ES2553390T3 - Método para la detección de receptores truncados intracelulares - Google Patents

Abstract

Método para detectar la presencia de un receptor truncado p95ErbB2, utilizando una matriz, comprendiendo dicho método: (a) incubar un extracto celular con una pluralidad de perlas específicas para una región de unión a dominio extracelular (DEC) de un receptor de ErbB2 (HER-2) de longitud completa e incubar dicho extracto celular con una pluralidad de anticuerpos de catpura, en el que dicha pluralidad de anticuerpos de captura es específica para una región de unión a dominio intracelular (DIC) de dicho receptor truncado y en el que dicha pluralidad de anticuerpos de captura está inmovilizada sobre un soporte sólido en la matriz formando una pluralidad de receptores truncados capturados, (b) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados con anticuerpos de detección específicos para los receptores truncados correspondientes formando una pluralidad de receptores truncados capturados detectables, (c) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados detectables con un primer y segundo miembros de una pareja de amplificación de señales para generar una señal amplificada, y (d) detectar la señal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros de la pareja de amplificación de señales.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para la deteccion de receptores truncados intracelulares ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El proceso de transduccion de senales en las celulas es responsable de una diversidad de funciones biologicas, entre ellas la division y muerte celular, el metabolismo, la activacion de las celulas inmunologicas, la neurotransmision y la percepcion sensorial, entre otras muchas. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, los trastornos en la transduccion normal de senales en las celulas pueden conducir a varios estados patologicos, tales como la diabetes, las enfermedades cardiovasculares, la autoinmunidad y el cancer.

Una ruta de transduccion de senales bien caracterizada es la ruta de la MAP quinasa, que es responsable de la transduccion de la senal del factor de crecimiento epidermico (FCE) de estimulacion de la proliferacion celular en las celulas (ver la figura 1). El FCE se une a una tirosina quinasa unida a receptor transmembranal, el receptor del factor de crecimiento epidermico (RFCE), que resulta activado por la union del FCE. La union de FCE al RFCE activa la actividad de tirosina quinasa del dominio citoplasmatico del receptor. Una consecuencia de esta activacion de quinasa es la autofosforilacion del RFCE en los residuos de tirosina. Los residuos de tirosina fosforilada en el RFCE activado proporcionan un sitio de anclaje para la union de protemas adaptadoras que contienen dominio SH2, tales como GRB2. En su funcion de adaptador, GRB2 se une ademas a un factor de intercambio de nucleotidos guanina, SOS, mediante un dominio SH3 en GRB2. La formacion del complejo RFCE-GRB2-SOS conduce a la activacion de SOS del factor de intercambio de nucleotidos de guanina, que estimula la eliminacion de GDP de Ras. Tras la eliminacion de GDP, Ras se une a GTP y resulta activado.

Tras la activacion, Ras se une y activa la actividad de protema quinasa de la RAF quinasa, una protema quinasa espedfica de serina/treonina. A continuacion se activa una cascada de protemas quinasas que conduce a la proliferacion celular. En lmeas generales, la RAF quinasa fosforila y activa la MEK, otra serina/treonina quinasa. La MEK activada fosforila y activa la protema quinasa activada por mitogeno (MAPK). Entre las dianas para la fosforilacion adicional por la MAPK se encuentran la protema ribosomica 40S quinasa S6 (RSK). La fosforilacion de la RSK por la MAPK resulta en la activacion de RSK, que a su vez fosforila la protema ribosomica S6. Otra diana conocida de la MAPK es el protooncogen c-Myc, un gen importante para la proliferacion celular que se encuentra mutado en una diversidad de canceres.MAPK tambien fosforila y activa otra protema quinasa, MNK, que a su vez fosforila el factor de transcripcion CREB. Indirectamente, MAPK regula ademas la transcripcion del gen Fos, que codifica todavfa otro factor de transcripcion que participa en la proliferacion celular. Mediante la alteracion de los niveles y actividades de dichos factores de transcripcion, MAPK transduce la senal extracelular originaria del FCE llevando a una transcripcion alterada de genes que resultan importantes para la progresion del ciclo celular.

Dada la funcion crucial que desempenan las rutas de transduccion de senales en el crecimiento celular, no sorprende que muchos canceres aparezcan como resultado de mutaciones y otras alteraciones en componentes de la transduccion de senales que resultan en la activacion aberrante de las rutas de proliferacion celular. Por ejemplo, la sobreexpresion o hiperactividad de RFCE se ha asociado a varios canceres, incluyendo el glioblastoma multiforme, el cancer de colon y el cancer de pulmon. Esto ha impulsado el desarrollo de terapeuticas anticancer dirigidas contra RFCE, incluyendo el gefitinib y el erlotinib para el cancer de pulmon, y el cetuximab para el cancer de colon.

El cetuximab es un ejemplo de un inhibidor de anticuerpos monoclonales, el cual se une al dominio del RFCE de union a ligandos extracelulares, impidiendo de esta manera la union de ligandos que activan la RFCE tirosina quinasa. En contraste, el gefitinib y el erlotinib son moleculas pequenas que inhiben la RFCE tirosina quinasa de localizacion intracelular. En ausencia de actividad de quinasa, el RFCE no puede autofosforilarse en los residuos de tirosina, lo que es un requisito previo para la union de protemas adaptadoras posteriores, tales como GRB2. Al detener la cascada de senalizacion en las celulas basadas en esta ruta para el crecimiento, se reducen la proliferacion y migracion tumorales.

Ademas, otros estudios han demostrado que aproximadamente el 70% de los melanomas humanos y una fraccion mas pequena de otros tumores presentan una mutacion puntual (V599E) en el gen Raf que conduce a la activacion persistente de la ruta de MPAK (ver, por ejemplo, Davies et al., Nature 417:949-954, 2002). Estos resultados sugieren que las mutaciones, en particular en las rutas de transduccion de senales, pueden ser caractensticas de tipos particulares de tumor y que dichas rutas espedficas alteradas de transduccion de senales podnan ser una diana prometedora para la intervencion quimioterapeutica. Kelkar et al., Journal of Virology 78(18):10122-10132, 2004, se refiere al estudio de la interaccion de los adenovirus con la dinema y microtubulos citoplasmaticos. El documento n° US 2007/111944 se refiere a un metodo para purificar una molecula de factor de crecimiento endotelial vascular (FCEV) mediante cromatograffa de afinidad de una muestra biologica que contiene la molecula que debe purificarse, bajo condiciones suficientes para la union de las moleculas de longitud completa pero no de

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las formas truncadas o recortadas. Scaltriti et al., National cancer institute Journal, Oxford University; Vol. 99(8):628- 638, 2007, se refiere a la deteccion de p95HER2, una forma truncada del receptor de ErbB2 (HER-2) y la respuesta a las terapias anti-HER2 en el cancer de mama.

Dado que diferentes tratamiento del cancer, particularmente la quimioterapia del cancer, pueden funcionar directa o indirectamente mediante el bloqueo o la activacion de las rutas celulares de transduccion de senales implicadas en la proliferacion o muerte celulares, respectivamente, la actividad de una ruta dada de transduccion de senales en una forma particular de cancer podna servir como un buen indicador de la eficacia de diversos tratamientos del cancer. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, ademas de satisfacer otras necesidades, la presente invencion proporciona un metodo para evaluar la efectividad de las potenciales terapias anticancer en un paciente individual. De esta manera, la presente invencion proporciona metodos para ayudar al medico a seleccionar una terapia del cancer adecuada, a la dosis correcta y en el momento correcto para cada paciente.

BREVE DESCRIPCION RESUMIDA DE LA INVENCION

La presente invencion proporciona composiciones y metodos para detectar los estados de activacion de los componentes de las rutas de transduccion de senales en las celulas tumorales (por ejemplo celulas circulantes de un tumor mamario). La informacion sobre los estados de activacion de los componentes de las rutas de transduccion de senales derivadas de la practica de la presente invencion puede utilizarse para el diagnostico del cancer, para el pronostico y para el diseno de tratamientos del cancer.

En un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para detectar la presencia de un receptor truncado p95ErbB2, utilizando una matriz, comprendiendo dicho metodo:

(a) incubar un extracto celular con una pluralidad de perlas espedficas para una region de union a dominio extracelular (DEC) de un receptor de ErbB2 (HER-2) de longitud completa e incubar dicho extracto celular con una pluralidad de anticuerpos de captura, en el que dicha pluralidad de anticuerpos de captura es espedfica para una region de union a dominio intracelular (DIC) de dicho receptor truncado y en el que dicha pluralidad de anticuerpos de captura esta inmovilizada sobre un soporte solido en la matriz formando una pluralidad de receptores truncados capturados,

(b) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados con anticuerpos de deteccion espedficos para los receptores truncados correspondientes formando una pluralidad de receptores truncados capturados detectables,

(c) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados detectables con un primer y segundo miembros de una pareja de amplificacion de senales para generar una senal amplificada, y

(d) detectar la senal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros de la pareja de amplificacion de senales.

En algunas realizaciones, los metodos de la presente invencion pueden resultar utiles para ayudar o asistir en la seleccion de un farmaco anticancer adecuado para el tratamiento de un tumor mamario. En algunas realizaciones, los metodos de la presente invencion pueden resultar utiles para mejorar la seleccion de un farmaco anticancer adecuado para el tratamiento de un tumor mamario.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona una matriz que presenta un rango dinamico superior que comprende una pluralidad de series de dilucion de anticuerpos de captura inmovilizados sobre un soporte solido, en el que los anticuerpos de captura en cada serie de dilucion son espedficos para uno o mas analitos correspondientes a un componente de una ruta de transduccion de senales u otra protema (por ejemplo un receptor de hormona nuclear) en un extracto celular. Las matrices direccionables descritas en la presente memoria resultan particularmente utiles para determinar la expresion y/o estado de activacion de moleculas de transduccion de senales y otras protemas implicadas en el cancer de mama.

Otros objetivos, caractensticas y ventajas de la presente invencion resultaran evidentes para el experto en la materia a partir de la descripcion detallada y figuras siguientes.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra un ejemplo de una ruta de transduccion de senales que participa en la proliferacion celular que puede utilizarse en la practica de la invencion. Se ilustran componentes de la ruta RFCE/MAPK/ERK que es utilizada por las celulas para convertir una senal mitogenica en proliferacion celular.

La figura 2 muestra una realizacion de la presente invencion en la que los ensayos de proximidad descritos en la presente memoria detectaron RFCE fosforilado (pRFCE) y HER-2 fosforilado (pHER-2) con sensibilidad de celulas individuales.

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La figura 4 muestra esquematicamente la aplicacion de las matrices direccionables de la invencion para la seleccion de farmacos durante el curso del tratamiento del cancer.

La figura 5 muestra un ejemplo esquematico de una matriz direccionable que comprende diluciones de anticuerpos contra componentes de una ruta de receptor de tirosina quinasa, tales como aquellos en la ruta RFCE/MAPK/ERK. Los anticuerpos se han sembrado por triplicado a cuatro diluciones diferentes en la matriz direccionable.

La figura 6 muestra un ejemplo esquematico de una matriz direccionable que comprende diluciones de anticuerpos contra componentes de rutas de transduccion de senales activadas en la angiogenesis tumoral. Los anticuerpos se han sembrado por triplicado a cuatro diluciones diferentes en la matriz direccionable.

La figura 7 muestra un ejemplo esquematico de una matriz direccionable que comprende diluciones de anticuerpos contra componentes de rutas de transduccion de senales activadas en la angiogenesis tumoral. Los anticuerpos se han sembrado por triplicado a cuatro diluciones diferentes en la matriz direccionable.

La figura 8 muestra un ejemplo esquematico de una matriz direccionable que comprende diluciones de anticuerpos contra componentes de una ruta de receptor de tirosina quinasa y rutas de transduccion de senales activadas en la angiogenesis tumoral. Los anticuerpos se han sembrado por triplicado a cuatro diluciones diferentes en la matriz direccionable.

La figura 9 muestra un ejemplo esquematico de una matriz direccionable que comprende diluciones de anticuerpos contra componentes de una ruta de receptor de tirosina quinasa y rutas de transduccion de senales activadas en la angiogenesis tumoral. Los anticuerpos pueden sembrarse por triplicado en una serie de dilucion en la matriz direccionable.

La figura 10 muestra los niveles relativos de fosforilacion de RFCE para 5 muestras de cancer de mama y 6 muestras normales. Los datos tambien se muestran en la Tabla 40.

La figura 11 muestra los niveles relativos de fosforilacion de HER-2 para 5 muestras de cancer de mama y 6 muestras normales. Los datos tambien se muestran en la Tabla 41.

La figura 12 muestra imagenes de tincion CTC en el sistema Veridex Cell Search™ para 5 pacientes de cancer de mama. Las lmeas celulares de control eran la A431 (positiva para RFCE) y SKBr3 (positiva para HER-2).

La figura 13 muestra que la HER-2 de longitud completa (ErbB2) puede extraerse de una muestra del paciente utilizando anticuerpos que se unen al dominio extracelular de Erb2 unido a una perla de poliestireno o a un dextrano polimerico.

La figura 14 muestra una realizacion de la presente invencion para detectar receptores truncados tales como p95ErbB2. SA = estreptavidina; HRP = peroxidasa de rabano picante; TSA = amplificacion de senales con tiramida.

La figura 15 muestra que el pretratamiento con perlas recubiertas con un anticuerpo dirigido contra el dominio extracelular (DEC) de ErbB2 (HER-2) elimino practicamente por completo la senal de ErbB2 de longitud completa sin afectar a la senal de dominio intracelular (ICD) de ErbB2.

La figura 16 muestra que el tratamiento con APMA (acetato (4-aminofenil)mercurico) incremento la fosforilacion de p95ErbB2 en celulas BT-474.

La figura 17 muestra que la heregulina incremento la fosforilacion de p95ErbB2 en celulas T47D.

La figura 18 muestra multiples puntos en los que pueden utilizarse los metodos de la presente invencion para influir sobre la practica clmica con respecto a la seleccion de la terapia para el cancer de mama apropiada para un paciente particular.

La figura 19 muestra una realizacion del formato de ensayo de la presente invencion, el cual se basa en la colocalizacion de dos anticuerpos detectores adicionales unidos a enzimas para los sucesos de canalizacion posteriores para cada protema diana unida.

La figura 20 muestra la sensibilidad para celulas individuales de los ensayos de pHER-1 y de pHER-2.

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La figura 21 muestra la expresion/activacion de ErbB con el tratamiento de FCE o de HRG p en diversas lmeas celulares.

La figura 22 muestra el perfil de ErB RTK de las celulas T47D con estimulacion con FCE o HRG p.

La figura 23 muestra una realizacion ejemplar de una matriz de la ruta de ErbB.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

I. Introduccion

Tal como se ha indicado anteriormente, la activacion de las rutas de transduccion de senales que participan en la proliferacion celular y la desactivacion de las rutas implicadas en la muerte celular son ejemplos no limitativos de caractensticas moleculares que caracterizan muchos tipos diferentes de cancer. En muchos casos, la actividad de rutas particulares de transduccion de senales y de los componentes de las mismas, pueden servir como firmas moleculares para un tipo de cancer dado. Dichos componentes activados pueden proporcionar ademas dianas utiles para la intervencion terapeutica. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, el conocimiento del nivel de actividad de un sistema particular de transduccion de senales dentro de una celula de cancer antes, durante y despues del tratamiento proporciona al medico una informacion altamente relevante que puede utilizarse para seleccionar un curso de tratamiento apropiado. Ademas, el seguimiento continuo de las rutas de transduccion de senales que se encuentran activas en las celulas de cancer a medida que progresa el tratamiento puede proporcionar al medico informacion adicional sobre la eficacia del tratamiento, motivando al medico a que continue con un curso de tratamiento particular o a que cambie a otra lmea de tratamiento en el caso de que, por ejemplo, las celulas de cancer hayan adquirido resistencia al tratamiento por aberraciones posteriores que activan la misma ruta u otras rutas de transduccion de senales.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente invencion proporciona metodos y composiciones para la deteccion de la expresion y estados de activacion de una pluralidad de moleculas de transduccion de senales desregulada en tejido tumoral o en celulas extratumorales, tales como celulas circulantes raras de un tumor solido en un ensayo multiplex de alto rendimiento espedfico. La invencion proporciona ademas metodos y composiciones para la seleccion de una terapia apropiada (farmacos individuales o combinaciones de farmacos) para regular negativamente o cerrar una ruta de senalizacion desregulada. De esta manera, la invencion puede utilizarse para facilitar el diseno de terapias personalizadas para pacientes de cancer.

La capacidad de detectar e identificar celulas tumorales en la circulacion mediante la determinacion de la actividad de rutas de transduccion de senales al nivel de celulas individuales es una ventaja importante de la presente invencion. Con frecuencia se encuentran celulas tumorales en la sangre de pacientes con diversos estadios tempranos de cancer, en forma de "micrometastasis" (celulas tumorales diseminadas) y tambien se encuentran en canceres metastasicas. El numero de celulas tumorales en la sangre dependera del estadio y tipo de tumor. Aunque las biopsias tfpicamente se obtienen de tumores primarios, la mayona de los tumores metastasicos no se biopsia, dificultando mucho el analisis molecular de dichas muestras tumorales. Durante la metastasis tumoral, las celulas tumorales mas agresivas abandonan el tumor primario y viajan por la sangre y el sistema linfatico hasta alcanzar un sitio distante. De esta manera, las celulas tumorales circulantes en la sangre representan la poblacion mas agresiva y homogenea de celulas tumorales. Sin embargo, el numero de celulas tumorales metastasicas con frecuencia es muy bajo, variando entre uno y varios miles de celulas por mililitro de sangre. La capacidad de aislar y someter a ensayo las rutas de transduccion de senales en dichas celulas raras y de aplicar dicha informacion a conseguir tratamientos mas efectivos para el cancer es un objetivo de la presente invencion.

En algunas realizaciones, los inmunoensayos multiplex de alto rendimiento de la presente invencion pueden detectar el estado de activacion de una o mas moleculas de transduccion de senales en celulas circulantes de un tumor solido al nivel de celulas individuales. De hecho, pueden detectarse moleculas de transduccion de senales tales como RFCE con una sensibilidad de aproximadamente 100 zeptomoles y con un rango dinamico lineal de entre aproximadamente 100 zeptomoles y aproximadamente 100 femtomoles. De esta manera, la deteccion en celulas individuales del estado de activacion de multiples transductores de senales en celulas circulantes raras facilita el pronostico y diagnostico del cancer, asf como el diseno de terapias dirigidas personalizadas.

Entre las celulas circulantes raras se incluyen las celulas circulantes de un tumor solido que han metastizado o micrometastizado a partir de un tumor solido. Las celulas tumorales circulantes, las celulas madre cancerosas y las celulas que migran a un tumor (por ejemplo debido a la quimioatraccion), tales como las celulas progenitoras endoteliales circulantes, las celulas endoteliales circulantes, las celulas mieloides proangiogenicas circulantes y las celulas dendnticas circulantes son algunos ejemplos de celulas circulantes asociadas a un tumor solido.

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Las moleculas de transduccion de senales de interes tipicamente se extraen poco despues de aislar las celulas circulantes con el fin de conservar su estado de activacion in situ, preferentemente dentro de las primeras aproximadamente 24, 6 o 1 horas, y mas preferentemente dentro de los primeros aproximadamente 30, 15 o 5 minutos. Las celulas aisladas tambien pueden incubarse ventajosamente con uno o mas factores de crecimiento, habitualmente a concentraciones entre nanomolares y micromolares, durante aproximadamente 1 a 30 minutos con el fin de resucitar o estimular la activacion de las moleculas de transduccion de senales (ver, por ejemplo, Irish et al., Cell 118:217-228, 2004).

Tal como se explica en mayor detalle en la presente memoria, para evaluar las potenciales terapias anticancer para un paciente individual, las celulas aisladas pueden incubarse con uno o mas farmacos anticancer a diferentes dosis. A continuacion puede llevarse a cabo una estimulacion con factor de crecimiento durante unos cuantos minutos (por ejemplo entre aproximadamente 1 y 5 minutos) o durante varias horas (por ejemplo durante aproximadamente 1 a 6 horas). La activacion diferencial de las rutas de senalizacion con y sin farmacos anticancer puede ayudar en la seleccion de una terapia de cancer adecuada a la dosis apropiada para cada paciente individual. Las celulas circulantes tambien pueden aislarse a partir de una muestra de paciente durante el tratamiento con farmaco anticancer y estimularse con uno o mas factores de crecimiento para determinar si debena implementarse un cambio de terapia. De esta manera, los metodos de la presente invencion ayudan ventajosamente al medico clmico al proporcionarle el farmaco anticancer correcto a la dosis correcta en el momento correcto para cada paciente.

Con respecto al cancer de mama, las opciones de ensayo actuales resultan insatisfactorias porque el tratamiento de los tumores tanto primarios como metastasicos en un paciente de cancer de mama se basa en un diagnostico puntual a partir de una muestra de biopsia obtenida durante un estadio temprano de la enfermedad. En particular, la intervencion terapeutica para los estadios tanto tempranos como metastasicos del cancer de mama se basa unicamente en el diagnostico inicial derivado de la muestra de biopsia obtenida durante un estadio temprano de la enfermedad debido a la imposibilidad practica de obtener una muestra de biopsia de un paciente con cancer metastasico. Sin embargo, los tumores de mama se desarrollan en funcion del tiempo y el tratamiento, de manera que el seguimiento temporal de los tumores de mama resulta crucial para un control optimo de los pacientes de cancer de mama. Por ejemplo, un cambio en el estado de activacion de uno o mas de los receptores de tirosina quinasa de la familia de ERbB (HER) podna afectar a la seleccion de terapia en el momento de una recurrencia. En efecto, la discrepancia en el estatus de HER-2 entre el cancer primario y el cancer metastasico es comun debido a que 37% de todos los pacientes de cancer de mama cambian de un tumor primario negativo para HER-2 a cancer metastasico positivo para HER-2. Ademas, los pacientes pueden presentar resistencia de nuevo o desarrollar resistencia adquirida a la terapia hormonal debido a la activacion de HER-1/2. En algunos casos, los pacientes pueden presentar resistencia de novo o desarrollar resistencia adquirida a terapias dirigidas contra ErbB debido a la presencia de celulas tumorales que expresan p95HER-2. En consecuencia, existe una necesidad clmica no satisfecha de ensayos que ayuden al medico clmico en la prescripcion de la terapia apropiada para el cancer en el tiempo correcto debido a que la tecnologfa actual no presenta suficiente sensibilidad y especificidad, no puede utilizarse para el seguimiento de pacientes bajo terapia y no utiliza el perfilado de rutas para guiar las decisiones individualizadas de tratamiento.

En contraste con las opciones de ensayo del cancer de mama disponibles actualmente, los metodos de la presente invencion permiten el seguimiento de los pacientes de cancer de mama durante todos los estadios de la enfermedad, al proporcionar una "biopsia en tiempo real" de los tumores de mama solidos utilizando muestras tales como celulas tumorales circulantes (CTC) procedentes de la sangre y/o de aspirados con aguja fina (AAF). A tftulo de ejemplo no limitativo, los ensayos de cancer de mama descritos en la presente memoria pueden utilizarse en el diagnostico inicial del cancer de mama en un paciente en un estadio temprano de la enfermedad. La seleccion de una terapia adecuada para el cancer esta guiada por el perfilado de los estados de activacion de rutas de senalizacion espedficas con y sin farmacos anticancer utilizando los ensayos de deteccion unica y de doble deteccion por proximidad descritos en la presente memoria. Ventajosamente, los metodos de la presente invencion pueden utilizarse ademas para el seguimiento de la progresion o regresion de la enfermedad debido a que la intervencion terapeutica puede basarse en muestras obtenidas en cualquier estadio de la enfermedad y analizarse utilizando los ensayos de deteccion unica y de doble deteccion por proximidad descritos en la presente memoria. De esta manera, la seleccion de terapias del cancer adecuadas para los estadios tempranos y metastasicos del cancer de mama esta guida por el diagnostico en tiempo real y un analisis del estado de activacion de moleculas espedficas de rutas de senalizacion.

Los metodos de la presente invencion se adaptan ventajosamente para resolver cuestiones cruciales en el control del cancer y para proporcionar un mejor estandar de cuidado para los pacientes de cancer de mama, debido a que (1) proporcionan una sensibilidad incrementada (por ejemplo puede conseguirse la deteccion de celulas individuales para detectar moleculas de transduccion de senales totales y fosforiladas, tales como RFCE y HER-2), (2) proporcionan una especificidad incrementada (por ejemplo los ensayos de proximidad de tres anticuerpos incrementan la especificidad para detectar moleculas fosforiladas de transduccion de senales), (3) permiten el perfilado de rutas (por ejemplo, puede detectarse el estado de activacion de moleculas espedficas de transduccion

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de senales en CTC o AAF de pacientes), y (4) elimina posibles problemas durante la obtencion de las muestras de los pacientes (por ejemplo, los ensayos pueden llevarse a cabo en unas cuantas celulas tumorales). Aunque puede utilizarse cualquier muestra en los nuevos ensayos descritos en la presente memoria, las CTC resultan particularmente utiles porque representan las celulas tumorales mas agresivas, es conocido que todos los tumores liberan las CTC, pueden ser la unica fuente de tumores residuales o tumores metasticos de diffcil acceso, y se encuentran en la sangre. De esta manera, los metodos de la presente invencion permiten el muestreo en serie de tejidos de tumor mamario, resultando en la obtencion de informacion valiosa sobre los cambios producidos en las celulas tumorales como funcion del tiempo y la terapia, y proporcionan al medico clmico medios para realizar un seguimiento de las firmas de rutas de senalizacion de cancer en rapido cambio.

En resumen, los metodos de la presente invencion proporcionan ventajosamente una seleccion y seguimiento precisos de los pacientes de cancer (por ejemplo pacientes de cancer de mama) que mas probablemente se beneficianan de la terapia dirigida, llevando a cabo el perfilado de rutas con celulas tumorales de facil acceso utilizando ensayos multiplex de anticuerpos de deteccion unica o de proximidad.

II. Definiciones

Tal como se utilizan en la presente memoria, los terminos y expresiones siguientes presentan los significados atribuidos a ellos a menos que se indique lo contrario.

El termino "cancer" pretende incluir cualquier miembro de una clase de enfermedades caracterizada por el crecimiento descontrolado de celulas aberrantes. El termino incluye todos los canceres y condiciones neoplasicas conocidos, caracterizados como malignos, benignos, tejido blandos o solidos, y canceres de todos los estadios y grados, incluyendo canceres premetastasicos y postmetastasicos. Entre los ejemplos de diferentes tipos de cancer se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el cancer de mama, el cancer de pulmon (por ejemplo el cancer de pulmon de celulas no pequenas), los canceres digestivos y gastrointestinales tales como el cancer colorrectal, los tumores estromales gastrointestinales, los tumores carcinoides gastrointestinales, el cancer de colon, el cancer rectal, el cancer anal, el cancer de los conductos biliares, el cancer del intestino delgado y el cancer de estomago (gastrico), el cancer esofagico, el cancer de la vesfcula biliar, el cancer hepatico, el cancer pancreatico, el cancer del apendice, el cancer ovarico, el cancer renal (por ejemplo el carcinoma de celulas renales), el cancer del sistema nervioso central, el cancer de piel, los linfomas, los coriocarcinomas, los canceres de cabeza y cuello, los sarcomas osteogenicos y las leucemias. Tal como se utiliza en la presente memoria, un "tumor" comprende una o mas celulas cancerosas. En una realizacion preferente, el tumor mamario se deriva de un sujeto con una forma invasiva o in situ de carcinoma ductal o carcinoma lobular. En otra realizacion preferente, el tumor mamario se deriva de un sujeto con cancer mamario recurrente o metastasico.

El termino "analito" incluye cualquier molecula de interes, tipicamente una macromolecula tal como un polipeptido, cuya presencia, cantidad y/o identidad se determina. En determinados casos el analito es un componente celular de celulas circulantes de un tumor solido, preferentemente una molecula de transduccion de senales.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "serie de dilucion" pretende incluir una serie de concentraciones decrecientes de una muestra particular (por ejemplo un lisado celular) o reactivo (por ejemplo un anticuerpo). Tfpicamente se produce una serie de dilucion mediante un procedimiento de mezcla de una cantidad medida de una concentracion inicial de una muestra o reactivo con un diluyente (por ejemplo un tampon de dilucion) con el fin de crear una concentracion mas baja de muestra o reactivo, y la repeticion del procedimiento suficientes veces para obtener el numero deseado de diluciones en serie. La muestra o reactivo puede diluirse en serie por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 500 o 1.000 veces para producir una serie de dilucion que comprende por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 concentraciones decrecientes de la muestra o reactivo. Por ejemplo, puede producirse una serie de dilucion que comprenda una dilucion en serie de 2 veces de un reactivo de anticuerpo de captura a una concentracion inicial de 1 mg/ml mediante la mezcla de una cantidad de la concentracion inicial de anticuerpo de captura con una cantidad igual de un tampon de dilucion para crear una concentracion de 0,5 mg/ml del anticuerpo de captura, y repetir el procedimiento para obtener concentraciones de anticuerpo de captura de 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,0625 mg/ml, 0,0325 mg/ml, etc.

La expresion "rango dinamico superior" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la capacidad de un ensayo de detectar un analito espedfico en tan solo una celula o incluso en miles de celulas. Por ejemplo, los inmunoensayos descritos en la presente memoria presentan un rango dinamico superior debido a que detectan ventajosamente una molecula particular de interes de transduccion de senales en aproximadamente 1 a 10.000 celulas (por ejemplo en aproximadamente 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500, 750, 1.000, 2.500, 5.000, 7.500 o 10.000 celulas) utilizando una serie de dilucion de concentraciones de anticuerpo de captura.

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La expresion "molecula de transduccion de senales" o "transductor de senales" incluye protemas y otras moleculas que llevan a cabo el procedimiento por el que una celula convierte una senal o estimulo extracelular en una respuesta, implicando tfpicamente secuencias ordenadas de reacciones bioqmmicas en el interior de la celula. Entre los ejemplos de moleculas de transduccion de senales se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, receptores de tirosina quinasa tales como RFCE (por ejemplo RFCE/HER-1/ErbB1, HER-2/Neu/ErbB2, HER-3/ErbB3, HER- 4/ErbB4), RFCE-1/FLT-1, RFCE-2/FLK-1/KDR, RFCE-3/FLT-4, FLT-3/FLK-2, PDGFR (por ejemplo PDGFRA, PDGFRB), c-KIT/SCFR, INSR (receptor de insulina), IGF-IR, IGF-IIR, IRR (receptor relacionado con receptor de insulina), CSF-1R, FGFR 1-4, HGFR 1-2, CCK4, TRK A-C, MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYRO3, TIE 1-2, TEK, RYK, DDR 1-2, RET, c-ROS, V-cadherina, LTK (tirosina quinasa de leucocitos), ALK (quinasa de linfoma anaplasico), ROR 1-2, MUSK, AATYK 1-3, RTK 106 y formas truncadas de los receptores de tirosina quinasa tales como p95ErbB2; no receptores de tirosina quinasa tales como BCR-ABL, Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack y LIMK; componentes de la cascada de senalizacion de tirosina quinasa tales como Akt, MAPK/ERK, MEK, RAF, PLA2, MEKK, JNKK, JNK, p38, Shc (p66), PI3K, Ras (por ejemplo K-Ras, N-Ras, H- Ras), Rho, Rac1, Cdc42, PLC, PKC, p70 S6 quinasa, p53, ciclina D1, STAT1, STAT3, PIP2, PIP3, PDK, mTOR, BAD, p21, p27, ROCK, IP3, TSP-1, NOS, PTEN, RSK 1-3, JNK, c-Jun, Rb, CREB, Ki67 y paxilina; receptores de hormona nuclear tales como el receptor de estrogeno (RE), receptor de progesterona (RP), receptor de androgeno, receptor de glucocorticoide, receptor de mineralocorticoide, receptor de vitamina A, receptor de vitamina D, receptor de retinoide, receptor de hormona tiroidea y receptores huerfanos; coativadores y represores de receptores nucleares tales como el factor amplificado en cancer de mama 1 (AIB1) y el correpresor de receptores nucleares 1 (NCOR), respectivamente, y las combinaciones de los mismos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "celulas circulantes" comprende celulas extratumorales que han metastizado o micrometastizado a partir de un tumor solido. Entre los ejemplos de celulas circulantes se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, celulas tumorales circulantes, celulas madre cancerosas y/o celulas que migran al tumor (por ejemplo celulas progenitoras endoteliales circulantes, celulas endoteliales circulantes, celulas mieloides proangiogenicas circulantes, celulas dendnticas circulantes, etc.).

El termino "muestra" tal como se utiliza en la presente memoria incluye cualquier especimen biologico obtenido de un paciente. Entre las muestras se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, sangre completa, plasma, suero, globulos rojos, globulos blancos (por ejemplo celulas mononucleares de sangre periferica), lfquido de lavado ductal, lfquido aspirado del pezon, linfa (por ejemplo celulas tumorales diseminadas del ganglio linfatico), lfquido aspirado de la medula osea, saliva, orina, deposiciones (es decir, heces), esputo, lfquido de lavado bronquial, lagrimas, lfquido aspirado con aguja fina (por ejemplo recolectado mediante aspiracion aleatoria periareolar con aguja fina), cualquier otro lfquido corporal, una muestra de tejido (por ejemplo tejido tumoral), tal como una biopsia de un tumor (por ejemplo biopsia con aguja) o un ganglio linfatico (por ejemplo biopsia de ganglio linfatico centinela) y extractos celulares de los mismos. En algunas realizaciones la muestra es de sangre completa o un componente fraccion de la misma, tal como plasma, suero o un pellet celular. En realizaciones preferentes la muestra se obtiene mediante aislamiento de celulas circulantes de un tumor solido procedente de sangre completa o de una fraccion celular de la misma utilizando cualquier procedimiento conocido de la tecnica. En otras realizaciones la muestra es una muestra de tejido tumoral fijada en formalina e incluida en parafina (FFPE), por ejemplo de un tumor solido de mama.

Una "biopsia" se refiere al procedimiento de extirpacion de una muestra de tejido para la evaluacion diagnostica o pronostica y al especimen de tejido mismo. Puede aplicarse cualquier tecnica de biopsia conocida de la tecnica a los metodos y composiciones de la presente invencion. La tecnica de la biopsia aplicada generalmente dependera del tipo de tejido que debe evaluarse y del tamano y tipo de tumor (es decir, solido o suspendido (es decir, sangre o ascites)), entre otros factores. Entre las tecnicas de biopsia representativas se incluyen la biopsia de excision, la biopsia por incision, la biopsia con aguja (por ejemplo biopsia por puncion con aguja gruesa, biopsia de aspiracion con aguja fina, etc.), la biopsia quirurgica y la biopsia de medula osea. Se comentan las tecnicas de biopsia en, por ejemplo, Harrison's Principles of Internal Medicine, Kasper et al., editores, 16a edicion, 2005, capftulo 70 y en toda la parte V. El experto en la materia apreciara que pueden llevarse a cabo tecnicas de biopsia para identificar celulas cancerosas y/o precancerosas en una muestra de tejido dada.

El termino "sujeto" o "paciente" o "individuo" tipicamente incluye seres humanos, aunque tambien puede incluir otros animales tales como, por ejemplo, otros primates, roedores, perros, felinos, equinos, ovinos, porcinos y similares.

Una "matriz" o "micromatriz" comprende un conjunto y/o serie de dilucion diferenciado de anticuerpos de captura inmovilizados o fijados sobre un soporte solido tales como, por ejemplo, vidrio (por ejemplo un portaobjetos de vidrio), plastico, chips, agujas, filtros, perlas (por ejemplo perlas magneticas, perlas de poliestireno, etc.), papel, membrana (por ejemplo nilon, nitrocelulosa, cloruro de polivinilideno (PVDF), etc.), haces de fibras o cualquier otro sustrato adecuado. Los anticuerpos de captura generalmente se inmovilizan o fijan sobre el soporte solido mediante interacciones covalentes o no covalentes (por ejemplo enlaces ionicos, interacciones hidrofobicas, enlaces de hidrogeno, fuerzas de Van der Waals, enlaces dipolo-dipolo). En determinados casos, los anticuerpos de captura comprenden etiquetas de captura que interactuan con agentes de captura unidos al soporte solido. Las matrices

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utilizadas en los ensayos de la presente invencion tfpicamente comprenden una pluralidad de diferentes anticuerpos de captura y/o concentraciones de anticuerpos de captura que se acoplan con la superficie de un soporte solido en diferentes sitios conocidos/direccionables.

La expresion "anticuerpo de captura" pretende incluir un anticuerpo inmovilizado que es espedfico de (es decir se une, es ligado por o forma un complejo con) uno o mas analitos de interes en una muestra, tal como un extracto celular de celulas circulantes de un tumor solido. En realizaciones preferentes, el anticuerpo de captura se fija sobre un soporte solido en una matriz. Los anticuerpos de captura adecuados para inmovilizar cualquiera de entre una diversidad de moleculas de transduccion de senales sobre un soporte solido se encuentran disponibles de Upstate (Temecula, CA), Biosource (Camarillo, CA), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruza, CA), Sigma (St. Louis, MO) y BD Biosciences (San Jose, CA).

La expresion "anticuerpo de deteccion" tal como se utiliza en la presente memoria incluye un anticuerpo que comprende un marcaje detectable que es espedfico para (es decir, se une a, es ligado por o forma un complejo con) uno o mas analitos de interes en una muestra. La expresion comprende ademas un anticuerpo que es espedfico para uno o mas analitos de interes, en el que el anticuerpo puede ser ligado por otra especie que comprende un marcaje detectable. Entre los ejemplos de marcajes detectables se incluyen, aunque sin limitacion, marcajes de biotina/estreptavidina, marcajes de acidos nucleicos (por ejemplo oligonucleotidos), marcajes qmmicamente reactivos, marcajes fluorescentes, marcajes enzimaticos, marcajes radioactivos y combinaciones de los mismos. Los anticuerpos de deteccion adecuados para detectar el estado de activacion y/o la cantidad total de cualquiera de entre una diversidad de moleculas de transduccion de senales se encuentran disponibles de Upstate (Temecula, CA), Biosource (Camarillo, CA), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruza, CA), Sigma (St. Louis, MO) y BD Biosciences (San Jose, CA). A tftulo de ejemplo no limitativo, los anticuerpos fosfoespedficos contra diversas formas fosforiladas de moleculas de transduccion de senales tales como RFCE, c-KIT, c-Src, FLK-1, RA, RFCDPB, Akt, MAPK, PTEN, Raf y MEK se encuentran disponibles de Santa Cruz Biotechnology.

La expresion "anticuerpo dependiente del estado de activacion" incluye un anticuerpo de deteccion que es espedfico de (es decir, se une a, es ligado por o forma un complejo con) un estado de activacion particular de uno o mas analitos de interes en una muestra. En realizaciones preferentes, el anticuerpo dependiente del estado de activacion detecta la fosforilacion, ubiquitinacion y/o estado de acomplejamiento de uno o mas analitos, tales como una o mas moleculas de transduccion de senales. En algunas realizaciones, la fosforilacion de miembros de la familia de RFCE de receptores de tirosina quinasa y/o la formacion de complejos heterodimericos entre miembros de la familia de RFCE se detecta utilizando anticuerpos dependientes del estado de activacion. Entre los ejemplos no limitativos de estados de activacion (listados entre parentesis) que resultan adecuados para la deteccion de anticuerpos dependientes del estado de activacion se incluyen: RFCE (RFCEvIII, RFCE fosforilado (p-), RFCE:Shc, RFCE ubiquitinado (u-), p-RFCEvIII); ErbB2 (p95:truncado (Tr)-ErbB2, p-ErbB2, p95:Tr-p-ErbB2, HER-2:Shc, ErbB2:PI3K, ErbB2:RFCE, ErbB2:ErbB3, ErbB2:ErbB4); ErbB3 (p-ErbB3, ErbB3:PI3K, p-ErbB3:PI3K, ErbB3:Shc); ErbB4 (p- ErbB4, ErbB4:Shc); RE (p-RE (S118, S167); IGF-1R (p-IGF-1R, IGF-1R:IRS, IRS:PI3K, p-IRS, IGF-1R:PI3K); INSR (p-INSR); KIT (p-KIT); FLT3 (p-FLT3); HGFRI (p-HGFRI); HGFR2 (p-HGFR2); RET (p-RET); FCDPRa (p-FCDPRa); FCDPRP (p-FCDPRP); FCEVRI (p-FCEVRI, FCEVRI:PLCg, FCEVR1:Src); FCEVR2 (p-FCEVR2, FCEVR2:PLCy, FCEVR2:Src, FCEVR2:heparina sulfato, FCEVR2:VE-cadherina); FCEVR3 (p-FCEVR3); FCFR1 (pFCFRI); FCFR2 (p-FCFR2); FCFR3 (p-FCFR3); FCFR4 (p-FCFR4); Tiel (p-Tiel); Tie2 (p-Tie2); EphA (p-EphA); EphB (p-EphB); NFKB y/o IKB (p-IK (S32), p-NFKB (S536), p-P65:IKBa); Akt (p-Akt (T308, S473)); PTEN (p-PTEN); Bad (p-Bad (S 112, S136), Bad: 14-3-3); mTor (p-mTor (S2448)); p70S6K (p-p70S6K (T229, T389)); Mek (p-Mek (S217, S221)); Erk (p-Erk (T202, Y204)); Rsk-1 (p-Rsk-1 (T357, S363)); Jnk (p-Jnk (T183, Y185)); P38 (p-P38 (T180, Y182)); Stat3 (p- Stat-3 (Y705, S727)); Fak (p-Fak (Y576)); Rb (p-Rb (S249, T252, S780)); Ki67; p53 (p-p53 (S392, S20)); CREB (p- CREB (S133)); c-Jun (p-c-Jun (S63)); cSrc (p-cSrc (Y416)) y paxilina (p-paxilina (Y118)).

La expresion "anticuerpo independiente del estado de activacion" incluye un anticuerpo de deteccion que es espedfico de (es decir, se une a, es ligado por o forma un complejo con) uno o mas analitos de interes en una muestra con independencia de su estado de activacion. Por ejemplo, el anticuerpo independiente del estado de activacion puede detectar formas tanto fosforiladas como no fosforiladas de uno o mas analitos, tales como una o mas moleculas de transduccion de senales.

La expresion "acido nucleico" o "polinucleotido" incluye desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos y polfmeros de los mismos en forma de cadena sencilla o doble cadena, tales como, por ejemplo, ADN y ARN. Entre los acidos nucleicos se incluyen los acidos nucleicos que contienen analogos de nucleotido, o residuos o enlaces esqueleticos modificados, los cuales son sinteticos, naturales y no naturales, y que presentan propiedades de union similares a las del acido nucleico de referencia. Entre los ejemplos de dichos analogos se incluyen, aunque sin limitacion, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de metilo quirales, 2'-O-metilribonucleotidos y acidos peptido-nucleicos (APN). A menos que se encuentre espedficamente limitado, la expresion comprende acidos

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nucleicos que contienen analogos conocidos de nucleotidos naturales que presentan propiedades de union similares a las del acido nucleico de referencia. A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular de acidos nucleicos tambien comprende impKcitamente las variantes modificadas conservadoramente de la misma y secuencias complementarias, as^ como las secuencias indicadas expUcitamente.

El termino "oligonucleotido" se refiere a un oligomero o poUmero de cadena sencilla de ARN, ADN, Idbrido de ARN/ADN y/o un mimetico de los mismos. En determinados casos, los oligonucleotidos estan compuestos de nucleobases, azucares y enlaces internucleosido (esqueleticos) naturales (es decir, no modificados). En otros casos, los oligonucleotidos comprenden nucleosidos, azucares y/o enlaces internucleosido modificados.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "motivo de desapareamiento" o "region de desapareamiento" se refiere a un oligonucleotido que no presenta una complementariedad del 100% respecto a su secuencia complementaria. Un oligonucleotido puede presentar por lo menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas regiones de desapareamiento. Las regiones de desapareamiento pueden ser contiguas o pueden estar separadas por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o mas nucleotidos. Los motivos o regiones de desapareamiento pueden comprender un unico nucleotido o pueden comprender dos, tres, cuatro, cinco o mas nucleotidos.

La expresion "condiciones de hibridacion restrictiva" se refiere a condiciones bajo las que un oligonucleotido se hibridara con su secuencia complementaria, pero no con otras secuencias. Las condiciones restrictivas son dependientes de la secuencia y seran diferentes bajo diferentes circunstancias. Las secuencias mas largas se hibridan espedficamente a temperaturas mas altas. Una grna extensa a la hibridacion de acidos nucleicos es Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays", 1993. Generalmente se selecciona que las condiciones restrictivas sean de entre aproximadamente 5°C y 10°C inferiores al punto de fusion termica (Tm) para la secuencia espedfica a una fuerza ionica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza ionica, pH y concentracion de acidos nucleicos definidas) a la que el 50% de las sondas complementarias a la diana se hibrida con la secuencia diana en el equilibrio (ya que las secuencias diana se encuentran presentes en exceso, a la Tm, el 50% de las sondas se encuentra ocupado en el equilibrio). Tambien pueden conseguirse condiciones restrictivas con la adicion de agentes desestabilizadores, tales como la formamida. Para la hibridacion selectiva o espedfica, una senal positiva es de por lo menos dos veces el nivel de fondo, preferentemente de 10 veces el nivel de hibridacion de fondo.

La expresion "sustancialmente identico" o "identidad sustancial" en el contexto de dos o mas acidos nucleicos se refiere a dos o mas secuencias o subsecuencias que son iguales o que presentan un porcentaje definido de nucleotidos que son iguales (es decir, con una identidad de por lo menos aproximadamente 60%, preferentemente de por lo menos aproximadamente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% en una region definida) en la comparacion y alineacion para la correspondencia maxima en una ventana de comparacion o region designada segun se mide con un algoritmo de comparacion de secuencias o mediante alineacion manual e inspeccion visual. Dicha definicion, en el caso de que lo indique el contexto, se refiere analogamente ademas al complemento de la secuencia. Preferentemente la identidad sustancial existen en una region que presenta una longitud de por lo menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75 o 100 nucleotidos.

El termino "incubar" se utiliza como sinonimo de "poner en contacto" y "exponer", y no implica ningun requisito espedfico de tiempo o temperatura, a menos que se indique lo contrario.

III. Descripcion de las realizaciones

En una realizacion, la presente invencion proporciona metodos para la deteccion de la expresion y estados de activacion de una pluralidad de transductores de senales desregulados en celulas tumorales derivadas de tejido tumoral o celulas circulantes de un tumor solido en un ensayo multiplex de alto rendimiento espedfico. La invencion proporciona ademas metodos y composiciones para la seleccion de terapias apropiadas para regular negativamente o cerrar una o mas de las rutas de senalizacion desreguladas. De esta manera, pueden utilizarse realizaciones de la invencion para facilitar el diseno de terapias personalizadas basadas en la firma molecular particular proporcionada por la coleccion de protemas activadas de transduccion de senales en un tumor de un paciente dado.

Entre las celulas circulantes de un tumor solido se incluyen las celulas que han metastizado o micrometastizado a partir de un tumor solido, incluyendo celulas madre cancerosas o celulas que migran al tumor (por ejemplo debido a quimioatraccion), tales como las celulas progenitoras endoteliales, las celulas endoteliales circulantes, los pericitos, las celulas mieloides proangiogenicas circulantes, las celulas dendnticas, etc. Pueden obtenerse muestras de un paciente que contienen las celulas circulantes a partir de cualquier lfquido biologico accesible (por ejemplo sangre completa, suero, plasma, esputo, lfquido de lavado bronquial, orina, lfquido aspirado del pezon, linfa, saliva, lfquido aspirado con aguja fina, etc.). En determinados casos, la muestra de sangre completa se separa en una fraccion de plasma o suero y una fraccion celular (es decir, el pellet celular). La fraccion celular tfpicamente contiene globulos

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rojos, globulos blancos y/o celulas circulantes de un tumor solido tales como celulas tumorales circulantes (CTC), celulas endoteliales circulantes (CEC), celulas progenitoras endoteliales circulantes (CEPC), celulas madre cancerosas (CSC), celulas tumorales diseminadas del ganglio linfatico y combinaciones de las mismas. La fraccion plasma o suero habitualmente contiene, entre otros, acidos nucleicos (por ejemplo ADN, ARN) y protemas que son liberadas por las celulas circulantes de un tumor solido.

Las celulas circulantes tfpicamente se a^slan a partir de una muestra de un paciente utilizando uno o mas metodos de separacion, incluyendo, por ejemplo, la separacion inmunomagnetica (ver, por ejemplo, Racila et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4589-4594, 1998; Bilkenroth et al., Int. J. Cancer 92:577-582, 2001), el sistema CellTracks® de Immunicon (Huntingdon Valley, PA), la separacion de microfluidos (ver, por ejemplo, Mohamed et al., IEEE Trans. Nanobiosci. 3:251-256, 2004; Lin et al., n° de resumen 5147, 97th AACR Annual Meeting, Washington, D.C., 2006), FACS (ver, por ejemplo, Mancuso et al., Blood 97:3658-3661, 2001), la centrifugacion en gradiente de densidad (ver, por ejemplo, Baker et al., Clin. Cancer-Res. 13:4865-4871, 2003) y los metodos de remocion (ver, por ejemplo, Meye et al., Int. J. Oncol. 21:521-530, 2002).

Con el fin de conservar los estados de activacion in situ, los transductores de senales se extraen ventajosamente poco despues de aislar las celulas, preferentemente dentro de las 96, 72, 48, 24, 6 o 1 hora siguientes, mas preferentemente dentro de los 30, 15 o 5 minutos siguientes. Las celulas aisladas tambien pueden incubarse ventajosamente con factores de crecimiento, habitualmente a concentraciones entre nanomolares y micromolares, durante aproximadamente 1 a 30 minutos con el fin de resucitar o estimular la activacion de los transductores de senales (ver, por ejemplo, Irish et al., Cell 118:217-228, 2004). Entre los factores de crecimiento estimuladores se incluyen el factor de crecimiento epidermico (FCE), la heregulina (HRG), TGF-a, PIGF, la angiopoyetina (Ang), NRG1, PGF, TNF-a, VFCE, PEDgF, IGF, FGF, hGf, citoquinas y similares. Con el fin de evaluar las potencias terapias anticancer para un paciente individual, previamente a la estimulacion con factor de crecimiento, las celulas aisladas pueden incubarse con uno o mas farmacos anticancer de diferentes dosis. La estimulacion con factor de crecimiento puede llevarse a cabo durante unos cuantos minutos u horas (por ejemplo durante 1 a 5 minutos y 1 a 6 horas). La activacion diferencial de las rutas de senalizacion con y sin farmacos anticancer ayuda en la seleccion de una terapia de cancer adecuada a la dosis apropiada para cada paciente individual. Tras el aislamiento, tratamiento con agente anticancer y/o estimulacion con factor de crecimiento, las celulas se lisan para extraer los transductores de senales utilizando cualquier procedimiento conocido de la tecnica. Preferentemente, la lisis celular se inicia entre aproximadamente 1 a 360 minutos despues de la estimulacion con factor de crecimiento, y mas preferentemente en dos intervalos de tiempo diferentes: (1) aproximadamente 1 a 5 minutos despues de la estimulacion con factor de crecimiento, y (2) aproximadamente 30 a 180 minutos despues de la estimulacion con factor de crecimiento. Alternativamente, el lisado puede almacenarse a -80°C hasta su utilizacion.

En algunas realizaciones, el farmaco anticancer comprende un agente que interfiere con la funcion de componentes de la ruta activada de transduccion de senales en las celulas cancerosas. Entre los ejemplos no limitativos de dichos agentes se incluyen los listados a continuacion, en la Tabla 1.

