Cu grids(Electron Microscopy Sciences)에 적용하여, 3차례 세척하였다. 이후 2% 우라닐 아세테이트를 음성 염색을 진행하였고, 영상을 한국기초과학연구원에 있는 FEI Tecnai를 이용하여 획득하였다.

3. CLT - sFt - μPg DCNC의 구조 모델링

CLT-sFt-μPg 단일유닛의 구조를 인간 페리틴(PDB 2FG4) 및 마이크로플라스미노겐(PDB 1QRZ)의 결정 구조를 기초로 하여 MODELLER v9.12를 이용하여 모델링하였다. 총 1,000개의 단량체 구조를 생성하였고, PyMOL을 이용하여 야생형 페리틴 케이지 구조(PDB 3A68)에 기초하여 CLT-sFt-μPg DCNC를 조립하였다. 기준에서 벗어나는 적어도 20개의 구조를 GROMACS를 이용하여 재정립하였고, 기준에서 벗어나지 않고 가장 낮은 에너지를 나타내는 구조를 모델로서 선정하였다.

4. 혈전 결합 분석

혈전은 신선한 냉동 혈장(FFP, 0.2 mL)에 CaCl2(10mM) 및 트롬빈(0.5 U/mL)을 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 방치하여 형성하였고, PBS를 이용하여 철저하게 세척하였다. 1 내지 4 μM의 FITC가 표지된 단백질을 혈전 위에 첨가하였고, 37℃에서 30분간 인큐베이션 하였다. 이후 결합하지 않은 물질들을 제거하기 위한 세척을 진행하였다. 형광은 SPECTA MAX BEMINI EM(MOLECULAR DEVIDES)을 이용하여 488 nm의 excitation 파장 및 520 nm의 emission에서 모니터링 하였다. 현미경 관찰을 위하여, 1 mm 유리 플레이트 위에 얇은 층으로 절편한 혈전을 올려 놓고, 1. 25 μM의 농도로 각 단백질을 인큐베이션 한 후, PBS로 세척하고 형광 현미경 하에서 관찰을 하였다. 케이지의 형성에 의해 짧은 페리틴 단편의 양 말단에 연결된 펩타이드들의 활성이 영향을 받지 않는다는 것을 확인하기 위해, 동등한 몰 농도의 페리틴 모노머 및 유리 단백질도 인큐베이션 하였다.

5. 혈전 용해력 (혼탁도) 분석

SUNRISE-BASIC 리더기(TECAN, 스위스)를 이용하여, 코스타 96-웰 EIA/RIA 플레이트로(in triplicate) 상온에서 분석을 수행하였다. 혈전은 상술한 것과 동일한 방법으로 생성했다. 형성된 혈전의 용해를 위하여, 혈전에 각각의 단백질(7 μM)을 더하였다. 혈전을 용해하기 이전에, 마이크로플라스미노겐 또는 마이크로플라스미노겐이 융합된 펩타이드들을 유로키나제로 37℃에서 1시간 동안 활성화 시켰다. 따라서, 혈전 용해반응은 유로키나제의 존재 하에서 수행이 되었다.

6. 혈장 내 α2 - 항플라스민 분석 및 출혈 부작용 확인

종래 보고된 방법에 따라, 설치류에서 α2-항플라스민의 레벨을 분석하였다(Blood 97, 3086-3092, 2001). 활성화된 CLT-sFt-μPn (7.9 mg/kg) 및 μPn (5mg/kg) 단백질을 ICR 마우스(6-8주령 : 18-25g)의 꼬리 정맥을 통해 투여하였다(μPn: 마이크로플라스민). 동일한 부피의 샐라인(saline)을 대조군으로서 투여하였다. 20 μL의 동물 혈액을 지정된 시간(15분, 60분 및 120분)에 채취하였고, 혈장을 준비하였다. α2-항플라스민의 수준을 분석하기 위하여, 설치류 혈장과 혼합하기 이전 및 이후에 in vitro 플라스민 활성을 측정하였다.

