MX2010009140A - Seleccion de farmacos para terapia de cancer de mama utilizando matrices basadas en anticuerpos. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona composiciones y métodos para detectar los estados de activación de componentes de rutas de transducción de señal en células de tumor. La información de los estados de activación de componentes de rutas de transducción de señal derivada del uso del invención, puede emplearse para diagnóstico de cáncer, pronóstico y para el diseño de tratamientos de cáncer.

Description

una cantidad de estados de enfermedad tales como diabete's, enfermedad cardiaca, autoinmunidad y cáncer. | Una ' ruta de transducción de señal ; bien caracterizada es la ruta AP quinasa, que es responsable por transducción de la señal del factor de crecimiento epidérmico i (EGF = Epidermal Growth Factor) a la promoción de proliferación celular en células (ver, figura 1). EGF liga a una tirosina quinasa enlazada a receptor de transmembrana, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) , que se activa por el enlace de EGF. El enlace de EGF a EGFR activa la actividad de tirosina quinasa del dominio citoplásmico del receptor. Una consecuencia de esta activación- de quinasa es la autofosforilación de EGFR en residuos tirosina. Los residuos tirosina fosforilados en EGFR activado proporcionan un sitio de acoplamiento para el enlace del dominio de SH2 que contiene proteínas adaptadoras tales como GRB2. En ¡su función como un adaptador, GRB2 además liga a un factor de intercambio guanina nucleótido, SOS, mediante un dominio SH3 en GRB2. La formación del complejo EGFR-GRB2-S0S lleva a activación SOS de un factor de intercambio guanina nucleótido que promueve la eliminación de GDP de Ras. Al eliminar GDP, Ras liga a GTP y se activa. - I Después de activación, Ras liga a y activa la actividad de proteína quinasa de RAF quinasa, una proteina quinasa específica de serina/treonina . Lo que sigue la activación de una cascada proteina quinasa que lleva proliferación celular. En perfil, RAF quinasa ¦ fosforila entonces y activa MEK, otra serina/treonina quinasa. MEK activado fosforila y activa -la proteina quinasa activada fjor rnitógeno (MAPK = Mitogen Activated Protein Kinase) . Entre lias dianas para adicional fosforilación por MAPK están · la proteina ribosomal S6 quinasa 40S (RSK) . La fosforilación de RSK por MAPK resulta en la activación de RSK, que a su vez fosforila la proteina ribosomal S6. Otra diana conocida de MAPK es el proto-oncogen, c-Myc, un gen importante para proliferación celular, que se muta en una variedad de cánceres. MAPK también fosforila y activa otra proteina quinasa, MNK, que a su vez fosforila el factor de transcripción CREB. Indirectamente, MAPK también regula la ' transcripción- del gen Fos, que codifica todavía otro' factor ¦ de transcripción involucrado en proliferación celular, jAl alterar los niveles y actividades de estos factores de transcripción, MAPK transduce la señal extracelular original de EGF en transcripción alterada de genes que son importantes para el progreso del ciclo celular.

Dado el papel central que juegan las rutas de transducción de señal en crecimiento celular, no es sorprendente que muchos cánceres surjan cómo resultado en mutaciones y otras alteraciones en componentes de transducción de señal que resultan en activación aberrante de rutas de proliferación celular. Por ejemplo, la sobreexpresión o hiperactividad de EGFR se ha asociado con una cantidad de cánceres, incluyendo glioblastoma multiforme, cáncer de colon y cáncer pulmonar. Esto ha promovido el desarrollo de terapéuticas anti-cáncer dirigidas- contra EGER, incluyendo gefitinib y erlotinib para cáncer pulmonar, cetuximab para cáncer de colon.

Cetuximab es un ejemplo de un inhibidor |de anticuerpo monoclonal, que liga al dominio de enlace ligando-extracelular de EGFR, evitando de esta manera el enlace de ligandos que activan EGFR tirosina quinasa. En contraste, gefitinib y erlotinib son pequeñas moléculas que inhiben el EGFR tirosina quinasa ubicado intracelularmente . En la ausencia de actividad de quinasa, EGFR es incapaz de someterse a autofosforilación en residuos tirosina, que es un prerrequisito para ligar proteínas adaptadoras corriente abajo, tales como GRB2. Al. detener la cascada de señalización en células que se basan en esta ruta para crecimiento, |se disminuye la proliferación y migración de tumor.

Adicionalmente, otros estudios han mostrado que ? aproximadamente 70% de melanomas humanos y una menor fracción de otros tumores tienen una mutación punto (V599E) en, el gen Raf que lleva a persistente activación de la ruta MAPK (ver, por ejemplo, Davies et al., Nature, 417:949-954 (2002 Estos resultados sugieren que mutaciones en rutas | de transducción de señal particulares pueden caracterizarse por tipos particulares de tumores y que estas rutas ! de transducción de señal especificas alteradas pueden ser | un objetivo promisorio para intervención quimioterapéutica.

Dado que los diferentes tratamientos de cáncer, particularmente quimioterapia de cáncer pueden funcionar ya sea directa o indirectamente mediante cualquiera de bloqueo o activación de rutas de transducción dé señal celular involucradas en proliferación o muerte celular respectivamente, la actividad de una ruta de transducción de señal dada en una forma particular de cáncer puede servir como un buen indicador de la ' eficacia- de diversos tratamientos de cáncer. De acuerdo con esto, además de cumplir con otras necesidades, la presente , invención proporciona un método para evaluar la efectividad de terapias anti-cáncer potenciales para un paciente individual. Cómo tal, la presente invención proporciona métodos para asistir a un médico en seleccionar una terapia de cáncer conveniente a la dosis correcta y al tiempo correcto para cada paciente. í BREVE COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones y métodos para detectar los estados de activación de componentes de rutas de transducción de señal en células de tumor (por ejemplo, células circulantes de un tumor de, mama) . Información en los estados de activación de componentes de rutas de transduccion de señal derivadas de la práctica de |la presente invención, puede utilizarse para diagnóstico jde cáncer, pronóstico y en el diseño de tratamientos de cáncerj, En un aspecto, la presente invención proporciona un método para seleccionar un fármaco anti-cáncer conveniente para el tratamiento de un tumor de mama, el método comprende: (a) aislar células de un tumor de mama después de administración de un fármaco anti-cáncer, o antes ¡de incubación con un fármaco anti-cáncer; (b) lisar las células aisladas para producir |un extracto celular; (c) detectar un estado de activación de uno o más analitos en el extracto celular utilizando un ensayo que comprende una pluralidad de series de dilución de anticuerpos de captura específicos para el uno o más analitos, en donde los anticuerpos de captura se restringen en un sopor.te sólido; y (d) determinar si el fármaco anti-cáncer jes conveniente o no es conveniente para el tratamiento del tumor de mama al comparar el estado de activación detectado por el uno o más analitos con un perfil de activación de referencia generado en la ausencia del fármaco anti-cáncer En una modalidad preferida, el método para seleccionar un fármaco anti-cáncer conveniente para ¡el tratamiento de un tumor de mama comprende: (a) aislar células de un tumor de mama después |de administración de un fármaco anti-cáncer, o antes |de incubación con un fármaco anti-cáncer; . . (b) lisar las células aisladas para producir |un extracto celular;: (c) detectar un estado de activación de uno o más analitos en el extracto celular utilizando un ensayo que comprende una pluralidad "de series de dilución de anticuerpos de captura específicos para el ' uno o más analitos, en donde los anticuerpos de captura se restringen en un soporte sólido; (d) comparar el estado de activación detectado por el uno o más analitos con un perfil de activación de referencia generado en la ausencia del fármaco anti-cáncer; y ¡e) indicar que el fármaco anti-cáncer es adecuado para el tratamiento del tumor de mama cuando el estado |de activación detectado para el uno o más analitos se disminuye sustancialmente en comparación con el perfil de activación |de referencia.

En algunas modalidades, los métodos de la presente invención pueden ser útiles para ayudar o asistir en la selección de una droga anti-cáncer conveniente para el tratamiento de un tumor de mama. En otras modalidades, los métodos de la presente invención pueden ser útiles para mejorar la selección de un fármaco anti-cáncer conveniente para el tratamiento de un tumor de mama.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para identificar la respuesta de un tumor de mama a tratamiento con un fármaco anti-cáncer, el método comprende: (a) aislar células de un tumor de mama después |de administración de un fármaco anti-cáncer o antes |de incubación con un fármaco anti-cáncer; (b) lisar las células aisladas para producir |un extracto celular; (c) detectar un estado de activación de uno ó más analitos en el extracto celular, utilizando un ensayo que comprende una pluralidad de series de dilución de anticuerjos de captura específicos para el uno o más analitos, en donjde los anticuerpos de captura se restringen en un soporjte solido; y j (d) identificar el tumor de mama que responde o jno responde a tratamiento con el fármaco anti-cáncer al comparar el estado de activación detectado por el uno o más analitos con un perfil de activación de referencia generado en |la ausencia del fármaco anti-cáncer.

En una modalidad preferida, el método . pajra identificar la respuesta de un tumor de mama a tratamiento con un fármaco anti-cáncer, comprende: (a) aislar células de un tumor de mama después jde administración de un fármaco anti-cáncer o antes Ide incubación con un fármaco anti—cáncer; (b) lisar las células aisladas para producir |un extracto celular; i . (c) detectar un estado dé activación de uno o más analitos en el extracto celular utilizando un ensayo que comprende una pluralidad de series de dilución de anticuerjos de captura específicos para el uno o más analitos, en donde los anticuerpos de captura " se restringen en un soporte sólido; (d) comparar el estado ¾de activación detectado por el uno o más analitos con - un perfil de activación de referencia generado en la ausencia del fármaco anti-cáncer; y (e) indicar que el tumor de mama responde a tratamiento con el fármaco anti-cáncer cuando · el estado de j activación detectado para el uno o más analitos se disminuye sustancialmente en comparación con el perfil de activación ¡de referencia.

En algunas modalidades, los métodos de la presente invención pueden ser útiles para ayudar o asistir en la identificación de la respuesta de un tumor de mama a tratamiento con una droga anti-cáncer. En otras modalidades, los métodos de la presente invención pueden ser útiles para mejorar la identificación de la respuesta de un tumor de mdma á tratamiento con un fármaco anti-cáncer. , Todavía en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para pronosticar la respuesta de iun sujeto que tiene un tumor de mama a tratamiento con |un fármaco anti-cáncer, el método comprende: (a) aislar células de un tumor de mama después |de administración de¦ un fármaco anti-cáncer, o antes |de incubación con un fármaco anti-cáncer; (b) lisar las células aisladas para producir |un extracto celular; (c) detectar un estado de activación de uno o más analitos en 'el extracto .celular utilizando un ensayo que comprende una pluralidad de series de dilución de anticuerpos de captura específicos para el uno o más analitos, en donde los anticuerpos de captura se restringen en un soporte sólido; y (d) pronosticar la probabilidad de que el sujeto responderá a tratamiento con el fármaco anti-cáncer al comparar el estado de activación detectado por el uno ó más analitos con un perfil de activación de referencia generado en la ausencia del fármaco anti-cáncer.- En una modalidad preferida, el método para pronosticar la respuesta de un sujeto que tiene un tumor de mama a tratamiento con un fármaco anti-cáncer comprende: (a) aislar células de un tumor de mama después de administración de un fármaco anti-cáncer, . o antes de incubación con un fármaco anti-cáncer; (b) lisar las células aisladas para producir ¡un extracto celular; (c) detectar un estado de activación de uno o más analitos en el extracto celular utilizando un ensayo que comprende una pluralidad de series de dilución de anticuerpos de captura específicos para el uno o más analitos, en donde los anticuerpos de captura se restringen en un soporte sólido; (d) comparar el estado de activación detectado por el uno o más analitos con un perfil de activación |de referencia generado en la ausencia del fármaco antif-cáncer ; (e) indicar que el sujeto probablemente responderá a tratamiento con el fármaco anti-cáncer cuando el1 estado de activación detectado para el uno o más analitos se disminuye sustancialmente en comparación con el perfil de activación de referencia.

En algunas modalidades, los métodos de la presente invención pueden ser útiles para ayudar o asistir : en |la predicción de la probabilidad de un sujeto al responder tratamiento con urt fármaco anti-cáncer. En otras modalidades, los métodos de la presente invención pueden ser útiles para mejorar la predicción de la probabilidad de un sujeto |en responder a tratamiento con un fármaco anti-cáncer . ; En un aspecto adicional, la presente¦ invención proporciona un conjunto^ o matriz que tiene un intervalo dinámico superior que comprende una pluralidad de series de dilución de anticuerpos de captura restringidos en un soporte sólido, en donde los anticuerpos de captura en cada serie de dilución son específicos para uno o más analitos que i corresponden a un componente de una ruta de transducción jde señal u otra proteína (por ejemplo receptor de hormona i nuclear) en un extracto celular. Las matrices direccionales aquí descritas son particularmente útiles para determinar |la expresión y/o estado de . activación de moléculas |de transducción de señal y otras proteínas involucradas |en cáncer de mama.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para detector la presencia (o ausencJa) de un receptor truncado, el método comprende: I (a) incubar un extracto celular con una pluralidad de perlas específicas para una región de enlace de dominio extracelular (ECD = extracellular .domain) de un receptor jde (c) incubar el extracto celular carente del receptor de longitud integra con una pluralidad jde anticuerpos de captura, en donde la pluralidad de anticuerpos de captura es especifica, para una región de enlace de dominio intracelular (ICD) del receptor truncado y en donde jla pluralidad de anticuerpos de captura se restringe en un soporte sólido para formar una pluralidad de receptores truncados capturados; (d) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados con anticuerpos de detección que comprenden una pluralidad de anticuerpos independientes de estado de activación y una pluralidad de anticuerpos dependientes de estado de activación específicos para los- ' receptores truncados correspondientes para formar una pluralidad de receptores truncados capturados detectables, en donde los i anticuerpos independientes de estado de activación se etiquetan con una porción facilitadora, los anticuerpos dependientes de estado de activación se etiquetan con jun primer miembro de un par de amplificación de señal, y ¡la porción facilitadora genera un . agente de oxidación que canaliza con y reacciona con el primer miembro del par |de amplificación de señal; (e) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados detectables con un segundo miembro del : par de amplificación de señal para generar una señal amplificada; ¡y (f) detectar la' señal amplificada- generada del primero y segundo miembros del par de amplificación de señal.

Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención serán aparentes a una persona con destre¡za en la técnica a partir de la siguiente descripción: detallada y figuras . ¡ BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra un ejemplo de una ruta 'de transducción de señal involucrada en proliferación ceíuljar que puede emplearse en la práctica de la invención. , Se ilustran componentes de la ruta EGFR/MAPK/ERK que se utiliza por las células para convertir una señal mitogéníca en proliferación celular. · La Figura 2 muestra una modalidad de la presenjte invención en donde los ensayos de proximidad aquí descritas detectan EGFR fosforilado (pEGFR) y HER-2 fosforilado (pHER-2) con sensibilidad a una sola célula.

La Figura 3 muestra que los ensayos de proximidad aquí descritos resultan en .ensayos altamente específicos para la detección de HER-2 a nivel de una sola célula sólo |en células que expresan HER-2. ! La Figura 4 muestra esquemáticamente la aplicación de las matrices direccionables de la invención para selección de fármaco a través del curso de tratamiento de cáncer., La Figura 5· muestra un ejemplo esquemático de u'na matriz direccionable que comprende diluciones de anticuerpos a componentes de una ruta de receptor tirosina quinasa, tales como aquellas en la ruta EGFR/MAPK/ERK. Anticuerpos |se revisten en triplicado en cuatro diferentes diluciones en |la matriz direccionable.

La Figura 6 muestra un ejemplo esquemático de una matriz direccionable que. comprende diluciones de anticuerpos a componentes dé rutas de transducción de señal activádas en angiogénesis de tumor. Anticuerpos se revisten en triplicado en cuatro diluciones diferentes en la matriz direccionable.

La Figura 7 muestra un ejemplo esquemático de una matriz direccionable alterna que comprende diluciones de anticuerpos a componentes de rutas de transducción de señal activadas en angiogénesis de tumor. Anticuerpos se revisten en triplicado en cuatro diluciones diferentes en la matriz direccionable.

La Figura 8 muestra un ejemplo esquemático de una matriz direccionable que comprende diluciones de anticuerpos a componentes de una ruta receptor tirosina quinasa y rutas de transducción de señal activadas en angiogénesis de tumor. Anticuerpos se revisten en triplicado en cuatro diluciones diferentes en la matriz direccionable.

La Figura 9 muestra un ejemplo esquemático de úna matriz direccionable alterna que comprende diluciones de anticuerpos a componentes de una ruta de receptor tirosina quinasa y rutas de transducción de señal activadas ¡en angiogénesis de tumor. Los anticuerpos pueden revestirse ; en triplicado en una serie de dilución en la matriz direccionable La Figura 10 muestra los niveles de fosforilación relative de EGFR para 5 muestras de cáncer de mama y muestras normales. Los datos también se ilustran en la Tabla 40.

La Figura 11 muestra los niveles de fosforilación relativa de HER-2 para 5 muestras de cáncer de mama y muestras normales. Datos también se ilustran en la Tabla 41.

La Figura 12 muestra imágenes de tinción CTC en el sistema Veridex CellSearch para 5 pacientes de cáncer de mama. Controles de lineas celulares son A431 (positivo para EGFR) y SKBr3 (positivo para HER-2) La Figura 13 muestra que HER-2 de longitud integra (ErbB2) puede retirarse de una muestra de paciente utilizando anticuerpos que ligan al - dominio 'extracelular de ErbB2 conectado a una perla de poliestireno o un dextrano polimérico La Figura 14A-14B muestran una modalidad de | la presente invención para detectar receptores truncados tales como p95ErbB2. SA = estreptavidina; HRP = peroxidasa | de rábano picante; TSA = amplificación de señal tiramida.

La Figura 15 muestra que el pretratamiento con experimentos empleando el ensayo de apoptosis de Annexina-5. Annexina-5 es un miembro de una familia de proteínas altamente conservada que liga fosfolípidos acídicos en una forma dependiente de calcio. Annexina-5 posee una alta afinidad por fosfatidilserina . Fosfatidilserina se trasloca del lado interior de la membrana de plasma a la capa exterior cuando las células se someten a muerte por Apoptosis o necrosis celular y sirve como una señal con la cual la célula destinada para muerte se reconoce por fagocitos. Células A549 se pretratan por 30 min con los péptidos de prueba - 10 microgramos por mi - seguido por exposición a la ceramida C2. La ceramida media la apoptosis celular a través de la activación de la proteína cinasa activada por mitógeno ( APK = Mitogen Activating Protein Kinase) y la cinasa activada por tensión (JNK/SAPK) . La ceramida C2 es un análogo soluble de membrana sintético de ceramida.

Resultados del ensayo de prevención de apoptosis: Los péptidos de la invención y la combinación de péptidos no mostraron protección significante en contra de la apoptosis inducida por ceramida en las células de pulmón humano.

EJEMPLO 14: Ensayo de perfilado de citocina Thl/Th2 Los ratones Balb/c (originados en 1923, es una cepa popular y se utilizan en muchas disciplinas de investigación diferentes. También se clasifican como generados de la perlas revestidas con un. anticuerpo dirigido al dominio extracelular (ECD) . de ErbB2 (HER-2) casi se retira completamente la señal ErbB2 de longitud integra sin afectar la señal de dominio intracelular ErbB2 (ICD).

La Figura 16 muestra que el tratamiento con ((acetato 4-aminofenil) mercúrico) (APMA = ((4-aminophenyl ) mercuric acétate) aumentó la fosforilación de p95ErbB2 en células BT-474.

La Figura 17 muestra que heregulina incrementó la fosforilación de p95ErbB2 en células T47D.

La Figura 18 muestra múltiples puntos en donde los métodos de la presente · invención pueden emplearse para influenciar la práctica clínica con respecto a selección de la . terapia apropiada de cáncer de mama para un paciente particular .

La Figura 19 muestra una modalidad del formato de ensayo de la presente invención, que se basa en la (jo-localización de dos anticuerpos detectores adicionales enlazados con enzimas para subsecuentes eventos de canalización por cada proteína diana ligada.

La Figura 20 muestra sensibilidad de una sq>la célula para ensayos pHER-1 y pHER-2.

La Figura 21 muestra expresión/activación ErbB con tratamiento EGF o HRG ß en diversas líneas celulares.

La Figura 22 muestra el perfil T47D ErbB , RTK con estimulo EGF o HRG ß.

La Figura 23 muestra una modalidad ejemplar de una matriz de ruta ErbB.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I. INTRODUCCIÓN Como se describió anteriormente, la activación de rutas de transducción de señal que están involucradas ¡en proliferación celular y la desactivación de rutas que están involucradas en muerte celular son ejemplos no limitantes de características moleculares que distinguen en muchos tipos diferentes de cáncer. En muchos casos, la actividad de rutas de transducción de señal particular y sus componentes, pueden servir como firmas moleculares para un tipo determinado de cáncer. Estos componentes activados además pueden proporcionar dianas útiles para intervención terapéutica'. De acuerdo con esto, el conocimiento del nivel de actividad de un sistema de transducción de señal particular dentro de una célula de cáncer antes de, durante y después de tratamiento proporciona a un médico con . información altamente relevante que puede emplearse para seleccionar un curso de tratamiento a adoptar apropiado. Además, la supervisión continua ¡de rutas de transducción de señal que son activas en células | de cáncer conforme avanza el tratamiento, puede proporcionar | al médico con información adicional en la eficacia | de tratamiento, señalar al médico el que continúe un curso | de tratamiento particular' o que cambia a otra linea de i tratamiento, cuando por ejemplo células de cáncer se han vuelto resistentes a tratamiento a través de mayores aberraciones que activen ya sea la misma, u otra ruta Le transducción de señal.

De acuerdo con esto, la presente invención proporciona métodos y composiciones para detectar los estados de expresión y activación de una pluralidad de moléculas de transducción de señal desequilibradas en tejido de tumor o células extratumorales tales como células de circulación raras de un tumor sólido, en un ensayo de alto rendimiento múltiplex especifico. La invención también proporciojna métodos y composiciones para la selección de terapia apropiada (fármacos sencillos o combinaciones de fármacos) para reducir a la baja o reducir la expresión o desactivar una ruta de señalización desequilibrada. De esta manera, la invención puede emplearse para facilitar el diseño de terapias personalizadas para pacientes de cáncer.

La capacidad para detectar e identificar células ¡de tumor en la circulación a través de determinar la actividad de las rutas de transducción de señal al nivel de células sencillas es una ventana importante de la presente invención. Las células de tumor a menudo se encuentran en la sangre de pacientes con diversas etapas tempranas de cáncer cómo "micrometástasis" (células de tumor diseminadas) y también se encuentran en cánceres metastásicos . El número de células 'de tumor en la sangre depende de la etapa y tipo de turne!r . Mientras que las biopsias típicamente se obtienen en tumJrs primarios, la mayoría de los tumores metastásicos no se someten a biopsia, haciendo el análisis molecular de estas muestras de tumor muy difícil. Durante metástasis de tumJr, i las células de tumor más agresivas dejan al tumor primarioj y recorren a través de la sangre y el sistema linfático para llegar a una ubicación distante. De esta manera, células de tumor circulantes de la sangre representan la población más agresiva y homogénea de células de tumor. Sin embargo, el número de células de tumor metastásicas en la sangre frecuentemente es muy bajo, variando desde uno a varios miles de células por mililitro de sangre. La capacidad para aislar y ensayar rutas de transducción de señal en estas células i raras y aplicar esta información haqia tratamientos de cáncer más efectivos es un objetivo de la presente invención.

? En algunas modalidades, los inmunoensayos de alto ? rendimiento multiplex, de la presente invención , pueden detectar el estado de aptivación de una o más moléculas de transducción de señal en células en circulación de un tumor sólido al nivel de una sola célula. De hecho, moléculas de transducción de señal tales como EGFR pueden ser delectadas con una sensibilidad de aproximadamente 100 zeptomoles y un intervalo dinámico lineal desde aproximadamente 100 zeptomoles a aproximadamente 100 femtomoles. Como tal, la detección de una sola célula del estado de activación de múltiples transductores de señal en. células circulantes raras facilita el pronóstico y diagnóstico de cáncer · asi como el diseño de terapias dirigidas personalizadas.

Células raras en circulación incluyen células en circulación de un tumor sólido que ya se han sometido a metástasis o micrometástasis de un tumor sólido. Células de tumor en circulación, células madre de cáncer, y células que migran a un tumor (por ejemplo, debido a quimioatraccion) tales como células progenitoras endotelial'es en circulación, células endoteliales en circulación, célulás mielpides pJo-angiogénicas en circulación, y células dendriticas en circulación, son algunos ejemplos de células en circulación asociadas con un tumor sólido.

Moléculas de transducción de señal de inte és i típicamente se extraen poco después de que se aislan las células en circulación para conservar su estado de activación in situ, de preferencia dentro de aproximadamente 24, 6 ó 1 hr, y más preferiblemente, entre aproximadamente 30, 15 J 5 minutos. Las células aisladas pueden también incubarse con uno o más factores de crecimiento, usualmente concentraciones nanomolares a micromolares, por aproximadamente 1-30 minutos para resucitar o estimular la activación de las moléculas de transducción de señal (ver, e.g., Irish et al., Cell, 118:217-228 (2004)) . | Como se explica con mayor detalle aquí, para evaluar terapias anti-cáncer potenciales para un pacienjte individual, las células aisladas pueden incubarse con unoj o más fármacos anti-cáncer a dosis variantes. El estímulo de factor de crecimiento puede entonces realizarse por unos cuantos minutos (por ejemplo, aproximadamente 1-5 minutos) por varias horas (por ejemplo, aproximadamente 1-6 horas1) . La activación diferencial de las rutas de señalización con y sin fármacos anti-cáncer puede ayudar en la selección dé una terapia de cáncer conveniente a la dosis adecuada ' para cJda paciente individual. Las células en circulación también pueden aislarse en una muestra de paciente durante tratamiento con fármaco anti-cáncer y estimularse con uno, o más ' factores de crecimiento para determinar si deberá implementarse un cambio en terapia. Como tal, los métodos !de la présente invención asisten ventajosamente al médico |en proporcionar el fármaco anti-cáncer correcto a la dosis correcta y al tiempo correcto para cada paciente.

Con respecto a cáncer de mama, las actuales opciones de prueba son insatisfactorias debido a que el tratamiento tanto, de tumores primarios como metastásicos en un paciente de cáncer de mama se basa en diagnóstico . de una vez de un ' tiempo a partir de una muestra de biopsia tomada durante una etapa temprana de la enfermedad. En particular, resistencia adquirida a terapia hormonal debido a activación HER-1/2. En algunos casos, pacientes pueden tener resistencia de novo o desarrollar resistencia adquirida a terapias dirigidas a ErbB debido a la presencia de célúlas de tumor que expresan p95HER-2. Como resultado, hay una necesidad clínica no satisfecha para ensayos en ayudar al médico en recetar la terapia de cáncer apropiada al tiempo apropiado debido a' que la tecnología actual carece de sensibilidad y especificidad, no puede emplearse para supervisar a pacientes en terapia y no utiliza perfilado jde ruta para guiar a decisiones de tratamiento individualizadas.

En contraste con las opciones de prueba para cánc|er de mama actualmente disponibles, los métodos de la preserite invención permiten la supervisión de pacientes de cáncer jde mama través de todas las etapas de la enfermedad al proporcionar una "biopsia en tiempo real" de tumores de ma'ma sólidos utilizando muestras tales como células de tumor en circulación (CTCs = circulating tumor cells) de sangre y/o aspirados de agujas finas (FNAs) . Como un ejemplo no limitante, los ensayos de cáncer de mama aquí descritos pueden emplearse en el diagnóstico inicial de cáncer de mama en una paciente en una etapa temprana de la enfermedad, la selección de una terapia de cáncer conveniente es guiada por el perfilado de estados de activación de las rutas de señalización especificas con y sin fármacos anti-cáncer utilizando los ensayos de detección dual de proximidad detección sencilla aquí descritos. Ventajosamente los métodos de la preserite invención también pueden emplearse para supervisar el avance o regresión de la enfermedad debido a que la intervención terapéutica .puede basarse en muestras tomadas en cualquier etapa de la enfermedad y analizarse utilizando los ensayos de detección dual de proximidad- y ! de detección sencilla aquí descritos. Como tal, la selección de terapias de cáncer convenientes para las etapas tempranas j y metastásicas de cáncer de mama está guiada por diagnóstico én tiempo real y un análisis de estado de activación tie moléculas de rutas de señalización especificas.

Los métodos de la presente invención se ajustan benéficamente para atender aspectos clave en el manejo o gestión de cáncer y proporciona una norma superior de cuidado para pacientes de cáncer de mama debido a que (1) proporcionan sensibilidad incrementada (por ejemplo, detección' de célula sencilla puede lograrse para detectar moléculas de transducción de señal total y fosforil'adas tales como EGFR y HER-2), (2) proporcionar especificidad incrementada (por ejemplo, ensayos de proximidad de trés-anticuerpos mejoran la especificidad para detectar moléculjas de transducción de señal fosforiladas ) , (3) permit!en perfilado de ruta (por ejemplo, estados de activación de moléculas de transducción de señal especificas ¦ pueden detectarse en CTCs o FNA de pacientes), y (4) eliminar cualesquiera aspectos con obtener muestras de paciente (por ejemplo, los ¦ ensayos pueden realizarse en unás cuentas células de tumor) . Aunque cualquier muestra puede emplearse en los ensayos novedosos aquí descritos, CTCs son particularmente útiles debido a que representan las células de tumor más agresivas, todo tumor se conoce que libere CTGs, pueden ser la única fuente de tumores residuales o tumores metastásicos de difícil acceso, y se. encuentran en la sangre. Como tales, los métodos de la presente invención permiten el muestreado en serie de tejidos de tumor de. mama, resultando en información valiosa en cambios que ocurren en células de tumor como una función del tiempo y terapia y proporcionan! a ? los médicos con medios para monitorear las firmas de rutas ¡de cáncer de evolución rápida En resumen, los métodos de la presente invención proporcionan ventajosamente selección y supervisión precisa de pacientes de cáncer (por ejemplo, pacientes de cáncer 'de mama) que más probablemente se beneficien de terapia dirigida al realizar perfilado de ruta en células de tumor de fácil acceso -utilizando ensayos, de proximidad o detección sencilljos basados en anticuerpo multiplexa'dos , II . Definiciones Como se emplea aquí, los siguientes términos tierien los significados adjudicados a menos de que se especifique |de otra forma.

El término "cáncer" se pretende que incluya cualquier miembro de una clase de enfermedades caracterizadas por un crecimiento descontrolado de células aberrantes. | El término incluye todos los cánceres conocidos y condiciones neoplásticas, ya sea caracterizada como malignos, benignos, de tejidos suaves o sólido, y cánceres de todas las etapas y grados incluyendo cánceres pre- y post-metastásicós .

Ejemplos de diferentes tipos de cáncer incluyen, pero no están limitados a cáncer de mama; cáncer, de pulmón (p!or ejemplo, cáncer pulmonar de células no pequeñas) ; cáncerjes digestivos y gastrointestinales tales como cáncer colorectaCL, tumores estromales ' gastrointestinales, tumores carcinoidLs gastrointestinales, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer anal, cáncer de ductos biliares, cáncer de intestino delgado, y cáncer de estómago (gástrico) ; cáncer esofágico; cáncer ¡de vesicular biliar; cáncer de hígado; cáncer pancreático; cáncer de apéndice; cáncer de ovarios; cáncer renal (pjor ejemplo, carcinoma de células renales) ; cáncer del sistema nervioso central; cáncer de piel; linfomas; coriocarcinomas ; cánceres de cabeza y cuello; sarcomas osteogénicos; y cánceres de sangre. Como se emplea aquí, un "turnar" comprende una o más células cancerosas. En una modalidad preferida, el tumor de mama se deriva de un sujeto con una forma invasiva o in situ de carcinoma ductal o carcinoma lobular. En otra modalidad preferida, el tumor de mama se deriva de un sujeto con cáncer de mama recurrente o metastásico.

El término "analito" incluye cualquier molécula de interés, típicamente una macromolécula tal como [un polipéptido, cuya presencia, cantidad y/o identidad, |se determina. En ciertos casos, el analito es un componente celular de células en circulación de' un tumor sólido, de preferencia una molécula de transducción de señal.

Como se emplea aquí, el término "series Jde dilución" se pretende que incluya una serie jde i concentraciones descendentes de una muestra particular (pjor ejemplo, lisado celular) o¦ reactivo (por ejemplo, anticuerpo) . Una serie de dilución típicamente se prodJce por un proceso de mezclado una cantidad medida de una ( j concentración inicial de una muestra o reactivo con un diluyente (por ejemplo, un amortiguador de dilución) para crear una menor concentración de la muestra de reactivo, repetir el' proceso veces suficientes para obtener el número deseado de diluciones en serie. La muestra o reactivo puede diluirse en forma serial al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 500 o 1000-veces par.a producir una serie de dilución que comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 concentraciones descendentes de la muestra o reactivo. Por ejemplo, una serie de dilución que i comprende una dilución en serie de 2-veces de un reactivo de anticuerpo de captura a una concentración inicial de 1 mg/ml puede producirse al mezclar una cantidad de la concentración inicial del anticuerpo de captura con una cantidad igual de un amortiguador de dilución para crear una concentración de 0.5 mg/ml del anticuerpo de captura, y repetir el proceso para obtener las concentraciones de anticuerpo de captura de A-C, MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYR03, TIE 1-2, TEK, RYK, DDR 1-2, RET, c-ROS, V-cadherina, LTK (leucocito tirosina quinasa) , ALK (linfoma quinasa anaplástica) , ROR 1-2, MUSK, AATYK 1-3, RTK 106, y formas truncadas del receptor tirosina quinasas tales como p95ErbB2; receptores no tirosina quinasa tales como BCR-ABL, Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, y LIMK; componentes de cascada de señalización de tirosina quinasa tales como Akt, MAPK/ERK, EK, RAF, PLA2, MEKK, JNKK, JNK, p38, Shc (p66) , PI3K, Jas (e.g., K-Ras, N-Ras, H-Ras), Rho, Racl, Cdc42, -PLC, PKC, ^70 i S6 quinasa, p53 ciclina DI, STAT1, STAT3, PIP2, PIP3, PD¡K, mTOR, BAD, p21, p27, ROCK, IP3, TSP-1, NOS, PTEN, RSK 1-3, JNK, c-Jun, Rb, CREB, Ki67, y paxilina; receptores de hormona nuclear tales como receptor de estrógeno (ER) , receptor de progesterona (PR), receptor de andrógeno, receptor de glucocorticoide, receptor de mineralocorticoide, receptor de vitamina A, receptor de vitamina D, receptor retinoide, receptor de hormona de- tiroides, y receptores huérfanos coactivadores y represores de receptor nuclear tales comó amplificados en cáncer de mama-1 (AIB1) y corepresor de receptor nuclear 1 (NCOR) , respectivamente; y sus combinaciones.

Como se. emplea aquí, el término "células | en circulación" comprende células extratumorales que ya están | en metástasis o micrometástasis de un tumor sólido . Ejemplos | de células en circulación incluyen pero no están limitadas células de tumor en circulación, células madre de cáncer y/o células que migran al tumor (por ejemplo, células progenitores endoteliales en circulación, células endoteliales en circulación, células mieloides prb- i angiogénicas en circulación, · células dendriticas en circulación, etc. ) .

El término "muestra" como se emplea aquí, incluye cualquier espécimen biológico obtenido de un pacientje. Muestras incluyen, sin limitación, sangre entera, plas !a, suero, glóbulos rojos, glóbulos blancos (por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica) ,· fluido de lavado ductal, aspirado de pezón, linfa (por ejemplo, células de tumor diseminadas del nodo linfático) , aspirado en médula ósea, saliva, orina, excremento (es decir, heces), esputo, fluido de lavado bronquial, lágrimas, aspirado dé aguja fina (por ejemplo, recolectado por aspiración de aguja fina periareolar al azar) , cualquier otro fluido corporal, una muestra de tejido (por ejemplo, tejido de tumor) tal como una i biopsia de un tumor (por ejemplo, biopsia de agujas) o un nodo linfático (por ejemplo, biopsia de nodo linfático centinela), y sus extractos celulares. En algunas modalidades, la muestra es sangre entera o un componente fraccional de la misma tal como plasma, suero, o precipitado celular. En modalidades preferidas, la muestra se obtiene al El término "sujeto" o "paciente," j o "individualmente" incluye típicamente humanos, pero también puede incluir otros animales tales como, por ejemplo, otros primates, roedores, caninos, felinos, equinos, ovinos, porcinos y semejantes.

Una "matriz" o "micro matriz" comprende un conjunto distinto y/o series de dilución de anticuerpos de captura inmovilizados o restringidos en un soporte sólido tal como, por ejemplo, vidrio (por ejemplo, un porta objetos de vidrio) , plástico, astillas o chips, espigas o pasadores, filtros, perlas (tale por ejemplo, perlas magnéticas, ; perlas de poliestireno, etc.), papel, membrana (por ejemplo, , nyIon, nitrocelulosa, fluoruro de polivinilideno (PVDF), etc haces de fibras o cualquier otro substrato conveniente. líos anticuerpos de captura en general son inmovilizados restringidos en el soporte sólido por interacciones covalentes o no covalentes (por ejemplo, enlaces iónicos, interacciones hidrofóbicas , enlaces de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, enlace dipolo-dipolo) . En ciertos casos, los anticuerpos de captura comprenden etiquetas de captura que interactúan con agentes de captura ligados al soporte sólido. Las matrices empleadas en los ensayos de la presente invención típicamente comprenden una pluralidad de diferentes anticuerpos de captura y/o concentraciones de anticuerpo de captura que se acoplan a la superficie de un soporte sólido en diferentes ubicaciones conocidas/.direccionables .

El término "anticuerpo de captura" se pretende que incluya un anticuerpo inmovilizado que es especifico para ('es decir, liga, esta enlazado por, o forma un complejo con) Jno o más analitos de interés en una muestra tal como un extracto celular de células en circulación de un tumor sólido. En modalidades preferidas, el anticuerpo de captura se restringe en un soporte sólido en la matriz. Anticuerpos de captura convenientes para inmovilizar cualquiera de una variedad de moléculas de transducción de señal en un soporte sólido, están disponibles de Upstate (Temecula, CA) , ¡ Biosource (Camarillo, CA) , Cell Signaling Technologies (Danvers,- MA) , R&D Systems ( inneapolis , MN) , Lab Vision (Fremont, CA) , Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) , Sigma (St. Lpuis, MO) , and BD Biosciences (San José, CA) .

El término "ánticuerpo de detección" como sé emplea aquí incluye un anticuerpo que comprende una etiqueta detectable · que es especifica para (es decir, liga, es ligada por, o forma un complejo con) uno o más analitos de interés en una muestra. El término también abarca un · anticuerpo que es especifico para uno o más analitos de interés, en donde el anticuerpo puede ligarse por otra especie que comprende una etiqueta detectable. Ejemplos de etiquetas detectabl.es incluyen, pero no están limitados a, etiquetas de biotina/estraptavidina, etiquetas de ácido nucleico (por ejemplo, oligonucleótido) , etiquetas químicamente reactivajs, ¦etiquetas fluorescentes, etiquetas de enzimas, etiquetas radioactivas y sus combinaciones. Anticuerpos de detección convenientes para detectar el estado de activación yj/o cantidad total de cualquiera de una variedad de moléculas jde transducción de señal están disponibles de Upstate (TemeculL, CA) , Biosource (Camarillo, CA) , Cell Signaling Technologies (Danvers, MA) , R&D Systems (Minneapolis, ??)·, Lab Vision (Fremont, CA) , Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA1) , Sigma (St. Louis, MO) , and BD Biosciences (San José, CA) . Como un ejemplo no . limitante, anticuerpos fosfo-espécífieos contra diversas formas fosforiladas de moléculas de transducción de señal tales como EGFR, c-KIT, c-Src, FLK-1, PDGFRA, ' PDGFRB, Akt, MAPK, PTEN, Raf., y MEK están disponibl es de Santa Cruz Biotechnology.

El término "anticuerpo dependiente de estado de activación" incluye un anticuerpo de detección que es especifico para (es decir, liga, es ligado por, o forma un complejo con) un estado de activación particular de ' uno o más analitos de interés en una muestra. En modalidades preferidas, el anticuerpo dependiente de estado de activación detecta el estado de fosforilación, ubicuitinación?? , /o complejación de uno o más analitos tales como una o más moléculas de transducción de- señal. En algunas modalidades, la fosforilación de miembros de la familia EGFR de receptor tirosina quinasas y/o la formación de complejos heterodiméricos entre los miembros de familia EGFR se detecta utilizando anticuerpos dependientes de estado de activación. Ejemplos no limitantes de estado de activación (citados en paréntesis) son adecuados para detección con anticuerpos dependientes de estado de activación incluyen: EGjFR (EGFRvIII, EGFR fosforilado (p-) , EGFR : Shc, (u-) EGjFR ubicuitinado, p-EGFRvIII) ; ErbB2 (p95: (Tr) -ErbB2 truncado, p-ErbB2, p95 : Tr-p-ErbB2 , HER-2:Shc, ErbB2:PI3K, ErbB2 : EGFR, ErbB2:ErbB3, ErbB2 : ErbB4 ) ; ErbB3 (p-ErbB3, ErbB3:Pl3K, p-ErbB3:PI3K, ErbB3:Shc); ErbB4 (p-ErbB4, ErbB4:Shc); ER (p-ER (S118, SI 67); IGF-1R (p-IGF-lR, IGF-1R:IRS, IRS:PI3 , p-IRS, IGF-1R:PI3K) ; INSR (p-INSR) ; KIT (p-KIT) ; FLT3 (p-FLT3); HGFRI (p-HGFRI); HGFR2 (p-HGFR2); RET (p-RET) ; PDGFRa (p-PDGFRa); PDGFRP (p-PDGFRP) ; VEGFRI (p-VEGFRI, VEGFRI : PLGg, VEGFRl:Src); VEGFR2 (p-VEGFR2, VEGFR2 : PLCy, VEGFR2:Src, VEGFR2 : heparina sulfato, VEGFR2 : VE-cadherina) ; VEGFR3 (p-VEGFR3); FGFRl (p-FGFRl); FGFR2 (p-FGFR2 ) ; FGFR3 (p-FGFR3); FGFR4 (p-FGFR4); Tiel (p-Tiel); Tie2 (p-Tie2 ) ; EphA (p-EphA) ; EphB (p-EphB); NFKB y/o IKB (p-IK (S32), p-NFKB (S536), p-P65:IKBa); Akt (p-Akt (T308, S473)); PTEN (p-PTE ) ; Bad p-Bad (S112, S136), Bad: 14-3-3); mTor (p-mTor (S2448)); p70S6K (p-p70S6K (T229, T389) ) ; Mek (p-Mek (S217, S221)); Erk (p-Erk (T202, Y204)); Rsk-1 (p-Rsk-1 (T357, S363)); Jnk (p-JTnk (T183, Y185)); P38 (p-P38 (T180, Y182)); Stat3 (p-Stat-3 (Y705, S727)); Fak (p-Fak (Y576)); Rb (p-Rb (S249, T252, S780)); KÍ67; p53 (p-p53 (S392, S20) ) ; CREB (p-CREB (S133)); c-Jun (p-c-Jun (S63) ) ; cSrc (p-cSrc (Y416) ) ; y paxilina (p-paxiliria (Y118) ) . · El término "anticuerpo independiente de estado de activación" incluye un anticuerpo de detección que es especifico para (es decir, liga, es ligado por, o forma un complejo con) uno o más analitos de interés en una muestra independiente de su estado dé activación. Por ejemplo, el anticuerpo independiente de estado de activación puede detectar tanto formas fosforiladas como no fosforiladas de uno o más analitos tal como una o más moléculas de específicamente, el término abarca ácidos nucleicos que i contiene análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de enlace similares como el ácido nucleico de referencia. A menos que se indique de otra forma, un ácido nucleico particular también abarca en forma implícita sus variantes modificadas de manera conservadora y secuencias complementarias así como la secuencia indicada en forma explícita.

El término "oligonucleótido" se refiere a un oligómero o polímero de una sola hebra de ARN, ADN, híbrido ARN/ADN, y/o su . mimético. En ciertos casos, los oligonucleótidos están compuestos de nucleobases de' Origen natural (es decir, no modificadas), azucares y enlajes internucleósido (estructura principal) . En ciertos otros ¦ casos, oligonucleótidos comprenden núcleo bases modificadas, azucares y/o enlaces' internucleósido .

Como se emplea aquí, el término "motivo |de apareamiento incorrecto" o "región de apareamien'to incorrecto" se refiere a una porción de un oligonucleótido que no tiene 100% de complementariedad con su secuencia complementaria. Un oligonucleótido puede tener al menos, uJa, dos, tres, cuatro, cinco, seis, o más regiones de apareamiento incorrecto. Las regiones de apareamiento incorrecto pueden ser contiguas o pueden estar separadas por' 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, o más nucleótidos.

Los motivos o regiones · de apareamiento incorrecto pueden comprender un solo nucleótido o pueden comprender dos, tres, cuatro, cinco, o más nucleótidos. ¡ La frase "condiciones severas de la hibridizacióñ" se refiere a condiciones bajo las cuales un oligonucleótiLo hibridizará a su secuencia complementaria, pero no a otras secuencias. Condiciones severas son dependientes de secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Secuencias más largas hibridizan específicamente a superiores temperaturas. Una guia extensa a la hibridizacióñ de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principies of hybridization and the stratégy of nucleic acid assays" (1993). En general, se eligen condiciones severas de aproximadamente 5-10 grados C menor que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una concentración a un pH de concentracijón iónica definido. La Tm es la temperatura (bajo concentración iónica pH, y concentración nucleica) en la cual 50% de las sondas complementarias con el objetivo hibridizan a la secuencia objetivo en equilibrio (como las' secuencias objetivo están presentes en exceso, a Tm, 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio) . Condiciones severas también pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Para hibridizacióñ selectiva de una pluralidad de transductores de señal desregulados en i células de tumor derivadas de tejido de tumor o células en circulación de un tumor sólido en un ensayo de alto rendimiento múltiple, especifico. La invención también i proporciona métodos y composiciones para la selección ¡de terapias apropiadas para reducir la expresión o 'desactivar una o más rutas de señalización desreguladas . De esta manera, modalidades de la invención pueden emplearse para facilitar el diseño de terapias personalizadas con base en la firma molecular particular que se proporciona por la colección de proteínas de transducción de señal activadas |en un tumor de paciente determinado.

Células en circulación de un tumor sólido incluyen células que ya están en metástasis o micrometástasis de un tumor sólido, incluyendo células madre de cáncer o células que migran al tumor (es decir debido a quimiatracción) , tales como células progenitoras endoteliales , células endoteliales en circulación, pericitos, células mieloides pre-angiogénicas en circulación, células dendríticas, etc. Muestras de paciente que contienen las células en circulación pueden obtenerse de cualquier fluido biológico accesible (por ejemplo, sangre entera, suero, plasma, esputo, fluido de lavado bronquial, orina, aspirado de pezón, linfa, saliva, aspirado de aguja fina, etc.). En ciertos casos, toda la muestra de sangre se separa en una fracción de suero o plasma y una fracción celular (es decir, precipitado celular) . La fracción celular típicamente' contiene glóbulos rojos, glóbulos blancos y/o células en circulación de un tumor sólido tales como células de tumos en circulación (CTCs) , células endoteliales en circulación (CECs) , células progenitoras endoteliales en circulación, (CEPCs) , células madre de cáncer (CSCs) , células de tumor diseminado del nojdo linfático, y sus combinaciones. La fracción de suero plasma usualmente contiene entre otros, ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARN) y proteínas qué se liberan por células en circulación de un tumor sólido.

Las células en circulación típicamente se aislan jde una muestra de paciente utilizando uno o más métodos jde separación incluyendo por -ejemplo, separación inmuno-magnética (ver, por ejemplo, Racila et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 95:4589-4594 (1998); Bilkenroth et al., Int. J. Cáncer, 92:577-582 (2001)), el sistema CellTracks® System por Immunicon (Huntingdon Valley, PA) , separación microfluídica (ver por ejemplo, Mohamed et al., IEEE Trans. Nanobioscl . , 3:251-256 (2004); Lin et al., Abstract No. 5147, 97th AACR Annual Meeting, Washington, D.C. (2006)), FACS (ver, por ejemplo, Mancuso et al., Blood, 97:3658-3661 (2001)), centrifugación o gradiente de densidad (ver por ejemplo, j Baker et al., Clin. Cáncer Res., 13:4865-4871 (2003) ), 1 métodos de agotamiento (ver, por ejemplo, Meye et al., iñt.