Tabla 1

RFCE (ErbB1) (A)

HER-2 (ErbB2) (C) HER-3 (ErbB3) (E) HER-4 (ErbB4) - diana

Cetuximab Panitumumab Matuzumab Nimotuzumab Vacuna de ErbB1

Trastuzumab (Herceptin®) Pertuzumab (ADN) BMS-599626* Anticuerpo (U3)

*Heterodimerizacion HER-1/2; Fase 1

RFCE (ErbB1) (B)

HER-2 (ErbB2) (D) ErbB1/2 (F) ErbB1/2/4 (G)

Erlotinib Gefitinib EKB 569* CL-387-785**

CP-724714 (Pfizer) Lapatinib (Tykerb®) HKI-272* HKI-357 (preclmico) BIBW 2992** Canertinib* ARRY-334543 JNJ-26483327 JNJ-26483327

*(Wyeth, Irreversible, II CRC) **(Wyeth, Irreversible, Precimico)

*Wyeth, Irreversible, CPCNP I/II, Mamario ** Boehringer Ingelheim, Irreversible, I/II prostatico, ovarico, mamario *Pfizer, Irreversible, CNCNP II, mamario

Raf (H) SRC (H) Mek: (I) NFkB-IkB (I)

Sorafenib PLX4032 (Plexxikon)

AZ PD-325901 (II: CPCNP) AZD6244 -Matriz/Az XL518 Exelisis/ADN

mTor (J)

PI3K (J) RFCEV2 y RFCEV1 (K) RFCEV1/2/3:

Rad 001 : Everolimus* Temsirolimus** AP-23573***

PX-866* Avastina (ADN) HuMV833* FCEV-Trap** AZD 2171 (CPCNP, CRC) AMG-706 (+ RFCDP)

mTor (J)

PI3K (J) RFCEV2 y RFCEV1 (K) RFCEV1/2/3:

*Everolimus (Novartis, combinacion con Gefetinib/Erlotinib; I/II: CPCNP, glioblastoma) **Temsirolimus (Wyeth, combinacion con Gefetinib/Erlotinib; I/II: CPCNP, glioblastoma) ***AP-23573 (Ariad, I/II: endometrial)

*inhibicion espedfica de P110alfa; ProIX Pharma; CPCNP preclmico * (PDL) anti-FCVEa **Regeneron/Aventis (mimetico de receptor) (fase 2)

Diana de RFCVE (L)

EPH A-D

DC101* IMC-IC11** IMC1121B Totalmente humanizado CDP-791*** Pazopanib****

CDP-791 (UCB) CP-547632* AG13736** E-7080 (Eisai) CHIR-258*** OSI-930 (+ cKit, RFCDP) Bay-579352 (+ RFCDP) ABT-869* BMS-540215 (+RFCF1) KRN-951 BBIW

*Imclone (Fase 2/3?) **IgG1 quimerica contra RFCEV2 ***Celltech, anticiuerpo di-Fab pegilado contra R2 **** GSK, mieloma multiple, ovarico, CCR fase 3 inclusion completa, sarcoma II)

*OSI, PFIZER: (+ ErbB1 + RFCDP) (CPCNP, etapa ovarica 2) **Pfizer: RFCEV1,2 y RFCDPbeta) (CCR II) ***(RFCVE1,2 RFCF3,RFCDP) *(+CSF1R, Erk, Flt-3, RFCDP)

RFCVE2/ErbB1/2 (ErbB1)/cMet/RFCF (M)

RFCVE2/3/Raf/RFCDP/cKit/F It-3 (N) TIE 1/2 RFCEV2/1/3, Flt-3, cFMS, RFCDP/cKit (O)

ZD6474*

Sorafenib* PTK787 (No cFMS, FLT-3)

XL647**

Sunitinib

AEE 788***

XL-999 SU-6668

(Pfizer) GSK

AZ(AZD2171) BMS Novartis (AEE788) Amgen Otros

RFCVE2/ErbB1/2 (ErbB1)/cMet/RFCF (M)

RFCVE2/3/Raf/RFCDP/cKit/F It-3 (N) TIE 1/2 RFCEV2/1/3, Flt-3, cFMS, RFCDP/cKit (O)

*(vandetanib) (Fase III: tiroides, CPNCP **(Exelixis; tambien EPHB2): (paciente resistente a erlotinib, pacientes asiaticos) (Fase 2) ***(Novartis, fase1/2)

*(CCR, CHC, CPCNP(III), Melanoma (III))

Diana de RFCDP (P)

Diana de Abl: (Q) FTL 3 RET

Tandutinib Nilotinib

Imatinib Dasatinib Nilotinib AT-9283 AZD-0530 Bosutinib

Diana de kit (R)

RFCH1/2 RFCF1-4 Diana de IGF-1R (S)

AMG-706 XL-880 XL-999

Chiron Merck Pfizer Novartis

Inhibidores de HSP90:

Farmacos antimitoticos: Otras dianas:

IPI-504* 17-AAG**

Docetaxel* Paclitaxel** Vinblastina, Vincristina, Vinorelbina*** Inhibidores de HDAC BCL2 Quimioterapeuticos (fragmentacion) Inhibidores del proteosoma

*(Infinity Pharma,

*(Estabilizador de los

ErbB1 mutante,

microtubulos; adyuvante y

mieloma multiple I/II,

cancer de mama avanzado;

GIST)

CPCNP, cancer de prostata

**(Kosan, tumores

independiente de

solidos I/II)

androgenos) **(Estabilizador de los microtubulos; Adyuvante y cancer mamario avanzado; CPCNP, cancer ovarico, sarcoma de Kaposi asociado al SIDA) ***(Desestabilizadores de los microtubulos)

En otra realizacion, la presente invencion utiliza una matriz direccionable que presenta un rango dinamico superior que comprende una pluralidad de series de dilucion de anticuerpos de captura inmovilizados sobre un soporte solido, en la que los anticuerpos de captura en cada serie de dilucion son espedficos para uno o mas analitos 5 correspondientes a un componente de una ruta de transduccion de senales y otras protemas diana. En diversos aspectos, dicha realizacion incluye matrices que comprenden componentes de rutas de transduccion de senales caractensticas de tumores particulares, por ejemplo rutas de transduccion de senales activas en las celulas de cancer de mama. De esta manera, la invencion puede ponerse en practica ventajosamente, en la que cada molecula de transduccion de senales u otra protema de interes con un potencial defecto de expresion o activacion que causa 10 cancer se encuentra representada en una matriz o chip individual. En algunos aspectos, los componentes de una ruta dada de transduccion de senales activa en una celula tumoral particular se organizan ordenadamente en una secuencia lineal que corresponde a la secuencia en la que se envfa la informacion a traves de una ruta de transduccion de senales dentro de una celula. Se muestran ejemplos de dichas matrices en las figuras 5 a 9. Los anticuerpos de captura espedficos para uno o mas componentes de una ruta dada de transduccion de senales 15 activa en una celula tumoral particular tambien pueden imprimirse de manera aleatoria para minimizar cualquier artefacto presente relacionado con la superficie.

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Entre los ejemplos no limitativos de rutas de transduccion de senales que pueden interrogarse utilizando la presente invencion se incluyen los mostrados en la Tabla 2.

Tabla 2

Rutal

ErbBI ErbBI FosFo ErbBI Shc ErbBI ubiquitina ErbBI- PI3K PTEN

Ruta2

ErbBI ErbBI VIII Fosfo- ErbBI VIII ErbBI VIII Shc ErbBI VIII ubiquitina ErbBI VII I PI3K PTEN

Ruta3

ErbB2 ErbB2 Fosfo HER-2 Shc Complejo ErbB2: PI3K ErbB2 ubiquitina PTEN

Ruta4

ErbB2 ErbB2 truncado en p95 Fosfo- ErbB2 fosfo- ERBB2 truncado en P95 HER-2 Shc Complejo ERBB2:PI 3K ErbB2 ubiquitina P95ErbB2: PI3K

Ruta5

ErbB3 Fosfo- ErbB3 Complejo ErbB3:PI3 K Fosfo- ErbB3 PI3K ErbB3:Shc

Ruta6

ErbB4 Fosfo- ErbB4 ErbB4:Shc

Ruta7

IGF-1R Fosfo-IGF- 1R IGF- 1R:IRS IRS:PI3K Fosfo-IRS IGF-IR :PI3K

Ruta8

INSR Fosfo- INSR

Ruta9

KIT Fosfo-KIT

Ruta10

FLT3 FosfoFLT3

Ruta11

HGFR 1 Fosfo- RFCH 1

Ruta12

HGFR 2 Fosfo- RFCH 2

Ruta13

RET FosfoRET

Ruta14

RFCDPalf a Fosfo- RFCDP- alfa

Ruta15

RFCDPbet a Fosfo- RFCDP- beta

Ruta16

RFCE 1 RFCE 1 Fosfo Complejo RFCE 1: PLCy RFCE 1: Src

Ruta17

RFCE 2 RFCE 2 Fosfo Complejo RFCE 2: PLCy RFCE 2: Src Complejo de RFCE- 2/heparin sulfato RFCE-2, complejo de VE cadherina

Ruta18

RFCE 3 Fosfo- RFCE 3

Ruta19

RFCE 1 Fosfo- RFCF 1

Ruta20

FGFR 2 Fosfo- RFCF 2

Ruta21

FGFR 3 Fosfo- RFCF 3

Ruta22

FGFR 4 Fosfo- RFCF 4

Ruta23

TIE 1 Fosfo-TIE 1

Ruta24

TIE 2 Fosfo-TIE 2

Ruta25

EPHA Fosfo- EPHA

Ruta26

EPHB Fosfo- EPHB

Ruta27

Complejo NFkB-IkB Fosfo-IKB (S32) Total IkB Total NFkB Fosfo NFkB(S53 6) Total P65 IkBa Fosfo P65 IkBa

Ruta28

ER Fosfo-RE ER-AIB1 Otros complejos de RE

Ruta29

PR Fosfo-Pr Complejos de PR

Ruta30

Ruta de erizo

Ruta31

Ruta Wnt

Ruta32

Ruta Notch

Ruta33

Total Mek Fosfo Mek (S217/S2 21) Total Erk Fosfo Erk (T202/Y20 4) Total Rsk- 1 Fosfo Rsk-1 (T357/S36 3) Total Stat3 Fosfo Stat-3 (Y705) (S727) Total Stat I Fosfo Stat1 (Y 701) Fosfo Bad (S112) Bad (total) Total Fak Fosfo Fak (Y576) Total cSrc FosFo cSrc(Y416 ) Total Ras Fosfo-Ras

Ruta34

Akt (Total) Fosfo Akt (T473) Fosfo Akt (T308) Fosfo Bad (S112) Bad (total) Fosfo Bad (S136) Bad:14-3- 3 complejo Total mTor Fosfo mTor (S2448) Total p70S6K Fosfo p70S6K (T229) (T389) GSK3beta Total(Fosf o Ser 9)

Ruta35

Total Jnk Total Total Rb Total p53 Fosfo- Total c- Total

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Fosfo Jnk(T183/ Y 1 85) P38Fosfo P38 (T180/Y18 2) Fosfo Rb (S249/T25 2) Fosfo Rb(S780) Fosfo p53 (S392) Fosfo p53 (S20) CREB(S1 33) Total CREB Jun Fosfo- c-Jun; (S63) Paxilina Fosfo Paxilina (Y118)

Ruta36

Ki67 Caspasa hendida 3,8,9 otros TOPO2

Ruta37

FCTbeta

En determinadas realizaciones, el farmaco anticancer comprende un agente antisenalizacion (es decir, un farmaco citostatico), tal como un anticuerpo monoclonal o un inhibidor de tirosina quinasa, un agente antiproliferacion, un agente quimioterapeutico (es decir, un farmaco citotoxico), un agente terapeutico hormonal, un agente radioterapeutico, una vacuna y/o cualquier otro compuesto con la capacidad de reducir o anular el crecimiento incontrolado de celulas aberrantes tales como celulas cancerosas. En algunas realizaciones, las celulas circulantes aisladas se tratan con uno o mas agentes antisenalizacion, agentes antiproliferativos y/o agentes terapeuticos hormonales en combinacion con por lo menos un agente quimioterapeutico.

Entre los ejemplos de agentes antisenalizacion adecuados para la utilizacion en el presente metodo se incluyen,

aunque sin limitarse a ellos, anticuerpos monoclonales tales como trastuzumab (Herceptin®), alemtuzumab 1 ® ® 1 ® ® ' 1 '

(Campath ), bevacizumab (Avastin ), cetuximab (Erbitux ), gemtuzumab (Mylotarg ), panitumumab (Vectibix™),

ffis ffis ffis

rituximab (Rituxan ) y tositumomab (BEXXAR ); inhibidores de tirosina quinasa tales como gefitinib (Iressa ), sunitinib (Sutent®), erlotinib (Tarceva®), lapatinib (GW-572016; Tykerb®), canertinib (CI 1033), semaxinib (SU5416), vatalanib (PTK787/ZK222584), sorafenib (BAY 43-9006; Nexavar®), mesilato de imatinibe (Gleevec®), leflunomido (SU101) y vandetanib (ZACTiMa™; ZD6474); y combinaciones de los mismos.

Entre los agentes antiproliferativos ejemplares se incluyen inhibidores de mTOR tales como sirolimus (rapamicina), temsirolimus (CCI779) y everolimus (RAD001); inhibidores de Akt tales como 1L6-hidroximetil-quiro-inositol-2-(R)-2- O-metil-3-O-octadecil-sn-glicerocarbonato, acetato de 9-metoxi-2-metil-elipticinio, 1,3-dihidro-1-(1-((4-(6-fenil-1H- imidazo[4,5-g]quinoxalm-7-il)fenil)metil)-4-piperidinil)-2H-benzimidazol-2-ona, 10-(4'-(N-dietilamino)butil)-2-

clorofenoxazina, 3-formilcromona tiosamicarbazona (complejo de Cu(II)Cl2), API-2, un peptido 15-mero derivado de los aminoacidos 10 a 24 del protooncogen TCL1 (Hiromura et al., J. Biol. Chem., 279:53407-53418, 2004, KP372-1, y los compuestos indicados en Kozikowski et al., J. Am. Chem. Soc. 125:1144-1145, 2003, y Kau et al., Cancer Cell, 4:463-476, 2003; y las combinaciones de los mismos.

Entre los ejemplos no limitativos de agentes quimioterapeuticos se incluyen los farmacos basados en platino (por ejemplo oxaliplatino, cisplatino, carboplatino, espiroplatino, iproplatino, satraplatino, etc.), agentes alquilantes (por ejemplo ciclofosfamida, ifosfamida, clorambucilo, busulfan, melfalan, mecloretamina, uramustina, tiotepa, nitrosoureas, etc.), antimetabolitos (por ejemplo 5-fluorouracilo, azatioprina, 6-mercaptopurina, metotrexato, leucovorina, capecitabina, citarabina, floxuridina, fludarabina, gemcitabina (Gemzar®), pemetrexed (ALIMTA®), raltitrexed, etc.), alcaloides vegetales (por ejemplo vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina, podofilotoxina, paclitaxel (Taxol®), docetaxel (Taxotere®), etc.), inhibidores de topoisomerasa (por ejemplo irinotecan, topotecan, amsacrina, etoposido (VP16), fosfato de etoposido, teniposido, etc.), antibioticos antitumorales (por ejemplo doxorrubicina, adriamicina, daunorrubicina, epirubicina, actinomicina, bleomicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, etc.), sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, estereoisomeros de los mismos, derivados de los mismos, analogos de los mismos y combinaciones de los mismos.

Entre los ejemplos de agentes terapeuticos hormonales se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, inhibidores de aromatasa (por ejemplo aminoglutetimida, anastrozol (Arimidex®), letrozol (Femara®), vorozol, exemestano (Aromasin®), 4-androsten-3,6,17-triona (6OXO), 1,4,6-androstatrien-3,17-diona (aTd), formestano (Lentaron®), etc.), moduladores selectivos de receptores de estrogeno (por ejemplo bazedoxifeno, clomifeno, fulvestrant, lasofoxifeno, raloxifeno, tamoxifeno, toremifeno, etc.), esteroides (por ejemplo dexametasona), finasterido y agonistas de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH) tales como goserelina, sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, estereoisomeros de los mismos, derivados de los mismos, analogos de los mismos y combinaciones de los mismos.

Entre los ejemplos no limitativos de vacunas para el cancer utiles en la presente invencion se incluyen ANYARA de Active Biotech, DCVax-LB de Northwest Biotherapeutics, EP-2101 de IDM Pharma, GV1001 de Pharmexa, IO-2055 de Idera Pharmaceuticals, INGN 225 de Introgen Therapeutics y Stimuvax de Biomira/Merck.

Entre los ejemplos de agentes radioterapeuticos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, radionucleidos tales como

47Sc, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 86Y, 87Y, 90Y, 105Rh, 111Ag, 111In, 117mSn, 149Pm, 153Sm 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At y 212Bi,

opcionalmente conjugados con anticuerpos dirigidos contra antfgenos tumorales.

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En algunas realizaciones, cada serie de dilucion de anticuerpos de captura comprende una serie decreciente de concentraciones de anticuerpo de captura. En determinados casos, los anticuerpos de captura se diluyen en serie por lo menos 2 veces (por ejemplo 2, 5, 10, 20, 50, 100, 500 o 1.000 veces) con el fin de producir una serie de dilucion que comprende un numero prefijado (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, l5, 20, 25 o mas) de concentraciones decrecientes de anticuerpo de captura que se aplican como puntos sobre la matriz. Preferentemente se aplicaron como puntos sobre la matriz por lo menos 2, 3, 4, 5 o 6 replicas de cada dilucion de anticuerpo de captura.

En otras realizaciones, el soporte solido comprende vidrio (por ejemplo un portaobjetos de vidrio), plastico, chips, agujas, filtros, perlas, papel, membrana (por ejemplo nilon, nitrocelulosa, fluoruro de polivinilideno (PVDF), etc.), haces de fibras o cualquier otro sustrato adecuado. En una realizacion preferente, los anticuerpos de captura se fijan (por ejemplo mediante interacciones covalentes o no covalentes) sobre portaobjetos de vidrio recubiertos con un polfmero de nitrocelulosa, tal como, por ejemplo, FAST®Slides, las cuales se encuentran disponibles comercialmente de Whatman Inc. (Florham Park, NJ).

En algunas realizaciones, el extracto celular comprende un extracto de celulas circulantes de un tumor solido. Las celulas circulantes rtpicamente se afslan de una muestra de un paciente utilizando uno o mas metodos de separacion conocidos de la tecnica, incluyendo, por ejemplo, la separacion inmunomagnetica, el sistema CellTracks®, la separacion de microfluidos, FACS, la centrifugacion en gradiente de densidad y los metodos de deplecion.

En otras realizaciones, la muestra de un paciente comprende una muestra de lfquido corporal, tal como, por ejemplo, una muestra de sangre completa, suero, plasma, lfquido de lavado ductal, lfquido aspirado del pezon, linfa, aspirado de medula osea, orina, saliva y/o lfquido aspirado con aguja fina. En determinados casos, la muestra de sangre completa se separa en una fraccion de plasma o suero y una fraccion celular (es decir, el pellet celular). La fraccion celular rtpicamente contiene globulos rojos, globulos blancos y/o celulas circulantes de un tumor mamario solido, tales como CTC, CEC, CEPC, celulas tumorales diseminadas de ganglio linfatico y/o CSC. La fraccion plasma o suero habitualmente contiene, entre otros, acidos nucleicos (por ejemplo ADN, ARN) y protemas que son liberadas por las celulas circulantes de un tumor solido.

En algunos casos, las celulas circulantes aisladas pueden estimularse in vitro con uno o mas factores de crecimiento antes, durante y/o despues de la incubacion con uno o mas farmacos anticancer de interes. Anteriormente se han indicado factores de crecimiento estimuladores. En otros casos, las celulas circulantes aisladas pueden lisarse, por ejemplo tras la estimulacion con factor de crecimiento y/o tratamiento con farmaco anticancer, con el fin de producir el extracto celular (por ejemplo un lisado celular) utilizando cualquier procedimiento conocido de la tecnica. Preferentemente, la lisis celular se inicia entre aproximadamente 1 a 360 minutos despues de la estimulacion con factor de crecimiento, y mas preferentemente en dos intervalos de tiempo diferentes: (1) aproximadamente 1 a 5 minutos despues de la estimulacion con factor de crecimiento, y (2) aproximadamente 30 a 180 minutos despues de la estimulacion con factor de crecimiento. Alternativamente, el lisado celular puede almacenarse a -80°C hasta su utilizacion.

En realizaciones preferentes, la expresion y/o los estados de activacion de una pluralidad de moleculas de transduccion de senales en celulas tumorales tales como celulas circulantes del tumor solido, se detectan utilizando un ensayo de deteccion unica o un ensayo de doble deteccion de proximidad tal como se indica posteriormente.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en un aspecto la presente invencion proporciona un metodo para seleccionar un farmaco anticancer adecuado para el tratamiento de un tumor mamario, comprendiendo el metodo:

(a) aislar celulas de un tumor mamario tras la administracion de un farmaco anticancer, o previamente a la incubacion con un farmaco anticancer,

(b) lisar las celulas aisladas para producir un extracto celular,

(c) detectar un estado de activacion de uno o mas analitos en el extracto celular utilizando un ensayo que comprende una pluralidad de series de dilucion de anticuerpos de captura espedficos de uno o mas analitos, en el que los anticuerpos de captura se inmovilizan sobre un soporte solido, y

(d) determinar si el farmaco anticancer resulta adecuado o inadecuado para el tratamiento del tumor mamario mediante comparacion del estado de activacion detectado para uno o mas analitos con un perfil de activacion de referencia generado en ausencia del farmaco anticancer.

En determinados casos, los metodos de la presente invencion pueden comprender ademas enviar o informar de los resultados de la etapa (d) a un medico clmico, por ejemplo a un oncologo o a un medico general. En determinados otros casos, los metodos de la presente invencion pueden comprender ademas registrar o almacenar los resultados de la etapa (d) en una base de datos informatica u otro aparato o dispositivo adecuado para almacenar informacion, por ejemplo en un laboratorio.

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En una realizacion preferente, el metodo para la seleccion de un farmaco de un tumor mamario, comprende:

(a) aislar celulas de un tumor mamario tras la administracion de un incubacion con un farmaco anticancer,

(b) lisar las celulas aisladas para producir un extracto celular,

(c) detectar un estado de activacion de uno o mas analitos en el extracto celular utilizando un ensayo que comprende una pluralidad de series de dilucion de anticuerpos de captura espedficos de uno o mas analitos, en el que los anticuerpos de captura se inmovilizan sobre un soporte solido,

(d) comparar el estado de activacion detectado para el analito o analitos con un perfil de activacion de referencia generado en ausencia del farmaco anticancer, y

(e) indicacion de que el farmaco anticancer resulta adecuado para el tratamiento del tumor mamario en el caso de que el estado de activacion detectado para el analito o analitos se encuentra sustancialmente reducido en comparacion con el perfil de activacion de referencia.

En determinados casos, el metodo puede comprender ademas, a modo de etapa (f), o puede comprender alternativamente, a modo de etapa (e), la etapa de indicar que el farmaco anticancer resulta inadecuado para el tratamiento del tumor mamario en el caso de que el estado de activacion detectado para el analito o analitos no se reduzca sustancialmente en comparacion con el perfil de activacion de referencia.

En determinados otros casos, la realizacion preferente puede comprender ademas enviar o informar de los resultados de la etapa (e) a un medico clmico, por ejemplo a un oncologo o a un medico general. En todavfa otros casos, la realizacion preferente puede comprender ademas registrar o almacenar los resultados de la etapa (e) en una base de datos informatica u otro aparato o dispositivo adecuado para almacenar informacion, por ejemplo en un laboratorio.

En algunas realizaciones, el estado de activacion de un analito, tal como una molecula de transduccion de senales, se considera "sustancialmente reducida" en presencia de un farmaco anticancer en el caso de que se encuentre por lo menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% menos activada que en ausencia del farmaco anticancer. En otras realizaciones, el estado de activacion de un analito, tal como una molecula de transduccion de senales, se considera "sustancialmente reducido" en presencia de un farmaco anticancer (1) en el caso de que se produzca un cambio de activacion alta o fuerte del analito sin el farmaco anticancer a una activacion moderada, debil, baja o muy debil del analito sin el farmaco anticancer, o (2) en el caso de que se produzca un cambio de activacion moderada del analito sin el farmaco anticancer a una activacion debil, baja o muy debil del analito con el farmaco anticancer.

En algunas realizaciones, los metodos de la presente invencion pueden comprender ademas la etapa de obtencion de una muestra de un sujeto que presenta un tumor mamario a partir del que se afslan celulas de un tumor mamario. La muestra puede obtenerse de un sujeto con cancer de mama antes del tratamiento con farmaco anticancer (por ejemplo antes de la incubacion con un farmaco anticancer) o despues de la administracion de un farmaco anticancer (por ejemplo en cualquier momento durante el curso del tratamiento del cancer). Entre las muestras adecuadas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, sangre completa, suero, plasma, lfquido de lavado ductal, lfquido aspirado del pezon, linfa, aspirado de medula osea, orina, saliva, lfquido aspirado con aguja fina (AGF) y combinaciones de los mismos. En una realizacion preferente, la muestra es de sangre completa o de AGF. En la presente realizacion, las celulas circulantes de un tumor mamario pueden aislarse a partir de la muestra de sangre completa o pueden aislarse celulas de cancer mamario a partir de la muestra de AGF. En el caso de que las celulas aisladas se obtengan de un sujeto que no ha recibido tratamiento con un farmaco anticancer, las celulas aisladas pueden incubarse in vitro bajo condiciones adecuadas con un farmaco anticancer o un coctel de farmacos anticancer con diana en uno o mas de los analitos que deben detectarse en la etapa (c).

Las celulas circulantes de un tumor mamario pueden aislarse a partir de una muestra mediante cualquier tecnica conocida de la tecnica, por ejemplo mediante separacion inmunomagnetica, el sistema CellTracks®, separacion de microfluidos, FACS, centrifugacion en gradiente de densidad y metodos de deplecion (ver el Ejemplo 1). Entre los ejemplos de celula circulantes que pueden aislarse a partir de una muestra se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, celulas tumorales circulantes, celulas endoteliales circulantes, celulas progenitoras endoteliales circulantes, celulas madre cancerosas, celulas tumorales diseminadas y combinaciones de las mismas. Pueden lisarse celulas aisladas, tales como celulas circulantes, para transformar de esta manera las celulas aisladas en un extracto celular mediante cualquier tecnica conocida (ver el Ejemplo 1).

En una realizacion, el tumor mamario se deriva de un sujeto con carcinoma ductal o con carcinoma lobular. Entre los ejemplos de carcinoma ductal se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el carcinoma ductal invasivo y el carcinoma ductal in situ. Entre los ejemplos no limitativos de carcinoma lobular se incluyen el carcinoma lobular invasivo o el carcinoma lobular in situ.

anticancer adecuado para el tratamiento farmaco anticancer, o previamente a la

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En algunas realizaciones, las celulas aisladas se estimulan in vitro con factores de crecimiento tal como se indica en la presente memoria. En otras realizaciones, el farmaco anticancer puede comprender uno o mas de los agentes terapeuticos indicados en la presente memoria, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, anticuerpos monoclonales, inhibidores de tirosina quinasa, agentes quimioterapeuticos, agentes terapeuticos hormonales, agentes radioterapeuticos y vacunas.

En realizaciones preferentes, el analito o analitos presentes en el extracto celular comprenden una pluralidad de moleculas de transduccion de senales. Entre los ejemplos de moleculas de transduccion de senales se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, receptores de tirosina quinasas, no receptores de tirosina quinasas, componentes de la cascada de senalizacion de tirosina quinasa, receptores de hormona nuclear, coactivadores de receptores nucleares, represores de receptores nucleares y combinaciones de los mismos. En determinados casos, la pluralidad de moleculas de transduccion de senales se selecciona de entre el grupo que consiste de RFCE (ErbBI), HER-2 (ErbB2), p95ErbB2, HER-3 (ErbB3), HER-4 (ErbB4), Raf, SRC, Mek, NFkB-IkB, mTor, PI3K, VFCE, RFCE-1, RFCE-2, RFCE-3, Eph-a, Ephb, Eph-c, Eph-d, cMet, FGFR, cKit, Flt-3, Tie-1, Tie-2, Flt-3, cFMS, PDGFRA, PDGFRB, Abl, FTL 3, RET, Kit, HGFR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, IGF-1R, ER, PR, NCOR, AIB1 y combinaciones de los mismos. Preferentemente, la pluralidad de moleculas de transduccion de senales se selecciona de entre el grupo que consiste de ErbBI, ErbB2, p95ErbB2, ErbB3, ErbB4, RFCE1, RFCE-2, RFCE-3, ER, PR y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, el estado de activacion detectado para el analito o analitos presentes en el extracto celular puede ser, por ejemplo, un estado de fosforilacion, un estado de ubiquitinacion, un estado de acomplejamiento o combinaciones de los mismos. En otras realizaciones, el soporte solido puede comprender, por ejemplo, vidrio, plastico, chips, agujas, filtros, perlas, papel, membrana, haces de fibras y combinaciones de los mismos. En todavfa otras realizaciones, los anticuerpos de captura se fijan sobre el soporte solido en orden direccionable.

En determinados aspectos, el ensayo en la etapa (c) comprende:

(i) incubar (por ejemplo poner en contacto) el extracto celular con la pluralidad de series de dilucion de anticuerpos de captura para formar una pluralidad de analitos capturados (por ejemplo para transformar los analitos presentes en el extracto celular en complejos de analitos capturados que comprenden los analitos y los anticuerpos de captura),

(ii) incubar (por ejemplo poner en contacto) la pluralidad de analitos capturados con anticuerpos dependientes del estado de activacion espedficos para los analitos correspondientes, con el fin de formar una pluralidad de analitos capturados detectables (por ejemplo para transformar los complejos de analitos capturados en complejos de analitos capturados detectables que comprenden los analitos capturados y anticuerpos dependientes del estado de activacion),

(iii) incubar (por ejemplo poner en contacto) la pluralidad de analitos capturados detectables con un primer y un segundo miembros de una pareja de amplificacion de senales para generar una senal amplificada, y

(iv) detectar la senal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros de la pareja de amplificacion de senal.

En algunos casos, los anticuerpos dependientes del estado de activacion comprenden un primer miembro de una pareja de union (por ejemplo biotina). En otros casos, el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales (por ejemplo una peroxidasa tal como PRP) comprende un segundo miembro de la pareja de union (por ejemplo estreptavidina). En determinados casos, el segundo miembro de la pareja de amplificacion de senales puede ser, por ejemplo, un reactivo tiramida (por ejemplo biotina-tiramida). Preferentemente, la senal amplificada se genera mediante oxidacion con peroxidasa de biotina-tiramida con el fin de producir una tiramida activada (por ejemplo para transformar la biotina-tiramida en una tiramida activada). La tiramida activada puede detectarse directa o indirectamente, por ejemplo tras la adicion de un reactivo de deteccion de senales. Entre los ejemplos no limitativos de reactivos detectores de senales se incluyen los fluoroforos marcados con estreptavidina y las combinaciones de peroxidasas marcadas con estreptavidina y reactivos cromogenicos tales como, por ejemplo, 3,3',5,5'- tetrametilbencidina (TMB).

En determinadas otras realizaciones, el ensayo en la etapa (c) comprende:

(i) incubar (por ejemplo poner en contacto) el extracto celular con la pluralidad de series de dilucion de anticuerpos de captura para formar una pluralidad de analitos capturados (por ejemplo para transformar los analitos presentes en el extracto celular en complejos de analitos capturados que comprenden los analitos y los anticuerpos de captura),

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(ii) incubar (por ejemplo poner en contacto) la pluralidad de analitos capturados con anticuerpos de deteccion que comprenden una pluralidad de anticuerpos independientes del estado de activacion y una pluralidad de anticuerpos dependientes del estado de activacion espedficos para los analitos correspondientes con el fin de formar una pluralidad de analitos capturados detectables (por ejemplo para transformar los complejos de analitos capturados en complejos de analitos capturados detectables que comprenden los analitos capturados y anticuerpos de deteccion), en el que los anticuerpos independientes de estado de activacion se marcan con una fraccion facilitadora, los anticuerpos dependientes del estado de activacion se marcan con un primer miembro de una pareja de amplificacion de senales y la fraccion glucosa oxidasa facilitadora genera un agente oxidante que se canaliza y reacciona con el primer miembro de la pareja de amplificacion de senal,

(iii) incubar (por ejemplo poner en contacto) la pluralidad de analitos capturados detectables con un segundo miembro de la pareja de amplificacion de senal para generar una senal amplificada, y

(iv) detectar la senal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros de la pareja de amplificacion de senal.

Los anticuerpos independientes del estado de activacion pueden marcarse directamente con la fraccion facilitadora o marcarse indirectamente con la fraccion facilitadora, por ejemplo mediante hibridacion entre un oligonucleotido conjugado con los anticuerpos independientes del estado de activacion y un oligonucleotido complementario conjugado con la fraccion facilitadora. De manera similar, los anticuerpos dependientes del estado de activacion pueden marcarse directamente con el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales o marcarse indirectamente con el primer miembro de la pareja de amplificacion de senal, por ejemplo mediante union entre un primer miembro de una pareja de union conjugado con los anticuerpos dependientes del estado de activacion y un segundo miembro de la pareja de union conjugado con el primer miembro de la pareja de amplificacion de senal. En determinados casos, el primer miembro de la pareja de union es biotina y el segundo miembro de la pareja de union es una avidina, tal como estreptavidina o neutravidina.

En algunas realizaciones, la fraccion facilitadora puede ser, por ejemplo, glucosa oxidasa. En determinados casos, la glucosa oxidasa y los anticuerpos independientes del estado de activacion pueden conjugarse con una molecula de dextrano activada por sulfhidrilo, tal como se indica en, por ejemplo, los Ejemplos 16 y 17. La molecula de dextrano activada por sulfhidrilo presenta un peso molecular de aproximadamente 500 kDa (por ejemplo de aproximadamente 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o 750 kDa). En otras realizaciones, el agente oxidante puede ser, por ejemplo, peroxido de hidrogeno (H2O2). En todavfa otras realizaciones, el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales puede ser, por ejemplo, una peroxidasa tal como la peroxidasa de rabano picante (HRP). En realizaciones adicionales, el segundo miembro de la pareja de amplificacion de senales puede ser, por ejemplo, un reactivo tiramida (por ejemplo biotina-tiramida). Preferentemente, la senal amplificada se genera mediante oxidacion con peroxidasa de biotina-tiramida con el fin de producir una tiramida activada (por ejemplo para transformar la biotina-tiramida en una tiramida activada). La tiramida activada puede detectarse directa o indirectamente, por ejemplo tras la adicion de un reactivo de deteccion de senales. Entre los ejemplos no limitativos de reactivos detectores de senales se incluyen los fluoroforos marcados con estreptavidina y las combinaciones de peroxidasas marcadas con estreptavidina y reactivos cromogenicos tales como, por ejemplo, 3,3',5,5'- tetrametilbencidina (TMB).

En determinados casos, la peroxidasa de rabano picante y los anticuerpos dependientes del estado de activacion pueden conjugarse con una molecula de dextrano activada por sulfhidrilo. La molecula de dextrano activada por sulfhidrilo tfpicamente presente un peso molecular de aproximadamente 70 kDa (por ejemplo de aproximadamente 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 kDa).

En algunas realizaciones, los metodos de la presente invencion pueden resultar utiles para ayudar o asistir en la seleccion de un farmaco anticancer adecuado para el tratamiento de un tumor mamario. En algunas realizaciones, los metodos de la presente invencion pueden resultar utiles para mejorar la seleccion de un farmaco anticancer adecuado para el tratamiento de un tumor mamario.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para identificar la respuesta de un tumor mamario al tratamiento con un farmaco anticancer, comprendiendo el metodo:

(a) aislar celulas de un tumor mamario tras la administracion de un farmaco anticancer, o previamente a la incubacion con un farmaco anticancer,

(b) lisar las celulas aisladas para producir un extracto celular,

(c) detectar un estado de activacion de uno o mas analitos en el extracto celular utilizando un ensayo que comprende una pluralidad de series de dilucion de anticuerpos de captura espedficos de uno o mas analitos, en el que los anticuerpos de captura se inmovilizan sobre un soporte solido, y

(d) determinar si el tumor mamario responde o no responde al tratamiento con el farmaco anticancer mediante comparacion del estado de activacion detectado para uno o mas analitos con un perfil de activacion de referencia generado en ausencia del farmaco anticancer.

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En determinados casos, los metodos de la presente invencion pueden comprender ademas enviar o informar de los resultados de la etapa (d) a un medico clmico, por ejemplo a un oncologo o a un medico general. En determinados otros casos, los metodos de la presente invencion pueden comprender ademas registrar o almacenar los resultados de la etapa (d) en una base de datos informatica u otro aparato o dispositivo adecuado para almacenar informacion, por ejemplo en un laboratorio.

En una realizacion preferente, el metodo para identificar la respuesta a un tumor mamario al tratamiento con un farmaco anticancer comprende:

(a) aislar celulas de un tumor mamario tras la administracion de un farmaco anticancer, o previamente a la incubacion con un farmaco anticancer,

(b) lisar las celulas aisladas para producir un extracto celular,

(c) detectar un estado de activacion de uno o mas analitos en el extracto celular utilizando un ensayo que comprende una pluralidad de series de dilucion de anticuerpos de captura espedficos de uno o mas analitos, en el que los anticuerpos de captura se inmovilizan sobre un soporte solido,

(d) comparar el estado de activacion detectado para el analito o analitos con un perfil de activacion de referencia generado en ausencia del farmaco anticancer, y

(e) indicar que el tumor mamario responde al tratamiento con el farmaco anticancer en el caso de que el estado de activacion detectado para el analito o analitos se encuentre sustancialmente reducido en comparacion con el perfil de activacion de referencia.

En determinados casos, la realizacion preferente puede comprender ademas, a modo de etapa (f), o puede comprender alternativamente, a modo de etapa (e), la etapa de indicar que el tumor mamario no es sensible al tratamiento con el farmaco anticancer en el caso de que el estado de activacion detectado para el analito o analitos no se reduzca sustancialmente en comparacion con el perfil de activacion de referencia.

En determinados otros casos, la realizacion preferente puede comprender ademas enviar o informar de los resultados de la etapa (e) a un medico clmico, por ejemplo a un oncologo o a un medico general. En todavfa otros casos, la realizacion preferente puede comprender ademas registrar o almacenar los resultados de la etapa (e) en una base de datos informatica u otro aparato o dispositivo adecuado para almacenar informacion, por ejemplo en un laboratorio.

El estado de activacion de un analito (por ejemplo una molecula de transduccion de senales) puede "reducirse sustancialmente" en presencia de un farmaco anticancer tal como se ha indicado anteriormente. En algunas realizaciones, los metodos descritos en la presente memoria pueden comprender ademas la etapa de obtencion de una muestra de un sujeto que presenta un tumor mamario a partir del que se afslan celulas de cancer de mama. La muestra puede obtenerse de un sujeto con cancer de mama antes del tratamiento con farmaco anticancer (por ejemplo antes de la incubacion con un farmaco anticancer) o despues de la administracion de un farmaco anticancer (por ejemplo en cualquier momento durante el curso del tratamiento del cancer). Entre las muestras adecuadas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, sangre completa, suero, plasma, lfquido de lavado ductal, lfquido aspirado del pezon, linfa, aspirado de medula osea, orina, saliva, lfquido aspirado con aguja fina (AGF) y combinaciones de los mismos. En una realizacion preferente, la muestra es de sangre completa o de AGF. En la presente realizacion, las celulas circulantes de un tumor mamario pueden aislarse a partir de la muestra de sangre completa o pueden aislarse celulas de cancer mamario a partir de la muestra de AGF. En el caso de que las celulas aisladas se obtengan de un sujeto que no ha recibido tratamiento con un farmaco anticancer, las celulas aisladas pueden incubarse in vitro bajo condiciones adecuadas con un farmaco anticancer o un coctel de farmacos anticancer con diana en uno o mas de los analitos que deben detectarse en la etapa (c).

Las celulas circulantes de un tumor mamario pueden aislarse a partir de una muestra mediante cualquier tecnica conocida de la tecnica, por ejemplo mediante separacion inmunomagnetica, el sistema CellTracks®, separacion de microfluidos, FACS, centrifugacion en gradiente de densidad y metodos de eliminacion (ver el Ejemplo 1). Entre los ejemplos de celula circulantes que pueden aislarse a partir de una muestra se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, celulas tumorales circulantes, celulas endoteliales circulantes, celulas progenitoras endoteliales circulantes, celulas madre cancerosas, celulas tumorales diseminadas y combinaciones de las mismas. Pueden lisarse celulas aisladas, tales como celulas circulantes, para transformar de esta manera las celulas aisladas en un extracto celular mediante cualquier tecnica conocida (ver el Ejemplo 1).

En algunas realizaciones, el tumor mamario se deriva de un sujeto con carcinoma ductal o con carcinoma lobular. Entre los ejemplos de carcinoma ductal se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el carcinoma ductal invasivo y el carcinoma ductal in situ. Entre los ejemplos no limitativos de carcinoma lobular se incluyen el carcinoma lobular invasivo o el carcinoma lobular in situ.

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En algunas realizaciones, las celulas aisladas se estimulan in vitro con factores de crecimiento tal como se indica en la presente memoria. En otras realizaciones, el farmaco anticancer puede comprender uno o mas de los agentes terapeuticos indicados en la presente memoria, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, anticuerpos monoclonales, inhibidores de tirosina quinasa, agentes quimioterapeuticos, agentes terapeuticos hormonales, agentes radioterapeuticos y vacunas.

En realizaciones preferentes, el analito o analitos presentes en el extracto celular comprenden una pluralidad de moleculas de transduccion de senales. Entre los ejemplos de moleculas de transduccion de senales se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, receptores de tirosina quinasas, no receptores de tirosina quinasas, componentes de la cascada de senalizacion de tirosina quinasa, receptores de hormona nuclear, coactivadores de receptores nucleares, represores de receptores nucleares y combinaciones de los mismos. En determinados casos, la pluralidad de moleculas de transduccion de senales se selecciona de entre el grupo que consiste de RFCE (ErbBI), HER-2 (ErbB2), p95ErbB2, HER-3 (ErbB3), HER-4 (ErbB4), Raf, SRC, Mek, NFkB-IkB, mTor, PI3K, VFCE, RFCE-1, RFCE-2, RFCE-3, Eph-a, Ephb, Eph-c, Eph-d, cMet, FGFR, cKit, Flt-3, Tie-1, Tie-2, Flt-3, cFMS, PDGFRA, PDGFRB, Abl, FTL 3, RET, Kit, HGFR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, IGF-1R, ER, PR, NCOR, AIB1 y combinaciones de los mismos. Preferentemente, la pluralidad de moleculas de transduccion de senales se selecciona de entre el grupo que consiste de ErbBI, ErbB2, p95ErbB2, ErbB3, ErbB4, RFCE1, RFCE-2, RFCE-3, ER, PR y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, el estado de activacion detectado para el analito o analitos presentes en el extracto celular puede ser, por ejemplo, un estado de fosforilacion, un estado de ubiquitinacion, un estado de acomplejamiento o combinaciones de los mismos. En otras realizaciones, el soporte solido puede comprender, por ejemplo, vidrio, plastico, chips, agujas, filtros, perlas, papel, membrana, haces de fibras y combinaciones de los mismos. En todavfa otras realizaciones, los anticuerpos de captura se fijan sobre el soporte solido en orden direccionable.

En determinadas realizaciones, el ensayo en la etapa (c) comprende:

(i) incubar (por ejemplo poner en contacto) el extracto celular con la pluralidad de series de dilucion de anticuerpos de captura para formar una pluralidad de analitos capturados (por ejemplo para transformar los analitos presentes en el extracto celular en complejos de analitos capturados que comprenden los analitos y los anticuerpos de captura),

(ii) incubar (por ejemplo poner en contacto) la pluralidad de receptores truncados capturados con anticuerpos dependientes del estado de activacion espedficos para los analitos correspondientes, formando una pluralidad e analitos capturados detectables (por ejemplo para transformar los complejos de analitos capturados en complejos de analitos capturados detectables que comprenden los analitos capturados y anticuerpos dependientes del estado de activacion),

(iii) incubar (por ejemplo poner en contacto) la pluralidad de analitos capturados detectables con un primer y un segundo miembros de la pareja de amplificacion de senales con el fin de generar una senal amplificada, y

(iv) detectar la senal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros de la pareja de amplificacion de senal.

En algunos casos, los anticuerpos dependientes del estado de activacion comprenden un primer miembro de una pareja de union (por ejemplo biotina). En otros casos, el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales (por ejemplo una peroxidasa tal como PRP) comprende un segundo miembro de la pareja de union (por ejemplo estreptavidina). En determinados casos, el segundo miembro de la pareja de amplificacion de senales puede ser, por ejemplo, un reactivo tiramida (por ejemplo biotina-tiramida). Preferentemente, la senal amplificada se genera mediante oxidacion con peroxidasa de biotina-tiramida con el fin de producir una tiramida activada (por ejemplo para transformar la biotina-tiramida en una tiramida activada). La tiramida activada puede detectarse directa o indirectamente, por ejemplo tras la adicion de un reactivo de deteccion de senales. Entre los ejemplos no limitativos de reactivos detectores de senales se incluyen los fluoroforos marcados con estreptavidina y las combinaciones de peroxidasas marcadas con estreptavidina y reactivos cromogenicos tales como, por ejemplo, 3,3',5,5'- tetrametilbencidina (TMB).

En determinadas otras realizaciones, el ensayo en la etapa (c) comprende:

(i) incubar (por ejemplo poner en contacto) el extracto celular con la pluralidad de series de dilucion de anticuerpos de captura para formar una pluralidad de analitos capturados (por ejemplo para transformar los analitos presentes en el extracto celular en complejos de analitos capturados que comprenden los analitos y los anticuerpos de captura),

(ii) incubar (por ejemplo poner en contacto) la pluralidad de analitos capturados con anticuerpos de deteccion que comprenden una pluralidad de anticuerpos independientes del estado de activacion y una pluralidad de

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anticuerpos dependientes del estado de activacion espedficos para los analitos correspondientes con el fin de formar una pluralidad de analitos capturados detectables (por ejemplo para transformar los complejos de analitos capturados en complejos de analitos capturados detectables que comprenden los analitos capturados y anticuerpos de deteccion), en el que los anticuerpos independientes de estado de activacion se marcan con una fraccion facilitadora, los anticuerpos dependientes del estado de activacion se marcan con un primer miembro de una pareja de amplificacion de senales y la fraccion glucosa oxidasa facilitadora genera un agente oxidante que se canaliza y reacciona con el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales,

(iii) incubar (por ejemplo poner en contacto) la pluralidad de analitos capturados detectables con un segundo miembro de la pareja de amplificacion de senal para generar una senal amplificada, y

(iv) detectar la senal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros de la pareja de amplificacion de senal.

Los anticuerpos independientes del estado de activacion pueden marcarse directamente con la fraccion facilitadora o marcarse indirectamente con la fraccion facilitadora, por ejemplo mediante hibridacion entre un oligonucleotido conjugado con los anticuerpos independientes del estado de activacion y un oligonucleotido complementario conjugado con la fraccion facilitadora. De manera similar, los anticuerpos dependientes del estado de activacion pueden marcarse directamente con el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales o marcarse indirectamente con el primer miembro de la pareja de amplificacion de senal, por ejemplo mediante union entre un primer miembro de una pareja de union conjugado con los anticuerpos dependientes del estado de activacion y un segundo miembro de la pareja de union conjugado con el primer miembro de la pareja de amplificacion de senal. En determinados casos, el primer miembro de la pareja de union es biotina y el segundo miembro de la pareja de union es una avidina, tal como estreptavidina o neutravidina.

En algunas realizaciones, la fraccion facilitadora puede ser, por ejemplo, glucosa oxidasa. En determinados casos, la glucosa oxidasa y los anticuerpos independientes del estado de activacion pueden conjugarse con una molecula de dextrano activada por sulfhidrilo, tal como se indica en, por ejemplo, los Ejemplos 16 y 17. La molecula de dextrano activada por sulfhidrilo presenta un peso molecular de aproximadamente 500 kDa (por ejemplo aproximadamente 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o 750 kDa). En otras realizaciones, el agente oxidante puede ser, por ejemplo, peroxido de hidrogeno (H2O2). En todavfa otras realizaciones, el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales puede ser, por ejemplo, una peroxidasa tal como la peroxidasa de rabano picante (HRP). En realizaciones adicionales, el segundo miembro de la pareja de amplificacion de senales puede ser, por ejemplo, un reactivo tiramida (por ejemplo biotina-tiramida). Preferentemente, la senal amplificada se genera mediante oxidacion con peroxidasa de biotina-tiramida con el fin de producir una tiramida activada (por ejemplo para transformar la biotina-tiramida en una tiramida activada). La tiramida activada puede detectarse directa o indirectamente, por ejemplo tras la adicion de un reactivo de deteccion de senales. Entre los ejemplos no limitativos de reactivos detectores de senales se incluyen los fluoroforos marcados con estreptavidina y las combinaciones de peroxidasas marcadas con estreptavidina y reactivos cromogenicos tales como, por ejemplo, 3,3',5,5'- tetrametilbencidina (TMB).

En determinados casos, la peroxidasa de rabano picante y los anticuerpos dependientes del estado de activacion pueden conjugarse con una molecula de dextrano activada por sulfhidrilo. La molecula de dextrano activada por sulfhidrilo tipicamente presente un peso molecular de aproximadamente 70 kDa (por ejemplo de aproximadamente 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 kDa).

En algunas realizaciones, los metodos de la presente invencion pueden resultar utiles para ayudar o asistir en la identificacion de una respuesta del tumor mamario al tratamiento con un farmaco anticancer. En otras realizaciones, los metodos de la presente invencion pueden resultar utiles para mejorar la identificacion de una respuesta del tumor mamario al tratamiento con un farmaco anticancer.

En todavfa otro aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para predecir la respuesta de un sujeto que presenta un tumor mamario al tratamiento con un farmaco anticancer, comprendiendo el metodo:

(a) aislar celulas de un tumor mamario tras la administracion de un farmaco anticancer, o previamente a la incubacion con un farmaco anticancer,

(b) lisar las celulas aisladas para producir un extracto celular,

(c) detectar un estado de activacion de uno o mas analitos en el extracto celular utilizando un ensayo que comprende una pluralidad de series de dilucion de anticuerpos de captura espedficos de uno o mas analitos, en el que los anticuerpos de captura se inmovilizan sobre un soporte solido, y

(d) predecir la probabilidad de que el sujeto respondera al tratamiento con el farmaco anticancer mediante comparacion del estado de activacion detectado para uno o mas analitos con un perfil de activacion de referencia generado en ausencia del farmaco anticancer.

En determinados casos, los metodos de la presente invencion pueden comprender ademas enviar o informar de los resultados de la etapa (d) a un medico clmico, por ejemplo a un oncologo o a un medico general. En determinados

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otros casos, los metodos de la presente invencion pueden comprender ademas registrar o almacenar los resultados de la etapa (d) en una base de datos informatica u otro aparato o dispositivo adecuado para almacenar informacion, por ejemplo en un laboratorio.

En una realizacion preferente, el metodo para predecir la respuesta de un sujeto que presenta un tumor mamario al tratamiento con un farmaco anticancer comprende:

(a) aislar celulas de un tumor mamario tras la administracion de un farmaco anticancer, o previamente a la incubacion con un farmaco anticancer,

(b) lisar las celulas aisladas para producir un extracto celular,

(c) detectar un estado de activacion de uno o mas analitos en el extracto celular utilizando un ensayo que comprende una pluralidad

de series de dilucion de anticuerpos de captura espedficos para el analito o analitos, en el que los anticuerpos de captura se fijan sobre un soporte solido,

(d) comparar el estado de activacion detectado para el analito o analitos con un perfil de activacion de referencia generado en ausencia del farmaco anticancer, y

(d) indicacion de que el sujeto probablemente respondera al tratamiento con el farmaco anticancer en el caso de que el estado de activacion detectado para el analito o analitos se encuentre sustancialmente reducido en comparacion con el perfil de activacion de referencia.

En determinados casos, la realizacion preferente puede comprender ademas, a modo de etapa (f), o puede comprender alternativamente, a modo de etapa (e), la etapa de indicar que es probable que el sujeto no responda (por ejemplo es improbable o presenta una probabilidad baja de responder) al tratamiento con el farmaco anticancer en el caso de que el estado de activacion detectado para el analito o analitos no se reduzca sustancialmente en comparacion con el perfil de activacion de referencia.

En determinados otros casos, la realizacion preferente puede comprender ademas enviar o informar de los resultados de la etapa (e) a un medico clmico, por ejemplo a un oncologo o a un medico general. En todavfa otros casos, la realizacion preferente puede comprender ademas registrar o almacenar los resultados de la etapa (e) en una base de datos informatica u otro aparato o dispositivo adecuado para almacenar informacion, por ejemplo en un laboratorio.

El estado de activacion de un analito (por ejemplo una molecula de transduccion de senales) puede "reducirse sustancialmente" en presencia de un farmaco anticancer tal como se ha indicado anteriormente. En algunas realizaciones, los metodos descritos en la presente memoria pueden comprender ademas la etapa de obtencion de una muestra de un sujeto que presenta un tumor mamario a partir del que se afslan celulas de cancer de mama. La muestra puede obtenerse de un sujeto con cancer de mama antes del tratamiento con farmaco anticancer (por ejemplo antes de la incubacion con un farmaco anticancer) o despues de la administracion de un farmaco anticancer (por ejemplo en cualquier momento durante el curso del tratamiento del cancer). Entre las muestras adecuadas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, sangre completa, suero, plasma, lfquido de lavado ductal, lfquido aspirado del pezon, linfa, aspirado de medula osea, orina, saliva, lfquido aspirado con aguja fina (AGF) y combinaciones de los mismos. En una realizacion preferente, la muestra es de sangre completa o de AGF. En la presente realizacion, las celulas circulantes de un tumor mamario pueden aislarse a partir de la muestra de sangre completa o pueden aislarse celulas de cancer mamario a partir de la muestra de AGF. En el caso de que las celulas aisladas se obtengan de un sujeto que no ha recibido tratamiento con un farmaco anticancer, las celulas aisladas pueden incubarse in vitro bajo condiciones adecuadas con un farmaco anticancer o un coctel de farmacos anticancer con diana en uno o mas de los analitos que deben detectarse en la etapa (c).

Las celulas circulantes de un tumor mamario pueden aislarse a partir de una muestra mediante cualquier tecnica conocida de la tecnica, por ejemplo mediante separacion inmunomagnetica, el sistema CellTracks®, separacion de microfluidos, FACS, centrifugacion en gradiente de densidad y metodos de deplecion (ver el Ejemplo 1). Entre los ejemplos de celula circulantes que pueden aislarse a partir de una muestra se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, celulas tumorales circulantes, celulas endoteliales circulantes, celulas progenitoras endoteliales circulantes, celulas madre cancerosas, celulas tumorales diseminadas y combinaciones de las mismas. Pueden lisarse celulas aisladas, tales como celulas circulantes, para transformar de esta manera las celulas aisladas en un extracto celular mediante cualquier tecnica conocida (ver el Ejemplo 1).

En algunas realizaciones, el tumor mamario se deriva de un sujeto con carcinoma ductal o con carcinoma lobular. Entre los ejemplos de carcinoma ductal se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el carcinoma ductal invasivo y el carcinoma ductal in situ. Entre los ejemplos no limitativos de carcinoma lobular se incluyen el carcinoma lobular invasivo o el carcinoma lobular in situ.

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En algunas realizaciones, las celulas aisladas se estimulan in vitro con factores de crecimiento tal como se indica en la presente memoria. En otras realizaciones, el farmaco anticancer puede comprender uno o mas de los agentes terapeuticos indicados en la presente memoria, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, anticuerpos monoclonales, inhibidores de tirosina quinasa, agentes quimioterapeuticos, agentes terapeuticos hormonales, agentes radioterapeuticos y vacunas.

