상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 제공한다.
(X)n-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Pro-Gln-Cys-(X)n
여기서, X는 Arg-Gly-Asp(RGD)를 나타내고, n은 0 내지 2의 정수이다.
또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 이용하여 DNA를 세포 또는 조직 내로 전달하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
펩타이드는 상대적으로 크기가 작고 독성이 적을 뿐 아니라, DNA에 가역적으로 결합하고 DNA를 응축하기 때문에, 세포 또는 조직 내 전달물질로 유용할 것으로 예상되고 있다.
HIV-1 Tat 단백질은 86개의 아미노산 잔기를 가지고 있고, 상기 단백질을 암호화하는 HIV-1 Tat 유전자는 두 개의 엑손으로 구성되어 있으며, 상기 HIV-1 Tat 단백질의 아미노산 서열 1-72는 엑손 1에 의해 암호화되고, 73-86의 아미노산 서열은 엑손 2에 의해 암호화된다. 또한 HIV-1 Tat 단백질은 2개의 라이신(lysine)과 6개의 아르기닌(arginine)을 포함하는 아미노산 서열 49-57이 기본구역이며, 이 부분이 세포 핵 위치결정(nuclear localization)에 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Eric Viveset al., J. Biol. Chem.272(25):16010-16017,1997).
이에 본 발명자들은 HIV-1 tat 단백질 중 NLS(nuclear localization sequence) 기능에 중요한 역할을 담당하는 아미노산 서열을 포함하는 12개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 기본 서열로 하여 상기 펩타이드의 N-말단과 C-말단에 몇몇 다른 특성의 아미노산을 부가함으로써 구조적 및 기능적으로 좀 더 유용한 형태의 펩타이드를 제작하였다. 본 발명은 이렇게 제작한 펩타이드를 제공하는 데 특징이 있으며, 상기 펩타이드의 서열을 하기 일반서열로 표시하였다.
(X)n-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Pro-Gln-Cys-(X)n
여기서, X는 Arg-Gly-Asp(RGD)를 나타내고, n은 0 내지 2의 정수이다.
한편, 상기 일반서열로 표시되는 아미노산 서열에서 제조될 수 있는 구체적인 펩타이드를 서열번호 2 내지 4에 나타내었다. 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드, 세포 또는 조직 내로 전달하고자 하는 DNA 및 양이온 리포좀의 삼중복합체를 이용하여 DNA를 세포 또는 조직 내로 전달한다는 점에 특징이 있다. 상기 양이온 리포좀으로는 당업계에서 통상적으로 사용되고 있는 리포펙틴(lipofectin), 올리고펙틴(oligofectin), DMRIE-CTM, 리포펙타민(lipofectamine), 리포펙타민 플러스TM(lipofectamine plusTM), 리포펙타민TM2000 등을 사용할 수 있으나, 보다 바람직하게는 리포펙타민(이하 'LFA'라 한다) 또는 DOTAP:DOPE=1:1의 혼합체(이하, 'D-P'라 한다)를 사용하는 것이 바람직하다. 그 외에도 음이온 리포좀 및 중성 리포좀 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 펩타이드를 이용한 세포 또는 조직 내로의 DNA 전달은 상기 펩타이드, 세포 또는 조직 내로 전달하고자 하는 DNA 및 양이온 리포좀을 혼합하여 복합체를 제조한 후, 상기 복합체를 DNA를 전달하고자 하는 세포와 혼합하여 함께 배양하거나, 조직에 주입함으로써 이루어질 수 있으며, 상기 펩타이드, DNA 및 리포좀의 혼합순서는 필요에 따라 변경될 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체는 혈청과 항생제가 포함되지 않은 배양액 또는 PBS 완충용액 상(0.15M NaCl 첨가됨)에서 본 발명에서 제조한 서열번호 2 내지 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 중에서 선택되는 어느 하나의 펩타이드 및 양이온 리포좀을 세포 내로 전달하고자 하는 DNA와 적절한 비율로 혼합함으로써 제조될 수 있으며, 1 ~ 10 : 1 : 1 ~ 10의 비율로 혼합하는 것이 바람직하다. 특히 양이온 리포좀으로 LFA 또는 D-P 리포좀을 사용할 경우 복합체의 혼합비율은 3 ~ 5 : 1 : 3 ~ 6이 바람직하다. 또한 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 DNA는 크기(size)와 형태에 제한없이 사용될 수 있으나, 올리고뉴클레오티드 형태의 DNA인 경우에는 15 bases 내지 120 bases를 사용하는 것이 바람직하고, 플라스미드 벡터 형태의 DNA인 경우에는 3 kb 내지 8 kb의 크기인 것이 바람직하다. 구체적으로 본 발명에서는 본 발명에 따른 펩타이드의 세포 내 전달 효율을 보다 효율적으로 측정하기 위해, 루시퍼라제 유전자,LacZ(β-galactosidase) 유전자 및 GFP(green fluorescence protein) 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 및 FITC-표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 나아가 본 발명의 방법을 적용할 수 있는 세포주 또는 조직은 그 종류에 관계없이 광범위하게 사용될 수 있으나, 보다 바람직하게는 암 또는 질환과 관련된 세포 또는 조직이 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
세포배양
본 발명에 사용된 세포주는 하기 표 1에 기재된 바와 같다.
