KR100468316B1 - Dna의 세포 또는 조직 내 전달 효율을 높이는 펩타이드 - Google Patents

Dna의 세포 또는 조직 내 전달 효율을 높이는 펩타이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 DNA의 세포 또는 조직 내 전달 효율을 높이는 펩타이드 및 이를 이용하여 DNA를 세포 또는 조직 내로 전달하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 하기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 이를 이용하여 DNA를 세포 또는 조직 내로 전달하는 방법에 관한 것이다.
(X)n-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Pro-Gln-Cys-(X)n
여기서, X는 Arg-Gly-Asp(RGD)를 나타내고, n은 0 내지 2의 정수이다.
본 발명에 따른 펩타이드는 세포 또는 조직 내로 DNA를 전달하는 데 있어서, 기존의 양이온 리포좀이 갖는 DNA 전달 한계를 극복할 수 있는 매우 뛰어난 전달 매개체로서 유용하게 이용될 수 있으며, 세포 또는 조직 내로 전달하고자 하는 DNA 및 리포좀과 단순혼합하여 사용되기 때문에 방법이 매우 간편하고, 대량생산이 용이하여 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

DNA의 세포 또는 조직 내 전달 효율을 높이는 펩타이드{Peptides increasing the transfer efficiency of DNA into cell or tissue}
본 발명은 DNA의 세포 또는 조직 내 전달 효율을 높이는 펩타이드 및 이를이용하여 DNA를 세포 또는 조직 내로 전달하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 세포 또는 조직 내로의 DNA 전달 효율이 우수한 특정 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 이를 이용하여 DNA를 세포 또는 조직 내로 전달하는 방법에 관한 것이다.
최근에 유전자 치료기술이 급속하게 발전하면서 여러 형태의 유전자들을 세포 또는 조직 내로 전달하는 유전자 전달기술의 개발이 시급한 과제로 부각되었다. 유전자를 전달하는 기술로서 이상적인 방법은 세포 또는 조직 내로 유전자를 효율적으로 전달하면서 독성 및 면역반응을 유발하는 등의 부작용이 없어야 하며, 전임상 및 임상을 위한 대량생산이 가능해야 한다. 현재 사용되고 있는 유전자 전달방법은 크게 바이러스성과 비바이러스성 방법으로 나눌 수 있다. 바이러스성 방법으로는 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), AAV(adeno-associated virus) 등의 바이러스를 이용한 방법이 사용되고 있으나, 바이러스의 대량생산이 어렵고, 특정 세포주에 대한 감염성 저하로 인해 다양한 세포주로의 적용이 어려울 뿐 아니라 면역반응을 일으키는 등의 부작용이 보고되고 있다.(Yibin Wanget al.,Adenovirus technology for genre manipulation and functional studies. DDT. 5(1), 2000; Joanne T.et al.,Science & Medicine44-52(March/April), 1997).
한편, 비바이러스성 방법으로는 리포좀(liposome) 또는 폴리머(polymer) 등의 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법, 일렉트로포레이션(electroporation), 미세주입(microinjection) 등의 방법이 사용되고 있다(Saghir Akhtaret al.,Adv. Drug Deliv. Rev. 44:3-21, 2000; Irina Lebedevaet al.,Eur. J. Pharm. Biopharm. 50:101-119, 2000; Ch. Garcia-Chaumontet al.,Pharmacol. Ther. 76:151-1601, 2000). 특히 비바이러스성 벡터는 생산이 쉽고 특별한 면역반응을 유발하지 않으며, 독성도 바이러스성 벡터에 비해 상대적으로 적은 편이기 때문에, 비바이러스성 벡터를 이용하려는 연구가 계속되고 있다(Colin W Poutonet al.,Adv. Drug Deliv. Rev. 46:187-203, 2001).
현재 비바이러스성 벡터로 가장 많이 사용되고 있는 리포좀(liposome)은 상업적으로 많이 개발되어 있다. 그 중 양이온 리포좀(cationic liposome)이 가장 많이 사용되고 있으며, 또한 다양한 형태의 양이온 리포좀이 개발되고 있다. 그러나 상기 양이온 리포좀은 시험관 내(in vitro)에서는 세포 내 전달이 원활하나 생체 내(in vivo)에서는 바이러스성 벡터에 비해 단백질, DNA의 크기 또는 세포주의 종류에 따라 세포 내 전달 효율이 일정치 못하며, DNA의 양에 비례해 증가되는 리포좀의 양적 증가는 세포독성을 나타내는 단점을 가지고 있다(Saghir Akhtaret al.,Adv. Drug Deliv. Rev. 44:3-21, 2000; Irina Lebedevaet al.,Eur. J. Pharm. Biopharm. 50:101-119, 2000).
또한 또다른 비바이러스성 벡터로서 폴리머를 이용하여 세포 내 전달 효과를 높이려는 연구가 많이 진행되고 있다. 폴리머는 특성상 상대적으로 적은 양을 사용할 수 있으나 세포 내 독성이 나타나고 잘 분해되지 않는 단점이 있다(Dan Luoet al.,Nat. biotech.18:33-37, 2001; Saghir Akhtaret al.,Adv. Drug Deliv.Rev. 44:3-21, 2000). 최근에는 물에 잘 녹는 수용성 및 생분해성 폴리머가 개발되고 있으나 생체 내에서의 안정성 등이 아직 입증되지 않은 상태이다(Sang-oh Hanet al.,Bioconjugate Chem. 12:337-345, 2001; Otmane Boussifet al.,Proc. Natl. Acd. Sci. 92:7297-7301, 1995).
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 DNA를 세포 또는 조직 내로 효율적으로 전달하는 펩타이드를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 이용하여 DNA를 세포 또는 조직 내로 전달하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 Tat-C 펩타이드-DNA-양이온 리포좀의 삼중 복합체를 이용하여 세포에 트랜스펙션을 수행한 후 루시퍼라제의 활성을 측정한 그래프이다.
+: Tat-C 펩타이드-DNA-양이온 리포좀의 삼중 복합체
-: DNA-양이온 리포좀의 이중 복합체(대조구)
도 2는 본 발명에 따른 Tat-C 펩타이드-DNA-양이온 리포좀의 삼중 복합체의 제조시 혼합순서에 따른 세포 내 DNA 전달 효율을 비교한 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 Tat-C 펩타이드-DNA-양이온 리포좀의 삼중 복합체의 제조시 혼합비율에 따른 K562 세포 내 DNA 전달 효율을 비교한 그래프이다.
