KR101851425B1 - 치료 효능 결정을 위한 신호 경로 단백질의 프로파일링 - Google Patents

치료 효능 결정을 위한 신호 경로 단백질의 프로파일링 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종양 세포와 같은 세포에서 PI3K 신호전달 경로의 구성요소들의 활성화 상태를 검출, 측정 및 정량하고, 그와 관련하여 항암 치료요법을 선택하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 이량체화된 수용체 타이로신 키나아제 (RTK) 쌍의 한 구성원 또는 PI3K p110 서브유닛에 특이적인 제 1 활성화 상태-독립적 항체가 촉진성 부분 (예를 들어, 글루코오스 옥시다아제) 및 신호 증폭 부분 (예를 들어, HRP) 로 표지된 RTK 쌍의 여타 구성원 또는 PI3K p85 또는 PI3K p110 서브유닛에 특이적인 제 2 활성화 상태-독립적 또는 의존적 항체로 표지되어 있는 집합적 효소 강화 반응성-면역검정 (CEER) 을 수반한다.

Description

치료 효능 결정을 위한 신호 경로 단백질의 프로파일링 {PROFILING OF SIGNAL PATHWAY PROTEINS TO DETERMINE THERAPEUTIC EFFICACY}
관련 출원의 상호참조
본 출원은, 그 어느 목적으로든 그의 전문이 본원에 참고문헌으로 포함되는, 2011 년 9 월 2 일에 출원한 미국 가출원 61/530,621, 2011 년 10 월 28 일에 출원한 미국 가출원 61/553,124, 및 2011 년 11 월 21 일에 출원한 미국 가출원 61/562,338 에 대해 우선권을 청구한다.
세포 생장 및 생존을 매개하는 신호 전달 경로는, 종양생성이 종종 비정상적인 신호 전달 경로를 수반하기 때문에, 암 치료의 표적이 되곤 한다. 신호전달 비정상은 암세포에 생장 잠재성 증대 및 DNA 손상제로 인해 유도되는 아폽토시스를 회피하는 능력을 제공하게 된다.
한가지 널리 특징분석된 신호 전달 경로는 포스파티딜이노시톨 3-키나아제 (PI3K) 경로인데, 이는 다양한 세포 프로세스, 예를 들어 악성 형질전환, 성장 인자 신호전달, 염증 및 면역성에서 중요하다. 효소가 본래 바이러스 발암단백질 및 포스파티딜이노시톨 (PI) 및 이노시톨 고리의 3'-히드록실에서의 그의 포스포릴화된 유도체를 포스포릴화하는 성장 인자 수용체 타이로신 키나아제와 연계된 활성으로 밝혀졌다. 포스포이노시타이드 3-키나아제 (PI3K) 는 이노시톨 고리의 3-히드록실 잔기에서 지질을 포스포릴화하는 지질 키나아제이다. PI3-키나아제에 의해 생성되는 3-포스포릴화된 인지질 (PIP3) 이 지질 결합 도메인이 있는 2 차 메신저 모집 키나아제, 예컨대 AKT 및 포스포이노시타이드-의존적 키나아제-1 (PDK1) 로서 작용한다.
클래스 I PI3 키나아제는 다음과 같은 2 개의 서브유닛으로 이루어진 이종이량체이다: 1 개의 110 kDa 촉매 서브유닛 (p110) 및 85 kDa 조절 서브유닛 (p85). 조절 서브유닛은 SH2 도메인을 포함하며, 타이로신 키나아제 활성을 가진 성장 인자 수용체에 의해 포스포릴화된 타이로신 잔기 또는 발암유전자 생성물에 결합함으로써, p110 촉매 서브유닛의 PI3K 활성을 유도하며, 후속하여 그의 지질 기질을 포스포릴화한다.
클래스 I PI3 키나아제는 싸이토카인, 인테그린, 성장 인자 및 면역수용체의 하류방향의 중요한 신호 전달 이벤트에 수반되는데, 이는 그 경로의 제어가 세포 증식 및 발암 조절과 같은 중요한 치료 효과를 유도할 수 있음을 시사한다. 클래스 I PI3 키나아제의 활성화는 성장 인자 또는 리간드가 그의 인지 수용체 타이로신 키나아제 (RTK) 에 결합할 때 개시된다. 그러한 수용체에는 인간 상피 성장 인자 수용체 패밀리의 구성원들 (HER, EGFR 또는 ErbB), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 수용체, 인슐린 및 인슐린형 성장 인자 1 (IGF-1) 수용체가 포함된다. 후속하는 RTK 이량체화 및 포스포릴화는 PI3K 이종이량체로 하여금 활성화된 RTK 및/또는 어댑터 단백질에 직접 결합할 수 있게 한다. 활성화된 PI3K 는 포스파티딜이노시톨-4,5-비포스페이트 (PI(4,5)P2 또는 PIP2) 의 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리포스페이트 (P(3,4,5)P3 또는 PIP3) 로의 포스포릴화를 촉매한다. PIP3 는 PI3K 경로의 중심적인 효과기인 AKT 의 포스포릴화를 촉진한다. AKT 는 신호를 하류방향 기질의 호스트에 전달하는데, 이는 성장, 대사, 증식 및 생존을 포함하는 다양한 중요 세포 기능을 제어한다.
PI3K 경로의 부적합한 공동-가담은 일반적으로 인간 암에서 나타난다. PI3K 경로는 종종 유방암 뿐만 아니라 여타 종양 유형에서도 과활성화되어 있다. 유방암의 70% 에는 PI3K 경로의 이상조절이 있는 것으로 나타났다 (Lopez-Knowles et al. Int. J. Cancer, 126, 1121-1131 (2010)). PIK3CA 유전자 (PI3K p110 서브유닛을 인코딩함) 에서의 돌연변이가 유방, 대장 및 자궁내막 종양 및 교아세포종에서 공통적으로 나타난다는 것이 이미 확립되어 있다. 추가로, 많은 암에 있어서, RTK 가 종종 돌연변이화되거나, 증폭되거나 또는 과발현되어, 일탈적인 PI3K 활성화를 유발한다. 취합하면, 그러한 발견사실들은 PI3K 경로의 구성요소들이 암 치료요법을 위한 매력적인 표적이 될 것임을 알려준다.
현재, 여러 PI3K 경로 저해제들이 전임상 연구에서 연구 중이며, 그 결과는 유망한 것으로 보인다 (Markman et al, Annls. Oncol. 21(4), 683-691 (2010)). 암 세포 증식 억제가 PI3K 저해제를 수용한 일부 환자에서 나타났다 (Courtney et al. J. Clin. Oncol. 28(6), 1075-1083 (2010)). 그러한 PI3K 치료요법이 암 치료에 있어서 성공을 증명했지만 (Baselga et al, J. Clin. Oncol, 28: 15s, abstract 3003, (2010); Burris et al, J. Clin. Oncol, 28: 15s, abstract 3005, (2010)), 치료한 모든 대상체가 응답한다거나 잘 응답한다는 것은 아니라는 점을 인지하는 것이 중요하다. 표적으로 삼는 저해제에 잘 응답할 공산이 큰 것을 예측하는 방법이 필요하다. 불행하게도, PI3K 체세포 돌연변이의 존재여부는 치료 응답성을 적절히 예측해 주지 못한다. 따라서, PI3K 저해제 및 PI3K 저해제-병용 요법에 대한 임상적 반응성 (clinical sensitivity) 을 결정하기 위해 이용될 수 있는 주요 신호전달 경로를 알아낼 예측적인 바이오마커 검정이 필요하다. 본 발명은 그러한 필요 및 여타 필요를 만족시킨다.
발명의 개요
PI3K 경로는, 유방, 폐, 위, 대장 및 췌장암과 같은 다수의 암에 연루되어 있으며, 그의 저해제는 암, 심지어 기존 항암 요법에 더이상 응답하지 않는 암에 대해서도 유용한 치료제이다. PI3K 저해제는 개발 중이며, 일부 환자 연구에서 약간의 유망성을 나타낸 바 있다. 본 발명은 암 또는 고형 종양이 있는 환자에서 PI3K 경로를 모니터링하는 검정 방법을 제공한다.
이와 같이, 본 발명은 활성화된 PI3K 경로 구성요소들 및/또는 인근 신호전달 경로와 연계된 여타 구성요소들 및/또는 단백질을 검출 및 정량하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 또한 기존 치료요법에서는 직접 표적으로 삼지 않은 연계되어 있거나 또는 인근에 있는 경로의 활성화 및/또는 발현을 분로 (shunt) 시키는 것과 같은, 종양 적응을 평가하기에 유용하다. 상기 방법은PI3K 저해제 또는 PI3K 저해제 병용 요법으로 인한 환자의 임상적 유익을 예측하기 위해 이용된다. 본 발명의 실시로 알게 되는 정보는 암 진단, 예측 및 암 치료 또는 투약 방식의 고안에서 유용할 수 있다.
한 국면에서, 본 발명은, 이에 제한되지 않으나, HER1/HER2 이량체, HER1/HER3 이량체, HER2/HER3 이량체, HER2/HER2 이량체, HER2/HER4 이량체, p95HER2/HER3 이량체, p95HER2/HER2 이량체 등을 포함하는 수용체 타이로신 키나아제 (예를 들어, 이량체 쌍) 의 단독- 또는 이종이량체화를 검출 및/또는 정량하기 위한 검정법을 제공한다.
특정 국면에서, 검정은 3 가지 항체를 포함한다:
(1) 이량체쌍의 한 구성원에 특이적인 포획 항체;
(2) 이량체쌍의 제 1 구성원에 특이적인 제 1 검출 항체, 여기서 제 1 검출 항체는 포획 항체와 상이한 도메인에 대해 특이적임; 및
(3) 이량체 쌍의 제 2 구성원에 특이적인 제 2 검출 항체.
특별한 구현예에서, 수용체 타이로신 키나아제의 이량체화 검출 및/또는 정량을 위한 근접 검정법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 세포 추출물을 포획 항체의 하나 또는 여러개의 연속 희석물과 인큐베이션하여 여러 포획 분석물을 형성하는 단계;
(ii) 여러 포획 분석물을 각각 분석물의 이량체화된 쌍의 제 1 구성원 및 제 2 구성원에 특이적인 제 1 의 또는 여러개의 제 1 활성화 상태-독립적 항체 또는 제 2 의 또는 여러개의 제 2 활성화 상태-독립적 항체를 함유하는 검출 항체와 인큐베이션하여, 여러개의 검출가능한 포획된 이량체화 분석물을 형성하는 단계,
여기서 제 1 검출 항체를 촉진성 부분으로 표지하고, 제 2 검출 항체를 신호 증폭쌍의 제 1 구성원으로 표지하고, 촉진성 부분은 신호 증폭쌍의 제 1 구성원에 채널링하여 반응하는 산화제를 생성함;
(iii) 여러 검출가능한 포획 이량체화 분석물을 신호 증폭쌍의 제 2 구성원과 인큐베이션하여 증폭된 신호를 생성하는 단계; 및
(iv) 신호 증폭쌍의 제 1 및 제 2 구성원으로부터 생성된 증폭된 신호를 검출하는 단계.
바람직한 국면에서, 증폭된 신호의 양은 이량체화된 수용체 타이로신 키나아제의 양과 상관관계가 있다.
포획 항체 및 검출 항체는 바람직하게는 분석물 결합과 관련하여 이들 사이의 경쟁을 최소화하도록 (즉, 포획 및 검출 항체의 두가지 모두가 동시에 그의 해당하는 신호 전달 분자에 결합할 수 있음) 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 유방, 대장, 위, 폐 또는 췌장암과 같은 고형 종양이 발생할 위험이 있거나, 그것을 갖고 있을 것으로 추정되거나 또는 그것을 갖고 있는 것으로 진단된 환자에서 하나 이상의 발암성 RTK (예를 들어, HER1, HER2, HER3, p95HER2, cMET 및 IGF-1R) 의 RTK 활성화 (예를 들어, 포스포릴화) 상태를 결정하기 위해 이용된다.
한 국면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 암을 갖고 있거나 또는 암을 가진 것으로 추정되는 대상체의 치료법을 선택하는 방법을 제공한다:
(a) 둘 이상의 수용체 타이로신 키나아제 (RTK) 의 이량체화 측정 단계, 여기서 측정은 하기 단계를 포함함: (i) 세포 추출물을 포획 항체의 하나 또는 여러개의 연속 희석물과 인큐베이션하여 여러 포획 분석물을 형성하는 단계; (ii) 상기 여러 포획 분석물을, 분석물의 이량체화된 쌍의 제 1 구성원 및 제 2 구성원에 각각 특이적인 제 1 의 또는 여러개의 제 1 활성화 상태-독립적 항체 및 제 2 의 또는 여러개의 제 2 활성화 상태-독립적 항체를 함유하는 검출 항체와 인큐베이션하여 여러 검출가능한 포획된 이량체화 분석물 형성하는 단계, 여기서 제 1 활성화 상태-독립적 항체는 촉진성 부분으로 표지하고, 제 2 활성화 상태-독립적 항체는 신호 증폭쌍의 제 1 구성원으로 표지하고, 촉진성 부분이 신호 증폭쌍의 제 1 구성원으로 채널링하여 반응하는 산화제를 생성함; (iii) 여러 검출가능한 포획 이량체화 분석물을 신호 증폭쌍의 제 2 구성원과 인큐베이션하여 증폭된 신호를 생성하는 단계; 및 (iv) 신호 증폭쌍의 제 1 및 제 2 구성원으로부터 생성된 증폭 신호를 검출하는 단계; 및
(b) 둘 이상의 RTK 의 이량체화를 동일한 2 개의 RTK 의 기준 이량체화 프로파일과 비교하여 항암제를 선택하는 단계, 여기서 기준 이량체화 프로파일은 항암제의 부재 하에 생성됨.
일부 구현예에서, 방법은 추가로 상기 2 개 이상의 RTK 에 대해 생성된 표준 곡선에 대한 2 개 이상의 RTK 의 이량체화 수준의 보정 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 추출물을 항암제 투여 후 암이 있는 대상체로부터 분리한다. 일부 구현예에서, 세포 추출물을 항암제와 접촉시킨다. 일부 구현예에서, 항암제를 PI3K 조절 화합물, RTK 조절 화합물, 또는 이들의 조합으로 이루어진 것에서 선택한다.
일부 구현예에서, 세포 추출물을 유방, 폐, 췌장, 대장 또는 위암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암이 있거나 또는 있을 것으로 추정되는 대상체로부터 분리한다.
일부 구현예에서, 둘 이상의 RTK 가 HER1/HER2 이량체, HER1/HER3 이량체, HER2/HER3 이량체, HER2/HER2 이량체, HER2/HER4 이량체, p95HER2/HER3 이량체, 및 p95HER2/HER2 이량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원이다.
일부 구현예에서, 제 1 활성화 상태-독립적 항체가 촉진성 부분으로 직접 표지된다. 일부 구현예에서, 촉진성 부분은 글루코오스 옥시다아제이다. 일부 구현예에서, 글루코오스 옥시다아제 및 활성화 상태-독립적 항체는 술프히드릴-활성화 덱스트란 분자에 컨쥬게이션되어 있다. 일부 구현예에서, 술프히드릴-활성화 덱스트란 분자의 분자량은 약 500kDa 이다.
일부 구현예에서, 결합쌍의 제 1 구성원이 바이오틴이고/이거나 결합쌍의 제 2 구성원이 스트렙타비딘이다.
일부 구현예에서, 제 2 활성화 상태-독립적 항체가 신호 증폭쌍의 제 1 구성원으로 직접 표지된다.
일부 구현예에서, 제 2 활성화 상태-독립적 항체가 활성화 상태-독립적 항체에 컨쥬게이션된 결합쌍의 제 1 구성원 및 신호 증폭쌍의 제 1 구성원에 컨쥬게이션된 결합쌍의 제 2 구성원 사이의 결합을 통해 신호 증폭쌍의 제 1 구성원으로 표지된다.
일부 구현예에서, 포획 항체가 유리, 플라스틱, 칩, 핀, 필터, 비드, 종이, 멤브레인, 섬유다발 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고체 담지체 상에 있다. 일부 구현예에서, 포획 항체는 고려가능한 어레이에서 고체 담지체 상에 구속되어 있다.
일부 구현예에서, 신호 증폭쌍의 제 1 구성원이 퍼옥시드이다. 일부 구현예에서, 퍼옥시드는 고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 이다. 일부 구현예에서, 신호 증폭쌍의 제 2 구성원이 티라마이드 시약이다. 일부 구현예에서, 티라마이드 시약이 바이오틴-티라마이드이다.
일부 구현예에서, 증폭된 신호가 바이오틴-티라마이드의 퍼옥시다아제 산화에 의해 생성되어 활성화된 티라마이드를 제공한다.
일부 구현예에서, 활성화된 티라마이드가 직접 검출된다. 일부 구현예에서, 활성화된 티라마이드가 신호-검출제의 첨가시 검출된다.
일부 구현예에서, 신호-검출제는 스트렙타비딘-표지 형광단이다. 일부 구현예에서, 신호-검출제가 스트렙타비딘-표지된 퍼옥시다아제 및 발색 시약의 조합물이다. 일부 구현예에서, 발색 시약이 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 발암유전자 단백질을 발현하는 것으로 이미 결정된 대상체에서 실시되어, 치료요법을 최적화하고, 독성을 감소시키고, 치료요법 처치의 효능을 모니터링하고/하거나 치료요법에 대한 적응성 비-응답성을 검출해 낸다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 유방, 대장, 위, 폐 또는 췌장암과 같은 고형 종양 암이 있는 것으로 추정되거나 또는 그것이 있는 것으로 진단된 대상체에서 RTK 활성화 또는 포스포릴화 상태를 측정하기 위해 이용된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 유방, 대장, 위, 폐 또는 췌장암과 같은 고형 종양 암이 있는 것으로 추정되거나 또는 그것이 있는 것으로 진단된 대상체에서 RTK 이량체화 상태를 측정하기 위해 이용된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 항암 치료요법시 재발한 대상체에서의 RTK 이량체화 및/또는 활성화 상태 측정에 이용되며, 종양 세포가 기존 항암 치료요법에 적응되었는지 여부 또는 대상체가 PI3K 저해제 또는 PI3K 저해제 병용요법을 받아야 하는지 여부를 결정하는데 이용된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 항암 치료요법시 재발한 대상체에서의 RTK 이량체화 및/또는 활성화 상태 측정에 이용되며, 종양 세포가 기존 항암 치료요법에 적응되었는지 여부 또는 대상체가 PI3K 저해제 또는 PI3K 저해제 병용요법을 받아야 하는지 여부를 결정하는데 이용된다.
또다른 국면에서, 본 발명은 PI3K 복합체의 양 및 PI3K 복합체의 활성화량 및/또는 포스포릴화 양을 결정 및/또는 정량 (예를 들어, 측정) 하는 방법을 제공한다. PI3K 복합체는 하기를 함유한다: i) 이량체화된 수용체 타이로신 키나아제 쌍; ii) PI3K p85 서브유닛 및 PI3K p110 (예를 들어, α 또는 β 서브유닛).
특정 국면에서, 검정은 3 가지 항체를 포함한다:
(1) PI3K p85 또는 PI3K p110 서브유닛에 특이적인 포획 항체;
(2) 이량체쌍의 제 1 구성원, 또는 PI3K 서브유닛에 특이적인 제 1 검출 항체, 여기서 제 1 검출 항체는 포획 항체와 상이한 도메인에 특이적이고, PI3K 서브유닛은 활성화되어 있을 수 있음; 및
(3) 이량체 쌍의 제 2 구성원 또는 PI3K 서브유닛에 특이적인 제 2 검출 항체.
한 국면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 암을 갖고 있거나 또는 암을 가진 것으로 추정되는 대상체의 치료법 선택 방법을 제공한다:
(a) PI3K 복합체 활성화 수준을 측정하는 단계, 여기서 상기 PI3K 복합체는 하기를 포함함: i) 둘 이상의 수용체 타이로신 키나아제 (RTK) 의 이량체화; ii) PI3K p85 서브유닛 및 PI3K p110 서브유닛, 상기 측정은 하기 단계를 포함함: (i) 세포 추출물을 포획 항체의 하나 또는 여러개의 연속 희석물과 인큐베이션하여 여러 포획 분석물을 형성하는 단계; (ii) 여러 포획 분석물을, a) 이량체화된 수용체 타이로신 키나아제 쌍의 한 구성원에 특이적인 제 1 의 또는 여러개의 제 1 활성화 상태-독립적 항체 또는 b) PI3K p110 서브유닛을 함유하는 제 1 검출 항체; 및 a) 이량체화된 수용체 타이로신 키나아제 쌍의 한 구성원, PI3K p85 또는 PI3K p110 서브유닛에 특이적인 제 2 의 또는 여러개의 제 2 활성화 상태-독립적 항체 또는 b)PI3K p85 서브유닛 및/또는 PI3K p110 서브유닛에 특이적인 활성화 상태-의존적 항체를 함유하는 제 2 검출 항체와 인큐베이션하여, 여러개의 검출가능한 포획된 이량체화되고 복합체화된 분석물을 형성하는 단계, 여기서 제 1 검출 항체는 촉진성 부분으로 표지되고, 제 2 검출 항체는 신호 증폭쌍의 제 1 구성원으로 표지되며, 촉진성 부분은 신호 증폭쌍의 제 1 구성원에 채널링하여 반응하는 산화제를 생성함; 여러 검출가능한 포획 이량체화 분석물을 신호 증폭쌍의 제 2 구성원과 인큐베이션하여 증폭된 신호를 생성하는 단계; 및 신호 증폭쌍의 제 1 및 제 2 구성원으로부터 생성된 증폭된 신호를 검출하는 단계;
(b) PI3K 복합체 활성화 수준을 기준 PI3K 복합체 활성화 프로파일과 비교하여 항암제를 선택하는 단계, 여기서 기준 이량체화 프로파일이 항암제의 부재 하에 생성됨.
일부 구현예에서, PI3K 복합체의 수준이 하기를 포함하는 상기 PI3K 복합체에 대해 생성된 표준 곡선에 대해 보정된다: i) 둘 이상의 수용체 타이로신 키나아제 (RTK) 의 이량체화; ii) PI3K p85 서브유닛 및 PI3K p110 서브유닛.
일부 구현예에서, 세포 추출물이 항암제 투여 후 암이 있는 대상체로부터 분리된다. 일부 구현예에서, 세포 추출물을 항암제와 접촉시킨다. 일부 구현예에서, 항암제는 PI3K 조절 화합물, RTK 조절 화합물, 또는 이들의 조합으로 이루어진 것으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 둘 이상의 RTK 가 HER1/HER2 이량체, HER1/HER3 이량체, HER2/HER3 이량체, HER2/HER2 이량체, HER2/HER4 이량체, p95HER2/HER3 이량체 및 p95HER2/HER2 이량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원이다.
일부 구현예에서, 제 1 활성화 상태-독립적 항체가 촉진성 부분으로 직접 표지된다. 일부 구현예에서, 촉진성 부분이 글루코오스 옥시다아제이다. 일부 구현예에서, 글루코오스 옥시다아제 및 활성화 상태-독립적 항체가 술프히드릴-활성화 덱스트란 분자에 컨쥬게이션되어 있다. 일부 구현예에서, 술프히드릴-활성화 분자의 분자량이 약 500kDa 이다.
일부 구현예에서, 결합쌍의 제 1 구성원이 바이오틴이고/이거나 결합쌍의 제 2 구성원이 스트렙타비딘이다.
일부 구현예에서, 제 2 활성화 상태-독립적 항체가 신호 증폭쌍의 제 1 구성원으로 직접 표지된다.
일부 구현예에서, 제 2 활성화 상태-독립적 항체가 활성화 상태-독립적 항체에 컨쥬게이션되어 있는 결합쌍의 제 1 구성원 및 신호 증폭쌍의 제 1 구성원에 컨쥬게이션되어 있는 결합쌍의 제 2 구성원 사이의 결합을 통해 신호 증폭쌍의 제 1 구성원으로 표지되어 있다.
일부 구현예에서, 포획 항체는 유리, 플라스틱, 칩, 핀, 필터, 비드, 종이, 멤브레인, 섬유다발 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고체 담지체 상에 있다. 일부 구현예에서, 포획 항체는 고려가능한 어레이에서 고체 담지체 상에 구속되어 있다.
일부 구현예에서, 신호 증폭쌍의 제 1 구성원이 퍼옥시다아제이다. 일부 구현예에서, 퍼옥시다아제가 고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 이다. 일부 구현예에서, 신호 증폭쌍의 제 2 구성원이 티라마이드 시약이다. 일부 구현예에서, 티라마이드 시약이 바이오틴-티라마이드이다.
일부 구현예에서, 증폭된 신호는 바이오틴-티라마이드의 퍼옥시다아제 산화에 의해 생성되어 활성화된 티라마이드를 제공한다.
일부 구현예에서, 활성화된 티라마이드는 직접 검출된다. 일부 구현예에서, 활성화된 티라마이드는 신호-검출제의 첨가시 검출된다.
일부 구현예에서, 신호-검출제는 스트렙타비딘-표지 형광단이다. 일부 구현예에서, 신호-검출제가 스트렙타비딘-표지된 퍼옥시다아제 및 발색 시약의 조합물이다. 일부 구현예에서, 발색 시약이 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 이다.
한 국면에서, 본 발명은 대상체가 PI3K 저해제 또는 PI3K 저해제 병용요법을 받아야 하는지 여부를 결정하기 위해 이용되는 방법을 제공한다.
또다른, 국면에서, 본 발명은 항암 치료요법 중 재발된 대상체가 PI3K 저해제 또는 PI3K 저해제 병용 요법을 받아야 하는지 여부를 결정하는데 이용되는 방법을 제공한다.
또다른 국면에서, 본 발명은 하나 이상의 발암유전자 단백질을 발현하는 것으로 이미 결정된 대상체에서 실시되어, 치료요법을 최적화하고, 독성을 감소시키고, 치료요법 처치의 효능을 모니터링하고/하거나 치료요법에 대한 적응성 비-응답성을 검출해 내는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 유방, 대장, 위, 폐 또는 췌장암과 같은 고형 종양 암이 발생할 것으로 추정되거나, 암을 갖고 있거나 또는 그것이 있는 것으로 진단된 대상체에서 PI3K 활성화 또는 포스포릴화 상태를 측정하기 위해 이용된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 유방, 대장, 위, 폐 또는 췌장암과 같은 고형 종양 암이 발생할 위험이 있거나, 암을 갖고 있거나 또는 그것이 있는 것으로 것으로 진단된 대상체에서 PI3K 복합체화 상태를 측정하기 위해 이용된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 항암 치료요법시 재발한 대상체에서의 PI3K 복합체화 및/또는 활성화 상태 측정에 이용되며, 종양 세포가 기존 항암 치료요법에 적응되었는지 여부 또는 대상체가 PI3K 저해제 또는 PI3K 저해제 병용요법을 받아야 하는지 여부를 결정하는데 이용된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 항암 치료요법시 재발한 대상체에서의 PI3K 복합체화 및/또는 활성화 상태 측정에 이용되며, 종양 세포가 기존 항암 치료요법에 적응되었는지 여부 또는 대상체가 RTK 저해제 또는 RTK 저해제 병용요법을 받아야 하는지 여부를 결정하는데 이용된다.
본 발명의 여타 목적, 특징 및 장점은 하기 발명의 상세한 설명 및 도면으로부터 당업자에게 자명할 것이다.
도 1A-C 는 수용체 타이로신 키나아제의 이량체화 검출을 위한 검정의 한 구현예를 보여준다.
도 2 는 본원에 기재된 방법 및 검정으로 검출가능한 PI3K 복합체 210 의 한 구현예를 보여준다.
도 3 은 본원에 기재된 방법 및 검정으로 검출가능한 PI3K 복합체 310 의 또다른 구현예를 보여준다.
도 4A 는 본원에 기재된 방법 및 검정으로 검출가능한 PI3K 복합체의 구현예를 보여준다. 도 4B 는 본원에 기재된 방법 및 검정으로 검출가능한 PI3K 복합체의 한 구현예를 보여준다. 도 4C 는 본원에 기재된 방법 및 검정으로 검출가능한 PI3K 복합체들의 검출을 설명한다. PI3K 복합체들은 비-처리 세포와 비교하여 헤레굴린 (HRG) 으로 처리한 T47D 세포 (인간 유방의 관 상피내암 세포주) 에서 검출된다.
도 5A 는 본원에 기재된 방법 및 검정으로 검출가능한 PI3K 복합체의 또다른 구현예를 보여준다. 도 5B 는 본원에 기재된 방법 및 검정으로 검출가능한 PI3K 복합체의 한 구현예를 보여준다.
도 6 은 유방암 환자의 경로 프로파일링 분석에서의 phospho-AKT 및 phospho-PI3K 의 비교를 설명한다.
도 7 은 phospho-PI3K 의 존재함은 유방암이 있는 환자 유래의 60 개의 FNA 시료 중의 phospho-AKT 와 상관관계가 있음을 설명한다. 활성화된 AKT 는 PI3KCA 돌연변이가 없는 환자에서 검출된다.
도 8 은 AKT 및 PI3K 사이의 상관관계의 한 구현예를 설명한다. 그래프는 활성화된 AKT (pAKT) 가 PI3KCA 체세포 돌연변이의 존재함과 상관관계가 없음을 보여준다.
도 9 는 유방암 환자 유래의 60 개의 FNA 시료에서 phospho-HER3 및 phospho-PI3K 의 존재성 사이에 서로 높은 상관관계가 있음을 설명한다. 검정에 사용된 PI3K 에 대한 컷오프 값과 무관하게, 시료에서 phospho-HER3 및 phospho-PI3K 사이에는 상관관계가 있다.
도 10 은 유방암 환자에서 phospho-HER3 및 phospho-AKT 의 서로간 존재여부에서의 상관관계를 설명한다.
도 11 은 활성화된 PI3K 가 활성화된 AKT 및 phospho-HER3 와 연관되어 있음을 보여준다. 도 11 은 또한 활성화된 AKT 가 PI3K 활성화 부재 하의 phospho-HER3 와 상관관계가 있음을 보여준다.
도 12 는 phospho-HER2 가 유방암 환자 유래의 FNA 시료에서 활성화된 PI3K 및 활성화된 AKT 와 연관되어 있음을 보여준다.
도 13 은 HER2 유전자 돌연변이 또는 증폭 없이 유방암 환자 시료에서 phospho-HER2, phospho-PI3K 및 phospho-AKT 의 동시적인 활성화를 보여준다.
도 14 는 Herceptin 병용 치료요법 중 재발한 유방암 환자 유래의 시료에서의 활성화된 HER1, HER2, HER3, p95, ERK, She, PI3K, AKT 및 ERK 단백질을 보여준다.
도 15 는 Herceptin 병용 치료요법 중 재발한 유방암 환자 유래의 시료에서의 활성화된 HER2, HER3, cMet, ERK, PI3K, 및 AKT 단백질을 보여준다.
도 16 은 AKT 저해제, HER1 저해제 또는 병용 요법으로 치료 후 NSCLC 종양 세포 시료에서 PI3K 경로 활성화의 CEER-FNA 분석을 보여준다.
도 17 은 AKT 저해제, Lapatinib (타이로신 키나아제 저해제) 또는 병용 요법으로 치료 후 유방암 세포 시료의 경로 프로파일링에서의 바이오마커의 CEER-FNA 분석을 설명한다.
도 18 은 신규한 근접성 기반의 이량체 검정을 이용해 검출되는 MCF7 세포 상의 HER1/2 및 HER2/3 이종복합체의 원 데이터를 보여준다.
도 19 는 췌장 종양 시료 및 HDPE 세포에서의 HER3 이종이량체 복합체 및 HER3/PI3K 복합체의 활성화를 보여준다. CEER 이량체 검정은 포획 및 다중 검출 항체를 병용하여 10 ㎍, 5 ㎍ 및 2 ㎍ 에서 실시했다. 5 ㎍ 데이터는 HER3/PI3K 복합체의 10 ㎍ 에 대한 것을 제외하고 전부 나타났다. HPDE 세포 및 종양 시료 10 내지 494 는 1:2 및 2:3 복합체를 각각 형성했다. HPDE 세포와 관련하여, 종양 시료에는 높은 수준의 phosopho-HER3 가 있었으며, PI3K 와 회합하여 HER3/PI3K 복합체를 형성했다.
도 20 은 MCF7 세포 (인간 유방 선암 세포주) 에서의 HRG 또는 EGF 에 응답하는 HER2 이종이량체 및 PI3K 의 활성화를 보여준다.
