MX2008015138A

MX2008015138A - Proteinas de union al factor de crecimiento de hepatocitos (fch).

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Publication number: MX2008015138A
Application number: MX2008015138A
Authority: MX
Inventors: S Kirk Wright; May Han; Lyne Breault; Jie Lin; Bijan Etemad-Gilbertson; Jeno Gyuris; William M Winston Jr; Christine Knuehl
Original assignee: Aveo Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2006-06-02
Filing date: 2007-06-01
Publication date: 2009-01-28
Also published as: KR20090026315A; IL195038A0; EP2380908A1; HK1129394A1; AU2007254853A1; AR061170A1; NZ573819A; JP2010246565A; US8268315B2; US20130203970A1; US7935502B2; NO20085422L; JP4560582B2; US7659378B2; AU2007254853B2; ES2378097T3; WO2007143098A3; EP2029627A2; WO2007143098A8; JP2009539348A

Abstract

La presente invención provee una familia de proteínas de unión que se unen y neutralizan la actividad del factor de crecimiento de hepatocitos (FCH), en particular el FCH humano. Las proteínas de unión se pueden utilizar como agentes diagnósticos y/o terapéuticos. Con respecto a su actividad terapéutica, las proteínas de unión se pueden utilizar para tratar ciertos trastornos que responden al FCH, por ejemplo ciertos tumores que responden al FCH.

Description

PROTEÍNAS DE UNIÓN AL FACTOR DE CRECIMIENTO DE HEPATOCITOS (FCH) SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reclama el beneficio y prioridad de las Solicitudes Provisionales Estadounidenses Nos. 60/810,714, presentada el 2 de junio de 2006, y 60/860,509, presentada el 21 de noviembre de 2006, cuyas divulgaciones se incorporan como referencia en la presente.

CAMPO DE LA INVENCIÓN El campo de la invención es la biología molecular, la inmunología y la oncología. Más particularmente, el campo es el de las proteínas de unión basadas en anticuerpos que se unen al factor de crecimiento de hepatocitos (FCH).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El factor de crecimiento de hepatocitos (FCH), también denominado factor de dispersión (FD), es una proteína heterodimérica multifuncional producida predominantemente por células mesenquimales, y es un efector de células que expresan la tirosina quinasa receptora Met (Bottaro et al. (1991 ) SCIENCE 251 : 802-804, Rubin et al. (1993) BIOCHIM. BIOPHYS. ACTA 1155: 357-371). El receptor Met humano también se conoce como "c-Met." El FCH maduro contiene dos cadenas polipeptídicas, la cadena a y la cadena ß. Los estudios publicados sugieren que es la cadena a la que contiene el dominio de unión al receptor c-Met del FCH.

Cuando se une a su receptor afín, el FCH media una cantidad de actividades celulares. El trayecto de señalización FCH-Met cumple una función en la regeneración del hígado, cicatrización de heridas, regeneración neural, angiogénesis y enfermedades malignas. Ver, por ej., Cao et al. (2001 ) PROC. NATL ACAD. SCI. USA 98: 7443-7448, Burgess et al. (2006) CÁNCER RES. 66: 1721 -1729, y las Patentes Estadounidenses Nos. 5.997.868 y 5.707.624. Los investigadores han estado desarrollando una cantidad de moduladores de FCH, incluyendo anticuerpos, para tratar los diversos trastornos que involucran la actividad del FCH, por ejemplo, ciertos cánceres que responden al FCH. Ver, por ej., Publicación de Solicitud Internacional No. WO 2005/017107. La estructura básica común a todos los anticuerpos se muestra en forma esquemática en la Figura 1 . Los anticuerpos son proteínas multiméricas que contienen cuatro cadenas de polipéptidos. Dos de las cadenas de polipéptidos se denominan pesadas o cadenas H y dos de las cadenas de polipéptidos se denominan livianas o cadenas L. Las cadenas pesadas y livianas de inmunoglobulina están conectadas por un enlace disulfuro entre cadenas. Las cadenas pesadas de inmunoglobulina están conectadas por una cantidad de enlaces disulfuro entre cadenas. Una cadena liviana está compuesto de una región variable (V|_ en la Figura 1 ) y una región constante (CL en la Figura 1 ), mientras que la cadena pesada está compuesta de una región variable (VH en la Figura 1 ) y al menos tres regiones constantes (CHi , CH2 y CH3 en la Figura 1 ). Las regiones variables determinan la especificidad del anticuerpo y las regiones constantes tienen otras funciones. La información estructural y del aminoácido indican que cada región variable comprende tres regiones hipervariables (también denominadas regiones determinantes de complementariedad o CDRS) flanqueadas por cuatro regiones de marco relativamente conservadas o FRs. Las tres CDR, denominadas CDRi, CDR2, y CDR3, son responsables por la especificidad de unión de los anticuerpos individuales. Cuando los anticuerpos deben utilizarse como agentes diagnósticos y terapéuticos, típicamente es preferible crear anticuerpos que tengan la especificidad y la afinidad de unión más alta a la molécula blanco. Se cree que las diferencias en las regiones variables pueden tener profundos efectos sobre la especificidad y afinidad del anticuerpo. La Patente Estadounidense No. 5.707.624 describe el uso de los anticuerpos anti-FCH en el tratamiento del sarcoma de Kaposi. De manera similar, la Patente Estadounidense No. 5.997.868 describe el tratamiento de un tumor mediante la administración de un anticuerpo anti-FCH al paciente a ser tratado para bloquear la capacidad del FCH endógeno de promover la angiogénesis en el tumor. Recientemente, los investigadores propusieron que los anticuerpos que se unen a la cadena ß del FCH pueden tener potencial como agentes terapéuticos en pacientes con tumores dependientes del FCH (Burgess (2006) supra). No obstante, existe la necesidad de otros moduladores de FCH que pueden ser utilizados como agentes terapéuticos y diagnósticos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de una familia de proteínas de unión que se unen específicamente al FCH, en particular al FCH humano. Las proteínas de unión se basan en anticuerpos en la medida que contengan sitios de unión al antígeno basados en las CDR de una familia de anticuerpos que específicamente se unen al FCH. Las CDR confieren la especificidad de unión de las proteínas de unión al FCH. Las proteínas de unión se pueden utilizar como agentes terapéuticos y diagnósticos. Cuando se utilizan como agente terapéutico están diseñadas (por ej. humanizadas) para reducir o eliminar el riesgo de inducir una respuesta inmune contra la proteína de unión cuando se administran al receptor (por ej., un humano). Las proteínas de unión neutralizan la actividad del FCH y, se pueden utilizar como agente terapéutico. En ciertas realizaciones, las proteínas de unión previenen que el FCH se una a su receptor afín, c-Met, neutralizando de este modo la actividad del FCH. En otras realizaciones, las proteínas de unión se unen al FCH y neutralizan su actividad biológica pero sin evitar que el FCH se una al receptor c-Met. Dado que el FCH ha estado implicado en el desarrollo y proliferación de las células cancerígenas, las proteínas de unión se pueden utilizar para inhibir la proliferación de células cancerígenas. Más aún, cuando se administran a un mamífero, las proteínas de unión pueden inhibir o reducir el crecimiento del tumor en el mamífero. Estos y otros aspectos y ventajas de la invención serán evidentes al considerar las siguientes figures, la descripción detallada, y las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La invención puede entenderse por completo con referencia a los siguientes dibujos. La Figura 1 es una representación esquemática de un anticuerpo típico. La Figura 2 es un diagrama esquemático que muestra la secuencia de aminoácidos que definen la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de los anticuerpos denotados como 1A3, 1 D3, 1 F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6 y 3D11. Las secuencias de aminoácidos para cada anticuerpo están alineadas una contra otra y las regiones que definen el péptido de señal, CDRi, CDR2, y CDR3 están identificadas en cajas. Las secuencias sin cajas representan las secuencias FR. La Figura 3 es un diagrama esquemático que muestra las secuencias CDRi, CDR2, y CDR3 para cada una de las secuencias de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina presentadas en la Figura 2. La Figura 4 es un diagrama esquemático que muestra la secuencia de aminoácidos que define la región variable de cadena liviana de inmunoglobulina completa de los anticuerpos 1A3, 1 D3, 1 F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6, y 3D11. Las secuencias de aminoácidos para cada anticuerpo están alineadas una contra otra y las regiones que definen el péptido de señal, CDR^ CDR2, y CDR3 se identifican en cajas. Las secuencias sin caja representan las secuencias de FR.

La Figura 5 es un diagrama esquemático que muestra las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 para cada una de las secuencias de la región variable de cadena liviana de inmunoglobulina presentadas en la Figura 4. La Figura 6 es un gráfico que resume los resultados de un experimento para medir la actividad inhibidora del tumor de los anticuerpos anti-FCH 1 D3, 1 F3, 1A3 y 2B8 en un modelo de xenoinjerto U87MG. Los diamantes corresponden a PBS; los triángulos corresponden al anticuerpo anti-FCH 1A3; X corresponde al anticuerpo anti-FCH 1 D3; los cuadrados corresponden al anticuerpo anti-FCH 1 F3, y los círculos corresponden al anticuerpo anti-FCH 2B8.

La Figura 7 es un gráfico que resume los resultados de un experimento para medir la actividad inhibidora del tumor de los anticuerpos 1 D3, 1 F3, 1A3 y 2B8 en un modelo de xenoinjerto U118. Los diamantes corresponden a IgG; los cuadrados corresponden al anticuerpo anti-FCH 1 F3, los triángulos corresponden al anticuerpo anti-FCH 1 D3; X corresponde al anticuerpo anti-FCH 1A3; y los círculos corresponden al anticuerpo anti-FCH 2B8.

La Figura 8 es una tabla que resume los datos de resonancia de plasmón superficial sobre la afinidad de unión al antígeno y la cinética de interacción entre el FCH humano y los anticuerpos quiméricos, quiméricos/humanizados, o humanizados 2B8. La Tabla enumera los pares de cadena liviana de kappa y cadena pesada de lgG1 ensayados. Esos anticuerpos con desviaciones estándar (STDEV) mencionaos se analizaron en tres experimentos independientes. La Figura 9 es un diagrama en barras que resume los datos experimentales que indican que el Hu2B8 se une a un epítopo exclusivo mutuo al anticuerpo monoclonal 2B8 murino. El 2B8 humanizado o quimérico fue capturado sobre un chip Fe anti-humano. El FCH luego se unió al 2B8 humanizado o quimérico. Se midió la capacidad del ratón 2B8 o el anticuerpo control (anticuerpo anti-FCH de cabra policlonal) de unirse al FCH capturado. Ambos anticuerpos 2B8 humanizado y 2B8 quimérico evitan que el 2B8 murino se una al FCH. Las barras blancas corresponden al anticuerpo 2B8 quimérico; las barras grises corresponden al anticuerpo Hu2B8 humanizado (región variable kappa Kv1-39.1 y región variable de cadena pesada Hv5-51.1); las barras negras corresponden al anticuerpo Hu2B8 humanizado (región variable kappa Kv3-15.1 y región variable de cadena pesada Hv5-51.1).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de una familia de proteínas de unión que se unen específicamente, y neutralizan la actividad del FCH, en particular el FCH humano. Las proteínas de unión se pueden utilizar en una variedad de aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Las proteínas de unión se basan en los sitios de unión al antígeno de ciertos anticuerpos monoclonales que han sido seleccionados por su capacidad de unirse, y neutralizar la actividad del FCH. En particular, las proteínas de unión contienen secuencias de CDR de región variable de inmunoglobulina que juntas definen un sitio de unión para FCH. En vista de la actividad neutralizadora de estos anticuerpos, éstos son particularmente útiles para modular el crecimiento y/o proliferación de las células que responden al FCH, por ejemplo, células cancerígenas. Cuando se utilizan como agente terapéutico, las proteínas de unión se pueden diseñar para minimizar o eliminar el riesgo de inducir una respuesta inmune contra las proteínas de unión cuando se administran al receptor. Más aún, dependiendo de la aplicación particular, se contempla que las proteínas de unión pueden conjugarse a otros restos, por ejemplo, marcas detectables, por ejemplo, radiomarcas, y moléculas efectoras, por ejemplo, otros productos terapéuticos basados en proteínas y pequeñas moléculas. Cada una de estas características y aspectos de la invención se mencionan en detalla a continuación.

I - Proteínas de FCH En un aspecto, la invención provee una proteína de unión aislada que se une al FCH humano. La proteína de unión comprende (i) una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina que comprende la estructura CDR Li-CDR L2-CDR L3, y (¡i) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR), en las cuales la región variable de cadena liviana de inmunoglobulina y la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina juntas definen un sitio de unión único para unirse al FCH humano. La CDRLi comprende la secuencia de aminoácidos Xi X2 Ser X4 X5 ?d X7 Xs X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15, en la cual el aminoácido X es Arg, Lys, o Ser, X2 es Ala o Thr, X4 es Glu, Gln, o Ser, X5 es Asn, Asp, o Ser, X6 es lie o Val, X7 es Asp, Lys, Ser, Val, o Tyr, X8 es un enlace peptídico o Tyr, X9 es un enlace peptídico o Asp, X10 es un enlace peptídico o Gly, X11 es un enlace peptídico o Asn, X-i2 es un enlace peptídico, lie, o Ser, ?? 3 es Asn o Tyr, X-u es lie, Leu, Met, o Val, X15 es Ala, Asn, His, o Ser. CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos X16 X17 X18 X19 X20 X21 X22, en la cual el aminoácido X-i6 es Ala, Asp, Arg, Gly, o Val, X17 es Ala, Thr, o Val, Xi8 es Asn, Ser, o Thr, X19 es Arg, Asn, Lys, o His, X20 es Leu o Arg, X2i es Ala, Asn, Glu, Val, o Pro, X22 es Asp, Ser, o Thr. CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 Pro X30 Thr, en la cual el aminoácido X23 es Leu, Gly, o GIn, X24 es His o GIn, X25 es Phe, Ser, Trp, o Tyr, X26 es Asp, He, Ser, Trp, o Tyr, X27 es Gly, Glu, Asn, o Ser, X28 es Asp, Asn, Phe, Thr, o Tyr, X30 es Leu, Phe, Pro, o Tyr. En otro aspecto, la invención provee una proteína de unión aislada que se une al FCH humano que comprende (i) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la estructura CDR HrCDR H2-CDR H3 y (¡i) una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina que comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR), en las cuales la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y la región variable de cadena liviana de inmunoglobulina juntas definen un sitio de unión único para la unión al FCH humano. La CDRHi comprende la secuencia de aminoácidos X1 Tyr X3 X4 X5, en la cual el aminoácido X1 es Asp, Asn, Ser, o Thr, X3 es Phe, Ser, Trp, o Tyr, X4 es lie, Leu, o Met, X5 es Asn, His, o Ser. CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos Xe lie X8 X9 X10 X11 Gly ??3 X14 X15 Tyr ??7 Xi8 X19 X20 X21 X22, en la cual el aminoácido X6 es Lys, GIn, Glu, Val, o Tyr, X8 es Asn, Gly, Ser, Trp, o Tyr, Xg es Ala, Pro o Ser, X10 es Gly o Thr, Xn es un enlace peptídico, Asp, Asn, Gly, o Ser, X 3 es Asp, Asn, His, o Ser, X14 es Ser o Thr, X15 es Asn o Tyr, Xi7 es Asn o Pro, ??ß es Ala, Asp, Gly, Gln, Glu, Pro, o Ser, X19 es Asn, Lys, Met, o Ser, X20 es Leu, Phe o Val, X21 es Lys, Met, o Gln, X22 es Asp, Gly o Ser. CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 X34 Tyr, en la cual el aminoácido X23 es Arg, Asn, Gln, o Glu, X24 es Gly, Leu, Arg, o Tyr, X25 es un enlace peptídico, Asp, o Gly, X26 es un enlace peptídico o Gly, X27 es un enlace peptídico o Tyr, X2e es un enlace peptídico, Leu, o Tyr, X2g es un enlace peptídico, Gly, Leu, Arg, o Val, X30 es un enlace peptídico, Asp, Gly, o Glu, X31 es un enlace peptídico, Asn, Arg, Ser, o Tyr, X32 es un enlace de péptido, Ala, Gly, He, o Tyr, X33 es Met o Phe, X34 es Ala o Asp. Se entiende que la proteína de unión puede comprender tanto secuencias de la cadena liviana de inmunoglobulina y la cadena pesada de inmunoglobulina o sus fragmentos, mencionadas anteriormente. Más aún, se entiende que la proteína de unión puede ser un anticuerpo intacto o un fragmento de unión al antígeno del mismo, o un sitio de anticuerpo biosintético. En ciertas realizaciones, las secuencias de CDR de la cadena liviana de inmunoglobulina y la cadena pesada de inmunoglobulina están interpuestas con regiones de marco (FR). En otras realizaciones, las secuencias de CDR de la cadena liviana de inmunoglobulina y la cadena pesada de inmunoglobulina están interpuestas entre regiones de marco humanas o humanizadas. En otro aspecto, la invención provee una proteína de unión aislada que se une específicamente al FCH humano. La proteína de unión comprende: (a) una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina que comprende la estructura CDRL-I-CDRL2-CDRL3 y (b) región variable de cadena pesada de inmunoglobulina, en la cual la región variable de cadena liviana de inmunoglobulina y la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina juntas definen un sitio de unión único para la unión al FCH humano. La CDRLi comprende una secuencia seleccionada del grupo integrado por la SEC ID NO. 8 (1A3), SEC ID NO. 18 (2B8), SEC ID NO. 28 (2F8), SEC ID NO. 38 (3B6), SEC ID NO. 48 (3D11), SEC ID NO. 58 (1 D3), SEC ID NO. 68 (1 F3), y SEC ID NO. 78 (3A12). La CDRL2 comprende una secuencia seleccionada del grupo integrado por la SEC ID NO. 9 (1A3), SEC ID NO. 19 (2B8), SEC ID NO. 29 (2F8), SEC ID NO. 39 (3B6), SEC ID NO. 49 (3D11), SEC ID NO. 59 (1 D3), SEC ID NO. 69 (1 F3), SEC ID NO. 79 (3A12) y SEC ID NO. 206 (LRMR2B8LC). La CDRL3 comprende una secuencia seleccionada del grupo integrado por la SEC ID NO. 10 (1A3), SEC ID NO. 20 (2B8), SEC ID NO. 30 (2F8), SEC ID NO. 40 (3B6), SEC ID NO. 50 (3D11), SEC ID NO. 60 (1 D3), SEC ID NO. 70 (1 F3), y SEC ID NO. 80 (3A12). A lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, las secuencias denotadas por una particular SEC ID NO. Están seguidas en paréntesis por el anticuerpo que era el origen de la secuencia particular. A modo de ejemplo, la SEC ID NO. 8 (1A3) indica que la secuencia de SEC ID NO. 8 se basa en la secuencia presente en el anticuerpo 1A3. En una realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina que comprende una CDRu que comprende la secuencia de SEC ID NO. 8 (1A3), una CDRL2 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 9 (1A3), y una CDRL3 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 10 (1A3). En otra realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina que comprende una CDRu que comprende la secuencia de SEC ID NO. 18 (2B8), una CDRL2 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 19 (2B8) o SEC ID NO. 206 (LRMR2B8LC), y una CDRL3 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 20 (2B8).

En otra realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina que comprende una CDRu que comprende la secuencia de SEC ID NO. 28 (2F8), una CDRL2 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 29 (2F8), y una CDRL3 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 30 (2F8). En otra realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina que comprende una CDRu que comprende la secuencia de SEC ID NO. 38 (3B6), una CDRL2 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 39 (3B6), y una CDRL3 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 40 (3B6). En otra realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina que comprende una CDRu que comprende la secuencia de SEC ID NO. 48 (3D11), una CDRL2 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 49 (3D11), y una CDRL3 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 50 (3D11). En otra realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina que comprende una CDRU que comprende la secuencia de SEC ID NO. 58 (1 D3), una CDRL2 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 59 (1D3), y una CDRL3 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 60 (1 D3). En otra realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina que comprende una CDRU que comprende la secuencia de SEC ID NO. 68 (1 F3), una CDRL2 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 69 (1F3), y una CDRL3 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 70 (1 F3).

En otra realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina que comprende una CDRLi que comprende la secuencia de SEC ID NO. 78 (3A12), una CDRu? que comprende la secuencia de SEC ID NO. 79 (3A12), y una CDRL3 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 80 (3A12). En cada una de las realizaciones anteriores, las secuencias de CDRu , CDRL2, y CDR|_3 se interponen entre las FRs de inmunoglobulina de humano o humanizadas. Se entiende que la proteína de unión puede ser un anticuerpo intacto, un fragmento de unión al antígeno del mismo, o un sitio del anticuerpo biosintético. En otro aspecto, la invención provee una proteína de unión aislada que se une al FCH humano. La proteina de unión comprende (a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la estructura CDRm-CDRH2-CDRH3, y (b) una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina, en la cual la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y la región variable de cadena liviana de inmunoglobulina juntas definen un sitio de unión único para la unión al FCH humano. La CDRm comprende una secuencia seleccionada del grupo integrado por la SEC ID NO. 5 (1A3), SEC ID NO. 15 (2B8), SEC ID NO. 25 (2F8), SEC ID NO. 35 (3B6), SEC ID NO. 45 (3D11), SEC ID NO. 55 (1 D3), SEC ID NO. 65 (1 F3), y SEC ID NO. 75 (3A12); la CDRH2 comprende una secuencia seleccionada del grupo integrado por la SEC ID NO. 6 (1A3), SEC ID NO. 16 (2B8), SEC ID NO. 26 (2F8), SEC ID NO. 36 (3B6), SEC ID NO. 46 (3D11), SEC ID NO. 56 (1D3), SEC ID NO. 66 (1 F3), SEC ID NO. 76 (3A12), SEC ID NO. 202 (Hu2B8 Hv1f.1 ), SEC ID NO. 203 (Hu2B8 Hv5a.1 o Hu2B8 Hv5-51.1), SEC ID NO. 204 (LR2B8HC) y SEC ID NO. 205 (LRMR2B8HC); y la CDRH3 comprende una secuencia seleccionada del grupo integrado por la SEC ID NO. 7 (1A3), SEC ID NO. 17 (2B8), SEC ID NO. 27 (2F8), SEC ID NO. 37 (3B6), SEC ID NO. 47 (3D11), SEC ID NO. 57 (1 D3), SEC ID NO. 67 (1 F3), y SEC ID NO. 77 (3A12). En una realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende: una CDRHi que comprende la secuencia de SEC ID NO. 5 (1A3); una CDRH2 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 6 (1A3); y una CDRH3 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 7 (1A3). En otra realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende: una CDRHi que comprende la secuencia de SEC ID NO. 15 (2B8); una CDRH2 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 16 (2B8), SEC ID NO. 202 (Hu2B8 Hv1f.1), SEC ID NO. 203 (Hu2B8 Hv5a.1 o Hu2B8 Hv5-51.1), SEC ID NO. 204 (LR2B8HC) o SEC ID NO. 205 (LRMR2B8HC); y una CDRH3 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 17 (2B8). En otra realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende: una CDRHi que comprende la secuencia de SEC ID NO. 25 (2F8); una CDRH2 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 26 (2F8); y una CDRH3 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 27 (2F8). En otra realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRHi que comprende la secuencia de SEC ID NO. 35 (3B6); una CDRH2 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 36 (3B6); y una CDRH3 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 37 (3B6).

En otra realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende: una CDRHi que comprende la secuencia de SEC ID NO. 45 (3D11); una CDRH2 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 46 (3D11); y una CDRH3 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 47 (3D11). En otra realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende: una CDRHi que comprende la secuencia de SEC ID NO. 55 (1 D3); una CDRH2 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 56 (1D3); y una CDR^ que comprende la secuencia de SEC ID NO. 57 (1 D3). En otra realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende: una CDRHi que comprende la secuencia de SEC ID NO. 65 (1 F3); una CDRH2 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 66 (1 F3); y una CDRH3 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 67 (1 F3). En otra realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende: una CDRHi que comprende la secuencia de SEC ID NO. 75 (3A12); una CDRH2 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 76 (3A12); y una CDRH3 que comprende la secuencia de SEC ID NO. 77 (3A12). En cada una de las realizaciones anteriores, las secuencias de CDRHi , CDRH2, y CDRH3 con preferencia se interponen entre las FRs de inmunoglobulina de humano o humanizadas. Se entiende que la proteína de unión puede ser un anticuerpo intacto, un fragmento de unión al antígeno del mismo, o un sitio del anticuerpo biosintético.

En otro aspecto, la invención provee una proteína de unión que se une al FCH humano. La proteína de unión comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina seleccionada del grupo integrado por los residuos 20-141 de SEC ID NO. 2 (1A3), los residuos 20-137 de SEC ID NO. 12 (2B8), los residuos 20-137 de SEC ID NO. 22 (2F8), los residuos 20-139 de SEC ID NO. 32 (3B6), los residuos 20-132 de SEC ID NO. 42 (3D11 ), los residuos 20-141 de SEC ID NO. 52 (1 D3), los residuos 20-141 de SEC ID NO. 62 (1 F3), y los residuos 20-141 de SEC ID NO. 72 (3A12) y una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina seleccionada del grupo integrado por los residuos 21 -127 de SEC ID NO. 4 (1A3), los residuos 21 -127 de SEC ID NO. 14 (2B8), los residuos 20-131 de SEC ID NO. 24 (2F8), los residuos 23-129 de SEC ID NO. 34 (3B6), los residuos 23-128 de SEC ID NO. 44 (3D11 ), los residuos 21 -127 de SEC ID NO. 54 (1 D3), los residuos 21 -127 de SEC ID NO. 64 (1 F3), y los residuos 21-127 de SEC ID NO. 74 (3A12). En otra realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos 20-141 de SEC ID NO. 2 (1 A3), y una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos 21 -127 de SEC ID NO. 4 (1A3). En una realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos 20-137 de SEC ID NO. 12 (2B8), y una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos 21 -127 de SEC ID NO. 14 (2B8). En otra realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos 20-137 de SEC ID NO. 22 (2F8), y una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos 20-131 de SEC ID NO. 24 (2F8). En otra realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos 20-139 de SEC ID NO. 32 (3B6), y una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos 23-129 de SEC ID NO. 34 (3B6). En otra realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos 20-132 de SEC ID NO. 42 (3D11), y una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos 23-128 de SEC ID NO. 44 (3D11 ). En otra realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos 20-141 de SEC ID NO. 52 (1D3), y una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos 21-127 de SEC ID NO. 54 (1 D3). En otra realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos 20-141 de SEC ID NO. 62 (1 F3), y una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos 21-127 de SEC ID NO. 64 (1 F3). En otra realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos 20-141 de SEC ID NO. 72 (3A12), y una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos 21-127 de SEC ID NO. 74 (3A12). En cada una de las realizaciones anteriores, la proteína de unión puede ser un anticuerpo intacto, un fragmento de unión al antígeno del mismo, o un sitio del anticuerpo biosintético. En otro aspecto, la invención provee una proteína de unión aislada que se une al FCH humano. La proteína de unión comprende (i) una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina seleccionada del grupo integrado por la SEC ID NO. 173 (región variable de cadena liviana Hu2B8 Kv1-39.1), SEC ID NO. 179 (región variable de cadena liviana Hu2B8 Kv3-15.1), SEC ID NO. 193 (región variable de cadena liviana LR2B8LC), y SEC ID NO. 199 (región variable de cadena liviana LRMR2B8LC); y (ii) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina seleccionada del grupo integrado por la SEC ID NO. 159 (región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv1f.1), SEC ID NO. 165 (región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv5a.1), SEC ID NO. 169 (región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv5-51.1), SEC ID NO. 183 (región variable de cadena pesada LR2B8HC), y SEC ID NO. 189 (región variable de cadena liviana LRMR2B8LC). La proteína de unión puede ser un anticuerpo intacto, un fragmento de unión al antígeno del mismo, o un sitio del anticuerpo biosintético. .

