JP2020522266A - 非対称なｃｈ２−ｃｈ３領域の変異を有する、操作された多重特異性抗体及び他の多量体タンパク質 - Google Patents

Abstract

本発明は、非対称なＣＨ２−ＣＨ３領域の変異を有する、操作された多重特異性抗体及び他の多量体タンパク質、並びにそれらを製造及び使用する方法に関する。

Description

本発明は、非対称なＣＨ２−ＣＨ３領域の変異を有する、操作された多重特異性抗体及び他の多量体タンパク質、並びにそれらを製造及び使用する方法に関する。

（配列表）
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表を含み、その全容を参照により本明細書に援用する。ＡＳＣＩＩテキストファイルは、２０１８年５月２９日に作成され、ファイル名はＪＢＩ５１２４ＷＯＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、そのサイズは１６４キロバイトである。

治療用生物製剤プログラムは、二重標的化を行うための二重特異性抗体、細胞を再方向付けする試み、及び免疫チェックポイントの調節に益々その方向性が向けられつつある。実際に、多くの二重特異性治療薬で現在臨床試験が行われている（Ｊａｃｈｉｍｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ．２０１４（４）：３３１−４３）。二重特異性抗体の開発は、上流及び下流プロセス、すなわち、再現可能かつ大規模化が可能な方法で高力価で純粋な生成物を生成できること、及び、過剰な親分子又は中間分子から二重特異性分子を分離することの両方の難しさによって制限されている。ＩｇＧ重鎖又は半分子を特異的にペアリングするための方法が開発されており、ノブインホール、制御されたＦａｂアーム交換、ＣｒｏｓｓＭＡｂ、並びに共通の軽鎖及び直交性Ｆａｂ界面などがある。Ｆｖ系分子（すなわち、ＢｉＴＥ、ダイアボディ）及び非ＩｇＧ系スカフォールド（すなわち、ＤＡＲＰｉｎ、アドネクチン、ファイノマー、及びセンチリン）の製造は、これらの分子を治療薬として開発するうえで関心が高まっている。

Ｆｖのみ又は代替的なスカフォールド系分子の短所として、尿***により、又はＦｃＲｎによってリサイクルされないためにリソソームで分解されることにより、血清中寿命が一般的に短いことがある。したがって、完全なＦｃドメインを有するＩｇＧ系の多重特異性分子は、そのより長い血清中半減期、エフェクター機能を促進する能力、及びアポトーシス経路の誘導のために魅力的である。

二重特異性抗体の精製は、残留する親抗体及び他の中間ｍＡｂ及びＡｂフラグメント分子を除去するために複数の工程が必要とされることから、困難を伴う場合がある。こうした分子は、誘導された二重特異性抗体と同様の生物物理的特性を有し得ることから、クロマトグラフィー法によって容易に分離することはできない。このように精製が困難であることは、二重特異性分子の収率又は純度の低下につながり得る。

したがって、代替的な二重特異性及び多重特異性フォーマット、並びに抗体などの二重特異性及び多重特異性分子を精製するための方法が依然求められている。

本発明は、単離された多重特異性抗体であって、変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ、又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域とを含み、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された多重特異性抗体を提供する。

本発明はまた、単離された多重特異性抗体であって、変異Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と、３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域とを含み、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された多重特異性抗体も提供する。

本発明はまた、単離された多重特異性抗体であって、変異Ｑ３１１Ｋを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と、３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域とを含み、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された多重特異性抗体も提供する。

本発明はまた、単離された多重特異性抗体であって、変異Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と、３０７及び３０９位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域とを含み、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された多重特異性抗体も提供する。

本発明はまた、単離された多重特異性抗体であって、変異Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と、３０７及び３０９位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域とを含み、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された多重特異性抗体も提供する。

本発明はまた、単離された多重特異性抗体であって、変異Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域とを含み、基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された多重特異性抗体も提供する。

本発明はまた、単離された多重特異性抗体であって、変異Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域とを含み、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された多重特異性抗体も提供する。

本発明はまた、単離されたポリヌクレオチドであって、
変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域をコードするポリヌクレオチドを含むか、
変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域とをコードするポリヌクレオチドを含むか、又は
配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、８７、８８又は９１のポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドも提供する。