세포주명 |
특성 |
구입처 |
K562 |
chronic myelogenous leukemia |
한국세포주은행(KCLB, Korea) |
HeLa |
cervix adenocarcinoma |
HeLaRC32 |
cervix adenocarcinoma |
HL-60 |
acute promyelocytic leukemia |
HT-29 |
colon adenocarcinoma |
MCF-7 |
breast cancer |
Hep3B |
liver carcinoma |
A549 |
lung carcinoma |
NCI-H1299 |
lung carcinoma |
WI-38VA13 |
normal lung |
293 |
human embryonic kidney cell |
Microbix사 (Canada) |
WRT7/P2 |
monocyte/macrophage cell line |
Dr. Yagita (Juntendo University, Japan) 실험실에서 분양 받음 |
본 발명에서 사용된 모든 세포들을 RPMI 1640, EMEM(JBI, Korea, Daegu) 등의 배양액에 10% 열-불활성화된 FBS(heat-inactivated fetal bovine serum)(JBI ; Hyclone, USA)와 2mM L-글루타민(glutamine), 100units/㎖ 페니실린(penicillin), 그리고 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin, JBI)을 첨가하여 37℃, 5% CO2세포 배양기에서 배양하였다. 또한 배양 과정에서 적정한 세포 농도를 유지하도록 유의하였으며, 실험에 사용될 세포는 전날 신선한 배양액으로 교체한 후, 실험 당일 0.4% 트리판 블루(trypan blue)로 생존도를 확인한 다음 사용하였다.
<실시예 2>
Tat-C 펩타이드, DNA 및 양이온 리포좀 제작
2-1) Tat-C 펩타이드 제작
HIV-1 바이러스의 Tat 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 서열번호 1로 표시되는 49-60의 아미노산 서열의 C-말단에 시스테인(Cys)을 부가하여 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 제작하였으며, 이를 'Tat-C 펩타이드'라 명명하였다. 이 때 상기 펩타이드는 당업계에 알려진 공지의 방법에 따라 합성할 수 있으며, 구체적으로 본 발명에서는 애니젠(Anygen Inc., Korea) 사에 주문제작하였다. 이후, C18 컬럼을 이용하여 상기 합성된 펩타이드를 정제한 후, HPLC(Shimadzu, Japan) 및 말디-ToF-매스(Maldi-ToF-mass; ABI, USA)를 통해 95% 이상의 순도 및 분자량을 확인하였다. 또한 대조구로 사용된 펩타이드(Sc-Tat)는 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 Tat 펩타이드를 무작위로 배열하여 제작하였으며, 상기 Sc-Tat 펩타이드의 아미노산 서열을 서열번호 5로 나타내었다.
2-2) 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 DNA 제작
본 발명에 따른 펩타이드의 DNA 전달 효율을 조사하기 위해, 리포터 유전자로 루시퍼라제 유전자,LacZ(β-갈락토시다제) 유전자 및 GFP 유전자를 사용하였다. 상기 루시퍼라제 유전자를 pGEM-luc 벡터(Promega)에서 분리하여 이를 pcDNA3 벡터(Invitrogen) 내의BamHⅠ-XhoⅠ 부위에 클로닝하였으며, 이를 pcDNA3-luc 벡터( 7 kb)라 명명하였고, 상기LacZ유전자를 pHook-2 LacZ 벡터(Invitrogen)에서 분리하여 pcDNA3 벡터(Invitrogen) 내의HindⅢ-BamHI 부위에 클로닝하였으며, 이를 pcDNA3-LacZ 벡터(8 kb)라 명명하였다. 또한 GFP 유전자를 포함하는 벡터로는 pEGFP-NI 벡터(5 kb, Clontech)를 사용하였다.