J. Oncol., 21:521-530 (2002))'.

Para conservar los estados de activación in situ, los ¦ transductores de señal se extraen venta osamente pojco después de que se aislan las células, de preferencia dentro de 96, 72, 48, 24, 6 ó 1 hr, más preferiblemente de entre 30, 15, ó 5 minutos. Las células aisladas también pueden incubarse ventajosamente con factores de crecimiento usualmente a concentraciones nanomolares a micromolares por aproximadamente 1-30 minutos para resucitar o estimular activación de transductor de señal (yer, por ejemplo, Irish et al., .Cell, 118:217-228 (2004))! Factores de crecimiento estimulantes incluye factor de crecimiento epidérmico (EGF¡) , heregulina (HRG) , TGF-a, PIGF, angiopoyetina (Ang) , NRGjl, PGF, TNF-OÍ, , VEGF, PDGF, IGF, FGF, HGF, citoquinas semejantes. Para evaluar las terapias anti-cáncer potenciales para un paciente individual, antes de estimulo de factor de crecimiento, las células aisladas pueden ser incubadas con uno o más fármacos anti-cáncer con diversas dosis. El estimulo de factor de crecimiento .puede realizarse por unos cuantos minutos u horas (por ejemplo, 1-5 minutos a 1-6 horas) . La activación diferencial de rutas de señalización con y sin fármacos anti-cáncer ayuda en la selección de una terapia de cáncer conveniente a una dosjis propia por cada paciente individual. Después de aislamiéntjo, tratamiento con agente anti-cáncer y/o estimulo de factor |de crecimiento, las células se lisan para extraer lós, transductores de señal utilizando cualquier técnica conocida en al especialidad. De preferencia, la lisis celular se inicia entre aproximadamente 1-360 minutos después de estimulo de factor de crecimiento, y más preferiblemente en dos intervalos de tiempo diferentes: (1) a aproximadamente 1-5 minutos después de estimulo de factor de crecimiento; (2)· entre aproximadamente 30-180 minutos después dé estimu!lo de factor de crecimiento. En forma alterna, el lisado puede almacenarse a -80 grados C hasta uso.

En algunas modalidades, el fármaco anti-cáncer comprende un agente que interfiere con la función de los componentes de la ruta de traducción de .señal activada en células de cáncer. Ejemplos no limitantes de estos agentes incluyen aquellos citados a continuación en la Tabla 1'. ! Tabla 1 I EGFR (ErbBl) (B) HER-2 (ErbB2) <D) CP-724714 Erlotinib (Pfizer) Gefitinib • EKB 569* CL-387-785** * (Wyeth, Irreversible, II CRC) ** (Wyeth, Irreversible, Preclinico) Raf (H) SRC (H) Sorafenib AZ PLX4032 (Plexxikon) mTor (J) PI3 (J) Rad 001 : Everolimus* PX-866* Temsirolimus** AP-23573*** *Everolimus (Novartis, *Inhibición combinación con específica Gefetinib/Erlotinib; I/II: NSCLC, PllOalfa; ProIX Glioblastoma) **Temsirolimus Pharma; (Wyeth, combinación con Preclinico NSCLC ZD6474* Sorafenib* XL647** AEE 788*** ?(vandetanib) (Fase III: tiroides, NSCLC) * (RCC, HCC, **(Exelixis; También EPHB2) : NSCLC (III) , (Paciente resistente a Erlotinib; Melanoma (III) ) Pacientes asiáticos) (Fase 2) *** (Novartis, Fase 1/2) diana PDGFR (P) diana Abi: (Q) Tandutinib Imatinib nilotinib Dasatinib nilotinib A.T-9283 AZD-0530 Bosutinib it diana (R) HGFR1/2 A G-706 XL-880 XL-999 Inhibidores HSP90 : Drogas anti- I Tabla 1 (continúa) EGER (ErbBl) (A) HER-3 (Er±B3) (E) Cetuximab Anticuerpo (U3) Panitumumab Matuzumab Nimotu umab ErbBl vaccine??vacuna EGFR CErbBl) (B> ErbBl/2 (F> Erlotinib Lapatinib (Tykerb®) Gefitinib HKI-272* EKB 569* HKI-357 (Preclinico) CL-387-785** BIBW 2992** *Wyeth, Irreversible, I/II NSCLC, Mama * (Wyeth, Irreversible, II ** Boehringer CRC) ngelheim, **(Wyeth, Irreversible, Irreversible, l/ll Preclínico) Próstata, Ovarios, Mama Raf (H) Mek: (I) Sorafenib PD-325901 (II: NSCLC) PLX4032 (Plexxikon) A2D6244 - Matriz/Az XL518 Exelisis/DNA VEGFR2 y mTor (J) VEGFR1 (K) Rad 001 : Everolimus* Avastin (DNA) Terasiro1imus** HUMV833* AP-23573*** VEGF-Trap** *Everolimus (Novartis, combinación con Gefetinib/Erlotinib; I/II: NSCLC, Glioblastoma) * (PDL) anti-VEGFa **Temsirolimus ( yeth, **Regeneron/Av.entis combinación con (Mímico de receptor) Gefetinib/Erlotinib; (Fase 2) I/II: · NSCLC, Glioblastoma) ***??-23573' (Ariad, I/II : Endometrial) diana VEGFR2 (I.) EPH A-D DC101* Bay-579352 (+ PDGFR) IMC-IC11** ABT-869* IMC1121B Totalmente BMS-540215 (+FGFR1) humanizado CDP-791*** KRN-951 Pazopanib**** BBIW *Imclone (Fase 2/3?) .. ** IgGl quimérico contra VEGFR2 ***Celltech, PEGilado anticuerpo di-Fab contra * (+CSF1R, Erk, Flt-3, R2 PDGFR) **** GS , Mieloma múltiple, ovarios, participación completa Fase 3 RCC, sarcoma II) VEGFR 2/ErbBl/2 TIE 1/2 (ErbBl) /cMet/FGFR (M) ZD6474* XL647** AEE 788'*** * (vandetanib) (Fase III: tiroides, NSCLC) ** (Exelixis; También EPHB2) : (Paciente resistente a Erlotinib; Pacientes asiáticos) (Fase 2) *** (Novartis, Fase 1/2) diana PDGFR (P) FTL 3 Tandutinib nilotinib Kit diana (R) FGFR1-4 AMG-706 Chiron XL-880 XL-999 Inhibidores HSP90: Otras dianas : Tabla 1 (continúa) EGFR (ErbBl) (A) diana HER-4 (ErbB4) Cetuximab Panitumuiaab Matuzumab Nimotuzumab ErbBl vaccine?? acuna EGFR (ErbBl) (B) ErbBl/2/4 (G) Erlotinib Canertinib* Gefitinib ARRY-334543 EKB 569* JNJ-26483327 CL-387-785** JNJ-26483327 * (Wyeth, Irreversible, II CRC) *Pfizer, Irreversible, ** (Wyeth, Irreversible, II NSCLC, mama Preclinico) Raf <H) FkB-IkB (I) Sorafenib PLX4032 (Plexxikon) mTor (J) VEGFR1/2/3 : Rad 001 : Everolimus* AZD 2171 <NSCLC, CRC) Temsirolimus** AMG-706 <+ PDGFR) AP-23573*** *Everolimus (Novartis, combinación con Gefetinib/Erlotinib; I/II: NSCLC, Glioblas oma) **Temsirolimus ( yeth, combinación con Gefetinib/Erlotinib; I/II: MSCLC, Glioblastoma) +**¾p— 23573 (Ariad, I/II : Endometrial) diana VEGFR2 EPH A-D DC101* IMC-ICll** IMC1121B Totalmente humanizado CDP-791*** Pazopanib** ** *Imclone {Fase 2/3?) ** IgGl quimérico contra VEG R2 ***Celltech, PEGilado anticuerpo di-Fab contra R2 **** GSK, Miéloma múltiple, ovarios, participación completa Fase 3 RCC, sarcoma II) VEGFR 2/ErbBl/2 VEGFR2/1/3, Flt-3, (ErbBl) /cMet/FGFR <M) cFMS, PDGFR/cKit (O) PTK787 {No cFMS, FLT- ZD6474* 3) XL647** Sunitinib AEE 788*** XL-99 SU-6668 (Pfizer) GSK AZ (AZD2171) : B S ¦ ¦ : .

Novartis (AEE-788) ¦ , Amgen [ Otros * (vandetanib) (Fase III: tiroides, NSCLC) ** (Exelixis; También EPHB2 ) : {Paciente resistente a Erlotinib; Pacientes asiáticos) {Fase 2) *** (Novartis, Fase 1/2) diana PDGFR (P) RET Tandutinib nilotinib Kit diana <R) diana IGF-lR <S) i En otra modalidad, la ' presente invención proporciona una matriz direccionable que tiene superior intervalo dinámico que comprende una pluralidad de series de dilución de anticuerpos de captura restringidos en un soporte sólido, en donde los anticuerpos de captura en cada serie de dilución son específicos para uno o más analitos correspondientes a componente de una ruta de transducción de i señal y otras proteínas diana. En diversos aspectos, esta modalidad incluye matrices que comprenden componentes de rutas de transducción de señal características de tumores particulares, por ejemplo rutas de transducción de señal activas en células de cáncer de mama. De esta manera, la invención puede practicarse ventajosamente en donde cada molécula de transducción de- señal u otra proteina de interés como una expresión de potencial o defecto de activación que provoca cáncer, se representa en un chip o matriz sencilla.

I En algunos aspectos, los componentes de una ruta de transducción de señal- dada activa en una célula de tumor particular dispuesta en una secuencia lineal que corresponde a la secuencia en donde se retransmite información a través de una ruta de transducción de señal dentro de una célula. Ejemplos de estas matrices se ilustran en las figuras 5-9. Los anticuerpos de captura específicos para uno o más componentes de una ruta de transducción de señal dada activa en una célula de tumor particular, también pueden imprimirse en forma aleatoria para reducir al mínimo cualesquiera artefactos relacionados con superficie. ! Ejemplos no limitantes de rutas de transducción ele señal que pueden interrogarse utilizando la presente Tabla 2 i ErbB2 : ErbB2 Ruta 3 ErbB2 HER-2 Shc PI3K Fosfo Complex ErbB2 ERBB2 Truncado Fosfo Ruta 4 ErbB2 ErbB2Fosfo P95 Truncado P95 Complejo Fosfo ErbB3 PI 3K Ruta 5 ErbB3 ErbB3 : PI3K ErbB3 Fosfo Fosfo Ruta 6 ErbB4 ErbB4 : Shc ErbB4 Fosfo Ruta 7 IGF-1R IGF-1R: IRS IRS:PI3K IGF-1R Fosfo Ruta 8 INSR INSR Ruta 9 KIT Fosfo KIT Fosfo Ruta 10 FLT3 FLT3 Fosfo Ruta 11 HGFR 1 HGFR 1 Fosfo Ruta 12 HGFR 2 HGFR 2 Ruta 13 RET Fosfo RET PDGFR PDGFR Ruta 14 alfa alfa Fosfo PDGFR PDGFR Ruta 15 beta beta Fosfo Complej o VEGFR 1 VEGFR 1: Ruta 16 VEGFR 1 VEGFR 1 : Fosfo Src PLCy Complej o VEGFR 2 : VEGFR 2 Ruta 17 VEGFR 2 VEGFR 2 : Src Fosfo PLCy VEGFR 3 Ruta 18 VEGFR 3 ! Fosfo FGFR 1 Ruta 19 FGFR 1 Fosfo FGFR 2 Ruta 20 FGFR 2 Fosfo FGFR 3 Ruta 21 FGFR 3 Fosfo FGFR 4 Ruta 22 FGFR 4 Fosfo TIE 1 Ruta 23 TIE 1 Fosfo TIE 2 Ruta 24 TIE 2 Fosfo EPHA Ruta 25 EPHA Fosfo EPHB Ruta 26 EPHB Fosfo Comple P65 IkBa Fosfo-??? Fosfo NF B o NFkB- Total Ruta 27 (S32) (S536) IkB Fosfo Total IkB total NFKB P65 IkBa Otros Ruta 28 ER Fosfo ER ER-AIB1 complejo 5 ER Complej o 5 ' Ruta 29 PR Fosfo Pr PR Ruta Ruta 30 Hedgeho g Ruta Ruta 31 Wnt Ruta Ruta 32 Notch En ciertas modalidades, el fármaco o droga anta-cáncer comprende un agente anti-señalización (es decir, una droga citostática) tal como un anticuerpo monoclonal un ! inhibidor de tirosina quinasa; un agente anti-proliferativjo; un agente quimioterapéutico (es decir un fármaco citotóxico1) ; un agente terapéutico hormonal; un agente radioterapéutico; una vacuna y/o cualquier otro compuesto con la capacidad para reducir o abrogar el crecimiento descontrolado de células aberrantes tales como células cancerosas. En algunas modalidades, las células en circulación aisladas se tratan con uno o más agentes anti-señalización, agentes anti-proliferativos y/o agentes terapéuticos hormonales |en combinación con >al menos un agente quimioterapéutico.

Ejemplos de agentes anti-señalización adecuados para utilizar en la presente invención incluyen . sin limitación anticuerpos monoclonales tales como trastuzumab (Herceptin®) , alemtuzumab (Campath®) , bevacizumab (Avastin®) , cetuximab (Erbitux®) , gemtuzumab (Mylotarg®) , panitumumab (Vectibix™) , rituximab (Rituxan®) , y tositumomab (BEXXAR ) ; inhibidores de tirosina quinasa tales como gefitinib (Iressa®), sunitinib (Sutent®), erlotinib (Tarceva , lapatinib (GW-572016; Tykerb®) , canertinib (CI 1033), semaxinib (SU5416) , vatalanib ( PTK787/ZK22258 ) , sorafenib (BAY 43-9006; Nexavar®) , imatinib mesylate (Gleevec®) , leflunomide (SU101) , y vandetanib (ZACTIMA™; ZD6474); y sus combinaciones.

Agentes, anti-proliferativos ejemplares incluyen inhibidores mTOR tales como sirolimus (rapamicina) , GV1001 de Pharmexa, IO-2055 de Idera Pharmaceuticals, ItiGN 225 de Introgen Therapeutics y Stimuvax de Biomira/Merck.

Ejemplos de agentes radioterapéuticos incluyen pe'ro no están limitados a radionúclidos tales ' como 47Sc, 64Cu, 570u, 89Sr, 86Y, 87Y, 90Y, 105Rh, mAg, ? ??, 117mSn, 149Pm, 153Sm, 156Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, y 212Bi, opcionalmente conjugados con anticuerpos dirigidos contra antigenos de tumor.

En algunas modalidades, cada serie de dilución de anticuerpos de captura comprende una serie de concentraciones de anticuerpo de captura descendente. En ciertas instancias, los anticuerpos de captura se diluyen én serie al menos dos veces (por ejemplo 2, 5, 10, 20, 50, 100, 500, o lOOO. vecJs ) para producir una serie de dilución que comprende un númJro establecido (por ejemplo, 2, .3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, o más) de concentraciones de anticuerpo de captura descendentes que son aplicado por puntos o manchado en la matriz. De preferencia, al menos 2, 3, 4, 5, o 6 réplicas |de- cada dilución de anticuerpo de captura se aplican sobre ¡la matriz.

En otras modalidades, el soporte sólido comprende vidrio (por ejemplo un portaobjetos de vidrio) ..plástico, astillas (chips) , espigas, filtros, perlas, papel, membrana (por ejemplo nailon, . nitrocelulosa, fluoruro de polivinilideno (PVDF), etc.), haces de fibras o cualquier otro sustrato conveniente. En una modalidad preferida, -Jos ácidos nucleicos (por ejemplo, DNA, RNA) y proteínas que ¡se liberan al circular células de un tumor sólido.

En algunos casos, las células en circulación aisladas pueden estimularse in vitro con uno o más factores de crecimiento antes, durante y/o después de incubación con uno o más fármacos anti-cáncer de interés. Factores de crecimiento estimulatorios se describieron anteriormente. En otros casos, las células en circulación aisladas pueden lisarse, por ejemplo siguiendo estímulo de factor de' crecimiento y/o tratamiento de fármaco o droga anti-cáncer, para producir el extracto celular (por ejemplo lisado celular) utilizando cualquier técnica conocida la especialidad. De preferencia, la lisis celular se inicia entre aproximadamente 1-360 minutos después de estímulo de factor de crecimiento y más preferiblemente en dos intervaíos de tiempo diferentes: (1) a aproximadamente 1-5 minutos después de estímulo de factor de crecimiento; y (2). éntire aproximadamente 30-180 minutos después de estímulo de factor de crecimiento. En forma alterna, el lisado celular puede almacenarse a -80°C. hasta uso. Én modalidades preferidas, los estados de expresión y/o activación de una pluralidad de moléculas de transducción de señal en células, de tumor, tales como células en circulación de un tumor sólido, se detectan utilizando un ensayo de detección sencillo o detección dual de proximidad como se. describe a continuación.

De acuerdo con esto, en un aspecto, la presente invención proporciona un método para seleccionar un fármaco anti-cáncer conveniente para el tratamiento de un tumor !de mama, el método comprende: (a) aislar células de un tumor de mama después de administración de un fármaco anti-cáncer o antes de incubación con un fármaco anti-cáncer; · (b) lisar las células aisladas para producir un extracto celular; (c) detectar un estado de activación de uno o más analitos en el extracto celular utilizando un ensayo que ¡ comprende una pluralidad de series de dilución de anticuerpos de captura específicos para el uno o más analitos, en donde los anticuerpos de captura se restringen en un soporte sólido; y (d) determinar si el fármaco anti-cáncer es adecuado o inadecuado para el tratamiento de un tumor de mama al comparar el estado de activación detectado para el uno más analitos con' un perfil de activación de referencia generado en la ausencia del fármaco anti-cáncer. | En ciertos casos, los métodos de la presente invención pueden además comprender enviar o reportar los resultados de la etapa (d) a un médico, por ejemplo un oncólogo o un médico general. En -ciertos otros casos, los métodos de la presente invención además pueden comprender registrar o almacenar los resultados de la etapa (d) en una base de datos de computadora u otra máquina o dispositivo conveniente para almacenar información, por ejemplo: en ,un laboratorio .

En una modalidad preferida, el método pajra seleccionar una droga anti-cáncer conveniente para jel tratamiento de un tumor de mama comprende: (a) aislar células de un tumor de mama después de administración de fármaco anti-cáncer, o antes de incubación de un fármaco anti-cáncer; (b) lisar las células aisladas para producir iun extracto celular; i (c) detectar un estado de activación de uno o más j analitos en el extracto celular utilizando un ensayo que comprende una pluralidad de series de dilución de anticuérpjos de captura específicos para el uno o más analitos, en don'de los anticuerpos de captura se restringen en un soporte sólido; ,' (d) comparar el estado de activación detectado por el uno o más analitos con .un perfil de activación de referencia generado en la ausencia del fármaco anti-cáncer; y (e) indicar que el fármaco anti-cáncer es adecuado para el tratamiento del tumor de mama cuando el estado de activación detectado para el uno o más analitos se disminuye sustancialmente en comparación con el perfil de activación :de referencia.

¦En ciertos casos, la modalidad preferida adem'ás puede comprender, es decir, como en la etapa (f), o en forma alterna comprender, es decir, como en la etapa (e) , la etapa de indicar que el fármaco anti-cáncer es inadecuado para el tratamiento del tumor de mama cuando el estado de activación detectado para el uno o más analitos no se disminuye sustancialmente en comparación con el perfil de activación de referencia. " | En ciertos otros casos, la modalidad preferida además puede comprender enviar o reportar los resultados de la etapa (e) a un médico, por ejemplo un oncólogo o médico general. Todavía en otros casos, ' la modalidad preferida además puede comprender registrar o almacenar los resultados de la etapa (e) en una base de datos de computadora u otjra máquina o dispositivo, conveniente para almacenar información, por ej.emplo en un laboratorio.

En algunas modalidades, el estado de activación j de un analito tal como una molécula de transduccion de señal, |se considera "disminuido sustancialmente" en la presencia de i un fármaco anti-cáncer cuando es el menos aproximadamente 5f%, 55%, 60%, 65%, 70%,. 75%, 80%, '85%, 90%, o 95% menos activado que en la ausencia del fármaco anti-cáncer. En otras modalidades, el estado de activación de un analito tal como una molécula de transducción de señal se considera que s "sustancialmente disminuido" en la presencia de un fármaco anti-cáncer (1) cuando hay un cambio de alta o fuerte activación del analito sin el fármaco anti-cáncer a activación media, débil, baja o muy débil del analito, con el fármaco anti-cáncer o (2) cuando hay un cambio de activación media del analito sin el fármaco anti-cáncer a activación débil, baja o muy débil del analito con el fármaco anticáncer.

En algunas modalidades, los métodos de la preserite invención además pueden comprender la etapa de obtener una muestra de un sujeto que tiene un tumor de mama del cual se aislan células de tumor de mama. La muestra puede obtenerse de un sujeto con cáncer de mama ya sea antes del tratamiento con fármaco anti-cáncer (es decir, antes de incubación con |un j fármaco o droga anti-cáncer) o después de administración 'de un fármaco anti-cáncer (por ejemplo, en cualquier momento través del curso del tratamiento de cáncer) .¦ Muestras convenientes incluyen pero no están limitadas a sangre entera, suero, plasma, fluido de lavado ductal, aspirado de pezón, linfa, aspirado de médula ósea, orina, saliva, aspirado de aguja fina (FNA) y sus combinaciones. En una modalidad preferida, la muestra es una muestra de sangre entera o FNA. En .esta modalidad, células en circulación de un. tumor de mama pueden aislarse de la muestra de sangre entera o células de cáncer de mama pueden aislarse de la muestra de FNA. Si se obtienen células aisladas de un sujeto que no ha recibido tratamiento con un fármaco anti-cáncer, las células aisladas pueden incubarse in vitro bajo condiciones convenientes con un fármaco o un coctel de fármacos anJi-cáncer que hacen blanco en uno o más de los analitos detectarse en la etapa (c) .

Las células en circulación de un tumor de mama pueden aislarse de una muestra por cualquier técnica conocida en la especialidad, por ejemplo por separación inmunomagnética, . el sistema CellTracks®, separación microfluidica, FACS, centrifugación de gradiente de densidad y 'métodos de agotamiento (ver Ejemplo 1) . Ejemplos de céluljas de circulación que pueden aislarse de una muestra incluyjen sin limitación, células de tumor en circulación, célullas endoteliales en circulación, células progenitoras endoteliales en circulación, células madre de cáncer, células de tumor dictaminadas y sus combinaciones. Células aisladas tales como células en circulación pueden Usarse para de eJta manera transformar las células aisladas en un extracto celular por cualquier técnica conocida en la especialidad (ver, Ejemplo 1) .

En una modalidad, el tumor de mama se deriva de |un sujeto con carcinoma ductal o carcinoma lobular. Ejemplos |de carcinomas ductales incluyen pero no están limitados | a carcinoma ductal invasivo y carcinoma ductal in situ. Ejemplos no limitantes de carcinomas lobulares incluyen carcinoma lobular invasivo y carcinoma lobular in situ: En ciertos casos, las células de un tumor de mama se aislan del tejido de tumor. El tejido de tumor puede s Ier por ejemplo tejido de tumor primario o tejido dé tumor metastático. En una modalidad preferida^ las células .se aislan del tejido de tumor como una muestra de aspirado de aguja fina (FNA) .

En algunas modalidades, las células aisladas se estimulan in vitro con factores de crecimiento como se describe aquí. En otras modalidades, la droga anti-cáncer puede comprender uno o más de los agentes terapéuticos aquí descritos, incluyendo pero no limitados a anticuerpos monoclonales, inhibidores de tirosiha quinasa, agéntes quimioterapéuticos, agentes terapéuticos hormonales, agentes radioterapéuticos y vacunas.

En modalidades preferidas, el uno o más analitios presentes en el extracto celular comprenden una pluralidad de moléculas de transducción de señal. Ejemplos de moléculas de transducción de señal incluyen sin limitación, receptor de tirosina quinasas, no receptores de tirosina quinasas, componentes de cascada de señalización de tirosina quinasa, receptores de hormona nuclear, coactivadores de receptor nuclear, represores de receptor nuclear y sus combinaciones.

En ciertos casos, la pluralidad de moléculas de transduccion de señal se elige del grupo que consiste de EGFR (ErbBl) , HER-2 (ErbB2), p95ErbB2, HER-3 (ErbB3), HER-4 (ErbB4), Raf, SRC, Mek, NFkB-IkB, mTor, PI3K, VEGF, VEGFR-1 , VEGFR-2 , VEGFR-3, Eph-a, Eph-b, Eph-c, Eph-d, c et, FGFR, cKit, Flt-3, Tie-1, Tie-2, Flt-3, cFMS, PDGFRA, PDGFRB, Abl, FTL 3, RET, Kit, HGFR, FGFR1 , FGFR2, FGFR3 , . FGFR , .IGF-1R, ER, PR, NC AIB1, y sus combinaciones. De preferencia, la pluralidad Jde i moléculas de transducción de señal se elige del grupo que consiste de ErbBl, ErbB2, p95ErbB2, ErbB3, ErbB4, VEGFR-|l, VEGFR-2, VEGFR-3,' ER, PR, y sus combinaciones.

En algunas modalidades, el estado de activación detectado para el uno o más analitos presentes en el extracto celular, puede ser por ejemplo un estado de fosforilación, un estado ubicuitinación, un estado de complejación o formación de complejos, o sus combinaciones.. En otras modalidades, iel soporte sólido puede comprender por ejemplo vidrio, plástico, astillas (chips), espigas, filtros, perlas, papel, membrana, haces de fibras y sus combinaciones. Todavía en otras i modalidades, los anticuerpos de captura se restringen en |el soporte sólido en una matriz direccionable .

En ciertas modalidades, el ensayo en la etapa (c) comprende: (i) incubar (por ejemplo, contactar) el extracto celular con la pluralidad de series de dilución |de i anticuerpos de captura para formar una pluralidad de analitós capturados (por ejemplo, para transformar los analitbs presentes en el extracto celular en complejos de analitós capturados que comprenden los analitós y anticuerpos r capturados) ; (ii) incubar (por ejemplo, contactar) la pluralidad de analitós capturados con anticuerpos dependientes djel estado de activación específicos para los : analitbs correspondientes para formar una pluralidad de analitós capturados detectables (por ejemplo, para transforrfiar ; los complejos de analitós capturados en complejos de analitós capturados detectables que comprenden los analitós capturados y anticuerpos dependientes de estado de activación) ; (iii) . incubar (por ejemplo, contactar) jla pluralidad de analitós capturados detectables con primeros y segundos miembros de un par de amplificación de señal pata generar una señal amplificada; y (iv) detectar la señal- amplificada generada d'el primer y segundo miembros del par de amplificación de señalI En algunos casos, los anticuerpos dependientes Jde estado de activación comprenden un primer miembro de un p¡ar de enlace (por ejemplo, biotina) . En otros casos, el prim'er miembro del par de amplificación de señal (por ejemplo, una peroxidasa tal como HRP) comprende un segundo miembro del par de enlace (por ejemplo estreptavidina) . En ciertos casos, el segundo miembro del par de amplificación de señal puede ser por ejemplo un reactivo tiramida (por ejemplo, biotina-tiramida) . De preferencia, la señal amplificada se genera por oxidación con peroxidada de biotina-tiramida para producir una tiramida activada (por ejemplo, para transformar la biotina-tiramida en una tiramida activada) . La tiramida activada puede detectarse "directamente o detectarse indirectamente, por ejemplo ante la adición de un reactivo de detección de señal. Ejemplos no limitantes de reactivos jde detección de señal incluyen fluoróforos etiquetados con estreptavidina y combinaciones de peroxidasas' etiquetadas con estreptavidina y reactivos cromogénicos tales como 3, 3', 5,5'-tetrametilbencidina (TMB) . | En ciertas otras modalidades, el ensayo en la etajpa (ó) comprende: (i) incubar (por ejemplo, contactar) el extracto celular con la pluralidad de series de dilución de anticuerpos de captura para formar una pluralidad de analitos capturados (por ejemplo, para transformar los analitos presentes en el extracto celular, en complejos de analitjos capturados que comprenden los analitos y anticuerpos |de captura) ; (ii) incubar (por ejemplo, poner en contacto contactar) la pluralidad de analitos capturados con anticuerpos de detección que comprenden una pluralidad |de anticuerpos independientes de estado de activación y una pluralidad de anticuerpos dependientes de estado' de activación específicos para los analitos correspondientes para formar una pluralidad de analitos capturados detectabljes (por ejemplo, para transformar los complejos de analitos capturados en complejos de analitos capturados detectables que comprenden .los analitos capturados y los anticuerpos de detección) , en donde los anticuerpos independientes de estado de activación se etiquetan con una porción facilitadora, los anticuerpos dependientes de estado de activación se etiquetan con un primer miembro de un par de amplificación de señal la porción facilitadora genera un agente de oxidación que canaliza con y reacciona con el primer miembro del par |de amplificación de señal; (iii) incubar (por ejemplo, poner en contacto) la pluralidad de analitos capturados detectables con jun segundo miembro del par de amplificación de señal para generar una señal amplificada; y (iv) detectar la señal amplificada que se genera del primer y segundo miembros del par de amplificación de señal.

Los anticuerpos independientes de estado de activación pueden etiquetarse directamente con la porción facilitadora o etiquetarse indirectamente con la porción facilitadora,, por ejemplo mediante hibridización entre un oligonucleótido conjugado a los anticuerpos independientes |de estado de activación y oligonucleótido complementario conjugado a la porción facilitadora. Similarmente, los anticuerpos dependientes de estado de activación pueden etiquetarse directamente con el primer miembro del par de amplificación de señal o etiquetados indirectamente con el primer miembro del par de amplificación de señal, por ejemplo mediante enlace entre un primer miembro de un par de enlace conjugado con anticuerpos dependientes de estado de activación y un segundo miembro del par de enlace, conjugado al primer miembro del par de amplificación de señal. En ciertos casos, el primer miembro del par de enlace es bioti'na y el segundo miembro del par de enlace es avidina tal ccjmo estreptavidina o neutravidina .

En algunas modalidades, la porción facilitaddra puede ser por ejemplo glucosa oxidasa. En ciertos casos, la glucosa oxidasa y los anticuerpos independientes de estado de activación pueden conjugarse con una molécula de dextrano activado con sulfhidrilo como se describe, por ejemplo, en los Ejemplos 16 y 17.' La molécula de dextrano activado con sulfhidrilo típicamente tiene un peso molecular de aproximadamente 500kDa (por ejemplo, aproximadamente 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, o 750kDa) . En otras modalidades, el agente oxidante puede ser por ejemplo peróxido. de hidrógeno (H2O2) . Todavía en otras modalidades, leí primer miembro del par de amplificación de señal puede s'er por ejemplo una peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante (HRP) . En modalidades adicionales, el segundo miembro del par de amplificación de señal puede ser por ejemplo un reactivo tiramida (por ejemplo, biotina-tiramida) . De preferencia, la señal amplificada se genera por oxidación de peroxidasa de biotina-tiramida para producir una tiramida activada (por ejemplo, para transformar la biotina-tiramida en tiramida activada) . La tiramida activada puede ser detectada directamente o detectada indirectamente, por ejemplo ante la adición de un reactivo de detección de seña' 1 Ejemplos no limitantes de reactivos de detección de señal incluyen fluorósforos etiquetados con estreptavidina y combinaciones de peroxidasas etiquetadas con estreptavidina y reactivos cromogénicos tales como 3,3',5,5¡' tetrametilbencidina (TMB) .

En ciertos casos, la peroxidasa de rábano picantej los anticuerpos dependientes de estado de activación pueden conjugarse a una molécula de dextrano activada con sulfhidrilo. La molécula de dextrano activada con sulfhidrilo típicamente tiene un peso molécular de aproximadamente 70kDa (por ejemplo, aproximadamente 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 7(5, 80, 85, 90, 95, o lOOkDa) .

En algunas modalidades, los métodos de la preserite invención pueden ser útiles para ayudar o asistir en |la selección de una droga o fármaco anti-cáncer conveniente para el tratamiento de un tumor de mama. En otras modalidades, los métodos de la presente invención pueden ser útiles para mejorar la selección de una droga de anti-cáncer conveniente para el tratamiento de un tumor de mama.

En otro aspecto, la presente invención proporciona í un método para identificar la respuesta de un tumor de mamaj tratamiento con un fármaco anti-cáncer, el método comprende I (a) aislar células de un tumor de mama después íde administración de un fármaco anti-cáncer, o antes |de incubación con un fármaco anti-cáncer; (b) lisar las células aisladas para producir |un extracto celular; (c) detectar un estado de activación de uno o más analitos en el extracto celular utilizando un ensayo que comprende una pluralidad de series de dilución de anticuerpos de captura especifico para el uno o más analitos, en donde los anticuerpos de captura se restringen en un soporte sólido; y (d) identificar el tumor de mama como que responde o no responde a tratamiento con el fármaco anti-cáncer al comparar el estado de activación detectado por el uno o más analitos con un perfil de activación de referencia generado en la ausencia del fármaco anti-cáncer.

En ciertos casos, los métodos de la presente invención además pueden comprender enviar o reportar los resultados de la etapa (d) a un médico,, por ejemplo, un oncólogo o un médico general. En ciertos otros casos, los métodos de la presente invención además pueden comprender registrar o almacenar los resultados de la etapa (d) en una base de datos de computadora u otra máquina o dispositivo conveniente para almacenar información, por ejemplo, en un laboratorio .

En una modalidad preferida, el método para identificar la respuesta de un tumor de mama a tratamiento con un fármaco anti-cáncer comprende: (a) aislar células de un tumor de mama después de administración de un fármaco anti-cáncer, o antes de incubación con un fármaco anti-cáncer; i (b) lisar las células aisladas para producir ¡un extracto celular; (c) detectar un estado de activación de uno o más analitos en el extracto celular utilizando un ensayo que comprende una pluralidad de series de dilución de anticuerpjos de captura específicos para el uno o más analitos, en doríde los anticuerpos de captura se restringen en un soporte sólido; (d) comparar el estado de activación detectado pa'ra el uno o más analitos con un perfil de activación de referencia generado en la ausencia del fármaco anti-cáncer; y (e) indicar que el tumor de mama responde tratamiento con el fármaco anti-cáncer cuando el estado jde activación detectado por el uno o más analitos se disminuye substancialmente en comparación ' con el perfil de activacijón de referencia.

En ciertos casos, la modalidad preferida adem'ás pueden comprender, es decir, como etapa (f), o en forma alterna comprender, es decir como etapa (e) , la etapa ¡de indicar que el tumor de mama no responde a tratamiento con el fármaco anti-cáncer cuando el estado , de activación' detectado para el uno o más analitos no se disminuye substancialmente' en comparación con- el perfil de activación de referencia.

En ciertos otros casos, la modalidad preferiida i además puede comprender enviar o reportar los resultados ¡de la etapa (e) a un médico, por' ejemplo, un oncólogo o |un médico general. Todavía en otros casos, la modalidad preferida puede además comprender grabar o almacenar: los resultados de la etapa (e) en una base de datos de computadora u otra máquina o dispositivo conveniente pa'ra almacenar información, · por ejemplo, en un laboratorio.

El estado de activación de un analito (por ejemplo, una molécula de transducción de señal) puede ser "disminui'do substancialmente" en la presencia de un fármaco anti-cáncer como se describe anteriormente. En algunas modalidades, los métodos aquí descritos además pueden comprender la. etapa de obtener una . muestra de un sujeto que tiene un tumor de mama del cual se aislan células de cáncer de mama. La muestra puede obtenerse de un sujeto con cáncer de mama, ya sea antes del tratamiento con fármaco anti-cáncer (por ejemplo, ant'es de incubación con un fármaco anti-cáncer) o después de administración de un fármaco anti-cáncer (por ejemplo, en cualquier momento durante el curso del tratamiento de cáncer) . Muestras convenientes incluyen, pero no están limitadas a sangre entra, suero, plasma, fluido de lavado ductal, aspirado de pezón, linfa, aspirado de médula ósea, orina, saliva, aspirado de aguja fina (FNA), y sus combinaciones. En una modalidad preferida, la muestra es sangre entera o muestra de FNA. En esta modalidad, células en circulación de un tumor de mama pueden aislarse de |la muestra de sangre entera o células de cáncer de mama pueden aislarse de la muestra FNA. Si se obtienen células aisladas de un sujeto que no ha recibido tratamiento con un fármaco anti-cáncer, las células aisladas pueden incubarse in vil.ro bajo condiciones convenientes con uno o un cóctel de fármacos anti-cáncer que hacen diana en uno o más de los analitos a detectarse en la etapa (c) .

Células en circulación de un tumor de mama pueden aislarse de una muestra por cualquier técnica conocida en ¡ la especialidad, por ejemplo, por separación inmunomagnética, |el Sistema CellTracks®, separación microfluidica, FACS, centrifugación de gradiente de densidad y métodos |de agotamiento (ver, Ejemplo 1) . Ejemplos de células en circulación que pueden aislarse de una muestra incluyen stin limitación células de tumor en circulación, células endoteliales en circulación, células progenitoras endoteliales en circulación, células madre de cáncer, células de tumor diseminadas, y sus combinaciones. Células aisladas tales como células en circulación pueden Usarse para de esta manera, transformar las células aisladas en un extracto celular por cualquier técnica conocida en la especialidad {ver, Ejemplo 1) .

En algunas modalidades, el tumor de mama se deriva de un sujeto con carcinoma ductal o carcinoma lobular. Ejemplos de carcinomas ductales incluyen, pero no están limitados a carcinoma ductal invasivo y carcinoma ductal in situ. " Ejemplos no limitantes de carcinomas lobulares incluyen carcinoma lobular invasivo o carcinoma lobular |in situ .

En ciertos casos, las células de un tumor de mama se aislan de tejido de tumor. El tejido de tumor puede por ejemplo, ser tejido de tumor primario o tejido de tumor metastásico. En una modalidad preférida, las células ¡se i aislan del tejido de tumor como una muestra de aspirado 'de aguja fina (FNA) .

En algunas modalidades, las células aisladas Ise estimulan in vitro con factores de crecimiento como se ! i describe aquí. En otras modalidades, la droga anti-cáncer puede comprender uno o más de los agentes terapéuticos aquí descritos, incluyendo pero , no limitados a anticuérpos monoclonales, inhibidores de tirosina quinasa, agentes quimioterapéuticos, agentes terapéuticos hormonales, agentes radioterapéuticos y vacunas.

En modalidades preferidas, el uno o más analitos presentes en el extracto celular comprenden una pluralidad de moléculas de transducción de señal. Ejemplos de moléculas de transducción de señal incluyen sin limitación, receptor de tirosina quinasas, no receptor de tirosina quinasajs, componentes de cascada de señalización de tirosina quinasa, receptores de hormona nuclear, coactivadores de receptor nuclear, represores de receptor nuclear, y sus combinaciones. En ciertos casos, la pluralidad de moléculas de transducción de señal se elige del grupo que consiste de EGFR (ErbBl), HER-2 (ErbB2), p95ErbB2, HER-3 ( ErbB3 ) , HER-4 (ErbB4), Raf, SRC, Mek, NFkB-IkB, mTor, PI3K, VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, Eph-a, Eph-b, Eph-c, Eph-d, cMet, FGFR, cKit, Flt-3, Tie-1, Tie-2, Flt-3, cFMS, PDGFRA, PDGFRB, Abl, FTL 3, RET, Kit, HGFR, FGFR1, FGFR2 , FGFR3, FGFR4, IGF-1R, ER, PR, NCC|R, AIB1, y sus combinaciones. De preferencia, la pluralidad de moléculas de transducción de señal se elige del grupo que consiste de ErbBl, ErbB2, p95ErbB2, ErbB3, ErbB4, VEGFR-1, VEGFR-2 , VEGFR-3 , ER, PR, y sus combinaciones.

En algunas modalidades, el estado de activacijón detectado para el uno o más analitos presentes en el extracto celular puede ser, por ejemplo, un estado de fosforilación, un estado de ubiquitinación, un estado de complej ación, o s|us combinaciones. En otras modalidades, el soporte sólido puejde comprender, por ejemplo, vidrio, plástico, pastillas, chips, espigas, filtros, perlas, papel, membrana, ases de fibras y sus combinaciones. Todavía en otras modalidades, los anticuerpos de captura se restringen en el soporte sólido en una matriz direccionable .

En ciertas modalidades, el ensayo en la etapa (¡c) comprende: (i) incubar (por ejemplo, hacer contacto) del extracto celular con la pluralidad de series de dilución |de anticuerpos de captura para formar una pluralidad de analitos capturados (por ejemplo, para transformar los analiJos presentes en el extracto celular en complejos dé ánalitjos capturados que comprenden los analitos y anticuerpos de captura) ; (ii) incubar (por ejemplo, poner en contacto) la pluralidad de analitos capturados con anticuerpos dependientes de estado de activación específicos para los analitos correspondientes, para formar una pluralidad Jde analitos capturados detectables (por ejemplo, para transformar los complejos de analitos capturados en complejos de analitos capturados detectables que comprende los analitos ¡ capturados y anticuerpos dependientes de estado tíe activación) ; (iii) incubar (por ejemplo, poner en contactb) la pluralidad de analitos capturados detectables con primeros y segundos miembros de un par de amplificación de señal para generar una señal amplificada; y (iv) detectar la señal amplificada que se genera del primer y segundo miembros del par de amplificación jde señal.

En algunos casos, los anticuerpos dependientes de estado de activación comprenden un primer miembro ' de un par de enlace (por ejemplo biotina) . En otros casos, el: primjer miembro del par de amplificación de señal (por ejemplo, una peroxidasa tal como HRP) comprende un segundo miembro del par-de enlace (por ejemplo, estreptavidina) . En ciertos casoL, el Segundo miembro del par de amplificación de señal puede ser por ejemplo un reactivo tiramida (por ejemplo, biotinja-tiramida) . De preferencia, la señal amplificada se gene!ra por oxidación de peroxidasa de biotina-tiramida para producjir una tiramida activada (por ejemplo, para transformar la biotina-tiramida en una tiramida activada) . La tiramida activada puede ser detectada directamente o detectada indirectamente, por ejemplo, ante la adición de un reactivo de activación se etiquetan con una porción facilitadora, los anticuerpos dependientes de estado de activación se etiquetan con un primer miembro de un par de amplificación de señal, la porción facilitadora genera un agente de oxidación que canaliza con y reacciona con el primer miembro del par !de amplificación de señal; (iii) incubar (por ejemplo, poner en contact|o) la pluralidad de analitos capturados detectables con ¡un segundo miembro del par de amplificación de señal pa¡ra generar una señal amplificada; y (iv) detectar la señal amplificada generada del primero y segundo miembros del par de amplificación de señal.

Los anticuerpos independientes de estado de activación pueden ser directamente etiquetados con la porción facilitadora o indirectamente etiquetados con la porción facilitadora, por ejemplo, mediante hibridización entre un oligonucleótido conjugado a los anticuerpos independientes de estado de activación y un oligonucleótido complementario conjugado con la porción facilitadora. Similarmente, los anticuerpos dependientes de estado de activación pueden sjer etiquetados directamente con el primer miembro del par de amplificación de señal o indirectamente etiquetados con el primer miembro del par de amplificación de señal, por ejemplo, mediante enlace entre un primer miembro de un par ¡de enlace conjugado a los anticuerpos dependientes de estado de activación y un segundo miembro del par de enlace conjugado con el primer miembro del par de amplificación de señal. En i ciertos casos, el primer miembro del par de enlace es biotiLa y el segundo miembro del par de enlace es una avidina tjal como estreptavidina o neutravidina .

En algunas modalidades, < la porción facilitadora puede ser por ejemplo, glucosa oxidasa. En ciertos casos, la glucosa oxidasa y losu anticuerpos independientes de estado de activación pueden conjugarse a una molécula dextrano activada con sulfhidrilo como se describe en, e.g., Ejemplos 16 y 17. La molécula de dextrano activado con sulfhidrilo típicamente tiene un peso molecular de aproximadamente 500 kDa (e.g., aproximadamente 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, o 750kDa) . En otras modalidades, el agente oxidante puede ser por ejemplo, peróxido de hidrógeno (H2O2) . Todavía en otras modalidades, el primer miembro del par ¡de amplificación de señal puede ser por ejemplo, una peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante (HRP) . En modalidades adicionales, el segundo miembro del par de amplificación de señal puede ser por ejemplo un reactivo tiramida (íjor ejemplo, biotina-tiramida) . De preferencia, la señal amplificada se genera por oxidación" de peroxidasa de biotina-tiramida para producir una tiramida activada (por ejemplo, para transformar la biotina-tiramida en una tiramida activada) . La tiramida activada puede ser detectada directamente ?' detectada indirectamente, por ejemplo, ante la adición de un reactivo de detección de señal. Ejemplqs no limitantes de los reactivos de detección de señal incluyen fluoróforos etiquetados con estreptavidina y combinaciones de peroxidasas etiquetadas con estreptavidina y ¡ reactivos cromogénicos tales como, e.g. , 3, 3' , 5, 5' -tetrametilbenzidina (TMB) . ; 1 En ciertos casos, la peroxidasa de rábano; picarite los anticuerpos dependientes de estado- de activación pueden conjugarse en una molécula de dextrano activado ' con sulfhidrilo. La molécula de dextrano activado 1 con sulfhidrilo típicamente tiene un peso molecular de aproximadamente 70 kDa (por ejemplo, aproximadamente 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o lOOkDa) .

En algunas modalidades, los métodos de la presente invención pueden ser útiles para ayudar o asistir e la identificación de una respuesta de tumor de mama a tratamiento con un fármaco anti-cáncer. En otras modalidades, los métodos de la presente invención pueden ser útiles para mejorar la identificación de una respuesta de tumor de mama a tratamiento con una droga anti-cáncer. ; Todavía en otro aspecto, la presente invencijon i proporciona un método para pronosticar la respuesta de ¡un sujeto que tiene un tumor de mama a tratamiento con ¡un fármaco anti-cáncer, el método comprende: (a) aislar células de un tumor de mama después |de administración de un fármaco anti-cáncer, o : antes |de incubación con un fármaco anti-cáncer; (b) lisar las células aisladas para producir |un extracto celular; (c) detectar un estado de activación de uno o más analitos en el extracto celular utilizando un ensayo' que comprende una pluralidad de series de dilución de anticuerpos de captura específicos para el uno o más analitos; en doJde los anticuerpos' de captura se restringen en un sopor¡te sólido; y (d) pronosticar la probabilidad de que el suje'to responda a tratamiento con el fármaco anti-cáncer al comparar el estado de activación detectado para el uno o más ánalitJos con un perfil de activación de referencia generado en |la ausencia del fármaco anti-cáncer.

En ciertos casos, los métodos de. la preseríte invención pueden además comprender enviar o reportará los resultados de la etapa (d) a un médico, por ejemplo, un oncólogo o un médico general. En ciertos otros casds,; los métodos de la presente invención además . pueden comprender registrar o almacenar los resultados de la etapa (d) en una base de datos de computadora u otra máquina o dispositivo conveniente para 'almacenar información, por ejemplo, en |un laboratorio.

En una modalidad preferida, el . método para ! pronosticar la respuesta de un sujeto que tiene un tumor de mama a tratamiento con un fármaco anti-cáncer, comprende: (a) aislar células de un tumor de mama después de .administración de un fármaco anti-cáncer, o antes de incubación con un fármaco anti-cáncer; (b) lisar las células aisladas para producir ¡un extracto celular; (c) detectar un estado de activación de uno o mas analitos en el extracto celular utilizando un ensayo qjue comprende una pluralidad de series de dilución de anticuerpjos de captura específicos para el uno o más analitos, en donde los anticuerpos de captura se restringen en un sopor|íte sólido; (d) comparar el estado de activación detectado pa'ra el uno o más analitos con un . perfil de activación de referencia generado en la ausencia del fármaco anti-cáncer; y (e) indicar que el sujeto probablemente responderá al tratamiento con el fármaco anti-cáncer cuando el estado de activación detectado para el uno . o más analitos se disminuye substancialmente en comparación con el perfil de activacijón de referencia.

En ciertos casos, la modalidad preferida ademas puede comprender, es decir, como etapa (f), o en forma alterna comprender, es decir, como etapa (e) , la etapa de indicar que el sujeto no responderá probablemente (ppr ejemplo, tiene una posibilidad poco probable o baja probabilidad de responder) a tratamiento con el fármaco anticáncer cuando el estado de activación detectado para el uno o más analitos no se disminuye substancialmente en comparacijón con el perfil de activación de referencia. j •En ciertos otros casos, la modalidad preferijda además puede comprender enviar o reportar' los resultados de la- etapa (e) a un médico, por ejemplo, un oncólogo o un médico general. Todavía en1 otros casos, la modalidad preferida además puede comprender registrar o almacenar los resultados de la etapa (e) en una base de datos de •computadora u otra máquina o dispositivo conveniente para almacenar información, por ejemplo, en un laboratorio.

El estado de activación de un analito (por ejemplo, una molécula de transducción de señal) puede ser "substancialmente disminuido" en la presencia de un fármaco anti-cáncer como se describió anteriormente. En algunjas modalidades, los métodos aquí descritos además pueden comprender la etapa de obtener una muestra de un sujeto que tiene un tumor de mama del cual se aislan células de cáncer de mama. La muestra puede obtenerse de un sujeto con cáncer de mama ya sea antes del tratamiento con el fármaco antii- cáncer (por ejemplo, antes de incubación con un fármaco antji- cáncer) o después de administración de un fármaco anti-cáncer (por ejemplo, en cualquier momento a' través del curso del tratamiento de cáncer) . Muestras convenientes incluyen, pero no están limitadas a sangre entera, suero, plasma, fluido de lavado ductal, aspirado de pezón, linfa, aspirado de médula ósea, orina, saliva, aspirado de aguja fina (FNÁ) , y sus combinaciones. En una modalidad preferida, la muestra es muestra de sangre entera o de FNA. En esta modalidad, células en circulación de un tumor de mama pueden aislarse jde la muestra de sangre entera o células de cáncer de mama pueden aislarse de la muestra de FNA. Si células aisladas se obtienen de un sujeto que no ha recibido tratamiento: con un fármaco anti-cáncer, las células aisladas pueden incubarse in vitro bajo condiciones convenientes .con un fármaco o un cóctel de fármacos anti-cáncer que hacen diana en . uno , o más analitos a detectarse en la etapa (c) . .