本発明はまた、ベクターであって、
変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域をコードする単離されたポリヌクレオチド、
配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、８７、８８又は９１のポリヌクレオチド配列を有する、単離されたポリヌクレオチド、
変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域とをコードするポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド、又は
配列番号２７及び４７、それぞれ、
配列番号２８及び４７、それぞれ、
配列番号２９及び４７、それぞれ、
配列番号３０及び４７、それぞれ、
配列番号３１及び４８、それぞれ、
配列番号３２及び４８、それぞれ、
配列番号３３及び４８、それぞれ、
配列番号３４及び４８、それぞれ、
配列番号３５及び４９、それぞれ、
配列番号３６及び４９、それぞれ、
配列番号３７及び４９、それぞれ、
配列番号３８及び４９、それぞれ、
配列番号３９及び５０、それぞれ、
配列番号４０及び５０、それぞれ、
配列番号４１及び５０、それぞれ、
配列番号４２及び５０、それぞれ、
配列番号４３及び５１、それぞれ、
配列番号４４及び５１、それぞれ、
配列番号４５及び５１、それぞれ、
配列番号４６及び５１、それぞれ、
配列番号８７及び８９、それぞれ、
配列番号８７及び９０、それぞれ、
配列番号８８及び８９、それぞれ、
配列番号８８及び９０、それぞれ、
配列番号９２及び８９、それぞれ、又は
配列番号９２及び９０、それぞれ、を有する単離されたポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。

本発明はまた、本発明のベクターを含む宿主細胞も提供する。

本発明はまた、本発明の単離された多重特異性抗体を製造する方法であって、
多重特異性抗体が発現される条件下で本発明の宿主細胞を培養することと、
プロテインＡリガンド親和性クロマトグラフィーを使用して多重特異性抗体を精製することと、を含む、方法も提供する。

本発明はまた、変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１の重鎖と、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２の重鎖とを含む、単離された多重特異性抗体を製造する方法であって、
変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ を有する第１の重鎖と第１の軽鎖とを含む第１の親抗体を与えることと、
３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２の重鎖と第２の軽鎖とを含む第２の親抗体を与えることと、
第１の親抗体と第２の親抗体とを試料中で接触させることと、
試料をインキュベートすることと、
プロテインＡリガンド親和性クロマトグラフィーを使用して多重特異性抗体を精製することとを含む方法も提供する。

本発明はまた、同じアミノ酸配列を有する２個の重鎖又はそのフラグメントと２個の軽鎖又はそのフラグメントとを含む、単離された抗体であって、２個の重鎖が、変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有し、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された抗体も提供する。

本発明はまた、
配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、５２、５３又は５６のＣＨ２−ＣＨ３領域を含む抗体重鎖をコードするか、又は
配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、８７、８８又は９１のポリヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチドも提供する。

本発明はまた、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む多量体タンパク質であって、第１のポリペプチドが、変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域を含み、第２のポリペプチドが、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域を含み、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、多量体タンパク質も提供する。

本発明はまた、本発明の多量体タンパク質を含む医薬組成物も提供する。

本発明はまた、変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域とを含む単離された多量体タンパク質を製造する方法であって、
変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域を含む第１の親タンパク質を与えることと、
３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域を含む第２の親タンパク質を与えることと、
第１の親タンパク質と第２の親タンパク質とを試料中で接触させることと、
試料をインキュベートすることと、
プロテインＡリガンド親和性クロマトグラフィーを使用して多重特異性タンパク質を精製することと、を含む、方法も提供する。

ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインとマウスＩｇＧ２ａのＣＨ２ドメインとの間の、アミノ酸残基３０５〜３１５までのアラインメントを示す。なお、残基の番号付けは、ＥＵインデックスに従う。 ＩｇＧ１のＣＨ２の残基Ｔ３０７、Ｌ３０９、及びＱ３１１（図で下線を付した残基）のＦｃＲｎ又はＺドメイン（Ｚ３４Ｃペプチド）との相互作用を示す。各残基は、ＦｃＲｎ中の残基及びＺドメインと側鎖による相互作用を行った。Ｔ３０７は、ＦｃＲｎのβ２マイクログロブリンドメイン上のＩ１と相互作用した。Ｌ３０９及びＱ３１１Ｒは、ＦｃＲｎ及びＺドメインの両方との相互作用に関与していた（それぞれＬ３０９及びＱ３１１の点線及び実線）。ＩＱＲＴ：配列番号１０２（ＦｃＲｎのβ２個の鎖の一部）；ＬＮＧＥＥＦＭＤＦＤＬＫＱＧＴＷＧＧＤＷＰＥＡ：配列番号１０３（ＦｃＲｎのα鎖の一部）；ＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮ：配列番号１０４（ＩｇＧ１のＣＨ２ドメインの一部）；ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤＣ：配列番号９９。 ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイを用いた、ＦｃＲｎに対する示された各単一特異性抗体とｍＡｂ ＲＳＶ−Ｌとの競合結合の用量反応曲線を示す。グラフは、競合抗体の濃度に対してプロットした最大シグナル（％）を示す。 ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイを用いた、ＦｃＲｎに対する示された各単一特異性又は二重特異性抗体とｍＡｂ ＲＳＶ−Ｌとの競合結合の用量反応曲線を示す。グラフは、競合抗体の濃度に対してプロットした最大シグナル（％）を示す。 ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイを用いた、ＦｃγＲＩに対する示された各単一特異性又は二重特異性抗体とｍＡｂ ＲＳＶ−Ｌとの競合結合の用量反応曲線を示す。グラフは、競合抗体の濃度に対してプロットした最大シグナル（％）を示す。 ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイを用いた、ＦｃγＲＩＩａに対する示された各単一特異性又は二重特異性抗体とｍＡｂ ＲＳＶ−Ｌとの競合結合の用量反応曲線を示す。グラフは、競合抗体の濃度に対してプロットした最大シグナル（％）を示す。 ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイを用いた、ＦｃγＲＩＩｂに対する示された各単一特異性又は二重特異性抗体とｍＡｂ ＲＳＶ−Ｌとの競合結合の用量反応曲線を示す。グラフは、競合抗体の濃度に対してプロットした最大シグナル（％）を示す。 ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイを用いた、ＦｃγＲＩＩＩａに対する示された各単一特異性又は二重特異性抗体とｍＡｂ ＲＳＶ−Ｌとの競合結合の用量反応曲線を示す。グラフは、競合抗体の濃度に対してプロットした最大シグナル（％）を示す。 開発された条件下で二重特異性抗体を親単一特異性ｍＡｂから分離することができることを示す疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）クロマトグラムを示す。 Ｆａｂアーム交換を用いて作製された等モル量の抗体ＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］及びｇｐ１２０−Ｒ及びｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］の混合物の試料のＨＩＣクロマトグラムを示す。 プロテインＡ樹脂からのＦａｂアーム交換を用いて作製された抗体ＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］、ｇｐ１２０−Ｒ及びｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］の混合物の試料の溶出プロファイルを示す。 プロテインＡの溶出ピークのＨＩＣクロマトグラムを示す。 上清中Ｆａｂアーム交換を行ったｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］の試料の溶出プロファイルを示す。 上清中Ｆａｂアーム交換を行ったｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］からの試料のプロテインＡ親和性カラムのｐＨ４．７の溶出液のＨＩＣ分析を示す。 上清中Ｆａｂアーム交換を行ったｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］からの試料のプロテインＡ親和性カラムのｐＨ４．２の溶出液のＨＩＣ分析を示す。 上清中Ｆａｂアーム交換を行ったｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］からの試料のプロテインＡ親和性カラムのｐＨ３．４の溶出液のＨＩＣ分析を示す。 ｐＨ ４．６、４．２及び３．４で溶出する３つの異なるピークを示す、上清中Ｆａｂアーム交換を行ったｂｓＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］の試料のプロテインＡクロマトグラムを示す。 上清中Ｆａｂアーム交換を行ったｂｓＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］からの試料のプロテインＡ親和性カラムのｐＨ４．６の溶出液のＨＩＣ分析を示す。 上清中Ｆａｂアーム交換を行ったｂｓＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］からの試料のプロテインＡ親和性カラムのｐＨ４．２の溶出液のＨＩＣ分析を示す。 上清中Ｆａｂアーム交換を行ったｂｓＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］からの試料のプロテインＡ親和性カラムのｐＨ３．４の溶出液のＨＩＣ分析を示す。 共通軽鎖技術を使用して作製されたｂｓＴＮＦ−［ＴＬＱ］の試料のプロテインＡクロマトグラムを示す。 共通軽鎖技術を使用して作製されたｂｓＴＮＦ−［ＴＬＱ］の試料のプロテインＡ親和性カラムのｐＨ４．７の溶出液のＨＩＣ分析を示す。 共通軽鎖技術を使用して作製されたｂｓＴＮＦ−［ＴＬＱ］の試料のプロテインＡ親和性カラムのｐＨ４．２の溶出液のＨＩＣ分析を示す。 共通軽鎖技術を使用して作製されたｂｓＴＮＦ−［ＴＬＱ］の試料のプロテインＡ親和性カラムのｐＨ３．４の溶出液のＨＩＣ分析を示す。 Ｔｇ３２ヘミ接合体マウスにおける示された抗体の薬物動態分析を示す。グラフは、時間に対してプロットした線形期の初期の時点に対して正規化された各ｍＡｂの濃度を示す。各点は、１群当たり４匹の動物の平均±標準誤差を示す。