En otro aspecto, la invención provee una proteína de unión aislada que se une al FCH humano. La proteína de unión comprende (i) una cadena liviana de inmunoglobulina seleccionada del grupo integrado por la SEC ID NO. 177 (Hu2B8 Kv1-39.1 + alotipo constante de kappa (Km(3) (alelo 2)), SEC ID NO. 181 (Hu2B8 Kv3-15.1 + alotipo constante de kappa (Km(3) (alelo 2)), SEC ID NO. 197 (LR2B8LC + alotipo constante de kappa (Km(3) (alelo 1)), y SEC ID NO. 201 (LRMR2B8LC + alotipo constante de kappa (Km(3) (alelo 1)); y (ii) una cadena pesada de inmunoglobulina seleccionada del grupo integrado por la SEC ID NO. 163 (Hu2B8 Hv1f.1 + alotipo constante de lgG1 (G1 m(17.1 )), SEC ID NO. 167 (Hu2B8 Hv5a.1 + alotipo constante de lgG1 (G1 m(17.1)), SEC ID NO. 171 (Hu2B8 Hv5-51.1 + alotipo constante de lgG1 (G1 m(17.1)), SEC ID NO. 187 (LR2B8HC + alotipo constante de lgG1 (G1 m(3)) (alelo 1)), y SEC ID NO. 191 (LRMR2B8HC +alotipo constante de lgG1 (G1 m(3)) (alelo 1)). La proteína de unión puede ser un anticuerpo intacto, un fragmento de unión al antígeno del mismo, o un sitio del anticuerpo biosintético. En otro aspecto, la invención provee una proteína de unión aislada que se une al FCH humano reducido. La proteína de unión comprende (i) una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina que comprende tres CDR, y (ii) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende tres CDR. Las CDR típicamente se interponen entre las FRs. Las CDR de la cadena liviana de inmunoglobulina y la cadena pesada de inmunoglobulina juntas definen un sitio de unión que se une al FCH humano reducido, por ejemplo, la cadena a del FCH reducido. El FCH reducido se refiere al FCH tratado con una cantidad de agente reductor, por ejemplo, ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol, o glutatione suficiente para reducir el enlace disulfuro entre la cadena a y la cadena ß. Las concentraciones a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, DTT 100 mM y 5% de 2-mercaptoetanol. En ciertas realizaciones, la proteína de unión comprende una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina que comprende al menos una CDR seleccionada del grupo integrado por CDRLi , CDRL2 y CDRL3. Opcionalmente, la proteína de unión comprende dos CDR, por ejemplo, CDRLi y CDRL2, O CDRLI y CDR|_3, o CDRU y CDRL3- Opcionalmente, la proteína de unión comprende las tres CDR, es decir, CDRLi , CDRL2 y CDRL3. La CDRLi comprende la secuencia de aminoácidos Xi X2 Ser X4 X5 ?ß X7 Xs X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15, en la cual el aminoácido X1 es Arg o Lys, X2 es Ala o Thr, X4 es Glu o GIn, X5 es Asn, Ser, o Asp, X6 es lie o Val, X7 es Tyr, Asp, o Lys, Xa es un enlace peptídico o Tyr, X9 es un enlace peptídico o Asp, X10 es un enlace peptídico o Gly, Xn es un enlace peptídico o Asn, X 2 es un enlace peptídico o Ser, X^ es Asn o Tyr, X14 es lie o Leu, X15 es Ala, Asn, o Ser. CDR|_2 comprende la secuencia de aminoácidos X 6 Xi7 X18 X-19 Leu X21 X22, en la cual el aminoácido Xi6 es Ala, Asp, Val, o Arg, Xi7 es Ala o Val, Xie es Asn, Ser, o Thr, X19 es Arg, Asn, o His, X21 es Ala, Glu, Val, o Pro, X22 es Asp o Ser. CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 Pro X30 Thr, en la cual el aminoácido X23 es Leu o GIn, X24 es His o GIn, X25 es Phe, Ser, o Tyr, X26 es Asp, He, o Trp, X27 es Gly o Glu, X28 es Asp, Phe, o Thr, X30 es Phe, Pro, o Tyr. En otra realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende al menos una CDR seleccionada del grupo integrado por CDRHi , CDRH2, y CDRH3- Opcionalmente, la proteína de unión comprende dos CDR, por ejemplo, CDRHi y CDRH2, o CDRHi y CDRH3, o CDRm y CDRH3- Opcionalmente, la proteína de unión comprende las tres CDR, es decir, CDRHi, CDRH2 y CDRH3- CDRHi comprende la secuencia de aminoácidos X1 Tyr X3 X4 X5, en la cual el aminoácido X1 es Asp, Asn, Ser, o Thr, X3 es Phe, Trp, o Tyr, X4 es lie o Met, X5 es Asn, His, o Ser. CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos Xe lie X8 X9 Gly Xn Gly X13 ?? X15 Tyr ?? ??8 X19 X20 Lys X22, en la cual el aminoácido X6 es Lys, GIn, o Tyr, X8 es Gly, Ser, o Tyr, X9 es Pro o Ser, Xn es Asp, Gly, o Ser, X13 es Asp o Ser, X es Ser o Thr, X 5 es Asn o Tyr, X17 es Asn o Pro, Xi8 es Ala, Asp, Gly, o Glu, X19 es Asn, Met, o Ser, X2o es Phe o Val, X22 es Asp o Gly. CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 Asp Tyr, en la cual el aminoácido X23 es Arg o Gln, X24 es Gly o Leu, X25 es Asp, Gly, o un enlace peptídico, X26 es Gly o un enlace peptídico, X27 es un enlace peptídico o Tyr, X28 es Leu, un enlace peptídico o Tyr, X2g es a Gly, Arg o Leu, X30 es Asp, Gly o Glu, X31 es a Tyr, Arg o Asn, X32 es Ala, Gly o Tyr, X33 es Met o Phe. Se entiende que la proteína de unión puede comprender tanto las secuencias de la cadena pesada de inmunoglobulina y la cadena liviana de inmunoglobulina o sus fragmentos, mencionados anteriormente. Más aún se entiende que la proteína de unión puede ser un anticuerpo intacto, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, o un sitio del anticuerpo biosintético. En ciertas realizaciones, la proteína de unión comprende una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina que comprende (i) una CDRu que tiene una secuencia seleccionada del grupo integrado por la SEC ID NO. 8 (1A3), SEC ID NO. 28 (2F8), SEC ID NO. 38 (3B6), SEC ID NO. 58 (1 D3), y SEC ID NO. 68 (1 F3), (ii) una CDRL2 que tiene una secuencia seleccionada del grupo integrado por la SEC ID NO. 9 (1A3), SEC ID NO. 29 (2F8), SEC ID NO. 39 (3B6), SEC ID NO. 59 (1 D3), y SEC ID NO. 69 (1 F3), y (iii) una CDRL3 que tiene una secuencia seleccionada del grupo integrado por la SEC ID NO. 10 (1A3), SEC ID NO. 30 (2F8), SEC ID NO. 40 (3B6), SEC ID NO. 60 (1 D3), y SEC ID NO. 70 (1 F3). Las secuencias de CDR pueden interponerse entre FRs humanas o humanizadas. En otras realizaciones, la proteína de unión comprende una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo integrado por los residuos 21 -127 de SEC ID NO. 4 (1A3), los residuos 20-131 de SEC ID NO. 24 (2F8), los residuos 23-129 de SEC ID NO. 34 (3B6), los residuos 21-127 de SEC ID NO. 54 (1 D3), y los residuos 21 -127 de SEC ID NO. 64 (1 F3).

En ciertas realizaciones, la proteína de unión comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende (i) una CDRHi que tiene una secuencia seleccionada del grupo integrado por la SEC ID NO. 5 (1A3), SEC ID NO. 25 (2F8), SEC ID NO. 35 (3B6), SEC ID NO. 55 (1 D3), y SEC ID NO. 65 (1 F3), (ii) una CDRH2 que tiene una secuencia seleccionada del grupo integrado por la SEC ID NO. 6 (1A3), SEC ID NO. 26 (2F8), SEC ID NO. 36 (3B6), SEC ID NO. 56 (1 D3), y SEC ID NO. 66 (1 F3), y (iii) una CDRH3 que tiene una secuencia seleccionada del grupo integrado por la SEC ID NO. 7 (1A3), SEC ID NO. 27 (2F8), SEC ID NO. 37 (3B6), SEC ID NO. 57 (1 D3), y SEC ID NO. 67 (1 F3). Las secuencias de CDR pueden interponerse entre FRs humanas o humanizadas. En otra realización, la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo integrado por los residuos 20-141 de SEC ID NO. 2 (1A3), los residuos 20-137 de SEC ID NO. 22 (2F8), los residuos 20-139 de SEC ID NO. 32 (3B6), los residuos 20-141 de SEC ID NO. 52 (1 D3), y los residuos 20-141 de SEC ID NO. 62 (1 F3). En otro aspecto, la invención provee una proteína de unión aislada que se une al FCH humano y comprende una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina. La proteína de unión aislada compite para unirse al FCH con al menos un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo integrado por (i) un anticuerpo que tiene una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina de residuos 20-131 de SEC ID NO. 24 (2F8), y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de residuos 20-137 de SEC ID NO. 22 (2F8), (ii) un anticuerpo que tiene una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina de residuos 23-129 de SEC ID NO. 34 (3B6), y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de residuos 20-139 de la SEC ID NO. 32 (3B6), y (iii) un anticuerpo que tiene una región variable de cadena liviana de inmunoglobulina de los residuos 23-128 de la SEC ID NO. 44 (3D11 ), y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de residuos 20-132 de SEC ID NO. 42 (3D11 ). En ciertas circunstancias, la proteína de unión se une al mismo epítopo del FCH como uno de los anticuerpos de referencia. Se entiende que cada una de las proteínas de unión mencionadas anteriormente puede ser un anticuerpo intacto, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal. En forma alternativa, la proteína de unión puede ser un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo, o puede ser un sitio de unión al anticuerpo biosintético. Los fragmentos del anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', (Fab')2 o Fv. Las técnicas para producir dichos fragmentos de anticuerpo son conocidas por los expertos en la técnica. En la técnica se conocen una cantidad de sitios de unión del anticuerpo biosintético e incluyen, por ejemplo, moléculas simples Fv o sFv descriptas, por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nos. 5.476.786. Otros sitios de unión del anticuerpo biosintético incluyen proteínas de unión biespecíficas o bifuncionales, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos o bifuncionales, los cuales son anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen al menos a dos antígenos diferentes. Por ejemplo, las proteínas de unión biespecíficas pueden unirse al FCH, por ejemplo al FCH humano, y otro antígeno de interés. Los métodos para producir anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica e, incluye, por ejemplo, la fusión de hibridomas o la unión de fragmentos Fab'. Ver, por ej., Songsivilai et al. (1990) CLIN. EXP. IMMUNOL. 79: 315-325; Kostelny er a/. (1992) J. IMMUNOL. 148: 1547-1553.

Las proteínas de unión de la invención pueden unirse al FCHh que contiene una sustitución de cisterna en arginina en la posición 561 o una sustitución de glicina en glutamato en la posición 555. En otro aspecto, la invención provee una proteína de unión aislada que se une al FCH humano con un kd de 4,0x10"5 s"1 o inferior, 3,0x10"5 s"1 o inferior, o 2,0x10"5 s"1 o inferior. La proteína de unión aislada puede unirse al FCH humano con un kd desde 5,0x10"5 s"1 hasta 0,5x10"5 s"1, o desde 4,0x10"5 s"1 hasta 1 ,0x10"5 s"1, o desde 3,0x10"5 s"1 hasta 1 ,5x10"5 s"1. En otro aspecto, la invención provee una proteína de unión aislada que se une al FCH humano con un KD de 100 pM o inferior, o 20 pM o inferior, o 10 pM o inferior, o 5 pM o inferior. La proteína de unión aislada puede unirse al FCH humano con un KD desde 100 pM hasta 5 pM, o desde 20 pM hasta 5 pM, o desde 15 pM hasta 10 pM, o desde 20 pM hasta 10 pM, o desde 15 pM hasta 5 pM. A menos que se especifique lo contrario, los valores KD se determinan mediante métodos y condiciones descriptas en el Ejemplo 6. En otro aspecto, la invención provee una proteína de unión aislada que se une al FCH humano, en la cual el anticuerpo se une al FCH humano con un KD inferior a 37°C que a 25°C. La proteína de unión que se une opcionalmente se une al FCH humano con una KD inferior a 5 pM a 37°C. En otros aspectos y realizaciones, las proteínas de unión pueden inhibir al FCHh de unirse al c-Met. Por ejemplo, las proteínas de unión pueden tener una IC50 (concentración al 50% de inhibición máxima) de al menos aproximadamente 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, y 7,0 nM cuando se ensaya utilizando el protocolo descripto en el Ejemplo 7(a). En otras realizaciones, las proteínas de unión pueden neutralizar la incorporación del FCH BrdU en 4 células MBr-5 (ATCC, Catálogo No. CCL208) utilizando el método descripto en el Ejemplo 7(b).

Las proteínas de unión tienen una IC50 de 50 nM o inferior, con preferencia 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 1 , 0,5 nM o inferior, cuando se ensayan utilizando el protocolo descripto en el Ejemplo 7(b). En otras realizaciones, las proteínas de unión puede ser utilizado para inhibir la fosforilación de c-Met estimulado por el FCH en células PC-3 células (ATCC, Manassus, VA Catálogo No. CRL-1435) utilizando el ensayo descripto en el Ejemplo 9. Las proteínas de unión inhiben la fosforilización de c-Met estimulado por el FCH (1 ,25 nM) en células PC-3 con una IC50 de 2 nM o inferior (Tabla 8), utilizando el ensayo descripto en el Ejemplo 9.

II - Producción de las Proteínas de Unión Las proteínas de unión de la invención se pueden producir en varias formas utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las moléculas de ADN que codifican las regiones variables de cadena liviana y las regiones variables de cadena pesada pueden sintetizarse por vía química, utilizando un sintetizador comercial y la información de secuencias provista en la presente. Tales moléculas de ADN sintéticas se pueden ligar a otras secuencias de nucleótidos adecuadas, incluyendo, por ejemplo, las secuencias codificadoras de región constante, y las secuencias de control de expresión, para producir las construcciones de expresión génica convencionales que codifican las proteínas de unión deseadas. La producción de las construcciones génicas definidas está dentro de la rutina de la técnica. En forma alternativa, las secuencias provistas en la presente se pueden clonar a partir de hibridomas mediante técnicas de hibridación convencionales o técnicas de PCR, utilizando sondas de ácido nucleico sintético cuyas secuencias se basan en la información de secuencias provista en la presente o la información de secuencias de la técnica anterior con respecto a los genes que codifican las cadenas pesadas y livianas de anticuerpos murinos en células de hibridoma. La producción y uso de tales sondas está dentro de la técnica. Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de unión deseadas se pueden introducir (ligar) en los vectores de expresión, los cuales se pueden introducir en una célula hospedero mediante técnicas de transfección o transformación estándar conocidas en la técnica. Las células hospedero a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, células de E. coli, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñon de hámster bebé (BHK), células de riñon de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ej., Hep G2), y células de mieloma que no producen de otro modo la proteína de inmunoglobulina. Las células hospedero transfectadas se pueden desarrollar en condiciones que permitan a las células hospedero expresar los genes de interés, por ejemplo, los genes que codifican las regiones variables de cadena pesada o liviana de inmunoglobulina. Los productos de expresión resultantes se pueden cosechar utilizando técnicas conocidas en la técnica. Las condiciones de expresión y purificación particulares variarán dependiendo del sistema de expresión empleado. Por ejemplo, si el gen debe expresarse en E. coli, el cebador se clona en un vector de expresión. Esto se obtiene posicionando el gen diseñado corriente debajo de un promotor bacteriano adecuado, por ej., Trp o Tac, y una secuencia señal, por ej., una secuencia que codifica el fragmento B de la proteína A (FB). La proteína de fusión expresada resultante típicamente se acumula en cuerpos retráctiles o de inclusión en el citoplasma de las células, y puede cosecharse después de la disrupción de las células por homogenización a alta presión (French press) o sonicación. Los cuerpos refráctiles luego se solubilizan, y las proteínas expresadas se repliegan y escinden mediante los métodos ya establecidos para muchas otras proteínas recombinantes. Si el gen diseñado debe expresarse en células hospedero eucariotas, por ejemplo células de mieloma o células CHO, el cebador se inserta en un vector de expresión que contiene un promotor eucariota adecuado, una señal de secreción, mejoradores de inmunoglobulina, y varios intrones. Este vector de expresión puede contener opcionalmente secuencias que codifican todo o parte de una región constante, permitiendo la expresión de una cadena pesada o liviana, entera o parte de ella. La construcción génica puede transfectarse en células de mieloma o células CHO utilizando protocolos de transfección establecidos. Tales células transfectadas pueden expresar fragmentos Vi. o VH, heterodímeros VL-VH, polipéptidos de cadena simple VH-VL O VL-Vh, cadenas completas de inmunoglobulina pesadas o livianas, o sus porciones, cada una de las cuales puede unirse a un dominio de proteína que tiene otra función (por ej., citotoxicidad).

III - Modificaciones a las proteínas de unión Debe entenderse que las proteínas dé unión pueden modificarse para optimizar el rendimiento dependiendo del uso que se le van a dar a las proteínas de unión. Por ejemplo, cuando la proteína de unión se utiliza como agente terapéutico, la proteína de unión puede ser modificada para reducir su inmunogenicidad en el receptor destinado. En forma alternativa o además, la proteína de unión puede ser fusionada o acoplada a otra proteína o péptido, por ejemplo, un factor de crecimiento, citoquina o citotoxina. Tales modificaciones pueden obtenerse utilizando técnicas de manipulación génica de rutina conocidas en la técnica.

En el arte se conocen varias técnicas para reducir la antigenicidad de los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpo. Estas técnicas se pueden utilizar para reducir o eliminar la antigenicidad de las proteínas de unión de la invención. Por ejemplo, cuando las proteínas de unión deben administrarse a un ser humano, con preferencia las proteínas de unión se diseñan para reducir su antigenicidad en humanos. Esto proceso a menudo se denomina humanización. Con preferencia, las proteínas de unión humanizadas tienen la misma o sustancialmente la misma afinidad para el antígeno como la proteína de unión no-humanizada original de la cual deriva. En un método de humanización bien conocido, se crean proteínas quiméricas en las cuales las regiones constantes de inmunoglobulina de anticuerpos de una especie, por ej., ratón, se reemplazan con regiones constantes de inmunoglobulina a partir de una segunda especie diferente, por ej., un ser humano. En este ejemplo, el anticuerpo resultante es una quimera ratón-humano, donde las secuencias de la región constante humana, en principio, son menos inmunogénicas que las secuencias murinas de contraparte. Este tipo de diseño del anticuerpo se describe, por ejemplo, en Morrison, et al. (1984) PROC. NAT. ACAD. SCI. 81 : 6851-6855, Neuberger et al. (1984) NATURE 312: 604-608; Patentes Estadounidenses Nos. 6.893.625 (Robinson); 5.500.362 (Robinson); y 4.816.567 (Cabilly). En otro método, conocido como injerto de CDR, las CDR de las regiones variables de cadena pesada y liviana de un anticuerpo de interés se injertan en marcos (FRs) de otra especie. Por ejemplo, las CDR murinas se pueden injertar en secuencias de FR humanas. En algunas realizaciones, las CDR de las regiones variables de cadena pesada y liviana de un anticuerpo anti-FCH se injertan en FRs humanos o FRs humanos consenso. A fin de crear FRs humanos consenso, los FRs de vahas secuencias de aminoácidos de cadena liviana o cadena pesada humana se alinean para identificar una secuencia de aminoácidos consenso. El injerto de la CDR se describe, por ejemplo, en la Patente Estadounidense Nos. 7.022.500 (Queen); 6.982.321 (Winter); 6.180.370 (Queen); 6.054.297 (Cárter); 5.693.762 (Queen); 5.859.205 (Adair); 5.693,761 (Queen); 5.565.332 (Hoogenboom); 5.585.089 (Queen); 5.530.101 (Queen); Jones et al. (1986) NATURE 321 : 522-525; Riechmann et al. (1988) NATURE 332: 323-327; Verhoeyen er a/. (1988) SCIENCE 239: 1 534-1536; y Winter (1998) FEBS LETT 430: 92-94. En un método denominado "superhumanización," se crean anticuerpos en los cuales la inmunogenicidad se reduce o se elimina mediante una forma alternativa de injerto. En la superhumanización, las secuencias de FR humano se eligen a partir de un conjunto de genes de la línea germinal humana basado en la similitud estructural de las CDR humanas con aquellos del anticuerpo de ratón a ser humanizado. Este método se describe, por ejemplo, en la Patente Estadounidense No. 6.881 .557 (Foote) y en Tan et al. (2002) J. IMMUNOL 169: 1 1 19-1 125. Otros métodos para reducir la inmunogenicidad incluyen, técnicas conocidas como "reshaping," "hiperquimerización," o "veneering/resurfacing" para producir anticuerpos humanizados. Ver, por ej., Vaswami et al. (1998) ANNALS DE ALLERGY, ASTHMA, & IMMUNOL. 81 : 105; Roguska et al. (1996) PROT. ENGINEER 9: 895-904; y la Patente Estadounidense No. 6.072.035 (Hardman). En el método de veneering/resurfacing, los residuos aminoácidos accesibles superficiales en el anticuerpo murino se reemplazan por los residuos de aminoácidos hallados en las mismas posiciones en un anticuerpo humano. Este tipo de resurfacing del anticuerpo se describe, por ejemplo, en la Patente Estadounidense No. 5.639.641 (Pedersen). Un método como ejemplo para convertir un anticuerpo de ratón en una forma adecuada para uso médico se conoce como tecnología ACTIVMAB™ (Vaccinex, Inc., Rochester, NY), la cual involucra un vector basado en el virus de la vacuna para expresar los anticuerpos en células mamíferas. Se dice que se producen altos niveles de diversidad de combinación de las cadenas livianas y pesadas de inmunoglobulina. Ver, por ej., Patente Estadounidense Nos. 6.706.477 (Zauderer); 6.800.442 (Zauderer); y 6.872.518 (Zauderer). Otro método ejemplo para convertir un anticuerpo de ratón en una forma adecuada para su uso en humanos es la tecnología practicada en el comercio por KaloBios Pharmaceuticals, Inc. (Palo Alto, CA). Esta tecnología implica el uso de una biblioteca "aceptora" humana registrada para producir una biblioteca "enfocada al epítopo" para la selección del anticuerpo. Otro método ejemplo para modificar un anticuerpo de ratón en una forma adecuada para uso médico en humanos es la tecnología HUMAN ENGINEERING™ (HE™), el cual es practicado en el comercio por XOMA (US) LLC. Ver, por ej., Publicación de Solicitud Internacional No. WO 93/11794 y la Patente Estadounidense Nos. 5.766.886; 5.770.196; 5.821.123; y 5.869.619. Cualquier método adecuado, incluyendo cualquiera de los métodos anteriores, se puede utilizar para reducir o eliminar la inmunogenicidad humana de una proteína de unión de interés. Además, es posible crear anticuerpos totalmente humanos en ratones. En este método, los anticuerpos humanos se preparan utilizando un ratón transgénico en el cual los genes que producen el anticuerpo de ratón han sido reemplazados por una porción sustancial de los genes que producen el anticuerpo humano. Tales ratones producen moléculas de inmunoglobulina humana en lugar de inmunoglobulina murina. Ver, por ej., WO 98/24893 (Jacobovitz et al.) y Méndez et al. (1997) NATURE GENETICS 1 5: 146-156. Los anticuerpos monoclonales anti-FCH totalmente humanos se pueden producir utilizando el siguiente método. Los ratones transgénicos que contienen genes de inmunoglobulina humana se inmunizan con el antígeno de interés, por ej., FCH. Las células linfáticas de los ratones luego se obtienen de los ratones, las cuales se fusionan con una línea celular del tipo mieloide para preparar líneas células de hibridoma inmortal. Las líneas celulares de hibridoma se clasifican y se seleccionan para identificar las líneas celulares del hibridoma que producen anticuerpos específicos al FCH. Las proteínas de unión de la invención se pueden conjugar con otras moléculas, dependiendo del uso. Por ejemplo, si la proteína de unión va a ser utilizada como producto terapéutico, entonces la proteína de unión puede ser conjugada con otro agente, por ejemplo, una molécula efectora que modula o de otro modo promueve la terapia. En la medida que el efector es un agente basado en la no-proteína, por ejemplo, un fármaco de molécula pequeña, una radiomarca o toxina, entonces, el agente se puede acoplar por vía química a la proteína de unión utilizando químicas de acoplamiento in Vitro estándar. Si, por otro lado, la molécula efectora es una proteína o péptido, por ejemplo, una enzima, receptor, toxina, factor de crecimiento, citoquina u otro inmunomodelador, entonces la proteína de unión puede acoplarse por vía química a la efectora utilizando químicas de acoplamiento in Vitro o se pueden acoplar a una proteína de fusión. Las proteínas de fusión se pueden construir y expresar utilizando las técnicas similares a las mencionadas en la sección II.

IV - Uso de Proteínas de unión Las proteínas de unión descriptas en la presente pueden ser utilizadas en forma de agente diagnóstico o agente terapéutico. (1) Aplicaciones Terapéuticas Dado que las proteínas de unión de la invención neutraliza la actividad del FCH, se pueden utilizar en varias aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, ciertas proteínas de unión de la invención son útiles en la prevención o tratamiento de enfermedades o trastornos proliferativos. Las proteínas de unión pueden ser utilizadas para inhibir o reducir la proliferación de células tumorales. En este método, la células tumorales se exponen a una cantidad eficaz para uso terapéutico de la proteína de unión para inhibir o reducir la proliferación de la célula tumoral. En ciertas realizaciones, las proteínas de unión inhiben la proliferación de la célula tumoral en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 100%. En ciertas realizaciones, la proteína de unión se utiliza para inhibir o reducir la proliferación de una célula tumoral en donde la proteína de unión reduce la capacidad del FCHh de unirse al c-Met. En otras realizaciones, la proteína de unión se utiliza para inhibir o reducir la proliferación de una célula tumoral aún cuando la proteína de unión se une al FCHh pero no inhibe sustancialmente la unión del FCHh al c-Met, como se muestra por el anticuerpo 3B6 en las Tablas 5 y 6. Además, la proteína de unión puede ser utilizada para inhibir, o disminuir el crecimiento o desarrollo del tumor en un mamífero. En dicho método, se administra una cantidad eficaz de la proteína de unión al mamífero para inhibir o disminuir el crecimiento tumoral en el mamífero. En consecuencia, las proteínas de unión se pueden utilizar para tratar tumores, por ejemplo, en un mamífero. El método comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz para uso terapéutico de la proteína de unión. La proteína de unión puede ser administrada sola o en combinación con otra molécula activa para uso farmacéutico, para tratar el tumor. Se contempla que las proteínas de unión de la invención se pueden utilizar en el tratamiento de una variedad de trastornos que responde al FCH, incluyendo, por ejemplo células tumorales que responden al FCH en el cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer ovárico, cáncer de cuello y cabeza, cáncer ovárico, mieloma múltiple, cáncer de hígado, cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer de riñón, cáncer nasofaríngeo, cáncer pancreático, mesotelioma, melanoma y glioblastoma. Tal como se utiliza en la presente, "tratar, "tratando" y "tratamiento" se refiere al tratamiento de un estado de enfermedad en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) prevenir el estado de enfermedad de que se produzca en un mamífero, en particular, cuando dicho animal está predispuesto al estado de enfermedad pero aún no le ha sido diagnosticado; (b) inhibir el estado de enfermedad, es decir detener su desarrollo; y/o (c) aliviar el estado de enfermedad, es decir, originar la regresión del estado de enfermedad. En general, una cantidad eficaz para uso terapéutico del componente activo estará en el rango desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg, opcionalmente desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg, opcionalmente desde aproximadamente 1 mg/kg hasta 10 mg/kg. La cantidad administrada dependerá de variables tales como el tipo y extensión de la enfermedad a ser tratada, el estado de salud general del paciente en particular, la eficacia biológica relativa de la proteína de unión administrada, la formulación de la proteína de unión, la presencia y los tipos de excipientes en la formulación, y la vía de administración. La dosificación inicial administrada puede incrementarse más allá del nivel superior a fin de lograr rápidamente el nivel en sangre o el nivel de tejido deseado, o la dosificación inicial puede ser más pequeña que la dosificación óptima y la dosificación diaria puede aumentarse progresivamente durante el curso del tratamiento dependiendo de la situación particular. La dosificación humana puede optimizarse, por ej., en una escala de dosis Fase I convencional diseñada para correr desde 0,5 mg/kg hasta 20 mg/kg. La frecuencia de dosificación puede variar, dependiendo de los factores tales como vía de administración, cantidad de dosis, y la condición de la enfermedad que se está tratando. Las frecuencias de dosificación son una vez por día, una vez por semana, y una vez cada dos días. Una vía preferida de administración es la parenteral, por ej., infusión intravenosa. La formulación de fármacos basados en un anticuerpo monoclonal está dentro de la capacidad de la técnica. En algunas realizaciones de la invención, la proteína de unión, por ej., anticuerpo monoclonal, es liofilizada y reconstituida en solución salina tamponada en el momento de la administración. Las proteínas de unión se pueden administrar o bien solas o en combinación con otros ingredientes activos para uso farmacéutico. Los otros ingredientes activos, por ej., immunomoduladores, se pueden administrar juntos con la proteína de unión, o se pueden administrar antes o después de la proteína de unión. Las formulaciones que contienen las proteínas de unión para uso terapéutico, incluyen típicamente las proteínas de unión combinadas con un vehículo aceptable para uso farmacéutico. Tal como se utiliza en la presente, "vehículo aceptable para uso farmacéutico" significa buffers, vehículos, y excipientes, que están, dentro del alcance del criterio médico, adecuado para uso en contacto con los tejidos de los seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, u otro problema o complicación, conmensurado con una relación beneficio/riesgo. El vehículo o vehículos debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de las formulaciones y no perjudicial al receptor. Los vehículos aceptables para uso farmacéutico, en este respecto, incluyen cualquiera y todos los buffers, solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes isotónicos y de retardo de la absorción, y similares, compatibles con las administración farmacéutica. El uso de dichos medios y agentes para sustancias activas para uso farmacéutico se conoce en la técnica. Las formulaciones se pueden presentar, en forma conveniente, en una forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante cualquier método adecuado, incluyendo cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Una composición farmacéutica de la invención debe formularse para que sea compatible con la vía de administración de destino. Ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral o administración no-parenteral, por ejemplo, administración intravenosa, intradérmica, inhalación, transdérmica (tópica), transmucosal, y rectal. Las soluciones que se pueden usar para administración oral o parenteral se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica, descriptos, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18° ed. (Mack Publishing Company, 1990). Las formulaciones adecuadas para administración oral pueden estar en la forma de: unidades discretas tales como inyectables, cápsulas, cápsulas de gelatina, sachets, comprimidos, sellos, o pastillas, cada una de ellas contiene una cantidad predeterminada de la proteína de unión; un polvo o composición granular; una solución o una suspensión en un líquido acuoso o líquido no acuoso; o una emulsión aceite-en-agua o una emulsión agua-en-aceite. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen, por ejemplo, los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol, u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tal como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tal como ácido ascórbico o bisulfito de sodio, agentes quelantes tal como ácido etilendiaminotetraacético; buffers tales como acetatos, nitratos o fosfatos y agentes para el ajuste de tonicidad tal como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse como ácidos o bases, tal como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede estar incluida en ampollas, jeringas descartables o recipientes de múltiples dosis de fabricación de vidrio o plástico. En general, las composiciones adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas (solubles en agua) o dispersiones o polvos para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersión. Para administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina de buffer de fosfato (PBS). Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido), y sus mezclas adecuadas.