10 μL의 혈장을 420 μL 0.05 M Tris-HCl 버퍼 (pH 7.4), 100 mM NaCl, 0.01 % Tween 20을 이용하여 희석하였고, 5 nM의 플라스민을 첨가하였다. 10초간 인큐베이션 한 이후에, 50 μL의 3 mM S2403 (Chromogenics, Antwerp, Belgium)를 반응 샘플에 첨가하였고 405 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 흡광도의 변화는 버퍼만을 처리한 군에서(즉, 0% α2-항플라스민) 분당 약 0.18 이었고, 샐라인을 처리한 동물의 혈장에서(즉, 100% α2-항플라스민) 분당 약 0.09 이었다. 상기한 결과를 바탕으로 캘리브레이션 곡선을 작성하였다.

또한, 활성화된 CLT-sFt-μPn (7.9 mg/kg) 및 μPn (5mg/kg) 단백질이 투여된 ICR 마우스(6-8주령 : 18-25g)의 꼬리 끝에 상처를 낸 후, 출혈이 멎는 시간을 측정하였다. 동일한 부피의 saline 및 tPA를 대조군으로서 투여하였다.

7. 동맥 혈전 동물 모델

수컷 ICR(6 내지 8주령, 18-25g)을 병원균이 없는 환경에서 습도와 온도를 유지하며 사육하였다. 마우스를 마취하고, 오른쪽 경동맥이 드러나도록 피부를 절개하였다. 근막을 직접적으로 절개하고, 우측 경동맥(common carotid artery)의 일부를 노출시켰다. 혈전은 FeCl3(5%)로 충분히 적셔진 필터 페이퍼를 우측 경동맥 하단에 삽입함으로써 유도하였으며, 삽입된 필터페이퍼는 3분이 지나고 제거하였다.

혈전 형성에 의한 폐색이 나타나고 2분이 경과한 후, 64.25 μM의 CLT-sFt-μPn, μPn 및 CLT-μPn 각각을 100 μL 씩 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 투여된 단백질들은 유로키나제와 함께 1시간 동안 배양함으로써 활성화 되었고(1:20), 동일한 양의 유로키나제를 대조군으로써 따로 투여하였다. 마우스의 경동맥을 관류 고정하였고, 헤마토실린/에오신(H/E) 염색 후 조직학적 분석을 위해 회수하였다. 손상된 경동맥의 조직 횡-절편 12개를 균일하게 절단하고 H/E 염색을 수행한 후 VECTRA 3.0 (Perkinelmer) 하에서 관찰하였다.

폐색된 영역을 inForm program(Perkinelmer)를 이용하여 측정하였고, 총 혈관 내강에 대비하여 그 비율을 %로 표준화 함으로써, 각 절편마다 혈전의 정도를 정량화하였다. 각각의 단백질로 처리한 마우스마다 12개 절편의 평균을 플로팅 하였다.

8. 심부정맥 혈전증(deep vein thrombosis) 모델

정맥 혈전증 동물모델은 종래 문헌에서 보고된 바에 따라 준비하였다(Thrombisis and haemostasis 105, 1060-1071, 2011). 간략하게, SD랫드를 마취하고 상대정맥 및 하대정맥을 노출시켜 인접한 다른 장기들로부터 분리하였다. 각 대정맥의 말단 3 cm를 2-0 실크실로 느슨하게 묶어주고, 분지 혈관은 꽉 묶어주었다. 즉시, 20 UI의 트롬빈을 꼬리 정맥을 통해 투여하였다.

혈전의 형성에 의한 폐색이 나타나고 30분이 경과한 후, CLT-sFt-μPn (7.92 mg/kg) 또는 μPn (5mg/kg)을 꼬리 정맥을 통해 정맥투여 하였다. 상기 투여한 각 단백질들은 유로키나제에 의해 1시간 동안 미리 활성화 시켜놓았으며, 동일한 양의 유로키나제를 대조군으로서 독립적으로 투여하였다. 60분이 경과하고, 정맥을 분리하여 PBS가 담긴 페트리 디쉬에 보관하였다. 혈전용해 활성은 혈전의 함수중량(wet weight)을 즉시 측정함으로써 평가하였다.