2-3) 양이온 리포좀 제작
양이온 리포좀으로는 리포펙타민(LFA; life technologies Inc., USA)과 본 발명에서 자체 제작한 DOTAP:DOPE=1:1 혼합체(D-P)를 사용하였다. 상기 D-P 리포좀은 다음과 같이 제조하였다. 먼저, CHCl3에 녹아 있는 50㎎/㎖의 DOTAP(N-1(-(2,3-dioleoyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammoniumethyl sulphate; Avanti? Polar Lipids, Inc. USA)과 50㎎/㎖의 DOPE (Dioleoylphosphatidyl-ethanolamine, Avanti?Polar Lipids, Inc. USA)를 1:1로 혼합한 다음, 증발기(evaporator)를 이용하여 필름(film)을 만든 후 건조하였다. 이후, 10㎖의 0.15M 살린(saline)에 용해시켜 리포좀이 형성되도록 하였다. 그리고 나서, 상기 생성된 리포좀을 볼텍싱(vortexing) 및 소니케이션(sonication)을 수행한 후, 100nm의 미니-엑스트루더(Mini-Extruder; Avanti?Polar Lipids, Inc. USA, Alabaster)를 10회 통과시켜 D-P 리포좀을 제조하였다.
<실시예 3>
Tat-C 펩타이드-DNA-양이온 리포좀의 삼중 복합체 제작 및 DNA 전달 효율
조사
3-1) Tat-C 펩타이드-DNA-D-P 리포좀의 삼중 복합체의 DNA 전달 효율
상기 실시예 2에서 제조된, 루시퍼라제 유전자가 삽입된 pcDNA3-luc 벡터 DNA, Tat-C 펩타이드 및 D-P 리포좀을 혼합하여 Tat-C 펩타이드-DNA-D-P 리포좀의 삼중 복합체를 제조하였다. 이 때 Tat-C 펩타이드:DNA:D-P 리포좀의 혼합비율(w/w)을 3:1:5로 하였다. 먼저, 상기 DNA와 Tat-C 펩타이드를 50㎕ OPTI-MEM 배양액에 혼합하여 5분간 반응시킨 후, D-P 리포좀이 용해된 50㎕ OPTI-MEM 배양액을 첨가하여 10분간 반응시킨 다음, 이를 K562 세포주에 가하여 5시간 동안 배양시켰다. 이후, 20% FBS가 포함된 OPTI-MEM을 300㎕씩 첨가하여 다시 16시간 배양한 후, 세포 내의 루시퍼라제 유전자의 발현을 조사하였다. 상기 루시퍼라제 유전자 발현은 루시퍼라제 어세이 시스템 킷트(Luciferase Assay System kit; Promega, USA)를 사용하여 발현된 루시퍼라제 활성을 하기와 같이 측정하였다.
배양이 끝난 세포주를 PBS(Mg2+and Ca2+가 첨가되지 않은 것임) 완충용액으로 2회 세척하고, 1×CCLR(Cell culture Lysis Reagent, 25mM Tris-phosphate (pH 7.8), 2mM DTT, 2mM 1,2-diaminocyclohexane-N,N,N',N'-tetracacetic acid, 10% glycerol, 1% Triton?X-100)을 100㎕/well씩 가하여 세포를 용해(lysis)시킨 후, 12,000g로 1분간 원심분리하여 세포의 잔해를 제거하였다. 이후, 원심분리하여 얻어진 50㎕ 상층액(supernatant)에 루시퍼라제 어세이 시약(Luciferase Assay reagent) 20㎕를 첨가한 다음, 루미노미터(luminometer; Berthold detection systems, Sirius, Germany)를 사용하여 루시퍼라제 활성을 10초간 측정하였다. 이 때 대조구는 본 발명에 따른 Tat-C 펩타이드를 첨가하지 않고 D-P 리포좀만을 사용하여 DNA를 세포 내로 트랜스펙션한 것이다. 그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, D-P 리포좀을 단독으로 사용했을 때(대조구)보다 본 발명에 따른 Tat-C 펩타이드를 함께 사용하였을 때 루시퍼라제 활성이 현저하게 증가함을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명에 따른 Tat-C 펩타이드가 DNA를 세포 내로 전달하는 효율적인 매개체라는 것을 보여주는 것이다.