A: Tat-C 펩타이드-DNA-D-P 리포좀의 삼중 복합체
B: Tat-C 펩타이드-DNA-LFA 리포좀의 삼중 복합체
도 4는 본 발명에 따른 Tat-C 펩타이드-DNA-양이온 리포좀의 삼중 복합체의 제조시 혼합비율에 따른 HeLa 세포 내 DNA 전달 효율을 비교한 그래프이다.
A: Tat-C 펩타이드-DNA-D-P 리포좀의 삼중 복합체
B: Tat-C 펩타이드-DNA-LFA 리포좀의 삼중 복합체
도 5는 본 발명에 따른 Tat-C 펩타이드-DNA-양이온 리포좀의 삼중 복합체의제조시 pH에 따른 세포 내 DNA 전달 효율을 나타낸 그래프이다.
A: Tat-C 펩타이드-DNA-D-P 리포좀의 삼중복합체
B: Tat-C 펩타이드-DNA-LFA 리포좀의 삼중복합체
도 6은 본 발명에 따른 Tat-C 펩타이드-DNA-D-P 리포좀의 삼중복합체의 세포주에 따른 DNA 전달 효율을 나타낸 그래프이다. 여기서 혼합비율은 펩타이드 : D-P 리포좀으로 나타내었으며, DNA 비율은 1로 하였다.
A: 293 세포주
B: HT-29 세포주
C: MCF-7 세포주
D: A549 세포주
E: NCI-H1299 세포주
F: WI-38VA13 세포주
G: Hep3B 세포주
도 7은 본 발명에 따른 Tat-C 펩타이드-DNA-LFA 리포좀의 삼중복합체의 세포주에 따른 DNA 전달 효율을 나타낸 그래프이다. 여기서 혼합비율은 펩타이드 : LFA 리포좀으로 나타내었으며, DNA 비율은 1로 하였다.
A: 293 세포주
B: HT-29 세포주
C: MCF-7 세포주
D: A549 세포주
E: NCI-H1299 세포주
F: WI-38VA13 세포주
G: Hep3B 세포주
도 8은 DNA로 FITC-표지된 올리고뉴클레오티드를 사용했을 때 WRT7/P2 세포 내 DNA 전달 효율을 나타낸 사진으로서, FITC 형광을 측정한 것이다.
A: 트랜스펙션 전의 WRT7/P2 세포의 광학현미경 사진
B: Tat-C 펩타이드-DNA-LFA 리포좀의 삼중복합체를 트랜스펙션시킨 경우
C: DNA-LFA 리포좀의 이중복합체를 트랜스펙션시킨 경우
D: DNA만을 트랜스펙션시킨 경우
도 9a는 Tat-C 펩타이드 및 변형된 Tat-C 펩타이드의 HeLa 세포주 내 DNA 전달 효율을 나타낸 그래프로서, 루시퍼라제 활성을 측정한 것이다.
도 9b는 Tat-C 펩타이드 및 변형된 Tat-C 펩타이드의 K562 세포주 내 DNA 전달 효율을 나타낸 그래프로서, 루시퍼라제 활성을 측정한 것이다.
도 9c는 Tat-C 펩타이드 및 변형된 Tat-C 펩타이드의 HL-60 세포주 내 DNA 전달 효율을 나타낸 사진으로서, GFP 발현을 조사한 것이다.
A: Tat-C 펩타이드
B: Tat-C-RGD-RGD 펩타이드
C: RGD-Tat-C-RGD 펩타이드
D: Sc-Tat 펩타이드(대조구)
도 9d는 Tat-C 펩타이드 및 변형된 Tat-C 펩타이드의 K562 세포주 내 DNA 전달 효율을 나타낸 사진으로서, GFP 발현을 조사한 것이다.
A: Tat-C 펩타이드
B: Tat-C-RGD-RGD 펩타이드
C: RGD-Tat-C-RGD 펩타이드
D: Sc-Tat 펩타이드(대조구)
도 10a는 3개의 플라스미드 DNA를 세포 내로 코트랜스펙션시켰을 때 Tat-C 펩타이드의 세포 내 코트랜스펙션 효율을 나타낸 그래프로서, 루시퍼라제 활성을 측정한 것이다. 여기서, Ca-Pi는 상기 3개의 플라스미드 DNA를 칼슘-인산염 침전법(calcium phosphate precipitation)에 따라 실시하여 세포에 코트랜스펙션시킨 대조구이다.
도 10b는 재조합 AAV 생성에 필요한 3개의 플라스미드 DNA가 동시에 세포 내로 코트랜스펙션되어 이로부터 AAV가 생성되었는지를 알아보기 위해, 3개의 플라스미드로부터 생성된 AAV를 함유하는 세포 용액과 야생형 아데노바이러스를 HeLaRC32 세포에 코인펙션시킨 후 루시퍼라제 활성을 측정한 그래프이다. 여기서, Ca-Pi는 상기 3개의 플라스미드 DNA를 칼슘-인산염 침전법(calcium phosphate precipitation)에 따라 실시하여 세포에 코트랜스펙션시킨 대조구이다.
도 11은 본 발명에 따른 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중복합체의 세포 내 DNA 전달 효율에 있어서 혈청이 미치는 영향을 조사한 그래프이다.
A: HeLa 세포주
B: K562 세포주
도 12는 본 발명에 따른 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체의 HeLa 세포주 내 DNA 전달 효율에 있어서 혈청이 미치는 영향을 조사한 사진이다.
A: 혈청 첨가한 상태(Serum +)
B: 혈청 첨가하지 않은 상태(Serum -)
C: 대조구(DNA-리포좀의 이중 복합체)(Serum +)
도 13은 본 발명에 따른 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체의 K562 세포주 내 DNA 전달 효율에 있어서 혈청이 미치는 영향을 조사한 사진이다.
A: 혈청 첨가한 상태(Serum +)
B: 혈청 첨가하지 않은 상태(Serum -)
C: 대조구(DNA-리포좀의 이중 복합체)(Serum +)
도 14는 본 발명에 따른 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체의 생체 조직 내 DNA 전달 효율을 나타낸 사진이다. 여기서, A 내지 C는 X-gal 염색만을 한 것이고, D 및 E는 X-gal 염색 후 헤마톡실린으로 대조 염색한 것이다.
PDL 복합체: 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체
DL 복합체: DNA-리포좀의 이중 복합체
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 제공한다.