<실험결과>

1. 융합단백질의 케이지 나노입자의 제조 및 이의 특성

본 발명자들은 마이크로플라스민에 기반을 둔 혈전용해제를 개발하기 위하여 이중 탑재 가능한 페리틴 나노케이지(double-chambered nanocage, DCNC)를 디자인 하였다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 다가의(multivalent) 혈전 표적성(clot-targeting, CLT) 펩타이드 및 마이크로플라스민 단백질이 DCNC의 표면에 공존하도록 하였다.

상기 페리틴은 케이지와 같은 나노입자를 형성하며, 이러한 케이지 위에 다양한 기능성 분획들이 화학적 또는 유전학적으로 컨쥬게이션 할 수 있다. DCNC를 이용하는 것에 대한 아이디어에는 펩타이드와 단백질 탑재물들이 이중의 효과를 제공할 수 있다는 것에 있다. 곧, 이러한 활성은 리간드의 결합활성에 의해 증가될 수 있으며 각자의 기능을 방해하지는 않는다.

본 발명에서 사용하고 있는 CLT (CNAGESSKNC)는 혈전에 존재하는 피브린-피브로넥틴 복합체를 인식할 수 있는 파지 디스플레이에 의해 발견이 되었다. 본 발명자들은 인간 페리틴 경쇄의 짧은 단편(sFt)을 이용하였고, 이러한 짧은 단편은 야생형 페리틴의 다섯 번째 헬릭스를 제거함으로써 만들어졌다. 짧은 단편의 페리틴 모노머가 형성하는 케이지에 탑재된 펩타이드와 단백질은 각자의 결합활성과 생리학적 활성을 방해하지 않았다.

마이크로플라스미노겐(μPg)은 유로키나제에 의해 Arg-Val 잔기가 절단됨으로써 마이크로플라스민(μPn)으로 활성화될 수 있다. 활성화된 마이크로플라스민은 두 개의 사슬이 이황화결합된 세린 프로테아제이며, His, Asp 및 Ser의 전통적인 삼중 촉매적 측면에서 트립신에 상응한다.

마이크로플라스민은 tPA나 UPA등의 플라스민 활성화효소에 의해 마이크로플라스미노겐으로부터 변환되어 피브린을 절단/용해하는 활성을 갖는다. UPA는 마이크로플라스미노겐 Arg580 Val581사이를 절단하여 Val581부터 끝까지를 포함하는 마이크로플라스민으로 변환한다. 마이크로플라스민은 neutral pH에서 안정성이 떨어지므로 마이크로플라스미노겐의 상태로 단백질을 제조 및 정제한 후 UPA로 활성화시켜 본 실험에 사용하였다.

CLT 펩타이드와 마이크로플라스미노겐 단백질 탑재물의 방향과 노출 패턴을 예측하기 위해, MODELLER v9.12로 상동성 모델링을 함으로써 CLT-sFT-μPg 서브유닛의 구조적 모델을 제작하였다(도 1a). 도 1a에 나타낸 바와 같이, sFt의 C-말단에 각각 융합되어 있는 네 개의 마이크로플라스미노겐은 4-fold 대칭으로 뭉쳐져 있었으며, 꽃잎과 유사한 외형을 나타내고 있었고, 6 개의 꽃잎이 나노케이지의 표면에 분산되어 있는 형상이 관찰되었다. sFt의 N-말단에 각각 결합되어 있는 24개의 CLT 펩타이드는 나노케이지의 바깥쪽을 향하여 노출이 되어 있음을 확인할 수 있었다(도 1b). 마이크로플라스미노겐 탑재물은 활성화 절단 위치(Arg-Val)를 보유할 수 있는 방향으로 향하고 있었으며, 촉매적 삼중 아미노산은 케이지의 바깥쪽에 위치하여 접근이 가능한 형태를 취하고 있었다(도 1a).