3-2) Tat-C 펩타이드-DNA-LFA의 삼중 복합체의 DNA 전달 효율
양이온 리포좀으로 리포펙타민(LFA)을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 3-1)과 동일한 방법에 따라 실시하여 Tat-C 펩타이드-DNA(pcDNA3-luc 벡터)-LFA 리포좀의 삼중 복합체를 제조하였으며, 제조사(life technologies Inc., USA)의 권장방법에 따라 K562 세포주에 트랜스펙션하여 루시퍼라제의 활성을 조사하였다. 그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, LFA 리포좀을 단독으로 사용했을 때(대조구)보다 본 발명에 따른 Tat-C 펩타이드를 함께 사용하였을 때 루시퍼라제 활성이 현저하게 증가함을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명에 따른 Tat-C 펩타이드가 DNA를 세포 내로 전달하는 효율적인 매개체라는 것을 보여주는 것이다.
<실시예 4>
혼합순서에 따른 Tat-C 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체의 세포 내 DNA 전달 효율 조사
Tat-C 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체 제조시 혼합순서를 달리하여 각복합체를 제조한 후, 상기 복합체를 K562 세포주 내로 트랜스펙션시켰다. 이 때 리포좀으로는 LFA를 사용하였다. 이후, 상기 실시예 3-1)과 동일한 방법에 따라 실시하여 루시퍼라제 활성을 조사하였다. 그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, Tat-C 펩타이드를 DNA와 먼저 혼합한 다음, 이후 리포좀(LFA)을 혼합하여 복합체를 제조하였을 때 루시퍼라제 활성이 현저하게 높음을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드-DNA-양이온 리포좀의 삼중 복합체 제조의 최적 혼합순서는 펩타이드를 DNA와 먼저 혼합한 후, 상기 펩타이드-DNA 혼합물에 리포좀을 혼합하는 것이다.
<실시예 5>
혼합비율에 따른 Tat-C 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체의 세포 내 DNA 전달 효율 조사
Tat-C 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체 제조시 혼합비율에 따른 세포 내 DNA 전달 효율을 조사하기 위해, 펩타이드 및 리포좀의 혼합비율을 달리하여 각 복합체를 제조한 후, 상기 복합체를 K562 및 HeLa 세포주 내로 트랜스펙션시켰다. 이 때 리포좀으로는 D-P 및 LFA 리포좀을 사용했으며, DNA로는 루시퍼라제 유전자가 삽입된 pcDNA3-luc 벡터를 사용하였다. 또한, 상기 복합체의 혼합비율은 펩타이드 : 리포좀 = 2 ~ 5 : 2 ~ 6(K562 세포주) 및 3 ~ 4 : 3 ~ 5(HeLa 세포주)로 하였으며, DNA는 1로 하였다. 대조구로는 본 발명에 따른 Tat-C 펩타이드를 첨가하지 않고 리포좀만을 단독으로 사용하였다(Tat-C 펩타이드 : 리포좀 = 0 : 4). 이후, 상기 실시예 3-1)과 동일한 방법에 따라 실시하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, K562 세포주에서는 혼합비율에 따라 루시퍼라제 활성(세포 내 DNA 전달 효율)이 다소 차이가 있었으나, 거의 모두 대조구보다 현저하게 향상된 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히, 리포좀의 비율이 펩타이드 비율과 동량이거나 높은 경우 높은 루시퍼라제 활성을 나타냄을 볼 수 있었다. D-P의 경우에는 펩타이드 : 리포좀 = 3 : 3 또는 4 : 4 ~ 6일 때 높은 활성을 나타내었으며(도 3의 A), LFA의 경우에는 펩타이드 : 리포좀 = 3 ~ 5 : 5 ~ 6인 경우 높은 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 3의 B). 또한, 도 4에 도시된 바와 같이, HeLa 세포주에서도 유사한 양상을 나타남을 확인할 수 있었다. 특히 D-P의 경우에는 펩타이드 : 리포좀 = 4 : 4일 때 가장 높은 활성을 나타내었으며(도 4의 A), LFA의 경우에는 펩타이드 : 리포좀 = 3 ~ 4 : 5인 경우 가장 높은 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 4의 B).