Con preferencia las formulaciones farmacéuticas son estériles. La esterilización puede obtenerse, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. Siempre que la composición sea liofilizada, la esterilización utilizando este método puede llevarse a cabo antes o a continuación de la liofilización o reconstitución. Una vez que la composición farmacéutica haya sido formulada, puede almacenarse, por ejemplo, en recipientes en forma de una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o en forma de un polvo deshidratado o liofilizado. (2) Aplicaciones Diagnósticas Siempre que las proteínas de unión se utilicen para fines diagnósticos, ya sea in vitro o in vivo, las proteínas de unión típicamente se rotulan en forma directa o indirecta con un resto detectable. El resto detectable puede ser cualquier resto que sea capaz de producir, en forma directa o indirecta, una señal detectable. Por ejemplo, el resto detectable puede ser un radioisótopo, tal como hidrógeno (3H), 14Carbono ( 4C), 32Fósforo (32P), 35Azufre (35S), o 125Yodo ( 25l); un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como fluoresceína isotiocianato, rodamina, o luciferina; una enzima, tal como alcalina fosfatasa, beta-galactosidasa, o peroxidasa de rábano picante; una sonda espín, tal como una espín label; o una partícula coloreada, por ejemplo, un látex o partícula dorada. Se entiende que la proteína de unión puede ser conjugada al resto detectable utilizando una cantidad de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, según se describen en Hunter et al. (1962) NATURE 144: 945; David et al. (1974) BIOCHEMISTRY 13: 1014; Pain et al. (1981 ) J. IMMUNOL. METH. 40: 219; y Nygren (1982) J. HISTOCHEM. Y CYTOCHEM. 30: 407. Las radiomarcas se pueden detectar, por ej., visualmente o con la ayuda de un espectrofotómetro u otro detector.

Las proteínas de unión se pueden emplear en un amplio rango de técnicas de inmunoensayo disponibles en la técnica. Los inmunoensayos ejemplares incluyen, por ejemplo, inmunoensayos sándwich, inmunoensayos competitivos, procedimientos inmunohistoquímicos. En un inmunoensayo sándwich, se utilizan dos anticuerpos que se unen a un analito o antígeno de interés, por ej., uno inmovilizado sobre un soporte sólido, y uno libre en solución y marcado con un resto detectable. Cuando una muestra que contiene el antígeno es introducida en el sistema, el antígeno se une tanto al anticuerpo inmovilizado como al anticuerpo marcado, para formar un complejo inmune "sandwich" sobre la superficie del soporte. La proteína complejada es detectada lavando componentes de muestra no-unidos y un exceso de anticuerpo marcado, y midiendo la cantidad de anticuerpo marcado complejado a la proteína sobre la superficie del soporte. Alternativamente, el anticuerpo libre en solución puede detectarse por un tercer anticuerpo marcado con un resto detectable que se une al anticuerpo libre. Una revisión detallada del diseño de ensayo, teoría y protocolos inmunológicos, se puede hallar en numerosos textos, que incluyen Butt, ed., (1984) PRACTICAL IMMUNOLOGY, Marcel Dekker, New York; Harlow et al. eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY APPROACH, Cold Spring Harbor Laboratory; y Diamandis et al., eds. (1996) IM UNOASSAY, Academic Press, Boston. Se contempla que las proteínas de unión marcadas son útiles como agentes de imagen in vivo, por lo que las proteínas de unión pueden apuntar los agentes de imagen a tejidos particulares de interés en el receptor. Un resto remotamente detectable preferido para imagen in vivo incluye el átomo radioactivo Tecnecio"99m (99mTc), un emisor gamma con un tiempo de vida media de aproximadamente seis horas. Los restos no radioactivos también útiles en la obtención de imágenes in vivo incluyen marcadores de espín de nitróxido como así también iones lantánidos y de metales de transición, los cuales inducen la relajación protónica in situ. Además de la inmuno imagen, los restos radioactivos complejados se pueden utilizar en protocolos de radioinmunoterapia estándar para destruir la célula buscada. Los nucléotidos preferidos para radioinmunoterapia de alta dosis incluyen los átomos radioactivos 90Ytrio (90Yt), 131Yodo (131l) y 111lndio (111ln). La proteína de unión puede marcarse con 131l, ni |n v 99mjc U†j|jzanc|0 técnicas de acoplamiento conocidas en las técnicas de imagen. De manera similar, los procedimientos para preparar y administrar el agente de imagen así como también capturar y procesar imágenes son bien conocidos en la técnica de imagen y por lo tanto no se describen en la presente. De manera similar, los métodos para realizar inmunoterapias basadas en anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5.534.254. A lo largo de la descripción, donde se describen las composiciones como que tienen, incluyen o comprenden componentes específicos, se contempla que las composiciones también consisten esencialmente, o consisten en los componentes mencionados. De manera similar, donde se describen los procesos como que tienen, incluyen o comprenden pasos de procesamiento específicos, los procesos también consisten esencialmente o consisten en los pasos de procesamiento mencionados. Salvo que se indique lo contrario, el orden de los pasos o el orden para realizar ciertas acciones son inmateriales en la medida que la invención permanezca operable. Además, a menos que se especifique lo contrario, se pueden llevar a cabo pasos o acciones en forma simultánea.

EJEMPLOS Los siguientes Ejemplos describen la producción y caracterización de una cantidad de anticuerpos monoclonales anti-FCHh.

Ejemplo 1 - Producción de Anticuerpos monoclonales anti-FCHh Este Ejemplo describe la producción de una cantidad de anticuerpos monoclonales anti-FCHh. Las inmunizaciones, fusiones y pantallas primarias se llevaron a cabo en MBS Inc. (Portland, ME), siguiendo el protocolo de Sitios Múltiples de Inmunización Repetitiva (RIMMS). Se inmunizaron cinco ratones AJ y cinco ratones Balb/c con FCH humano recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN; Catálogo No. 294-HGN-025). Se eligieron dos ratones con sueros que despliegan actividad anti-FCH más alta por el Ensayo Inmunoabsorbente Enlazado a la Enzima (ELISA) para la subsiguiente fusión. Se cosecharon los bazos y nodos linfáticos de los ratones apropiados. Las células B luego se cosecharon y fusionaron con una línea de mieloma. Los productos de fusión se diluyeron en serie sobre una o más placas hasta casi la clonación. Los sobrenadantes de las fusiones resultantes se clasificaron por su unión al FCHh mediante ELISA. Los sobrenadantes identificados como anticuerpos que contienen al FCH también se caracterizaron por ensayo funcional in vitro según se menciona en los siguientes ejemplos. Un panel de hibridomas se seleccionó y los hibridomas se subclonaron y se expandieron. Los anticuerpos monoclonales luego se purificaron por cromatografía de afinidad sobre la resina de la Proteína A/G en condiciones estándar.

Ejemplo 2 - Análisis de secuencia de anticuerpos monoclonales anti-FCHh Este Ejemplo describe el isotipo y los análisis de secuencia de los anticuerpos monoclonales anti-FCHh producidos en el Ejemplo 1. a. Determinación de los Isotipos del Anticuerpo Monoclonal Murino de FCH El isotipo de cadena pesada y del tipo cadena liviana de cada anticuerpo monoclonal se determinó utilizando el Kit IsoStrip Mouse Monoclonal Anticuerpo Isotyping de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche Applied Science). Todos los anticuerpos se determinaron para contener una cadena liviana kappa de inmunoglobulina y una cadena liviana de lgG1 de inmunoglobulina. b^ Determinación de secuencias nucleotídicas que codifican las regiones variables de cadena liviana y pesada de inmunoglobulina El ARN total se extrajo a partir de cada línea celular de hibridoma monoclonal utilizando el Kit RNeasy Miniprep de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen Venlo, Holanda). El ADNc de cebadora cepa de longitud completa se generó utilizando el Kit de amplificación de ADNc BD SMART™ RACE de acuerdo con las instrucción del fabricante (Clontech) utilizando los cebadores oligonucleotídicos BD SMART II A (5' aagcagtggtatcaacgcagagtacgcggg 3') (SEC ID NO. 85) y 5 -RACE CDS Cebador (5' tttttttttttttttttttttttttvn 3', donde v = a, g, o c y n = a, g, c, o t) (SEC ID NO. 86) a los fines de 5' RACE (Amplificación rápida de extremos de ADNc). Las regiones variables de las cadenas kappa de inmunoglobulina y pesada (lgG1) se amplificaron por PCR (reacción en cadena de polimerasa) utilizando el Sistema de PCR de Alta Fidelidad de Expansión (Roche Applied Science) de acuerdo con las instrucciones el fabricante. Las regiones variables de cadena pesada se amplificaron con la mezcla de cebador oligonucleotídico de 5' Universal Cebador Mix A (mezcla de 5' ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt 3' (SEC ID NO. 87) y 5' ctaatacgactcactatagggc 3'(SEC ID NO. 88)) y un cebador específico de la Región constante de lgG1 de 3', ya sea 5' tatgcaaggcttacaaccaca 3' (SEC ID NO. 89) o 5' gccagtggatagacagatgggggtgtcg 3' (SEC ID NO. 90). Las regiones variables de las cadenas kappa se amplificaron con la mezcla de cebador oligonucleotídico de 5' Universal Cebador Mix A y un cebador específico de la región constante de kappa de 3', ya sea 5' ctcattcctgttgaagctcttgacaat 3' (SEC ID NO. 91) o 5' cgactgaggcacctccagatgtt 3' (SEC ID NO. 92). Los productos de PCR individuales se fraccionaron por electroforesis de gel de agarosa y se purificaron utilizando el Kit de purificación de gel Qiaquick de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen). Los productos PCR se clonaron a continuación en el plásmido pCR2.1 TOPO utilizando el kit de clonación basado en la topoisomerasa TOPO TA Cloning® Kit (con el vector pCR®2.1-TOPO®) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se transformaron en las bacterias DH5 utilizando técnicas de transformación estándar. El ADN del plásmido aislado de los clones bacterianos transformados se secuenciaron utilizando los cebadores T7 (5' TAATACGACTCACTATAGGG 3') (SEC ID NO. 93), M13 Delantero (5' GTAAAACGACGGCCAGT 3') (SEC ID NO. 94), y M13 Inverso (5' CAGGAAACAGCTATGACC 3') (SEC ID NO. 95) de Agencourt Bioscience utilizando métodos de secuenciamiento de ADN dideoxi estándar para identificar la secuencia de las secuencias de la región variable. Las secuencias se analizaron utilizando el software Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, CA) y el servidor de web IMGT/V-Quest webserver (http://imgt.cines.fr/textes/vquest) para identificar y confirmar las secuencias de la región variable. Determinación de secuencias nucleotídicas que codifican secuencias de región constante de cadena liviana y pesada de inmunoqlobulina para las cadenas kappa e lqG1 1A3. 1 D3. 1 F3, y 2B8 Los ADNs de longitud completa para las cadenas lgG1 1A3, 1 D3, y 1 F3 se amplificaron por PCR a partir del ADNc creado anteriormente utilizando el cebador delantero. 5' ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatgaactttgggctcagattgattttcc 3' (codón de inicio subrayado (SEC ID NO. 96) y el cebador inverso 5' ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcatttaccaggagagtgggagagg 3' (codón de detención subrayado) (SEC ID NO. 97). El ADNc de longitud completa para la cadena de lgG1 2B8 se amplificó a partir del ADNc creado anteriormente utilizando el cebador delantero 5' ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatgggatggagctatatcatcctcttt 3' (codón de inicio subrayado) (SEC ID NO. 98) y el cebador inverso 5' ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcatttaccaggagagtgggagag 3' (codón de detención subrayado) (SEC ID NO. 99). El ADNc de longitud completa para la cadena kappa 2B8 se amplificó utilizando el cebador delantero 5' ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatggaatcacagactctggtcttcata 3' (codón de inicio subrayado) (SEC ID NO. 100) y el cebador inverso 5' ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctaacactcattcctgttgaagctc 3' (codón de detención subrayado) (SEC ID NO. 101 ). Los fragmentos de PCR se subclonaron en pDONR221 (Invitrogen, Carlsbad, CA) por reacción de recombinación Gateway BP (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se secuenció por Agencourt Bioscience utilizando métodos de secuenciamento de ADN dideoxi para la secuencia de la región constante y además confirmar la secuencias de región variable. g\ Análisis de Secuencia Las regiones variables (texto normal) se identificaron utilizando el software IMGTA/-QUEST webserver (http://imgt.cines.fr/textes/vquest/). Las secuencias del péptido de señal se predijeron sobre la base de la identificación del codón de inicio de marco (ATG) que estaba corriente arriba de la región variable identificada. Las secuencias del péptido de señal se identificaron y se subrayan a continuación. El último nucleótido de cada región variable es la cebadora base del próximo codón generado por la unión de la región variable/constante. Este nucleótido se incluye en la región variable porque es parte de ese exón. Las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes mencionadas a continuación incluyen la traducción de este codón de unión. A fin de crear las secuencias del anticuerpo de cadena pesada o kappa completa, la secuencias de la región variable mencionadas a continuación se combinan con sus respectivas secuencias de la región constante respectiva (la secuencias de señal se subraya). (1) Región variable de cadena pesada 1A3 (SEC ID NO. 1) 1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcagcct ctgaattcac tttcagtaac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tgcagtgggt cgcatacatt agtcctggtg gtggtagctc ctactatcca 241 gccagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgcaag acaaggggat 361 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcag (2) kappa Región variable de cadena liviana 1A3 (SEC ID NO. 3) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgttt ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttat agtaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaagc tggaaataaa ac (3) Región variable de cadena pesada 2B8 (SEC ID NO. 1 1 ) 1 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgt ccactcccag 61 gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt gaagctgtcc 121 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgaa tcagaggcct 181 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 301 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc ag (4) Región variable de cadena liviana kappa 2B8 (SEC ID NO. 13) 1 atggaatcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg tgctgatggq 61 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 121 ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca 181 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat 241 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct 301 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaggc tggaaataaa ac (5) Región variable de cadena pesada 2F8 (SEC ID NO. 21 ) 1 atggaatgga gctqqgtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactgccag 61 gtccagctga agcagtctgg agctgagctg gtgaggcctg ggacttcagt gaagatgtcc 121 tgcaaggctt ctggctacac cttcactacc tactatatac actgggtgaa tcagaggcct 181 ggacagggcc ttgagtggat tggaaagatt ggtcctggaa gtggtagtac ttactacaat 241 gagatgttca aagacaaggc cacattgact gtagacacat cctccagcac agcctacatg 301 cagctcagca gcctgacatc tgacgactct gcggtctatt tctgtgcaag aaggggactg 361 ggacgtggct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc ag (6) Región variable de cadena liviana kappa 2F8 (SEC ID NO. 23) 1 atggagacag acacaatcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 61 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 121 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggta atagttatat caactggtac 181 caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctatg ttgcatccaa tctagaatct 241 gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 301 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtattga ggatcctccc 361 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaac (7) Región variable de cadena pesada 3B6 (SEC ID NO. 31 ) 1 atggaatggc cttgtatctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgaaggtgt ccactcccag 61 gttcagctgc agcagtctgg ggctgaactg gtgaggcctg ggtcctcagt gaagatttcc 121 tgcaaggctt ctggctatgt attcagtagc tactggatga actgggtgaa gcagaggcct 181 ggacagggtc ttgagtggat tggacagatt tatcctggag atggtgatag taactacaat 241 ggaaacttca agggtaaagc cacactgact gcagacaaat cctccagtac agcctacatg 301 cagctcagca gcctaacatc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcatc ccagctcggg 361 ctacgtgaga actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcag (8) Región variable de cadena liviana kappa 3B6 (2 codones de inicio de ATG posibles (letra mayúscula)) (SEC ID NO. 33) 1 ATGgacATGa ggacccctgc tcagtttctt ggaatcttgt tgctctggtt tccaggtatc 61 aaatgtgaca tcaagatgac ccagtctcca tcttccatgt atgcatctct aggagagaga 121 gtcacaatca cttgcaaggc gagtcaggac attaaaagct atttaagctg gttccagcag 181 aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgtaa acagattggt agatggggtc 241 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg caagattctt ctctcaccat caccagcctg 301 gagaatgaag atatgggaat ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc gttcacgttc 361 ggagggggga ccaagctgga aataaagc (9) Región variable de cadena pesada 3D1 1 (SEC ID NO. 41) 1 atggctgtcc cggtgctgtt cctctgcctg gttgcatttc caagctgtgt cctgtcccag 61 gtacagctga aggagtcagg acctggcctg gtggcgccct cacagagcct gtccatcact 21 tgcactgtct ctgggttttc attaaccagc tatagtttac actgggttcg ccagcctcca 181 ggaaagggtc tggaatggct gggagtaata tgggctggtg gaaacacaaa ttataattcg 241 tctctcatgt ccagactgac catcaggaaa gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa 301 atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc atgtactact gtgccagaga gaggtttgct 361 tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcag (10) Región variable de cadena liviana kappa 3D1 1 (SEC ID NO. 43) 1 atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt caaaatatcc 61 agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatatcc aggggagaag 121 gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 181 tcaggcacct cccccaaaag atggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccct 241 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactccc tcacaatcag tagtatggag 301 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccact cacgttcggt 361 gctgggacca agctggagct gaaac (1 1 ) Región variable de cadena pesada 1 D3 (SEC ID NO. 51 ) 1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc cgagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatatatt actgtgtgag acaaggggat 361 ggttattacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt catcgtctcc 421 tcag (12) Región variable de cadena liviana kappa 1 D3 (SEC ID NO. 53) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgtcagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gaacaagtga gaatatttac agtaatttag cgtggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct aatctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca ggatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggaggtatta ctgtcaacat ttttggggga ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaaac tggaaataaa ac (13) Región variable de cadena pesada 1 F3 (SEC ID NO. 61 ) 1 atqaactttq ggctcagatt qattttcctt qtccttqttt taaaaqqtqt qaaqtqtqaq 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagtctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcggcct ctggattcac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatatatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctct agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggggat 361 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcag (14) Región variable de cadena liviana kappa 1 F3 (SEC ID NO. 63) 1 atgagtgtqc ccactcaqqt cctqggqttg ctqctgctgt ggcttacaga tqccaqatqt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgat gcaacacact taccagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gtttggaggg 361 gggaccagac tggaaattaa ac (15) Región variable de cadena pesada 3A12 (SEC ID NO. 71 ) 1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaaqtgtgaa 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaaatctcc 121 tgtgcagcct ctggatttac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgaaca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggagat 361 ggttactatg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcag (16) Región variable de cadena liviana kappa 3A12 (SEC ID NO. 73) 1 atgagtqtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc gccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 21 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac attaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtccatgct gcaacaaagt tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaaac tagaaataaa ac (17) Región constante de cadena pesada lgG1 de ratón de referencia (J00453) (SEC ID NO. 81 ) 1 ccaaaacgac acccccatct gtctatccac tggcccctgg atctgctgcc caaactaact 61 ccatggtgac cctgggatgc ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtg acagtgacct 121 ggaactctgg atccctgtcc agcggtgtgc acaccttccc agctgtcctg gagtctgacc 181 tctacactct gagcagctca gtgactgtcc cctccagccc tcggcccagc gagaccgtca 241 cctgcaacgt tgcccacccg gccagcagca ccaaggtgga caagaaaatt gtgcccaggg 301 attgtggttg taagccttgc atatgtacag tcccagaagt atcatctgtc ttcatcttcc 361 ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg tgtgttgtgg 421 tagacatcag caaggatgat cccgaggtcc agttcagctg gtttgtagat gatgtggagg 481 tgcacacagc tcagacgcaa ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc cgctcagtca 541 gtgaacttcc catcatgcac caggactggc tcaatggcaa ggagttcaaa tgcagggtca 601 acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggcagaccga 661 aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag gataaagtca 721 gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag tggcagtgga 781 atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catgaacacg aatggctctt 841 acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga aatactttca 901 cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc ctctcccact 961 ctcctggtaa atga (18) Región constante de cadena pesada lgG1 de ratón determinada para 1 A3, 1 D3, 1 F3, y 2B8 (derivada de ratón de cepa AJ) (SEC ID NO. 82) 1 ccaaaacgac acccccatct gtctatccac tggcccctgg atctgctgcc caaactaact 61 ccatggtgac cctgggatgc ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtg acagtgacct 121 ggaactctgg atccctgtcc agcggtgtgc acaccttccc agctgtcctg cagtctgacc 181 tctacactct gagcagctca gtgactgtcc cctccagcac ctggcccagc gagaccgtca 241 cctgcaacgt tgcccacccg gccagcagca ccaaggtgga caagaaaatt gtgcccaggg 301 attgtggttg taagccttgc atatgtacag tcccagaagt atcatctgtc ttcatcttcc 361 ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg tgtgttgtgg 421 tagacatcag caaggatgat cccgaggtcc agttcagctg gtttgtagat gatgtggagg 481 tgcacacagc tcagacgcaa ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc cgctcagtca 541 gtgaacttcc catcatgcac caggactggc tcaatggcaa ggagttcaaa tgcagggtca 601 acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggcagaccga 661 aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag gataaagtca 72 gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag tggcagtgga 781 atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catggacaca gatggctctt 841 acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga aatactttca 901 cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc ctctcccact 961 ctcctggtaa atga (19) Región constante de cadena liviana kappa de ratón de referencia (V00807) y Mouse Región constante de cadena liviana kappa de ratón determinada para 1 D3. 1 F3, y 2B8 (derivada de ratón de cepa AJ) (SEC ID NO. 83) 1 gggctgatgc tgcaccaact gtatccatct tcccaccatc cagtgagcag ttaacatctg 61 gaggtgcctc agtcgtgtgc ttcttgaaca acttctaccc caaagacatc aatgtcaagt 121 ggaagattga tggcagtgaa cgacaaaatg gcgtcctgaa cagttggact gatcaggaca 181 gcaaagacag cacctacagc atgagcagca ccctcacgtt gaccaaggac gagtatgaac 241 gacataacag ctatacctgt gaggccactc acaagacatc aacttcaccc attgtcaaga 301 gcttcaacag gaatgagtgt tag (20) Región constante de cadena liviana kappa de ratón determinada para 1A3 que contiene un nucleótido alterado comparado con 1 D3, 1 F3, y 2B8 (subrayado) (SEC ID NO. 84) 1 gggctgatgc tgcaccaact gtatccatct tcccaccatc cagtgagcag ttaacatctg 61 gaggtgcctc agtcgtgtgc ttcttgaaca acttctaccc caaagacatc aatgtcaagt 121 ggaagattga tggcagtgaa cgacaaaatg gcgtcctgaa cagttggact gatcaggaca 181 gcaaagacag cacctacagc atgagcagca ccctcatgtt gaccaaggac gagtatgaac 241 gacataacag ctatacctgt gaggccactc acaagacatc aacttcaccc attgtcaaga 301 gcttcaacag gaatgagtgt tag Cada una de las secuencias de aminoácidos que define la región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas para los anticuerpos producidos en el Ejemplo 1 se establece en la Figura 2. Cada una de la secuencias están alineadas una con otra y las secuencias que definen el péptido de señal, las CDRL CDR2 y CDR3 se identifican por cajas. La Figura 3 muestra una alineación de las secuencias CDRi , CDR2 y CDR3 separadas para cada uno de los anticuerpos. Cada una de las secuencias de aminoácidos que define la región variable de cadena liviana de inmunoglobulinas para cada una de los anticuerpos producidos en el Ejemplo 1 se establece en la Figura 4. Cada una de la secuencias están alineadas una con otra y las secuencias que definen el péptido de señal, las CDR^ CDR2 y CDR3 se identifican por cajas. La Figura 5 muestra una alineación de las secuencias de CDRi , CDR2 y CDR3 separadas para cada uno de los anticuerpos.

Para conveniencia, la Tabla 1 provee una tabla de concordancia que muestra la correspondencia entre las secuencias del anticuerpo descriptas en este ejemplo con las presentadas en el Listado de secuencias.