Las células en circulación de un tumor de mama pueden aislarse de una muestra por cualquier técnica conocida en la especialidad, por ejemplo, por separación inmunomagnética, el Sistema CellTracks®, separación microfluidica, FACS, centrifugación con gradiente de densidad y métodos de agotamiento (ver, Ejemplo 1) . Ejemplos de células en circulación que pueden aislarse de una muestra incluyen sin limitación, células de tumor en circulación, células endoteliales en. circulación, células progenitoras endoteliales en circulación, células madre de cáncer, células de tumor diseminado, y sus combinaciones. Células aisladas i tales como células en circulación pueden Usarse para de esta manera transformar las células aisladas en un extracto celular por cualquier técnica conocida en la especialidad ( ver, Ej emplo 1 ) .

En algunas modalidades, el tumor de mama se deriva de un sujeto con carcinoma ductal o carcinoma lobula Ejemplos de carcinomas ductales incluyen, pero no est|án limitados a carcinoma ductal invasivo y carcinoma ductal |m situ. Ejemplos no limitantes de carcinomas lobularjes incluyen carcinoma ' lobular invasivo o carcinoma lobular |m situ .

En ciertos casos, las células de un tumor de mama se aislan de tejido de tumor. El tejido de tumor puede sjer por ejemplo, tejido de tumor primario o tejido de , tum'or metastásico. En una modalidad preferida, las células se aislan de tejido de tumor como una muestra de aspirado de aguja fina (FNA) .

En algunas modalidades, las células aisladas se estimulan in vitro con factores de crecimiento como se describe aquí. En otras modalidades, el fármaco anti-cáncjer puede comprender uno o más de los agentes terapéuticos aquí descritos, incluyendo pero no limitados a anticuerpos monoclonales, inhibidores de tirpsina quinasa; agéntjes quimioterapéuticos , agentes terapéuticos hormonales, agentes radioterapéuticos, y vacunas.

En modalidades preferidas, el uno o más analitos presentes en el extracto celular comprenden una pluralidad de moléculas de transducción de señal. Ejemplos de moléculas de , transducción de señal incluyen sin limitación, receptor de tirosina quinasas, no-receptores de tirosina quinasas, componentes de cascada de señalización de tirosina quinasa, receptores de hormona nuclear, coactivadores de receptor nuclear, represores de receptor nuclear, y sus combinaciones. En ciertos casos, la pluralidad de moléculas de transducción de señal se eligen del grupo que consiste de EGFR (ErbBl), HER-2 (ErbB2), p95ErbB2, HER-3 (ErbB3) > HER-4 (ErbB4) , Raf, SRC, Mek, . NFkB-IkB, mTor, PI3K, VEGF, VEGFR-1,' VEGFR-2, VEGFR-3 , Eph-a, Eph-b, Eph-c, Eph-d, cMet, FGFR, cKit, Flt-3, Tie-1, Tie-2, Flt-3, cFMS, PDGFRA, PDGFRB, Abl, FTL 3', RET , Kit, HGFR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, IGF-1R, ER, PR,. ÑCJR, AIB1, y sus combinaciones. De preferencia, la pluralidad de moléculas de transducción de señal se elige del grupo que consiste de ErbBl, ErbB2, p95ErbB2, ErbB3, ErbB4, VEGFR-¡1, VEGFR-2, VEGFR-3, ER, PR, y sus combinaciones. : ??.· algunas modalidades, el estado de activación detectado para el uno o más analitos presentes en el extracto celular, puede ser por ejemplo, un estado de fosforiíaciión, un estado de ubiquitinación, un estado de comple ación,' o sus combinaciones. En otras modalidades, el soporte sólido puede comprender, por ejemplo, vidrio, plástico, pastillas (chips) , espigas, filtros, perlas, papel, membrana, haces de fibras, sus combinaciones. Todavía en otras modalidades, los anticuerpos de captura se restringen en el soporte sólido !en una matriz direccionable .

En ciertas modalidades, el ensayo en la etapa ( comprende: (i) incubar (por ejemplo, hacer contacto) del extracto celular con la pluralidad de series de dilución de anticuerpos de captura para formar una pluralidad de analitios capturados (por ejemplo, para transformar los analitos presentes en el extracto celular en complejos de analitos capturados que comprenden los analitos y anticuerpos de captura) ; (ii) incubar (por ejemplo, poner en contacto) la pluralidad de analitos capturados con anticuerpos dependientes de estado de activación específicos para los analitos correspondientes,, para formar una pluralidad de analitos capturados detectables (por ejemplo, para transformar los complejos de analitos capturados en complej!os de analitos capturados detectables que comprende los analitos capturados y anticuerpos dependientes de estado de activación) ; (iii) incubar (por ejemplo, poner en contact la pluralidad de analitos capturados detectables con primeros y segundos miembros de un par de amplificación de señal para generar una señal amplificada; y (iv) detectar la señal amplificada que se genera del primer y segundo miembros del par de amplificación de señal.

En algunos casos, los anticuerpos dependientes de estado de activación comprender un primer "miembro de un par de enlace (por ejemplo biotina) . En otros casos, el primer miembro del par de amplificación de señal (por ejemplo, una peroxidasa tal como HRP) comprende un segundo miembro del par de enlace (por ejemplo, estreptavidina) . En ciertos casos, el Segundo miembro del par de amplificación de señal puede ser por ejemplo un reactivo tiramida (por ejemplo, biotin;a- tiramida) . De preferencia, la señal amplificada se genera por oxidación de peroxidasa de biotina-tiramida para producir una tiramida activada (por ejemplo, para transformar la biotina-tiramida en una tiramida activada) . La tiramida activada puede ser detectada directamente o detectJda indirectamente, por ejemplo, ante la adición de un reactJvo de detección de señal. Ejemplos no limitantes de reactivos de detección de señal incluyen fluoróforos etiquetados con • estreptavidina y combinaciones de peroxidasas etiquetadas con estreptavidina y reactivos cromogénicos tales como e.g., 3, 3' , 5, 5' -tetrametilbenzidina (TMB) .

En ciertas otras modalidades, el ensayo en la eta'pa (c) comprende : (i) incubar (por ejemplo, poner en contacto) ¡el extracto celular con la pluralidad de . series de dilución de anticuerpos de captura para formar una pluralidad de .ariaiitos capturados (por ejemplo, para transformar los1 ariaiitos presentes en el extracto celular en complejos . dé analitos-capturados que . comprenden los analitos y anticuerpos ¡de captura ) ; (ii) incubar (por ejemplo, poner en contacto) la pluralidad de analitos capturados con anticuerpos !de detección que comprenden una pluralidad de anticuerpos independientes de estado de activación y una pluralidad de anticuerpos dependientes de estado de activación específicos para los analitos correspondientes, para formar una pluralidad de analitos capturados detectables (por ejemplo, para transformar los complejos de analitos capturados en complejos de analitos capturados detectables que comprenden los analitos capturados y anticuerpos de detección) ; 1 en donde los anticuerpos independientes de1.estado de activación se etiquetan con una porción facilitadora, los anticuerpos dependientes de estado de activación se' etiquetan con un primer miembro de un par de amplificación dé Señal, y la porción facilitadora genera un agente de- oxidación, que canaliza con y reacciona con el primer - miembro del par. |de amplificación de señal; , > (iii) incubar (por ejemplo, poner en co!ntact ) la pluralidad de analitos capturados detectables con un segundo miembro del par de amplificación de señal' patra generar una señal amplificada; y (iv) detectar la señal amplificada generada djel primero y segundo miembros del par de amplificación de señal.

Los anticuerpos independientes de estado Jde i activación pueden ser directamente etiquetados con la porción facilitadora o indirectamente etiquetados con la porción facilitadora, por ejemplo, mediante hibridización entre un oligonucleótido conjugado a los anticuerpos independientes de estado de activación y un oligonucleótido complementario conjugado con la porción facilitadora. Similarmente, ijos anticuerpos dependientes de estado de activación pueden s¡er i etiquetados directamente con el primer miembro del par de amplificación de señal o indirectamente etiquetados con el primer miembro del par de amplificación de señal, por ejemplo, mediante enlace entre un primer miembro de un par de enlace conjugado a los anticuerpos dependientes de estado de activación y un segundo miembro del par de enlace conjugajdo con el primer miembro del par de amplificación de señal. jEn ciertos casos, el primer miembro del par de enlace es ;bipti!na y el segundo miembro del par de enlace es una avidina tal como estreptavidina o neutravidina .

En algunas modalidades, la porción facilitadora puede ser por ejemplo, glucosa oxidasa. En ciertos casos, la glucosa oxidasa y los anticuerpos independientes de estado de activación pueden conjugarse a una molécula dextrano activada con sulfhidrilo como se describe en, e.g., Ejemplos 16 y 17. La molécula de dextrano activado con sulfhidrilo típicamente tiene un peso molecular de aproximadamente 500- kDa (e.g., aproximadamente 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, o 750kDa) . En otras modalidades, el agente oxidaJte puede ser por ejemplo, peróxido de hidrógeno (H2O2) . Todavía en otras modalidades, el primer miembro del par de amplificación de señal puede ser por ejemplo, una peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante (HRP) . En modalidades adicionales, el segundo miembro del .par de amplificación de señal puede ser por ejemplo un reactivo tiramida (¿>or ejemplo, biotina-tiramida) . De preferencia, la señal amplificada se genera por oxidación de peroxidasa de biotiria-tiramida para producir una tiramida activada (por ejemplo,· para transformar la biotina-tiramida en una tiramida activada) . La tiramida activada puede ser detectada directamente o detectada indirectamente, por ejemplo, ante la adición de un reactivo de detección de señal. Ejemplos no limitantes de los reactivos de detección de señal incluyen fluoróforos etiquetados con estreptavidina y combinaciones de peroxidasas etiquetadas con estreptavidina y reactivos cromogénicos tales como, e.g., 3, 3' , 5, 5' -tetrametilbenzidina (TMB) .

En ciertos casos, la peroxidasa de rábano picantel los anticuerpos dependientes de estado de activación pueden conjugarse en una molécula de dextrano activado cbn sulfhidrilo . La molécula de dextrano activado con sulfhidrilo típicamente tiene. un peso molecular de aproximadamente 70 kDa (por ejemplo, aproximadamente 40, 4;5, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o lOOkDa) .

En algunas modalidades, los métodos de la presente invención pueden ser útiles para ayudar o asistir en Ha predicción de la probabilidad que un sujeto responda a tratamiento con un fármaco anti-cáncer. En otras modalidades, los métodos de la presente invención pueden ser útiles para mejorar la predicción de la probabilidad de que un sujeto responda tratamiento con una droga anti-cáncer., En un aspecto adicional, la presente invencijon proporciona una matriz que tiene superior intervalo dinámijco que comprende una pluralidad de series de dilución ¡de anticuerpos de captura restringidos en un soporte sólido, ¡en donde los anticuerpos de captura en cada serie de diluci¡ón son específicos para uno o más analitos que corresponden a ¡un componente de una ruta de transducción de señal u otlra proteína (por ejemplo, receptor de hormona nuclear) en |un extracto celular.

En ciertas modalidades, la ruta de transducción 'de señal puede estar involucrada en proliferación celular. En estas modalidades, los anticuerpos de captura puedjen comprender, por ejemplo uno o más miembros seleccionados del grupo que consiste de anticuerpos reactivos con IGF1R, cMET, ErbBl, ErbB2, p95ErbB2, ErbB3, ErbB4, Shc, PI3K, Erk, Rsk, Akt, p70S6K, ER, PR, NCOR y AIB1. En ciertas otras modalidades, la ruta de transducción de señal puede estar involucrada en angiogénesis de tumor. En estas modalidades, los anticuerpos de captura pueden comprender, por ejemplo uno o más miembros seleccionados del grupo que consiste de anticuerpos reactivos con Shc, PI3K, Erk, Rsk, Akt, p70S6'K, VEGFR-1, VEGFR-2, Tie 2, complejo V-Caderina-R2 , PDGFRA y PDGFRB. Como tales, las matrices" direccionables descritas aquí son particularmente útiles para determinar la expresijón y/o estado de activación de moléculas de transducción ¡de señal y otras proteínas involucradas en cáncer de mama.' En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para detectar la presencia (o ausencia) de un receptor truncado, el método comprende: (a) incubar (por ejemplo, hacer contacto) ¡un extracto celular con una pluralidad de perlas específicas para una región de enlace de dominio extracelular (ECD) de |un receptor de longitud íntegra; (b) retirar la pluralidad de perlas del extracto celular, de esta manera retirando el receptor de longitud (e) incubar (por ejemplo, poner en contacto) la pluralidad de receptores truncados capturados detectables con primeros y segundos miembros de un par de amplificación Le i señal para generar una señal amplificada; y I (f) detectar una señal amplificada generada del primero y segundo miembros del par de amplificación de señal.

I El receptor truncado típicamente es un fragmento jde receptor de longitud íntegra y comparte una región de enlace de dominio intracelular (ICD) con el receptor de longitud íntegra. En ciertas modalidades, el receptor de longitud íntegra comprende una región de enlace de dominlio extracelular (ECD) , un dominio de transmembrana y una región de enlace de dominio intracelular (ICD) . Sin estar ligado o limitado por ninguna teoría particular, el receptor truncado puede surgir a través del procesamiento proteolítico del ECD o del receptor de longitud íntegra o por cualquier inicio de traducción alterno de residuos metionina que se ubican antejs, dentro o después del dominio de transmembrana, por ejemp o, para crear un receptor truncado con el ECD recortado o jun ' I receptor truncado que comprende un fragmento ICD citosólico! o asociado con membrana.

En ciertas modalidades preferidas, el' receptjor truncado es p95ErbB2 y el receptor de longitud íntegra correspondiente es ErbB2 (HER-2) . Sin embargo, una persojna con destreza en la técnica apreciará que los métodos aquí descritos para detectar proteínas truncadas pueden aplicarse a una cantidad de diferentes proteínas incluyendo pero no limitadas al mutante EGFR VIH (implicado en glioblastoma, cáncer colorectal, etc.), otros receptores de tirosi a quinasa truncados, caspasas y semejantes. El Ejemplo 12 proporciona una modalidad ejemplar de los métodos de ensayo de la presente invención para detectar, receptores truncados tales como p95ErbB2 en células raras en circulación utilizando un ELISA de micromatriz de detección sencilla, alto rendimiento, multiplex, que tiene superior intervalo dinámico.

En. algunas modalidades, la pluralidad de perlas específicas para una región de enlace ECD comprende un par estreptavidina-biotina, en donde la estreptavidina se conecta a la perla y la biotina se conecta a un anticuerpo. lEn ciertos . casos, el anticuerpo es específico para la región ¡de enlace ECD del receptor de longitud íntegra. En otras modalidades, el extracto celular se produce por lisis de las células en circulación de un tumor sólido, tal como por ejemplo un tumor de mama. Las células en circulación pueden aislarse de una muestra por cualquier técnica aquí descritL, por ejemplo, por separación inmunomagnética . Muestras convenientes incluyen, pero no están limitadas a sangre entera, suero, plasma, fluido de lavado ductal, aspirado de pezón, linfa, aspirado de médula ósea, orina, saliva, aspirado de aguja fina, y sus' combinaciones. En una modalidad preferida, la muestra es sangre entera. En forma I alterna, el extracto celular se produce por lisis de céluljas aisladas de tejido de tumor tal como por ejemplo, tejido ^ie tumor de mama. El tejido de tumor puede ser por ejemplo, tejido de tumor primario o tejido de tumor metastásicp. En ! una modalidad preferida, las células se aislan de tejido ¡de tumor como una muestra de aspirado de aguja fina (FNA) .

En algunas modalidades, las células aisladas se estimulan in vitro con factores de crecimiento comó se describe aquí. En otras modalidades, las células aisladas jse incuban con un fármaco anti-cáncer antes de estimulo de factor de crecimiento. Fármacos anti-cáncer convenientes incluyen uno o más de los agentes terapéuticos descritos aqui, tales como por ejemplo, anticuerpos monoclonales , inhibidores de tirosina quinasa, agentes quimioterapéuticos , agentes terapéuticos hormonales, agentes radioterapéuticos y vacunas. j En ciertas modalidades, un estado de activación ¡de la pluralidad de receptores truncados capturados detectables se interroga. El estado de activación a interrogar puede ser por ejemplo, un estado de fosforilación, un estado de ubiquitinación, un estado de complejado, o sus combinaciones. En ciertas otras modalidades, el soporte de sólido al cual la pluralidad de anticuerpos capturados se restringe, . puede comprender, por ejemplo, vidrio, plástico, pastillas (chips) , espigas, filtros, perlas, papel, membrana, haces de fibras y sus combinaciones. En modalidades adicionales, la pluralidad de anticuerpos de captura se restringe en el soporte sólijdo en una matriz direccionable.

En algunos casos, los anticuerpos de deteccijón comprenden un primer miembro de un par de enlace {por ejemplo, biotina) . En otros casos, el primer miembro ,áel par de amplificación de señal (por ejemplo, una peroxidasa tal como HRP) comprende un segundo miembro del par de enlace (por ejemplo, estreptavidina) . En ciertos casos, el segundo miembro del par de amplificación de señal ' puede ser por ejemplo un reactivo tiramida (por ejemplo, biotina-tiramida) . De preferencia, la señal amplificada se genera por oxidación de peroxidasa de biotina-tiramida para producir un tiramida activada (por ejemplo, para transformar la biotina-tiramida i en una tiramida activada). La tiramida activada puede s r detectada directamente o. detectada indirectamente, por ejemplo, ante la adición de un reactivo de detección de señal. Ejemplos no limitantes de reactivos de detección de señal incluyen fluoróforos etiquetados con estreptavidina y combinaciones de peroxidasas etiquetas con estreptavidina y reactivos cromogénicos tales como por ejemplo 3, 3', 5,5'-tetrametilbenzidina (???)·.

En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona un método para detectar la presencia (o ausencia) de un receptor truncado, el método comprende: (a) incubar (por ejemplo, hacer contacto) u"n extracto celular con una pluralidad de perlas especificas para una región de enlace de dominio extracelular (ECD) de un receptor de longitud integra; | (b) retirar la pluralidad de perlas del. extracto celular, de esta manera retirando el receptor dé longitud integra para formar un extracto celular carente del receptor de longitud integra (por ejemplo, para transformar el extracto celular en un extracto celular ' carente de un receptor de longitud integra especifico o .familia e receptores de longitud integra) ; (c) incubar {por ejemplo, poner en contacto) !el extracto celular carente del receptor de longitud integra con una pluralidad de anticuerpos de captura, en donde la pluralidad de anticuerpos de captura es especifica para una región de enlace de dominio intracelular (ICD) de un receptLr truncado y en donde la pluralidad de anticuerpos de captura se restringe en un soporte sólido para formar una pluralidad de receptores truncados capturados (por ejemplo, para transformar el receptor truncado presente en un éxtracto celular agotado del receptor de longitud integra y complej os de receptores truncados y anticuerpos de captura) ; (d) incubar (por ejemplo, poner ' en contacto) la i pluralidad de receptores truncados capturados con anticuerpos de detección que comprende una pluralidad de anticuerpos independientes de estado de activación vy una pluralidad de anticuerpos dependientes de estado de activación específicos para los receptores truncados correspondientes para formar una pluralidad de receptores truncados capturados detectables (por ejemplo, para transformar los complejos de receptores truncados capturados en complejos de receptores truncados capturados detectables que comprenden los receptores truncados capturados y anticuerpos de detección) , en donde los anticuerpos independientes de estado de activación se etiquetan con una porción facilitadora, los anticuerpos dependientes de estado de activación se etiquetan con un primer miembro de un par de amplificación de señal la porción facilitadora genera un agente de oxidación q|ue canaliza con y reacciona con el primer miembro del par jde amplificación de señal; (e) incubar (por ejemplo, poner en contacto) !la pluralidad de receptores truncados capturados detectables Jon I un segundo miembro del par de amplificación de señal pajra generar una señal amplificada; y (f) detectar la señal amplificada generada del primer y segundo miembros del par de amplificación de s¾ñal En un aspecto adicional, la -presente invención proporciona un método para detectar la presencia (o ausencija) de un receptor truncado, el método comprende: (a) incubar (por ejemplo, hacer contacto) un extracto celular con una pluralidad de perlas especificas i para una región de enlace de dominio extracelular (ECD) de ün receptor de longitud Integra; \ (b) retirar la pluralidad de perlas del extracjto celular, de esta manera retirando .el receptor de longitud integra- para formar un extracto celular carente del receptor de longitud, integra (por ejemplo, para transformar íel extracto celular en un extracto celular carente dé un receptor de longitud integra especifico o familia de receptores de longitud integra) ; . (c) incubar (por ejemplo, poner en contacto) el extracto celular carente del receptor de longitud integra con una pluralidad de anticuerpos de captura, en , donde la pluralidad de anticuerpos de captura es especifica para una región de enlace de dominio intracelular (ICD) de un receptor truncado y en donde la pluralidad de anticuerpos de captura se restringe en un soporte sólido para formar una pluralidad de receptores truncados capturados (por ejemplo, , para transformar el receptor truncado presente en un extracto celular agotado del receptor de longitud integra y' complejos de receptores truncados y anticuerpos de captura) ; ¦ (d) incubar (por ejemplo, poner en contacto) la pluralidad de receptores truncados capturados con anticuerpos de detección específicos para los receptores truncados correspondientes, para formar una pluralidad de receptores truncados capturados detectables (por . ejemplo, para transformar los complejos de receptores truncados capturados en complejos de receptores truncados capturados detectables que comprenden los receptores- truncados capturados anticuerpos dependientes de estado de activación) ; (e) incubar (por ejemplo, poner en contacto) la pluralidad de receptores truncados capturados detectables con primeros y segundos miembros de un par de amplificación de señal para generar una señal amplificada; y | (f) detectar una señal amplificada generada, djel primero y segundo miembros del par de amplificación de señal.

El receptor truncado típicamente es un fragmento [le receptor de longitud íntegra y comparte una región de enlace de dominio intracelular (ICD) con el receptor de longitjud íntegra. En ciertas modalidades, el receptor de longitud íntegra comprende una región de enlace de dominio extracelular (ECD) , un dominio de 'transmembrana y una región de enlace de dominio intracelular (ICDJ. Sin estar ligado o limitado por ninguna teoría particular, el · receptor truncado puede surgir a través del procesamiento proteolítico del ECD o del receptor de longitud íntegra o por cualquier inicio |de traducción alterno de residuos metionina que se ubican antejs, dentro o después del dominio de transmembrana, por ejemplo, células en circulación de un tumor sólido, tal como por ejemplo un tumor de mama. Las células en circulación' pueden aislarse de una muestra por cualquier técnica aquí descrita, por ejemplo, por separación inmunomagnética . 1 Muestras convenientes incluyen, pero no están limitadas a sangre entera, suero, plasma, fluido de lavado ductal, aspirado Le pezón, linfa, aspirado de médula ósea, orina, saliva, aspirado de aguja fina, y sus combinaciones. En una modalidad preferida, la muestra es sangre entera. En forma alterna, el extracto celular se produce por lisis de células aisladas ' de tejido de tumor tal como por ejemplo, tejido de tumor de mama. El tejido de tumor puede ser por ejemplo, tejido de tumor primario o tejido de tumor metastásicp. En una modalidad preferida, las células se aislan de tejido de tumor como una muestra de aspirado de aguja fina (FNA) .

En algunas modalidades, las -células aisladas se estimulan in vitro ¦ con factores de crecimiento como se describe aquí. En otras modalidades, las células aisladas se incuban con un fármaco anti-cáncer antes de estimülo de factor de crecimiento. Fármacos anti-cáncer convenientes incluyen uno o más de los agentes terapéuticos déscritos aquí, tales como por ejemplo, anticuerpos monoclonalés , inhibidores de tirosina quinasa, agentes quimioterapéuticcjs, agentes terapéuticos hormonales, agentes radioterapéuticosj y vacunas .

En ciertas modalidades, un estado de activación de la pluralidad de receptores truncados' capturados detectables se interroga. El estado de activación a interrogar puede ser por ejemplo, un estado de fosforilación, un estado jde ubiquitinación, un estado de complejado, o sus combinaciones . En ciertas otras modalidades, el soporte de sólido al cual la pluralidad de anticuerpos capturados se restringe, puede comprender, por ejemplo, vidrio, plástico, pastillas (chips espigas, filtros, perlas, papel, membrana, haces de fibras sus combinaciones. En modalidades adicionales, la pluralidad de anticuerpos de captura se restringe en el soporte sólido en una matriz direccionable .

Los anticuerpos independientes de estado de activación pueden ser directamente etiquetados con la porción 'facilitadora o indirectamente etiquetados con la porción facilitadora, por ejemplo, mediante hibridización entre un oligonucleótido conjugado a los anticuerpos independientes de estado de activación y un oligonucleótido complementario conjugado con la porción facilitadora. Similarmente, ]los anticuerpos dependientes de estado de activación pueden ser etiquetados directamente con el primer miembro del par de amplificación de señal o indirectamente etiquetados con el primer miembro del par de amplificación de señal, por ejemplo, mediante enlace entre un primer miembro de un par |de enlace conjugado a los anticuerpos dependientes de estado de activación y un segundo miembro del par . de enlace conjugado directamente o detectada indirectamente, por ejemplo, ante la adición de un reactivo de detección de señal. Ejemplos rio ? limitantes de los reactivos de detección de señal ' incluyen ser útiles para ayudar o asistir en diagnóstico · de cáncer, pronóstico o en 'el diseño de tratamientos de cáncer (p¡or ejemplo al ayudar o asistir en (i) la selección de un fármaco anti-cáncer conveniente para ' el tratamiento de un tumor de mama, (ii) la identifica.ción de la respuesta de tumor de mama a tratamiento con un fármaco anti-cáncer o (iil). la predicción de la probabilidad de que un sujeto responda tratamiento con un fármaco anti-cáncer.

En otras modalidades, los métodos de ensayo de ía presente invención para detectar la presencia (o ausencia ; o nivel) de un receptor truncado tal como p95ErbB2, pueden ser útiles para mejorar diagnóstico de cáncer, pronóstico o él diseño de tratamientos de cáncer, por ejemplo al mejorar (i), la selección de un fármaco anti-cáncer conveniente para él tratamiento de un tumor de mama, (ii) la identificación de la respuesta de un tumor de mama a tratamiento con un fármaco anti-cáncer, 0 (iii) la predicción de la probabilidad de lan sujeto a responder al tratamiento con un fármaco anti-cáncer, IV: Cáncer de Mama El cáncer de mama es la quinta causa más común de muerte de cáncer en todo el mundo, después de cáncer i pulmonar, cáncer de estómago, cáncer de hígado y cáncer !de colon. En el 2005, el cáncer de mama provocó 502,000 muerdes en todo el mundo. Entre mujeres de todo el mundo, , el cán er de mama es la causa más común de muerte pór cáncer.

En los E.U.A., el cáncer de mama es' la tercer cau'sa más común de muerte por cáncer, después de cáncer pulmonar y cáncer de colon. En 2007, cáncer de mama provocó más de 40,000 muertes en los E.U.A.. Entre mujeres en los E.U.A., el i cáncer de mama, es el cáncer más común y la segunda causa más común de muerte por cáncer. De hecho, mujeres en los E.U A. tienen una probabilidad de 1 a 8 en el curso de vida de desarrollar cáncer de mama invasivo y una posibilidad de 1 en 33 de que el cáncer de mama provoque su muerte. ! El número de casos de cáncer de mama en todo él mundo ha aumentado significativamente desde 1970, un fenómeno que parcialmente se inculpa en los estilos de vida modernos en el mundo occidental. Debido a que la mama está compuesta por tejidos idénticos en hombres y mujeres, el cáncer de mama también ocurre en hombres, aunque es menos común.

Clasificación Los cánceres de mama pueden describirse, utilizando cuatro diferentes esquemas de clasificación, cada uno basado en los siguientes criterios: 1. Patología. El patólogo puede categorizar cada tumor con base en su apariencia histológica y otros criterios. Los tipos patológicos más comunes de cáncer de mama son carcinoma ductal invasivo y carcinoma lobular invasivo . 2. ' Grado de tumor. El grado histológico puede determinarse por el patólogo bajo el microscopio. Un tumjor bien diferenciado (de bajo grado) semeja tejido normal, jün tumor deficientemente diferenciado (alto grado) está compuesto por células desorganizadas y no parece como tejido normal. Tumores moderadamente diferenciados (grado intermedio) están algo intermedio. 3. Estado de expresión génico y de proteínas ^ líos cánceres de mama pueden probarse para expresión y/o activación de moléculas de transducción de señal tales como I por ejemplo el receptor de estrógeno (ER= Estrogen Receptor) receptor de progesterona (PR= Progesterone Receptor), Her2/Neu/ErbB2. Como se describe aquí,- el perfil de expresión de un tumor dado ayuda en la predicción de su pronóstico asiste al oncólogo para seleccionar el tratamiento mas apropiado . 4. Etapa del tumor. Los cánceres de mama puedan organizarse' de acuerdo con el sistema de clasificación TNM: a. Tumor. Cinco valores (Tis, TI, T2, T3, o T.4 ) dependiendo de la presencia o ausencia de cáncer invasivp, las dimensiones del cáncer invasivo y la presencia o ausenc!ia de invasión fuera de la mama (por - ejemplo a la piel de ila mama o al músculo o tórax, o caja torácica subyacente) . b. Nodo linfático. Cuatro valores (NO, NI, N2, N3) dependiendo del número, tamaño y ubicación de depósitjos metastásicos en nodos linfáticos. iI c. Metástasis. Dos valores (MO o MI) dependieJdo I de la presencia o ausericia de metástasis diferente a nodos linfáticos (asi denominadas metástasis distantes por ejemjlo al hueso, cerebro, pulmón, etc.).

Patología Con respecto a la patología, la clasificación de |la Organización Mundial de la Salud (World Health Organization' s ) de tumores' de mama, establece los siguientes tipos histológicos: y carcinoma de mama bilateral; 2. Lesiones precursoras tales como neoplasia lobular (por ejemplo, carcinoma lobular in situ) , lesiones proliferativas intraductales (por ejemplo, hiperplasia ductal usual, hiperplasia epitelial plana, hiperplasia dúctil atipica, carcinoma ductal in situ) , carcinoma micro invasivo y neoplasmas papilares intraductales (por ejemplo papiloma central, papiloma periférico, papiloma atipico, carcinoma papilar intraductal, carcinoma papilar intracistico, lesiones epiteliales benignas) ; J i 3. Lesiones epiteliales benignas tales . como adenosis, incluyendo variantes (por ejemplo adenosis esclerosante, adenosis apocrina, adenosis de conductos romos??blunt, adenosis micrograndular, adenosis adenomioepitelial) , lesión esclerosante compleja/cicatriz radial y adenomas (por ejemplo adenoma tubular, adenoma lactante, adenoma apocrino, adenoma pleomórfico, adenoma ductal) ; 4. Lesiones mioepiteliales tales como mioepiteliosis , adenosis adenomioepitelial, adenomioepitelioma y mioepitelioma maligno; 5. Tumores mesenquimales tales como sarcomja, haemangioma, angiomatosis, haemangiopericitoma, hiperplasjia estromal pseudoangiomatosa, miofibroblastoma, .fibromatosjis (agresiva) , tumor miofibroblástico inflamatorio, lipoma (p.or ejemplo, angiolipoma) , tumor de, células granulares, 1 neurofibroma, schwannoma, -angiosarcoma, liposarcomja, rabdomiosarcoma, osteosarcoma, leiomioma y leiomisarcoma; 6. Tumores fibroepiteliales tales como fibroadenóma, tumor filoides (por ejemplo benigno, fronteja, maligno), sarcoma estromal periductal de bajo grado, hamartoma mamario; 7. Tumores de pezón tales como adenoma de pezón, adenoma siringomatoso y enfermedad de Paget del pezón; 8. Linfoma maligno; 9. Tumores metastásicos; y 10. Tumores de pecho masculino tal como ginecomastia y carcinoma in situ o invasivo.

Carcinoma ductal es el tipo más común de . cáncer ¡de mama en mujeres y se refiere al desarrollo de células jde I cáncer dentro de los ductos lácteos de la mama. Viene en dos formas: Carcinoma ductal invasivo (IDC= Invasive Ductal Carcinoma) , un neoplasma maligno invasivo; y un carcinoma ductal in situ (DCIS = Ductal Carcinoma In Situ) , un neoplasma no invasivo. IDC es la forma más común de cáncer de mama invasivo, representa aproximadamente 80% de todos ljos tipos de cáncer de- mama. En una mamografia, usualmente ;se visualiza como una" masa con picos finos que radian desde los bordes. Ante examen físico, esta masa usualmente se siente. , i mucho más dura o más firme que las lesiones de mama benignas.

En examen microscópico, las células cancerosas invaden < y reemplazan los tejidos normales circundantes. DCIS es el tipo i más común de cáncer de mama no invasivo en mujeres. Conforme se ha difundido más el examen de mamografia, DCIS se ha vuelto una de las condiciones de mama más comúnmente diagnosticadas. A menudo se refiere como cáncer de mama de "etapa cero". DCIS usualmente se descubre a través de un mamograma como manchas muy pequeñas de calcio conocidas como microcalcificaciones . Sin embargo, no todas las microcalcificaciones indican la presencia de DCIS, que debe' confirmarse por biopsia. DCIS debe ser multifocal y el tratamiento se dirige a cortar todos los elementos- de duclto anormales, dejando márgenes claros. Después del tratamiento de corte a menudo incluye terapia de radiación local. Con tratamiento apropiado, DCIS es poco probable' que se desarrolle en cáncer invasivo. La excisión quirúrgica con radiación reduce el riesgo de que DCIS recurra o que ¡el cáncer de mama invasivo se desarrolle. ! Carcinoma lobular invasivo (ILC = Invasive Lobular Carcinoma) es un tipo de cáncer de mama que empieza en un lóbulo y se dispersa al tejido de mama circundante. Si no se trata en una etapa temprana, ILC puede desplazarse a otras partes del cuerpo tales como el útero u ovarios. ILC es el segundo tipo más común de cáncer de mama invasivo, que representa aproximadamente 10-15% de todos los casos de cáncer de mama. ILC se caracteriza por un engrosamiento general de un área de la mama,, usualmente la sección sobre él pezón y hacia el brazo. ILC es menos probable que aparezca en un mamograma . Cuando aparece, puede mostrarse como una masa con picos finos radiando desde los bordes o aparece como una asimetría en comparación con la otra mama.

Terapias I Una cantidad de alteraciones en componentes de transducción de señal clave se ha demostrado en cáncer de mama. Estos incluyen: mutaciones EGFR que resultan ¡en activación; activación de otros receptores de tirosi!na quinasas tales como cMet; activación EGFR con HER-2 y activación HER-3 o amplificación HER-2; activación EGFR c!on mutación PI3K; activación EGFR con deleción PTEN; ¡ y activación EGFR con mutación Ras. Diversas alteraciones en diferentes componentes de rutas de transducción de señal jse han dirigido por diversas formas de quimioterapia.

Al- mismo tiempo, la formación de nuevos vasos sanguíneos en células de tumor, un proceso denominado angiogénesis, puede ser dirigida. VEGF es un factor de supervivencia de células endoteliales que es esencial para la formación de nuevos vasos sanguíneos. De acuerdo con esto, un enfoque a la modulación 'de angiogénesis mediada por VEGF es utilizar anticuerpos dirigidos contra la propia proteína VEGF o VEGFR. Bevacizumab, un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante a VEGF, actúa en forma sinergistica con ! quimioterapia y se ha mostrado que mejora la supervivencia en pacientes con cánceres colorectales , de mama y de pulmón.

Todas las terapias endocrinas se diseñan para bloquear la función .de receptor de estrógeno (ER) en una forma única. Por ejemplo, moduladores de receptor de estrógeno selectivos (SERMs = Selective Estrogen Receptor Modulators ) . tales como tamoxifen ligan ER y bloquean parcialmente su actividad. Ablación de ovarios, agonistas de hormona para liberación de hormona luteinizante, e inhibidores de aromatasa tales como anastrozol (Arimidex®) , letrozol (Femara®) , y exemestano (Aromasin®) reducen el -nivel de estrógeno e inhiben la activación inducida por ligando jde ER. El ideal SERM deberá funcionar como un antiestrógeno en la mama y útero y un agonista · de estrógeno parcial en los sistemas esquelético, cardiovascular y nervioso central, asi como el tracto gastrointestinal y la vagina.

Antiestrógenos esferoidales tales como fulvestra'nt ligan ER más cerradamente, por lo tanto bloquean por complejto su función e inducen degr'adación de receptor.

Tamoxifen, un modulador de receptor de estróge'no selectivo (ER)., es el fármaco más ampliamente empleado pjra el tratamiento de cáncer de mama ER positivo. Estudios de terapia adyuvante de tamoxifen muestran una reducción de 40% a 50% en las probabilidades de recurrencia y mortalidad.

Tamoxifen también proporciona remisión temporal en 30% a 50% de pacientes con enfermedad, metastásica y es también efectivo para la prevención de cáncer de mama.

Inhibidores de aromatasa se están volviendo la norma' para el cuidado en el tratamiento de mujeres postmenopáusicas con cáncer de mama, mientras que tamoxifen permanece la norma en mujeres^ pre-menopáusicas . Aunque los inhibidores de aromatasa pueden ser ligeramente más efectivos que el tamoxifen, permanece como un fármaco importante debido a sus beneficios documentados en secuencia con estos agentjes para terapia adyuvante, y debido a que continuará en tener un papel en enfermedad metastásica.

Resistencia Resistencia de novo (sin respuesta a terap¡ia inicial; resistencia primaria) y resistencia adquirida (relapso de enfermedad o avance después de mostrar una respuesta inicial a la terapia; resistencia secundaria) a i tamoxifen son problemas mayores. Como resultado, el comprender ' la biología · de tumor y los mecanismos de resistencia .puede proporcionar implicaciones clinidas significantes.

Biología ER/PR: ER y PR son receptores de hormonjas nucleares que funcionan como factores de transcripción en el núcleo cuando se enlazan a ligando (s). ER y PR tienen estructuras similares y contienen un dominio de enlace |de ADN, un dominio de dimerización, un dominio de enlace de hormona y varios dominios de activación de transcripción. Una mayor reducción en riesgo para recurrencia se notó para pacientes con tumores ER positivos, PR positivos en comparación con aquellos con tumores ER positivos, PR negativos .

Función ER: El enlace de hormona a ER activa la proteina a través de fosforilación, disocia proteínas chaperonas tales como proteínas de choque térmico 90, altera su conformación. ER ligado a hormona ("activado") entonces dimeriza con otro receptor y el dímero liga elementos de respuesta a estrógeno (secuencias de ADN I específicas), presentes, en el promotor de¦ genes que respondan a estrógeno. Dímeros ER ligados a promotor forman un complejo con proteínas co-regulatorias tales como amplificajdo en cáncer de mama 1 (AIB1 o SRC3) que actúan en forma coordinada para influenciar la transcripción de genes . jde respuesta a estrógeno. Típicamente, co-activadores ligan |ER cuando el receptor se liga por estrógeno, mientras que los co-represores ligan cuando ER se enlaza por tamoxifen. AljBl está sobre-expresado en 65% de cánceres de mama y el gjen correspondiente se amplifica en 5%. Altos niveles de AI¡B1 pueden contribuir a resistencia de SERM al mejorar la actividad agonista de estrógeno (por ejemplo tratar con inhibidores de aromatasa) . Dímeros ER también forman complejos con proteínas co-represoras tales como NCOR, paira reducir la expresión génica de ciertos genes (por ejemplo H0XB13) .

Varias quinasas en las redes de señalización de factor de crecimiento también pueden activar ER en un proceso denominado activación independiente de ligando. Bajo ciertas condiciones, tales como alta actividad de familia . ErbB : (por ejemplo, alta actividad HER-2 o HER-1), ER ligado a complejos de tamoxifen con AIB1, resulta en incrementada actividad de agonista de estrógeno de tamoxifen (por ejemplo, tratar con inhibidores de aromatasa o fulvestran junto con inhibidores i de quinasa) .

Esta acción ER · no nuclear o señalización de esteroide iniciada por membrana (MISS = membrane-initiated steroid signaling) ocurre dentro de minutos de la adición de estrógeno. SER s tales como tamoxifen también puede activar - ER de membrana. Estos receptores se han encontrado jen células de hueso, neurales, uterinas, de grasa I y endoteliales . Mecanismos por los cuales el estrógeno ' activa La función ER de membrana empiezan a aclararse. Interacciones directas entre ER con una variedad de moléculas de señalización de membrana tales como el receptor de factor de crecimiento tipo insulina 1, la subunidad regulatoria p85 de PI3K, Src y Shc, una proteína que puede .acoplar directamente ER a una variedad de receptores de factor de crecimiento tirosina quinasa, se han observado. La activación de estas rutas por estrógeno envía poderosas señales proliferativas de células y supervivencia de células por activación de Akt y MAPK. Además, estas quinasas pueden fosforilar ER y sus coreguladores para aumentar la señalización ER nuclear. La fosforilación de estas proteínas también puede aumentar la actividad tipo agonista Le estrógeno de tamoxifen y otros SERMs.

El anti-estrógeno puro fulvestrant no, activa ER de membrana de esta manera; sin embargo, SERMs tales como tamoxifen activan ER de membrana en una forma similar estrógeno. Los efectos de membrana de ER, como su actividad nuclear, puede ser específico de célula, subtipo receptor y de ligando y también pueden in luenciarse por el medio de señalización de factor de , crecimiento que es mucho más prominente, por ejemplo en cánceres de, mama que sobjre expresan ErbBl o HER-2. El estímulo de la actividad ,MISS de ER por tamoxifen y otros SERMs puede en parte explicar la resistencia a estos agentes en ocasiones observada en tumores que sobre expresan HER-2.

Además de funciones ER asociadas con el núcleo membrana de plasma (la señalización de esteroide iniciada por membrana; MISS) , ER conjuga con otras moléculas de ruta ; pajra facilitar subsecuente avance de tumor. Esta interferencia molecular puede mejor tratarse con inhibidores de aromatasá y no SER s.

ER tiene al menos dos funciones principales. Sirve como un factor de transcripción para genes reguladojs-estrógeno y un co-activador para otros factores de transcripciones en el núcleo. También funciona 'en Jel citoplasma y · en la membrana de plasma para activar señalización de factor de crecimiento. En algunos tumores de mama, particularmente aquellos con rutas de señalización de factor de crecimiento altamente activas tales como amplificación HER-2, se establece un ciclo vicioso en doJde el estrógeno activa la señalización de factor de crecimiéntL, y la ruta de señalización de factor de crecimiento activa más ER. El estrógeno en estos tumores se esperaría que fuera jun factor dominante al activar múltiples rutas importantes en avance de tumor. Esta interferencia .molecular tidne implicaciones importantes para el tratamiento de cáncer de mama. Como un ejemplo, terapia de privación de estrógeno ojón inhibidores de aromatasa,. deberá ser más efectiva que SERMs en tumores amplificados HER-2 al desactivar ambas actividades de señalización de esferoide de inicio nuclear como MISS Jde ER.

Enfermedad Metastática Dos tercios o más de tumores de mama dependen del estrógeno para crecimiento. Un número de agentes que bloquean estrógeno pueden emplearse · para tratamiento de cáncer de mama metastático. La respuesta de tratamiento! estos agentes no es pronosticable, sin embargo, i aproximadamente un tercio de pacientes · con cáncer de mama metastático con receptores para estrógeno o progesterona, no tienen beneficio de. la terapia hormonal. Casi todos los. pacientes con cán'cer de mama metastático eventualmente se volverán resistentes a terapia hormonal a pesar del hecho de que los receptores de hormonas todavía están presentes.

La selección de terapia se determina con base en la activación de las rutas de señalización o una mejor comprensión de la biología de tumor. La presente invención proporciona venta osamente una metodología de ensayo junto con un chip de pronóstico/diagnóstico para ayudar a los oncólogos a decidir el mejor tratamiento para pacient|es individuales. ' V. Construcción de Matrices de Anticuerpo En ciertos aspectos, el estado de activación de u'na pluralidad de moléculas de transducción de señal en un extracto celular de células de tumor, tales como células en circulación de un tumor sólido, se detecta utilizando una matriz basada en anticuerpo . que comprende una serie de dilución de anticuerpos de captura restringidos en un soporte sólido. Las matrices típicamente comprenden una pluralidad de diferentes anticuerpos de captura en un intervalo de concentraciones de anticuerpo de captura que se acopla con la superficie del soporte sólido en diferentes sitios direccionales .

El soporte sólido puede comprender cualquier substrato conveniente , para inmovilizar proteínas. Ejemplos de soporte sólidos incluyen, pero no están limitados a, vidrio (por ejemplo, portaobjetos de vidrio) , plástico, astillas (chips) , espigas, filtros, perlas, papel, membranas, haces de fibras, . geles, metales, cerámicas y semejantes. Membranas tales como nylon (Biotrans™, ICN Biomedicals, InL. (Costa Mesa, CA) ; Zeta-Probe®, Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA) ) , nitrocelulosa (Protran®, Whatman In . (Florham Park, NJ) ) , y PVDF (Immobilon™, Millipore Corp. (Billerica, MA) ) son adecuadas para utilizar como soportes sólidos en las matrices de la presente invención. De preferencia, los anticuerpos de captura se restringen en porta objetos de vidrio revestidos con un polímero de nitrocelulosa, por ejemplo, FAST® Slides, comercialmente disponible de Whatman Inc. (Florham Park, NJ) .

Aspectos particulares del soporte sólido que sjon convenientes incluyen la capacidad por ligar grandes cantidades de anticuerpos de captura y la capacidad por ligar anticuerpos de captura con mínima desnaturalización. Otjro aspecto conveniente es que el soporte sólido exhibe mínima "absorción por capilaridad" cuando soluciones de anticuerpo que contienen anticuerpos de captura se aplican al soporte.

Un soporte sólido con mínima- absorción por cápilaridad permite pequeñas alícuotas de solución de anticuerpos, de captura aplicadas, al soporte para resultar en puntos definidos pequeños de anticuerpos de captura inmovilizados.

Los anticuerpos de captura típicamente : se restringen en forma ' directa o indirecta (por ejemplo,, por etiquetas de captura) en el soporte sólido por interacciones covalentes o no covalentes (por ejemplo, enlaces; ió.nicoL, interacciones hidrofóbicas, enlaces de hidrógeno, fuerzas Le Van der Waals, enlaces dipolo-dipolo) . ¦ En [algunas modalidades, los anticuerpos de captura se . conectan covalentemente al soporte sólido utilizando un entrelazadpr homobifuncional o heterobifuncional empleando métodos condiciones de entrelazamiento o recolección estándar. Entrelazadotes convenientes están comercialmente disponibles de distribuidores tales como, por ejemplo, Pierce Biotechnology (Rockford, IL) . 1 Métodos para generar matrices adecuadas,' ;para utilizar en la _ presente invención incluyen pero no ; están limitados a, cualquier técnica empleada para construir matrices de ácido nucleico o proteínas. En algunas modalidades, los anticuerpos de captura se aplican por puntos sobre una matriz utilizando un aparato microspdtter, ; que típicamente son impresoras robóticas equipadas con . clavijas divididas, clavijas romas o impresión de inyección de .tinta.

Sistemas robóticos convenientes para imprimir las matrices de anticuerpos descritas aquí, incluyen PixSys 5000 robot (Cartesian Technologies; Irvine, CA) con clavijas divididas ChipMaker2 (TeleChem International; Sunnyvale, CA) asi como otras impresoras roboticas disponibles dé BioRobics ( oburo, MA) y Packard · Instrument Co.. (Meriden, CT) . De preferencia, al menos 2, 3, 4, 5, o 6 réplicas de cada dilución ¡de ¦ · ¡ : i anticuerpo de captura se aplican por puntos en la matriz.; Otro método para generar matrices adecuadas pa|ra utilizar en la presente invención, comprende surtir un volumen conocido de dilución de anticuerpo de captura en cada posición de matriz selecta al poner en contacto un surtidor capilar sobre un soporte sólido bajo condiciones efectivas para extraer un ~ volumen definido de liquido sobre el cual dirigir un volumen definido de liquido sobre el soporte, en donde este 'proceso se repite utilizando, diluciones de anticuerpo de captura selectas en cada posición de ;mátriz selecta para crear una matriz completa. El método puede practicarse para formar una pluralidad de estas matrices, jen donde la etapa de depósito de solución se aplicaba; una posición selecta en cada una de la pluralidad dé s'oportjes sólidos en cada ciclo repetido. Una descripción adicional ¡de este método puede encontrarse, por ejemplo, en la patente de los E.U.A. Número 5,807,522.