En realizaciones preferentes, el analito o analitos presentes en el extracto celular comprenden una pluralidad de moleculas de transduccion de senales. Entre los ejemplos de moleculas de transduccion de senales se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, receptores de tirosina quinasas, no receptores de tirosina quinasas, componentes de la cascada de senalizacion de tirosina quinasa, receptores de hormona nuclear, coactivadores de receptores nucleares, represores de receptores nucleares y combinaciones de los mismos. En determinados casos, la pluralidad de moleculas de transduccion de senales se selecciona de entre el grupo que consiste de RFCE (ErbBI), HER-2 (ErbB2), p95ErbB2, HER-3 (ErbB3), HER-4 (ErbB4), Raf, SRC, Mek, NFkB-IkB, mTor, PI3K, VFCE, RFCE-1, RFCE-2, RFCE-3, Eph-a, Ephb, Eph-c, Eph-d, cMet, FGFR, cKit, Flt-3, Tie-1, Tie-2, Flt-3, cFMS, PDGFRA, PDGFRB, Abl, FTL 3, RET, Kit, HGFR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, IGF-1R, ER, PR, NCOR, AIB1 y combinaciones de los mismos. Preferentemente, la pluralidad de moleculas de transduccion de senales se selecciona de entre el grupo que consiste de ErbBI, ErbB2, p95ErbB2, ErbB3, ErbB4, RFCE1, RFCE-2, RFCE-3, ER, PR y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, el estado de activacion detectado para el analito o analitos presentes en el extracto celular puede ser, por ejemplo, un estado de fosforilacion, un estado de ubiquitinacion, un estado de acomplejamiento o combinaciones de los mismos. En otras realizacones, el soporte solido puede comprender, por ejemplo, vidrio, plastico, chips, agujas, filtros, perlas, papel, membrana, haces de fibras y combinaciones de los mismos. En todavfa otras realizaciones, los anticuerpos de captura se fijan sobre el soporte solido en orden direccionable.

En determinadas realizaciones, el ensayo en la etapa (c) comprende:

(i) incubar (por ejemplo poner en contacto) el extracto celular con la pluralidad de series de dilucion de anticuerpos de captura para formar una pluralidad de analitos capturados (por ejemplo para transformar los analitos presentes en el extracto celular en complejos de analitos capturados que comprenden los analitos y los anticuerpos de captura),

(ii) incubar (por ejemplo poner en contacto) la pluralidad de analitos capaturados con anticuerpos dependientes del estado de activacion espedficos para los analitos correspondientes, con el fin de formar una pluralidad de analitos capturados detectables (por ejemplo para transformar los complejos de analitos capturados en complejos de analitos capturados detectables que comprenden los analitos capturados y anticuerpos dependientes del estado de activacion),

(iii) incubar (por ejemplo poner en contacto) la pluralidad de analitos capturados detectables con un primer y un segundo miembros de una pareja de amplificacion de senales para generar una senal amplificada, y

(iv) detectar la senal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros de la pareja de amplificacion de senal.

En algunos casos, los anticuerpos dependientes del estado de activacion comprenden un primer miembro de una pareja de union (por ejemplo biotina). En otros casos, el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales (por ejemplo una peroxidasa tal como PRP) comprende un segundo miembro de la pareja de union (por ejemplo estreptavidina). En determinados casos, el segundo miembro de la pareja de amplificacion de senales puede ser, por ejemplo, un reactivo tiramida (por ejemplo biotina-tiramida). Preferentemente, la senal amplificada se genera mediante oxidacion con peroxidasa de biotina-tiramida con el fin de producir una tiramida activada (por ejemplo para transformar la biotina-tiramida en una tiramida activada). La tiramida activada puede detectarse directa o indirectamente, por ejemplo tras la adicion de un reactivo de deteccion de senales. Entre los ejemplos no limitativos de reactivos detectores de senales se incluyen los fluoroforos marcados con estreptavidina y las combinaciones de peroxidasas marcadas con estreptavidina y reactivos cromogenicos tales como, por ejemplo, 3,3',5,5'- tetrametilbencidina (TMB).

En determinadas otras realizaciones, el ensayo en la etapa (c) comprende:

(i) incubar (por ejemplo poner en contacto) el extracto celular con la pluralidad de series de dilucion de anticuerpos de captura para formar una pluralidad de analitos capturados (por ejemplo para transformar los analitos presentes en el extracto celular en complejos de analitos capturados que comprenden los analitos y los anticuerpos de captura),

(ii) incubar (por ejemplo poner en contacto) la pluralidad de analitos capturados con anticuerpos de deteccion que comprenden una pluralidad de

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anticuerpos independientes del estado de activacion y una pluralidad de anticuerpos dependientes del estado de activacion espedficos para los analitos correspondientes, formando una pluralidad de analitos capturados detectables (por ejemplo para transformer los complejos de analitos capturados en complejos de analitos capturados detectables que comprenden los analitos capturados y anticuerpos de deteccion), en el que los anticuerpos independientes de estado de activacion se marcan con una fraccion facilitadora, los anticuerpos dependientes del estado de activacion se marcan con un primer miembro de una pareja de amplificacion de senales y la fraccion facilitadora genera un agente oxidante que se canaliza y reacciona con el primer miembro de la pareja de amplificacion de senal,

(iii) incubar (por ejemplo poner en contacto) la pluralidad de analitos capturados detectables con un segundo miembro de la pareja de amplificacion de senal para generar una senal amplificada, y

(iv) detectar la senal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros de la pareja de amplificacion de senal.

Los anticuerpos independientes del estado de activacion pueden marcarse directamente con la fraccion facilitadora o marcarse indirectamente con la fraccion facilitadora, por ejemplo mediante hibridacion entre un oligonucleotido conjugado con los anticuerpos independientes del estado de activacion y un oligonucleotido complementario conjugado con la fraccion facilitadora. De manera similar, los anticuerpos dependientes del estado de activacion pueden marcarse directamente con el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales o marcarse indirectamente con el primer miembro de la pareja de amplificacion de senal, por ejemplo mediante union entre un primer miembro de una pareja de union conjugado con los anticuerpos dependientes del estado de activacion y un segundo miembro de la pareja de union conjugado con el primer miembro de la pareja de amplificacion de senal. En determinados casos, el primer miembro de la pareja de union es biotina y el segundo miembro de la pareja de union es una avidina, tal como estreptavidina o neutravidina.

En algunas realizaciones, la fraccion facilitadora puede ser, por ejemplo, glucosa oxidasa. En determinados casos, la glucosa oxidasa y los anticuerpos independientes del estado de activacion pueden conjugarse con una molecula de dextrano activada por sulfhidrilo, tal como se indica en, por ejemplo, los Ejemplos 16 y 17. La molecula de dextrano activada por sulfhidrilo presenta un peso molecular de aproximadamente 500 kDa (por ejemplo aproximadamente 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o 750 kDa). En otras realizaciones, el agente oxidante puede ser, por ejemplo, peroxido de hidrogeno (H2O2). En todavfa otras realizaciones, el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales puede ser, por ejemplo, una peroxidasa tal como la peroxidasa de rabano picante (HRP). En realizaciones adicionales, el segundo miembro de la pareja de amplificacion de senales puede ser, por ejemplo, un reactivo tiramida (por ejemplo biotina-tiramida). Preferentemente, la senal amplificada se genera mediante oxidacion con peroxidasa de biotina-tiramida con el fin de producir una tiramida activada (por ejemplo para transformar la biotina-tiramida en una tiramida activada). La tiramida activada puede detectarse directa o indirectamente, por ejemplo tras la adicion de un reactivo de deteccion de senales. Entre los ejemplos no limitativos de reactivos detectores de senales se incluyen los fluoroforos marcados con estreptavidina y las combinaciones de peroxidasas marcadas con estreptavidina y reactivos cromogenicos tales como, por ejemplo, 3,3',5,5'- tetrametilbencidina (TMB).

En determinados casos, la peroxidasa de rabano picante y los anticuerpos dependientes del estado de activacion pueden conjugarse con una molecula de dextrano activada por sulfhidrilo. La molecula de dextrano activada por sulfhidrilo tipicamente presente un peso molecular de aproximadamente 70 kDa (por ejemplo de aproximadamente 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 kDa).

En algunas realizaciones, los metodos de la presente invencion pueden resultar utiles para ayudar o asistir en la prediccion de la probabilidad de que un sujeto responda al tratamiento con un farmaco anticancer. En otras realizaciones, los metodos de la presente invencion pueden resultar utiles para mejorar la prediccion de la probabilidad de que un sujeto responda al tratamiento con un farmaco anticancer.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona una matriz que presenta un rango dinamico superior que comprende una pluralidad de series de dilucion de anticuerpos de captura inmovilizados sobre un soporte solido, en el que los anticuerpos de captura en cada serie de dilucion son espedficos para uno o mas analitos correspondientes a un componente de una ruta de transduccion de senales u otra protema (por ejemplo un receptor de hormona nuclear) en un extracto celular.

En determinadas realizaciones, la ruta de transduccion de senales puede estar implicada en la proliferacion celular. En dichas realizaciones, los anticuerpos de captura pueden comprender, por ejemplo, uno o mas miembros seleccionados de entre el grupo que consiste de anticuerpos reactivos con IGFIR, cMET, ErbBI, ErbB2, p95ErbB2, ErbB3, ErbB4, Shc, PI3K, Erk, Rsk, Akt, p70S6K, RE, RP, NCOR y AIB1 En determinadas realizaciones, la ruta de transduccion de senales puede estar implicada en la angiogenesis tumoral. En dichas realizaciones, los anticuerpos de captura pueden comprender, por ejemplo, uno o mas miembros seleccionados de entre el grupo que consiste de anticuerpos reactivos con Shc, PI3K, Erk, Rsk, Akt, p70S6K, RFCEV-1, RFCEV-2, Tie 2, complejo de cadherina V-

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R2, RFCDPA y RFCDPB. De esta manera, las matrices direccionables descritas en la presente memoria resultan particularmente utiles para determinar la expresion y/o estado de activacion de moleculas de transduccion de senales y otras protemas implicadas en el cancer de mama.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo para detectar la presencia (o la ausencia) de un receptor truncado, comprendiendo el metodo:

(a) incubar (por ejemplo poner en contacto) un extracto celular con una pluralidad de perlas espedficas para una region de union a dominio extracelular (DEC) de un receptor de longitud completa,

(b) separar la pluralidad de perlas del extracto celular, separando de esta manera el receptor de longitud completa para formar un extracto celular sin el receptor de longitud completa (por ejemplo para transformar el extracto celular en un extracto celular sin un receptor de longitud completa espedfico o familia de receptores de longitud completa),

(c) incubar (por ejemplo poner en contacto) el extracto celular sin el receptor de longitud completa con una pluralidad de anticuerpos de captura, en el que la pluralidad de anticuerpos de captura es espedfica de una region de union a dominio intracelular (DIC) de un receptor truncado y en el que la pluralidad de anticuerpos de captura se inmoviliza sobre un soporte solido para formar una pluralidad de receptores truncados capturados (por ejemplo para transformar el receptor truncado presente en un extracto celular con reduccion de la cantidad receptores de longitud completa en complejos de receptores truncados y anticuerpos de captura),

(d) incubar (por ejemplo poner en contacto) la pluralidad de receptores truncados capturados con anticuerpos de deteccion espedficos para los receptores truncados correspondientes para formar una pluralidad de receptores truncados capturados detectables (por ejemplo para transformar los complejos de receptores truncados capturados en complejos de recetproes truncados capturados detectables que comprenden los receptores truncados capturados y anticuerpos dependientes del estado de activacion),

(e) incubar (por ejemplo poner en contacto) la pluralidad de receptores truncados capturados detectables con un primer y segundo miembros de una pareja de amplificacion de senales para generar una senal amplificada, y

(f) detectar la senal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros de la pareja de amplificacion de senales.

El receptor truncado tfpicamente es un fragmento del receptor de longitud completa y comparte una region de union a dominio intracelular (DIC) con el receptor de longitud completa. En determinadas realizaciones, el receptor de longitud completa puede comprender una region de union a dominio extracelular (DEC), un dominio transmembranal y una region de union a dominio intracelular (DIC). Sin restringirse a ninguna teona en particular, el receptor truncado puede aparecer mediante el procesamiento proteolftico del DEC del receptor de longitud completa o mediante inicio alternativo de la traduccion a partir de residuos de metionina que se encuentran localizados antes, dentro o despues del dominio transmembranal, por ejemplo para crear un receptor truncado con un DEC acortado o un receptor truncado que comprende un fragmento DIC asociado a membrana o citosolico.

En determinadas realizaciones preferentes, el receptor truncado es p95ErbB2 y el receptor de longitud completa correspondiente es ErbB2 (HER-2). Sin embargo, el experto en la materia apreciara que los metodos descritos en la presente memoria para detectar protemas truncadas pueden aplicarse a varias protemas diferentes, entre ellas, aunque sin limitacion, el mutante V111 del RFCE (que participa en el glioblastoma, el cancer colorrectal, etc.), otros receptores tirosina quinasa truncados, caspasas y similares. El Ejemplo 12 proporciona una realizacion ejemplar de los metodos de ensayo de la presente invencion para detectar receptores truncados tales como p95ErbB2 en celulas circulantes raras utilizando un ELISA de micromatrices de deteccion individual de alto rendimiento multiplexado con un rango dinamico superior.

En algunas realizaciones, la pluralidad de perlas espedficas para una region de union a DEC puede comprender una pareja de estreptavidina-biotina, en la que la estreptavidina se encuentra unida a la perla y la biotina se encuentra unida al anticuerpo. En determinados casos, el anticuerpo es espedfico para la region de union a DEC del receptor de longitud completa. En otras realizaciones, el extracto celular puede producirse lisando celulas circulantes de un tumor solido, tal como, por ejemplo, un tumor mamario. Las celulas circulantes pueden aislarse a partir de una muestra mediante cualquier tecnica descrita en la presente memoria, por ejemplo mediante separacion inmunomagnetica. Entre las muestras adecuadas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, sangre completa, suero, plasma, lfquido de lavado ductal, lfquido aspirado del pezon, linfa, aspirado de medula osea, orina, saliva, lfquido aspirado con aguja fina y combinaciones de los mismos. En una realizacion preferente, la muestra es de sangre completa. Alternativamente, el extracto celular puede producirse lisando celulas circulantes de un tumor solido, tal como, por ejemplo, tejido de tumor mamario. El tejido tumoral puede ser, por ejemplo, tejido tumoral primario o tejido tumoral metastasico. En una realizacion preferente, las celulas se afslan a partir de tejido tumoral en forma de una muestra de lfquido aspirado con aguja fina (AGF).

En algunas realizaciones, las celulas aisladas se estimulan in vitro con factores de crecimiento tal como se indica en la presente memoria. En otras realizaciones, las celulas aisladas pueden incubarse con un farmaco anticancer antes de la estimulacion con factores de crecimiento. Entre los farmacos anticancer adecuados se incluyen uno o mas de

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los agentes terapeuticos indicados en la presente memoria, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, anticuerpos monoclonales, inhibidores de tirosina quinasa, agentes quimioterapeuticos, agentes terapeuticos hormonales, agentes radioterapeuticos y vacunas.

En determinadas realizaciones, se interroga un estado de activacion de la pluralidad de receptores truncados capturados detectables. El estado de activacion que debe interrogarse puede ser, por ejemplo, un estado de fosforilacion, un estado de ubiquitinacion, un estado de acomplejamiento o combinaciones de los mismos. En determinadas otras realizaciones, el soporte solido en el que puede inmovilizarse la pluralidad de anticuerpos capturados puede comprender, por ejemplo, vidrio, plastico, chips, agujas, filtros, perlas, papel, membrana, haces de fibras y combinaciones de los mismos. En realizaciones adicionales, la pluralidad de anticuerpos de captura se fijan sobre el soporte solido en un orden direccionable.

En algunos casos, los anticuerpos de deteccion comprenden un primer miembro de una pareja de union (por ejemplo biotina). En otros casos, el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales (por ejemplo una peroxidasa tal como PRP) comprende un segundo miembro de la pareja de union (por ejemplo estreptavidina). En determinados casos, el segundo miembro de la pareja de amplificacion de senales puede ser, por ejemplo, un reactivo tiramida (por ejemplo biotina-tiramida). Preferentemente, la senal amplificada se genera mediante oxidacion con peroxidasa de biotina-tiramida con el fin de producir una tiramida activada (por ejemplo para transformar la biotina-tiramida en una tiramida activada). La tiramida activada puede detectarse directa o indirectamente, por ejemplo tras la adicion de un reactivo de deteccion de senales. Entre los ejemplos no limitativos de reactivos detectores de senales se incluyen los fluoroforos marcados con estreptavidina y las combinaciones de peroxidasas marcadas con estreptavidina y reactivos cromogenicos tales como, por ejemplo, 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB).

En un aspecto relacionado, la presente invencion proporciona un metodo para detectar la presencia (o la ausencia) de un receptor truncado, comprendiendo el metodo:

(a) incubar (por ejemplo poner en contacto) un extracto celular con una pluralidad de perlas espedficas para una region de union a dominio extracelular (DEC) de un receptor de longitud completa,

(b) separar la pluralidad de perlas del extracto celular, separando de esta manera el receptor de longitud completa para formar un extracto celular sin el receptor de longitud completa (por ejemplo para transformar el extracto celular en un extracto celular sin un receptor de longitud completa espedfico o familia de receptores de longitud completa),

(c) incubar (por ejemplo poner en contacto) el extracto celular sin el receptor de longitud completa con una pluralidad de anticuerpos de captura, en el que la pluralidad de anticuerpos de captura es espedfica de una region de union a dominio intracelular (DIC) de un receptor truncado y en el que la pluralidad de anticuerpos de captura se inmoviliza sobre un soporte solido para formar una pluralidad de receptores truncados capturados (por ejemplo para transformar el receptor truncado presente en un extracto celular con reduccion de la cantidad de receptores de longitud completa en complejos de receptores truncados y anticuerpos de captura),

(d) incubar (por ejemplo poner en contacto) la pluralidad de receptores truncados capturados con anticuerpos de deteccion que comprenden una pluralidad de anticuerpos independientes del estado de activacion y una pluralidad de anticuerpos dependientes del estado de activacion espedficos para los receptores truncados correspondientes con el fin de formar una pluralidad de receptores truncados capturados detectables (por ejemplo para transformar los complejos de receptores truncados capturados en complejos de receptores capturados detectables que comprenden los receptores truncados capturados y anticuerpos de deteccion), en el que los anticuerpos independientes de estado de activacion se marcan con una fraccion facilitadora, los anticuerpos dependientes del estado de activacion se marcan con un primer miembro de una pareja de amplificacion de senales y la fraccion facilitadora genera un agente oxidante que se canaliza y reacciona con el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales,

(e) incubar (por ejemplo poner en contacto) la pluralidad de receptores truncados capturados detectables con un segundo miembro de la pareja de amplificacion de senales para generar una senal amplificada, y

(f) detectar la senal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros de la pareja de amplificacion de senales.

El receptor truncado tfpicamente es un fragmento del receptor de longitud completa y comparte una region de union a dominio intracelular (DIC) con el receptor de longitud completa. En determinadas realizaciones, el receptor de longitud completa puede comprender una region de union a dominio extracelular (DEC), un dominio transmembranal y una region de union a dominio intracelular (DIC). Sin restringirse a ninguna teona en particular, el receptor truncado puede aparecer mediante el procesamiento proteolftico del DEC del receptor de longitud completa o mediante inicio alternativo de la traduccion a partir de residuos de metionina que se encuentran localizados antes, dentro o despues del dominio transmembranal, por ejemplo para crear un receptor truncado con un DEC acortado o un receptor truncado que comprende un fragmento DIC asociado a membrana o citosolico.

En determinadas realizaciones preferentes, el receptor truncado es p95ErbB2 y el receptor de longitud completa correspondiente es ErbB2 (HER-2). Sin embargo, el experto en la materia apreciara que los metodos descritos en la

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presente memoria para detectar protemas truncadas pueden aplicarse a varias protemas diferentes, entre ellas, aunque sin limitacion, el mutante V111 del RFCE (que participa en el glioblastoma, el cancer colorrectal, etc.), otros receptores tirosina quinasa truncados, caspasas y similares. El Ejemplo 12 proporciona una realizacion ejemplar de los metodos de ensayo de la presente invencion para detectar receptores truncados tales como p95ErbB2 en celulas circulantes raras utilizando un ELISA de micromatrices de deteccion individual de alto rendimiento multiplexado con un rango dinamico superior.

En algunas realizaciones, la pluralidad de perlas espedficas para una region de union a DEC puede comprender una pareja de estreptavidina-biotina, en la que la estreptavidina se encuentra unida a la perla y la biotina se encuentra unida al anticuerpo. En determinados casos, el anticuerpo es espedfico para la region de union a DEC del receptor de longitud completa. En otras realizaciones, el extracto celular puede producirse lisando celulas circulantes de un tumor solido, tal como, por ejemplo, un tumor mamario. Las celulas circulantes pueden aislarse a partir de una muestra mediante cualquier tecnica descrita en la presente memoria, por ejemplo mediante separacion inmunomagnetica. Entre las muestras adecuadas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, sangre completa, suero, plasma, lfquido de lavado ductal, lfquido aspirado del pezon, linfa, aspirado de medula osea, orina, saliva, lfquido aspirado con aguja fina y combinaciones de los mismos. En una realizacion preferente, la muestra es de sangre completa. Alternativamente, el extracto celular puede producirse lisando celulas circulantes de un tumor solido, tal como, por ejemplo, tejido de tumor mamario. El tejido tumoral puede ser, por ejemplo, tejido tumoral primario o tejido tumoral metastasico. En una realizacion preferente, las celulas se afslan a partir de tejido tumoral en forma de una muestra de lfquido aspirado con aguja fina (AGF).

En algunas realizaciones, las celulas aisladas se estimulan in vitro con factores de crecimiento tal como se indica en la presente memoria. En otras realizaciones, las celulas aisladas pueden incubarse con un farmaco anticancer antes de la estimulacion con factores de crecimiento. Entre los farmacos anticancer adecuados se incluyen uno o mas de los agentes terapeuticos indicados en la presente memoria, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, anticuerpos monoclonales, inhibidores de tirosina quinasa, agentes quimioterapeuticos, agentes terapeuticos hormonales, agentes radioterapeuticos y vacunas.

En determinadas realizaciones, se interroga un estado de activacion de la pluralidad de receptores truncados capturados detectables. El estado de activacion que debe interrogarse puede ser, por ejemplo, un estado de fosforilacion, un estado de ubiquitinacion, un estado de acomplejamiento o combinaciones de los mismos. En determinadas otras realizaciones, el soporte solido en el que puede inmovilizarse la pluralidad de anticuerpos capturados puede comprender, por ejemplo, vidrio, plastico, chips, agujas, filtros, perlas, papel, membrana, haces de fibras y combinaciones de los mismos. En realizaciones adicionales, la pluralidad de anticuerpos de captura se fijan sobre el soporte solido en un orden direccionable.

Los anticuerpos independientes del estado de activacion pueden marcarse directamente con la fraccion facilitadora o marcarse indirectamente con la fraccion facilitadora, por ejemplo mediante hibridacion entre un oligonucleotido conjugado con los anticuerpos independientes del estado de activacion y un oligonucleotido complementario conjugado con la fraccion facilitadora. De manera similar, los anticuerpos dependientes del estado de activacion pueden marcarse directamente con el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales o marcarse indirectamente con el primer miembro de la pareja de amplificacion de senal, por ejemplo mediante union entre un primer miembro de una pareja de union conjugado con los anticuerpos dependientes del estado de activacion y un segundo miembro de la pareja de union conjugado con el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales. En determinados casos, el primer miembro de la pareja de union es biotina y el segundo miembro de la pareja de union es una avidina, tal como estreptavidina o neutravidina.

En algunas realizaciones, la fraccion facilitadora puede ser, por ejemplo, glucosa oxidasa. En determinados casos, la glucosa oxidasa y los anticuerpos independientes del estado de activacion pueden conjugarse con una molecula de dextrano activada por sulfhidrilo, tal como se indica en, por ejemplo, los Ejemplos 16 y 17. La molecula de dextrano activada por sulfhidrilo presenta un peso molecular de aproximadamente 500 kDa (por ejemplo de aproximadamente 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o 750 kDa). En otras realizaciones, el agente oxidante puede ser, por ejemplo, peroxido de hidrogeno (H2O2). En todavfa otras realizaciones, el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales puede ser, por ejemplo, una peroxidasa tal como la peroxidasa de rabano picante (HRP). En realizaciones adicionales, el segundo miembro de la pareja de amplificacion de senales puede ser, por ejemplo, un reactivo tiramida (por ejemplo biotina-tiramida). Preferentemente, la senal amplificada se genera mediante oxidacion con peroxidasa de biotina-tiramida con el fin de producir una tiramida activada (por ejemplo para transformar la biotina-tiramida en una tiramida activada). La tiramida activada puede detectarse directa o indirectamente, por ejemplo tras la adicion de un reactivo de deteccion de senales. Entre los ejemplos no limitativos de reactivos detectores de senales se incluyen los fluoroforos marcados con estreptavidina y las combinaciones de peroxidasas marcadas con estreptavidina y reactivos cromogenicos tales como, por ejemplo, 3,3',5,5'- tetrametilbencidina (TMB).

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En determinados casos, la peroxidasa de rabano picante y los anticuerpos dependientes del estado de activacion pueden conjugarse con una molecula de dextrano activada por sulfhidrilo. La molecula de dextrano activada por sulfhidrilo tipicamente presente un peso molecular de aproximadamente 70 kDa (por ejemplo de aproximadamente 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 kDa).

En algunas realizaciones, los metodos de ensayo de la presente invencion para detectar la presencia (o la ausencia o el nivel) de un receptor truncado tal como p95ErbB2, que pueden resultar utiles para ayudar o asistir en el diagnostico y pronostico del cancer, o en el diseno de tratamientos para el cancer, por ejemplo ayudando o asistiendo en: (i) la seleccion de un farmaco anticancer adecuado para el tratamiento de un tumor mamario, (ii) la identificacion de la respuesta de un tumor mamario al tratamiento con un farmaco anticancer, o (iii) la prediccion de la probabilidad de un sujeto de responder al tratamiento con un farmaco anticancer.

En otras realizaciones, los metodos de ensayo de la presente invencion para detectar la presencia (o la ausencia o el nivel) de un receptor truncado tal como p95ErbB2 pueden resultar utiles para mejorar el diagnostico y pronostico del cancer, o el diseno de tratamientos para el cancer, por ejemplo mediante la mejora de: (i) la seleccion de un farmaco anticancer adecuado para el tratamiento de un tumor mamario, (ii) la identificacion de la respuesta de un tumor mamario al tratamiento con un farmaco anticancer, o (iii) la prediccion de la probabilidad de un sujeto de responder al tratamiento con un farmaco anticancer.

IV. Cancer de mama

El cancer de mama es la quinta causa mas comun de muerte por cancer en todo el mundo, despues del cancer de pulmon, cancer de estomago, cancer de hugado y cancer de colon. En 2005, el cancer de mama causo 502.000 muertes en todo el mundo. Entre mujeres a escala global, el cancer de mama es la causa mas comun de muerte por cancer.

En los Estados Unidos, el cancer de mama es la tercera causa mas comun de muerte por cancer, despues del cancer de pulmon y el cancer de colon. En 2007, el cancer de mama causo mas de 40.000 muertes en los Estados Unidos. Entre mujeres en los Estados Unidos, el cancer de mama es el cancer mas comun y la segunda causa mas comun de muerte por cancer. De hecho, las mujeres en los Estados Unidos presentan una probabilidad entre 8 de desarrollar a lo largo de su vida cancer de mama invasivo y una probabilidad entre 33 de que el cancer de mama sea mortal.

El numero de casos de cancer de mama en todo el mundo se ha incrementado significativamente en los anos 70, un fenomeno atribuido en parte a los estilos de vida modernos en el mundo occidental. Debido a que la mama esta compuesta de tejidos identicos en hombres y mujeres, el cancer de mama tambien aparece en hombres, aunque es menos comun.

Clasificacion

Los canceres de mama pueden describirse utilizando cuatro esquemas de clasificacion diferentes, cada uno basado en los criterios siguientes:

1. Patologfa. El patologo puede categorizar cada tumor basandose en su apariencia histologico y en otros criterios. Los tipos patologicos mas comunes de cancer de mama son el carcinoma ductal invasivo y el carcinoma lobular invasivo.

2. Grado del tumor. El grado histologico puede ser determinado por el patologo al microscopio. Un tumor bien diferenciado (de grado bajo) es similar al tejido normal. Un tumor pobremente diferenciado (grado alto) esta compuesto de celulas desorganizadas y no presenta la apariencia de tejido normal. Los tumores moderadamente diferenciados (grado intermedio) se encuentran en un punto intermedio.

3. Estatus de protemas y expresion genica. Los canceres de mama pueden someterse a ensayo para la expresion y/o activacion de moleculas de transduccion de senales tales como, por ejemplo, el receptor de estrogeno (ER), el receptor de progesterona (PR) y Her2/Neu/ErbB2. Tal como se ha descrito en la presente memoria, el perfil de expresion de un tumor dado ayuda en la prediccion de su pronostico y asiste al oncologo en la seleccion del tratamiento mas apropiado.

4. Estadio del tumor. Los canceres de mama pueden estadificarse segun el sistema de clasificacion TNM:

a. Tumor. Cinco valores (Tis, T1, T2, T3 o T4), dependiendo de la presencia o ausencia de cancer invasivo, las dimensiones del cancer invasivo, y la presencia o ausencia de invasion fuera de la mama (por ejemplo en la piel de la mama o en el musculo o caja toracica subyacente).

b. Ganglio linfatico. Cuatro valores (N0, N1, N2 o N3), dependiendo del numero, tamano y localizacion de los depositos metastasicos en ganglios linfaticos.

c. Metastasis. Dos valores (M0 o M1), dependiendo de la presencia o ausencia de metastasis diferentes de las de ganglios linfaticos (metastasis denominadas distantes, por ejemplo en hueso, cerebro, pulmon, etc.).

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Patoloaia

Con respecto a la patologfa, la clasificacion de la Organizacion Mundial de la Salud de los tumores de mama fija los tipos histologicos siguientes:

1. Carcinomas de mama invasivos, tales como el carcinoma ductal invasivo (por ejemplo el carcinoma de tipo basal, el carcinoma de tipo mixto, el carcinoma pleomorfico, el carcinoma con celulas gigantes osteoclasticas, el carcinoma con caractensticas coriocarcinomatosas, el carcinoma con caractensticas melanoticas), el carcinoma lobular invasivo, el carcinoma tubular, el carcinoma cribiforme invasivo, el carcinoma medular, el carcinoma mucinoso y otros tumores con abundante mucina (por ejemplo el carcinoma mucinoso, el cistadenocarcinoma y el carcinoma mucinosa de celulas columnares y el carcinoma de celulas en anillo de sello gastrico), los tumores neuroendocrinos (por ejemplo el carcinoma neuroendocrino solido (carcinoide de mama), el tumor carcinoide affpico, el carcinoma de celulas pequenas o celulas en avena y el carcinoma neuroendocrino de celulas grandes), el carcinoma papilar invasivo, el carcinoma micropapilar invasivo, el carcinoma apocrino, los carcinomas metaplasicos (por ejemplo los carcinomas metaplasicos mixtos epiteliales/mesenquimales o los carcinomas metaplasicos epiteliales puros tales como el carcinoma de celulas escamosas, el adenocarcinoma con metaplasia de celulas fusiformes, el carcinoma adenoescamoso y el carcinoma mucoepidermoide), el carcinoma rico en lfpidos, el carcinoma secretor, el carcinoma oncocffico, el carcinoma qmstico adenoide, el carcinoma de celulas acmicas, el carcinoma de celulas claras ricas en glucogeno, el carcinoma sebaceo, el carcinoma inflamatorio y el carcinoma bilateral de mama.

2. Lesiones precursoras, tales como la neoplasia lobular (por ejemplo el carcinoma lobular in situ), las lesiones proliferativas intraductales (por ejemplo la hiperplasia ductal, la hiperplasia epitelial plana, la hiperplasia ductal affpica y el carcinoma ductal in situ), el carcinoma microinvasivo y los neoplasmas papilares intraductales (por ejemplo el papiloma central, el papiloma periferico, el papiloma affpico, el carcinoma papilar intraductal, el carcinoma papilar intraqmstico y las lesiones epiteliales benignas),

3. Lesiones epiteliales benignas, tales como adenosis, incluyendo variantes (por ejemplo la adenosis esclerosante, la adenosis apocrina, la adenosis de conductos terminales, la adenosis microglandular y la adenosis adenomioepitelial), la lesion esclerosante de cicatriz radiada/compleja y los adenomas (por ejemplo el adenoma tubular, el adenoma lactante, el adenoma apocrino, el adenoma pleomorfico y el adenoma ductal),

4. Lesiones mioepiteliales tales como la mioepiteliosis, la adenosis adenomioepitelial, el adenomioepitelioma y el mioepitelioma maligno,

5. Tumores mesenquimales tales como el sarcoma, el hemangioma, la angiomatosis, el hemangiopericitoma, la hiperplasia estromal pseudoangiomatosa, el miofibroblastoma, la fibromatosis (agresiva), el tumor miofibroblastico inflamatorio, el lipoma (por ejemplo el angiolipoma), el tumor de celulas granulares, el neurofibroma, el schwanoma, el angiosarcoma, el liposarcoma, el rabdomiosarcoma, el osteosarcoma, el leiomioma y el leiomiosarcoma.

6. Tumores fibroepiteliales tales como el fibroadenoma, el tumor filodes (por ejemplo benigno, lfmite y maligno), el sarcoma estromal periductal de grado bajo y el hamartoma mamario.

7. Tumores del pezon, tales como el adenoma de pezon, el adenoma siringomatoso y la enfermedad de Paget del pezon.

8. Linfoma maligno.

9. Tumores metastasicos, y

10. tumores de la mama masculina, tales como la ginecomastia y el carcinoma in situ o invasivo.

El carcinoma ductal es el tipo mas comun de cancer de mama en mujeres y se refiere al desarrollo de celulas de cancer dentro de los conductos galactoforos de la mama. Se presenta en dos formas: carcinoma ductal invasivo (CDI), un neoplasma maligno invasivo, y como carcinoma ductal in situ (CDIS), un neoplasma no invasivo. El CDI es la forma mas comun de cancer de mama invasivo. Constituye aproximadamente 80% de todos los tipos de cancer de mama. En la mamograffa habitualmente aparece como una masa con ramas finas que radian desde los bordes. En el examen ffsico, este bulto habitualmente se percibe al tacto como mucho mas duro o firme que las lesiones de mama benignas. En el examen microscopico, las celulas cancerosas invaden y sustituyen los tejidos circundantes normales. El CDIS es el tipo mas comun de cancer de mama no invasivo en mujeres. A medida que se ha generalizado la mamograffa de cribado, el CDIS se ha convertido en una de las condiciones de la mama diagnosticadas con mayor frecuencia. Con frecuencia se denomina "estadio cero" del cancer de mama. El CDIS habitualmente se detecta mediante un mamograma como puntos muy pequenos de calcio denominados microcalcificaciones. Sin embargo, no todas las microcalcificaciones indican la presencia de CDIS, la cual debe confirmarse mediante biopsia. El CDIS puede ser multifocal y el tratamiento se diriga a extirpar la totalidad de los elementos ductales anormales, dejando claros margenes. Tras la extirpacion, el tratamiento con frecuencia incluye radioterapia local. Con el tratamiento correcto, es improbable que el CDIS se desarrolle en cancer invasivo. La extirpacion quirurgica con radiacion reduce el riesgo de que el CDIS recurra o de que se desarrolle cancer de mama invasivo.

El carcinoma lobular invasivo (CLI) es un tipo de cancer de mama que se inicia en un lobulo y que se extiende al tejido mamario circundante. Si no se trata en un estadio precoz, el CLI puede extenderse a otras partes del cuerpo

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tales como el utero o los ovarios. El CLI es el segundo tipo mas comun de cancer de mama invasivo, constituyendo aproximadamente 10% a 15% de todos los casos de cancer de mama. El CLI se caracteriza por un engrosamiento general de un area de la mama, habitualmente la seccion situada sobre el pezon y hacia el brazo. Es menos probable que el CLI aparezca en un mamograma. Cuando sf aparece, puede visualizarse como una masa con ramas finas que radian desde los bordes o puede aparecer como una asimetna en comparacion con la otra mama.

Terapias

Se han demostrado en el cancer de mama varias alteraciones en componentes cruciales de la transduccion de senales. Entre ellas se incluyen: mutaciones del RFCE que resultan en la activacion; la activacion de otros receptores de tirosina quinasa tales como cMet; la activacion del RFCE con activacion de HER-2 y HER-3 o la amplificacion de HER-2; la activacion del RFCE con la mutacion PI3K; la activacion de RFCE con delecion de PTEN, y la activacion del RFCE con la mutacion Ras. Diversas alteraciones de diferentes componentes de las rutas de transduccion de senales han sido las dianas de diversas formas de quimioterapia.

Simultaneamente, puede ser una diana la formacion de nuevos vasos sangumeos hasta las celulas tumorales, un proceso denominado angiogenesis. El VFCE es un factor de supervivencia de las celulas endoteliales que resulta esencial para la formacion de nuevos vasos sangumeos. Por consiguiente, un enfoque para modular la angiogenesis mediada por el VFCE es la utilizacion de anticuerpos dirigidos contra la protema VFCE misma o contra el RFCE. El bevacizumab, un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante de VFCE, actua sinergicamente con la quimioterapia y se ha demostrado que mejora la supervivencia en pacientes con cancer colorrectal, de mama y de pulmon.

Todas las terapias endocrinas se han disenado para bloquear la accion del receptor de estrogeno (RE) de un modo unico. Por ejemplo, los moduladores selectivos de receptores estrogenicos (MSRE) tales como el tamoxifeno se unen al RE y bloquean parcialmente su actividad. La ablacion ovarica, los agonistas de la hormona luteinizante liberadora de hormonas e inhibidores de la aromatasa tales como el anastrozol (Arimidex®), el letrozol (Femara®) y el exemestano (Aromasin®) reducen el nivel de estrogeno e inhiben la activacion inducida por ligando del RE. Los MSRE debenan actuar como antiestrogeno en la mama y el utero y como agonista parcial de estrogeno en los sistemas esqueletico, cardiovascular y nervioso central, asf como en el tracto gastrointestinal y vagina.

Los antiestrogenos esteroideos tales como el fulvestrant se unen al RE mas fuertemente, bloqueando por lo tanto de modo completo su accion e induciendo la degradacion del receptor.

El tamoxifeno, un modulador selectivo del receptor de estrogeno (RE), es el farmaco mas ampliamente utilizado para el tratamiento del cancer de mama positivo para el RE. Los estudios de terapia adyuvante con tamoxifeno muestran una reduccion de 40% a 50% en la probabilidad de recurrencia y en la mortalidad. El tamoxifeno proporciona ademas una remision temporal en 30% a 50% de los pacientes con enfermedad metastasico y tambien resulta efectivo en la prevencion del cancer de mama.

Los inhibidores de aromatasa se estan conviertiendo en el estandar de referencia para el tratamiento de mujeres postmenopausicas con cancer de mama, mientras que el tamoxifeno sigue siendo el estandar para mujeres premenopausicas. Aunque los inhibidores de aromatasa podnan resultar ligeramente mas efectivos que el tamoxifeno, sigue siendo un farmaco importante por sus beneficios documentados en secuencia con dichos agentes para la terapia adyuvante y porque continuara presentando un papel para la enfermedad metastasica.

Resistencias

La resistencia de novo (falta de respuesta a la terapia inicial; resistencia primaria) y la resistencia adquirida (recafda de la enfermedad o progresion de la misma tras mostrar una respuesta inicial a la terapia; resistencia secundaria) al tamoxifeno son problemas importantes. En consecuencia, la comprension de la biologfa tumoral y de los mecanismos de las resistencias podna presentar implicaciones clmicas significativas.

Biologfa de los receptores RE/RP: RE y RP son receptores de hormona nuclear que actuan como factores de transcripcion en el nucleo cuando se encuentran unidos a uno o mas ligandos. RE y PR presentan estructuras similares y contienen un dominio de union a ADN, un dominio de dimerizacion, un dominio de union a hormonas y varios dominios activadores de la transcripcion. Se ha observado una mayor reduccion del riesgo de recurrencia en pacientes con tumores positivos para RE y PR comparado con aquellos con tumores negativos para los mismos.

Accion del RE: la union de hormonas al RE activa la protema mediante fosforilacion, disocia protemas chaperonas tales como la protema 90 de choque termico, y altera su conformacion. El RE con hormona unida ("activado") seguidamente se dimeriza con otro receptor, y el dfmero se une a elementos de respuesta a estrogeno (secuencias de ADN espedficas) presentes en el promotor de los genes sensibles al estrogeno. Los dfmeros de RE unidos a un

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promotor forman un complejo con protemas correguladoras tales como la protema amplificada 1 en el cancer de mama (AIB1 o SRC3), que actua coordinadamente influyendo sobre la transcripcion de los genes sensibles al estrogeno. Tfpicamente, se unen coactivadores al RE cuando el receptor se encuentra unido a estrogeno, mientras que se unen correpresores cuando el RE se encuentra unido a tamoxifeno. AIB1 se sobreexpresa en 65% de los canceres de mama y el gen correspondiente se amplifica en el 5%. Los niveles elevados de AIB1 podnan contribuir a la resistencia a MSRE al incrementar la actividad de agonistas del estrogeno (por ejemplo el tratamiento con inhibidores de aromatasa). Los dfmeros de RE tambien forman complejos con protemas correpresoras tales como NCOR, regulando negativamente la expresion genica de determinados genes (por ejemplo HOXB13).

Varias quinasas presentes en las rutas de senalizacion de factores de crecimiento tambien pueden activar el RE en un proceso denominado activacion independiente de ligando. Bajo determinadas condiciones, tales como una actividad elevada de la familia de ErbB (por ejemplo una actividad elevada de HER-2 o de HER-1), el RE unido al tamoxifeno se acompleja con AIB1, resultando en una actividad incrementada de agonista de estrogeno del tamoxifeno (por ejemplo el tratamiento con fulvestrant o inhibidores de aromatasa conjuntamente con inhibidores de quinasa).

Dicha accion de RE no nuclear o senalizacion iniciada por esteroide en la membrana (SIEM) se produce en los minutos siguientes a la adicion de estrogeno. Los MSRE tales como el tamoxifeno tambien pueden activar el RE membranal. Se han encontrado estos receptores en celulas oseas, neurales, uterinas, adiposas y endoteliales. Los mecanismos por los que el estrogeno activa la funcion del RE membranal se estan empezando a clarificar. Se han observado interacciones directas entre el RE y una diversidad de moleculas de senalizacion en membrana tales como el receptor del factor 1 de crecimiento similar a insulina, la subunidad reguladora p85 de PI3K, Src y Shc, una protema que puede acoplar directamente el RE a una diversidad de factores de crecimiento tirosina quinasa. La activacion de dichas rutas por el estrogeno envfa potentes senales de supervivencia y proliferacion celulares mediante la activacion de Akt y MAPK. Ademas, dichas quinasas pueden fosforilar el RE y sus correguladores para incrementar la senalizacion del RE nuclear. La fosforilacion de estas protemas puede incrementar ademas la actividad de tipo agonista de estrogeno del tamoxifeno y de otros MSRE.

El antiestrogeno puro fulvestrant no activa el RE membranal de esta manera; sin embargo, los MSRE tales como el tamoxifeno sf activan el RE membranal de una manera similar al estrogeno. Los efectos en membrana del RE, al igual que su actividad nuclear, pueden ser espedficos de celula, de subtipo de receptor y de ligando, y tambien pueden verse influidos por el factor de crecimiento, siendo el entorno de senalizacion mas prominente, por ejemplo, en canceres de mama que sobreexpresan ErbBI o HER-2. La estimulacion de la actividad MISS del RE por el tamoxifeno y otros MSRE puede explicar, en parte, la resistencia de estos agentes observada ocasionalmente en tumores que sobreexpresan HER-2.

Ademas de las funciones del RE asociadas al nucleo y a la membrana plasmatica (senalizacion iniciada por esteroide en membrana, SIEM), el RE se conjuga con otras moleculas de la ruta para facilitar la posterior progresion tumoral. Esta intercomunicacion molecular puede tratarse mas efectivamente con inhibidores de aromatasa que con los MSRE.

El RE presenta por lo menos dos funciones principales. Sirve como factor de transcripcion para los genes regulados por estrogeno y es un coactivador para otros factores de transcripcion presentes en el nucleo. Funciona ademas en el citoplasma y en la membrana plasmatica activando la senalizacion de factores de crecimiento. En algunos tumores mamarios, particularmente aquellos con rutas de senalizacion de factores de crecimiento muy activas, tales como la amplificacion de HER-2, se establece un ciclo vicioso en el que el estrogeno activa la senalizacion de factor de crecimiento y la ruta de senalizacion de factores de crecimiento activa adicionalmente el RE. El estrogeno en dichos tumores se esperana que fuese un factor dominante al activar multiples rutas importantes en la progresion tumoral. Dicha intercomunicacion molecular presenta importantes implicaciones para el tratamiento del cancer de mama. A tttulo de ejemplo, la terapia de privacion de estrogeno con inhibidores de aromatasa debena resultar mas efectiva que los MSRE en tumores con amplificacion de HER-2 al cerrar la senalizacion de esteroide tanto iniciada en el nucleo como las actividades MISS del RE.

Enfermedad metastasica

Dos tercios o mas de los tumores de mama dependen del estrogeno para su crecimiento. Pueden utilizarse varios agentes bloqueantes de estrogeno para el tratamiento del cancer de mama metastasico. Sin embargo, esta respuesta del tratamiento con estos agentes es impredecible y aproximadamente un tercio de los pacientes con cancer de mama metastasico con receptores de estrogeno o de progesterona no obtienen ningun beneficio de la terapia hormonal. Practicamente la totalidad de los pacientes con cancer de mama metastasico finalmente adquiriran resistencia a la terapia hormonal aunque todavfa se encuentren presentes los receptores hormonales.

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La seleccion de la terapia se determina basandose en la activacion de rutas de senalizacion o en una mejor comprension de la biolog^a tumoral. La presente invencion proporciona ventajosamente una metodolog^a de ensayo conjuntamente con un chip diagnostico/pronostico para ayudar a los oncologos a decidir cual es el mejor tratamiento para cada paciente.

V. Construccion de matrices de anticuerpos

En determinados aspectos, el estado de activacion de una pluralidad de moleculas de transduccion de senales en un extracto celular de celulas tumorales tales como celulas circulantes procedentes de un tumor solido, se detecta utilizando una matriz con anticuerpos que comprende una serie de dilucion de anticuerpos de captura inmovilizados sobre un soporte solido. Las matrices tipicamente comprenden una pluralidad de diferentes anticuerpos de captura en un abanico de concentraciones de los anticuerpos de captura que se encuentran acoplados a la superficie del soporte solido en diferentes localizaciones direccionables.

El soporte solido puede comprender cualquier sustrato adecuado para inmovilizar protemas. Entre los ejemplos de soportes solidos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, vidrio (por ejemplo un portaobjetos de vidrio), plastico, chips, agujas, filtros, perlas, papel, membranas, haces de fibras, geles, metal, ceramica y similares. Algunas membranas, tales como el nilon (Biotrans™, ICN Biomedicals, Inc. (Costa Mesa, CA); Zeta-Probe®, Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA)), la nitrocelulosa (Protran®, Whatman Inc. (Florham Park, NJ)) y PVDF (Immobilon™, Millipore Corp. (Billerica, MA)) resultan adecuadas para la utilizacion como soportes solidos en las matrices de la presente invencion. Preferentemente, los anticuerpos de captura se fijan sobre portaobjetos de vidrio recubiertos con un polfmero de nitrocelulosa, por ejemplo, FAST®Slides, las cuales se encuentran disponibles comercialmente de Whatman Inc. (Florham Park, NJ).

Entre los aspectos particulares del soporte solido que resultan deseables se incluyen la capacidad de unirse a grandes cantidades de anticuerpos de captura y la capacidad de unirse a anticuerpos de captura con una desnaturalizacion minima. Otro aspecto adecuado es que el soporte solido muestra una "absorcion" minima al aplicar en el soporte las soluciones de anticuerpos que contienen los anticuerpos de captura. Un soporte solido con minima absorcion permite la aplicacion en el soporte de almuotas pequenas de solucion de anticuerpos de captura, resultando en puntos pequenos definidos de anticuerpo de captura inmovilizado.

Los anticuerpos de captura tfpicamente se inmovilizan sobre el soporte solido directa o indirectamente (por ejemplo mediante etiquetas de captura) mediante interacciones covalentes o no covalentes (por ejemplo enlaces ionicos, interacciones hidrofobicas, enlaces de hidrogeno, fuerzas de Van der Waals, enlaces dipolo-dipolo). En algunas realizaciones, los anticuerpos de captura se unen covalentemente al soporte solido utilizando un entrecruzante homobifuncional o heterobifuncional utilizando metodos y condiciones de entrecruzamiento estandares. Los entrecruzantes adecuados se encuentran disponibles comercialmente de proveedores tales como, por ejemplo, Pierce Biotechnology (Rockford, IL).

Entre los metodos para generar matrices adecuadas para la utilizacion en la presente invencion se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, cualquier tecnica utilizada para construir matrices de protemas o acidos nucleicos. En algunas realizaciones, los anticuerpos de captura se aplican en forma de puntos sobre una matriz utilizando un robot micrometrico de deposito ("microspotter"), que tfpicamente es un impresor robotico dotado de agujas ranuradas, agujas romas o un impresor de inyeccion. Entre los sistemas roboticos adecuados para la impresion de las matrices de anticuerpos descritas en la presente memoria se incluyen el robot PixSys 5000 (Cartesian Technologies, Irvine, CA) con agujas ranuradas ChipMaker2 (TeleChem International, Sunnyvale, CA), asf como otros impresores roboticos disponibles de BioRobics (Woburn, MA) y de Packard Instrument Co. (Meriden, CT). Preferentemente se aplicaron como puntos sobre la matriz por lo menos 2, 3, 4, 5 o 6 replicas de cada dilucion de anticuerpo de captura.

Otro metodo para generar matrices adecuadas para la utilizacion en la presente invencion comprende dispensar un volumen conocido de una dilucion de anticuerpo de captura en cada posicion seleccionada de la matriz mediante contacto de un dispensador capilar con un soporte solido bajo condiciones efectivas para aplicar un volumen definido de lfquido en el soporte, en el que dicho procedimiento se repite utilizando diluciones seleccionadas de anticuerpo de captura en cada posicion seleccionada de la matriz con el fin de crear una matriz completa. El metodo puede ponerse en practica formando una pluralidad de dichas matrices, en las que la etapa de deposicion de solucion se aplica en una posicion seleccionada en cada uno de entre una pluralidad de soportes solidos en cada ciclo repetido. Puede encontrarse una descripcion adicional de dicho metodo en, por ejemplo, la patente US n° 5.807.522.

En determinados casos, pueden utilizarse dispositivos de impresion en papel para generar las matrices de anticuerpos. Por ejemplo, la dilucion deseada de anticuerpo de captura puede cargarse en el cabezal de impresion de una impresora de inyeccion e imprimirse sobre un soporte solido adecuado (ver, por ejemplo, Silzel et al., Clin. Chem. 44:2036-2043, 1998).

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En algunas realizaciones, la matriz generada sobre el soporte solido presenta una densidad de por lo menos 5 puntos/cm2 aproximadamente, y preferentemente por lo menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000 o 9.000, o 10.000 puntos/cm2.

En determinados casos, los puntos sobre el soporte solido representan, cada uno, un anticuerpo de captura diferente. En determinados otros casos, multiples puntos sobre el soporte solido representan el mismo anticuerpo de captura, por ejemplo como serie de dilucion que comprende una serie de concentraciones decrecientes de anticuerpo de captura.

Se describen ejemplos adicionales de metodos para preparar y construir matrices de anticuerpos sobre soporte solidos en las patentes US n° 6.197.599, n° 6.777.239, n° 6.780.582, n° 6.897.073, n° 7.179.638 y n° 7.192.720; publicaciones de patente US n° 20060115810, n° 20060263837, n° 20060292680 y n° 20070054326; y Varnum et al., Methods Mol. Biol. 264:161-172, 2004.

Se conocen en la tecnica metodos para escanear matrices de anticuerpos y entre ellos se incluyen, aunque sin limitacion, cualquier tecnica utilizada para escanear matrices de protemas o acidos nucleicos. Los escaners de micromatrices adecuados para la utilizacion en la presente invencion se encuentran disponibles de PerkinElmer (Boston, MA), Agilent Technologies (Palo Alto, CA), Applied Precision (Issaquah, WA), GSI Lumonics Inc. (Billerica, MA) y Axon Instruments (Union City, CA). A tftulo de ejemplo no limitativo, puede utilizarse un ScanArray3000 de GSI para la deteccion por fluorescencia con el software ImaGene para la cuantificacion.

VI. Ensayos de deteccion individual

En algunas realizaciones, el ensayo para detectar el estado de activacion de un analito particular (por ejemplo una molecula de transduccion de senales) de interes en un extracto celular de celulas tumorales, tales como celulas circulantes procedentes de un tumor solido, puede ser un ensayo de dos anticuerpos multiplex de proximidad de alto rendimiento que presenta un rango dinamico superior. A tftulo de ejemplo no limitativo, los dos anticuerpos utilizados en el ensayo pueden comprender: (1) un anticuerpo de captura espedfico para el analito, y (2) un anticuerpo de deteccion espedfico para una forma activada del analito (es decir, anticuerpo dependiente del estado de activacion). El anticuerpo dependiente del estado de activacion es capaz de detectar, por ejemplo, la fosforilacion, la ubiquitinacion y/o el estado de acomplejamiento del analito. Alternativamente, el anticuerpo de deteccion comprende un anticuerpo independiente del estado de activacion, que detecta la cantidad total del analito en el extracto celular. El anticuerpo imdependiente del estado de activacion es capaz generalmente de detectar las formas tanto activada como no activada del analito.