<실시예 6>
본 발명에 따른 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체 제조시 pH에 따른 DNA 전달 효율 조사
펩타이드, DNA 및 리포좀이 배양액상에서 혼합될 때 배양액의 pH가 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체에 의한 세포 내 DNA 전달에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해, 혈청과 항생제가 포함되지 않은, pH 5.0 내지 8.0 범위내의PBS와 OPTI-MEM(-)를 사용하여 실험을 수행하였다. pH 5.0 내지 6.0의 용액은 PBS로, pH 6.5 내지 pH 8.0의 용액은 OPTI-MEM(-)로 제조하여 각각의 pH의 용액에서 제작된 펩타이드-DNA(pcDNA3-luc 벡터)-리포좀의 삼중복합체를 HeLa 세포주에 트랜스펙션시킨 후, 루시퍼라제 활성을 조사하였다. 이 때 펩타이드로는 Tat-C 펩타이드를 사용하였으며, 리포좀으로는 D-P 및 LFA 리포좀을 사용하였다. 또한, 펩타이드-DNA-리포좀 복합체의 혼합비율은 D-P 리포좀의 경우에는 펩타이드 : DNA : D-P = 3 : 1 : 3으로 하였고, LFA 리포좀의 경우에는 펩타이드 : DNA : LFA = 3 : 1 : 5로 하였다.
그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, 대부분의 pH에서 높은 루시퍼라제 활성을 보였으며, 특히 pH 6.0 내지 7.5에서 가장 높은 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이는 펩타이드, DNA 및 리포좀 각각이 갖는 고유의 전하에 따라 정전기적 결합에 의해 복합체가 형성되기 때문에 강산이나 강염기의 pH에서는 전하에 영향을 주어 결국 복합체 형성에 영향을 주기 때문이라 사료된다.
<실시예 7>
세포주에 따른 세포 내 DNA 전달 효율 조사
K562 및 HeLa 세포주 외에 7종류의 다양한 세포주 293, HT-29, MCF-7, A549, NCI-H1299, WI-38VA13 및 Hep3B) 및 복합체의 혼합비율에 따른 DNA 전달 효율을 조사하였다. 먼저, 본 발명에 따른 Tat-C 펩타이드, DNA(pcDNA3-luc 벡터) 및 리포좀 복합체를 혼합비율을 달리하여 제조한 후, 상기 실시예 3-1)과 동일한 방법에따라 각 세포주에 트랜스펙션하여 루시퍼라제 활성을 조사하였다. 그 결과, Tat-C 펩타이드-DNA-D-P 리포좀의 삼중 복합체의 경우, 도 6에 도시된 바와 같이, 각 세포주마다 혼합비율에 따라 루시퍼라제 활성(세포 내 DNA 전달 효율)은 다소 차이를 나타내었으나, 본 발명에 따른 복합체를 이용했을 때 모든 세포주에서 D-P 리포좀만을 단독으로 사용했을 때에 비해 현저히 높은 루시퍼라제 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, Tat-C 펩타이드-DNA-LFA 리포좀의 삼중 복합체의 경우에도, 도 7에 도시된 바와 같이, 상기 Tat-C 펩타이드-DNA-D-P 리포좀의 삼중 복합체의 경우와 유사한 양상을 나타내었으며, LFA 리포좀만을 단독으로 사용했을 때보다 현저히 높은 루시퍼라제 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명에 따른 방법이 세포주에 제한을 받지 않고, 광범위한 세포주에서 우수한 DNA 전달 효율을 나타냄을 알 수 있다.
<실시예 8>
DNA로 FITC-올리고뉴클레오티드를 사용했을 때의 세포 내 DNA 전달 효율 조사
상기 실시예 2-2)에서 제작한 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 DNA 외에 다른 형태의 DNA의 세포 내 전달 효율을 알아보기 위하여 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 양끝에 FITC가 표지된, 서열번호 6으로 표시되는 올리고뉴클레오티드(FITC-labeled oligonucleotide)(GenoTech Inc., Korea)를 Tat-C 펩타이드 및 LFA 리포좀과 복합체를 제조하여 이를 쥐의 단핵구 세포인 WRT7/P2 세포주에 트랜스펙션시킨 후, FITC의 형광을 조사하였다. 그 결과, 도 8에 도시된 바와 같이, Tat-C 펩타이드-DNA-LFA 리포좀과 복합체의 경우 LFA 리포좀만을 단독으로 처리했을 때보다 매우 강한 형광을 나타냄을 볼 수 있었다. 이는 본 발명에 따른 펩타이드를 이용할 경우 세포 내로 플라스미드 DNA 뿐 아니라 안티센스, 올리고 기만체(decoy),라이보자임 등을 포함한 올리고뉴클레오티드 형태의 DNA도 매우 잘 전달할 수 있다는 것을 보여주는 결과이다. 즉, 본 발명에 따른 펩타이드-DNA-리포좀 복합체가 DNA의 형태에 제한을 받지 않고 어떤 형태의 DNA도 세포 내로 잘 전달하는 매우 효율적인 유전자 전달 시스템으로 유용하게 이용될 수 있음을 보여주는 결과이다.