TABLA 1 SEC. ID NO. Proteína o Ácido nucleico 1 Región variable de cadena pesada 1A3 - ácido nucleico 2 Región variable de cadena pesada 1A3 - proteína 3 Región variable de cadena (kappa) liviana 1A3 - ácido nucleico 4 Región variable de cadena (kappa) liviana 1A3 - proteína 5 CDRi de cadena pesada 1A3 6 CDR2 de cadena pesada 1A3 7 CDR3 de cadena pesada 1A3 8 CDR1 de cadena (kappa) liviana 1A3 9 CDR2 de cadena (kappa) liviana 1A3 10 CDR3 de cadena (kappa) liviana 1A3 1 1 Región variable de cadena pesada 2B8 - ácido nucleico 12 Región variable de cadena pesada 2B8 - proteína 13 Región variable de cadena (kappa) liviana 2B8 - ácido nucleico 14 Región variable de cadena (kappa) liviana 2B8 - proteína 15 CDRT de cadena pesada 2B8 16 CDR2 de cadena pesada 2B8 17 CDR3 de cadena pesada 2B8 18 CDR^e cadena (kappa) liviana 2B8 19 CDR2 de cadena (kappa) liviana 2B8 20 CDR3 de cadena (kappa) liviana 2B8 21 Región variable de cadena pesada 2F8 - ácido nucleico 22 Región variable de cadena pesada 2F8 - proteína SEC. ID NO. Proteína o Ácido nucleico 23 Región variable de cadena (kappa) liviana 2F8 - ácido nucleico 24 Región variable de cadena (kappa) liviana 2F8 - proteína 25 CDRi de cadena pesada 2F8 26 CDR2 de cadena pesada 2F8 27 CDR3 de cadena pesada 2F8 28 CDRi de cadena (kappa) liviana 2F8 29 CDR2 de cadena (kappa) liviana 2F8 30 CDR3 de cadena (kappa) liviana 2F8 31 Región variable de cadena pesada 3B6 - ácido nucleico 32 Región variable de cadena pesada 3B6 - proteína 33 Región variable de cadena (kappa) liviana 3B6 - ácido nucleico 34 Región variable de cadena (kappa) liviana 3B6 - proteína 35 CDRi de cadena pesada 3B6 36 CDR2 de cadena pesada 3B6 37 CDR3 de cadena pesada 3B6 38 CDRi de cadena (kappa) liviana 3B6 39 CDR2 de cadena (kappa) liviana 3B6 40 CDR3 de cadena (kappa) liviana 3B6 41 Región variable de cadena pesada 3D11 - ácido nucleico 42 Región variable de cadena pesada 3D11 - proteína 43 Región variable de cadena (kappa) liviana 3D1 1 - ácido nucleico 44 Región variable de cadena (kappa) liviana 3D1 1 - proteína 45 CDR-i de cadena pesada 3D1 1 46 CDR2 de cadena pesada 3D1 1 47 CDR3 de cadena pesada 3D1 1 48 CDRi de cadena (kappa) liviana 3D1 1 49 CDR2 de cadena (kappa) liviana 3D1 1 SEC. ID NO. Proteína o Ácido nucleico 50 CDR3 de cadena (kappa) liviana 3D1 1 51 Región variable de cadena pesada 1 D3 - ácido nucleico 52 Región variable de cadena pesada 1 D3 - proteína 53 Región variable de cadena (kappa) liviana 1 D3 - ácido nucleico 54 Región variable de cadena (kappa) liviana 1 D3 - proteína 55 CDR-i de cadena pesada 1 D3 56 CDR2 de cadena pesada 1 D3 57 CDR3 de cadena pesada 1 D3 58 CDRi de cadena (kappa) liviana 1 D3 59 CDR2 de cadena (kappa) liviana 1 D3 60 CDR3 de cadena (kappa) liviana 1 D3 61 Región variable de cadena pesada 1 F3 - ácido nucleico 62 Región variable de cadena pesada 1 F3 - proteína 63 Región variable de cadena (kappa) liviana 1 F3 - ácido nucleico 64 Región variable de cadena (kappa) liviana 1 F3 - proteína 65 CDR1 de cadena pesada 1 F3 66 CDR2 de cadena pesada 1 F3 67 CDR3 de cadena pesada 1 F3 68 CDR1 de cadena (kappa) liviana 1 F3 69 CDR2 de cadena (kappa) liviana 1 F3 70 CDR3 de cadena (kappa) liviana 1 F3 71 Región variable de cadena pesada 3A12 - ácido nucleico 72 Región variable de cadena pesada 3A12 - proteína 73 Región variable de cadena (kappa) liviana 3A12 - ácido nucleico 74 Región variable de cadena (kappa) liviana 3A12 - proteína 75 CDR1 de cadena pesada 3A12 76 CDR2 de cadena pesada 3A12 SEC. ID NO. Proteína o Ácido nucleico 77 CDR3 de cadena pesada 3A12 78 CDR-i de cadena (kappa) liviana 3A12 79 CDR2 de cadena (kappa) liviana 3A12 80 CDR3 de cadena (kappa) liviana 3A12 Además, para conveniencia, las siguientes secuencias representan las secuencias de cadena liviana y pesada de longitud completa reales o contempladas (es decir, que contienen secuencias tanto de la región constante como variable) para cada uno de los anticuerpos descriptos en este Ejemplo. Se observa que las regiones constantes de los anticuerpos murinos 2F8, 3A12, 3B6, y 3D11 no se secuenciaron pero se presumen que tienen las mismas secuencias de región constante que los anticuerpos 1 D3, 1 F3, y 2B8, los cuales se secuenciaron, ya que todas derivaban de ratón de cepa AJ. Se aprecia, sin embargo, que las secuencias de región variable descriptas en la presente se pueden ligar a cada una de una cantidad de otras secuencias de región constantes conocidas por los expertos en la técnica para producir cadenas livianas y pesadas de inmunoglobulina de longitud completa. (1) Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena pesada 1A3 de longitud completa (Región variable de cadena pesada 1A3 y Región constante de IgGD (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 122) 1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcagcct ctgaattcac tttcagtaac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tgcagtgggt cgcatacatt agtcctggtg gtggtagctc ctactatcca 241 gccagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgcaag acaaggggat 361 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 481 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 541 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 601 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 661 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 72 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 781 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 841 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1081 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1 141 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1201 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1261 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1381 cactctcctg gtaaatga (2) Secuencia de proteína que define la secuencia de cadena pesada 1A3 de longitud completa (Región variable de cadena pesada 1A3 y Región constante de IqGD (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 123) 1 evqlvesggg Ivqpggslkl scaaseftfs nyymswvrqt pekrlqwvay ispgggssyy 61 pasvkgrfti srdnakntly Iqmsslksed tamyycarqg dgyygdyamd ywgqgtsvtv 121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtwnsgslss gvhtfpavlq 181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssvf 241 ifppkpkdvl titltpkvtc v vdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr 301 svselpimhq dwlngkefkc rvnsaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd 361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn 421 tftcsvlheg Ihnhhteksl shspgk (3) Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena liviana 1A3 de longitud completa (región variable kappa 1A3 y Región constante) (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 124) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgttt ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttat agtaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaagc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcatg 601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag (4) Secuencia de proteína gue define la secuencia de cadena liviana 1A3 de longitud completa (región variable kappa 1A3 y Región constante) (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 125) 1 diqmtqspas Isvsvgetvt itcraseniy snlawyqqkq gkspqllvya atnladgvps 61 rfsgsgsgtq fslkinslqs edfgtyycqh fwgtpytfgg gtkleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga svvcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlm 181 Itkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec (5) Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena pesada 2B8 de longitud completa (región variable 2B8 de cadena pesada y Región constante de IgGD (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 126) 1 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgt ccactcccag 61 gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt gaagctgtcc 121 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgaa tcagaggcct 181 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 301 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc agccaaaacg 421 acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 481 accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 541 ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 601 ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 661 gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 721 tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 781 cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 841 agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 901 gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 961 cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1021 gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1081 caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1141 tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1201 ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1261 tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1321 gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1381 aaatga (6) Secuencia de proteína que define la secuencia de cadena pesada 2B8 de longitud completa (región variable 2B8 de cadena pesada y Región constante de IqGD (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 127) 1 qvqlqqpgae Ivkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqr pgqglewige inptnghtny 61 nekfkskatl tvdkssstay mqlssltsed savyycarny vgsifdywgq gttltvssak 121 ttppsvypla pgsaaqtnsm vtlgclvkgy fpepvtvtwn sgslssgvht fpavlqsdly 181 tlsssvtvps stwpsetvtc nvahpasstk vdkkivprdc gckpcictvp evssvfifpp 241 kpkdvltitl tpkvtcvvvd iskddpevqf swfvddvevh taqtqpreeq fnstfrsvse 301 Ipimhqdwln gkefkcrvns aafpapiekt isktkgrpka pqvytipppk eqmakdkvsl 361 tcmitdffpe ditvewqwng qpaenykntq pimdtdgsyf vysklnvqks nweagntftc 421 svlheglhnh htekslshsp gk (7) Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena liviana 2B8 de longitud completa (región variable kappa 2B8 y Región constante) (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 128) 1 atggaatcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg tgctgatggg 61 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 121 ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca 181 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat 241 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct 301 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaggc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag (8) Secuencia de proteina que define la secuencia de cadena liviana 2B8 de longitud completa (región variable kappa 2B8 y Región constante) (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 129) 1 nivmtqspks msmsvgervt Isckasenvv syvswyqqkp aqspklliyg asnrntgvpd 61 rftgsgsatd ftltissvra edladyhcgq synypytfgg gtrleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga svvcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt 181 Itkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec (9) Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena pesada 2F8 de longitud completa (región variable 2F8 de cadena pesada y Región constante de IgGD (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 130) 1 atggaatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactgccag 61 gtccagctga agcagtctgg agctgagctg gtgaggcctg ggacttcagt gaagatgtcc 121 tgcaaggctt ctggctacac cttcactacc tactatatac actgggtgaa tcagaggcct 181 ggacagggcc ttgagtggat tggaaagatt ggtcctggaa gtggtagtac ttactacaat 241 gagatgttca aagacaaggc cacattgact gtagacacat cctccagcac agcctacatg 301 cagctcagca gcctgacatc tgacgactct gcggtctatt tctgtgcaag aaggggactg 361 ggacgtggct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc agccaaaacg 421 acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 481 accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 541 ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 601 ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 661 gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 721 tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 781 cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 841 agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 901 gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 961 cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1021 gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1081 caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1 141 tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1201 ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1261 tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1321 gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1381 aaatga (10) Secuencia de proteína que define la secuencia de cadena pesada 2F8 de longitud completa (región variable 2F8 de cadena pesada y Región constante de IgGD (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 131 ) 1 qvqlkqsgae Ivrpgtsvkm sckasgytft tyyihwvnqr pgqglewigk igpgsgstyy 61 nemfkdkatl tvdtssstay mqlssltsdd savyfcarrg Igrgfdywgq gttltvssak 121 ttppsvypla pgsaaqtnsm vtlgclvkgy fpepvtvtwn sgslssgvht fpavlqsdly 181 tlsssvtvps stwpsetvtc nvahpasstk vdkkivprdc gckpcictvp evssvfifpp 241 kpkdvltitl tpkvtcv vd iskddpevqf swfvddvevh taqtqpreeq fnstfrsvse 301 Ipimhqdwln gkefkcrvns aafpapiekt isktkgrpka pqvytipppk eqmakdkvsl 361 tcmitdffpe ditvewqwng qpaenykntq pimdtdgsyf vysklnvqks nweagntftc 421 svlheglhnh htekslshsp gk (1 1) Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena liviana 2F8 de longitud completa (región variable kappa 2F8 y Región constante) (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 132) 1 atggagacag acacaatcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 61 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 121 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggta atagttatat caactggtac 181 caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctatg ttgcatccaa tctagaatct 241 gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 301 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtattga ggatcctccc 361 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 421 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 481 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 541 aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 601 agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 661 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag (12) Secuencia de proteína gue define la secuencia de cadena liviana 2F8 de longitud completa (región variable kappa 2F8 y Región constante) (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 133) 1 divltqspas lavslgqrat isckasqsvd ydgnsyinwy qqkpgqppkv liyvasnles 61 giparfsgsg sgtdftlnih pveeedaaty ycqqsiedpp tfgagtklel kradaaptvs 121 ifppsseqlt sggasvvcfl nnfypkdinv kwkidgserq ngvlnswtdq dskdstysms 181 stltltkdey erhnsytcea thktstspiv ksfnrnec (13) Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena pesada 3B6 de longitud completa (región variable 3B6 de cadena pesada y región constante de IgGD (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 134) 1 atggaatggc cttgtatctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgaaggtgt ccactcccag 61 gttcagctgc agcagtctgg ggctgaactg gtgaggcctg ggtcctcagt gaagatttcc 121 tgcaaggctt ctggctatgt attcagtagc tactggatga actgggtgaa gcagaggcct 181 ggacagggtc ttgagtggat tggacagatt tatcctggag atggtgatag taactacaat 241 ggaaacttca agggtaaagc cacactgact gcagacaaat cctccagtac agcctacatg 301 cagctcagca gcctaacatc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcatc ccagctcggg 361 ctacgtgaga actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc 421 aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg gcccctggat ctgctgccca aactaactcc 481 atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc tatttccctg agccagtgac agtgacctgg 541 aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac accttcccag ctgtcctgca gtctgacctc 601 tacactctga gcagctcagt gactgtcccc tccagcacct ggcccagcga gaccgtcacc 661 tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat 721 tgtggttgta agccttgcat atgtacagtc ccagaagtat catctgtctt catcttcccc 781 ccaaagccca aggatgtgct caccattact ctgactccta aggtcacgtg tgttgtggta 841 gacatcagca aggatgatcc cgaggtccag ttcagctggt ttgtagatga tgtggaggtg 901 cacacagctc agacgcaacc ccgggaggag cagttcaaca gcactttccg ctcagtcagt 961 gaacttccca tcatgcacca ggactggctc aatggcaagg agttcaaatg cagggtcaac 1021 agtgcagctt tccctgcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg cagaccgaag 1081 gctccacagg tgtacaccat tccacctccc aaggagcaga tggccaagga taaagtcagt 1141 ctgacctgca tgataacaga cttcttccct gaagacatta ctgtggagtg gcagtggaat 1201 gggcagccag cggagaacta caagaacact cagcccatca tggacacaga tggctcttac 1261 ttcgtctaca gcaagctcaa tgtgcagaag agcaactggg aggcaggaaa tactttcacc 1321 tgctctgtgt tacatgaggg cctgcacaac caccatactg agaagagcct ctcccactct 381 cctggtaaat ga (14) Secuencia de proteína que define la secuencia de cadena pesada 3B6 de longitud completa (región variable 3B6 de cadena pesada y Región constante de IgGD (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 135) 1 qvqlqqsgae Ivrpgssvki sckasgyvfs sywmnwvkqr pgqglewigq iypgdgdsny 61 ngnfkgkatl tadkssstay mqlssltsed savyfcasql glrenyfdyw gqgttltvss 121 akttppsvyp lapgsaaqtn smvtlgclvk gyfpepvtvt wnsgslssgv htfpavlqsd 181 lytlsssvtv psstwpsetv tcnvahpass tkvdkkivpr dcgckpcict vpevssvfif 241 ppkpkdvlti tltpkvtcvv vdiskddpev qfswfvddve vhtaqtqpre eqfnstfrsv 301 selpimhqdw Ingkefkcrv nsaafpapie ktisktkgrp kapqvytipp pkeqmakdkv 361 sltcmitdff peditvewqw ngqpaenykn tqpimdtdgs yfvysklnvq ksnweagntf 421 tcsvlheglh nhhtekslsh spgk (15) Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena liviana 3B6 de longitud completa (región Variable kappa 3B6 y Región constante) (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 136) 1 ATGgacATGa ggacccctgc tcagtttctt ggaatcttgt tgctctggtt tccaggtatc 61 aaatgtgaca tcaagatgac ccagtctcca tcttccatgt atgcatctct aggagagaga 121 gtcacaatca cttgcaaggc gagtcaggac attaaaagct atttaagctg gttccagcag 181 aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgtaa acagattggt agatggggtc 241 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg caagattctt ctctcaccat caccagcctg 301 gagaatgaag atatgggaat ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc gttcacgttc 361 ggagggggga ccaagctgga aataaagcgg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc 421 ccaccatcca gtgagcagtt aacatctgga ggtgcctcag tcgtgtgctt cttgaacaac 481 ttctacccca aagacatcaa tgtcaagtgg aagattgatg gcagtgaacg acaaaatggc 541 gtcctgaaca gttggactga tcaggacagc aaagacagca cctacagcat gagcagcacc 601 ctcacgttga ccaaggacga gtatgaacga cataacagct atacctgtga ggccactcac 661 aagacatcaa cttcacccat tgtcaagagc ttcaacagga atgagtgtta g (16) Secuencia de proteína que define la secuencia de cadena liviana 3B6 de longitud completa (región Variable kappa 3B6 y Región constante) (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 137) 1 dikmtqspss myaslgervt itckasqdik sylswfqqkp gkspktliyr vnrlvdgvps 61 rfsgsgsgqd ssltitslen edmgiyyclq ydefpftfgg gtkleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga svvcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt 181 Itkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec (17) Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena pesada 3D1 1 de longitud completa (3D1 1 Región variable de cadena pesada y Región constante de IqGD (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 138) 1 atggctgtcc cggtgctqtt cctctqcctq qttqcatttc caaqctqtqt cctqtcccag 61 gtacagctga aggagtcagg acctggcctg gtggcgccct cacagagcct gtccatcact 121 tgcactgtct ctgggttttc attaaccagc tatagtttac actgggttcg ccagcctcca 181 ggaaagggtc tggaatggct gggagtaata tgggctggtg gaaacacaaa ttataattcg 241 tctctcatgt ccagactgac catcaggaaa gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa 301 atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc atgtactact gtgccagaga gaggtttgct 361 tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcagcca aaacgacacc cccatctgtc 421 tatccactgg cccctggatc tgctgcccaa actaactcca tggtgaccct gggatgcctg 481 gtcaagggct atttccctga gccagtgaca gtgacctgga actctggatc cctgtccagc 541 ggtgtgcaca ccttcccagc tgtcctgcag tctgacctct acactctgag cagctcagtg 601 actgtcccct ccagcacctg gcccagcgag accgtcacct gcaacgttgc ccacccggcc 661 agcagcacca aggtggacaa gaaaattgtg cccagggatt gtggttgtaa gccttgcata 721 tgtacagtcc cagaagtatc atctgtcttc atcttccccc caaagcccaa ggatgtgctc 781 accattactc tgactcctaa ggtcacgtgt gttgtggtag acatcagcaa ggatgatccc 841 gaggtccagt tcagctggtt tgtagatgat gtggaggtgc acacagctca gacgcaaccc 901 cgggaggagc agttcaacag cactttccgc tcagtcagtg aacttcccat catgcaccag 961 gactggctca atggcaagga gttcaaatgc agggtcaaca gtgcagcttt ccctgccccc 1021 atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggc agaccgaagg ctccacaggt gtacaccatt 1081 ccacctccca aggagcagat ggccaaggat aaagtcagtc tgacctgcat gataacagac 1141 ttcttccctg aagacattac tgtggagtgg cagtggaatg ggcagccagc ggagaactac 201 aagaacactc agcccatcat ggacacagat ggctcttact tcgtctacag caagctcaat 1261 gtgcagaaga gcaactggga ggcaggaaat actttcacct gctctgtgtt acatgagggc 1321 ctgcacaacc accatactga gaagagcctc tcccactctc ctggtaaatg a (18) Secuencia de proteína que define la secuencia de cadena pesada 3D1 1 de longitud completa (3D1 Región variable de cadena pesada y Región constante de IqGD (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 139) 1 qvqlkesgpg Ivapsqslsi tctvsgfslt syslhwvrqp pgkglewlgv iwaggntnyn 61 sslmsrltir kdnsksqvfl kmnslqtddt amyycarerf aywgqgtlvt vsaakttpps 121 vyplapgsaa qtnsmvtlgc Ivkgyfpepv tvtwnsgsls sgvhtfpavl qsdlytlsss 181 vtvpsstwps etvtcnvahp asstkvdkki vprdcgckpc ictvpevssv fifppkpkdv 241 Ititltpkvt cvvvdiskdd pevqfswfvd dvevhtaqtq preeqfnstf rsvselpimh 301 qdwlngkefk crvnsaafpa piektisktk grpkapqvyt ipppkeqmak dkvsltcmit 361 dffpeditve wqwngqpaen ykntqpimdt dgsyfvyskl nvqksnweag ntftcsvlhe 421 glhnhhteks Ishspgk (19) Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena liviana 3D11 de longitud completa (región Variable kappa 3D11 y Región constante) (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 140) 1 atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt caaaatatcc 61 agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatatcc aggggagaag 121 gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 181 tcaggcacct cccccaaaag atggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccct 241 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactccc tcacaatcag tagtatggag 301 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccact cacgttcggt 361 gctgggacca agctggagct gaaacgggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca 421 ccatccagtg agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc 481 taccccaaag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc 541 ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc 601 acgttgacca aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag 661 acatcaactt cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgttag (20) Secuencia de proteína que define la secuencia de cadena liviana 3D1 de longitud completa (región Variable kappa 3D1 1 v Región constante) (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 141 ) 1 qivltqspai msaypgekvt mtcsasssvs ymhwyqqksg tspkrwiydt sklasgvpar 61 fsgsgsgtsy sltissmeae daatyycqqw ssnpltfgag tklelkrada aptvsifpps 121 seqltsggas vvcflnnfyp kdinvkwkid gserqngvln swtdqdskds tysmsstltl 181 tkdeyerhns ytceathkts tspivksfnr nec (21) Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena pesada 1 D3 de longitud completa (región Variable 1 D3 de cadena pesada y Región constante de IgGD (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 142) 1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc cgagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatatatt actgtgtgag acaaggggat 361 ggttattacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt catcgtctcc 421 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 481 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 541 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 601 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 661 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 721 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 781 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 841 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1081 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1 141 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1201 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1261 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1381 cactctcctg gtaaatga (22) Secuencia de proteína que define la secuencia de cadena pesada 1 D3 de longitud completa (región Variable 1 D3 de cadena pesada y Región constante de IqGD (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 143) 1 evqlvesggg Ivqpggslkl scaasgftfs dyymswvrqt pekrlewvay issgggstyy 61 pdsvkgrfti srdnakntly Iqmsslksed taiyycvrqg dgyygdyamd ywgqgtsviv 121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtwnsgslss gvhtfpavlq 181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssvf 241 ifppkpkdvl titltpkvtc vvvdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr 301 svselpimhq dwlngkefkc rvnsaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd 361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn 421 tftcsvlheg Ihnhhteksl shspgk (23) Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena liviana 1 D3 de longitud completa (región variable kappa 1 D3 y Región constante) (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 144) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgtcagatqt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gaacaagtga gaatatttac agtaatttag cgtggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct aatctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca ggatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggaggtatta ctgtcaacat ttttggggga ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaaac tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag (24) Secuencia de proteína que define la secuencia de cadena liviana 1 D3 de longitud completa (región variable kappa 1 D3 y Región constante) (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 145) 1 diqmtqspas Isvsvgetvt itcrtseniy snlawyqqkq gkspqlliya atnladgvps 61 rfsgsgsgtq fslrinslqs edfgryycqh fwgtpytfgg gtkleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga svvcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt 181 Itkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec (25) Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena pesada 1 F3 de longitud completa (Región variable 1 F3 de cadena pesada y Región constante de IgGD (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 146) 1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttqttt taaaaggtgt gaagtgtgag 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagtctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcggcct ctggattcac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatatatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctct agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggggat 361 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 481 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 541 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 601 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 661 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 721 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 781 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 841 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1081 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 141 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1201 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1261 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1381 cactctcctg gtaaatga (26) Secuencia de proteína que define la secuencia de cadena pesada 1 F3 de longitud completa (Región variable 1 F3 de cadena pesada y Región constante de IqGD (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 147) 1 evqlvesggg Ivqsggslkl scaasgftfs nyfmswvrqt pekrlewvay issgggstyy 61 pdsvkgrfti srdnakntly Iqmsslksed tamyycvrqg dgyygdyamd ywgqgtsvtv 121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtwnsgslss gvhtfpavlq 181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssvf 241 ifppkpkdvl titltpkvtc vvvdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr 301 svselpimhq dwlngkefkc rvnsaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd 361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn 421 tftcsvlheg Ihnhhteksl shspgk (27) Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena liviana 1 F3 de longitud completa (región variable kappa 1 F3 y Región constante) (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 148) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgat gcaacacact taccagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gtttggaggg 361 gggaccagac tggaaattaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag (28) Secuencia de proteína gue define la secuencia de cadena liviana 1 F3 de longitud completa (región variable kappa 1 F3 y Región constante) (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 149) 1 diqmtqspas Isvsvgetvt itcraseniy snlawyqqkq gkspqllvyd athlpdgvps 61 rfsgsgsgtq fslkinslqs edfgsyycqh fwgtpytfgg gtrleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga svvcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt 181 Itkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec (29) Secuencia de ácido nucleico gue codifica la secuencia de cadena pesada 3A12 de longitud completa (Región variable 3A12 de cadena pesada y Región constante de IgGD (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 150) 1 atqaactttg gqctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaaatctcc 121 tgtgcagcct ctggatttac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgaaca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggagat 361 ggttactatg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 481 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 541 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 601 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 661 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 721 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 781 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 841 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1081 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1 141 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1201 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1261 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1381 cactctcctg gtaaatga (30) Secuencia de proteína que define la secuencia de cadena pesada 3A12 de longitud completa (Región variable 3A12 de cadena pesada y Región constante de IgGD (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 151 ) 1 evqlvesggg Ivqpggslki scaasgftfs nyfmswvrqt pekrlewvay issgggstyy 61 pdsvkgrfti srdnakntly Iqmnslksed tamyycvrqg dgyygdyamd ywgqgtsvtv 121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtwnsgslss gvhtfpavlq 181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssvf 241 ifppkpkdvl titltpkvtc vvvdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr 301 svselpimhq dwlngkefkc rvnsaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd 361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn 421 tftcsvlheg Ihnhhteksl shspgk (31 ) Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena liviana 3A12 de longitud completa (Región variable kappa 3A12 y Región constante) (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 152) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc gccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac attaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtccatgct gcaacaaagt tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaaac tagaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag (32) Secuencia de proteína que define la secuencia de cadena liviana 3A12 de longitud completa (Región variable kappa 3A12 y Región constante) (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 153) 1 diqmtqspas Isvsvgetvt itcraseniy inlawyqqkq gkspqllvha atkladgvps 61 rfsgsgsgtq yslkinslqs edfgsyycqh fwgtpytfgg gtkleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga svvcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt 181 Itkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec Para conveniencia, la Tabla 2 provee una tabla de concordancia que muestra la correspondencia entre las secuencias de longitud completa de los anticuerpos mencionados en este Ejemplo con los presentados en el Listado de secuencias. TABLA 2 SEC. ID NO. Proteína o Ácido nucleico 122 variable pesada 1A3 + constante de lgG1 - ácido nucleico 123 variable pesada 1A3 + constante de lgG1 - proteína 124 variable liviana 1A3 + constante - ácido nucleico 125 variable liviana 1A3 + constante - proteína 126 variable pesada 2B8 + constante de lgG1 - ácido nucleico 127 variable pesada 2B8 + constante de lgG1 - proteína 128 variable liviana 2B8 + constante - ácido nucleico 129 variable liviana 2B8 + constante - proteína 130 variable pesada 2F8 + constante de lgG1 - ácido nucleico 131 variable pesada 2F8 + constante de lgG1 - proteína 132 variable liviana 2F8 + constante - ácido nucleico SEC. ID NO. Proteína o Ácido nucleico 133 vanable liviana 2F8 + constante - proteína 134 variable pesada 3B6 + constante de lgG1 - ácido nucleico 135 variable pesada 3B6 + constante de lgG1 - proteína 136 variable liviana 3B6 + constante - ácido nucleico 137 variable liviana 3B6 + constante - proteína 138 variable pesada 3D11 + constante de lgG1 - ácido nucleico 139 variable pesada 3D11 + constante de lgG1 - proteína 140 variable liviana 3D11 + constante - ácido nucleico 141 variable liviana 3D11 + constante - proteína 142 variable pesada 1 D3 + constante de lgG1 - ácido nucleico 143 variable pesada 1 D3 + constante de lgG1 - proteína 144 variable liviana 1 D3 + constante - ácido nucleico 145 variable liviana 1 D3 + constante - proteína 146 variable pesada 1 F3 + constante de lgG1 - ácido nucleico 147 variable pesada 1 F3 + constante de lgG1 - proteína 148 variable liviana 1 F3 + constante - ácido nucleico 149 variable liviana 1 F3 + constante - proteína 150 variable pesada 3A12 + constante de lgG1 - ácido nucleico 151 variable pesada 3A12 + constante de lgG1 - proteína 152 variable liviana 3A12 + constante - ácido nucleico 153 variable liviana 3A12 + constante - proteína Ejemplo 3 - Producción de varias proteínas FCHh recombinante Este Ejemplo describe la clonación y la expresión de una cantidad de proteínas recombinantes utilizadas para caracterizar los anticuerpos creados en el Ejemplo 1 y en el Ejemplo 14. En particular, este Ejemplo describe la clonación y la expresión de la proteína de FCHh recombinante, una proteína de FCHh recombinante que contiene una sustitución de glicina en glutamato en la posición 555 (G555E), una proteína de FCHh recombinante que contiene una sustitución de cisterna en arginina en la posición 561 (C561 R), una proteína de FCH quimérica de ratón-humano-ratón (rhr) recombinante que contiene la secuencia de FCH V495-L585 humana dispuesta dentro de la secuencia de FCH de ratón, una proteína de FCH quimérica rhr recombinante que contiene la secuencia de FCH I499-R566 humada dispuesta dentro de la secuencia de FCH de ratón, y una proteína de FCH quimérica de rhr recombinante que contiene una secuencia de FCH W507-L585 humana dispuesta dentro de la secuencia de FCH de ratón. Las siguientes construcciones de expresión se generaron utilizando técnicas moleculares estándar y las secuencias de ADNc resultantes se confirmaron por el secuenciamiento de ADN: a, FCHh-Fc En una cebadora vuelta de PCR, dos fragmentos de PCR solapados se generaron introduciendo un sitio Not I y que codifica una marca 6xHis entre FCHh y hlgFc. Los fragmentos de PCR solapados fueron útiles como molde en una segunda vuelta para amplificar el FCHh-his-lgFc. El fragmento resultante se digirió por Nhel y BamHI y se clonó en pADNc5/FRT (Invitrogen, #35-3014). Luego, el FCHh se amplificó a partir del clon de Invitrogen ID: IOH29794 (ADNc de FCH humano). Se encontró que la secuencia corresponde a la secuencia depositada en el NCBI bajo el número de depósito NM_000601 ,4. (1) Cebador de 5'FCHh Nhel ACTGGCTAGCATGTGGGTGACCAAACTCCT (SEC ID NO. 102) (2) Cebador de Marca 3' FCHh Notl His GTGATGGTGATGGTGATGGCGGCCGCATGACTGTGGTACCTTATATG (SEC ID NO. 103) (3) Cebador de 5' HisIqFc ACTGGCGGCCGCCATCACCATCACCATCAC (SEC ID NO. 104) (4) Cebador de 3' IqFc BamHI ACTGGGATCCTCACTATTTACCCGGGGACAG (SEC ID NO. 105) b, FCHh-Fc G555E y FCHh-Fc C561 R Los mutantes de FCHh-Fc,G555E y C561 R se generaron por mutagénesis dirigida al sitio utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange II XL (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. (1) Cebador Sentido de FCHh-Fc (G555E) CATGATGTCCACGAAAGAGGAGATGAG (SEC ID NO. 106) (2) Cebador Anti-sentido de FCHh-Fc (G555E) CTCATCTCCTCTTTCGTGGACATCATG (SEC ID NO. 107) (3) Cebador Sentido de FCHh-Fc (C561 R) GGAAGAGGAGATGAGAAACGCAAACAGGTTCTCAATG (SEC ID NO. 108) (4) Cebador Anti-sentido de FCHh-Fc (C561 R) CATTGAGAACCTGTTTGCGTTTCTCATCTCCTCTTCC (SEC ID NO. 109) c. Fe quimera de ratón-humano-ratón La construcción de IgFc quimera ratón-human — ratón contiene el FCHh de cadena alfa de FCHr, aminoácidos de la cadena beta Val 495-Leu 585 de FCH humano, y la cadena beta del terminal C de FCHr seguido de 6xHis tag e IgG-Fc.