En una realizacion preferente, el ensayo de dos anticuerpos comprende:

(i) incubar el extracto celular con una pluralidad de series de dilucion de anticuerpos de captura para formar una pluralidad de analitos capturados,

(ii) incubar la pluralidad de analitos capturados con anticuerpos dependientes del estado de activacion espedficos para los analitos correspondientes con el fin de formar una pluralidad de analitos capturados detectables,

(iii) incubar la pluralidad de analitos capturados detectables con un primer y un segundo miembros de una pareja de amplificacion de senales para generar una senal amplificada, y

(iv) detectar la senal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros de la pareja de amplificacion de senal.

Los ensayos de dos anticuerpos descritos en la presente memoria tfpicamente son matrices de anticuerpos que comprenden una pluralidad de diferentes anticuerpos de captura en un abanico de concentraciones de los anticuerpos de captura que se encuentran acoplados a la superficie del soporte solido en diferentes localizaciones direccionables. Se han descrito anteriormente ejemplos de soportes solidos adecuados para la utilizacion en la presente invencion.

Los anticuerpos de captura y los anticuerpos de deteccion preferentemente se seleccionan para minimizar la competicion entre ellos con respecto a la union al analito (es decir, tanto los anticuerpos de captura como los de deteccion pueden unirse simultaneamente a sus moleculas de transduccion de senales correspondientes).

En una realizacion, los anticuerpos de deteccion pueden comprender un primer miembro de una pareja de union (por ejemplo biotina) y el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales comprende un segundo miembro de la pareja de union (por ejemplo estreptavidina). Los miembros de la pareja de union pueden acoplarse directa o indirectamente a los anticuerpos de deteccion o con el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales

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utilizando metodos bien conocidos de la tecnica. En determinados casos, el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales es una peroxidasa (por ejemplo peroxidasa de rabano picante (PRP), catalasa, cloroperoxidasa, citocromo-c peroxidasa, eosinofilo peroxidasa, glutation peroxidasa, lactoperoxidasa, mieloperoxidasa, peroxidasa tiroidea, desyodinasa, etc.) y el segundo miembro de la pareja de amplificacion de senales es un reactivo tiramida (por ejemplo biotina-tiramida). En estos casos, la senal amplificada se genera mediante oxidacion de peroxidasa del reactivo de tiramida para producir una tiramida activada en presencia de peroxido de hidrogeno (H2O2).

La tiramida activada se detecta directamente o despues de la adicion de un reactivo detector de senales tal como, por ejemplo, un fluoroforo marcado con estreptavidina o una combinacion de una peroxidasa marcada con estreptavidina y un reactivo cromogenico. Entre los fluoroforos adecuados para la utilizacion en el presente metodo se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, un pigmento Alexa Fluor® (por ejemplo Alexa Fluor® 555), fluorescema, isotiocianato de fluorescema (FITC), verde Oregon Green™, rodamina, rojo Texas, isotiocianato de tetrarodamina (TRITC), CyDye™ fluor (por ejemplo Cy2, Cy3, Cy5) y similares. El marcaje de estreptavidina puede acoplarse directa o indirectamente con el fluoroforo o peroxidasa utilizando metodos bien conocidos de la tecnica. Entre los ejemplos no limitativos de reactivos cromogenicos adecuados para la utilizacion en el presente metodo se incluyen 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), 3,3'-diaminobencidina (DAB), acido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolm-6-sulfonico) (ABTS), 4-cloro-1-naftol (4CN) y/o porfirinogeno.

En el Ejemplo 3 se proporciona un protocolo ejemplar para llevar a cabo los ensayos de dos anticuerpos descritos en la presente memoria.

En otra realizacion, la presente invencion proporciona kits para llevar a cabo los ensayos de dos anticuerpos descritos anteriormente, que comprenden: (a) una serie de dilucion de una pluralidad de anticuerpos de captura inmovilizados sobre un soporte solido, y (b) una pluralidad de anticuerpos de deteccion (por ejemplo anticuerpos independientes del estado de activacion y anticuerpos dependientes del estado de activacion). En algunos casos, los kits puede contener ademas instrucciones de metodos de utilizacion del kit para la deteccion de los estados de activacion de una pluralidad de moleculas de transduccion de senales de celulas circulantes procedentes de un tumor solido. Los kits pueden contener ademas cualquiera de los reactivos adicionales indicados anteriormente con respecto a la realizacion de los metodos espedficos tales como, por ejemplo, primer y segundo miembros de la pareja de amplificacion de senales, reactivos de amplificacion de senales de tiramida, tampones de lavado, etc.

En otra realizacion de un enfoque de dos anticuerpos, la presente invencion proporciona un metodo para detectar la presencia de un receptor truncado, comprendiendo el metodo:

(a) incubar un extracto celular con una pluralidad de perlas espedficas para una region de union a dominio extracelular (DEC), en el que la region de union a DEC es espedfica para un receptor de longitud completa,

(b) separar la pluralidad de perlas del extracto celular, separando de esta manera los receptores de longitud completa para formar un extracto celular sin receptores de longitud completa,

(c) incubar dicho extracto celular que no presente dichos receptores de longitud completa, con una pluralidad de anticuerpos de captura, en el que dicha pluralidad de anticuerpos de captura es espedfica de una region de union a dominio intracelular (DlC) de dicho receptor truncado y en el que dicha pluralidad de anticuerpos capturados esta inmovilizada sobre un soporte solido para formar una pluralidad de receptores truncados capturados,

(d) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados con anticuerpos de deteccion espedficos para los receptores truncados correspondientes con el fin de formar una pluralidad de receptores truncados capturados detectables,

(e) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados detectables con un primer y segundo miembros de una pareja de amplificacion de senales para generar una senal amplificada, y

(f) detectar la senal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros de la pareja de amplificacion de senales.

En determinadas realizaciones, el receptor truncado puede ser p95 ErbB2 y el receptor de longitud completa es ErbB2 (HER-2). En determinados otros aspectos, la pluralidad de perlas espedfica para una region de union a dominio extracelular (DEC) comprende una pareja de estreptavidina-biotina, en la que la biotina se encuentra unida a una perla y la biotina se encuentra unida a un anticuerpo (por ejemplo en el que el anticuerpo es espedfico para la region de union a DEC del receptor de longitud completa).

La figura 14A muestra que las perlas recubiertas con un anticuerpo dirigido contra el dominio extracelular (DEC) de un receptor de interes se unen al receptor de longitud completa (por ejemplo ErbB2) pero no al receptor truncado (por ejemplo p95) para separar cualquier receptor de longitud completa del ensayo. La figura 14B muestra que el receptor truncado (por ejemplo p95), una vez unido a un anticuerpo de captura, seguidamente puede detectarse con un anticuerpo de deteccion que es espedfico para el dominio intracelular (DIC) del receptor de longitud completa (por ejemplo ErbB2). El anticuerpo de deteccion puede conjugarse directamente con peroxidasa de rabano picante

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(PRP). A continuacion puede llevarse a cabo la amplificacion de senales de tiramida (AST) para generar una senal que debe detectarse. El estado de activacion de p95 puede interrogarse a fin de determinar, por ejemplo, su estado de fosforilacion, estado de ubiquitinacion y/o estado de acomplejamiento.

VII. Ensayos de doble deteccion de proximidad

En algunas realizaciones, el ensayo para detectar el estado de activacion de un analito particular (por ejemplo una molecula de transduccion de senales) de interes en un extracto celular de celulas tumorales, tales como celulas circulantes procedentes de un tumor solido, puede ser un ensayo multiplex de proximidad de alto rendimiento (es decir, de tres anticuerpos) que presenta un rango dinamico superior. A tttulo de ejemplo no limitativo, los tres anticuerpos utilizados en el ensayo de proximidad pueden comprender: (1) un anticuerpo de captura espedfico para el analito, (2) un anticuerpo de deteccion espedfico para una forma activdad del analito (es decir, anticuerpo dependiente del estado de activacion), y (3) un anticuerpo de deteccion que detecta la cantidad total del analito (es decir, anticuerpo independiente del estado de activacion). El anticuerpo dependiente del estado de activacion es capaz de detectar, por ejemplo, la fosforilacion, la ubiquitinacion y/o el estado de acomplejamiento del analito. El anticuerpo dependiente del estado de activacion es capaz generalmente de detectar las formas tanto activada como no activada del analito.

En una realizacion preferente, el ensayo de proximidad comprende:

(i) incubar el extracto celular con una pluralidad de series de dilucion de anticuerpos de captura para formar una pluralidad de analitos capturados,

(ii) incubar la pluralidad de analitos capturados con anticuerpos de deteccion que comprenden una pluralidad de anticuerpos independientes del estado de activacion y una pluralidad de anticuerpos dependientes del estado de activacion espedficos para los analitos correspondientes con el fin de formar una pluralidad de analitos capturados detectables, en el que los anticuerpos independientes de estado de activacion se marcan con una fraccion facilitadora, los anticuerpos dependientes del estado de activacion se marcan con un primer miembro de una pareja de amplificacion de senales y la fraccion facilitadora genera un agente oxidante que se canaliza y reacciona con el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales,

(iii) incubar la pluralidad de analitos capturados detectables con un segundo miembro de la pareja de amplificacion de senal para generar una senal amplificada, y

(iv) detectar la senal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros de la pareja de amplificacion de senal.

Alternativamente, los anticuerpos dependientes del estado de activacion pueden marcarse con una fraccion facilitadora y los anticuerpos independientes del estado de activacion pueden marcarse con un primer miembro de una pareja de amplificacion de senales.

Los ensayos de proximidad descritos en la presente memoria tfpicamente son matrices de anticuerpos que comprenden una pluralidad de diferentes anticuerpos de captura en un abanico de concentraciones de los anticuerpos de captura que se encuentran acoplados a la superficie del soporte solido en diferentes localizaciones direccionables. Se han descrito anteriormente ejemplos de soportes solidos adecuados para la utilizacion en la presente invencion.

Los anticuerpos de captura, anticuerpos independientes del estado de activacion y anticuerpos dependientes del estado de activacion preferentemente se seleccionan para minimizar la competicion entre ellos con respecto a la union de analito (es decir, todos los anticuerpos pueden unirse simultaneamente a sus moleculas de transduccion de senales correspondientes).

En algunas realizaciones, los anticuerpos independientes del estado de activacion comprenden ademas una fraccion detectable. En dichos casos, la cantidad de la fraccion detectable guarda relacion con la cantidad de uno o ma sde los analitos en el extracto celular. Entre los ejemplos de fracciones detectables se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, marcajes fluorescentes, marcajes qmmicamente reactivos, marcajes enzimaticos, marcajes radioactivos y similares. Preferentemente, la fraccion detectable es un fluoroforo tal como un pigmento Alexa Fluor® (por ejemplo Alexa Fluor® 647), fluorescema, isotiocianato de fluorescema (FITC), verde Oregon Green™, rodamina, rojo Texas, isotiocianato de tetrarodamina (TRITC), CyDye™ fluor (por ejemplo Cy2, Cy3, Cy5), y similares. La fraccion detectable puede acoplarse directa o indirectamente a los anticuerpos independientes del estado de activacion utilizando metodos bien conocidos de la tecnica.

En determinados casos, los anticuerpos independientes del estado de activacion se marcan directamente con la fraccion facilitadora. La fraccion facilitadora puede acoplarse con los anticuerpos independientes del estado de activacion utilizando metodos bien conocidos de la tecnica. Una fraccion facilitadora adecuada para la utilizacion en la presente invencion incluye cualquier molecula capaz de generar un agente oxidante que canaliza (es decir que se dirige a) y reacciona con (es decir, se une, es ligada por, o forma un complejo con) otra molecula en proximidad (es

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decir, espacialmente proxima o cercana) a la fraccion facilitadora.. Entre los ejemplos de fracciones facilitadoras se incluyen, aunque sin limitacion, enzimas tales como glucosa oxidasa o cualquier otro enzima que cataliza una reaccion de oxidacion/reduccion que implica ox^geno molecular (O2) como aceptor de electrones, y fotosensibilizadores tales como azul de metileno, rosa de Bengal, porfirinas, pigmentos escuarato, ftalocianinas y similares. Entre los ejemplos no limitativos de agentes oxidantes se incluyen el peroxido de hidrogeno (H2O2), un ox^geno singlete y cualquier otro compuesto que transfiera atomos de oxfgeno o gane electrones en una reaccion de oxidacion/reduccion. Preferentemente, en presencia de un sustrato adecuado (es decir, glucosa), la fraccion facilitadora (es decir, la glucosa oxidasa) genera un agente oxidante (por ejemplo peroxido de hidrogeno (H2O2), oxfgeno singlete, etc.) que se canaliza y reacciona con el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales (por ejemplo la peroxidasa de rabano picante (HRP), hapteno protegido por un grupo protector, un enzima inactivado mediante enlace tioeter con un inhibidor de enzima, etc.) en el caso de que las dos fracciones se encuentren proximas entre su

En determinados otros casos, los anticuerpos independientes del estado de activacion se marcan indirectamente con la fraccion facilitadora mediante hibridacion entre un conector oligonucleotido conjugado con los anticuerpos independientes del estado de activacion y un conector oligonucleotido complementario conjugado con la fraccion facilitadora. Los conectores oligonucleotidos pueden acoplarse con la fraccion facilitadora o con los anticuerpos independientes del estado de activacion utilizando metodos bien conocidos de la tecnica. En algunas realizaciones, el conector oligonucleotido conjugado con la fraccion facilitadora presenta una complementariedad del 100% respecto al conector oligonucleotido conjugado con los anticuerpos independientes del estado de activacion. En otras realizaciones, la pareja de conectores oligonucleotidos comprende por lo menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas regiones de desapareamiento, por ejemplo en la hibridacion bajo condiciones de hibridacion restrictivas. El experto en la materia apreciara que los anticuerpos independientes del estado de activacion para diferentes analitos pueden conjugarse con el mismo conector oligonucleotido o con diferentes conectores oligonucleotidos.

La longitud de los conectores oligonucleotidos que se conjugan con la fraccion facilitadora o con los anticuerpos independientes del estado de activacion puede variar. En general, la secuencia del conector puede presentar una longitud de por lo menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75 o 100 nucleotidos. Tfpicamente se generan secuencias de acidos nucleicos aleatorias para el acoplamiento. A tttulo de ejemplo no limitativo, puede disenarse una biblioteca de conectores oligonucleotidos para que presente tres dominios contiguos diferentes: un dominio espaciador, dominio de firma y dominio de conjugacion. Preferentemente, los conectores oligonucleotidos se disenan para un acoplamiento eficiente sin destruir la funcion de la fraccion facilitadora o de los anticuerpos independientes del estado de activacion con los que se encuentran conjugados.

Las secuencias conectoras oligonucleotidas pueden disenarse para prevenir o minimizar cualquier formacion de estructura secundaria bajo una diversidad de condiciones de ensayo. Tfpicamente se lleva a cabo un seguimiento cuidadoso de la temperaturas de fusion para cada segmento dentro del conector con el fin de permitir su participacion en los procedimientos de ensayo globales. Generalmente, el intervalo de temperaturas de fusion del segmento de la secuencia conectora es de entre 1°C y 10°C. Los algoritmos informaticos (por ejemplo OLIGO 6.0) para determinar la temperatura de fusion, la estructura secundaria y la estructura de horquilla bajo concentraciones ionicas definidas pueden utilizarse para analizar cada uno de los tres dominios diferentes dentro de cada conector. Las secuencias combinadas globales tambien pueden analizarse para caracterizar su estructura y compatibilidad con otras secuencias oligonucleotidas conectoras conjugadas, por ejemplo para conocer si se hibridaran bajo condiciones de hibridacion restrictivas con un conector oligonucleotido complementario.

La region espaciadora del conector oligonucleotido proporciona una separacion adecuada del dominio de conjugacion respecto al sitio de entrecruzamiento del oligonucleotido. El dominio de conjugacion funciona uniendo las moleculas marcadas con una secuencia conectora oligonucleotida complementaria con el dominio de conjugacion mediante hibridacion de acidos nucleicos. La hibridacion mediada por acidos nucleicos puede llevarse a cabo antes o despues de la formacion del complejo de anticuerpo-analito (es decir, el antfgeno), proporcionando un formato de ensayo mas flexible. Al contrario que muchos metodos directos de conjugacion de anticuerpos, la union de oligonucleotidos relativamente pequenos a anticuerpos o a otras moleculas presenta un impacto mmimo sobre la afinidad espedfica de los anticuerpos para su analito diana o sobre la funcion de las moleculas conjugadas.

En algunas realizaciones, el dominio de secuencia de firma del conector oligonucleotido puede utilizarse en ensayos multiplexados complejos de protemas. Pueden conjugarse multiples anticuerpos con conectores oligonucleotidos que presentan diferentes secuencias de firma. En inmunoensayos multiplex, pueden utilizarse secuencias oligonucleotidas informadoras marcadas con sondas apropiadas para detectar la reactividad cruzada entre anticuerpos y sus antfgenos en el formato de ensayo multiplex.

Los conectores oligonucleotidos pueden conjugarse con anticuerpos o con otras moleculas utilizando varios metodos diferentes. Por ejemplo, pueden sintetizarse conectores oligonucleotidos con un grupo tiol en el extremo 5' o 3'. El grupo tiol puede desprotegerse utilizando agentes reductores (por ejemplo TCEP-HCl) y los conectores resultantes

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pueden purificarse utilizando una columna de centrifugacion para desalado. Los conectores oligonucleotidos desprotegidos resultantes pueden conjugarse con las aminas primarias de anticuerpos o de otros tipos de protemas utilizando entrecruzadores heterobifuncionales tales como SMCC. Alternativamente, pueden tratarse los grupos 5'- fosfato de los oligonucleotidos con carbodiimida de EDC soluble en agua con el fin de formar esteres de fosfato y posteriormente acoplarse con moleculas que contienen amina. En determinados casos, el diol en el residuo de 3'- ribosa puede oxidarse formando grupos aldelmdo y despues conjugarse con los grupos amina de anticuerpos o de otros tipos de protemas mediante aminacion reductora. En determinados otros casos, el conector oligonucleotido puede sintetizarse con una modificacion de biotina en el extremo 3' o 5' y conjugarse con moleculas marcadas con estreptavidina.

Los conectores oligonucleotidos pueden sintetizarse utilizando cualquiera de entre una diversidad de procedimientos conocidos de la tecnica, tales como los descritos en Usman et al., J. Am. Chem. Soc. 109:7845, 1987; Scaring et al., Nucl. Acids Res. 18:5433, 1990; Wincott et al., Nucl. Acids Res. 23:2677-2684, 1995, y Wincott et al., Methods Mol. Bio. 74:59, 1997. En general, la smtesis de oligonucleotidos utiliza grupos protectores y de acoplamiento habituales para los acidos nucleicos, tales como el dimetoxitritilo en el extremo 5' y las fosforamiditas en el extremo 3'. Los reactivos adecuados para la smtesis de oligonucleotidos, los metodos para la desproteccion de los acidos nucleicos, y los metodos para la purificacion de los acidos nucleicos son conocidos por el experto en la materia.

En determinados casos, los anticuerpos dependientes del estado de activacion se marcan directamente con el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales. El miembro de la pareja de amplificacion de senales puede acoplarse con los anticuerpos dependientes del estado de activacion utilizando metodos bien conocidos de la tecnica. En determinados otros casos, los anticuerpos dependientes del estado de activacion se marcan indirectamente con el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales mediante la union entre un primer miembro de una pareja de union conjugada con los anticuerpos dependientes del estado de activacion y un segundo miembro de la pareja de union conjugado con el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales. Los miembros de la pareja de union (por ejemplo biotina/estreptavidina) pueden acoplarse con el miembro de la pareja de amplificacion de senales o con los anticuerpos dependientes del estado de activacion utilizando metodos bien conocidos de la tecnica. Entre los ejemplos de miembros de la pareja de amplificacion de senales se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, peroxidasas tales como la peroxidasa de rabano picante (HRP), catalasa, cloroperoxidasa, citocromo c peroxidasa, eosinofilo peroxidasa, glutation peroxidasa, lactoperoxidasa, mieloperoxidasa, peroxidasa del tiroides, deyodinasa, y similares. Entre otros ejemplos de miembros de pareja de amplificacion se senales se incluyen haptenos protegidos por un grupo protector y enzimas inactivados mediante union tioeter a un inhibidor enzimatico.

En un ejemplo de canalizacion por proximidad, la fraccion facilitadora es la glucosa oxidasa (GO) y el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales es la peroxidasa de rabano picante (PRP). Al poner en contacto la GO con un sustrato tal como glucosa, genera un agente oxidante (es decir, peroxido de hidrogeno (H2O2)). En el caso de que la PRP se encuentre dentro de una proximidad canalizadora a la GO, el H2O2 generado por la Go sera canalizado y acomplejado con la PRP, formando un complejo PRP-H2O2 que, en presencia del segundo miembro de la pareja de amplificacion de senales (por ejemplo un sustrato quimioluminiscente tal como luminol o isoluminol o un sustrato fluorogenico tal como tiramida (por ejemplo biotina-tiramida), acido homovamlico o acido 4-hidroxifenil- acetico) generara una senal amplificada. Los metodos de utilizacion de GO y PRP en un ensayo de proximidad se describen en, por ejemplo, Langry et al., U.S. Dept. of Energy, informe n° UCRL-ID-136797, 1999. En el caso de que se utilice biotina-tiramida como segundo miembro de la pareja de amplificacion de senales, el complejo HRP-H2O2 oxida la tiramida, generando un radical tiramida reactivo que se une covalentemente a residuos nucleofflicos proximos. La tiramida activada se detecta directamente o despues de la adicion de un reactivo detector de senales tal como, por ejemplo, un fluoroforo marcado con estreptavidina o una combinacion de una peroxidasa marcada con estreptavidina y un reactivo cromogenico. Entre los fluoroforos adecuados para la utilizacion en la presente invencion se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, un pigmento Alexa Fluor® (por ejemplo Alexa Fluor® 555), fluorescema, isotiocianato de fluorescema (FITC), verde Oregon Green™, rodamina, rojo Texas, isotiocianato de tetrarodamina (TRITC), CyDye™ fluor (por ejemplo Cy2, Cy3, Cy5), y similares. El marcaje estreptavidina puede acoplarse directa o indirectamente con el fluoroforo o peroxidasa utilizando metodos bien conocidos de la tecnica. Entre los ejemplos no limitativos de reactivos cromogenicos adecuados para la utilizacion en la presente invencion se incluyen 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), 3,3'-diaminobencidina (DAB), acido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolm- 6-sulfonico) (ABTS), 4-cloro-1-naftol (4CN) y/o porfirinogeno.

En otro ejemplo de canalizacion de proximidad, la fraccion facilitadora es un fotosensibilizador y el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales es una molecula grande marcada con multiples haptenos que se encuentran protegidos con grupos protectores que evitan la union de los haptenos a una pareja de union espedfica (por ejemplo un ligando, anticuerpo, etc.). Por ejemplo, el miembro de la pareja de amplificacion de senales puede ser una molecula de dextrano marcada con moleculas protegidas de biotina, coumarina y/o fluorescema. Entre los grupos protectores adecuados se incluyen, aunque sin limitacion, los grupos fenoxi, analino, olefina, tioeter y selenoeter. Se describen fotosensibilizadores adicionales y moleculas de hapteno protegidas adecuadas para la

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utilizacion en ensayo de proximidad de la presente invencion, en la patente US n° 5.807.675. Al excitar con luz el fotosensibilizador se genera un agente oxidante (por ejemplo oxfgeno singlete). En el caso de que las moleculas de hapteno se encuentren dentro de la canalizacion por proximidad del fotosensibilizador, el oxfgeno singlete generado por el fotosensibilizador se canaliza y reacciona con tioeteres en los grupos protectores de los haptenos, rindiendo grupos carbonilo (cetonas o aldeddo) y acido sulffnico, liberando los grupos protectores de los haptenos. Los haptenos no protegidos en este caso se encuentran disponibles para unirse espedficamente al segundo miembro de la pareja de senalizacion de senales (por ejemplo una pareja de union espedfica que puede generar una senal detectable). Por ejemplo, en el caso de que el hapteno sea biotina, la pareja de union espedfica puede ser una estreptavidina marcada con enzima. Entre los enzimas ejemplares se incluyen fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, PRP, etc. Tras el lavado par eliminar los reactivos no unidos, la senal detectable puede generarse mediante la adicion de un sustrato detectable (por ejemplo fluorescente, quimioluminiscente, cromogenico, etc.) del enzima y detectarse utilizando metodos adecuados e instrumentacion conocida de la tecnica. Alternativamente, la senal detectable puede amplificarse utilizando la amplificacion de senales de tiramida y la tiramida activada detectarse directamente o detectarse tras la adicion de un reactivo de deteccion de senales tal como se ha indicado anteriormente.

En todavfa otro ejemplo de canalizacion por proximidad, la fraccion facilitadora es un fotosensibilizador y el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales es un complejo de enzima-inhibidor. El enzima e inhibidor (por ejemplo dextrano marcado con acido fosfonico) se unen entre sf con un conector cortable (por ejemplo tioeter). Al excitar el fotosensibilizador con luz, genera un agente oxidante (es decir, oxfgeno singlete). En el caso de que el complejo de enzima-inhibidor se encuentre dentro de la canalizacion por proximidad al fotosensibilizador, el oxfgeno singlete generado por el fotosensibilizador se canaliza y reacciona con el conector escindible, liberando el inhibidor del enzima, activando de esta manera el enzima. Se anade un sustrato enzimatico para generar una senal detectable, o alternativamente, se anade un reactivo de amplificacion para generar una senal amplificada.

En un ejemplo adicional de canalizacion por proximidad, la fraccion facilitadora es PRP, el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales es un hapteno protegido o un complejo de enzima-inhibidor tal como se ha indicado anteriormente, y los grupos protectores comprenden p-alcoxi-fenol. La adicion de fenilendiamina y H2O2 genera una fenilen-diimina reactivo que se canaliza al hapteno protegido o al complejo de enzima-inhibidor y reacciona con los grupos protectores p-alcoxi-fenol, rindiendo haptenos expuestos o un enzima reactivo. La senal amplificada se genera y se detecta tal como se ha indicado anteriormente (ver, por ejemplo, las patentes US 5.532.138 y n° 5.445.944).

Un protocolo ejemplar para llevar a cabo los ensayos de proximidad descritos en la presente memoria se proporciona en el Ejemplo 4.

En otra realizacion, la presente invencion proporciona kits para llevar a cabo los ensayos de proximidad descritos anteriormente, que comprenden: (a) una serie de dilucion de una pluralidad de anticuerpos de captura inmovilizados sobre un soporte solido, y (b) una pluralidad de anticuerpos de deteccion (por ejemplo anticuerpos independientes del estado de activacion y anticuerpos dependientes del estado de activacion). En algunos casos, los kits puede contener ademas instrucciones de metodos de utilizacion del kit para la deteccion de los estados de activacion de una pluralidad de moleculas de transduccion de senales de celulas circulantes procedentes de un tumor solido. Los kits pueden contener ademas cualquiera de los reactivos adicionales indicados anteriormente con respecto a la realizacion de los metodos espedficos de la presente invencion, tales como, por ejemplo, primer y segundo miembros de la pareja de amplificacion de senales, reactivos de amplificacion de senales de tiramida, sustratos para la fraccion facilitadora, tampones de lavado, etc.

VIII. Produccion de anticuerpos

La generacion y seleccion de anticuerpos no disponibles comercialmente todavfa, para el analisis de los estados de activacion de moleculas de transduccion de senales en celulas tumorales tales como celulas circulantes raras segun la presente invencion puede llevarse a cabo de varias maneras. Por ejemplo, una manera es expresar y/o purificar un polipeptido de interes (es decir, un antfgeno) utilizando metodos de expresion y purificacion de protemas conocidos de la tecnica, mientras que otra manera es sintetizar el polipeptido de interes utilizando metodos de smtesis peptfdica en fase solida conocidos de la tecnica. Ver, por ejemplo, Guide to Protein Purification, Murray P. Deutcher, editor, Meth. Enzymol. 182, 1990; Solid Phase Peptide Synthesis, Greg B. Fields, editor, Meth. Enzymol. 289, 1997; Kiso et al., Chem. Pharm. Bull. 38:1192-99, 1990; Mostafavi et al., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids 1:255-60, 1995, y Fujiwara et al., Chem. Pharm. Bull. 44:1326-31, 1996. A continuacion, el polipeptido purificado o sintetizado puede inyectarse, por ejemplo en ratones o conejos, para generar anticuerpos policlonales o monoclonales. El experto en la materia reconocera que se encuentran disponibles muchos procedimientos para la produccion de anticuerpos, por ejemplo tal como se describe en Antibodies, A Laboratory Manual, HarBajo y Lane, editores, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988. El experto en la materia apreciara ademas que tambien pueden prepararse fragmentos de union o fragmentos Fab que imitan los anticuerpos (por ejemplo que

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conservan las regiones de union funcionales), a partir de informacion genetica mediante diversos procedimientos. Ver, por ejemplo, Antibody Engineering: A Practical Approach, Borrebaeck, editor, Oxford University Press, Oxford, 1995; y Huse et al, J. Immunol., 149:3914-3920, 1992.

Ademas, numerosas publicaciones han informado de la utilizacion de la tecnolog^a de expresion fagica para producir y cribar bibliotecas de polipeptidos para la union a un antigeno diana seleccionado (ver, por ejemplo, Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382, 1990; Devlin et al., Science 249:404-406, 1990; Scott et al., Science 249:386-388, 1990, y Ladner et al., patente US n° 5.571.698). Un concepto basico de los metodos de expresion fagica es el establecimiento de una asociacion ffsica entre un polipeptido codificado por el ADN fagico y un antigeno diana. Esta asociacion ffsica es proporcionada por la partmula fagica, que expresa un polipeptido como parte de una capside que envuelve el genoma fagico codificante del polipeptido. El establecimiento de una asociacion ffsica entre los polipeptidos y su material genetico permite el cribado en masa simultaneo de un gran numero de fagos portadores de diferentes polipeptidos. Los fagos que expresan un polipeptido con afinidad para un antfgeno diana se unen al antfgeno diana y estos fagos son enriquecidos mediante cribado de afinidad para el antfgeno diana. La identidad de los polipeptidos expresados a partir de estos fagos puede determinarse a partir de los genomas respectivos. Utilizando dichos metodos, seguidamente puede sintetizarse en masa por medios convencionales (ver, por ejemplo, la patente US n° 6.057.098).

Los anticuerpos que se generan mediante estos metodos seguidamente pueden seleccionarse en primer lugar cribando para afinidad y especificidad con el polipeptido antigenico purificado de interes y, en caso necesario, comparando los resultados de afinidad y especificidad de los anticuerpos con los de otros polipeptidos antigenicos que se desea excluir de la union. El procedimiento de cribado puede incluir la inmovilizacion de los polipeptidos antigenicos purificados en pocillos separados de las placas de microtitulacion. La solucion que contiene un anticuerpo o grupo de anticuerpos potencial seguidamente se introduce en los pocillos de microtitulacion respectivos y se incuba durante aproximadamente 30 minutos a 2 horas. A continuacion, se lavan los pocillos de microtitulacion y se anade un anticuerpo secundario marcado (por ejemplo un anticuerpo antiraton conjugado con fosfatasa alcalina en el caso de que los anticuerpos cultivados sean anticuerpos de raton) a los pocillos y se incuba durante aproximadamente 30 minutos y despues se lava. Se anade sustrato a los pocillos y aparece una reaccion de color en los que se encuentra presente anticuerpo que reacciona contra el polipeptido antigenico inmovilizado.

Los anticuerpos identificados de esta manera seguidamente pueden analizarse en mayor detalle para su afinidad y especificidad. Durante el desarrollo de los inmunoensayos para una protema diana, la protema diana purificada actua como estandar a partir del que se evalua la sensibilidad y especificidad del inmunoensayo con los anticuerpos seleccionados. Debido a que la afinidad de union de los diversos anticuerpos es variable, por ejemplo determinadas combinaciones de anticuerpos pueden interferir entre sf estericamente, el rendimiento de ensayo del anticuerpo podna ser una medida mas importante que la afinidad y especificidad absolutas de ese anticuerpo.

El experto en la materia reconocera que pueden adoptarse muchos enfoques a la produccion de anticuerpos o fragmentos de union, asf como al cribado y seleccion para afinidad y especificidad de los diversos polipeptidos de interes, aunque estos enfoques no modifican el alcance de la presente invencion.

A. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales preferentemente se cultivan en animales mediante multiples inyecciones subcutaneas (s.c.) o intraperitoneales (i.p.) de un polipeptido de interes y un adyuvante. Puede resultar util conjugar el polipeptido de interes con una protema portadora que resulte inmunogenica en la especie que debe inmunizarse, tal como, por ejemplo, hemocianina de lapa americana, albumina serica, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja, utilizando un agente bifuncional o derivatizante. Entre los ejemplos no limitativos de agentes bifuncionales o derivatizantes se incluyen el ester de maleimidobenzoil-sulfosuccinimida (conjugacion mediante residuos de cistema), N-hidroxisuccinimida (conjugacion mediante residuos de lisina), glutaraldehudo, anhfdrido succmico, SOCh, y R-|N=C=NR, en el que R y R1 son grupos alquilo diferentes.

Los animales se inmunizan contra el polipeptido de interes o contra un conjugado o derivado inmunogenico del mismo mediante combinacion con, por ejemplo, 100 mg (conejos) o 5 mg (ratones) del antfgeno o conjugado con 3 volumenes de adyuvante completo de Freund y la inyeccion de la solucion intradermicamente en multiples sitios. Un mes despues, los animales reciben un refuerzo de aproximadamente 1/5 a 1/10 de la cantidad original de polipeptido o conjugado en coadyuvante incompleto de Freund mediante inyeccion subcutanea en multiples sitios. Siete a catorce dfas despues, se extraen muestras de sangre de los animales y se somete a ensayo el suero para el tttulo de anticuerpos. Los animales tfpicamente reciben un refuerzo hasta que el tftulo alcanza un nivel estable. Preferentemente el animal recibe un refuerzo de conjugado del mismo polipeptido, aunque puede utilizarse un conjugado con una protema inmunogenica diferentes y/o utilizar un reactivo de entrecruzamiento diferente. Tambien pueden prepararse conjugados en cultivo celular recombinante en forma de protemas de fusion. En determinados casos, pueden utilizarse agentes agregantes tales como alumina para intensificar la respuesta inmunologica.

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B. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales se obtienen generalmente a partir de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogenea, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la poblacion son identicos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden encontrarse presentes en cantidades reducidas. De esta manera, el modificador "monoclonal" caracteriza al anticuerpo como no formando una mezcla de anticuerpos discretos. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos monoclonales utilizando el metodo del hibridoma descrito por Kohler et al., Nature 256:495, 1975, o mediante cualquier metodo de ADN recombinante conocido de la tecnica (ver, por ejemplo, la patente US n° 4.816.567).

En el metodo del hibridoma, se inmuniza un raton u otro animal huesped apropiado (por ejemplo un hamster) tal como se ha indicado anteriormente para inducir los linfocitos que producen o que son capaces de producir los anticuerpos que se unen espedficamente al polipeptido de interes utilizado para la inmunizacion. Alternativamente, los linfocitos se inmunizan in vitro. A continuacion, los linfocitos inmunizados se fusionan con celulas de mieloma utilizando un agente de fusion adecuado, tal como polietilenglicol, para formar celulas de hibridoma (ver, por ejemplo, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, paginas 59-103 (1986)). Las celulas de hibridoma preparadas de esta manera se sembraron y cultivaron en un medio de cultivo adecuado que contema preferentemente una o mas sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las celulas de mieloma parental no fusionadas. Por ejemplo, en el caso de que las celulas de mieloma parental no presenten el enzima hipoxantina guanina fosforibosil-transferasa (HGPRT), el medio de cultivo de las celulas de hibridoma tfpicamente incluira hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), los cuales evitan el crecimiento de las celulas deficientes en HGPRT.

Las celulas de mieloma preferentes son aquellas que se fusionan eficientemente, dan soporte a una produccion estable de nivel elevado de anticuerpos por parte de las celulas productoras de anticuerpos seleccionadas y/o son sensibles a un medio tal como medio hAt. Entre los ejemplos de dichas lmeas celulares preferentes de mieloma para la produccion de anticuerpos monoclonales humanos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, lmeas de mieloma murino tales como las derivadas de los tumores de raton MOPC-21 y MPC-11 (disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, CA), SP-2 o celulas X63-Ag8-653 (disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, MD) y lmeas celulares de mieloma humano o de heteromieloma de raton-humano (ver, por ejemplo, Kozbor, J. Immunol. 133:3001, 1984) y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, paginas 51-63, 1987).

El medio de cultivo en el que las celulas de hibridoma crecen puede someterse a ensayo para la produccion de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipeptido de interes. Preferentemente, la especificidad de union de anticuerpos monoclonales producidos por celulas de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitacion o mediante un ensayo de union in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo de inmunosorcion ligada a enzima (ELISA). La afinidad de union de los anticuerpos monoclonales puede determinarse utilizando, por ejemplo, el analisis de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem. 107:220, 1980.

Tras identificar las celulas de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilucion limitante y se cultivan mediante metodos estandares (ver, por ejemplo, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, paginas 59-103 (1986)). Entre los medios de cultivo adecuados para este fin se incluyen, por ejemplo, medio D- MEM o medio RPMI-1640. Ademas, las celulas de hibridoma pueden cultivarse in vivo en forma de tumores ascites en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden separarse a partir del medio de cultivo, lfquido ascites o suero mediante procedimientos convencionales de purificacion de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, protema A-sefarosa, cromatograffa en hidroxilapatito, electroforesis en gel, dialisis o cromatograffa de afinidad.

El ADN codificante de los anticuerpos monoclonales puede aislarse y secuenciarse facilmente mediante procedimientos convencionales (por ejemplo mediante la utilizacion de sondas oligonucleotidas que sean capaces de unirse espedficamente a genes codificantes de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las celulas de hibridoma pueden servir como fuente preferente de dicho ADN. Tras el aislamiento, el ADN puede insertarse en vectores de expresion, que seguidamente se transfectan en celulas huesped, tales como celulas de E. coli, celulas COS de simio, celulas de ovario de hamster chino (CHO) o celulas de mieloma que de otra manera no producinan anticuerpos, para inducir la smtesis de anticuerpos monoclonales en las celulas huesped recombinantes. Ver, por ejemplo, Skerra et al., Curr. Opin. Immunol. 5:256-262, 1993; y Pluckthun, Immunol. Rev. 130:151-188, 1992. El ADN tambien puede modificarse, por ejemplo mediante la sustitucion de las secuencias codificantes de los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera en lugar de las secuencias murinas homologas (ver, por ejemplo, la patente US n° 4.816.567, y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851, 1984) o mediante union

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covalente a la secuencia codificante de inmunoglobulina de la totalidad o parte de la secuencia codificante de un polipeptido no inmunoglobulina.

En una realizacion adicional, pueden aislarse anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpo a partir de bibliotecas fagicas de anticuerpos generadas utilizando las tecnicas descritas en, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990; Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991, y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991. La produccion de anticuerpos monoclonales humanos de alta afinidad (orden de nM) mediante intercambio de cadenas se describe en Marks et al., BioTechnology 10:779-783, 1992. La utilizacion de la infeccion combinatorial y la recombinacion in vivo como estrategia para la construccion de bibliotecas fagicas de gran tamano se describe en Waterhouse et al., Nuc. Acids Res. 21:2265-2266, 1993. De esta manera, dichas tecnicas son alternativas viables a los metodos tradicionales de hibridoma de anticuerpo monoclonal para la generacion de anticuerpos monoclonales.

C. Anticuerpos humanizados

Los metodos para humanizar anticuerpos no humanos son conocidos de la tecnica. Preferentemente se introducen uno o mas residuos aminoacidos en un anticuerpo humanizado a partir de una fuente que es no humana. Estos residuos aminoacidos no humanos con frecuencia se denominan residuos "importados", que tfpicamente se obtienen de un dominio variable "importado". La humanizacion puede llevarse a cabo esencialmente mediante sustitucion de secuencias de region hipervariable de un anticuerpo no humano por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Ver, por ejemplo, Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323327, 1988, y Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quimericos (ver, por ejemplo, la patente US n° 4.816.567), en la que se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la practica, los anticuerpos humanizados son tfpicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de region hipervariable y posiblemente algunos residuos de region marco (FR) se sustituyen por residuos procedentes de sitios analogos de anticuerpos de roedor.

La eleccion de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que deben utilizarse en la preparacion de los anticuerpos humanizados indicados en la presente memoria es una consideracion importante para reducir la antigenicidad. Segun el metodo denominado "de ajuste optimo", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a la biblioteca completa de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana mas similar a la del roedor seguidamente se acepta como la region marco humana (FR) para el anticuerpo humanizado (ver, por ejemplo, Sims et al., J. Immunol. 151:2296, 1993; y Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901, 1987). Otro metodo utiliza una FR particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras y pesadas. Puede utilizarse la misma FR para varios anticuerpos humanizados diferentes (ver, por ejemplo, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285, 1992; y Presta et al., J. Immunol. 151:2623, 1993).

Tambien resulta importante que los anticuerpos se humanicen conservando la afinidad elevada para el antfgeno y otras propiedades biologicas favorables. Para conseguir este objetivo, pueden prepararse anticuerpos humanizados mediante un procedimiento de analisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina se encuentran normalmente disponibles y resultaran familiares al experto en la materia. Se encuentran disponibles programas informaticos que ilustran y muestran estructuras probables de conformacion tridimensional de secuencias candidatas de inmunoglobulina seleccionadas. La inspeccion de estas visualizaciones permite analizar el papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el analisis de residuos que influyen sobre la capacidad de la secuencia de region variable candidata para la union a su antfgeno. De esta manera, pueden seleccionarse y combinarse residuos de FR procedentes de secuencias del receptor e importadas, de manera que se consiga la caractenstica de anticuerpo deseada, tal como una afinidad incrementada para el antfgeno o antfgenos diana. En general, los residuos de la region hipervariable participan directa y espedficamente en influir sobre la union de antfgeno.

Se encuentran contempladas por la presente invencion diversas formas de anticuerpos humanizados. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fab. Alternativamente, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgA, IgG o IgM intacto.

D. Anticuerpos humanos

A modo de alternativa a la humanizacion pueden generarse anticuerpos humanos. En algunas realizaciones, pueden producirse animales transgenicos (por ejemplo ratones) que son capaces, tras la inmunizacion, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de produccion endogena de inmunoglobulinas. Por ejemplo, se ha descrito que la delecion homocigotica del gen de region de union (JH) de cadena pesada de anticuerpo en ratones quimericos y mutantes de lmea germinal resulta en la inhibicion total de la produccion

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endogena de anticuerpos. La transferencia de la matriz genica de inmunoglobulina de lmea germinal humana a dichos ratones mutantes de lmea germinal resultara en la produccion de anticuerpos humanos tras el reto antigenico. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551, 1993; Jakobovits et al., Nature 362:255-258, 1993; Bruggermann et al., Year in Immun. 7:33, 1993, y patentes US n° 5.591.669, n° 5.589.369 y n° 5.545.807.

Alternativamente, puede utilizarse la tecnologfa de expresion fagica (ver, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-553, 1990) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, utilizando repertorios genicos de dominio variable (V) de inmunoglobulina procedentes de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta tecnica, se clonan genes de dominio V de anticuerpo en el mismo marco de un gen de protema mayor o menor de cubierta de un bacteriofago filamentoso, tal como M13 o fd, y se expresan en forma de fragmentos de anticuerpo funcionales sobre la superficie de la partmula fagica. Debido a que la partmula filamentosa contiene una copia de ADN de cadena sencilla del genoma fagico, las selecciones basadas en las propiedades fucionales del anticuerpo tambien resultan en que la seleccion del gen codificante del anticuerpo muestre tambien estas propiedades. De esta manera, el fago imita algunas de las propiedades de la celula B. Puede llevarse a cabo la expresion fagica en una diversidad de formatos, tal como se describe en, por ejemplo, Johnson et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 3:564-571, 1993. Pueden utilizarse varias fuentes de segmentos genicos V para la expresion fagica. Ver, por ejemplo, Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991. Puede construirse un repertorio de genes V procedente de donantes humanos no humanizados y pueden aislarse anticuerpos contra un abanico diversos de antfgenos (incluyendo autoantfgenos), siguiendo esencialmente las tecnicas descritas en Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991; Griffith et al., EMBO J. 12:725-734, 1993, y las patentes US n° 5.565.332 y n° 5.573.905.

En determinados casos, los anticuerpos humanos pueden ser generados por celulas B activadas in vitro, tal como se describe en, por ejemplo, las patentes US n° 5.567.610 y n° 5.229.275.

E. Fragmentos de anticuerpo

Se han desarrollado diversas tecnicas para la produccion de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, dichos fragmentos se han derivado mediante digestion proteolftica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Meth. 24:107-117, 1992, y Brennan et al., Science 229:81, 1985). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente utilizando celulas huesped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse a partir de las bibliotecas fagicas de anticuerpos comentadas anteriormente. Alternativamente, pueden recuperarse fragmentos Fab'-SH directamente a partir de celulas de E. coli y acoplarse qmmicamente para formar fragmentos F(ab')2 (ver, por ejemplo, Carter et al., BioTechnology 10:163167, 1992). Segun otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente a partir de un cultivo de celulas huesped recombinantes. Otras tecnicas para la produccion de fragmentos de anticuerpo resultaran evidentes para el experto en la materia. En otras realizaciones, el anticuerpo de eleccion es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv). Ver, por ejemplo, la solicitud de patente PCT publicacion n° WO 93/16185, y las patentes US n° 5.571.894 y n° 5.587.458. El fragmento de anticuerpo tambien puede ser un anticuerpo lineal tal como se describe en, por ejemplo, la patente US n° 5.641.870. Estos fragmentos lineales de anticuerpo pueden ser monoespedficos o biespedficos.

F. Anticuerpos biespedficos

Los anticuerpos biespedficos son anticuerpos que presentan especificidades de union para por lo menos dos epttopos diferentes. Los anticuerpos biespedficos ejemplares pueden unirse a dos epttopos diferentes del mismo polipeptido de interes. Otros anticuerpos biespedficos pueden combinar un sitio de union para el polipeptido de interes con uno o mas sitios de union para uno o mas antfgenos adicionales. Pueden prepararse anticuerpos biespedficos en forma de anticuerpos de longitud completa o de fragmentos de anticuerpo (por ejemplo anticuerpos biespedficos F(ab')2).

Los metodos para preparar anticuerpos biespedficos son conocidos de la tecnica. La produccion tradicional de anticuerpos biespedficos de longitud completa se basa en la coexpresion de dos parejas de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en la que las dos cadenas presentan especificidades diferentes (ver, por ejemplo, Millstein et al., Nature 305:537-539, 1983). Debido a la coleccion aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moleculas de anticuerpo diferentes, de las que unicamente una presenta la estructura biespedfica correcta. La purificacion de la molecula correcta habitualmente se lleva a cabo mediante cromatograffa de afinidad. Se dan a conocer procedimientos similares en la solicitud de patente PCT publicacion n° WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659, 1991.

Segun otro enfoque, se fusionan dominios variables de anticuerpo con las especificidades de union deseadas (sitios de combinacion de anticuerpo-antfgeno) con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusion

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preferentemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de las regiones CH2 y CH3 de bisagra. Resulta preferente que la primera region constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la union de cadena ligera se encuentre presente en por lo menos una de las fusiones. El ADN codificante de las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresion separados y se cotransfectan en un organismo huesped adecuado. Lo anterior proporciona una mayor flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptfdicos en realizaciones en el caso de que proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptfdicas utilizadas en la construccion proporcionen los rendimientos optimos. Sin embargo, resulta posible insertar las secuencias codificantes de dos o de las tres cadenas polipeptfdicas en un solo vector de expresion en el caso de que la expresion de por lo menos dos cadenas polipeptfdicas en proporciones iguales resulte en rendimientos elevados o en el caso de que las proporciones no resulten particularmente significativas.

En una realizacion preferente de dicho enfoque, los anticuerpos biespedficos estan compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina hnbrida con una primera especificidad de union en un brazo y una pareja de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina tnbrida (que proporciona una segunda especificidad de union) en el otro brazo. Esta estructura asimetrica facilita la separacion del compuesto biespedfico deseado respecto de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en unicamente una mitad de la molecula biespedfica proporciona un modo facil de separacion. Ver, por ejemplo, la solicitud de patente PCT publicacion n° WO 94/04690, y Suresh et al., Meth. Enzymol. 121:210, 1986.

Segun otro enfoque descrito en la patente US n° 5.731.168, la interfaz entre una pareja de moleculas de anticuerpo puede manipularse para maximizar el porcentaje de heterodfmeros que se recuperan del cultivo de celulas recombinantes. La interfaz preferente comprende por lo menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este metodo, se sustituye una o mas cadenas laterales pequenas de aminoacidos de la interfaz de la primera molecula de anticuerpo por cadenas laterales de mayor tamano (por ejemplo de tirosina o de triptofano). Se crean "cavidades" compensadoras de tamano igual o similar a la cadena o cadenas laterales grandes en la interfaz de la segunda molecula de anticuerpo mediante la sustitucion de cadenas laterales grandes de aminoacidos por otras mas pequenas (por ejemplo de alanina o de treonina). Lo anterior proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento de heterodfmero sobre otros productos finales no deseados, tales como hodfmeros.

Entre los anticuerpos biespedficos se incluyen anticuerpos entrecruzados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina y el otro, a biotina. Pueden prepararse anticuerpos heteroconjugados utilizando cualquier metodo de entrecruzamiento conveniente. Los agentes y tecnicas de entrecruzamiento adecuados son bien conocidos de la tecnica y se dan a conocer en, por ejemplo, la patente US n° 4.676.980.

Tambien son conocidos de la tecnica procedimientos adecuados para generar anticuerpos biespedficos a partir de fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos biespedficos utilizando el enlace qmmico. En determinados casos, pueden generarse anticuerpos biespedficos mediante un procedimiento en el que se cortan proteolfticamente anticuerpos intactos para generar fragmentos F(ab')2 (ver, por ejemplo, Brennan et al., Science 229:81, 1985). Estos fragmentos se reducen en presencia del agente acomplejante ditiol arsenito sodico para estabilizar los ditioles vecinos y evitar la formacion de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados seguidamente se convierten en derivados tionitrobenzoato (TNB). A continuacion, uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte en el Fab'-tiol mediante reduccion con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespedfico.

En algunas realizaciones, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente a partir de E. coli y acoplarse qmmicamente para formar anticuerpos biespedficos. Por ejemplo, puede producirse una molecula de anticuerpo biespedfico F(ab')2 totalmente humanizada mediante los metodos descritos en Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217225 (1992). Cada fragmento Fab' se secreto separadamente de E. coli y se sometio a acoplamiento qmmico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespedfico.

Tambien se han descrito diversas tecnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespedfico directamente a partir de un cultivo de celulas recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespedficos utilizando cremalleras de leucinas. Ver, por ejemplo, Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553, 1992. Los peptidos de cremallera de leucinas de las protemas Fos y Jun se unen a las partes Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusion genica. Los homodfmeros de anticuerpo se redujeron en la region bisagra formando monomeros y despues se reoxidaron para formar los heterodfmeros de anticuerpo. Este metodo tambien puede utilizarse para la produccion de homodfmeros de anticuerpo. La tecnologfa de "diacuerpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993, ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpo biespedfico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un conector que es excesivamente corto para permitir el apareamiento entre

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los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, se fuerza que los dominios VH y VL de un fragmento se emparejen con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando de esta manera dos sitios de union a anffgeno. Otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespedfico mediante la utilizacion de dfmeros de Fv de cadena sencilla (scFv) se describe en Gruber et al., J. Immunol. 152:5368, 1994.

Los anticuerpos con mas de dos valencias tambien se encuentran contemplados. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespedficos. Ver, por ejemplo, Tutt et al., J. Immunol. 147:60, 1991.

G. Purificacion de anticuerpos

Al utilizar tecnicas recombinantes, pueden producirse anticuerpos en el interior de una celula huesped aislada, en el espacio periplasmatico de una celula huesped, o secretarse directamente de una celula huesped al medio. En el caso de que el anticuerpo se produzca intracelularmente, en primer lugar se eliminan los residuos particulados, por ejemplo mediante centrifugacion o ultrafiltracion. Carter et al., BioTech. 10:163-167, 1992, describen un procedimiento para aislar anticuerpos que son secretados al espacio periplasmico de E. coli. Brevemente, se descongela pasta celular en presencia de acetato sodico (pH 3,5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. Los residuos celulares pueden eliminarse mediante centrifugacion. En el caso de que el anticuerpo se secrete al medio, los sobrenadantes de estos sistemas de expresion generalmente se concentran utilizando un filtro de concentracion de protemas disponible comercialmente, por ejemplo una unidad de ultrafiltacion Amicon o Millipore Pellicon. Puede incluirse un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriormente indicadas, con el fin de inhibir la proteolisis y pueden incluirse antibioticos para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios.