<실시예 9>
변형된 Tat-C 펩타이드의 DNA 전달 효율 조사
9-1) 변형된 Tat-C 펩타이드 제작 및 세포 내 DNA 전달 효율 조사
상기 실시예 2-1)에서 제조한 Tat-C 펩타이드의 N-말단과 C-말단에 각각 RGD 아미노산 서열을 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 부가하여 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 제작하였으며, 이를 'RGD-Tat-C-RGD 펩타이드'라 명명하였다. 또한 상기 Tat-C 펩타이드의 C-말단에 RGD 아미노산 서열을 2개 부가하여 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 제작하였으며, 이를 'Tat-C-RGD-RGD 펩타이드'라 명명하였다. 이후, 상기 제작된 두 펩타이드와 상기 실시예 2-1)에서 제작된 펩타이드를 이용하여 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체를 제조하였다. 이 때, DNA로는 루시퍼라제 유전자가 삽입된 pcDNA3-luc 벡터를 사용하였으며, 리포좀으로는 D-P 리포좀을 사용하였다. 또한, 상기 복합체의 혼합비율은 펩타이드 : DNA : D-P 리포좀 = 4 : 1 : 4로 하였다. 이후, 상기 각 복합체를 HeLa 세포주 및 K562 세포주에 트랜스펙션시킨 후, 상기 실시예 3-1)과 동일한 방법에 따라 실시하여 각 세포주에서 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
그 결과, HeLa 세포주의 경우, 도 9a에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드들, 즉 Tat-C 펩타이드(서열번호 2), RGD-Tat-C-RGD 펩타이드(서열번호 3) 및 Tat-C-RGD-RGD 펩타이드(서열번호 4)의 경우 대조구인 변형되지 않은 온전한 Tat 펩타이드(서열번호 1) 및 상기 Tat 펩타이드의 아미노산 서열을 무작위로 배열한 Sc-Tat 펩타이드(서열번호 5)에 비해 현저하게 높은 루시퍼라제 활성을 보임을 확인할 수 있었다. 또한, K562 세포주의 경우도, 도 9b에 도시된 바와 같이, 상기 HeLa 세포주의 경우에서와 유사한 양상을 나타냄을 확인할 수 있었다.
도 9a 및 도 9b에서 NLS 기능이 있다고 알려진 아미노산 서열인 상기 변형되지 않은 온전한 Tat 펩타이드(서열번호 1)가 상기 NLS 기능을 억제하도록 무작위로 배열된 상기 Sc-Tat 펩타이드(서열번호 5)와 세포 내 DNA 전달 효율에 있어서 별다른 차이를 나타내지 않음을 볼 때, 본 발명에 따른 세포 내 DNA 전달 효율의 증가는 상기 Tat 펩타이드의 NLS 기능에 기인하는 것이 아니라, 본 발명에서 제작한 펩타이드들이 DNA의 세포 내 전달 효율을 증가시킨 것에 기인하는 것임을 알 수 있다.
9-2) GFP 발현을 통한 본 발명에 따른 펩타이드의 세포 내 DNA 전달 효율 조사
상기 9-1)에서 사용한 루시퍼라제 유전자 외에 다른 리포터 유전자인 GFP 유전자를 사용하여 본 발명에 따른 펩타이드(Tat-C 펩타이드 및 변형된 Tat-C 펩타이드들)의 세포 내 DNA 전달 효율을 재확인하였다. 먼저, DNA로 상기 실시예 2-2)에서 제조한 GFP 유전자가 삽입된 벡터를 사용하여 상기 실시예 3-1)과 동일한 방법에 따라 펩타이드-DNA-D-P 리포좀의 삼중 복합체를 제조한 후, 이를 세포주(HL-60 및 K562)에 트랜스펙션시킨 다음, GFP의 발현을 조사하였다. GFP의 발현은 배양이 끝난 세포주를 PBS 완충용액으로 2회 세척한 후, 형광 현미경(Leica, Germany)을 이용하여 측정하였다. 그 결과, HL-60 세포주의 경우, 도 9c에 도시된 바와 같이, Sc-Tat 펩타이드에 비해 본 발명에 따른 펩타이드가 약 5 내지 7배 이상의 GFP 발현을 보임을 확인할 수 있었으며, 도 9d에 도시된 바와 같이 K562 세포주의 경우도 유사한 GFP 발현 양상을 나타내었다. 이 결과는 상기 실시예 9-1)의 루시퍼라제 활성 조사 결과와 동일한 결과이다.