CLT-sFt-μPg 및 sFt-μPg DCNC를 정제하였고, DLS(differential light scattering)을 수행함으로써 그 특성을 파악하였다(도 2a, 2b). 상기 두 종의 DCNC는 각각 평균 17.9 nm 및 16.1 nm 의 크기를 나타냈으며, 이는 예측 모델에서 예상한 값과 유사한 것이었다. 즉, 두 가지 펩타이드(CLT 및 마이크로플라스미노겐)를 융합하기 위한 변형은 전체적인 케이지의 특성에 별다른 영향을 미치지 않았다는 것을 의미한다.

2. 융합펩타이드 나노 케이지의 혈전용해능 평가

CLT-sFt-μPg DCNC의 혈전용해제로서 효과를 평가하기 위하여 (i) CLT 펩타이드의 혈전-표적능, (ii) 마이크로플라스미노겐, 마이크로플라스민의 혈전-용해능 및 (iii) 항-플라스민(anti-plasmin)에 의한 체성 불활성화 정도를 평가하였다.

이러한 사항들을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 μPg, CLT-결합된 마이크로플라스미노겐(CLT-μPg) 융합 단백질 및 루시퍼라제-결합된 sFt(sFt-Luc) 나노케이지를 대조군으로서 제조하였다(도 3a). 얼려놓았던 신선한 혈장(FFP)에 CaCl2와 트롬빈을 첨가하여 형성된 혈전은 형광기로 표지된 단백질과 함께 인큐베이션 하였고, 결합되지 않은 형광물질을 제거하기 위해 세척을 진행하였다.

현미경 관찰을 위해서, 얇게 겹쳐진 혈전을 유리 플레이트 위에 형성시키고 결합된 단백질을 관찰하였다. CLT가 결합된 생성물들, 즉, CLT-sFt-μPg DCNC 및 CLT-μPg 융합 단백질은 혈전과 함께 분산되어 있었다(도 3b).

본 발명자들은 동일한 몰 농도의 페리틴 모노머 및 유리 단백질을 이용하여 케이지 탑재물들(CLT 및 마이크로플라스미노겐)의 활성이 케이지의 형성에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 확인하였다. 각 구조물의 결합 능력은 형광-표지된 나노케이지 및 단백질을 혈전과 함께 96-웰 플레이트에서 인큐베이션 함으로써 정량화하였다.

그 결과, CLT-sFt-μPg DCNC의 결합력은 CLT-μPg 융합 단백질보다 현저히 높았으며, 이는 곧 나노케이지 표면의 CLT 펩타이드가 케이지 구조에 의한 결합활성 증진에 의해 혈전을 더 높은 친화력으로 표적한다는 것을 의미한다(도 3c, 3d).

CLT-sFt-μPg DCNC, μPg, CLT-μPg 단백질 및 sFt-μPg를 유로키나제를 이용하여 활성화시킨 다음에 96-웰 플레이트에서 혈전과 함께 인큐베이션 하였다. 도 4a에 나타낸 혈전 혼탁도 분석 결과와 같이, 케이지에 탑재된 활성화된 μPn 또는 유리된 형태의 μPn은 혈전을 효과적으로 용해하였으며, 유로키나제 단독과 비교해 더 높은 활성을 나타내었다(도 4a). 샐라인(saline) 그룹에서 혼탁도가 약간 상승한 것은 인큐베이션 하는 시간 동안에 혈전이 천천히 형성되었기 때문이다.

이러한 결과를 통해, 케이지에 탑재된 μPn 또는 유리된 형태의 μPn은 효과적으로 혈전을 용해한다는 것을 알 수 있었다. In vitro 실험상으로는, 케이지에 탑재된 μPn 또는 유리된 형태의 μPn을 혈전과 함께 직접적으로 인큐베이션 하였을 때, CLT는 이들의 용해 활성에 별다른 영향을 미치지 않았다. 하지만, in vivo 상에서는 CLT에 의한 혈전 표적능이 혈전을 용해하는데 필수적이며 매우 중요하다는 것을 이하의 결과를 통해서 확인할 수 있었다.