(X)n-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Pro-Gln-Cys-(X)n
여기서, X는 Arg-Gly-Asp(RGD)를 나타내고, n은 0 내지 2의 정수이다.
또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 이용하여 DNA를 세포 또는 조직 내로 전달하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
펩타이드는 상대적으로 크기가 작고 독성이 적을 뿐 아니라, DNA에 가역적으로 결합하고 DNA를 응축하기 때문에, 세포 또는 조직 내 전달물질로 유용할 것으로 예상되고 있다.
HIV-1 Tat 단백질은 86개의 아미노산 잔기를 가지고 있고, 상기 단백질을 암호화하는 HIV-1 Tat 유전자는 두 개의 엑손으로 구성되어 있으며, 상기 HIV-1 Tat 단백질의 아미노산 서열 1-72는 엑손 1에 의해 암호화되고, 73-86의 아미노산 서열은 엑손 2에 의해 암호화된다. 또한 HIV-1 Tat 단백질은 2개의 라이신(lysine)과 6개의 아르기닌(arginine)을 포함하는 아미노산 서열 49-57이 기본구역이며, 이 부분이 세포 핵 위치결정(nuclear localization)에 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Eric Viveset al., J. Biol. Chem.272(25):16010-16017,1997).
이에 본 발명자들은 HIV-1 tat 단백질 중 NLS(nuclear localization sequence) 기능에 중요한 역할을 담당하는 아미노산 서열을 포함하는 12개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 기본 서열로 하여 상기 펩타이드의 N-말단과 C-말단에 몇몇 다른 특성의 아미노산을 부가함으로써 구조적 및 기능적으로 좀 더 유용한 형태의 펩타이드를 제작하였다. 본 발명은 이렇게 제작한 펩타이드를 제공하는 데 특징이 있으며, 상기 펩타이드의 서열을 하기 일반서열로 표시하였다.
(X)n-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Pro-Gln-Cys-(X)n
여기서, X는 Arg-Gly-Asp(RGD)를 나타내고, n은 0 내지 2의 정수이다.
한편, 상기 일반서열로 표시되는 아미노산 서열에서 제조될 수 있는 구체적인 펩타이드를 서열번호 2 내지 4에 나타내었다. 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드, 세포 또는 조직 내로 전달하고자 하는 DNA 및 양이온 리포좀의 삼중복합체를 이용하여 DNA를 세포 또는 조직 내로 전달한다는 점에 특징이 있다. 상기 양이온 리포좀으로는 당업계에서 통상적으로 사용되고 있는 리포펙틴(lipofectin), 올리고펙틴(oligofectin), DMRIE-CTM, 리포펙타민(lipofectamine), 리포펙타민 플러스TM(lipofectamine plusTM), 리포펙타민TM2000 등을 사용할 수 있으나, 보다 바람직하게는 리포펙타민(이하 'LFA'라 한다) 또는 DOTAP:DOPE=1:1의 혼합체(이하, 'D-P'라 한다)를 사용하는 것이 바람직하다. 그 외에도 음이온 리포좀 및 중성 리포좀 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 펩타이드를 이용한 세포 또는 조직 내로의 DNA 전달은 상기 펩타이드, 세포 또는 조직 내로 전달하고자 하는 DNA 및 양이온 리포좀을 혼합하여 복합체를 제조한 후, 상기 복합체를 DNA를 전달하고자 하는 세포와 혼합하여 함께 배양하거나, 조직에 주입함으로써 이루어질 수 있으며, 상기 펩타이드, DNA 및 리포좀의 혼합순서는 필요에 따라 변경될 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체는 혈청과 항생제가 포함되지 않은 배양액 또는 PBS 완충용액 상(0.15M NaCl 첨가됨)에서 본 발명에서 제조한 서열번호 2 내지 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 중에서 선택되는 어느 하나의 펩타이드 및 양이온 리포좀을 세포 내로 전달하고자 하는 DNA와 적절한 비율로 혼합함으로써 제조될 수 있으며, 1 ~ 10 : 1 : 1 ~ 10의 비율로 혼합하는 것이 바람직하다. 특히 양이온 리포좀으로 LFA 또는 D-P 리포좀을 사용할 경우 복합체의 혼합비율은 3 ~ 5 : 1 : 3 ~ 6이 바람직하다. 또한 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 DNA는 크기(size)와 형태에 제한없이 사용될 수 있으나, 올리고뉴클레오티드 형태의 DNA인 경우에는 15 bases 내지 120 bases를 사용하는 것이 바람직하고, 플라스미드 벡터 형태의 DNA인 경우에는 3 kb 내지 8 kb의 크기인 것이 바람직하다. 구체적으로 본 발명에서는 본 발명에 따른 펩타이드의 세포 내 전달 효율을 보다 효율적으로 측정하기 위해, 루시퍼라제 유전자,LacZ(β-galactosidase) 유전자 및 GFP(green fluorescence protein) 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 및 FITC-표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 나아가 본 발명의 방법을 적용할 수 있는 세포주 또는 조직은 그 종류에 관계없이 광범위하게 사용될 수 있으나, 보다 바람직하게는 암 또는 질환과 관련된 세포 또는 조직이 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
세포배양
본 발명에 사용된 세포주는 하기 표 1에 기재된 바와 같다.
세포주명 특성 구입처
K562 chronic myelogenous leukemia 한국세포주은행(KCLB, Korea)
HeLa cervix adenocarcinoma
HeLaRC32 cervix adenocarcinoma
HL-60 acute promyelocytic leukemia
HT-29 colon adenocarcinoma
MCF-7 breast cancer
Hep3B liver carcinoma
A549 lung carcinoma
NCI-H1299 lung carcinoma
WI-38VA13 normal lung
293 human embryonic kidney cell Microbix사 (Canada)
WRT7/P2 monocyte/macrophage cell line Dr. Yagita (Juntendo University, Japan) 실험실에서 분양 받음
본 발명에서 사용된 모든 세포들을 RPMI 1640, EMEM(JBI, Korea, Daegu) 등의 배양액에 10% 열-불활성화된 FBS(heat-inactivated fetal bovine serum)(JBI ; Hyclone, USA)와 2mM L-글루타민(glutamine), 100units/㎖ 페니실린(penicillin), 그리고 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin, JBI)을 첨가하여 37℃, 5% CO2세포 배양기에서 배양하였다. 또한 배양 과정에서 적정한 세포 농도를 유지하도록 유의하였으며, 실험에 사용될 세포는 전날 신선한 배양액으로 교체한 후, 실험 당일 0.4% 트리판 블루(trypan blue)로 생존도를 확인한 다음 사용하였다.