<실시예 10>
본 발명에 따른 펩타이드의 코트랜스펙션(cotransfection) 효율 조사
본 발명에 따른 펩타이드의 코트랜스펙션 효율을 조사하기 위해 재조합 AAV생성에 필요한 세 종류의 플라스미드 트랜스진, ACP-luc, XX2 및 XX6을 이용하여 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체를 제조하였다. 재조합 AAV 생성에 필요한 세종류의 플라스미드는 하기 표 2에 기재하였다.
플라스미드 DNA |
특성 |
구입처 |
ACP-luc |
양쪽 끝에 ITR을 가지고 그 사이에 CMV promoter와 luciferase 유전자, BGH를 가짐 |
성균관대학교 의과대학 김덕경교수(삼성의료원) 실험실 |
XX2 |
cap ORF와 rep ORF를 가짐 |
The University of North Carolina at Chapel Hill |
XX6 |
E1A, E1B, E2A, E4, VA를 가짐 |
10-1) 코트랜스펙션 후 루시퍼라제 활성 측정
트랜스펙션을 수행하기 24시간 전에, 293 세포주를 6-well plate 상에 7×105cells/well로 분주하여 CO2배양기(incubator)에서 배양하였다. 다음 날 OPTI-MEM(-)로 세포를 한번 씻어 준 다음 1㎖의 OPTI-MEM(-)을 세포에 첨가하였다. 이후, 상기 실시예 2-1)에서 제작한 Tat-C 펩타이드와 상기 표 2에 기재된 세 가지의 플라스미드의 혼합액(ACP-luc : XX2 : XX6 = 1 : 1 : 3(w/w))을 각각 3:1, 4:1 및 5:1 (w/w)의 비율로 혼합하여 실온에서 5분 반응시켰다. 이후, D-P 리포좀을 상기 플라스미드 혼합액(DNA)의 5배에 해당하는 양으로 첨가하여 실온에서 10분간 더 반응시켰다. 그리고 나서, 상기 펩타이드-3개의 DNA-리포좀의 복합체를 293 세포주에 넣고, 37℃, CO2배양기에서 6시간 반응시킨 다음, 다시 EMEM(+)을 1㎖ 첨가하여 24시간 배양하였다. 이 때 대조구는 상기 3개의 플라스미드 DNA를 칼슘-인산염 침전법(calcium phosphate precipitation)에 따라 세포에 트랜스펙션시킨 것이다.
그 결과, 도 10a에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드-DNA-리포좀의복합체를 사용하여 코트랜스펙션한 경우가 대조구에 비해 높은 루시퍼라제 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
10-2) 재조합 AAV의 생성에 의한 DNA 전달 효율 조사
상기 도 10a에서 도시된 루시퍼라제 활성은 상기 3개의 플라스미드 중에서 ACP-luc 플라스미드만이 트랜스펙션되어도 활성을 나타낼 수 있다. 그러나, 재조합 AAV는 상기 3개의 플라스미드가 모두 함께 코트랜스펙션되어야만 생성될 수 있고, 또한 세포 내로 전달된 유전자들이 활성을 나타내기 위해서는 상기 유전자들의 세포 핵 내로의 이동이 필수적이다. 따라서, 상기 ACP-luc 유전자를 갖는 AAV가 인펙션된 세포의 루시퍼라제 활성을 조사하여 간접적으로 AAV 생성을 조사할 수 있다.