El ADNc del FCH humano que codifica los aminoácidos V495-L585 se amplificó a partir del clon Invitrogen ID: IOH29794 (ADNc de FCH humano). La secuencia corresponde a la secuencia depositada en el NCBI bajo el número de depósito NM_000601 ,4. Las secuencias de FCH de ratón se amplificaron por RT-PCR a partir del ARN total de hígado de ratón (Clontech, # 636603) utilizando el kit Super Script One Step RT-PCR de Invitrogen (#10928-034) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La secuencia de ADNc del FCHr corresponde a la secuencia depositada en el NCBI bajo el número de depósito D10213.1 . Tres fragmentos, denominados Fragmentos 1 , 2, y 3, se generaron utilizando los cebadores de PCR solapados y se aparearon en vueltas consecutivas de amplificación de PCR. El producto final se separó con Nhel y Notl y se clonó en pADNc5/FRT IgGFc. (1 ) Cebadores del Fragmento 1 para 5'Nhel de cadena alfa de FCHr 5'ATCGGCTAGCATGATGTGGGGGACCAAAC (SEC ID NO. 1 10) 3' GAATCCCATTTACAACCCGCAGTTGTTTTGTTTTGG (SEC ID NO. 1 1 1 ) {2} Cebadores del Fragmento 2 para aa V495-L585 de cadena beta del FCHh 5' CCAAAACAAAACAACTGCGGGTTGTAAATGGGATTC (SEC ID NO. 1 12) 3' CAGGATTGCAGGTCGAGCAAGCTTCATTAAAACCAGATCT (SEC ID NO. 1 13) (3) Cebador del Fragmento 3 para 3'Notl del terminal C de cadena beta del FCHr 5' AGATCTGGTTTTAATGAAGCTTGCTCGACCTGCAATCCTG (SEC ID NO. 114) 3' GTAATTTTGACATACAAGTTGTGCGGCCGCCATCACCATCACCATCAC (SEC ID NO. 115) g\ Construcción de FCHh y quimera rhr Los vectores que codifican el FCHh y la quimera rhr (V495-L585), FCHh de pADNc5/FRT y quimera pADNc5/FRT-rhr (V495-L585), sin la marca Fe -tag se generaron por mutagénesis de sitio dirigida. Se introdujo un codón de detención 3' de la marca 6xHis utilizando el kit QuikChange II XL de mutagénesis de sitio dirigida (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El cebador de mutagénesis incluía el cebador 1 : CATCACCATCACCATCACTAAGCGGGTCTGGTGCCACG (SEC ID NO. 116), y el Cebador 2: CGTGGCACCAGACCCGCTTAGTGATGGTGATGGTGATG (SEC ID NO. 117). Además, se crearon dos quimeras rhr a partir de la construcción pADNc5/FRT-rhr (V495-L585) por mutagénesis de sitio dirigida utilizando el kit QuikChange II XL mutagénesis de sitio dirigida (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una construcción rhr contenía la región de I499-R556 del FCHh dispuesta entre las secuencias murinas. La otra construcción rhr contenía la región de W507-L585 del FCHh dispuesta entre las secuencias murinas. Para la quimera rhr (I499-R556), se realizaron las siguientes mutaciones de punto en orden en el molde de la construcción (V495-L585) de la quimera pADNc5/FRT-rhr: D558E, C561 R, V564I, V567I y M583L, utilizando las oligosecuencias nucleotídicas apropiadas. Para la quimera rhr (W507-L585), se introdujeron las siguientes mutaciones de punto en un paso en el molde de la construcción quimera pADNc5/FRT-quimera rhr (V495-L585): Q502R, N504T y I505V, utilizando las oligosecuencias nucleotídicas apropiadas. La secuencia nucleotídica resultante de la proteína FCHh-Fc se establece como SEC ID NO. 118, que incluye la secuencia señal (nucleótidos 1-93) y el prodominio (nucleótidos 94-162). La secuencia de aminoácidos de la proteína FCHh-Fc se establece como SEC ID NO. 119. La secuencia nucleotídica resultante que codifica la proteína quimérica rhr (V495-L585)-Fc se establece en la SEC ID NO. 120, que incluye la secuencia señal (nucleótidos 1-96) y el prodominio (nucleótidos 97-165). La secuencia de aminoácidos de la proteína quimérica rhr (V495-L585)-Fc se establece en la SEC ID NO. 121. La secuencia nucleotídica resultante que codifica, y la secuencia de proteína que define, la construcción rhr (V495-L585) se establecen en las SECs ID NOS. 211 y 212, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico establecida en la SEC ID NO. 211 incluye la secuencia señal (nucleótidos 1-96) y el prodominio (nucleótidos 97-165), y la secuencia de proteína establecida en la SEC ID NO. 212 incluye la secuencia de proteína activa (sin la secuencia señal o el prodominio). La secuencia nucleotídica resultante que codifica, y la secuencia de proteína que define, la construcción rhr (I499-R556) se establecen en las SECs ID NOS. 213 y 214, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico establecida en la SEC ID NO. 213 incluye la secuencia señal (nucleótidos 1-96) y el prodominio (nucleótidos 97-165), y la secuencia de proteína establecida en la SEC ID NO. 214 incluye la secuencia de proteína activa (sin la secuencia señal o el prodominio). La secuencia nucleotídica resultante que codifica, y la secuencia de proteína que define, la construcción rhr (W507-L585) se establecen en las SECs ID NOS. 215 y 216, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico establecida en la SEC ID NO. 215 incluye la secuencia señal (nucleótidos 1-96) y el prodominio (nucleótidos 97-165), y la secuencia de proteína establecida en la SEC ID NO. 216 incluye la secuencia de proteína activa (sin la secuencia señal o el prodominio). e. Expresión de la proteína (1) Cultivo celular Las células CHO Flpln (Invitrogen, Catálogo No. R758-07)) se desarrollaron en el medio F12K (ATCC, Catálogo No. 30-2004), 10% de FCS (Invitrogen, Catálogo No. 10438026), 1% de Penicilina (10000 unidades/ml) /Estreptomicina (10,000 µg/ml) (Invitrogen, Catálogo No. 15140-122) a 37°C, 5% CO2, 100 µg/ml de Zeocin (Invitrogen, Catálogo No. R250-01). (2) Generación de líneas celulares CHO Flpln estables Las células hospedero CHO Flpln se transfectaron con una relación 9:1 del ADN del plásmido de expresión pOG44:pADNc5/FRT utilizando lipofectamina 2000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Catálogo No. 11668-027). Como controles, las células se transfectaron con el vector pADNc5/FRT vacío/ plásmido pOG44 y pOG44 (Invitrogen, Catálogo No. 35-3018) solo. Veinte horas después de la transfección, las células se separaron, y después de cuarenta y ocho horas se agregaron 0,5 mg/ml de higromicina B (Sigma, Catálogo No. H0654-SPEC) a las células. La selección policlonal de células estables se realizó en F12K, 10% de FCS, 1 % de Penicilina/Estreptomicina, 0,5 mg/ml de Higromicina B. (3) Expresión de Proteína en líneas celulares CHO Flpln estables Aproximadamente 2x106 se sembraron en placas de 15 cm y se desarrollaron en 1 :1 de F12K (ATCC, Catálogo No. 30-2004)/ glucosa alta DMEM (Invitrogen, Catálogo No. 11995065), 5% de IgG FCS ultra bajo (Invitrogen, #16250-78) a 37°C, 5% de C02 durante 5 a 6 días. Los sobrenadantes se cosecharon y las proteínas resultantes se analizaron por ELISA y por resonancia de plasmón superficial.

Ejemplo 4 - Características de unión de los anticuerpos monoclonales anti-FCHh Los anticuerpos monoclonales producidos en el Ejemplo 1 se caracterizaron por su capacidad de unirse al FCHh, y a algunas de las proteínas de FCH recombinantes producidas en el Ejemplo 3. Los anticuerpos se analizaron mediante resonancia de plasmón superficial utilizando un instrumento BIAcore T100 para determinar su capacidad de unirse al FCH y a algunas de las proteínas de fusión descriptas en el Ejemplo 3. Cada anticuerpo se inmovilizó sobre un chip sensor CM5 de dextrano carboximetilado (BIAcore, Catálogo No. BR-1006-68) por acoplamiento amina (BIAcore, Catálogo No. BR-1000-50) utilizando un protocolo de acoplamiento estándar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizaron análisis a 25°C utilizando PBS (GIBCO, Catálogo No. 14040- 133) que contiene 0,05% de tensoactivo P20 (BIAcore, Catálogo No. R- 000-54), 2 mg/ml de BSA (EMD, Catálogo No. 2930) y 10 mg/ml de sal de CM-dextrano sódico t (Fluka, Catálogo No. 86524) como buffer de corrida. El sobrenadante que contiene diferentes proteínas de fusión al FCH o el sobrenadante de las células transfectadas con el vector vacío se inyectaron en cada anticuerpo a una velocidad de flujo de 30 µ?/min durante 3 minutos. La unión resultante se determinó como unidades de resonancia (UR) sobre la línea base de 30 segundos después del final de la inyección. La unión se comparó con el FCH humano (R&D Systems, Catálogo No. 294-HGN-025) diluido en el buffer de corrida. La unión no específica se monitoreó comparando la unión a una superficie control donde el IgG de ratón (Rockiand, Catálogo No. 010-0102) se inmovilizó utilizando el mismo procedimiento de acoplamiento de amina. Los resultados se resumen en la Tabla 3.

TABLA 3 Los resultados en la Tabla 3 muestran que cada uno de los anticuerpos se une al FCHr y al FCH humano purificado. Más aún, todos los anticuerpos se unen al FCHh que contiene las mutaciones de punto G555E y C561 R. En general, todos los anticuerpos excepto el 1 F3 y el 2F8 no se unieron al FCH murino demostrando que los anticuerpos 1A3, 1 D3, 2B8, 3A12, 3B6, y 3D11 se unen específicamente al FCH humano. Los anticuerpos 1 D3, 1 F3, y 2B8 se unen a la quimera ratón-humano-ratón por lo que los anticuerpos restantes no lo hicieron. Los resultados sugieren que los anticuerpos 1 D3 y 2B8 al menos en parte se unen a los residuos 495-585 de FCH humano. Los anticuerpos 1A3, 3A12, 3B6, y 3D11 parece que se unen a porciones del FCHh humano diferentes de los 495-585. En la actualidad, no se sabe por qué el 2F8 no se une a la quimera rhr en la forma que parece que se une tanto al FCHh como al FCHr.

Ejemplo 5 - Capacidad de los anticuerpos monoclonales anti-FCHh de unirse al FCH reducido y no reducido En este Ejemplo, los anticuerpos monoclonales anti-FCHh producidos en el Ejemplo 1 se analizaron por su capacidad de unirse al FCH reducido y no reducido. La reactividad de los sueros anti-FCH con el FCHh recombinante se determinó por inmunotransferencia (immunoblotting). Ocho pg de proteína de FCHh recombinante en buffer de corrida NuPAGE MOPS SDS (Invitrogen) con o sin buffer de reducción de la muestra NuPAGE (Invitrogen) se fraccionó en 4-12% de un gel de pocilio Bis-Tris 1 ,0mmX2D (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las proteínas fraccionadas luego se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa utilizando procedimientos estándar. Las membranas de nitrocelulosa se bloquearon con 5% de solución de leche en polvo sin grasa en solución salina de buffer Tris con 0.1% de Tween-20® (TBST), y luego se montó sobre un aparato Mini Protean II Multi-Screen (BioRad) para un bloqueo posterior. Las membranas resultantes se sondearon con los anticuerpos purificados en un aparato Multi-Screen. Los anticuerpos purificados se diluyeron hasta 5pg/ml en buffer de bloqueo. La membrana de nitrocelulosas luego se removió del aparato, y se incubó con anticuerpos de IgG anti-ratón marcados con peroxidasa de rábano picante. Los resultados se resumen en la Tabla 4, donde los números reflejan el grado de unión - representando el mínimo (poca o ninguna unión) y 3+ representa la unión máxima.

TABLA 4 Los datos en la Tabla 4 muestran que todos los anticuerpos se unen al rFCHh no reducido. Por el contrario, los anticuerpos monoclonales 1A3, 1 D3, 1 F3, 2F8, 3B6 se unieron al rFCHh reducido pero los anticuerpos 2B8, 3A12, y 3D1 1 no se unieron al rFCHh reducido.

Ejemplo 6 - Afinidades de unión Las afinidades de unión y la cinética de interacción de cada uno de los anticuerpos producidos en el Ejemplo 1 contra el FCHh se midieron por resonancia de plasmón superficial.

Las inmunoglobulinas anti-ratón de conejo (BIAcore, Catálogo No. BR-1005-14) se inmovilizaron sobre chips sensores CM5 de dextrano carboximetilado (BIAcore, Catálogo No. BR-1006-68) por acoplamiento de amina (BIAcore, Catálogo No. BR-1000-50) utilizando un protocolo de acoplamiento estándar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los análisis se realizaron a 25°C utilizando PBS (GIBCO, Catálogo No. 14040-133) que contiene 0,05% de tensioactivo P20 (BIAcore, Catálogo No. BR-1000-54), 2 mg/ml de BSA (EMD, Catálogo No. 2930), y 10 mg/ml de sal de CM-dextrano de sodio (Fluka, Catálogo No. 86524) como buffer de corrida. Los anticuerpos se capturaron en una célula de flujo individual a una velocidad de flujo de 10 µ?/min. El tiempo de inyección fue variable para cada anticuerpo para dar aproximadamente 20 UR de anticuerpo capturado para cada ciclo. El buffer o FCH (R&D Systems, Catálogo No. 294-HGN-025) diluido buffer de corrida se inyectó en forma consecutiva sobre una superficie de referencia (ningún anticuerpo capturado) y la superficie activa (anticuerpo a ser ensayado) durante 2 minutos a 60 µ?/min. La fase de disociación se monitoreó durante 15 o 90 minutos, dependiendo de la concentración. La superficie luego se regeneró con 10mM de Glicina-HCI, pH 1 ,7 (BIAcore, Catálogo No. BR-1003-54) inyectado durante 3 minutos a una velocidad de flujo de 60 µ?/min antes de iniciarse otro ciclo. Las concentraciones de FCH ensayadas fueron de 0,46 nM hasta 7,5 nM.

Los parámetros cinéticos se determinaron utilizando la función cinética del software BIAevalutation con sustracción de referencia. Los parámetros cinéticos para cada anticuerpo, ka (constante de velocidad de asociación), kd (constante de velocidad de disociación) y KD (constante de disociación de equilibrio) se resumen en la Tabla 5.

TABLA 5 Los datos en la Tabla 5 muestran que los anticuerpos se unen al FCHh con una KD de aproximadamente 100 pM o inferior, aproximadamente 50 pM o inferior, o 20 pM o inferior.

Ejemplo 7 - Actividad de neutralización de los anticuerpos anti-FCHh En este Ejemplo, los anticuerpos producidos en el Ejemplo 1 se caracterizaron por su capacidad de (a) inhibir la unión del FCHh a c-Met, e (b) inhibir la incorporación de BrdU estimulado al FCH en células 4MBr-5. a. Ensayo de Inhibición de Unión al FCH-Met (Ensayo de Neutralización) Los anticuerpos se ensayaron por ELISA para su capacidad de inhibir la unión del FCHh al c-Met. Específicamente, las placas de 96 ppcillos Wallac de ensayo Wallac DELFIA (Wallac Inc., Catálogo No. AAAND-0001 ) se recubrieron con 100 µ? de 6,25 Mg/ml de FCH (R&D Systems, Catálogo No. 294-HGN-025) en buffer de recubrimiento de carbonato (15 mM de Na2C03 y 34 mM de NaHC03, pH 9,0) durante 16 horas a 4°C. Las placas luego se bloquearon con 200 µ? de 5% de leche en polvo no-grasa en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos se prepararon en una placa separada agregando concentraciones en aumento de los anticuerpos bajo investigación (0,033-667nM, dilución en serie 3 veces) hasta c-Met 2nM (R&D Systems, Catálogo No. 358-MT/CF) en 5% de leche en polvo en PBS. Se transfirieron 100 µ? de muestra por pocilio a la placa de ensayo y se incubaron durante la noche a 4°C. Las placas de ensayo luego se lavaron 3 veces con PBS-0.1 % de Tween 20, y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con 100 µ?/pocillo de 2 pg/ml de anticuerpo c-Met antihumano biotinilado (R&D Systems, Catálogo No. BAF358) preparado en 5% de leche en polvo no grasa en PBS. Las placas resultantes luego se lavaron tres veces con PBS-0.1 % de Tween 20, y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con estreptavidina Eu-marcada (Wallac, Catálogo No. 1244-360) diluida 1 :1000 en buffer de ensayo DELFIA (Wallac, Catálogo No. 4002-0010). Las placas resultantes se lavaron 3 veces con Solución de lavado DELFIA (Wallac, Catálogo No. 4010-0010) y se incubaron con 100 µ?/pocillo Solución de mejoramiento DELFIA (Wallac #4001-0010) durante 15 minutos a temperatura ambiente con balanceo. Las placas se leyeron en un instrumento VictorV (Perkin Elmer) utilizando el método Europium. Los valores de IC5o se calcularon y se resumen en la Tabla 6. TABLA 6 Anticuerpo IC50 (nM) SD 1A3 5,65 0,91 1 D3 4,43 2,27 1 F3 6,57 0,28 2B8 5,57 1 ,19 2F8 5,36 0,88 3A12 5,26 2,11 3B6 - - 3D11 5,66 2,75 Los resultados muestran que todos los anticuerpos (es decir, 1 D3, 1A3, 2B8, 3A12, 1 F3, 3D11 , y 2F8) que no sean 3B6 neutralizan en forma eficiente la unión del FCH a c-Met. b. Neutralización de la incorporación de BrdU estimulado al FCH en células 4MBr-5 Se distribuyeron diez µ? de 12,5 nM de FCHh en pocilios individuales de una placa microtítulo de cultivo tisular de 96 pocilios (Costar Catálogo No. 3903). Se agregaron diez µ?_ de anticuerpos diluidos en serie a concentraciones de 6667, 2222, 740, 247, 82, 27, 9.1 , 3,0, 1 ,0, 0,33 nM a cada pocilio. La mezcla de anticuerpo y FCH luego se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las células epiteliales bronquiales de mono 4MBr-5 (ATCC, CCL208) cultivadas en F-12K (ATCC, 30-2004), 15% de FBS (Gibco 10438-026), 30 ng/ml de EGF (Sigma E9644), 1 % de penicilina/estreptomicina (PS, Gibco Catálogo No. 15140-122) se disociaron con tripsina (Gibco Catálogo No. 25200-056), se resuspendieron en el medio de ensayo (F-12K, 2,5% de FBS, 1% de PS) a 75,000 células/ml, y 80 pL de la suspensión celular se distribuyó en la mezcla de anticuerpo y FCH. Las células resultantes se incubaron a 37°C, 5% CO2. Cuarenta y ocho horas más tarde, se agregaron 10 µ? de BrdU 100 µ? (Roche Catálogo No. 1669915). Setenta y dos horas más tarde, se eliminó el medio, las placas se secaron con un secador de pelo y se procesaron con el ELISA BrdU de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche Catálogo No. 1669915). La señal luminiscente se cuantificó por un lector de placa Synergy HT (Bio-Tek). Los datos se ajustaron a una respuesta de dosis sigmoidal con declive variable con la ecuación y = parte inferior + (parte superior-parte ¡nferior)/(1+10A(log(EC50-x)*declive de la colina)) en GraphPad Prism (Software GraphPad). Cada experimento se repitió al menos 3 veces en duplicados, y valores de EC5o promedio se presentan en la Tabla 7.

TABLA 7 Los resultados en la Tabla 7 muestran que todos los anticuerpos, 1A3, 1 D3, 1 F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6, y 3D11 inhiben la proliferación inducida por FCH en células 4MBr-5.

Ejemplo 8 - Actividad anti-dispersión de los anticuerpos anti-FCHh Este Ejemplo describe una caracterización de los anticuerpos producidos en el Ejemplo 1 por su capacidad de inhibir la actividad de dispersión inducida por el FCH. El FCH induce "dispersión" (motilidad) de agrupamientos en células MDCK (ATCC, Manassas, VA, Catálogo No. CCL-34). Las células MDCK se sembraron placas de cultivo tisular de 96 pocilios Costar (Corning Incorporated, Corning, NY, Catálogo No. 3595) a una densidad de 4x103 células por pocilio en 80 µ?_ de MEM (ATCC, Manassas, VA, Catálogo No. 30-2003) que contiene 10% de suero bovino fetal (Invitrogen Catálogo No. 10438026), y 1 % de penicilina-estreptomicina (Invitrogen Catálogo No. 15140122). Cada uno de los anticuerpos para ser investigados se diluyó hasta 6,667 nM en MEM que contiene 10% de suero bovino fetal y 1 % de penicilina-estreptomicina. Cada una de las diferentes diluciones de anticuerpo, como así también MEM que contiene 10% de suero fetal bovino y 1 % de penicilina-estreptomicina sin anticuerpo, se combinó en forma separada con un volumen igual de MEM que contiene 10% de suero bovino fetal y 1 % de penicilina-estreptomicina, y 100 ng/ml de FCH (R&D Systems Catálogo No. 294-HGN-025). Las diluciones de anticuerpo/FCH se incubaron durante 30 minutos a 25°C. Veinte µ? de cada dilución de anticuerpo/FCH se agregó por separado a pocilios individuales, dando una concentración de anticuerpo final de 666,7 nM, y una concentración de FCH final de 10 ng/ml. Las células MDCK luego se incubaron durante 24 horas a 37°C con 5% de C02. Después de 24 horas de incubación, las células MDCK se lavaron cuidadosamente una vez con 100 µ? por pocilio de PBS helado (Invitrogen Catálogo No. 14190144), y se ajustó con 100 µ? por pocilio de metanol helado mientras se agitaba durante 10 minutos a 25°C. Las placas luego se lavaron cuidadosamente una vez con agua destilada. Un volumen de 100 µ? de solución violeta cristalina, que consiste de 0,5% de violeta cristalino (Sigma, St. Louis, MO, Catálogo No. C3886) y 50% de etanol en agua destilada, se agregó a cada pocilio, y las células se incubaron durante 20 minutos a 25°C con balanceo. A continuación de la solución violeta cristalina, las células se lavaron cuidadosamente tres veces con agua destilada. Luego, se agregó PBS a cada pocilio para evitar que se sequen las muestras. Las células se procesaron por imagen utilizando el microscopio Leica DMIRB (Leica Microsystems GmbH, Wetzler, Alemania), cámara DC500 (Leica Microsystems GmbH, Wetzler, Alemania), y software MagnaFire 2.1C (Optronics, Goleta, CA), y las muestras se estimaron por nivel de distribución. Los resultados se resumen en la Tabla 8.

TABLA 8 - Sin inhibición +++ Muy fuerte, inhibición casi completa. ++ Inhibición fuerte + Inhibición detectable Los resultados en la Tabla 8 muestran que el anticuerpo 2B8 inhibió la distribución inducida por FCH más que los otros anticuerpos. Los anticuerpos 1 D3 y 3B6 mostraron un nivel intermedio de inhibición; el anticuerpo 1A3 mostró un nivel de inhibición de bajo a intermedio: los anticuerpos 1 F3 y 2F8 mostraron un nivel de inhibición bajo; y los anticuerpos 3A12 y 3D11 mostraron poca o ninguna inhibición detectable.

Ejemplo 9 - Inhibición de la fosforilación de c-Met estimulada por FCH Este ejemplo describe una caracterización de los anticuerpos producidos en el Ejemplo 1 por su capacidad para inhibir la fosforilación de c-Met estimulada por FCH en células PC-3. El FCH induce la fosforilación de Met en células PC-3 (ATCC No. CRL-1435). Las células PC-3 se sembraron en pocilios individuales de placas de cultivo de tejido Costar de 96 pocilios (Corning Catálogo No. 3595) a una densidad de 4,5x104 células por pocilio en 100 µ? de F-12K (ATCC, Manassas, VA, Catálogo No. 30-2004) que contiene 10% de suero bovino fetal (Invitrogen Catálogo No. 10438026) y 1 % de penicilina-estreptomicina (Invitrogen Catálogo No. 15140122). Después de 24 horas a 37°C con 5% de C02, se eliminó el medio, y las células se enjuagaron una vez con F-12K libre de suero que contiene 1 % de penicilina-estreptomicina. La células luego se incubaron durante 24 horas en 100 pL de F-12K libre de suero que contiene 1 % de penicilina-estreptomicina.

Las siguientes 10 diluciones diferentes de cada uno de los anticuerpos que se investigan se prepararon en F-12K libre de suero que contiene 1 % de penicilina-estreptomicina: 6667 nM, 2222 nM, 741 nM, 247 nM, 82,3 nM, 27,4 nM, 9.1 nM, 3,0 nM, 1 ,0 nM, y 0,3 nM. Cada dilución de anticuerpo, y, F-12K libre de suero que contiene 1% de penicilina-estreptomicina sin anticuerpo, se combinaron por separado con un volumen igual de F-12K libre de suero que contiene 1% de penicilina-estreptomicina y 500 ng/ml de FCH (R&D Systems Catálogo No. 294-HGN-025). Estas diluciones de anticuerpo/FCH se incubaron durante 30 minutos a 25°C. Esto dio por resultado una concentración final de FCH 1 ,25 nM. Las células PC-3 luego se enjuagaron una vez con F-12K libre de suero que contiene 1% de penicilina-estreptomicina. A continuación, se agregaron 70 µ? de F-12K libre de suero que contiene 1% de penicilina-estreptomicina a las células, seguido de 10 µ? de Na3V04 10 mM (Sigma Catálogo No. S6508) en F-12K libre de suero que contiene 1% de penicilina-estreptomicina. Las células luego se incubaron durante 60 minutos a 37°C con 5% de C02. A continuación de la incubación, se agregaron 20 µ? de cada dilución de anticuerpo/FCH por separado a los pocilios separados, dando una concentración final de FCH de 50 ng/ml, y las siguientes concentraciones finales de cada anticuerpo: 666,7 nM, 222,2 nM, 74.1 nM, 24,7 nM, 8,23 nM, 2,74 nM, 0,91 nM, 0,30 nM, 0.10 nM, 0,03 nM. Las células luego se incubaron durante 10 minutos a 37°C con 5% de C02, después de lo cual la mezcla medio/anticuerpo/FCH se removió, las placas se colocaron en hielo. Las células luego se enjuagaron una vez con 100 µ? por pocilio de PBS helado (Invitrogen Catálogo No. 14190144) que contiene Na3V04 1 mM. Las células luego se incubaron durante 30 minutos a 4°C en 100 µ? por pocilio de buffer de lisis helado que consiste de 1 % de OmniPur Tritón X-100 (MERCK KGaA, Darmstadt, Alemania, Catálogo No. 9410), Tris-HCI 50 mM, pH 8,0, NaCI 100 mM, Na3V04 0,3 mM, 1x cóctel de inhibidor de proteasa (Sigma Catálogo No. P8340), y 1x de cóctel de inhibidor de fosfatasa 2 (Sigma Catálogo No. 5726).