La composicion de anticuerpos preparada a partir de celulas puede purificarse utilizando, por ejemplo, cromatograffa en hidroxilapatito, electroforesis en gel, dialisis y cromatograffa de afinidad. La idoneidad de la protema A como ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que se encuentre presente en el anticuerpo. La protema A puede utilizarse para purificar anticuerpos que esten basados en las cadenas pesadas y1, y2 o y4 humanas (ver, por ejemplo, Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13, 1983). Se recomienda protema G para todos los isotipos de raton y para y3 humano (ver, por ejemplo, Guss et al., EMBO J. 5:1567-1575, 1986). La matriz a la que se une el ligando de afinidad con la mayor frecuencia es agarosa, aunque se encuentran disponibles otras matrices. Las matrices mecanicamente estables tales como el vidrio de poro controlado o el poli(estirendivinil)benceno permiten caudales mas rapidos y tiempos de procesamiento mas cortos que los conseguidos con la agarosa. En el caso de que el anticuerpo comprenda un dominio CH3, para la purificacion resulta util la resina Bakerbond ABXTM (J.T. Baker, Phillipsburg, N.J.). Se encuentran disponibles otras tecnicas para la purificacion de protemas, tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio ionico, la precipitacion con etanol, la HPLc de fase inversa, la cromatograffa en sflice, la cromatograffa en heparina-SEPHAROSE™, la cromatograffa en una resina de intercambio anionico o cationico (tal como una columna de acido poliaspartico), el cromatoenfoque, SDS-PAGE y la precipitacion con sulfato amonico, dependiendo del anticuerpo que debe recuperarse.

Tras cualquier etapa o etapas preliminares de purificacion, la mezcla que comprende el anticuerpo de interes y contaminantes puede someterse a cromatograffa de interaccion hidrofobica de pH bajo utilizando un tampon de elucion a un pH de entre aproximadamente 2,5 y 4,5, preferentemente llevada a cabo a concentraciones salinas bajas (por ejemplo de entre aproximadamente 0 y 0,25 M).

El experto en la materia apreciara que cualquier molecula de union que presente una funcion similar a la de un anticuerpo, por ejemplo una molecula de union o pareja de union que sea espedfica para uno o mas analitos de interes en una muestra, tambien puede utilizarse en los metodos y composiciones de la presente invencion. Entre los ejemplos de moleculas de tipo anticuerpo adecuadas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, anticuerpos de dominio, unicuerpos, nanocuerpos, protemas reactivas con anffgenos de tiburon, avfmeros, adnectinas, anticalms, ligandos de afinidad, filomeros, aptameros, aficuerpos, trinectinas, y similares.

IX. Metodos de administracion

Segun los metodos de la presente invencion, los farmacos anticancer descritos en la presente memoria se administran en un sujeto mediante cualquier medio conveniente conocido de la tecnia. Los metodos de la presente invencion pueden utilizarse para seleccionar un farmaco anticancer o combinacion de farmacos anticancer adecuado para el tratamiento de un tumor (por ejemplo un tumor mamario) en un sujeto. Los metodos de la invencion tambien pueden utilizarse para identificar la respuesta de un tumor (por ejemplo un tumor mamario) en un sujeto al tratamiento con un farmaco anticancer o con una combinacion de farmacos anticancer. Ademas, los metodos de la invencion pueden utilizarse para predecir la respuesta de un sujeto que presenta un tumor (por ejemplo un tumor mamario) al tratamiento con un farmaco anticancer o con una combinacion de farmacos anticancer. El experto en la materia apreciara que los farmacos anticancer indicados en la presente memoria pueden administrarse solos o como

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parte de un enfoque terapeutico combinado con quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, inmunoterapia y/o cirugfa convencionales.

En determinadas realizaciones, el farmaco anticancer comprende un agente antisenalizacion (es decir, un farmaco citostatico), tal como un anticuerpo monoclonal o un inhibidor de tirosina quinasa, un agente antiproliferacion, un agente quimioterapeutico (es decir, un farmaco citotoxico), un agente terapeutico hormonal, un agente radioterapeutico, una vacuna y/o cualquier otro compuesto con la capacidad de reducir o anular el crecimiento incontrolado de celulas aberrantes tales como celulas cancerosas. En algunas realizaciones, el sujeto se trata con uno o mas agentes antisenalizacion, agentes antiproliferativos y/o agentes terapeuticos hormonales en combinacion con por lo menos un agente quimioterapeutico. Se han descrito anteriormente anticuerpos monoclonales, inhibidores de tirosina quinasa, agentes antiproliferativos, agentes quimioterapeuticos, agentes terapeuticos hormonales, agentes radioterapeuticos y vacunas ejemplares.

En algunas realizaciones, los farmacos anticancer indicados en la presente memoria pueden coadministrarse con agentes inmunoterapeuticos convencionales, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, inmunoestimuladores (por ejemplo bacilo Calmette-Guerin (BCG), levamisol, interleuquina-2, alfa-interferon, etc.), inmunotoxinas (por ejemplo conjugado de anticuerpo monoclonal anti-CD33-caliqueamicina, conjugado de anticuerpo monoclonal anti-CD22- exotoxina de Pseudomonas, etc.) y radioinmunoterapia (por ejemplo anticuerpo monoclonal anti-CD20 conjugado con 111In, 90Y o 131I, etc.).

Los farmacos anticancer pueden administrarse con un excipiente farmaceutico adecuado segun resulte necesario y la administracion puede llevarse a cabo mediante cualquiera de los modos de administracion aceptados. De esta manera, la administracion puede ser, por ejemplo, oral, bucal, sublingual, gingival, palatal, intravenosa, topica, subcutanea, transcutanea, transdermica, intramuscular, intraarticular, parenteral, intraarteriola, intradermica, intraventricular, intracraneal, intraperitoneal, intravesical, intratecal, intralesional, intranasal, rectal, vaginal o mediante inhalacion. El termino "coadministrarse" se refiere a que un farmaco anticancer se administra simultaneamente, justo antes o justo despues de la administracion de un segundo farmaco (por ejemplo otro farmaco anticancer, un farmaco util para reducir los efectos secundarios asociados a la terapia con farmaco anticancer, un agente radioterapeutico, un agente terapeutico hormonal, un agente inmunoterapeutico, etc.).

Una cantidad terapeuticamente efectiva de un farmaco anticancer puede administrarse repetidamente, por ejemplo por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o mas veces, o la dosis puede administrarse mediante infusion continua. La dosis puede adoptar la forma de solido, semisolido, polvos liofilizados o formas de dosificacion lfquida tales como, por ejemplo, tabletas, pfldoras, pellets, capsulas, polvos, soluciones, suspensiones, emulsiones, supositorios, enemas de retencion, cremas, pomadas, lociones, geles, aerosoles, espumas o similares, preferentemente en formas de dosificacion unitaria adecuadas para la administracion simple de dosis exactas.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "forma de dosificacion unitaria" se refiere a unidades ffsicamente discretas que resultan adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y otros mairnferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de un farmaco anticancer calculado para producir el inicio, tolerabilidad y/o efectos terapeuticos deseados, y/o efectos terapeuticos, asociada a un excipiente farmaceutico adecuado (por ejemplo una ampolla). Ademas, pueden prepararse formas de dosificacion concentrada a partir de la que pueden producirse las formas de dosificacion unitaria mas diluidas. De esta manera, las formas de dosificacion mas concentradas contendran sustancialmente mas de, por ejemplo, por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas veces la cantidad del farmaco anticancer.

Los metodos para preparar dichas formas de dosificacion son conocidos por el experto en la materia (ver, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a edicion, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990). Entre las formas de dosificacion tfpicamente se incluyen un portador o excipiente farmaceutico convencional y adicionalmente puede incluir otros agentes medicinales, portadores, adyuvantes, diluyentes, intensificadores de la permeacion en tejidos, solubilizadores y similares. Pueden adaptarse excipientes apropiados a la forma de dosificacion particular y a la via de administracion mediante metodos bien conocidos de la tecnica (ver, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra).

Entre los ejemplos de excipientes adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma acacia, fosfato de calcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, solucion salina, jarabe, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y acidos poliacnlicos, tales como carbopoles, por ejemplo Carbopol 941, Carbopol 980, Carbopol 981, etc. Entre las formas de dosificacion pueden incluirse adicionalmente agentes lubricantes tales como talco, estearato de magnesio y aceite mineral; agentes humectantes; agentes emulsionantes; agentes de suspension; agentes conservantes tales como metilhidroxibenzoatos, etilhidroxibenzoatos y propilhidroxibenzoatos (es decir, los parabenos); agentes de ajuste del pH tales como acidos y bases inorganicos y organicos; agentes

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edulcorantes y agentes saborizantes. Las formas de dosificacion pueden comprender ademas perlas de poKmero biodegradable, dextrano y complejos de inclusion con ciclodextrina.

Para la administracion oral, la dosis terapeuticamente efectiva puede encontrarse en forma de tabletas, capsulas, emulsiones, suspensiones, soluciones, jarabes, sprays, pastillas, polvos y formulaciones de liberacion sostenida. Entre los excipientes adecuados para la administracion oral se incluyen grados farmaceuticos de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, talco, celulosa, glucosa, gelatina, sacarosa, carbonato de magnesio y similares.

En algunas realizaciones, la dosis terapeuticamente eficaz adopta la forma de una pfldora, tableta o capsula, y de esta manera, la forma de dosificacion puede contener, conjuntamente con un farmaco anticancer, cualquiera de los siguientes: un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato dicalcico y similares; un desintegrante tal como almidon o derivados del mismo; un lubricante tal como estearato de magnesio y similares; y un ligante tal como almidon, goma acacia, polivinilpirrolidona, gelatina, celulosa y derivados de los mismos. Tambien puede formularse un farmaco anticancer en forma de supositorio dispuesto, por ejemplo, en un portador de polietilenglicol (PEG).

Las formas de dosificacion lfquidas pueden prepararse mediante disolucion o dispersion de un farmaco anticancer y opcionalmente uno o mas adyuvantes farmaceuticamente aceptables en un portador tal como, por ejemplo, solucion salina acuosa (por ejemplo cloruro sodico al 0,9% p/v), dextrosa acuosa, glicerol, etanol y similares, para formar una solucion o suspension, por ejemplo, para la administracion oral, topica o intravenosa. Tambien puede formularse un farmaco anticancer en un enema de retencion.

Para la administracion topica, la dosis terapeuticamente eficaz puede encontrarse en forma de emulsiones, lociones, geles, espumas, cremas, gelatinas, soluciones, suspensiones, pomadas y parches transdermicos. Para la administracion mediante inhalacion, puede administrarse un farmaco anticancer en forma de polvos secos o en forma lfquida mediante un nebulizador. Para la administracion parenteral, la dosis terapeuticamente efectiva puede encontrarse en forma de soluciones inyectables esteriles y de polvos empaquetados esteriles. Preferentemente, las soluciones inyectables se formulan a un pH de entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 7,5.

La dosis terapeuticamente eficaz tambien puede proporcionarse en una forma liofilizada. Dichas formas de dosificacion pueden incluir un tampon, por ejemplo bicarbonato, para la reconstitucion previa a la administracion, o el tampon puede incluirse en la forma de dosificacion liofilizada para la reconstitucion con, por ejemplo, agua. La forma de dosificacion liofilizada puede comprender ademas un vasoconstrictor adecuado, por ejemplo epinefrina. La forma de dosificacion liofilizada puede proporcionarse en una jeringa, opcionalmente empaquetada en combinacion con el tampon para la reconstitucion, de manera que la forma de dosificacion reconstituida pueda administrarse inmediatamente en un sujeto.

Tambien puede realizarse un seguimiento del sujeto a intervalos de tiempo periodicos con el fin de evaluar la eficacia de un regimen terapeutico determinado. Por ejemplo, pueden cambiar los estados de activacion de determinadas moleculas de transduccion de senalees basandose en el efecto terapeutico del tratamiento con uno o mas de los farmacos anticancer indicados en la presente memoria. Puede realizarse un seguimiento del sujeto con el fin de evaluar la respuesta y comprender los efectos de determinados farmacos o tratamientos en un enfoque personalizado. Ademas, los sujetos que responden inicialmente a un farmaco anticancer o combinacion de farmacos anticancer espedfico pueden hacerse refractarios al farmaco o combinacion de farmacos, lo que indica que estos sujetos han desarrollado una resistencia adquirida a farmaco. En estos sujetos se puede interrumpir la terapia a la que estan sometidos y prescribirse un tratamiento alternativo segun los metodos de la presente invencion.

En determinados aspectos, los metodos descritos en la presente memoria pueden utilizarse conjuntamente con paneles de marcadores de expresion genica que predicen la probabilidad de pronostico y/o recurrencia de cancer de mama en diversas poblaciones de mujeres con, por ejemplo, enfermedad sin afectacion ganglionar. Estos paneles genicos pueden resultar utiles para identificar mujeres que es improbable que experimentan recurrencia y, de esta manera, que es improbable que se beneficien de la quimioterapia adyuvante. Los paneles de expresion pueden utilizarse para identificar mujeres que pueden evitar con seguridad la quimioterapia adyuvante, sin afectar negativamente los resultados de periodo sin enfermedad y de supervivencia global. Entre los sistemas adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, Oncotype DXTM, que es un panel de 21 genes de Genomic Health, Inc.; MammaPrint®, que es un panel de 70 genes de Agendia, y un panel de 76 genes de Veridex.

Ademas, en determinados otros aspectos, los metodos descritos en la presente memoria pueden utilizarse conjuntamente con paneles de marcadores de expresion genica que identifican los tumores originales para canceres de tumor primario desconocido (TPD). Estos paneles genicos pueden resultar utiles para identificar mujeres con cancer metastasico que se beneficianan de una terapia consistente con la administrada en mujeres diagnosticadas inicialmente con cancer de mama. Entre los sistemas adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el ensayo Aviara CancerTYPE ID, un ensayo de expresion basado en RT-PCR que mide 92 genes para identificar el sitio

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primario de origen de 39 tipos tumorales, y el ensayo Pathwork®Tissue of Origin Test, que mide la exprsion de mas de 1.600 genes en una micromatriz y compara la "firma" de expresion genica de un tumor con la de 15 tipos de tejido conocidos.

X. Ejemplos

Los ejemplos siguientes se proporcionan a fin de ilustrar, aunque sin limitacion, la invencion reivindicada.

Ejemplo 1. Aislamiento, estimulacion y lisis de celulas circulantes.

Las celulas circulantes de un tumor solido comprenden celulas que han metastizado o micrometastizado a partir de un tumor solido y entre ellas se incluyen las celulas tumorales circulantes (CTC), las celulas madre cancerosas (CMC) y/o las celulas que migran al tumor (por ejemplo las celulas progenitoras endoteliales circulantes (CPEC), las celulas endoteliales circulantes (CEC), las celulas mieloides proangiogenicas circulantes, las celulas dendnticas circulantes, etc.). Las muestras de paciente que contienen celulas circulantes pueden obtenerse de cualquier lfquido biologico accesible (por ejemplo sangre completa, suero, plasma, lfquido de lavado ductal, lfquido aspirado del pezon, linfa, orina, saliva, lfquido aspirado con aguja fina, etc.). Las celulas circulantes pueden aislarse a partir de una muestra de un paciente utilizando uno o mas metodos de separacion, incluyendo, por ejemplo, la separacion inmunomagnetica (ver, por ejemplo, Racila et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4589-4594, 1998; Bilkenroth et al., Int. J. Cancer 92:577-582, 2001), el sistema CellTracks® de Immunicon (Huntingdon Valley, PA), la separacion de microfluidos (ver, por ejemplo, Mohamed et al., IEEE Trans. Nanobiosci. 3:251-256, 2004; Lin et al., n° de resumen 5147, 97th aAcR Annual Meeting, Washington, D.C., 2006), FACS (ver, por ejemplo, Mancuso et al., Blood 97:36583661, 2001), la centrifugacion en gradiente de densidad (ver, por ejemplo, Baker et al., Clin. Cancer-Res. 13:48654871,2003) y los metodos de remocion (ver, por ejemplo, Meye et al., Int. J. Oncol. 21:521-530, 2002).

Aislamiento manual de las CTC:

Separacion inmunomagnetica de CTC. Aislamiento manual seguido de ensayo de activacion:

1) Se utilizan perlas magneticas (Dynal M450, Dynal AS, Oslo, Noruega) que han sido previamente conjugadas con un anticuerpo monoclonal anti-EpCAM (Kordia Life Sciences, Leiden, Pafses Bajos). Alternativamente pueden utilizarse anticuerpos policlonales o mezclas de anticuerpos monoclonales.

2) Inmediatamente antes de la utilizacion, las perlas Dynabeads prerrecubiertas se lavan una vez en un volumen igual de PBS con BSA al 0,01%.

3) Se anaden 25 ml de las Dynabeads prerrecubiertas a 1 ml de la muestra.

4) La mezcla se incuba durante 20 minutos a una temperatura de entre 2°C y 8°C con balanceo y rotacion suaves.

5) El tubo se introduce en el separador magnetico (iman MPL-1) durante 2 minutos.

6) Se descarta el sobrenadante y las celulas unidas a las perlas se lavan tres veces mediante resuspension en PBS con BSA al 0,01% seguido de separacion magnetica.

7) La muestra se resuspende en 100 ml de tampon de estimulacion.

Preparacion de muestras:

1) Se introduce sangre periferica de sujetos humanos en un tubo siliconizado que contiene EDTA 1 mg/ml. Los primeros 3 a 5 ml se descartan para evitar la contaminacion con celulas epiteliales liberadas de la vena punzada.

2) se diluye 1 ml de sangre completa 1:3 con NaCl al 0,9% previamente a la utilizacion.

Preparacion de control:

1) Se preparan controles de lmea celular mediante la a celulas HL-60.

2) Se preparan controles de lmea celular mediante la a sangre completa procedente de donantes sanos.

Aislamiento manual de CEC y CPEC:

A tftulo de ejemplo no limitativo, las CEC y CPEC viables pueden aislarse utilizando la tecnica de aislamiento/enriquecimiento inmunomagnetico descrita en Beerepoot et al., Ann. Oncology 15:139-145, 2004. Brevemente, se incuba sangre periferica con perlas magneticas (Dynal M450 IgG-i) que ha sido conjugada previamente con un anticuerpo monoclonal anti-CD146 (Kordia Life Sciences). Este anticuerpo reconoce todos los linajes de las celulas endoteliales pero no las celulas hematopoyeticas o epiteliales, en la sangre periferica (George et al., J. Immunol. Meth. 139:65-75, 1991). La seleccion negativa de las celulas hematopoyeticas y epiteliales puede utilizarse previamente a la seleccion positiva con perlas magneticas conjugadas con anticuerpos apropiados (por ejemplo perlas Dynal-CD45 para la remocion de leucocitos; perlas Dynal-CD14 para la remocion de monocitos,

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Dynal-EpCAM para la remocion de celulas epiteliales (Invitrogen, Carlsbad, CA)). En el presente ejemplo unicamente se utilizo la seleccion positiva.

Separacion inmunomagnetica de las CEC y CPEC. Aislamiento manual seguido de ensayo de activacion:

1) Se utilizan perlas magneticas (Dynal M450) que han sido previamente conjugadas con un anticuerpo monoclonal anti-CD146 (Kordia Life Sciences).

2) Inmediatamente antes de la utilizacion, las perlas Dynabeads prerrecubiertas se lavan una vez en un volumen igual de PBS con BSA al 0,01%.

3) Se anaden 25 ml de las Dynabeads prerrecubiertas a 1 ml de la muestra.

4) La mezcla se incuba durante 20 minutos a una temperatura de entre 2°C y 8°C con balanceo y rotacion suaves.

5) El tubo se introduce en el separador magnetico (iman MPL-1) durante 2 minutos.

6) Se descarta el sobrenadante y las celulas unidas a las perlas se lavan tres veces mediante resuspension en PBS con BSA al 0,01% seguido de separacion magnetica. 7) La muestra se resuspende en 100 ml de tampon de estimulacion.

Preparacion de muestras:

1) Se introduce sangre periferica de sujetos humanos en un tubo siliconizado que contiene EDTA 1 mg/ml. Los primeros 3 a 5 ml se descartan para evitar la contaminacion con celulas endoteliales liberadas de la vena punzada.

2) se diluye 1 ml de sangre completa 1:3 con NaCl al 0,9% previamente a la utilizacion.

Preparacion de control:

1) Se preparan controles de lmea celular mediante la adicion de pulsos humana (HUVEC) a celulas HL-60.

2) Se preparan controles de lmea celular mediante la adicion de pulsos humana (HUVEC) a sangre completa donada por individuos sanos.

Aislamiento manual de CPEC (sin CEC):

Las CPEC son un subtipo circulante de celulas progenitoras derivadas de la medula osea que presentan la capacidad de diferenciarse en celulas endoteliales maduras en respuesta a diversos factores de crecimiento angiogenico. Las CPEC pueden aislarse mediante seleccion con anticuerpos que reconocen el marcador de superficie CD34. CD133 es un marcador de superficie que diferencia las celulas progenitoras endoteliales inmaduras (CPE) o las celulas madre hematopoyeticas primitivas (CMH) de las CPEC. Se han descrito diversos procedimientos de aislamiento de las CPEC a partir de diferentes fuentes mediante cultivo en adherencia o microperlas magneticas. En el presente ejemplo, se utilizo un protocolo modificado a partir del descrito en Asahara et al., Science 275:964967, 1997.

Separacion inmunomagnetica de CPEC. Aislamiento manual seguido de ensayo de activacion:

1) Se utilizan perlas magneticas (Dynal M450 CD34). Estas perlas se encuentran recubiertas con un anticuerpo monoclonal espedfico para el antfgeno de superficie CD34.

2) Inmediatamente antes de la utilizacion, las perlas Dynabeads prerrecubiertas se lavan una vez en un volumen igual de PBS con BSA al 0,01%.

3) Se anaden 25 ml de las Dynabeads prerrecubiertas a 1 ml de la muestra.

4) La mezcla se incuba durante 20 minutos a una temperatura de entre 2°C y 8°C con balanceo y rotacion suaves.

5) El tubo se introduce en el separador magnetico (iman MPL-1) durante 2 minutos.

6) Se descarta el sobrenadante y las celulas unidas a las perlas se lavan tres veces mediante resuspension en PBS con BSA al 0,01% seguido de separacion magnetica.

7) La muestra se resuspende en 100 ml de tampon de estimulacion.

Preparacion de muestras:

1) Se introduce sangre periferica de sujetos humanos en un tubo siliconizado que contiene EDTA 1 mg/ml. Los primeros 3 a 5 ml se descartan para evitar la contaminacion con celulas epiteliales liberadas de la vena punzada.

2) Se diluyen 10 ml de sangre 1:1 con una solucion salina equilibrada.

3) Se anade una capa de 4 ml de sangre diluida sobre 3 ml de Ficoll-Paque en tubos de 10 ml.

4) Los tubos se centrifugan a 400xg durante 30 a 40 minutos a una temperatura de entre 18°C y 20°C.

5) Se separa mediante aspiracion la capa superior, que contiene plasma y plaquetas, utilizando una pipeta Pasteur esteril, dejando la capa de celulas mononucleares intacta en la interfaz.

6) Las celulas mononucleares se transfieren a un tubo de centnfuga esteril utilizando una pipeta esteril.

7) Se anaden 6 ml de solucion salina equilibrada y las celulas se resuspenden suavemente.

8) La mezcla se centrifuga a 60-100xg durante 10 minutos a una temperatura de entre 18°C y 20°C. 9) Se separa

de celulas endoteliales de vena umbilical de celulas endoteliales de vena umbilical

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el sobrenadante y las celulas mononucleares de cada tubo se resuspenden en 1 ml de PBS.

Aislamiento celular de CTC, CEC y CPEC utilizando el sistema Veridex:

Veridex, LLC (Warren, NJ) ha comercializado el sistema CellSearch, que consiste del sistema CellTracks®AutoPrep®, el kit de celulas epiteliales CellSearch™ y el analizador CellTracks®. El sistema CellTracks® AutoPrep® es un sistema de preparacion de muestras semiautomatico (Kagan et al., J. Clin. Ligand Assay 25:104110, 2002). El kit de celulas epiteliales CellSearch™ consiste de: ferrofluidos recubiertos con anticuerpos anti- EpCAM espedficos para celulas epiteliales, anticuerpos conjugados con ficoeritrina contra las citoqueratinas 8, 18 y 19, un anticuerpo anti-CD45 conjugado con aloficocianina, pigmento DAPI y tampones para el lavado, permeabilizacion y resuspension de las celulas. El protocolo utilizado en el presente ejemplo tambien se describe en Allard et al., Clin. Cancer Res. 10:6897-6904, 2004. El sistema Veridex completo puede utilizarse para la enumeracion de CTC o, mediante la extraccion manual de la muestra tras el aislamiento con el sistema CellTracks® AutoPrep®, puede proporcionar un metodo de aislamiento previo al analisis para la activacion de rutas. El numero de CTC puede ser informativo para el desarrollo de un algoritmo.

Sistema Veridex. Enriquecimiento en CTC seguido de recuento:

1) Se mezclan 7,5 ml de sangre con 6 ml de tampon, se centrifuga a 800xg durante 10 minutos y despues se introducen en el sistema CellTracks® AutoPrep®.

2) Tras aspirar el instrumento el sobrenadante, el instrumento anade los ferrofluidos.

3) El instrumento lleva a cabo la incubacion y posterior etapa de separacion magnetica.

4) Las celulas no unidas y el plasma restante son aspirados.

5) Se anaden reactivos de tincion conjuntamente con el tampon de permeabilizacion para la tincion de fluorescencia.

6) Tras la incubacion por el sistema, nuevamente se separan las celulas magneticamente y se resuspenden en el dispositivo de presentacion celular MagNest®.

7) A continuacion, el dispositivo de presentacion celular MagNest® se introduce en el analizador CellTracks®, un microscopio de fluorescencia semiautomatico de cuatro colores.

8) Se capturan las imagenes que cumplen los criterios definidos de Veridex y se muestran mediante un explorador en Internet para la seleccion manual final.

9) Los resultados del recuento celular se exprsan como numero de celulas por cada 7,5 ml de sangre.

Sistema Veridex. Enriquecimiento en CTC seguido de ensayo de activacion:

1) Se mezclan 7,5 ml de sangre con 6 ml de tampon, se centrifuga a 800xg durante 10 minutos y despues se introducen en el sistema CellTracks® AutoPrep®.

2) Tras aspirar el instrumento el sobrenadante, el instrumento anade los ferrofluidos.

3) El instrumento lleva a cabo la incubacion y posterior etapa de separacion magnetica.

4) Las celulas no unidas y el plasma restante son aspirados.

5) La muestra se resuspende en 100 ml de tampon de estimulacion.

Sistema Veridex. Enriquecimiento en CEC y CPEC seguido de ensayo de activacion:

1) Veridex ofrece un kit de celulas endoteliales CellSearch™ que utiliza la captura con un anticuerpo anti-CD146. El kit de celulas endoteliales CellSearch™ se utiliza conjuntamente con el sistema CellTracks® AutoPrep® para la preparacion de muestras de sangre y el analizador CellTracks® para el recuento y caracterizacion de las CEC y CPEC en sangre completa. El protocolo es el mismo que para el kit de celulas epiteliales CellSearch™.

Preparacion de muestras:

1) Recuento: Se introduce sangre periferica de sujetos humanos en el tubo de conservacion CellSave siguiendo las instrucciones del fabricante. Los primeros 3 a 5 ml se descartan para evitar la contaminacion con celulas epiteliales o endoteliales liberadas de la vena punzada.

2) Analisis de la ruta: Se introduce sangre periferica de sujetos humanos en un tubo siliconizado que contiene EDTA 1 mg/ml. Los primeros 3 a 5 ml se descartan para evitar la contaminacion con celulas epiteliales o endoteliales liberadas de la vena punzada.

Aislamiento manual de las CMC:

Se acumulan las pruebas que indican que los tumores contienen una pequena poblacion de celulas madre cancerosas putativas con mecanismos de autorenovacion y supervivencia unicos (ver, por ejemplo, Sells, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 51:1-28, 2004; Reya et al., Nature 414:105-11, 2001; Dontu et al., Trends Endocrinol. Metal. 15:193197, 2004; y Dick, Nature 423:231-233, 2003). Las celulas madre cancerosas (CMC) pueden existir en un estado quiescente durante un tiempo prolongado, lo que las hace resistentes a farmacos quimioterapeuticos con diana en celulas en division. Esta poblacion iniciadora del cancer puede caracterizarse con el fin de activar las rutas de autorenovacion y supervivencia que se someteran a terapia dirigida para su eliminacion selectiva. Se han descrito

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procedimientos de aislamiento de las CMC utilizando el cultivo en adherencia o las microperlas magneticas. En el presente ejemplo, se utilizo un protocolo modificado a partir del descrito en Cote et al., Clin. Can. Res. 12:5615, 2006.

Separacion inmunomagnetica de CMC. Aislamiento manual seguido de ensayo de activacion:

1) Se utilizan perlas magneticas (Dynal AS, Oslo, Noruega). Estas perlas se recubren con un anticuerpo monoclonal espedfico para el antigeno de superficie CD34 o CD133.

2) Inmediatamente antes de la utilizacion, las perlas Dynabeads prerrecubiertas se lavan una vez en un volumen igual de PBS con BSA al 0,01%.

3) Se anaden 1-107 Dynabeads prerrecubiertas a 3 ml de la muestra.

4) La mezcla se incuba durante 60 minutos a una temperatura de entre 2°C y 8°C con balanceo y rotacion suaves.

5) La mezcla se divide en porciones de 1 ml y cada tubo se introduce en el separador magnetico (iman MPL-1) durante por lo menos 6 minutos.

6) Se descarta el sobrenadante y las celulas unidas a las perlas se lavan tres veces mediante resuspension en PBS con BSA al 0,01% seguido de separacion magnetica.

7) La muestra se resuspende en 100 ml de tampon de estimulacion.

Preparacion de muestras:

1) Se obtienen espedmenes de medula osea de pacientes de cancer mamario temprano tras obtener el consentimiento informado del paciente.

2) Se lleva a cabo el procesamiento de los aspirados de medula osea tal como se describe en Bauer et al., Clin. Can. Res. 6:3552-3559, 2000. La fraccion de celulas mononucleares que contiene cualesquiera celulas tumorales diseminadas se enriquece mediante centrifugacion en gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque utilizando una centnfuga Beckman GS-6 a 4.000xg durante 35 minutos y se lava dos veces con PBS.

Estimulacion y lisis celular de CMC aisladas:

Estimulacion celular:

1) Se anaden los factores de crecimiento TGF-a (100 nM), Hrg (100 nM) y/o IGF (100 nM) a las celulas y se incuban a 37°C durante 5 minutos.

Estimulacion celular con tratamiento farmacologico:

1) La muestra se incuba con Herceptin, lapatinib, Tarceva y/o analogos de rapamicina a concentraciones terapeuticamente efectivas durante 30 minutos a 37°C.

2) A continuacion, se estimulan las celulas mediante la adicion de los factores TGF-a (100 nM), Hrg (100 nM) y/o iGf (100 nM) y se incuban a 37°C durante 5 minutos.

Estimulacion celular con tratamiento farmacologico (bucle de retroalimentacion):

1) La muestra se incuba con Herceptin, lapatinib, Tarceva y/o analogos de rapamicina a concentraciones terapeuticamente eficaces durante 30 minutos a 37°C.

2) A continuacion, se estimulan las celulas mediante la adicion de los factores TGF-a (100 nM), Hrg (100 nM) y/o iGf (100 nM) y se incuban a 37°C durante 120 minutos.

Las CMC estimuladas se lisan utilizando el protocolo siguiente:

1) Se prepara tampon de lisis fresco mezclando los reactivos indicados en la Tabla 3.

2) Tras el lavado final, las celulas se resuspenden sobre hielo en 100 ml de tampon frio.

3) La incubacion se lleva a cabo sobre hielo durante 30 minutos.

4) La mezcla se centrifuga en una microcentnfuga a velocidad maxima durante 10 minutos para separar las perlas del lisado.

5) El lisado se transfiere a un tubo nuevo para el ensayo o almacenamiento a -80°C.

Tabla 3

Receta de tampon de lisis (10 ml)

Reactivos

Conc. sol. madre Conc. final Volumen

Triton X-100 al 10%

10 1 1,00

Tris 1 M, pH 7,5

1 0,05 0,05

NaF 1 M

1 0,05 0,05

NaCl5 M

5 0,1 0,20

B-glicerolfosfato 2 M

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NaaVO4 0,1 M

0,1 0,001 0,10

Pepstatina 1 mg/ml

1 0,10

Mini-proteasa completa

1 tableta

EDTA 0,5 M

0,5 0,005 0,10

Total (ml) 3,00

Agua Agua (ml) 7,00

Estimulacion celular y lisis de CMC y/o CPEC aisladas:

Se cree que el FCEV estimula la supervivencia al activar las rutas antiapoptoticas tanto en las CEPC (Larrivee et al., J. Biol. Chem. 278:22006-22013, 2003) como en CEC maduras que se han desprendido de la pared vascular (Solovey et al., Blood 93:3824-3830, 1999). El FCVE tambien puede estimular la proliferacion de las CPEC o de las CEC maduras, aunque las CEC maduras aparentemente solo presentan una capacidad proliferativa limitada en comparacion con las CPEC (Lin et al., J. Clin. Invest. 105:71-77, 2000). Por estos motivos, las CEC y/o las CEPC resultan activadas al incubarlas con factores de crecimiento de la familia del VFCE antes de la lisis.

Estimulacion celular:

1) Se anaden los factores de crecimiento VFCE, FGF, PDGF, PIGF y/o Ang, cada uno a 100 nM, a las celulas y se incuban a 37°C durante 5 minutos.

Estimulacion celular con tratamiento farmacologico:

1) La muestra se incuba con avastina, Nexavar, Sutent y/o analogos de rapamicina a concentraciones terapeuticamente eficaces durante 30 minutos a 37°C.

2) A continuacion, se estimulan las celulas mediante la adicion de FCVE, FCF, FCDP, FCP y/o Ang, cada uno a 100 nM, y se incuban a 37°C durante 5 minutos.

Estimulacion celular con tratamiento farmacologico (bucle de retroalimentacion):

1) La muestra se incuba con avastina, Nexavar, Sutent y/o analogos de rapamicina a concentraciones terapeuticamente eficaces durante 30 minutos a 37°C.

2) A continuacion, se estimulan las celulas mediante la adicion de FCVE, FCF, FCDP, FCP y/o Ang, cada uno a 100 nM, y se incuban a 37°C durante 120 minutos.

Las celulas CEC y/o CPEC aisladas se lisan utilizando el protocolo siguiente:

1) Se prepara tampon de lisis fresco mezclando los reactivos indicados en la Tabla 3.

2) Tras el lavado final, las celulas se resuspenden sobre hielo en 100 ml de tampon frio.

3) La incubacion se lleva a cabo sobre hielo durante 30 minutos.

4) La mezcla se centrifuga en una microcentnfuga a velocidad maxima durante 10 minutos para separar las perlas del lisado.

5) El lisado se transfiere a un tubo nuevo para el ensayo o almacenamiento a -80°C.

Estimulacion y lisis celulares de CMC aisladas:

Estimulacion celular:

1) Se anaden los factores de crecimiento TGF-a (100 nM), Hrg (100 nM) y/o IGF (100 nM) a las celulas y se incuban a 37°C durante 5 minutos.

Estimulacion celular con tratamiento farmacologico:

1) La muestra se incuba con Herceptin, lapatinib, Tarceva y/o analogos de rapamicina a concentraciones terapeuticamente eficaces durante 30 minutos a 37°C.

2) A continuacion, se estimulan las celulas mediante la adicion de los factores TGF-a (100 nM), Hrg (100 nM) y/o IGF (100 nM) y se incuban a 37°C durante 5 minutos.

Estimulacion celular con tratamiento farmacologico (bucle de retroalimentacion):

1) La muestra se incuba con Herceptin, lapatinib, Tarceva y/o analogos de rapamicina a concentraciones terapeuticamente efectivas durante 30 minutos a 37°C.

2) A continuacion, se estimulan las celulas mediante la adicion de los factores TGF-a (100 nM), Hrg (100 nM) y/o iGf (100 nM) y se incuban a 37°C durante 120 minutos.

Las CMC estimuladas se lisan aplicando el protocolo siguiente:

1) Se prepara tampon de lisis fresco mezclando los reactivos indicados en la Tabla 3.

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2) Tras el lavado final, las celulas se resuspenden sobre hielo en 100 ml de tampon frte.

3) La incubacion se lleva a cabo sobre hielo durante 30 minutes.

4) La mezcla se centrifuga en una microcentnfuga a velocidad maxima durante 10 minutos para separar las perlas del lisado.

5) El lisado se transfiere a un tubo nuevo para el ensayo o almacenamiento a -80°C.

Ejemplo 2. Preparacion de extractos de celulas tumorales a partir de tejidos, biopsia o cultivos primarios.

El presente ejemplo ilustra metodos para aislar, estimular y lisar celulas procedentes de espedmenes de tejido tumoral o de biopsia. El presente ejemplo ilustra ademas metodos para iniciar, estimular y lisar cultivos primarios de celulas tumorales aisladas a partir de tejido, biopsia o sangre completa. Se describen metodos adicionales para aislar y cultivar celulas tumorales a partir de espedmenes biologicos para el cribado de agentes quimioterapeuticos en, por ejemplo, las patentes US n° 5.728.541, n° 6.416.967, n° 6.887.680, n° 6.900.027, n° 6.933.129 y n° 7.112.415; y en las publicaciones de patente US n° 2004/0023375 y n° 2005/0202411. Los extractos celulares preparados segun el presente ejemplo pueden utilizarse en los ensayos de deteccion individual o de proximidad indicados en la presente memoria.

Aislamiento de celulas tumorales a partir de tejidos primarios o metastasicos:

Aislamiento y cultivo celular:

1) Se extrajeron quirurgicamente aproximadamente 5 a 100 mg de tejido tumoral no contaminado no necrotico y se introdujeron en una botella de 100 ml que contema medio de cultivo celular esteril (por ejemplo RPMI-1640 con FBS al 10% y antibioticos).

2) Las muestras pueden almacenarse o transportarse a temperatura ambiente dentro de las primeras 72 horas desde la extraccion.

3) Las muestras se enjuagan tres veces en medio de cultivo celular.

4) El tejido se corta en trozos pequenos con un escalpelo y despues se desagrega formando una suspension celular pasandolo a traves de una malla fina de alambre.

5) Alternativamente, el tejido en trozos se trata con un coctel que contiene colagenasa II al 0,25% y ADNasa al 0,001% diluida en medio de cultivo celular sin suero que contiene antibioticos. La incubacion se realiza durante 15 a 20 minutos bajo agitacion suave. Se eliminan los enzimas tras el tratamiento mediante lavado 3 veces con medio de cultivo celular.

6) La concentracion celular se ajusta a 106/ml y las celulas se siembran en placas de 6 pocillos y se deja que sedimenten durante la noche. Al dfa siguiente, las celulas se tripsinizan y se siembran nuevamente en placas de microtitulacion para la estimulacion con ligandos y/o la inhibicion con farmacos dirigidos.

Estimulacion y lisis celulares en tumores desagregados:

Estimulacion celular:

1) Se anaden los factores de crecimiento TGF-a (100 nM), Hrg (100 nM) y/o IGF (100 nM) a las celulas y se incuban a 37°C durante 5 minutos.

Estimulacion celular con tratamiento farmacologico:

1) La muestra se incuba con Herceptin, lapatinib, Tarceva y/o analogos de rapamicina a concentraciones terapeuticamente efectivas durante 30 minutos a 37°C.

2) A continuacion, las celulas se estimulan con TGF-a (100 nM), Hrg (100 nM) y/o IGF (100 nM) y se incuban a 37°C durante 5 minutos.

Estimulacion celular con tratamiento farmacologico (bucle de retroalimentacion):

1) La muestra se incuba con Herceptin, lapatinib, Tarceva y/o analogos de rapamicina a concentraciones terapeuticamente efectivas durante 30 minutos a 37°C.

2) A continuacion, las celulas se estimulan con TGF-a (100 nM), Hrg (100 nM) y/o IGF (100 nM) y se incuban a 37°C durante 120 minutos.

Las celulas estimuladas se lisan aplicando el protocolo siguiente:

1) Se prepara tampon de lisis fresco mezclando los reactivos indicados en la Tabla 3, anteriormente.

2) Tras el lavado final, las celulas se resuspenden sobre hielo en 100 ml de tampon frte.

3) La incubacion se lleva a cabo sobre hielo durante 30 minutos.

4) La mezcla se centrifuga en una microcentnfuga a velocidad maxima durante 10 minutos para separar las perlas del lisado.

5) El lisado se transfiere a un tubo nuevo para el ensayo o almacenamiento a -80°C.

Aislamiento de celulas tumorales procedentes de especimenes de biopsia:

Aislamiento y cultivo celular:

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1) Se extrajeron biopsias cilindro quirurgicamente (2 cilindros con agujas de calibre 14, 3 cilindros con agujas de calibre 16 y 4 cilindros con agujas de calibre 18, con 1-2 biopsias para las asistidas por vado) y se introdujeron en un vial esteril de 10 ml que contema medio de cultivo celular tal como para los espedmenes tumorales.

2) Las muestras pueden almacenarse o transportarse a temperatura ambiente dentro de las primeras 72 horas desde la extraccion.

3) El material celular de las biopsias cilindro se desagrego formando una suspension celular pasandolo por una malla de alambre fino. 4) Alternativamente, las biopsias pueden tratarse con un coctel que contiene colagenasa II al 0,25% y ADNasa al 0,001% diluida en medio de cultivo celular sin suero y con antibioticos. La incubacion se realiza durante 15 a 20 minutos bajo agitacion suave. Se eliminan los enzimas tras el tratamiento mediante lavado 3 veces con medio de cultivo celular.

5) La concentracion celular se ajusta a 106/ml y las celulas se siembran en placas de 6 pocillos y se deja que sedimenten durante la noche. Al dfa siguiente, las celulas se tripsinizan y se siembran nuevamente en placas de microtitulacion para la estimulacion con ligandos y/o la inhibicion con farmacos dirigidos.

Estimulacion y lisis de celulas procedentes de biopsias:

Estimulacion celular:

1) Se anaden los factores de crecimiento TGF-a (100 nM), Hrg (100 nM) y/o IGF (100 nM) a las celulas y se incuban a 37°C durante 5 minutos.

Estimulacion celular con tratamiento farmacologico:

1) La muestra se incuba con Herceptin, lapatinib, Tarceva y/o analogos de rapamicina a concentraciones terapeuticamente efectivas durante 30 minutos a 37°C.

2) A continuacion, las celulas se estimulan con TGF-a (100 nM), Hrg (100 nM) y/o IGF (100 nM) y se incuban a 37°C durante 5 minutos.

Estimulacion celular con tratamiento farmacologico (bucle de retroalimentacion):

1) La muestra se incuba con Herceptin, lapatinib, Tarceva y/o analogos de rapamicina a concentraciones terapeuticamente efectivas durante 30 minutos a 37°C.

2) A continuacion, las celulas se estimulan con TGF-a (100 nM), Hrg (100 nM) y/o IGF (100 nM) y se incuban a 37°C durante 120 minutos.

Las celulas estimuladas se lisan aplicando el protocolo siguiente:

1) Se prepara tampon de lisis fresco mezclando los reactivos indicados en la Tabla 3, anteriormente.

2) Tras el lavado final, las celulas se resuspenden sobre hielo en 100 ml de tampon fno.

3) La incubacion se lleva a cabo sobre hielo durante 30 minutos.

4) La mezcla se centrifuga en una microcentnfuga a velocidad maxima durante 10 minutos para separar las perlas del lisado.

5) El lisado se transfiere a un tubo nuevo para el ensayo o almacenamiento a -80°C.

Preparacion de cultivos primarios de celulas tumorales aisladas a partir de tejido, biopsia o sangre completa:

Cultivo celular:

1) Se cultivan celulas tumorales aisladas a partir de tejido, biopsia o sangre completa tal como se ha indicado anteriormente, en matraces esteriles pequenos (por ejemplo T-25), placas Petri (por ejemplo de 10 mm) o placas (por ejemplo placas de 24 pocillos), dependiendo del numero de celulas tumorales aisladas.

2) La incubacion se realiza en medio de cultivo celular (por ejemplo RPMI-1640 con FBS al 2% y antibioticos) en una incubacion humidificada a 37°C suplementada con 5% de CO2. Con el tiempo, las celulas forman una monocapa sobre el fondo del recipiente y empiezan a dividirse. En el momento en que las celulas estan proximas a la confluencia, se tripsinizan y se siembran nuevamente en placas de microtitulacion para la estimulacion con ligandos y/o la inhibicion con farmacos dirigidos.

Estimulacion y lisis celulares de cultivos primarios de celulas tumorales aisladas a partir de tejido, biopsia o sangre completa:

Estimulacion celular:

1) Se anaden los factores de crecimiento TGF-a (100 nM), Hrg (100 nM) y/o IGF (100 nM) a las celulas y se incuban a 37°C durante 5 minutos.

Estimulacion celular con tratamiento farmacologico:

1) La muestra se incuba con Herceptin, lapatinib, Tarceva y/o analogos de rapamicina a concentraciones terapeuticamente efectivas durante 30 minutos a 37°C.

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2) A continuacion, las celulas se estimulan con TGF-a (100 nM), Hrg (100 nM) y/o IGF (100 nM) y se incuban a 37°C durante 5 minutes.

Estimulacion celular con tratamiento farmacologico (bucle de retroalimentacion):

1) La muestra se incuba con Herceptin, lapatinib, Tarceva y/o analogos de rapamicina a concentraciones terapeuticamente efectivas durante 30 minutos a 37°C.

2) A continuacion, las celulas se estimulan con TGF-a (100 nM), Hrg (100 nM) y/o IGF (100 nM) y se incuban a 37°C durante 120 minutos.

Las celulas estimuladas se lisan aplicando el protocolo siguiente:

1) Se prepara tampon de lisis fresco mezclando los reactivos indicados en la Tabla 3, anteriormente.

2) Tras el lavado final, las celulas se resuspenden sobre hielo en 100 ml de tampon frte.

3) La incubacion se lleva a cabo sobre hielo durante 30 minutos.

4) La mezcla se centrifuga en una microcentnfuga a velocidad maxima durante 10 minutos para separar las perlas del lisado.

5) El lisado se transfiere a un tubo nuevo para el ensayo o almacenamiento a -80°C.

Ejemplo 3. ELISA en micromatriz de deteccion individual con amplificacion de senales de tiramida.

El presente ejemplo ilustra un ELISA multiplex de alto rendimiento en micromatriz de deteccion individual que presenta un rango dinamico superior, que resulta adecuado para analizar los estados de activacion de las moleculas de transduccion de senales en celulas circulantes raras:

1) Se imprimio anticuerpo de captura sobre un portaobjetos FAST de 16 celdas (Whatman Inc., Florham Park, NJ) con una dilucion en serie de 2 veces.

2) Tras secar durante la noche, el portaobjetos se bloqueo con tampon de bloqueo de Whatman.

3) Se anadieron 80 ml de lisado celular a cada celda con una dilucion en serie de 10 veces. Se incubo el portaobjetos durante dos horas a temperatura ambiente.

4) Tras seis lavados con TBS-Tween, se incubaron 80 ml de anticuerpo de deteccion marcado con biotina (por ejemplo un anticuerpo monoclonal que reconozca p-RFCE o un anticuerpo monoclonal que reconozca RFCE con independencia del estado de activacion) durante dos horas a temperatura ambiente.

5) Tras seis lavados, se anadio peroxidasa de rabano picante marcada con estreptavidina (SA-HRP) y se incubo durante 1 hora para permitir que la SA-HRP se uniese al anticuerpo de deteccion marcado con biotina.

6) Para la amplificacion de senales, se anadieron 80 ml de biotina-tiramida a una concentracion de 5 mg/ml y se hicieron reaccionar durante 15 minutos. El portaobjetos se lavo seis veces con TBS-Tween, dos veces con DMSO al 20%/TBS-Tween y una vez con TBS.

7) Se anadieron 80 ml de SA-Alexa 555 y se incubaron durante 30 minutos. A continuacion, se lavo el portaobjetos dos veces, se seco durante 5 minutos y se analizo en un escaner de micromatrices (Perkin-Elmer, Inc., Waltham, MA).

Ejemplo 4. ELISA en micromatriz de doble deteccion de proximidad con amplificacion de senales de tiramida.

El presente ejemplo ilustra un ELISA multiplex de alto rendimiento en micromatriz de deteccion individual que presenta un rango dinamico superior, que resulta adecuado para analizar los estados de activacion de las moleculas de transduccion de senales en celulas circulantes raras:

1) Se imprimio anticuerpo de captura sobre un portaobjetos FAST de 16 celdas (Whatman Inc.) con una dilucion de entre 1 y 0,004 mg/ml.

2) Tras secar durante la noche, el portaobjetos se bloqueo con tampon de bloqueo de Whatman.

3) Se anadieron 80 ml de lisado celular A431 a cada celda con una dilucion en serie de 10 veces. Se incubo el portaobjetos durante dos horas a temperatura ambiente.

4) Tras seis lavados con TBS-Tween, se anadieron 80 ml de anticuerpos de deteccion para el ensayo de proximidad diluidos en TBS-Tween/BSA al 2%/FBS al 1% a los portaobjetos. Los anticuerpos de deteccion utilizados fueron: (1) un anticuerpo monoclonal anti-RFCE que se conjugo directamente con glucosa oxidasa (GO), y (2) un anticuerpo monoclonal que reconoce el RFCE fosforilado que se conjugo directamente con peroxidasa de rabano picante (HRP). La incubacion fue de dos horas a temperatura ambiente.

5) Alternativamente, en la etapa de deteccion se utilizo un conjugado con biotina del anticuerpo monoclonal que reconoda el RFCE fosforilado. En estos casos, tras seis lavados se incluyo una etapa secuencial adicional de incubacion con estreptavidina-HRP durante 1 hora.

6) Alternativamente, en la etapa de deteccion se utilizo un conjugado mediado por oligonucleotido con glucosa oxidasa (GO) del anticuerpo anti-RFCE. Se utilizo el conjugado de HRP conjugado directamente o mediante union con biotina-estreptavidina(SA) con el anticuerpo de RFCE fosforilado.

7) Para la amplificacion de las senales, se anadieron 80 ml de biotina-tiramida a una concentracion de 5 mg/ml y se hicieron reaccionar durante 15 minutos. El portaobjetos se lavo seis veces con TBS-Tween, dos veces con DMSO al 20%/TBS-Tween y una vez con TBS.

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8) Se anadieron 80 ml de SA-Alexa 555 y se incubaron durante 30 minutes. A continuacion, se lavo el portaobjetos dos veces, se seco durante 5 minutos y se analizo en un escaner de micromatrices (Perkin-Elmer, Inc.).

La figura 2 ilustra una realizacion de la presente invencion en la que los ensayos de proximidad descritos en la presente memoria detectaron RFCE fosforilado (RFCEp) y HER-2 fosforilado (pHER-2) con sensibilidad de celulas individuales.

La figura 3 muestra que los ensayos de proximidad descritos en la presente memoria resultaron en ensayos altamente espedficos para la deteccion de HER-2 al nivel de celulas individuales unicamente en celulas que expresaban HER-2.

Ejemplo 5. Generacion de perfiles de activacion para la seleccion de farmacos.

Los metodos y composiciones de la presente invencion pueden aplicarse a la seleccion de farmacos para el tratamiento del cancer. Un protocolo tfpico incluye la generacion de dos perfiles, un perfil de activacion de referencia y un perfil de activacion de ensayo, que seguidamente se comparan para determinar la eficacia de un regimen de tratamiento farmacologico particular (ver la figura 4).

Perfil de activacion de referencia

Para obtener un perfil de activacion de referencia, se obtuvo una muestra de sangre de un paciente que presentaba un tipo espedfico de cancer (por ejemplo un tumor mamario) previamente al tratamiento farmacologico anticancer. Se aislaron celulas circulantes raras procedentes del tumor canceroso de la muestra de sangre utilizando, por ejemplo, tecnicas de separacion inmunomagnetica tal como se describe en mayor detalle en la presente memoria. Las celulas circulantes aisladas pueden estimularse in vitro con uno o mas factores de crecimiento. A continuacion, las celulas estimuladas se lisan para producir un extracto celular. El extracto celular se aplica en una matriz direccionable que contiene una serie de dilucion de un panel de anticuerpos de captura espedficos para las moleculas de transduccion de senales cuyos estados de activacion pueden encontrarse alterados en el tipo de cancer del paciente. Los ensayos de deteccion individual o los de proximidad se llevan a cabo utilizando los anticuerpos de deteccion apropiados (por ejemplo anticuerpos independientes del estado de activacion y/o anticuerpos dependientes del estado de activacion) con el fin de determinar el estado de activacion de cada molecula de transduccion de senales de interes. La tabla de "Seleccion de rutas" mostrada en la Tabla 2 resulta particularmente util para seleccionar que estados de activacion se deben detectar segun el tipo de cancer del paciente. Por ejemplo, un paciente podna presentar un tipo de cancer que muestre los estados de activacion de la ruta de RFCE indicada en la "Ruta 1" de la Tabla 2. Alternativamente, otro paciente podna presentar otro tipo de cancer que mostrarse los estados de activacion de la ruta de RFCE indicada en la "Ruta 2" de la Tabla 2. De esta manera, se genera un perfil de activacion de referencia que proporciona los estados de activacion de las moleculas de transduccion de senales en el cancer del paciente en ausencia de cualesquier farmacos anticancer.