도 21 은 유방암 환자의 CEER-FNA 경로 분석으로부터의 원 데이터 (raw data) 를 설명한다.
도 22 는 더 많은 유방암 환자의 CEER-FNA 경로 분석을 설명한다.
도 23 은 더욱더 많은 유방암 환자의 CEER-FNA 경로 분석을 설명한다.
도 24 는 유방암 환자의 CEER-FNA 경로 분석을 설명한다.
도 25 는 유방암 환자에서의 IGF-IR, PI3K, AKT 및 ERK 활성화를 설명한다.
도 26 은 유방암 환자에서의 IGF-IR 및 AKT 활성화를 설명한다. 활성화된 IGF-IR 수준은 phospho-AKT 수준과 상관관계가 있다. 추가로, 상승된 수준의 전체 IGF-1R 가 또한 phospho-AKT 와 상관관계가 있다.
도 27 은 NSCLC 환자에서의 IGF-IR 또는 cMET 활성화에 따른 PI3K 활성화를 설명한다. G12C KRAS 돌연변이가 있는 환자 1 유래의 종양 시료에는 높은 수준의 PI3K 복합체 및 phospho-PI3K 와 더불어 높은 수준의 전체 및 포스포릴화 IGF-IR 가 있다. 경로 프로파일링 분석은 또한 환자 2 유래의 종양 시료가 또한 높은 수준의 전체 및 포스포릴화된 IGF-IR, PI3K 복합체 및 phospho-PI3K 를 발현한다는 것을 보여준다.
도 28 은 폐암 환자에서 HER3 및/또는 cMET 활성화와 더불어 PI3K 활성화가 검출된다는 것을 설명한다.
도 29 는 G12C KRAS 돌연변이가 있는 NSCLC 환자에서의 HER3, cMET 및 PI3K 의 동시적인 활성화를 설명한다. 여타 활성화된 하류방향 효과기 단백질들 (예를 들어, FAK 및 CRKL) 이 검출되었다. VEGFR2 발현은 높았고, FGFR1 및 FGFR2 의 두가지 모두가 시료에서 활성화되어 있었다. 경로 분석 프로파일링은 치료 전 종양 시료에서 실시되었다.
도 30 은 NSCLC 환자에서의 PI3K 활성화 및 HER 이종이량체의 "힛트 맵 (heat map)" 을 보여준다. ErbB 이량체화 및 PI3K 경로 활성화는 종양 시료를 검출한다.
도 31 은 NSCLC 환자로부터의 KRAS 및 EGFR 체세포 돌연변이가 없는 종양 시료에서의 HER3 및 PI3K 의 동시적인 활성화를 설명한다. 활성화된 CRKL, FAK 및 She 의 수준이 또한 검출되었다. 전체 VEGFR2 발현이 또한 높았다.
도 32 는 위암 환자 시료에 phospho-HER3 이 존재함을 설명한다. 일부 시료에서, 활성화된 HER3 은 활성화된 cMET 의 존재여부와 상관관계가 있었다. 활성화된 ErbB 수용체는 여러 위 종양 시료에서 검출되었다.
도 33 은 포스포릴화된 경로 마커들의 요목 색인을 제시하는 MultiDimensional Scaling (MDS) 그래프를 보여준다.
도 34 는 위암이 있는 환자의 경로 프로파일링 분석에서의 phospho-PI3K 및 phospho-AKT/ERK 의 비교를 설명한다. FGFR1, FGFR2, FGFR3, 및 FGFR4 를 포함하는 FGFR 패밀리의 활성화는 시료 중 일부에서 검출되었다.
도 35 는 치료요법 전 대장암이 있는 환자에서의 PI3K 경로 활성화 및 HER 경로 활성화를 설명한다.
도 36 은 치료요법 전 대장암 환자로부터 취해진 G13D KRAS 돌연변이가 있는 시료에서의 PI3K 경로 활성화 및 HER 경로 활성화를 설명한다. 도 36 은 HER1 (EGFR), HER2, She, ERK 및 AKT 단백질이 고도로 활성화되었음을 보여준다.
도 37 은 치료요법 전 G12D KRAS 돌연변이가 있는 대장암 환자에서의 PI3K 경로 활성화 및 HER 경로 활성화를 설명한다.
도 38 은 대장암이 있는 환자 유래의 시료의 경로 프로파일링에서의 바이오마커의 FNA 분석을 설명한다.
도 39 는 KRAS 돌연변이가 있는 췌장암 환자의 경로 프로파일링에서의 바이오마커의 FNA 분석을 설명한다.
도 40 은 KRAS 돌연변이가 없는 췌장 환자의 경로 프로파일링에서의 바이오마커의 FNA 분석을 설명한다.
도 41 은 핵산 및 관능성 단백질 분석을 병용하는 총괄적인 질환 프로파일링 방법의 예시의 개념도를 보여준다.
도 42 는 실시예 12 에 기재된 임상 연구의 상세사항을 보여준다.
도 43 은 실시예 12 에 기재된 임상 연구의 더욱 상세한 사항을 보여준다.
도 44 는 HER1 저해제에 노출시킨 시료 (예를 들어, A, B, C 및 D) 유래의 유방암 흡출물의 활성화된 (포스포릴화된) PI3K 경로 프로파일링을 설명한다.
도 45 는 유방 종양의 FNA 및 림프절 종양의 FNA 으로부터 활성화된 (포스포릴화된) PI3K 경로 프로파일을 설명한다.
도 46A 는 CEER 검정으로 결정되는 PI3K 경로의 구성요소들의 단백질 발현 수준을 설명한다. 도 46B 는 환자의 유방 종양 및 림프절 종양에서 HER1, HER2, HER3, cMET, IGF 1R 및 CK 의 단백질 수준이 유사하다는 것을 보여준다.
도 47 는 유방암 환자의 코호트에서 활성화된 PI3K 경로 단백질, 활성화된 PI3K 돌연변이, 및 이들의 조합 사이의 통계적으로 유의한 상관관계가 있음을 보여준다. 1 차 IHC HER2 스코어가 +1 및 +2 인 환자에서의 phospho-HER2 의 수준과 CEER 로 측정된 phospho-AKT 의 수준과는 상관관계가 있다. 프로파일링한 37% 의 환자에서, phospho-HER 의 존재여부는 phospho-AKT 와 상관관계가 있다.
도 48 은 본 연구에서의 환자 14003 내지 3004 의 총괄적인 질환 프로파일링으로부터 수득된 데이터를 설명한다. 환자는 HER2 를 과발현했으며, 높은 HER3 및 PI3K 활성을 지닌 종양을 갖고 있다. 질환 프로파일은 환자가 PI3K 저해제 단독으로 또는 병용요법으로 이익을 얻을 수 있다는 것을 알려준다.
도 49 는 종양 및 정상적인 인접 조직 유래의 FNA 의 비교예 유방암 프로파일링을 설명한다. 도 49A 는 항-범 CK 항체로 염색된 조직 섹션의 면역세포화학적 영상을 보여준다. 종양 세포는 기질의 세포에 비해 CK 를 높은 수준으로 발현한다. 도 49B 는 유방암 종양 시료 및 정상적인 인접 조직 시료의 PI3K 경로 프로파일을 설명한다. 도 49C 는 본원에 기재된 CEER-FNA 검정 결과를 나타내는 그래프를 도시한다.
도 50 는 HER2 경로의 경로 프로파일링이 HER2 및 p95HER2 에 대한 IHC 에 비해 전체 p95HER2 및 활성화된 p95HER2 발현에 관한 더욱 상세한 데이터를 제공한다는 것을 보여준다. 도 50A 는 유방암 흡출 시료에서 HER2 단백질 및 p95HER2 단백질에 대한 웨스턴 블랏을 보여준다. 도 50B 는 IHC 로 측정시 HER2 를 고도로 (예를 들어, 3+) 발현하는 종양 시료가 HER2 를 2+ 또는 1+/0 수준으로 발현하는 것에 비해 전체 p95HER2 단백질 및 활성화된 (포스포릴화된) p95HER2 단백질을 과발현할 공산이 더 크다는 것을 보여준다. 도 50C 는 IHC 측정 HER2 발현으로 구분한 전체 p95HER2 단백질 발현의 그래프를 나타낸다.
도 51 은 CEER 에 의해 HER2 에 대해 양성으로 시험된 6 개의 FNA 시료가 1 차 IHC 로 측정하여 HER2 양성 세포를 발현한 환자로부터 유래한다는 것을 보여준다.
도 52 는 관능적 경로 프로파일링 및 유전자형 검정을 병용하는 본 발명의 총괄적 경로 분석의 비제한적 예시를 설명한다. 특히, FNA 시료를 분석하여 전체 및 활성화된 (즉, 포스포릴화된) 신호전달 경로 구성요소들 (예를 들어, HER1, HER2, p95HER2, HER3, cMET, IGF-1R, CK, PI3K, SHC, AKT, 및/또는 ERK) 을 CEER 검정으로 검출하고, 유전자에서 PIK3CA, KRAS, 및/또는 BRAF 와 같은 체세포 돌연변이를 검출했다.
발명의 상세한 설명
I. 도입부
PI3K 신호 전달 경로는 정상적인 생리적 세포 대사 및 생존 기능을 중재하는 것으로 공지되어 있으나, 그 경로의 일탈적인 활성화는 종양발생 또는 종양 전이를 유도할 수 있다. PI3K 경로를 통한 신호전달은 수많은 암세포에서, 특히 화학치료요법 후에 상향조절된다. 나아가, PI3K 활성화는 광범위한 항암 치료요버에 대한 치료 내성을 예측해 준다. 또한, 여타 중요 발암 경로가 PI3K 경로에 수렴하고 상호작용하는 것으로 알려져 있다.
종양 치료요법 개발의 한가지 접근법은 그러한 경로들을 통해 세포내 신호전달을 차단하는 것이다. 전임상적 모델은 PI3K 경로 저해제의 이용이 PI3K 활성화가 있는 유방암 환자에서 극적인 항암 응답성을 이끌어낼 수 있다는 것을 증명한 바 있다. 가장 놀라운 점은, PIK3CA 돌연변이가 존재한다고 해서 환자가 PI3K 치료요법에 응답하지 않는 것이 아니라는 점이다. 본 발명의 방법은 PI3K 경로 활성화 뿐만 아니라 PI3K 신호전달에 수렴하는 여타 신호전달 경로를 측정 (예를 들어, 검출 및 정량) 하기 위해 이용된다. 그러한 방법은 PI3K 저해제 및 PI3K 저해제 병용 요법에 임상적으로 반응할 암 환자 선별에 유용하다. 치료 과정에서 암 세포에서 활성인 신호 전달 경로의 계속적인 모니터링은 전문의에게 치료의 효능에 대한 추가적인 정보를 제공하게 되어, 예를 들어 암세포가 동일하거나 또는 또다른 신호 전달 경로를 활성화시키는 추가적인 일탈을 통해 치료에 내성을 갖게 되었을 때, 담당 전문의가 특정 치료 과정을 계속해 갈지 또는 또다른 치료 방법으로 전환할지 결정할 수 있도록 해 준다.
본원의 방법은 종양 세포가 항암 치료요법에 응답하여 종양 세포가 하나 이상의 벌충적인 신호전달 경로를 활성화할 수 있다는 점을 확인하기 위해 이용된다. 임의의 특정 이론에 구애됨 없이, 종양 세포는 저해제의 직접적인 표적이 아닌 신호전달 경로에 연계되어 활성화됨으로써 특정 경로 저해제에 적응하게 되는 것으로 여겨진다. 따라서, PI3K 저해제와의 병용 요법은 일부 암에서의 치료에 대한 최적의 응답성을 달성하는데 필요할 수 있다. 나아가, 그러한 발견사실들은 임상적 설정에서 활성화된 신호전달 경로를 모니터링하는 방법을 필요로 한다는 점을 강조하게 된다.
II . 정의
본원에 사용된 바와 같이, 하기 용어들은 달리 언급되지 않는 한 그에 고유한 의미를 갖게 된다.
용어 "암" 은 일탈적인 세포의 비제어적 성장을 특징으로 하는 질환 클래스의 임의의 구성원을 포함한다. 상기 용어는 모든 공지된 암 및 신생물 상태를 포함하는데, 이는 악성이며, 양성이고, 연한 조직 또는 고형인 것으로 특징으로 하며, 전이 전후의 암을 포함하는 모든 단계 및 등급의 암을 포함한다. 상이한 유형의 암의 예시에는, 이에 한정되지 않으나, 유방암; 폐암 (예를 들어, 비-소세포 폐암); 소화기 및 위장관 암, 예컨대 결장암, 위 체세포 종양, 위암 종양, 대장암, 직장암, 담도암, 소장암 및 위 (위장) 암; 식도암; 방광암; 간암; 췌장암; 충수암; 난소암; 신장암 (예를 들어, 신세포 암종); 중추신경계의 암; 피부암; 림프종; 융모막 암종; 두경부암; 골육종; 및 혈액암을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "종양" 은 하나 이상의 암세포를 포함한다. 한 구현예에서, 유방 종양은 도관암 또는 소엽암의 침습적 또는 원위치에서의 형태를 가진 대상체로부터 유도된다. 또다른 구현예에서, 유방 종양은 재발성 또는 전이성 유방암을 가진 대상체로부터 유도된다.
용어 "분석물" 은 일반적으로, 그의 존재여부, 양 (발현 수준), 활성화 상태 및/또는 정체가 밝혀져 있는 폴리펩티드와 같은 거대분자인, 관심대상의 임의의 분자를 포함한다. 특정한 경우, 분석물은 예를 들어 HER2 (ErbB2) 신호전달 경로의 구성요소와 같은 신호 전달 분자이다.
용어 "신호 전달 분자" 또는 "신호 전달자" 는 세포가, 일반적으로 세포 내부에서의 정해진 순서의 생화학적 반응을 수반하는, 세포가 세포외 신호 또는 자극을 응답으로 변환시키도록 하는 프로세스를 실시하는 단백질 및 여타 분자를 포함한다. 신호 전달 분자의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 하기의 것이 포함된다: 수용체 타이로신 키나아제, 예컨대 EGFR (예를 들어, EGFR/HER1/ErbB1, HER2/ Neu/ErbB2, HER3/ErbB3, HER4/ErbB4), VEGFR1/FLT1, VEGFR2/FLK1/KDR, VEGFR3/FLT4, FLT3/FLK2, PDGFR (예를 들어, PDGFRA, PDGFRB), c-KIT/SCFR, ISR (인슐린 수용체), IGF-IR, IGF-IIR, IRR (인슐린 수용체-관련 수용체), CSF-1R, FGFR 1-4, HGFR 1-2, CCK4, TRK A-C, c-MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYR03, TIE 1-2, TEK, RYK, DDR 1-2, RET, c-ROS, V-캐드헤린, LTK (백혈구 타이로신 키나아제), ALK (악성 림프종 키나아제), ROR 1-2, MUSK, AATYK 1-3, 및 RTK 106; 수용체 타이로신 키나아제의 절단된 형태, 예컨대 아미노-말단 세포외 도메인을 소실한 절단된 HER2 수용체 (예를 들어, p95ErbB2 (p95m), p110, p95c, p95n, 등); 수용체 타이로신 키나아제 이량체 (예를 들어, p95HER2/HER3, p95HER2/HER2, HER2/HER2, HER2/HER3, HER1/HER2, HER2/HER3, HER2/HER4, 등); 비-수용체 타이로신 키나아제, 예컨대 BCR-ABL, Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, 및 LIMK; 타이로신 키나아제 신호전달 캐스캐이드 구성요소들, 예컨대 AKT (예를 들어, AKT1, AKT2, AKT3), MEK (MAP2K1), ERK2 (MAPK1), ERK1 (MAPK3), PI3K (예를 들어, PIK3CA (p110), PIK3R1 (p85)), PDK1, PDK2, 포스파타아제 및 텐신 상동체 (PTEN), SGK3, 4E-BP1, P70S6K (예를 들어, p70 S6 키나아제 스플라이스 변이체 알파 I), 단백질 타이로신 포스파타아제 (예를 들어, PTP1B, PTPN13, BDP1, 등), RAF, PLA2, MEKK, JNKK, JNK, p38, She (p66), Ras (예를 들어, K-Ras, N-Ras, H-Ras), Rho, Rac1, Cdc42, PLC, PKC, p53, 싸이클린 D1, STAT1, STAT3, 포스파티딜이노시톨 4,5-비스포스페이트 (PIP2), 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리포스페이트 (PIP3), mTOR, BAD, p21, p27, ROCK, IP3, TSP-1, NOS, GSK-3 , RSK 1-3, JNK, c-Jun, Rb, CREB, Ki67, 및 팍실린 (paxillin); 핵의 호르몬 수용체, 예컨대 에스트로겐 수용체 (ER), 프로게스테론 수용체 (PR), 안드로겐 수용체, 글루코코르티코이드 수용체, 미네랄로코르티코이드 수용체, 비타민 A 수용체, 비타민 D 수용체, 레티노이드 수용체, 티로이드 호르몬 수용체, 및 오르펀 수용체; 예컨대 유방암-1 (AIB1) 및 핵의 보조억제제 1 (NCOR) 에서 각각 증폭되는, 핵의 수용체 보조활성화제 및 억제제; 및 이들의 조합.
용어 "PI3K 경로 변경" 은 PI3K 유전자 돌연변이, PI3K 유전자 증폭 및/또는 PTEN 소실로 인한 PI3K 신호전달 경로의 일탈적인 조절이상을 지칭한다.
용어 "수용체-유형 타이로신 키나아제" 또는 "RTK" 는, 비-수용체 유형 타이로신 키나아제가 전부 세포내에 있는 반면, 세포외, 막통과 및 세포내 부분을 각각 갖는 것을 특징으로 하는 수용체들의 패밀리의 임의의 구성원을 포함한다. 수용체 패밀리는 여러 생물학적 활성을 가진 수많은 막통과 수용체를 포함하여 이루어진다. 사실, 약 20 가지의 상이한 서브패밀리의 수용체-유형 타이로신 키나아제가 밝혀진 바 있다. HER (ErbB) 서브패밀리로 지정되는 한 타이로신 키나아제 서브패밀리는 EGFR (HER1), HER2, HER3, 및 HER4 를 포함하여 이루어진다. 이제까지 밝혀진 상기 서브패밀리의 수용체의 리간드들은 상피 생장 인자, TGF-알파, 앰피레굴린, HB-EGF, 베타셀룰린 및 헤레굴린을 포함한다. 그러한 수용체-유형 타이로신 키나아제의 또다른 서브패밀리는 IS-R, IGF-IR, 및 IR-R 을 포함하는 인슐린 서브패밀리를 포함한다. PDGF 서브패밀리는 PDGF-알파 및 베타 수용체, CSFIR, c-kit 및 FLK-II 을 포함한다.
용어 "HER2 신호전달 경로의 구성요소" 는 HER2 의 상류방향 리간드, HER2 의 결합 파트너 및/또는 HER2 를 통해 조절되는 하류방향 효과기 분자 중 임의의 하나 이상을 포함하다. HER2 신호전달 경로 구성요소의 예시는, 이에 제한되지 않으나, 헤레굴린 (heregulin), HER1/ErbB1, HER2/ ErbB2, HER3/ErbB3, HER4/ErbB4, AKT (예를 들어, AKT1, AKT2, AKT3), MEK (MAP2K1), ERK2 (MAPK1), ERK1 (MAPK3), PI3K (예를 들어, PIK3CA (p110), PIK3R1 (p85)), PDK1, PDK2, PTEN, SGK3, 4E-BP 1, P70S6K (예를 들어, 스플라이스 변이체 알파 I), 단백질 타이로신 포스파타아제 (예를 들어, PTP 1B, PTPN13, BDP1, 등), HER2 이량체 (예를 들어, p95HER2/HER3, p95HER2/HER2, HER2/HER2, HER2/HER3, HER1/HER2, HER2/HER3, HER2/HER4, 등), GSK-3p, PIP2, PIP3, p27, 및 이들의 조합을 포함한다.
용어 "HER3 신호전달 경로의 구성요소" 는 HER3 의 상류방향 리간드, HER3 의 결합 파트너, 및/또는 HER3 을 통해 조절되는 하류방향 효과기 분자 중 임의의 한가지 이상을 포함한다. HER3 신호전달 경로 구성요소의 예시는, 이에 제한되지 않으나, 헤레굴린, HER1/ErbB1, HER2/ErbB2, HER3/ErbB3, HER4/ErbB4, AKT (예를 들어, AKT1, AKT2, AKT3), MEK (MAP2K1), ERK2 (MAPK1), ERK1 (MAPK3), PI3K (예를 들어, PIK3CA (p110), PIK3R1 (p85)), PDK1, PDK2, PTEN, SGK3, 4E-BP 1, P70S6K (예를 들어, 스플라이스 변이체 알파 I), 단백질 타이로신 포스파타아제 (예를 들어, PTP 1B, PTPN13, BDP1, 등), HER2 이량체 (예를 들어, p95HER2/HER3, p95HER2/HER2, HER2/HER2, HER2/HER3, HER1/HER2, HER2/HER3, HER2/HER4, 등), GSK-3p, PIP2, PIP3, p27, 및 이들의 조합을 포함한다.
용어 "종양 적응 (tumor adaptation)" 은 종양의 세포들이 항암 치료요법에 노출되고, 치료제에 의해 직접 표적이 되는 신호전달 경로와 연합되어 있거나 또는 인근의 신호전달 경로를 활성화시키는 프로세스를 포함한다. 종양 세포는 표적으로 하는 치료요법에 의해 제공되는 차단 또는 억제를 벌충하는 메커니즘으로서 연합된/인근의 신호전달 경로를 활성화시킨다.
용어 "활성화 상태" 는 신호전달 분자의 활성화된 형태에서의 HER2 신호전달 경로 구성요소와 같은 특별한 신호 전달 분자를 포함한다. 유사하게, 용어 "활성화 수준" 은 HER2 신호전달 경로 구성요소와 같은 특별한 신호 전달 분자가 활성화되는 정도를 지칭한다. 활성화 상태는 일반적으로 하나 이상의 신호 전달 분자의 포스포릴화, 유비퀴틴화 및/또는 복합체화 상태에 해당한다. 활성화 상태 (괄호 안에 수록) 의 비제한적 예시는 하기를 포함한다: EGFR (EGFRvIII, 포스포릴화 (p-) EGFR, EGFR: She, 유비퀴틴화 (u-) EGFR, p-EGFRvIII); ErbB2 (p-ErbB2, p95HER2 (절단된 ErbB2), p-p95HER2, ErbB2:Shc, ErbB2:PI3K, ErbB2:EGFR, ErbB2:ErbB3, ErbB2:ErbB4); ErbB3 (p-ErbB3, ErbB3 :PI3K, p-ErbB3:PI3K, ErbB3 :Shc); ErbB4 (p-ErbB4, ErbB4:Shc); c-MET (p-c-MET); AKT1 (p-AKT1); AKT2 (p-AKT2); AKT3 (p-AKT3); PTEN (p-PTEN); P70S6K (p-P70S6K); MEK (p-MEK); ERK1 (p-ERKl); ERK2 (p-ERK2); PDK1 (p-PDKl); PDK2 (p-PDK2); SGK3 (p-SGK3); 4E-BP1 (p-4E-BPl); PIK3R1 (p-PIK3R1); c-KIT (p-c-KIT); ER (p-ER); IGF-1R (p-IGF-1R, IGF-1R:IRS, IRS:PI3K, p-IRS, IGF-1R:PI3K); INSR (p-INSR); FLT3 (p-FLT3); HGFRl (p-HGFRl); HGFR2 (p-HGFR2); RET (p-RET); PDGFRA (p-PDGFRA); PDGFRB (p-PDGFRB); VEGFR1 (p-VEGFRl, VEGFR1:PLCγ, VEGFRl:Src); VEGFR2 (p-VEGFR2, VEGFR2:PLCγ, VEGFR2:Src, VEGFR2: 헤파린 설페이트, VEGFR2:VE-캐드헤린); VEGFR3 (p-VEGFR3); FGFR1 (p-FGFRl); FGFR2 (p-FGFR2); FGFR3 (p-FGFR3); FGFR4 (p-FGFR4); TIE1 (p-TIEl); TIE2 (p-TIE2); EPHA (p-EPHA); EPHB (p-EPHB); GSK-3β (p-GSK-3β); NFKB (p-NFKB), 1KB (p-IKB, p-P65:IKB); BAD (p-BAD, BAD: 14-3-3); mTOR (p-mTOR); Rsk-1 (p-Rsk-1); Jnk (p-Jnk); P38 (p-P38); STAT3 (p-STAT3); Fak (p-Fak); Rb (p-Rb); Ki67; p53 (p-p53); CREB (p-CREB); c-Jun (p-c-Jun); c-Src (p-c-Src); 및 팍실린 (paxillin) (p-팍실린).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "연속 희석물" 은 특별한 시료 (예를 들어, 세포 해리물) 또는 시약 (예를 들어, 항체) 의 농도를 줄여간 일련의 것들을 포함하는 것을 의도로 한다. 연속 희석물은 일반적으로 측정한 양의 출발 농도의 시료 또는 시약을 희석물 (예를 들어, 희석 완충액) 과 혼합하여 더 낮은 농도의 시료 또는 시약을 만들어내고, 원하는 연속 횟수의 희석물을 수득할 충분한 횟수로 해당 프로세스를 반복하는 프로세스로 제조된다. 시료 또는 시약이 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 500, 또는 1000-배 연속 희석되어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 회 감소시킨 농도의 시료 또는 시약을 함유하는 연속 희석물을 수득하게 된다. 예를 들어, 1 mg/ml 을 출발 농도로 한 포획 항체 시약의 2-배 연속 희석물을 함유하는 연속 희석물은 출발 농도의 포획 항체를 동등한 양의 희석 완충액과 혼합하여 0.5 mg/ml 농도의 포획 항체를 만들고, 그 프로세스를 반복해 0.25 mg/ml, 0.125 mg/ml, 0.0625 mg/ml, 0.0325 mg/ml 등의 포획 항체 농도를 수득하게 된다.
본원에 사용된 용어 "월등한 동적 범위" 는 1 개 세포 또는 수천개의 세포에서 특정 분석물을 검출할 검정의 능력을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 면역검정은, 이들이 유리하게 포획 항체 농축물의 연속 희석물을 이용해 약 1 내지 10,000 개의 세포 (예를 들어, 약 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500, 750, 1000, 2500, 5000, 7500, 또는 10,000 개의 세포) 에서 관심대상의 특별한 신호 전달 분자를 검출할 수 있기 때문에 월등한 동적 범위를 지니고 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "순환 세포" 는 고형 종양 유래의 전이되거나 또는 소전이성인 종양외 세포를 포함한다. 순환 세포의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 순환 종양 세포, 암 줄기세포 및/또는 종양으로 이동하고 있는 세포 (예를 들어, 순환 내피 전구 세포, 순환 내피 세포, 순환 혈관형성전 미엘로이드 세포, 순환 수상 세포 등) 를 포함한다. 순환 세포를 포함하는 환자 시료는 임의의 접근가능한 생물학적 액체 (예를 들어, 전혈, 혈장, 혈청, 척수액, 기관기 세척액, 뇨, 유두 흡출물, 림프, 타액, 미세침 흡입물 등) 로부터 수득될 수 있다. 특별한 경우, 전혈 시료가 혈장 또는 혈청 분획 및 세포 분획 (즉, 세포 펠렛) 으로 분리된다. 세포 분획은 일반적으로 적혈구, 백혈구 및/또는 고형 종양의 순환 세포, 예컨대 순환 종양 세포 (CTC), 순환 내피 세포 (CEC), 순환 내피 전구 세포 (CEPC), 암 줄기 세포 (CSC), 림프절의 산재성 종양 세포 및 이들의 조합을 포함한다.
순환 세포는 일반적으로, 예를 들어 면역자성 분리 (참고문헌은, 예를 들어 Racila et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:4589-4594 (1998); Bilkenroth et al, Int. J. Cancer, 92:577-582 (2001)), Immunicon (Huntingdon Valley, PA) 사의 CellTracks® System, 미세유동 분리 (참고문헌은, 예를 들어 Mohamed et al, IEEE Trans. Nanobioscl, 3 :251-256 (2004); Lin et al, Abstract No. 5147, 97th AACR Annual Meeting, Washington, D.C. (2006)), FACS (참고문헌은, 예를 들어 Mancuso et al, Blood, 97:3658-3661 (2001)), 밀도 구배 원심분리 (참고문헌은, 예를 들어 Baker et al, Clin. Cancer Res., 13:4865-4871 (2003)), 및 소모 방법 (depletion methods) (참고문헌은, 예를 들어 Meye et al, Int. J. Oncol, 21: 521-530 (2002)) 을 포함하는 하나 이상의 분리 방법을 이용해 환자 시료로부터 분리된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "시료" 는 환자로부터 수득된 임의의 생물학적 검체를 포함한다. 시료에는, 이에 제한되지 않지만, 전혈, 혈청, 혈장, 적혈구 세포, 백혈구 세포 (예를 들어, 말초혈 단핵구 세포), 관 세척액, 유두 흡출물, 림프 (예를 들어, 림프절의 산재된 종양 세포), 골수 흡출물, 타액, 뇨, 변 (즉, 대변), 척수액, 기관지 세척액, 눈물, 미세침 흡출물 (예를 들어, 무작위적 유선주변 미세침 흡출물), 임의의 여타 체액, 조직 시료 (예를 들어, 종양 조직), 예컨대 종양의 생검 (예를 들어, 바늘 생검) 또는 림프절 (예를 들어, 보초 림프절 생검), 및 그의 세포 추출물이 포함된다. 일부 구현예에서, 시료는 전혈 또는 그의 분획화 구성요소, 예컨대 혈장, 혈청 또는 세포 펠렛이다. 바람직한 구현예에서, 시료는 전혈 또는 그의 세포 분획으로부터 당업자에게 공지된 임의의 기법을 이용해 분리하여 수득된다. 다른 구현예에서, 시료는 예를 들어 유방의 고형 종양으로부터 포르말린 고정 파라핀 내입 (FFPE) 종양 조직 시료이다.
"생검" 은 진단 또는 예후 평가를 위해 조직 시료를 제거하는 프로세스 및 조직 시편 그 자체를 지칭한다. 당업자에게 공지된 임의의 생검 기법이 본 발명의 방법 및 조성물에 적용될 수 있다. 적용된 생검 기법은 다른 요인들보다도 일반적으로 평가할 조직 유형 및 종양의 크기 및 유형 (즉, 고형인지 또는 현탁되어 (즉, 혈액 또는 복수에 존재) 있는지) 에 좌우된다. 대표적인 생검 기법에는, 절제 생검 (excisional biopsy), 절개 생검 (incisional biopsy), 바늘 생검 (needle biopsy) (예를 들어, 원뿔형 바늘 생검 (core needle biopsy), 미세침 흡출 생검 (fine-needle aspiration biopsy) 등), 외과적 생검 (surgical biopsy), 및 골수 생검 (bone marrow biopsy) 이 포함된다. 생검 기법은 예를 들어, 문헌 [Harrison 's Principles of Internal Medicine, Kasper, et al, eds., 16th ed., 2005, Chapter 70, and throughout Part V] 에서 논의된다. 당업자는 생검 기법이 주어진 조직 시료에서 암세포 및/또는 암 발병 전의 세포를 동정할 수 있다는 점을 알 수 있을 것이다.
용어 "대상체" 또는 "환자" 또는 "개체" 는 일반적으로 인간을 포함하나, 예를 들어 여타 영장류, 쥐과동물, 개, 고양이, 말, 양, 돼지 등과 같은 여타 동물들도 포함할 수 있다.
"어레이" 또는 "마이크로어레이" 는 예를 들어, 유리 (예를 들어, 유리 슬라이드), 플라스틱, 칩, 핀, 필터, 비드 (예를 들어, 자석 비드, 폴리스티렌 비드 등), 종이, 멤브레인 (예를 들어, 나일론, 니트로셀룰로오스, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 등), 필터 다발 또는 임의의 여타 적합한 기판에 고정 또는 속박되어 있는 포획 항체의 구분되는 셋트 및/또는 연속 희석물을 포함한다. 포획 항체는 일반적으로 공유결합 또는 비공유결합 상호작용 (예를 들어, 이온 결합, 소수성 상호작용, 수소 결합, 반 데르 발스 힘, 쌍극자-쌍극자 결합) 을 통해 고체 담지체 상에 고정 또는 속박되어 있다. 특정한 경우, 포획 항체는 고체 담지체에 결합되어 있는 포획제와 상호작용하는 포획 태그를 포함한다. 본원에 기재된 어레이에 사용되는 어레이는 일반적으로 상이한 공지된/설명가능한 위치에 고체 담지체의 표면에 커플링되어 있는 여러개의 상이한 포획 항체 및/또는 포획 항체 농축물을 포함한다.