<실시예 2>
Tat-C 펩타이드, DNA 및 양이온 리포좀 제작
2-1) Tat-C 펩타이드 제작
HIV-1 바이러스의 Tat 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 서열번호 1로 표시되는 49-60의 아미노산 서열의 C-말단에 시스테인(Cys)을 부가하여 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 제작하였으며, 이를 'Tat-C 펩타이드'라 명명하였다. 이 때 상기 펩타이드는 당업계에 알려진 공지의 방법에 따라 합성할 수 있으며, 구체적으로 본 발명에서는 애니젠(Anygen Inc., Korea) 사에 주문제작하였다. 이후, C18 컬럼을 이용하여 상기 합성된 펩타이드를 정제한 후, HPLC(Shimadzu, Japan) 및 말디-ToF-매스(Maldi-ToF-mass; ABI, USA)를 통해 95% 이상의 순도 및 분자량을 확인하였다. 또한 대조구로 사용된 펩타이드(Sc-Tat)는 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 Tat 펩타이드를 무작위로 배열하여 제작하였으며, 상기 Sc-Tat 펩타이드의 아미노산 서열을 서열번호 5로 나타내었다.
2-2) 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 DNA 제작
본 발명에 따른 펩타이드의 DNA 전달 효율을 조사하기 위해, 리포터 유전자로 루시퍼라제 유전자,LacZ(β-갈락토시다제) 유전자 및 GFP 유전자를 사용하였다. 상기 루시퍼라제 유전자를 pGEM-luc 벡터(Promega)에서 분리하여 이를 pcDNA3 벡터(Invitrogen) 내의BamHⅠ-XhoⅠ 부위에 클로닝하였으며, 이를 pcDNA3-luc 벡터( 7 kb)라 명명하였고, 상기LacZ유전자를 pHook-2 LacZ 벡터(Invitrogen)에서 분리하여 pcDNA3 벡터(Invitrogen) 내의HindⅢ-BamHI 부위에 클로닝하였으며, 이를 pcDNA3-LacZ 벡터(8 kb)라 명명하였다. 또한 GFP 유전자를 포함하는 벡터로는 pEGFP-NI 벡터(5 kb, Clontech)를 사용하였다.
2-3) 양이온 리포좀 제작
양이온 리포좀으로는 리포펙타민(LFA; life technologies Inc., USA)과 본 발명에서 자체 제작한 DOTAP:DOPE=1:1 혼합체(D-P)를 사용하였다. 상기 D-P 리포좀은 다음과 같이 제조하였다. 먼저, CHCl3에 녹아 있는 50㎎/㎖의 DOTAP(N-1(-(2,3-dioleoyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammoniumethyl sulphate; Avanti? Polar Lipids, Inc. USA)과 50㎎/㎖의 DOPE (Dioleoylphosphatidyl-ethanolamine, Avanti?Polar Lipids, Inc. USA)를 1:1로 혼합한 다음, 증발기(evaporator)를 이용하여 필름(film)을 만든 후 건조하였다. 이후, 10㎖의 0.15M 살린(saline)에 용해시켜 리포좀이 형성되도록 하였다. 그리고 나서, 상기 생성된 리포좀을 볼텍싱(vortexing) 및 소니케이션(sonication)을 수행한 후, 100nm의 미니-엑스트루더(Mini-Extruder; Avanti?Polar Lipids, Inc. USA, Alabaster)를 10회 통과시켜 D-P 리포좀을 제조하였다.
<실시예 3>
Tat-C 펩타이드-DNA-양이온 리포좀의 삼중 복합체 제작 및 DNA 전달 효율
조사
3-1) Tat-C 펩타이드-DNA-D-P 리포좀의 삼중 복합체의 DNA 전달 효율
상기 실시예 2에서 제조된, 루시퍼라제 유전자가 삽입된 pcDNA3-luc 벡터 DNA, Tat-C 펩타이드 및 D-P 리포좀을 혼합하여 Tat-C 펩타이드-DNA-D-P 리포좀의 삼중 복합체를 제조하였다. 이 때 Tat-C 펩타이드:DNA:D-P 리포좀의 혼합비율(w/w)을 3:1:5로 하였다. 먼저, 상기 DNA와 Tat-C 펩타이드를 50㎕ OPTI-MEM 배양액에 혼합하여 5분간 반응시킨 후, D-P 리포좀이 용해된 50㎕ OPTI-MEM 배양액을 첨가하여 10분간 반응시킨 다음, 이를 K562 세포주에 가하여 5시간 동안 배양시켰다. 이후, 20% FBS가 포함된 OPTI-MEM을 300㎕씩 첨가하여 다시 16시간 배양한 후, 세포 내의 루시퍼라제 유전자의 발현을 조사하였다. 상기 루시퍼라제 유전자 발현은 루시퍼라제 어세이 시스템 킷트(Luciferase Assay System kit; Promega, USA)를 사용하여 발현된 루시퍼라제 활성을 하기와 같이 측정하였다.
배양이 끝난 세포주를 PBS(Mg2+and Ca2+가 첨가되지 않은 것임) 완충용액으로 2회 세척하고, 1×CCLR(Cell culture Lysis Reagent, 25mM Tris-phosphate (pH 7.8), 2mM DTT, 2mM 1,2-diaminocyclohexane-N,N,N',N'-tetracacetic acid, 10% glycerol, 1% Triton?X-100)을 100㎕/well씩 가하여 세포를 용해(lysis)시킨 후, 12,000g로 1분간 원심분리하여 세포의 잔해를 제거하였다. 이후, 원심분리하여 얻어진 50㎕ 상층액(supernatant)에 루시퍼라제 어세이 시약(Luciferase Assay reagent) 20㎕를 첨가한 다음, 루미노미터(luminometer; Berthold detection systems, Sirius, Germany)를 사용하여 루시퍼라제 활성을 10초간 측정하였다. 이 때 대조구는 본 발명에 따른 Tat-C 펩타이드를 첨가하지 않고 D-P 리포좀만을 사용하여 DNA를 세포 내로 트랜스펙션한 것이다. 그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, D-P 리포좀을 단독으로 사용했을 때(대조구)보다 본 발명에 따른 Tat-C 펩타이드를 함께 사용하였을 때 루시퍼라제 활성이 현저하게 증가함을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명에 따른 Tat-C 펩타이드가 DNA를 세포 내로 전달하는 효율적인 매개체라는 것을 보여주는 것이다.