En ciertos casos, dispositivos para imprimir- en 20060115810, 20060263837, 20060292680, y 20070054326; Varnum et al., Methods Mol. Biol., 264:161-172 (2004 ) .; Métodos para explorar matrices de anticuerpos |se conocen en la técnica e incluyen, sin limitación, cualquier técnica empleada para explorar matrices de ácidos nucleicos proteínas. Exploradores de micro matrices adecuados Ipara utilizar en la presente invención están disponibles de PerkinElmer (Boston, MA) , Agilent Technologies. (Palo: Alto, CA) , Applied Precisión (Issaquah, WA) , GSI Lumonics ¡Inc. (Billerica, ¦ MA) , y Axon Instruments (Union City, GA) .¦ IComo un . ejemplo no limitante, un ScanArray3000 para detección fluorescente puede emplearse con el programa ImaGené (para cuantificación . '; VI . Matrices de Detección Sencillas En algunas modalidades, el ensayo para detectar ¡el estado de activación de un analito particular (por ejempl molécula de transducción de señal) de interés, en un extracto celular de células de tumor tal como células en circulación de un tumor sólido es un ensayo de dos anticuerpos de alto rendimiento múltiples, que tienen superior intervalo dinámico. Como un ejemplo no limitante, los dos anticuerpos empleados en el ensayo pueden comprender: (1) un anticuerpo de captura específico para el analito; y (-2) un anticuerpo |de detección específico para una forma activada del analito ( es decir, anticuerpo dependiente de estado de activación) anticuerpo dependiente de estado de activación es capaz 'de detectar, por ejemplo, el estado de fosforilació'n, ubiquitinación y/o complejación del analito. En forma i I alterna, el anticuerpo de detección comprende un anticuerpo independiente de estado de activación,, que detecta la cantidad total del analito en el extracto celular. > El anticuerpo independiente de estado de activación en general es capaz de detectar ambas formas activada y no activada del analito. ' ¡ En una modalidad preferida, el ensayo de : dos anticuerpos comprende: (i) incubar el extracto celular con una pluralidad de series de dilución de anticuerpos de captura, para , fórmjar una pluralidad de analitos capturados; (ii) incubar la pluralidad de analitos capturados con anticuerpos dependientes de estado de activacijón específicos para los analitos correspondientes, para formar una pluralidad de analitos capturados detectables; (iii) incubar la pluralidad de analitos capturados detectables con primeros y segundos miembros de un par de amplificación de señal' para generar una señal amplificada;; y (iv) detectar la señal amplificada que se genera del primer y segundo miembros del par de amplificación ¡de señal. ; ¦ ' Los ensayos de dos anticuerpos aquí descrito!s, típicamente son ensayos basados en anticuerpo que comprenden una pluralidad de diferentes anticuerpos de captura en un intervalo de 'concentraciones de anticuerpo de captura que jse I acoplan a la superficie de un soporte sólido en diferentjes sitios direccionales . · Ejemplos de soportes .sólidos convenientes para utilizar en la presente invención, jse i describieron anteriormente. j Los anticuerpos de captura y los anticuerpos de ' detección de preferencia se eligen para reducir al "mínimo la competencia entre ellos con respecta a enlace de analito (es decir, ambos anticuerpos de captura y detección pueden ligar •simultáneamente sus moléculas de transducción de señal) .

En una modalidad, los anticuerpos de , detección comprenden un primer miembro de un par de enlace (por ej emplo, biotina) y el primer miembro del par amplificación de señal comprende un segundo miembro de par de enlace (por ejemplo, estreptavidina ) . Los miembros del par de enlace pueden acoplarse directa o indirectamente a los " anticuerpos de detección o al primer miembro del par de amplificación 'de i señal utilizando . métodos bien conocidos en la especialidad .

En ciertos casos, el primer miembro del par de amplificación de señal es una peroxidasa (por ejemplo, peroxidasa de rábajno picante (HRP) , catalasa, 1 cloroperoxidasa, citocromo peroxidasa, eosinófilo peroxidasa, glutationa ' peroxidasa, lactoperoxidasa, mieloperoxidasa, tiroide peroxidasa, Un protocolo ejemplar para realizar los ensayos de dos anticuerpos aquí descritos se proporciona en el Ejemplo 3.

En otra modalidad, la presente invención proporciona equipos, para realizar los ensayos de d'os anticuerpos anteriormente descritos, que comprenden: (a)i una serie de dilución de una pluralidad de anticuerpos de captura restringidos en un soporte sólido; y (b) una pluralidad de anticuerpos de detección (por ejemplo, anticuerpos independientes de estado de activación y/o anticuerpos dependientes de estado de activación) . En algunos casos, ljos equipos además pueden contener instrucciones para métodos |de utilizar el equipo para detectar los estados de activación ¡de una pluralidad de moléculas de transducción de señal de células en circulación de un tumor sólido. Los equipaos también pueden contener cualquiera de los reactivjos adicionales anteriormente descritos con respecto a realizar los métodos especificos de la presente invención tales · cJmo por ejemplo, primeros y segundos miembros del par de amplificación de señal, reactivos de amplificación de señal de tiramida, amortiguadores de lavado, etc.

En otra modalidad de un enfoque de dos anticuerpos, la presente invención proporciona un método para detectar la presencia de un receptor truncado, el método comprende: j (a) incubar un extracto celular con una pluralidad de perlas específicas para una región de enlace de dominio primero y segundos miembros del par de amplificación de señal.

En ciertas modalidades, el receptor truncado es pj95 ErbB2 y el receptor de longitud integra es ErbB2 (HER-2) . En ciertos otros aspectos, la pluralidad de perlas especificas para una región de enlace de dominio extracelular (ECD) comprende un par estreptavidina-biotina, en donde la bioti a se conecta a la perla y la biotina se conecta a un anticuerpo (por ejemplo, en donde el anticuerpo es especifico para la región de enlace ECD del receptor de longitud integra) .

La Figura 14A muestra que las perlas revestidas don un anticuerpo dirigido al dominio extracelular (ECD) de un receptor de interés, ligan al receptor de longitud integra (e.g., ErbB2), pero no al receptor truncado (e.g., p95) para retirar cualquier receptor de longitud integra del ensaco . La Figura 14B muestra que el receptor truncado (e.g., p95¡) , una vez ligado a un anticuerpo de captura, puede entóncjes detectarse por un anticuerpo de detección que es especifico para el dominio intracelular (ICD) del receptor de longitLd integra (e.g., ErbB2) . El anticuerpo de detección: puejde conjugarse directamente a peroxidasa de rábano picante (HRP) . Amplificación de señal tiramida (TSA) puede entonces realizarse para generar una señal a detectar! El ; estado , de activación de p95 puede interrogarse para determinar, por ejemplo su estado de fosforilación, estado de ubiquitinacijón y/o estado de complej ación .

VII . Ensayos de Detección Dual de Proximidad En algunas . modalidades , el ensayo para detectar el estado de activación de un analito particular (por ejemplo, molécula de transducción de señal) de interés en un éxtracto celular de células de tumor, tales como células' en circulación de un tumor sólido es un ensayo de proximidad de alto rendimiento múltiplex (es decir, de tres-anticuerpo's ) que tiene superior intervalo dinámico. Como un ejemplo no limitante, los tres anticuerpos empleados en el ensayo de proximidad pueden comprender: (1) un anticuerpo de captura especifico para el analito; (2) un anticuerpo de deteccilon especifico para una forma activada del analito (es decir, anticuerpo dependiente de estado de activación) ; y (3] un anticuerpo de detección que detecta la cantidad total, del analito (es decir, anticuerpo independiente de estado |de activación) . El anticuerpo dependiente de estado !de activación es capaz de detectar, por ejemplo el estado de fosforilación, ubiquitinación y/o complejación o formaci'no de complejos del analito. El anticuerpo dependiente de estado de activación en general es capaz de detectar ambas formas activadas y no activadas del analito.

En una modalidad preferida, el ensayo de proximidad comprende : (i) incubar el extracto celular con una pluralidad de amplificación de señal. ; Los ensayos de proximidad aquí descritos típicamente son matrices basadas en anticuerpo que comprenden una pluralidad de anticuerpos de · captura diferentes en un intervalo de concentraciones de anticuerpo de captura que se acoplan a la superficie de un soporte sólido en diferentes sitios direccionables . Ejemplos de soportes sólidos convenientes para utilizar en la ¦ presente invención se describieron anteriormente.

Los . anticuerpos de captura, anticuerpos independientes de estado de activación, y anticuerpos i dependientes de estado de activación, de preferencia se eligen para reducir al mínimo la competencia entre ellos1 con respecto a enlace analito (es decir, todos los anticuerpos pueden ligar simultáneamente sus moléculas de transducción de señal correspondientes) .

En algunas modalidades, los anticuerpos independientes de estado de activación además comprenden una porción .detectable. En estos casos, la cantidad dé la porción detectable es correlativa a la cantidad de uno o más de los analitos en el extracto celular. Ejemplos !de porciones detectables incluyen, pero no están limitados a etiquetas fluorescentes, etiquetas químicamente reactiva!js, etiquetas de enzima, etiquetas radioactivas y semejantes. De preferencia, la porción detectable es un fluoróforo tal como agentes de oxidación incluyen peróxido de hidrógeno (H2O2) , ¡un oxigeno singlete y cualquier otro compuesto que transfiera átomos de .oxigeno o que gane electrones en una reacción !de oxidación/reducción. De preferencia, en la presencia de iun substrato conveniente (por ejemplo, glucosa, luz, etc. ) , la porción facilitadora (por ejemplo, glucosa oxidasa, fotosensibilizador, etc. ) genera un agente oxidante (por ejemplo, peróxido de hidrógeno (H2O2) , oxigeno sencillo, etc. ) que canaliza a y reacciona con el primer miembro del, par de amplificación de señal (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (HRP) , protegido con .hapteno por un grupo protector, una enzima inactivada por un enlace tioéter a un inhibidor de enzima, etc. ) cuando las dos porciones están en proximidad entre si.

En ciertos otros casos, los anticuerpjos independientes de estado de activación se etiquetjan indirectamente con una porción facilitadora median'te hibridización entre un enlazador oligonucleótido conjugado a los anticuerpos independientes- de estado de activación y un enlazador oligonucleótido complementario conjugado a la porción facilitadora. Los enlazadores oligonucleótido pueden acoplarse a la porción facilitadora o a los anticuerpjos independientes de estado de activación utilizando métodos bien conocidos en la técnica. En algunas modalidades, el enlazador oligonucleótido conjugado a la porción facilitadora tiene 100% de complementariedad al enlazador oligonucleótido I ¡ conjugado a los anticuerpos independientes de estado jde activación. En otras modalidades, el par ¦ enlazador oligonucleótido comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más regiones de apareamiento incorrecto, por ejemplo, ante hibridización bajo condiciones de hibridización severas. Una persona con destreza en la técnica apreciará que anticuerpos independientes de estado de activación específicos para diferentes analitos ya pueden conjugarse al mismo enlazador oligonucleótido o a diferentes enlazadores oligonucleótido.! La longitud de los enlazadores oligonucleótido que se conjugan a la porción facilitadora o a los anticuerpos independientes de estado de activación puede variar. En general, la' secuencia enlazadora puede ser al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75 o 100 nucleótidos de longitud. Típicamente, secuencias de ácido nucleico aleatorias se generan para acoplamiento. Como un ejemplo no limitante, una biblioteca de enlazadores oligonucleótido puede diseñarse para tener tres distintos dominios contiguos: un dominio espaciador; un dominio de firma; y dominio de conjugación. De preferencia, los enlazadores oligonucleótidos se diseñan para acoplamiento eficiente sin destruir la función de la porción facilitádojra o anticuerpos independientes de estado de activación a ljos cuales se conjugan.

Las secuencias enlazadoras de oligonucleótido pueden diseñarse para evitar o reducir al mínimo cualquier. formación de estructura secundaria bajo una variedad de i condiciones de ensayo. Temperaturas de fusión típicamente se supervisan cuidadosamente por cada segmento dentro , del enlazador para permitir su participación en los procedimientos de ensayo total. En general, el . intervalo de temperaturas de fusión del segmento de la secuencia enlazadoras está entre 1-10 grados C. Algoritmos de computadora {e.g., OLIGO 6.0) para determinar la temperatura de fusión, estructura secundaria y estructura de horquilla, bajo concentraciones iónicas definidas, pueden emplearse para analizar cada uno de los tres diferentes dominios diferentes dentro de cada enlazador. Las secuencias combinadas totales también pueden analizarse por su caracterización estructural y su compatibilidad con otras secuencias enlazadoras oligonucleótido conjugada, por ejemplo, si hibridizarán bajo severas condiciones de hibridización a un enlazador oligonucleótido complementario.

La región espaciadora del enlazador oligonucleótijdo proporciona separación adecuada del dominio' de conjugación desde el sitio de entrelazamiento o . reticulación djel í oligonucleótido. El dominio de conjugación funciona paira enlazar moléculas etiquetadas con una secuencia enlazadora Le oligonucleótido complementaria al dominio de conjugación mediante hibridización de ácido nucleico. La hibridizáción mediada por ácido nucleico puede realizarse ya sea antes o después de formación del complejo anticuerpo-analito (jes decir, antigeno) , proporcionando un formato de ensayo más flexible. A diferencia de muchos métodos de conjugación de anticuerpos directos, enlazar oligonucleótidos relativamente pequeños con anticuerpos u otras moléculas, tiene impacto mínimo en la afinidad específica de anticuerpos hacia su analito objetivo o en la función de las moléculas conjµga'das.

En algunas modalidades, el- dominio de secuencia firma del enlazador oligonucleótido puede emplearse en ensayos de proteínas múltiplejadas complejas. Múltiples anticuerpos pueden conjugarse con enlazadores oligonucleótido con diferentes secuencias de firma. En inmunoensayos múltiplex, secuencias oligonucleótido reporteras etiquetadas con sondas apropiadas pueden emplearse para detectar reactividad cruzada entre anticuerpos y sus antígerios en el formato de ensayo múltiplex.

Enlazadores oligonucleótido pueden conjugarse, don anticuerpos u otras moléculas utilizando varios métodos diferentes. Por ejemplo, enlazadores oligonucleótidos pueden sintetizarse con un grupo tiol en cualquiera del extremo 5'| o 3' . El grupo tiol puede desprotegerse utilizando agéntes reductores (e.g., ¦ TCEP-HC1) y los enlazadores resultantes pueden purificarse al utilizar una columna de espín desalificante . Los enlazadores oligonucleótidos desprotegidos resultantes pueden conjugarse a las aminas primarias de anticuerpos u otros tipos de proteínas utilizando entrelazadores heterobifuncionales tales como S CC. En forma alterna, grupos 5' -fosfato en oligonucleótidos pueden tratarse con EDC carbodiimida soluble en agua, para formar fosfato ésteres y subsecuentemente acoplados a moléculas que contienen amina. En ciertos casos, el diol en el residuo 3'-ribosa puede oxidarse en grupos aldehido y después conjugarse en los grupos amina de anticuerpos u otros tipos de proteínas utilizando áminación reductiva. En ciertos otros casos, el enlazador oligonucleótido puede sintetizarse con una modificación biotina en cualquiera del extremo 3' o 5' y conjugarse con moléculas etiquetadas con estreptavidina ..

Enlazadores oligonucleótidos pueden sintetizarse utilizando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas en la especialidad, tales como aquellas descritas en Usman et al., J. Am. Chem. Soc, 109:7845 (1987); 'Scaringe et .aí., Nucí. Acids Res., 18:5433 (1990); Wincott et al., Nucí.. Acids Res., 23:2677-2684 (1995); y Wincott et al., Methods Mol. Bio., 74:59 (1997). En general, la síntesis de oligonucleótidos hace uso de grupos de acoplamiento | y protección de ácido nucleico comunes , tales' cJmo dimetoxitritilo en . el extremo 5' y fosforamiditas en el extremo 3' . Reactivos convenientes para síntesis de oligonucleótido, métodos para desprotección de ácildo nucleico, y métodos para purificación de ácido nucleico se conocen por aquellos con destreza en la técnica.

En ciertos casos, los anticuerpos dependientes de estado de activación se etiquetan directamente con el primer miembro del par de amplificación de señal. El miembro de pjar de amplificación de señal puede acoplarse a los anticuerpos dependientes de estado de activación utilizando métodos 'bien conocidos en la técnica. En ciertos otros casos, los anticuerpos dependientes de estado de activación se etiquetan indirectamente con el primer miembro del par de amplificación de señal mediante enlace entre un primer miembro de un par de enlace conjugado a los anticuerpos dependientes de estado de activación y un segundo miembro del par de enlace conjuga'do al primer miembro del par de amplificación de señal. Jos miembros del par de enlace (por ejemplo, biotina/estreptavidina) pueden acoplarse al miembro de par de amplificación . de señal o a los anticuerpos dependientes de estado de activación utilizando métodos bien conocidos en la especialidad. Ejemplos de miembros de par de amplificación de señal incluyen pero no están limitados a peroxidasas tales como peroxidasa de rábano picante , (HRP) , catalasa, cloroperoxidasa, citocromo c peroxidasa, eosinófilo peroxidasa, glutationa peroxidasa, lactoperoxidasa, mieloperoxidasa, tiroide peroxidasa, desyodinasa' y semejantes. Otros ejemplos de miembros de pares de amplificación de señal incluyen haptenos protegidos por un grupo protector y enzimas inactivadas por enlace tioéter a un inhibidor de enzima.

En un ejemplo de canalización de proximidad, · la porción facilitadora es glucosa oxidasa (GO) y el primer miembro del par de amplificación de señal es peroxidasa de rábano picante (HRP) . Cuando GO se contactan con un substrato tal como glucosa, genera un agente de oxidación (es decir, peróxido de hidrógeno (H202) ) . Si HRP está dentro de la proximidad de canalización a GO, H202 generado por GO se canaliza con y compleja con HRP para formar un complejo HRP- H202, que, en la presencia del segundo miembro del par de amplificación de señal (por ejemplo, un substrato quimioluminescente tal como luminol o isoluminol o un substrato fluorogénico tal como tiramida (e.g. r biotina-tiramida, ácido homovallinico o ácido 4-hidroxifenil acético), genera una señal amplificada. Métodos pira utilizar GO y HRP en un ensayo de proximidad se describen Jn, e.g., Langry et al., U.S. Dept . of Energy Report No. UCRL-ID- 136797 (1999). Cuando biotina-tiramida se emplea como el segundo miembro del par de amplificación de señal, el complejo HRP-H202 oxida la tiramida para generar un radical tiramida reactivo que enlaza covalentemente residuos nucleof-ílieos cercanos. La tiramida activada ' ya se detecta directamente o se detecta ante la adición de un reactivo · de detección de señal tal como por ejemplo, un fluoróforo etiquetado con estreptavidina o una combinación de peroxidasa etiquetada con estreptavidina y un reactivo cromogénico. Ejemplos de fluoróforos adecuados para utilizar ert la presente invención incluyen, pero no están limitados a Alexa Fluor® dye (e.g., Alexa Fluor® 555), fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina (FITC), Oregon Green™; rodamina, rojo Texas, isotiocianato de tetrarodamina (TRÍTG) , un CyDye™ flúor (e.g., Cy2, Cy3, Cy5) , y semejantes, La etiqueta de estreptavidina puede - acoplarse directa o' indirectamente al fluoróforo o peroxidasa utilizando métodos bien conocidos en la especialidad. Ejemplos no limitantes de reactivos cromogénicos adecuados , para uso en la preseríte invención incluyen 3, 3' , 5, 5' -tetrametilbenzidina (TMB) , 3,3'-diaminobenzidina ' (DAB) , ácido 2 , 2 ' -azino-bis ( 3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS) , 4-cloro-l-naptol (4CN), y/o porfirinógeno .

En otro ejemplo de canalización de proximidad, |la porción facilitadora es .un fotosensibilizador y el primer miembro del par de amplificación de señal es una molécJla grande etiquetada con múltiples haptenos que se protegen qon grupos protectores que evitan enlace de los haptenos a un galactosidasa, HRP, etc. Después de lavar para retirar reactivos sin ligar, la señal detectable puede generarse al agregar un substrato detectable {por ejemplo, fluorescente, quimioluminescente, cromogénico, etc. ) de la enzima detectar utilizando métodos e instrumentación convenientes ¦ conocidos en la especialidad. En forma alterna, la señal detectable puede ser amplificada utilizando amplificación de señal de tiramida y la tiramida activada ya se detecta directamente o detecta ante la adición del reactivo de detección de señal como se describió anteriormente. ? Todavía en otro ejemplo de canalización jde proximidad, la porción facilitadora es un fotosensibilizador y el primer miembro del par de amplificación de señal es un complejo inhibidor-enzima. La enzima e inhibidor (é.g., dextrano etiquetado con ácido fosfónico) se enlazan en conjunto por un enlazador escindible (e.g., tioéter) . Cuando el fotosensibilizador se excita con luz, genera un agente oxidante (es decir, oxígeno singlete) . Si el complejo inhibidor-enzima está dentro de proximidad de canalización al fotosensibilizador , el oxígeno singlete generado por el fotosensibilizador se canaliza ' con y reacciona con el enlazador escindible, liberando el inhibidor de la enzima, de esta manera activando la enzima. Se agrega un substrato de enzima para generar una señal detectable o en forma alterna, un reactivo de amplificación se agrega para generar una señal amplificada .

En un ejemplo adicional de canalización de proximidad, la porción facilitadora es HRP, el primer miembro de par de amplificación de señal es un hapteno protegido o un complejo inhibidor de enzima como se describió anteriormente, y los grupos protectores comprenden p-alcoxi fenol. La adición de fenilendiamina y H2O2 genera fenilen diimida reactiva que canaliza al hapteno protegido o el complejo enzima-inhibidor, y reacciona con .grupos protectores p-alcoxi fenol para dar por resultado haptenos expuestos o una enzima reactiva. . La' señal amplificada se genera y detecta como se describió anteriormente {ver, por ejemplo, las patentes e los E.U.A. Nos. 5,532,138 y 5,445,944) .

Un protocolo ejemplar para realizar los ensayos !de proximidad aquí descritos, se proporciona en el Ejemplo 4.

En otra modalidad, la presente inveñcijón proporciona equipos para realizar los ensayos de proximidjad anteriormente . descritos, que comprenden: (a) una serie de dilución de una pluralidad de anticuerpos de captura restringidos en un soporte sólido; y (b) una ' pluralidad de anticuerpos de detección (por ejemplo, anticuerpos independientes de estado de activación y anticuerpos dependientes de estado de activación) . En algunos casos, los equipos además pueden contener instrucciones por métodos de utilizar el equipo pará detectar los estados de activación de una pluralidad de moléculas de transducción de : señal [de células en circulación de un tumor sólido, Los équidos también pueden contener cualquiera de los reactivos adicionales descritos anteriormente con respecto a realizar los métodos específicos de la presente invención tales ¡como por ejemplo, primeros y segundos miembros del par de amplificación de señal, reactivos de amplificación de señal tiramida, substratos para la porción facilitadora, amortiguadores de lavado, etc. . 1 ! 1 VIII . Producción de Anticuerpos La generación y selección de anticuerpos 1 que |no están ya comercialmente disponibles para analizar los estados de activación de moléculas de transducción de señal en células de tumor, tales como células raras en circulación de acuerdo con la presente invención, puede lograrse en> varias formas. Por ejemplo, una forma es expresar y/o purificar un i ¡ polipéptido de interés (es decir, antígeno) utilizando métodos de purificación y expresión de proteínas conocidos en la especialidad, mientras que otra forma es sintetizar el polipéptido de interés utilizando métodos de síntesis péptildo fase sólida conocidos en la especialidad. ' - Ver,: por ejemplo, Guide to Protein Purification, Murray P.; Deutcher, ed., Meth. Enzymol., Vol . 182 (1990); Solid Phase PeptMe Synthesis, Greg B. Fields, ed., Meth. Enzymol., - Vol . ; 2¡ 89 (1997); Kiso et al., Chem. Pharm. Bull., 38:1192-99 (1990 Mostafavi et al., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Aéids, 1:255-60, (1995) ; y Fujiwara et al., Chem. Pharm.1 Bull., 44:1326-31 (1996) . El polipéptido purificado o sintetizado ' i puede entonces inyectarse, por ejemplo en ratones o conejos, para generar anticuerpos policlonales o monoclonales . i Una persona con destreza en la técnica reconocerá queN están disponibles muchos procedimientos para la producción de anticuerpos, por ejemplo como se describe en Antibodiés , A Laboratory Manual, Harlow and Lañe, Eds . , Cold Spring Hárbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988) . Una persona con destreza en la técnica también apreciará que fragmentos de enlace o fragmentos Fab que imitan (por ejemplo, retienen las regiones de enlace funcionales de) . anticuerpos, también pueden prepararse a partir de información genética por diversos procedimientos. Ver, e.g., Antibody Engineexing: Practical Approach, Borrebaeck, Ed., Oxford University Presls, Oxford (1995) ; y Huse' et al., J. Immunol., 149 : 3914 39|20 (1992) .

Además, numerosas publicaciones han reportado |el uso de tecnología de expresión en fago para producir y cribar bibliotecas de polipéptidos para ligar a un antígeno objétijvo selecto {ver, e.g, Cwirla et al., Proc. Nati. Acad. Sci. [USA, 87:6378-6382 (1990) ; Devlin et al., Science, 249:404-406 ¡ (1990) ; Scott et al., Science, 249:386-388 (1990) ; y Ladner et al., patente de los E.U.A. No. 5, 571, 698) . Un coneepjto básico de métodos de expresión en fago el es> |el establecimiento de una asociación física entre un polipéptido codificado por el ADN fago y un antígeno objetivo. Esta asociación física se proporciona por la partícula fago, que exhibe un polipéptido como parte de una cápside , que circunscribe al genoma fago que codifica el polipéptido. El establecimiento de una asociación física entre polipéptidos y su material genético permite criba en masa simultánea de muy grandes números de fagos que contienen diferentes polipéptidos. La expresión en fago de un polipéptido; con afinidad a un antígeno objetivo, liga al antígeno objetivo y estos fagos se enriquecen por criba de afinidad al antígeno objetivo o diana. La identidad de polipéptidos exhibidos de estos fagos puede determinarse a partir de sus genomas respectivos. Utilizando estos métodos, un polipéptido identificado que tiene una afinidad de enlace para un antígeno diana deseado puede entonces sintetizarse en volumen por medios convencionales (ver,' por ejemplo, la patente de los E.U.A. No. 6,057,098).

Los anticuerpos que se generan por estos métodjos pueden entonces seleccionarse al primero cribar por afinidad. y especificidad con el antígeno polipéptido purificado !de interés y si se requiere, comparar los resultados á la afinidad y especificidad de los anticuerpos con otros antígenos polipéptido que se desean excluidos de enlace IE1 procedimiento de criba puede involucrar inmovilización de l!os antigenos polipéptido purificados en pozos separados (de placas de microtitulación . La solución que contiene un anticuerpo potencial o grupo de anticuerpos . entonces se coloca en los pozos de microtitulación respectivos e incuba por aproximadamente 30 minutos a 2 horas. Los pozos de microtitulación entonces se lavan y un anticuerpo secundario etiquetado (por ejemplo, un anticuerpo anti-ratón conjugajdo con fosfatasa alcalina si los anticuerpos desarrollados sjon anticuerpos de ratón) se agrega a los pozos e incuba, por aproximadamente 30 minutos y después lava. El. substrato se agrega a los pozos y aparecerá una reacción de color en donjde el anticuerpo . al antigeno polipéptido inmovilizado esjtá presente .

Los anticuerpos asi identificados pueden entonces ser más analizados para afinidad y especificidad. En el desarrollo de inmunoensayos para proteina diana, la proteína diana purificada actúa como una norma con la cual se juzgue la sensibilidad y especificidad del inmunoensayo utilizan'do los anticuerpos que se han seleccionado. Debido a que lia afinidad de enlace de diversos anticuerpos puede diferir, por ejemplo, ciertas . combinaciones de anticuerpo pueden interferir con otro ensayo esféricamente, el desempeño de un anticuerpo puede ser una medida más importante que las absolutas afinidad y especificidad de ese anticuerpo.

Aquellos con destreza en la técnica reconocerán que muchos enfoques pueden tomarse al producir anticuerpos o fragmentos de enlace y criba y selección por afinidad y especificidad por los diversos polipéptidos de interés, pero estos enfoques no cambian el alcance de la 'presen¡te invención.

?. Anticuerpos Policlonales Anticuerpos policlonales de preferencia |se desarrollan en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) de un polipéptido de interés y un adyuvante. Puede ser útil el conjugar el polipéptido de interés con un portador de proteina que es inmunogéniqo en las especies a inmunizar, tales como por ejemplo, hemociánina de lapa californi'ana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soya, utilizando un agente derivatizante o bifuncional. Ejemplos no limitantes de agentes bifuncionales o derivatizantes incluyen maleimidobenzoil sulfosuccinimida éster (conjugación a través de residuos de cisteina) , N-hidroxisuccinimida (conjugación a través de residuos lisina) , glutaraldehido, anhídrido succínico, S0C12 y R]N=C=NR, en donde R y Ri son diferentes grupos alquilo.

Los animales se inmunizan contra el polipéptido de interés o un conjugado inmunogéni'co o su derivado al combinar, por ejemplo 100 µg (para conejos) o 5 ¦ µ? (para ratones) del antígeno o conjugado con 3 volúmenes 'de adyuvante completo de Freund e inyectar la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes después, los animales son reforzados con aproximadamente 1/5 a 1/10 de la cantidad original de polipéptido o conjugado en adyuvante incompleto de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a catorce días después, los animales se sangran y el suero se ensaya para titulo de anticuerpo. ' Los animales típicamente . se refuerzan hasta que su título alcanza una meseta. De preferencia, el animal se refuerza con el conjugado del mismo polipéptido, pero la conjugación a una diferente proteína inmunogénica y/o a través de un reactivo de entrelazamiento diferente, puede emplearse. Conjugados también pueden elaborarse en, cultivos, celular recombinante como proteínas de fusión. En ciertos casos, agentes de agregación tales como alumbre pueden emplearse para mejorar la respuesta inmune. i B . Anticuerpos Monoclonales Anticuerpos monoclonales en general se obtienen de una población de anticuerpos 'substancialmente homogéneos, \es decir, los anticuerpos individuales que comprende |la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones |de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. De esta manera, el modificador "monoclonal" indilca el carácter del anticuerpo que no es una mezcla !de anticuerpos discretos. Por ejemplo, anticuerpos monoclonaljes pueden elaborarse utilizando el método de hibridomá descrijto por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) o por cualquier método de ADN recombinante conocido en la especialidad (ver, por ejemplo, la patente de los E.U.A. No. 4,816,567).

En el método de hibridomá, se inmuniza un ratóni u otro animal hospedero apropiado (por ejemplo hámster) como 'se describió anteriormente para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que ¦ ligan específicamente al polipéptido de interés empleado para inmunización. En forma alterna, los linfocitos se inmunizjan in vitro. Los linfocitos inmunizados después se fusionan con células de mieloma utilizando un agente de fusión conveniente,' tal como polietilen glicol, para formar células de hibridomá (ver, por . ejemplo, Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, Academic Press, pp. J9- 103 (1986)). Las células de hibridomá así preparadas se siembran y desarrollan en un medio de cultivo conveniente que de preferencia contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma precursoras sin fusión. Por ejemplo, si las células de mieloma precursoras carecen de la enzima hipoxa'ntina, guanina fosforibosil transferasa (HGP.RT) , el medio de cultivo 1 para las células de hibridomá típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) que evita el crecimiento de células deficientes en HGPR .

Células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan producción de alto nivel estable de anticuerpo ,por las células productoras de anticuerpo selectas, y/o son sensibles a un medio tal como medio HAT. Ejemplos de estas lineas celulares de mieloma preferidas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos incluyen pero no están limitadas a lineas de mielo Ima murino tales como aquellas derivadas de tumores de rat !?? MOPC-21 y MPC-11 (disponibles de Salk Institute Ce 11 Distribution Center; San Diego, CA) , . células SP-2 o X63-Ag8-653 (disponibles de the American Type Culture Collection; Rockville, MD) , y lineas celulares de mieloma humano o heteromieloma ratón-humano (ver, por ejemplo, Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcjel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63 (1987)).

El medio de cultivo en donde células de hibridoma crecen pueden ensayarse para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipéptidó de interés. De preferencia, la especificidad de enlace de anticuerpos monoclonales producida por células de hibridoma, se determina por inmuno precipitación o por un ensayo de enlace in vitro tal como radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo de inmunoabsorción ligado a un enzima (ELISA = Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay) . La afinidad de enlace de anticuerpos monoclonales puede determinarse utilizando por ejemplo el análisis Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem. , 107:2120 (1980) . ; Después que células de hibridoma se identifican qiue producen anticuerpos de las deseadas especificidad, afinid d y/o actividad, los clones pueden ser subclonados ' por procedimientos de dilución limitante y desarrollados por métodos estándar (ver, por ejemplo, Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, Academic Press, pp . 59-103 (1986)) . Medio de cultivo conveniente para este propósito incluye por ejemplo medio, D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden desarrollarse in!vivo como tumores de ascitis en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden : ser separados del medio de cultivo, fluido de ascitis o suero por procedimientos de purificación de1 anticuerpo convencionales tales como por ejemplo proteina-Sepharose A, cromatografía de hidroxilapatita, electroforésis en gel, diálisis; | o cromatografía de afinidad.

ADN que codifica los anticuerpos monoclonales puede aislarse y secuenciarse fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo al emplear sondas oligonucleótido que son capaces de ligar específicamente a genes i que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de este ADN. Una vez aislado, el ADN puede s¡er colocado en vectores de expresión,- que después se transfectan en .células hospederas tales como- células de E. coli,¡ células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO Chínese Hámster Ovary) o células de mieloma que no producjen de · otra forma anticuerpo, para inducir la síntesis ide anticuerpos monoclonales en - las células hospederías recombinantes . Ver, por ejemplo, Skerra et al., Curr. pxn. Immunol., 5:256-262 (1993); y Pluckthun, Immunol i?evj. , 130:151-188 (1992). El ADN también puede ser modificado pjor ejemplo al . sustituir la secuencia de codificación pa'ra dominios constantes de cadena pesada y cadena ligera humJna en lugar de las secuencias mürinas homologas (ver,, por ejemplo, la patente de los E.U.A. Número 4, 816, 567; Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984) o por unión covalente a la secuencia de codificación |de inmunoglobulina de todo o parte de ' la secuencia' |de codificación por un polipéptido sin inmunoglobulina.

En una modalidad adicional, anticuerpos monoclonales o. fragmentos de anticuerpo, pueden aislarse de bibliotecas fago de anticuerpo generadas utilizando · lias técnicas descritas por ejemplo en cCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990); Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) . La producción de anticuerpos monoclonales humanos de al|a afinidad (intervalo nM) por entremezclado de cadena se describe en Marks et al., BioTechnology, 10:779-783 (1992; El uso de infección combinatoria y recombinación in vivo ¡como estrategia para construir muy grandes bibliotecas fago, se describe en Waterhouse et al., Nuc. Acids Res., 21:2265-2266 (1993) . De esta manera, estas técnicas son alternativas viables a métodos de hibridoma anticuerpo monoclonal tradicionales para la generación de anticuerpos monoclonales. C . Anticuerpos Humanizados Métodos para humanizar anticuerpos no humanos se conocen en la técnica. De preferencia, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoácido introducidas en él desde una fuente que no es humana. Éstos residuos aminoácidos no humanos a menudo se refieren como residuos de "importación", que típicamente se toman de un dominio variable de "importación". La humanización puede realizarse esencialmente al sustituir las secuencias de región hipervariable de un anticuerpo no humano por la secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Ver, por ejemplo, Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); y Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988) . De acuerdo con esto, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (ver, por ejemplo, la patente de los E.U.A. Número 4,816,567), en donde sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en donde algunos residuos de región hipervariable y posiblemente algunos residuos de región · marco (FR = Framework Región) se sustituyen por residuos de sitios análogos de anticuerpos de roedor.

La selección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para utilizarse en producir ' los i anticuerpos humanizados aquí descritos es una consideración importante para reducir antigenicidad. De acuerdo con el así denominado método de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba contra toda la biblioteca de secuencias de dominios variables humanos conocidas. La secuencia humana - que es más cercana a la del roedor después se acepta como FR humana para el anticuerpo humanizado (ver, por ejemplo, Sims et al., J. Immunol. , 151:2296 (1993); y Chothia et al., J. Mol: Biol., 196:Joi (1987) ) . Otro método utiliza una FR particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma FR puede emplearse para varios 1 anticuerpos humanizados diferentes {ver, por ejemplo, Cárter et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992) ; y Presta et al., J. Immunol., 151 :2623 (1993) ) .

También es importante que anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad para el antigeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta, anticuerpos humanizados pueden prepararse por un proceso de análisis de las secuencias precursoras y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias precursora y humanizada. Modelos! de inmunoglobulina tridimensionales están disponibles comúnmente y son familiares para aquellos con destreza en jla especialidad. Programas de computadora están disponibles qjue ilustran y exhiben estructuras de conformación tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidato selectas. La inspección de estas expresionjes permite análisis del papel probable de los residuos en jel funcionamiento de secuencia de inmunoglobulina ' candidato, es decir el. análisis de residuos que influencian la capacidad Jde la inmunoglobulina candidato para ligar su antigeno. De esta manera^ residuos FR pueden seleccionarse y combinarse de la secuencias de recipiente e importación, de manera tal 'que la característica de anticuerpo deseada, tal como incrementada afinidad para el o los antígenos objetivos, se logre En general, los residuos dé región hipervariable están involucrados directa y específicamente en" influenciar el enlace de antígeno.

Diversas formas de anticuerpos humanizados se i contemplan de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fab. En forma alterna, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto tal como Ln anticuerpo intacto IgA, IgG, o IgM.

D . Anticuerpos Humanos i Como una alternativa a humanización, pueden generarse anticuerpos, humanos. En algunas modalidades, animales transgénicos (por ejemplo, ratones) pueden producirse, que son capaces ante inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos, humanos en la ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen de región ¡de unión de cadena pesada de anticuerpo (JH) en ratones mutantes de linea germinal y quiméricos, resulta en inhibición completa de producción de anticuerpo endógeno. : La transferencia de la matriz de génes de inmunoglobulina de linea germinal humana en estos ratones mutantes de linea germinal ' resultará en la producción de anticuerpos humanjos ante prueba de antigeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immun., 7:33 (1993); y en las patentes de los E.U.A. Números 5, 591, 669, 5, 589, 369, y 5,545,807.

En forma alterna, la tecnología de expresión en fago (ver, por ejemplo, McCafferty et al., Nature, 348:552-553 (1990)) puede utilizarse para, producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro utilizando repertorios de genes de dominio variable de inmunoglobulina (V) de donadores no inmunizados. De acuerdo con iesta técnica, genes de dominio de anticuerpo V se clonan en cuadro en cualquiera de un gen de proteína de revestimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se expresan como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula fago. Debido a que . la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de una sola hebra del genoma fago, selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también resultan en selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe esas propiedades. De esta manera, el fago imita alguna de las propiedades de la célula B. La expresión en fago puede .realizarse én una variedad de formatos como se describe por ejemplo por Johnson et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 3:564-571 (1993). Varijas fuentes de segmentos del gen V pueden emplearse pdra expresión en fago. Ver, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991). Un repertorio de genes V de donadores humanos no inmunizados puede construirse y anticuerpos a una matriz diversa de antígeno (incluyendo auto antígenos) pueden aislarse esencialmente siguiendo las técnicas descritas porn la especialidad. En otras modalidades, el anticuerpo de selección es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) . Velr, por ejemplo, la publicación del PCT Número WO 93/16185; y Jas patentes de los E.U.A. Números 5,571,894 y' 5,587,458. El fragmento de anticuerpo también puede ser un anticuerpo lineal como se describe, por ejemplo en la patente de, los E.U.A. Número 5,641,870. Estos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecificos .

F. Anticuerpos Biespecificos Anticuerpos biespecificos son anticuerpos que tiene especificidades de enlace para al menos dos epítopjes diferentes. Anticuerpos biespecificos ejemplares pueden ligar a dos epitopes diferentes del mismo polipéptido de interés. Otros anticuerpos biespecificos pueden combinar un sitio de enlace para él polipéptido de interés con el o los sitios de enlace para uno o más antigenos adicionales. Anticuerpos biespecificos pueden prepararse como anticuerpos de longitud integra o fragmento de anticuerpo (por ejemplo anticuerpos biespecificos F(ab' )2) · .

Métodos para producir anticuerpos biespecificos |se conocen en la técnica. Producción tradicional de anticuerpos biespecificos de longitud integra se basa en la co-expresión de dos pares de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (ver, por ejemplo Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido al surtido aleatorio de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estjss hibridomas (cuadroma) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpo, de las cuales sólo1 una tiene la estructura biespecífica . correcta . La purificación de la molécula correcta usualmente se realiza por cromatografía de afinidad. Procedimientos similares, se describen en la publicación del. PCT Número WO 93/08829 y Traunecker et al., EMBO J. , 10:3655-3659 (1991).

De acuerdo con un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (los¦ sitios de combinación anticuerpo-antígenos) se fusionan con las secuencias del dominio constante de la inmunoglobulina. La fusión es preferentemente con un dominio' constante de la cadena pesada- de la inmunoglobulina,, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2, y CH3. Es preferible tener primero la región constante de la cadJna pesada primaria (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera presente en al, menos una de las fusiones. El ADN que codifica las fusiones de la cadena pesada de. la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligJra de la inmunoglobulina, son insertadas en vectores de expresión independientes, y son co-transfectadas ' en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en las modalidades cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptidos utilizados en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Es, sin embargo, posible insertar las secuencias se codifican para dos o todas las tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptidos en proporciones iguales résultan Ln rendimientos elevados o cuando las proporciones no son de importancia particular.

En una modalidad preferida de este enfoque, ; los anticuerpos biespecificos están compuestos de un híbrido de la cadena pesada de la inmunoglobulina con una especificidad de unión primaria en un brazo, y un par híbrido de la cadena pesada-cadena ligera de la inmunoglobulina (que proporciona una especificidad de unión secundaria) en el- otro brazo. Esta estructura asimétrica facilita la separación de los compuestos biespecificos deseados de las combinaciones no deseadas de la cadena de inmunoglobulina, como la presencia de una cadena ligera de la inmunoglobulina en sólo la mitad de la molécula biespecífica que proporciona una manera fácil de separación. Véase, por ejemplo, PCT Publicación Número WO 94/04690 y Suresh et al., Meth. Enzymol., 121:210 (1986).

De acuerdo a otro enfoque descrito en la Patente de los E.U.A. Número 5,731,168, la interfaz entre un par de moléculas del anticuerpo pueden ser modificadas por ingeniería para maximizar el porcentaje de heterodímeros que son recuperados del cultivo celular recombinante . La interfaz preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante del anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeños de la- interfaz |de la molécula del anticuerpo , primario ' son sustituidos con cadenas . laterales más grandes (por ejemplo, tirosina triptofano) . Las "cavidades" compensatorias de tamáño idéntico o similar para la(s) cadena (s) lateral grande son creadas en la interfaz de ' la molécula del anticuerpo secundario al sustituir cadenas laterales de aminoácidos grandes con cadenas laterales de aminoácidos más pequeñ'os ejemplo, alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre los productos finales no deseados tales como los homodímeros.

Los anticuerpos biespecífieos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a la avidina, y el otro a la biotina. Los anticuerpos heteroconjugados se pueden hacer utilizando cualquier métcjdo de reticulación conveniente. Lo's agentes y las técnicas de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica, Y están descritos en, por ejemplo, en la Patente de los E.U. A. Número 4, 676, 980. ; Las técnicas adecuadas para generar anticuerpos biespecificos de fragmentos de anticuerpos también¦ son conocidas en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos biespecificos pueden prepararse utilizando el enlace químico. En ciertos casos, los anticuerpos biespecificos pueden ser generados por un procedimiento en el que los anticuerpos intactos son proteolíticamente escindidos para generar los fragmentos F(ab')2 {véase, por ejemplo, Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Estos fragmentos son reducidos én la presencia del agente que forma complejos con el ditiol arsenita de sodio para estabilizar los ditioles vecinales y prevenir la formación de -disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados luego son convertidos a derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab' -TNB luego se reconvierten al Fab' -tiol por la reducción con la mercaptoetilamina y es mezclado con una cantidad equimolar del otro derivado Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecifico .

En algunas modalidades, ¦ los fragmentos Fab' -SH pueden ser directamente recuperados de É. coli y acoplados químicamente para formar los anticuerpos biespecificos . Por ejemplo, una molécula- F(ab')2 del anticuerpo biespecífico totalmente humanizado puede ser producido por los métodos descritos en Shalaby et al., J. Exp. Med. , 175: 217-225 (1992). Cada fragmento Fab' fue segregado por separado de \E. coli y sometido al acoplamiento químico dirigido in vitfo para formar el anticuerpo biespecífico .

Varias técnicas para hacer y aislar los fragmentos del anticuerpo biespecífico directamente de los cultivos celulares recombinantes también han sido descritas. ¦ Por ejemplo, los anticuerpos biespecífieos han sido producidos utilizando las cremalleras de leucina. Véase, por ejemplo, i Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-1553' (1992). Lbs péptidos. de la cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos diferent;es anticuerpos por fusión génica. Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros luego se re-oxidaron para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este método también puede ser utlizado para lia prudeción de homodímeros de anticuerpo. La tecnolog ¡!ía "diacuerpo" descrita por' Hollinger et al., Proc. Nati. AcaL. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para hacer fragmentos de anticuerpos biespecífieos . Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por un conector que es muy corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma adena . En consecuencia, los dominios VH y VL dé un ragmentos son forzados a aparearse con los dominios VL y iVH complementarios de otro fragmento, de ese- modo formar dos sitios de unión al antigeno. Otra estrategia , para hacjer fragmentos de anticuerpos biespecificos para el uso de los dimeros Fv (sFv) de una sola cadena están descritos en Grubjer et al., J. Imm nol., 152:5368 (1994) .

Anticuerpos con más de dos valencias también están contemplados. Por ejemplo, anticuerpos triespecificos pueden ser preparados. Véase, por ejemplo, Tutt et al., J. Immunol 14 : 60 (1991) . .

G. Purificación del Anticuerpo Cuando se utilizan técnicas recombinantes, '; los anticuerpos pueden ser producidos dentro de una , célula huésped aislada, en el espacio, periplásmi'co de una célula huésped, o directamente segregados de una célula huésped en el medio. Si el anticuerpo es producido intracelularmente, los desechos de partículas primero son eliminados, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración . Cárter et al., BioTech. , 10:163-167 (1992) describe un procedimiento para aislar anticuerpos que son secretados en el espacio periplásmico de E. coli. . En resumen, la pasta celular se descongela en la presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA, y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante unos 30. minutos. Los desechos celulares pueden eliminarse: por centrifugación. Donde el anticuerpo se secreta en el medio, los sobrenadantes de .tales sistemas de expresión generalmente se concentran utilizando un filtro de concentración de- proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidjor de proteasas tales como el P SF puede estar incluido |en cualquiera de los pasos anteriores para inhibir1 |la proteólisis y los antibióticos pueden estar incluidos !pa|ra prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios.

La composición del anticuerpo preparado de1 ljas células puede purificarse utilizando, por ejemplo,: |la cromatografía de hidroxilapatita, la electroforésis en gell, la diálisis, y la cromatografía de afinidad. La adecuación de la proteína A como un ligando de afinidad depende ! de: las especies y el isotipo de cualquier dominio Fe de la inmunoglobulina que esté presente en el ' anticuerpo.1 |La proteína A puede ser utilizada para purificar anticuerpos qjue están basados en las cadenas pesadas ??, ?2, o ?4 de humano (véase, por ejemplo, Lindmark et al., J. Immunol. etJ. , 62:1-13 (1983)) . La proteína G se recomienda para . todos los isotipos de ratón y para ?3 de humano (véase, por ejemplo, Guss et al., EMBO J., 5:1567-1575 (1986) ) La matriz a lá que el ligando de afinidad se adjunta es con más frecuencia de agarosa, pero otras matrices están disponibles. Las matrices mecánicamente estables tales como el vidrio ' de ;poro controlado o el poli (estirenodivinil) benceno permiten tasas de flujo más rápido ' y tiempos de procesamiento menores que pueden lograrse con agarosa. Donde el anticuerpo comprende- ¡un pero no están limitados a, anticuerpos de dómini unicuerpos, nanocuerpos, proteínas activas de antígeno shar¡ avímeros, adnectinas, anticalmodulinas, ligandos de afinidajd, filómeros, aptámeros, anticuerpos, trinectinas, y semejantes IX. Métodos de Administración De acuerdo a los métodos de la presente invenció'n, I las drogas contra el cáncer descritas aquí son administradas a un sujeto por cualquier medio conveniente conocido en la técnica. Los métodos de la presente invención pueden ser utilizados para seleccionar una droga contra el cáncer adecuada o la combinación de drogas contra el cáncer para el tratamiento de un tumor (por ejemplo, el tumor de mama) en un sujeto. Los métodos de la invención también pueden ser utilizados para identificar la respuesta de un tumor (por ejemplo, el tumor de mama) en un sujeto para el tratamiento con una droga contra el cáncer o la combinación de drogas contra el cáncer. Además, los métodos de la invención pueden ser utilizados para predecir la respuesta de un sujeto que tiene un tumor (por ejemplo, el tumor de mama) para el tratamiento con una droga contra el cáncer o la combinación de drogas contra el cáncer. Una persona con destreza en la i técnica apreciará que las drogas contra el cáncer descritas aquí pueden ser administradas solas o como parte de un enfoque terapéutico combinado con quimioterapia convencional, radioterapia, terapia hormonal, inmunoterapia, y/o cirugía.

En ciertas modalidades, la droga contra el cáncer comprende un agente antiseñalización (es decir, una droga citostática) tal como un anticuerpo monoclonal o un inhibidor de la tirosina quinasa; un agente anti proliferativo; un agente quimioterapéutico (es decir, una droga citotóxica) ; jun agente terapéutico hormonal; un agente de radioterapia utico; una vacuna; y/o cualquier otro compuesto con la capacidad de reducir o detener el crecimiento descontrolado de células aberrantes tales como las células cancerosas. En algunas modalidades, el sujeto es tratado con uno o más agentes antiseñalización, agentes antiproliferativos , y/o agentes terapéuticos hormonales en combinación con al menos un agente quimioterapéutico. Los anticuerpos monoclonales ejemplares, inhibidores de la tirosina quinasa, agentes antiproliferativos , agentes quimioterapéuticos, agentes terapéuticos hormonales, agentes radioterapéuticos, y vacunas fueron descritos antes.