El anticuerpo humano-R anti-FCH (c-met) biotinilado (R&D Systems Catálogo No. BAF358) se diluyo hasta una concentración de 2 pg/ml en buffer de ensayo DELFIA (PerkinElmer, Turku, Finlandia, Catálogo No. 4002-0010) que contiene 1 % de albúmina de suero bovino (Sigma Catálogo No. A2153), y 50 µ? de esta dilución se agregó por pocilio de placas de microtitulación de estrepatividina amarilla (PerkinElmer Catálogo No. AAAND-0005). Las placas luego se incubaron con anticuerpo durante 30 minutos a 25°C con balanceo. A continuación de la incubación, las placas se lavaron con solución de lavado DELFIA (PerkinElmer Catálogo No. 4010-0010), y se agregaron 80 µ? de cada uno de los diferentes lisados de célula PC-3 a los pocilios individuales de las placas de microtitulación de estreptavidina lavadas. Las placas de microtitulación de estreptavidina que contiene lisados de célula PC-3 se incubaron durante 60 minutos a 25°C con agitación, y luego se lavaron con solución de lavado DELFIA. Se agregaron 100 µ? de 600 ng/ml de anticuerpo Eu-N1 P-Tyr-100 DELFIA (PerkinElmer Catálogo No. AD0159) diluido en buffer de ensayo DELFIA que contiene 1 % de albúmina de suero bovino a cada pocilio de las placas de microtilulación de estreptavidina amarilla previamente incubadas con lisados de célula PC-3. Las placas se incubaron durante 60 minutos a 25°C, con balanceo. Las placas se lavaron una última vez con solución de lavado DELFIA. Luego se agregaron 200 µ? de solución de mejoramiento DELFIA (PerkinElmer Catálogo No. 4001 -0010) a cada pocilio de las placas de microtitulación de estreptavidina lavadas, y las placas se incubaron en la oscuridad durante 5 minutos a 25°C, con agitación. La señal luego se midió utilizando el protocolo Europium en el lector Victor3V (PerkinElmer). Los valores de EC5o se calcularon utilizando Prism 4 para Windows (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) y la ecuación de respuesta de dosis sigmoidal. Los resultados resumidos como EC50s en nM se tabulan en la Tabla 9.

TABLA 9 Los datos en la Tabla 9 muestran que los ocho anticuerpos son potentes inhibidores de la fosforilación de c-Met inducida por FCH en células PC-3.

Ejemplo 10 - Inhibición del tumor en modelo xenoinjerto U87MG La capacidad de los anticuerpos monoclonales murinos de la invención de inhibir el desarrollo del tumor se ensayó en un modelo xenoinjerto U87MG. Las células U87MG (ATCC) se expandieron en el cultivo a 37°C en una atmósfera que contiene 5% de CO2 y 95% de aire, utilizando un medio que comprende medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 10% de suero bovino fetal, 100 unidades/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina. Las células se cultivaron y se mantuvieron separando las células de la pared de la bandeja de cultivo utilizando tripsina-EDTA.

Las células casi confluentes se recolectaron por tripsinización y luego 5x106 células en 50% de Matrigel (BD Biosciences; catálogo no. 356237) se inyectaron por vía subcutánea en el área dorsal superior entre las costillas del hombro de ratones ICR SCID hembras de 7 semanas de vida (Taconic Labs). Los diámetros largos (L) y los cortos (W) de los tumores se midieron con un calibre. El volumen del tumor (vol.) se calculó como: Volumen (mm3) = L * W2 / 2. Cuando los tumores se desarrollaron hasta aproximadamente 200 mm3, los ratones que portaban el tumor se randomizaron en 5 grupos de 10 ratones cada uno. Un grupo recibió PBS. Cada uno de los otros 4 grupos recibió uno del anticuerpo 1A3, 1 D3, 1 F3 o 2B8. Todos los anticuerpos se dosificaron a 1 mg/kg por peso corporal, dos veces por semana, mediante inyecciones intra-peritoneales de 5 dosis. Los volúmenes de los tumores y los pesos corporales de los ratones se registraron dos veces por semana. La inhibición del desarrollo del tumor se analizó utilizando el ensayo T de Student. Los resultados se resumen en la Figura 6 y la Tabla 10.

Tabla 10 Se obtuvo regresión parcial en el grupo 2B8 tratado (Figura 6). La inhibición del crecimiento estadísticamente significativo se observó en los grupos tratados 1A3 y 1 F3 (Tabla 10). Hubo una inhibición del crecimiento del tumor del 51% para 1 D3 con un valor p de 0,075. No se observó pérdida de peso corporal significativa.

Ejemplo 11 - Inhibición del tumor en modelo de xenoinjerto U118 La capacidad de los anticuerpos 1A3, 1 D3, 1 F3 y 2B8 de inhibir el desarrollo del tumor se ensayó en el modelo de xenoinjerto U 18. Las células U118 (ATCC) se expandieron como se describió en el Ejemplo 10 (anterior) con respecto a las células U87MG. Los tumores subcutáneos se establecieron como se describió en el Ejemplo 10 anterior, salvo que los ratones utilizados eran ratones desnudos NCr hembras de 7 semanas de vida (Taconic), y el tratamiento se inició cuando los tumores se desarrollaron hasta aproximadamente 80 mm3. Como en el modelo U87MG, todos los anticuerpos se dosificaron a 1 mg/kg de peso corporal dos veces a la semana mediante inyecciones intra-peritoneales para 4 dosis. Los volúmenes de los tumores y los pesos corporales de los ratones se registraron dos veces por semana. La inhibición del desarrollo del tumor se analizó utilizando el ensayo T de Student. Los resultados se resumen en la Figura 7 y la Tabla 11.

Tabla 11 Porcentaje de inhibición 2B8 vs IgG 75% p=0,007 1A3 vs IgG 57% p=0,01 1 D3 vs IgG 47% p=0.12 1 F3 vs IgG 30% p=0,39 La inhibición del crecimiento del tumor estadísticamente significativo se observó en los grupos tratados 2B8 y 1A3 (Figura 7). Hubo una inhibición del crecimiento del tumor en los grupos 1 F3 y 1 D3 con un valor p inferior a 0,05, lo cual se definió como una significancia estadística en este estudio (Tabla 1 1 ). No se observó pérdida de peso corporal significativa.

Ejemplo 12 - Humanización de los anticuerpos monoclonales murinos Este ejemplo describe la humanización del anticuerpo 2B8 murino, junto con una caracterización de los anticuerpos humanizados resultantes. Las regiones variables livianas y pesadas 2B8 múrinas se "humanizaron" mediante dos métodos. A. Procedimiento de Humanización 1 En el primer método, tres regiones variables de cadena pesada humanizadas y dos regiones variables de cadena liviana kappa humanizadas se diseñaron en base al método de "superhumanización" descripto en Hwang et al. (2005) METHODS 36:35-42; Tan et al. (2002) J. IMMUNOL. 169:1 1 19-1 125; Patente Estadounidense No. 6.881.557. La clase estructural canónica Chothia se determinó para cada CDR 2B8 de ratón basado en la longitud de la CDR y la composición del aminoácido. Las regiones variables de la línea germinal humana que consiste de la misma clase estructural canónica Chothia y la s regiones variables pesadas se identificaron sobre la base de los alelos de referencia de la región variable de la línea germinal humana conocida descripta en el sitio web del Sistema de Información Inmunogenético Internacional (IMGT) (disponibles en la web en imgt.cines.fr y biochem.unizh.ch/anticuerpo/Sequences/index.html). Estas regiones variables de línea germinal humana de la misma clase estructural se compararon con las regiones variables 2B8 murinas calculando la identidad o la similitud porcentual entre los residuos de aminoácidos de la CDR. Esas regiones variables de la línea germinal humana con la identidad y/o similitud más alta con los residuos de la CDR 2B8 de ratón se eligieron para el injerto de CDR. Los residuos marco de las regiones variables de línea germinal humana se preservaron mientras que los residuos de la CDR 2B8 de ratón se utilizaron para reemplazar los residuos de la región variable de la línea germinal humana correspondiente que fueron diferentes entre la CDR 2B8 de ratón y las CDR de la línea germinal humana. La región J humana que era más similar a la región J de ratón 2B8 luego se agregó al terminal carboxilo de la región variable "superhumanizada". Una secuencia señal luego se agregó al terminal amino de las regiones variables "superhumanizadas" y estas secuencias de aminoácidos se convirtieron en secuencias de ácido nucleico. La secuencia de ácido nucleico de la región variable completa se construyó utilizando los métodos de PCR de síntesis génica (Young et al. (2004) NUCL. ACIDS RES. 32:e59) y se clonaron en un vector de expresión de mamífero (basado en pADNc3,2 DEST (Invitrogen)) que contiene las regiones de constante humana de lgG1 (G1 m(17.1) alotipo) o kappa (Km(3) alotipo (alelo 2)) (corriente abajo de las regiones variables) utilizando técnicas de biología molecular estándar. Los cuatro anticuerpos de lgG1 de cadena pesada (2B8 quimérico y 3 cadenas pesadas humanizadas (Hu2B8 Hv1-f.1 , Hu2B8 Hv5-a.1 , Hu2B8 Hv5-51.1) se expresaron en las posibles combinaciones con los 3 anticuerpos de cadena kappa (quimera 2B8 y 2 cadenas livianas humanizadas (Hu2B8 Kv1-39.1 y Hu2B8 Kv3-15.1 ) creando 12 proteínas de anticuerpo diferentes. La unión de los anticuerpos quiméricos, quiméricos/humanizados, y humanizados al FCH humano luego se midió según se describe a continuación y los resultados se resumen en la Figura 8. Cada una de las posibles combinaciones de las regiones variables de la cadena pesada de inmunoglobulina y de la cadena liviana de inmunoglobulina se establece a continuación en la Tabla 12A.

Tabla 12A Región variable de cadena pesada Región variable de cadena liviana 2B8 quimérica (SEC ID NO: 12) 2B8 quimérica (SEC ID NO: 14) 2B8 quimérica (SEC ID NO: 12) Hu2B8 Kv1-39.1 (SEC ID NO: 173) 2B8 quimérica (SEC ID NO: 12) Hu2B8 Kv3-15.1 (SEC ID NO: 179) Hu2B8 Hv1-f.1 (SEC ID NO: 159) 2B8 quimérica (SEC ID NO: 14) Hu2B8 Hv1-f.1 (SEC ID NO: 159) Hu2B8 Kv1-39.1 (SEC ID NO: 173) Hu2B8 Hv1-f.1 (SEC ID NO: 159) Hu2B8 Kv3-15.1 (SEC ID NO: 179) Hu2B8 Hv5-a.1 (SEC ID NO: 165) 2B8 quimérica (SEC ID NO: 14) Hu2B8 Hv5-a.1 (SEC ID NO: 165) Hu2B8 Kv1-39,1 (SEC ID NO: 173) Hu2B8 Hv5-a.1 (SEC ID NO: 165) Hu2B8 Kv3-15.1 (SEC ID NO: 179) Hu2B8 Hv5-51.1 (SEC ID NO: 169) 2B8 quimérica (SEC ID NO: 14) Hu2B8 Hv5-51.1 (SEC ID NO: 169) Hu2B8 Kv1-39.1 (SEC ID NO: 173) Hu2B8 HV5-51.1 (SEC ID NO: 169) Hu2B8 Kv3-15.1 (SEC ID NO: 179) Cada una de las posibles combinaciones de las cadenas pesadas de inmunoglobulina y las cadenas livianas de inmunoglobulina se establecen a continuación en la Tabla 12B.

Tabla 12B Cadena pesada de inmunoglobulina Cadena liviana de inmunoglobulina lgG1 de 2B8 quimérica (SEC ID NO: 155) 2B8 quimérica kappa (Km(3)) (SEC ID NO: 157) lgG1 de 2B8 quimérica (SEC ID NO: 155) Hu2B8 Kv1-39.1 + alotipo constante de kappa (Km(3)) (alelo 2) (SEC ID NO: 177) lgG1 de 2B8 quimérica (SEC ID NO: 155) Hu2B8 Kv3-15.1 + alotipo constante de kappa (Km(3)) (alelo 2) (SEC ID NO: 181) Hu2B8 Hv1-f.1 + constante de lgG1 2B8 quimérica kappa (Km(3)) (G1 M(17.1)) alotipo (SEC ID NO: 163) (SEC ID NO: 157) Hu2B8 Hv1-f.1 + constante de lgG1 Hu2B8 Kv1-39.1 + alotipo constante de (G1 M(17.1)) alotipo (SEC ID NO: 163) kappa (Km(3)) (alelo 2) (SEC ID NO: 177) Hu2B8 Hv1-f.1 + constante de lgG1 Hu2B8 Kv3-15.1 + alotipo constante de (G1 M(17.1)) alotipo (SEC ID NO: 163) kappa (Km(3)) (alelo 2) (SEC ID NO: 181) Hu2B8 Hv5-a.1 + constante de lgG1 2B8 quimérica kappa (Km(3)) (G1 M(17.1)) alotipo (SEC ID NO: 167) (SEC ID NO: 157) Hu2B8 Hv5-a.1 + constante de lgG1 Hu2B8 Kv1-39.1 + alotipo constante de (G1 M(17.1)) alotipo (SEC ID NO: 167) kappa (Km(3)) (alelo 2) (SEC ID NO: 177) Hu2B8 Hv5-a.1 + constante de lgG1 Hu2B8 Kv3-15.1 + alotipo constante de (G1 M(17.1)) alotipo (SEC ID NO: 167) kappa (Km(3)) (alelo 2) (SEC ID NO: 181) Hu2B8 Hv5-51.1 + constante de lgG1 2B8 quimérica kappa (Km(3)) (G1M(17.1)) alotipo (SEC ID NO: 171) (SEC ID NO: 157) Hu2B8 Hv5-51.1 + constante de lgG1 Hu2B8 Kv1-39.1 + alotipo constante de (G1 M(17.1)) alotipo (SEC ID NO: 171) kappa (Km(3)) (alelo 2) (SEC ID NO: 177) Hu2B8 Hv5-51.1 + constante de lgG1 Hu2B8 Kv3-15.1 + alotipo constante de (G1 M(17.1)) alotipo (SEC ID NO: 171) kappa (Km(3)) (alelo 2) (SEC ID NO: 181) Dos de las posibles construcciones de anticuerpo que contienen las cadenas pesadas y livianas de inmunoglobulina de longitud completa que contienen las regiones variables humanizadas se designan a continuación: sh2B8-9 (G1m(17.1)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ alotipo de región constante de lgG1 (G1 m(17.1)) (SEC ID NO. 171) más hu2B8 Kv 1-39.1 (+ alotipo de región constante kappa (Km(3) (alelo 2))) (SEC ID NO. 177) sh2B8-12 (G1m(17.1)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ alotipo de región constante de lgG1 (G1 m(17.1 )) (SEC ID NO. 171 ) más hu2B8 Kv 3-15.1 (+ región constante kappa (Km(3) alotipo (alelo 2))) (SEC ID NO. 181 ). La secuencia de ácidos nucleicos que codifica y la secuencia de proteínas que define cada uno de los anticuerpos humanizados se resumen a continuación. En esta sección, el último nucleótido de cada región variable es la primera base del próximo codón generado por la unión de la región constante/variable. Este nucleótido se incluye en la región variable porque es parte de ese exón. Las secuencias de aminoácidos de regiones constantes mencionadas a continuación incluyen la traducción de este codón de unión. (1 ) Secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena pesada 2B8 quimérica de longitud completa (Región variable de ratón y Región constante de lgG1 humana) (alotipo G1m(17.1)) (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 154) 1 atgggatgga gctatatcat cctctttttg qtaqcaacag ctacagatgt ccactcccaq 61 gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt gaagctgtcc 121 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgaa tcagaggcct 181 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 301 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaaggc accactctca ccgtctcctc agcctccacc 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga (2) Secuencia de proteína que define la cadena pesada 2B8 quimérica de longitud completa (2B8 quimérica de lqG1 (G1 m(17.1 ) alotipo) (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 155) 1 qvqlqqpgae Ivkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqr pgqglewige inptnghtny 61 nekfkskatl tvdkssstay mqlssltsed savyycarny vgsifdywgq gttltvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkyepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk Itvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk (3) Secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena liviana 2B8 quimérica de longitud completa (Región variable de ratón y Región constante humana) (2B8 guimérica kappa (Km(3))) (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 156) 1 atgqaatcac aqactctqqt cttcatatcc atactqctct qqttatatqq tqctqatggg 61 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 121 ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca 181 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat 241 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct 301 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaggc tggaaataaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 421 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 601 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttga (4) Secuencia de proteína que define la cadena liviana 2B8 quimérica de longitud completa (2B8 quimérica kappa (Km(3))) (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 157) 1 nivmtqspks msmsvgervt Isckasenvv syvswyqqkp aqspklliyg asnrntgvpd 61 rftgsgsatd ftltissvra edladyhcgq synypytfgg gtrleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta swcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 181 Iskadyekhk vyacevthqg Isspvtksfn rgec (5) Secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv1 -f.1 humanizada (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 158) 1 atggactgca cctqqaqqat cctcctcttq gtggcaqcaq ctacaqgcac ccacgccgag 61 gtccagctgg tacagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggctacagt gaaaatctcc 121 tgcaaggttt ctggatacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgca acaggcccct 181 ggaaaagggc ttgagtggat gggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 gagaagttcc agggcagagt caccataacc gcggacacgt ctacagacac agcctacatg 301 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaac aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc ag (6) Secuencia de proteína gue define la región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv1 -f.1 humanizada (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 159) 1 evqlvqsgae vkkpgatvki sckvsgytft tywmhwvqqa pgkglewmge inptnghtny 61 nekfqgrvti tadtstdtay melsslrsed tavyycatny vgsifdywgq gtlvtvss (7) Secuencia de ácido nucleico gue codifica el alotipo de la región constante de cadena pesada de lgG1 Humana (G1 m(17. P) (SEC ID NO. 160) 1 cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 61 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 121 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 181 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 241 acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca 301 aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 361 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 421 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 481 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 541 gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 601 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 661 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc 721 tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 781 ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 841 tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 901 agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 961 agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga (8) Secuencia de proteína que define el alotipo de la región constante de cadena pesada de lqG1 Humana (G1 m(17.P) (SEC ID NO. 161). El primer aminoácido deriva de la traducción del último nucleótido de la región variable y el inicio de los dos nucleótidos de la secuencia de cadena pesada de lgG . 1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss 61 glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkkvep kscdkthtcp pcpapellgg 121 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn 181 styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka Ipapiektis kakgqprepq vytlppsrde 241 Itknqvsltc Ivkgfypsdi avewesngqp ennykttppv Idsdgsffly skltvdksrw 301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk (9) Secuencia de ácido nucleico que codifica la Región variable Hu2B8 Hv1f.1 humanizada de cadena pesada de longitud completa y la región constante de cadena pesada del alotipo de lgG1 humano (G1 m(17.1 ) (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 162) 1 atggactgca cctggaggat cctcctcttg gtggcagcag ctacaggcac ccacgccgag 61 gtccagctgg tacagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggctacagt gaaaatctcc 121 tgcaaggttt ctggatacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgca acaggcccct 181 ggaaaagggc ttgagtggat gggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 gagaagttcc agggcagagt caccataacc gcggacacgt ctacagacac agcctacatg 301 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaac aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga (10) Secuencia de proteína que define la Región variable Hu2B8 Hv1f.1 humanizada de cadena pesada de longitud completa y el alotipo de la región constante de cadena pesada de lgG1 humano (G1 m(17.1 ) (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 163) 1 evqlvqsgae vkkpgatvki sckvsgytft tywmhwvqqa pgkglewmge inptnghtny 61 nekfqgrvti tadtstdtay melsslrsed tavyycatny vgsifdywgq gtlvtvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk Itvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk (1 1) Secuencia de ácido nucleico gue codifica la región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv5a.1 humanizada (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 164) 1 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaggatctcc 121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 ccgtccttcc aaggccacgt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc ag (12) Secuencia de proteína que define la región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv5a.1 humanizada (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 165) 1 evqlvqsgae vkkpgeslri sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 61 npsfqghvti sadksistay Iqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvss (13) Secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv5a.1 humanizada de longitud completa y la región constante de cadena pesada del alotipo de lgG1 humano (G1 m(17.1 ) (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 166) 1 atgqqqtcaa ccqccatcct cqccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaggatctcc 121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 ccgtccttcc aaggccacgt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1 141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga (14) Secuencia de proteína que define la región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv5a.1 humanizada de longitud completa y la región constante de cadena pesada del alotipo de lgG1 humano (G1 m(17.1) (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 167) 1 evqlvqsgae vkkpgeslri sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 61 npsfqghvti sadksistay Iqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvssas 21 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk Itvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk (15) Secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv5-51.1 humanizada (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 168) 1 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctqgctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc ag (16) Secuencia de proteína gue define la secuencia variable de cadena pesada Hu2B8 Hv5-51.1 humanizada (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 169) 1 evqlvqsgae vkkpgeslki sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 61 npsfqgqvti sadksistay Iqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvss (17) Secuencia de ácido nucleico gue codifica la región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv5-51.1 humanizada de longitud completa y la región constante de cadena pesada del alotipo de lgG1 humano (G1 m(17.1 ) (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 170) 1 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga (18) Secuencia de proteína que define la región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv5-51.1 humanizada de longitud completa y la región constante de cadena pesada del alotipo de lgG1 humano (G1 m(17.1 ) (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 171) 1 evqlvqsgae vkkpgeslki sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 61 npsfqgqvti sadksistay Iqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslss vtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tc vvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk Itvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk (19) Secuencia de ácido nucleico que codifica la Región variable de cadena kappa Hu2B8 Kv1-39.1 humanizada (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 172). Dos posibles ATG de inicio se muestran en letras mayúsculas. 1 ATGgacATGa gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 61 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 121 gtcaccatca cttgcaaggc cagtgagaat gtggtttctt atgtatcctg gtatcagcag 181 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatggggcat ccaaccggaa cactggggtc 241 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 301 caacctgaag attttgcaac ttactactgt gggcagagtt acaactatcc gtacacgttt 361 ggccagggga ccaagctgga gatcaaac (20) Secuencia de proteína gue define la región variable de cadena kappa Hu2B8 Kv1-39.1 humanizada (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 173) 1 diqmtqspss Isasvgdrvt itckasenvv syvswyqqkp gkapklliyg asnrntgvps 61 rfsgsgsgtd ftltisslqp edfatyycgq synypytfgq gtkleik (21 ) Secuencia de ácido nucleico gue codifica el alotipo de la región constante de cadena kappa humana (Km(3)) (alelo 2) (SEC ID NO. 174) 1 gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg 61 gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt 121 ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca 181 gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga 241 aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga 301 gcttcaacag gggagagtgt tga (22) Secuencia de proteína que define el alotipo de la región constante de cadena kappa humana (Km(3)) (alelo 2) (SEC ID NO. 175). The first aminoácido es derived from translation de the last nucleotide de región variable y beginning dos nucleótidos de the kappa Light Chain sequence. 1 rtvaapsvfi fppsdeqlks gtasvvclln nfypreakvq wkvdnalqsg nsqesvteqd 61 skdstyslss tltlskadye khkvyacevt hqglsspvtk sfnrgec (23) Secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena liviana Hu2B8 Kv1-39.1 humanizada de longitud completa y el alotipo de la región constante de cadena kappa humana (Km(3)) (alelo 2) (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 176) 1 atgqacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 61 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 121 gtcaccatca cttgcaaggc cagtgagaat gtggtttctt atgtatcctg gtatcagcag 181 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatggggcat ccaaccggaa cactggggtc 241 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 301 caacctgaag attttgcaac ttactactgt gggcagagtt acaactatcc gtacacgttt 361 ggccagggga ccaagctgga gatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 421 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 481 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 541 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 601 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 661 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgttg a (24) Secuencia de proteína que define la región variable de cadena liviana Hu2B8 Kv1-39.1 humanizada de longitud completa y el alotipo de la región constante de cadena kappa humana (Km(3)) (alelo 1 ) (SEC ID NO. 177) 1 diqmtqspss Isasvgdrvt itckasenvv syvswyqqkp gkapklliyg asnrntgvps 61 rfsgsgsgtd ftltisslqp edfatyycgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 181 Iskadyekhk vyacevthqg Isspvtksfn rgec (25) Secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena liviana Hu2B8 Kv3-15.1 humanizada (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 178) 1 atggaagccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccactgga 61 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 121 ctctcctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtacca gcagaaacct 181 ggccaggctc ccaggctcct catctatggg gcatccaacc ggaacactgg tatcccagcc 241 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 301 gaagattttg cagtttatta ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gtttggccag 361 gggaccaagc tggagatcaa ac (26) Secuencia de proteína gue define la región variable de cadena liviana Hu2B8 Kv3-15.1 humanizada (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 179) 1 eivmtqspat Isvspgerat Isckasenvv syvswyqqkp gqaprlliyg as 61 rfsgsgsgte ftltisslqs edfavyycgq synypytfgq gtkleik (27) Ácido nucleico que codifica la región variable de cadena liviana Hu2B8 Kv3-15.1 humanizada de longitud completa y el alotipo de la región constante de cadena kappa humana (Km(3)) (alelo 2) (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 180) 1 atggaagccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccactgga 61 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 121 ctctcctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtacca gcagaaacct 181 ggccaggctc ccaggctcct catctatggg gcatccaacc ggaacactgg tatcccagcc 241 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 301 gaagattttg cagtttatta ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gtttggccag 361 gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 421 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 601 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttga (28) Secuencia de proteína gue define la región variable de cadena liviana Hu2B8 Kv3-15.1 humanizada v el alotipo de la región constante de cadena kappa humana (Km(3)) (alelo 2) (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 181 ) 1 eivmtqspat Isvspgerat Isckasenvv syvswyqqkp gqaprlliyg asnrntgipa 61 rfsgsgsgte ftltisslqs edfavyycgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 181 Iskadyekhk vyacevthqg Isspvtksfn rgec Para conveniencia, la Tabla 13 provee un esquema de concordancia que muestra la correspondencia entre las secuencias de longitud completa y de los anticuerpos mencionados en esta sección con los presentados en el Listado de Secuencias. TABLA 13 SEC. ID NO. Proteína o Ácido nucleico 154 lgG1 de 2B8 quimérica (G1 m(17.1)) - ácido nucleico 155 lgG1 de 2B8 quimérica (G1 m(17.1)) - proteína 156 kappa de 2B8 quimérica (Km(3)) - ácido nucleico 157 kappa de 2B8 quimérica (Km(3)) - proteina 158 Región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv1f.1- ácido nucleico 159 Región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv1f.1- proteína 160 Alotipo de región constante de cadena pesada de lgG1 Humana (G1m(17.1)) - ácido nucleico 161 Alotipo de región constante de cadena pesada de lgG1 Humana (G1m(17.1)) - proteína 162 Hu2B8 Hv1f.1 + alotipo de constante de lgG1 (G1m(17.1)) - ácido nucleico 163 Hu2B8 Hv1f.1 + alotipo de constante de lgG1 (G1m(17.1)) - proteína 164 Región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv5a.1- ácido nucleico 165 Región variable de cadena pesada, Hu2B8 Hv5a.1- proteína 166 Hu2B8 Hv5a.1 + alotipo de constante de lgG1 (G1 m(17.1)) - ácido nucleico 167 Hu2B8 Hv5a.1 + alotipo de constante de lgG1 (G1m(17.1)) - proteína 168 Región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv5-51.1- ácido nucleico 169 Región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv5-51.1- proteína 170 Hu2B8 Hv5-51.1 + alotipo de constante de lgG1 (G1 m(17.1) - ácido nucleico 171 Hu2B8 Hv5-51.1 + alotipo de constante de lgG1 (G1 m(17.1 ) - proteína 172 Región variable de cadena kappa Hu2B8 Kv1-39.1- ácido nucleico SEC. ID NO. Proteína o Ácido nucleico 173 Región variable de cadena kappa Hu2B8 Kv1-39.1- proteína 174 alotipo de la región constante de cadena kappa humana (Km(3)) (alelo 2) - ácido nucleico 175 Alotipo de la región constante de cadena kappa humana (Km(3)) (alelo 2) - proteína 176 Hu2B8 Kv1-39.1 + alotipo de constante de kappa (Km(3)) (alelo 2) - ácido nucleico 177 Hu2B8 Kv1-39.1 + alotipo de constante de kappa (Km(3)) (alelo 2) - proteína 178 Región variable de cadena kappa Hu2B8 Kv3-15.1- ácido nucleico 179 Región variable de cadena kappa Hu2B8 Kv3-15.1- proteína 180 Hu2B8 Kv3-15.1 + alotipo de constante de kappa (Km(3)) (alelo 2) - ácido nucleico 181 Hu2B8 Kv3-15.1 + alotipo de constante de kappa (Km(3)) (alelo 2) - proteína B. Procedimiento de Humanización 2 El segundo método de humanización empleado para reducir la inmunogenicidad del anticuerpo 2B8 de ratón se basa en el método descripto en Studnicka et al. (1994) PROTEÍNA ENG. 7:805-814. Las regiones variables de la línea germinal humana Kappa y pesadas más idénticas (a nivel del aminoácido) a las de 2B8 de ratón se identificaron. Los residuos que diferían entre ratón y humano se convirtieron en la secuencia humana que depende del probable riesgo que tal cambio afectaría la unión o inmuhogenicidad. Los residuos de bajo riesgo (es decir, residuos que cuando cambian probablemente no afectarían la unión al antígeno y además reducirían la inmunogenicidad potencial) se cambiaron al aminoácido humano en la región variable pesada (creando la LR2B8HC) y la región variable kappa (creando la LR2B8LC). Además, el riesgo y el riesgo medio (es decir los residuos que cuando se cambian de algún modo es probable que tengan un efecto sobre los residuos de unión al antígeno y además reducirían la inmunogenicidad potencial) se cambiaron al aminoácido humano en la región variable pesada (creando la LRMR2B8HC) y la región variable kappa (creando la LRMR2B8LC). El alotipo de la región constante de lgG1 humana de cadena pesada (G1m(3) (alelo 1)) se agregó al terminal carboxilo de las dos regiones variables pesadas diseñadas humanas y el alotipo de la región kappa constante humana (Km(3) (alelo 1)) se agregó al terminal carboxilo de las dos regiones variables livianas diseñadas humanas, creando de este modo cuatro cadenas de anticuerpos diseñados humanos. Las secuencias de ácido nucleico de región variable se sintetizaron primero por métodos de síntesis génica y luego se agregaron a las secuencias de región constante humana. Estos anticuerpos diseñados humanos se clonaron en vectores de expresión de proteína mamífera, y la proteína se expresó en las cuatro combinaciones posibles de cadena pesada más cadena liviana. La unión de los anticuerpos quiméricos, quiméricos/humanizados, o humanizados al FCH humano se midió utilizando técnicas convencionales, según se describe a continuación. Las secuencias de ácido nucleico que codifican y las secuencias de proteínas que definen cada uno de los anticuerpos humanizados se resumen a continuación. En esta sección, el último nucleótido de cada región variable es la primera base de del próximo codón generado por la unión de la región variable/constante. Este nucleótido se incluye en la región variable porque es parte de ese exón. Las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes mencionadas a continuación incluyen la traducción de este codón de unión. (1) Secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada LR2B8HC humanizada (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 182) 1 atgggctggt catatattat tctctttctt gttgctaccg ctaccgatgt gcactctcaa 6 gtccaactcg tacaaccagg cgctgaagtc gtaaaacccg gaacatctgt taaactctca 121 tgcaaagcct caggatacac tttcacaact tactggatgc attgggtcaa tcaagccccc 181 ggacaaggcc tcgaatggat tggcgaaatt aacccaacta acggacatac taattataat 241 gaaaaattta agggcaaagc tacactcacc gtcgataaat caacctctac agcttatatg 301 gaactttcat ccctgagatc agaagataca gccgtctact attgcgccag aaactacgta 361 ggatcaatat tcgattactg gggtcaaggc actctcctca cagtcagctc ag (2) Secuencia de proteína gue define la región variable de cadena pesada LR2B8HC humanizada (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 183) 1 qvqlvqpgae vvkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqa pgqglewige inptnghtny 61 nekfkgkatl tvdkststay melsslrsed tavyycarny vgsifdywgq gtlltvss (3) Secuencia de ácido nucleico que codifica el alotipo de la región constante de lgG1 humana de cadena pesada (G1 m(3)) (alelo 1 ) (SEC ID NO. 184) 1 ccagcacaaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 61 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 121 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 81 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 241 acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca 301 aatcttgtga caaaactcac acatgtccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 361 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 421 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 481 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 541 gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 601 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 661 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga 721 tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 781 ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 841 tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 901 agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 961 agaagagcct ctccctgtcc ccgggtaaat ga (4) Secuencia de proteína que define el alotipo de la región constante de cadena pesada de lqG1 humana (G1 m(3)) (alelo 1 o 2) (SEC ID NO. 185). El primer aminoácido deriva de la traducción del último nucleótido de región variable y el inicio de los dos nucleótidos de la secuencia de cadena pesada de lgG1 . 1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss 61 glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep kscdkthtcp pcpapellgg 121 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn 81 styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka Ipapiektis kakgqprepq vytlppsree 241 mtknqvsltc Ivkgfypsdi avewesngqp ennykttppv Idsdgsffly skltvdksrw 301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk (5) Secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada LR2B8HC humanizada de cadena pesada de longitud completa y el alotipo de la región constante de cadena pesada de lgG1 humana (G1 m(3)) (alelo 1 ) (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 186) 1 atgggctggt catatattat tctctttctt gttgctaccg ctaccgatgt gcactctcaa 61 gtccaactcg tacaaccagg cgctgaagtc gtaaaacccg gaacatctgt taaactctca 121 tgcaaagcct caggatacac tttcacaact tactggatgc attgggtcaa tcaagccccc 181 ggacaaggcc tcgaatggat tggcgaaatt aacccaacta acggacatac taattataat 241 gaaaaattta agggcaaagc tacactcacc gtcgataaat caacctctac agcttatatg 301 gaactttcat ccctgagatc agaagataca gccgtctact attgcgccag aaactacgta 361 ggatcaatat tcgattactg gggtcaaggc actctcctca cagtcagctc agccagcaca 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgtcc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ccccgggtaa atga (6) Secuencia de proteína que define la región variable de cadena pesada LR2B8HC humanizada de cadena pesada de longitud completa y el alotipo de la región constante de lgG1 humana de cadena pesada (G1m(3)) (alelo 1 ) (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 187) 1 qvqlvqpgae vkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqa pgqglewige inptnghtny 61 nekfkgkatl tvdkststay melsslrsed tavyycarny vgsifdywgq gtlltvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkrvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsreemt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk Itvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk (7) Secuencia de ácido nucleico gue codifica la región variable de cadena pesada LRMR2B8HC humanizada (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 188) 1 atgggttggt catatattat actctttctc gtagccaccg ccaccgacgt acactctcag 61 gttcaactcg tacaacccgg cgccgaagtc aagaaaccag gaacatcagt caaactctca 121 tgtaaagcaa gcggatacac ctttactact tattggatgc attgggtaag acaagccccc 181 ggacaaggac tcgaatggat aggcgaaata aatcccacta atggacatac aaattataat 241 caaaaatttc aaggacgcgc tacactcacc gtcgataaat caacctcaac cgcatacatg 301 gaactcagct ccctccgatc cgaagacact gccgtttatt attgtgccag aaactatgta 361 ggatctattt tcgattactg gggacaagga acacttctca ccgtaagctc ag (8) Secuencia de proteína gue define la región variable de cadena pesada LRMR2B8HC humanizada (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 189) 1 qvqlvqpgae vkkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvrqa pgqglewige inptnghtny 61 nqkfqgratl tvdkststay melsslrsed tavyycarny vgsifdywgq gtlltvss (9) Secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada LRMR2B8HC humanizada de cadena pesada de longitud completa y el alotipo de la región constante de cadena pesada de lgG1 humana (G1 m(3)) (alelo 1) (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 190) 1 atgggttggt catatattat actctttctc gtagccaccg ccaccgacgt acactctcag 61 gttcaactcg tacaacccgg cgccgaagtc aagaaaccag gaacatcagt caaactctca 121 tgtaaagcaa gcggatacac ctttactact tattggatgc attgggtaag acaagccccc 181 ggacaaggac tcgaatggat aggcgaaata aatcccacta atggacatac aaattataat 241 caaaaatttc aaggacgcgc tacactcacc gtcgataaat caacctcaac cgcatacatg 301 gaactcagct ccctccgatc cgaagacact gccgtttatt attgtgccag aaactatgta 361 ggatctattt tcgattactg gggacaagga acacttctca ccgtaagctc agccagcaca 42 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgtcc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1 141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ccccgggtaa atga (10) Secuencia de proteína que define la Región variable de cadena pesada LRMR2B8HC humanizada de cadena pesada de longitud completa y el alotipo de la región constante de cadena pesada de lgG1 humana (G1 m(3)) (alelo 1 ) (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 191 ) 1 qvqlvqpgae vkkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvrqa pgqglewige inptnghtny 61 nqkfqgratl tvdkststay melsslrsed tavyycarny vgsifdywgq gtlltvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkrvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsreemt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk Itvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk (1 1 ) Secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena liviana LR2B8LC humanizada (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 192) 1 atggaaagtc agacccttgt attcatctct attcttcttt ggttgtatgg agcagacggc 61 gacattgtga tgacccaatc ccccgatagt atggccatga gtgtaggaga aagagtcacc 121 cttaattgca aagcctccga aaatgtcgtt tcatatgtgt cttggtatca acaaaaaccc 181 ggccaatcac ccaaacttct catatacggc gcttcaaaca gaaacacagg cgttcccgac 241 agatttagtg gatccggatc agctacagat ttcaccctta ccatcagttc agttcaagca 301 gaagacgttg cagactatca ttgcggacaa tcttataact acccttacac attcggacaa (12) Secuencia de proteína que define la región variable de cadena liviana LR2B8LC humanizada (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 193) 1 divmtqspds mamsvgervt Inckasenvv syvswyqqkp gqspklliyg asnrntgvpd 61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleik (13) Secuencia de ácido nucleico que codifica el alotipo de la región constante de cadena kappa humana (Km(3)) (alelo 1 ) (SEC ID NO. 194) 1 gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg 61 gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt 121 ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca 181 gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga 241 aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga 301 gcttcaacag gggagagtgt tag (14) Secuencia de proteína gue define el alotipo de la región constante de cadena kappa humana (Km(3)) (alelo 1 ) (SEC ID NO. 195). El primer aminoácido deriva de la traducción del último nucleótido de región variable y el inicio de dos nucleótidos de la secuencia de cadena liviana kappa. 1 rtvaapsvfi fppsdeqlks gtasvvclln nfypreakvq wkvdnalqsg nsqesvteqd 61 skdstyslss tltlskadye khkvyacevt hqglsspvtk sfnrgec (15) Secuencia de ácido nucleico gue codifica la región variable de cadena liviana LR2B8LC humanizada de longitud completa y el alotipo de la región constante de cadena kappa humana (Km(3)) (alelo 1 ) (SEC ID NO. 196) 1 atggaaagtc agacccttgt attcatctct attcttcttt ggttgtatgg agcagacggc 61 gacattgtga tgacccaatc ccccgatagt atggccatga gtgtaggaga aagagtcacc 121 cttaattgca aagcctccga aaatgtcgtt tcatatgtgt cttggtatca acaaaaaccc 181 ggccaatcac ccaaacttct catatacggc gcttcaaaca gaaacacagg cgttcccgac 241 agatttagtg gatccggatc agctacagat ttcaccctta ccatcagttc agttcaagca 301 gaagacgttg cagactatca ttgcggacaa tcttataact acccttacac attcggacaa 361 ggaaccaaac tcgaaattaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 421 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 601 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag (16) Secuencia de proteína que codifica la región variable de cadena liviana LR2B8LC humanizada de longitud completa y el alotipo de la región constante de cadena kappa humana (Km(3)) (alelo 1 ) (SEC ID NO. 197) 1 divmtqspds mamsvgervt Inckasenvv syvswyqqkp gqspklliyg asnrntgvpd 61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 181 Iskadyekhk vyacevthqg Isspvtksfn rgec (17) Secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena liviana LRMR2B8LC humanizada (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 198) 1 atggaatccc aaacccttgt tttcatctct atccttctct ggctttatgg cgccgacgga 61 gacatcgtaa tgacacaatc ccctgactct cttgctatga gcttgggcga acgagtaaca 121 cttaactgca aagcatccga aaatgtcgta tcttacgtat cctggtatca gcaaaaacct 181 ggtcaaagtc ctaaacttct tatatatggt gcaagtaatc gtgaaagtgg cgtcccagac 241 agatttagcg gttcaggttc agcaactgac tttacactta caatttctag cgttcaggcc 301 gaagacgttg cagactatca ttgtggacaa tcttataact atccttatac tttcggacaa 361 ggcactaaac ttgaaattaa ac (18) Secuencia de proteína que define la región variable de cadena liviana LRMR2B8LC humanizada (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 199) 1 divmtqspds lamslgervt Inckasenvv syvswyqqkp gqspklliyg asnresgvpd 61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleik (19) Secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena liviana LRMR2B8LC hümanizada de longitud completa y el alotipo de la región constante de cadena kappa humana (Km(3)) (alelo 1) (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 200) 1 atggaatccc aaacccttgt tttcatctct atccttctct ggctttatgg cgccgacgga 61 gacatcgtaa tgacacaatc ccctgactct cttgctatga gcttgggcga acgagtaaca 121 cttaactgca aagcatccga aaatgtcgta tcttacgtat cctggtatca gcaaaaacct 181 ggtcaaagtc ctaaacttct tatatatggt gcaagtaatc gtgaaagtgg cgtcccagac 241 agatttagcg gttcaggttc agcaactgac tttacactta caatttctag cgttcaggcc 301 gaagacgttg cagactatca ttgtggacaa tcttataact atccttatac tttcggacaa 361 ggcactaaac ttgaaattaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 421 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 601 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag (20) Secuencia de proteína que define la región variable de cadena liviana LRMR2B8LC humanizada de longitud completa y el alotipo de la región constante de cadena kappa humana (Km(3)) (alelo 1 ) (SEC ID NO. 201 ) 1 divmtqspds lamslgervt Inckasenvv syvswyqqkp gqspklliyg asnresgvpd 61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 181 Iskadyekhk vyacevthqg Isspvtksfn rgec Para conveniencia, La Tabla 14 provee una tabla de concordancia que muestra la correspondencia entre las secuencias de longitud completa y la de los anticuerpos mencionados en esta sección con los presentadas en el Listado de secuencias.