용어 "포획 항체" 는 세포 추출물과 같은 시료 중의 관심대상의 하나 이상의 분석물에 특이적인 (즉, 결합하거나, 결합되거나 또는 그와 복합체를 형성) 고정된 항체를 포함한다. 특별한 구현예에서, 포획 항체는 어레이 내 고체 담지체에 속박되어 있다. 고체 담지체 상의 임의의 다양한 신호 전달 분자의 고정에 적합한 포획 항체는 Upstate (Temecula, CA), Biosource (Camarillo, CA), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Sigma (St. Louis, MO), 및 BD Biosciences (San Jose, CA) 사들로부터 입수가능하다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "검출 항체" 는 시료 중의 관심대상의 하나 이상의 분석물에 특이적인 (즉, 결합하거나, 결합되어 있거나, 또는 그와 복합체를 형성) 검출가능한 표지를 포함하는 항체를 포함한다. 상기 용어는 또한 관심대상의 하나 이상의 분석물에 특이적인 항체를 포함하는데, 여기서 상기 항체는 검출가능한 표지를 포함하는 또다른 종에 의해 결합되어 있을 수 있다. 검출가능한 표지의 예시는, 이에 제한되지 않으나, 바이오틴/스트렙타비딘 표지, 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드) 표지, 화학적으로 반응성인 표지, 형광 표지, 효소 표지, 방사활성 표지 및 이들의 조합을 포함한다. 임의의 다양한 신호 전달 분자의 활성화 상태 및/또는 총량 검출에 적합한 검출 항체는 Upstate (Temecula, CA), Biosource (Camarillo, CA), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Sigma (St. Louis, MO), 및 BD Biosciences (San Jose, CA) 사들로부터 입수가능하다. 비제한적 예시로서, EGFR, c-KIT, c-Src, FLK-1, PDGFRA, PDGFRB, AKT, MAPK, PTEN, Raf, 및 MEK 과 같은 신호 전달 분자의 다양한 포스포릴화된 형태에 대한 포스포-특이적 항체를 Santa Cruz Biotechnology 로부터 입수가능하다.
용어 "활성화 상태-의존적 항체" 는 시료 중의 관심대상의 하나 이상의 분석물의 특별한 활성화 상태에 특이적인 (즉, 결합하거나, 결합되어 있거나, 또는 그와 복합체를 형성) 검출 항체를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 활성화 상태-의존적 항체는 하나 이상의 신호 전달 분자와 같은 하나 이상의 분석물의 포스포릴화, 유비퀴틴화 및/또는 복합체화 상태를 검출한다. 일부 구현예에서, EGFR 클래스의 수용체 타이로신 키나아제 구성원들의 포스포릴화 및/또는 EGFR 클래스 구성원들 사이의 이종이량체 복합체 형성은 활성화 상태-의존적 항체를 이용해 검출된다. 특별한 구현예에서, 활성화 상태-의존적 항체는 하기와 같은 신호 전달 분자 중 하나 이상의 포스포릴화의 하나 이상의 부위 (인간 단백질 서열에서 아미노산 위치에 해당하는 포스포릴화 부위) 를 검출하기에 유용하다: EGFR/HER1/ErbBl (예를 들어, 타이로신 (Y) 1068); ErbB2/HER2 (예를 들어, Y1248); ErbB3/HER3 (예를 들어, Y1289); ErbB4/HER4 (예를 들어, Y1284); SGK3 (예를 들어, 트레오닌 (T) 256 및/또는 세린 (S) 422); 4E-BP 1 (예를 들어, T70); ERKl (예를 들어, T202 및/또는 Y204); ERK2 (예를 들어, T202); MEK (예를 들어, S217 및/또는 S221); PIK3R1 (예를 들어, Y688); PDK1 (예를 들어, S241); P70S6K (예를 들어, T229, T389, 및/또는 S421); c-MET (예를 들어, Y1349); PTEN (예를 들어, S380); AKTl (예를 들어, S473 및/또는 T308); AKT2 (예를 들어, S474 및/또는 T309); AKT3 (예를 들어, S472 및/또는 T305); GSK-3 (예를 들어, S9); NFKB (예를 들어, S536); 1KB (예를 들어, S32); BAD (예를 들어, SI12 및/또는 S136); mTOR (예를 들어, S2448); Rsk-1 (예를 들어, T357 및/또는 S363); Jnk (예를 들어, T183 및/또는 Y185); P38 (예를 들어, T180 및/또는 Y182); STAT3 (예를 들어, Y705 및/또는 S727); FAK (예를 들어, Y576); Rb (예를 들어, S249, T252, 및/또는 S780); p53 (예를 들어, S392 및/또는 S20); CREB (예를 들어, S 133); c-Jun (예를 들어, S63); c-Src (예를 들어, Y416); 및 팍실린 (예를 들어, Y118).
용어 "활성화 상태-독립적 항체" 는 시료 중에 그의 활성화 상태와 무관하게 관심대상의 하나 이상의 분석물에 특이적인 (즉, 결합하거나, 결합되어 있거나 또는 그와 복합체를 형성) 검출 항체를 포함한다. 예를 들어, 활성화 상태-독립적 항체는 하나 이상의 신호 전달 분자와 같은 하나 이상의 분석물의 포스포릴화된 형태 및 포스포릴화되지 않은 형태 두가지 모두를 검출한다.
III . 구현예의 상세한 설명
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은, 다중적인, 고속 인접 검정을 이용해 고형 종양의 종양 조직 또는 순환 세포에서의 신호 전달 경로의 구성요소들의 상태 (예를 들어, 발현 및/또는 활성화 수준) 을 검출하는 조성물 및 방법을 제공한다.
한 구현예에서, 본 발명은 둘 이상의 수용체 타이로신 키나아제 (RTK) 의 이량체화를 검출 및/또는 정량하는 방법을 제공한다. 또다른 구현예에서, 본 발명은 RTK 이량체, PI3K p85 조절 서브유닛 및 PI3K p110 촉매 서브유닛을 포함하는 PI3K 복합체의 수준을 측정 (예를 들어, 검출 및/또는 정량) 하는 방법을 제공한다.
PI3K p85 조절 서브유닛은 p85a (서열 식별 번호 1), ρ85β (서열 식별 번호 2), ρ55γ (서열 식별 번호 3), p150 (서열 식별 번호 4), 및 p101 (서열 식별 번호 5) 으로 정해진 다섯가지 변이체 중 임의의 하나를 포함한다. PI3K p110 서브유닛은 p110α (서열 식별 번호 6), 110β (서열 식별 번호 7), p110γ (서열 식별 번호 8), 및 p110δ (서열 식별 번호 9) 로 정해진 변이체들 중 임의의 것을 포함한다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 고형 종양 유래의 종양 세포 또는 순환 세포에서의 활성화된 PI3K 의 수준을 측정 (예를 들어, 검출 및 정량) 하는 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 PI3K 복합체화, PI3K 활성화 (예를 들어, 포스포릴화), PI3K 경로의 하류방향 단백질 (예를 들어, 어댑터, 효과기, 키나아제 단백질), 및 PI3K 경로와 연계된 경로의 여타 신호 전달을 모니터링하는 방법을 제공한다.
본 발명은 항암 치료요법 (예를 들어, RTK 및 PI3K 조절 화합물, 또는 이들의 조합) 에 특이적인 환자의 종양의 응답성을 결정 또는 예측하는 조성물 및 방법을 제공한다. 일부의 경우, 상기 방법은 PI3K 저해제 치료요법 또는 PI3K 저해제 병용 요법의 임상적인 유익을 예측하기 위해 이용된다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법을 이용한 환자의 종양 세포에서의 PI3K 신호전달 경로에서의 PI3K 활성화 또는 활성화된 구성요소들의 상승된 수준 측정은 환자가 PI3K 저해제 치료요법 또는 PI3K 병용 요법으로 임상적으로 유익할 수 있는지 예측하게 된다. 본 발명은 또한 하나 이상의 탈조절되는 신호 전달 경로를 하향조절하거나 또는 분로시키는 적절한 치료요법을 선택하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명의 특정 구현예는 주어진 환자의 종양에서 전체 및 활성화된 신호 전달 단백질들의 집합에 의해 제공되는 특별한 분자 특성을 기반으로 하여 개별맞춤된 치료요법의 고안을 촉진하는데 이용된다.
한 구현예에서, 본 발명은 항암 치료요법시 재발한 환자 유래의 종양 시료에서의 PI3K 및 RTK, 또는 그의 기질, 및/또는 여타 신호 전달 분자의 발현 수준 및/또는 활성화 (예를 들어 포스포릴화) 정도의 측정 (예를 들어, 검출 및 정량) 방법을 제공한다. 마찬가지로, 본 발명은 유리하게는, 치료요법 과정을 통해 스크리닝 및 모니터링하고, 대안적인 표적화된 치료요법 또는 병용요법으로 전환해야 하는지 여부를 평가함으로써 하나 이상의 표적화된 치료요법을 진행 중인, 유방암, 비-소세포 폐암, 위암, 췌장암 및 대장암과 같은 고형 종양이 있는 환자에게 유익을 제공한다. 특별한 국면에서, 치료요법에 대한 종양 적응은 결과적으로 본 발명의 방법을 이용해 검출될 수 있는 벌충적인 신호전달 경로의 활성화를 제공하게 된다. 여타의 경우, 환자에서 종양 적응의 결정은 환자의 치료가 대안적인 표적화된 치료요법 또는 병용 요법으로 전환되어야 하는지 여부를 나타낸다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 항암제의 존재 또는 부재 하에 종양 시료 중의 RTK 이량체화 및/또는 PI3K 복합체화의 검출 및/또는 정량을 비교하여 고형 종양 암이 있는 환자에 대한 항암제 치료를 선택하는 방법을 제공한다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 유리하게는 표적 단백질 키나아제에서의 돌연변이, 치료제에 대해 획득된 내성, 치료요법에 대한 신호 전달 분자에 의한 적응, 치료 지시 불이행 및/또는 차선의 약물 투여량 투여로 인해 항암제에 대해 내성이 된 환자를 식별해 낸다.
특정 국면에서, 본원에 기재된 방법은 기존 항암 치료요법에 대한 암 또는 종양 적응을 모니터링해 추적한다. 특별한 경우, CEER 기법을 이용해 경로 프로파일링의 활성화를 추적 및 모니터링함으로써, 예를 들어 연관된 경로에 대한 활성화 및/또는 발현에 의한 기존 치료요법에 대한 경로가 있는지 여부에 대해 확인할 수 있다. 그러한 기법은 치료요법 효율의 평가를 가능하게 한다. 본래 경로 활성화가 중단 또는 감쇠된다면, 또다른 경로에서 경로 벌충이 있는지 여부를 확인하기 위해서 연계된 경로를 추궁하는 것이 중요하다. 그러한 경우, 병용 치료요법 투여 계획이 권장될 수 있거나, 또는 다른 치료요법으로 전환할 것이 권장될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 실시예 3, 4 및 6 에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 방법이 항암 치료요법에서 재발한 환자 유래의 종양 세포에서 활성화된 PI3K, HER1, HER2, HER3, IGF-1R, AKT 및/또는 ERK 의 수준을 모니터링하기 위해 이용된다. 그러한 환자들의 종양에서, 치료요법에 의해 직접적으로 표적이 되지는 않는 벌충적인 신호전달 경로가 활성화되었다 (도 14 내지 17 및 25 참조). 유리하게는, 본원의 방법을 이용하여, 경로 프로파일링 분석에서 환자가 PI3K 저해제 치료요법 또는 PI3K 저해제 병용 요법에 의해 임상적으로 이익을 얻을 수 있다는 것을 나타낸다.
표적 단백질의 발현 또는 유전자 돌연변이만의 분석은 암이 있거나 또는 암이 있을 것으로 추정되는 대상체에 대한 최대 임상적 효능이 있는 적절한 치료요법 선별에 한계가 있다. RTK 이량체화 및 PI3K 복합체화의 총괄적 프로파일링은 그들의 의도하는 표적 단백질에 대한 특정 항암제의 효능에 대한 통찰력 있는 정보를 제공한다. 본 발명의 방법은 또한 벌충적인 경로의 활성화와 같은 잠재적 약물 내성 메커니즘과 관련한 가치있는 정보를 제공하며, 암 환자에 대한 유효한 치료 및 투여 계획에 대한 안내를 제공한다.
IV . PI3K 신호전달 및 암
본 발명에 따르면, PI3K 경로 및/또는 RTK 경로 (예를 들어, HER1, HER2, HER3, HER4, cMET, 및 IGF-1R 경로) 의 활성화 상태는 유방, 대장, 위, 폐 또는 췌장암과 같은 고형 종양암이 있는 환자 유래의 종양 세포에서 정량적으로 측정될 수 있다. 본 발명은 종양 시료에서의 PI3K 경로의 수많은 단백질들의 활성화 수준의 동시적인 정량 방법을 제공한다.
포스포이노시타이드 3-키나아제 (PDK) 는 세포 생존, 증식, 분화, 대사 및 운동성을 포함하는 수많은 세포 프로세스에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 수용체 타이로신 키나아제 (RTK) 및 G 단백질 커플링된 수용체의 하류방향의 주된 효과기로서, PI3K 가 인지질 생성에 의해 다양한 성장 인자 및 싸이토카인으로부터 세포간 메세지로 신호를 전달하며, 이는 이어서 세린/트레오닌 키나아제 AKT 및 여타 효과기 경로를 활성화한다. 여타 하류방향 효과기의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, RAC1, SGK, PKC, Mdm2, FKHR, NF-κΒ, BAD, MEK, PTEN, GSK3β, mTOR, 및 S6K 이 포함된다.
PI3K 가 RTK (예를 들어, HER1, HER2, HER3 및 HER4) 를 통해 성장 인자 자극에 의해 활성화되면, PI3K p85 서브유닛은 RTK 및/또는 어댑터 단백질 상의 포스포타이로신 잔기에 직접 결합한다. 그러한 결합은 p85 에 의한 PI3K p110 서브유닛의 분자내 저해를 경감시키며, PI3K 를 세포의 원형질막에 위치시킨다. 여기서, PI3K 는 PIP2 의 PIP3 로의 포스포릴화를 촉매하며, 이어서 AKT 의 포스포릴화를 촉진한다. 활성화된 AKT 는 세포 생존, 아폽토시스 억제 및 세포 싸이클 제어를 가능케 하는 프로세스를 개시하는 연관된/부근의 경로의 다수의 여타 단백질들을 포스포릴화한다.
PI3K 경로의 복잡성에 추가하여, 여타 세포 신호전달 네트워크와 많은 혼선이 있었다. 그러한 관련된 또는 근접한 신호전달 네트워크에는, 이에 제한되지 않으나, mTOR, p53, RAS 및 MAPK 경로가 포함된다. PI3K 경로, 뿐만 아니라 ErbB 클래스 경로의 구성요소들의 일탈적인 발현 및/또는 활성화가 유방암, 난소암, 위암, 폐암 및 대장암을 포함하는 수많은 인간 종양에서 보고된 바 있다. 한 구현예에서, 본 발명의 방법은, 유방, 폐, 췌장, 위, 대장 또는 여타 암 세포와 같은 종양 세포의 세포 추출물 중의 하나 이상의 신호 전달 분자들 (예를 들어, 수용체 타이로신 키나아제, 예컨대 ErbB 클래스의 구성원 또는 PI3K 와 같은 신호전달 경로 구성요소) 의 이량체화 존재여부, 발현 수준 및/또는 활성화 상태를 검출하기 위해 이용된다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 추가로 유방, 폐, 췌장, 위, 대장 또는 여타 암 세포와 같은 종양 세포의 세포 추출물 중의 하나 이상의 드문 체세포 돌연변이의 존재여부를 검출하기 위한 체세포 돌연변이 (예를 들어, 대립형질 변이) 분석을 포함한다. 체세포 돌연변이를 보유하는 유전자의 비제한적 예시는 PI3K, KRAS 및 BRAF 을 포함한다. 예를 들어, PIK3CA 유전자에서의 체세포 돌연변이는 E542K, E545D, E545K, 및 H1047R 돌연변이를 포함한다. 대립형질 변이의 검출 방법은 본원에 그의 전문이 참고문헌으로 포함되는 미국 가출원 번호 61/525,137, 및 PCT/US2012/051442 에 개시되어 있다.
비제한적 예시로서, 대립형질-특이적 서열 증폭을 위한 체세포 돌연변이 (예를 들어, 대립형질 변이) 분석은 하기를 포함할 수 있다: (a) 대립형질-특이적 프라이머를 표적 대립형질을 포함하는 제 1 핵산 분자에 혼성화시키는 단계; (b) 대립형질-특이적 블로커 프로브를 상대편 대립형질을 포함하는 제 2 핵산 분자에 혼성화시키는 단계, 여기서 상대편 대립형질은 표적 대립형질과 동일한 좌에 해당하는 것임; (c) 좌-특이적 검출 프로브를 제 1 핵산 분자에 혼성화시키는 단계; (d) 좌-특이적 프라이머를 대립형질-특이적 프라이머의 신장 생성물에 혼성화시키는 단계; 및 (e) 표적 대립형질을 PCR 증폭하는 단계. 특별한 구현예에서, 대립형질-특이적 블로커 프로브는 3' 말단에 비-증폭성 블로커 부분을 포함한다. 또다른 특별한 구현예에서, 대립형질-특이적 프라이머 및 대립형질-특이적 블로커 프로브는 전부 표적 대립형질 및 상대편 대립형질 각각의 위치에 개질된 염기를 포함한다. 참고문헌은, 예를 들어 그의 전문이 본원에 참고문헌으로 포함되는 미국 가출원 번호 61/525, 137, 및 PCT/US2012/051442.
V. 항체 어레이
특정 국면에서, 유방, 폐 또는 여타 암 세포와 같은 종양 세포의 세포 추출물에서의 하나 이상 (예를 들어, 여러개) 의 신호 전달 분자들 (예를 들어, 수용체 타이로신 키나아제, 예컨대 HER2 또는 ErbB 클래스의 여타 구성원들, 또는 신호전달 경로 구성요소들, 예컨대 PI3K) 의 이량체화 존재유무, 발현 수준 및/또는 활성화 상태는 고체 담지체 상에 속박되어 있는 포획 항체의 연속 희석물을 포함하는 항체-기반의 어레이를 이용해 검출된다. 어레이는 일반적으로 상이한 위치지정가능한 위치에서 고체 담지체의 표면에 커플링되어 있는 일정 범위의 포획 상체 농도의 여러개의 상이한 포획 항체를 포함한다.
한가지 특별한 구현예에서, 본 발명은 각 연속 희석물 중의 포획 항체가 신호 전달 경로의 구성요소 및 여타 표적 단백질에 해당하는 하나 이상의 분석물에 특이적인, 고체 담지체에 속박되어 있는 포획 항체의 여러 연속 희석물을 포함하는 월등한 동적 범위를 가진 고려가능한 검정을 제공한다. 다양한 국면에서, 상기 구현예는 특별한 종양에 특징적인 신호 전달 경로, 예를 들어, 유방암 세포에서 활성인 신호 전달 경로 (예를 들어, HER 경로) 의 구성요소들을 포함하는 어레이를 포함한다. 따라서, 본 발명은 유리하게는, 단일 어레이 또는 칩 상에 각 신호 전달 분자 또는 잠재적 발현 또는 활성화 결함이 있는 관심대상의 여타 단백질들이 제시되도록 하여 실시될 수 있다. 일부 국면에서, 특별한 종양 세포에서 활성인 주어진 신호 전달 경로의 구성요소들은 세포내 신호 전달 경로를 통해 정보가 승계되는 순서에 대응하는 선형적 순서로 어레이에 배치된다. 그러한 어레이의 예시는 본원에 기재되어 있고, 어느 목적으로든 본원에 그 전문이 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 8,163,499 및 PCT 공보 번호 WO2009/108637 에 개시되어 있다. 특별한 종양 세포에서 활성인 주어진 신호 전달 경로의 하나 이상의 구성요소에 특이적인 포획 항체는 또한 임의의 표면-관련 인공물을 최소화하기 위해 무작위적 방식으로 인쇄될 수 있다.
고체 담지체는 단백질 고정을 위한 임의의 적합한 기판을 포함할 수 있다. 고체 담지체의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 유리 (예를 들어, 유리 슬라이드), 플라스틱, 칩, 핀, 필터, 비드, 종이, 멤브레인, 섬유다발, 겔, 금속, 세라믹 등이 포함된다. 멤브레인, 예컨대 나일론 (BiotransTM, ICN Biomedicals, Inc. (Costa Mesa, CA); Zeta-Probe®, Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA)), 니트로셀룰로오스 (Protran®, Whatman Inc. (Florham Park, NJ)), 및 PVDF (ImmobilonTM, Millipore Corp. (Billerica, MA)) 가 본 발명의 어레이에서 고체 담지체로서 이용하기에 적합하다. 바람직하게는, 포획 항체는 니트로셀룰로오스 중합체로 코팅된 유리 슬라이드, 예를 들어, Whatman Inc. (Florham Park, NJ) 사에서 시판하여 입수가능한 FAST® Slides 에 속박되어 있다.
바람직한 고체 담지체의 특별한 국면은 대량의 포획 항체에 결합하는 능력 및 변성을 최소화하며 포획 항체에 결합하는 능력을 포함한다. 또다른 적합한 국면은, 포획 항체를 포함하는 항체 용액이 담지체에 적용될 때 최소의 "위킹 (wicking)" 을 나타내는 것이다. 최소의 위킹이 있는 고체 담지체는 적은 분취량의 포획 항체 용액이 담지체에 적용되도록 하여, 작은, 정해진 스팟의 고정된 포획 항체를 제공하게 된다.
포획 항체는 일반적으로 공유적 또는 비공유적 상호작용 (예를 들어, 이온 결합, 소수성 상호작용, 수소 결합, Van der Waals 힘, 쌍극자-쌍극자 결합) 을 통해 고체 담지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 (예를 들어, 포획 태그를 통해) 속박되어 있다. 일부 구현예에서, 포획 항체는 표준 가교결합 방법 및 조건을 이용해 동종이중관능성 또는 이종이중관능성 크로스링커를 이용해 고체 담지체에 공유결합으로 결합되어 있다. 적합한 크로스링커는 예를 들어, Pierce Biotechnology (Rockford, IL) 와 같은 공급사에서 시판하여 입수가능하다.
본 발명에 사용하기에 적합한 어레이 생성 방법은, 이에 제한되지 않으나 단백질 또는 핵산 어레이 구축에 이용되는 임의의 기법을 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 항체는 스플릿 핀, 블런트 핀, 또는 잉크젯 프린팅이 장착되어 있는 일반적으로 로보틱 프린터인 마이크로스팟터 (microspotter) 를 이용해 어레이에 스팟팅한다. 본원에 기재된 항체 어레이 프린팅에 적합한 로보틱 시스템은, ChipMaker2 스필트 핀 (split pins) (TeleChem International; Sunnyvale, CA) 이 있는 PixSys 5000 로봇 (Cartesian Technologies; Irvine, CA) 뿐만 아니라, BioRobics (Woburn, MA) 사 및 Packard Instrument Co. (Meriden, CT) 사에서 입수가능한 여타 로보틱 프린터를 포함한다. 바람직하게는, 각 포획 항체 희석액을 2, 3, 4, 5, 또는 6 회 이상 반복하여 어레이에 스팟팅한다.
본 발명에 사용하기에 적합한 어레이를 생성하는 또다른 방법은 정해진 부피의 약체를 담지체에 올리기에 유효한 조건 하에 모세관 디스펜서를 고체 담지체 상에 접촉시켜 알고 있는 부피의 포획 항체 희석액을 각 선별된 어레이 위치에 제공하는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 프로세스는 각 선별된 어레이 위치에서 선별된 포획 항체 희석액을 이용해 반복되어 완전한 어레이를 제공하게 된다. 상기 방법은 상기 어레이를 여러개 제조할 때 실시될 수 있는데, 여기서 용액-침지 단계가 각 반복 싸이클에서 여러 고체 담지체 각각의 선별된 위치에 적용된다. 그러한 방법에 대한 추가적인 설명은 예를 들어, 미국 특허 5,807,522 에서 찾을 수 있다.
특별한 경우, 종이에 인쇄하는 기기를 이용하는 항체 어레이를 제공할 수 있다. 예를 들어, 원하는 포획 항체 희석액이 데스크탑 젯트 프린터의 프린트헤드에 로오딩되어, 적합한 고체 담지체 상에 인쇄될 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Silzel et al, Clin. Chem., 44:2036-2043 (1998)).
일부 구현예에서, 고체 담지체 상에 제공된 어레이의 밀도는 약 5 스팟/cm2 이상, 바람직하게는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 또는 9000, 또는 10,000 스팟/cm2 이상이다.
특별한 경우, 고체 담지체 상의 스팟들은 각각 상이한 포획 항체를 나타낸다. 특정한 다른 경우, 고체 담지체 상의 여러 스팟이, 예를 들어 점점 감소시킨 농도의 일련의 포획 항체를 포함하는 연속 희석물과 같이 동일한 포획 항체를 나타낸다.
고체 담지체 상에 항체 어레이를 제조 및 구축하는 방법의 추가적인 예시는 미국 특허 번호 6,197,599, 6,777,239, 6,780,582, 6,897,073, 7,179,638, 7,192,720, 및 7,771,955; 미국 특허 공보 번호 20060115810, 20060263837, 및 20070054326; 및 문헌 [Varnum et al, Methods Mol. Biol, 264: 161-172 (2004)] 에 기재되어 있다.
항체 어레이의 스캐닝 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 이에 제한되지 않으나, 단백질 또는 핵산 어레이를 스캔하는데 이용되는 임의의 기법을 포함한다. 본 발명에 이용하기에 적합한 마이크로어레이 스캐너는 PerkinElmer (Boston, MA), Agilent Technologies (Palo Alto, CA), Applied Precision (Issaquah, WA), GSI Lumonics Inc. (Billerica, MA), 및 Axon Instruments (Union City, CA) 사들로부터 입수가능하다. 비제한적 예시로서, 형광 검출을 위한 GSI ScanArray3000 가 정량을 위한 ImaGene 소프트웨어와 함께 이용될 수 있다.
A. 이량체화 검출 검정
한 구현예에서, 본 발명은, 이에 제한되지 않으나, HER1/HER2 이량체, HER1/HER3 이량체, HER2/HER3 이량체, HER2/HER2 이량체, HER2/HER4 이량체, p95HER2/HER3 이량체, p95HER2/HER2 이량체 등을 포함하는 동종- 또는 이종수용체 타이로신 키나아제의 이량체 형성을 검출 및/또는 정량하기 위한 검정을 제공한다. 동종이량체는 동종이량체화로 지칭되는 프로세스에서 HER2/HER2 와 같은 두가지 동일한 분자에 의해 형성되는 한편, 이종이량체는 이종이량체화로 지칭되는 프로세스에서 HER1/HER3 와 같은 두가지 상이한 거대분자에 의해 형성된다. 상기 국면에서, 검정은 3 가지 항체를 포함한다: (1) 이량체쌍의 한 구성원에 특이적인 포획 항체; (2) 이량체쌍의 제 1 구성원에 특이적인 제 1 검출 항체, 여기서 제 1 검출 항체는 포획 항체와는 상이한 도메인에 특이적임; 및 (3) 이량체쌍의 제 2 구성원에 특이적인 제 2 검출 항체.
특정 CEER 기법이 미국 특허 8, 163,299, 미국 특허 공보 번호 20080261829, 20090035792, 20100167945, 20110071042 및 20110281748 에 개시되어 있다. 추가적인 상세사항은 예를 들어 그의 전문이 본원에 참고문헌으로 포함되는 WO 2010/132723 및 WO 2011/008990 에서 찾을 수 있다.
도 1A 내지 C 는 수용체 타이로신 키나아제의 이량체화 검출을 위한 상기 근접 검정의 한 구현예를 보여준다. 도 1A 에 제시된 바와 같이, 포획 항체 112 가 사용되어 RTK 이량체의 한 구성원, 예를 들어 HER2 113 를 포획한다. 이어서, 제 1 검출 항체 115 가 HER2 상의 상이한 위치 (예를 들어, 에피토프) 에 결합하기 위해 이용된다. 이어서, 제 2 검출 120 항체는 이량체화된 제 1 수용체 타이로신 키나아제, HER3 125 에 결합하는데 이용된다. 제 1 검출 항체는 이량체의 한 구성원에 특이적인 하나 또는 여러개의 제 1 활성화 상태-독립적 항체를 포함하는 반면, 하나의 제 2 검출 항체 또는 여러개의 제 1 검출 항체는 이량체의 여타 구성원에 특이적이다. 제 1 검출 항체를 촉진성 부분, 예를 들어 글루코오스 옥시다아제 (GO) 로 표지하며, 제 2 검출 항체를 신호 증폭쌍의 제 1 구성원, 예를 들어 고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 로 표지한다. 촉진성 부분은 산화제, 예를 들어 과산화수소를 생성하여, 신호 증폭쌍의 제 1 구성원으로 채널링하여 반응하게 된다. 이후, 여러개의 검출가능한 포획된 분석물을 신호 증폭쌍의 제 2 구성원, 예를 들어 티라마이드 또는 티라마이드 바이오틴과 인큐베이션하여, 증폭된 신호를 생성한 후, 이것이 검출된다. 여타 이종이량체 예시들, 예컨대 HER2/HER1 이량체 및 HER3/HER1 이량체가 각각 도 1B 및 도 1C 에 제시된다.
수용체 타이로신 키나아제의 이량체화 측정을 위한 적합한 활성화 상태-독립적 항체에는 아직 활성화 (예를 들어, 포스포릴화) 되지 않은 아미노산 잔기를 갖고 있는 수용체 타이로신 키나아제 상의 에피토프에 결합하는 임의의 항체가 포함된다. 본 발명에 이용하기에 적합한 RTK, 예컨대 ErbB 클래스의 구성원들, cMET, IGF-1R 등에 결합하는 활성화 상태-독립적 항체는, 이에 제한되지 않으나 Cell Signaling Technology (Danvers, MA), Thermo Scientific (Waltham, MA), Abeam (Cambridge, MA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), 및 EMD Millipore (Billerica, MA) 사에서 시판하여 입수가능하다.
수용체 타이로신 키나아제의 이량체화 측정에 적합한 활성화 상태-의존적 항체에는 아직 활성화 (예를 들어, 포스포릴화) 되지 않은 아미노산 잔기를 갖고 있는 수용체 타이로신 키나아제 상의 에피토프에 결합하는 임의의 항체가 포함된다. 본 발명에 이용하기에 적합한 RTK, 예컨대 ErbB 클래스의 구성원들, cMET, IGF-1R 등에 결합하는 활성화 상태-독립적 항체는, 이에 제한되지 않으나 Cell Signaling Technology (Danvers, MA), Thermo Scientific (Waltham, MA), Abeam (Cambridge, MA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), 및 EMD Millipore (Billerica, MA) 사들로부터 시판하여 입수가능하다.
한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 암을 갖고 있거나 또는 암을 가진 것으로 추정되는 대상체의 치료법을 선택하는 방법을 밝혀냈다:
(a) 둘 이상의 수용체 타이로신 키나아제 (RTK) 의 이량체화를 측정하는 단계, 여기서 측정은 하기 단계들을 포함한다: (i) 세포 추출물을 포획 항체의 하나 또는 여러개의 연속 희석물과 인큐베이션하여 여러 포획 분석물을 형성하는 단계; (ii) 여러 포획 분석물을 각각 분석물의 이량제화된 쌍의 제 1 구성원 및 제 2 구성원에 특이적인 제 1 의 또는 여러개의 제 1 활성화 상태-독립적 항체 및 제 2 의 또는 여러개의 제 2 활성화 상태-독립적 항체를 함유하는 검출 항체와 인큐베이션하여, 여러 검출가능한 포획된 이량체화된 분석물을 형성하는 단계, 여기서 제 1 활성화 상태-독립적 항체는 촉진성 부분으로 표지하고, 제 2 활성화 상태-독립적 항체는 신호 증폭쌍의 제 1 구성원으로 표지하고, 촉진성 부분이 신호 증폭쌍의 제 1 구성원으로 채널링하여 반응하는 산화제를 생성함; (iii) 여러 검출가능한 포획 이량체화 분석물을 신호 증폭쌍의 제 2 구성원과 인큐베이션하여 증폭된 신호를 생성하는 단계; 및 (iv) 신호 증폭쌍의 제 1 및 제 2 구성원으로부터 생성된 증폭된 신호를 검출하는 단계; 및
(b) 둘 이상의 RTK 의 이량체화를 동일한 2 개의 RTK 의 기준 이량체화 프로파일과 비교하여 항암제를 선택하는 단계, 여기서 기준 이량체화 프로파일은 항암제의 부재 하에 생성됨.