3-2) Tat-C 펩타이드-DNA-LFA의 삼중 복합체의 DNA 전달 효율
양이온 리포좀으로 리포펙타민(LFA)을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 3-1)과 동일한 방법에 따라 실시하여 Tat-C 펩타이드-DNA(pcDNA3-luc 벡터)-LFA 리포좀의 삼중 복합체를 제조하였으며, 제조사(life technologies Inc., USA)의 권장방법에 따라 K562 세포주에 트랜스펙션하여 루시퍼라제의 활성을 조사하였다. 그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, LFA 리포좀을 단독으로 사용했을 때(대조구)보다 본 발명에 따른 Tat-C 펩타이드를 함께 사용하였을 때 루시퍼라제 활성이 현저하게 증가함을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명에 따른 Tat-C 펩타이드가 DNA를 세포 내로 전달하는 효율적인 매개체라는 것을 보여주는 것이다.
<실시예 4>
혼합순서에 따른 Tat-C 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체의 세포 내 DNA 전달 효율 조사
Tat-C 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체 제조시 혼합순서를 달리하여 각복합체를 제조한 후, 상기 복합체를 K562 세포주 내로 트랜스펙션시켰다. 이 때 리포좀으로는 LFA를 사용하였다. 이후, 상기 실시예 3-1)과 동일한 방법에 따라 실시하여 루시퍼라제 활성을 조사하였다. 그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, Tat-C 펩타이드를 DNA와 먼저 혼합한 다음, 이후 리포좀(LFA)을 혼합하여 복합체를 제조하였을 때 루시퍼라제 활성이 현저하게 높음을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드-DNA-양이온 리포좀의 삼중 복합체 제조의 최적 혼합순서는 펩타이드를 DNA와 먼저 혼합한 후, 상기 펩타이드-DNA 혼합물에 리포좀을 혼합하는 것이다.
<실시예 5>
혼합비율에 따른 Tat-C 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체의 세포 내 DNA 전달 효율 조사
Tat-C 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체 제조시 혼합비율에 따른 세포 내 DNA 전달 효율을 조사하기 위해, 펩타이드 및 리포좀의 혼합비율을 달리하여 각 복합체를 제조한 후, 상기 복합체를 K562 및 HeLa 세포주 내로 트랜스펙션시켰다. 이 때 리포좀으로는 D-P 및 LFA 리포좀을 사용했으며, DNA로는 루시퍼라제 유전자가 삽입된 pcDNA3-luc 벡터를 사용하였다. 또한, 상기 복합체의 혼합비율은 펩타이드 : 리포좀 = 2 ~ 5 : 2 ~ 6(K562 세포주) 및 3 ~ 4 : 3 ~ 5(HeLa 세포주)로 하였으며, DNA는 1로 하였다. 대조구로는 본 발명에 따른 Tat-C 펩타이드를 첨가하지 않고 리포좀만을 단독으로 사용하였다(Tat-C 펩타이드 : 리포좀 = 0 : 4). 이후, 상기 실시예 3-1)과 동일한 방법에 따라 실시하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, K562 세포주에서는 혼합비율에 따라 루시퍼라제 활성(세포 내 DNA 전달 효율)이 다소 차이가 있었으나, 거의 모두 대조구보다 현저하게 향상된 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히, 리포좀의 비율이 펩타이드 비율과 동량이거나 높은 경우 높은 루시퍼라제 활성을 나타냄을 볼 수 있었다. D-P의 경우에는 펩타이드 : 리포좀 = 3 : 3 또는 4 : 4 ~ 6일 때 높은 활성을 나타내었으며(도 3의 A), LFA의 경우에는 펩타이드 : 리포좀 = 3 ~ 5 : 5 ~ 6인 경우 높은 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 3의 B). 또한, 도 4에 도시된 바와 같이, HeLa 세포주에서도 유사한 양상을 나타남을 확인할 수 있었다. 특히 D-P의 경우에는 펩타이드 : 리포좀 = 4 : 4일 때 가장 높은 활성을 나타내었으며(도 4의 A), LFA의 경우에는 펩타이드 : 리포좀 = 3 ~ 4 : 5인 경우 가장 높은 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 4의 B).
<실시예 6>
본 발명에 따른 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체 제조시 pH에 따른 DNA 전달 효율 조사
펩타이드, DNA 및 리포좀이 배양액상에서 혼합될 때 배양액의 pH가 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체에 의한 세포 내 DNA 전달에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해, 혈청과 항생제가 포함되지 않은, pH 5.0 내지 8.0 범위내의PBS와 OPTI-MEM(-)를 사용하여 실험을 수행하였다. pH 5.0 내지 6.0의 용액은 PBS로, pH 6.5 내지 pH 8.0의 용액은 OPTI-MEM(-)로 제조하여 각각의 pH의 용액에서 제작된 펩타이드-DNA(pcDNA3-luc 벡터)-리포좀의 삼중복합체를 HeLa 세포주에 트랜스펙션시킨 후, 루시퍼라제 활성을 조사하였다. 이 때 펩타이드로는 Tat-C 펩타이드를 사용하였으며, 리포좀으로는 D-P 및 LFA 리포좀을 사용하였다. 또한, 펩타이드-DNA-리포좀 복합체의 혼합비율은 D-P 리포좀의 경우에는 펩타이드 : DNA : D-P = 3 : 1 : 3으로 하였고, LFA 리포좀의 경우에는 펩타이드 : DNA : LFA = 3 : 1 : 5로 하였다.
그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, 대부분의 pH에서 높은 루시퍼라제 활성을 보였으며, 특히 pH 6.0 내지 7.5에서 가장 높은 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이는 펩타이드, DNA 및 리포좀 각각이 갖는 고유의 전하에 따라 정전기적 결합에 의해 복합체가 형성되기 때문에 강산이나 강염기의 pH에서는 전하에 영향을 주어 결국 복합체 형성에 영향을 주기 때문이라 사료된다.