3. 나노케이지에 의한 마이크로플라스민의 안정화 효과 및 출혈 부작용 확인

본 발명자들은 순환하는 α2-안티플라스민의 양을 모니터링 함으로써, 혈액 내에서 활성화된 μPn 이 안티-플라스민에 의해 분해되는 것을 케이지 단백질 구조가 방어해줄 수 있는지 여부를 확인하였다. 정맥내의 플라스민 또는 마이크로플라스민은 각각 분해되면서 혈액 내 α2-안티플라스민의 양을 감소시킨다는 것이 보고된 바 있다. 따라서, 혈액 내 α2-안티플라스민의 양이 감소한다는 것은 플라스민 또는 마이크로플라스민이 분해되었다는 것을 의미한다.

또한, 임상에서 사용하고 있는 tPA는 체성 출혈을 야기할 수 있다는 문제점이 있다. 이에, 본 발명의 케이지 탑재 마이크로플라스민이 출혈 부작용이 있는지 확인하기 위하여, 마우스 꼬리 끝에 상처를 낸 후, 출혈이 멎는 시간을 측정하였다.

도 4b에 나타낸 바와 같이, 유리된 형태의 μPn을 투여한 경우와 비교하였을 때 활성화된 CLT-sFt-μPn DCNC을 정맥으로 투여한 이후, 순환하는 α2-안티플라스민의 양이 더 천천히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 곧, 케이지에 탑재된 μPn이 항-플라스민에 의해 분해되는 것을 나노케이지 구조가 보호해 줬다는 것을 의미한다.

도 4c에 나타낸 바와 같이, CLT-sFt-μPn와 μPn을 각각 처리한 마우스는 출혈이 멎는 시간이 saline control과 비슷한 정도를 나타내었으나, tPA를 처리한 마우스는 출혈이 멎는 시간이 더 길게 나타났다. 이로써, tPA는 출혈 부작용을 야기할 수 있으나 본 발명의 CLT-sFt-μPn은 μPn와 마찬가지로 출혈 부작용이 없음을 확인하였다. 이로써, 본 발명의 융합펩타이드는 부작용 없는 혈전 용해제로써 유용하게 사용될 수 있다.

4. In vivo 혈전용해능 평가

동맥성 혈전과 정맥성 혈전은 원인, 특성 및 질환의 결과가 서로 다르다. 그렇지만, 상기 두 가지 유형의 혈전은 모두 생명을 위협하는 원인이 될 수 있으며, 신속하게 제거가 되어야 한다.

CLT-sFt-μPg DCNC의 혈전용해제로서의 효과를 in vivo로 확인하기 위해, 동맥성 혈전 마우스 모델에 CLT-sFt-μPg DCNC 및 다른 대조 물질들을 정맥으로 투여하였다.

도 5a에 나타나듯이, 우측 경동맥의 가로 조직학적 절편을 관찰한 결과, 혈관이 5% FeCl₃에 노출이 되었을 때 혈액 덩어리가 혈관을 폐색하는 결과를 나타내었다. 활성화된 CLT-sFt-μPn DCNC을 투여한 결과 동맥의 혈행이 개선되었지만, 활성화된 μPn, CLT-μPn, sFt-μPn 및 유로키나제 단독은 모두 혈액 덩어리를 녹이지 못하거나, 효과가 미비하였다. 또한, 현재 임상에서 사용하고 있는 혈전용해제인 tPA와 그 효과를 비교하였을 때에도 CLT-sFt-μPn의 혈행 개선 효과가 현저히 우수함을 확인하였다.