일부 구현예에서, 상기 방법은 둘 이상의 RTK 의 이량체화 수준을 둘 이상의 RTK 에 대해 생성되는 표준 곡선에 대해 포정하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 추출물은 항암제 투여 후 암이 있는 대상체로부터 분리한다. 일부 구현예에서, 세포 추출물을 항암제와 접촉시킨다. 일부 구현예에서, 항암제를 PI3K 조절 화합물, RTK 조절 화합물, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택한다.
바람직한 국면에서, 증폭된 신호의 양은 이량체화된 수용체 타이로신 키나아제의 양과 상관관계가 있다.
포획 항체 및 검출 항체는 바람직하게는 이들의 분석물 결합과의 경쟁 (즉, 포획 및 검출 항체 두가지 모두가 동시에 그의 해당하는 신호 전달 분자들에 결합할 수 있음) 을 최소화하도록 선택된다.
다양한 촉진성 부분들이 본 발명에서 유용하다. 본 발명에 사용하기에 적합한 촉진성 부분에는 촉진성 부분에 근접한 (즉, 공간적으로 인접 또는 근접) 또다른 분자에 채널링 (즉, 그로 향함) 하여 반응 (즉, 결합하거나, 결합되어 있거나 또는 그와 복합체를 형성) 하는 산화제를 생성할 수 있는 임의의 분자가 포함된다. 촉진성 부분의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 효소, 예컨대 글루코오스 옥시다아제 또는 전자 수용체와 같이 분자 산소 (O2) 를 수반하는 산화/환원 반응을 촉매하는 효소, 및 광감작제, 예컨대 메틸렌 블루, 로즈 벵갈, 포르피린, 스쿼네이트 염료, 프탈로시아닌 등이 포함된다. 산화제의 비제한적 예시에는 과산화수소 (H2O2), 단일항 산소, 및 산소 원자를 운반하거나 또는 산화/환원 반응에서 전자를 얻는 임의의 여타 화합물이 포함된다. 바람직하게는, 적합한 기질 (예를 들어, 글루코오스, 광 등) 의 존재 하에, 촉진성 부분 (예를 들어, 글루코오스 옥시다아제, 광감작제, 등) 는 두 부분이 서로 근접하여 존재할 때 신호 증폭쌍의 제 1 구성원 (예를 들어, 고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP), 보호기에 의해 보호받는 합텐, 효소 저해제에 대한 티오에테르 연결에 의해 불활성화되는 효소 등) 에 채널링하여 반응하는 산화제 (예를 들어, 과산화수소 (H2O2), 단일 산소, 등) 를 생성한다.
적합한 신호 증폭쌍에는, 이에 제한되지 않으나, 퍼옥시다아제, 예컨대 고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP), 카탈라아제, 클로로퍼옥시다아제, 시토크롬 c 퍼옥시다아제, 에오시노필 퍼옥시다아제, 글루타티온 퍼옥시다아제, 락토퍼옥시다아제, 미엘로퍼옥시다아제, 티로이드 퍼옥시다아제, 데이오디나아제 등이 포함된다. 신호 증폭쌍 구성원의 또다른 예시에는 보호기에 의해 보호받는 합텐 및 효소 저해제에 대한 티오에테르 결합에 의해 불활성화되는 효소가 포함된다.
근접 채널링의 한 예시에서, 촉진성 부분은 글루코오스 옥시다아제 (GO) 이고, 신호 증폭쌍의 제 1 구성원은 고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 이다. GO 가 글루코오스와 같은 기질과 접촉시, 산화제 (예컨대, 과산화수소 (H2O2)) 를 생성한다. HRP 가 GO 에 대한 채널링 근접권에 있다면, GO 에 의해 생성되는 H2O2 는 HRP 에 채널링되어 복합체를 형성하여 HRP-H2O2 복합체를 형성하게 되며, 이는 신호 증폭쌍의 제 2 구성원 (예를 들어, 화학발광 기질, 예컨대 루미놀 또는 이소루미놀 또는 형광생성 기질, 예컨대 티라마이드 (예를 들어, 바이오틴-티라마이드), 호모바닐산, 또는 4-히드록시페닐 아세트산) 의 존재 하에 증폭 신호를 생성할 것이다. 바이오틴-티라마이드가 신호 증폭쌍의 제 2 구성원으로 이용되는 경우, HRP-H2O2 복합체는 티라마이드를 산화시켜 친핵성 잔기 근처에 공유결합으로 결합하는 반응성 티라마이드 라디칼을 생성한다. 활성화된 티라마이드는 직접 검출되거나 또는, 예를 들어 스트렙타비딘-표지된 형광단 또는 스트렙타비딘-표지된 퍼옥시다아제 및 발색 시약의 조합물과 같은 신호-검출 시약 첨가시 검출된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 형광단의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, Alexa Fluor® 염료 (예를 들어, Alexa Fluor®555), 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이트 (FITC), Oregon GreenTM; 로다민, 텍사스 레드 (Texas red), 테트라로다민 이소티오시네이트 (TRITC), CyDyeTM fluor (예를 들어, Cy2, Cy3, Cy5) 등이 포함된다. 스트렙타비딘 표지는 당업계에 널리 공지된 방법을 이용해 형광단 또는 퍼옥시다아제에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 발색 시약의 비제한적 예시에는, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB), 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB), 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산) (ABTS), 4-클로로-1-나프톨 (4CN), 및/또는 포르피리노겐이 포함된다.
근접 채널링의 또다른 예시에서, 촉진성 부분은 광감작제이고, 신호 증폭쌍의 제 1 구성원은 특정한 결합 파트너 (예를 들어, 리간드, 항체 등) 에 대한 합텐의 결합을 방해하는 보호기를 이용해 보호되는 다중 합텐으로 표지되는 대형 분자이다. 예를 들어, 단일 증폭쌍 구성원은 보호된 바이오틴, 쿠마린 및/또는 플루오레신 분자로 표지되는 덱스트란 분자일 수 있다. 적합한 보호기에는, 이에 제한되지 않으나, 페녹시-, 아날리노-, 올레핀-, 티오에테르-, 및 셀레노에테르-보호기가 포함된다.
추가적인 광감작제 및 보호된 합텐 분자는 미국 특허 5,807,675 에 기재되어 있다. 광감작제가 광을 여기시키는 경우, 산화제 (즉, 단일항 산소) 를 생성한다. 합텐 분자가 광감작제에 대해 채널링 근접권에 있다면, 광감작제에 의해 생성된 단일항 산소가 합텐의 보호기 상의 티오에테르에 채널링하여 그와 반응해 카르보닐기 (케톤 또는 알데히드) 및 술핀산을 생성하여, 합텐으로부터 보호기를 방출한다. 이어서, 보호되지 않은 합텐은 신호 증폭쌍의 제 2 구성원 (예를 들어, 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 특이적 결합 파트너) 에 특이적으로 결합할 수 있게 된다. 예를 들어, 합텐이 바이오틴인 경우, 특이적 결합 파트너는 효소-표지된 스트렙타비딘일 수 있다.
예시 효소에는 알칼리성 포스파타아제, β-갈락토시다아제, HRP 등이 포함된다. 미결합 시약을 제거하기 위해 세척한 후, 검출가능한 신호는 효소의 검출가능한 (예를 들어, 형광성, 화학발광성, 발색성 등) 기질을 첨가하여 생성될 수 있으며, 당업계에 공지된 적합한 방법을 이용해 검출될 수 있다. 대안적으로, 검출가능한 신호는 티라마이드 신호 증폭을 이용해 증폭될 수 있고, 활성화된 티라마이드는 직접 검출되거나 또는 본원에 기재된 바와 같은 신호-검출 시약의 첨가시 검출된다.
근접 채널링의 또다른 예시에서, 촉진성 부분은 광감작제이고, 신호 증폭쌍의 제 1 구성원은 효소-저해제 복합체이다. 효소 및 저해제 (예를 들어, 포스폰산-표지 덱스트란) 는 절단가능한 링커 (예를 들어, 티오에테르) 에 의해 함께 결합되어 있다. 광감작제가 광으로 여기되는 경우, 산화제 (예를 들어, 단일항 산소) 가 생성된다. 효소-저해제 복합체가 광감작제에 대한 채널링 근접권에 있을 때, 광감작제에 의해 생성되는 단일항 산소는 절단가능한 링커에 채널링되어 반응하여, 효소로부터 저해제를 방출함으로써 효소를 활성화시킨다. 효소 기질이 첨가되어 검출가능한 신호를 생성시키거나, 또는 대안적으로 증폭 시약이 첨가되어 증폭된 신호를 생성한다.
근접 채널링의 또다른 예시에서, 촉진성 부분은 HRP 이고, 신호 증폭쌍의 제 1 구성원이 상기 기재된 바와 같은 보호된 합텐 또는 효소-저해제 복합체이며, 보호기는 p-알콕시 페놀을 포함한다. 페닐렌디아민 및 H2O2 의 첨가로 보호된 합텐 또는 효소-저해제 복합체에 채널링되어 p-알콕시 페놀 보호기와 반응하여 노출된 합텐 또는 반응성 효소를 제공하게 되는 반응성 페닐렌 디이민을 생성한다. 증폭된 신호가 생성되고, 상기 기재된 바와 같이 검출된다 (참고문헌은, 예를 들어 미국 특허 번호 5,532,138 및 5,445,944).
한 구현예에서, 세포 추출물은 시료로부터 분리된 추출물을 함유한다. 특별한 경우, 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 미세침 흡출물 (FNA), 뇨, 변, 기관지 세척액, 눈물, 유두 흡출물, 림프, 타액 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 또다른 구현예에서, 시료는 고형 종양 암이 있는 환자로부터 수득된다. 그러한 암의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 유방암, 폐암 (예를 들어, 비-소세포 폐암종), 위암, 췌장암, 대장암 및 이들의 조합이 포함된다.
일부의 경우, 세포 추출물은 항암 치료요법을 받은 암 환자로부터 분리된다. 특별한 경우, 분리된 세포는 항암제 또는 항암제의 조합물에 접촉시킨다. 일부의 경우, 항암제에는 PI3K 저해제 또는 RTK 조절 화합물, 예컨대 HER1, HER2, HER3, cMET 또는 IGF-1R 저해제) 가 포함된다. 다른 경우, 분리된 세포는 성장 인자 자극 전에 항암제 또는 항암제의 조합물과 인큐베이션한다. 또다른 경우, 분리된 세포를 성장 인자 자극 후에 해리시켜 세포 추출물을 제공한다.
본 발명의 방법은 유방암, 대장암, 위암, 폐암 또는 췌장암과 같은 고형 종양 암이 발생할 위험이 있거나, 암이 있을 것으로 추정되거나 또는 암으로 진단된 환자에서 하나 이상의 발암성 RTK (예를 들어, HER1, HER2, HER3, p95HER2, cMET 및 IGF-1R) 의 RTK 활성화 (예를 들어, 포스포릴화) 상태 결정에 특히 유용하다. 특별한 경우, 본 발명의 방법은 활성화된 (예를 들어, 포스포릴화된) RTK (예를 들어, phospho-HER2 수준) 를 측정해 대상체가 활성화된 형태의 하나 이상의 RTK 클래스 단백질을 발현하는지 여부 (예를 들어, HER2-양성 환자) 를 결정하여 대상체에서의 암의 진단 및 예후결정을 보조, 지원 또는 촉진한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 이미 하나 이상의 발암유전자 단백질을 발현하는 것으로 결정된 대상체에서 실시되어, 치료요법을 최적화하고, 독성을 감소시키고, 치료요법 처치의 효능을 모니터링하고/하거나, 치료요법에 대한 적응성 비-응답성을 검출하게 된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 RTK 경로 및/또는 연관되거나 또는 벌충적인 경로의 하나 이상의 효과기 및 어댑터 단백질의 활성화 상태의 결정을 포함한다. 일부의 경우, 연계되어 있거나 또는 벌충적인 경로가 항암 치료요법에 대한 종양 적응시 조절이탈하게 된다.
B. PI3K 복합체에 대한 검출 검정
예를 들어, HER3 활성화가 PI3K 활성화를 초래한다는 것이 공지되어 있다. 그러나, 놀랍게도 특별한 경우 및 특별한 조건 하에서는 HER3 포스포릴화 및 PI3K 포스포릴화가 함께 일어난다는 것을 발견하게 되었다. 본원에 기재된 검정을 이용하면, PI3K 복합체의 양 및 PI3K 복합체의 활성화 및/또는 포스포릴화 양을 검출 및 정량하는 것이 가능하다. PI3K 복합체는 하기를 포함한다: i) 이량체화된 수용체 타이로신 키나아제 쌍; ii) PI3K p85 서브유닛 및 PI3K p110 (예를 들어, α 또는 β) 서브유닛. 검정은 3 가지 항체를 포함한다: (1) PI3K p85 또는 PI3K p110 서브유닛에 특이적인 포획 항체; (2) 이량체쌍의 제 1 구성원에 특이적인 제 1 검출 항체, 또는 PI3K 서브유닛, 여기서 제 1 검출 항체는 포획 항체와는 상이한 도메인에 특이적이며, PI3K 서브유닛은 활성화될 수 있음; 및 (3) 이량체쌍의 제 2 구성원에 특이적인 제 2 검출 항체 또는 PI3K 서브유닛.
도 2 는 본원에 기재된 방법 및 검정으로 검출가능한 PI3K 복합체 210 의 한 구현예를 보여준다. 상기 구현예에서, (1) PI3K p85 서브유닛 212 는 포획 항체 220 에 의해 결합되어 있고; (2) 제 1 검출 항체 250 은 PI3K p110α 또는 β 서브유닛에 특이적이고; (3) 제 2 검출 항체 230 은 이량체쌍의 제 1 구성원에 특이적이다.
도 3 은 본원에 기재된 방법 및 검정으로 검출가능한 활성화된 PI3K 복합체 310 의 또다른 구현예를 보여준다. 상기 구현예에서, (1) PI3K p85 서브유닛은 포획 항체 320 에 결합되어 있고; (2) 제 1 검출 항체 360 은 PI3K p110α 또는 β 서브유닛에 특이적이고; (3) 제 2 검출 항체는 PI3K 서브유닛 상의 포스포릴화 부위, 예컨대 p85 (예를 들어, Y452, Y458, Y460, Y463, Y467, Y688, Y470, 또는 여타 pTyr 부위) 상의 포스포릴화에 특이적인 활성화 상태-의존적 항체 330 을 포함한다.
도 4A 는 본원에 기재된 방법 및 검정으로 검출가능한 활성화된 PI3K 복합체의 또다른 구현예를 보여준다. 도 4A 에 제시된 구현예에서, (1) PI3K p85 서브유닛이 포획 항체 421 에 의해 결합되어 있고; (2) 제 1 검출 항체 430 가 이량체화된 수용체 타이로신 키나아제의 한 구성원 (예를 들어, HER1, HER2, HER3, cMET, IGF-1R 등) 에 특이적인 활성화 상태-독립적 항체를 포함하고; (3) 제 2 검출 항체 450 이 PI3K 서브유닛 상의 포스포릴화 부위, 예컨대 p85 (예를 들어, Y452, Y458, Y460, Y463, Y467, Y688, Y470, 또는 여타 pTyr 부위) 에 특이적인 활성화 상태-의존적 항체를 포함한다.
도 4B 는 본원에 기재된 방법 및 검정으로 검출가능한 PI3K 복합체의 또다른 구현예를 보여준다. 도 4B 에 제시된 구현예에서, (1) PI3K p85 서브유닛이 포획 항체 452 에 의해 결합되어 있고; (2) 제 1 검출 항체 471 이 이량체화된 수용체 타이로신 키나아제의 한 구성원 (예를 들어, HER1, HER2, HER3, cMET, IGF-1R 등) 에 특이적인 활성화 상태-독립적 항체를 포함하고; (3) 제 2 검출 항체 491 이 이량체화된 쌍의 여타 구성원에 특이적인 활성화 상태-독립적 항체를 포함한다.
도 4C 는 비-처리 세포와 비교한, 헤르굴린 (HRG) 으로 처리한 T47D 세포 (인간 유방의 관 상피내암 세포주) 에서의 활성화된 PI3K 복합체들의 검출을 도시한다. 일부 구현예에서, PI3K 복합체들의 검출은 또한 활성화된 (예를 들어, 포스포릴화된) PI3K 의 검출과 상관관계가 있을 것이다.
도 5A 는 본원에 기재된 방법 및 검정에 의해 검출가능한 PI3K 복합체의 또다른 구현예를 보여준다. 도 5A 에 제시된 구현예에서 (1) PI3K p110 서브유닛은 포획 항체 501 에 의해 결합되어 있고; (2) 제 1 검출 항체 515 가 이량체화된 수용체 타이로신 키나아제의 한 구성원 (예를 들어, HER1, HER2, HER3, cMET, IGF-1R 등) 에 특이적인 활성화 상태-독립적 항체를 포함하고; (3) 제 2 검출 항체 525 가 PI3K 서브유닛 상의 포스포릴화 부위, 예컨대 p85 (예를 들어, Y452, Y458, Y460, Y463, Y467, Y688, Y470, 또는 여타 pTyr 부위) 에 특이적인 활성화 상태-의존적 항체를 포함한다. 특정 국면에서, phospho-PI3K 검출을 위한 p85 포획은 p110 포획보다 더 민감하다.
도 5B 는 본원에 기재된 방법 및 검정으로 검출가능한 PI3K 복합체의 한 구현예를 보여준다. 도 5B 에 제시된 구현예에서 (1) PI3K p85 서브유닛이 포획 항체 530 에 의해 결합되어 있고; (2) 제 1 검출 항체 550 이 수용체 타이로신 키나아제의 이량체 중 한 구성원 (예를 들어, HER1, HER2, HER3, cMET, IGF-1R 등) 에 특이적인 활성화 상태-독립적 항체를 포함하고; (3) 제 2 검출 항체 562 가 PI3K 서브유닛 상의 포스포릴화 부위, 예컨대 p85 (예를 들어, Y452, Y458, Y460, Y463, Y467, Y688, Y470, 또는 여타 pTyr 부위) 에 특이적인 활성화 상태-의존적 항체를 포함한다.
PI3K 복합체 수준 측정에 적합한 항체에는, PI3K p110 서브유닛 (예를 들어, α 또는 β), PI3K p85 서브유닛 또는 이량체화된 수용체 타이로신 키나아제쌍의 에피토프에 대해 특이적인 (즉, 인식, 결합, 또는 그와 복합체 형성) 임의의 항체가 포함된다.
적합한 활성화 상태-독립적 항체는 PI3K p110 서브유닛, PI3K p85 서브유닛 또는 이량체화된 수용체 타이로신 키나아제쌍의 에피토프에 결합하며, 여기서 상기 에피토프에는 포스포릴화된 아미노산 잔기가 없다. 그러한 활성화 상태-독립적 항체에는 PI3K p85 서브유닛 항체 (Cell Signaling Technology 사의 카탈로그 #4257, #4292; Santa Cruz Biotechnology 사의 카탈로그 번호 sc-12929, sc-56934, sc-56938, sc-71892, sc-71891, 및 sc-3761 12, sc-292114, 및 sc-131325; Abeam 사의 카탈로그 번호 ab86714, ab22653, ab40755, ab250, abl35253, ab71925, ab63040, ab90578, abl33595, abl35952, ab65261, 및 ab71522), PI3K p110α 서브유닛 항체 (Cell Signaling Technology 사의 카탈로그 #4249 및 #4249; Santa Cruz Biotechnology 사의 카탈로그 번호 sc-7248, sc-7189, sc-8010, sc-7174, sc-1332, sc-1331), 및 PI3K p110β 서브유닛 항체 (Cell Signaling Technology 사의 카탈로그 #3011; Santa Cruz Biotechnology 사의 카탈로그 번호 sc-7248, sc-7189, sc-8010, sc-376641, sc-376412, sc-376492, sc-603, sc-7175, sc-602; Abeam 사의 카탈로그 번호 ab32569, ab55593, ab97322, 및 ab32874) 가 포함된다.
이량체화된 RTK 에 특이적인 적합한 활성화 상태-독립적 항체에는, HER1 에 대한 항체 (Cell Signaling Technology 사의 카탈로그 #2646, #2239, #2239, #2963, #3265, 및 #2232; Santa Cruz Biotechnology 사의 카탈로그 번호 sc-374607, sc-365829, sc-80543, sc-120, sc-03, sc-101, sc-373476, sc-31155, sc-71031, sc-81451 및 sc-71037), HER2 에 대한 항체 (Cell Signaling Technology 사의 카탈로그 #2165, #2248, #3250 및 #2242), HER3 에 대한 항체 (Cell Signaling Technology 사의 카탈로그 #4754; Santa Cruz Biotechnology 사의 카탈로그 번호 sc-415, sc-7390, sc-292557, sc-81455, sc-81454, sc-71067, sc-53279, 및 sc-285), 및 HER4 에 대한 항체 (Cell Signaling Technology 사의 카탈로그 #4795; Santa Cruz Biotechnology 사의 카탈로그 번호 sc-31 150, sc-8050, sc-81456, sc-71071, sc-71070, sc-53280, sc31 151, sc-283, 및 sc-31149) 가 포함된다.
일부 구현예에서, p110α 서브유닛에 결합하는 항체가 본 발명에 이용된다. 일부 구현예에서, p110β 서브유닛에 결합하는 항체가 본 발명에 이용된다. PI3K 에 대한 적합한 활성화-의존성 항체가 본원에 그의 전문이 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 공보 20080014595 에 기재되어 있다. PI3K 에 대한 항체는 또한, 이에 제한되지 않으나, Upstate (Temecula, CA), Biosource (Camarillo, CA), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), BD Biosciences (San Jose, CA), Thermo Scientific (Waltham, MA), Abeam (Cambridge, MA), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), 및 EMD Millipore (Billerica, MA) 사들로부터 시판되어 입수가능하다.
예를 들어, 적합한 활성화 상태-의존적 항체가 PI3K p110 서브유닛 또는 p85 서브유닛 상의 에피토프에 결합하는데, 여기서 상기 에피토프는 하나 이상의 포스포릴화된 아미노산 잔기를 갖고 있다 (예를 들어, p85 의 Y688, 또는 여타 pTyr). 그러한 활성화 상태-의존적 항체에는, p-PI3K p85 (Tyr458)/p55 (Tyrl99) 항체 (Cell Signaling Technology 사의 카탈로그 #4228), p-PI3K p85 (Tyr67) 항체 (Santa Cruz Biotechnology 사의 카탈로그 # sc-293115), 및 p-PI3K p85 (Tyr607) 항체 (Abeam 사의 카탈로그 번호 ab61801) 가 포함된다. 본 발명에 유용한 Phospho-PI3K p85 항체는 그의 전문이 본원에 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 공보 번호 20080014595 에 기재되어 있다. 마찬가지로, 본 발명에 유용한 PI3K p110 항체는 그의 전문이 본원에 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 6,274,327 에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, PI3K 항원 (서열 식별 번호: 10 내지 12) 에 특이적인 항체 또는 그의 절편들이 PI3K 복합체화 측정 방법에 이용될 수 있다.
수용체 타이로신 키나아제의 이량체화 측정에 적합한 활성화 상태-의존적 항체에는 활성화된 (예를 들어, 포스포릴화된) 아미노산 잔기가 있는 수용체 타이로신 키나아제의 에피토프에 결합하는 임의의 항체가 포함된다.
본 발명에 사용하기에 적합한 ErbB 클래스의 구성원들, cMET, IGF-1R 등과 같은 RTK 에 결합하는 활성화 상태-의존적 항체는, 이에 제한되지 않으나, Upstate (Temecula, CA), Biosource (Camarillo, CA), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), BD Biosciences (San Jose, CA), Thermo Scientific (Waltham, MA), Abeam (Cambridge, MA), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), 및 EMD Millipore (Billerica, MA) 사로부터 시판되어 입수가능하다.
예를 들어, 이량체화된 RTK 에 특이적인 적합한 활성화 상태-의존적 항체에는, HER1 에 대한 항체 (Cell Signaling Technology 사의 카탈로그 #8808, #3056, #6963, #2231, #2641, #2235, #2237, #2238, #2236, #2234, #2220, #4404, 및 #4407; Santa Cruz Biotechnology 사의 카탈로그 번호 sc-16802, sc-12351, sc-16804, sc-16803, sc-101665, scl01668, sc-101667, 및 sc-101669), HER2 에 대한 항체 (Cell Signaling Technology 사의 카탈로그 #2244, #2241, #6942, #2249, 및 #2247), HER3 에 대한 항체 (Cell Signaling Technology 사의 카탈로그 # 4561, #4787 ,#4791, #2842 및 #8017; Santa Cruz Biotechnology 사의 카탈로그 번호 sc-135654), 및 HER4 에 대한 항체 (Cell Signaling Technology 사의 카탈로그 # 3790 및 #4757; Santa Cruz Biotechnology 사의 카탈로그 번호 sc-33040 및 sc-81491) 가 포함된다.
한가지 특별한 구현예에서, PI3K 복합체의 수준을 측정 (즉, 검출 및 정량) 하기 위한 근접 검정법에서, PI3K 복합체가 a) 이량체화된 수용체 타이로신 키나아제 쌍; b) PI3K p85 서브유닛 및 PI3K p110 서브유닛을 포함하는데, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i)세포 추출물을 포획 항체의 하나 또는 여러개의 연속 희석물과 인큐베이션하여 여러 포획 분석물을 형성하는 단계;
(ii) 여러 포획 분석물을, a) 이량체화된 수용체 타이로신 키나아제 쌍의 한 구성원에 특이적인 제 1 의 또는 여러개의 제 1 활성화 상태-독립적 항체 또는 b) PI3K p110 서브유닛을 함유하는 제 1 검출 항체; 및 a) 이량체화된 수용체 타이로신 키나아제 쌍의 한 구성원, PI3K p85 또는 PI3K p110 서브유닛에 특이적인 제 2 의 또는 여러개의 제 2 활성화 상태-독립적 항체 또는 b)PI3K p85 서브유닛 및/또는 PI3K p110 서브유닛에 특이적인 활성화 상태-의존적 항체를 함유하는 제 2 검출 항체와 인큐베이션하여, 여러개의 검출가능한 포획된 이량체화되고 복합체화된 분석물을 형성하는 단계,
여기서, 제 1 검출 항체를 촉진성 부분으로 표지하고, 제 2 검출 항체를 신호 증폭쌍의 제 1 구성원으로 표지하고, 촉진성 부분이 신호 증폭쌍의 제 1 구성원에 채널링하여 반응하는 산화제를 생성함;
(iii) 여러 검출가능한 포획 이량체화 분석물을 신호 증폭쌍의 제 2 구성원과 인큐베이션하여 증폭된 신호를 생성하는 단계; 및
(iv) 신호 증폭쌍의 제 1 및 제 2 구성원으로부터 생성된 증폭된 신호를 검출하는 단계.
또다른 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 암을 갖고 있거나 또는 암을 가진 것으로 추정되는 대상체의 치료법을 선택하는 방법을 제공한다:
(a) PI3K 복합체 활성화 수준을 측정하는 단계, 여기서 상기 PI3K 복합체는 하기를 포함함: i) 둘 이상의 수용체 타이로신 키나아제 (RTK) 의 이량체화; ii) PI3K p85 서브유닛 및 PI3K p110 서브유닛, 상기 측정은 하기 단계를 포함함: (i) 세포 추출물을 포획 항체의 하나 또는 여러개의 연속 희석물과 인큐베이션하여 여러 포획 분석물을 형성하는 단계; (ii) 여러 포획 분석물을, a) 이량체화된 수용체 타이로신 키나아제 쌍의 한 구성원에 특이적인 제 1 의 또는 여러개의 제 1 활성화 상태-독립적 항체 또는 b) PI3K p110 서브유닛을 포함하는 제 1 검출 항체; 및 a) 이량체화된 수용체 타이로신 키나아제 쌍의 한 구성원, PI3K p85 또는 PI3K p110 서브유닛에 특이적인 제 2 의 또는 여러개의 제 2 활성화 상태-독립적 항체 또는 b) PI3K p85 서브유닛 및/또는 PI3K p110 서브유닛에 특이적인 활성화 상태-의존적 항체를 포함하는 제 2 검출 항체와 인큐베이션하여, 여러 검출가능한 포획된 이량체화 및 복합체화 분석물을 형성하는 단계, 여기서 제 1 검출 항체가 촉진성 부분으로 표지되고, 제 2 검출 항체가 신호 증폭쌍의 제 1 구성원으로 표지되고, 촉진성 부분이 신호 증폭쌍의 제 1 구성원으로 채널링하여 반응하는 산화제를 생성하고; 여러 검출가능한 포획 이량체화 분석물을 신호 증폭쌍의 제 2 구성원과 인큐베이션하여 증폭된 신호를 생성하고; 신호 증폭쌍의 제 1 및 제 2 구성원으로부터 생성된 증폭된 신호를 검출함;
(b) PI3K 복합체 활성화 수준을 기준 PI3K 복합체 활성화 프로파일과 비교하여 항암제를 선택하는 단계, 여기서 기준 복합체 프로파일은 항암제의 부재 하에 생성됨.
바람직한 국면에서, 증폭된 신호의 양은 PI3K 복합체의 양과 상관관계가 있다.
일부 구현예에서, PI3K 복합체의 수준은, i) 둘 이상의 수용체 타이로신 키나아제 (RTK) 의 이량체화; ii) PI3K p85 서브유닛 및 PI3K p110 서브유닛을 포함하는, 상기 PI3K 복합체에 대해 생성되는 표준 곡선에 대해 보정된다.
일부 구현예에서, PI3K 복합체 활성화 수준은 a) 시료 중의 phospho-PI3K 의 양을 시료에 존재하는 PI3K 의 전체 수준과 비교하고, b) 활성화된 PI3K 복합체 대 전체 PI3K 의 비율을 확립하여 결정된다. PI3K 복합체 활성화의 수준은 상기 비율을 기준으로 하여 결정된다. 일부의 경우, PI3K 복합체 활성화의 수준은 컷-오프 역치값 미만이며, 상기 값은 대상체가 PI3K 저해제 치료로 유익함을 얻지 못할 것임을 의미한다. 일부의 경우, PI3K 복합체 활성화 수준은 컷-오프 역치값 초과이며, 상기 값은 대상체가 PI3K 저해제 치료로 유익을 얻을 것임을 의미한다.
일부 구현예에서, 약 3 내지 1000 CU 인 PI3K 복합체 활성화 수준은 PI3K 저해제로 인해 유익을 얻는 암이 있는 대상체의 표식이다. 예를 들어, 암이 있고 PI3K 활성화 수준이 3 내지 1000 CU 인 대상체는 PI3K 저해제에 응답할 공산이 크다. 바람직한 구현예에서, 약 20 내지 500 CU 인 PI3K 복합체 활성화 수준은 PI3K 저해제로 유익을 얻는 암이 있는 대상체의 표식이다. 예를 들어, 암이 있고, PI3K 복합체 활성화 수준이 20 내지 500 CU 인 대상체는 PI3K 저해제에 응답할 공산이 크다. 일부 구현예에서, 1 CU 의 PI3K 복합체화가 있는 시료는 기준 세포주 또는 시료를 이용해 확립된 1 개의 표준 기준의 RFU 값과 동등한 RFU 값을 갖는다.
일부 구현예에서, PI3K 복합체 활성화 (예를 들어, 포스포릴화된 PI3K 복합체) 의 수준은 대상체를 위해 PI3K 저해제만 단독으로 선택되어야 함을 나타낸다. 다른 구현예에서, PI3K 복합체 활성화 수준은 대상체를 위해서는 PI3K 저해제 및 또다른 항암제를 함유하는 병용 치료요법이 선택되어야 함을 나타낸다.