TABLA 14 SEC. ID NO. Proteína o Ácido nucleico 182 LR2B8HC Región variable de cadena pesada - ácido nucleico 183 LR2B8HC Región variable de cadena pesada - proteína 184 Región constante de lgG1 humana de cadena pesada (G1 m(3) alotipo) (alelo 1 ) - ácido nucleico 185 Región constante de lgG1 humana de cadena pesada (G1 m(3) alotipo) (alelo 1 ) - proteína 186 LR2B8HC + alotipo constante de lgG1 (G1 m(3)) (alelo 1 ) - ácido nucleico 187 LR2B8HC + alotipo constante de lgG1 (G1 m(3)) (alelo 1 ) - proteína 188 LRMR2B8HC Región variable de cadena pesada - ácido nucleico 189 LRMR2B8HC Región variable de cadena pesada - proteina 190 LRMR2B8HC + alotipo constante de lgG1 (G1 m(3)) (alelo 1 ) - ácido nucleico SEC. ID NO. Proteína o Ácido nucleico 191 LRMR2B8HC + alotipo constante de lgG1 (G1m(3)) (alelo 1) - proteína 192 LR2B8LC Región variable de cadena liviana - ácido nucleico 193 LR2B8LC Región variable de cadena liviana - proteína 194 Alotipo de la región constante de cadena kappa humana (Km(3)) (alelo 1) - ácido nucleico 195 alotipo de la región constante de cadena kappa humana (Km(3)) (alelo 1) - proteína 196 LR2B8LC + alotipo constante de kappa (Km(3)) (alelo 1) - ácido nucleico 197 LR2B8LC + alotipo constante de kappa (Km(3)) (alelo 1) - proteína 198 LRMR2B8LC Región variable de cadena liviana - ácido nucleico 199 LRMR2B8LC Región variable de cadena liviana - proteína 200 LRMR2B8LC + alotipo constante de kappa (Km(3)) (alelo 1) - ácido nucleico 201 LRMR2B8LC + alotipo constante de kappa (Km(3)) (alelo 1) - proteína La Tabla 15 resume las secuencias de CDR de cadena pesada (Definición Kabat) de los anticuerpos 2B8 humanizados preparados por el procedimiento de humanización 1 y por el procedimiento de humanización 2 descripto en la presente anteriormente en este ejemplo.

TABLA 15 Anticuerpo CDR1 CDR2 CDR3 Región Variable de Cadena Pesada de Longitud Completa Pesada 2B8 TYWMH EINPTNGHTNYNEKFKS NYVGSIFDY SEC ID murina (SEC ID NO: (SEC ID NO: 16) (SEC ID NO: 17) NO: 12 15) Hu2B8 Hv1f.1 TYWMH EINPTNGHTNYNEKFQG NYVGSIFDY SEC ID (SEC ID NO: (SEC ID NO: 202) (SEC ID NO: 17) NO: 159 15) Hu2B8 TYWMH EINPTNGHTNYNPSFQG NYVGSIFDY SEC ID Hv5a.1 (SEC ID NO: (SEC ID NO: 203) (SEC ID NO: 17) NO: 165 15) Hu2B8 Hv5- TYWMH EINPTNGHTNYNPSFQG NYVGSIFDY SEC ID 51.1 (SEC ID NO: (SEC ID NO: 203) (SEC ID NO: 17) NO: 169 15) LR2B8HC TYWMH EINPTNGHTNYNEKFKG NYVGSIFDY SEC ID (SEC ID NO: (SEC ID NO: 204) (SEC ID NO: 17) NO: 183 15) LRMR2B8HC TYWMH EINPTNGHTNYNQKFQG NYVGSIFDY SEC ID (SEC ID NO: (SEC ID NO: 205) (SEC ID NO: 17) NO: 189 15) La Tabla 16 resume las secuencias de CDR de cadena liviana (Definición Kabat) de los anticuerpos 2B8 humanizados preparados por el procedimiento de humanización 1 y por el procedimiento de humanización 2 descripto en la presente anteriormente en este ejemplo.

TABLA 16 Anticuerpo CDR1 CDR2 CDR3 Región variable de cadena liviana de longitud completa Liviana 2B8 KASENWSYVS GASNRNT GQSYNYPYT SEC ID NO: 14 murina (SEC ID NO: 18) (SEC ID NO: 19) (SEC ID NO: 20) Hu2B8 Kv1-39.1 KASENWSYVS GASNRNT GQSYNYPYT SEC ID NO: 173 (SEC ID NO: 18) (SEC ID NO: 19) (SEC ID NO: 20) Hu2B8 Kv3-15.1 KASENWSYVS GASNRNT GQSYNYPYT SEC ID NO: 179 (SEC ID NO: 18) (SEC ID NO: 19) (SEC ID NO: 20) LR2B8LC KASENWSYVS GASNRNT GQSYNYPYT SEC ID NO: 193 (SEC ID NO: 18) (SEC ID NO: 19) (SEC ID NO: 20) LRMR2B8LC KASENWSYVS GASNRES GQSYNYPYT SEC ID NO: 199 (SEC ID NO: 18) (SEC ID NO: (SEC ID NO: 206) 20) C. Afinidad de unión de los anticuerpos 2B8 humanizados La afinidad de unión al antígeno y la cinética de interacción se evaluaron mediante la tecnología de resonancia de plasmón superficial utilizando un instrumento BIAcore T100. Las inmunoglobulinas anti-humanas de ratón (Jackson ImmunoResearch Labs, 209-005-098) se inmovilizaron sobre chips sensores CM4 de dextrano carboximetilado (BIAcore, Catálogo No. BR-1005-34) mediante acoplamiento de amina (BIAcore, Catálogo No. BR-1000-50) utilizando un protocolo de acoplamiento estándar de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los análisis se llevaron a cabo 25°C utilizando PBS (GIBCO, Catálogo No. 14040-133) que contiene 0,05% de tensioactivo P20 (BIAcore, Catálogo No. BR-1000-54), 2 mg/ml de BSA (EMD, Catálogo No. 2930) y 10 mg/ml de sal de CM-dextrano de sodio (Fluka, Catálogo No. 86524) como buffer de corrida. Los anticuerpos se capturaron sobre una célula de flujo individual a una velocidad de flujo de 10 µ?/min. El tiempo de inyección fue variable para cada anticuerpo para dar aproximadamente 20 UR de anticuerpo capturado para cada ciclo. El buffer o FCH (R&D Systems, Catálogo No. 294-HGN-025) diluido en buffer de corrida se inyectó en forma consecutiva sobre una superficie de referencia (sin anticuerpo capturado) y la superficie activa (anticuerpo a ser ensayado) durante minutos a 60 µ?/min. La fase de disociación se monitoreó durante 15 o 90 minutos, dependiendo de la concentración. La superficie luego se regeneró con Glicina 10 mM-HCI, pH 2,0 (BIAcore, Catálogo No. BR-1003-55) inyectado durante 3 minutos a una velocidad de flujo de 60 µ?/min antes de iniciarse otro ciclo. Las concentraciones de FCH ensayadas fueron 1 ,88, 3,75 y 7,5 nM. La determinación de los parámetros cinéticos se obtuvo utilizando la función cinética del software de BIAevaluación con sustracción de referencia. Los parámetros cinéticos para cada anticuerpo, ka (constante de velocidad de asociación), kd (constante de velocidad de disociación) y KD (constante de disociación de equilibrio) se resumen en la Figura 8. Los resultados resumidos en la Figura 8 muestran que ciertas combinaciones de cadenas pesadas superhumanizadas (Hu2B8 Hv5a.1 , Hu2B8 Hv5-51 .1 o Hu2B8 Hv1 -f.1 ) y cadenas livianas (Hu2B8 Kv1 -39.1 o Hu2B8 Kv3-15.1 ) retienen una afinidad de unión similar (KD) a FCH en la forma de 2B8 quimérica (regiones variables de ratón con regiones constantes humanas) y 2B8 (Taba 5). D. Ensayo de unión mutua exclusiva La unión exclusiva mutua al FCH se evaluó por tecnología de resonancia de plasmón superficial utilizando un BIAcore instrumento T100. Las inmunoglobulinas anti-humanas de ratón (Jackson ImmunoResearch Labs, 209-005-098) se inmovilizaron sobre chips sensores CM5 de dextrano carboximetilado (BIAcore, Catálogo No. BR-1006-68) por acoplamiento de amina (BIAcore, Catálogo No. BR-1000-50) utilizando un protocolo de acoplamiento estándar de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los análisis se llevaron a cabo a 25°C utilizando PBS (GIBCO, Catálogo No. 14040-133) que contiene 0,05% de tensioactivo P20 (BIAcore, #BR-1000-54), 2 mg/ml de BSA (EMD, Catálogo No. 2930) y 10 mg/ml de sal de CM-dextrano de sodio (Fluka, Catálogo No. 86524) como buffer de corrida. Los anticuerpos humanizados se capturaron sobre una célula de flujo individual a una velocidad de flujo de 30 µ?/min. El tiempo de inyección fue variable para cada anticuerpo para dar aproximadamente 150 RU de anticuerpo capturado para cada ciclo. El FCH (R&D Systems, Catálogo No. 294-HGN-025) diluido en buffer de corrida a una concentración final de 7,5 pg/ml se inyectó durante 90 seg a 30 L/min sobre los anticuerpos humanizados capturados. La unión de FCH se monitoreó antes de la inyección subsiguiente del anticuerpo 2B8 de ratón o el anticuerpo anti-FCH de cabra policlonal (R & D Systems, AF294) durante 3 min a 30 µ?/min. La superficie luego se regeneró con glicina 10mM-HCI, pH 2,0 (BIAcore, Catálogo No. BR-1003-55) inyectado durante 3 min a una velocidad de flujo de 60 µ? /min antes de que otro anticuerpo sea ensayado. Los resultados se resumen en la Figura 9.

Los resultados resumidos en la Figura 9 muestran que los anticuerpos 2B8 humanizados y los anticuerpos 2B8 quiméricos evitan que el 2B8 se una al FCH. Estos resultados muestran que los anticuerpos humanizados se unen aún al mismo epítopo de FCH que el anticuerpo 2B8 original.

Ejemplo 13 - Producción de variantes 2B8 humanizadas a. Anticuerpos HUMAN ENGINEERED™ La cadena liviana Human Engineered de riesgo bajo-más-moderado y de riesgo bajo optimizado-de expresión y codón (LR2B8LC y LRMR2B8LC, respectivamente) y las cadenas pesadas (LR2B8HC y LRMR2B8HC, respectivamente) se clonaron en-fase en los vectores de expresión de anticuerpo transitorio de XOMA, que contienen los módulos de las regiones constantes kappa y Gamma-1 humanas. Las cuatro variantes 2B8 Human Engineered se produjeron por la transfección transitoria en las células HEK293E. Se produjeron los siguientes cuatros anticuerpos: HE2B8-1 = LR2B8HC (+ Alotipo de la región constante de lgG1 (G1 m(3) (alelo 1 )) (SEC ID NO. 187) más LR2B8LC (+ alotipo de región constante kappa (Km(3) (alelo 1 ))) (SEC ID NO. 197) HE2B8-2 = LR2B8HC (+ Alotipo de la región constante de lgG1 (G1 m(3) (alelo 1 )) (SEC ID NO. 187) más LRMR2B8LC (+ alotipo de región constante kappa (Km(3) (alelo 1 ))) (SEC ID NO. 201 ) HE2B8-3 = LRMR2B8HC (+ Alotipo de la región constante de lgG1 (G1 m(3) (alelo 1 )) (SEC ID NO. 191 ) más LR2B8LC (+ alotipo de región constante kappa (Km(3) (alelo 1 ))) (SEC ID NO. 197) HE2B8-4 = LRMR2B8HC (+ Alotipo de la región constante de lgG1 (G1 m(3) (alelo 1 )) (SEC ID NO. 191 ) más LRMR2B8LC (+ alotipo de región constante kappa (Km(3) (alelo 1))) (SEC ID NO. 201) Las cadenas liviana y pesada se co-transfectaron en células HEK293E adaptadas a la suspensión de XOMA desarrolladas en medio IS293 (Irvine Scientific, Irvine, CA) utilizando matraces de agitación de 2 litros. Después de 24 horas en los matraces de agitación, 200 mi de células transfectadas se centrifugaron, se resuspendieron en 40 mi de medio fresco y se transfirieron a los matraces Integra (Wilson Wolf Manufacturing Inc., MN) para producción. Después de la incubación durante siete días, la suspensiones celulares se removieron de los matraces Integra, se centrifugaron y los sobrenadantes el cultivo se retuvieron. Los anticuerpos en los sobrenadantes del cultivo se purificaron sobre columnas de espin de la proteína A (Pro-Chem), se dializaron contra PBS, se concentraron y se filtraron estéril. b. Anticuerpos SUPERHUMANIZADOS™ El ADNc de la Hu2B8_Hv5-51.1 de longitud completa + alotipo de dominio constante de lgG1 humano (G1m(3)) se clonó en pEE6,4 (Lonza Biologics, Berkshire, UK) utilizando los sitios de restricción HindIII y EcoRI. La región variable Hu2B8_Kv1-39.1 de longitud completa + el ADNc de dominio constante kappa humano y la región variable Hu2B8_Kv3-15.1 de longitud completa + el ADNc de dominio constante de kappa humano constante se clonaron cada uno de ellos en pEE14,4 (Lonza Biologics) utilizando los sitios de restricción HindIII y EcoRI. El promotor hCMV-MIE + Hu2B8_Hv5-51.1 de longitud completa + alotipo de dominio constante de lgG1 humano (G1m(3)) ADNc + fragmento SV40 poli A (in pEE6,4) se removió por digestión de Notl/Sall y se insertó en el vector pEE14,4 de cadena kappa a través de los sitios Notl/Sall, creando de este modo 2 vectores de expresión diferentes que expresan cada uno en forma simultánea la cadena pesada y liviana para producir los siguientes anticuerpos: sh2B8-9 (G1 m(3)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ Alotipo de región constante de lgG1 (G1 m(3)) (alelo 2)) (SEC ID NO. 210) más hu2B8 Kv 1-39.1 (+ alotipo de región constante kappa (Km(3) (alelo 2))) (SEC ID NO: 177) sh2B8-12 (G1m(3)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ Alotipo de región constante de lgG1 (G1 m(3)) (alelo 2)) (SEC ID NO. 210) más hu2B8 Kv 3-15.1 (+ alotipo de región constante kappa (Km(3) (alelo 2))) (SEC ID No. 181 ) Las secuencias de ácido nucleicos que codifican y las secuencias de proteínas que definen el alotipo de la región constante pesada de lgG1 humana G1 m(3) (alelo 2) y cada una de las secuencias de cadena pesada de longitud completa se establecen a continuación. Las secuencias de cadena liviana fueron las mismas que las descriptas en el Ejemplo 12. (1) Secuencia de ácido nucleico que codifica el alotipo de la región constante de cadena pesada de lgG1 humana (G1 m(3)) (alelo 2) (SEC ID NO. 207) 1 cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 61 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 121 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 181 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 241 acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca 301 aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 361 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 421 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 481 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 541 gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 601 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaag accatctcca 661 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga 721 tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 781 ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 841 tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 901 agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 961 agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga (2) Secuencia de proteína que define el alotipo de la región constante de cadena pesada de lqG1 humana (G1 m(3)) (alelo 1 o 2) (SEC ID NO. 208). El primer aminoácido deriva de la traducción del último nucleótido de la región variable y el inicio de los dos nucleótidos de la secuencia de cadena pesada de lgG1. 1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss 61 glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep kscdkthtcp pcpapellgg 121 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn 181 styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka Ipapiektis kakgqprepq vytlppsree 241 mtknqvsltc Ivkgfypsdi avewesngqp ennykttppv Idsdgsffly skltvdksrw 301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk (3) Secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv5-51 .1 humanizada que contiene la cadena de longitud completa y el alotipo de la región constante de cadena pesada de lgG1 humana G1 m(3) (alelo 2) (secuencia señal subrayada) (SEC ID NO. 209) 1 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga agaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1 141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga (4) Secuencia de proteína que define la Hu2B8 Hv5-51 .1 humanizada que contiene la cadena pesada de longitud completa y el alotipo de la región constante de cadena pesada de lgG1 humana G1 m(3) (alelo 2) (sin la secuencia señal) (SEC ID NO. 210) 1 evqlvqsgae vkkpgeslki sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 61 npsfqgqvti sadksistay Iqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkrvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsreemt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk Itvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk Cada vector de expresión dual se transfectó en células 293T para expresión transitoria utilizando DMEM 10% suero bovino fetal. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se lavaron y luego se reemplazaron con un medio libre de suero, IS GRO™ (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) que contiene L-glutamina 4mM. El sobrenadante se cosechó diariamente y se reemplazó con medio fresco durante 10 días. Los sobrenadantes de cultivo se centrifugaron, se filtraron (0,45pm) y se concentraron 10-100 veces. Los anticuerpos se purificaron sobre resina ProSep vA (Millipore), se dializaron contra PBS, se concentraron y se filtraron estéril.