En algunas modalidades, las drogas contra el cáncer descritas aquí pueden ser coadministradas con agentes inmuneterapéuticos convencionales que incluyen, , pero no limitados a, inmunoestimulantes (por ejemplo, Bacillus de Calmette-Guérin (BCG) , levamisol, interleucina-2, interferon-alfa, etc.), inmunotoxinas (por ejemplo, el conjugado anticuerpo monoclonal anti-CD33-caliqueamicina, el conjuga'do anticuerpo monoclonal anti-CD22-exotoxina de pseudomonas, etc.), y radioinmunoterapia (por ejemplo, el conjugado anticuerpo monoclonal anti-CD20 para 11:LIn, 90Y, o 131I, etc.) Las drogas contra el cáncer pueden sjer administradas con un excipiente farmacéutico adecuado según sea necesario- y puede llevarse a cabo por cualquiera de lbs modos aceptados de la administración. Asi, la administración puede ser, por ejemplo, oral, bucal, sublingual, gingival, paladina, intravenosa, tópica, subcutánea, transcutánea, transdérmica, intramuscular, intra-articular, parenteral, intraarterial, intradémica, intraventricular, intracraneal, intraperitoneal , intravesical , intratecal, intralesional , intranasal, rectal, vaginal, o por inhalación. Por "coadministrar" quiere decir que una droga contra el cáncer es administrada al mismo tiempo, justo antes, o justo después de la administración de una. droga secundaria (por ejemplo, otra droga contra el cáncer, una droga útil para reducir los efectos secundarios asociados con la terapia con drogas contra el cáncer, un agente radioterapeútico, . un agenjte terapéutico hormonal, un agente inmuneterapéutico, etc.).

Una cantidad terapeúticamente efectiva de una drojga contra el cáncer puede ser administrada en varias ocasiones, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o con más veces, o la dosis puede ser administrada por infusión continua. La dosis puede adoptar la forma de sólido, semisólido, polvo liofilizado, o formas liquidas de dosificación, tales como, por ejemplo, tabletas, pildoras, pastillas, cápsulas, polvos, soluciones, suspensiones, emulsiones, supositorios, enemas ¡de retención, cremas, ungüentos, lociones, geles, aerosoles, espumas, o semejantes, preferentemente en formas de unidad Le dosificación adecuadas para la administración simple |de dosificaciones precisas.

Como aquí es utilizado, el término "forma de unidad de dosificación" se refiere a las unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para humanos y otros mamíferos, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de una droga contra el cáncer calculada para producir el inicio deseado, la tolerabilidad, y/o los: efectos terapéuticos, en asociación con un excipiente farmacéutico adecuado (por ejemplo, una ampolleta) . Además, formas de dosificación más concentradas pueden prepararse, de las que formas de unidad de dosificación más diluidas luego pueden ser producidas. Las formas de dosificación más concentradas por lo tanto contendrán sustancialmente más que, por ejemplp, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o con más veces !la cantidad de la droga contra el cáncer.

Los métodos para preparar tales formas de dosificación son conocidas por aquellos con destreza en la técnica (véase, por ejemplo, REMINGTON's PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18TH ED. , Mack Publishing. Co., Easton, PA (1990)). Las fórJas de dosificación incluyen típicamente un vehículo o excipiente farmacéutico convencional y pueden además incluir otros agentes medicinales, vehículos, adyuvantes, diluyentes, potenciadores de la permeación de tejido, solubilizante's , y semejantes. Los excipientes adecuados pueden adaptarse a la medida a la forma de dosificación particular y la ruta de administración por métodos bien conocidos en la técnijca (véase, por ejemplo, REMINGTON's PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra) .

Ejemplos de excipientes adecuados incluyen, pero ¡no están limitados a, lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbito'l, manitol, almidones, goma de acacia, fosfato de calcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, solución salina, jarabe, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, y ácidos poliacrílieos tales como Carbopoles, por ejemplo, Carbopol 941, Carbopol 980, Carbopol 981, etc. Las formas de dosificación pueden incluir' además agentes lubricantes tales como el talco, estearato de magnesio, y aceite mineral; agentes humectantes, agentes emulsionante; agentes de suspensión; agentes conservantes tales como^ el metil-, etilen-, y propil-, hidroxi-benzoatos (es decir, los parabenos); agentes de ajuste del pH tales como los ácidos y bases orgánicas e inorgánicas; agentes edulcorantes; y agentes saborizantes . Las formas de dosificación también pueden comprender perlas de polímero biodegradable, dextrano y complejos de inclusión de ciclodextrina .

Para la administración oral, la dosis terapéuticamente, efectiva puede ser en forma de . tabletas, cápsulas, emulsiones, suspensiones, soluciones, jarábJs, atomizadores, grageas, polvos, y formulaciones de liberación sostenida. Los excipientes adecuados para la administración oral incluyen grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, gelatina, sacarosa, carbonato de magnesio, y semejantes.

En algunas modalidades, la dosis terapéuticamente r efectiva toma la forma de una pildora, tableta, o cápsula, por lo tanto, la forma de dosificación puede contener, junto con una droga contra el cáncer, cualquiera de los siguientes un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato dicálcico, semejantes; un disgregánte tal como almidón o sus derivadc-s; un lubricante tal como él estearato de magnesio y semejantes; y un aglutinante tal como un almidón, goma de acacia, polivinil pirrolidina, gelatina, celulosa y sus derivadqs Una droga contra el cáncer también puede formularse en |un supositorio dispuesto, por ejemplo, en un vehículo |de polietilen glicol (PEG) .

Las formas de ¦ dosificación líquidas pueden prepararse al disolver o dispersar una droga contra el 'cáncer y opcionalmente uno o más adyuvantes farmacéuticamente aceptables en un vehículo tal como, por ejemplo, solución salina acusa (por ejemplo,' 0.9% p/v de cloruro de sodio! ) , dextrosa acuosa, glicerol, etanol, y semejantes, para formar una solución o suspensión, por ejemplo, para la administración oral, tópica, o intravenosa. Una droga contLa el cáncer también puede formularse en un enema de retención! Para la administración tópica, la dosís terapéuticamente efectiva puede ser en la forma de emulsiones, losiones, geles, espumas, cremas, .jaleas, soluciones, suspensiones, ungüentos, y parches transdérmicos . Para la administración por inhalación, una droga contra el cáncer puede ser administrada como un polvo seco o en forma líquida por un nebulizador. Para- la administráciLn parenteral, la dosis terapéuticamente efectiva puede ser en forma de soluciones inyectables estériles y polvos empacados estériles. Preferentemente, las soluciones inyectables están formuladas a un pH de alrededor de 4.5 a 7.5.

La dosis terapéuticamente efectiva también puejde proporcionarse en una forma liofilizada. Tales' formas de dosificación pueden incluir un amortiguador, por ejemplp, bicarbonato, para la reconstitución previa a !la administración, o el amortiguador puede ser incluido en la forma de dosificación liofilizada para la reconstitución con, por ejemplo, agua. La forma de dosificación liofilizada puede además comprender un vaso constrictor adecuado, por ejemplo, epinefrina. La forma " de dosificación liofilizada puede s(er proporcionada en una jeringa, opcionalmente empaquetada jen combinación con el amortiguador para la reconstitución, tjal que la forma de dosificación reconstituida pueda ser administrada inmediatamente a un sujeto.

Un sujeto también puede ser monitoreado en intervalos de tiempo periódicos para evaluar la eficacia de un. cierto régimen terapéutico. Por ejemplo, los estados de activación de ciertas moléculas de transducción de señales pueden cambiar basadas en el efecto terapéutico 1 del tratamiento con una o más de las drogas contra el cáncer ! aquí descritas. El ·. sujeto puede monitorearse para evaluar la respuesta y entender los efectos de ciertas drogas o tratamientos en un enfoque individualizado. Además, los sujetos que responden inicialmente a una droga contra el cáncer especifica o la combinación de drogas contra el cáncer pueden llegar a ser resistentes a la droga o la combinación de- la droga, lo que indica que estos sujetos han desarrollado resistencia adquirida a la droga. Estos sujetos pueden s,er suspendidos en su terapia actual y recetados con |un tratamiento alternativo de acuerdo con los métodos de |la presente invención.' En ciertos aspectos, los métodos descritos aquí pueden ser utilizados en conjunción con grupos de marcadores de expresión genética que predicen la probabilidad del pronóstico del , cáncer de mama y/o recurrencia en varias poblaciones de mujeres con, por ejemplo, la enfermedad de nodo negativo. Estos paneles de genes pueden ser útiles ;para identificar mujeres quienes son poco probables : de experimentar recurrencia- y, por lo tanto, improbables de beneficiarse de' la quimioterapia adyuvante. Los paneles de expresión pueden ser utilizados para identificar mujeres quienes con seguridad pueden evitar la quimioterapia adyuvante, sin afectar negativamente los resultados de supervivencia libre de enfermedad y global. Los sistemas adecuados incluyen, pero no están limitados a, Oncotype i DX! que es un panel de 21 genes de Genomic Health,.: Inc MammaPrint , ® que es un panel de .70 genes de Agendia; y ¡un grupo de 76 genes de Veridex. : ! Además, en ciertos aspectos, los métodos déscritjos aquí pueden ser utilizados en conjunto con paneles ¡de marcadores de expresión genética que identifican el' carcinoma de tumor primario desconocido (CUP) . Estos paneles de genes pueden ser útiles en identificar mujeres con ' cáncer metastático que se beneficiarían de la terapia consistente con la que se da a mujeres diagnosticadas inicialmehte con cáncer de mama. Los . sistemas adecuados incluyen, pero no están limitados a, el análisis Aviara CancerTYPE ID, . un análisis de expresión basado en RT-PCR que mide 92 genes para identificar el sitio primario de origen para 39 tipos de tumores; y la Prueba de Tejido de Origen Pathwork , que mide la expresión de más de 1600 genes en una micromatriz compara una "firma" de expresión genética del tumor en contra de aquellos 15 tipos de tejido conocidos.

X. Ejemplos i Los ejemplos siguientes se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar, la invención reivindicada.

Ejemplo 1. Aislamiento, Estimulación, y Lisis de las Células Circulantes .

Las células circulantes de un tumor sólido comprenden células que se han metastatizado o micrometastatizado de un tumor sólido e incluyen las células tumorales circulantes (CTCs), las células madres de cánJer (CSCs), y/o las células que están migrando al tumor or ejemplo, células endoteliales progenitoras circulantes (CEPCs), células endoteliales circulantes (CECs) , células mieloides pro-angiogénicas circulantes, células dendriticas circulantes, etc.) . Las muestras de pacientes que contienen células circulantes se pueden obtener de cualquier fluido biológico accesible (por ejemplo, sangre entera, suero, plasma, fluido de lavado ductal, ' aspirado del pezón, linfa, orina, saliva, aspirado con aguja fina, etc.). Las células circulantes se pueden aislar dé una muestra del paciente utilizando uno o más métodos de separación tales como, por ejemplo, la separación inmunomagnét'ica (véase, por ejemplo, •Racila et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 95 : 589-45j94 (1998); Bilkenroth et al., Int. J. Cáncer, 92:577-582 (2001)), el sistema CellTrack™ por Immunicon (Huntingdon Valley, PA) , la separación microfluidica (véase, por ejemplo, Mohamed et al., IEEE Trans. Nanobiosci. , 3:251-256 (2004); Lin et al., Abstract No. 5147, 97th AACR Annual Meeting, Washington, D.C. (2006)), FACS {véase, 'por ejemplo, Mancuso et al., Blood, 97:3658-3661 (2001)), la centrifugación en gradiente de densidad {véase, por ejemplo, Baker et 'al., Clin. Cáncer Res., 13:4865-4871 (2003)), y los métodos de reducción {véase, por ejemplo, Meye et al., Int. J. Oncol 21:521-530 (2002)) .

Manual de aislamiento de CTCs : Separación inmunomagnética de CTCs - aislamienjto manual seguido por un' análisis de activación: 1) Perlas magnéticas (Dynal M450; Dynal AS; Osl , Noruega) que han sido previamente conjugadas con un anticuerpo monoclonal anti-EpCAM (Kordia Life Sciences; Leiden, Holanda) han sido utilizadas. Alternativamente, anticuerpos policlonales o mezclas de anticuerpos monoclonales pueden ser utilizados. 2) Justo antes de usar, las Dynabeajds prerrevestidas se lavan una . vez en un volumen igual de P|BS con BSA a 0.01% . 3) 25 µ? de las Dynabeads prerrevestidas se agregan a 1 mi de la muestra. 4) La mezcla se incuba durante 20 minutos a 2-8°C con inclinación y rotación suave. 5) El tubo se coloca en el separador magnétijco (imán MPL-1) durante 2 minutos. '6) El sobrenadante se descarta y las células uríidjas a las perlas se lavan tres veces para resuspender en PBS con BSA a 0.01% seguido por la separación magnética. 7) La muestra se resuspende en 100 µ? del amortiguador de estimulación.

Preparación de la muestra: 1) La sangre periférica de los sujetos humanos se extrae en un tubo siliconado que contiene 1 mg/ml EDTA.' L'os primeros 3-5 mi se descartan para evitar la contaminación cjon células epiteliales liberadas de la vena perforada. 2) 1 mi de la sangre entera se diluye 1:3 con 0. 9% NaCl antes de su uso.

Preparación de control: 1) Los controles de la linea celular se hacen al agregar lineas celulares de cáncer humano en células HL-60. 2) Los controles de la línea celular se hacen al agregar líneas celulares de cáncer humano en la sangre .entejra de donantes sanos.

Aislamiento manual de CECs y CEPCs : Como un ejemplo no limitativo, los CECs y CEEjCs viables se pueden aislar utilizando ,1a técnica !de aislamiento/enriquecimiento inmunomagnético descrito: ¡en Beerepoot et al., ¦ Ann. Oncology, 15:139-145 (2004): ¡En resumen, la sangre periférica se incuba con perlas magnéticas (Dynal M450 IgGi) que han sido previamente conjugadas con un anticuerpo monoclonal anti-CD146 (Kordia Life Sciences) . Este anticuerpo reconoce todos los linajes de las células endoteliales, pero no las. células hematopoyétiCas o epiteliales, en la sangre periférica (George et al.; J. Immunol. Meth. , 139.: 65-75 (1991)). La selección negativa de las células hematopoyéticas y epiteliales puede ser utilizada antes de la selección positiva con las perlas magnéticas conjugadas con los anticuerpos apropiados (por ejemplo, las perlas Dynal-CD45 para agotar leucocitos, las perlas Dynal-CD14 para agotar monocitos, Dynal-EpCAM para agotar células epiteliales ( Invitrogen; Carlsbad, CA) ) . En este ejemplo, |la selección positiva- solamente se utiliza.

La separación inmunomagnética de CECs y CEPCs aislamiento manual seguido por un análisis de activación: 1) Las perlas magnéticas (Dynal M450) que han sijdo previamente conjugadas con un anticuerpo monoclonal ant¡i-CD146 (Kordia Life Sciences) son utilizadas. 2) Justo antes de usar, las Dynabea'ds prerrevestidas se lavan una vez en un volumen igual de EjBS-con BSA a 0.01%. 3) 25 µ? de Dynabeads prerrevestidas se agregan a mi de la muestra. 4) La mezcla se incuba durante 20 minutos a 2-8°C ¡ ' I con inclinación y rotación suave. ' 5) El tubo se coloca en el separador > magnético (imán MPL-1) durante 2 minutos. 6) El sobrenadante se descarta y las células uriid'as a las perlas se lavan tres veces al resuspenderse en PB= cjon BSA a 0.01% seguido por la separación magnética. j. 7) La muestra se resuspende en ¦ 100 µ? i d¡el amortiguador de estimulación. · | Preparación de la muestra: | 1) La sangre periférica de los sujetos humanós ¡se extrae en un tubo siliconado que contiene 1 mg/ml ; ED A. Los primeros 3-5 mi se descartan para evitar la contaminación con células endoteliales liberadas de la vena perforada. 2) 1 mi de sangre entera se diluye 1:3 con 0. 9% NaCl antes de usar. : Preparación del control: 1) ' Los controles de la linea celular se hacen al agregar células endoteliales de la vena de cordón umbilical humano (HUVEC) en células HL-60. 2) Los controles de la linea celular se hacen al agregar células endoteliales de la vena de cordón umbilical humano (HUVEC) en la sangre entera donada por individuos sanos.

Aislamiento manual de CEPCs (sin CECs) : Los CEPCs son un subtipo circulante de células progenitores derivadas de la mé ¦du'la ósea que tienen l?a capacidad de diferenciarse en células endoteliales maduras en respuesta a varios factores de crecimiento angiogénicos.1 Los CEPCs pueden aislarse por la selección con anticuerpos que reconocen el marcador de superficie CD34. El CD133 es un marcador de superficie que diferencia las células progenitoras endoteliales inmaduras (EPCs) o las células madre hematopoyéticas embrionarias (HSCs) de CEPCs. Várijos procedimientos de aislamiento de CEPCs de diferentes fuentes han sido descritos que utilizan cultivos de adherencia | o I microperlas magnéticas. En este ejemplo, un protocolo modificado del que se describe en Asahara et al., Sciénqe, 275:964-967 (1997) es utilizado.

' Separación inmunomagnética de CEPCs - aislamiento manual seguido por un análisis de activación: 1) Perlas magnéticas (Dynal M450 CD34) sjon utilizadas. Estas perlas' están revestidas con un anticuerpo monoclonal especifico para el ántigeno de superficie CD34. 2) Justo antes del uso, las Dynabe ds prerrevestidas se lavan una vez en un volumen igual dé ^BS con BSA a 0.01%. 3) 25 µ? de Dynabeáds prerrevestidas se agregan a 1 mi de la muestra. 4) La mezcla se incuba durante 20 minutos a 2-8!°C con inclinación y rotación suave. 5) El tubo se coloca en el separador magnético ¡de (imán MPL-1) durante 2 minutos.. 6) El sobrenadante se descarta y las células unidas a las perlas se lavan tres veces al resuspenderse en PBS cjon BSA a 0.01% seguido por la separación magnética. 7) La muestra se resuspende en 100 µ? del amortiguador de estimulación.

* Preparación de la muestra: 1) La sangre periférica de los sujetos humanos |se extrae en un tubo siliconado que contiene 1 mg/ml EDTA. L|os primeros 3-5 mi se descartan para evitar la contaminación con las células endoteliales liberadas de la vena perforada. 2) 10 mi de sangre se diluye 1:1 con una solución salina equilibrada. 1) 4 mi de la sangre diluida se estatifican en 3 |ml de Ficoll-Paque en .tubos de 10 mi. 2) Los tubos se centrifugan a 400 x g durante 30-f40 minutos a 18-20°C. 3) La capa superior que contiene el plasma y las plaquetas se extrae utilizando una pipeta Pasteur estéril, dejando la capa de células mononucleares inalteradas en la interfase. eliminar manualmente la muestra después del aislamiento con i el Sistema CellTracks® AutoPrep®, que puede proporcionar un método para el aislamiento antes del análisis para la activación de la vía. El número de CTCs puede ser informativo para el desarrollo de algoritmos.

Sistema Veridex - enriquecimiento del CTC seguido por recuento: 1) 7.5 mi de sangre se mezclan con 6 mi del amortiguador, centrifugados a 800 x g durante 10 minutos, luego son colocados en el Sistema CellTracks® AutoPrep®. 2) Después de que el' instrumento aspira l sobrenadante, el instrumento agrega los ferrofluidos . 3) El instrumento realiza la incubación y el paso de separación magnética siguiente. 4) Las células no unidas y el plasma remanente s;on aspirados. 5) Los reactivos de tinción se agregan en conjunto con el amortiguador de permeabilización para la tinción de florescencia. 6) Después de la incubación por el sistema, lias células otra vez separan magnéticamente y se resuspenden |en el dispositivo de presentación de células MagNest®. 7) El dispositivo de presentación de célúljas MagNest® luego se coloca en el Analizador CellTracks®, Jun microscopio de fluorescencia semiautomático de cuatro CellTracks AutoPrep para la preparación de la muestra <üe sangre y el Analizador CellTracks® para contar y caracterizar los CECs y CEPCs de sangre entera. El protocolo es el mismo que para el Equipo de Células Endoteliales CellSearch .

Preparación de la muestra: 1) Conteo: La sangre periférica de los sujetos humanos se extrae en el tubo de Preservación CellSave de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los primeros 3-5 mi se descartan para evitar la contaminación con células epiteliales o endoteliales liberadas de la vena perforada. 2) Análisis de la vía: La sangre periférica de los sujetos humanos se extrae en un tubo siliconado que contiene 1 mg/ml EDTA. Los primeros 3-5 mi se descartan para evitar la contaminación con células epiteliales o endoteliales liberados de la vena perforada.

Aislamiento manual de CSCs: La evidencia se acumula de que los tumor!es contienen, una población pequeña de células madre de cáncer putativo con mecanismos únicos de supervivencia y autorenovación (véase, por ejemplo, Sells, Crit. Rev. Oncol . Hematol., 51:1-28 (2004); Reya et al., Nature, 414:105-111 (2001); Dontu et al., Trends Endocrinol. Metal., 15:193-197 (2004); y Dick, Nature, 423:231-233 (2003)) . Las células madre de cáncer (CSCs) pueden existir en un estado inactivo durante mucho tiempo, haciéndolas resistentes a las drogas quimioterapéuticas que se dirigen a las células en división.

Clin. Can. Res., 12:5615 (2006) es utilizado.

Separación inmunomagnética de CSC - separación manual seguida por un análisis de activación: 1) Perlas magnéticas (Dynal AS; Oslo, Noruega) sbn utilizadas. Estas perlas están recubiertas con un anticuerpo monoclonal especificó ya sea para el antigeno de superficie CD34 o CD133. : 2) Justo antes de utilizar, las Dynabeads prjs-revestidas se lavan una vez con un volumen igual de PBS cpn BSA al 0.01%. . 3) De 1-107 (1-107??) Dynabeads pre-revestidas Be agregan a 3 mi de la muestra. 4) La mezcla se incuba durante 60 minutos a 2-8°C con inclinación y rotación suave. i 5) La mezcla se divide en porciones de 1 mi y ca'da tubo se coloca en el separador magnético (imán MPL-1) po al menos 6 minutos . 6) El sobrenadante se descarta y las células unidas a las perlas se lavan tres veces para resuspenderse en PBS con BSA al 0.01% seguido por la separación magnética. 7) La muestra se resuspende en 100 µ? djel amortiguador de estimulación.

Preparación de la muestra: 1) Las muestras de médula ósea se obtienen 'de pacientes con cáncer de mama temprano tras el consentimiento informado del paciente. 2) El procesamiento de los aspirados de la médula ósea se realizan como está descrito en Bauer et al., Clin.

Can. Res., 6:3552-3559 (2000)) . La fracción de células mononucleares que contienen cualquier célula tumoral diseminada se enriquece por la centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque que utiliza una centrifuga Beékman GS-6 a 4000 x g durante 35 minutos y se lava dos veces con PBS.

Estimulación celular y lisls de las CTCs aisladas: Estimulación celular: 1)' Los factores de crecimiento TGF- (100 nM) , Hrg (100 nM) , y/o IGF (100 nM) se agregan a las células y |se incuban a 37°C durante 5 minutos.

¦Estimulación celular, con el tratamiento de lia droga : 1) La muestra se incuba con Herceptina, Lapatiniba, Tarceva, y/o análogos de Rapamicina a concentraciones terapéuticamente efectivas durante 30 minutos a 37°C. 2) Las células luego se estimulan al agregar los factores TGF-OÍ (100 nM) , Hrg (100 nM) , y/o IGF (100 n ) y se incuban a 37°C durante 5 minutos Estimulación celular con el tratamiento dé la droga (bucle de retroalimentación ) : 1) La muestra se incuba con Herceptina, Lapatiniba, Tarceva, y/o análogos de Rapamicina a concentraciones terapéuticamente efectivas durante 30 minutos a 37°C. 2) Las células luego se estimulan por TGF- (100 nM) , Hrg (100 nM) , y/o IGF (100 nM) y se incuban a ; 37| durante 120 minutos Los CTCs estimulados se lisan utilizando el protocolo siguiente: 1) El amortiguador de lisis fresco es preparado recientemente al mezclar los reactivos establecidos en la Tabla 3. 2) Después de lavado final, las células (se resuspenden en hielo en 100 µ? del amortiguador enfriado. 3) La incubación se realiza en hielo durante 30 minutos . 4) La mezcla se centrifuga en una micro centrifuga a velocidad máxima durante 10 minutos para separar las perljas de lisado. 5) El Usado se transfiere a un tubo nuevo para análisis. o para almacenar a -80°C.

•Tabla 3 Estimulación celular y lisis de las CECs y/o CEPCs aisladas : El factor de crecimiento endotelial vascullar (VEGF) se cree que promueve la supervivencia al activar Jas vías antiapoptóticas en ambas CEPCs (Larrivee et al., ü. Biol. Chem., 278:22006-22013 (2003)) y CECs maduras, que han sido descamadas de la pared del vaso (Solovey et al., Bloocl, 93:3824-3830 (1999)) . VEGF también puede estimular, la proliferación de las CEPCs o las CECs maduras, aunque, las CECs maduras parecen tener solamente una capacidad proliferativa limitada comparada con CEPCs (Lin et al.<, 'J. Clin. Invest., 105:71-77 (2000)) . Por estas razones, CECs y/o CEPCs se activan por la incubación con la familia de los factores del crecimiento VEGF antes de la lisis. .

Estimulación celular: 1) Los factores de crecimiento VEGF, FGF, PDG;F, PIGF, y/o Ang, cada uno a 100 nM, se agregan a las células se incuban a 37°C durante 5 minutos.

Estimulación celular con el tratamiento de lia droga : 1) La muestra se incuba con Análogos de Avastiria, Nexavar, Sutent, y/o Rapamicina a concentraciones terapéuticamente efectivas durante 30 minutos a 37°C. 2) Las células luego se estimulan al agregar los factores VEGF, FGF, PDGF, PIGF, y/o Ang, cada uno a 100 nM,¡ y se incuban a 37°C durante 5 minutos.

Estimulación celular con el tratamiento de la droga (bucle de retroalimentación) : 1) La muestra se incuba coh Análogos de Avasti a, Nexavar, Sutent, y/o Rapamicina a concentraciones terapéuticamente efectivas durante 30 minutos a 37°C. 2) Las células luego se estimulan al agregar VEGF, FGF, PDGF, PIGF, y/o Ang, cada uno a 100 nM, y se incuban a 37°C durante 120 minutos.

Las células CECs y/o CEPC aisladas se liskn utilizando el protocolo siguiente: 1) El amortiguador de lisis fresco se prepara recientemente al mezclar los reactivos establecidos eñ la Tabla 3. 2) Después del lavado final, las células se resuspenden en hielo en 100 µ? del amortiguador frió. 3) La incubación se realiza en hielo durante 30 minutos . 4) La mezcla se centrifuga en una micjro centrifuga a velocidad máxima durante 10 minutos para separar las perlas de lisado. 5) El lisado se transfiere a un tubo nuevo pajra el análisis o almacenamiento a -80°C.

Estimulación celular y lisis de las CSCs aisladas: Células estimuladas: 1) Los factores de crecimiento TGF-a (?????), Hrg (100 nM) , y/o IGF ,(100 nM) se agregan a las células y se incuban a la 37°C durante 5 minutos.

Las células estimuladas con el tratamiento de la droga: . j 1) La muestra se incuba con análogos 'de Herceptina, Lapatiniba, Tarceva, y/o Rapamicina concentraciones terapéuticamente efectivas durante 30 miriutjos a 37°C. ! 2) Las células luego se estimulan al agregar l]os factores TGF-OÍ (100 nM) , Hrg (100 nM) , y/o IGF (100 nM) y |se incuban a 37°C durante 5 minutos.

Células estimuladas con el tratamiento de la droga (bucle de retroalimentación) : i 1) La muestra se incuba con análogos |de Herceptina, Lapatiniba, Tarceva, y/o Rapamicina | a concentraciones terapéuticamente efectivas durante 30 minutos a 37°C. 2) Las células luego se estimulan al agregar lios factores TGF-OÍ (100 nM), Hrg (100 nM) , y/o IGF (100 nM) y |se incuban a 37°C durante 120 minutos.

Las células CSC aisladas se lisan utilizando el protocolo siguiente: . 1) El amortiguador de lisis fresco se prepa'ra recientemente al mezclar los reactivos establecidos en la I Tabla 3. ' 2) Después del lavado final, las células ¡se resuspenden en hielo en 100 µ? del amortiguador frió. ¦ 3) La incubación se realiza en hielo . durante |30 minutos . 4) La mezcla se centrifuga en una micro centrifuga a velocidad máxima durante 10 minutos para separar las perlas del lisado. 5) El lisado se transfiere a un tubo nuevo paira el análisis o almacenamiento a -80°C.

Ejemplo 2. Preparación de Extractos de Células Tumorales de Tejido, Biopsia, o Cultivos Primarios.

Este ejemplo ilustra métodos para aislar, estimular, y lisar células del tejido tumoral o muestras de la biopsia. Este ejemplo .también ilustra métodos para iniciar, estimular, y lisar cultivos primarios de ' células tumorales aisladas del tejido, biopsia, o sangre. Métodos adicionales para aislar y cultivar células tumorales de muestras biológicas para detección de agentes quimioterapéuticos están descritos, por ejemplo, en la Patente de los E.U.A. Números 5, 728, 541; '6,416,967; 6,887,680; 6,900,027; 6,933,129; y 7,112,415; y en las Publicaciones de Patente de los E.U.A. Números 20040023375 y 20050202411. Los extractos celulares preparados de acuerdo con este ejemplo pueden ser utilizados en la deteccipn individual o los análisis de proximidad aquí descritos.

Aislamiento de células tumorales de tejidos primarios metastásicos : Aislamiento y cultivo celular: 1) Aproximadamente 5-100 mg de tejido tumoral jno necrótico, no contaminado se recolectan quirúrgicamente y se colocan en una botella de 100 mi que contiene medio de cultivó celular estéril (por ejemplo, RMPI-1640 con 10% FBSj y antibióticos) . 2) Las muestras pueden almacenarse' o transportarse temperatura ambiente dentro de las 72 horas de extracción. 3) Las muestras se enjuagan tres veces en el medio ¡de cultivo celular. 4) El tejido se pica en piezas pequeñas con un bistu!ri I y luego ¦ se disgrega en una suspensión celular al pasar través de una malla de alambre fino. 5) Alternativamente, el tejido picado se trata con un cóctel que contiene 0.25% de Collagenasa II y 0.001% DNase de desoxirribonucleasa diluida en el medio de cultivo celul!ar libre de suero que contiene antibióticos. La incubación ;es durante 15-20 minutos con agitación suave. Las enzimas 'jse eliminan después del tratamiento al lavarse tres veces con el medio de cultivo 'celular. 6) La concentración celular se ajusta a 106/ml y l|as células se siembran en placas de seis pocilios y se dejlan reposar durante la noche. Al día siguiente, las células se tripsinizan y se resiembran en placas de microtitulación para la estimulación con ligandos y/o inhibición con las drogjas dirigidas.

Estimulación celular y llsis de células de los tumores disgregados : Estimulación celular: 1) Los factores de crecimiento TGF-OÍ (100 ??') , Hrg (100 nM) , y/o IGF (100 nM) se agregan a las células ¡y se incuban a 37°C durante 5 minutos.

Estimulación celular con el tratamiento de |la droga: 1) La muestra se incuba con análogos de Herceptina, Lapatiniba, Tarceva, y/o Rapamicina a i concentraciones terapéuticamente efectivas durante 30 minutos a 37°C. 2) Las células luego se estimulan al agregar ljos. factores TGF-OÍ (100 nM) , Hrg (100 nM) , y/o IGF (100 nM) ,y |se incuban a 37°C durante 5 minutos.

Estimulación celular con el tratamiento de la droga (bucle de retroalimentación) : 1) La muestra se incuba con análogos de Herceptina, Lapatiniba, Tarceva, y/o Rapamicina ] a concentraciones terapéuticamente efectivas durante 30 miiiut¡os a 37°C. 2) Las células luego se estimulan por TGF-of (ljOO nM) , Hrg (100 nM) , y/o IGF (100 nM) y se incuban a 37°C durante 120 minutos.

Las células estimuladas se lisan utilizando leí protocolo siguiente: 1.) El amortiguador de lisis fresco se prepajra recientemente al mezclar los reactivos establecidos en |la Tabla 3 anterior. ! 2) Después del lavado final, las células |se resuspenden en hielo en 100 µ? del amortiguador frió. 3) La incubación se realiza en hielo durante 30 minutos . 4) La mezcla se centrifuga en una micro centrifuga a velocidad máxima durante 10 minutos para separar las perlas del lisado. 5) El lisado se transfiere a un tubo nuevo , pájra el análisis o el almacenamiento a -80°C.

Aislamiento de células tumorales de muestras de la biopsia .· Aislamiento y cultivo celular: j 1) (Dos núcleos para agujas de calibre 14, 3 núcleos para agujas de calibre 16, y 4 núcleos para agujas de calibre 18, con 1-2 biopsias de biopsias asistidas por vacijo) y se colocan en ampolletas estériles de 10 mi que contieJen el medio de cultivo celular como para las muestras de tumor. 2) Las muestras se pueden almacenar o transportar a temperatura ambiente dentro de las 72 horas de extracción 3) El material celular de las biopsias con aguja gruesa se disgregan en una suspensión celular al pasarse través de una malla de alambre fino. 4 ) Alternativamente, las biopsias pueden tratarse con un cóctel que contiene 0 . 25% de Collagenasa II y 0 . 00,1 % DNase de desoxiribonucleasa diluida en el medio de cultilvo celular que contiene antibióticos. La incubación es de 15-20 minutos con agitación suave. Las enzimas eliminan después del tratamiento al lavarse tres veces con el medio de -cultivo celular . 5 ) La concentración celular se ajusta a 106/ml y las células se siembran en placas de seis pocilios y se 1es deja reposar durante la noche. Al día siguiente, la células se tripsinizan y se resiembran en placas de microtitulación para la estimulación con ligandos y/o la inhibición con drogas dirigidas . i Estimulación celular y lisis de las células de las biopsias : Estimulación celular: 1 ) Los factores de crecimiento TGF-a ( 100 nM) , Hrg ( 100 nM) , y/o IGF ( 100 nM) se agregan a las células y se incuban a 37°C durante 5 minutos.

Estimulación celular con el tratamiento de la droga : · 1 ) La muestra se incuba · con Herceptiria, Lapatiniba, Tarceva, y/o análogos de Rapamicina concentraciones terapéuticamente efectivas durante 30 minutos a 37°C. 2 ) . Las células luego se estimulan al agregar los factores TGF-a (100 nM) , Hrg (100 nM) , y/o IGF (100 nM) y ¡se incuban a 37°C durante 5 minutos.

Estimulación celular con el tratamiento de ¡la í droga (bucle de retroalimentación) : 1) La muestra se incuba con Herceptin'a, Lapatiniba, Tarceva, y/o análogos de Rapamicina concentraciones terapéuticamente efectivas durante 30 minutos a 37°C. 2) Las células luego se estimulan por TGF- (ljOO nM) , Hrg (100 nM) , y/o IGF (100 nM) y se incuban a 37°C durante 120 minutos Las células estimuladas se lisan utilizando | el protocolo siguiente 1) El amortiguador de lisis fresco se prepara recientemente al mezclar los reactivos establecidos en |la Tabla 3 anterior. 2) Después < del lavado final, las células |se resuspenden en hielo en 100 µ? del amortiguador frió.. 3) La incubación se realiza en hielo durante 30 minutos. 4) La mezcla sé centrifuga en una micro centrifuga a velocidad máxima durante 10 minutos para separar las perlas del lisado 5) El lisado se transfiere a un tubo nuevo para el análisis o el almacenamiento a -80°C.

Inicio de los cultivos primarios de células t morales aisladas de tejido, biopsia o sangre entera: Cultivo celular: I 1) Las células tumorales aisladas de tejid'o, biopsia, o sangre entera como se describen antes se cultivan en matraces estériles pequeños (por ejemplo, T-25) , placas de Petri (por ejemplo, 10 mm) , o placas (por ejemplo, placas de 24 pocilios) dependiendo en el número de células tumorales aisladas .. 2 ) La incubación se hace en el medio de cultijvo celular (por ejemplo, RMPI-1640 con 2% FBS y antibióticos) jen una incubación humidificada a 37°C suplementada con 5% C02. • Con el tiempo, las células forman una monocapa en' la . parte inferior del vaso y se comienzan a dividir. Cuando; las células están cerca de la confluencia, luego se tripsinizan y se resiembran en placas de microtitulación para la estimulación con ligandos y/o la inhibición cón drogas dirigidas.

Estimulación celular y lisis de los cultivos primarios de células tumorales aisladas de tejido, biopsia, o sangre enter : Estimulación celular: > 1) Los factores de crecimiento TGF- (100 n ¡) , Hrg (100 nM) , y/o IGF (100 nM) se agregan a las células y ise incuban a 37°C durante 5 minutos.

Estimulación celular con el tratamiento con lia i I droga : 1) La muestra se incuba con análogos de Herceptina, Lapatiniba, Tarceva, y/o Rapamicina concentraciones terapéuticamente efectivas durante 30 minutjos a 37°C. 2) Las células luego se estimulan al agregar líos factores TGF-a (100 nM) , Hrg (100 nM) , y/o IGF (100 nM) y ¡se incuban a 37°C durante 5 minutos.

Estimulación celular con el tratamiento de la droga (bucle de retroalimentación) 1) La muestra se incuba con análogos ¡de Herceptina, Lapatiniba, Tarceva, y/o ¦ Rapamicina concentraciones terapéuticamente efectivas durante 30 minutjos a 37°C. 2) Las células luego se estimulan por TGF-a (ljOO nM) , Hrg (100 nM) , y/o IGF (100 nM) y se incuban : a , 37°C durante 120 minutos.

Las células estimuladas se lisan utilizando !el protocolo siguiente: 1) El amortiguador de lisis fresco se prépajra recientemente al mezclar los reactivos establecidos en lia Tabla 3 anterior. 2) Después de lavado final, las células |se resuspenden en hielo en 100 µ? del amortiguador frío. 3) La incubación se realiza en hielo durante ¡30 minutos. t La mezcla se centrifuga en Una micro centrifuga a velocidad máxima durante 10 minutos para separar las perlas del lisado. 5) El lisado se transfiere a un tubo nuevo 'pa¡ra el análisis o el almacenamiento a -80°C.

Ejemplo 3. Detección individual de la micro matriz de ELISA con amplificación de la séñal de la Tiramida ¦ Este ejemplo ilustra una detección individu'al de la micro matriz de ELISA múltiple, de gran productividad, que tiene un rango dinámico superior que es adecuado !para analizar los estados de activación de las moléculas |de transducción de señales en células raras en circulación: ' 1) El anticuerpo de captura fue impreso en |un portaobjetos FAST de 16 celdas ( hatman Inc.; FlorhaV Parjk, NJ) con una- solución doble en serie 2) Después de. secar durante la noche, ¡ el portaobjetos fue bloqueado con un amortiguador de bloqueo Whatman . . '. ' ] 3) 80 µ? del lisado celular fueron agregados |en cada celda con una solución décuple en serie. El portaobjetos ; i fue incubado durante dos horas a temperatura ambiente. > ? 4) Después de seis lavados con TBS-Tween, 80 |µ1 del anticuerpos de detección etiquetado con biotina 1 {por ejemplo, un anticuerpo monoclonal que reconoce p-EGFR un anticuerpo monoclonal que reconoce EGFR a pesar del estado de activación) se incubó durante dos horas a temperatura ambiente. 5) Después de seis lavados, la peroxidasa |de rábano etiquetada con estreptavidina (SA-HRP) se agregó y ¡se incubó durante 1 hora para permitir al SA-HRP unirse |al anticuerpo de detección etiquetado con biotina. . : 6) Para la amplificación de la señal, 80 jil |de biotina-tiramida a 5 µg/ml se agregaron y reaccionaron durante 15 minutos. El portaobjetos fue lavado seis veces con TBS-Tween, dos veces con 20% DMSO/TBS-Tween, y una vez con TBS. 7) 80 µ? de SA-Alexa 555 fueron agregados incubados durante 30 minutos. El portaobjetos luego fue lavado dos veces, secado durante 5 minutos, y detectado en ]un detector de micro matriz (Perkin-Elmer, Inc.; Waltham, MA) Ejemplo 4. Detección Dual de la Proximidad de la Micro Matriz de ELISA con Amplificación de Señal de la Tiramida .

Este ejemplo ilustra una detección dual de | la proximidad de la micro matriz de ELISA múltiple, de gran productividad, que tiene un rango dinámico superior qúe es adecuado para analizar los estados de activación de las moléculas de transducción de señales en las células raras en circulación: 1) El anticuerpo de captura fue impreso en jun portaobjetos FAST de 16 celdas ( hatman Inc.)' con Jna disolución en serie del intervalo de 1 mg/ml a 0.004 mg/ml. 2 ) Después de secar durante la noche, el portaobjetos fue bloqueado con el amortiguador de .bloqueo Whatman. 3) 80 µ? de A431 del lisado celular fue agréga'do en cada celda con una solución décuple en serie. |E1 portaobjetos fue incubado durante dos horas a temperatura ambiente. 4) Después de seis lavados con TBS-Tween, 80 ?µ? de los anticuerpos de detección para el análisis de proximidad diluido en TBS-Tween/2 % BSA/1% FBS fueron agregados a los portaobjetos. Los anticuerpos de detección utilizados fueron: (1) un anticuerpo monoclonal an i-EGFR que fue directamente conjugado a la glucosa oxidasa (GO) ; ( 2 ) un anticuerpo monoclonal que reconoce el EGFR fosforilajdo que fue directamente conjugado a la peroxidasa de rábano (HRP) . La incubación fué durante 2 horas a temperatura ambiente. 5) Alternativamente, el paso de detección utili-zo un conjugado con biotina del anticuerpo monoclonal que reconoce el EGFR fosforilado. En estos casos, después de .seis lavados un paso secuencial adicional de incubación con estreptavidina-HRP durante 1 hora fue incluido. 6) Alternativamente, el paso de detección utililzó I un conjugado - de glucosa oxidasa (GO) mediada por oligonucleótido del anticuerpo ant-i-EGFR. Ya sea el conjugJdo directamente o el conjugado unido a biotina-esteptavidina (SA) de HRP al anticuerpo EGFR fosforilado fue utilizado. 7) Para la amplificación de la señal, 80 µ? de biotina-tiramida a 5 µg/ml fueron agregados y reaccionaron durante 15 minutos. El portaobjetos fue lavado seis veces con TBS-Tween, dos veces con 20% DMSO/TBS-Tween, y una vez cjon TBS. 8) 80 µ? de SA-Alexa 555 fueron agregados j e I incubados durante 30 minutos. El portaobjetos luego fue lavado dos veces, secado durante 5 minutos, y explorado en un detector de micro matriz ( Perkin-Elmer , Inc.) .

La figura 2 ilustra una modalidad de la presente invención en la que los análisis de proximidad aquí descritos detectaron el EGFR fosforilado (pEGFR) y el HEJ-2 fosforilado (pHER-2) con sensibilidad celular única. La figura 3 muestra que ' los análisis de proximidad aq¡uí descritos resultaron en los análisis altamente especificjos para la detección de HER-2 a niveles celulares únicos |en células que expresan HER-2.

Ejemplo 5. Generación de Perfiles de Activación para la Selección de la Droga.

Los métodos y las composiciones de la presente invención pueden aplicarse para la selección de la droga para el tratamiento del cáncer. Un protocolo típico implica la generación de dos perfiles, un perfil de activación de referencia y un perfil de activación de prueba, que luegó son i comparados para determinar la eficacia de un régimen (de tratamiento de la droga particular (véase, figura 4).

Perfil de Activación de Referencia Para obtener un perfil de activación ¡de referencia, una muestra de sangre se obtiene de un paciente que tiene un tipo específico de cáncer (por ejemplo, cáncer de mama) antes del tratamiento de la droga contra el cáncer. Las células raras circulantes derivadas del tumor cancerígeno se aislan de la muestra de sangre que utiliza, por ejemplo, las técnicas de separación inmunomagnética como se.' describen aquí en mayor detalle. Las células circulantes aisladas pueden estimularse in vitro con uno o más factores de crecimiento. Las células estimuladas luego pueden lisarse para producir un extracto celular. El extracto celular se aplica a una matriz direccionable que contiene una serie de dilusiones de un panel de anticuerpos de captura específicos para las moléculas de transducción de señales cuyos estados de activación pueden alterarse en el tipo de cáncer del paciente. La detección individual o análisis de proximidad se realizan utilizando anticuerpos de detección apropiados (por ejemplo, anticuerpos independientes del estado de activación y/o anticuerpos dependientes del estado de activación) para determinar el estado de activación de cada molécula de transducción de señales de interés. La Tabla "selección de la vía" mostrada en la Tabla 2 es particularmente útil para seleccionar que estados de activación para determinar basados en el tipo de cáncer del paciente. Por ejemplo, un paciente puede tener un tipo de cáncer que muestra los estados de activación de la via EGFR establecida en "vía 1" de la Tabla 2. Alternativamente, otro paciente puede tener otro tipo de cáncer que muestra los estados de activación de la via EGFR í establecida en "via 2" de la Tabla 2. Un perfil de activación de referencia es asi generado que proporciona los' estados de activación de las moléculas de transducción de señales en el cáncer del paciente en la ausencia de cualquier droga contra el cáncer.

Perfil de Activación de Pzueba Para obtener un perfil de activación ide prueba, una segunda muestra de sangre se obtiene del pacierlte que tiene el tipo específico de cáncer (por ejemplo, cáncer de mama) ya sea antes del tratamiento con la droga contra el cáncer o después de la administración de una droga contra el cáncer (por ejemplo, en cualquier tiempo a través del curso del tratamiento del cáncer) . Las células circulantes raras derivadas del tumor cancerígeno se aislan de la muestra de sangre. Si las células aisladas se obtienen de un paciente quien no ha recibido tratamiento con una droga contra el cáncer, las células aisladas se incuban con drogas contra el cáncer que tienen como objetivo una o más moléculas Le transducción de señales activadas determinadas del perfil de activación de referencia descrito antes. La Tabla "selección de la droga" (Tabla 1) es particularmente útil para seleccionar las drogas contra el cáncer apropiadas que ya son aprobadas o están en ensayos clínicos que inhiben las moléculas de transducción de señales diana activadas específicas. Por ejemplo, si se determina del perfil de activación de referencia que EGFR está activada, luego las células pueden incubarse con una o más drogas enlistadas jen la columna "A" o . "B" de la Tabla 1. Las células aisladas luego pueden estimularse in vitro con uno o más factores de crecimiento. Las células aisladas luego pueden lisarse para producir un extracto celular. El extracto celular se aplica a la matriz direccionable y los análisis de proximidad ;se realizan para determinar el estado de activación de cada molécula de transducción de señales de interés. Un perfil de activación de prueba para el paciente es así generado que proporciona los estados de activación de las moléculas Jde transducción de señales- en el cáncer del paciente la presencia de drogas 'contra el cáncer específicas.

Selección de la droga Las drogas contra el cáncer están determinadas por ser adecuadas o inadecuadas para el tratamiento del i I cáncer del paciente al comparar el perfil de activación de prueba con el perfil de activación de referencia. Por ejemplo, si el tratamiento con una droga causa que la .mayoría o todas las moléculas de transducción de .señales sean sustancialmente menos activadas que en la ausencia de ljas drogas, por ejemplo, un cambio de la activación fuerte sin las drogas a la activación débil o muy débil con las drogJs, luego el tratamiento se determina por ser adecuado para el cáncer del paciente. En tales casos, el tratamiento se inicia con la droga contra el cáncer adecuada en un paciente que no ha recibido la terapia con la droga o el tratamiento siguiente se continúa con la droga contra el cáncer adecuJda en un paciente que ya recibe la droga. Sin embargo/ si el tratamiento con una droga se considera inadecuado para el tratamiento del cáncer del paciente, drogas diferentes se seleccionan y se utilizan para generar un nuevo perfil de activación de prueba, que luego es comparado con el perfil de activación de referencia. En tales casos, el tratamiento se inicia con una droga contra el cáncer adecuada en un paciente que no ha recibido la terapia con la droga o el tratamiento siguiente se cambia a una droga contra el cáncer adecuada en un paciente que actualmente recibe la droga inadecuada.

Ejemplo 6. Matrices direccionables para el Análisis del Receptor Activado de Tirosina quinasas .