Perfil de activacion de ensayo

Con el fin de obtener un perfil de activacion de ensayo, se obtiene una segunda muestra de sangre del paciente que presenta el tipo de cancer espedfico (por ejemplo un tumor mamario) antes del tratamiento farmacologico anticancer o despues de la administracion de un farmaco anticancer (por ejemplo en cualquier tiempo durante el curso del tratamiento del cancer). Se afslan a partir de la muestra de sangre celulas circulantes raras derivadas del tumor canceroso. En el caso de que se obtengan celulas aisladas de un paciente que no ha recibido tratamiento con un farmaco anticancer, las celulas aisladas se incuban con farmacos anticancer con diana en una o mas moleculas de transduccion de senales activadas determinadas a partir del perfil de activacion de referencia indicado anteriormente. La tabla de "Seleccion de farmaco" (Tabla 1) resulta particularmente util para seleccionar los farmacos anticancer apropiados que se encuentran autorizados o en ensayo clmico, que inhiben moleculas diana de transduccion de senales activadas espedficas. Por ejemplo, en caso de que se determine a partir del perfil de activacion de referencia que el RFCE se encuentra activado, las celulas pueden incubarse con uno o mas de los farmacos listados en la columna "A" o "B" de la Tabla 1. A continuacion, las celulas aisladas pueden estimularse in vitro con uno o mas factores de crecimiento. A continuacion, las celulas aisladas se lisan para producir un extracto celular. El extracto celular se aplica a la matriz direccionable y se llevan a cabo ensayos de proximidad para determinar el estado de activacion de cada molecula de transduccion de senales de interes. De esta manera, se genera un perfil de activacion de ensayo para el paciente que proporciona los estados de activacion de las moleculas de transduccion de senales en el cancer del paciente en presencia de farmacos anticancer espedficos.

Seleccion de farmacos

Se determina si los farmacos anticancer resultan adecuados o inadecuados para el tratamiento del cancer del paciente mediante comparacion del perfil de activacion de ensayo con el perfil de activacion de referencia. Por

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ejemplo, en el caso de que el tratamiento farmacologico provoque que la mayor parte o todas las moleculas de transduccion de senales se encuentren sustancialmente menos activadas que en ausencia de los farmacos, por ejemplo un cambio de una activacion fuerte sin los farmacos a una activacion debil o muy debil con los farmacos, se determina que el tratamiento resulta adecuado para el cancer del paciente. En estos casos, el tratamiento se inicia con el farmaco anticancer adecuado en un paciente que no ha recibido terapia farmacologica o se continua el tratamiento con el farmaco anticancer adecuado en un paciente que ya recibe el farmaco. Sin embargo, en el caso de que el tratamiento farmacologico se considere inadecuado para el tratamiento del cancer del paciente, se seleccionan diferentes farmacos y se utilizan para generar un nuevo perfil de activacion de ensayo, que seguidamente se compara con el perfil de activacion de referencia. En estos casos, el tratamiento se inicia con el farmaco anticancer adecuado en un paciente que no ha recibido terapia farmacologica o el tratamiento posterior se cambia a un farmaco anticancer adecuado en un paciente que actualmente recibe el farmaco inadecuado.

Ejemplo 6. Matrices direccionables para el analisis de los receptores de tirosina quinasas activados.

La figura 5 ilustra una matriz direccionable ejemplar de receptor de tirosina quinasa de la invencion. Tal como se comenta en la presente memoria, los receptores de tirosina quinasa son componentes cruciales de muchas rutas de transduccion de senales participates en la proliferacion celular. Por ejemplo, la familia de ErbB de receptores de tirosina quinasa presenta cuatro miembros de la familia y desempena un papel importante en procesos celulares fundamentes tales como la proliferacion, diferenciacion y supervivencia celulares. Se ha informado de que esta familia de receptores de tirosina quinasa se sobreexpresa en varios canceres diferentes y se asocia a un resultado clmico peor. Al unirse el factor de crecimiento, ErbB1/RFCE, ErbB3/HER-3 y ErbB4/HER-4 se homodimerizan y se heterodimerizan, activando varias rutas de senalizacion diferentes. ErbB2/HER-2 no se une a factores de crecimiento y es la pareja de heterodimerizacion preferente para los tres miembros de la familia. ErbB2 tambien puede homodimerizarse al sobreexpresarse y activar rutas de senalizacion. La homodimerizacion o heterodimerizacion de la familia de ErbB resulta en la trans-fosforilacion. La autofosforilacion o transfosforilacion alivia la conformacion inhibidora de los receptores de tirosina quinasa, permitiendo una activacion de quinasa total y creando simultaneamente sitios de union para numerosas moleculas de senalizacion que contienen SH2, tales como Src, Shc SHP-1, SHEP-1 y PI3K. Las protemas adaptadoras o protemas senalizacion como Shc, Grb2 o PI3K son enviadas a los receptores fosforilados. La fosforilacion de las protemas adaptadoras resulta en la activacion de las rutas de MAPK y Akt. La activacion de la ruta MAPK puede evaluarse determinando el estado de fosforilacion de Erk y Rsk, mientras que puede evaluarse la activacion de la ruta de PI3K mediante la determinacion del estado de fosforilacion de Akt y p70S6K.

De esta manera, la matriz direccionable mostrada en la figura 5 permite no solo determinar la expresion de la familia de ErbB de receptores de tirosina quinasa, sino tambien su estado de activacion. Tambien puede estudiarse la activacion de las rutas de MAP y de PI3K/Akt en el chip direccionable. Ademas, la expresion y/o estado de activacion de receptores hormonales nucleares tales como RE (receptor de estrogenos) y RP (receptor de progesterona) y otras protemas tales como CORN

(correpresor de receptor nuclear), AIB1 (amplificado en cancer de mama-1), IGF-1R, cMET, Ki67 y TOPO II pueden estudiarse en el chip direccionable. Otra caractenstica del chip es la presencia de controles internos para determinar el contenido tumoral o de celulas asociadas a tumor (CEC, CPE, pericitos, etc.) e IgG no especfficas para determinar cualquier union no especffica.

Ejemplo 7. Matrices direccionables para el analisis de las rutas de transduccion de senales en la angiogenesis.

Las figuras 6 y 7 ilustran la configuracion de matrices direccionables para determinar el estado de activacion de los componentes de transduccion de senales implicados en la angiogenesis. Tal como se indica en la presente memoria, la angiogenesis tumoral resulta crucial para el crecimiento de muchos tumores solidos. Entre las moleculas de transduccion de senales clave se incluyen los miembros de la familia de RFCE, FGFR y TIE de receptores de tirosina quinasa, que se expresan predominantemente sobre las celulas endoteliales. PDGFR tfpicamente se expresa sobre los pericitos. La expresion y estado de activacion de estos receptores resultan cnticos para determinar el mecanismo predominante de angiogenesis en especfmenes tumorales individuales. Algunos factores de crecimiento como vFcE y PIGF se unen a RFCE-1 y RFCE-2 e inician la homodimerizacion y la heterodimerizacion. Tras la dimerizacion se produce la fosforilacion de dichos receptores, a la que sigue a su vez la activacion de las rutas de senalizacion de MAPK y de PI3K/Akt. Los receptores FGFR, TlE y PDGFR tambien resultan activados de una manera similar. La autofosforilacion o trans-fosforilacion alivia la conformacion inhibidora de los receptores de tirosina quinasa, permitiendo una activacion de quinasa total y creando simultaneamente sitios de union para numerosas moleculas de senalizacion que contienen SH2, tales como Src, Shc, SHP-1, SHEP-1 y PI3K. Las protemas adaptadoras o protemas senalizacion como Shc, Grb2 o PI3K son enviadas a los receptores fosforilados. La fosforilacion de las protemas adaptadoras resulta en la activacion de las rutas de MAPK y Akt. La activacion de la ruta MAPK puede evaluarse determinando el estado de fosforilacion de Erk y Rsk, mientras que

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puede evaluarse la activacion de la ruta de PI3K mediante la determinacion del estado de fosforilacion de Akt y p70S6K.

De esta manera, los chips de angiogenesis direccionable, tales como los mostrados en las figuras 6 y 7, permiten no solo determinar la expresion de todos los componentes de transduccion de senales que participan en la angiogenesis en una muestra del paciente, sino tambien su estado de activacion. Tambien puede estudiarse la activacion de las rutas de MAP y de PI3K/Akt en el chip direccionable. El chip presenta controles internos para determinar el contenido tumoral o de celulas asociadas a tumor (CEC, CPE, pericitos, etc.) e IgG no espedficas para determinar cualquier union no espedfica.

Las figuras 8 y 9 muestran matrices direccionables combinadas que pueden utilizarse en la invencion para determinar la expresion y/o estado de activacion de la familia de ErbB de receptores de tirosina quinasa, asf como los componentes de la transduccion de senales que participan en la angiogenesis. Ademas, en estos chips direccionables combinados puede estudiarse la expresion y/o estado de activacion de receptores de hormona nuclear tales como RE (receptor de estrogeno) y RP (receptor de progesterona) y otras protemas tales como NCOR (correpresor de receptor nuclear), AIB1 (factor amplificado 1 en el cancer de mama), IGF-IR, cMET, Ki67 y TOPO II. Otra caractenstica de estos chips es la presencia de controles internos para determinar el contenido tumoral o de celulas asociadas a tumor (CEC, CPE, pericitos, etc.) e IgG no espedficas para determinar cualquier union no espedfica.

Ejemplo 8. Seleccion de pacientes para el tratamiento del cancer de mama.

Un reto mayor del tratamiento del cancer es la seleccion de regfmenes terapeuticos que maximicen la eficacia y minimicen la toxicidad para un paciente dado. Un reto relacionado es la obtencion de informacion diagnostica, pronostica y predictiva exacta.

En la actualidad, los tumores se clasifican generalmente en el sistema de tumor-ganglio-metastasis (TGM). Este sistema utiliza el tamano del tumor, la presencia o ausencia de tumor en ganglios linfaticos regionales y la presencia o ausencia de metastasis distantes para asignar un estadio al tumor segun las directrices publicadas en el manual de estadificacion del cancer de la AJCC (Lippincott, 5a edicion, paginas 171 a 180, 1997). El estadio asignado se utiliza como base para la seleccion de la terapia apropiada y con fines pronosticos. Ademas de los parametros de TNM, se utiliza la apariencia morfologica para clasificar adicionalmente los tumores en tipos tumorales y ayudar de esta manera a seleccionar la terapia apropiada. Sin embargo, este enfoque presenta serias limitaciones. Por ejemplo, los tumores que presentan una apariencia histopatologica similar pueden mostrar una variabilidad significativa en terminos de curso clmico y respuesta a la terapia. Ademas, algunos tumores son de progresion rapida, mientras que otros, no. Ademas, algunos tumores responden facilmente a la terapia hormonal o a la quimioterapia, mientras que otros son resistentes.

Los ensayos para marcadores de superficie celular, por ejemplo mediante inmunohistoqmmica, han proporcionado medios para clasificar determinados tipos tumorales en subclases. Por ejemplo, un factor considerado en las decisiones pronosticas y de tratamiento para el cancer de mama es la presencia o ausencia del receptor de estrogeno (RE) en las muestras tumorales. Los canceres de mama positivos para el RE tfpicamente responden mucho mas facilmente a las terapias hormonales, tales como el tamoxifeno, que actua como antiestrogeno en el tejido mamario, que los tumores negativos para el RE. Aunque utiles, estos analisis solo predicen en parte el comportamiento clmico de los tumores de mama. Existe una diversidad fenotfpica en los canceres que las herramientas diagnosticas actuales no consigue detectar. En consecuencia, todavfa no se sabe con certeza como estratificar los pacientes entre los potenciales tratamientos para optimizar el resultado (por ejemplo para el cancer de mama ver "NIH Consensus Development Conference Statement: Adjuvant Therapy for Breast Cancer, 1-3 de nov., 2000", J. Nat. Cancer Inst. Monographs 30:5-15, 2001; y Di Leo et al., Int. J. Clin. Oncol. 7:245-253, 2002).

La presente invencion comprende la idea de que pueden utilizarse rutas de senalizacion para obtener una mejor comprension de la etiologfa biologica del cancer y la progresion de la enfermedad. La presente invencion proporciona ademas metodos para el tratamiento de canceres con diversas rutas de senalizacion activadas utilizando un regimen terapeutico personalizado.

En la actualidad se utilizan tres marcadores moleculares diferentes para definir cuatro subclases diferentes de cancer de mama con implicaciones terapeuticas importantes. Los tres marcadores son RE, RP y HER-2/ErbB2. Las cuatro subclases principales son las siguientes:

1. RE+/RP+/ErbB2-

2. RE+/ErbB2+

3. RE-/ErbB2+

4. RE-/RP-/ErbB2

5

10

15

20

25

30

35

Una teona actual divide el cancer de mama en cinco subtipos moleculares: luminal A, luminal B, de tipo basal, positivo para HER-2/neu y similar a mama normal (ver, por ejemplo, Carey et al., JAMA 295:2492-2502, 2006; Fan et al., N. Engl. J. Med. 355:560-569, 2006; Hannemann et al., British J. Cancer 95:1334-1341, 2006; Potemski et al., Oncology 69:478-485, 2005). Mucho de lo que se conoce actualmente sobre estos subtipos se relaciona directamente con caractensticas que ya se entienden bien, tales como el estatus de receptor hormonal y de HER- 2/neu.

El estrogeno desempena un papel importante en la patogenesis del cancer de mama y la interferencia selectiva en la cascada de senalizacion mediada por estrogeno/RE es el medio mas efectivo para tratar los pacientes de cancer de mama positivo para el RE. El RE regula el crecimiento y la diferenciacion en celulas de mama tanto normales como malignas. La expresion de los receptores RE y/o de progesterona (RP) funcionales resulta esencial para que un tumor sea sensible a las terapias antihormonales ("sensible a hormonas") y multiples estudios han demostrado que la expresion del RE es fuertemente predictivo de la respuesta a las terapias antihormonales, aunque su expresion es solo debilmente pronostica. El RE no actua solo en la estimulacion del crecimiento tumoral, sino que actua una compleja red de interacciones que garantiza la viabilidad de las celulas cancerosas. La comprension de esta red proporciona la base cientffica para la seleccion de las terapias dirigidas.

Los perfiles de paciente ejemplares mostrados posteriormente, en las Tablas 4 a 22, ilustran como un analisis de las rutas activas en las celulas tumorales circulantes (CTC) procedentes de sangre o de celulas de cancer obtenidas de una biopsia con aguja pueden utilizarse para ayudar al medico a decidir un curso eficaz de tratamiento para un tumor mamario, por ejemplo el tratamiento neoadyuvante previo a la cirugfa para reducir el tamano del tumor mamario o el tratamiento en pacientes con cancer de mama localmente recurrente o metastasico. En breve, los niveles de activacion de diferentes componentes de las rutas de ErbB y de receptores de la hormona nuclear en las CTC o en celulas de cancer derivadas de biopsia pueden determinarse en presencia o en ausencia de diferentes combinaciones de agentes terapeuticos de ensayo.

Tabla 4

Paciente 4001: (RE+/RP+/ErbB2-)

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Tratamiento con Tamoxifeno

RE

Elevada Intermedia

RE (Ser 118)

Elevada Debil

RE (Ser 167)

Elevada Debil

Complejo RE:AIB1

Intermedia Debil

Complejo RE:N-CoR

Debil Elevada

Receptor de progesterona

Elevada Intermedia

IGF-1R

Bajo Debil Debil

Paciente 4001: (RE+/RP+/ErbB2-)

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Tratamiento con Tamoxifeno

ErbB1

Bajo Debil Debil

ErbB2

Bajo Debil Debil

ErbB3

Bajo Debil Debil

ErbB4

Bajo Debil Debil

PTEN

Intermedia Intermedia Intermedia

Shc

Debil Debil

PI3K

Debil Debil

Erk

Intermedia Debil

Rsk

Intermedia Debil

Akt

Intermedia Debil

P70S6K

Intermedia Debil

Ki67

Intermedia Debil

TOPO II

Intermedia Intermedia

El paciente (mujeres premenopausicas y sin afectacion ganglionar) se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales revelo un elevado nivel de expresion y activacion de RE/RP. El paciente fue tratado con tamoxifeno. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. De esta manera, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde al tamoxifeno. Se cree que el RE atrae la protema correpresora NCOr en presencia de antagonistas tales como el tamoxifeno, y se cree que esta atraccion resulta esencial para una actividad antagonista completa.

Tabla 5

Paciente 4002: (RE+/RP-/ErbB2-)

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Tratamiento con Tamoxifeno + Quimioterapia

RE

Elevada Intermedia

RE (Ser 118)

Elevada Debil

RE (Ser 167)

Elevada Debil

Complejo RE:AIB1

Intermedia Debil

Complejo RE:N-CoR

Debil Elevada

Receptor de progesterona

Bajo Debil

IGF-1R

Bajo Debil Debil

ErbB1

Bajo Debil Debil

ErbB2

Bajo Debil Debil

ErbB3

Bajo Debil Debil

ErbB4

Bajo Debil Debil

Shc

Debil Debil

PI3K

Debil Debil

Erk

Intermedia Debil

Paciente 4002: (RE+/RP-/ErbB2-)

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Tratamiento con Tamoxifeno + Quimioterapia

Rsk

Intermedia Debil

Akt

Intermedia Debil

P70S6K

Intermedia Debil

Ki67

Elevada Debil

TOPO II

Elevada Elevada

5 El paciente (mujeres premenopausicas y sin afectacion ganglionar) se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales revelo un elevado nivel de expresion de RE y una expresion elevada de Ki67. El paciente fue tratado con tamoxifeno + quimioterapia. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a tamoxifeno + quimioterapia. Se cree que el RE atrae la protema correpresora NCOR en presencia de 10 antagonistas tales como el tamoxifeno, y se cree que esta atraccion resulta esencial para una actividad antagonista completa.

Tabla 6

Paciente 4003: (RE+/RP+/ErbB2-)

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Tratamiento con Tamoxifeno + Quimioterapia

RE

Elevada Intermedia

RE (Ser 118)

Elevada Debil

RE (Ser 167)

Elevada Debil

Complejo RE:AIB1

Intermedia Debil

Complejo RE:N-CoR

Debil Elevada

Receptor de progesterona

Elevada Debil

IGF-1R

Bajo Debil Debil

ErbB1

Bajo Debil Debil

ErbB2

Bajo Debil Debil

ErbB3

Bajo Debil Debil

ErbB4

Bajo Debil Debil

Shc

Debil Debil

PI3K

Debil Debil

Erk

Intermedia Debil

Rsk

Intermedia Debil

Akt

Intermedia Debil

P70S6K

Intermedia Debil

Ki67

Elevada Debil

TOPO II

Elevada Elevada

El paciente (mujer premenopausica con afectacion ganglionar) se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales revelo un elevado nivel de expresion y activacion de RE/RP. El paciente fue tratado con tamoxifeno + quimioterapia. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a 5 tamoxifeno + quimioterapia. Se cree que el RE atrae la protema correpresora NCOR en presencia de antagonistas tales como el tamoxifeno, y se cree que esta atraccion resulta esencial para una actividad antagonista completa.

Tabla 7

Paciente 4004: (RE+/RP+/ErbB2-)

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Tratamiento con inhibidor de aromatasa

RE

Elevada Intermedia

RE (Ser 118)

Elevada Debil

RE (Ser 167)

Elevada Debil

Complejo RE:AIB1

Intermedia Debil

Complejo RE:N-CoR

Debil Intermedia

Receptor de progesterona

Elevada Intermedia

IGF-1R

Bajo Debil Debil

ErbBI

Bajo Intermedia Debil

ErbB2

Bajo Debil Debil

ErbB3

Bajo Debil Debil

ErbB4

Bajo Debil Debil

Shc

Debil Debil

PI3K

Debil Debil

Erk

Intermedia Debil

Rsk

Intermedia Debil

Akt

Intermedia Debil

P70S6K

Intermedia Debil

Ki67

Intermedia Debil

TOPO II

Bajo

10 El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales revelo una expresion y activacion elevadas de RE/RP conjuntamente con cierta activacion de ErbBI via MISS (activacion del RE en el citoplasma con activacion cruzada resultante de ErbBI). El paciente se trato con un inhibidor de aromatasa para eliminar toda actividad relacionada con el RE. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de 15 protemas anteriormente indicado responde a los inhibidores de aromatasa.

Tabla 8

Paciente 4005: (RE+/RP+/ErbB2-)

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Tratamiento con inhibidor de aromatasa + Quimioterapia

RE

Elevada Intermedia

RE (Ser 118)

Elevada Debil

RE (Ser 167)

Elevada Debil

Complejo RE:AIB1

Intermedia Debil

Paciente 4005: (RE+/RP+/ErbB2-)

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Tratamiento con inhibidor de aromatasa + Quimioterapia

Complejo RE:N-CoR

Debil Intermedia

Receptor de progesterona

Elevada Intermedia

IGF-1R

Bajo Debil Debil

ErbB1

Bajo Intermedia Debil

ErbB2

Bajo Debil Debil

ErbB3

Bajo Debil Debil

ErbB4

Bajo Debil Debil

Shc

Debil Debil

PI3K

Debil Debil

Erk

Intermedia Debil

Rsk

Intermedia Debil

Akt

Intermedia Debil

P70S6K

Intermedia Debil

Ki67

Elevada Debil

TOPO II

Elevada

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales revelo una expresion y activacion elevadas de RE/RP conjuntamente con cierta activacion de ErbBI v^a MISS (activacion del RE en el citoplasma con activacion cruzada resultante de ErbBI). El paciente se 5 trato con un inhibidor de aromatasa + quimioterapia para eliminar toda actividad relacionada con el RE. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a inhibidor de aromatasa + quimioterapia.

Tabla 9

Paciente 4006: (RE+/RP-/ErbB2-)

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Tratamiento con inhibidor de aromatasa O Tamoxifeno + Quimioterapia

RE

Elevada Intermedia

RE (Ser 118)

Elevada Debil

RE (Ser 167)

Elevada Debil

Complejo RE:AIB1

Intermedia Debil

Complejo RE:N-CoR

Debil Intermedia

Receptor de progesterona

Bajo Bajo

IGF-1R

Bajo Debil Debil

ErbB1

Bajo Intermedia Debil

ErbB2

Bajo Debil Debil

ErbB3

Bajo Debil Debil

10

Paciente 4006: (RE+/RP-/ErbB2-)

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Tratamiento con inhibidor de aromatasa O Tamoxifeno + Quimioterapia

ErbB4

Bajo Debil Debil

Shc

Debil Debil

PI3K

Debil Debil

Erk

Intermedia Debil

Rsk

Intermedia Debil

Akt

Intermedia Debil

P70S6K

Intermedia Debil

Ki67

Elevada Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales revelo una expresion y activacion elevadas de RE (tumores negativos para el RP) conjuntamente con cierta activacion de ErbBI via MISS (activacion del RE en el citoplasma con activacion cruzada

15 resultante de ErbBI). El paciente se trato con un inhibidor de aromatasa + quimioterapia para eliminar toda actividad relacionada con el RE. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a inhibidor de aromatasa + quimioterapia.

20 La Tabla 10 proporciona un ejemplo de un paciente con cancer de mama localmente recurrente o metastasico con recafda sometido a terapia endocrina y/o quimioterapia. Transcurren por lo menos 3 semanas desde que el paciente ha recibido quimioterapia adyuvante y terapia hormonal para cancer de mama localmente recurrente o metastasico.

Tabla 10

Paciente 4007: (RE+/RP+/ErbB2-)

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Tratamiento con Tamoxifeno o inhibidor de aromatasa + Taxano + Avastin®

RE

Elevada Intermedia

RE (Ser 118)

Elevada Debil

RE (Ser 167)

Elevada Debil

Complejo RE:AIB1

Intermedia Debil

Complejo RE:N-CoR

Debil Intermedia

Receptor de progesterona

Elevada Intermedia

IGF-1R

Bajo Debil Debil

ErbB1

Bajo Intermedia Debil

ErbB2

Bajo Debil Debil

ErbB3

Bajo Debil Debil

ErbB4

Bajo Debil Debil

Shc

Debil Debil

PI3K

Debil Debil

Erk

Intermedia Debil

Rsk

Intermedia Debil

Akt

Intermedia Debil

P70S6K

Intermedia Debil

Paciente 4007: (RE+/RP+/ErbB2-)

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Tratamiento con Tamoxifeno o inhibidor de aromatasa + Taxano + Avastin®

Ki67

Elevada Debil

Celulas endoteliales:

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Activacion con Avastin®

RFCEV2

Intermedia Fuerte Debil

RFCEV1

Intermedia Fuerte Debil

Tie 2

Bajo Debil Debil

Complejo de cadherina V-R2

Nula Intermedia Debil

Shc

Fuerte Debil

PI3K

Fuerte Debil

Erk

Fuerte Debil

Rsk

Fuerte Debil

Akt

Fuerte Debil

P70S6K

Fuerte Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) con cancer de mama localmente recurrente o metastasico se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales y de las celulas endoteliales 5 revelo una expresion y activacion elevadas de RE/RP conjuntamente con cierta activacion de ErbB1 via MISS (activacion del RE en el citoplasma con activacion cruzada resultante de ErbBI), as^ como la activacion de RFCE2. El paciente se trato con un inhibidor de aromatasa + quimioterapia + Avastin® para eliminar toda actividad relacionada con el RE y con RFCE2. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a la 10 combinacion de inhibidor de aromatasa + quimioterapia + Avastin®.

Tabla 11

Paciente 4008: (Elevada AIB1; ER+/PR+/ErbB2-)

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Tratamiento con Fulvestrant

RE

Elevada Bajo

RE (Ser 118)

Elevada Debil

RE (Ser 167)

Elevada Debil

Complejo RE:AIB1

V. Elevada Debil

Complejo RE:N-CoR

Debil Debil

Receptor de progesterona

Elevada Bajo

IGF-1R

Bajo Debil Debil

ErbB1

Bajo Debil Debil

ErbB2

Bajo Debil Debil

ErbB3

Bajo Debil Debil

ErbB4

Bajo Debil Debil

Shc

Debil Debil

Paciente 4008: (Elevada AIB1; RE+/RP+/ErbB2-)

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Tratamiento con Fulvestrant

PI3K

Debil Debil

Erk

Intermedia Debil

Rsk

Intermedia Debil

Akt

Intermedia Debil

P70S6K

Intermedia Debil

Ki67

Elevada Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis 5 de las celulas tumorales revelo una expresion y activacion elevadas de RE/PR conjuntamente con una expresion muy elevada del complejo RE:AIB1. El paciente se trato con fulvestrant (Faslodex®) para degradar el RE. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde al fulvestrant.

10 Tabla 12

Paciente 4009: (ER+/PR-/ErbB2-)

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Tratamiento con Aromatase Inhibitor + Quimioterapia

ER

Elevada Intermedia

ER (Ser 118)

Elevada Debil

ER (Ser 167)

Elevada Debil

Complejo RE:AIB1

Intermedia Debil

Complejo RE:N-CoR

Debil Intermedia

Receptor de progesterona

Bajo Bajo

IGF-1R

Bajo Debil Debil

ErbB1

Bajo Intermedia Debil

ErbB2

Bajo Debil Debil

ErbB3

Bajo Debil Debil

ErbB4

Bajo Debil Debil

Shc

Debil Debil

PI3K

Debil Debil

Erk

Intermedia Debil

Rsk

Intermedia Debil

Akt

Intermedia Debil

P70S6K

Intermedia Debil

Ki67

Elevada Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales revelo elevados niveles de expresion y activacion de RE. El RP se expresaba a niveles muy bajos. El paciente se trato con un inhibidor de aromatasa + quimioterapia para eliminar toda actividad relacionada 15 con el RE. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a inhibidor de aromatasa + quimioterapia.

Tabla 13

Paciente 4010: (RE+/RP-/ErbB1+)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (Nivel de fosforilacion) Tratamiento con Al + Lapatinib or Erbitux®

RE

Elevada Intermedia

RE (Ser 118)

Elevada Debil

RE (Ser 167)

Elevada Debil

Complejo RE:AIB1

Intermedia Debil

Complejo RE:N-CoR

Debil Intermedia

Receptor de

Bajo Bajo

progesterona

IGF-1R

Bajo Debil Debil

ErbB1

Intermedia Intermedia Debil

ErbB2

Bajo Debil Debil

ErbB3

Bajo Debil Debil

ErbB4

Bajo Debil Debil

Shc

Intermedia Debil

PI3K

Debil Debil

Erk

Intermedia Debil

Rsk

Intermedia Debil

Akt

Debil Debil

P70S6K

Debil Debil

Ki67

Elevada Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales revelo elevados niveles de expresion y activacion de RE. El RP se expresaba a niveles muy bajos. ErbBI se encontraba activado. El paciente se trato con un inhibidor de aromatasa + lapatinib o Erbitux® para 5 eliminar toda actividad relacionada con RE/ErbB1. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a la combinacion de inhibidor de aromatasa + lapatinib o Erbitux®.

Tabla 14

Paciente 4011: (ER+/PR-/ErbB1+)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (Nivel de fosforilacion) Tratamiento con Al + Lapatinib o Erbitux®

ER

Elevada Intermedia

ER (Ser 118)

Elevada Debil

ER (Ser 167)

Elevada Debil

ER:AIB1

Complex

Intermedia Debil

ER:N-CoR

10

Paciente 4011: (ER+/PR-/ErbB1+)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (Nivel de fosforilacion) Tratamiento con Al + Lapatinib or Erbitux®

Complex

Debil Intermedia

Progesterone

Receptor

Bajo Bajo

IGF-1R

Bajo Debil Debil

ErbB1

Elevada Elevada Debil

ErbB2

Bajo Debil Debil

ErbB3

Bajo Debil Debil

ErbB4

Bajo Debil Debil

Shc

Elevada Debil

PI3K

Debil Debil

Erk

Elevada Debil

Rsk

Elevada Debil

Akt

Debil Debil

P70S6K

Debil Debil

Ki67

Elevada Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales revelo elevados niveles de expresion y activacion de RE. El RP se expresaba a niveles muy bajos. ErbBI se encontraba activado. El paciente se trato con un inhibidor de aromatasa + lapatinib o Erbitux® para 15 eliminar toda actividad relacionada con RE/ErbB1. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a la combinacion de inhibidor de aromatasa + lapatinib o Erbitux®.

__________________________________________Tabla 15__________________________________________

Paciente 4012: (RE+/RP-/ErbB1+/ErbB2+)_________________________________________________________

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (Nivel de fosforilacion) Tratamiento con Al + Lapatinib

RE

Elevada Intermedia

RE (Ser 118)

Elevada Debil

RE (Ser 167)

Elevada Debil

Complejo RE:AIB1

Intermedia Debil

Complejo RE:N-CoR

Debil Intermedia

Receptor de progesterona

Bajo Bajo

IGF-1R

Bajo Debil Debil

ErbB1

Intermedia Intermedia Debil

ErbB2

Intermedia Intermedia Debil

ErbB3

Bajo Debil Debil

ErbB4

Bajo Debil Debil

Shc

Intermedia Debil

Paciente 4012: (ER+/PR-/ErbB1+/ErbB2+)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (Nivel de fosforilacion) Tratamiento con Al + Lapatinib

PI3K

Intermedia Debil

Erk

Intermedia Debil

Rsk

Intermedia Debil

Akt

Intermedia Debil

P70S6K

Intermedia Debil

Ki67

Elevada Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales revelo elevados niveles de expresion y activacion de RE. El RP se expresaba a niveles muy 5 bajos. ErbBI y ErbB2 se encontraban activados. El paciente se trato con un inhibidor de aromatasa y lapatinib para eliminar toda actividad relacionada con RE/ErbB1/ErB2. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a inhibidor de aromatasa + lapatinib.

10 Tabla 16

Paciente 4013: (ER+/PR-/ErbB1+/ErbB2+/ErbB3+)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (Nivel de fosforilacion) Tratamiento con Al + Lapatinib

RE

Elevada Intermedia

RE (Ser 118)

Elevada Debil

RE (Ser 167)

Elevada Debil

Complejo RE:AIB1

Intermedia Debil

Complejo RE:N-CoR

Debil Intermedia

Receptor de progesterona

Bajo Bajo

IGF-1R

Bajo Debil Debil

ErbB1

Intermedia Intermedia Debil

ErbB2

Intermedia Intermedia Debil

ErbB3

Bajo Intermedia Debil

ErbB4

Bajo Debil Debil

Shc

Intermedia Debil

PI3K

Intermedia Debil

Erk

Intermedia Debil

Rsk

Intermedia Debil

Akt

Intermedia Debil

P70S6K

Intermedia Debil

Ki67

Elevada Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales revelo elevados niveles de expresion y activacion de RE. El RP se expresaba a niveles muy bajos. ErbBI, ErbB2 y ErbB3 se encontraban activados. El paciente se trato con un inhibidor de aromatasa + 15 lapatinib para eliminar toda actividad relacionada con RE/ErbBl/ErB2/ErbB3. El paciente respondio y en la nueva

biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a inhibidor de aromatasa + lapatinib.

La Tabla 17 proporciona un ejemplo de un paciente con cancer de mama localmente recurrente o metastasico con 5 recafda sometido a terapia antiangiogenica. Transcurrieron por lo menos 3 semanas desde que el paciente ha recibido quimioterapia adyuvante y terapia hormonal para cancer de mama localmente recurrente o metastasico.

Tabla 17

Paciente 4014: (RE+/RP-/ErbB1+/ErbB2+/ErbB3+)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (Nivel de fosforilacion) Tratamiento con Al + Lapatinib + Avastin®

RE

Elevada Intermedia

RE (Ser 118)

Elevada Debil

RE (Ser 167)

Elevada Debil

Complejo RE:AIB1

Intermedia Debil

Complejo RE:N-CoR

Debil Intermedia

Receptor de progesterona

Bajo Bajo

IGF-1R

Bajo Debil Debil

ErbB1

Intermedia Intermedia Debil

ErbB2

Intermedia Intermedia Debil

ErbB3

Bajo Intermedia Debil

ErbB4

Bajo Debil Debil

Shc

Intermedia Debil

PI3K

Intermedia Debil

Erk

Intermedia Debil

Rsk

Intermedia Debil

Akt

Intermedia Debil

P70S6K

Intermedia Debil

Ki67

Elevada Debil

Celulas endoteliales:

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Activacion con Avastin®

RFCEV2

Intermedia Fuerte Debil

RFCEV1

Intermedia Fuerte Debil

Tie 2

Bajo Debil Debil

Complejo de cadherina V-R2

Nula Intermedia Debil

Shc

Fuerte Debil

PI3K

Fuerte Debil

Erk

Fuerte Debil

Rsk

Fuerte Debil

Akt

Fuerte Debil

Celulas endoteliales:

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Activacion con Avastin®

P70S6K

Fuerte Debil

10

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) con cancer de mama localmente recurrente o metastasico se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales y celulas endoteliales revelo elevados niveles de expresion y activacion de RE conjuntamente con la activacion de RFCE2. El RP se expresaba a niveles muy bajos. ErbBI, ErbB2 y ErbB3 se encontraban activados. El paciente se trato con un inhibidor de 15 aromatasa + lapatinib + Avastin® para eliminar toda actividad relacionada con RE + ErbBI, ErbB2, ErbB3 y RFCE2. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con elperfil de protemas anteriormente indicado responde a la combinacion de inhibidor de aromatasa + lapatinib + Avastin®.

20 Tabla 18

Paciente 4015: (ER+/PR-/ErbB2-/IGF-1R+)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (Nivel de fosforilacion) Tratamiento con Al + Anti-IGF- 1 R Ab

RE

Elevada Intermedia

RE (Ser 118)

Elevada Debil

RE (Ser 167)

Elevada Debil

Complejo RE:AIB1

Intermedia Debil

Complejo RE:N-CoR

Debil Intermedia

Receptor de progesterona

Bajo Bajo

IGF-1R

Elevada/Intermedia Elevada Debil

ErbB1

Bajo Bajo Debil

ErbB2

Bajo Bajo Debil

ErbB3

Bajo Debil Debil

ErbB4

Bajo Debil Debil

Shc

Intermedia Debil

PI3K

Intermedia Debil

Erk

Intermedia Debil

Rsk

Intermedia Debil

Akt

Intermedia Debil

P70S6K

Intermedia Debil

Ki67

Elevada Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales revelo elevados niveles de expresion y activacion de RE. El RP se expresaba a niveles muy bajos. IGF-1R se encontraba activado. El paciente se trato con un inhibidor de aromatasa + anticuerpos anti-IGF-lR 5 para eliminar toda actividad relacionada con RE/IGF-1R. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a inhibidor de aromatasa + anticuerpos anti-IGF-IR.

Tabla 19

Paciente 4016: (ER+/PR+/ErbB2+)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (Nivel de fosforilacion) Tratamiento con Al + Herceptin® + Avastin®

ER

Elevada Intermedia

ER (Ser 118)

Elevada Debil

ER (Ser 167)

Elevada Debil

Complejo RE:AIB1

Intermedia Debil

Complejo RE:N-CoR

Debil Intermedia

Receptor de progesterona

Elevada Bajo

IGF-1R

Bajo Debil Debil

ErbB1

Intermedia Debil Debil

ErbB2

Elevada Elevada Debil

P95 ErbB2

Bajo Bajo Bajo

ErbB3

Bajo Debil Debil

ErbB4

Bajo Debil Debil

Shc

Intermedia Debil

PI3K

Intermedia Debil

Erk

Intermedia Debil

Rsk

Intermedia Debil

Akt

Intermedia Debil

P70S6K

Intermedia Debil

Ki67

Elevada Debil

Celulas endoteliales:

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Activacion con Avastin®

RFCEV2

Intermedia Fuerte Debil

RFCEV1

Intermedia Fuerte Debil

Tie 2

Bajo Debil Debil

Complejo de cadherina V-R2

Nula Intermedia Debil

Shc

Fuerte Debil

PI3K

Fuerte Debil

Erk

Fuerte Debil

Rsk

Fuerte Debil

Akt

Fuerte Debil

P70S6K

Fuerte Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) con cancer de mama localmente recurrente o metastasico se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales y celulas endoteliales revelo elevados niveles de expresion y activacion de RE, RP y ErbB2 conjuntamente con la activacion de RFCE2. El 5 paciente se trato con un inhibidor de aromatasa + Herceptin® + Avastin® para eliminar toda actividad relacionada con RE, ErbB2 y RFCE2. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a la combinacion de inhibidor de aromatasa + Herceptin® + Avastin®.

10 Tabla 20

Paciente 4017: (RE+/PR+/REbB2+)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (Nivel de fosforilacion) Tratamiento con Al + Lapatinib + Avastin®

RE

Elevada Intermedia

RE (SRE 118)

Elevada Debil

RE (SRE 167)

Elevada Debil

Complejo RE:AIB1

Intermedia Debil

Complejo RE:N-CoR

Debil Intermedia

Receptor de progesterona

Elevada Bajo

IGF-1R

Bajo Debil Debil

REbB1

Intermedia Intermedia Debil

REbB2

Elevada Elevada Debil

P95 REbB2

Intermedia Elevada Debil

REbB3

Bajo Intermedia Debil

REbB4

Bajo Debil Debil

Shc

Intermedia Debil

PI3K

Elevada Debil

REk

Elevada Debil

Rsk

Elevada Debil

Akt

Elevada Debil

P70S6K

Elevada Debil

Ki67

Elevada Debil

Celulas endoteliales:

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Activacion con Avastin®

RFCEV2

Intermedia Fuerte Debil

RFCEV1

Intermedia Fuerte Debil

Tie 2

Bajo Debil Debil

Complejo de cadherina V-R2

Nula Intermedia Debil

Shc

Fuerte Debil

PI3K

Fuerte Debil

REk

Fuerte Debil

Rsk

Fuerte Debil

Akt

Fuerte Debil

P70S6K

Fuerte Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) con cancer de mama localmente recurrente o metastasico se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales y celulas endoteliales revelo elevados niveles de expresion y activacion de RE, ErbB2 y ErbB2 p95 conjuntamente con la activacion de RFCE2.

15 El paciente se trato con un inhibidor de aromatasa + lapatinib + Avastin® para eliminar toda actividad relacionada con RE + ErbBI, ErbB2, ErbB3, ErbB2 p95 y RFCE2. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a la combinacion de inhibidor de aromatasa + lapatinib + Avastin®.

Tabla 21

Paciente 4018: (ER+/PR-/ErbB2+)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (Nivel de fosforilacion) Tratamiento con Al + Herceptin® + Taxanos + Avastin®

RE

Elevada Intermedia

RE (Ser 118)

Elevada Debil

RE (Ser 167)

Elevada Debil

Complejo RE:AIB1

Intermedia Debil

Complejo RE:N-CoR

Debil Intermedia

Receptor de progesterona

Bajo Bajo

IGF-1R

Bajo Debil Debil

ErbB1

Intermedia Debil Debil

ErbB2

Elevada Elevada Debil

P95 ErbB2

Bajo Bajo Bajo

ErbB3

Bajo Debil Debil

ErbB4

Bajo Debil Debil

Shc

Intermedia Debil

PI3K

Intermedia Debil

Erk

Intermedia Debil

Rsk

Intermedia Debil

Akt

Intermedia Debil

P70S6K

Intermedia Debil

Ki67

Elevada Debil

Celulas endoteliales:

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Activacion con Avastin®

RFCEV2

Intermedia Fuerte Debil

RFCEV1

Intermedia Fuerte Debil

Tie 2

Bajo Debil Debil

Complejo de cadherina V-R2

Nula Intermedia Debil

Shc

Fuerte Debil

PI3K

Fuerte Debil

Erk

Fuerte Debil

Rsk

Fuerte Debil

Celulas endoteliales:

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Activacion con Avastin®

Akt

Fuerte Debil

P70S6K

Fuerte Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) con cancer de mama localmente recurrente o metastasico 5 se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales y celulas endoteliales revelo elevados niveles de expresion y activacion de RE y ErbB2 conjuntamente con la activacion de RFCE2. Los niveles de RP eran bajos. El paciente se trato con un inhibidor de aromatasa + Herceptin® + taxanos + Avastin® para eliminar toda actividad relacionada con RE, ErbB2 y RFCE2. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas 10 anteriormente indicado responde a la combinacion de inhibidor de aromatasa + Herceptin® + Avastin® + quimioterapia.

Tabla 22

Paciente 4019: (RE+/RP-/ErbB2+)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (Nivel de fosforilacion) Tratamiento con Al + Lapatinib + Avastin® + Quimioterapia

RE

Elevada Intermedia

RE (Ser 118)

Elevada Debil

RE (Ser 167)

Elevada Debil

Complejo RE:AIB1

Intermedia Debil

Complejo RE:N-CoR

Debil Intermedia

5

10

15

20

25

30

Receptor de progesterona

Baja Bajo

IGF-1R

Baja Debil Debil

ErbBI

Intermedia Intermedia Debil

ErbB2

Elevada Elevada Debil

P95 ErbB2

Intermedia Elevada Debil

ErbB3

Baja Intermedia Debil

ErbB4

Baja Debil Debil

Shc

Intermedia Debil

PI3K

Elevada Debil

Erk

Elevada Debil

Rsk

Elevada Debil

Akt

Elevada Debil

P70S6K

Elevada Debil

Ki67

Elevada Debil

Celulas endoteliales:

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Activacion con Avastin®

RFCEV2

Intermedia Fuerte Debil

Celulas endoteliales:

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Activacion con Avastin®

RFCEV1

Intermedia Fuerte Debil

Tie 2

Bajo Debil Debil

Complejo de cadherina V-R2

Nula Intermedia Debil

Shc

Fuerte Debil

PI3K

Fuerte Debil

Erk

Fuerte Debil

Rsk

Fuerte Debil

Akt

Fuerte Debil

P70S6K

Fuerte Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) con cancer de mama localmente recurrente o metastasico se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales y celulas endoteliales revelo elevados niveles de expresion y activacion de RE, ErbB2 y ErbB2 p95 conjuntamente con la activacion de RFCE2. El nivel de RP era bajo. El paciente se trato con un inhibidor de aromatasa + lapatinib + Avastin® + quimioterapia para eliminar toda actividad relacionada con RE + ErbBI, ErbB2, ErbB3, ErbB2 p95 y RFCE2. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a la combinacion de inhibidor de aromatasa + lapatinib + Avastin® + quimioterapia.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en determinados aspectos, la presente invencion permite la seleccion inteligente de marcadores de activacion que predeciran optimamente la supervivencia. Los marcadores de activacion mas apropiados pueden variar segun los diferentes farmacos, y pueden utilizarse como grna para seleccionar entre la monoterapia con farmaco anticancer y la terapia de combinacion con un coctel de farmacos anticancer para proporcionar terapias dirigidas personalizadas.

Ejemplo 9. Seleccion de pacientes para el tratamiento del cancer de mama positivo para Her2.

En los Estados Unidos aparecen aproximadamente 200.000 casos de cancer de mama cada ano. HER-2/ErbB2, un receptor membranal de tirosina quinasa de 185 kDa, se observa en 18% a 20% de los canceres de mama y se ha asociado a una tasa incrementada de recafda y muerte. ErbB2 ahora es un marcador predictivo establecido de beneficio derivado de terapias tales como el trastuzumab (Herceptin®).

Durante la ultima decada, se han realizado avances considerables en el tratamiento del cancer de mama ErbB2+. La Herceptin® ha cambiado la historia natural de la enfermedad en los contextos metastasico y adyuvante. El lapatinib, ahora disponible comercialmente como Tykerb® (GlaxoSmithKline), es una adicion importante y el primero de probablemente muchos agentes que se haran disponibles en el contexto futuro tras la Herceptin®.

Desafortunadamente, se desarrolla resistencia a Herceptin® en muchos casos, y en la practica totalidad de los casos de metastasis. Tambien se ha observado resistencia tanto de novo como adquirida a la Herceptin®.

5

10

15

20

25

30

35

Son posibles modos de resistencia a Herceptin®:

• Expresion alterada de diana (cambio en el estatus de ErbBs)

• Senalizacion por rutas alternativas (IGF-1R)

• Dimerizacion preferente con otros receptores (ErbBI o ErbB3)

• Administracion suboptima de farmaco (la enfermedad metastasica del SNC en mujeres con cancer de mama ErbB2 aparentemente resulta particularmente comun). La incidencia de enfermedad metastasica en el SCN en pacientes con cancer de mama metastasico ErbB2+ puede ser de hasta un tercio de los pacientes con enfermedad metastasica ErbB2+.

• Alteracion de PTEN

• mutaciones de PI3K

• Expresion de ErbB2 P95 o truncado de ErbB2

• Sobreexpresion o amplificacion de cMET

Marcadores de seleccion/eficacia de la terapia:

• 5-FU/capecitabine: expresion de timidilato sintetasa (TS)

• expresion de dihidropirimidina deshidrogenasa (DPD)

• las HDAC reducen la expresion de TS

• Taxanos: ErbB2

• Antraciclinas sobreexpresion de TOPO2

• positivo para ErbB2: (5-FU o taxanos o antraciclinas)

Se han sometido a ensayo multiples regfmenes de quimioterapia en combinacion con Herceptin®. La combinacion preferente es el tratamiento con paclitaxel, docetaxel, un taxano mas una sal de platino, en el contexto metastasico. Todas las terapias dirigidas tambien pueden utilizarse en combinacion.

Los perfiles de paciente ejemplares mostrados posteriormente, en las Tablas 23 a 25, ilustran como un analisis de las rutas activas en las celulas tumorales circulantes (CTC) procedentes de sangre o en celulas de cancer obtenidas de biopsia pueden utilizarse para ayudar al medico a seleccionar los pacientes que podnan ser sensibles al trastuzumab (Herceptin®) y que por lo tanto se beneficianan de dicha terapia para el tratamiento de un tumor mamario. Los perfiles de paciente ejemplares mostrados posteriormente, en las Tablas 26 a 31, ilustran como un analisis de las rutas activas en las CTC procedentes de sangre o en celulas de cancer obtenidas de biopsia pueden utilizarse ®para ayudar al medico a seleccionar una terapia adecuada para los pacientes tras la recafda con Herceptin resultante de la resistencia de novo o adquirida. En breve, los niveles de activacion de diferentes componentes de las rutas de transduccion de senales tales como las rutas de receptor de ErbB en las CTC o las celulas de cancer derivadas de biopsia pueden determinarse en presencia o en ausencia de diferentes combinaciones de agentes terapeuticos de ensayo.

Tabla 23

Paciente 5001: (ErbB2+)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (nivel de fosforilacion) Tratamiento con Herceptin® + Avastin® + Taxanos (Opcional)

IGF-1R

Baja Debil Debil

ErbBI

Intermedio Debil Debil

ErbB2

Alto Alto Debil

ErbB2 P95

Baja Debil Debil

ErbB3

Baja Intermedio Debil

ErbB4

Baja Debil Debil

Shc

Intermedio Debil

PI3K

Intermedio Debil

Erk

Intermedio Debil

Rsk

Intermedio Debil

Akt

Intermedio Debil

P70S6K

Intermedio Debil

Ki67

Alta Debil

TOPO2

Baja Debil

Celulas endoteliales:

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (nivel de fosforilacion) Activacion con Avastin®

RFCEV2

Intermedio Fuerte Debil

RFCEV1

Intermedio Intermedio Debil

Tie 2

Baja Debil Debil

Complejo de

Nula Intermedio Debil

cadherina V-R2

Celulas endoteliales:

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (nivel de fosforilacion) Activacion con Avastin®

She

Fuerte Debil

PI3K

Fuerte Debil

Erk

Fuerte Debil

Rsk

Fuerte Debil

Akt

Fuerte Debil

P70S6K

Fuerte Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) con cancer de mama localmente recurrente o metastasico se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales y celulas endoteliales revelo 5 elevados niveles de expresion y activacion de ErbB2 conjuntamente con la activacion de RFCE2. El paciente se trato con Herceptin® + taxano + Avastin® para eliminar toda actividad relacionada con ErbB2 y RFCE2. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a Herceptin® + Avastin® + quimioterapia.

10 Tabla 24

Paciente 5002: (ErbB2+)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (nivel de fosforilacion) Tratamiento con Herceptin® + Avastin® + FEC: [fluorouracilo, epirrubicina (antraciclina) y ciclofosfamidal

IGF-1R

Baja Debil Debil

ErbBI

Intermedio Debil Debil

ErbB2

Alto Alto Debil

ErbB2 P95

Baja Debil Debil

ErbB3

Baja Intermedio Debil

ErbB4

Baja Debil Debil

Shc

Intermedio Debil

PI3K

Intermedio Debil

Erk

Intermedio Debil

Rsk

Intermedio Debil

Akt

Intermedio Debil

P70S6K

Intermedio Debil

Ki67

Alta Debil

TOPO2

Alta Alta

Celulas endoteliales:

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion Activacion con Avastin®

RFCEV2

Intermedio Fuerte Debil

RFCEV1

Intermedio Fuerte Debil

Tie 2

Baja Debil Debil

Celulas endoteliales:

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Activacion con Avastin®

Complejo de cadherina V-R2

Nula Intermedio Debil

Shc

Fuerte Debil

PI3K

Fuerte Debil

Erk

Fuerte Debil

Rsk

Fuerte Debil

Akt

Fuerte Debil

P70S6K

Fuerte Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) con cancer de mama localmente recurrente o metastasico 15 se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales y celulas endoteliales revelo elevados niveles de expresion y activacion de ErbB2 y TOPO2 conjuntamente con la activacion de RFCE2. El

paciente se trato con Herceptin® + antraciclina + quimioterapia + Avastin® para eliminar toda actividad relacionada con ErbB2, RFCE2 y TOPO2. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a la combinacion de Herceptin® + antraciclina + quimioterapia + Avastin®.

Tabla 25

Paciente 5003: (ErbB2+)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (nivel de fosforilacion) Tratamiento con Herceptin® + sorafinib o sunitib o AZD2171 + Taxanos (Opcional)

IGF-1R

Baja Debil Debil

ErbBI

Intermedio Debil Debil

ErbB2

Alta Alta Debil

P95 ErbB2

Baja Debil Debil

ErbB3

Baja Intermedio Debil

ErbB4

Baja Debil Debil

Shc

Intermedio Debil

PI3K

Intermedio Debil

Erk

Intermedio Debil

Rsk

Intermedio Debil

Akt

Intermedio Debil

P70S6K

Intermedio Debil

Ki67

Alta Debil

TOPO2

Baja Debil

Celulas endoteliales y pericitos:

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion Activacion con AZD2171 o sorafinib o sunitinib Activacion con Avastin®

RFCE2

Intermedio Fuerte Debil Debil

RFCE1

Intermedio Fuerte Debil Intermedio

Tie 2

Baja Debil Debil Debil

Complejo de cadherina V-R2

Nulo Intermedio Debil Debil

RFCDPa

Intermedio Alta Debil Alta

RFCDPb

Intermedio Alta Debil Hiqh

Shc

Fuerte Debil Debil

PI3K

Fuerte Debil Debil

Erk

Fuerte Debil Debil

Rsk

Fuerte Debil Debil

Akt

Fuerte Debil Debil

P70S6K

Fuerte Debil Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) con cancer de mama localmente recurrente o metastasico se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales y celulas endoteliales revelo 10 elevados niveles de expresion y activacion de ErbB2 y PDGFR conjuntamente con la activacion de RFCE2. El paciente se trato con Herceptin® + sorafinib + Avastin® para eliminar toda actividad relacionada con ErbB2, RFCDPv RFCE2. Debido a que PdGfR se encuentra sobreexpresado y activado en los pacientes resistentes a Avastin®, informacion tal como la presentada anteriormente indica que AZD2171 o sorafinib, que inhibe el PDGFR asf como el RFCE, podnan ser agentes de eleccion para tratar dichos tumores. El paciente respondio y en la nueva biopsia 15 presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a Herceptin® + sorafinib + quimioterapia.

Tabla 26

Paciente 5004: (ErbB2+)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (nivel de fosforilacion) Tratamiento con lapatinib + taxanos+ sorafinib o sunitib o AZD2171

IGF-1R

Baja Debil Debil

ErbBI

Alta Alta Debil

ErbB2

Alta Alta Debil

P95 ErbB2

Baja Debil Debil

ErbB3

Intermedio Intermedio Debil

ErbB4

Baja Debil Debil

Shc

Intermedio Debil

PI3K

Intermedio Debil

Erk

Intermedio Debil

Rsk

Intermedio Debil

Akt

Intermedio Debil

P70S6K

Intermedio Debil

Ki67

Alta Debil

TOPO2

Baja Debil

Celulas endoteliales y pericitos:

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion Activacion con AZD2171 o sorafinib o sunitinib Activacion con Avastin®

RFCE2

Intermedio Fuerte Debil Debil

RFCE1

Intermedio Fuerte Debil Intermedio

Tie 2

Baja Debil Debil Debil

Complejo de cadherina V-R2

Nulo Intermedio Debil Debil

RFCDPa

Intermedio Alta Debil Alta

RFCDPb

Intermedio Alta Debil Alta

Shc

Fuerte Debil Debil

PI3K

Fuerte Debil Debil

Erk

Fuerte Debil Debil

Rsk

Fuerte Debil Debil

Akt

Fuerte Debil Debil

P70S6K

Fuerte Debil Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) con cancer de mama localmente recurrente o metastasico se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales y celulas endoteliales revelo elevados niveles de expresion y activacion de ErbB1, ErbB2 y PDGFR conjuntamente con la activacion de RFCE2.