<실시예 7>
세포주에 따른 세포 내 DNA 전달 효율 조사
K562 및 HeLa 세포주 외에 7종류의 다양한 세포주 293, HT-29, MCF-7, A549, NCI-H1299, WI-38VA13 및 Hep3B) 및 복합체의 혼합비율에 따른 DNA 전달 효율을 조사하였다. 먼저, 본 발명에 따른 Tat-C 펩타이드, DNA(pcDNA3-luc 벡터) 및 리포좀 복합체를 혼합비율을 달리하여 제조한 후, 상기 실시예 3-1)과 동일한 방법에따라 각 세포주에 트랜스펙션하여 루시퍼라제 활성을 조사하였다. 그 결과, Tat-C 펩타이드-DNA-D-P 리포좀의 삼중 복합체의 경우, 도 6에 도시된 바와 같이, 각 세포주마다 혼합비율에 따라 루시퍼라제 활성(세포 내 DNA 전달 효율)은 다소 차이를 나타내었으나, 본 발명에 따른 복합체를 이용했을 때 모든 세포주에서 D-P 리포좀만을 단독으로 사용했을 때에 비해 현저히 높은 루시퍼라제 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, Tat-C 펩타이드-DNA-LFA 리포좀의 삼중 복합체의 경우에도, 도 7에 도시된 바와 같이, 상기 Tat-C 펩타이드-DNA-D-P 리포좀의 삼중 복합체의 경우와 유사한 양상을 나타내었으며, LFA 리포좀만을 단독으로 사용했을 때보다 현저히 높은 루시퍼라제 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명에 따른 방법이 세포주에 제한을 받지 않고, 광범위한 세포주에서 우수한 DNA 전달 효율을 나타냄을 알 수 있다.
<실시예 8>
DNA로 FITC-올리고뉴클레오티드를 사용했을 때의 세포 내 DNA 전달 효율 조사
상기 실시예 2-2)에서 제작한 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 DNA 외에 다른 형태의 DNA의 세포 내 전달 효율을 알아보기 위하여 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 양끝에 FITC가 표지된, 서열번호 6으로 표시되는 올리고뉴클레오티드(FITC-labeled oligonucleotide)(GenoTech Inc., Korea)를 Tat-C 펩타이드 및 LFA 리포좀과 복합체를 제조하여 이를 쥐의 단핵구 세포인 WRT7/P2 세포주에 트랜스펙션시킨 후, FITC의 형광을 조사하였다. 그 결과, 도 8에 도시된 바와 같이, Tat-C 펩타이드-DNA-LFA 리포좀과 복합체의 경우 LFA 리포좀만을 단독으로 처리했을 때보다 매우 강한 형광을 나타냄을 볼 수 있었다. 이는 본 발명에 따른 펩타이드를 이용할 경우 세포 내로 플라스미드 DNA 뿐 아니라 안티센스, 올리고 기만체(decoy),라이보자임 등을 포함한 올리고뉴클레오티드 형태의 DNA도 매우 잘 전달할 수 있다는 것을 보여주는 결과이다. 즉, 본 발명에 따른 펩타이드-DNA-리포좀 복합체가 DNA의 형태에 제한을 받지 않고 어떤 형태의 DNA도 세포 내로 잘 전달하는 매우 효율적인 유전자 전달 시스템으로 유용하게 이용될 수 있음을 보여주는 결과이다.
<실시예 9>
변형된 Tat-C 펩타이드의 DNA 전달 효율 조사
9-1) 변형된 Tat-C 펩타이드 제작 및 세포 내 DNA 전달 효율 조사
상기 실시예 2-1)에서 제조한 Tat-C 펩타이드의 N-말단과 C-말단에 각각 RGD 아미노산 서열을 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 부가하여 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 제작하였으며, 이를 'RGD-Tat-C-RGD 펩타이드'라 명명하였다. 또한 상기 Tat-C 펩타이드의 C-말단에 RGD 아미노산 서열을 2개 부가하여 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 제작하였으며, 이를 'Tat-C-RGD-RGD 펩타이드'라 명명하였다. 이후, 상기 제작된 두 펩타이드와 상기 실시예 2-1)에서 제작된 펩타이드를 이용하여 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체를 제조하였다. 이 때, DNA로는 루시퍼라제 유전자가 삽입된 pcDNA3-luc 벡터를 사용하였으며, 리포좀으로는 D-P 리포좀을 사용하였다. 또한, 상기 복합체의 혼합비율은 펩타이드 : DNA : D-P 리포좀 = 4 : 1 : 4로 하였다. 이후, 상기 각 복합체를 HeLa 세포주 및 K562 세포주에 트랜스펙션시킨 후, 상기 실시예 3-1)과 동일한 방법에 따라 실시하여 각 세포주에서 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
그 결과, HeLa 세포주의 경우, 도 9a에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드들, 즉 Tat-C 펩타이드(서열번호 2), RGD-Tat-C-RGD 펩타이드(서열번호 3) 및 Tat-C-RGD-RGD 펩타이드(서열번호 4)의 경우 대조구인 변형되지 않은 온전한 Tat 펩타이드(서열번호 1) 및 상기 Tat 펩타이드의 아미노산 서열을 무작위로 배열한 Sc-Tat 펩타이드(서열번호 5)에 비해 현저하게 높은 루시퍼라제 활성을 보임을 확인할 수 있었다. 또한, K562 세포주의 경우도, 도 9b에 도시된 바와 같이, 상기 HeLa 세포주의 경우에서와 유사한 양상을 나타냄을 확인할 수 있었다.
도 9a 및 도 9b에서 NLS 기능이 있다고 알려진 아미노산 서열인 상기 변형되지 않은 온전한 Tat 펩타이드(서열번호 1)가 상기 NLS 기능을 억제하도록 무작위로 배열된 상기 Sc-Tat 펩타이드(서열번호 5)와 세포 내 DNA 전달 효율에 있어서 별다른 차이를 나타내지 않음을 볼 때, 본 발명에 따른 세포 내 DNA 전달 효율의 증가는 상기 Tat 펩타이드의 NLS 기능에 기인하는 것이 아니라, 본 발명에서 제작한 펩타이드들이 DNA의 세포 내 전달 효율을 증가시킨 것에 기인하는 것임을 알 수 있다.