일부 구현예에서, 세포 추출물은 항암제 투여 후 암이 있는 대상체로부터 분리된다. 일부 구현예에서, 세포 추출물은 항암제와 접촉시킨다. 일부 구현예에서, 항암제는 PI3K 조절 화합물, RTK 조절 화합물, 또는 이들의 조합으로 이루어진 것으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 둘 이상의 RTK 가 HER1/HER2 이량체, HER1/HER3 이량체, HER2/HER3 이량체, HER2/HER2 이량체, HER2/HER4 이량체, p95HER2/HER3 이량체, 및 p95HER2/HER2 이량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원이다.
상기 논의된 바와 같이, 근접 채널링의 한 예시에서, 촉진성 부분은 글루코오스 옥시다아제 (GO) 이고, 신호 증폭쌍의 제 1 구성원은 고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 이다. GO 를 글루코오스와 같은 기질에 접촉시키는 경우, 이는 산화제 (예를 들어, 과산화수소 (H2O2)) 를 발생시킨다. HRP 가 GO 에 대한 채널링 근접권에 존재하는 경우, GO 에 의해 생성된 H2O2 는 HRP 에 채널링되어 그와 복합체를 형성하여, HRP-H2O2 를 복합체를 형성하고, 이는 신호 증폭쌍의 제 2 구성원 (예를 들어, 화학발광 기질, 예컨대 루미놀 또는 이소루미놀 또는 형광형성 기질, 예컨대 티라마이드 (예를 들어, 바이오틴-티라마이드), 호모바닐린산, 또는 4-히드록시페닐 아세트산) 의 존재 하에, 증폭된 신호를 생성한다. 바이오틴-티라마이드가 신호 증폭쌍의 제 2 구성원으로 사용되는 경우, HRP-H2O2 복합체는 티라마이드를 산화시켜 부근의 친핵성 잔기에 공유결합으로 결합하는 반응성 티라마이드 라디칼을 생성한다. 활성화된 티라마이드는 직접 검출되거나, 또는 예를 들어 스트렙타비딘-표지된 형광단 또는 스트렙타비딘-표지 퍼옥시다아제 및 발색 시약의 조합물과 같은 신호-검출 시약의 첨가시 검출된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 형광단의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, Alexa Fluor® 염료 (예를 들어, Alexa Fluor® 555), 플루오레신, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), Oregon Green™; 로다민, 텍사스 레드, 테트라로다민 이소티오시네이트 (TRITC), CyDye™ fluor (예를 들어, Cy2, Cy3, Cy5) 등이 포함된다. 스트렙타비딘 표지는 당업계에 널리 공지된 방법을 이용해 형광단 또는 퍼옥시다아제에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 발색 시약의 비제한적 예시는, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB), 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB), 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산) (ABTS), 4-클로로-1-나프톨 (4CN), 및/또는 포르피리노겐을 포함한다.
한 구현예에서, 세포 추출물은 시료로부터 분리된 세포의 추출물을 포함한다. 특별한 경우, 시료는, 전혈, 혈장, 혈청, 미세침 흡출물 (FNA), 뇨, 변, 기관지 세척액, 눈물, 유두 흡출물, 림프, 타액 및 이들의 조합을 포함한다. 또다른 구현예에서, 시료는 고형 종양 암이 있는 환자로부터 수득된다. 그러한 암의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 유방암, 폐암 (예를 들어, 비-소세포 폐암), 위암, 췌장암, 대장암 및 이들의 조합이 포함된다. 일부의 경우, 세포 추출물은 항암제 치료요법을 받은 암 환자로부터 분리된다. 특별한 경우, 분리된 세포는 항암제의 항암제 병용물과 접촉시킨다. 일부의 경우, 항암제에는 PI3K 저해제 또는 RTK 저해제 (예컨대 HER1, HER2, HER3, cMET 또는 IGF-IR 저해제) 가 포함된다. 다른 경우에는, 분리된 세포가 성장 인자 자극 전에 항암제 또는 항암제 조합물과 인큐베이션된다. 또다른 경우, 분리된 세포는 성장 인자 자극 후 해리되어 세포 추출물을 제공한다.
본 발명의 방법은, 고형 종양 암, 예컨대 유방암, 대장암, 위암, 폐 또는 췌장암이 발생할 위험이 있거나, 있는 것으로 의심되거나, 또는 그것으로 진단된 환자에서의 PI3K 복합체 활성화 (예를 들어, 포스포릴화) 상태 결정에 특히 유용하다. 일부의 경우, PI3K 복합체의 활성화는 하나 이상의 활성화된 RTK (예를 들어, HER1, HER2, HER3, p95HER2, cMET 및 IGF-IR), PI3K p85 서브유닛 및 PI3K p110 서브유닛을 포함한다. 특별한 경우, 본 발명의 방법은 활성화된 PI3K 복합체를 측정하여 대상체의 종양 세포가 활성화된 PI3K 복합체를 발현하는지 여부를 결정하여 대상체에서의 암 진단 및 예후를 보조, 지원 또는 촉진하게 된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 발암유전자 단백질을 발현하는 것으로 이미 결정된 대상체에서 치료요법을 최적화하거나, 독성을 감소시키거나, 치료요법 처치의 효능을 모니터링하고/하거나 치료요법에 대한 적응성 무응답성을 검출하기 위해 실시된다.
일부 국면에서, 본 발명의 방법은 추가로 PI3K 경로 또는 연관 및/또는 벌충적인 경로의 하나 이상의 신호 전달 단백질의 활성화 상태를 결정하는 단계를 포함한다. 일부의 경우, 연관되어 있거나 또는 벌충적인 경로는 항암제 치료요법에 대한 종양 적응시 조절이탈된다.
또다른 구현예에서, PI3K 복합체 검정은 하기를 포함한다: (1) PI3K 의 p85 서브유닛에 특이적인 포획 항체; (2) RTK 또는 하류방향 단백질 (예를 들어, 어댑터 단백질, 효과기 또는 키나아제 단백질) 의 활성화된 형태에 결합하는 특이적인 검출 항체; 및 (3) 또다른 RTK 또는 하류방향 단백질 (예를 들면, 어댑터 단백질, 효과기 또는 키나아제 단백질) 의 활성화된 형태를 인식하는 검출 항체의 비제한적 예시에는 CK, She, AKT, CRKL, PDK1, MEK, FAK, PTEN, ERK/MAPK, BRAF, KRAS, PRAS40, 및 p70S6K 이 포함된다.
C. 항체의 제조
아직까지 신호 전달 분자들 (예를 들어, HER2 신호전달 경로 구성요소들 및 PI3K) 의 발현 및/또는 활성화 수준 분석용으로 시판되여 입수가능한 것이 없는 종양 세포와 같은 세포에서의 항체의 제조 및 선택이 본 발명에 따라 몇가지 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 한가지 방법은 당업계에 공지된 단백질 발현 및 정제 방법을 이용해 관심대상의 폴리펩티드 (예를 들어, 항원) 를 발현 및/또는 정제하는 것이며, 또다른 방법은 당업계에 공지된 고상 펩티드 합성 방법을 이용해 관심대상의 폴리펩티들 합성하는 것이다. 참고문헌은, 예를 들어 Guide to Protein Purification, Murray P. Deutcher, ed., Meth. Enzymol, Vol. 182 (1990); Solid Phase Peptide Synthesis, Greg B. Fields, ed., Meth. Enzymol., Vol. 289 (1997); Kiso et al, Chem. Pharm. Bull., 38: 1192-99 (1990); Mostafavi et al, Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids, 1 :255-60, (1995); 및 Fujiwara et al, Chem. Pharm. Bull, 44: 1326-31 (1996). 이어서, 정제 또는 합성된 폴리펩티드는 예를 들어 마우스 또는 토끼에 주입되어, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 생성한다. 당업자는, 예를 들어 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)] 에 기재된 바와 같이, 수많은 과정들이 항체 제조에 이용가능하다는 것을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, PI3K 항원, 예컨대 서열 식별 번호 10 내지 12 의 것이 사용되어 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 항체를 제공할 수 있다. 당업자는 또한 항체를 모방 (예를 들어, 항체의 관능성 결합 영역을 속박하는) 하는 Fab 절편들 또는 절편들이 다양한 과정에 의해 유전자 정보로부터 제조될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 참고문헌은, 예를 들어 Antibody Engineering: A Practical Approach, Borrebaeck, Ed., Oxford University Press, Oxford (1995); and Huse et al., J. Immunol, 149:3914-3920 (1992).
추가로, 수많은 공개문헌들이 선택된 표적 항원 결합용으로 폴리펩티드의 라이브러리를 제조 및 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 기법의 용도를 보고한 바 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Cwirla et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382 (1990); Devlin et al, Science, 249:404-406 (1990); Scott et al, Science, 249:386-388 (1990); 및 Ladner et al, 미국 특허 5,571,698). 파지 디스플레이 방법의 기본적인 컨셉은 파지 DNA 에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 및 표적 항원 사이의 물리적 연계성의 확립이다. 그러한 물리적 연계성은 파지 입자에 의해 제공되며, 이는 폴리펩티드를 인코딩하는 파지 유전체를 둘러싸는 캡시드의 일부분으로서의 폴리펩티드를 디스플레이한다. 폴리펩티드 및 그의 유전자 물질간의 물리적 연계성의 확립은 상이한 폴리펩티드를 보유하는 매우 많은 수의 파지의 동시적인 대용량 스크리닝을 가능케 한다. 표적 항원에 대한 친화성을 가진 폴리펩티드를 디스플레이하는 파지는 표적 항원에 결합하며, 그러한 파지는 표적 항원을 스크리닝하는 친화성에 의해 풍부화된다. 그러한 파지에 의해 디스플레이되는 폴리펩티드의 정체는 그의 각각의 유전체로부터 결정될 수 있다. 그러한 방법을 이용해, 원하는 표적 항원에 대한 친화성을 갖는 것으로 밝혀진 폴리펩티드는 통상적 수단에 의해 대용량으로 합성될 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어 미국 특허 6,057,098).
이어서, 그러한 방법에 의해 생성되는 항체들은 관심대상의 정제된 폴리펩티드 항원을 이용해 친화성 및 특이성에 대해 먼저 스크리닝하고, 필요에 따라 그 결과는 결합에서 배제하길 원하는 여타 폴리펩티드 항원과 해당 항체의 친화성 및 특이성과 비교하여 선택될 수 있다. 스크리닝 과정은 미세역가 플레이트의 개별 웰에서 정제된 폴리펩티드 항원의 고정을 수반할 수 있다. 이어서, 잠재적인 항체 또는 항체들의 무리를 포함하는 용액을 각 미세역가 웰에 위치시키고, 약 30 분 내지 2 시간 동안 인큐베이션한다. 이어서, 미세역가 웰을 세척하고, 표지된 2 차 항체 (예를 들어, 상승된 항체가 마우스 항체인 경우, 알칼리성 포스파타아제에 컨쥬게이션시킨 항-마우스 항체) 를 웰에 첨가하고, 약 30 분간 인큐베이션한 후, 세척한다. 기질을 웰에 첨가하고, 고정된 폴리펩티드 항원에 대한 항체가 존재하는 경우 발색이 일어난다.
이어서, 그렇게 동정된 항체들은 친화성 및 특이성에 대해 추가로 분석될 수 있다. 표적 단백질에 대한 면역 검정 개발에서, 정제된 표적 단백질은 선택된 항체를 이용하는 면역검정의 민감도 및 특이성을 판단하는 표준으로 작용한다. 다양한 항체들의 결합 친화성이 상이할 수 있기 때문에, 예를 들어 특정 항체 조합들이 서로 입체장애적으로 방해가 될 수 있으며, 항체의 검정 성능은 해당 항체의 절대적인 친화성 및 특이성보다도 더욱 중요한 척도가 될 수 있다.
당업자는 항체 제조 또는 절편들의 결합 및 관심대상의 다양한 폴리펩티드에 대한 친화성 및 선택성에 대한 선별에서 수많은 접근법이 취해질 수 있으나, 그러한 접근법들은 본 발명의 범위를 변경시키지 않는다는 것을 알 수 있을 것이다.
1. 폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 바람직하게는 관심대상의 폴리펩티드 및 아쥬반트의 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 발생시킨다. 이는 관심대상의 컨쥬게이트를 면역화시킬 단백질 담체, 예컨대 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민, 소 티로글로글로불린 또는 대두 트립신 저해제에 이관능성 또는 유도화제를 이용해 컨쥬게이션하기에 유용할 수 있다. 이관능성 또는 유도화제의 비제한적 예시에는 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 컨쥬게이션), N-히드록시숙신이미드 (라이신 잔기를 통한 컨쥬게이션), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 및 R1N=C=NR (식 중, R 및 R1 는 상이한 알킬기임) 이다.
동물들은, 예를 들어, 100 ㎍ (토끼용) 또는 5 ㎍ (마우스용) 의 항원 또는 컨쥬게이트를 3 배 부피의 프로인트 (Freund's) 완전 아쥬반트와 함께 조합하여, 해당 용액을 여러 부위에 피내에 주사하여 관심대상의 폴리펩티드 면역원성 컨쥬게이트 또는 그의 유도체에 대해 면역화시킨다. 1 개월 후, 동물들은 프로인트 불완전 아쥬반트 중의 본래 양의 약 1/5 내지 1/10 의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트를 여러 부위에 피하주사하여 동물을 부스팅시킨다. 7 내지 14 일 후, 동물에서 채혈하여, 혈청을 항체 역가에 대해 검정한다. 일반적으로, 역가 정점에 이를 때까지 동물들을 부스팅한다. 바람직하게는, 동물들은 동일한 폴리펩티드의 컨쥬게이트로 부스팅하나, 상이한 면역원성 단백질 및/또는 상이한 가교제를 통한 컨쥬게이션이 이용될 수 있다. 컨쥬게이트는 또한 융합 단백질로서 재조합 세포 배양에서 제조될 수 있다. 특별한 경우, 백반과 같은 응집제가 면역 응답성 강화를 위해 이용될 수 있다.
2. 모노클로날 항체
모노클로날 항체는 실질적으로 균질인 항체의 집단, 즉 일반적으로 미량으로 존재할 수 있는 자연발생적 돌연변이를 제외하고 개별 항체들이 동일한 집단을 포함한 개별 항체들로부터 수득된다. 따라서, 수식어 "모노클로날" 은 구분되는 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특징을 나타낸다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et ah, Nature, 256:495 (1975)] 에 기재된 하이브리도마 방법에 의해 또는 당업계에 공지된 임의의 재조합 DNA 방법 (참고문헌은, 예를 들어 미국 특허 4,816,567) 에 의해 제조될 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 여타 적절한 숙주 동물 (예를 들어, 햄스터) 은 상기 기재된 바와 같이 면역화하여 면역화에 이용된 관심대상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 이끌어낸다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화시킨다. 이어서, 면역화된 림프구는 적절한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 그리콜을 이용해 골수 세포에 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 (참고문헌은, 예를 들어 Goding, Monoclonal Antibody: Principles and Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986)). 그렇게 제조된 하이브리도마 세포는, 바람직하게는 비융합된 부모 골수 세포의 생존 또는 생장을 억제하는 하나 이상의 물질을 포함하는 적절한 배양 배지에 시딩하여 생장시킨다.
예를 들어, 부모 미엘로마 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (HGPRT) 가 결핍되어 있다면, 하이브리도마 세포용 배양 배지는 일반적으로 HGPRT-결핍 세포의 생장을 억제할 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지) 를 포함할 것이다.
바람직한 골수 세포는 선별된 항체-제조 세포에 의한 높은 수준의 항체 생산에 안정적이며/이거나 HAT 배지와 같은 배지에 감수성인 담지체에 효율적으로 융합하는 것이다. 인간 모노클로날 항체 제조를 위한 그러한 바람직한 골수 세포주의 예시는, 이에 제한되지 않으나, 쥐과동물 골수 세포주, 예컨대 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것 (예컨대, 제조사 Salk Institute Cell Distribution Center; San Diego, CA 의 것), SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 (기관 American Type Culture Collection; Rockville, MD 로부터 입수가능), 및 인간 골수종 또는 마우스-인간 이종골수종 세포주 (참고문헌은, 예를 들어 Kozbor, J. Immunol, 133:3001 (1984); and Brodeur et ah, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63 (1987)) 로부터 유도된 것을 포함한다.
하이브리도마 세포가 생장할 수 있는 배양 배지는 관심대상의 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체의 제조에 대해 검정될 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 제조된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침강법에 의해, 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사활성면역검정 (radioimmunoassay) (RIA) 또는 효소-연계 면역흡수 검정 (ELISA) 에 의해 결정된다. 모노클로날 항체의 결합 친화성은 예를 들어, 문헌 [Scatchard analysis of Munson et ah, Anal. Biochem., 107:220 (1980)] 을 이용해 결정될 수 있다.
원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 하에르 제조하는 하이브리도마 세포를 동정한 후, 클론들은 희석 과정을 제한하여 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 상장시킬 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986)). 그러한 목적을 위해 적합한 배양 배지에는, 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 추가로, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수로서 생체내에서 생장될 수 있다. 서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는 예를 들어 단백질 A-세파로오스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 항체 정제 과정에 의해 배양 배지, 복수액, 또는 혈청으로부터 분리될 수 있다.
모노클로날 항체를 인코딩하는 DNA 는 통상적 과정 (예를 들어, 쥐과동물 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로프를 이용) 을 이용해 분리 및 서열분석될 수 있다. 하이브리도마 세포는 그러한 DNA 의 바람직한 공급원으로 제공된다. 일단 분리되면, DNA 는 발현 벡터에 위치될 수 있고, 이어서 이를 대장균 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary) (CHO) 세포 또는 달리 항체를 생산하지 않는 골수 세포에 형질이식하여 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 유도한다. 참고문헌은, 예를 들어 Skerra et al., Curr. Opin. Immunol, 5:256-262 (1993); and Pluckthun, Immunol Rev., 130: 151-188 (1992). DNA 는 또한 예를 들어 동종의 쥐과동물 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열을 대체하여 (참고문헌은, 예를 들어 미국 특허 4,816,567; 및Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851 (1984)), 또는 비-면역원성 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부에 면역글로불린 코딩 서열을 공유결합으로 결합시켜 개질시킬 수 있다.
추가 구현예에서, 모노클로날 항체 또는 항체 절편들을 예를 들어, 문헌 [McCafferty et al, Nature, 348:552-554 (1990); Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991); and Marks et al, J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991)] 에 기재된 기법을 이용해 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 사슬 셔플링 (chain shuffling) 에 의한 고친화성 (nM 범위) 인간 모노클로날 항체의 제조는 문헌 [Marks et al, BioTechnology, 10:779-783 (1992)] 에 기재되어 있다. 매우 큰 파지 라이브러리 구축을 위한 전략으로서의 조합 감염 (combinatorial infection) 및 시험관내 재조합 (in vivo recombination) 의 이용이 문헌 [Waterhouse et al, Nuc. Acids Res., 21 :2265-2266 (1993)] 에 기재되어 있다. 따라서, 그러한 기법들은 모노클로날 항체 생성을 위한 전통저인 모노클로날 항체 하이브라도마 방법에 대한 가시적인 대안이다.
3. 인간화된 항체
비인간 항체의 인간화 방법이 당업계에 공지되어 있다. 바람직하게는, 인간화된 항체는 비인간 공급원 유래의 것으로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖고 있다. 그러한 비인간 아미노산 잔기는 종종 "임포트 (import)" 잔기로 지칭되며, 이는 일반적으로 "임포트 (import)" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 본질적으로 인간 항체의 해당 서열에 대한 비인간 항체의 과가변 영역 서열의 대체에 의해 실행될 수 있다. 참고문헌은, 예를 들어 [Jones et al., Nature, 321 :522-525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332:323-327 (1988); and Verhoeyen et al, Science, 239: 1534-1536 (1988)]. 따라서, 그러한 "인간화된" 항체는 키메라 항체이며 (참고문헌은, 예를 들어 미국 특허 4,816,567), 여기서 비인간 종 유래의 해당 서열에 의해서는 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적게 치환되어 있다. 실제, 인간화된 항체는 일반적으로 인간 항체로서, 일부 과가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크 영역 (FR) 잔기들이 설치류 항체의 유사한 영역 유래의 잔기들로 치환된다.
본원에 기재된 인간화된 항체 제조에 이용될, 경쇄 및 중쇄 두가지 모두인 인간 가변 도메인의 선택은 면역원성 감소를 위해 중요한 고려사항이다. 소위 "베스트-핏 (best- fit) 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 이어서, 설치류의 것에 가장 가까운 인간 서열을 인간화된 항체에 대한 인간 FR 로 취한다 (참고문헌은, 예를 들어 Sims et al, J. Immunol, 151 :2296 (1993); and Chothia et al, J. Mol. Biol, 196:901 (1987)). 또다른 방법은 경쇄 및 중쇄의 특별한 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유도되는 특별한 FR 을 이용한다. 동일한 FR 은 여러 상이한 인간화된 항체를 위해 이용될 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Carter et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); and Presta et al, J. Immunol, 151 :2623 (1993)).
항체가 항원에 대한 높은 친화성 및 여타 바람직한 생물학적 특성을 유지한 채 인간화되어야 한다는 것이 또한 중요하다. 그러한 목적을 달성하기 위해, 인간화된 항체는 부모 및 인간화된 서열의 3 차원적 모델을 이용해 부모 서열 및 다양한 개념적인 인간화된 생성물들의 분석 프로세스에 의해 제조될 수 있다. 3 차원적 면역글로불린 모델은 통상적을 이용가능하며, 당업자에게 익숙한 것이다. 선택된 후보자 면역글로불린의 총체적인 3 차원적 공간배치 구조를 설명 및 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 그러한 디스플레이의 점검은 후보자 면역글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기들의 예상 역할 분석, 즉 후보자 면역글로불린의 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 그러한 방식으로, FR 잔기는 수용자 및 임포트 서열로부터 선택 및 조합될 수 있고, 이로써 원하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 친화성 증대가 달성된다. 일반적으로, 과가변 영역 잔기들은 항원 결합에 영향을 미치는 것에 직접적으로 그리고 특이적으로 관여된다.
본 발명에 따르면 다양한 형태의 인간화된 항체가 고려된다. 예를 들어, 인간화된 항체는 Fab 분절과 같은 항체 분절일 수 있다. 대안적으로, 인간화된 항체는 온전한 IgA, IgG, 또는 IgM 항체와 같은 온전한 항체일 수 있다.
4. 인간 항체
인간화에 대한 대안으로, 인간 항체를 만들어 낼 수 있다. 일부 구현예에서, 면역화시에 내생적 면역글로불린 생산 없이 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 형질이식 동물 (예를 들어, 마우스) 이 제조될 수 있다. 예를 들어, 키메라성의 생식세포 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역 (JH) 유전자의 동형 결실이 내생적 항체 제조의 완전한 억제를 결과로서 제공한다는 것이 기재된 바 있다. 그러한 생식세포 돌연변이 마우스에서의 인간 생식세포 면역글로불린 유전자 어레이의 이동이 항원 공격시 인간 항체의 생산을 결과로서 제공할 것이다. 참고문헌은, 예를 들어 Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Set USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al, Year in Immun., 7:33 (1993); 및 미국 특허 번호 5,591,669, 5,589,369, 및 5,545,807.
대안적으로, 파지 디스플레이 기법 (참고문헌은, 예를 들어 McCafferty et al, Nature, 348:552-553 (1990)) 을 이용하여 비면역화 공여자 (donor) 유래의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리를 이용하여 시험관내에서 인간 항체 및 항체 절편을 생산할 수 있다. 그러한 기법에 따르면, 항체 V 도메인 유전자는 섬유상 박테리오파지, 예컨대 Ml3 또는 fd 의 주된 또는 부속적인 코트 단백질 유전자 프레임 내에 클로닝되고, 파지 입자의 표면에 기능성 항체 절편들로 디스플레이된다. 섬유상 입자들이 파지 유전체의 단일 가닥 DNA 카피를 포함하기 때문에, 항체의 기능 특성을 기준으로 한 선별이 그러한 특성을 나타내는 항체를 인코딩하는 유전자를 선별하게 해 준다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성을 일부 모방한다. 파지 디스플레이는 예를 들어, 문헌 [Johnson et al, Curr. Opin. Struct. Biol, 3 :564-571 (1993)] 에 기재된 바와 같이 여러 포맷으로 실시될 수 있다. V-유전자 절편들의 여러 공급원들이 파지 디스플레이에 이용될 수 있다. 참고문헌은, 예를 들어 Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991). 비면역화 인간 공여자 유래의 V 유전자의 레퍼토리가 구축될 수 있으며, 항원 (자가항원 포함) 의 여러가지 어레이에 대한 항체들이 본질적으로 문헌 [Marks et al, J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991); Griffith et al, EMBO J., 12:725-734 (1993); 및 미국 특허 번호 5,565,332 및 5,573,905] 에 기재된 기법에 따라 분리될 수 있다 .
특별한 경우, 인간 항체는 예를 들어, 미국 특허 번호 5,567,610 및 5,229,275 에 기재된 바와 같이 시험관내에서 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다.
5. 항체 절편들
항체 절편들의 제조를 위한 다양한 기법들이 개발되었다. 전통적으로, 그러한 절편들은 온전한 항체의 단백질가수분해 소화를 통해 유도되었다 (참고문헌은, 예를 들어 Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Meth., 24: 107-117 (1992); and Brennan et al, Science, 229:81 (1985)). 그러나, 그러한 절편들은 현재 재조합 숙주 세포를 이용해 직접 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체 절편들은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 절편들은 대장균 세포들로부터 직접 회수한 후 화학적으로 커플링시켜 F(ab')2 절편들을 형성할 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Carter et al, BioTechnology, 10: 163-167 (1992)). 또다른 접근법에 따르면, F(ab')2 절편들은 재조합 숙주 세포로부터 직접 분리될 수 있다. 항체 절편 생산을 위한 여타 기법들은 당업자에게 자명할 것이다. 다른 구현예에서, 선택한 항체는 단일쇄 Fv 절편 (scFv) 이다. 참고문헌은, 예를 들어 PCT 공보 번호 WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458. 항체 절편은 또한 예를 들어, 미국 특허 5,641,870 에 기재된 바와 같은 선형 항체일 수 있다. 그러한 선형 항체 절편들은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
6. 이중특이적 항체
이중특이적 항체는 둘 이상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 가진 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체는 관심대상의 동일한 폴리펩티드의 두가지 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 여타 이중특이적 항체는 관심대상의 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 하나 이상의 추가적인 항원에 대한 결합 부위(들)과 조합할 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체로서 또는 항체 절편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체) 으로서 제조될 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 제법은 두가지 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현을 기반으로 하는데, 여기서 상기 두 사슬은 상이한 특이성을 갖고 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Millstein et al, Nature, 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위적 유전으로 인해, 그러한 하이브리도마 (쿼드로마) 는 10 가지 상이한 항체 분자들의 잠재적 혼합물을 제공하게 되며, 여기서 오직 1 개만이 올바른 이중특이적 구조를 갖고 있다. 올바른 분자의 정제는 일반적으로 친화성 크로마토그래피에 의해 실시된다. 유사한 과정들이 PCT 공보 번호 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al, EMBO J., 10:3655-3659 (1991)] 에 개시되어 있다.
상이한 접근법에 따르면, 원하는 결합 특이성 (항체-항원 조합 부위) 을 가진 항체 가변 도메인을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 상기 융합은 바람직하게는, 적어도 일부분의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하고 있는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 이용한다. 하나 이상의 융합에서 제시되는 경쇄 결합에 필요한 부위를 포함하는 제 1 중쇄 불변 영역 (CHI) 을 갖고 있는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합 및 필요에 따라 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 DNA 가 따로따로 발현 벡터에 삽입되고, 적합한 숙주 유기체에 함께 형질이식된다. 이는 구축에 동일하지 않은 비율의 세가지 폴리펩티드 사슬이 사용되어 최적 수율을 제공하는 구현예에서의 폴리펩티드 절편들의 상호 비율을 조정함에 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 둘 이상의 폴리펩티드 사슬의 발현이 높은 수율을 제공하는 경우 또는 비율이 별로 의미가 없는 경우에 세 폴리펩티드 사슬 중 둘 또는 전부에 대한 코딩 서열을 1 개의 발현 벡터에 삽입하는 것이 가능하다.
그러한 접근법의 바람직한 구현예에서, 이중특이적 항체는 한쪽 팔에는 제 1 결합 특이성을 가진 하이브리드 면역글로불린 중쇄를 갖고 있고, 나머지 팔에는 하이•‘드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제 2 결합 특이성을 제공함) 을 갖고 있도록 이루어져 있다. 그러한 비대칭적 구조는, 손쉬운 분리 수단을 제공하는 이중특이적 분자의 오직 절반에 면역글로불린 경쇄가 존재함으로 인해 원치않는 면역글로불린 사슬 조합으로부터 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 해 준다. 참고문헌은, 예를 들어 PCT 공보 번호 WO 94/04690 및 Suresh et al, Meth. Enzymol, 121:210 (1986).
미국 특허 5,731,168 에 기재된 또다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자들 사이의 접면이 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화하도록 조작될 수 있다. 바람직한 접면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 한 부분을 포함한다. 상기 방법에서, 제 1 항체 분자의 접면 유래의 하나 이상의 소형 아미노산-측쇄가 더 긴 측쇄 (예를 들어, 타이로신 또는 트립토판) 로 교체된다. 큰 측쇄(들)에 대한 동일하거나 또는 유사한 크기의 벌충적인 "공동 (cavities)" 은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 것들 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌) 것으로 교체하여 제 2 항체 분자의 접면에 생성시킨다. 이는 동종이량체와 같은 여타 원치않는 말단 생성물 상에서 이종이량체의 수율을 증대시키는 메커니즘을 제공한다.
이중특이적 항체에는 가교결합되거나 또는 "헤테로컨쥬게이트" 항체가 포함된다. 예를 들어, 헤테로컨쥬게이트에서의 항체들 중 하나는 아비딘에 커플링되어 있을 수 있고, 나머지는 바이오틴에 커플링되어 있을 수 있다. 헤테로컨쥬게이트 항체는 임의의 통상적인 가교결합 방법을 이용해 제조될 수 있다. 적합한 가교결합제 및 기법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 4,676,980 에 개시되어 있다.
항체 절편들로부터 이중특이적 항체를 생성하는 적합한 기법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 연결을 이용해 제조될 수 있다. 특별한 경우, 이중특이적 항체는 온전한 항체가 단백질가수분해로 절단되어 F(ab')2 절편들을 생성하는 과정에 의해 생성될 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Brennan et al, Science, 229:81 (1985)). 그러한 절편들은 근접한 디티올으 안정화시키고 분자간 디설파이드 형성을 방해하는 디티올 착화제의 존재 하에 감소된다. 이어서, 생성된 Fab' 절편들은 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 변환된다. 이어서, Fab'-TNB 유도체들 중 하나는 머캅토에틸아민을 이용한 환원에 의해 Fab'-티올로 재변환되고, 동몰량의 여타 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다.
일부 구현예에서, Fab'-SH 절편들은 대장균으로부터 직접 회수될 수 있고, 화학적으로 커플링되어 이중특이적 항체를 형성한다. 예를 들어, 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자는 문헌 [Shalaby et al, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)] 에 기재된 방법으로 제조될 수 있다. 각 Fab' 절편은 대장균으로부터 따로따로 분비되며, 지령된 시험관내 적용되어 이중특이적 항체를 형성한다.
재조합 세포 배양으로부터 직접 이중특이적 항체 절편들을 제조 및 분리하는 다양한 기법들이 또한 기재된 바 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 이용해 제조된 바 있다. 참고문헌은, 예를 들어 Kostelny et al, J. Immunol, 148: 1547-1553 (1992). Fos 및 Jun 단백질 유래의 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해 두가지 사이한 항체의 Fab' 부분에 연결되어 있다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성하며, 이어서 재산화되어 항체 이종이량체를 형성한다. 그러한 방법은 또한 항체 동종이량체의 제조에 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 에 기되어 있는 "디아바디 (diabody)" 기법은 이중특이적 항체 절편들의 제조를 위한 대안적인 메커니즘으로 제공된다. 절편들은 동일한 사슬 상의 두 도메인 사이에 짝을 이루도록 충분히 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL) 에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH) 을 포함한다. 따라서, 한 절편의 VH 및 VL 도메인은 또다른 절편의 상보적인 VL 및 VH 도메인과 짝을 이루게 됨으로써, 2 개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 이용해 이중특이적 항체 절편들을 제조하는 또다른 전략은 문헌 [Gruber et al, J. Immunol, 152:5368 (1994)] 에 기재되어 있다.