도 5b에 나타나듯이, 활성화된 CLT-sFt-μPn DCNC의 투여는 상당한 혈전용해/덩어리 파괴 활성을 나타내었다. CLT-sFt-μPn DCNC의 혈전용해 활성은 CLT 부분의 존재로 인한 정확한 in vivo 혈전 표적성으로 인한 것이었다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, CLT-μPn 의 표적성이 실패한 것은 유리 μPn이 케이지화 된 μPn보다 항-플라스민에 의해 더욱 용이하게 활성을 소실하기 때문인 것으로 판단되었다. 또한, tPA과 비교하였을 때에도 CLT-sFt-μPn의 혈전 용해/덩어리 파괴 활성이 현저히 우수함을 확인하였다.

오른쪽 및 왼쪽 경동맥 ex vivo 이미지를 관찰해본 결과, CLT-sFt-μPg DCNC 는 우중간 경동맥에 존재하는 혈전 영역을 매우 특이적으로 표적하는 것으로 나타났다. In vitro 결합 결과와는 대조적으로, CLT-μPg 융합 단백질은 유리 μPg과 마찬가지로 우중간 경동맥에 존재하는 혈전을 표적하는 효과가 나타나지 않았다. 이는 CLT-μPg 융합 단백질의 혈전 용해 활성이 낮았던 이유가 될 수 있을 것이다.

그 다음으로, 본 발명자들은 CLT-sFt-μPg DCNC가 정맥에 존재하는 혈전을 용해하는 활성을 평가하였다. 정맥의 비정상적인 혈전은 혈액이 심장으로 되돌아가는 것을 차단하여 통증과 종창의 발생을 야기한다. 심부정맥 혈전증(deep vein thrombosis)은 다리의 주요 정맥에 혈전이 생기는 유형이다. 이러한 혈전이 떨어져 나와서 순환하다가 심장 또는 폐 혈관을 막게 될 경우 급성 폐 색전증과 같은 상태를 유발하게 된다.

본 발명자들은 도 5c에 나타낸 바와 같이, 랫드의 하대정맥을 수술적으로 차단하여 해당 영역에 현저한 혈전이 형성되도록 하였다. 활성화된 CLT-sFt-μPn DCNC를 처리한 랫드에서는, 샐라인 또는 유리된 μPn를 처리한 랫드와 비교해 크기가 더 작고 무게가 덜 나가는 혈전이 형성되었다(도 5d).

이상의 결과와 같이, 본 발명에 따른 CLT-sFt-μPn DCNC는 플라스민-기반의 새로운 혈전용해용 나노케이지로서 혈전이 존재하는 부위를 표적하는 효과, 순환계에 존재하는 저해제들에 대한 낮은 감수성, 동맥 혈전과 정맥 혈전 모두를 강력하게 파괴하는 약리학적 활성을 지니고 있다.