5 El paciente se trato con lapatinib + sorafinib para eliminar toda actividad relacionada con ErbBI, ErbB2, PDGFR y RFCE2. Debido a que ErbBI y PDGFR se encuentran sobreexpresado y activados en los pacientes resistentes a Herceptin® y Avastin®, informacion tal como la presentada anteriormente indica que AZD2171 o sorafinib, que inhibe el PDGFR asf como el RFCE, podnan ser agentes de eleccion para tratar dichos tumores. Se utilizo lapatinib en lugar de Herceptin® debido a que el lapatinib inhibe tanto ErbBI como ErbB2. El paciente respondio y en la nueva 10 biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a lapatinib + sorafinib + quimioterapia.

Tabla 27

Paciente 5005: (ErbB2+)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (nivel de fosforilacion) Tratamiento con Herceptin® + Taxanos + sorafinib o sunitib o AZD2171 + antic. anti-IGF-IR

IGF-1R

Alta Alta Debil

ErbBI

Intermedio Intermedio Debil

ErbB2

Alta Alta Debil

P95 ErbB2

Baja Debil Debil

ErbB3

Baja Intermedio Debil

ErbB4

Baja Debil Debil

Shc

Intermedio Debil

PI3K

Intermedio Debil

Erk

Intermedio Debil

Rsk

Intermedio Debil

Akt

Intermedio Debil

P70S6K

Intermedio Debil

Ki67

Alta Debil

TOPO2

Baja Debil

Celulas endoteliales y pericitos:

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion Activacion con AZD2171 o sorafinib o sunitinib Activacion con Avastin®

RFCE2

Intermedio Fuerte Debil Debil

RFCE1

Intermedio Fuerte Debil Intermedio

Tie 2

Baja Debil Debil Debil

Complejo de cadherina V-R2

Nulo Intermedio Debil Debil

RFCDPa

Intermedio Alta Debil Alta

RFCDPb

Intermedio Alta Debil Alta

Shc

Fuerte Debil Debil

PI3K

Fuerte Debil Debil

Erk

Fuerte Debil Debil

Rsk

Fuerte Debil Debil

Akt

Fuerte Debil Debil

P70S6K

Fuerte Debil Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) con cancer de mama localmente recurrente o metastasico se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales y celulas endoteliales revelo elevados niveles de expresion y activacion de IGF-1R, ErbB2 y PDGFR conjuntamente con la activacion de RFCE2.

5 El paciente se trato con Herceptin® + sorafinib + Avastin® + anticuerpo (Ab) IGF-1R para eliminar toda actividad relacionada con IGF-1R, ErbB2, PDGFR y RFCE2. Debido a que IGF-1R y PDGFR se encuentran sobreexpresados y activados en los pacientes resistentes a Herceptin® y Avastin®, informacion tal como la presentada anteriormente indica que AZD2171 o sorafinib, que inhibe el PDGFR asf como el RFCE, podnan ser agentes de eleccion para tratar dichos tumores. Se utilizo Ab IGF-1R conjuntamente con Herceptin® en lugar de Herceptin® sola para inhibir 10 tanto IGF-1R como ErbB2. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a Herceptin® + Ab IGF-1R sorafinib + quimioterapia.

Tabla 28

Paciente 5006: (ErbB2+/delecion de PTEN)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (nivel de fosforilacion) Tratamiento con lapatinib + taxanos + sorafinib o sunitib o AZD2171 + rapamicina

IGF-1R

Baja Baja Debil

ErbBI

Intermedio Intermedio Intermedio

ErbB2

Alta Alta Debil

P95 ErbB2

Intermedio Alta Debil

ErbB3

Baja Intermedio Intermedio

ErbB4

Baja Debil Debil

PTEN

Baja Baja Baja

Shc

Intermedio Debil

PI3K

Intermedio Intermedio

Erk

Intermedio Debil

Rsk

Intermedio Debil

Akt

Intermedio Alta

P70S6K

Intermedio Debil

Ki67

Alta Debil

TOPO2

Baja Debil

Celulas endoteliales y pericitos:

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion Activacion con AZD2171 o sorafinib o sunitinib Activacion con Avastin®

RFCE2

Intermedio Fuerte Debil Debil

RFCE1

Intermedio Fuerte Debil Intermedio

Tie 2

Baja Debil Debil Debil

Complejo de cadherina V- R2

Nulo Intermedio Debil Debil

RFCDPa

Intermedio Alta Debil Alta

RFCDPb

Intermedio Alta Debil Alta

Shc

Fuerte Debil Debil

PI3K

Fuerte Debil Debil

Erk

Fuerte Debil Debil

Rsk

Fuerte Debil Debil

Akt

Fuerte Debil Debil

P70S6K

Fuerte Debil Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) con cancer de mama localmente recurrente o metastasico se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales y celulas endoteliales revelo elevados niveles de expresion y activacion de ErbB2 p95, ErbB2 y PDGFR conjuntamente con la activacion de 5 RFCE2. El paciente presentaba ademas una delecion de PTEN. El paciente se trato con lapatinib + sorafinib para eliminar toda actividad relacionada con ErbB2, PDGFR y RFCE2. Debido a que ErbB2 p95 y PDGFR se encuentran sobreexpresados y activados en los pacientes resistentes a Herceptin® y Avastin®, informacion tal como la presentada anteriormente indica que AZD2171 o sorafinib, que inhibe el PDGFR asf como el RFCE, podnan ser agentes de eleccion para tratar dichos tumores. Se utilizo lapatinib en lugar de Herceptin® para inhibir tanto ErbB2 10 p95 como ErbB2 y se utilizo el inhibidor mTor para eliminar la actividad de senalizacion posterior. El paciente

respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a lapatinib + sorafinib + rapamicina + quimioterapia.

Tabla 29

Paciente 5007: (ErbB2+/ErbB2 p95+)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (nivel de fosforilacion) Tratamiento con Lapatinib + Taxanes + Sorafinib or Sunitinib or AZD2171

IGF-1R

Baja Baja Debil

ErbBI

Intermedio Intermedio Debil

ErbB2

Alta Alta Debil

P95 ErbB2

Alta Alta Debil

ErbB3

Baja Intermedio Debil

ErbB4

Baja Debil Debil

Shc

Intermedio Debil

PI3K

Intermedio Debil

Erk

Intermedio Debil

Rsk

Intermedio Debil

Akt

Alta Debil

P70S6K

Intermedio Debil

Ki67

Alta Debil

TOPO2

Baja Debil

Celulas endoteliales y pericitos:

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Activacion con AZD2171 o sorafinib o sunitinib Activacion con Avastin®

RFCE2

Intermedio Fuerte Debil Debil

RFCE1

Intermedio Fuerte Debil Intermedio

Tie 2

Baja Debil Debil Debil

Complejo de cadherina V- R2

Nulo Intermedio Debil Debil

RFCDPa

Intermedio Alta Debil Alta

RFCDPb

Intermedio Alta Debil Alta

Shc

Fuerte Debil Debil

PI3K

Fuerte Debil Debil

Erk

Fuerte Debil Debil

Rsk

Fuerte Debil Debil

Akt

Fuerte Debil Debil

P70S6K

Fuerte Debil Debil

5

10

15

20

25

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) con cancer de mama localmente recurrente o metastasico se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales y celulas endoteliales revelo elevados niveles de expresion y activacion de ErbB2 p95, ErbB2 y PDGFR conjuntamente con la activacion de RFCE2. El paciente se trato con lapatinib + sorafinib para eliminar toda actividad relacionada con ErbB2, PDGFR y RFCE2. Debido a que ErbB2 p95 y PDGFR se encuentran sobreexpresados y activados en los pacientes resistentes a Herceptin® y Avastin®, informacion tal como la presentada anteriormente indica que AZD2171 o sorafinib, que inhibe el PDGFR asf como el RFCE, podnan ser agentes de eleccion para tratar dichos tumores. Se utilizo lapatinib en lugar de Herceptin® para inhibir tanto ErbB2 p95 como ErbB2. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a lapatinib + sorafinib + quimioterapia.

Tabla 30

Paciente 5008: (ErbB2+)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (nivel de fosforilacion) Tratamiento con lapatinib + taxanos+ sorafinib o sunitib o AZD2171

IGF-1R

Baja Baja Debil

ErbBI

Intermedio Intermedio Debil

ErbB2

Alta Alta Debil

P95 ErbB2

Baja Debil Debil

ErbB3

Baja Intermedio Debil

ErbB4

Baja Debil Debil

Shc

Intermedio Debil

PI3K

Intermedio Debil

Erk

Intermedio Debil

Rsk

Intermedio Debil

Akt

Intermedio Debil

P70S6K

Intermedio Debil

Ki67

Alta Debil

TOPO2

Baja Debil

Celulas endoteliales y pericitos:

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Activacion con AZD2171 o sorafinib o sunitinib Activacion con Avastin®

RFCE2

Intermedio Fuerte Debil Debil

RFCE1

Intermedio Fuerte Debil Intermedio

Tie 2

Baja Debil Debil Debil

Complejo de cadherina V- R2

Nulo Intermedio Debil Debil

RFCDPa

Intermedio Alta Debil Alta

RFCDPb

Intermedio Alta Debil Alta

Shc

Fuerte Debil Debil

PI3K

Fuerte Debil Debil

Erk

Fuerte Debil Debil

Rsk

Fuerte Debil Debil

Akt

Fuerte Debil Debil

P70S6K

Fuerte Debil Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) con cancer de mama metastasico se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales y celulas endoteliales revelo elevados niveles de expresion y activacion de ErbB2 y PDGFR conjuntamente con la activacion de RFCE2. El paciente presentaba metastasis cerebrales. El paciente se trato con lapatinib + sorafinib para eliminar toda actividad relacionada con ErbB2, RFCDP y RFCE2. Debido a que RFCDP se encuentra sobreexpresado y activado en los pacientes resistentes a Avastin®, informacion tal como la presentada anteriormente indica que AZD2171 o sorafinib, que inhibe el PDGFR asf como el RFCE, podnan ser agentes de eleccion para tratar dichos tumores. Se utilizo lapatinib en lugar de Herceptin® debido a que el paciente presentaba metastasis cerebrales. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a lapatinib + sorafinib + quimioterapia.

Tabla 31

Paciente 5009: (ErbB2+)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (nivel de fosforilacion) Tratamiento con Herceptin® + taxanos + Avastin® + lapatinib

IGF-1R

Baja Debil Debil

ErbB1

Intermedio Intermedio Debil

ErbB2

Alta Alta Debil

P95 ErbB2

Intermedio Intermedio Debil

ErbB3

Baja Intermedio Debil

ErbB4

Baja Debil Debil

Shc

Intermedio Debil

PI3K

Intermedio Debil

Erk

Intermedio Debil

Rsk

Intermedio Debil

Akt

Intermedio Debil

P70S6K

Intermedio Debil

Ki67

Alta Debil

Paciente 5009: (ErbB2+)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (nivel de fosforilacion) Tratamiento con Herceptin® + taxanos + Avastin® + lapatinib

TOPO2

Baja Debil

Celulas endoteliales y pericitos:

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Activacion con AZD2171 o sorafinib o Sunitinib Activacion con Avastin®

RFCE2

Intermedio Fuerte Debil Debil

RFCE1

Intermedio Fuerte Debil Debil

Tie 2

Baja Debil Debil Debil

Complejo de cadherina V- R2

Nulo Intermedio Debil Debil

RFCDPa

Intermedio Baja Debil Debil

RFCDPb

Intermedio Baja Debil Debil

Shc

Fuerte Debil Debil

PI3K

Fuerte Debil Debil

Erk

Fuerte Debil Debil

Rsk

Fuerte Debil Debil

Akt

Fuerte Debil Debil

P70S6K

Fuerte Debil Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) con cancer de mama localmente recurrente o metastasico 5 se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales y celulas endoteliales revelo elevados niveles de expresion y activacion de ErbBI, ErbB2, ErbB3 y PDGFR conjuntamente con la activacion de RFCE2. El paciente se trato con Herceptin® + lapatinib + sorafinib para eliminar toda actividad relacionada con ErbBI, ErbB2, ErbB3, PDGFR y RFCE2. Debido a que ErbBI y RFCDP se encuentran sobreexpresados y activados en los pacientes resistentes a Herceptin® y Avastin®, informacion tal como la presentada anteriormente indica que 10 AZD2171 o sorafinib, que inhibe el RFCDP asf como el RFCE, podnan ser agentes de eleccion para tratar dichos

tumores. Se utilizo lapatinib en lugar de Herceptin® para inhibir ErbBI, ErbB2 y ErbB3. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a lapatinib + Herceptin® + sorafinib + quimioterapia.

15 Ejemplo 10. Seleccion de pacientes para el tratamiento del cancer de mama ER-, PR- y negativo para ErbB2.

Aproximadamente 15-20% de las mujeres con cancer de mama presenta el tipo triple negativo de cancer. Los pacientes con "cancer de mama triple negativo" presenta una ausencia completa de los receptores de hormona RE, RP y HER-2/ErbB2, con un curso clmico agresivo y pocas opciones de tratamiento. La unica opcion terapeutica es la 20 quimioterapia y a este respecto la eleccion de agentes citostaticos es limitada. El tratamiento estandar para el cancer de mama triple negativo tfpicamente es una combinacion de quimioterapia, cirugfa y/o terapia de radiacion. Al

80

tratarla con terapia estandar, las mujeres con cancer de mama triple negativo presentan un pronostico a largo plazo peor que las mujeres con cancer de mama que no es triple negativo. Las celulas de cancer de mama triple negativo habitualmente presentan expresion de ErbBI sobre su superficie celular. Las mujeres con cancer de mama positivo para ErbBI presentan un pronostico a largo plazo peor que las mujeres cuyos tumores no expresan ErbBI. Existe 5 una necesidad en la tecnica de metodos para el perfilado, seleccion y prediccion de opciones de tratamiento para los pacientes con cancer de mama triple negativo.

Tabla 32

Paciente 6001: (triple negativo con niveles Bajas de ErbBI)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (nivel de fosforilacion) Tratamiento con taxanos + Avastin®

RE

Baja

RP

Baja

IGF-1R

Baja Debil Debil

ErbBI

Baja Debil Debil

ErbB2

Baja Debil Debil

P95 ErbB2

Baja Debil Debil

ErbB3

Baja Debil Debil

ErbB4

Baja Debil Debil

Shc

Intermedio Debil

PI3K

Intermedio Debil

Erk

Intermedio Debil

Rsk

Intermedio Debil

Akt

Intermedio Debil

P70S6K

Intermedio Debil

Ki67

Alta Debil

TOPO2

Baja Debil

Celulas endoteliales y pericitos:

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Activacion con AZD2171 o sorafinib o sunitinib Activacion con Avastin®

RFCE2

Intermedio Fuerte Debil Debil

RFCE1

Intermedio Fuerte Debil Debil

Tie 2

Baja Debil Debil Debil

Complejo de cadherina V-R2

Nulo Intermedio Debil Debil

RFCDPa

Intermedio Baja Debil Debil

RFCDPb

Intermedio Baja Debil Debil

Shc

Fuerte Debil Debil

PI3K

Fuerte Debil Debil

Erk

Fuerte Debil Debil

Rsk

Fuerte Debil Debil

Akt

Fuerte Debil Debil

P70S6K

Fuerte Debil Debil

10 El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) con cancer de mama localmente recurrente o metastasico se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales y celulas endoteliales revelo niveles bajos de expresion y activacion nula de RE, ErbB2 y ErbB2 p95 conjuntamente con la activacion de unicamente RFCEV2. El paciente se trato con taxanos + Avastin® para eliminar toda actividad relacionada con RFCE2. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. De 15 esta manera, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a Avastin® + quimioterapia.

Tabla 33

Paciente 6002: (triple negativo)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (Nivel de fosforilacion) Tratamiento con Tarceva® + taxanos + Avastin®

RE

Baja

RP

Baja

IGF-1R

Baja Debil Debil

ErbBI

Intermedio Intermedio Debil

ErbB2

Baja Debil Debil

P95 ErbB2

Baja Debil Debil

ErbB3

Baja Debil Debil

ErbB4

Baja Debil Debil

Shc

Intermedio Debil

PI3K

Intermedio Debil

Erk

Intermedio Debil

Rsk

Intermedio Debil

Akt

Intermedio Debil

P70S6K

Intermedio Debil

Ki67

Alta Debil

TOPO2

Baja Debil

Celulas endoteliales y pericitos:

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Activacion con AZD2171 o sorafinib o sunitinib Activacion con Avastin®

RFCE2

Intermedio Fuerte Debil Debil

RFCE1

Intermedio Fuerte Debil Debil

Tie 2

Baja Debil Debil Debil

Complejo de cadherina V- R2

Nulo Intermedio Debil Debil

PDGFRa

Intermedio Baja Debil Debil

PDGFRb

Intermedio Baja Debil Debil

Shc

Fuerte Debil Debil

PI3K

Fuerte Debil Debil

Erk

Fuerte Debil Debil

Rsk

Fuerte Debil Debil

Akt

Fuerte Debil Debil

P70S6K

Fuerte Debil Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) con cancer de mama localmente recurrente o metastasico se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales y celulas endoteliales revelo elevados intermedios de expresion y activacion de ErbB1 y la activacion de RFCE2. El paciente se trato con 5 Tarceva® + Avastin® para eliminar toda actividad relacionada con ErbBI y RFCE2. El paciente respondio y en la

nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a Tarceva® + Avastin® + quimioterapia.

Tabla 34

Paciente 6003: (triple negativo)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (Nivel de fosforilacion) Tratamiento con inhibidor pan-Her + taxanos + Avastin®

RE

Baja

RP

Baja

IGF-1R

Baja Debil Debil

ErbBI

Intermedio Intermedio Debil

ErbB2

Baja Intermedio Debil

P95 ErbB2

Nulo Debil Debil

ErbB3

Baja Intermedio Debil

ErbB4

Baja Debil Debil

PTEN

Intermedio

Shc

Intermedio Debil

PI3K

Intermedio Debil

Erk

Intermedio Debil

Rsk

Intermedio Debil

Akt

Intermedio Debil

P70S6K

Intermedio Debil

Ki67

Alta Debil

TOPO2 Baja Debil

Celulas endoteliales y pericitos:

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Activacion con AZD2171 o sorafinib o sunitinib Activacion con Avastin®

RFCE2

Intermedio Fuerte Debil Debil

RFCE1

Intermedio Fuerte Debil Debil

Tie 2

Baja Debil Debil Debil

Complejo de cadherina V- R2

Nulo Intermedio Debil Debil

RFCDPa

Intermedio Baja Debil Debil

RFCDPb

Intermedio Baja Debil Debil

Shc

Fuerte Debil Debil

PI3K

Fuerte Debil Debil

Erk

Fuerte Debil Debil

Rsk

Fuerte Debil Debil

Akt

Fuerte Debil Debil

P70S6K

Fuerte Debil Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) con cancer de mama localmente recurrente o metastasico se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales y las celulas endoteliales revelo niveles intermedios de expresion y activacion de ErbB1, ErbB2 y ErbB3, conjuntamente con la activacion de RFCE2.

5 El paciente se trato con un inhibidor pan-HER + Avastin® para eliminar toda actividad relacionada con ErbBI, ErbB2 y RFCE2. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a la combinacion de inhibidor pan- HER + Avastin® + quimioterapia. Entre los ejemplos de inhibidores pan-HER se incluyen, aunque sin limitacion, BMS-599626 y CI-1033.

10

Tabla 35

Paciente 6004: (triple negativo)

Receptor

Expresion Activacion (+/-GF) (nivel de fosforilacion) Tratamiento con Inhibidor pan-Her + taxanos + Avastin® + rapamicina

RE

Baja

RP

Baja

IGF-1R

Baja Debil Debil

ErbBI

Intermedio Intermedio Debil

ErbB2

Baja Intermedio Debil

P95 ErbB2

Nulo Nulo Nulo

ErbB3

Baja Intermedio Debil

ErbB4

Baja Debil Debil

PTEN

Nulo

Shc

Intermedio Debil

PI3K

Intermedio Debil

Erk

Intermedio Debil

Rsk

Intermedio Debil

Akt

Intermedio Debil

P70S6K

Intermedio Debil

Ki67

Alta Debil

TOPO2

Baja Debil

Celulas endoteliales y pericitos:

Receptor

Expresion Activacion (nivel de fosforilacion) Activacion con AZD2171 o sorafinib o sunitinib Activacion con Avastin®

RFCE2

Intermedio Fuerte Debil Debil

RFCE1

Intermedio Fuerte Debil Debil

Tie 2

Baja Debil Debil Debil

Complejo de cadherina V- R2

Nulo Intermedio Debil Debil

RFCDPa

Intermedio Baja Debil Debil

RFCDPb

Intermedio Baja Debil Debil

5

10

15

20

25

30

Shc

Fuerte Debil Debil

PI3K

Fuerte Debil Debil

Erk

Fuerte Debil Debil

Rsk

Fuerte Debil Debil

Akt

Fuerte Debil Debil

P70S6K

Fuerte Debil Debil

El paciente (mujer premenopausica o postmenopausica) con cancer de mama localmente recurrente o metastasico se biopsio o se aislaron CTC a partir de sangre. El analisis de las celulas tumorales y las celulas endoteliales revelo niveles intermedios de expresion y activacion de ErbB1, ErbB2 y ErbB3, conjuntamente con la activacion de RFCE2. PTEN se encontraba delecionado. El paciente se trato con un inhibidor pan-HER + Avastin® + inhibidor de mTOR para eliminar toda actividad relacionada con ErbBI, ErbB2, ErbB3 y RFCE2. El paciente respondio y en la nueva biopsia presentaba el perfil de protemas mostrado anteriormente. Por lo tanto, un paciente con el perfil de protemas anteriormente indicado responde a la combinacion de inhibidor pan-HER + Avastin® + rapamicina + quimioterapia.

Ejemplo 11. El seguimiento de los pacientes de cancer de mama para la activacion de RFCE y/o HER-2 gma la seleccion del tratamiento

Se examinaron cinco pacientes de cancer de mama sometidos a terapia para el numero de celulas tumorales circulantes (CTC), la expresion de RFCE sobre las CTC mediante tincion y la fosforilacion de RFCE y HER-2 (ErbB2) utilizando los ensayos de proximidad descritos en la presente memoria. En las Tablas 36, 37 y 38 se muestran los datos de demograffa de los pacientes, historia de cancer y medicacion actual, respectivamente. Los resultados de los ensayos con tumor primario para receptor de estrogeno (RE), receptor de progesterona (RP) y HER-2 se proporcionan en la Tabla 39. Las Tablas 40 y 41 muestran el numero de CTC detectado en cada muestra y los niveles de fosforilacion relativos de RFCE y HER-2. Se calcularon los niveles de fosforilacion relativos utilizando la media de 4 controles con tampon. Los datos de fosforilacion tambien se proporcionan en forma de grafico en las figuras 10 y 11. La figura 12 muestra imagenes de tincion de CTC para RFCE, citoqueratina (CK) y citoqueratina con DAPI. Los controles de lmea celular eran SKBr3 y A431, que eran positivos para la expresion de HER-2 y RFCE, respectivamente. Se proceso sangre completa procedente de 6 individuos normales utilizando el mismo protocolo a modo de controles. Ninguna de las muestras normales mostraba fosforilacion de RFCE o HER-2 a niveles superiores al nivel de fondo.

Tabla 36

Datos demograficos de los 5 pacientes con cancer de mama en el estudio.

Numero de paciente

Fecha de nacimiento Sexo Raza/Etnicidad

01-003

01/APR/1951 Mujer Hispano/Latino

01-006

15/OCT/1929 Mujer Asiatico

01-014

29/SEP/1966 Mujer Hispano/Latino

01-019

08/JUN/1954 Mujer Asiatico

02-017

03/OCT/1954 Mujer Caucasico

Tabla 37

Historia de cancer de los 5 pacientes con cancer de mama en el estudio.

Paciente Numero

Tipo de cancer Estadio Sitio de metastasis Comprobacion de si es actual Tipo de tratamiento

01-003

MAMA 3C GANGLIOS LINFATICOS PARED TORACICA IZQUIERDA Comprobado QUIMIOTERAPIA

01-006

MAMA 4 GANGLIOS LINFATICOS E HfGADO Comprobado QUIMIOTERAPIA

01-014

MAMA 4 GANGLIOS LINFATICOS Comprobado QUIMIOTERAPIA

01-019

MAMA 4 HUESO HiGADO Comprobado QUIMIOTERAPIA

02-017

MAMA 3 GANGLIOS LINFATICOS No comprobado RADIACION QUIMIOTERAPIA

Tabla 38

Medicacion actual de los 5 pacientes con cancer de mama en el estudio.

Numero de

Nombre del Diagnostico asociado al tratamiento Dosis

paciente

farmaco

01-003

BENADRYL MEDICACION PRE-QUIMIO 25 MG CADA 28 DiAS

01-003

DECADRON MEDICACION PRE-QUIMIO 20 MG CADA 28 DiAS

01-003

HERCEPTIN QUIMIO PARA CANCER DE MAMA 8 MG CADA 28 DiAS

01-003

TAGAMET PRE-QUIMIO PARA CANCER DE MAMA 300 MG CADA 28 DIAS

01-003

TAXOTERE QUIMIO PARA CANCER DE MAMA 40 MG CADA 28 DiAS

01-003

TYLENOL DOLOR 1 G CADA 28 DiAS

Medicacion actual de los 5 pacientes con cancer de mama en el estudio.

Numero de paciente

Nombre del farmaco Diagnostico asociado al tratamiento Dosis

01-003

ZOFRAN PRE-QUIMIO PARA CANCER DE MAMA 32 MG CADA 28 DIAS

01-006

DECADRON PRE-MED PARA QUIMIO 20 MG CADA 2 SEMANAS

01-006

GEMZAR QUIMIO PARA CANCER DE MAMA 1000 MG CADA 2 SEMANAS

01-006

HERCEPTIN QUIMIO PARA CANCER DE MAMA 100 MG CADA SEMANAS

01-006

KYTRIL PRE-MED PARA QUIMIO 1 MG CADA 2 SEMANAS

01-006

TYLENOL PRE MED 1 G CADA 2 SEMANAS

01-014

CARBOPLATINO QUIMIO PARA CANCER DE MAMA 650 MG CADA 21 DiAS

01-014

DECADRON PRE-MED PARA QUIMIO 20 MG CADA 21 DIAS

01-014

HERCEPTIN QUIMIO PARA CANCER DE MAMA 270 MG CADA 21 DiAS

01-014

ROCEPHIN ANTIBIOTICO PARA FIEBRE 1000 MG PRN

01-014

TAXOTERE QUIMIO PARA CANCER DE MAMA 100 MG CADA 21 DiAS

01-014

ZOFRAN PRE-MED PARA QUIMIO 32 MG CADA 21 DIAS

01-019

AREDIA QUIMIO PARA CANCER DE MAMA 90 MG CADA 21 DiAS

01-019

BENADRYL PRE-MED PARA QUIMIO 25 MG CADA 21 DiAS

01-019

CARBOPLATINO QUIMIO PARA CANCER DE MAMA 580 MG CADA 21 DiAS

01-019

DECADRON PRE-MED PARA QUIMIO 20 MG CADA 21 DIAS

01-019

KYTRIL PRE-MED PARA QUIMIO 1 MG CADA 21 DiAS

01-019

MORFINA SULFATO PRE-QUIMIO 2 MG PRN

01-019

TAGAMET PRE-MED PARA QUIMIO 300 MG CADA 21 DiAS

01-019

TAXOTERE QUIMIO PARA CANCER DE MAMA 110 MG CADA 21 DiAS

01-019

ZOCOR HIPERCOLESTEROLEMIA 10 MG AL DiA

02-017

ADRIAMICINA CANCER DE MAMA 79 MG CADA 21 DiAS

02-017

BENADRYL PRURITO 25 MG CADA 21 DiAS

02-017

CYTOXEN CANCER DE MAMA 790 MG CADA 21 DiAS

02-017

DECADRON NAUSEA 20 MG CADA 21 DiAS

02-017

VICODIN DOLOR DEL CANCER 325 MG TID PRN

02-017

ZOFRAN NAUSEA Y VOMITOS 32 MG CADA 21 DiAS

Tabla 39

Resultados del ensayo diagnostico de RE, RP y HER-2 para los 5 pacientes con cancer de mama en el estudio.

Numero de paciente

El sujeto ^es positivo para RE? El sujeto ^es positivo para RP? El sujeto ^es positivo para HER2?

01-003

No No Si

01-006

No No Desconocido

01-014

No No Si

01-019

Si No No

02-017

No No No

Tabla 40

Numero de CTC (por cada 7,5 ml) y niveles relativos de fosforilacion de RFCE para 5 muestras de cancer de ____________________mama y 6 muestras normales.________________________________

Cancer de mama

Normal

5

10

15

20

25

30

35

n° de serie

ID de paciente CTC Nivel relativo de RFCE ID de paciente CTC Nivel relativo de RFCE

1

01-014 3 0,7 02-007 0 1,14

2

01-003 1 1,26 01-013 0 1,31

3

01-019 4 0,88 01-011 0 1,2

4

01-006 1 3,27 01-015 1 0,68

5

02-017 3 2,44 02-012 0 1,32

6

02-013 0 0,68

Table 41

Numero de CTC (por cada 7,5 ml) y niveles relativos de fosforilacion de HER-2 para 5 muestras de cancer de mama y 6 muestras normales.

Cancer de mama

Normal

n° de serie

ID de paciente CTC Nivel relativo de HER-2 ID de paciente CTC Nivel relativo de HER-2

1

01-014 3 0.66 02-007 0 1.13

2

01-003 1 1 01-013 0 1.15

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01-019 4 0.94 01-011 0 1.31

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01-006 1 2.52 01-015 1 0.76

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02-017 3 2.14 02-012 0 1.07

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02-013 0 0.59

El paciente 01-019 mostro un resultado positivo para RE y negativo para RP y la sobreexpresion de HER-2 en el tumor primario. Este paciente no recibio Herceptin® y se estaba sometiendo a tratamiento con Taxotere® + carboplatino en el momento de la extraccion de sangre. Se identificaron cuatro CTC. Ninguna de estas celulas mostro tincion positiva para la expresion de RFCE en el sistema Veridex CellSearchTM. Tras la estimulacion de las CTC aisladas con ligando, no se produjo fosforilacion detectable de RFCE o HER-2 en los ensayos de proximidad. Estos datos informan al medico de que las celulas tumorales del paciente continuan no estando controladas por rutas de RFCE/HER-2, por lo que no hay motivo para modificar la terapia actual.

No se proporcionan datos para el ensayo de HER-2 para el paciente 01-006, pero presumiblemente proporciono un resultado positivo para HER-2 ya que recibfa terapia de Herceptin®. El paciente mostro un resultado negativo tanto para RE como para RP. El paciente 01-006 presentaba 1 CTC que era positiva para la expresion de RFCE segun tincion. Se detecto una activacion significativa tanto de RFCE como de HER-2. A pesar de la terapia que inclrna Herceptin®, no se cerro la ruta de RFCE ni la de HER-2. La activacion podna resultar de la formacion de heterodfmeros entre EFGR y HER-2, permitiendo evadirse de la inhibicion por Herceptin®. Estos datos informan al medico de que debe modificarse la terapia. Estanan indicadas terapias que incluyen agentes con diana tanto en RFCE como en HER-2, tales como lapatinib, Herceptin® + ZACTIMA™, Herceptin® + Erbitux®, Herceptin® + Iressa®, o Herceptin® + Tarceva®.

El paciente 02-017 mostro un resultado negativo para RE, RP y sobreexpresion de HER-2 en el tumor primario. El paciente habfa sido tratado previamente con adriamicina + citoxeno, aunque en el momento de la extraccion de sangre no se sometfa a ninguna terapia para el cancer. La muestra contema 3 CTC, la totalidad de las cuales mostraba tincion positiva para la expresion de RFCE. Se detecto una activacion significativa tanto de RFCE como de HER-2 en los ensayos de proximidad. Aunque el tumor primario de esta paciente era negativo para la sobreexpresion de HER-2, las rutas de RFCE/hER-2 se encontraban activas. El tratamiento con Herceptin®, sola o en combinacion con quimioterapeuticos, o quimioterapeuticos solos, no resultana una terapia adecuada para este paciente. Estos datos informan al medico de que estana indicada una terapia que incluyese agentes con diana tanto en RFCE como en HER-2, tales como lapatinib, Herceptin® + ZACTIMA™, Herceptin® + Erbitux®, Herceptin® + Iressa®, o Herceptin® + Tarceva®.

Se informo de los tumores primarios de los pacientes 01-003 y 01-014 en las historias de los pacientes como positivos para sobreexpresion de HER-2. Ambos pacientes eran negativos tanto para el RE como para el RP. El paciente 01-003 se estaba tratando con Herceptin® y Taxotere®, mientras que el paciente 01-014 se estaba tratando con Herceptin®, carboplatino y Taxotere®. El paciente 01-003 presentaba 1 CTC que era negativo para la expresion de RFCE segun tincion. No se detecto una activacion significativa de RFCE ni de HER-2. Estos datos informan al medico de que la ruta controlada por HER-2 detectada originalmente en el tumor primario ya no se encuentra activa. Dado que el porcentaje de tumor primario que se tine de hecho con anticuerpo de HER-2 en un tumor primario con

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puntuacion positiva frecuentemente es de ~10%, no resulta inesperado que las CTC asociadas a recurrencia no esten sobreexpresando HER-2. La ruta de RFCE no se encuentra activa. No existe ningun motivo para tratar este paciente con terapias dirigidas contra RFCE o HER-2. El paciente 01-014 presentaba 3 CTC, la totalidad de las cuales mostro tincion positiva para la expresion de RFCE. No se detecto para este paciente fosforilacion de RFCE ni de HER-2. A pesar del hecho de que las CTC mostraban expresion de RFCE, las rutas de RFCE no se encontraban activas. Unos niveles menores de RFCE en ausencia de HER-2 podnan no ser suficientemente elevados para activar las celulas cancerosas. Nuevamente no hay motivo para tratar este paciente con terapias dirigidas contra RFCE o HER-2.

La Tabla 42 muestra un resumen de la informacion diagnostica para cada paciente y las recomendaciones de terapia.

Tabla 42

Resumen de informacion diagnostica de los 5 pacientes con cancer de mama en el estudio con las indicaciones de terapia resultantes.

N° de paciente

Estatus de RE Estatus de RP Estatus de HER-2 N° de CTC CTC RFCE RFCEp pHER-2 Terapia indicada (puede anadirse quimioterapia en combinacion)

01-019

Positivo Negativo Negativo 4 Negativo Negativo Negativo terapia hormonal

01-006

Negativo Negativo Desconocido 1 Positivo Positivo Positivo lapatinib, Herceptin® + ZACTIMA™, Herceptin® + Erbitux®, Herceptin® + Iressa®, Herceptin® + Tarceva®

02-017

Negativo Negativo Negativo 3 Positivo Positivo Positivo lapatinib, Herceptin® + ZACTIMA™, Herceptin® + Erbitux®, Herceptin® + Iressa®, Herceptin® + Tarceva®

01-003

Negativo Negativo Positivo 1 Negativo Negativo Negativo (sin RFCE +/o inhibidores de HER-2)

01-014

Negativo Negativo Positivo 3 Positivo Negativo Negativo (sin RFCE +/o inhibidores de HER-2)

Ejemplo 12. Un nuevo ensayo para cuantificar p95 ErbB2 y otros receptores tirosina quinasa truncados o protemas de muestras clmicas.

HER-2, tambien conocido como ErbB2, es uno de cuatro miembros (HER-1, HER-2, HER-3 y HER-4) de la familia del receptor de factor de crecimiento epidermico o HER. Todos los receptores de HER comparten una estructura similar: un dominio de union a ligando extracelular; una region transmembranal hidrofobica corta, y un dominio de tirosina quinasa citoplasmatico. La hetero- u homo-dimerizacion de receptores de HER, inducida por la union de ligando o la sobreexpresion de receptores, conduce a la activacion del receptor quinasa y a la posterior fosforilacion de varios residuos de tirosina. A su vez, dichos residuos de tirosina fosforilados, situados dentro del extremo carboxilo-terminal de los receptores, reclutan moleculas de mediadores y activan las rutas de senalizacion que conducen a la modificacion del crecimiento, diferenciacion y supervivencia celulares. ErbB2 se

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sobreexpresa/amplifica en aproximadamente 15% a 25% de los canceres de mama humanos y su sobreexpresion/amplificacion se asocia a un fenotipo agresivo.

El trastuzumab (Herceptin®), un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante que se une con afinidad elevada al dominio extracelular de ErbB2, proporciona beneficios clmicos sustanciales en los pacientes con cancer de mama avanzado con sobreexpresion de ErbB2 o con amplificacion del gen ErbB2 y mejora la supervivencia en combinacion con quimioterapia. Ademas, recientemente se ha demostrado que Herceptin® mejora la supervivencia sin recafdas y la supervivencia global en pacientes con cancer de mama temprano sobreexpresante de ErbB2.

Sin embargo, 70% a 80% de los pacientes con cancer de mama sobreexpresante de ErbB2 no responden a Herceptin® al recibirlo como unico agente terapeutico debido a resistencia primaria o adquirida. Existen varios mecanismos potenciales para la resistencia a Herceptin®, incluyendo: la inactivacion o la perdida de fosfatasa y delecion de homologo de la tensina en el cromosoma 10 (PTEn); la activacion de otros receptores de tirosina quinasa, incluyendo el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1R) y la acumulacion de formas truncadas del receptor de ErbB2 que no presentan el dominio aminoterminal extracelular de union a Herceptin®.

Los polipeptidos ErbB2 truncados que contienen unicamente fragmentos carboxilo-terminales citosolicos, colectivamente conocidos como p95ErbB2 o fragmentos C-terminales, se encuentran frecuentemente en lmeas celulares y tumores de cancer de mama expresantes de ErbB2. De hecho, estos fragmentos son las formas de ErbB2 predominantes en algunos tumores. Estos fragmentos aparecen por el procesamiento proteolftico del dominio extracelular de ErbB2 de longitud completa o mediante el inicio alternativo de la traduccion a partir de dos residuos de metionina (aminoacido 611 o 687) que se encuentran situados antes y despues del dominio transmembranal, respectivamente.

La funcion biologico de p95ErbB2 no ha sido caracterizada por completo, aunque la sobreexpresion de p95ErbB2 se ha demostrado que conduce al crecimiento de xenoinjertos tumorales en ratones desnudos. La protema p95ErbB2 presenta actividad de quinasa y esta actividad resulta necesaria para el crecimiento tumoral. El hecho de que el receptor p95ErbB2 truncado presenta actividad de quinasa en ausencia del dominio extracelular de union a Herceptin® sugiere que los tumores expresantes de p95ErbB2 podnan ser resistentes a Herceptin® aunque sensibles a los efectos de inhibicion de los inhibidores pan-HER tales como, por ejemplo, lapatinib (un inhibidor de tirosina quinasa de bajo peso molecular de ErbB2 que presenta actividad en pacientes con tumores expresantes de ErbB2 resistentes a Herceptin®). Los datos clmicos tempranos indican que 8 de cada 9 pacientes que expresan p95ErbB2 son resistentes a Herceptin®. Tambien se ha demostrado recientemente que la resistencia adquirida a los inhibidores de tirosina quinasa pan-HER y Herceptin® se produce mediante un mecanismo de retroalimentacion que conduce a la sobreexpresion de ErbB2 o al posible truncado de ErbB2, conduciendo a la formacion de p95ErbB2.

Debido a que Herceptin® inhibe el truncado de ErbB2, una combinacion de Herceptin® con inhibidores de tirosina quinasa pan-HER podna resultar ideal para tratar pacientes con resistencia adquirida a Herceptin® y/o inhibidores de tirosina quinasa pan-HER.

Con respecto a los metodos actuales para la deteccion de p95ErbB2, la presencia de p95ErbB2 en tumores mamarios humanos puede detectarse mediante analisis de transferencia western. Sin embargo, esta tecnica requiere una gran cantidad de tejido tumoral recien congelado, una grave limitacion porque este tejido se encuentra raramente disponibles en muestras clmicas. Los ensayos de deteccion de p95ErbB2 basados en inmunofluorescencia pueden llevarse a cabo en secciones de tejido rutinarias fijadas en formalina e incluidas en parafina de muestras clmicas. Esta tecnica se basa en la observacion de que p95ErbB2, pero no ErbB2 de longitud completa, se localiza tanto en el citoplasma como en la membrana celular. El metodo utiliza un anticuerpo anti-ErbB2 con diana en el dominio intracelular y se basa en la tincion citoplasmatica diferencial. Sin embargo, los metodos basados en la inmunofluorescencia presentan una sensibilidad limitada (-10.000 receptores en cada celula) y no pueden detectar niveles bajos de p95ErbB2 que controlan la proliferacion tumoral. Ademas, el polipeptido p95ErbB2 funcional se encuentra localizado sobre la membrana celular y no en el citoplasma. Ademas, resulta diffcil diferenciar entre ErbB2 internalizado en el citoplasma y p95ErbB2 en el citoplasma.

El nuevo metodo de ensayo ultrasensible y altamente espedfico que se describe en la presente memoria supera las limitaciones de los metodos actuales de deteccion de p95ErbB2 y puede utilizarse en una amplia diversidad de muestras clmicas, tales como aspirados con aguja fina, biopsias cilindro y celulas tumorales circulantes (CTC) obtenidas a partir de sangre. Ademas de medir p95ErbB2, el metodo de la invencion es capaz de detectar la activacion de los cuatro miembros de la familia de ErbB conjuntamente con PTEN e IGF-1R a partir de cantidades minusculas de material biologico.

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Metodos ejemplares

La figura 13 muestra que ErbB2 de longitud completa puede extraerse de muestras clmicas utilizando anticuerpos que se unen al dominio extracelular de Erb2 unido a una perla de poliestireno o a un dextrano polimerico. El ensayo aprovecha la rapida cinetica de la union en fase solucion, la extraccion selectiva de protema de longitud completa por anticuerpos receptores unidos a las perlas y la incapacidad de las protemas unidas a perla de unirse a una matriz plana. Alternativamente, pueden utilizarse perlas cargadas magneticamente para retener ErbB2 de longitud completa y solo se aplicana p95ErbB2 truncado a la micromatriz.

El metodo de ensayo "A", posteriormente, ilustra la deteccion de p95ErbB2 utilizando un ensayo de proximidad de elevadas sensibilidad y especificidad. El metodo de ensayo "B", posteriormente, ilustra la deteccion de p95ErbB" utilizando un unico anticuerpo. Estos metodos para detectar protemas truncadas pueden aplicarse a varias protemas diferentes, entre ellas, aunque sin limitacion, p95ErbB2, el mutante V111 de RFCE (que participa en el glioblastoma, el cancer colorrectal, etc.), otros receptores tirosina quinasa truncados, caspasas y similares.

A. Deteccion dual de proximidad de receptores truncados utilizando ELISA de micromatrices con amplificacion de senales de tiramida.

El presente ejemplo ilustra un ELISA multiplex de alto rendimiento en micromatriz de proximidad de deteccion dual que presenta un rango dinamico superior, que resulta adecuado para analizar detectar receptores truncados tales como p95ErbB2 en celulas circulantes raras:

1) se imprimieron anticuerpos de captura sobre un portaobjetos FAST de 16 celdas (Whatman Inc.) con una dilucion de entre 1 y 0,004 mg/ml.

2) Tras secar durante la noche, el portaobjetos se bloqueo con tampon de bloqueo de Whatman.

3) Se anadieron 80 ml de lisado celular BT474 a cada portaobjetos con o sin perlas recubiertas con anticuerpo (extracelular) anti-ErbB2 con una dilucion en serie de 10 veces. Se incubo el portaobjetos durante dos horas a temperatura ambiente.

4) Tras seis lavados con TBS-Tween, se anadieron 80 ml de anticuerpos de deteccion para el ensayo de proximidad diluidos en TBS-Tween/BSA al 2%/FBS al 1% a los portaobjetos. Los anticuerpos de deteccion utilizados fueron: (1) un anticuerpo anti-ErbB2 espedfico para el dominio intracelular de ErbB2 que se conjuga directamente a glucosa oxidasa (GO), y (2) un anticuerpo monoclonal que reconoce ErbB2 fosforilado que se conjuga directamente con peroxidasa de rabano picante (PRP). La incubacion fue de 2 horas a temperatura ambiente.

5) Para la amplificacion de senales, se anadieron 80 ml de biotina-tiramida a una concentracion de 5 mg/ml y se hicieron reaccionar durante 15 minutos conjuntamente con glucosa 50 mM. El portaobjetos se lavo seis veces con TBS-Tween, dos veces con DMSO al 20%/TBS-Tween y una vez con TBS. Se anadieron 80 ml de SA-Alexa 555 y se incubaron durante 30 minutos. A continuacion, se lavo el portaobjetos dos veces, se seco durante 5 minutos y se analizo en un escaner de micromatrices (Perkin-Elmer, Inc.).

6) A tttulo de ejemplo no limitativo, el portaobjetos 1 puede informar sobre la activacion total de ErbB2, mientras que el portaobjetos 2 puede informar sobre la activacion de ErbB2 truncada. Basandose en la cantidad de ErbB2 activado o truncado total en la muestra, puede seleccionarse una terapia apropiada.

B. Deteccion de receptores truncados utilizando ELISA de micromatrices con amplificacion de senales de tiramida.

El presente ejemplo ilustra un ELISA multiplex de alto rendimiento en micromatriz de proximidad de deteccion unica que presenta un rango dinamico superior, que resulta adecuado para analizar detectar receptores truncados tales como p95ErbB2 en celulas circulantes raras:

1) Se imprimio anticuerpo de captura sobre un portaobjetos FAST de 16 celdas (Whatman Inc.) con una dilucion de entre 1 y 0,004 mg/ml.

2) Tras secar durante la noche, el portaobjetos se bloqueo con tampon de bloqueo de Whatman.

3) Se anadieron 80 ml de lisado celular BT474 a cada portaobjetos con o sin perlas recubiertas con anticuerpo (extracelular) anti-ErbB2 con una dilucion en serie de 10 veces. Se incubo el portaobjetos durante dos horas a temperatura ambiente.

4) Tras seis lavados con TBS-Tween, se anadieron 80 ml de anticuerpos de deteccion para el ensayo de proximidad diluidos en TBS-Tween/BSA al 2%/FBS al 1% a los portaobjetos. El anticuerpo de deteccion utilizado era un anticuerpo anti-ErbB2 espedfico para el dominio intracelular de ErbB2 directamente conjugado con PRP. La incubacion fue de 2 horas a temperatura ambiente.

5) Para la amplificacion de senales, se anadieron 80 ml de biotina-tiramida a una concentracion de 5 mg/ml y se hicieron reaccionar durante 15 minutos conjuntamente con peroxido de hidrogeno 1 mM. El portaobjetos se lavo seis veces con TBS-Tween, dos veces con DMSO al 20%/TBS-Tween y una vez con TBS.

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6) Se anadieron 80 ml de SA-Alexa 555 y se incubaron durante 30 minutes. A continuacion, se lavo el portaobjetos dos veces, se seco durante 5 minutes y se analizo en un escaner de micromatrices (Perkin-Elmer, Inc.).

7) A trtulo de ejemplo no limitativo, el portaobjetos 1 puede informar sobre la activacion total de ErbB2, mientras que el portaobjetos 2 puede informar sobre la activacion de ErbB2 truncada. Basandose en la cantidad de ErbB2 activado o truncado total en la muestra, puede seleccionarse una terapia apropiada.

Una realizacion de la presente invencion para detectar un receptor truncado tal como p95ErbB2 se muestra en la figura 14. La figura 14A muestra que las perlas recubiertas con un anticuerpo dirigido contra el dominio extracelular (DEC) de un receptor de interes se une al receptor de longitud completa pero no al receptor truncado para eliminar cualquier receptor de longitud completa del ensayo. La figura 14B muestra que el receptor truncado, una vez unido a un anticuerpo de captura, seguidamente puede detectarse con un anticuerpo de deteccion que es espedfico para el dominio intracelular (DIC) del receptor de longitud completa. El anticuerpo de deteccion puede conjugarse directamente con peroxidasa de rabano picante (PRP). A continuacion puede llevarse a cabo la amplificacion de senales de tiramida (AST) para generar una senal que debe detectarse.

Con respecto a p95ErbB2, la figura 15 muestra que el pretratamiento con perlas recubiertas con un anticuerpo dirigido contra el dominio extracelular (DEC) de ErbB2 (HER-2) elimino practicamente por completo la senal de ErbB2 de longitud completa sin afectar a la senal de dominio intracelular (DIC) de ErbB2. La reduccion de la senal de ErbB2 de longitud completa era dependiente de la concentracion de las perlas con acoplamiento de anticuerpo de DEC de HER-2 que se utilizaron en el ensayo, ya que el incremento de la cantidad de perlas con anticuerpo acoplado de 4 pg/l a 12 pg/ml redujo la senal de ErbB2 de longitud completa de 9,59% a 2,84%.

Las figuras 16 y 17 confirman que p95ErbB2 era detectado espedficamente utilizando los metodos de ensayo descritos anteriormente. Tal como se muestra en la figura 16, el tratamiento de APMA (acetato (4- aminofenil)mercurico) incremento la fosforilacion de p95ErbB2 en celulas BT474. La figura 17 muestra que la heregulina incrementa la fosforilacion de p95ErbB2 en celulas T47D.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, los metodos descritos anteriormente para la deteccion de protemas truncadas tales como p95ErbB2 en una muestra de paciente proporcionan por lo menos las ventajas siguientes respecto a metodos disponibles actualmente:

1) Mayor sensibilidad, proporcionando la capacidad de detectar receptores truncados a partir de celulas individuales.

2) Mayor especificidad.

3) La capacidad de informar de una ruta entera utilizando micromatrices multiplexadas en lugar de una unica protema.

4) Escalabilidad.

Ejemplo 13. Seleccion de pacientes para el tratamiento con cancer de mama invasivo sin afectacion ganglionar de estadio I o II, tras la identificacion del riesgo de recurrencia con un panel de expresion genica.

Se han desarrollado paneles de marcadores de expresion genica que predicen la probabilidad de pronostico y/o recurrencia de cancer de mama en diversas poblaciones de mujeres con, por ejemplo, enfermedad sin afectacion ganglionar. Estos paneles genicos pueden resultar utiles para identificar mujeres que es improbable que experimenten recurrencia y, de esta manera, que es improbable que se beneficien de la quimioterapia adyuvante. Los paneles de expresion pueden utilizarse para identificar mujeres que pueden evitar con seguridad la quimioterapia adyuvante, sin afectar negativamente los resultados de periodo sin enfermedad y de supervivencia global. Entre los sistemas adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, Oncotype DXTM, que es un panel de 21 genes de Genomic Health, Inc. (Redwood City, CA); MammaPrint®, que es un panel de 70 genes de Agendia (Amsterdam, Pafses Bajos), y un panel de 76 genes de Veridex (Warren, NJ). Estos paneles pueden utilizarse conjuntamente con el analisis de la activacion de rutas para determinar la necesidad de incluir quimioterapia con las terapias dirigidas apropiadas seleccionadas utilizando los metodos descritos en los Ejemplos anteriores.

El protocolo siguiente proporciona una realizacion ejemplar de la presente invencion en la que se utiliza el perfilado de expresion genica conjuntamente con el perfilado del estado de activacion para seleccionar la terapia dirigida apropiada o la combinacion de terapias dirigidas para el tratamiento del cancer de mama:

1) se recoge una muestra tumoral con un grosor mmimo de 3 mm y un grosor maximo de 5 mm utilizando un punzon para biopsias. La biopsia se introduce directamente en el tubo para muestras que contiene conservante RNARetain™. El tubo se envfa inmediatamente a Agendia para su analisis con el ensayo MammaPrint®.

2) El informe de ensayo de Agendia asigna el paciente al grupo de "buena" firma/riesgo bajo o a un grupo de "mala" firma/riesgo alto. En el caso de que el paciente se encuentre en el grupo de riesgo bajo, puede evitar con seguridad la quimioterapia adyuvante sin afectar su nivel de supervivencia sin enfermedad y global.

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3) El ensayo MammaPrint® resulta aplicable a pacientes tanto positivos para RE como negativos para RE. Tras determinar el estatus de RE y de ErbB2, el paciente es asignado a una de las subclases de cancer de mama indicadas en el Ejemplo 8. Las cuatro subclases principales eran las siguientes:

1. RE+/RP+/ErbB2-

2. RE+/ErbB2+

3. RE-/ErbB2+

4. ER-/RP-/ErbB2

4) Se a^slan celulas tumorales (por ejemplo CTC) a partir de sangre y se preparan para el analisis tal como se describe en el Ejemplo 1. Alternativamente, puede utilizarse una biopsia con aguja fina para preparar un extracto de celulas tumorales tal como se describe en el Ejemplo 2. Las preparaciones celulares se someten a ensayo tal como se describe en el Ejemplo 3 o 4. El perfil de activacion se evaluo de manera similar tal como se describe en el Ejemplo 8 (Tablas 4 a 22), Ejemplo 9 (Tablas 23 a 31) y Ejemplo 10 (Tablas 32 a 35). Se selecciona la terapia dirigida o combinacion de terapias dirigidas apropiada. En el caso de que el paciente se encuentre en el grupo de riesgo bajo, no se anade ninguna quimioterapia. En el caso de que el paciente se encuentre en el grupo de riesgo elevado, la quimioterapia seleccionada por el medico basandose en la informacion clmica se anade a las terapias dirigidas.