2 가 이상의 항체들이 또한 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다. 참고문헌은, 예를 들어 Tutt et al, J. Immunol, 147:60 (1991).
7. 항체 정제
재조합 기법 이용시, 항체는 분리된 숙주 세포 내부에서, 숙주 세포의 주변세포질 공간에서 제조될 수 있거나, 또는 숙주 세포로부터 배지까지 직접 분비될 수도 있다. 항체가 세포내에서 제조되는 경우, 입상의 부스러기가 먼저 예를 들어 원심분리 또는 초원심분리에 의해 제거된다. 문헌 [Carter et al, BioTech., 10: 163-167 (1992)] 에서는 대장균의 주변세포질 공간으로 분비되는 항체들을 분리하는 과정을 기술한다. 간략하게, 세포 페이스트를 나트륨 아세테이트 (pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF) 의 존재 하에 약 30 분 동안 해동시킨다. 세포 찌꺼기는 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체가 배지로 분비되는 곳에서, 그러한 발현 시스템으로부터의 상청액은 일반적으로 시판하여 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amicon 또는 Millipore Pellicon ultrafiltration 유닛을 이용해 농축된다. 프로테아제 저해제, 예컨대 PMSF 는 임의의 선행 단계에 포함되어 단백질 가수분해를 저해하며, 항생제가 포함되어 불리한 오염물들의 생장을 막을 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 이용해 정제될 수 있다. 친화성 리간드로서의 단백질 A 의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 좌우된다. 단백질 A 는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄를 기반으로 하는 항체 정제에 이용될 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Lindmark et al, J. Immunol. Meth., 62: 1-13 (1983)). 단백질 G 는 모든 마우스 이소타입 및 인간 γ3 에 대해 권장되는 것이다 (참고문헌은, 예를 들어 Guss et al, EMBO J., 5: 1567-1575 (1986)). 친화성 리간드가 결합되는 매트릭스는 가장 빈번하게는 아가로스이나, 여타 매트릭스도 이용가능하다.
기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 제어된 포어 글래스 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스보다도 더 빠른 유동 속도 및 더 짧은 가공 시간을 제공해 준다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABXTM 수지 (J. T. Baker; Phillipsburg, N.J.) 가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 여타 기법들, 예컨대 이온-교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 석출, 역상 HPLC, 실리카 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSETM 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대 폴리아스파르트산 컬럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 암모늄 설페이트 석출이 회수할 항체에 따라 이용가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들)에 후속하여, 관심대상의 항체 및 오염물을 함유하는 혼합물은, 바람직하게는 낮은 염 농도에서 실시되는, 약 2.5 내지 4.5 의 pH 의 용출 완충액을 이용하는 저 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용될 수 있다 (예를 들어, 약 0 내지 0.25 M 염).
당업자는 항체와 유사한 기능을 가진 임의의 결합 분자, 예를 들어, 시료 중의 관심대상의 하나 이상의 분석물에 특이적인 결합 분자 또는 결합 파트너가 또한 본 발명의 방법 및 조성물에 이용될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 적합한 항체형 분자의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 도메인 항체, 유니바디, 나노바디, 상어 항원 반응성 단백질, 아비머 (avimers), 아드넥틴 (adnectins), 안티캄 (anticalms), 친화성 리간드, 필로머 (phylomers), 압타머 (aptamers), 어피바디 (affibodies), 트리넥틴 (trinectins) 등이 포함된다.
D. 투여 방법
본 발명의 방법에 따르면, 본원에 기재된 항암제는 당업계에 공지된 임의의 통상적 수단에 의해 대상체에 투여된다. 본 발명의 방법은 종양 (예를 들어, 원발 또는 전이 유방 종양) 의 하나 이상의 항암제를 이용한 치료에 대한 응답성을 결정, 예측, 확인 및/또는 모니터링하기 위해 이용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 대상체에서의 종양 (예를 들어, 원발 또는 전이 유방 종양) 의 치료를 위한 하나 이상의 적합한 항암제를 선택하는데 이용될 수 있다. 당업자는 항암제(들)이 단독으로 또는, 통상적인 화학요법, 방사선요법, 호르몬 치료요법, 면역치료요법 및/또는 외과수술을 이용한 병용 치료 접근법의 일부분으로 투여될 수 있다는 것을 알 것이다.
특정 구현예에서, 항암제는 항-신호전달제 (예를 들어, 세포정지제), 예컨대 모노클로날 항체 또는 타이로신 키나아제 저해제; 항증식제; 화학치료제 (예를 들어, 세포독성제); 호르몬 치료제; 방사선치료제; 백신; 및/또는 암세포와 같은 일탈적인 세포의 비제어적 생장을 감소 또는 제지하는 능력을 가진 임의의 여타 화합물들을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 하나 이상의 화학치료제와 병용하여 하나 이상의 항-신호전달제, 항증식제 및/또는 호르몬 치료제로 치료된다. 예시 모노클로날 항체, 타이로신 키나아제 저해제, 항증식제, 화학치료제, 호르몬 치료제. 방사선치료제 및 백신이 본원에 기재되어 있다.
특별한 구현예에서, 항암제는 모노클로날 항체, 타이로신 키나아제 저해제, 및 이들의 조합물을 포함하는, HER2 활성을 조절하는 하나 이사의 화합물을 포함한다. HER2-조절 화합물의 비제한적 예시는 모노클로날 항체, 예컨대 트라스투주맙 (Herceptin®), 트라스투주맙-DM1, 에르투막소맙 및 페르투주맙 (2C4; Omnitarg™); 소형 분자 타이로신 키나아제 저해제, 예컨대 게피티닙 (Iressa®), 엘로티닙 (Tarceva®), 피리티닙, CP-654577, CP-724714, 카네르티닙 (CI 1033), HKI-272, 라파티닙 (GW-572016; Tykerb®), PKI-166, AEE788, BMS-599626, HKI-357, BIBW 2992, ARRY-334543, JNJ-26483327, 및 JNJ-26483327; 및 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, HER2-조절 화합물들은 본원에 기재되어 있거나 또는 당업자에게 공지된 하나 이상의 여타 항암제와 병용하여 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 항암제는 모노클로날 항체, 타이로신 키나아제 저해제, 및 이들의 조합을 포함하는, HER3 및 여타 ErbB 클래스 구성원들의 활성을 조절하는 하나 이상의 화합물을 함유한다. 이들 화합물의 비제한적 예시에는, 모노클로날 항체, 예컨대 MM-121, AMG-888 (U3-1287), 트라스투주맙 (Herceptin®), 페르투주맙 (2C4; Omnitarg™), 세툭시맙 (Erbitux®); 소형 분자 타이로신 키나아제 저해제, 예컨대 게피티닙 (Iressa®), 엘로티닙 (Tarceva®), 카네르티닙 (CI 1033), 라파티닙 (GW-572016; Tykerb®), MP-470, AZD8931, PF00299804; 및 이들의 조합이 포함된다. 일부 구현예에서, RTK 조절 화합물에는, HER1-, HER2- 및 HER3-조절 화합물, cMET 조절 화합물 및 IGF-1R 조절 화합물이 포함된다. 특정 구현예에서, HER1-, HER2- 및 HER3-조절 화합물이 본원에 기재되어 있거나 또는 당업자에게 공지된 하나 이상의 여타 항암제와 병용하여 사용될 수 있다.
여타 구현예에서, 항암제는 모노클로날 항체, 저해제 및 이들의 조합을 포함하여, PI3K 활성을 조절하는 하나 이상의 화합물을 함유한다. 그러한 화합물의 비제한적 예시에는, 저해제, 예컨대 SF 1126 (Semaphore Pharmaceuticals), XL147 (Exelixis), XL765 (Exelixis), NVP-BEZ235 (Novartis), NVP-BGT226 (Novartis), NVP-BKM120 (Novartis), GDC-0941 (Genentech/ Piramed Pharma), PX-866 (ProIX Pharmaceuticals), GSK1059615 (GlaxoSithKline), CAL-101 (Calistoga Pharmaceuticals), 및 이들의 조합이 포함된다.
본 발명에 사용하기에 적합한 항-신호전달제의 예시에는, 이에 제한됨 없이, 모노클로날 항체, 예컨대 트라스투주맙 (Herceptin®), 페르투주맙 (2C4; Omnitarg™), 알렘투주맙 (Campath®), 베바시주맙 (Avastin®), 세툭시맙 (Erbitux®), 겜투주맙 (Mylotarg®), 파니투무맙 (Vectibix™), 리툭시맙 (Rituxan®), 및 토시투모맙 (BEXXAR®); 타이로신 키나아제 저해제, 예컨대 게피티닙 (Iressa®), 수니티닙 (Sutent®), 엘로티닙 (Tarceva®), 라파티닙 (GW-572016; Tykerb®), 카네르티닙 (CI 1033), 세막시닙 (SU5416), 바탈라닙 (PTK787/ZK222584), 소라페닙 (BAY 43-9006; Nexavar®), 이마티닙 메실레이트 (Gleevec®), 레플루노마이드 (SU101), 반데타닙 (ZACTIMA™; ZD6474), 필리티닙, CP-654577, CP-724714, HKI-272, PKI-166, AEE788, BMS-599626, HKI-357, BIBW 2992, ARRY-334543, JNJ-26483327, 및 JNJ-26483327; 및 이들의 조합이 포함된다.
예시 항증식제에는, mTOR 저해제, 예컨대 시롤리무스 (rapamycin), 템시롤리무스 (CCI-779), 및 에베롤리무스 (RADOOl); AKT 저해제, 예컨대 lL6-히드록시메틸-클로로-이노시톨-2-(R)-2-0-메틸-3-0-옥타데실-sn-글리세로카르보네이트, 9-메톡시-2-메틸렐리프티시늄 아세테이트, 1,3-디히드로-1-(1-((4-(6-페닐-1H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-7-일)페닐)메틸)-4-피페리디닐)-2H-벤즈이미다졸-2-온, 10-(4'-(N-디에틸아미노)부틸)-2-클로로페녹사진, 3-포르밀크로몬 티오세미카르바존 (Cu(II)Cl2 복합체), API-2, 프로토-발암유전자 TCL1 의 아미노산 10 내지 24 로부터 유도된 15-머 펩티드 (Hiromura et al, J. Biol. Chem., 279:53407-53418 (2004), KP372-1), 및 문헌 [Kozikowski et al, J. Am. Chem. Soc., 125: 1144-1145 (2003) 및 Kau et al, Cancer Cell, 4:463-476 (2003)] 에 기재된 화합물들; 및 이들의 조합이 포함된다.
화학치료제의 비제한적 예시에는, 백금-클래스 약물 (예를 들어, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 카르보플라틴, 스피로플라틴, 이프로플라틴, 사트라플라틴 등), 알킬화제 (예를 들어, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 클로람부실, 부술판, 멜팔란, 메클로레타민, 우라무스틴, 티오테파, 니트로소우레아 등), 항대사약물 (예를 들어, 5-플루오로우라실, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 류코보린, 카페시타빈, 시타라빈, 플록수리딘, 플루다라빈, 겜시타빈 (Gemzar®), 페메트렉세드 (ALIMTA®), 랄티트렉세드 등), 식물성 알칼로이드 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신, 포도필로톡신, 파클리탁셀 (Taxol®), 도세탁셀 (Taxotere®) 등), 토포이소머라아제 저해제 (예를 들어, 이리노테칸, 토포테칸, 암사크린, 에토프사이드 (VP 16), 에토프사이드 포스페이트, 테니포사이드 등), 항종양 항생제 (예를 들어, 독소루비신, 아드리아미신, 다우노루비신, 에피루비신, 악티노마이신, 블레오마이신, 미톡마이신, 미톡사트론, 플리카마이신 등), 이들의 약제학적으로 허용되는 염, 이들의 입체이성질체, 이들의 유도체, 이들의 유사체 및 이들의 조합이 포함된다.
호르몬 치료제의 예시에는, 이에 제한됨 없이, 아로마타아제 저해제 (예를 들어, 아미노글루테티마이드, 아나스트로졸 (Arimidex®), 레트로졸 (Femara®), 보로졸, 엑세메스탄 (Aromasin®), 4-안드로스텐-3,6,17-트리온 (6-OXO), 1,4,6-안드로스타트리엔-3,17-디온 (ATD), 포르메스탄 (Lentaron®), 등), 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (예를 들어, 바제독시펜, 클로미펜, 풀베스트란트, 라소폭시펜, 랄록시펜, 타목시펜, 토레미펜 등), 스테로이드 (예를 들어, 덱사메타손), 피나스테라이드, 및 고나도트로핀-방출 호르몬 아고니스트 (GnRH), 예컨대 고세렐린, 이들의 약제학적으로 허용되는 염, 이들의 입체이성질체, 이들의 유도체, 이들의 유사체 및 이들의 조합이 포함된다.
본 발명에 유용한 암 백신의 비제한적 예시에는, Active Biotech 사의 ANAYARA, Northwest Biotherapeutics 사의 DCVax-LB, IDM Pharma 사의 EP-2101, Pharmexa 사의 GV1001, Idera Pharmaceuticals 사의 IO-2055, Introgen Therapeutics 사의 INGN 225 및 Biomira/Merck 사의 Stimuvax 가 포함된다.
방사선치료제의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 라디오뉴클라이드, 예컨대 종양 항원에 대한 항원에 임의로 컨쥬게이션된 47Sc, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 86Y, 87Y, 90Y, 105Rh, 111Ag, 111In, 117mSn, 149Pm, 153Sm, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 및 212Bi 가 포함된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항암제는, 이에 제한되지 않으나, 면역자극제 (예를 들어, Bacillus Calmette-Guerin (BCG), 레바미솔, 인터류킨-2, 알파-인터페론 등), 면역독소 (예를 들어, 항-CD33 모노크로날 항체-칼리케미신 컨쥬게이트, 항-CD22 모노크로날 항체-슈도모나스 외독소 컨쥬게이트 등) 및 방사선면역치료요법 (예를 들어, mIn, 90Y 또는 131I 에 컨쥬게이션된 항-CD20 모노클로날 항체 등) 과 병용될 수 있다.
항암제는 필요에 따라 적합한 약제학적 부형제와 함께 투여될 수 있으며, 임의의 허용가능한 투여 방식을 통해 실시될 수 있다. 따라서, 투여는, 예를 들어 경구, 협측, 설하, 치은, 구개, 정맥내, 국소, 피하, 경피성, 경피, 근육내, 관절내, 장관외, 소동맥내, 피내, 뇌실내, 두개내, 복강내, 방광내, 척추강내, 병소내, 비강내, 직장내, 질내 투여이거나 또는 흡입에 의한 것일 수 있다. "병용투여" 란, 항암제가 제 2 의 약제 (예를 들어, 또다른 항암제, 항암제 투여요법과 연관된 부작용을 감소시키기에 유용한 약물, 방사선치료제, 호르몬 치료제, 면역치료제 등) 의 투여와 동시에, 직전에 또는 직후에 투여됨을 의미한다.
치료유효량의 항암제는 반복적으로, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 회 이상 투여될 수 있거나, 또는 투여량이 연속 주입으로 투여될 수 있다. 투여량은 고체, 반고체, 동결건조 분말 또는 액체 투여량 형태, 예컨대 정제, 필, 펠렛, 캡슐, 분말, 용액, 현탁액, 에멀전, 좌제, 보류 관장, 크림, 연고, 로션, 겔, 에어로졸, 폼 등의 형태로, 바람직하게는 정확한 투여량의 단순한 투여에 적합한 단위 투여량 형태를 취할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단위 투여량 형태" 는 각 단위체가 적합한 약제학적 부형제와 연합하여 원하는 발증, 용인능 및/또는 치료 유효성을 제공하도록 산출된 항아제의 예정된 양을 포함하는, 인간 대상체 및 여타 포유류에 대해 단일제로 구성된 투여량으로 적합한 물리적으로 구분된 단위체를 지칭한다 (예를 들어, 앰플). 추가로, 더 높은 농도의 투여량 형태가 제조될 수 있으며, 이로부터 더 묽은 단위 투여량 형태가 제조될 수 있다. 이에 따라, 더욱 농축된 투여량 형태는 실질적으로, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상 배수의 양인 항암제를 포함할 것이다.
그러한 투여량 형태의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다 (참고문헌은, 예를 들어 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18TH ED., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)). 투여량 형태는 일반적으로 통상적인 약제학적 담체 또는 부형제를 포함하며, 추가적으로 여타 의약제, 담체, 아쥬반트, 희석제, 조직 침투 강화제, 가용화제 등을 포함한다. 적절한 부형제는 특별한 투여량 형태 및 당업계에 공지된 방법에 의한 투여 경로에 맞도록 맞춰질 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 상기 문헌).
적합한 부형제의 예시는, 이에 제한되지 않으나, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 검 아카시아, 칼슘 포스페이트, 알기네이트, 트래거캔트, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 세룰로오스, 물, 식염수, 시럽, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로피메틸셀룰로오스, 및 폴리아크릴산, 예컨대 Carbopols, 예를 들어, Carbopol 941, Carbopol 980, Carbopol 981 등을 포함한다. 투여량 형태는 추가적으로 윤활제, 예컨대 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일; 습윤제; 에멀전화제; 현탁제; 보존제, 예컨대 메틸-, 에틸-, 및 프로필-히드록시-벤조에이트 (즉, 파라벤); pH 조정제, 예컨대 무기산 및 유기산 및 염기; 당화제; 및 풍미제를 포함한다. 투여량 형태는 또한 생분해성 중합체 비드, 덱스트란, 및 시클로덱스트린 봉입체 복합체를 포함할 수 있다.
경구 투여를 위해, 치료 유효 투여량은 정제, 캡슐, 에멀전, 현탁액, 용액, 시럽, 로젠지, 분말 및 지연-방출 제형물의 형태일 수 있다. 경구 투여에 적합한 부형제에는, 약제학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 탈크, 셀룰오로스, 글루코오스, 젤라틴, 수크로오스, 마그네슘 카르보네이트 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료 유효 투여량은 필, 정제 또는 캡슐의 형태를 취하며, 투여량 형태는 항암제와 더불어, 하기 중 임의의 것을 포함할 수 있다: 희석제, 예컨대 락토오스, 수크로오스, 디칼슘 포스페이트 등; 붕해제, 예컨대 전분 또는 그의 유도체; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 등; 및 결합제, 예컨대 전분, 검 아카시아, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 셀룰로오스 및 그의 유도체. 항암제는 또한 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 담체 중에 침지된 좌제로 제형화될 수 있다.
액체 투여량 형태는 항암제 및 임의로는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 아쥬반트를 담체, 예컨대 식염수 (예를 들어, 0.9% w/v 나트륨 클로라이드), 수성 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올 등을 용해 또는 분산시켜, 예를 들어 경구용, 국소용 또는 정맥내 투여를 위한 용액 또는 분산액을 형성하여 제조될 수 있다. 항암제는 또한 보류 관장으로 제형화될 수 있다.
국소 투여를 위해, 치료 유효 투여량은 에멀전, 로션, 겔, 폼, 크림, 젤리, 용액, 현탁액, 연고 및 경피용 팻치의 형태를 취할 수 있다. 흡입에 의한 투여를 위해, 항암제는 네뷸라이저를 통해 건조 분말 또는 액체 형태로 전달될 수 있다. 비경구 투여를 위해서는, 치료 유효량의 투여량이 멸균 주사액 및 멸균 포장 분말의 형태일 수 있다. 바람직하게는, 주사용 용액이 약 4.5 내지 약 7.5 의 pH 에서 제형화된다.
치료 유효 투여량은 또한 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 그러한 투여량 형태는 완충제, 예를 들어 중탄산염을 투여 전 재건을 위해 포함할 수 있거나, 또는 완충제가 예를 들어 물을 이용한 제건을 위해 동결건조된 투여량 형태에 포함될 수 있다. 동결건조된 투여량 형태는 추가로 적합한 혈관수축제, 예를 들어 에피네프린을 함유할 수 있다. 동결건조된 투여량 형태는, 임의로는 재건용 완충액과 조합하여 포장되어 있는 주사기에서 제공될 수 있어, 재건되는 투여량 형태는 즉시 대상체에게 투여될 수 있다.
대상체는 또한 특정한 치료 투약계획의 효능을 평가하기 위해 주기적인 시간 간격을 두고 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 특정 신호 전달 분자들의 활성화 상태는 본원에 기재된 하나 이상의 항암제를 이용한 치료의 치료 유효성을 기반으로 선택될 수 있다. 대상체는 응답성을 평가하고 개별맞춤 접근법에서 특정 약물 또는 치료의 유효성을 이해하기 위해 모니터링될 수 있다.
추가적으로, 특정 항암제 또는 항암제의 병용에 최초로 응답하는 대상체가 약물 또는 약물 병용에 불응하게 될 수 있는데, 이는 해당 대상체에서 후천적 약물 내성이 발생했음을 나타낸다. 그러한 대상체들은 그들의 현행 치료요법을 중단하고, 본 발명의 방법에 따라 처방되는 대안적인 치료요법을 취할 수 있다.
특정 국면에서, 본원에 기재된 방법은 예를 들어, 음성 결절 질병을 가진 다양한 여성 집단에서 유방암 예후 및/또는 재발의 가능성을 예측하는 유전자 발현 마커의 패널과 함께 이용될 수 있다. 그러한 유전자 패널은 재발을 경험하여, 아쥬반트 화학요법이 유익하지 않을 여성을 식별하는데 유용할 수 있다. 발현 패널은 무병 및 전반적 생존 결과에 부정적으로 영향을 미치지 않고, 아쥬반트 화학요법을 안전하게 피할 수 있는 여성을 식별하는데 이용될 수 있다. 적합한 시스템에는, 이에 제한되지 않으나, Genomic Health, Inc. 사의 12-유전자 패널인 Oncotype DX™; Agendia 사의 70-유전자 패널인 MammaPrint,®; Veridex 사의 76-유전자 패널이 포함된다.
추가로, 특정한 다른 국면에서, 본원에 기재된 방법은 미지의 원발 암 (CUP) 의 본래 종양을 식별하는 유전자 발현 마커의 패널과 함께 이용될 수 있다. 그러한 유전자 패널은 유방암이 최초에 진단된 여성에게 제공되는 치료요법으로 유익을 얻게 될 전이성 암이 있는 여성을 식별하는데 유용할 수 있다. 적합한 시스템에는, 이에 제한되지 않으나, Aviara CancerTYPE ID 검정, 39 가지 종양 유형의 기원의 원발 부위를 밝혀낼 92 가지 유전자를 측정하는 RT-PCR-기반의 발현 검정; 및 마이크로어레이 상에서 1600 개 초과의 유전자의 발현을 측정하고, 종양의 유전자 발현 "특성 (signature)" 을 "15 가지 공지된 조직 유형" 의 것과 비교하는 Origin Test 사의 Pathwork® Tissue 이 포함된다.
VI . 실시예
하기 실시예는 청구된 본 발명을 제한함없이 설명하기 위해 제공된다.
실시예 1: PI3K -조절 화합물들에 대한 환자 선택을 위한 PI3K 활성화의 정량적 분석.
본 실시예는 활성화된 (포스포릴화된) PI3K 복합체가, 이에 제한되지 않으나 AKT, mTOR 및 S6K 을 포함하는 활성화된 PI3K 복합체 경로 구성요소들의 존재성과 상관관계가 있음을 증명한다. 본 실시예는 상승된 수준의 PI3K 활성화가 있는 유방암 환자들이 또한 활성화된 (포스포릴화된) AKT 를 발현한다는 것을 보여준다. 활성화된 PI3K 가 있는 환자 21 명 중 19 명이 또한 상승된 수준의 phospho-AKT 를 갖고 있다. 이는 phospho-AKT 가 PI3K 의 하류방향에 작용하며, PI3K 의 활성화가 AKT 의 활성화를 결과적으로 제공한다는 점을 뒷받침한다. 유방암 환자 시료에서의 PI3K 활성화와 포스포릴화된 AKT 사이의 높은 상관도 (p-값 = 0.0222; 도 6) 는 PI3K 경로 활성화가 종양발생과 생물학적으로 연관이 있음을 확인해 준다.
경로 프로파일링 분석은 유방암 환자로부터 수집된 60 가지 FNA 시료에서 실시했다. 다중연합적 면역어레이 CEER (Collaborative Enzyme Enhanced Reactive-immunoassay) 플랫폼을 이용하여 경로 단백질 발현 및 포스포릴화 수준을 결정했다. DNA 를 시료로부터 추출하고, 체세포 돌연변이의 패널에 대해 분석했다. 검출된 활성화된 경로는 HER1, HER2, HER3, IGF-1R, cMET, PI3K 및 연계되어 있는 하류방향 단백질을 포함한다.
본 실시예는 PI3K 활성화가 있는 21 명의 환자 중 오직 5 명만이 PI3KCA 돌연변이를 보유했음을 보여준다. 대부분의 유방암 환자에서는, 활성화된 (포스포릴화된) AKT 가 PI3KCA 야생형 상태에 대응한다. PI3KCA 돌연변이 및 PI3K 저해제에 대한 응답성 사이에는 상관관계가 있는 반면, 본 실시예는 PI3K 경로 변경이 없는 암 환자가 또한 PI3K 저해제 치료요법으로 유익을 얻을 수 있음을 설명한다. 도 6 은 유방암이 있는 환자의 경로 프로파일링 분석에서의 phospho-AKT 및 phospho-PI3K 의 비교를 설명한다. 도 7 은 유방암이 있는 환자 유래의 60 가지 FNA 시료에서 phospho-PI3K 의 존재성이 phospho-AKT 와 상관관계가 있음을 설명한다. 활성화된 AKT 는 PI3KCA 돌연변이가 없는 환자에서 검출되었다. 도 8 은 활성화된 AKT 가 PI3KCA 체세포 돌연변이와 상관관계가 없음을 설명한다.
실시예 2: 유방암 환자 유래의 FNA 시료에서의 PI3K 활성화 및 ErbB 클래스 수용체 타이로신 키나아제 ( RTK ) 활성화의 정량적 분석.
본 실시예는 유방암 환자에서의 PI3K 경로 활성화에 따른 ErbB 활성화 및 이량체 형성의 분석을 설명한다. 특히, 본 실시예는 상승된 수준의 활성화된 포스포릴화된 ErbB, 예컨대 포스포릴화된 HER2 및 포스포릴화된 HER3 이 상승된 수준의 p-AKT 및 p-PI3K 와 연계되어 있음을 보여준다. 추가로, 본 실시예는 상승된 수준의 ErbB 활성화 및 이량체화가 있는 환자가 PI3K 저해제를 이용한 치료로 유익을 얻을 수 있음을 보여준다. 활성화된 HER2, HER3, PI3K, 및/또는 AKT 수준에서의 임의의 변화의 존재 또는 부재를 검출하여, PI3K 저해제에 대한 임상적 반응성이 평가될 수 있다.
경로 분석은 유방암 환자들로부터 수집된 60 개의 FNA 시료 상에서 실시되었다. 다중연합적 면역어레이 CEER (Collaborative Enzyme Enhanced Reactive-immunoassay) 플랫폼을 이용하여 경로 단백질 발현 및 포스포릴화 수준을 결정했다. DNA 를 시료로부터 추출하고, 체세포 돌연변이의 패널에 대해 분석했다. 검출된 활성화된 경로는 HER1, HER2, HER3, IGF-1R, cMET, PI3K 및 연관된 하류방향 단백질들 (예를 들어, 어댑터 및 효과기 단백질들) 을 포함했다.
본 실시예는 유방암 환자 유래의 60 개의 FNA 시료에서의 활성화된 HER2, HER3, PI3K 및 AKT 중에서의 높은 정도의 상관관계를 설명한다. 특히, phospho-HER3 은 활성화된 phospho-PI3K 를 갖고 있는 21 명의 환자들 중 20 명에서 활성화되어 있다 (p=0.00001, 도 9). 본 실시예는 또한 ErbB 활성화 (즉, 증가된 수준의 HER3:PI3K 복합체, phospho-HER3, 전체 HER3, HER2/HER3 이종이량체, HER1/HER3 이종이량체, Heregulin (HRG) 또는 TGFα 존재 하의 HER4/HER3 이종이량체) 가 있는 환자들이 PI3K 저해제 치료로 유익을 얻는 것을 보여준다. 도 9 는 유방암 환자 유래의 60 개의 FNA 시료에서의 phospho-HER3 및 phospho-PI3K 의 존재 사이에 높은 정도의 상관관계를 설명한다. 검정에 이용된 PI3K 에 대한 컷오프 값과 무관하게, 시료 중의 phospho-HER3 및 phospho-PI3K 사이에는 상관관계가 있다. 도 10 은 유방암 환자에서의 phospho-HER3 및 phospho-AKT 의 존재 사이에서의 상관관계를 설명한다. 도 11 은 활성화된 PI3K 가 활성화된 AKT 및 phospho-HER3 과 연계되어 있음을 보여준다. 도 6 은 또한 활성화된 AKT 가 PI3K 활성화의 부재 하에 phospho-HER3 와 상관관계가 있음을 보여준다. 도 12 는 phospho-HER2 가 유방암 환자 유래의 FNA 시료에서 활성화된 PI3K 및 활성화된 AKT 와 관련되어 있음을 보여준다. 도 13 은 HER2 유전자 돌연변이 또는 증폭이 되지 않은 유방암 환자 시료에서의 phospho-HER2, phospho-PI3K 및 phospho-AKT 의 동시적 활성화를 보여준다.
실시예 3: Herceptin 병용 요법에서 재발한 환자에서 PI3K 활성화 및 HER3 활성화의 정량적 분석.
항암 치료요법시 재발된 유방암 (BCA) 환자의 전이 부위로부터 수집한 미세침 흡출물 (FNA) 시료 중의 HER1, HER2, p95HER2, HER3, cMET, IGF-1R 및 하류방향 키나아제를 포함하는 중요 특성 수용체 타이로신 키나아제, 및 PI3K, She, AKT 및 ERK 를 포함하는 어댑터 단백질에 대한 총괄적 분석이 본원에 보고된다.
본 연구에서, CEER-FNA 경로 프로파일링 분석은 Herceptin 병용요법시 재발한 유방암 환자의 내시경 초음파 (EUS) 를 이용해 간 생검에서 실시되었다. 시료 내 HER1, HER2, HER3, p95, PI3K, AKT, ERK/MAPK 및 She 단백질의 활성화된 형태의 상승된 수준이 검출되었다. 경로 활성화 프로파일은 환자가 pan-HER 저해제 및 PI3K 저해제를 포함하는 병용 치료에 임상적으로 반응성일 수 있음을 시사한다.
또다른 연구에서, CEER-FNA 경로 프로파일링 분석을 Herceptin 병용 요법시 재발한 유방암 환자의 겨드랑이 결정 유래의 생검에서 실시했다. 체세포 돌연변이 분석은 환자에 H1047R PIK3CA 돌연변이가 있음을 보여준다. HER1, HER2, HER3, cMET, She, ERK/MAPK, PI3K 및 AKT 단백질의 활성화된 형태의 상승된 수준이 검출되었다. 경로 활성화 프로파일은 환자가 PI3K 저해제 병용 치료요법에 응답성일 수 있음을 시사한다.
본 실시예는 또한 ErbB 활성화 (즉, 상승된 수준의 HER3:PI3K 복합체, phospho-HER3, 전체 HER3, HER2/HER3 이종이량체, HER1/HER3 이종이량체, HER4/HER3 이종이량체, 헤르굴린 (HRG) 또는 TGFα) 된 환자가 병용 치료로 유익할 수 있음을 시사한다. 한 구현예에서, 상승된 수준의 HER3/PI3K 복합체를 갖고 있는 고형 종양암이 있는 환자는 PI3K 저해제 및 항-HER3 항체 치료요법을 포함하는 치료 투약계획으로 유익을 얻을 수 있다. 또다른 구현예에서, 상승된 수준의 HER2/HER3 이종이량체를 갖고 있는 고형 종양 암 환자는 PI3K 저해제 및, Pertuzamab 또는 항-HER2 항체 또는 TKI 의 병용 치료에 임상적으로 반응성일 수 있다. 도 14 는 Herceptin 병용 요법시 재발된 유방암 환자 유래의 시료에서 활성화된 HER1, HER2, HER3, p95, ERK, She, PI3K, AKT 및 ERK 단백질을 보여준다. 도 15 는 Herceptin 병용 요법시 재발한, H1047R PIK3CA 체세포 돌연변이가 있는 유방암 환자 유래의 시료에서의 활성화된 HER2, HER3, cMet, ERK, PI3K 및 AKT 단백질을 보여준다.