La figura 5 ilustra una estructura ejemplar del receptor tirosina quinasa' dirigida de la invención . ! Como aquí se discute, receptores de tirosina quinasas son componentes claves de muchas vías de transducción de señales involucradas en- la proliferación celular. Por ejemplo, la familia ErbB del receptor tirosina quinasa tiene cuatro miembros de la familia y juega un papel importante en los procesos celulares fundamentales como la proliferación celular, diferenciación, y supervivencia. Esta familia cel receptor tirosina quinasa ha sido reportado por sobreexpresarse en un número de diferentes tipos de cáncer y se asocia con un peor resultado clínico. En la unión del factor de crecimiento, ErbBl/EGFR, ErbB3/HER-3, y ErbB4 /HER-4 homo- y heterodimerizan para activar un número de vías de señalización diferentes. ErbB2/HER-2 no se une a un factor de crecimiento y es el socio ' preferido de heterodimerizáción. para todos los tres miembros de la familia. ErbB2 también puede homodimerizar cuando se sobreexpresa y activa las vías de señalización. La homo- y heterodimerizáción de la familia ErbB resulta en la transfosforilación. La auto÷- o transfosforilación libera la conformación inhibitoria del receptor de tirosina quinasa, permitiendo la activacion quinasa completa y al mismo tiempo crea sitios de unión para numerosas moléculas de señalización que contienen SH2, tales como Src, Shc SHP-1, SHEP-1, y PI3K. Las proteínas adaptadoras o proteínas de señalización como Shc, Grb2, o PI3K se reclutan a los receptores fosforilados . La fosforilación de las proteínas adaptadoras resulta en la activación de las vías MAPK y Akt . La activación de la V|ía MAPK puede evaluarse por la determinación de la condición de fosforilación de Erk y Rsk, mientras que la activación de Ha vía PI3K puede evaluarse por la determinación de la condicijón de fosforilación de Akt y p70S6K.

Así, la matriz direccionable mostrada en lia figura 5 permite no sólo determinar la expresión de |la familia ErbB del receptor tirosina quinasa, sino también ¡su condición de activación. Tanto la activación de la vía MAPK como PI3K/Akt también puede estudiarse en la matriz dirigida. Además, la condición de expresión y/o activación de ljos receptores hormonales nucleares tales como el ER (receptor de estrógenos) y PR (receptor de progesteronas ) , y otras proteínas tales como NCOR (corepresor de receptor nuclear), AIB1 (amplificado en el cáncer¦ de mama-1) , IGF-IR, cMET, Ki67, y TOPO II pueden estudiarse en la matriz dirigida. Otra característica de la matriz es la presencia de controlas internos para determinar el tumor o el contenido de células asociadas al tumor (CEC's, CEP''s, pericitos, etc.) y la IgG no especifica para determinar cualquier unión no especifica, Ejemplo 7. Matrices direccionables para el Análisis de Vías de Transducción de Señales en la Angiogénesis .

Las figuras 6 y 7 ilustran la configuración de matrices direccionables para determinar el estado de activación de los componentes de transducción de señales involucrados en la angiogénesis. Como aquí se describe, la angiogénesis tumoral es critica para el crecimiento de muchos tumores sólidos. Entre las moléculas de transducción Le señales clave estructuradas incluyen miembros de la' famil ía VEGFR, FGFR, y TIE de receptores de tirosina quinasas, que se expresan predominantemente en células endoteliales . PDGFR se expresa típicamente en pericitos. La expresión y la condición de activación dé estos receptores es crítica en la determinación del mecanismo predominante de la angiogénes |1S en las muestras del tumor individual. Los factores !de crecimiento como VEGF y PIGF se unen a VEGFR- 1 y VEGFR-2 e inician la -homo- y heterodimerización . La dimerización les seguida por la fosforilación de estos receptores, .que a su vez es seguida por la activación de las vías de señalizacijón MAPK y PI3K/Akt. Los receptores FGFR, TIE, y PDGFR también se activan de una manera similar. La auto- o transfosforilación libera la conformación inhibitoria ¡de receptores de tirosina quinasas, permitiendo la áctiváción ¦ quinasa completa y al mismo tiempo crea sitios de unión para numerosas moléculas de señalización que "contienen SH2, tales como Src, Shc, SHP-1, V-cadherina, SHEP-1, y PI3K. Las proteínas adaptadoras o proteínas de señalización como SlJc, Grb2, o PI3K son reclutadas a los receptores fosforilados . La fosforilación de las proteínas adaptadoras resulta en la activación de las vías APK y Akt. La activación de la vía MAPK puede evaluarse por la determinación de la condición de fosforilación de Erk y Rsk, mientras que la activación de |la vía PI3K puede evaluarse por la determinación de la condición de fosforilación de Akt y p70S6K.

Así, las matrices de angiogénesis dirigidas, tales como aquellas mostradas en las figuras 6 y 7, permiten no sólo determinar la' expresión de todos los componentes de transducción de señales involucrados en la angiogénesis en una muestra del paciente, sino también su condición de activación. Tanto la activación de la vía MAPK y PI3K/Akt pueden estudiarse en la matriz dirigida. La matriz tiene controles internos para determinar el tumor o el contenido de células asociadas al tumor (CEC's, CEP's, pericitos, etc.) y la IgG no especifica para determinar cualquier unión no especifica.

Las figuras 8 y 9 muestran matrices direccionables combinadas de. la invención para determinar la expresión y/o condición de activación de. la familia ErbB del receptor tirosina quinasa así como los componentes de transducción de señales involucrados en la ang'iogénesiJs .

Además, la expresión y/o condición de activación de, l'os receptores hormonales nucleares tales como ER (receptor de estrógeno) y PR (receptor de progesterona) , y otras proteínas tales como NCOR (corepresor de receptor nuclear), AI.B1 (amplificado en el cáncer de mama-1) , IGF-IR, cMET, Ki67, TOPO II pueden estudiarse en estas matrices dirigidas combinadas. Otra característica de estas matrices es la presencia de controles internos para determinar el tumor o el contenido de células asociadas al tumor (CEC's, CEP's, pericitos, etc.) y la IgG no especifica para determinar cualquier unión no especifica. '.

Ejemplo 8. Selección de Pacientes para el Tratamiento de Cáncer de Mama.

Un reto importante del tratamiento del cánqer í es la selección de regímenes terapéuticos que maximizan |la eficacia y minimizan la toxicidad para un pacien'te determinado. Un reto relacionado yace en el intento de proporcionar información exacta de diagnóstico, pronostico, y predictiva.

En la actualidad, los tumores se clasifican generalmente bajo el sistema tumor-nódulo-metástasis (TNM) . Éste sistema utiliza el tamaño del tumor, la presencia o ausencia del tumor en los nodulos linfáticos regionales, y la presencia o ausencia de la metástasis distante para asignar un estadio al tumor de acuerdo a las guías publicadas en el manual de estadificación del cáncer del Comité de la Sociedad Americana del Cáncer (AJCC= American Join Cometii on 'Canee' ¡r) (Lippincott, 5th ed., pp.171-180 (1997)). El estadio asignado es utilizado como una base para la selección de la terapia apropiada' y para fines pronósticos. Además de los parámetros TNM, el aspecto morfológico es utilizado además ira clasificar tumores en tipos de tumores y de ese modo1 ayudar en la selección de la terapia apropiada. Sin embargo, leste enfoque tiene serias limitaciones. Por ejemplo, los tumores con aspecto histopatológico similar pueden exhibir variabilidad significativa en términos del curso clínico; y la respuesta a la terapia. Además, 'algunos tumores , son rápidamente progresivos mientras que otros no. ' Por .otra parte, algunos tumores responden rápidamente a la te±apia hormonal o la quimioterapia mientras que otros ' son resistentes.

Los análisis para los marcadores de superficie celular, por ejemplo, que utilizan inmunohistoquímica, 1 han proporcionado medios para clasificar ciertos tipos de tumores en subclases. Por ejemplo, un factor considerado .en el pronóstico y las decisiones del tratamiento para el cáncer de mama es la presencia o la ausencia del receptor de estrógeno (ER) en muestras de tumores. Los cánceres de mama: ER-positivos responden típicamente mucho más rápido a1 las terapias hormonales tales como el tamoxifeno, que actúa como un anti-estrógeno en el tejido mamario, que los tumores ER-negativos. Aunque útiles, estos, análisis solamente predicen en parte el comportamiento clínico de los tumores de mama. Hay diversidad fenotípica presente en los cánceres que las herramientas diagnósticas actuales fallan al detectar. Como una consecuencia, todavía hay mucha controversia sobre la forma de estatificar a los pacientes entre los posibles tratamientos a fin de optimizar el resultado (por ejemplo, para el cáncer de mama, véase "NIH Consensus Development Conference, Statement: Adjuvant Therapy for Breast CancJr , Nov. 1-3, 2000", J. Nat-. Cáncer Inst. Monographs , 30:5-15 (2001) ; y Di Leo et al., Int. J. Clin. Oncol ., 7 : 245-253 (2002) ) .

La presente invención engloba la idea de que l'as vías de señalización pueden utilizarse para proporcionar nuevos entendimientos en la etiología biológica del cáncer la progresión de la enfermedad. La presente invención además proporciona métodos para el tratamiento de cánceres con varias vías de señalización activadas que utilizan un régimen terapéutico personalizado.

Tres marcadores moleculares diferentes sjon utilizados' actualmente para definir cuatro subclases diferentes del cáncer de mama con implicaciones terapéuticas importantes. Los tres marcadores son ER, PR, y HER-2/ErbB2. Las cuatro subclases importantes son como sigue: j · expresión es solamente un pronóstico débil. ER no actúa solo para estimular el crecimiento del tumor; sino, que una red de interacción compleja opera para asegurar la viabilidad dé las células cancerosas. La comprensión de esta red proporciona fundamentos científicos para la selección de las terapias dirigidas .

Los perfiles de los pacientes ejemplares mostrados en las Tablas 4-22 ilustran como un análisis dé las vías activan en las células tumorales circulantes (CTCs) de la sangre o de las células cancerosas obtenidas de: una biopsia con aguja gruesa pueden ser utilizadas para ayudar los médicos a decidir sobre un curso eficaz del tratamiento para un tumor de mama, por ejemplo, el tratamiento I neoadyuvante antes de la cirugía para reducir el tamaño del tumor de mama o el tratamiento en pacientes con cáncer de mama' localmente recurrente o metastásico. En resumen,; los niveles de activación de los componentes diferentes del ; ErbB y las vías del receptor hormonal nuclear en CTCs' o las células cancerosas derivadas de la ' biopsia pueden determinarse en la presencia o la ausencia de ljas combinaciones diferentes de los agentes terapéuticos |de prueba.

Tabla 4 Paciente 4001: (ER+/PR+/ErbB2-) i La paciente (mujer premenopáusica y nodo negativo) se sometió a biopsia o CTCs se aislaron de sangré. El análisis de sus células de tumor revelos alta expresión activación de ER/PR. La paciente fue tratada con tamoxifen. La paciente respondió y con re-biopsia tuvo el perfil Le proteínas como se mostró anteriormente. De esta manera, una paciente con el perfil de proteínas anteriores responde tamoxifen. ER se considera que recluta la' protieíha corepresor ' NCOR en la presencia de antagonistas tales como tamoxifen, y este reclutamiento se considera que es esencial para completa actividad antagonista.

Tabla 5 Paciente 4002: (ER+/PR-/ErbB2-) Receptor ExpreActivación Tratamiento sión (Nivel de con Tamoxifen Fosforila+ ción) Quimioterapi a ER Alto 'Medio ER (Ser 118) ¦Alto Débil ER (Ser 167) Alto Débil Complejo Medio Débil ER: AIB1 La paciente (mujer premenopáusica y nodo negativo) se sometió a biopsia o CTCs se aislaron de la sangre. El análisis de sus células de tumor reveló alta expresión y activación de ER y alta expresión Ki67. La paciente fue I tratada con tamoxifen + quimioterapia. La paciente respondió ! y con re-biopsia tuvo el perfil de proteínas como se mostró anteriormente. De esta manera, una paciente con el perfil de proteínas anterior responde a tamoxifen + quimioterapia. |ER se considera que recluta la proteína co-represora NCOR en lia presencia de antagonistas tales como tamoxifen, y es:te í reclutamiento se considera que es esencial para actividad antagonista completa.

Tabla 6 Paciente 4003: (ER+/PR+/ErbB2-) La paciente (mujer premenopáusica y nodo positivjo) se sometió a biopsia o CTCs se aislaron de la sangre. jEl análisis de sus células de. tumor reveló alta expresión y activación de ER/PR. La paciente fue tratada con tamoxifen + quimioterapia. La paciente respondió y con re-biopsia y el perfil de proteínas como se mostró anteriormente. De esta manera, una paciente con el perfil de proteínás anterijor responde a tamoxifen + quimioterapia. ER se considera q|ue recluta la proteína coreprespra NCOR en la presencia jde antagonistas tales como tamoxifen, y este reclutamiento se considera esencial para actividad antagonista completa. . ; Tabla Paciente 4004: (ER+/PR+/ErbB2-) paciente (mujer pre- o post-menopáusica) se sometió a biopsia o CTCs se aislaron de la sangre. Análisis de las células de tumor reveló alta expresión y activación de ER/PR junto con algo de activación de ErbBl por iMISS (activación ER en citoplasma con activación de comunicación o transducción de ErbBl). La paciente fue tratada cbn inhibidor de aromatasa para desactivar toda actividad relacionada a ER. La paciente respondió y con re-bióps¡ía tuvo el perfil de proteínas como se mostrado anteriormente De esta manera, una paciente con el perfil de' proteínas anterior responde a inhibidores de aromatasa.

Tabla 8 Paciente 4005: (ER+/PR+/ErbB2-) ER (Ser Alto Débil ' 118)' ER (Ser Alto Débil 167) Complej o Medio Débil ER : AIB1 Complej o Débil Medio ER:N-CoR Receptor de Alto Medio Proges-terona IGF-1R Baj a Débil Débil ErbBl Baj a Medio Débil ErbB2 Baj a Débil Débil ! ErbB3 Baj a Débil Débil ¡ ErbB4 Baj a Débil Débil Shc. Débil Débil PI3K Débil Débil Erk Medio Débil Rsk Medio Débil Akt Medio Débil P70S6K Medio Débil Ki67 Alto Débil' . ! TOPO II Alto La paciente (mujer pre- o post-menopáusica) se sometió a biopsia o CTCs se aislaron de sangre. Análisis !de the células de tumor reveló alta expresión y activación Le ER/PR junto con cierta activación de ErbBl por MIBS (activación ER en citoplasma con activación de comunicación resultante de ErbBl) . La paciente fue tratada con inhibidor de aromatasa + quimioterapia para desactivar toda Ha actividad relacionada a ER. La paciente respondió y con re- biopsia tuvo el perfil de proteínas como se mostró anteriormente. De esta manera, uná paciente con el perfil de ' proteínas anterior responde a inhibidor de aromatasa + quimioterapia.

Tabla 9 Paciente 4006: (ER+/PR-/ErbB2-) Receptor Expresión Activación Tratamiento (Nivel de con Inhibid or Fosforide aromatasa lación) o Tamoxifen + Quimioterap La ER Alto Medio ER (Ser 118) Alto Débil ER (Ser 167) Alto Débil Complej o Medio Débil ER : AIB1 sometió a biopsia o CTCs se aislaron de la sangre. Análisis de las células de tumor reveló alta expresión y activación de ER (tumores negativos PR) junto con cierta activación de ErbBl por MISS (activación ER en citoplasma con activación de comunicación o traducción resultante de ErbBl) . La paciente fue tratada con un inhibidor de aromatasa + quimioterapia para desactivas toda actividad relacionada a ER. La pacienjte respondió y con re-biopsia tuvo el perfil de proteínas que' se mostró anteriormente. De esta manera, una paciente con el perfil de proteínas anterior responde a inhibidor' de aromatasa + quimioterapia. ¡ La Tabla 10 proporciona un ejemplo de una paciente con cáncer de mama metastático o localmente recurrente; que tuvo relapsos en terapia endocrina y/o quimioterapia. ' ?1 menos 3 semanas transcurrieron desde que ' la ! paciente recibiera quimioterapia de adyuvante y terapia hormonal ¡para i cáncer . de mama metastático o recurrente .local . : j Tabla 10 | Paciente 4007: (ER+/PR+/ErbB2-) ! Receptor Expresión Activación Tratamiento (Nivel de con j FosforiTamoxifen lación) Inhibidor de aromatasa + Taxano + Avastin® ER Alto Medio ER (Ser 118) Alto Débil ER (Ser 167) Alto Débil Complej o Medio Débil ER: AIB1 Células La paciente (mujer pre- o post-menopáusica) con cáncer de mama metastático o recurrente local se sometió biopsia o CTCs se aislaron de la sangre. Análisis de sus células de tumor y células endoteliales revela alta expresión y activación de ER/PR junto con cierta activación de ÉrbBl por MISS (activación ER en citoplasma con activación de comunicación resultante de ErbBl) asi como activación VEGFR2.

I La paciente se trató con un inhibidor de aromatasa j + quimioterapia + Avastin® para desactivar toda actividad relacionada a ER- y VEGFR2-. La paciente respondió y con re-' biopsia tuvo el perfil de proteínas que se mostró anteriormente. De esta manera, una paciente con el perfil de proteínas anterior responde a la combinación de inhibidor |de aromatasa + quimioterapia + Avastin®.

Tabla 11 Paciente 4008: (Alto AIB1; ER+/PR+/ErbB2-) Receptor Expresión Activación Tratamien ¿o (Nivel de con Fosforilación) Fulvestrant ER Alto Baja < ER (Ser 118) Alto Débil j ER (Ser 167) Alto Débil ¡ Complejo V. Alto Débil ! ER: AIB1 Complej o Débil Débil ! ER:N-CoR Receptor de Alto Baja Progesterona 1 IGF-1R 'Baj a Débil Débil ErbBl Baj a Débil Débil ErbB2 Baj a Débil Débil ErbB3 Baj a Débil Débil ErbB Baj a Débil Débil , Shc Débil Débil PI3K Débil Débil .

Erk Medio Débil · Rsk Medio Débil 1 Akt Medio Débil La paciente (mujer pre- o post-menopáusica) se sometió a biopsia o CTCs se aislaron de la sangre. Análisis de las células de tumor reveló alta expresión y activación de ER/PR junto con muy alta expresión del Complejo ER:AIB1.: La paciente fue tratada con fulvestrant (Faslodex®) para degradar ER. La paciente respondió y ante re-biopsia tuvo el perfil de proteínas como se mostró anteriormente. De eslta manera, una paciente con el perfil de proteínas responde | a fulvestrant.

Tabla .12 Paciente 4009: (ER+/PR-/ErbB2-) Receptor Expresión Activación Tratamiento con (Nivel dé Inhibidor j de Fosforiaromatasa | lación) + Quimioterapia ER Alto Medio ER (Ser 118! Alto Débil ER (Ser 167] Alto Débil ER : AIB1 Medio Débil Complej o La paciente (mujer pre- o post-menopáusica) se sometió a biopsia o CTCs se aislaron de la sangre. Análisis de sus células de tumor reveló alta expresión y activación de ER. PR se expreso a muy bajos niveles. La paciente fué tratada con un inhibidor de aromatasa + quimioterapia ta desactivar toda actividad relacionada a ER. La paciente respondió y con re-biopsia tuvo el perfil de proteínas que se mostró anteriormente. De esta manera, una paciente con el perfil de proteínas anterior responde a inhibidor de aromatasa + quimioterapia.

Tabla 13 i .

Paciente 4010: (ER+/PR-/ErbBl+) Receptor Expresión Activación Tratamienti 5 (+/-GF) con ?? + (Nivel de Lapatinib O FosforiErbitux® lación) ER Alto Medio ER (Ser 118) Alto Débil ER (Ser 167) Alto Débil Complej o Medio Débil1 i ER:AIB1 Comple o Débil Medio ER:N-CoR Receptor de Baj a Baja Progesterona IGF-1R Baja Débil Débil EroBl Medio Medio Débil ErbB2 Baj a Débil Débil .

.ErbB3 Baj a Débil Débil ErbB4 Baja Débil Débil Shc Medio Débil La paciente (mujer pre- o post-menopáusica) ¡se sometió a biopsia o CTCs se aislaron de la sangre. Análisis de sus células de tumor reveló alta expresión y activación jde ER. PR se expresó a muy bajos niveles. ErbBl se activo. El paciente fue tratada con un inhibidor de aromatasa lapatinib o Erbitux® para desactivar toda actividad relacionada a ER/ErbBl. La paciente respondió y con Je-biopsia tuvo el - perfil de proteínas que se mostró anteriormente. De esta manera, una paciente con él perfil de proteínas anterior responde a la combinación de un inhibidor de aromatasa + lapatinib o Erbitux®.

Tabla 14 Paciente 4011: (ER+/PR-/ErbBl+) Receptor Expresión Activación Tratamiento (+/-GF) con AI + (Nivel de Lapatinib o Fosforilación) Erbitux® ; ER Alto Medio ER (Ser 118) Alto Débil 1 : ER (Ser 167) Alto Débil ¦ i ER : AIB1 Complej o Medio Débil ER:N-CoR Complej o Débil ' Medio Progesterona Receptor Baja Baja. ; ; IGF-1R Baj a Débil Débil ErbBl Alto Alto Débil ErbB2 Baja Débil Débil ErbB3 Baj a Débil Débil ErbB Baj a Débil Débil Shc Alto Débil ' PI3K Débil Débil : Erk Alto Débil ,¡ Rsk Alto Débil Akt Débil Débil P70S6K Débil Débil Ki67. Alto Débil : 26] La paciente (mujer pre- o post-menopáusica) se sometió a biopsia o CTCs¦ se aislaron de la sangre. Análisis de the células de tumor reveló alta expresión y activación de ER. PR se expreso a muy bajos niveles. ErbBl se activo.! La paciente fue tratada con un inhibidor de aromatasa + lapatinib o Erbitux® para - desactivar toda actividad relacionada a ER/ErbBl. La paciente respondió y con re- biopsia tuvo el perfil de proteínas como se mue!st::a anteriormente. De esta manera, 'uná paciente con él perfil de ¦ proteínas anterior responde a la combinación de un inhibidor ¦ de aromatasa + lapatinib o Erbitux®. , i Tabla 15 Paciente 4012: (ER+/PR-/ErbBl+/ErbB2+) ER. PE activo . aromatasa y lapatinib para desactivar toda actividad relacionada a ER/ErbBl/ErbB2. La paciente respondió y i ante re-biopsia tuvo el perfil de proteínas ' como se mostró anteriormente. De esta manera, una paciente con el perfil | de proteínas anterior responde a inhibidor de aromatasa lapatinib .

Tabla 16 Paciente 4013: (ER+/PR-/ErbBl+/ErbB2+/ErbB3+) Receptor Expresión Activación (+/- Tratamiento GF) con (Nivel de AI + Fosforilación) Lapatinib ER Alto Medio ER (Ser 118) Alto Débil ER (Ser 167) Alto Débil Complejo Medio Débil ER: AIB1 Complejo ER : N- Débil Medio CoR Receptor de Baj a Baja Progesterona IGF-1R Baja Débil Débil ErbBl Medio Medio Débil ErbB2 Medio ' Medio Débil ErbB3 Baj a Medio Débil- ErbB4 Baj a Débil Débil Shc Medio Débil PI3K Medio Débil ¦ Erk . Medio Débil i paciente (mujer pre- ' o post-menopáusica) se sometió a biopsia o CTCs se aislaron de la sangre. Ánálisjis de las células de tumor reveló alta expresión y activación ¡de ER. PR se expresa a. muy bajos niveles. ErbBl, ErbB'2, ErbB3 se activaron. La paciente fue tratada con un' inhibidor de aromatasa + lapatinib para desactivar toda actividad relacionada a ER/ErbBl/ErbB2/ErbB3. La paciente respondió y ante re-biopsia tuvo el perfil de proteínas como se mostjró anteriormente. De esta manera, una paciente con el perfil de i proteínas anterior responde a terapia con un inhibidor de aromatasa + lapatinib.

La Tabla 17 proporciona un ejemplo de un pacíen|te con un cáncer de mama metastático o recurrente lo'calmente quien tuvo relapso con terapia anti-angiogénica . Al menos semanas transcurrieron desde que la paciente recibiera quimioterapia adyuvante y terapia hormonal para el cáncer de mama metastático o localmente recurrente. i Tabla 17 Paciente 4014: (ER+/PR-/ErbBl+/ErbB2+/ErbB3+) Receptor Expresión Activación (+/- Tratamiento GF) con AI + (Nivel de Lapatinib + Fosforilación) Ayastiii® ! i ' ER Alto Medio ER (Ser 118) Alto Débil .

ER (Ser 167) Altó Débil Comple o Medio Débil ' ER : AIB1 i ¦ ! Complej o Débil Medio i ER:N-CoR Receptor . de Baj a Baj a ; Progesterona IGF-1R Baj a Débil Débil ; ErbBl Medio Medio Débil ErbB2 Medio Medio Débil ! ErbB3 Baj a Medio Débil ; ErbB4 Baj a Débil Débil ; Shc Medio Débil, i PI3K Medio Débil ; Erk Medio Débil Rsk Medio Débil , Akt Medio Débil P70S6K Medio Débil KÍ67 Alto Débil \ 1 a pac en e mu er pre- o pos -menop us ca cpn cáncer de mama metastático o recurrente local se sometió a biopsia o CTCs se aislaron de la sangre. Análisis de the células de tumor y células endoteliales reveló alta expresión y activación de ER junto con activación de VEGFR2. PR se expresó a muy bajos niveles. ErbBl, ErbB2, y ErbB3 Le activo. La paciente fue tratada con un inhibidor jde aromatasa + lapatinib + Avastin® para desactivar toda actividad relacionada a ER + ErbBl, ErbB2, ErbB3 y VEGFR2.

La paciente respondió y con re-biopsia tuvo el perfil de proteínas que se mostró anteriormente. De esta manera, una paciente con el perfil de proteínas anterior responde a La •combinación de un inhibidor de aromatasa + lapatinib Avastin®.

Tabla 18 Paciente 4015: (ER+/PR-/ErbB2-/lGF-lR+) La paciente (mujer pre- o post-menopáusi'ca), se sometió a biopsia o CTCs se aislaron de la sangre. Análisis de células de tumor reveló alta expresión y activación de E . PR se expresa a muy bajos niveles. IGF-1R se activó. ' La paciente fue tratada con un inhibidor de aromatasa + ánti- IGF-1R anticuerpos para desactivar toda actividad relacionaLa i a ER/IGF-1R. La paciente respondió y ante re-biopsia tuvo jel perfil de proteínas como se mostró anteriormente.' De esta manera, una paciente con el perfil de proteínas anterior responde a inhibidor de aromatasa + anticuerpos anti-IGF-lRl Tabla 19 ' Paciente 4016: (ER+/PR+/ErbB2+) Células éndoteliales : La paciente (mujer pre- o post-menopáusica ) con cáncer' de mama metastático o recurrente local se sometió a biopsia o CTCs se aislaron de la sangre. Análisis de las células de tumor y células endoteliales reveló alta expresión ¡ y activación de ER, PR, y ErbB2 junto con activación VEGFR2. La paciente fue tratada con un inhibidor de aromatasa Herceptin® + Avastin® para desactivar toda actividad relacionada a ER, ErbB2, y VEGFR2. La paciente respondió ante re-biopsia tuvo el perfil de proteínas que se . mostró anteriormente. De esta manera, una paciente con el perfil de proteínas anterior responde a terapia de combinación con un inhibidor de aromatasa + Herceptin® + Avastin®. ¡ Tabla 20 Paciente 4017: (ER+/PR+/ErbB2+) La pacienté (mujer pre- o post-menopáusica ) con cáncer de mama metastático o recurrente local se sometió a biopsia o CTCs se aislaron de la sangre. Análisis de las células de tumor y células endoteliales reveló alta expresión y activación de ERr ErbB2, y p95ErbB2, en conjunto c¡on activación VEGFR2. La paciente fue tratada con un inhibidor de aromatasa + lapatinib + Avastin® para desactivar 'toda actividad relacionada ER, ErbBl, ErbB2, ErbB3, p95ErbB2, y VEGFR2. La paciente respondió y ante re-biopsia tuvo leí perfil de proteínas como se mostró anteriormente. De esta manera, una paciente con el perfil de proteínas anterior responde a terapia de combinación con un inhibidor de aromatasa + lapatinib + Avastin®.

Tabla 21 Paciente 4018: (ER+/PR-/ErbB2+) Receptor Expresión Activación Tratamiento (+/-GF) con AI + (Nivel de Hereeptin® + FosfoTaxanos + rilación) Avastin® ER Alto Medio ER (Ser 118) Alto Débil ER (Ser 167) Alto. Débil Complejo Medio Débil ; ER: AIB1 Comple o Débil Medio ER:N-CoR Receptor de Baj a Baja Progesterona IGF-1R Baja. Débil Débil ErbBl Medio Débil Débil , ErbB2 Alto Alto ¦ ' Débil P95 ErbB2 Baja Baja Baja ErbB3 Baj a Débil Débil ErbB4 Baj a Débil Débil I Shc Medio Débil PI3K Medio Débil 1 Erk Medio Débil Rsk Medio Débil Células endotelxales : La -paciente (mujer pre- o post-menopáusica) qon cáncer de mama, metastático o recurrente local se sometió a biopsia o CTCs se aislaron de la sangre. Análisis de las células de tumor y células endoteliales reveló alta, expresión y activación de ER y ErbB2, en conjunto con activación VEGFR2. Los niveles de PR fueron bajosi. La paciente fue tratada con un inhibidor de aromatasa + Herceptin® + taxanbs + Avastin® para .desactivar toda actividad relacionada de ?. , ErbB2, y VEGFR2. La paciente respondió y ante re-biopsia tuvo el perfil de proteínas como se mostró anteriormente. De esta manera, una paciente con el perfil de proteínas anteripr responde a la combinación de un inhibidor de aromatasa Herceptin® + Avastin® + quimioterapia.

Tabla 22 Paciente 4019: (ER+/PR-/ErbB2+) / Células endoteliales: Receptor Expresión - Activación Activación (Nivel de con Avastii 1® Fosforilación) VEGFR2 Medio Fuerte Débil VEGFR1 Medio Fuerte Débil Tie 2 Baj a Débil Débil complejo V- Nulo Medio Débil Cadherin-R2 La paciente (mujer pre- o post-menopáusica ) ¡ qon cáncer de mama metastático o recurrente localmente, se sometió a biopsia o CTCs se aislaron de la sangre. Análisis de las células de tumor y células endoteliales reveló alta expresión y activación de ER, ErbB2, y p95ErbB2, junto cjon activación VEGFR2. Nivel PR nivel fue bajo. La paciente fue tratada con un inhibidor de aromatasa ·+ lapatinib .+ Avastin® + quimioterapia para desactivar toda actividad relacionada de ER, ErbBl, ErbB2, ErbB3, p95ErbB2, y VEGFR2. El paciente respondió y ante re-biopsia tuvo el perfil de proteínas coLo se mostró anteriormente. De esta manera, una- paciente con jel perfil de proteínas anterior responde a terapia combinacijón con un inhibidor de aromatasa + lapatinib + Avastin' quimioterapia.

De acuerdo con esto, en ciertos aspectos, la presente invención permite la selección inteligente |de marcadores de activación que pronosticarán mejor |la supervivencia. Los marcadores de activación más apropiados pueden variar entre diferentes drogas, o fármacos, y pueden emplearse como una guia para seleccionar entre monoterapia cié fármacos anti-cáncer contra terapia de combinación, con un cóctel de fármacos anti-cáncer para proporcionar terapias dirigidas, personalizadas.

Ejemplo 9. Selección de Pacientes para Tratamiento de Cáncjer de Mama Her2-Positivo .

En los E.U.A, hay aproximadamente 200,000 i casos de cáncer de mama cada año. HER-2/ErbB2, un receptor de tirosina quinasa de membrana de 185 kDa, se encuentra en 18% a 20% de cánceres de mama y se ha asociado con: una proporción incrementada de relapso y muerte. ErbB2 ahora es un marcador predictivo establecido de beneficio dé terapijas tales como trastuzumab (Herceptin®) .

Durante la última década, el avance mayor en ¡el tratamiento de cáncer de mama ErbB2+ se logró. Herceptin® iha cambiado la historia natural de la enfermedad en los entorri Ios metastásicos y adyuvantes. Lapatinib, ahora comercialmente disponible como Tykerb® (GlaxoSmithKline) , es una adicijón importante y el primero de lo que probablemente serán muchos agentes que estarán ' disponibles en el entorno pos;t Herceptin®.

Desafortunadamente, la resistencia a Herceptin® |se desarrolla en muchos casos, y casi en todos los casos en ¡el entorno metastásico. Tanto resistencia de novo como adquirida a Herceptin® también se ha observado.

Modos posibles de resistencia a Herceptin® son: • Expresión dirigida alterada (cambio en estado ErbB2) • Señalización por rutas- alternas (IGF-1R) , • Dimerización preferencial con otros receptores (ErbBl o ErbB3) Suministro de fármaco - sub-óptimo (enfermedad metastásica de CNS entre mujeres con cáncer de mama ErbB2 parece ser particularmente común. La incidencia de¡ La enfermedad metastásica de CNS en pacientes con cáncer de ;ma:na metastásico ErbB2+ puede ser tan alta como un tercio de pacientes con enfermedad metastásica ErbB2+) .

Alteración de PTEN.

• Mutaciones PI3K.

Expresión P95ErbB2 o truncado ErbB2.

• Sobreexpresión o amplificación de cMET Marcadores para selección/eficacia de terapia: • 5-FU/capcitibina : Expresión de timidilajto sintetasa (TS) .

Expresión de dihidropirimidina dehidrogenasa ( DPD] • Disminución de HDACs en expresión TS .

Taxanos: ErbB2 Antraciclinas': Sobreexpresión de TOP02.

• ErbB2 Positivo: (5-FU o taxanos o antraciclinas) Múltiples regímenes de quimioterapia se han probado en combinación con Herceptin®. La combinación preferida es tratamiento con paclitaxel, docetaxel, un taxano más una sal de platino, en el entorno metastásico. Todas las terapias dirigidas también pueden emplearse en combinación. ; Los perfiles ejemplares de pacientes mostrados continuación en las Tablas 23-25, ilustran como un análisis de rutas activas en células de tumor en circulación (CTCs) de sangre o células de cáncer obtenidas de una biopsia, pueden emplearse para ayudar a los médicos en seleccionar pacientes que puedan responder a trastuzumab (Herceptin®) y por lo tanto beneficiarse de esta terapia para el tratamiento de un tumor de .mama. Los perfiles de paciente ejemplares mostrados a continuación en las Tablas 26-31 ilustran como un análisis de las rutas activas en CTCs de células de sangre o de cáncer obtenidas de una biopsia, pueden emplearse para ayudar a los I médicos en seleccionar una terapia conveniente por pacientes después de relapso de Herceptin® que resulta ya sea de resistencia de. novo o adquirida. En breve, los niveles de activación de diferentes · componentes de las rutas de transducción de señal tales como rutas de receptor ErbB en CTCs o células de cáncer derivadas de biopsia,. pueden determinarse · en la presencia o ausencia de diferentes combinaciones de agentes terapéuticos de prueba.

Tabla 23 Paciente 5001: (ErbB2+) Células Endoteliales L - . cáncer de mama metastásico o recurrente local se sometió a biopsia o CTCs se aislaron de la* sangre. Análisis de, sus células de tumor y células endoteliales revela alta expresión y activación de ErbB2, junto con activación de VEGFR2;. La paciente fue tratada con Herceptin® + taxano + Avastin® ¡ para desactivar toda actividad relacionada a ErbB2 y- VEGFR2' La paciente respondió y al someter a re-biopsia tuvo el perfil con el perfil de proteínas anterior responde a i® + Avastin® + quimioterapia. ! Tabla 24 5002: (ErbB2+) Receptor Expresión Activación Tratamiento c on (+/-GF) Herceptin® + (Nivel de Avastin® Fosfori+ FE C: lación) [flúorouracilo , epirubicina (antraciclina) , y ciclofosfamida] IGF-1R Baj o Débil Débil ErbBl Medio Débil Débil ErbB2 Alto ¦ Alto Débil P95 ErbB2 Bajo Débil Débil ErbB3 Baj o Medio Débil ErbB4 Baj o Débil Débil Shc Medio Débil PI3K Medio Débil ; Erk Medio Débil Rsk Medio Débil La paciente (mujer pre- o postmenopáusica) con - cáncer de mama metastásico o recurrente local se sometió a biopsia o CTCs se aislaron de la sangre. Análisis de sus i células de tumor y células endoteliales reveló alta expresión y activación de ErbB2 y T0P02, junto ' con activación de VEGFR2. La paciente fue tratada con Herceptin® + antraciclina + quimioterapia + Avastin® para desactivar toda actividad relacionada a ErbB2, VEGFR2, y TÓP02. La paciente respondió| y ante re-biopsia tuvo el perfil de proteínas que se mostró anteriormente. De esta manera, una paciente con el perfil Le proteínas anterior responde a terapia de combinación cjon Herceptin® + antraciclina + quimioterapia + Avastin®.

Tabla 25 Paciente 5003: (ErbB2+) Receptor Expresión Activación Tratamiento (+/-GF) con (Nivel de Herceptin® I Fosforilación) Sora inib Sunitinib AZD21 1 + Taxanos (Opcional) j IGF-1R Baj o Débil Débil ErbBl Medio Débil Débil ErbB2 Alto Alto Débil P95 ErbB2 Bajo Débil Débil Células Receptor Expresión Activaci Activación Activación ón con con (Nivel AZD2171 Avastin4 de o Sorafi- Fosforil nib o ación) Sunitinib VEGFR2 Medio Fuerte Débil Débil VEGFR1 Medio Fuerte Débil Medio Tie 2 Baj o Débil Débil Débil Complejo V-Cadheri na-R2 Nulo Medio Débil Débil PDGFRa Medio Alto Débil Alto La paciente (mujer pre- o postmenopáusica ) : con í cáncer de mama metastásico o .recurrente local se s.omete a biopsia o CTCs se aislan de la sangre. Análisis de sus células de tumor y células endoteliales revela alta expresión y activación de ErbB2 y PDGFR, junto con activación jde VEGFR2. La paciente fue tratada con Herceptin® + sorafinibj + Avastin® para desactivar toda actividad relacionada a ErbE;2, PDGFR, y VEGFR2.' Debido a que PDGFR se sobreexpresa y activa en pacientes resistentes a Avastin®, información- tal icomo la presentada anteriormente indica que AZD2171 o sorafinib, que inhibe PDGFR asi como VEGFR, pueden ser agentes de selección para tratar estos" tumores. La paciente respondió y ante re-biopsia tuvo el perfil de proteínas que se mostlró anteriormente. De esta manera, una paciente con el perfil de proteínas anterior responde a Herceptin® + sorafinib quimioterapia.

Paciente 5004: (ErbB2+) Células Endoteliales y Perici os : La paciente · (mujer pre- o postmenopáusica) con cáncer de mama metastásico o recurrente local se sometió a biopsia o CTCs se aislaron de la sangre. Análisis de sus células de tumor y células endoteliales revela alta expresión y activación de ErbBl, ErbB2, y PDGFR, junto con activación VEGFR2*. La paciente fue tratada con lapatinib + sorafinib para desactivar toda actividad relacionada a ErbBl, ErbB2, PDGFR, y VEGFR2. Debido a que ErbBl y PDGFR se sobreexpresan y activan en pacientes resistentes a Herceptin® y Avastirí®, información tal como la presentada anteriormente indica que AZD2171 o sorafinib, que inhibe PDGFR asi 'como VEGFR, pueden ser agentes de selección para tratar estos tumores. Lapatinib se emplea en lugar de Herceptin® ya que lapatinib inhibe tanto a ErbBl como a ErbB2. La paciente respondió y ante rje-biopsia tuvo el perfil de proteínas que se mostró anteriormente. De esta manera, uña paciente con el perfil jde proteínas anterior responde a lapatinib + sorafinib quimioterapia.

Tabla 27 Paciente 5005: (ErbB2+) Células Endoteliales y Pericitos Receptor ExpreActivación Activación Activación sión (Nivel de con con FosforiAZD2171 Avastin® lación) Sorafinib o Sunitinib VEGFR2 Medio Fuerte Débil Débil VEGFR1 Medio Fuerte Débil Medio Tie 2 Baj o Débil Débil Débil Complej o V-Cadhe- rina-R2 Nulo Medio Débil Débil PDGFRa Medio · Alto Débil Alto 1 PDGFRb Medio Alto Débil Alto 1 Shc Fuerte Débil Débil ! PI3K Fuerte Débil Débil Erk Fuerte Débil Débil Rsk Fuerte Débil Débil Akt Fuerte Débil Débil P70S6K Fuerte Débil Débil la paciente (mujer pre- o postmenopáusica ) don cáncer de mama metastásico o recurrente local se sometiój a biopsia o CTCs se aislaron de la sangre. Análisis de sus células de tumor y células endoteliales revela alta expresión y activación de IGF-1R, ErbB2, y PDGFR, junto con activación VEGFR2. La paciente fue tratada con Herceptin® + s.orafinib + Avastin® + anticuerpo IGF-1R (Ab) para desactivar toda -la actividad relacionada a IGF-1R, ErbB2, PDGFR, y VEGFR2. Debido a que IGF-1R y PDGFR se sobreexpresan y activan Ln pacientes resistentes a Herceptin® y Avastin®, información tal como la presentada anteriormente indica , que AZD2171 o sorafinib, que inhibe PDGFR asi como. VEGFR, pueden ser agentes de selección para tratar estos tumores. IGF-1R Ab junto con Herceptin® se emplea en lugar de Herceptin® ; sólo para inhibir tanto IGF-1R como ErbB2. La paciente respondió y ante re-biopsia tuvo el perfil de proteínas mostrado anteriormente. De esta manera, una paciente con el perfil de proteínas anterior responde a Herceptin® + IGF—IR Ab + sorafinib + quimioterapia.

Tabla 28 paciente 5006: (ErbB2+/PTEN deletion) Receptor Expresión . Activación Tratamientí> (+/-GF) con (Nivel de Lapatinib + Fosforilación) Taxanos + Sorafinib o Sunitinib o AZD2171 + Rapamicina IGF-1R Baj o Bajo Débil ErbBl Medio Medio Medio ErbB2 Alto Alto Débil P95 ErbB2 Medio Alto Débil ErbB3 Baj o Medio. Medio ErbB4 Baj o Débil Débil PTEN Bajo Bajo Bajo Shc Medio Débil PI3K Medio Medio Erk Medio Débil Rsk Medio Débil Akt Medio Alto P70S6K Medio Débil Ki67 Alto Débil TOP02 Ba o Débil ; Células Endoteliales y Perici os : Receptor ExpreActivación Activación Activasión (Nivel de con ción cion FosforiAZD2171 o Avastii 1® lación) Sorafinib o Sunitinib VEGFR2 Medio Fuerte Débil Débil VEGFR1 Medio Fuerte Débil ! Medio Tie 2 Baj o Débil Débil Débil Complej o V- Cadherina- R2 Nulo Medio Débil Débil PDGFRa Medio Alto Débil Alto PDGFRb Medio Alto Débil Alto Shc Fuerte Débil Débil PI3K Fuerte Débil Débil Erk Fuerte Débil Débil Rsk Fuerte Débil • Débil Akt Fuerte Débil Débil P70S6K Fuerte Débil Débil La paciente (mujer pre- o postmenopáusica) con Células Endoteliales y Pericitos y activación de p95 ErbB2, ErbB2, y PDGFR, junto c'on activación VEGFR2. La paciente fue tratada con lapatinib sorafinib para desactivar toda actividad relacionada a ErbB¡2, PDGFR, y VEGFR2. Debido a que p95 ErbB2 y PDGFR se sobreexpresan y activan en pacientes¦ resistentes a Herceptin Avastin , información tal como la presentada anteriormen1te indica que AZD2171 o sorafinib, que inhiben PDGFR asi como VEGFR, pueden ser agentes de selección para tratar esvos tumores. Lapatinib se emplea en lugar de Herceptin® para inhibir tanto p95 ErbB2 como ErbB2. La paciente responde y ante re-biopsia tuvo el perfil de proteínas mostra¡do anteriormente. De esta manera, una paciente con el perfil de proteínas anterior responde a la combinación de lapatinib + sorafinib + quimioterapia.

Tabla 30 Paciente 5008: (ErbB2+) Receptor Expresión Activación Tratamiento con (+/-GF) Lapatinib + (Nivel de Taxanos + Fosforilación) Sorafinib o Sunitinib o ÁZD2171 IGF-1R Baj o Baj o Débil ErbBl Medio Medio Débil ErbB2 Alto Alto Débil Células Endoteliales y Pericitos Receptor ExpreActivación Activación Activaci Sn sión (Nivel de con con FosforiAZD2171 o Avastin® lación) Sorafinib o Sunitinib VEGFR2 Medio Fuerte Débil Débil \ VEGFR1 Medio Fuerte Débil Medio Tie 2 Baj o Débil Débil Débil se emplea en lugar de Herceptin ya que la paciente tuvo I metástasis en cerebro. La paciente respondió y ante rje-biopsia tuvo el perfil de proteínas que se most'ró anteriormente. De esta manera, una paciente con el perfil ¡de proteínas anterior responde a lapatinib + sorafinib quimioterapia .

Tabla 31 Paciente 5009: (ErbB2+) i Células Endoteliales y Pericitos : Receptor ExpreActivación Activación Activaci n " i sión (Nivel de con con FosforiAZD2171 o Ávast n® 1 lación) Sorafinib 1 o Sunitinib .VEGFR2 . Medio Fuerte Débil Débil ; VEGFR1 Medio Fuerte Débil Débil ' Tie 2 Baj o Débil Débil Débil : Comple o V- Cadherina- R2 Nulo Medio Débil Débil , PDGFRa' Medio Baj o Débil Débil PDGFRb Medio Bajo Débil Débil ; Shc Fuerte Débil Débil , PI3K Fuerte Débil' Débil 1 La paciente (mujer pre- o postmenopáusica) con cáncer de mama metastásico o recurrente local, se somete biop'sia o CTCs se aislan de la sangre. Análisis de s'us células de tumor y células endoteliales revela alta expresión y activación de ErbBl, ErbB2, ErbB3, y PDGFR, junto con activación de VEGFR2. La paciente fue tratada con Herceptin® + lapatinib + sorafinib para desactivar toda actividad relacionada a ErbBl, ErbB2, ErbB3, PDGFR, y VEGFR2. Debido a que ErbBl y PDGFR se sobreexpresan y activan en pacientes resistentes a Herceptin® y Avastin®, información tal como la presentada anteriormente indica que AZD2171 o sorafinib, que inhiben PDGFR asi como VEGFR, pueden ser agentes de seleccijón para tratar estos tumores. Lapatinib se empleó con Herceptin® para inhibir tanto ErbBl, ErbB2, como ErbB3. La paciente responde y ante re-biopsia tuvo el perfil de proteínas mostrado anteriormente. De esta manera, una paciente con el perfil de proteínas anterior responde a la combinación de lapatinib + Herceptin® + sorafinib + quimioterapia.

Ejemplo 10. Selección de Pacientes para Tratar Cáncer de Mama ER- , PR- , y ErbB2-Negativo .

Aproximadamente 15-20% de las mujeres con cáncer de mama tienen el tipo triple negativo de cáncer. Pacientes con i "cáncer de mama negativo triple receptor" tienen una ausencia completa de receptores de hormona ER, ,PR, y HER-2/ErbB2, con un curso clínico agresivo y una insuficiencia de opciones de tratamiento. La única opción terapéutica es quimioterapia y en este aspecto la selección de agentes ¦ citostáticos , es limitada. El tratamiento estándar para cáncer de mama triple negativo típicamente es una combinación de quimioterapias, cirugía y/o terapia de radiación. Cuando se trata con terapjia estándar, mujeres con cáncer de mama triple negativo tienen un peor resultado a largo plazo en comparación con mujeres con cáncer de mama que no es triple negativo. Las células de cáncer de mama triple negativo usualmente tienen ErbBl expresado en su superficie celular. Mujeres con cáncer de mama ErbBl positivo tienen un resultado peor a largo plazo en comparación con mujeres con tumores que no expresan ErbB Como tal, hay necesidad en la técnica por métodos para perfilar, seleccionar y pronosticar opciones de tratamiento para pacientes de cáncer de mama triple negativo.

Tabla 32 Paciente 6001: (Triple negativo con bajo ErbBl) Células Endoteliales y Pericitos : 508 La paciente (mujer pre- o post-menopáusica) con cáncer de mama metastásico o localmente recurrente,, se sometió a biopsia o CTCs se aislaron de la sangre. Análisis de sus células de tumor y células endoteliales reveló baja expresión y sin activación de ER, ErbB2 y p95 ErbB2, con scjlo activación VEGFR2. La paciente se trató con Taxanós Avastin® para desactivar la actividad relacionada a VEGFR2 La paciente respondió y en re-biopsia tuvo el perfil de proteínas que se mostró anteriormente. De esta manera, una paciente con el perfil de proteínas anterior responde Avastin® + quimioterapia.

Tabla 33 Paciente 6002: (Triple negativo) Células Endotelxales y Pericitos Receptor ExpreActivación Activación Activ ci í>n sión (Nivel de con con FosforiAZD2171 o Avas in® lación) Sorafinib o Sunitinib VEGFR2 Medio Fuerte Débil Débil VEGFR1 Medio Fuerte Débil Débil ; Tie 2 Baj o Débil Débil Débil 1 Complej o V- Caderina- R2 Nulo Medio Débil Débil ! PDGFRa Medio Baj o Débil Débil PDGFRb Medio Baj o Débil Débil , La paciente (mujer pre- o post-menopáusica) con cáncer de mama metastásico o localmente recurrente, se sometió a biopsia o CTCs se aislaron de la sangre. Análisis de células de tumor y células endoteliales reveló; Expresión media y activación de ErbBl y activación de VEGFR2. La paciente se trató con Tarceva® + Avastin® para desactivar toda la actividad relacionada a ErbBl y VEGFR2. La paciente respondió y ante re-biopsia tuvo el perfil de proteínas que se mostró anteriormente. De esta manera, una paciente con el perfil de proteínas anteriores responde a Tarceva® + Avastin' + quimioterapia.