Ejemplo 14. Seleccion de pacientes para el tratamiento tras la determinacion del tejido primario de origen mediante un panel de expresion genica.

Aproximadamente 3% a 5% de todos los tumores metastasicos se clasifican en la categona de cancer de tumor primario desconocido (TPD). El diagnostico correcto del tejido de origen resulta importante en las decisiones de tratamiento debido a que las terapias actuales se basan en gran parte en el sitio anatomico. Los paneles de expresion genica pueden resultar utiles para identificar mujeres con cancer metastasico que se beneficianan de una terapia consistente con la administrada en mujeres diagnosticadas inicialmente con cancer de mama. Entre los sistemas adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el ensayo de TPD de Rosetta Genomics, que clasifica los canceres y tejidos de origen mediante el ensayo de los patrones de expresion de los microARN (ver, por ejemplo, la solicitud publicada de patente PCT n° WO 08/117278); el ensayo CancerTYPE IDTM de Aviara DX (Carlsbad, CA), un ensayo de expresion basado en RT-PCR que mide 92 genes para identificar el sitio primario de origen de 39 tipos tumorales, y el ensayo Pathwork®Tissue of Origin Test (Sunnyvale, CA), que mide la expresion de mas de 1.600 genes en una micromatriz y compara la "firma" de expresion genica de un tumor con la de 15 tipos de tejido conocidos. Tras identificar que en el paciente la mama es el tejido de cancer primario, pueden utilizarse perfiles de activacion de rutas para seleccionar las terapias dirigidas apropiadas que deben incluirse en el programa de tratamiento.

El protocolo siguiente proporciona una realizacion ejemplar de la presente invencion en la que se utiliza el perfilado de expresion genica conjuntamente con el perfilado del estado de activacion para seleccionar la terapia dirigida apropiada o la combinacion de terapias dirigidas para el tratamiento del cancer de mama:

1) Se obtienen del paciente dos o mas portaobjetos con secciones de 7 mm de grosor de un tejido extirpado quirurgicamente o mediante biopsia con aguja fina, de un tumor metastasico. Estas celulas se fijan en formalina y se incluyen en parafina (FFPE). Un portaobjetos adicional tenido con H&E del mismo tumor se tine con H&E.

2) Un patologo revisa el portaobjetos tenido con H&E e indica el area que debe recolectarse para el ensayo CancerTYPE ID™. Los portaobjetos se envfa a Aviara DX para el analisis.

3) El informe de ensayo de Aviara DX indica los 5 sitios de origen mas probables segun un analisis del vecino k mas proximo y se deriva una prediccion. En el caso de que la prediccion para el paciente sea que el tumor de origen desconocido es de mama, pueden evaluarse las celulas tumorales del paciente para la activacion de rutas.

4) Se afslan celulas tumorales (por ejemplo CTC) a partir de sangre y se preparan para el analisis tal como se describe en el Ejemplo 1. Alternativamente, puede utilizarse una biopsia con aguja fina para preparar un extracto de celulas tumorales tal como se describe en el Ejemplo 2. Las preparaciones celulares se someten a ensayo tal como se describe en el Ejemplo 3 o 4. El perfil de activacion se evaluo de manera similar tal como se describe en el Ejemplo 8 (Tablas 4 a 22), Ejemplo 9 (Tablas 23 a 31) y Ejemplo 10 (Tablas 32 a 35). Se selecciona la terapia dirigida o combinacion de terapias dirigidas apropiada.

Ejemplo 15. Conjunto nuevo de ensayos de cancer de mama utilizando ensayos de proximidad.

Antecedentes:

En 2008, se identifico un total estimado de 182.460 nuevos casos de cancer de mama invasivo en mujeres de los E.E.U.U. Aproximadamente 20% de mujeres con cancer de mama presentaba una sobreexpresion de HER-2 en el momento del diagnostico. Los canceres de mama con sobreexpresion de HER-2 (positivos para HER-2) se asocian a formas mas agresivas de cancer y por lo tanto resultan en tasas de supervivencia mas bajas y tasas de recurrencia mas altas. Los pacientes positivos para HER-2 con frecuencia se tratan con el farmaco de anticuerpo monoclonal trastazumab (Herceptin®). Sin embargo, la Herceptin® es un tratamiento caro y potencialmente cardiotoxico; por lo

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tanto, es imperativa una identificacion exacta de los candidatos para optimizar los resultados clmicos. La Herceptin® actua bloqueando HER-2 y por lo tanto reduce el crecimiento de las celulas tumorales. El lapatinib (Tykerb®) es un inhibidor de quinasa de molecula pequena utilizado frecuentemente para pacientes en los que ha fracasado la terapia con Herceptin®.

Opciones de ensayo de HER-2 actuates:

El estatus de HER-2 tfpicamente se evalua mediante: (1) ensayo de protema receptora utilizando un ensayo inmunohistoqmmico (IHC), o (2) la amplificacion genica utilizando una tecnica de ensayo de hibridacion fluorescente in situ (FISH). Sin embargo, se acepta de manera general que los metodos de ensayo actuales no son exactos y pueden ser muy variables entre laboratorios y que pueden variar segun diferencias en la manipulacion de los espedmenes antes de su recepcion en el laboratorio. De hecho, la evidencia disponible sugiere que aproximadamente 20% de los ensayos de HER-2 actuales podnan ser inexactos (ASCO/CAP Guidelines for HER-2 Testing in Breast Cancer, J. Clin. Oncology, 2007).

Ensayos de cancer de mama basados en un ensayo de proximidad:

El nuevo conjunto de ensayos de cancer de mama descrito en el presente ejemplo aprovecha los ensayos multiplex de proximidad (es decir, de tres anticuerpos) de alto rendimiento descritos en la presente memoria. Estos ensayos diagnosticos resultan particularmente utiles para determinar la expresion y la activacion de HER-2 en las celulas tumorales circulantes (CTC) o en el lfquido aspirado con aguja fija (AGF) de pacientes con cancer de mama, y ayudara en la seleccion de la terapia para los pacientes con cancer de mama.

El protocolo siguiente describe el formato estandar utilizado para todos los ensayos indicados en el presente ejemplo:

1. Recogida de la muestra de sangre:

a. Recoger dos tubos de 7,5 ml con sangre.

b. Utilizar las perlas magneticas con molecula de adhesion a celulas epiteliales (EpCAM) de Veridex, con proteinas de union espedficas para las celulas epiteliales para separar las celulas tumorales circulantes (CTC) de otros componentes de la sangre.

c. Lavar la muestra.

2. Activar una muestra (se activaran unicamente las celulas vivas) y lisar las celulas en la misma.

3. Lisar las celulas de la otra muestra.

4. (Esta es la etapa que es variable segun el ensayo) Utilizar ensayos de proximidad en micromatriz para detectar dos proteinas (por ejemplo proteinas de transduccion de senales) y citoqueratina en la muestra activada para cuantificar las proteinas activadas totales y la citoqueratina:

a. Se fijan a la micromatriz tres anticuerpos monoclonales, espedficos de las dos proteinas y citoqueratina (CK).

b. La muestra se vierte sobre el chip micromatriz, permitiendo que los analitos se unan a los anticuerpos monoclonales espedficos de los mismos.

c. Se vierte sobre el chip micromatriz (dos anticuerpos monoclonales por cada analito) una mezcla de seis anticuerpos monoclonales adicionales. Con el fin de que se produzca fluorescencia en el sitio de un analito, deben unirse a ese analito los tres anticuerpos monoclonales espedficos (el anticuerpo que se encuentra fijo y los dos anticuerpos que se han vertido).

5. Analisis en micromatriz de las dos proteinas en la muestra inactivada para cuantificar las proteinas totales.

6. Cada resultado de protema activada se calibra con la muestra inactivada. Esto rinde los resultados de protema cuantitativos con un resultado "+" o "-" para cada uno de los tres analitos.

Producto A [Herceptin®]: el presente ensayo es un ensayo de activacion de ErbB de lmea base para detectar la activacion/fosforilacion de hER-2. El presente ensayo tambies es un ensayou de activacion de ErbB mejorado para la utilizacion con pacientes de estadio III y IV para determinar las discrepancias de HER-2. Se llevaron a cabo ensayos de proximidad en micromatriz para detectar ErbB1/HER-1, ErbB2/HER-2 y citoqueratina en la muestra activada con el fin de cuantificar las protemas activadas totales y la citoqueratina. Se utilizaron anticuerpos monoclonales contra ErbB1/HER-1 y ErbB2/HER-2, mientras que se utilizo un anticuerpo de la pancitoqueratina para las celulas epiteliales. La senal cuantitativa describe los niveles de activacion y expresion de las protemas HER-2 y HER-1. La puntuacion de activacion relativa se deriva a partir de una proporcion entre fosforilacion y expresion. El ensayo cuantifica: la activacion de HER-2 (fosforilacion), la expresion de HER-2, la activacion de HER-1 (fosforilacion), la expresion de HER-1 y la pancitoqueratina (para la normalizacion del numero de celulas). El ensayo presenta una sensibilidad elevada ya que la activacion de HER-2 se detecta en celulas tumorales circulantes individuales. El ensayo tambien presenta una especificidad > 99% medida por una reactividad cruzada inferior a 1% con otros marcadores. Reproducibilidad (intraensayo): CV = 5-15%. Reproducibilidad (entre ensayos): CV = 10-20%. El informe de ensayo proporciona lo siguiente: (1) la fosforilacion de hER-2 y HER-1, informada como una cantidad cuantitativa y como positiva o negativa; (2) la expresion de HER-2 y HER-1, informada como una cantidad

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cuantitativa y como positiva o negativa, y (3) la cuantificacion de la citoqueratina. En el caso de que los niveles de HER-1 y HER-2 sean normales pero los niveles de citoqueratina sean elevado, esto sena diagnostico del cancer de mama pero no indicana la utilizacion de terapias dirigidas a HER-1 o HER-2.

Producto B [Ensayo de inclusion de Tykerb®]: el presente ensayo es un ensayo de activacion de ErbB mejorado que incluye la deteccion de HER-2 p95 y RFCE. En particular, es un ensayo de inclusion de terapia con lapatinib (Tykerb®) para pacientes positivos para HER-2 en los que ha fracasado el tratamiento con Herceptin®. El presente ensayo ayuda en la seleccion y seguimiento de los pacientes de Herceptin® y en el cambio de los pacientes bajo terapia con Herceptin® a terapia con Tykerb®. Se llevaron a cabo ensayos de proximidad en micromatriz para detectar ErbB1/HER-1, p95HER-2 y citoqueratina en la muestra activada con el fin de cuantificar las protemas activadas totales y la citoqueratina. Se utilizaron anticuerpos monoclonales contra ErbB1/HER-1 y p95HER-2, mientras que se utilizo un anticuerpo de la pancitoqueratina para las celulas epiteliales. El ensayo cuantifica: la activacion de HER-2 p95 (fosforilacion), la expresion de HER-2 p95, la activacion de HER-1 (fosforilacion), la expresion de HER-1 y la pancitoqueratina (para la normalizacion del numero de celulas). El presente ensayo puede validarse en un ensayo clmico de pacientes metastasicos con enfermedad HER-2 p95 que habfan sido clasificados previamente como positivos para HER-2 basandose en IHC o FISH y en los que habfa fracasado la Herceptin®. Los pacientes que demuestran activacion de HER-2 p95 y HER-1 basandose en el ensayo de proximidad pueden tratarse con Tykerb®. El ensayo mostrara un beneficio en supervivencia global en pacientes positivos para HER-2 p95 tratados con Tykerb®. Debido a que HER-2 p95 no presenta el dominio extracelular de union a Herceptin® de HER-2, los niveles elevados de HER-2 p95 descartanan la Herceptin® y por el contrario indicanan la utilizacion de Tykerb®. Sin embargo, en el caso de que los niveles de HER-1 y HER-2 sean normales pero los niveles de citoqueratina sean elevados, esto sena diagnostico de cancer de mama pero no indicana la utilizacion de terapias dirigidas a HER-1 o HER-2.

La figura 18 muestra multiples puntos en los que pueden utilizarse los metodos de la presente invencion para influir sobre la practica clmica con respecto a la seleccion de la terapia para el cancer de mama apropiada para un paciente particular.

Ejemplo 16. Preparacion de dextrano activado por sulfhidrilo.

El presente ejemplo describe un protocolo para incorporar grupos sulfhidrilo libres en una molecula de dextrano. Tal como se ilustra en el Ejemplo 17, las moleculas de dextrano modificadas por sulfhidrilo pueden utilizarse para preparar conjugados con un anticuerpo y glucosa oxidasa (GO) para la utilizacion en los ensayos de deteccion individual y de proximidad descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, una molecula de dextrano de 500 kDa activada con sulfhidrilo puede conjugarse con un anticuerpo y GO de manera que la proporcion de anticuerpo:GO:dextrano sea de 2:12:1. La conjugacion de una molecula de dextrano de 500 kDa activada con sulfhidrilo con el anticuerpo y GO incrementa ventajosamente la sensibilidad del ensayo en aproximadamente 10 veces. En otras realizaciones, puede conjugarse con un anticuerpo y peroxidasa de rabano picante (HRP) una molecula de dextrano de 70 kDa activada por sulfhidrilo.

Definiciones y acronimos:

1. Dextrano = un polfmero de glucosa

2. Acido clortndrico = HCl

3. Hidrocloruro de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida = EDC

4. Solucion salina tamponada con fosfato = PBS

5. Hidroxido sodico = NaOH

6. Acido 2-morfolinoetanosulfonico = MES

7. Acido etilendiaminatetraacetico = EDTA

Instrumentos y equipos:

1. Bano de agua (Fisher, Isotemp 210)

2. Lector de placas de ELISA (Molecular Devices, SpectraMAX1900)

3. Lavador de placas de ELISA (Nunc, Nunc-Immuno Wash 8)

4. Mezclador vortex (Fisher, Vortex Mixer)

5. Liofilizador (Virtis, Freezemobile 12)

6. Centnfuga (Beckman, GS-6R)

7. Agitador magnetico (Coming, PC-410D)

8. Equipo para generar agua NANOpura (Barnstead, NANOpure Diamond)

9. Casete de dialisis (Pierce, 66380)

Reactivos, compuestos qmmicos y proveedores:

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1. Dextrano 500 kDa (Fisher BP1580-100)

2. Acido bromoacetico (Sigma, 259357)

3. Hidroxido sodico (Fisher, S318-500)

4. Isopropanol (Fisher, A451-4)

5. Acido clorhndrico 12 N (Fisher, A144-500)

6. Cisteamina (Sigma, M9768)

7. Hidrocloruro de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (Pierce, 22980)

8. Solucion salina tamponada con fosfato (Cellgro, 21-040-CV)

9. Solucion de acido etilendiaminatetraacetico 0,5 M (GIBCO, 15575-038)

10. Acido 2-morfolinoetanosulfonico (Fluka 69892)

11. Solucion salina tamponada con fosfato 10X (Fisher, BP399-500)

Tampones y soluciones:

1. NaOH 2,9 M: disolver 5,8 g de hidroxido sodico en 50 ml de agua nanopura.

2. Solucion de tampon MES 50 mM: disolver 5,33 g de acido 2-morfolinoetanosulfonico en 500 ml de agua

NANOpura y ajustar el pH a 4,5 utilizando HCl 12 N.

3. Tampon de dialisis: anadir 10 ml de solucion de EDTA 0,5 M y 100 ml de PBS 10X a 890 ml de agua

nanopura hasta alcanzar una concentracion final de 5 mM de EDTA en PBS.

Procedimiento:

Incorporacion de grupos carboxilo en dextrano:

1. A un gramo de dextrano 500 kDa (2 mmoles) disuelto en 8,5 ml de NaOH 2,9 M en una probeta de polipropileno de 50 ml con tapon enroscable se anadieron 850 mg de acido bromoacetico. Tras mezclar intensamente con vortex, el tubo se incubo en un bano de agua a 50°C durante la noche.

2. Tras la incubacion, se anadio isopropanol a la mezcla de reaccion hasta una concentracion final de 70% (v/v) para precipitar el dextrano carboxilado. Tras mezclar con un mezclador vortex, la solucion se centrifugo a 3.000 rpm en una centnfuga Beckman a temperatura ambiente durante 15 minutos y se descarto el sobrenadante.

3. El precipitado se redisolvio en 10 ml de agua nanopura y se repitio dos a tres veces adicionales la precipitacion con isopropanol hasta no obtener mas precipitado con la adicion de isopropanol. A continuacion, la solucion transparente de isopropanol al 70% se ajusto a pH 4 con HCl 12 N mezclando con vortex para regenerar el precipitado y la mezcla se centrifugo nuevamente a 3.000 rpm en la centnfuga Beckman durante 15 minutos para precipitar el dextrano carboxilado y se descarto el sobrenadante.

4. Para eliminar el acido bromoacetico residual, el precipitado se redisolvio en 10 ml de agua nanopura y se ajusto el pH de la solucion a 4 con HCl. A continuacion, se anadio isopropanol hasta el 70% en volumen para precipitar el dextrano carboxilado. Tras mezclar con un mezclador vortex, la solucion se centrifugo a 3.000 rpm en una centnfuga durante 15 minutos y se descarto el sobrenadante. Este procedimiento de lavado se repitio un total de tres veces.

5. Tras el ultimo lavado, el precipitado se disolvio nuevamente en 10 ml de agua nanopura y la solucion se liofilizo a sequedad en el liofilizador para eliminar el HCl.

6. El dextrano carboxilado liofilizado se almaceno a -70°C.

Conversion de los grupos carboxilo en el dextrano carboxilado en grupos sulfhidrilo:

1. Disolver 10 mg del dextrano carboxilado liofilizado en 0,5 ml de tampon MES 50 mM, pH 4,5 en un tubo de vidrio marron de 2 ml.

2. A la solucion de dextrano carboxilado se anaden 1,42 mg de EDC y la mezcla se agita a 40°C durante 30 minutos.

3. A continuacion, se anaden diez miligramos de cisteamina a la mezcla y la solucion resultante se agita durante una hora adicional a 4°C.

4. Tras agitar, la mezcla se transfiere a un casete de dialisis de 0,5 a 3,0 ml con un valor de corte de peso molecular de 10.000 y se dializa frente a 500 ml de PBS, pH 7,4, a 4°C durante la noche.

5. A continuacion, el tampon de dialisis se cambia a EDTA 5 mM/PBS y se dializa durante dos horas adicionales. El procedimiento de dialisis se repite una vez adicional.

6. El numero total de grupos sulfhidrilo incorporados en cada molecula de dextrano de 500 kDA se determina mediante ensayo de Ellman.

7. Se preparan alfcuotas de cincuenta microlitros de la solucion de dextrano con incorporacion de sulfhidrilos en tubos Eppendorf de 1 ml y se liofilizan las alfcuotas. Las alfcuotas liofilizadas se mantienen a -70°C durante el almacenamiento.

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Ejemplo 17. Preparacion de un conjugado de anticuerpo de HER2-glucosa oxidasa-dextrano.

El presente ejemplo describe un procedimiento para conjugar un anticuerpo de HER-2 dirigido a un dominio extracelular y glucosa oxidasa (GO) con una molecula de dextrano de 500 kDa activada por sulfhidrilo. El conjugado de anticuerpo de HER2-GO-dextrano puede utilizarse en los ensayos de deteccion individual y de proximidad descritos en la presente memoria.

Definiciones y acronimos:

1. Succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1-carboxil-(6-amidocaproato) = LC-SMCC

2. Dimetilsulfoxido = DMSO

3. Hidroxido sodico = NaOH

4. Acido clortffdrico concentrado = HCl

5. Solucion salina tamponada con fosfato = PBS

6. Acido etilendiaminatetraacetico = EDTA

7. Sal sodica de acido 2-(etilmercuriomercapto)benzoico = Timerosal

8. HPLC = Cromatograffa ffquida de Alto Rendimiento

Instrumentos y equipos:

1. Sistema HPLC (Agilent Technologies; serie 1100)

2. Columna de cromatograffa de exclusion por tamano (Phenomenex, BioSep-SEC-S 3000)

3. Espectrofotometro (Hitachi; U-200)

4. Centnfuga (Beckman, GS-6R)

5. Agitador magnetico (Coming, PC-410D)

6. Lector de placas de ELISA (Molecular Devices, SpectraMAX190)

7. Mezclador vortex (Fisher Scientific, 02-215-365)

8. Columna de desalado (Pierce, 43230)

9. Aparato Centricon YM-10 (Millipore, 4205)

10. Pipeta de 1 pl (Rainin, L-1000)

11. Pipeta de 200 pl (Rainin, L-200)

12. Pipeta de 20 pl (Rainin, L-20)

13. Pipeta de 2 pl (Rainin, L-2)

14. Pipeta multicanal (Rainin, L8-200)

Reactivos, compuestos qmmicos y proveedores:

1. Anticuerpo monoclonal de raton anti-HER-2 humano a una concentracion de 1 mg/ml en PBS (Lab Vision, MS- 301-PABX)

2. Glucosa oxidasa dializada (Prometheus)

3. Dextrano activado por sulfhidrilo (Prometheus)

4. LC-SMCC = Succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1-carboxil-(6-amidocaproato) (Fisher, 22362)

5. DMSO = Dimetilsulfoxido (Sigma, D2650)

6. Albumina de suero bovino (Sgima, A3294)

7. Hidroxido sodico (Fisher, S318-500)

8. Acido clortffdrico concentrado (Fisher, A144-500)

9. PBS = Solucion salina tamponada con fosfato (Cellgro, 21-040-CV)

10. Solucion de acido etilendiaminatetraacetico 0,5 M (Invitrogen, 1758)

11. Timerosal (Sigma, T8784)

Tampones y soluciones:

1. Tampon EDTA 5 mM/PBS desgasificado, pH 7,2: anadir 2 ml de solucion de EDTA 0,5 M a 200 ml de PBS y despues burbujear gas argon en la solucion resultante durante 5 minutos para eliminar todos los demas gases en la solucion.

2. Solucion de BSA al 10%/PBS: Disolver 100 mg de BSA en 10 ml de PBS y filtrar la solucion por un filtro de 0,2 pm. La solucion se mantiene en un congelador a -20°C.

3. Solucion de timerosal al 10%/PBS: Disolver 100 mg de timerosal en 10 ml de PBS y filtrar la solucion por un filtro de 0,2 pm. La solucion se mantiene en un congelador a -20°C.

4. TF 0,1 M (tampon fosfato), pH 6,8.

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Procedimiento:

Preparacion de la solucion de CL-SMCC para el uso immediate en la reaccion de activacion:

1. Sacar una botella de LC-SMCC del congelador a -20°C y dejar que se caliente hasta la temperature ambiente.

2. Pesar entre 1 y 2 mg de LC-SMCC en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y anadir el volumen correcto de DMSO para preparar una solucion de 4,5 mg/ml (LC-SMCC 10 mM). Almacenar el LC-SMCC restante nuevamente en el congelador.

Activacion de LC-SMCC del anticuerpo de HER-2:

1. Anadir 2,3 ml de la solucion de CL-SMCC 10 mM a 0,5 ml de la solucion de anticuerpo de HER-2, que contiene 500 mg del anticuerpo y mezcla con vortex inmediatamente para iniciar la reaccion. Tras mezclar con vortex, se mantiene la mezcla a temperatura ambiente para continuar la reaccion durante 30 minutos.

2. Simultaneamente preequilibrar una columna de desalado mediante lavado de la misma con 50 ml de tampon de EDTA 5 mM/PBS desgasificado.

3. Tras completar la activacion de la glucosa oxidasa con LC-SMCC, la mezcla de activacion se carga en la columna de desalado y la columna se eluye con tampon de EDTA 5 mM/PBS desgasificado a temperatura ambiente. La solucion eluida se recoge en fracciones de 0,5 ml y se realiza un seguimiento de la absorbancia de U.V. a 280 nm con un espectrofotometro.

4. Las fracciones que contienen el anticuerpo activado segun las absorbancias de U.V. se agrupan y se mantienen sobre hielo para la reaccion siguiente.

Activacion con LC-SMCC de glucosa oxidasa:

1. Ajustar el volumen de 0,16 ml de glucosa oxidasa dializada, que contiene 4 mg del enzima, a 0,5 ml con el tampon de EDTA 5 mM/PBS desgasificado.

2. Anadir 12,4 ml de la solucion de LC-SMCC 10 mM a los 0,5 ml de solucion de glucosa oxidasa y se mezcla con vortex inmediatamente para iniciar la reaccion. Tras mezclar con vortex, se mantiene la mezcla a temperatura ambiente para continuar la reaccion durante 30 minutos.

3. Simultaneamente preequilibrar una columna de desalado mediante lavado de la misma con 50 ml de tampon de EDTA 5 mM/PBS desgasificado.

4. Tras completar la activacion de la glucosa oxidasa con LC-SMCC, la mezcla de activacion se carga en la columna de desalado y la columna se eluye con tampon de EDTA 5 mM/PBS desgasificado a temperatura ambiente. La solucion eluida se recoge en fracciones de 0,5 ml y se realiza un seguimiento de la absorbancia de U.V. a 280 nm con un espectrofotometro.

5. Las fracciones que contienen la glucosa oxidasa activada segun las absorbancias de U.V. se agrupan y se mantienen sobre hielo para la reaccion siguiente.

Conjugacion del anticuerpo de HER-2 activado y de la glucosa oxidasa activada con dextrano activado por sulfhidrilo: 1 2 3 4

1. A una alfcuota de 1 mg liofilizada de dextrano activado por sulfhidrilo se anadieron 50 ml de agua nanopura para preparar una solucion de 20 mg/ml de dextrano activado por sulfhidrilo.

2. A la solucion de anticuerpo activado agrupada se anadio un volumen de solucion combinada de glucosa oxidasa activada correspondiente a 3 mg de glucosa oxidasa, seguida de 34,3 pl de la solucion de dextrano modificada por sulfhidrilos, proporcionando una proporcion molar aproximada de anticuerpo:glucosa oxidasa:dextrano de 2:12:1. Tras mezclar con vortex, la mezcla se mantuvo a 4°C durante la noche.

3. El exceso de grupos sulfhidrilo remanente en el dextrano modificado se bloqueo mediante la adicion de 56,4 ml de solucion 1 mg/ml de N-etilmaleimida en tampon de EDTA/PBS 0,5 mM desgasificado y se continuo con la reaccion de bloqueo durante 3 horas a 4°C.

Purificacion de un conjugado de anticuerpo de HER2-glucosa oxidasa-dextrano:

1. Tras la reaccion de bloqueo, la solucion de anticuerpo de HER-2-glucosa oxidasa-dextrano se concentro a ~300 ml en un aparato Centricon dotado de una membrana YM-10 de valor de corte de peso molecular 10.000.

2. La solucion concentrada se transfirio a un tubo Eppendorf de 1,5 ml y el tubo se centrifugo a 16.000g durante 3 minutos para eliinar la pequena cantidad de precipitado.

3. El sobrenadante se transfirio a un vial de muestras de HPLC y el volumen de la solucion se ajusto a 320 ml con el tampon de EDTA/PBS 5 mM desgasificado para la purificacion mediante HPLC.

4. Se inyectaron cien microlitros de la solucion conjugada en una columna de exclusion por tamano BioSep-SE-S 300 en un sistema de HPLC de Agilent y la protema conjugada se separo mediante elucion con PB 0,1 M, pH

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5. El primer pico de absorcion de UV de las fracciones de elucion se agrupo y se reservo sobre hielo.

6. Los 200 ml restantes de la solucion conjugada se purificaron tambien de manera similar y se agrupo la totalidad de los primeros picos de absorcion de UV de las tres HPLC. La solucion conjugada agrupada se ajusto a BSA al 0,1% con la solucion de BSA al 10%/PBS y el timerosal al 0,02% con la solucion de timerosal al 10%/PBS para el almacenamiento a largo plazo a -70°C.

7. La actividad enzimatica de glucosa oxidasa presente en el conjugado de anticuerpo de HER-2-glucosa oxidasa-dextrano se determino mediante un ensayo funcional de glucosa oxidasa.

8. La actividad de anticuerpo presente en el conjugado de anticuerpo de HER-2-glucosa oxidasa-dextrano se determino mediante un ensayo de ELISA de competicion.

Ejemplo 18. Nuevo ensayo multiplexado para detectar la activacion de los receptores de tirosina quinasa de la familia de ErbB en una celula tumoral circulante.

Resumen:

El perfilado de expresion/activacion de quinasas y de otras moleculas de rutas de transduccion de senales en un muestreo en serie de tejidos tumorales proporciona informacion valiosa sobre los cambios producidos en las celulas tumorales como funcion del tiempo y las terapias. Este perfilado temporal de la progresion tumoral permite al medico realizar un seguimiento de las firmas de cancer en rapido cambio en cada paciente. El presente ejemplo ilustra un nuevo y robusto ensayo para detectar el nivel de expresion y el grado de fosforilacion de la familia de ErbB de receptores de tirosina quinasa (RTK) y demuestra las ventajas de utilizar dicho sistema diagnostico de grna de la terapia con sensibilidad al nivel de celulas individuales. El ensayo se basa generalmetne en muestras tales como aspirados con aguja fina (AGF) y sangre y consigue elevadas sensibilidad y especificidad para interrogar un numero limitado de celulas cancerosas obtenidas de dichas muestras.

Introduccion:

La aparicion y progresion del cancer puede estar asociadas a una expresion y activacion anormalmente reguladas de los receptores y de otros componentes de la ruta de transduccion de senales. La activacion anormal de HER-1 y HER-2 se ha asociado a diversos tipos de progresion del cancer. Los metodos de perfilado de los patrones de fosforilacion de HER-1 y HER-2 podnan proporcionar informacion valiosa sobre la patogenesis global de la enfermedad y por lo tanto conducir a una mejor seleccion de la terapia, al identificar las moleculas relevantes que causan la enfermedad. El ensayo descrito en la presente memoria se basa en (1) una plataforma micromatriz multiplex de protemas en combinacion con (2) un procedimiento de amplificacion de senales de triple canalizacion de anticuerpo-enzima. La plataforma micromatriz ofrece la ampliabilidad necesaria para adaptarse a multiples marcadores, asf como la escalabilidad requerida para su despliegue comercial. El nuevo diseno unico del ensayo descrito en la presente memoria lo proporciona el enfoque de triple anticuerpo-enzima, que proporciona sensibilidad ultraelevada, conservando la especificidad. En realizaciones en las que se utiliza el ensayo para detectar y cuantificar aquellas dianas que se encuentran fosforiladas, y por lo tanto activadas, el ensayo puede llevarse a cabo de la manera siguiente:

1. La diana seleccionada es capturada por anticuerpos espedficos de diana imprimidos en diluciones en serie sobre una superficie de micromatriz. La figura 19 ilustra una realizacion del ensayo de la presente invencion, el cual se basa en la colocalizacion de dos anticuerpos detectores adicionales unidos a enzimas para los sucesos de canalizacion posteriores para cada protema diana unida.

2. En la realizacion mostrada en la figura 19, el complejo inmunologico formado por la union inicial de la diana a anticuerpos de captura y la union secundaria de los anticuerpos conjugados con glucosa oxidasa (GO) que reconocen un epftopo alternativo en las moleculas diana capturadas produce H2O2 en presencia de un sustrato de GO, tal como glucosa. GO es uno de los enzimas mas rapidos que se conocen, con un numero de renovacion (TON) de 105/min.

3. En la realizacion mostrada en la figura 19, la influencia local espedfica de diana de H2O2 seguidamente es utilizada por anticuerpos espedficos de fosfopeptido conjugados con peroxidasa de rabano picante (HRP, con un TON de 104/min) para unirse al sitio fosforilado en las dianas capturas, amplificando de esta manera la senal espedfica de diana. La especificidad para la deteccion de las dianas fosforiladas se incrementa en gran medida a traves del procedimiento colaborativo de inmunodeteccion y amplificacion, dado el requisito de union simultanea de tres tipos diferentes de anticuerpo.

La deteccion y cuantificacion de tan solo aproximadamente 2-3x104 sucesos de fosforilacion se consigue rutinariamente mediante el ensayo descrito en la presente memoria, llevando su deteccion al nivel de celulas individuales. Esta configuracion colaborativa de inmunoensayo puede aplicarse adicionalmente a la investigacion de interacciones y estados de activacion de protemas.

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Metodos:

Cultivo de tejidos: se obtuvieron de ATCC las lmeas celulares SKBR3, MDA-MB-468, T47D y BT474. Las celulas se cultivaron en los medios de crecimiento siguientes en placas de cultivo de tejidos de 100 mm a 37°C en 5% de CO2: medio SKBR3-5A de MacCoy con FBS al 10%; MDA-MB-468-DMEM, FBS al 10%; BT474-DMEM, FBS al 10%; T47D-RPMI 1640, FBS al 10%, 0,2 U/ml de insulina bovina. Las celulas se recolectaron a una confluencia de 70% a 80% con un procedimiento suave de desprendimiento (tratamiento con tripsina + posterior inactivacion) y posteriormente se realizo un recuento y se lavaron con 1X PBS. Se llevo a cabo la estimulacion celular con FCE 100 |jM o heregulina P 20 jM o ambos en medio de crecimiento sin suero durante 5 minutos. A continuacion, las celulas estimuladas see lavaron con 1X PBS y despues se lisaron y se mantuvieron sobre hielo durante 30 minutos.

Impresion de portaobjetos: los anticuerpos de captura se diluyeron en 1x PBS con detergente. Se utilizo un impresor de micromatrices de contacto (Genetix) para la impresion sobre portaobjetos FAST de nitrocelulosa de 16 celdas (Whatman). El diametro de punto era de aproximadamente 175 mm y los portaobjetos impresos se guardaron en una camara desecada a 4°C.

Ensayo multiplex de proximidad: se incubaron los portaobjetos con tampon de bloqueo durante 1 hora y despues se lavaron 3X con tampon TBST. A continuacion, se anadieron los lisados celulares a cada celda para la incubacion durante la noche a temperatura ambiente (RT). Tras completarse la union primaria, los lisados se aspiraron y despues se lavo cada celda varias veces con TBST. A continuacion, se anadieron anticuerpos detectores secundarios (conjugados con GO o HRP) a cada celda durante 2 horas a RT. Los anticuerpos detectores secundarios no unidos se eliminaron mediante lavado con TBST y se anadio tampon de amplificacion de senales que contema glucosa y tiramida biotinilada a cada celda durante 15 minutos. Tras eliminar el exceso de tiramida biotinilada, se anadio estreptavidina conjugada con Alexa-647 para la deteccion de las senales.

Analisis de los datos: la cuantificacion se llevo a cabo utilizando el software ScanArray Express de Perkin Elmer, y los datos obtenidos se corrigieron para intensidades de fondo locales y globales. Se utilizo un archivo GAL (GenePixArray) para proporcionar el nombre descriptivo e informacion de identificador y se incorporo en el archivo de resultados del analisis de imagenes. Las senales de los puntos por triplicado se promediarion y los datos se normalizaron para corregir la variabilidad entre celdas. Se utilizo un modelo de regresion no lineal para la cuantificacion de la cantidad equivalente por celda para los valores correspondientes de unidades relativas de fluorescencia (URF). Los datos se ajustaron a una ecuacion de Hill de cinco parametros para generar las curvas de estandares. Se valido cada curva frente a controles conocidos. Se realizo una prediccion de numero conocido de celulas para la dilucion, correspondiente a la curva con la pendiente mas pronunciada en la intensidad de la muestra desconocida.

Transferencia western: tras obtener numeros aproximadamente iguales de lisados celulares para cada lmea celular, se dividieron en almuotas en viales de un solo uso. Se determino la concentracion de protemas utilizando un ensayo de protemas de acido bicinchomnico (BCA). Se prepararon muestras con tampon para muestras que contema p- mercaptoetanol, y tras someter a ebullicion durante 5 minutos y enfriar hasta la RT, las muestras se cargaron en un gel de NuPage al 4-12% conjuntamente con una escalera de protemas. Tras completar la electroforesis, las protemas separadas en el gel se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Se lavo la membrana, se bloqueo con blotto al 5% y se incubo en primer lugar con anticuerpos primarios y despues con secundarios, antes del procedimiento de deteccion con NBT/BCIP.

Resultados:

Sensibilidad: Se detecto la activacion y expresion de HER-1 y HER-2 a un nivel de sensibilidad de una celual individual en multiples lmeas celulares (MDA-MB-468, A431, BT-474 y SKBr-3). Estas lmeas celulares expresan aproximadamente 1x106 RTK totales sobre la membrana celular de cada celula, aunque solo llegan a fosforilarse subconjuntos de los RTK totales y esta fosforilacion resulta necesaria para la activacion de la ruta. Las celulas SKBR-3 presentan una activacion espontanea de HER-2 debido a su amplificacion y por lo tanto proporcionan una referencia de control positivo. Resulta necesario estimular las celulas MDA-MB-468 con FCE (TGF-a) para inducir la fosforilacion de HER-1 y puede utilizarse su firma antes y despues de la estimulacion a modo de controles negativos y positivos. MDA-MB-468 presenta una activacion de hER-1 marginal antes de la estimulacion, mientras que ambas lmeas celulares alcanzan un pico aproximadamente a 2-5% de sus RTK activadas (~0,5 a 1x105 sucesos de fosforilacion por celula). La figura 20 muestra que el formato de ensayo descrito en la presente memoria permite la deteccion de menos de 105 sucesos de activacion con sensibilidad de celulas individuales.

Tabla 43

Nivel relativo de expresion de ErbB Activacion de RTK por cada celula (URF/celula)

ErbB1 ErbB2 ErbB3 FCE HRG

pHER1

pHER2 pHER1 pHER2

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MDA MB 468

10 -- 2 4000 ND 4000 ND

BT 474

-- 10 3 96 1200 ND 1200

T47D

-- 2 4 60 80 ND 165

SKBR3

3 10 2 360 1334 105 353

Especificidad: la especificidad analftica del formato colaborativo de inmunoensayo descrito en la presente memoria fue de >99,99%, segun el estudio comparativo realizado con multiples lmeas celulares con diversos niveles de RTK. Las lmeas celulares utilizadas y su expresion de ErbB dominante y la activacion de RTK tras la estimulacion con FCE o HRG-p se muestran en la transferencia western en la figura 21. El perfil de activacion de RTK para las celulas T47D, que expresan cierto nivel de ErbB2 y ErbB3 pero una cantidad extremadamente reducida de ErbBI, se muestra en la figura 22. El numero de celulas requerido para detectar la EC20 (12.000 URF) de pHER-1 o pHER-2 se utilizo para calcular la activacion de RTK por cada celula (URF/celula), tal como se muestra en la Tabla 43. Al utilizar celulas MB468 que expresaban una cantidad extremadamente baja de HER-2, disponer de -1.000 celulas por cada celda de reaccion no resultaba suficiente para alcanzar la EC20, y este tipo de senal baja o no detectable en otras lmeas celulares se indico como "ND" en la Tabla 43. Las celulas MDA-MB-468 presentan un nivel de -4.000 URF/celula de pHER-1 al estimularlas con FCE, pero no muestran un nivel detectable de pHER-2. Este formato colaborativo de inmunoensayo garantiza la ultraespecificidad, manteniendo simultaneamente su sensibilidad de ensayo subcelular- (104 a 105) molecular.

Conclusion:

El presente ejemplo ilustra un nuevo ensayo capaz de detectar espedficamente el estado de fosforilacion de los miembros de la familia ErbB de receptores con una sensibilidad que permite la utilizacion con celulas tumorales circulantes (CTC) raras. Mediante la identificacion de la activacion de hER1 y HER2 en las CTC, esta plataforma de ensayo puede proporcionar una grna, no solo para la seleccion inicial de terapeuticos dirigidos, sino tambien para el seguimiento posterior de la progresion de la terapia. El perfilado de expresion/activacion de quinasas y de otras moleculas de rutas de transduccion de senales (mostrados en la figura 23) en un muestreo en serie de CTC proporciona informacion valiosa sobre los cambios producidos en las celulas tumorales como funcion del tiempo y de las terapias. Este enfoque diagnostico de grna a la terapia puede introducirse en diversas etapas del control de la enfermedad, tal como se muestra en la figura 18. El perfilado temporal y espacial de progresion tumoral proporcionado por el formato de ensayo descrito en la presente memoria permite al medico clmico realizar un seguimiento de firmas de cancer en rapido cambio en cada paciente. Debido a su sensibilidad y especificidad unicas, el formato de ensayo descrito en el presente ejemplo puede aplicarse a la deteccion de sucesos de fosforilacion en miembros receptores de la familia de ErbB presentes en CTC raros. De esta manera, el presente metodo puede proporcionar una grna, no solo para la seleccion inicial de terapeuticos dirigidos, sino tambien para el seguimiento posterior de progresion de la terapia.

En resumen, la plataforma de inmunoensayo colaborativa multiplex de proximidad descrita en la presente memoria proporciona informacion clmica valiosa de muestras limitadas con ultrasensibilidad y especificidad que ayuda al oncologo en el mantenimiento o ajuste de las opciones de tratamiento de la enfermedad para cada paciente segun un cambio del perfil "personal" del cancer.

Ejemplo 19. Metodo para detectar la activacion de los receptores de tirosina quinasa de la familia de ErbB.

La aplicacion presenta tecnologfa capaz de detectar espedficamente sucesos de fosforilacion en la familia de ErbB de receptores de tirosina quinasa (RTK) con una sensibilidad al nivel de celulas individuales. En determinados aspectos, esta plataforma micromatriz multiplex de protemas utiliza la formacion de un inmunocomplejo unico de "triple canalizacion de anticuerpo-enzima". En una realizacion, este complejo requiere la colocalizacion de dos anticuerpos detectores conjugados con enzimas canalizadores correspondientes tras la union de protemas diana a los anticuerpos de captura. Los sucesos de canalizacion entre dos enzimas detectores en proximidad, glucosa oxidasa (GO, conjugada con anticuerpos anti-RTK) y peroxidasa de rabano picante (HRP, conjugada con sitios antifosforilados en los RTK) permite el perfilado de la RTK con una sensibilidad extrema. Este principio se aplico a dos sistemas modelo de cancer de mama con un numero limitado de celulas diana: celulas de cancer encontradas en una muestra de sangre completa de un paciente (celulas tumorales circulantes, CTC) y de lfquido aspirado con agua fina (AGF).

En la presente memoria se informa de la deteccion con exito de la activacion (fosforilacion) de HER1 y HER2 (pHER1 y pHER2) en un sistema modelo de CTC con un nivel de sensibilidad de una celula individual para las lmeas celulares MDA-MB-468 y SKBr-3. La especificidad analftica del formato de "inmunoensayo de proximidad" fue de >99,99%, segun estudios comparativos realizados con multiples lmeas celulares con diversos niveles de RTK. Ademas, en la presente memoria tambien se presentan modelos de xenoinjerto para diferentes tipos de cancer de mama utilizando lmeas celulares con grados variables de expresion de ErbB-RTK (MDA-MB-231, MDA-MB-468 y

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MDA-MB-435) para demostrar su aplicacion potencial con muestras de AGF. Aunque pudieron detectar niveles moderados de pHER2 y pHER1 en AGF de xenoinjerto de MD-MB-231 y se obtuvo un nivel de pHER1 significativo en AGF procedente de xenoinjertos de MDA-MB-468, no se detecto la activacion de HER1 o HER2 en AGF obtenido de xenoinjertos de MDA-MB-435. Estos resultados del sistema modelo de xenoinjerto-AGF concuerdan con el perfil de la lmea celular reguladora, lo que demuestra que este metodo puede utilizarse para detectar la activacion de los receptores de ErbB en cualquier tipo de muestra obtenida en procedimientos mmimamente invasivos (por ejemplo de CTC a AGF).

La capacidad del presente ensayo de realizar un seguimiento del estatus de activacion de los RTK dirigidos con una cantidad limitada de muestras resulta extremadamente util ya que el exito de las terapias dirigidas se basa en la capacidad del farmaco de desactivar (o desfosforilar) los rTk diana. Ademas, dicho principio puede aplicarse a la investigacion de otras moleculas de rutas de transduccion de senales para una mejor seleccion de la terapia y un seguimiento efectivo de la enfermedad entre las opciones disponibles de tratamiento del cancer. Debido a que el perfil de la enfermedad con frecuencia cambia en el cancer de mama recurrente, este formato de ensayo unico puede utilizarse para proporcionar informacion clmica valiosa con un numero limitado de muestras obtenidas de una "enfermedad cambiante" para ayudar al oncologo a ajustar las opciones de tratamiento de la enfermedad para cada paciente segun un cambio "personal" del perfil del cancer.

Ejemplo 20. Metodo para detectar la activacion de los receptores de tirosina quinasa en celulas tumorales circulantes utilizando un inmunoensayo en micromatriz mediado por proximidad.

Antecedentes: la activacion anormal de HER1 y HER2 se ha asociado a diversos tipos de progresion del cancer, y los cambios en el estatus de expresion de tumor primario a celulas tumorales circulantes (CTC) se ha informado que se producen con una frecuencia significativa. Los metodos para detectar la fosforilacion de HER1 y HER2 en CTC recogidas en serie podna proporcionar informacion valiosa sobre el cambio de perfil global de la enfermedad y por lo tanto conducir a selecciones/ajustes mejores de la terapia.

Metodos: se ha desarrollado una plataforma micromatriz multiplex de protemas con triple canalizacion de anticuerpo- enzima para detectar la fosforilacion de las moleculas diana. Esta plataforma micromatriz multiplex de protemas utiliza una formacion unica de complejo inmunologico mediante colocalizacion de dos anticuerpos conjugados con enzima detector tras la captura de las protemas diana sobre la superficie de la micromatriz. Los sucesos de canalizacion entre los dos enzimas detectores en proximidad permite el perfilado de los receptores de tirosina quinasa (RTK) con sensibilidad al nivel de celulas individuales. La especificidad de deteccion de dianas fosforiladas se incrementa en gran medida dado el requisito de union simultanea de tres anticuerpos. Con el fin de validar el metodo en muestras clmicas, se llevaron a cabo ensayos con CTC activadas procedentes de 75 pacientes de cancer sometidos a diversos regfmenes de terapia.

Resultados: los presentes inventores identificaron 6 pacientes (8%) con HER1 activado, 6 pacientes (8%) con HER2 activado y 14 (18,5%) pacientes con doble activacion de RTK en sus CTC. 25 muestras normales mostraron una activacion no detectable de HER1/HER2. Los presentes inventores tambien observaron discrepancias entre el estatus de activacion de HER2 entre las CTC y su estatus IHQ del HER2 primario correspondiente entre pacientes de cancer de mama. Se encontraron CTC con HER2 activado en 6 pacientes de entre 16 (38%) canceres de mama primarios negativos para HER2. Ademas, 2 de 5 (40%) pacientes positivos para HER2 presentaba CTC sin activacion aparente de HER2.

Conclusion: la plataforma multiplexada mediada por proximidad proporciona ventajosamente sensibilidad al nivel de celulas individuales para detectar la activacion de las RTK en una cantidad limitada de muestra. De esta manera, pueden obtenerse y perfilarse las CTC presentes en los canceres en estadio metastasico para obtener informacion valiosa con impacto en la practica clmica.

Ejemplo 21. Metodo para detectar la activacion de los receptores de tirosina quinasa en lesiones metastasicas utilizando un inmunoensayo en micromatriz mediado por proximidad.

Antecedentes: los cambios en el estatus de expresion de los receptores tumorales de sitio primario a lesiones metastasicas es conocido de la tecnica que ocurren a una frecuencia significativa (~15% a 20%). En consecuencia, los metodos de perfilado de los patrones de activacion de los receptores de tirosina quinasa (RTK) en tumores metastasicos podnan proporcionar informacion valiosa sobre la cambiante patogenesis de la enfermedad.

Metodos: se ha desarrollado una nueva tecnologfa capaz de detectar espedficamente sucesos de fosforilacion en las RTK de la familia de ErbB. Esta plataforma micromatriz multiplex de protemas utiliza una formacion unica de complejo inmunologico mediante colocalizacion de dos anticuerpos conjugados con enzima detector tras la captura de las protemas diana sobre la superficie de la micromatriz. Los sucesos de canalizacion entre los dos enzimas detectores (por ejemplo la glucosa oxidasa y la peroxidasa de rabano picante) en proximidad permite el perfilado de

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las RTK con una sensibilidad extrema. De hecho, la especificidad analttica resulta muy mejorada dado el requisito de union simultanea de tres anticuerpos diferentes. Los presentes inventores utilizaron 29 tejidos de cancer de mama (estadios II a IV) como sistema modelo para el perfilado de RTK mediante aspirado metastasico con aguja fina (AGFm).

Resultados: las muestras de tejido tumoral recogidas utilizando agujas de calibre G23 se lisaron en 100 ml de tampon de lisis y las muestras solubles (que conteman ~100 a 200 mg de protema) se analizaron para el estatus de activacion de RTK. De 29 muestras de AGF, 27% (8/29) mostraron HER2 altamente activado y 2 muestras (6%) mostraron un nivel intermedio de HER2 activado. Una de las muestras con activacion intermedia de HER2 tambien mostro un nivel intermedio de activacion de HER1. Dos de las 8 muestras con HER2 activado tambien mostraron un nivel significativo de activacion de HER1. Entre las 19 muestras negativas para HER2 activado, 3 mostraron un nivel moderado de activacion de HER1.

Conclusion: la plataforma multiplexada mediada por proximidad proporciona ventajosamente sensibilidad al nivel de celulas individuales para detectar sucesos diana de fosforilacion de las RTK en una cantidad limitada de muestra de tejido AGFm. La capacidad de perfilar tumores en diferentes sitios metastasicos proporciona, por lo tanto, informacion valiosa sobre los diferentes potenciales de metastasis. De esta manera, las muestras de AGFm de pase unico mmimamente invasivas pueden utilizarse para ajustar las opciones de terapia a los cambios de perfil de la enfermedad.

Aunque la invencion anterior ha sido descrita en cierto detalle a tftulo de ilustraccion y ejemplo en aras de la claridad de comprension, resultara facilmente evidente para el experto ordinario en la materia a la luz de las ensenanzas de la presente invencion que pueden realizarse determinados cambios y modificaciones a la misma sin apartarse del alcance segun las reivindicaciones adjuntas.

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

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2. 2.

   20
3. 3.

   25
4. 4.

   30
5. 5.

   35
6. 6.

   40
7. 7.
8. 8. 45
9. 9.

   50 10.
10. 11.

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11. 12.

    Metodo para detectar la presencia de un receptor truncado p95ErbB2, utilizando una matriz, comprendiendo dicho metodo:

    (a) incubar un extracto celular con una pluralidad de perlas espedficas para una region de union a dominio extracelular (DEC) de un receptor de ErbB2 (HER-2) de longitud completa e incubar dicho extracto celular con una pluralidad de anticuerpos de catpura, en el que dicha pluralidad de anticuerpos de captura es espedfica para una region de union a dominio intracelular (DlC) de dicho receptor truncado y en el que dicha pluralidad de anticuerpos de captura esta inmovilizada sobre un soporte solido en la matriz formando una pluralidad de receptores truncados capturados,

    (b) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados con anticuerpos de deteccion espedficos para los receptores truncados correspondientes formando una pluralidad de receptores truncados capturados detectables,

    (c) incubar la pluralidad de receptores truncados capturados detectables con un primer y segundo miembros de una pareja de amplificacion de senales para generar una senal amplificada, y

    (d) detectar la senal amplificada generada a partir del primer y segundo miembros de la pareja de amplificacion de senales.

    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que los anticuerpos de deteccion espedficos para los receptores truncados correspondientes comprenden una pluralidad de anticuerpos independientes del estado de activacion y una pluralidad de anticuerpos dependientes del estado de activacion.

    Metodo segun la reivindicacion 2, en el que los anticuerpos independientes del estado de activacion estan marcados con una fraccion facilitadora, los anticuerpos dependientes del estado de activacion estan marcados con un primer miembro de una pareja de amplificacion de senales y la fraccion facilitadora genera un agente oxidante que canaliza y reacciona con el primer miembro de la pareja de amplificacion de senales.

    Metodo segun la reivindicacion 3, en el que la pluralidad de receptores truncados capturados detectables se incuba con un segundo miembro de la pareja de amplificacion de senales para generar una senal amplificada.

    Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicha pluralidad de perlas espedficas para una region de union a dominio extracelular (DEC) de un receptor ErbB2 de longitud completa (HER-2) comprende una pareja de estreptavidina-biotina, en el que la estreptavidina esta unida a la perla y la biotina esta unida a un anticuerpo.

    Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el extracto celular se produce lisando celulas circulantes de un tumor mamario o mediante el lisado de celulas aisladas de tejido tumoral.

    Metodo segun la reivindicacion 6, en el que el tejido tumoral es tejido tumoral primario o tejido tumoral metastasico.

    Metodo segun la revindicacion 6, en que las celulas se afslan a partir de tejido tumoral en forma de una muestra de lfquido aspirado con aguja fina.

    Metodo segun la reivindicacion 1 o 2 a 4, en el que se interroga sobre un estado de activacion de dicha pluralidad de recepttores truncados capturados detectables.

    Metodo segun la reivindicacion 9, en el que el estado de activacion se selecciona de entre el grupo que consiste de un estado de fosforilacion, un estado de ubiquitinacion, un estado de acomplejamiento y combinaciones de los mismos.

    Metodo segun la reivindicacion 3, en el que la fraccion facilitadora es la glucosa oxidasa.

    Metodo segun la reivindicacion 11, en el que la glucosa oxidasa y los anticuerpos independientes del estado de activacion se conjugan con una molecula de dextrano activada por sulfhidrilo.

    Metodo segun la reivindicacion 12, en el que la molecula de dextrano activada por sulfhidrilo presenta un peso molecular de 500 kDa.