실시예 4: 항암 치료요법에 노출된 종양 시료의 활성화 프로파일링.
본 실시예는 CEER 검정 플랫폼에 의해 결정되는 바와 같은 종양 세포 시료에서의 RTK 경로 및 하류방향 키나아제, 효과기 및 어댑터 단백질의 전체 및 활성화된 (포스포릴화된) 수준을 보여준다. 더 높은 수준의 포스포릴화된 PI3K, AKT, ERK (하류방향 효과기 표적들), 뿐만 아니라 활성화된 HER1, HER2, HER3 및 IGFIR (PI3K 멤브레인 유인 단백질로도 공지됨) 이 검출되었다. 일부 구현예에서, 비-소세포 폐암 종양 시료가 AKT 저해제 및/또는 HER1 저해제 치료요법에 노출되었다. 더 높은 수준의 포스포릴화된 PI3K, AKT, ERK (하류방향 효과기 표적들), 뿐만 아니라 활성화된 HER1, HER2, HER3 및 IGF-1R (PI3K 멤브레인 유인 단백질로도 공지됨) 이 검출되었다. 유방암 종양 시료가 AKT 저해제 및/또는 라파티닙 (Lapatinib) (타이로신 키나아제 저해제) 에 노출되었다. 본 실시예는 암 세포가 약물 치료요법으로 인한 치료압에 적응할 수 있음을 설명한다. 또한, ErbB 조절 화합물들 (즉, 항-HER2 항체, 예컨대 Pertuzamab, 항-HER3 항체, 및 타이로신 키나아제 저해제) 과 병용한 PI3K 저해제 치료요법이 단독적인 ErbB 조절 화합물에는 더이상 응답적이지 않은 환자에게 유익할 수 있음을 설명한다. 도 16 은 AKT 저해제, HER1 저해제 또는 병용 치료요법으로 치료 후 NSCLC 종양 세포 시료에서 PI3K 경로 활성화의 CEER-FNA 분석을 보여준다. 도 17 은 AKT 저해제, 라파티닙 (타이로신 키나아제 저해제) 또는 병용 치료요법으로 치료 후 유방암 세포 시료에서 경로 프로파일링에서 바이오마커의 CEER-FNA 분석을 설명한다.
실시예 5: HER 활성화 및 이량체화 측정을 위한 신규한 근접성 기반의 복합체 검정.
본 실시예는 단일 세포 수준에서 감수성을 가진 신호 전달 복합체에서 활성화된 이벤트를 특이적으로 검출할 수 있는 신규한 근접성 이량체화 및 복합체화 검정을 설명한다. CEER 플랫폼을 포함하는 상기 검정은 제한된 양의 시료를 다룰 때 특히 유용하며, 유리하게는 순환 종양 세포 및 전이성 FNA 종양 시료 상의 키나아제 및 여타 신호 전달 경로의 발현/활성화 프로파일링을 제공한다.
한 구현예에서, 신규한 근접성 기반의 이량체 검정은 환자 종양 시료에서 ErbB 이종이량체 복합체를 검출할 수 있다. 이에 한정되지 않으나 HRG 및 EGF 과 같은 경로 활성화 리간드 및/또는 항암제에 노출된 암 세포의 그런 복합체들을 또한 검출할 수 있다.
또다른 구현예에서, 신규한 근접성 기반의 복합체 검정은 췌장암 종양 시료에서 HER3/PI3K 복합체를 검출한다.
본 실시예는 근접성 검정에 사용되는 세가지 항체가 하기를 포함할 수 있음을 설명한다: (1) 이량체쌍의 한 구성원에 특이적인 포획 항체; (2) 이량체쌍의 제 1 구성원에 특이적인 제 1 검출 항체, 여기서 제 1 검출 항체는 포획 항체와 상이한 도메인에 대해 특이적임; 및 (3) 이량체쌍의 제 2 구성원에 특이적인 제 2 검출 항체. 일부 구현예에서, 신규한 근접성 기반의 이량체 검정은, 이에 제한되지 않으나, HER1/HER2 이량체, HER1/HER3 이량체, HER2/HER3 이량체, HER2/HER2 이량체, HER2/HER4 이량체, p95HER2/HER3 이량체, p95HER2/HER2 이량체 등을 포함하는 타이로신 키나아제의 동종- 또는 이종이량체화는 검출 및 정량에 이용된다.
한 구현예에서, PI3K 복합체 검정은 하기를 포함한다: (1) PI3K 의 p85 서브유닛에 특이적인 포획 항체; (2) RTK 의 활성화된 형태 또는 어댑터 단백질에 결합하는 특이적인 검출 항체; 및 (3) PI3K 의 p85 서브유닛의 활성화된 형태를 인식하는 검출 항체. 또다른 구현예에서, PI3K 복합체 검정은 하기를 포함한다: (1) PI3K 의 p85 서브유닛에 특이적인 포획 항체; (2) RTK 의 활성화된 형태 또는 어댑터 단백질에 결합하는 특이적인 검출 항체; 및 (3) 또다른 RTK 의 활성화된 형태 또는 어댑터 단백질을 인식하는 검출 항체. 또다른 구현예에서, PI3K 복합체 검정은 하기를 포함한다: (1) PI3K 의 p110 서브유닛에 특이적인 포획 항체; (2) RTK 의 활성화된 형태 또는 어댑터 단백질에 결합하는 특이적인 검출 항체; 및 (3) PI3K 의 p85 서브유닛의 활성화된 형태를 인식하는 검출 항체. 또다른 구현예에서, PI3K 복합체 검정은 하기를 포함한다: (1) PI3K 의 p85 서브유닛에 특이적인 포획 항체; (2) RTK 의 활성화된 형태 및 어댑터 단백질에 결합하는 특이적인 검출 항체; 및 (3) PI3K 의 p110 서브유닛의 활성화된 형태를 인식하는 검출 항체. 한 구현예에서, PI3K 복합체 검정은 하기를 포함한다: (1) PI3K 의 p85 서브유닛에 특이적인 포획 항체; (2) PI3K 의 p85 의 활성화된 형태에 결합하는 특이적인 검출 항체; 및 (3) PI3K 의 p110 서브유닛의 활성화된 형태를 인식하는 검출 항체. 도 18 은 신규한 근접성 기반의 이량체 검정을 이용해 검출되는 MCF7 세포 상의 HER1/2 및 HER2/3 이종복합체의 원 데이터를 보여준다. 도 19 는 췌장 종양 시료 및 HDPE 세포에서의 HER3 이종이량체 복합체 및 HER3/PI3K 복합체의 활성화를 보여준다. CEER 이량체 검정은 포획 및 다중 검출 항체의 조합물을 이용해 10 ㎍, 5 ㎍ 및 2 ㎍ 에서 실시되었다. HER3/PI3K 복합체에 대해 10 ㎍ 에서 실시된 것을 제외한 모든 것에 대해 5 ㎍ 데이터가 제시된다. HPDE 세포 및 종양 시료 10 내지 494 는 각각 1:2 및 2:3 복합체를 형성한다. HPDE 세포에 비해 상대적으로, 종양 시료는 더 높은 수준의 phosopho-HER3 를 갖고 있으며, 이는 PI3K 와 회합하여 HER3/PI3K 복합체를 형성한다. 도 20 은 MCF7 세포 (인간 유방 선암 세포주) 에서 HRG 또는 EGF 에 응답하는 HER2 이종이량체 및 PI3K 의 활성화를 보여준다.
실시예 6: 유방암 환자 유래의 FNA 에서의 RTK 및 PI3K 경로 활성화 검출.
본 실시예는 59 명의 유방암 환자의 CEER-FNA 경로 분석을 설명한다. 고형 종양이 있는 유방암 환자 군에서 CEER 검정으로 측정되는 바와 같이 RTK 경로 활성화 발생 뿐만 아니라 하류방향 효과기 및 어댑터 단백질이 평가되었다. 높은 수준의 포스포릴화된 HER2, HER3, PI3K 및 AKT 가 여러 시료에서 검출되었다. 본 실시예는 ErbB 조절 화합물들 (즉, 항-HER2 항체, 예컨대 Pertuzamab, 항-HER3 항체, 및 타이로신 키나아제 저해제) 과 병용하는 PI3K 저해제 치료요법이 그러한 경로 프로파일을 가진 환자에게 유익할 수 있음을 설명한다. 고형 종양 환자의 CEER-FNA 경로 분석은 경로 활성화 프로파일에 따른 각 환자에 대한 질환 치료 선택사항 평가에서 임상 실무자들을 도울 가치있는 임상 정보를 제공하게 된다. 도 21 은 유방암 환자의 CEER-FNA 경로 분석을 설명한다. 도 22 는 더 많은 유방암 환자의 CEER-FNA 경로 분석을 설명한다. 도 23 은 더욱더 많은 유방암 환자의 CEER-FNA 경로 분석을 설명한다. 도 24 는 유방암 환자의 CEER-FNA 경로 분석을 설명한다.
실시예 7: 유방암 환자에서의 PI3K 및 IGF - IR 활성화의 정량적 분석.
본 실시예는 호르몬 치료요법시 재발한 유방암 환자로부터 수집된 FNA 시료에서의 HER1, HER2, p95HER2, HER3, cMET, IGF 1R 및 하류방향 키나아제를 포함하는 중요 특성 수용체 타이로신 키나아제, 및 PI3K, She, AKT 및 ERK 를 포함하는 어댑터 단백질의 총괄적 분석을 보여준다. 상승된 수준의 활성화된 IGF-IR, PI3K AKT 및 ERK/MAPK 단백질을 검출했다. 특히, 환자에서의 PI3K 활성화는 PIK3CA 돌연변이 때문이 아니었다. 놀랍게도, 기존 치료요법 (예를 들어, 호르몬 치료요법) 은 치료요법에 의해 분로되나, 그에 의해 직접 표적이 되지는 않는 호르몬 경로와 연계되어 있는 벌충적인 경로를 활성화한다. 경로 활성화 프로파일은 환자가 IGF-IR 저해제 및 PI3K 저해제를 포함하는 병용 치료로 임상적으로 유익할 수 있음을 시사한다. 경로 프로파일은 또한 IGF-IR 경로를 표적으로 하는 치료제가 ER 양성 유방암 환자 치료에 유효할 수 있다는 점을 시사한다. 도 25 는 유방암 환자에서의 IGF-IR, PI3K, AKT 및 ERK 활성화를 설명한다. 도 26 은 유방암 환자에서의 IGF-IR 및 AKT 활성화를 설명한다. 활성화된 IGF-IR 수준은 phospho-AKT 수준과 상관관계가 있다. 추가로, 상승된 수준의 전체 IGF-IR 가 또한 phospho-AKT 와 상관관계가 있다.
실시예 8: 비소세포 폐 암종 환자에서 IGF - IR 또는 cMet 활성화와 함께 PI3K 활성화의 정량적 분석.
본 실시예는 항암 치료 전 NSCLC 환자로부터 수집된 FNA 시료 중의 HER1, HER2, p95HER2, HER3, cMET, IGF-IR 및 하류방향 키나아제를 포함하는 주된 특성 수용체 타이로신 키나아제, 및 PI3K, She, AKT 및 ERK 을 포함하는 어댑터 단백질에 관한 것이다. 한가지 특별한 구현예에서, 본 발명의 방법은 환자 종양 시료로부터 수합한 생물학적 시료 중의 여러 발암 단백질 (예를 들어,FGFRl, FGFR2, IGF-IR, cMET, HER1, HER2, HER3, VEGFR2, PI3K, SHC, FAK 및 CRKL) 의 발현 수준 뿐만 아니라 그의 활성화된 (예를 들어, 포스포릴화된) 형태의 발현 수준을 검출 및 측정할 수 있게 해 준다. 특별한 경우, NSCLC 환자 유래의 종양 시료는 KRAS 돌연변이 (예를 들어, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13C 및 G13R) 를 갖고 있다.
본원에 기재된 방법은 폐암 환자 유래의 종양 시료의 PI3K 활성화 프로파일링 실시에 이용된다. HER1/2, HER1/3, HER2/3 및 HER3/PI3K 복합체화와 함께 상승된 PI3K 및 AKT 활성화 수준을 검출했다. 흥미롭게도, ERK 의 활성화도 나타났다. 도 27 은 NSCLC 환자에서 IGF-IR 또는 cMET 활성화와 함께 PI3K 활성화를 설명한다. G12C KRAS 돌연변이가 있는 환자 1 유래의 종양 시료에는 높은 수준의 PI3K 복합체 및 phospho-PI3K 와 함께 높은 수준의 전체 및 포스포릴화된 IGF-IR 를 갖고 있다. 경로 프로파일링 분석은 또한 환자 2 유래의 종양 시료가 높은 수준의 전체 및 포스포릴화된 IGF-IR, PI3K 복합체 및 phospho-PI3K 를 발현한다는 것을 보여준다. 도 28 은 HER3 및/또는 cMET 활성화와 함께 PI3K 활성화가 폐암 환자에서 검출된다는 것을 설명한다. 도 29 는 G12C KRAS 돌연변이가 있는 NSCLC 환자에서의 ER3, cMET 및 PI3K 의 동시적인 활성화를 설명한다. 여타 활성화된 하류방향 효과기 단백질들 (예를 들어, FAK 및 CRKL) 이 검출되었다. VEGFR2 발현이 높고, FGFR1 및 FGFR2 의 두가지 모두가 시료에서 활성화되어 있다. 경로 분석 프로파일링은 치료 전 종양 시료에서 실시되었다. 도 30 은 NSCLC 환자에서의 PI3K 활성화 및 HER 이종이량체의 "힛트 맵 (heat map)" 을 보여준다. ErbB 이량체화 및 PI3K 경로 활성화가 종양 시료에서 검출되었다. 도 31 은 NSCLC 환자 유래의 KRAS 및 EGFR 체세포 돌연변이가 없는 종양 시료에서의 HER3 및 PI3K 의 동시적인 활성화를 설명한다. 활성화된 CRKL, FAK 및 She 의 수준이 또한 검출되었다. 전체 VEGFR2 발현도 역시 높았다.
실시예 9. 위암 환자에서의 ErbB 클래스 수용체 타이로신 키나아제 활성화 및 PI3K 활성화의 정량.
본 실시예는 위암 환자로부터 수집된 FNA 시료에 HER1, HER2, HER3, cMET, IGF-1R, cKIT 및, PI3K, She, AKT 및 ERK 을 포함하는 하류방향 효과기 단백질들을 포함하는 중요 특성 수용체 타이로신 키나아제의 총괄적 분석을 설명한다. 한가지 특별한 구현예에서, 높은 수준의 ErbB 클래스 RTK 활성화 및 이량체 형성이 여러 종양 시료에서 검출되었다. 일부 시료에서, cMET 활성화는 phospho-HER1 수준과 상관관계가 있다.
마커 군 분류 분석 (marker grouping analysis) 을 실시해 고형 종양 암에 대한 예측 바이오마커들 간의 일치성 또는 상관관계를 평가했다. 주성분 분석 (Principal Component Analysis) 과 유사한 다차원 척도법 (Multi Dimensional Scaling) 을 이용하여, 포스포릴화된 형태의 cMET 및 HER1 가 위암 환자 유래의 종양 시료에서 높은 일치 수준을 갖는다는 것이 결정되었다. HER2 와 She 사이에서 뿐만 아니라, 상기 시료에서는 IGF-1R 와 PI3K 사이에서도 일치성이 존재했다. 흥미롭게도, HER3 은 HER2 및 PI3K 의 두가지 모두와 밀접한 관계에 있다. 이는, HER2, HER3 및 PI3K 을 포함하는 활성화된 PI3K 복합체가 위 종양 시료의 질환 상태 및 경로 프로파일 결정에 이용될 수 있다는 점을 뒷받침한다. 도 32 는 위암 환자 시료에서 phospho-HER3 의 존재함을 설명한다. 일부 시료에서는, 활성화된 HER3 가 활성화된 cMET 의 존재여부와 상관관계가 있었다. 활성화된 ErbB 수용체들은 여러 위 종양 시료에서 검출되었다. 도 33 은 포스포릴화된 경로 마커들의 일치율을 제시하는 다차원 척도법 (MDS) 그래프를 보여준다. 도 34 는 위암이 있는 환자의 경로 프로파일 분석에서 phospho-PI3K 및 phospho-AKT/ERK 의 비교를 설명한다. FGFR1, FGFR2, FGFR3 및 FGFR4 을 포함하는 FGFR 클래스의 활성화가 시료 일부에서 검출되었다.
실시예 10. 치료요법 전 대장암 환자 유래의 고형 종양 시료 유래의 PI3K 경로 활성화 검출.
본 실시예는 대장암 환자로부터 수집한 FNA 시료에서의 HER1, HER2, HER3, cMET, IGF-1R, cKIT 및, PI3K, She, AKT 및 ERK 를 포함하는 하류방향 효과기 단백질들을 포함하는 주요 특성 수용체 타이로신 키나아제의 총괄적 분석을 설명한다. 한 구현예에서, 종양 시료에는 G13D KRAS 돌연변이가 있다. 또다른 구현예에서, 종양 시료는 야생형 KRAS 유전자를 발현한다. 도 35 는 치료요법 전 대장암 환자에서의 PI3K 경로 활성화 및 HER 경로 활성화를 설명한다. 도 36 은 치료요법 전 대장암 환자로부터 취한 G13D KRAS 돌연변이가 있는 시료에서의 PI3K 경로 활성화 및 HER 경로 활성화를 설명한다. 도 36 은 HER1 (EGFR), HER2, She, ERK 및 AKT 단백질들이 고도로 활성화되어 있음을 보여준다. 도 37 은 치료요법 전 G12D KRAS 돌연변이가 있는 대장암 환자에서의 PI3K 경로 활성화 및 HER 경로 활성화를 설명한다. 도 38 은 대장암이 있는 환자 유래의 시료의 경로 프로파일링에서의 바이오마커의 FNA 분석을 설명한다.
실시예 11. 췌장암 환자의 고형 종양 유래의 PI3K 경로 활성화 검출 방법.
표적 단백질 발현 또는 돌연변이 분석만으로는 최대의 임상적 효능이 있는 올바른 치료요법 투여계획을 선별하는데 한계가 있다. 그의 발현 수준 및 포스포릴화 수준을 포함한 경로 단백질의 총괄적인 기능 분석은 임상 전략 개발에 있어 중요하다. 경로 프로파일링 분석은 췌장암 환자로부터 수집된 시료 중의 HER1, HER2, p95HER2, HER3, cMET, IGF-IR, 및 PI3K 를 포함하는 중요 수용체 타이로신 키나아제 상에서, She, AKT 및 ERK 를 포함하는 하류방향 효과기 단백질들에 대해 실시되었다. 놀랍게도, 환자 시료에서 PI3K 과 함께 HER3, IGF-IR 및/또는 cMET 의 동시적인 활성화가 있었다. PIK3CA 돌연변이 및 KRAS 돌연변이 (예를 들어, G12V 또는 G12D) 가 코호트에서 발견되었다. 도 39 는 KRAS 돌연변이가 있는 췌장암 환자의 경로 프로파일링에서의 바이오마커의 FNA 분석을 보여준다. 도 40 은 KRAS 돌연변이의 존재 및 부재 하의 췌장 환자의 경로 프로파일링에서의 바이오마커의 FNA 분석을 보여준다.
실시예 12. 핵산 및 관능성 단백질 분석을 병용한 유방암 환자의 총괄적 질환 프로파일링.
본 실시예는 핵산 및 관능성 단백질 분석을 병용하는 총괄적 질환 프로파일링 방법을 설명한다. 도 41 은 예시 방법의 개념도를 보여준다. 본 발명의 방법은 환자로부터 수득된 약 100 개의 세포를 이용한다 (610). 일부 구현예에서, 시료는 미세침 흡출물 (FNA), 순환 종양 세포 (CTC), 복수, 내시경 초음파 유도 세침 흡인 생검, 또는 환자로부터 수합된 여타 세포들이다. 수합된 환자 시료는 단일 시료 공급원 (620) 을 대표하며, 본원에 참고문헌으로 포함되는 국제 특허 공보 번호 WO2011/008149 에 기재된 방법으로 저장 및 수송될 수 있다. 시료 분취물을 자동화된 플랫폼 (630), 예컨대 CEER 플랫폼 (635) 상에서의 관능성 경로 프로파일 결정 방법을 이용해 분석할 수 있다. 시료의 또다른 분취물은 드문 체세포 돌연변이 (640) 의 존재유무를 결정하는 방법을 이용해 분석할 수 있다. 체세포 돌연변이를 검출하는 방법의 비제한적 예시는 대립형질 변이 정량 및 SNP 유전자형 분석 (645) 을 포함한다. 본 발명의 방법은 관능성 경로 프로파일링 및 체세포 돌연변이 분석으로부터 수득된 데이터를 통합하여, 총괄적 질환 프로파일 (650) 을 제공한다. 일부 구현예에서, 질환 프로파일은 보고서로 제시될 수 있다.
본 실시예는 유방암 환자의 CEER-FNA 경로 프로파일링 및 체세포 돌연변이 분석을 병용한 다국적의 다중중심적인 연구 결과를 기재한다. 연구의 상세사항은 도 42 및 43 에 제시되어 있다. 환자 유래의 조직을 1 차적 면역세포화학 (IHC) 및/또는 제자리에서의 형광 (FISH) 에 의해 HER2 과발현에 대해 스크리닝했다. 질환 재발을 겪고, 제 IIIB 기 또는 IV 기 유방암이 있는 것으로 진단된 환자들 (124 명의 환자) 이 본 연구에 참여했다. FNA 시료를 각 환자 유래의 다양하고/하거나 다중적 전이 부위로부터 수집했다. 전이 부위의 비제한적 예시에는, 간, 뼈, 겨드랑이 및 여타 림프절, 폐, 피부, 흉벽, 뇌 및 흉골질이 포함된다. 일부 구현예에서, FNA 는 23 게이지 바늘을 이용해 100 ㎕ 의 ProteinLater (Prometheus Laboratories; San Diego, CA) 중에 수집하고, 상온에서 저장 및 수송했다. 다른 구현예에서, 환자의 FNA 시료는 내시경 초음파 (EUS) 가이드의 생검에 의해 100 ㎕ 의 ProteinLater 중에 수집하고, 상온에서 저장 및 수송했다.
본 실시예는 잠정적인 분석을 58 명의 환자에서 여러가지 경로 단백질, 예컨대 HER1, HER2, p95HER2, HER3, cMET, IGF-IR, CK, SHC, AKT, ERK 및 PI3K, 및 유전자에서의 체세포 돌연변이, 예컨대 PIK3CA, KRAS 및 BRAF 에 대해 실시했음을 설명한다. CEER 검정이 신호전달 경로 (예를 들어, RTK 및 PI3K 경로) 의 전체 단백질 및/또는 활성화된 (포스포릴화된) 단백질 수준 검출에 이용될 수 있다. RTK 및 하류방향 신호전달 단백질의 프로파일이 시험한 100% (58 명의 환자 중 58 명) 의 FNA 해리물에 대해 수득되었다. 이는 RNA-기반의 분석에 대해 달성된 약 70% 의 성공율에 비해 훨씬 더 큰 것이다. 일부 구현예에서, 약 100 ㎕ 의 FNA 해리물 중 4 내지 8 ㎕ 이면 경로 프로파일링 분석에 충분하다. FNA 해리물 중 단백질은 경로 프로파일링 및 유전자형 스크리닝의 두가지 모두에 대해 잘 보존되어 있다. 특히, 포스포릴화된 부위는 단백질 상에서 유지된다. 따라서, 단일한 시료 공급원이 돌연변이 및 경로 프로파일링의 두가지 모두에 이용되어 총괄적 질환 프로파일 확립에 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 경로 프로파일링은 항암 치료체를 투여받은 환자 유래의 유방암 흡출물 상에서 실시될 수 있다. 도 44 는 HER1 저해제에 노출된 시료 유래의 유방암 흡출물의 PI3K 경로 프로파일링의 이용을 설명한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 최소량의 시료 유래의 환자의 원발 종양 및 2 차 종양의 신호전달 경로 및 체세포 돌연변이의 결정 및 비교를 포함한다. 도 45 는 유방 종양 유래의 FNA 및 림프절 종양 유래의 FNA 의 활성화된 (포스포릴화된) PI3K 경로 프로파일을 설명한다. FNA 시료는 림프절 또는 겨드랑이 영역에 대해 23 또는 25 게이지 바늘을 이용해 수득되었다. 여타 경우, 시료는 EUS-FNA 였다. 도 46A 는 CEER 검정에 의해 결정되는 PI3K 경로의 구성요소들의 단백질 발현 수준을 설명한다. 도 46B 는 HER1, HER2, HER3, cMET, IGF 1R 및 CK 의 단백질 수준이 환자의 유방 종양 및 림프절 종양에서 유사하다는 것을 보여준다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 환자 코호트에서 신호전달 경로 프로파일을 분석하고, 여러 바이오마커들과 질병 프로파일 사이의 상관관계 확립에 이용될 수 있다. 일부의 경우, 유방암 환자의 총괄적인 질환 프로파일링이 PI3K 저해제를 포함하는 치료로 환자에게 유익하게 될 것인지 여부를 결정하기 위해 이용될 수 있다. 도 47 은 본 연구에서의 유방암 환자 코호트에서 활성화된 PI3K 경로 단백질, 활성화된 PI3K 돌연변이 및 이들의 조합 사이에서 통계적으로 유의한 상관관계가 있음을 보여준다. 도 48 은 본 연구의 임시적 분석에서 환자 14003 내지 3004 의 총괄적 질환 프로파일링으로부터 수득된 데이터를 보여준다. 환자가 HER2 를 과발현하며, 높은 HER3 및 PI3K 활성을 가진 유방암 종양을 갖고 있다는 것이 본원에 기재된 방법을 이용해 결정되었다. 질환 프로파일은 환자가 PI3K 저해제 치료요법으로 유익하게 된다는 것을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 또한 종양 및 정상적인 인접 조직 (NAT) 의 경로 프로파일을 비교하기 위해 이용될 수 있다. 도 49A 는 면역세포화학적 항-범 CK 항체 (anti-pan CK antibody) 로 염색한 조직의 면역세포화학적 영상을 보여준다. 종양 세포는 CK 에 대해 양성인 반면, 정상적인 인접 조직은 CK 를 발현하지 않는다. 도 49B 는 유방암 종양 시료 및 정상적인 인접 조직 시료의 PI3K 경로 프로파일을 설명한다. 도 49C 는 본원에 기재된 CEER-FNA 검정 결과를 보여준다. 그래프는 정상적인 인접 조직과는 상이한 종양 시료의 경로 프로파일을 보여준다. 특히, HER2, HER3, IGF-1R 및 CK 가 정상적인 인접 조직에 비해 종양에서 과발현된다.
본 발명의 방법은 유방암 FNA 시료에서 면역세포화학 (IHC) 으로 측정되는 HER2 단백질의 만연이 CEER 검정으로 결정되는 증가된 수준의 전체 p95HER2 단백질 및 phospho-p95HER2 단백질 두가지 모두와 상관관계가 있음을 증명하기 위해 이용될 수 있다. 도 50A 는 유방암 흡출 시료 중 HER2 단백질 및 p95HER2 단백질의 웨스턴 블랏을 보여준다. 도 50B 는 IHC 로 측정시 HER2 (예를 들어, 3+) 를 많이 발현하는 종양 시료가 HER2 를 2+ 또는 1+/0 수준으로 발현하는 것에 비해 전체 p95HER2 단백질 및 활성화된 (포스포릴화된) p95HER2 단백질을 과발현할 공산이 크다는 것을 보여준다. 도 50C 는 IHC 로 측정한 HER2 발현에 따라 무리를 나눈 전체 p95HER2 단백질 발현의 그래프를 나타낸다.
본 연구의 임시적 분석은 또한 CEER 을 이용한 IHC HER2 (예를 들어, 3+) 시료와 높은 일치성 (100%) 을 보여줬다. 도 51 은 CEER 로 HER2 에 대해 양성으로 시험된 6 개의 FNA 시료가 1 차적 IHC 에 의해 결정되는 바와 같이 HER2 양성 세포를 발현하는 환자 유래의 것임을 보여준다. IHC HER2 음성 종양에 대해서는 CEER 과 90.5% 일치율이 있었다. 특히, 8 개의 환자 시료에는 PI3KCA 체세포 돌연변이가 있었다.
본 발명의 방법은 유방암 환자에 대한 총괄적 질환 프로파일을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 도 52 는 관능성 경로 프로파일링 및 유전자형 분석을 병용하는 본원에 기재된 총괄적 경로 분석 유래의 데이터를 설명한다. FNA 시료를 분석하여 CEER 검정에 의해 전체 및 활성화된 (즉, 포스포릴화된) 신호전달 경로 구성요소들 (예를 들어, HER1, HER2, p95HER2, HER3, cMET, IGF-1R, CK, PI3K, SHC, AKT, 및/또는 ERK) 을 검출하고, PIK3CA, KRAS 및/또는 BRAF 와 같은 유전자에서의 체세포 돌연변이를 검출한다.
실시예 13. CEER 에 의한 유방암 CTC 시료에서의 HER2 발현 및 포스포릴화의 검출.
본 실시예는 CEER 플랫폼과 같은, 다중연합적 면역-마이크로어레이 플랫폼에서 활성화 및/또는 전체 HER2 단백질의 수준을 모니터링 및 정량하기 위한 본 발명의 방법의 이용을 설명한다.
전이성 유방암의 생존율은 상당히 낮다. 1 차적 부위에서의 종양 세포들은 종종 재발 질환에서 종양 세포 집단의 프로파일을 반영하지 않는다. 환자의 말초혈 중 순환 종양 세포 (CTC) 의 평가는 비-침습적인 질환 모니터링 방법을 제공한다. 재발 질환이 있는 환자에서의 CTC 에서 신뢰할 만한 분자 마커의 식별 및 평가가 유방암 생존을 더 개선시킬 수 있다.
융합적 효소 강화 반응성-면역검정 (Collaborative Enzyme Enhanced Reactive-immunoassay (CEER)) 기법은 면역-어레이 상에 고정된 포획 항체에 근접한 2 개의 검출 항체의 동시-편재를 필요로 하는 독특한 면역-복합체의 형성을 이용한다. 2 개의 검출 항체 상에 가깝게 컨쥬게이션된 2 가지 채널링-효소 사이의 융합은 극도의 감도 및 특이성을 가진 표적 단백질의 프로파일링을 가능케 한다.
본 연구에서, CEER 은 HER2 음성인 원발 질환을 가진 III 내지 IV 기 유방암 환자 76 명에서 분리된 CTC 중의 활성화 및/또는 전체 HER2 단백질의 수준을 분석하기 위해 이용되었다. 상기 코호트의 약 25% 의 HER2 음성 BCA 환자가 재발 질환으로부터 분리된 CTC 에서 다양한 수준의 HER2 활성화 (포스포릴화) 수준을 보여줬다. HER2 활성화되어 있는 것으로 결정된 환자 중 약 8% 는 또한 전체 HER2 단백질의 유의할 과발현을 나타냈다.
상기 결과는, HER2 과발현의 존재 또는 부재 하에 HER2 활성화가 일어났다는 것을 보여준다. 일부의 경우, HER2 활성화는 HER2 이종이량체 (예를 들어, p95HER2/HER2, HER1/HER2, HER2/HER3, HER2/HER4 등) 의 형성으로 일어날 수 있으며, 따라서 전체 HER2 단백질의 수준은 상승되지 않는다. 다른 경우에서는, HER2 활성화가 HER2 과발현 및 HER2 동종이량체 (예를 들어, HER2/HER2) 의 형성으로 인해 일어날 수 있다. 상기 결과는 활성화 및 전체 HER2 단백질의 수준 검출이 재발 질환을 가진 유방암 환자에서 질환을 모니터링하는 개선된 방법을 제공한다는 것을 보여준다.
HER2 프로파일이 원발 종양 및 재발 질환 환자에서 가변적일 수 있기 때문에, 전이성 유방암 환자의 CTC 에서의 HER2 상태의 일상적인 모니터링이 시급히 필요하다. 추가로, CEER 를 이용한 CTC 에서의 HER2 변경의 발생은 또한 재발한 질환이 있는 BCA 환자에 대한 유효한 치료 투약계획의 선택에 도움이 될 수 있다. 나아가, CEER 은 약물의 표적이 될 수 있는 여타 단백질에 대한 프로파일링 및 유효한 임상적 치료요법 개발 안내에 이용될 수 있다.