9-2) GFP 발현을 통한 본 발명에 따른 펩타이드의 세포 내 DNA 전달 효율 조사
상기 9-1)에서 사용한 루시퍼라제 유전자 외에 다른 리포터 유전자인 GFP 유전자를 사용하여 본 발명에 따른 펩타이드(Tat-C 펩타이드 및 변형된 Tat-C 펩타이드들)의 세포 내 DNA 전달 효율을 재확인하였다. 먼저, DNA로 상기 실시예 2-2)에서 제조한 GFP 유전자가 삽입된 벡터를 사용하여 상기 실시예 3-1)과 동일한 방법에 따라 펩타이드-DNA-D-P 리포좀의 삼중 복합체를 제조한 후, 이를 세포주(HL-60 및 K562)에 트랜스펙션시킨 다음, GFP의 발현을 조사하였다. GFP의 발현은 배양이 끝난 세포주를 PBS 완충용액으로 2회 세척한 후, 형광 현미경(Leica, Germany)을 이용하여 측정하였다. 그 결과, HL-60 세포주의 경우, 도 9c에 도시된 바와 같이, Sc-Tat 펩타이드에 비해 본 발명에 따른 펩타이드가 약 5 내지 7배 이상의 GFP 발현을 보임을 확인할 수 있었으며, 도 9d에 도시된 바와 같이 K562 세포주의 경우도 유사한 GFP 발현 양상을 나타내었다. 이 결과는 상기 실시예 9-1)의 루시퍼라제 활성 조사 결과와 동일한 결과이다.
<실시예 10>
본 발명에 따른 펩타이드의 코트랜스펙션(cotransfection) 효율 조사
본 발명에 따른 펩타이드의 코트랜스펙션 효율을 조사하기 위해 재조합 AAV생성에 필요한 세 종류의 플라스미드 트랜스진, ACP-luc, XX2 및 XX6을 이용하여 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체를 제조하였다. 재조합 AAV 생성에 필요한 세종류의 플라스미드는 하기 표 2에 기재하였다.
플라스미드 DNA 특성 구입처
ACP-luc 양쪽 끝에 ITR을 가지고 그 사이에 CMV promoter와 luciferase 유전자, BGH를 가짐 성균관대학교 의과대학 김덕경교수(삼성의료원) 실험실
XX2 cap ORF와 rep ORF를 가짐 The University of North Carolina at Chapel Hill
XX6 E1A, E1B, E2A, E4, VA를 가짐
10-1) 코트랜스펙션 후 루시퍼라제 활성 측정
트랜스펙션을 수행하기 24시간 전에, 293 세포주를 6-well plate 상에 7×105cells/well로 분주하여 CO2배양기(incubator)에서 배양하였다. 다음 날 OPTI-MEM(-)로 세포를 한번 씻어 준 다음 1㎖의 OPTI-MEM(-)을 세포에 첨가하였다. 이후, 상기 실시예 2-1)에서 제작한 Tat-C 펩타이드와 상기 표 2에 기재된 세 가지의 플라스미드의 혼합액(ACP-luc : XX2 : XX6 = 1 : 1 : 3(w/w))을 각각 3:1, 4:1 및 5:1 (w/w)의 비율로 혼합하여 실온에서 5분 반응시켰다. 이후, D-P 리포좀을 상기 플라스미드 혼합액(DNA)의 5배에 해당하는 양으로 첨가하여 실온에서 10분간 더 반응시켰다. 그리고 나서, 상기 펩타이드-3개의 DNA-리포좀의 복합체를 293 세포주에 넣고, 37℃, CO2배양기에서 6시간 반응시킨 다음, 다시 EMEM(+)을 1㎖ 첨가하여 24시간 배양하였다. 이 때 대조구는 상기 3개의 플라스미드 DNA를 칼슘-인산염 침전법(calcium phosphate precipitation)에 따라 세포에 트랜스펙션시킨 것이다.
그 결과, 도 10a에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드-DNA-리포좀의복합체를 사용하여 코트랜스펙션한 경우가 대조구에 비해 높은 루시퍼라제 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
10-2) 재조합 AAV의 생성에 의한 DNA 전달 효율 조사
상기 도 10a에서 도시된 루시퍼라제 활성은 상기 3개의 플라스미드 중에서 ACP-luc 플라스미드만이 트랜스펙션되어도 활성을 나타낼 수 있다. 그러나, 재조합 AAV는 상기 3개의 플라스미드가 모두 함께 코트랜스펙션되어야만 생성될 수 있고, 또한 세포 내로 전달된 유전자들이 활성을 나타내기 위해서는 상기 유전자들의 세포 핵 내로의 이동이 필수적이다. 따라서, 상기 ACP-luc 유전자를 갖는 AAV가 인펙션된 세포의 루시퍼라제 활성을 조사하여 간접적으로 AAV 생성을 조사할 수 있다.
먼저, 상기 실시예 10-1)와 동일한 방법에 따라 트랜스펙션을 실행하고 72시간이 지난 다음, 293 세포를 수확하여 37℃ 항온수조와 액체 질소에서 3-4회 정도 해동(thawing)과 냉동(freezing)을 반복하여 상기 세포를 파괴시켰다. 이후, 파괴된 세포를 1,000g에서 2분간 원심분리하여 상층액을 야생형의 아데노바이러스(50moi)와 함께 HeLaRC32 세포에 코인펙션시켰다. 24시간 후, 세포 라이시스 용액을 사용하여 세포를 수확한 다음, 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 이 때 대조구는 칼슘-인산염 침전법(calcium phosphate precipitation)에 따라 상기 3개의 플라스미드를 세포에 트랜스펙션하여 상기와 동일한 방법에 따라 야생형 아데노바이러스와 함께 HeLaRC32 세포주에 코인펙션시킨 것이다. 그 결과, 도 10b에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중복합체를 이용하여 코트랜스펙션한 경우 대조구에 비해 높은 루시퍼라제 활성을 나타내었으며, 특히 상기 복합체의 혼합비율이 4:1:5일 때 가장 높은 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 이는 재조합 AAV 생성에 필요한 3개의 플라스미드가 모두 세포 내로 코트랜스펙션되어 이로부터 AAV가 생성되었음을 보여주는 결과이다. 나아가, 이로부터 본 발명에 따른 펩타이드를 이용하여 하나 이상의 DNA를 동시에 세포 내로 효율적으로 전달할 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 11>
본 발명에 따른 펩타이드의 세포 내 DNA 전달 효율에 있어서 혈청(serum)이 미치는 영향 조사
본 발명에 따른 펩타이드를 이용한 DNA 전달에 있어서 혈청이 미치는 영향을 조사하기 위해, 본 발명에 따른 Tat-C 펩타이드-DNA(pcDNA3-luc)-D-P 리포좀의 삼중복합체를 HeLa 및 K562 세포주에 각각 트랜스펙션하여 배지 내 10% FBS의 존재 유(FBS+), 무(FBS-)에 따른 DNA 전달 효율을 조사하였다(도 11의 A 및 B). 이 때 대조구로는 DNA와 리포좀만의 복합체를 사용하였다. 그 결과, 도 11에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체의 경우 혈청을 포함하는 배지(FBS+)에서 현저히 높은 루시퍼라제 활성을 보임을 확인할 수 있었다.