Tabla 34 Paciente 6003: (Triple negativo) Receptor ExpreActivación Activación Activasión (Nivel de con ción FosforiAZD2171 o con lación) Sorafinib Avastin1 o Sunitinib VEGFR2 Medio Fuerte Débil Débil VEGFR1 Medio Fuerte Débil Débil Tie 2 Baj o Débil Débil Débil Complej o V- Caderina- Nulo R2 Medio Débil Débil PDGFRa Medio Baj o Débil Débil PDGFRb Medio Baj o Débil Débil Shc Fuerte Débil Débil PI3K Fuerte Débil Débil Erk Fuerte Débil Débil Rsk Fuerte Débil Débil Akt Fuerte Débil Débil P70S6K Fuerte Débil Débil paciente (mujer pre- o post-menopáusicá) cáncer de mama metastásico o localmente recurrente,: se sometió a biopsia o CTCs se aislaron de la sangre. Análisis de sus células de tumor y células endoteliales reveló expresión de medio y activación de ErbBl, ErbB2 y ErbB3, junto con activación de VEGFR2.·¦ La paciente se trató con inhibidor Pan Her + Avastin® para desactivar toda la actividad relacionada 'a ErbBl, ErbB2, ErbB3 y VEGFR2. La paciente respondió y ante re-biopsia tuvo el perfil de proteínas que se mostró anteriormente. De esta manera, una paciente con el perfil de proteínas anterior responde a la combinación de un inhibidor Pan Her + Avastin® ¡ + quimioterapia. Ejemplos de inhibidores Pan Her incluyen pejro no están limitados a BMS-599626 y CI-1033.

Tabla 35 Paciente 6004: (Triple negativo) Células Endoteliales y Pericitos : Receptor Exprés- ActivaActivación Activaci bn sion ción con con (Nivel AZD2171 o Avastin® de Sorafinib Fosforio Sunitinib lación) VEGFR2 Medio Fuerte Débil Débil VEGFR1 Medio Fuerte Débil Débil Tie 2 Ba o Débil Débil Débil La paciente (mujer pre- o · post-menopáúsica) : con cáncer de mama' metastásico' o localmente recurrente, se sometió a biopsia o CTCs se aislaron de la sangre. Análisis de células de sus células de tumor y células endoteliales revela expresión de medio y activación de ErbBl, ErbB2 y ErbB3, junto con activación de VEGFR2. PTEN se eliminó. El paciente se trató con un inhibidor Pan Her + Avastin® + inhibidor mTOR, para desactivar toda actividad relacionada a ErbBl, ErbB2, ErbB3 y VEGFR2. La paciente respondió y ante re-biopsia tuvo el perfil de proteínas que se mostró anteriormente. De esta manera, una paciente con el perfil |de proteínas anterior responde a un inhibidor Pan Her + Avastin + rapamicina + quimioterapia.

E emplo 11. Supervisión de Pacientes de Cáncer de Mama para Activación de EGFR y/o HER-2 para Guiar la Selección de Tratamiento.

Cinco pacientes de cáncer de mama en terapia se examinaron para número de células de tumor en circulación (CTC) , expresión EGFR en CTCs por tinción, y fosforilación EGFR y HER-2 (ErbB2) .utilizando los ensayos de proximidad aquí descritos. Los datos demográficos de las pacientes, . historia de cáncer, y medicamentación actual se muestran en las Tablas 36, 37 y 38, respectivamente. Los resultados de las pruebas de tumor primario para receptor de · estrógeno' (ER) , receptor de progesterona (PR) , y HER-2, se proporcionan en la Tabla 39. Las Tablas 40 y 41 muestran los números de CTCs detectados en cada muestra y los niveles de fosforilación relativos para EGFR y HER-2. Niveles de fos orilación relativos se calcularon utilizando el promedio de 4 controles de amortiguador. La información de fosforilación también se traza en las Figuras 10 y 11. La Figura 12 muestra imágenes de tinción CTC para ÉGF,R, I citoqueratina (CK) , y citoqueratina con DAPI . Controles de linea celular fueron SKBr3 y A431, que son positivos para expresión HER-2 y EGFR, respectivamente. Sangre entera de! individuos normales se procesa utilizando el mismo protpccjlo como controles. Ninguna de las muestras normales mostlró fosforilación EGFR o HER-2 sobre el fondo.

Tabla 36 Demográficos de 5 pacientes de cáncer de mama el estudio .

Tabla 37 , j Historia de cáncer de las 5 pacientes, de cáncer de mama en el estudio. .

Tabla 38 Medicamentos actuales para 5 pacientes de cáncer de mama jen el estudio .. ¡ Número Nombre de Diagnóstico Dosis de Pa.- Droga asociado con el ciente tratamiento 01-003 BENADRYL PRE-QUIMIO MEDICA25 MG Q 28 MENTO DÍAS 01-003 DECADRON PRE-QUIMIO MEDICA20 MG Q 28 MENTO DÍAS 01-003 HERCEPTIN CÁNCER DE MAMA 8 MG Q 28 QUIMIO DÍAS 01-003 TAGAMET PRE-QUIMIO PARA 300 MG Q CÁNCER DE MAMA 28 DÍAS 01-003 TAXOTERE CÁNCER DE MAMA 40 MG Q 28 QUIMIO DÍA 01-003 TYLENOL DOLOR 1 GR Q 28 DÍAS 01-003 ZOFRAN PRE-QUIMIO PARA 32 MG Q 28 CÁNCER DE MAMA DÍAS 01-006 DECADRON PRE-MED PARA 20 MG Q 2 QUIMIO SEMANAS 01-006 GEMZAR QUIMIO PARA CÁNCER 1000 MG Q DE MAMA 2 SEMANAs 01-006 HERCEPTIN QUIMIO PARA CÁNCER 100 MG Q DE MAMA SEMANAS 01-006 KYTRIL PRE-MED PARA QUIMIO 1 MG' Q 2 SEMANAS 01-006 TYLENOL PRE MED 1 GRAM Q 2 SEMAN.¾S 01-014 CARBOPLATIN QUIMIO PARA CÁNCER 650 MG Q DE MAMA 21 DÍAS 01-014 DECADRON PRE-MED PARA QUIMIO 20 MG Q i 21· DÍAS 01-014 HERCEPTIN QUIMIO PARA CÁNCER 270 MG Q DE MAMA 21 DÍAS 01-014 ROCEPHIN ANTIBIÓTICO PARA 1000 : MG FIEBRE PRN 01-014 TAXOTERE QUIMIO PARA CÁNCER 100 MG Q DE MAMA 21 DÍAS 01-014 ZOFRAN PRE-MED PARA QUIMIO 32 MG Q 21 DÍAS 01-019 AREDIA ' QUIMIO PARA CÁNCER 90 MG Q DE MAMA 21 DÍAS 01-019 BENADRYL PRE-MED PARA QUIMIO 25 MG Q 21 DÍAS 01-019 CARBOPLATIN CHEMO PARA CÁNCER 580' MG Q DE MAMA 21 DÍAS Tabla 39 Resultados de pruebas de diagnóstico de ER, PR, y HER-2 para las 5 pacientes de cáncer de mama en el estudio.

Tabla 40 Números de CTCs (por 7.5 mi) y niveles de fosforilación EGFR relativo para 5 muestras de cáncer de mama y 6 normales.

Tabla 41 Números de CTCs (por 7.5 mi) y niveles .de fosforilación HER!-2 relativos para 5 muestras de cáncer de mama y 6 normales.

La paciente 01-019 probó positiva para ER negativa para sobre-expresión de PR y HER-2 en el tumor primario.' A esta paciente no se le dió Herceptin® y se trató con Taxotere® + carboplatina al tiempo de toma de sangre.

Cuatro CTCs se identificaron. Ninguna de estas células se tiñó en forma positiva para expresión de EGFR por el Sistema Veridex CellSearch . Después de estímulo de los CT.Cs aislados con ligando, no hubo fosforilación detectable ya sea de EGFR o HER-2 en los ensayos de proximidad. Estos datos informan al médico que las células de tumor de la paciente continúan no siendo dirigidas por las rutas EGFR/HER-2;, de manera tal que no hay razón por cambiar, la terapia actual.

No hubo prueba HER-2 reportada para la paciente 01-006, pero supuestamente fue HER-2 positiva ya que se le suministró terapia de Herceptin®. La paciente fue negativa tanto para ER y PR. La paciente 01-006 tuvo 1 CTC que' fue positivo para expresión EGFR por tinción. Hubo activación significante tanto de EGFR como HER-2 detectado. A pesar de la terapia que incluye Herceptin®, ni EGFR ni las rutas HER| 2 se desactivaron. La activación puede ser resultante de la formación de heterodímeros entre EFGR y HER-2, permitiendo evasión de inhibición Herceptin®. Estos datos informan al médico que la terapia requiere cambiarse. Terapias que incluyen agentes que hacen blanco tanto en EGFR como en HER-2, tales como lapatinib, Herceptin® +¦ ZACTIMA™, Herceptin11 Erbitux®, Herceptin® + Iressa®, o Herceptin® + Tarceva®, serán indicadas.

La paciente 02-017 prueba negativa para ER, PR sobre expresión de HER-2 en el tumor primario. La pacienjte previamente se trató con adriamicina + citoxen, pero al tiempo de toma de sangre no estaba con terapia de cáncer. La muestra contuvo 3 CTCs, todas las cuales ,tiñer¡,on positivamnente para, expresión de EGFR. Hubo activadion significante de ambos EGFR como HER-2 detectados en los ensayos de proximidad. Aunque el tumor primario de j esta paciente fue negativa para sobre-expresión HER-2, las rutas EGFR/HER-2 fueron activas. Tratamiento con Herceptin®, ya sea solo o en combinación con quimioterapia o quimioterapia sola no hubiera sido una terapia adecuada para esta paciénte . Estos datos informan al médico que la terapia que incluye agentes que hacen blanco o diana tanto en EGFR como HÉR-2, tales, como lapatinib, Herceptin® + ZACTIMA™, Herceptin® + Erbitux®, Herceptin® + Iressa®, o Herceptin® + Tarceva®,; s(on indicados. : Los tumores primarios de las pacientes 01^003 y Ojl- 014 se reportaron en las historias de las pacientes ; como positivos para sobre-expresión de HER-2. Ambas pacientes fueron negativas para ER y PR. La paciente 01-003: que se estaba tratando con Herceptin® y Taxotere®, y la pacienté 01- 014 se trató con Herceptin®, carboplatina y Taxotere®. ; La paciente 01-003 tuvo 1 CTC que fue negativo para expresión de ' EGFR por tinción. No hubo fosforilación ya sea de EGFR o HER-2 detectada. Estos datos informan al médico que la , ruta dirigida por HER-2 - detectada originalmente en el tumor primario no es más activa. Dado que el porcentaje de tumor primario que tiñe actualmente con anticuerpo HER-2 en |un [continúa) Paciente CTC EGFR pEGFR pHER-2 Terapia ¡ # indicada j (quimioterapj puede agregarse combinación 01-019 Negativo Negativo Negativo terapia hormonal 01-006 Positivo Positivo Positivo lapatinib Herceptin1 ZACTIMA™, Herceptin' Erbitux®, Herceptin Iressa , Herceptin Tarceva® de enlace de ligando, extracelular; una corta región de transmembrana hidrofóbica; y un dominio crtoplásmico de tirosina quinasa. Hetero- u homodimerización de receptores HER, inducidos por enlace de ligando o sobre-expresión de receptor, lleva a la activación del. receptor quinasa y a la subsecuente fosforilación · de varios residuos tirosina. A su vez, estos residuos de tirosina . fosforilados , situados dentro del extremo carboxilo de los receptores, reclutan moléculas mediadoras y activan rutas de señalización lo que lleva a la modificación de crecimiento celular, diferenciación y supervivencia. ErbB2 se sobre-expresa/amplifica en aproximadamente' 15% a 25% de los cánceres de mama humanos, y su sobre-expresión/amplificación se asocial con un fenotipo agresivo .

Trastuzumab (Herceptin®) , un anticuerpo monoclorial humanizado recombinante que liga con alta afinidad al dominjio i extracelular de ErbB2, proporciona beneficios clínicos substanciales en pacientes con. sobre-expresión de ErbB2 ] o cáncer de mama avanzado amplificado por gen ErbB2 y me ora'da supervivencia cuando se combina con quimioterapia. Además, Herceptin® recientemente se ha mostrado que mejora la supervivencia libre de relapso y supervivencia total en pacientes con cáncer de mama temprano que sobre-expresa ErbB2.

Sin embargo, 70% a 80% de pacientes con cáncer |de mama que sobre-expresa ErbB2 no responden a Herceptin cúan'do se les da una terapia de un solo agente debido ya sea resistencia primaria o adquirida. Hay varios mecanismos ¦potenciales para resistencia a Herceptin®, que inclúyeli: inactivación o pérdida de fosfatasa y homólogo iterisiLa eliminado en el cromosoma 10 (PTEN); activación dé otr ¡os receptores- de tirosina quinasa, incluyendo el receptor de factor de crecimiento tipo insulina (IGF-1R = insulin-rl.ike growth factor receptor IR) ; y acumulación de formas, truncadas del receptor ErbB2 que carecen del dominio de enlace de Herceptin®-extracelular amino terminal. \ Los polipéptidos ErbB2 truncados contienen j sojlo fragmentos terminales carboxilo citosólico, . conocidos colectivamente como p95ErbB2 o fragmentos C-térmih les, frecuentemente se encuentran en tumores y lineas celularés de cáncer de mama que expresan ErbB2. De hecho, éstos fragmentos son las formas ErbB2 predominantes en algunos tumores. Estos fragmentos surgen á través de procesamiento proteolitico del dominio extracelular de ErbB2 de longitud integra o por inicio alterno de la traducción de dos residuos metionina (aminoácidos 611 o 687) que se ubican antes después del dominio de transmembrana, respectivamente. ¡ La función biológica de p95ErbB2 no se ha caracterizado por completo, aunque la sobre-expresión |de p95ErbB2 se ha mostrado que lleva a crecimiento de xeno- injertos de tumor en ratones desnudos. La proteíná p95ÉrbB2 tiene actividad de quinasa y esta actividad se requiere 'para crecimiento de tumor. El hecho de que el receptor truncado p95ErbB2 tiene actividad de- quinasa en la ausencia! del dominio extracelular de enlace Herceptin®, sugiere que: los tumores que expresan p95ErbB2 pueden ser resistentes a Herceptin® pero sensibles a los efectos inhibitorios de inhibidores pan-HER tales- como por ejemplo, lapatinib; (un inhibidor de tirosina quinasa de bajo peso molecular de ÉrbB2 que tiene actividad en pacientes con tumores que expresan ErbB2 resistentes a Herceptin®) . Datos clínicos tempranos indican que 8 de 9 pacientes que expresan p95ErbB2 son resistentes a Herceptin®. También recientemente se. iha demostrado que la resistencia adquirida a inhibidores |de tirosina quinasa pan-HER y Herceptin® ocurre a través de ¡ya un mecanismo de realimentación que lleva a sobre-expresión Jde ErbB3 o posible truncado de ErbB2, que lleva a la fqrmaci|ón de p95ErbB2. ' 1 Ya que Herceptin® inhibe el truncado de ErbB2,' u'na combinación de Herceptin con inhibidores de tirosina quinasa pan-HER pueden ser ideal para tratar pacientes i con resistencia adquirida a Herceptin® y/o inhibidores' ¡de tirosina quinasa pan-HER. ' Con respecto a los métodos actuales para la detección de p95ErbB2, la presencia de p95ErbB2 en tumores 'de mama humanos puede detectarse por análisis de transferencia Western. Sin embargo, esta técnica requiere una gran cantidad de tejido de tumor congelado fresco, una seria limitación debido a que ese tejido raramente está diSponiJle de muestras clínicas. Ensayos de detección p95ErbB2 basados en inmunoflourescencia, pueden realizarse en secciones de tejido incrustados en parafina fijas con formalina rutinarijas de muestras clínicas. Esta técnica construye a partir de la observación de que p95ErbB2, pero no ErbB2 de longitud íntegra, se localiza tanto en el citoplasma como en la membrana celular. El método utiliza un anticuerpo anti-ÉrbB2 que hace blanco en el dominio intracelular y se basa en tinción citoplásmica diferencial. Sin embargo, métodos basados en inmunofluorescencia tienen sensibilidad limitada (~10,000 receptores por célula) y no pueden detectar los bajos niveles de p95ErbB2 que impulsan la- proliferación del tumor. Además, el polipéptido p95ErbB2 funcional se ubicha en la membrana celular y no en el citoplasma. Además, es difícil diferenciar entre ErbB2 internalizado en' el citoplasma y p95ErbB2. en el citoplasma.

El método de ensayo novedoso, ultra-sensible y altamente específico aquí descrito supera las limitaciones de los métodos actuales para la detección de p95ErbB2 y puede utilizarse en una amplia variedad de muestras clínicas tales como aspirados de aguja fina, biopsias núcleo y células |de tumor de circulación (CTCs) que se obtienen de la sangre. Además de medir p95ErbB2, el método de la invención es capaz de detectar la activación de todos los cuatro miembros de la familia ErbB junto con PTEN y IGF-1R de cantidades pequeñas del material biológico.

Métodos Ejemplares La Figura 13 muestra que el ErbB2 de longitud integra puede retirarse de muestras clínicas utilizanjdo anticuerpos que ligan al dominio . extracelular de ÉrbB2 conectado a una perla de poliestireno o un dextranó polimérico. El ensayo aprovecha la cinética de enlace de fase en solución rápida, la extracción selectiva de proteína de longitud íntegra por anticuerpos receptores ligados a las perlas y la incapacidad de proteínas ligada a perla para ligar a un matriz planar. En forma alterna, perljas magnéticamente cargadas pueden emplearse para retener ErbB2 de longitud íntegra detrás y solo p95ErbB2 truncado se aplicará a una micromatriz.

El método de ensayo "A" a continuación ilustra la detección de p95ErbB2 utilizando un ensayo de al¡ta sensibilidad y especificidad y proximidad. El método de ensayo "B" a continuación ilustra la detección de p95ErbB2 utilizando un solo anticuerpo. Estos métodos para detectar proteínas truncadas pueden aplicarse a una cantidad de diferentes proteínas incluyendo pero no limitadas a p95ErbB;2, el mutante EGFR VIH (implicado en glioblastoma, cáncer colorectal, etc.), otros receptores de tirosina quinasas truncados, caspasas y semejantes.

A. Detección de proximidad dual de receptores truncados utilizando ELISA de micromatriz con amplificación de señal tiramida Este ejemplo ilustra un ELISA DE micromatr'iz múltiple, de alto rendimiento, con detección de proximidad dual que tiene superior intervalo dinámico que es adecuado para detectar receptores truncados tales como p95ErbB2 en células en circulación raras: i 1) Anticuerpos de captura, se imprimen en un porta-objetos 16-pad FAST slide (Whatman Inc.) con ! u a dilución en -serie en el intervalo de 1 mg/ml a 0.004 mg/ml. 2) Después de secar durante la noche, el port ¡a-objetos se bloquea con amortiguador de bloqueo Whatman. 3) 80 µ? de lisado celular BT474 con o sin perl]as revestidas con anticuerpo anti-ErbB2 (extracelular) 'se agregan en cada cojín con una dilución en serie de 10-veces . El porta-objetos se incuba por dos horas a temperatura ambiente. , 4) Después de seis lavados con TBS-Tween, 80 Ul de anticuerpos de detección para el ensayo de proximidad diluido en TBS-Tween/2% BSA/1% FBS se agregan a porta-objetos. Los anticuerpos de detección empleados son: (1) un anticuerpo anti-ErbB2 especifico para el dominio intracelular de ErbB2 que se conjuga , directamente¦ con glucosa oxídala (GO) ; y (2) un anticuerpo monoclonal que reconoce ErbB2 fosforilado que se conjuga directamente con peroxidasa jde rábano picante (HRP) . La incubación es por 2 horas temperatura ambiente. 5) Para amplificación de señal, 80 µ? de biotinja-tiramida a 5 µg/ml se agregan y reaccionan por 15 minut'os junto con glucosa 50 mM. El porta-objetos se lava seis veces con TBS-Tween, dos veces 20% DMSO/TBS-Tween, y una vezi con TBS . 80 µ? de SA-Alexa 555 se agregan e incuban por 30 min. El porta-objetos después se lava dos veces, seca por minutos y explora en explorador de micromatriz ( Pérkin-Elmejr , Inc . 6) Como un ejemplo no limitante, el porta-objetos 1 puede reportar activación' total de ErbB2 mientras que el porta-objeto 2 puede reportar en activación de ErbB2 provocada. - . Con base en la cantidad de ErbB2 trunca'do activado o total en la muestra, puede seleccionarse |la terapia apropiada.

B . Detección de receptores truncados utilizando ELISA de micromatriz con amplificación de señal de tiramida.

Este ejemplo ilustra un ELISA de micromatriz de alto rendimiento múltiple, de una sola detección, que tiene superior intervalo dinámico que es adecuado para detectar receptores truncados tales como p95ErbB2 en células raras ¡en circulación: 1) Anticuerpos de captura se imprimen : en |un porta-objetos 16-pad FAST (Whatman Inc.) con un intervalo |de dilución en serie de 1 mg/ml a 0.004 mg/ml. 2) Después de secar durante la noche, el portaobjetos se bloquea con un amortiguador de bloqueo Whatman. 3) 80 µ? de un lisado celular BT474 con o sin perlas revestidas con anticuerpo anti-ErbB2 (extracelular) se agregan en cada cojin con una dilución en serie de; 10-veces. El porta-objetos se incuba por dos horas a temperatura ambiente . 4) Después de seis lavadas con TBS-Tween, 80 (µ? de anticuerpos de detección para el ensayo diluido en TB's-Tween/2 BSA/1% FBS se agregan a los porta-objetos. El anticuerpo de detección empleado es un anticuerpo anti-ÉrbB2 especifico para el dominio intracelular de ErbB2 que se conjuga directamente con HRP . La incubación es por 2 horas a temperatura ambiente. 5) Para amplificación de señal, 80 µ? de biotiJa-tiramida a 5 µ?/?t?? se agregan y reaccionan por 15 minut'os junto con peróxido de hidrógeno 1 mM. El porta-objetos se lava seis veces con TBS-Tween, dos veces con 20% ' DMS0/TB,S-Tween, y una vez con TBS 6) 80 µ? de SA-Alexa 555 se agregan e incuban por 30 min. El porta-ob etos después sé lava dos veces, secan por 5 minutos, y explora en un explorador de micromatriz ( Perkin-Elmer, Inc.). 7) Como un ejemplo no limitante, el porta-obj etios 1 puede repórter activación ErbB2 total mientras que el porta-objetos 2 puede reportar activación de ErbB2 truncado. Con base en la cantidad de ErbB2 truncado total o activado |en la muestra, puede seleccionarse la terapia apropiada.

Una modalidad de la presente invención para detectar un receptor truncado tal como p95ErbB2 se muestra en la Figura 14. La Figura 14A muestra que perlas revestidas con un anticuerpo dirigido al dominio extracelular (ECD) de un receptor de interés, ligan al receptor de longitud integra pero no el receptor truncado para retirar cualquier receptor de longitud integra del ensayo. La Figura 14B muestra que el receptor truncado, una vez ligado a un anticuerpo de captura, puede entonces detectarse por un anticuerpo de detección que es especifico para el dominio intracelular (ICD) de'l receptor de longitud integra. El anticuerpo de detección puede conjugarse directamente a peroxidasa de rábano picante (HRF) . Amplificación de señal tiramida (TSA) puede entonces realizarse para generar una señal a detectar. I Con respecto a p95ErbB2, la Figura 15 muestra que el pretratamiento con perlas revestidas con un anticuerpo dirigido al dominio extracelular (ECD) de ErbB2 (HER-2) casi retira por completo la señal ErbB2 de longitud integra sin afectar la señal de dominio intracelular ErbB2 (ICD) . La disminución de la señal ErbB2 de longitud integra fue dependiente de la concentración de perlas acoplada(s anticuerpo HER-2 ECD que se utilizan en el ensayo conforme se incrementa la cantidad de perlas acopladas a anticuerpo !de| 4 µg/ml a 12 µ9/??1 disminuye la señal de ErbB2 de longitud integra de 9.59% a 2.84%.

Las Figuras 16 y 17 confirman que p95ErbB2 se ¦detectó específicamente utilizando los métodos de ensayo descritos anteriormente. Como se muestra en la Figura ?|ß, APMA (acetato ( 4-aminofenil ) mercúrico) el tratamiento aumento la fosforilación de p95ErbB2 en células BT-474. La. Figura |17 muestra que heregulina aumentó la fosforilación p95ErbB2 |en células T47D.

De acuerdo con esto, los métodos anteriormente descritos para detectar proteínas truncadas tales 1 como p95ErbB2 en una múestra de paciente, proporcionan al menos las siguientes ventajas frente a métodos que están actualmente disponibles: 1) Superior sensibilidad, proporcionando, la capacidad para detectar receptores- truncados de células sencillas . 2) Superior especificidad. 3) La capacidad por reportar en una ruta completa utilizando microhileras . múltiplej adas en lugar de una sola proteina . 4) Capacidad de ampliación o Escalabilidad.

Ejemplo 13. Selección de Pacientes : para Tratamiento Que tienen Cáncer de Mama Invasivo Negativo de Nodo Linfático Etapa I o Etapa II Después de Identificación de Riesgo de Recurrencia por un Panel de Expresión de Genes.

Paneles de marcadores de expresión de genes se han desarrollado que pronostican la probabilidad de pronóstico y/o recurrencia de cáncer de mama en diversas poblaciones de mujeres, por ejemplo, con enfermedad de nodo negativo. Estos paneles de genes pueden ser útiles para identificar mujeres que es poco probable que experimenten recurrencias y de esta manera es poco probable que se beneficien de quimioterapia adyuvante. Los paneles de expresión pueden emplearse! para identificar mujeres quienes pueden evitar- seguramente quimioterapia adyuvante, sin afectar en forma negativa ÍLos resultados de supervivencia total y libre de enfermedad. Sistemas convenientes incluyen, pero no están limitados a Oncotype DX™, que es un panel de 21-genes de Genomic Health, Inc. (Redwood City, CA) ; MammaPrint®, que es un panel de 70-genes de Agendia (Amsterdám, Holanda) ; y un panel de 76-genes de Veridex ( arren, NJ) . Estos paneles pueden emplearse en conjunto con el análisis de activación de ruta, para i determinar la necesidad por incluir quimioterapia con las terapias dirigidas apropiadas seleccionadas utilizando los métodos descritos en los Ejemplos previos.

El siguiente protocolo proporciona una modalidad ejemplar de la presente invención en donde se utiliza él perfilado de expresión de genes en conjunto con perfilado de estado de activación, para seleccionar la terapia dirigióla apropiada o combinación de terapias dirigidas para ¡el tratamiento de cáncer de mama: 1) Una muestra de tumor con un espesor mínimo 'de 3 mm y un espesor máximo de 5 mm se recolecta utilizanjdo punción de biopsia. La biopsia se coloca directamente en el tubo de muestra que contiene · el conservador RNARetain . El tubo se embarca inmediatamente a Agendia para prueba utilizando el ensayo MammaPrint®. 2) El reporte de prueba de Agendia asigna a lia paciente ya sea un grupo de bajo riesgo/de firma "bueno" o |un grupo de alto riesgo/firma "deficiente". Si la paciente está en el grupo de bajo riesgo, puede evitar en forma segura lia quimioterapia adyuvante sin afectar en forma negativa |la supervivencia libre de enfermedad y total. 3) El ensayo MammaPrint® es aplicable para pacientes que ya son ER positivas o ER negativas. Una vez que se determine el estado de ER y ErbB2, la paciente se asigna a una de las sub-clases de cáncer de mama descritas! en Ejemplo 8. Las cuatro sub-clases principales son como sigue: 1. ER+/PR+/ErbB2- 2. ER+/ErbB2+ 3. ER-/ErbB2+ 4. ER-/PR-/ErbB2 4) Células de tumor (e.g. , CTCs) se aislan de sangre y preparan para análisis como se describe en el Ejemplo 1.; En forma alterna, una ^porción de la biopsia puede emplearse para preparar un extracto de células de tumor como se describe en el Ejemplo 2. Las preparaciones celulares se ensayan como se describe ya sea en el Ejemplo 3 o Ejemplo 4. El perfil de activación se evalúa en una forma similar como se describe en el Ejemplo 8 (Tablas 4-22), Ejemplo 9 (Tablas 23-31), y Ejemplo 10 (Tablas 32-35). La terapia dirigida apropiada o combinación de terapias dirigidas, se eligen. Si la paciente está en el grupo de bajo riesgo, no se agrega quimioterapia Si la paciente está en el grupo de alto riesgo, | la quimioterapia que se elige por el doctor con base i en información clínica se agrega a las terapias dirigidas.

Ejemplo 14. Selección de Pacientes para Tratamiento Después de Determinación de Tejido Primario de Origen por un Panel | de Expresión de Genes .

Aproximadamente 3% a 5% de todos los tumores metastásicos se clasifican en la categoría de cáncer primario desconocido (CUP) . Diagnóstico correcto del tejido de origen es importante en decisiones de tratamiento . debido a que las terapias actuales se basan substancialmente en el sitio anatómico. Paneles de expresión de genes pueden ser útiljs.s para identificar mujeres con cáncer metastásico quienes se beneficiarán de la terapia consistente con aquellas dadas a mujeres con diagnóstico inicial de cáncer de mama. Sistemas convenientes incluyen pero no están limitados al ensayo I Rosetta Genomics CUP, que clasifica cánceres y tejidos de origen a través del análisis de patrones de expresión de microRNAs (ver, por ejemplo, ' Publicación PCT Nó.j ¡WO 08/117278); el ensayo CancerTYPE IDMR Aviara DX (Carlsbad, CA) , un ensayo de expresión basado en RT-PCR que mide 92 genes para identificar el sitio de origen primario para 39 tipos de tumor; y el Pathwork™ Tissue de Origin Test (Sunnyvale, CA) , que mide la expresión de más de 1600 genes en una micromatriz y compara una "firma" de expresión de genes de tumor .contra aquellas de 15 tipos de tejidos conocidos. Una vez que la paciente se ha identificado con mama como el tejido de cáncer primario, pueden emplearse perfiles de activación de ruta para seleccionar las terapias dirigidas apropiadas para incluir en el programa de tratamiento El siguiente protocolo proporciona una modalidad ejemplar de la presente invención, en donde se utiliza ]el perfilado de expresión de genes en conjunto con perfilado |de estado de activación para seleccionar la apropiada terapia dirigida o combinación de terapias dirigidas para el tratamiento de cáncer de mama: 1) Dos o más porta-objetos de vidrio con secciones con espesor de 7 µp? de un tejido retirado, ya s<;a en forma quirúrgica o por biopsia de aguja fina, de un tumor metastásico, se obtienen de la paciente. Estas células se fijan en formalina e incrustan en parafina (FFPE) . Un portaobjetos teñido con H&E adicional del mismo tumor se tiñe con H&E. 2) Un patólogo revisa el porta-objetos de H&E indica el área a recolectar para el ensayo CancerTYPE ID† Los porta-objetos se envían a Aviara DX para análisis. 3) El reporte de prueba de Aviara DX indica los sitios más probables de origen como se determina de un análisis de vecino k-más cercano y se deriva un pronóstico. Si el pronóstico para la paciente es para mama como el tumor de origen desconocido, las células de tumor de la paciente pueden estimarse para activación de ruta. 4) Células de tumor (e.g. , CTCs) se aislan !de sangre y preparan para análisis como se describe en el Ejemplo 1. En forma alterna, una biopsia de agujas finas puede emplearse para preparar un extracto de células de tumor como se describe en el Ejemplo 2. Las preparacionjes ' i celulares se ensayan como se describe en cualquiera del Ejemplo 3 o el Ejemplo 4. El perfil de activación se evalúa en una forma similar como se describe en el Ejemplo 8 (Tablas 4-22), Ejemplo 9 (Tablas 23-31), y Ejemplo 10 (Tablas 32-35; La terapia dirigida apropiada o combinación de terapias dirigidas se elige.

Ejemplo 15. Conjunto Novedoso de Pruebas de Cáncer de Mama Utilizando Ensayos de Proximidad.

Antecedentes : En 2008, un estimado de 182,460 nuevos casos de cáncer de mama invasivo serán , identificados entre mujeres en los E.U.A. Aproximadamente 20% de las mujeres con cáncer de mama tienen una sobre-expresión de HER-2 al tiempo de diagnóstico. Cánceres de mama sobre-expresados con ' HE -2 (HER-2-positivos ) se asocian con formas más agresivas ele cáncer y por lo tanto resultan en unas tasas de supervivencia más deficientes y superiores proporciones o tazas de recurrencia. Pacientes HER-2-positivas a menudo se tratan con la droga -de anticuerpo monoclonal trastazumab (Herceptin®) . Sin embargo, Herceptin® es un tratamiento cardio-tóxico potencialmente y costoso; por lo tanto, una i identificación precisa de candidatos es imperativa paira optimizar los resultados clínicos. Herceptin® trabaja Jal bloquear HER-2 y por lo tanto reduce el crecimiento !de células de tumor. Lapatinib (Tykerb ) es un inhibidor 'de quinasa-molécula pequeña a menudo empleado para pacientes qiu han fallado con la terapia Herceptin .

Opciones de Prueba HER-2 Actuales: El estado HER-2 típicamente se estima por ' cualquiera o ambos de: (1) prueba de proteína de receptor utilizando un ensayo de · inmunohistoquímica (IHC); o (2) amplificación de genes utilizando una técnica de prueba de hibridización in situ fluorescente (FISH) . Sin embargo, hay amplio, reconocimiento que los métodos de prueba actuales carecen de precisión y pueden ser altamente variables 'de laboratorio en laboratorio y pueden variar de acuerdo , con diferencias en el manejo del espécimen antes de que se reciba en el laboratorio. De hecho, la evidencia disponible sugiere que aproximadamente 20% de las pruebas HER-2 actuales pueden ser imprecisas (ASCO/CAP Guidelines for HER-2 Testing in Breast Cáncer, J.Clin. Oncology (2007)) .

Pruebas de Cáncer de Mama Basadas en Ensayo de Proximi ad: El conjunto novedoso de pruebas de cáncer de mama descritas en este ejemplo aprovecha los ensayos múltiples, de proximidad de alto rendimiento (es decir, tres-anticuerpos) aquí descritos. Esta prueba de diagnóstico será particularmente útil para determinar la expresión activación de HER-2 en células de tumor en circulación (CTCs) o aspirado de aguja fina (FNA) recolectado de pacientes cojn cáncer de mama, y ayudará en la selección de terapia para pacientes con cáncer de mama. i 347 El siguiente protocolo describe el formato estándar empleado para todas las pruebas establecidas en este ejemplo: 1. Recolectar una muestra de sangre: a. Recolectar dos tubos de 7.5 mL de sangre. b. Utilizar las perlas magnéticas con Molécula ele Adhesión de Célula Epitelial Veridex (EpCAM) con proteínas de enlace específicas a células epiteliales para separar células de tumor en circulación (CTCs) de otros componentes ele sangre. c. Lavar la muestra. 2. Activar' una muestra (solo células vivas |se activarán) y lisar esas células. 3. Lisar las otras células de muestra. 4. (Esta es la etapa que es variable entre , ca'da una de las pruebas) . El uso de ensayos de micromatriz ¡de proximidad para detectar dos proteínas (por ejemplo, proteínas de transducción de señal) y citoqueratina n la muestra activada para cuantificar total de proteí jas activadas y citoqueratina: a. Tres anticuerpos monoclonales, específicos para las · dos proteínas y citoqueratina (CK) , se fijan en |la micromatriz . b. La muestra se vacía sobre el chip |de micromatriz, permitiendo que los- analitos liguen a los anticuerpos monoclonales específicos para ellos c. Una mezcla de seis anticuerpos monoclonalés adicionales se vacia sobre el chip de micromatriz (dos anticuerpos monoclonalés por analito) . A fin de que ocurra fluorescencia en el sitio de un analito-, todos los trps anticuerpos monoclonalés específicos (el anticuerpo fijo dos anticuerpos vaciados) deben ligarse a ese analito. ¦5. Análisis de micromatriz de proteína de las djos proteínas en la muestra inactivada para cuantificar ¡la proteína total. 6. Cada resultado de p oteína activada se calibra con la muestra inactivada. Esto dará resultados cuantitativos de proteína con un resultado "+" o "-" por cada uno de los tres analitos.

Producto A [Herceptin®] : Esta prueba es un ensaíyo de activación de ErbB en línea base para detectar activación/fosforilación de HER-2. Esta prueba es también un ensayo de activación ErbB mejorado para utilizar en pacientes de Etapa III y IV para determinar discordancia HER-2. Ensayos de micromatriz de proximidad se realizan para detectar ErbBl/HER-1, ErbB2 /HER-2 y citoqueratina en la muestra activada para cuantificar el total de proteínas activadas y citoqueratina. Anticuerpos monoclonalés contra ErbBl/HER-1 y ErbB2/HER-2 se emplean, mientras que iun anticuerpo de pancitoqueratina para células epiteliales |se emplea. La señal cuantitativa describe niveles de activación y expresión de proteina HER-2 y HER-1. La calificación jde activación relativa se deriva de una proporción ¡de fosforilación a expresión. La prueba cuantifica: activación HER-2 (fosforilación); expresión HER-2; activación HER-1 (fosforilación); expresión HER-1; y pancitoqueratina (para normalización de número de células). La prueba tiene allta sensibilidad ya que se detecta la activación HER-2 en céluljas de tumor en circulación ' sencillas . La prueba también tie¡ne una especificidad de = 99%, como se mide por reactividad cruzada menor a 1% con otros marcadores. La capacidad de reproducción (intra ensayo): CV = 5-15%. Reproducibilidad (ínter ensayo): CV = 10-20%. El reporte de prueba proporciona lo siguiente: (1) fosforilación HER-2 y HER-1, reportados como una cantidad cuantitativa y como positivo o negativo; (2) expresión HER-2 y HER-1, reportada como una cantidad cuantitativa y positiva o negativa; y ( cuantificación de citoqueratina . Si los niveles de HER-1] o HER-2 son normales pero los niveles de citoqueratina sjon altos, esto, diagnosticará cáncer de mama pero no indicará |el uso de terapias dirigidas HER-1 o HER-2.

Producto B [Prueba Tykerb® Rule-in] : Esta * prueba es un ensayo de activación ErbB mejorado que incluye detección de p95HER-2 y EGFR. En particular, esto es una prueba regla para terapia lapatinib (Tykerb®) para pacientjes HER-2-positivo que falla en tratamiento con Herceptin®. Esta a HER-1 o HER-2.

La Figura 18 ilustra múltiples puntos en donde ljos métodos de la presente invención pueden emplearse pJra influenciar la práctica clínica con respecto a seleccionar la terapia de cáncer de mama apropiada para una paciente particular.

Ejemplo 16. Preparación de Dextrano activado con' Sulfhidrilo .

Este ejemplo describe un protocolo para incorporar grupos sulfhidrilo libres en una molécula de dextrano1. ; , Como se ilustra en el Ejemplo 17, las- moléculas de dextrano modificadas con sulfhidrilo pueden emplearse para preparar conjugados con un anticuerpo y glucosa oxidasa (GO) para ! utilizar en los ensayos sencillos de detección y proximidad aquí descritos. En algunas modalidades, una- molécula de. dextrano de 500 kDa activada con sulfhidrilo puede conjugarse a un anticuerpo y GO de manera tal que la proporción de anticuerpo : GO : dextrano es 2:12:1. La conjugación de una molécula de dextrano de 5.00 kDa activada con sulfhidrilo al anticuerpo y GO, mejora ventajosamente la sensibilidad del ensayo por aproximadamente 10-veces. En otras modalidades, una molécula de dextrano de 70 kDa activada con sulfhidrilo pueden conjugarse a un anticuerpo y peroxidasa de rábano picante. (HRP) .

Definiciones y Acrónimos : 1. Dextrano = un polímero de glucosa 2. Ácido clorhídico = HC1 3. Hidrocloruro de N- ( 3-dimetilaminopropil ) N'j -etilcarbodiimida = EDC 4. Salino Amortiguado con Fosfato = PBS 5. Hidróxido de Sodio = NaOH 6. Ácido 2-Morfolinetansülfónico = MES 7. Ácido Etilendiamintetraacético = EDTA Instrumentos y Equipo: 1. Baño de agua (Fisher, Isotemp 210) 2. Lector de Placas ELISA (Molecular Devices, 4. Isopropanol ( Fisherr, ' A451- ) 5. Ácido clorhídrico 12N (Fisher, A144-500) 6. Cisteamina (Sigma, M9768) 7. Hidrocloruro de N- ( 3-dimetilaminopropil) Ni' etilcarbodiimida (Pierce, 22980) 8. Salino Amortiguado con Fosfato (Cellgro, 2jl- 040-CV) 9. Solución de Ácido Etilendiamintetraacétiíco 0.5M (GIBCO, 15575-038) 10. Ácido 2-Morfolinetansulfónico (Fluka, 69892) 11. Salino Amortiguado con Fosfato 10X (Fishe¡r, BP399-500) Amortiguadores y Soluciones : 1. NaOH a 2.9 M: Se disuelven 5.8 g de hidróxijdo de sodio en 50 mL de agua NaNOpura. 2. Solución amortiguadora MES 50 mM: |Se disuelven 5.33 g de Ácido 2-Morfolinetansulfónico en 500 mL de agua NANOpura y se ajusta el pH a 4.5 utilizando HCl 12N. 3. Amortiguador de Diálisis: Se agregan 10 mL jde solución EDTA a 0.5 M y 100 mL. de 10X PBS a 890 mL de agua Nanopura para hacer la concentración final de EDTA 5 mM ¡en PBS.

Procedimiento : Incorporación de Grupos Carboxilo en Dextrano: 1. A un gramo de dextrano 500 kDa (2 µ??????d disuelto en 8.5 mL de NaOH a 2'.9 M en un tubo de ensayo de 50 mL con tapa de rosca de polipropileno se agregan 850 mg Le ácido bromoacético . Después de mezclado completo ; pjor torbellino, el tubo se incuba en un baño de agua de 50 gradps C durante la noche. 2. Después de incubación, se agrega isopropanoli a la mezcla de reacción a una concentración final de1 7[0% (vol/vol) para precipitar el dextrano carboxilado. Despu'és de mezclar con. un mezclador de torbellino, la solución |se centrifuga a 3000 rpm en una centrifuga Beckman a temperatulra ambiente por 15 min y se descarta el sobrenadante. 3. El precipitado se re-disuelve en 10 mL de agua nanopura y la precipitación con isopropanol se repite dos tres veces más hasta que no se obtiene precipitación' con isopropanol agregado. La solución de isopropanol al 70% clara después, se ajusta a pH 4 con HCl 12N con torbellino para volver a generar el precipitado y la mezcla de nuevo se centrifuga a 3000 rpm en la centrifuga Beckman por 15 minutos para precipitar el dextrano carboxilado y el sobrenadante descartado. ; 4. Para retirar el ácido bromoacético residua'l, el precipitado se re-disuelve en 10 mL de agua nanopura y el pH de la solución se ajusta a 4 con HCl. Isopropanol después se agrega a 70% en volumen para precipitar él dextrJno carboxilado. Después de mezclar en un mezclador de a EDTA/PBS 5 mM y dializa por otras dos horas. El proceso de diálisis se repite una vez más. 6. El número total de grupos sulfhídrico incorporados en cada molécula dextrano de 500 kDa se determina por ensayo de El lman. 7. Siete alícuotas de cincuenta microlitros de la solución de dextrano incorporada con sulfhidrilo se preparan en tubos Eppendorf de 1 mL y las alícuotas se liofilizan Las alícuotas liofilizadas se mantienen a -70 grados C .paira almacenamiento.

Ejemplo 17. Preparación de un Conjugado de Dextrano-Glúcojsa Oxidasa-Anticuerpo HER-2.

Este ejemplo describe un procedimiento para conjugar un anticuerpo HER-2 dirigido por dominio extracelular y glucosa oxidasa (GO) a una molécula de dextrano 500 kDa activada por sulfhidrilo. El conjugado de anticuerpo HER-2-GO-dextrano puede emplearse en los ensayjos sencillos de detección y proximidad aquí descritos.

Definiciones y Acronimos : 1. Succinimidil-4- (N-Maleimidometil ) ciclohexanjo- 1-carboxilo- ( 6-amidocaproato) = LC-SMCC 2. Dimetil Sulfóxido = DMSO 3. Hidróxido de Sodio = NaOH . Ácido Clorhídrico Concentrado = HC1 5. Salino Amortiguado con Fosfato = PBS 6. Ácido Etilendiamintetraacético = EDTA 7. Sal de Sodio de Ácido , ¡2-(Etilmercuriomercapto) benzoico = Timerosal : 8. HPLC = Cromatografía de Líquido de jAljto Desempeño . 1 ; Instrumentos y Equipos : 1. Sistema HPLC (Agilent Technologies; Series 1100) ; 2. Cromatografía de Exclusión de Tamaño (Phenomenex; BioSep-SEC-S 3000) . . ' I 3. . Espectrofotómetro (Hitachi; U-200) { 4. Centrífuga (Beckman; GS-6R) : I 5. Agitador Magnético (Corning; PC-410D) 6. Lector de Placas ELISA (Molecular Device¡s; Spectra MAX 190) : 7. Mezclador de Torbellino (Fisher Scientifi]c; 02-215-365.) ¦ · ' 8. Columna de Desalificación (Pierce, 43230) ¦ 9. Aparato de Centricon YM-10 (Millipore, 4205) 10. Pipeta de 1 mL (Rainin, L-1000) 11. Pipeta de 200 (Rainin,' L-200) 12. Pipeta de 20 µL (Rainin, L-20) 13. Pipeta de 2 L (Rainin, L-2) 14. Pipeta de Múltiples canales (Rainin, L8-200) Reactivos, Productos Químicos y Suministro: 1. Anticuerpo Monoclonal HER-2 Anti-humano de ratón a 1 mg/mL en PBS (Lab Vision; MS-301-PABX) 2. Glucosa Oxidasa Dializada ( Prometheus ) 3. Dextrano Activado con Sulfhidrilo (Prometheus') 4. LC-SMCC ' = Succinimidil-4- (N- aleimidometil ) ciclohexan-1-carboxilo- ( 6-amidocaproato) (Fisher; 22362) 5. · DMSO = Sulfóxido Dimetil (Sigma; D2650) 1 6. Albúmina de Suero Bovina (Sigma; A3294) ' ! 7. Hidróxido de Sodio (Fisher, S318) ! 8. Ácido Clorhídrico Concentrado (Fisher ?144t- 500; 9. PBS = Salino Amortiguado con Fosfato (Célligro, 21-040-CV) 10. Solución de Ácido Etilendiamintetraacético (EDTA) 0.5 M (Invitrogen; 1758) : 11. Timerosal (Sigma, T8784) Amortiguadores y Soluciones : 1. Amortiguador EDTA/PBS 5 mM Desgasificado, pH 7.2: Se agrega 2 mL de solución EDTA 0.5. M a 200 mL PÉS | y después se burbujea gas argón en la solución resultante por|5 minutos para retirar todos los otros gases en la solución: 2. Solución al 10% de BSA/PBS : Se disuelve 10,0 mg BSA en 10 mL PBS y se filtra la solución a través1 de un filtro de 0.2 µp?. La solución se mantiene en el congelador -20 grados C. 3. Solución de Thimerosal/PBS al 10%: Se disuelve de 100 mg Timerosal en 10 mL PBS y filtra la solución a través de un filtro de 0.2 µp?. La solución se mantiene en el congelador a -20 grados C. 4. PB 4.0.1M (Amortiguador Fosfato), pH 6.8.

Procedimiento : Preparación de la Solución LC-SMCC para Uso Inmediato en la Reacción de Activación: 1. Se- toma una botella de LC-SMCC del congelador a -20 grados C y se deja que caliente a temperatura > ambiente . 2.. Se pesa entre 1-2 mg de LC-SMCC en un tubo Eppendorf de 1.5 mL y. se agrega el volumen adecuado de DMSO para hacer una solución de 4.5 mg/mL (LC-SMCC lOmM) . ¡Se almacena el restante LC-SMCC de nuevo en el congelador.

Activación de LC-SMCC del Anticuerpo HER-2: 1. Se agregan 2.3 µL de la solución LC-SMCC 10 !mM a 0.5 mL de la solución del anticuerpo HER-2, que contiene 500 µg del anticuerpo, y se somete a torbellino inmediatamente para iniciar la reacción. Después de someter a torbellino, se mantiene la mezcla a temperatura ambiente para continuar la reacción por 30 minutos. 2. Mientras tanto se pre-equilibra una columna de descalificación al lavarla con 50 mL de amortiguador EDTA/PBS 5 mM desgasificado. i 360 i i 3. Después de que la activación del anticuerpo HER-2 con LC-SMCC se completa, la mezcla de activación se carga en la columna de desalificación y la columna no' se eluye con amortiguador . EDTA/PBS 5 mM desgasificado a temperatura ambiente. La solución eluida se recolecta a fracciones de 0.5 mL y supervisa por absorbancia de UV 280 nm con un espectrofotómetro . 4. Las fracciones ¦ que contienen el anticuerpo activado con base en la absorbancia de UV, se recolectan mantienen en hielo para la siguiente reacción. 1 Activación de LC-SMCC de Glucosa Oxidasa: 1. Se toman 0.16 mL de glucosa oxidasa dializada, que contiene 4 mg de la enzima, y se ajusta a su volumen 0.5 mL con el amortiguador EDTA/PBS 5 mM desgasificado. 2. Se agregan 12.4 L de la solución LC-SMCC |10 mM a la solución de glucosa oxidasa de 0.5 mL y se sométei a torbellino para iniciar la reacción. Después de someten a torbellino, se mantiene la mezcla a temperatura ambiente pa'ra contener la reacción por 30 minutos. 3. Mientras tanto, pre-equilibra una columna de desalificación al lavarla con 50 mL de amortiguador EDTA/PBS 5 mM desgasificado. 4. Después que la. activación de la glucosa oxidasa con LC-SMCC se completa, la mezcla de activación se carga en la columna de desalificación y la columna eluye on horas a 4 grados C.