실시예 14. 미세침 흡출물에서의 경로 활성화 및 체세포 돌연변이 분석이 유방암의 유효한 치료를 위한 후보자 약물을 찾아낼 수 있음.
본 실시예는 58 명의 유방암 (BCA) 환자의 전이 부위로부터 수집된 미세침 흡출물 (FNA) 시료의 총괄적인 유전자 및 분자 분석을 설명한다. 본 실시예는 RTK 경로 활성화 평가를 위한 CEER-FNA 경로 분석 실시 및 발암성 체세포 돌연변이 프로파일링과 같은 본 발명의 방법을 이용해 설명한다. 특히, 본 실시예는 본 발명의 방법이 제한된 양의 환자 시료로부터 질환 프로파일을 전개시키는데 이용될 수 있다는 것을 설명한다.
본 연구에서, CEER-FNA 경로 분석은 중요 수용체 타이로신 키나아제 및 HER1, HER2, p95HER2, HER3, cMET, IGF-IR, PI3K, She, AKT 및 ERK 를 포함하는 그의 하류방향 신호전달 분자들에 대한 정보 입수 뿐만 아니라 발암 유전자들 (예를 들어, PI3KCA, KRAS, BRAF 및 EGFR) 의 체세포 돌연변이의 프로파일링을 포함했다. 다중연합적 면역-어레이 CEER (Collaborative Enzyme Enhanced Reactive-immunoassay) 플랫폼을 이용하여 경로 단백질 발현 및 활성화 (예를 들어, 포스포릴화) 수준을 결정했다. 모든 FNA 시료들은 다중연합적 경로 발현/활성화의 분석 및 체세포 돌연변이 분석의 병용을 위한 충분한 재료를 제공했다.
비-맹검 시료에 대해서, IHC 로 결정된 HER2 양성 초대 종양으로부터 수집된 전이 부위 유래의 모든 FNA (mFNA) 는 CEER 분석에 의해 HER2 양성인 것으로 확인되었다. HER2 의 과발현은 HER2 음성 초대 종양이 있는 유방암 환자로부터 수집한 mFNA 의 10% 에서 발견되었다. PIK3CA 돌연변이는 그러한 코호트 시료의 20% 에서 발견되었다. 통계적으로 유의한 더 높은 수준의 포스포릴화된 HER1, HER2, HER3 및 IGF-IR 은 PIK3CA 돌연변이도 보유하고 있는 mFNA 에서 발견되었다. 유의한 수의 PIK3CA 야생형 환자가 또한 경로 활성화를 표시하는 강건한 경로 특징을 보여줬다. 연구 결과는 유방암 환자에서의 바이오마커 평가가 경로 단백질들 뿐만 아니라 돌연변이 분석도 포함해야 한다는 것을 보여준다.
총괄적인 질환 프로파일링은 특정한 약제의 그의 의도하는 표적 단백질에 대한 효능에 대한 통찰력있는 정보를 제공할 수 있다. 본 발명의 다중연합성 경로 분석은 또한 잠재적인 약물 내성 메커니즘에 관한 가치있는 정보를 제공할 수 있다. 나아가, 본원에 기재된 조합된 돌연변이 및 경로 활성화 프로파일링이 임상 설정에서 치료 전략 가이드를 보조할 수 있다.
본 명세서에 인용된 모든 공보 및 특허 출원은 각 개별 공보 또는 특허 출원이 특정하게 그리고 개별적으로 참고문헌으로 포함되는 것으로 표기된 것과 같이 본원에 참고문헌으로 포함된다. 본 발명은 명확한 이해를 목적으로 발명의 상세한 설명 및 실시예를 수단으로 하여 더욱 상세히 기술되긴 했지만, 당업자에게는 본 발명의 교시에 비추어 첨부된 특허청구범위의 진의 또는 범위를 벗어나지 않고도 그에 대한 특정한 변화 및 개질이 가능하다는 점이 자명할 것이다.
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Val Tyr Asn Asn Lys Val Phe Gly Glu Asp Ser Val 785 790 795 800 Gly Val Ile Phe Lys Asn Gly Asp Asp Leu Arg Gln Asp Met Leu Thr 805 810 815 Leu Gln Met Leu Arg Leu Met Asp Leu Leu Trp Lys Glu Ala Gly Leu 820 825 830 Asp Leu Arg Met Leu Pro Tyr Gly Cys Leu Ala Thr Gly Asp Arg Ser 835 840 845 Gly Leu Ile Glu Val Val Ser Thr Ser Glu Thr Ile Ala Asp Ile Gln 850 855 860 Leu Asn Ser Ser Asn Val Ala Ala Ala Ala Ala Phe Asn Lys Asp Ala 865 870 875 880 Leu Leu Asn Trp Leu Lys Glu Tyr Asn Ser Gly Asp Asp Leu Asp Arg 885 890 895 Ala Ile Glu Glu Phe Thr Leu Ser Cys Ala Gly Tyr Cys Val Ala Ser 900 905 910 Tyr Val Leu Gly Ile Gly Asp Arg His Ser Asp Asn Ile Met Val Lys 915 920 925 Lys Thr Gly Gln Leu Phe His Ile Asp Phe Gly His Ile Leu Gly Asn 930 935 940 Phe Lys Ser Lys Phe Gly Ile Lys Arg Glu Arg Val Pro Phe Ile Leu 945 950 955 960 Thr Tyr Asp Phe Ile His Val Ile Gln Gln Gly Lys Thr Gly Asn Thr 965 970 975 Glu Lys Phe Gly Arg Phe Arg Gln Cys Cys Glu Asp Ala Tyr Leu Ile 980 985 990 Leu Arg Arg His Gly Asn Leu Phe Ile Thr Leu Phe Ala Leu Met Leu 995 1000 1005 Thr Ala Gly Leu Pro Glu Leu Thr Ser Val Lys Asp Ile Gln Tyr Leu 1010 1015 1020 Lys Asp Ser Leu Ala Leu Gly Lys Ser Glu Glu Glu Ala Leu Lys Gln 1025 1030 1035 1040 Phe Lys Gln Lys Phe Asp Glu Ala Leu Arg Glu Ser Trp Thr Thr Lys 1045 1050 1055 Val Asn Trp Met Ala His Thr Val Arg Lys Asp Tyr Arg Ser 1060 1065 1070 <210> 8 <211> 1102 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) catalytic subunit p110gamma <400> 8 Met Glu Leu Glu Asn Tyr Lys Gln Pro Val Val Leu Arg Glu Asp Asn 1 5 10 15 Cys Arg Arg Arg Arg Arg Met Lys Pro Arg Ser Ala Ala Ala Ser Leu 20 25 30 Ser Ser Met Glu Leu Ile Pro Ile Glu Phe Val Leu Pro Thr Ser Gln 35 40 45 Arg Lys Cys Lys Ser Pro Glu Thr Ala Leu Leu His Val Ala Gly His 50 55 60 Gly Asn Val Glu Gln Met Lys Ala Gln Val Trp Leu Arg Ala Leu Glu 65 70 75 80 Thr Ser Val Ala Ala Asp Phe Tyr His Arg Leu Gly Pro His His Phe 85 90 95 Leu Leu Leu Tyr Gln Lys Lys Gly Gln Trp Tyr Glu Ile Tyr Asp Lys 100 105 110 Tyr Gln Val Val Gln Thr Leu Asp Cys Leu Arg Tyr Trp Lys Ala Thr 115 120 125 His Arg Ser Pro Gly Gln Ile His Leu Val Gln Arg His Pro Pro Ser 130 135 140 Glu Glu Ser Gln Ala Phe Gln Arg Gln Leu Thr Ala Leu Ile Gly Tyr 145 150 155 160 Asp Val Thr Asp Val Ser Asn Val His Asp Asp Glu Leu Glu Phe Thr 165 170 175 Arg Arg Gly Leu Val Thr Pro Arg Met Ala Glu Val Ala Ser Arg Asp 180 185 190 Pro Lys Leu Tyr Ala Met His Pro Trp Val Thr Ser Lys Pro Leu Pro 195 200 205 Glu Tyr Leu Trp Lys Lys Ile Ala Asn Asn Cys Ile Phe Ile Val Ile 210 215 220 His Arg Ser Thr Thr Ser Gln Thr Ile Lys Val Ser Pro Asp Asp Thr 225 230 235 240 Pro Gly Ala Ile Leu Gln Ser Phe Phe Thr Lys Met Ala Lys Lys Lys 245 250 255 Ser Leu Met Asp Ile Pro Glu Ser Gln Ser Glu Gln Asp Phe Val Leu 260 265 270 Arg Val Cys Gly Arg Asp Glu Tyr Leu Val Gly Glu Thr Pro Ile Lys 275 280 285 Asn Phe Gln Trp Val Arg His Cys Leu Lys Asn Gly Glu Glu Ile His 290 295 300 Val Val Leu Asp Thr Pro Pro Asp Pro Ala Leu Asp Glu Val Arg Lys 305 310 315 320 Glu Glu Trp Pro Leu Val Asp Asp Cys Thr Gly Val Thr Gly Tyr His 325 330 335 Glu Gln Leu Thr Ile His Gly Lys Asp His Glu Ser Val Phe Thr Val 340 345 350 Ser Leu Trp Asp Cys Asp Arg Lys Phe Arg Val Lys Ile Arg Gly Ile 355 360 365 Asp Ile Pro Val Leu Pro Arg Asn Thr Asp Leu Thr Val Phe Val Glu 370 375 380 Ala Asn Ile Gln His Gly Gln Gln Val Leu Cys Gln Arg Arg Thr Ser 385 390 395 400 Pro Lys Pro Phe Thr Glu Glu Val Leu Trp Asn Val Trp Leu Glu Phe 405 410 415 Ser Ile Lys Ile Lys Asp Leu Pro Lys Gly Ala Leu Leu Asn Leu Gln 420 425 430 Ile Tyr Cys Gly Lys Ala Pro Ala Leu Ser Ser Lys Ala Ser Ala Glu 435 440 445 Ser Pro Ser Ser Glu Ser Lys Gly Lys Val Gln Leu Leu Tyr Tyr Val 450 455 460 Asn Leu Leu Leu Ile Asp His Arg Phe Leu Leu Arg Arg Gly Glu Tyr 465 470 475 480 Val Leu His Met Trp Gln Ile Ser Gly Lys Gly Glu Asp Gln Gly Ser 485 490 495 Phe Asn Ala Asp Lys Leu Thr Ser Ala Thr Asn Pro Asp Lys Glu Asn 500 505 510 Ser Met Ser Ile Ser Ile Leu Leu Asp Asn Tyr Cys His Pro Ile Ala 515 520 525 Leu Pro Lys His Gln Pro Thr Pro Asp Pro Glu Gly Asp Arg Val Arg 530 535 540 Ala Glu Met Pro Asn Gln Leu Arg Lys Gln Leu Glu Ala Ile Ile Ala 545 550 555 560 Thr Asp Pro Leu Asn Pro Leu Thr Ala Glu Asp Lys Glu Leu Leu Trp 565 570 575 His Phe Arg Tyr Glu Ser Leu Lys His Pro Lys Ala Tyr Pro Lys Leu 580 585 590 Phe Ser Ser Val Lys Trp Gly Gln Gln Glu Ile Val Ala Lys Thr Tyr 595 600 605 Gln Leu Leu Ala Arg Arg Glu Val Trp Asp Gln Ser Ala Leu Asp Val 610 615 620 Gly Leu Thr Met Gln Leu Leu Asp Cys Asn Phe Ser Asp Glu Asn Val 625 630 635 640 Arg Ala Ile Ala Val Gln Lys Leu Glu Ser Leu Glu Asp Asp Asp Val 645 650 655 Leu His Tyr Leu Leu Gln Leu Val Gln Ala Val Lys Phe Glu Pro Tyr 660 665 670 His Asp Ser Ala Leu Ala Arg Phe Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg Asn 675 680 685 Lys Arg Ile Gly His Phe Leu Phe Trp Phe Leu Arg Ser Glu Ile Ala 690 695 700 Gln Ser Arg His Tyr Gln Gln Arg Phe Ala Val Ile Leu Glu Ala Tyr 705 710 715 720 Leu Arg Gly Cys Gly Thr Ala Met Leu His Asp Phe Thr Gln Gln Val 725 730 735 Gln Val Ile Glu Met Leu Gln Lys Val Thr Leu Asp Ile Lys Ser Leu 740 745 750 Ser Ala Glu Lys Tyr Asp Val Ser Ser Gln Val Ile Ser Gln Leu Lys 755 760 765 Gln Lys Leu Glu Asn Leu Gln Asn Ser Gln Leu Pro Glu Ser Phe Arg 770 775 780 Val Pro Tyr Asp Pro Gly Leu Lys Ala Gly Ala Leu Ala Ile Glu Lys 785 790 795 800 Cys Lys Val Met Ala Ser Lys Lys Lys Pro Leu Trp Leu Glu Phe Lys 805 810 815 Cys Ala Asp Pro Thr Ala Leu Ser Asn Glu Thr Ile Gly Ile Ile Phe 820 825 830 Lys His Gly Asp Asp Leu Arg Gln Asp Met Leu Ile Leu Gln Ile Leu 835 840 845 Arg Ile Met Glu Ser Ile Trp Glu Thr Glu Ser Leu Asp Leu Cys Leu 850 855 860 Leu Pro Tyr Gly Cys Ile Ser Thr Gly Asp Lys Ile Gly Met Ile Glu 865 870 875 880 Ile Val Lys Asp Ala Thr Thr Ile Ala Lys Ile Gln Gln Ser Thr Val 885 890 895 Gly Asn Thr Gly Ala Phe Lys Asp Glu Val Leu Asn His Trp Leu Lys 900 905 910 Glu Lys Ser Pro Thr Glu Glu Lys Phe Gln Ala Ala Val Glu Arg Phe 915 920 925 Val Tyr Ser Cys Ala Gly Tyr Cys Val Ala Thr Phe Val Leu Gly Ile 930 935 940 Gly Asp Arg His Asn Asp Asn Ile Met Ile Thr Glu Thr Gly Asn Leu 945 950 955 960 Phe His Ile Asp Phe Gly His Ile Leu Gly Asn Tyr Lys Ser Phe Leu 965 970 975 Gly Ile Asn Lys Glu Arg Val Pro Phe Val Leu Thr Pro Asp Phe Leu 980 985 990 Phe Val Met Gly Thr Ser Gly Lys Lys Thr Ser Pro His Phe Gln Lys 995 1000 1005 Phe Gln Asp Ile Cys Val Lys Ala Tyr Leu Ala Leu Arg His His Thr 1010 1015 1020 Asn Leu Leu Ile Ile Leu Phe Ser Met Met Leu Met Thr Gly Met Pro 1025 1030 1035 1040 Gln Leu Thr Ser Lys Glu Asp Ile Glu Tyr Ile Arg Asp Ala Leu Thr 1045 1050 1055 Val Gly Lys Asn Glu Glu Asp Ala Lys Lys Tyr Phe Leu Asp Gln Ile 1060 1065 1070 Glu Val Cys Arg Asp Lys Gly Trp Thr Val Gln Phe Asn Trp Phe Leu 1075 1080 1085 His Leu Val Leu Gly Ile Lys Gln Gly Glu Lys His Ser Ala 1090 1095 1100 <210> 9 <211> 1044 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) catalytic subunit p110delta <400> 9 Met Pro Pro Gly Val Asp Cys Pro Met Glu Phe Trp Thr Lys Glu Glu 1 5 10 15 Asn Gln Ser Val Val Val Asp Phe Leu Leu Pro Thr Gly Val Tyr Leu 20 25 30 Asn Phe Pro Val Ser Arg Asn Ala Asn Leu Ser Thr Ile Lys Gln Leu 35 40 45 Leu Trp His Arg Ala Gln Tyr Glu Pro Leu Phe His Met Leu Ser Gly 50 55 60 Pro Glu Ala Tyr Val Phe Thr Cys Ile Asn Gln Thr Ala Glu Gln Gln 65 70 75 80 Glu Leu Glu Asp Glu Gln Arg Arg Leu Cys Asp Val Gln Pro Phe Leu 85 90 95 Pro Val Leu Arg Leu Val Ala Arg Glu Gly Asp Arg Val Lys Lys Leu 100 105 110 Ile Asn Ser Gln Ile Ser Leu Leu Ile Gly Lys Gly Leu His Glu Phe 115 120 125 Asp Ser Leu Cys Asp Pro Glu Val Asn Asp Phe Arg Ala Lys Met Cys 130 135 140 Gln Phe Cys Glu Glu Ala Ala Ala Arg Arg Gln Gln Leu Gly Trp Glu 145 150 155 160 Ala Trp Leu Gln Tyr Ser Phe Pro Leu Gln Leu Glu Pro Ser Ala Gln 165 170 175 Thr Trp Gly Pro Gly Thr Leu Arg Leu Pro Asn Arg Ala Leu Leu Val 180 185 190 Asn Val Lys Phe Glu Gly Ser Glu Glu Ser Phe Thr Phe Gln Val Ser 195 200 205 Thr Lys Asp Val Pro Leu Ala Leu Met Ala Cys Ala Leu Arg Lys Lys 210 215 220 Ala Thr Val Phe Arg Gln Pro Leu Val Glu Gln Pro Glu Asp Tyr Thr 225 230 235 240 Leu Gln Val Asn Gly Arg His Glu Tyr Leu Tyr Gly Ser Tyr Pro Leu 245 250 255 Cys Gln Phe Gln Tyr Ile Cys Ser Cys Leu His Ser Gly Leu Thr Pro 260 265 270 His Leu Thr Met Val His Ser Ser Ser Ile Leu Ala Met Arg Asp Glu 275 280 285 Gln Ser Asn Pro Ala Pro Gln Val Gln Lys Pro Arg Ala Lys Pro Pro 290 295 300 Pro Ile Pro Ala Lys Lys Pro Ser Ser Val Ser Leu Trp Ser Leu Glu 305 310 315 320 Gln Pro Phe Arg Ile Glu Leu Ile Gln Gly Ser Lys Val Asn Ala Asp 325 330 335 Glu Arg Met Lys Leu Val Val Gln Ala Gly Leu Phe His Gly Asn Glu 340 345 350 Met Leu Cys Lys Thr Val Ser Ser Ser Glu Val Ser Val Cys Ser Glu 355 360 365 Pro Val Trp Lys Gln Arg Leu Glu Phe Asp Ile Asn Ile Cys Asp Leu 370 375 380 Pro Arg Met Ala Arg Leu Cys Phe Ala Leu Tyr Ala Val Ile Glu Lys 385 390 395 400 Ala Lys Lys Ala Arg Ser Thr Lys Lys Lys Ser Lys Lys Ala Asp Cys 405 410 415 Pro Ile Ala Trp Ala Asn Leu Met Leu Phe Asp Tyr Lys Asp Gln Leu 420 425 430 Lys Thr Gly Glu Arg Cys Leu Tyr Met Trp Pro Ser Val Pro Asp Glu 435 440 445 Lys Gly Glu Leu Leu Asn Pro Thr Gly Thr Val Arg Ser Asn Pro Asn 450 455 460 Thr Asp Ser Ala Ala Ala Leu Leu Ile Cys Leu Pro Glu Val Ala Pro 465 470 475 480 His Pro Val Tyr Tyr Pro Ala Leu Glu Lys Ile Leu Glu Leu Gly Arg 485 490 495 His Ser Glu Cys Val His Val Thr Glu Glu Glu Gln Leu Gln Leu Arg 500 505 510 Glu Ile Leu Glu Arg Arg Gly Ser Gly Glu Leu Tyr Glu His Glu Lys 515 520 525 Asp Leu Val Trp Lys Leu Arg His Glu Val Gln Glu His Phe Pro Glu 530 535 540 Ala Leu Ala Arg Leu Leu Leu Val Thr Lys Trp Asn Lys His Glu Asp 545 550 555 560 Val Ala Gln Met Leu Tyr Leu Leu Cys Ser Trp Pro Glu Leu Pro Val 565 570 575 Leu Ser Ala Leu Glu Leu Leu Asp Phe Ser Phe Pro Asp Cys His Val 580 585 590 Gly Ser Phe Ala Ile Lys Ser Leu Arg Lys Leu Thr Asp Asp Glu Leu 595 600 605 Phe Gln Tyr Leu Leu Gln Leu Val Gln Val Leu Lys Tyr Glu Ser Tyr 610 615 620 Leu Asp Cys Glu Leu Thr Lys Phe Leu Leu Asp Arg Ala Leu Ala Asn 625 630 635 640 Arg Lys Ile Gly His Phe Leu Phe Trp His Leu Arg Ser Glu Met His 645 650 655 Val Pro Ser Val Ala Leu Arg Phe Gly Leu Ile Leu Glu Ala Tyr Cys 660 665 670 Arg Gly Ser Thr His His Met Lys Val Leu Met Lys Gln Gly Glu Ala 675 680 685 Leu Ser Lys Leu Lys Ala Leu Asn Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser Gln 690 695 700 Lys Thr Pro Lys Pro Gln Thr Lys Glu Leu Met His Leu Cys Met Arg 705 710 715 720 Gln Glu Ala Tyr Leu Glu Ala Leu Ser His Leu Gln Ser Pro Leu Asp 725 730 735 Pro Ser Thr Leu Leu Ala Glu Val Cys Val Glu Gln Cys Thr Phe Met 740 745 750 Asp Ser Lys Met Lys Pro Leu Trp Ile Met Tyr Ser Asn Glu Glu Ala 755 760 765 Gly Ser Gly Gly Ser Val Gly Ile Ile Phe Lys Asn Gly Asp Asp Leu 770 775 780 Arg Gln Asp Met Leu Thr Leu Gln Met Ile Gln Leu Met Asp Val Leu 785 790 795 800 Trp Lys Gln Glu Gly Leu Asp Leu Arg Met Thr Pro Tyr Gly Cys Leu 805 810 815 Pro Thr Gly Asp Arg Thr Gly Leu Ile Glu Val Val Leu Arg Ser Asp 820 825 830 Thr Ile Ala Asn Ile Gln Leu Asn Lys Ser Asn Met Ala Ala Thr Ala 835 840 845 Ala Phe Asn Lys Asp Ala Leu Leu Asn Trp Leu Lys Ser Lys Asn Pro 850 855 860 Gly Glu Ala Leu Asp Arg Ala Ile Glu Glu Phe Thr Leu Ser Cys Ala 865 870 875 880 Gly Tyr Cys Val Ala Thr Tyr Val Leu Gly Ile Gly Asp Arg His Ser 885 890 895 Asp Asn Ile Met Ile Arg Glu Ser Gly Gln Leu Phe His Ile Asp Phe 900 905 910 Gly His Phe Leu Gly Asn Phe Lys Thr Lys Phe Gly Ile Asn Arg Glu 915 920 925 Arg Val Pro Phe Ile Leu Thr Tyr Asp Phe Val His Val Ile Gln Gln 930 935 940 Gly Lys Thr Asn Asn Ser Glu Lys Phe Glu Arg Phe Arg Gly Tyr Cys 945 950 955 960 Glu Arg Ala Tyr Thr Ile Leu Arg Arg His Gly Leu Leu Phe Leu His 965 970 975 Leu Phe Ala Leu Met Arg Ala Ala Gly Leu Pro Glu Leu Ser Cys Ser 980 985 990 Lys Asp Ile Gln Tyr Leu Lys Asp Ser Leu Ala Leu Gly Lys Thr Glu 995 1000 1005 Glu Glu Ala Leu Lys His Phe Arg Val Lys Phe Asn Glu Ala Leu Arg 1010 1015 1020 Glu Ser Trp Lys Thr Lys Val Asn Trp Leu Ala His Asn Val Ser Lys 1025 1030 1035 1040 Asp Asn Arg Gln <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PHOSPHORYLATION <222> (10)...(10) <223> phosphotyrosine <400> 10 Cys Gly Phe Ala Glu Pro Tyr Asn Leu Tyr Ser Ser Leu Lys Glu Lys 1 5 10 15 Val <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PHOSPHORYLATION <222> (9)...(9) <223> phosphotyrosine <400> 11 Cys Ser Lys Glu Tyr Asp Arg Leu Tyr Glu Glu Tyr Thr Arg Thr 1 5 10 15 <210> 12 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) p110 antigen <400> 12 Met Pro Pro Arg Pro Ser Ser Gly Glu Leu Trp Gly Ile His Leu Met 1 5 10 15 Pro Pro Arg Ile Leu Val Glu Cys Leu Leu Pro Asn Gly Met Ile Val 20 25 30 Thr Leu Glu Cys Leu Arg Glu Ala Thr Leu Val Thr Ile Lys His Glu 35 40 45 Leu Phe Lys Glu Ala Arg Lys Tyr Pro Leu His Gln Leu Leu Gln Asp 50 55 60 Glu Ser Ser Tyr Ile Phe Val Ser Val Thr Gln Glu Ala Glu Arg Glu 65 70 75 80 Glu Phe Phe Asp Glu Thr Arg Arg Leu Cys Asp Leu Arg Leu Phe Gln 85 90 95 Pro Phe Leu Lys Val Ile Glu Pro Val Gly Asn Arg Glu Glu Lys Leu 100 105 110 Asn Arg Glu Ile Gly Phe Ala Ile Gly Met Pro Val Cys Glu 115 120 125

Claims (58)

  1. 하기 단계를 포함하는, 고형 종양 암을 갖고 있거나 또는 고형 종양 암을 가진 것으로 추정되는 대상체에 대한 치료를 선택하기 위해 둘 이상의 수용체 타이로신 키나아제 (RTK) 분석물의 이량체화 수준을 측정하는 방법:
    (a) 둘 이상의 수용체 타이로신 키나아제 (RTK) 분석물의 이량체화 수준을 측정하는 단계, 여기서 측정은 하기 단계를 포함함:
    (i) 대상체로부터 수득된 세포 추출물을 포획 항체의 하나 또는 여러개의 연속 희석물과 인큐베이션하여 여러 포획 분석물을 형성하는 단계;
    (ii) 여러 포획 분석물을 각각 분석물의 이량체화된 쌍의 제 1 구성원 및 제 2 구성원에 특이적인 제 1 의 또는 여러개의 제 1 활성화 상태-독립적 항체 및 제 2 의 또는 여러개의 제 2 활성화 상태-독립적 항체를 함유하는 검출 항체와 인큐베이션하여, 여러 검출가능한 포획 이량체화 분석물을 형성하는 단계, 여기서 제 1 활성화 상태-독립적 항체를 촉진성 부분으로 표지하고, 제 2 활성화 상태-독립적 항체를 신호 증폭쌍의 제 1 구성원으로 표지하고, 촉진성 부분이 신호 증폭쌍의 제 1 구성원으로 채널링하여 반응하게 되는 산화제를 생성함;
    (iii) 여러 검출가능한 포획 이량체화 분석물을 신호 증폭쌍의 제 2 구성원과 인큐베이션하여 증폭 신호를 생성하는 단계; 및
    (iv) 신호 증폭쌍의 제 1 및 제 2 구성원으로부터 생성된 증폭 신호를 검출하는 단계; 및
    (b) 항암제를 선별하기 위하여, 2 개 이상의 RTK 의 이량체화를 동일한 2 개의 RTK 의 기준 이량체화 프로파일과 비교하는 단계, 여기서 기준 이량체화 프로파일은 항암제의 부재 하에 생성됨.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 2 개 이상의 RTK 에 대해 생성된 표준 곡선에 대한 둘 이상의 RTK 의 이량체화 수준을 보정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 세포 추출물이 항암제 투여 후 암이 있는 대상체로부터 분리되는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 세포 추출물을 항암제와 접촉시키는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 항암제가 PI3K 조절 화합물, RTK 조절 화합물 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 둘 이상의 RTK 가 HER1/HER2 이량체, HER1/HER3 이량체, HER2/HER3 이량체, HER2/HER2 이량체, HER2/HER4 이량체, p95HER2/HER3 이량체, 및 p95HER2/HER2 이량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 세포 추출물이 유방, 폐, 췌장, 대장 또는 위암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암을 갖고 있거나 또는 가진 것으로 추정되는 대상체로부터 분리되는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 제 1 활성화 상태-독립적 항체가 촉진성 부분으로 직접 표지되는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 제 2 활성화 상태-독립적 항체가 신호 증폭쌍의 제 1 구성원으로 직접 표지되는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 제 2 활성화 상태-독립적 항체가 활성화 상태-독립적 항체에 컨쥬게이션된 결합쌍의 제 1 구성원 및 신호 증폭쌍의 제 1 구성원에 컨쥬게이션된 결합쌍의 제 2 구성원 사이의 결합을 통해 신호 증폭쌍의 제 1 구성원으로 표지되는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 결합쌍의 제 1 구성원이 바이오틴이고/이거나 결합쌍의 제 2 구성원이 스트렙타비딘인 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 촉진성 부분이 글루코오스 옥시다아제인 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 글루코오스 옥시다아제 및 활성화 상태-독립적 항체가 술피드릴-활성화 덱스트란 분자에 컨쥬게이션되어 있는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 술피드릴-활성화 덱스트란 분자의 분자량이 500kDa 인 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 포획 항체가 유리, 플라스틱, 칩, 핀, 필터, 비드, 종이, 멤브레인, 섬유다발 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고체 담지체 상에 있는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 포획 항체가 고려가능한 어레이에서 고체 담지체 상에 구속되어 있는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 신호 증폭쌍의 제 1 구성원이 퍼옥시다아제인 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 퍼옥시다아제가 고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 인 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 신호 증폭쌍의 제 2 구성원이 티라마이드 시약인 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 티라마이드 시약이 바이오틴-티라마이드인 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 증폭 신호가 바이오틴-티라마이드의 퍼옥시다아제 산화에 의해 생성되어 활성화된 티라마이드를 제공하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 활성화된 티라마이드가 직접 검출되는 방법.
  23. 제 21 항에 있어서, 활성화된 티라마이드가 신호-검출 시약 첨가시 검출되는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 신호-검출 시약이 스트렙타비딘-표지 형광단인 방법.
  25. 제 23 항에 있어서, 신호-검출 시약이 스트렙타비딘-표지 퍼옥시다아제 및 발색 시약의 조합인 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 발색 시약이 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 인 방법.
  27. 하기 단계를 포함하는, 고형 종양 암을 갖고 있거나 또는 고형 종양 암을 가진 것으로 추정되는 대상체의 치료를 선택하기 위하여 PI3K 복합체 활성화 수준을 측정하는 방법으로서,
    상기 PI3K 복합체 분석물은 i) 2 개 이상의 수용체 타이로신 키나아제 (RTK) 의 이량체화; ii) PI3K p85 서브유닛 및 PI3K p110 서브유닛을 포함하는 방법:
    (i) 대상체로부터 수득된 세포 추출물을 포획 항체의 하나 또는 여러개의 연속 희석물과 인큐베이션하여 여러 포획 분석물을 형성하는 단계;
    (ii) 여러 포획 분석물을, (1) 이량체화된 수용체 타이로신 키나아제 쌍의 한 구성원에 특이적인 제 1 의 또는 여러개의 제 1 활성화 상태-독립적 항체 또는 PI3K p110 서브유닛을 함유하는 제 1 검출 항체; 및 (2) 이량체화된 수용체 타이로신 키나아제 쌍의 한 구성원, PI3K p85 또는 PI3K p110 서브유닛에 특이적인 제 2 의 또는 여러개의 제 2 활성화 상태-독립적 항체 또는 PI3K p85 서브유닛 및/또는 PI3K p110 서브유닛에 특이적인 활성화 상태-의존적 항체를 함유하는 제 2 검출 항체와 인큐베이션하여, 여러개의 검출가능한 포획된 이량체화되고 복합체화된 분석물을 형성하는 단계,
    여기서 제 1 검출 항체는 촉진성 부분으로 표지되고, 제 2 검출 항체는 신호 증폭쌍의 제 1 구성원으로 표지되며, 촉진성 부분은 신호 증폭쌍의 제 1 구성원에 채널링하여 반응하는 산화제를 생성함;
    (iii) 여러 검출가능한 포획 이량체화 분석물을 신호 증폭쌍의 제 2 구성원과 인큐베이션하여 증폭 신호를 생성하는 단계; 및
    신호 증폭쌍의 제 1 및 제 2 구성원으로부터 생성된 증폭 신호를 검출하는 단계; 및
    (iv) 항암제를 선별하기 위하여, PI3K 복합체 활성화 수준을 기준 PI3K 복합체 활성화 프로파일과 비교하는 단계, 여기서 기준 이량체화 프로파일은 항암제의 부재 하에 생성됨.
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