또한 DNA로 상기 실시예 2-2)에서 제조한 β-갈락토시다제 유전자가 삽입된 pcDNA3-LacZ 벡터를 사용하여 실험을 수행한 결과, 도 12 및 도 13에 도시된 바와같이, 도 11에 도시된 바와 같은 발현 양상을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명에 따른 펩타이드를 사용한 유전자 전달 시스템이 시험관 내 뿐 아니라 생체 내에도 적용될 수 있는 가능성을 보여주는 것이다.
<실시예 12>
본 발명에 따른 펩타이드의 생체 내에서의 DNA 전달 효율 조사
본 발명에 따른 펩타이드-DNA-D-P 리포좀의 삼중 복합체의 생체 내 DNA 전달 효율을 조사하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 6주령의 수컷 SD(Sprague-Dawley) 백서(200-250g)를 SLC(Japan)에서 구입하여 사육하였으며, 실험 전 기간 동안 펠렛형 고형사료로 사육하였다. 펜토바비탈(5㎎/100g 체중)을 백서의 복강에 주사하여 마취한 후, 복부를 절개하여 왼쪽 신장의 요관을 노출시켰다. 이후, 24 게이지 카테터(guage catheter)를 사용하여 상기 노출된 왼쪽 신장의 요관을 통해 Tat-C 펩타이드-DNA(pcDNA3-LacZ 벡터)-D-P 리포좀의 삼중 복합체(4:1:4)를 주입하였다. 24시간 후에 상기 백서로부터 신장을 적출하였다. 일렉트로닉 크리오톰(Electronic Cryotome?, Shandon, UK)을 이용하여 신장을 10㎕의 두께로 동결절단(cryosection)한 후, 폴리-프랩 슬라이드(Poly-Prep™, Sigma)에 부착시켰다. 그리고 나서, 4% 파라포름알데히드에 5분 동안 고정시킨 후, X-gal 용액(1.5 mM potassium ferricyanide, 1.5 mM potassium ferrocyanide, 1% X-gal)에 담가 16시간 동안 CO2배양기에서 반응시켰다. 이후, 염색된 조직은헤마톡실린(hematoxylin)으로 대조 염색한 후 400배의 배율로 현미경하에서 관찰하였다.
그 결과, 도 14에 도시된 바와 같이, 대조구인 DNA-리포좀의 이중복합체(도 14의 B 및 E)를 처리한 신장 및 아무것도 처리하지 않은 신장(도 14의 C 및 F)과 비교할 때에 본 발명에 따른 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중 복합체 처리구 신장(도 14의 A 및 D)에서만 β-갈락토시다제 활성이 있음을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명에 따른 펩타이드-DNA-리포좀의 삼중복합체는 시험관 내 뿐 아니라 생체 내에서도 우수한 DNA 전달 효율을 나타낸다는 것을 알 수 있다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명자들은 HIV Tat 단백질의 일부 아미노산 서열을 기본 골격으로 하여 상기 서열의 N-말단 및/또는 C-말단에 몇몇 다른 특성의 아미노산을 부가함으로써 구조적 및 기능적으로 좀 더 유용한 형태의 펩타이드를 제작하였다. 본 발명에 따른 펩타이드는 기존의 양이온 리포좀을 이용한 유전자 전달 시스템의 DNA 전달 한계를 극복할 수 있는 매우 뛰어난 새로운 유전자 전달 시스템으로 유용하게 이용될 수 있으며, 세포 또는 조직 내로 전달하고자 하는 DNA 및 리포좀과 단순혼합하여 사용되기 때문에 방법이 매우 간편하고, 대량생산이 용이하여 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 펩타이드는 하나 이상의 DNA를 한 세포주 안에 동시에 전달할 수 있는 매우 간편한 고효율의 DNA 전달 시스템으로 사용될 수 있을 뿐 아니라, 생체 내에서도 우수한 DNA 전달 효율을 갖기 때문에 유전자 치료분야에 유용하게 사용될 수 있다.
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Claims (14)

  1. 하기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드.
    (X)n-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Pro-Gln-Cys-(X)n
    여기서, X는 Arg-Gly-Asp(RGD)를 나타내고, n은 0 내지 2의 정수이다.
  2. 제 1항에 있어서, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드.
  3. 제 1항에 있어서, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드.
  4. 제 1항에 있어서, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드.
  5. 제 1항의 펩타이드, 세포 또는 조직 내로 전달하고자 하는 DNA 및 리포좀으로 이루어진 DNA 전달용 복합체.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 펩타이드, 세포 또는 조직 내로 전달하고자 하는 DNA 및 리포좀이 1 ~ 10 : 1 : 1 ~ 10의 비율로 혼합된 것을 특징으로 하는 DNA 전달용 복합체.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 DNA는 15 bases 내지 120 bases 크기의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 DNA 전달용 복합체.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 DNA는 3 kb 내지 8 kb 크기의 플라스미드 벡터인 것을 특징으로 하는 DNA 전달용 복합체.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터는 루시퍼라제(luciferase) 유전자,LacZ(β-galactosidase) 유전자 및GFP(green fluorescence protein) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 전달용 복합체.
  10. 제 6항에 있어서, 상기 리포좀은 양이온 리포좀인 것을 특징으로 하는 DNA 전달용 복합체.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 양이온 리포좀은 DOTAP:DOPE=1:1의 혼합체 또는 리포펙타민(lipofectamine)인 것을 특징으로 하는 DNA 전달용 복합체.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 펩타이드, DNA 및 DOTAP:DOPE=1:1의 혼합체가 3 ~ 5 : 1 : 3 ~ 6 의 비율로 혼합된 것을 특징으로 하는 DNA 전달용 복합체.
  13. 제 11항에 있어서, 상기 펩타이드, DNA 및 리포펙타민이 3 ~ 5 : 1 : 3 ~ 6 의 비율로 혼합된 것을 특징으로 하는 DNA 전달용 복합체.
  14. 제 5항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 2 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA 전달용 복합체.
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