본 발명에 따른 CLT-sFt-μPn DCNC는 플라스민-기반의 새로운 혈전용해용 나노케이지로서 혈전이 존재하는 부위를 표적하는 효과, 순환계에 존재하는 저해제들에 대한 낮은 감수성, 동맥 혈전과 정맥 혈전 모두를 강력하게 용해하는 약리학적 활성을 지니고 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Fusion peptide comprising clot-targeting peptide, ferritin fragment and thrombolytic peptide and its uses <130> NP16-0126P <150> KR 10-2017-0002588 <151> 2017-01-06 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clot targetting peptide 1 <400> 1 Cys Asn Ala Gly Glu Ser Ser Lys Asn Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clot targetting peptide 2 <400> 2 Cys Gly Leu Ile Ile Gln Lys Asn Glu Cys 1 5 10 <210> 3 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human ferritin light chain fragment (short ferritin) <400> 3 Met Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala 1 5 10 15 Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu 20 25 30 Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val 35 40 45 Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu 50 55 60 Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln 65 70 75 80 Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala 85 90 95 Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu 100 105 110 Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp 115 120 125 Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys 130 135 140 Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly 145 150 155 <210> 4 <211> 161 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human ferritin heavy chain fragment (short ferritin) <400> 4 Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp 1 5 10 15 Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser 20 25 30 Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala 35 40 45 Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg 50 55 60 Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg 65 70 75 80 Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser 85 90 95 Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn 100 105 110 Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro 115 120 125 His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys 130 135 140 Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly 145 150 155 160 Ala <210> 5 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Microplasminogen <400> 5 Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys 1 5 10 15 Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp 20 25 30 Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly 35 40 45 Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu 50 55 60 Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His 65 70 75 80 Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg 85 90 95 Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser 100 105 110 Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser 115 120 125 Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp 130 135 140 Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln 145 150 155 160 Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn 165 170 175 Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly 180 185 190 Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu 195 200 205 Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys 210 215 220 Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val 225 230 235 240 Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn 245 250 <210> 6 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Microplasmin <400> 6 Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile 20 25 30 Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro 35 40 45 Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn 50 55 60 Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu 65 70 75 80 Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val 85 90 95 Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val 100 105 110 Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln 115 120 125 Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile 130 135 140 Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln 145 150 155 160 Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys 165 170 175 Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr 180 185 190 Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn 195 200 205 Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu 210 215 220 Gly Val Met Arg Asn Asn 225 230 <210> 7 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion peptide full length <400> 7 Met Gly Gly Thr Cys Asn Ala Gly Glu Ser Ser Lys Asn Cys Ala Ser 1 5 10 15 Gly His Met Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu 20 25 30 Ala Ala Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr 35 40 45 Tyr Leu Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu 50 55 60 Gly Val Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly 65 70 75 80 Tyr Glu Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile Phe 85 90 95 Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro 100 105 110 Asp Ala Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala 115 120 125 Leu Leu Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu 130 135 140 Cys Asp Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile 145 150 155 160 Lys Lys Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Gly 165 170 175 Ser Glu Phe Val Asp Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ser Ala Ala Pro Ser 180 185 190 Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg 195 200 205 Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val 210 215 220 Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met 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His His His His His 435 440 445 <210> 8 <211> 175 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human ferritin light chain <400> 8 Met Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala 1 5 10 15 Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu 20 25 30 Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val 35 40 45 Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu 50 55 60 Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln 65 70 75 80 Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala 85 90 95 Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu 100 105 110 Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp 115 120 125 Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys 130 135 140 Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Pro Glu Ala 145 150 155 160 Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp 165 170 175 <210> 9 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human ferritin heavy chain <400> 9 Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp 1 5 10 15 Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser 20 25 30 Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala 35 40 45 Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg 50 55 60 Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg 65 70 75 80 Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser 85 90 95 Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn 100 105 110 Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro 115 120 125 His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys 130 135 140 Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly 145 150 155 160 Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu 165 170 175 Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser 180

Claims (12)

1. (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 혈전-표적성 펩타이드(clot-targeting peptide); (b) 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드; 및 (c) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 마이크로플라스미노겐(microplasminogen) 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 마이크로플라스민(microplasmin) 펩타이드가 차례로 연결된 융합 펩타이드.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 (a)의 혈전-표적성 펩타이드는 (b)의 펩타이드 N-말단에 연결되어 있으며, 상기 (c)의 마이크로플라스미노겐 또는 마이크로플라스민 펩타이드는 (b)의 펩타이드 C-말단에 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 (a)의 혈전-표적성 펩타이드는 또는 (c)의 마이크로플라스미노겐 또는 마이크로플라스민 펩타이드는 (b)의 펩타이드에 링커를 통해 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 융합 펩타이드는 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 융합 펩타이드.
   
7. 제1항, 제2항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항의 융합 펩타이드로 이루어진 케이지(cage) 단백질.
   
8. 제1항, 제2항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항의 융합 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
   
9. 제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
   
10. 제9항의 발현벡터로 형질전환된 숙주세포.
    
11. 제1항, 제2항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항의 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈전성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    
12. 제11항에 있어서, 상기 혈전성 질환은 급성 심근 경색증, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 급성 말초 동맥 폐쇄증, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증, 협심증, 뇌경색 및 중심 망막정맥 폐쇄로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.

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