Ejemplo 14 - Características de unión de las variantes de 2B8 humanizadas Los anticuerpos humanizados producidos en el Ejemplo 13 se caracterizaron por su capacidad de unirse al FCHh y las proteínas de FCH recombinantes producidas en el Ejemplo 3. Los anticuerpos se analizaron por resonancia de plasmón superficial utilizando un instrumento BIAcore T100 para evaluar la capacidad de unirse al FCHh y las proteínas de fusión mencionadas en el Ejemplo 3. Cada anticuerpo se inmovilizó sobre un chip sensor CM5 de dextrano carboximetilado (BIAcore, Catálogo No. BR-1006-68) por acoplamiento de amina (BIAcore, Catálogo No. BR-1000-50) utilizando un protocolo de acoplamiento estándar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los análisis se llevaron a cabo a 25°C utilizando PBS (GIBCO, Catálogo No. 14040-133) que contiene 0,05% de tensioactivo P20 (BIAcore, Catálogo No. R-1000-54), 2 mg/ml de BSA (EMD, Catálogo No. 2930) y 10 mg/ml de sal de CM-dextrano de sodio (Fluka, Catálogo No. 86524) como buffer de corrida. El sobrenadante que contiene diferentes proteínas de fusión de FCH o el sobrenadante de las células transfectadas con el vector vacío se inyectaron sobre cada anticuerpo a una velocidad de flujo de 30 µ?/min durante 3 minutos. La unión resultante se determinó como unidades de resonancia (UR) sobre 30 segundos de línea base después del final de la inyección. La unión se comparó con el FCH humano (R&D Systems, Catálogo No. 294-HGN-025) diluido en buffer de corrida. La unión no específica se monitoreó comparando la unión con una superficie control. Los resultados se resumen en la Tabla 17. TABLA 17 . Anticuerpo rFCHh (R&D rFCHr (R&D Quimera rhr Quimera rhr Quimera rhr Systems) Systems) (495-585) (507-585) (499-556) 2B8 Si No Si Si Si HE2B8-1 Si No Si Si Si HE2B8-2 Si No Si Si Si HE2B8-3 Si No Si Si Si HE2B8-4 Si No Si Si Si sh2B8-9 Si No Si Si Si (G1 m(3)) sh2B8-12 Si No Si Si Si (G1 m(3)) Los resultados en la Tabla 17 muestran que cada uno de los anticuerpos basados en 2B8 humanizados se unen al FCHrh y a las tres quimeras ratón-humano-ratón.

Ejemplo 15 - Afinidades de unión de las variantes de 2B8 humanizadas Las afinidades de unión y la cinética de interacción de los anticuerpos mencionados en la Tabla 15 se midieron por resonancia de plasmón superficial.

Las inmunoglobulinas anti-humanas de ratón (Jackson ImmunoResearch Labs, 209-005-098) se inmovilizaron sobre chips sensores CM4 de dextrano carboximetilado (BIAcore, Catálogo No. BR-1006-68) mediante acoplamiento de amina (BIAcore, Catálogo No. BR-1000-50) utilizando un protocolo de acoplamiento estándar de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los análisis se llevaron a cabo a 25°C utilizando PBS (GIBCO, Catálogo No. 14040-133) que contiene 0,05% de tensioactivo P20 (BIAcore, Catálogo No. BR-1000-54), 2 mg/ml de BSA (EMD, Catálogo No. 2930). Los anticuerpos se capturaron sobre una célula de flujo individual a una velocidad de flujo de 10 µ?/min. El tiempo de inyección fue variable para cada anticuerpo para dar aproximadamente 20 UR de anticuerpo capturado para cada ciclo. El buffer o FCH (R&D Systems, Catálogo No. 294-HGN-025) diluido en buffer de corrida se inyectó en forma consecutiva sobre una superficie de referencia (sin anticuerpo capturado) y la superficie activa (anticuerpo a ser ensayado) durante minutos a 60 µ?/min. La fase de disociación se monitoreó durante 15 o 90 minutos, dependiendo de la concentración. La superficie luego se regeneró con Glicina 10 mM-HCI, pH 2,0 (BIAcore, Catálogo No. BR-1003-55) inyectado durante 3 minutos a una velocidad de flujo de 60 µ?/min antes de iniciarse otro ciclo. Las concentraciones de FCH ensayadas fueron 0,46 nM y 7,5 nM. Los parámetros cinéticos se determinaron utilizando la función cinética del software BIAevalutation™ con sustracción de referencia. Los parámetros cinéticos para cada anticuerpo, ka (constante de velocidad de asociación), kd (constante de velocidad de disociación) y KD (constante de disociación de equilibrio) se resumen en la Tabla 18.

TABLA 18 Estos datos muestran que los anticuerpos humanizados tienen velocidades de asociación rápidas (ka), velocidades de disociación muy lentas (kd), y afinidades muy altas (KD). En particular, los anticuerpos tienen afinidades que varían desde 2,0 hasta 12 pM.

Ejemplo 16 - Comparación de afinidades de unión a 25°C y 37 C Las afinidades de unión y la cinética de interacción de los anticuerpos HE2B8-4, sh2B8-9, sh2B8-12, y 2B8 murino se midieron por resonancia de plasmón superficial en diferentes condiciones.

Las inmunoglobulinas anti-humanas de ratón (Jackson ImmunoResearch Labs, 209-005-098) se inmovilizaron sobre chips sensores CM4 de dextrano carboximetilado (BIAcore, Catálogo No. BR-1006-68) mediante acoplamiento de amina (BIAcore, Catálogo No. BR-1000-50) utilizando un protocolo de acoplamiento estándar de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. En el caso de las mediciones de 25°C para sh2b8-9 y sh2B8-12, se utilizó un chip sensor CM5 (BIAcore, Catálogo No. BR-1006-68). Los análisis se llevaron a cabo a 25°C utilizando PBS (GIBCO, Catálogo No. 14040-133) que contiene 0,05% de tensioactivo P20 (BIAcore, Catálogo No. BR-1000-54), 2 mg/ml de BSA (EMD, Catálogo No. 2930) como buffer de corrida. Los anticuerpos se capturaron sobre una célula de flujo individual a una velocidad de flujo de 10 µ?/min. El tiempo de inyección fue variable para cada anticuerpo para dar aproximadamente 20 UR de anticuerpo capturado para cada ciclo. El buffer o FCH (R&D Systems, Catálogo No. 294-HGN-025) diluido en buffer de corrida se inyectó en forma consecutiva sobre una superficie de referencia (sin anticuerpo capturado) y la superficie activa (anticuerpo a ser ensayado) durante minutos a 60 µ?/min. La fase de disociación se monitoreó durante 15 o 90 minutos, dependiendo de la concentración. La superficie de los chips sensores de las inmunoglobulinas anti-humanas de ratón luego se regeneró con Glicina 10 mM-HCI, pH 2,0 (BIAcore, Catálogo No. BR-1003-54) inyectado durante 3 minutos a una velocidad de flujo de 60 µ?/min antes de iniciarse otro ciclo. La superficie de los chips sensores de inmunoglobulinas antiratón de conejo se regeneró con Glicina 10 mM-HCI, pH 2,0 (BIAcore, Catálogo No. BR- 003-54) inyectado durante 3 minutos a una velocidad de flujo de 60 µ?/min antes de iniciarse otro ciclo. Las concentraciones de FCH ensayadas fueron 0,46 nM y 7,5 nM.

Los parámetros cinéticos se determinaron utilizando la función cinética del software BIAevalutation™ con sustracción de referencia. Los parámetros cinéticos para cada anticuerpo, ka (constante de velocidad de asociación), kd (constante de velocidad de disociación) y KD (constante de disociación de equilibrio) se resumen en la Tabla 19.

TABLA 19 Como se esperaba, las constantes de velocidad de asociación aumentaron con un incremento en la temperatura. Sorprendentemente, las constantes de disociación no cambiaron significativamente con una incremento correspondiente en la temperatura. En consecuencia las constantes de disociación de equilibrio total (KD) fueron aproximadamente 1 ,4 a 3 veces más pequeñas (afinidad más elevada) a temperatura fisiológica (37° C).

Ejemplo 17 - Actividad de neutralización de las variantes de 2B8 humanizadas Los anticuerpos descriptos en el Ejemplo 14 se caracterizaron por su capacidad (a) de inhibir la unión del FCHh al c-Met, y (b) inhibir la incorporación de BrdU estimulada por FCH en células 4MBr-5. El ensayo de inhibición de unión del FCH-Met (Ensayo de Neutralización) se llevó a cabo según se describe a continuación. Los anticuerpos se ensayaron por ELISA para su capacidad de inhibir la unión del FCHh al c-Met. Específicamente, las placas de 96 pocilios Wallac de ensayo Wallac DELFIA (Wallac Inc., Catálogo No. AAAND-0001 ) se recubrieron con 100 µ? de 6,25 pg/ml de FCH (R&D Systems, Catálogo No. 294-HGN-025) en buffer de recubrimiento de carbonato (15 mM de Na2C03 y 34 mM de NaHC03, pH 9,0) durante 16 horas a 4°C. Las placas luego se bloquearon con 200 µ? de 5% de leche en polvo descremada en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos se prepararon en una placa separada agregando concentraciones en aumento de los anticuerpos bajo investigación (0,033-250nM, dilución en serie 2 veces) hasta c-Met 2nM biotinilado en 5% de leche en polvo en PBS. El c-Met (R&D Systems, Catálogo No. 358-MT/CF) es biotinilado de acuerdo con la instrucción del fabricante en una relación de 10:1 biotin y c-Met (Pierce, Catálogo No. 21335). Se transfirieron 100 µ? de muestra por pocilio a la placa de ensayo y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas de ensayo luego se lavaron 3 veces con PBS-0.1 % de Tween 20, y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con estreptavidina Eu-marcada (Wallac, Catálogo No. 1244-360) diluida 1 : 1000 en buffer de ensayo DELFIA (Wallac, Catálogo No. 4002-0010), Las placas resultantes se lavaron 3 veces con solución de lavado DELFIA (Wallac, Catálogo No. 4010-0010), y se incubaron con 100 µ?/pocillo de solución de mejoramiento DELFIA (Wallac #4001 -0010) durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitación. Las placas se leyeron en un instrumento VictorV (Perkin Elmer) utilizando el método Europium. Los valores de IC50 se calcularon utilizando Prism. Los valores de IC50 se obtuvieron como se muestra en la Tabla 20. TABLA 20 Estos resultados de la Tabla 20 muestran que los anticuerpos humanizados ensayados en forma eficiente neutralizan la unión del FCH al c-Met.

Los anticuerpos en la Tabla 17 también se ensayaron en el ensayo de proliferación celular descripto en el Ejemplo 7(b). Los resultados se resumen a continuación en la Tabla 21. TABLA 21 Anticuerpo IC50 (nM) SD 2B8 0,86 0,35 HE2B8-1 0,47 0.15 HE2B8-2 0,66 0.13 HE2B8-3 0,55 0,28 HE2B8-4 0,58 0,26 sh2B8-9 (G1m(3)) 0,52 0.11 sh2B8-12 (G1 m(3)) 0,81 0,22 Los resultados de la Tabla 21 muestran que todos los anticuerpos humanizados ensayados inhiben la proliferación inducida por FCH de células 4MBr-5.

Ejemplo 18 - Actividad anti-dispersión de las variantes de 2B8 humanizadas Los anticuerpos en la Tabla 17 se ensayaron en el ensayo anti-dispersión descripto en el Ejemplo 8. Los resultados se resumen a continuación en la Tabla 22. TABLA 22 - Sin inhibición +++ Inhibición casi completa, muy fuerte ++ Inhibición fuerte + Inhibición detectable Los resultados en la Tabla 22 muestran que todos los anticuerpos humanizados ensayados inhibieron la dispersión inducida por FCH en el mismo grado que el anticuerpo monoclonal 2B8 murino.

Ejemplo 19 - Inhibición de fosforilación de c-Met estimulada por el FCH Los anticuerpos en la Tabla 17 se ensayaron en el ensayo de fosforilación de c-Met descripto en el Ejemplo 9. Los resultados se resumen a continuación en la Tabla 23.

TABLA 23 Los resultados en la Tabla 23 muestran que todos los anticuerpos humanizados ensayados son potentes inhibidores de la fosforilación de c-Met inducida por FCH en células PC-3.

Ejemplo 20 - Inhibición del tumor en modelo de xenoinjerto U87MG La capacidad de los anticuerpos monoclonales murinos de la invención de inhibir el desarrollo del tumor se ensayó en un modelo xenoinjerto U87MG. Las células U87MG (ATCC) se expandieron en el cultivo a 37°C en una atmósfera que contiene 5% de CO2 y 95% de aire, utilizando un medio que comprende medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 10% de suero bovino. fetal, 100 unidades/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina. Las células se cultivaron y se mantuvieron separando las células de la pared de la bandeja de cultivo utilizando tripsina-EDTA. Las células casi confluentes se recolectaron por tripsinización y luego 5x106 células en 50% de Matrigel (BD Biosciences; catálogo no. 356237) se inyectaron por vía subcutánea en el área dorsal superior entre las costillas del hombro de ratones ICR SCID hembras de 7 semanas de vida (Taconic Labs). Los diámetros largos (L) y los cortos (W) de los tumores se midieron con un calibre. El volumen del tumor (vol.) se calculó como: Volumen (mm3) = L * W2 / 2. Cuando los tumores se desarrollaron hasta aproximadamente 200 mm3, los ratones que portaban el tumor se aleatorizaron en 5 grupos de 10 ratones cada uno. Un grupo recibió PBS y un grupo recibió control de IgG humana. Cada uno de los otros 4 grupos recibió uno de los anticuerpos humanizados (HE2B8-1 , HE2B8-2, HE2B8-3, y HE2B8-4). Todos los anticuerpos se dosificaron a 0,25 mg/kg por peso corporal, dos veces por semana, mediante inyecciones intra-peritoneales de 5 dosis. Los volúmenes de los tumores y los pesos corporales de los ratones se registraron dos veces por semana. La inhibición del desarrollo del tumor se analizó utilizando el ensayo T de Student. Los anticuerpos ensayados fueron activos in vivo. Hubo una inhibición del desarrollo del tumor en 57% para HE2B8-1 con un valor p de 0,02, inhibición del crecimiento del tumor en 61 % para HE2B8-2 con un valor p de 0,02, inhibición del crecimiento del tumor en 85% para HE2B8-3, con un valor p de 0,0004, e inhibición del crecimiento del tumor en 74% para HE2B8-4 con un valor p de 0,001 . No se observó pérdida de peso corporal significativa. Un estudio subsiguiente se llevó a cabo según se describió anteriormente en ratones desnudos NCR hembras (Taconic Labs) que portan tumores U87MG inoculados en el flanco. Cada grupo (10 ratones cada uno) recibió uno de los siguientes tratamientos a 0,5 mg/kg: control vehicular PBS, control hulgG, HE2B8-4, o sh2B8-9. El tratamiento fue intra-peritoneal dos veces a la semana durante un mínimo de 5 semanas. Cada grupo de tratamiento mostró una regresión del tumor similar con inhibición del crecimiento del tumor de 1 13% para sh2B8-9 y 1 15% para HE2B8-4, y un retardo del crecimiento del tumor mínimo de 30 días. Ambos tratamientos fueron bien tolerados sin pérdida de peso corporal significativa. La invención puede estar incluida en otras formas específicas sin apartarse del espíritu o las características esenciales de la misma. Las realizaciones anteriores se consideran, por lo tanto a todos los fines ilustrativas más que limitantes de la invención descripta en la presente. El alcance de la invención se indica, de este modo, con las reivindicaciones adjuntas más que por la descripción anterior, y todos los cambios que están dentro del significado y rango de equivalencia de las reivindicaciones están dentro de la misma.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de unión aislada que se une al factor de crecimiento de hepatocitos (FCH) humano, que comprende una cadena ligera de inmunoglobulina y una cadena pesada de inmunoglobulina seleccionadas del grupo que consiste de: (a) una cadena ligera de inmunoglobulina de SEC ID NO. 177 (Hu2B8 Kv1-39.1 + alotipo constante de kappa (Km(3) (alelo 2)), y una cadena pesada de inmunoglobulina de SEC ID NO. 163 (Hu2B8 Hv1f.1 + alotipo constante de lgG1 (G1m(17,1)); (b) una cadena ligera de inmunoglobulina de SEC ID NO. 177 (Hu2B8 Kv1-39.1 + alotipo constante de kappa (Km(3) (alelo 2)), y una cadena pesada de inmunoglobulina de SEC ID NO. 167 (Hu2B8 Hv5a.1 + alotipo constante de lgG1 (G1 m(17,1)); (c) una cadena ligera inmunoglobulina de SEC ID NO. 177 (Hu2B8 Kv1 -39.1 + alotipo constante de kappa (Km(3) (alelo 2)), y una cadena pesada de inmunoglobulina de SEC ID NO. 171 (Hu2B8 Hv5-51.1 + alotipo constante de lgG1 (G1 m(17,1 )); (d) una cadena ligera inmunoglobulina de SEC ID NO. 177 (Hu2B8 Kv1-39.1 + alotipo constante de kappa (Km(3) (alelo 2)), y una cadena pesada de inmunoglobulina de SEC ID NO. 210 (Hu2B8 Hv5-51.1 + alotipo constante de lgG1 (G1m(3)) (alelo 2)); (e) una cadena ligera inmunoglobulina de SEC ID NO. 181 (Hu2B8 Kv3-15.1 + alotipo constante de kappa (Km(3) (alelo 2)), y una cadena pesada de inmunoglobulina de SEC ID NO. 163 (Hu2B8 Hv1f.1 + alotipo constante de lgG1 (G1 m(17,1)); (f) una cadena ligera inmunoglobulina de SEC ID NO. 181 (Hu2B8 Kv3-15.1 + alotipo constante de kappa (Km(3) (alelo 2)), y una cadena pesada de inmunoglobulina de SEC ID NO. 167 (Hu2B8 Hv5a.1 + alotipo constante de lgG1 (G1 m(17,1)); (g) una cadena ligera inmunoglobulina de SEC ID NO. 181 (Hu2B8 Kv3-15.1 + alotipo constante de kappa (Km(3) (alelo 2)), y una cadena pesada de inmunoglobulina de SEC ID NO. 171 (Hu2B8 Hv5-51.1 + alotipo constante de lgG1 (G1m(17,1)); and (h) una cadena ligera inmunoglobulina de SEC ID NO. 181 (Hu2B8 Kv3-15.1 + alotipo constante de kappa (Km(3) (alelo 2)), y una cadena pesada de inmunoglobulina de SEC ID NO. 210 (Hu2B8 Hv5-51.1 + alotipo constante de lgG1 (G1 m(3) (alelo 2)).

2. La proteína de unión de la reivindicación 1 , en donde la proteína de unión es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de proteína que se une al antígeno del mismo.

3. Un método para inhibir o reducir la proliferación de una célula tumoral in vitro que comprende exponer a la célula a una cantidad efectiva de la proteína de unión de la reivindicación 1 , para inhibir o reducir la proliferación de la célula tumoral.

4. El uso de la proteína de unión de la reivindicación 1 para elaborar un medicamento útil para inhibir o reducir el crecimiento de un tumor en un mamífero.

5. El uso de la proteína de unión de la reivindicación 1 para elaborar un medicamento útil para tratar un tumor en un mamífero.

6. Una proteína de unión aislada que se une al factor de crecimiento de hepatocitos (FCH) humano, que comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina seleccionadas del grupo que consiste de: (a) (i) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRu que comprende la secuencia SEC ID NO. 8 (1A3), una CDRL2 que comprende la secuencia SEC ID NO. 9 (1A3), y una CDRL3 que comprende la secuencia SEC ID NO. 10 (1A3); y (ii) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRm que comprende la secuencia SEC ID NO. 5 (1A3), una CDRH2 que comprende la secuencia SEC ID NO. 6 (1A3), y una CDRH3 que comprende la secuencia SEC ID NO. 7 (1A3); (b) (i) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRLi que comprende la secuencia SEC ID NO. 18 (2B8), una CDR|_2 que comprende la secuencia SEC ID NO. 19 (2B8), y una CDRL3 que comprende la secuencia SEC ID NO. 20 (2B8); y (ii) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRHi que comprende la secuencia SEC ID NO. 15 (2B8), una CDRH2 que comprende la secuencia SEC ID NO. 16 (2B8), SEC ID NO. 202 (Hu2B8 Hv1f.1), o SEC ID NO. 203 (Hu2B8 Hv5a.1 y Hu2B8 Hv5-51.1 ), y una CDRH3 que comprende la secuencia SEC ID NO. 17 (2B8); (c) (i) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRu que comprende la secuencia SEC ID NO. 28 (2F8), una CDR|_2 que comprende la secuencia SEC ID NO. 29 (2F8), y una CDRL3 que comprende la secuencia SEC ID NO. 30 (2F8); y (ii) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRHi que comprende la secuencia SEC ID NO. 25 (2F8), una CDRH2 que comprende la secuencia SEC ID NO. 26 (2F8), y una CDRH3 que comprende la secuencia SEC ID NO. 27 (2F8); (d) (i) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRu que comprende la secuencia SEC ID NO. 38 (3B6), una CDR|_2 que comprende la secuencia SEC ID NO. 39 (3B6), y una CDRL3 que comprende la secuencia SEC ID NO. 40 (3B6); y (ii) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRHi que comprende la secuencia SEC ID NO. 35 (3B6), una CDRH2 que comprende la secuencia SEC ID NO. 36 (3B6), y una CDRH3 que comprende la secuencia SEC ID NO. 37 (3B6); (e) (i) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRu que comprende la secuencia SEC ID NO. 48 (3D11 ), una CDR|_2 que comprende la secuencia SEC ID NO. 49 (3D11), y una CDRL3 que comprende la secuencia SEC ID NO. 50 (3D11); y (ii) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRm que comprende la secuencia SEC ID NO. 45 (3D11 ), una CDRH2 que comprende la secuencia SEC ID NO. 46 (3D11), y una CDRH3 que comprende la secuencia SEC ID NO. 47 (3D11); (f) (i) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRU que comprende la secuencia SEC ID NO. 58 (1 D3), una CDRL2 que comprende la secuencia SEC ID NO. 59 (1 D3), y una CDRL3 que comprende la secuencia SEC ID NO. 60 (1 D3); y (ii) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRHi que comprende la secuencia SEC ID NO. 55 (1 D3), una CDRH2 que comprende la secuencia SEC ID NO. 56 (1 D3), y una CDRH3 que comprende la secuencia SEC ID NO. 57 (1 D3); (g) (i) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRU que comprende la secuencia SEC ID NO. 68 (1 F3), una CDR|_2 que comprende la secuencia SEC ID NO. 69 (1 F3), y una CDRL3 que comprende la secuencia SEC ID NO. 70 (1 F3); y (ii) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRHi que comprende la secuencia SEC ID NO. 65 (1 F3), una CDRH2 que comprende la secuencia SEC ID NO. 66 (1 F3), y una CDRH3 que comprende la secuencia SEC ID NO. 67 (1 F3); y (h) (i) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRU que comprende la secuencia SEC ID NO. 78 (3A12), una CDRL2 que comprende la secuencia SEC ID NO. 79 (3A12), y una CDRL3 que comprende la secuencia SEC ID NO. 80 (3A12); y (ii) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRHi que comprende la secuencia SEC ID NO. 75 (3A12), una CDRH2 que comprende la secuencia SEC ID NO. 76 (3A12), y una CDRH3 que comprende la secuencia SEC ID NO. 77 (3A12).

7. La proteína de unión de la reivindicación 6, en donde las secuencias CDR están interpuestas entre secuencias de regiones de marco humanas o humanizadas. 8. Una proteína de unión aislada que se une al factor de crecimiento de hepatocitos (FCH) humano, que comprende una región variable de cadena ligera de ¡nmunoglobulina y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina seleccionadas del grupo que consiste de: (a) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21-127 de SEC ID NO. 4 (1A3), y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 20-141 de SEC ID NO. 2 (1A3); (b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21-127 de SEC ID NO. 14 (2B8), y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 20-137 de SEC ID NO. 12 (2B8); (c) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 20-131 de SEC ID NO. 24 (2F8), y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 20-137 de SEC ID NO. 22 (2F8); (d) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 23-129 de SEC ID NO. 34 (3B6), y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 20-139 de SEC ID NO. 32 (3B6); (e) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 23-128 de SEQ ID NO. 44 (3D11), y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 20-132 de SEQ ID NO. 42 (3D11 ); (f) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 -127 de SEC ID NO. 54 (1 D3), y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 20-141 de SEC ID NO. 52 (1 D3); (g) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 -127 de SEC ID NO. 64 (1 F3), y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 20-141 de SEC ID NO. 62 (1 F3); (h) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21-127 de SEC ID NO. 74 (3A12), y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 20-141 de SEC ID NO. 72 (3A12); (i) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO. 173 (región variable de cadena ligera de Hu2B8 Kv1-39.1 ), y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO. 159 (región variable de cadena pesada de Hu2B8 Hv1f.1); (j) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO. 173 (región variable de cadena ligera de Hu2B8 Kv1-39.1), y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO. 165 (región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv5a.1 ); (k) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO. 173 (región variable de cadena ligera de Hu2B8 Kv1-39.1 ), y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO. 169 (región variable de cadena pesada de Hu2B8 Hv5-51.1 );

(I) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO. 179 (región variable de cadena ligera de Hu2B8 Kv3-15.1), y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO. 159 (región variable de cadena pesada de Hu2B8 Hv1f.1 ); (m) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO. 179 (región variable de cadena ligera de Hu2B8 Kv3-15.1 ), y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO. 165 (región variable de cadena pesada de Hu2B8 Hv5a.1 ); y (n) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO. 179 (región variable de cadena ligera de Hu2B8 Kv3-15.1), y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO. 169 (región variable de cadena pesada de Hu2B8 Hv5-51.1 )

9. La proteína de unión de la reivindicación 8, en donde la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina comprende la secuencia de aminoácidos de residuos 21-127 de SEC ID NO. 14 (2B8), y la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 20-137 de SEC ID NO. 12 (2B8).

10. La proteína de unión de la reivindicación 8, en donde la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO. 173 (región variable de cadena ligera de Hu2B8 Kv1-39.1), y la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO. 169 (región variable de cadena pesada de Hu2B8 Hv5-51.1).

1 1. La proteína de unión de la reivindicación 1 , en donde la cadena ligera de inmunoglobulina comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO. 177 (Hu2B8 Kv1-39.1 + alotipo constante de kappa (Km(3) (alelo 2)), y la cadena pesada de inmunoglobulina comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO. 171 (Hu2B8 Hv5-51.1 + alotipo constante de lgG1 (G1m(17,1)).

12. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina según la reivindicación 6.

13. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina según la reivindicación 6.

14. Un vector de expresión que contiene la secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 12.

15. Un vector de expresión que contiene la secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 13.

16. Una célula hospedero que comprende al menos un vector de expresión que expresa una proteína de la reivindicación 6.

17. Un método de producir una proteína de unión, el método comprende: (a) desarrollar la célula hospedero de la reivindicación 16 bajo condiciones tales que la célula hospedero exprese una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina; y (b) cosechar la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina.

18. El método de la reivindicación 17, en donde, después del paso (b), la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina se une covalentemente a una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina, de modo que las regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada juntas unen al FCH humano

19. Un método de producir una proteína de unión, el método comprende: (a) desarrollar la célula hospedero de la reivindicación 16 bajo condiciones tales que la célula hospedero exprese una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina; y (b) cosechar la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina.

20. El método de la reivindicación 19, en donde, después del paso (b), la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina se une covalentemente a una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina, de modo que las regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada juntas unen al FCH humano.