먼저, 상기 실시예 10-1)와 동일한 방법에 따라 트랜스펙션을 실행하고 72시간이 지난 다음, 293 세포를 수확하여 37℃ 항온수조와 액체 질소에서 3-4회 정도 해동(thawing)과 냉동(freezing)을 반복하여 상기 세포를 파괴시켰다. 이후, 파괴된 세포를 1,000g에서 2분간 원심분리하여 상층액을 야생형의 아데노바이러스(50moi)와 함께 HeLaRC32 세포에 코인펙션시켰다. 24시간 후, 세포 라이시스 용액을 사용하여 세포를 수확한 다음, 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 이 때 대조구는 칼슘-인산염 침전법(calcium phosphate precipitation)에 따라 상기 3개의 플라스미드를 세포에 트랜스펙션하여 상기와 동일한 방법에 따라 야생형 아데노바이러스와 함께 HeLaRC32 세포주에 코인펙션시킨 것이다. 그 결과, 도 10b에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중복합체를 이용하여 코트랜스펙션한 경우 대조구에 비해 높은 루시퍼라제 활성을 나타내었으며, 특히 상기 복합체의 혼합비율이 4:1:5일 때 가장 높은 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 이는 재조합 AAV 생성에 필요한 3개의 플라스미드가 모두 세포 내로 코트랜스펙션되어 이로부터 AAV가 생성되었음을 보여주는 결과이다. 나아가, 이로부터 본 발명에 따른 펩타이드를 이용하여 하나 이상의 DNA를 동시에 세포 내로 효율적으로 전달할 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 11>
본 발명에 따른 펩타이드의 세포 내 DNA 전달 효율에 있어서 혈청(serum)이 미치는 영향 조사
본 발명에 따른 펩타이드를 이용한 DNA 전달에 있어서 혈청이 미치는 영향을 조사하기 위해, 본 발명에 따른 Tat-C 펩타이드-DNA(pcDNA3-luc)-D-P 리포좀의 삼중복합체를 HeLa 및 K562 세포주에 각각 트랜스펙션하여 배지 내 10% FBS의 존재 유(FBS+), 무(FBS-)에 따른 DNA 전달 효율을 조사하였다(도 11의 A 및 B). 이 때 대조구로는 DNA와 리포좀만의 복합체를 사용하였다. 그 결과, 도 11에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체의 경우 혈청을 포함하는 배지(FBS+)에서 현저히 높은 루시퍼라제 활성을 보임을 확인할 수 있었다.
또한 DNA로 상기 실시예 2-2)에서 제조한 β-갈락토시다제 유전자가 삽입된 pcDNA3-LacZ 벡터를 사용하여 실험을 수행한 결과, 도 12 및 도 13에 도시된 바와같이, 도 11에 도시된 바와 같은 발현 양상을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명에 따른 펩타이드를 사용한 유전자 전달 시스템이 시험관 내 뿐 아니라 생체 내에도 적용될 수 있는 가능성을 보여주는 것이다.
<실시예 12>
본 발명에 따른 펩타이드의 생체 내에서의 DNA 전달 효율 조사
본 발명에 따른 펩타이드-DNA-D-P 리포좀의 삼중 복합체의 생체 내 DNA 전달 효율을 조사하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 6주령의 수컷 SD(Sprague-Dawley) 백서(200-250g)를 SLC(Japan)에서 구입하여 사육하였으며, 실험 전 기간 동안 펠렛형 고형사료로 사육하였다. 펜토바비탈(5㎎/100g 체중)을 백서의 복강에 주사하여 마취한 후, 복부를 절개하여 왼쪽 신장의 요관을 노출시켰다. 이후, 24 게이지 카테터(guage catheter)를 사용하여 상기 노출된 왼쪽 신장의 요관을 통해 Tat-C 펩타이드-DNA(pcDNA3-LacZ 벡터)-D-P 리포좀의 삼중 복합체(4:1:4)를 주입하였다. 24시간 후에 상기 백서로부터 신장을 적출하였다. 일렉트로닉 크리오톰(Electronic Cryotome?, Shandon, UK)을 이용하여 신장을 10㎕의 두께로 동결절단(cryosection)한 후, 폴리-프랩 슬라이드(Poly-Prep™, Sigma)에 부착시켰다. 그리고 나서, 4% 파라포름알데히드에 5분 동안 고정시킨 후, X-gal 용액(1.5 mM potassium ferricyanide, 1.5 mM potassium ferrocyanide, 1% X-gal)에 담가 16시간 동안 CO2배양기에서 반응시켰다. 이후, 염색된 조직은헤마톡실린(hematoxylin)으로 대조 염색한 후 400배의 배율로 현미경하에서 관찰하였다.
그 결과, 도 14에 도시된 바와 같이, 대조구인 DNA-리포좀의 이중복합체(도 14의 B 및 E)를 처리한 신장 및 아무것도 처리하지 않은 신장(도 14의 C 및 F)과 비교할 때에 본 발명에 따른 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체 처리구 신장(도 14의 A 및 D)에서만 β-갈락토시다제 활성이 있음을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명에 따른 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중복합체는 시험관 내 뿐 아니라 생체 내에서도 우수한 DNA 전달 효율을 나타낸다는 것을 알 수 있다.