Purificación del Conjugado HER-2 Anticuerpo-Glucosa Oxidasa- Dextrano : 1. Después de la reacción de bloqueo, la solución de conjugado anticuerpo HER-2-glucosa oxidasa-dextrano |se concentra a ~300 µL en un Aparato Cent.ricon equipado con ina membrana YM-10 con corte de 10,000 de peso molecular. 2. La solución concentrada se transfiere a un tubo Eppendorf 1.5 mL y el tubo se centrifuga a 16,000 g por 3 minutos para retirar la pequeña cantidad de precipitado1. 3. El sobrenadante se transfiere a una ampolldta de muestra de HPLC y el volumen de la solución se ajusta 320 µ?. con el amortiguador EDTA/PBS 5 mM desgasificado pa'ra púrificación por HPLC. 4. Cien microlitros de la solución conjugada |se inyectan en una columna de exclusión de tamaño de BioSep-SE-S 300 en un sistema Agilent HPLC y la proteina conjugada |se separa por elución con 0.1M PB, pH 6.8 a un gasto de flujo |de 0.5 mL/min por 40 minutos y la solución eluida se supervisa por absorbancia UV a 280 nm. 5. El primer .pico de absorción de UV de las fracciones de elusión se recolecta y se mantiene en hielo. 6. Los 200 µ?, restantes de la solución conjugáda también se purifica igualmente y los primeros picos de absorción de UV de las tres corridas de HPLC se recolectan.

La solución conjugada recolectada se ajusta a BSA 0.1% con la solución de BSA/PBS 10% y Timerosal 0.02% con la solución Timerosal/PBS al 10% para almacenamiento a largo plazo a -¡70 grados C. 7. La actividad enzimática de glucosa oxidása presente en el conjugado anticuerpo-HER-2 glucosa oxidasa-dextrano, se determina por un ensayo funcional de glucosa oxidasa. 8. La actividad de anticuerpo presente en el conjugado anticuerpo HER-2-glucosa oxidasa-dextrano1 se determina por ensayo de ELISA de competencia.

Ejemplo 18. Ensayo Multiplexado Novedoso para Detectar Activación de Receptor de Tirosina Quinasa de la Familia ErbB en una Célula de Tumor en Circulación.

Extracto : El perfilado de expresión/activación de quinasas| y otras moléculas de ruta de transición de señal en ¡un muestreado en serie de tejidos de tumor, proporcicjna información valiosa de cambios que ocurren en células de tumor como una función de tiempo y terapias. Este perfila'do temporal de avance de tumor permite a los médicos el supervisar rápidamente firmas de cáncer en evolución en cada paciente. Este ejemplo ilustra un ensayo novedoso y robusto para detectar el nivel de expresión y el grado de fosforilación de la familia ErbB de receptor de tirosina quinasas (RTKs) y demuestra las ventajas de utilizar dicjno sistema de diagnóstico para guia de terapia sencil!lo alrededor e una célula. El ensayo general se basa en muestras tales como aspirado de agujas finas (FNAs) y sangre y logra alta sensibilidad y especificidad- para interrogar la cantidad limitada de células de cáncer que se obtienen ¡de estas muestras.

Introducción : El inicio y avance de cáncer pueden asociarse con expresión anormalmente regulada y activación de receptores y otros componentes de> la ruta de transducción de señal. La activación anormal de HER-1 y HER-2 se ha vinculado con diversos tipos de avance de, cáncer. Métodos para perfilado de patrones de fosforilación de HER-1 y HER-2 puedfen proporcionar percepción valiosa en la patogénesis de ! la enfermedad total, y por lo tanto lleva a una mejor selección de terapia al identificar moléculas que provoca la enfermedad relevante. El ensayo aquí dirigido se basa en (1) ina plataforma de micromatriz de proteínas multiplexadas combinada con (2) un proceso de amplificación de señal con canalización de triple-anticuerpo-enzima. La plataforma de micro matriz ofrece la capacidad de expansión requerida para alojar múltiples marcadores así como la capacidad de escala requerida para despliegue comercial. El diseño único y novedoso del ensayo aquí descrito se proporciona por el enfoque de triple-enzima-anticuerpo que confiere ultra-alta sensibilidad mientras que conserva la especificidad. [En modalidades en donde el ensayo se emplea para detectar| y cuantificar aquellos- objetivos qüe se fosforilan y por lio tanto activan, el ensayo puede realizarse como sigue: 1. La diana u objetivo selecto se captura por anticuerpos específicos de diana impresos en diluciones en serie en una superficie de micromatriz. La Figura 19 ilustra una modalidad del ensayo de la presente invención, que se basan en la co-localización de dos anticuerpos detectores adicionales enlazados con enzimas para subsecuentes eventos de canalización por cada proteína diana ligada 2. En la modalidad mostrada en la Figura 19, |el inmuno-complejo formado por el enlace de diana inicial por anticuerpos de captura y el enlace secundario de los anticuerpos conjugados con glucosa oxidasa (GO) que reconocen un epitope alterno en las moléculas diana capturadas prpdJce H202 en la presencia de un substrato GO tal como glucosas GO es una de las enzimas más rápidas conocidas" con un número de cambio o renovación (TON = turnover number) de 105/min. 3. En la modalidad mostrada en la Figura 19, el influjo local especifico de diana de H202 se utiliza entonces por anticuerpos específicos de fosfo-péptido conjugados a peroxidasa de rábano picante (HRP, con un TON de loVmin.) que liga al sitio fosforilado en los objetivos capturados, de esta manera amplificando la señal específica de diana. La epecificidad para la detección de objetivos o dianas fosforiladas se aumenta enormemente a través del proceso de amplificación e inmuno-detección colaborativa dado el requerimiento para enlace simultáneo de tres tipos diferentes de anticuerpos.

La detección y cuantificación de tan pocos cojmo aproximadamente 2-3 x 104 eventos de fosforilación, se logra rutinariamente por el ensayo aquí descrito, logrando su detección a un nivel de una sola célula. Esta configuración de inmunoensayo colaborativo puede además aplicarse pa¡ra investigar interacciones de proteínas y estados de activación.

Métodos: Cultivo de Tejido: Lineas celulares SKBR3, MDA-MB-468, T47D y BT474 se obtuvieron de ATCC. .Las células !se desarrollan en el siguiente medio de crecimiento en placas de cultivo de tejido de 100 mm a 37 grados C en 5% CO2 : medio SKBR3 - MacCoy's 5A con 10% FBS; MDA-MB-468 - DMEM, 10% FBS ; BT474 - DMEM, 10% FBS; T47D - RPMI 1640, 10% FBS, 0.2 U/ml de insulina bovina. Las células se recolectaron a confluencia de 70-80% con un proceso de ligero desprendimiento (tratamiento con tripsina + subsecuente inactivación) y subsecuentemente se contaron y lavaron con IX PBS. Se realizó estimulo de células con 100 µ? EGF o heregulina , ß 20 µ? o ambos en medio de crecimiento libre de suero por 5 min. Subsecuentemente, células estimuladas se lavaron con IX PBSj y después se lisaron y mantuvieron en hielo por 30 min. ¡ Impresión de Porta-objetos: Anticuerpos de captura se diluyeron en lx PBS con detergente. Una impresora de micromatriz de contacto (Genetix) se utiliza para imprimir en 16 porta-objetos de capa de nitrocelulosa FAST ( hatmári) . El diámetro de punto fue aproximadamente 175 um y los porta-objetos impresos se mantuvieron en una cámara desecante a 4 grados C. , Ensayo de Proximidad Multiplexado : Porta-obj etós se incubaron con amortiguador de bloqueo por 1 hr y después lavaron 3X con amortiguador TBST. Lisados celulares después se agregaron sobre cada capa para incubación durante la noche a temperatura ambiente (RT) . Al terminar el enlace, primario, se aspiraron lisados y luego cada capa o cojín se lavó varias veces con TBST. Después, anticuerpos detectores secundarios (conjugados con GO o HRP) se agregaron a cada capa por 2!hr a RT. Anticuerpos detectores secundarios sin ligar se retiraron al lavar con TBST, y amortiguador de amplificación de señal que contiene glucosa y tiramida biotinilada se agrega a cada capa por 15 minutos. Después de retirar exceso de tiramida biotinilada, estrepavidina conjugada con Alexa-647 se agrega para la detección de señal.

Análisis de Datos: La cuantificación se realizó utilizando el programa Perkin Elmer ScanArray Express y los datos obtenidos se corrigen para - intensidades de fondos locales y globales. Un archivo GenePixArray List (GAL) se utiliza para proporcionar información de identificador y nombre descriptivo y se incorporó en el archivo de salida Ide análisis de imagen. Señales de puntos triplicados se promediaron y" los datos se normalizaron para corregir variabilidad de capa en capa. Un modelo de regresión no lineal . se utiliza para la cuantificación de la cantidad equivalente celular para valores de unidad de fluorescencia reltiva (RFU) correspondientes. Los datos se ajustaron á una ecuación Hill de cinco parámetros para generar las curvas estándar. Cada curva se validó contra controles conocidos.' Un número conocido de células se pronostica para la diluci n apropiada, que corresponde a la curva con la pendiente más alta a la intensidad de la muestra desconocida.

Transferencia Western: Después que números aproximadamente iguales de lisados celulares para cada linea celular se obtuvieron, se tomaron alícuotas en ampolletas de un solo uso. La concentración de proteína se determinó utilizando un ensayo de proteína de ácido bicinconínico (BCA) . Se prepararon muestras con amortiguador de muestra que contiene ß-mercaptoetanol, y después de hervir por 5 minutos y enfriar a RT, las muestras se cargan en un gél de NuPage 4-12% junto con una escalera de proteínas. Al completar electroforésis , las proteínas separadas en el gel se, transfirieron a una membrana de nitrocelulosa . La membrana se lavó, bloqueó con blotto de leche al 5% e incubó primero con' anticuerpos primarios y después con secundarios antes del proceso de detección utilizando NBT/BCIP.

Resultados : Sensibilidad: La activación y expresión de HER-1| y HER-2 a un nivel de sensibilidad de una sola célula se detectaron en líneas celulares múltiples (líneas celulares DA- B-468, ' A431, BT-474 y SKBr-3). Estas líneas celulares expresan aproximadamente 1 x 106 total de RTKs. en su membrana celular por célula, aunque solo sub-conjuntos del total de RTKs se fosforilan y esta fosforilación se requiere paira activación de ruta. Las células SKBR-3 tienen activaci ;on HER-2 espontánea debido a su amplificación y por lo tarito proporcionan una referencia de control positivo. Célullas MDA-MB-468 requieren ser estimuladas con EGF (TGF-a) para inducir fosforilación HER-1 y su firma antes y después de estimulo puede emplearse como controles negativos y positivos. MDA-MB-468 tiene activación HER-1 marginal antes de estimulo, mientras que ambas lineas celulares hacen pico a aproximadamente 2-5% de sus RTKs activados (-0.5 a 1 x 105 de eventos de fosforilación por célula) . La Figura 20 muestra que el formato de ensayo aquí descrito permite detección de menos de 105 eventos de activación con sensibilidad de una sola célula.

Especificidad: Especificidad analítica del formato de inmunoensayo colaborativo aquí descrito fue >99.99% con base en un estudio comparativo realizado en líneas celular ,es múltiples con diversos niveles de' RTK. Líneas celular ¡es empleadas y su expresió · ErbB dominante y la activación RTK sobre estímulo de EGF o HRG ß se muestra en la transferenC|ía Western en la Figura 21. El perfil de activación RTK palra células T47D, que expresa cierto nivel de ErbB2 y ErbB3 pero una cantidad extremadamente baja de ErbBl, se ilustra en la Figura 22. El número de células requeridas para detectar EC20 (12000 RFU) pHER-1 o pHER-2 se empleó para calcular activación RTK por célula (RFU/célula) como se muestra en la Tabla 43. Cuando células MB468 que expresan una cantidad Conclusió : Este ejemplo ilustra un ensayo novedoso capaz de detectar específicamente el estado de . fosforilación de miembros receptores de familia ErbB con sensibilidad que permite su uso con células raras de tumores en circulación (CTCs) . Al identificar la activación HER-1 y HER-2 en CTGs, esta plataforma de ensayo puede proporcionar guía, no sojlo para la selección inicial de agentes terapéuticos dirigidas, sino también en supervisión subsecuente para el avance de la terapia. El perfilado de expresión/activación de quinasas y otras moléculas de ruta de transducción de señal (mostradas en la Figura 23) en un múestreado en serie de CTCs proporcionará información valiosa de cambios que ocurren en las células de tumor como una función del tiempo y las terapias. Este enfoque de diagnóstico para guía de terapia puede entrar a diversas etapas del manejo de la enfermedad, como se muestra en la Figura' 18. El perfilado temporal y espacial de avance de tumor que se proporciona por el formato de ensayo aquí descrito permitirá a los médicos supervisar firmas de cáncer- de rápida evolución en cada paciente. Debido a su sensibilidad y especificidad sin paralelo, el formato de ensayo descrito en este ejemplo puede aplicarle para detectar eventos de fosforilación en miembros receptores de familia ErbB presentes en CTCs raros. Como tal, este método puede proporcionar guía, no solo para la selección inicial de agentes terapéuticos dirigidos, sino también ¡en supervisión subsecuente para avance de terapia.

En suma, la plataforma de inmunoensayo-colaborativo basado en proximidad multiplexado aquí descrito, proporciona información clínica valiosa en muestras limitadas con ultra-sensibilidad y especificidad para ayudar a los oncólogos en mantener o ajustar sus opciones de tratamiento de enfermedad, para cada paciente de acuerdo con un cambio de perfil de cáncer "personal".

Ejemplo 19. Método para Detectar Activación de Receptor |de Tirosina Quinasa de Familia ErbB.

La solicitud presenta tecnología capaz de detectjor específicamente eventos , de fosforilación en receptor ¡de tirosina quinasas de familia ErbB (RTKs) a un nivel de sensibilidad de una sola célula. En ciertos aspectos, esta plataforma de micromatriz de proteína multiplexada utiliza la formación de un inmuno-complejo único de "canalización de enzima anticuerpo triple". En una modalidad, este complejjo requiere co-localización de dos anticuerpos detectores conjugados con enzimas de canalización correspondiente, una vez que se ligan proteínas objetivo por los anticuerpos de captura. Los eventos de canalización entre dos enzimas detectoras en proximidad, glucosa oxidasa (GO, conjugado con anticuerpos anti-RTK) y peroxidasa de rábano picante (HR!P, conjugada con sitios anti-fosforilados en RTKs) permit1en perfilado de RTK con extrema sensibilidad. Este principio se aplicó a dos sistemas, de modelo de cáncer de mama con ;un número limitado de células diana: células de cáncer que se encuentran en sangre entera de un paciente (células de tumor en circulación, CTCs) y en una muestra de aspirado de aguja fina (FNA) .

Aquí se reporta la detección exitosa de activación (fosforilación) de HERI y HER2 (pHERl y pHER2) en un sisteLa modelo CTC, a un nivel de sensibilidad de una sola célJla para las lineas celulares MDA-MB 468 y SKBr-3. La especificidad analítica del formato d.e "inmunoensayo ¡de proximidad" fue >99.99% con base en estudios comparativos realizados en líneas de múltiples células con diversos niveles de RTK. Además, también aquí se presentan modelos de xenoinjerto para diferentes tipos de cáncer de mama utilizando líneas celulares con grados variantes de expresión de ErbB-RTK (MDA-MB-231 , MDA-MB-468 y MDA- B-435) para demostrar su aplicación potencial con muestras de FNA (y FNA metastásico) . Mientras que fue posible detectar niveljss moderados de pHER2 y pHERl en FNA-xenoinj erto MD-MB-231 pHERl significante en FNA obtenido de xenoinjertos MDA-MB-468, no se detectó activación HERI o HER2 en FNA obtenido de xenoinjertos MDA-MB-435. Estos hallazgos de sistema de modelo xenoinj erto-FNA son concordantes con el perfil de impulsor de línea celular, demostrando que este método puede emplearse para detectar activación de receptores ErbB |en cualquier tipo de muestra que se obtiene de procedimientos ¡de invasión mínima (por ejemplo, de CTCs a FNAs) .

La habilidad de este ensayo para supervisar estado de activación de los RTKs dirigidos con una cantidad limitJda d muestra es extremadamente útil ya que el éxito de las terapias dirigidas se basa en la capacidad del fármaco o droga para desactivar (o desfosforilar ) RTKs dirigidos . Además, este principio puede aplicarse para investigar otras moléculas de ruta de transducción de señal para mejor selección de terapia y supervisión de enfermedad efectiva entre opciones de tratamiento de cáncer de mama disponibles. Conforme el perfil de la enfermedad a menudo cambia en cáncer de mama recurrente, este formato de ensayo único puejde emplearse para proporcionar información clínica valiosa ¡en muestras limitadas que se obtienen de una "enfermedad en' evolución" para ayudar a los oncólogos en ajustar sus opciones de tratamiento de enfermedad para cada paciente 'de acuerdo con un cambio de perfil de cáncer "personal".

Ejemplo 20. Método para Detectar Activación de Receptor cié Tirosina Quinasas en Células de Tumor en Circulación Utilizando un Inmunoensayo de Micromatriz Mediado ppr Proximidad.

Antecedentes: La activación anormal de HERI y HER2 se ha enlazado o vinculado con diversos tipos de avance Le Resultados: Identificamos 6 pacientes (8%) con HERI activo, 6 pacientes (8%) con HER2 activo y 14 (18.5%) pacientes con activación RTK dual en sus CTCs. 25 muestras normales no mostraron activación detectable de HER1/HER2. También observamos discrepancias entre el estado de activación HER2 entre CTCs y su estado HER2-IHC primario correspondiente entre pacientes de cáncer de mama. CTCs con HER2 activado se encontraron en 6 pacientes de 16 (38% cáncer de mama primarios negativos HER2. Además, 2 de (40%) pacientas positivas HER2 tuvieron CTCs sin activación HER2 aparente.

Conclusión: La plataforma mediada por proximidad multiplexada proporciona ventajosamente sensibilidad a nivel de una sola célula para detectar la activación de RTKs en una cantidad limitada de muestra. Como tal, CTCs encontradas en cánceres de etapa metastásica pueden obtenerse y perfilarse para proporcionar información valiosa para impactar la práctica clínica.

Ejemplo 21. Método para Detectar Activación de Receptor de Tirosina Quinasas en Lesiones Metastásicas Utilizndo un Inmunoensayo de Micromatriz Mediado por Proximidad.

Antecedentes: Los cambios en el estado de expresión de receptor de tumor entre sitio primario | y lesiones metastásicas se conoce que ocurren a una frecuéncjia significante (-15 a 20%). Como resultado, métodos pa'ra perfilado de patrones de activación de receptor de tirosina quinasa (RTK) en tumores metastásicos, pueden proporcionar una percepción valiosa al interior de la patogénesis de la enfermedad cambiante. i Métodos: Una tecnología novedos capaz de detectar específicamente eventos de fosforilación en RTKs de familia ErbB, se ha desarrollado. Esta plataforma de micromatriz de proteínas múltiplej adas utiliza la formación de un inmuro-complejo único que requiere la co-localización de dos anticuerpos conjugados-con enzima detectora, una vez; que se capturan las proteínas diana en la superficie de la micromatriz. Los eventos de canalización entre las; eos enzimas detectoras (por ejemplo, glucosa oxidasa y peroxidasa de rábano picante) en proximidad, permiten el perfilado de RTKs con sensibilidad extrema. De hecho, la especificidad analítica se mejora enormemente dado el requerimientb de enlace simultáneo de tres anticuerpos diferentes. Utilizamos 29 tejidos de cáncer de mama congelados (etapas II a IV) : como un sistema modelo para perfilado RTK de aspirado de agujias finas metastásicas (mFNA) .

Resultados: Las muestras de tejido de tumor recolectadas utilizando agujas calibre G23 se lisaron 00 µ? de amortiguador de lisis, y las muestras solubles (que contienen ~100 a 200 µ? de proteína) se analizaron >para estado de activación RTK. De las 29 muestras de FNA, 27% (8/29) mostraron HER2 altamente activado, y 2 muestras (6%) mostraron un nivel intermedio de 'HER2 activado. Una de las muestras con activación HER2 intermedia también mostró un nivel intermedio de activación HERI. Dos de las 8 muestras activadas HER2 también mostraron un nivel significante |de activación HERI. Entre las 19 muestras HER2-negativas activadas, 3 mostraron un nivel moderado de activación HERlJ.

Conclusión: La plataforma mediada por proximidad multiplexada proporciona ventajosamente sensibilidad a nivel de una sola célula de eventos de fosforilación diana¦ para detectar la activación de RTKs en una cantidad limitada de muestras de tejido mFNA. La capacidad en perfilar tumores en diferentes sitios metastásicos por lo tanto proporciona información · valiosa en sus potenciales metastásicos diferenciales. Como tal, muestras mFNA de un solo paso de mínima invasión puede ser utilizadas para ajusfar a la médijda opciones de · terapia conforme cambia el perfil de |la enfermedad .

Todas las publicaciones y solicitudes de patenties citadas en esta especificación, aquí se incorporan pjor referencia como si cada publicación o solicitud de patente individual sé indicara en forma específica e individual incorporada por referencia. Aunque la invención anterior se ha descrito en cierto detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de comprensión, será fácilmente aparente para aquellos con destreza ordinaria jen la especialidad a la luz de las enseñanzas de esta invención que ciertos cambios y modificaciones pueden hacerse a la misma sin apartarse del espíritu o alcance de . las reivindicaciones anexas.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para seleccionar un fármaco í anticáncer conveniente para el tratamiento de un tumor |de mama, el método se caracteriza porque comprende: (a) aislar células de un tumor de mama después de administración de un fármaco anticáncer, o antes de incubación con un fármaco anticáncer; (b) lisar las células aisladas para producir un extracto celular; (c) detectar un estado de activación de uno o más analitos en el extracto celular utilizando un, ensa'yo que comprende una pluralidad de series en, dilución de anticuerpos de captura específicos para el uno o mjás analitos, en donde los anticuerpos de captura se restringen en un soporte sólido; y (d) determinar si el fárma'co anticáncer es adecuado o inadecuado para el tratamiento del tumor de mama, al comparar el estado de activación detectando para el uno o más analitos con un perfil de activación de referencia generado en la ausencia del fármaco anticáncer. 2. El método de conformidad ' cón la reivindicación 1, caracterizado porque el tumor de mama se deriva de jun sujeto con carcinoma ductal o carcinoma lobular. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el carcinoma ductal es carcinoma ductal invasivo o carcinoma ductal in situ. 4. El método de conformidad con la reivindicacijím 2, caracterizado porque el carcinoma lobular es carcinoma lobular invasivo o carcinoma lobular in situ. 5. El método de¦ conformidad con la reivindicaciión 1, caracterizado porque las células comprenden células |en circulación del tumor de mama. 6. El método de conformidad con la reivindicaciión 5, caracterizado porque las células en circulación' se aislan de una muestra, por separación inmunomagnética . 7. El método de conformidad con la reivindicacijón 6, caracterizado porque la muestra se elige del grupo: que consiste de sangre entera, suero, plasma, fluido de lavado ductal, aspirado de pezón, linfa, aspirado de médula óseja, orina, saliva, aspirado de agujas finas, y sus combinaciones. 8. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque las células en circulación se eligen, del grupo que consiste de células de tumor en circulación, células endoteliales en circulación, células progenitoras endoteliales en circulación, células madre de cáncer, célulLs de tumor diseminadas, y sus combinaciones. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células se aislan ' de tejido de tumor. 10. El método de conformidad con la' reivindicación 9, caracterizado porque el tejido de tumor es tej ido' de · tumor primario o tejido de tumor metastásico .· . 11. El método de conformidad con la reivindicación (ZACTI A™; ZD6474), y sus combinaciones. 16. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el agente quimioterapéutico se élige del grupo que consiste de pemet'rexed (ALIMTA®) , gemcitabina (Gemzar®) , sirolimus (rapamicina) , análogos de rapamicina, compuestos ¦ de platino, carboplatina, cisplatiJa, satraplatina, paclitaxel (Taxol®) , docetaxel (Taxotere®) , temsirolimus (CCI-779) , everolimus (RAD001), y : sus combinaciones. 17. El método de conformidad con la reivindicáci n 13, caracterizado porque el agente terapéutico hormonal ]se elige del grupo que consiste de inhibidores de aromatasa, moduladores de receptor de estrógeno selectivos, esferoides., finasterida, agonistas de hormona de liberación de gonadotropina, sus sales farmacéuticas aceptables, sus estereoisómeros, sus derivados, sus análogos y sus combinaciones. 18. El método de conformidad · con la reivindicación 13, caracterizado porque el agente radioterapéutico se élige del grupo que consiste de 47Sc, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 86Y, 87Y, 90Y, 105Rh, lllAg, lllln, 117mSn, 149Pm, 153Sm, 166Ho, 177Lu, Í86Re, 188Re, 211At, 212BÍ, y sus combinaciones. 19. , El método de conformidad con la reivindicaci¡ón 1, caracterizado porque el uno o más analitos comprenden una pluralidad de moléculas de transducción de señal. ubiquitinación, estado de complej ación y sus combinaciones 24. El método de. conformidad con la reivindicaci'ón i 1, caracterizado porque el soporte sólido se elige del grupo que consiste de vidrio, plástico, astillas (chips) , espigajs, filtros, perlas, papel, membrana, haces de fibras y s¡us combinaciones . 25. El método de conformidad con la reivindicaci|ón 1, caracterizado porque los anticuerpos de captura |se •restringen en el soporte sólido en una matriz direccionable1. 26. El método de conformidad con la reivindicáci ,on 1, caracterizado porque el ensayo en la etapa (c) comprende: (i) incubar el extracto celular con una pluralidad de series de dilución de anticuerpos de captura para formar una pluralidad de analitos capturados; (ii) incubar la¦ pluralidjad de analitos capturados con anticuerpos dependientes de estado de activación para los analitos correspondientes, para formar una pluralidad de analitos capturados, detectables ; (iii) incubar la pluralidad de analitos capturados detectables con primeros y segundos miembros de un par de amplificación jde señal, para generar una señal amplificada; y (iv) detectar ¡la señal amplificada generada del primero y segundo miembros djel par de amplificación de señal. 27. El método de conformidad con la reivindicácion 26, caracterizado porque los anticuerpos dependiente? de estado de activación comprenden un primer miembro de un par de enlace. 28. El método de conformidad con la reivindicaciión 27, caracterizado porque el primer miembro del par de enlape es biotina. 29. El método de conformidad con la reivindicacijón 26, caracterizado porque el primer miembro del par de amplificación de señal comprende un segundo miembro del p'ar de enlace. .30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el segundo miembro del par de enlaces es estreptavidina . 31. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el primer miembro del par de i amplificación de señal es una peroxidasa. 32. El método de conformidad con la reivindicaciión 31, caracterizado porque la peroxidasa es peroxidasa ¡de rábano picante (HRP) . 33. El método de conformidad con la reivindicacijón 31, caracterizado porque el segundo miembro del par ¡de amplificación de señal es un reactivo de tiramida. 34.. El método de conformidad con la reivindicaciión 33, caracterizado porque el reactivo de tiramida es. biotinla-tiramida. 35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la señal amplificada se genera por oxidación de peroxidasa de la biotina-tiramida para producir una tiramida activada. 36. El método de conformidad con la reivindicacióin 35, caracterizado porque la tiramida activada se detecta directamente. , j 37. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la tiramida activada se detecta ante la adición de un reactivo de detección de señal. i 38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el reactivo, de detección de señal es un fluoróforo etiquetado con estreptavidina . ¡ | 39. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el reactivo para detección de señal es una combinación de una peroxidada etiquetada con ' i estreptavidina y un reactivo cromogénico. 40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el reactivo cromogénico; es 3, 3' , 5, 5' -tetrametilbenzidina (TMB) . 41. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ensayo en la etapa (c) comprende: (i) incubar el extracto celular con la pluralidad de series de dilución de anticuerpos de captura para formar 1 u:ia pluralidad de analitos capturados; (ii) incubar la pluralidad de analitos capturados con anticuerpos de detección que comprenden una pluralidad de anticuerpos independientes de estado de activación y una pluralidad de anticuerpos dependientes de estado de activación específicos para los analitos correspondientes, para formar una pluralidad de analitos capturados detectables, en donde los anticuerpos independientes de estado de activación se · etiquetan con una porción facilitadora, los anticuerpos dependientes de estado de activación se etiquetan con un primer miembro de un par ¡de amplificación de señal, y la porción facilitadora genera un agente oxidante que canaliza con y reacciona con el primer miembro del par de amplificación de señal; (iii) incubar la pluralidad de analitos capturados detectables con un segundo miembro _ del par de amplificación de señal, para generar Jna señal amplificada; y. (iv) detectar la señal amplificada generada del primer y segundo miembros del par de amplificación de señal. 42. El método de conformidad con la reivindicaci|ón 41, caracterizado porque los anticuerpos independientes jde estado de activación se etiquetan directamente con la porcijón facilitadora. 43. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque los anticuerpos independientes de estado de activación se etiquetan con la porción facilitádojra mediante hibridización entre un oligonucleótido conjugado con anticuerpos independientes de estado de activación y un oligonucleótido complementario conjugado con la porci'ón facilitadora . 44. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque los anticuerpos dependientes de estado de activación se etiquetan directamente con el primer miembro del .par de amplificación de señal. 45. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque los anticuerpos dependientes de estado de activación se etiquetan con el primer miembro del par de amplificación de señal mediante enlace entre un primer miembro de un par de enlace conjugado a los anticuerpos dependientes de estado de activación y un segundo miembro del par de enlace conjugado al primer miembro del par jde amplificación de señal. ¡ 46. El método de conformidad con la reivindicacijón 45, caracterizado porque el primer miembro del par de enlajce es biotina.- 47. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el segundo miembro de par de enlace es estreptavidina . 48. El método de conformidad con la reivindicacijón 41, caracterizado porque la porción facilitadora es glucojsa oxidasa . 49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la glucosa' oxidasa y los anticuerpjos independientes de estado de activación se conjugan con una molécula de dextrano activada con sulfhidrilo. 50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la molécula de dextrano activado con sulfhidrilo tiene un peso molecular de 500-kDa. ', 51. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado- porque el agente oxidante es peróxido de hidrógeno (H2O2) - 1 52. El. método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el primer miembro del; par de amplificación de señal es una peroxidasa. 53. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque la peroxidasa es peroxidasa de rábano picante (HRP) . i 54. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el segundo miembro del par de amplificación de. señal es un reactivo de tiramida. 55. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado .porque el reactivo de tiramida es biotina tiramida. 56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la señal amplificada se genera por oxidación de · peroxidasa de la biotina-tiramida, para producjir una tiramida activada. 57. El método de conformidad con la reivindicácilon caracterizado porque la tiramida activada se detecta directamente. 58. El método de conformidad con la reivindicáci n 56, caracterizado porque la tiramida activada se detecta1 p¡or la adición de un reactivo de detección de señal. ¡ 59. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el reactivo de detección se señal es un fluoroforo etiquetado con estreptavidina . 60. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el reactivo para detección ' de señal es una combinación de .peroxidasa etiquetada clon estreptavidina y un reactivo cromogenico. ! '61. El método de conformidad con la reivindicácilon 60, caracterizado porque el reactivo cromogénico: les 3, 3' , 5, 5' -tetrametilbenzidina (TMB) . · 62. Un método para identificar la respuesta de ¡un tumor de mama a tratamiento con un fármaco anticáncer, ¡el método se caracteriza porque comprende: (a) aislar células ¡de un tumor de mama después de administración de un fármaco anticáncer o antes de incubación con un fármaco anticáncer; (b) lisar las células aisladas para producir un extracto celular; (c) detectar un estado de activación de uno o más analitos en el extracto celular utilizando un ensayo; que comprende, una pluralidad de series de dilución de anticuerpos de captura específicos, para el uno o más analitos, en donde los anticuerpos de captura se restringen en un soporte sólido; y (d) identificar el tumor de. mama que responde o no responde' a tratamiento con el fármaco anticáncer , por comparación -del estado de activación detectado para el uno o más analitos con un perfil de activación de referencia generado en la ausencia del fármaco anticáncer. 63. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el tumor de mama se deriva de un sujeto con carcinoma ductal o carcinoma lobular. 64. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque ' el carcinoma ductal es carcinoma ductal invasivo o carcinoma . ductal in situ. 65. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el carcinoma lobular es carcinoma lobular invasivo o carcinoma lobular in situ. 66. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque las células comprenden células en circulación del tumor de mama. 67. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque las células en circulación se aislan i de una muestra por separaci .ó,n m. munomagne.ti.ca. ' Ij 68. El método de conformidad con la reivindicación j 67, caracterizado porque la muestra se elige del grupo que consiste de sangre entera, suero, plasma, fluido dé lavado ductal, aspirado, de pezón, linfa, aspirado de médula ósea, orina, saliva, aspirado de agujas finas, y sus combinaciones. 69. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque las células en circulación se eligen del grupo que consiste de células de tumor en circulación, células endoteliales en circulación, ' células progenitores endoteliales en circulación, células madre de cáncer, células de tumor diseminadas y sus combinaciones. \ 70. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque las células se aislan de tejido de tumor . 71. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el tejido de tumor es tej'idó de tumor primario o tejido de tumor metastático. 72. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque las células se aislan de tejido de tumor como una muestra de aspirado de aguja fina. 73. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque las células aisladas se estimulan in vitro con factores de crecimiento. 74. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el fármaco anticáncer se eligen' del grupo que consiste de un anticuerpo monoclonal, inhibidor de tirosina quinasa, agente quimioterapéutico, agente terapéutico hormonal, agente radioterapéutico, vacuna y sus combinaciones. 75. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el uno o más analitos comprende uha pluralidad de moléculas de transduccion de señal. 76. El método de conformidad con la¦ reivindicación 62, caracterizado porque el estado de activación se eligen del grupo que consiste de un estado de fosforilación, estado de ubiquitinación, estado de complej ación y sus combinaciones . 77. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el soporte sólido se eligen del grupo que consiste de vidrio, plástico, astillas (chips] espigas, filtros, perlas, papel, membrana, haces de fibras sus combinaciones. 78. El método de conformidad con la reivindicacijón-62, caracterizado porque los anticuerpos de .captura se restringen en el soporte sólido en una matriz direccionable . 79. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el ensayo en la etapa (c) comprende: (i) incubar el extracto celular con la pluralidad de series de dilución de anticuerpos de captura para formar una pluralidad de analitos capturados; (ii) incubar la pluralidad de analitos capturados con anticuerpos dependientes de estajdo de activación específicos para los analitos correspondientes, para formar una pluralidad ' de analitos capturados detectables; (iii) incubar la pluralidad de analitos capturados detectables con primeros y segundos miembros de iun par de amplificación de señal, para generar una señal i amplificada; y (iv) detectar la señal dé amplificación que se i genera del primer y segundo miembros de la par ele amplificación de señal. 80. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el ensayo en la etapa (c) comprende: (i) incubar el extracto celular con la pluralidad de series de dilución de anticuerpos de captura para formar ; una pluralidad de analitos capturados; (ii) incubar la. pluralidad de analitos capturados con anticuerpos de detección : que comprende una pluralidad de anticuerpos independientes de estado de activación y una pluralidad de anticuerpos dependientes de estado de activación específicos para los analitos correspondientes para formar una pluralidad de analitos capturados detectables, en donde los anticuerpos independientes de estado de activación se etiquetan¦ con una porción facilitadora, los anticuerpos dependientes de estado de activación se etiquetan con ' un primer miembro de un par de amplificación de señal, y la porción facilitadora genera un agente de oxidación qué canaliza con y reacciona ,con el primer miembro del par de amplificación de señal; (ii¿) incubar la pluralidad de analitos capturados detectables con un segundo miembro del par de amplificación de señal, para generar una señal amplificada; y (iv) detectar la señal de amplificada que se genera del primer y segundo miembros del 82, caracterizado porque el carcinoma lobular es carcinoma lobular invasivo o carcinoma lobular in situ. | 85. El método de conformidad con' la reivindicación 81, caracterizado porque las células comprende células |en circulación del tumor de mama. 86. El método de conformidad con la reivindicaci;on 85, caracterizado porque las células en circulación se aisl'an de una muestra por separación inmunomagnética . 87. El método de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque la muestra se eligen del grupo, que consiste de sangre entera, suero, plasma, fluido de lavado ductal, aspirado de pezón, linfa, aspirado de médula óseja orina, saliva, aspirado de aguja fina y sus combinaciones. 88. El método de conformidad con la reivindicaci!on 85, caracterizado porque las células en circulación se elig,en I del grupo que consiste de células en circulación de tumor, células endoteliales en circulación, células progenitoras endoteliales en circulación, células madre de cáncer, célul¡as de tumor diseminadas y sus combinaciones. 89. El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque las células se aislan del tejido de tumor. 90. El método de conformidad con la reivindicacilón 89, caracterizado porque el tejido de tumor es tejido |de tumor primario o tejido de tumor metastático. 81, caracterizado porque los anticuerpos de captura se restringen en el soporte sólido en una matriz direccionable .| 98. El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque el ensayo en la etapa (c) compr'encle analitos correspondientes para formar una pluralidad de analitos capturados detectables, en donde los anticuerpos independientes de estado de activación se etiquetan con una porción facilitadora, los anticuerpos dependientes de estado de activación se etiquetan con un primer miembro de un par de amplificación de señal, y la porción facilitadota genera un agente de oxidación que canaliza con y reacciona con Ll primer ' miembro del par de amplificación de señal; (ii incubar la pluralidad de analitos capturados detectables cjon un segundo miembro del par de amplificación de señal, para generar una señal amplificada; y (iv) detectar la señjal amplificada generada del primer . y segundo miembros de la par de amplificación de señal. 100. Una matriz que tiene superior intervalo dinámico, que comprende una pluralidad de series de dilución i de anticuerpos de captura restringidos en un soporte sólido, en donde los anticuerpos de captura en cada serie de dilución son específicos para uno o más analitos correspondientes a ¡un componente de una ruta de transducción de señal en un extracto celular. 101. La matriz de conformidad con la reivindicación 100, caracterizada porque la ruta de transducción de señjal esta involucrada en proliferación celular. 102. La matriz de conformidad con la reivindicación 101, caracterizada porque los. anticuerpos de captura receptor truncado y en donde la pluralidad de anticuerpos ¡de captura se restringe en un soporte sólido para formar una pluralidad de receptores truncados capturados; (d) incubar ¡la pluralidad de receptores truncados capturados con anticuerpos de detección específicos para los receptores truncados correspondientes, para formar una pluralidad de receptores truncados capturados detectables ; (e) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados detectables con primeros y segundos miembros de un par de amplificación de señal para generar una señal amplificada; y (f)' detectar una señal amplificada que se genera' del primer y segundo miembros del par de amplificación de señal. 106. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque el receptor truncado es p95ErbB2 107. El método de conformidad con1 la reivindicación 105, caracterizado porque el receptor de longitud íntegra es ErbB2 (HER-2) . 108. El método de conformidad con la reivindicaci¡on 105, caracterizado porque la pluralidad de perlas específicas para una región de enlace de dominio extracelular (ECD) comprende un par estreptavidina-biotina, en donde la estreptavidina se conecta a la perla y la biotina se conecjta a un anticuerpo. 109. El método de conformidad, con la reivindicaci n 108, caracterizado porque el anticuerpo es específico para la 116, caracterizado porque las células aisladas se incuban con un fármaco anticáncer antes de estimulo factor de crecimiento. 118. El método de conformidad con la reivindicación 117, caracterizado porque el fármaco anticáncer se eligen del grupo que consiste de un anticuerpo monoclonal, inhibidor de tirosina quinasa, agente quimioterapéutico, ' hormonal agenie terapéutico, agente radioterapéutico, vacuna y sis combinaciones. 119. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque un estado de activación de la pluralidad de receptores truncados capturados detectables es interrogado. J 120. El método de conformidad con la reivindicación I 119, caracterizado porque el estado de activación se eligen del grupo que consiste de un estado de fosforilación, estado ubiquitinación, estado de complej ación y sus combinaciones. 121.' El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque los anticuerpos de detección comprende un primer miembro de un par- de enlace. 122. El método de conformidad con la reivindicación 121, caracterizado porque el primer miembro del par de enlace es biotina. 123. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque el primer miembro del par de amplificación de señal comprende un segundo miembro del par de enlace. 124. El método de conformidad con la reivindicación 123, caracterizado porque el segundo miembro del par de enlace es estreptavidina . 125. El método de conformidad con la reivindicación 124, caracterizado porque el primer miembro de la par de amplificación de señal es una peroxidasa. 126. El método de conformidad con la reivindicación 125, caracterizado porque la peroxidasa es peroxidasa de rábano picante (HRP) . 127. El método de conformidad con la reivindicación 125, caracterizado porque el segundo miembro del par de amplificación de señal es un reactivo de tiramida. 128. El método de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado porque el reactivo de tiramida es biotiná-tiramida . 129. El método de conformidad con la reivindicación i 128, caracterizado porque la señal amplificada se genera por oxidación de peroxidasa de la biotina-tiramida, para producir una tiramida activada. 130. El método de conformidad con la reivindicación 129, caracterizado porque la tiramida activada se detectza directamente. 131. El método de conformidad con la reivindicación 129, caracterizado porque la tiramida activada se detecta ante la adición de un reactivo de detección de señal. 132. El método de conformidad con reivindicación 131, caracterizado porque el reactivo para detección de señal es un fluoróforo etiquetado : con estreptavidina . 133. El método de conformidad con la reivindicación 131, caracterizado porque el reactivo para detección de señal es una combinación de peroxidasa etiquetada con estreptavidina y un reactivo cromogénico. 134. El método de conformidad con , la reivindicación 133, caracterizado porque el reactivo cromogénico es 3, 3' , 5, 5' -tetrametilbenzidina (TMB) . 135. Un método para detectar la presencia dé un receptor truncado, el método se caracteriza porque comprende: (a) incubar un extracto celular con una pluralidad de perlas especificas para una región de enlace de dominio extracelular (ECD) de un receptor de longitud integra; (b) retirar jla pluralidad de perlas del extracto celular, de esta manera retirando el receptor de longitud integra para formar un extracto celular carente del - receptor de longitud integra; (c) incubar el extracto celular carente del receptor de longitud integra con una pluralidad de anticuerpos de captura, en donde la pluralidad de anticuerpos de captura jes especifica para una región de enlace de dominio intracelul'ar (ICD) del receptor truncado y en donde la pluralidad de anticuerpos de captura se restringe en un soporte sólido para formar una pluralidad de¦ receptores truncados capturados ; (d) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados! con anticuerpos de detección que comprenden una pluralidad de anticuerpos independientes de estados de activación y; u: a pluralidad de anticuerpos dependientes de estado | de activación específicos para los receptores : truncados correspondientes para formar una pluralidad de receptores truncados capturados detectables, en donde los anticuerpos independientes de estado de activación se etiquetan' con¡ una porción facilitadora, los anticuerpos dependientes de estado de activación se etiquetan con un primer miembro de un: par de amplificación de señal, y la porción facilitadora genera un agente oxidante que. canaliza con y reacciona con el primer miembro del par de amplificación de señal; (e) incubai: la pluralidad de receptores truncados capturados detectables; con un segundo miembro del par de amplificación de señal, ipara generar una señal amplificada; y (f) detectar la1 señal amplificada generada del primer y segundo miembros del' par de amplificación de señal.. 136. El método de conformidad [ con la reivindicación 135, caracterizado porque el receptor truncado es p95ErbB2. . ¦ 137. El método de conformidad con . la reivindicación 135, caracterizado porque el receptor de longitud integra es ErbB2 (HER-2) . 138. El método de conformidad con la reivindicación 135, caracterizado porque la pluralidad de perlas especificas para una región de enlace de dominio extracelular (ECD) comprende un par estreptavidina-biotina, en donde la estreptavidina se conecta a la perla y la biotina se conecta a un anticuerpo. 139. El método de . conformidad con la I reivindicación 138, caracterizado porque el anticuerpo es especifico para una región de enlace ECD del receptor de longitud integra. 140. El método de conformidad con la reivindicación 135, caracterizado porque el extracto celular se produce por lisis de las células en circulación de un tumor de mama . j 141. El método de conformidad con la reivindicación 140, caracterizado porque las células en circulación se aislan de una muestra por separación inmunomagnética . 142. El método de conformidad con lia I ¦ reivindicación 141, caracterizado porque la muestra se elige del grupo que consiste de sangre entera, suero, plasma, fluido de lavado ductal, aspirado de pezón, linfa, aspirado de médula ósea, orina, saliva, aspirado de agujas finas y sus combinaciones . 143. El método de conformidad con la reivindicación 135, caracterizado porque el extracto celular se produce por lisis de células aisladas del tejido de tumor. 144. El método de ¦ conformidad con lIa reivindicación 143, caracterizado porque el tejido de tumor es tejido de tumor primario o tejido de tumor metastásico. 145. El método de conformidad con : la reivindicación 143, caracterizado porque las células se aislan de tejido de tumor como una muestra de aspirado de agujas finas.' 146. El método de conformidad con la reivindicación 141 ó 143, caracterizado porqué las células aisladas se estimulan in vitro con factores de crecimiento. 147. El método de conformidad con jla reivindicación 146, caracterizado porque las células aisladas se incuban con un fármaco anticáncer antes de estimulo de factor de crecimiento. 148. El método de conformidad con la reivindicación 147, caracterizado porque el fármaco a ticáncer se elige del grupo que consiste de un anticuerpo monoclonal, inhibidor de tirosina quinasa, agente quimioterapéutico, agente terapéutico hormonal, agenjte radioterapéutico, vacuna y sus combinaciones.. 149. El método de conformidad con ¡la reivindicación 135, caracterizado porque los anticuerpos independientes de estado de activación se etiquetan directamente con la porción facilitadora. 150. El método de conformidad con la reivindicación 135, caracterizado porque los anticuerpos independientes de estado de activación se etiquetan con la porción facilitadora mediante hibridización entre In oligonucleótido conjugado a los anticuerpos independientes de estado de activación y .un oligonucleótido complementario conjugado a la porción facilitadora. ' ! 151. El método de conformidad con ; la reivindicación 135, caracterizado porque los anticuerpos dependientes de estado de activación se etiquetan directamente con el primer miembro del par de amplificación de señal. 152. El método de conformidad con reivindicación 135, caracterizado porque los anticuerpos dependientes de estado de activación se etiquetan con el primer miembro del par de amplificación de señal mediante enlace entre un primer miembro de un par de enlace conjugado a los anticuerpos dependientes de estado de activación y un segundo miembro del par de enlace conjugado al primer miembro del par de amplificación de señal. 153. El método de conformidad con la reivindicación 152, caracterizado porque el primer miembro del par de enlace es biotina. 154. El método de conformidad con reivindicación 152, caracterizado porque el segundo miembro del par de enlace es estreptavidina . 155. El método de conformidad con la i I reivindicación 135, '' caracterizado porque la porción facilitadora es glucosa oxidasa. 156. El método de conformidad con la reivindicación 155, caracterizado porque la glucosa oxidasa j y los anticuerpos independientes de estado de activación se conjugan a una molécula de dextrano activado con sulfhidrilo. 157. El método de conformidad con 1 la reivindicación 156, caracterizado porque la molécula de dextrano activado con sulfhidrilo tiene un peso molecular e 500kDa. . 158. El método de conformidad con la reivindicación 155, caracterizado porque el agente de oxidación es peróxido de hidrógeno (H2O2) '. 159. El método de conformidad con reivindicación 158, caracterizado porque el primer miembro del par de amplificación de señal es una peroxidasa. 160. El método de conformidad con la reivindicación 159, caracterizado porque la peroxidasa es peroxidasa de rábano picante (HRP) . 161. El método de conformidad con la reivindicación 159, caracterizado porque el segundo miembro del par de amplificación de señal es un reactivo de tiramida . 162. El método de conformidad con la reivindicación 161, caracterizado porque el reactivo de tiramida es biotina-tiramida . 163. El método de conformidad con i ¡La reivindicación 162, caracterizado porque la señal amplificada se genera por oxidación de peroxidasa de la biotina-tiramida para producir una tiramida activada. 164. El método de conformidad con la reivindicación 163, caracterizado porque la tiramida activada se detecta directamente. 165. El método de conformidad con la reivindicación 163, caracterizado porque la tiramida activada se detecta ante la adición de un reactivo de detección de señal. 166. El método de conformidad. con jla reivindicación 165, caracterizado porque el reactivo ¡de detección de señal es un fluoróforo etiquetado con estreptavidina. 167. El método de conformidad con 1 la reivindicación 165, caracterizado porque el reactivo para detección de señal es una combinación de peroxidajsa etiquetada con estreptavidina y un reactivo cromogénico. 168. El método de conformidad con ]la I caracterizado porque el reactivo '-tetrametilbenzidina (T B) . I