本明細書に引用されている特許及び特許出願を含む（但しそれらに限定されない）全ての刊行物は、参照によりそれらの全体が記載されているのと同様に、本明細書に援用される。

本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、限定を意図するものではないと理解すべきである。特に断らない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。

本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の試験を実施するために使用できるが、例示となる材料及び方法を本明細書に記載する。本発明を説明及び特許請求するうえで以下の用語が用いられる。

定義
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容によってそうでない旨が明確に断られない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「細胞」と言った場合には、２個以上の細胞の組み合わせなどが含まれる。

「多量体タンパク質」とは、結合して単一のタンパク質を形成する２個以上の別々のポリペプチド鎖で構成されたタンパク質のことを指す。ポリペプチド鎖同士は、非共有結合により、又は例えばジスルフィド結合を介して共有結合により結合させることができる。

「結合」とは、抗体の抗原との結合、又は多重特異性タンパク質のそのリガンドとの結合など、２個のタンパク質の特異的結合のことを指す。「特異的結合」とは、通常、２個のタンパク質の、約１×１０^−８Ｍ以下、例えば約１×１０^−９Ｍ以下、約１×１０^−１０Ｍ以下、約１×１０^−１１Ｍ以下、又は約１×１０^−１２Ｍ以下の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）での選択的結合を指し、典型的には、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）との結合におけるそのＫ_Ｄより少なくとも１００倍小さいＫ_Ｄでの選択的結合のことを指す。

「結合の低下」とは、変異を有さない親分子の結合と比較した場合に、ＣＨ２−ＣＨ３領域に少なくとも１つの変異を有する本発明の抗体又は多重特異性タンパク質の、プロテインＡリガンドとの結合における測定可能な低下のことを指す。

「結合を調節する」とは、ＣＨ２−ＣＨ３領域に少なくとも１つの変異を有する本発明の抗体又は多重特異性タンパク質の、ＦｃγＲ又はＦｃＲｎとの結合における測定可能な差のことを指す。

「抗原」とは、対象において免疫応答を開始することができるタンパク質又はタンパク質のフラグメントなどの分子のことを指す。

「非対称的安定化変異」とは、第１及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域の異なる位置にあり、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域又は第２のＣＨ２−ＣＨ３領域間のホモ二量体形成よりも第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と第２のＣＨ２−ＣＨ３領域との間のヘテロ二量体形成に有利な（例えば、安定化する）第１のＣＨ２−ＣＨ３領域内及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域内の変異のことを指す。

「異種タンパク質」とは、内因性細胞のＣＨ２−ＣＨ３領域を含むポリペプチドの天然の部分又は一部ではないポリペプチド又はタンパク質のことを指す。

「フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン」（ＦＮ３ドメイン）とは、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞骨格タンパク質、サイトカイン受容体、及び原核細胞酵素を含むタンパク質にしばしば存在するドメインを指す（Ｂｏｒｋ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：８９９０−８９９４，１９９２；Ｍｅｉｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７５：１９１０−１９１８，１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５：１５６５９−１５６６５，１９９０）。代表的なＦＮ３ドメインとしては、ヒトテネイシンＣに存在する１５個の異なるＦＮ３ドメイン、ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）に存在する１５個の異なるＦＮ３ドメイン、及び例えば米国特許第８，２７８，４１９号に記載される非天然の合成ＦＮ３ドメインがある。個々のＦＮ３ドメインは、ドメイン番号及びタンパク質名で呼ばれる（例えばテネイシンの３番目のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、又はフィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０））。ＦＮ３ドメインは、高い特異性及び親和性で抗原に結合するように操作することができる。

「ファイノマー」とは、高い特異性及び親和性で抗原に結合するように操作することができる、ヒトＦｙｎのＳＨ３ドメイン由来の抗原結合タンパク質のことを指す。

「抗体」とは、広義の意味であり、マウス、ウサギ、ヒト、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗原結合フラグメント、単一特異性、二重特異性抗体若しくは多重特異性抗体、二量体、四量体若しくは多量体の抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体、及び必要な特異性を有する抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の他の任意の改変された形態を含む免疫グロブリン分子を含む。「完全長抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に結合した２本の重鎖（ＨＣ）及び２本の軽鎖（ＬＣ）、並びにこれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）から構成される。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ヒンジＣＨ２及びＣＨ３から構成される）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＶＨ及びＶＬは、フレームワーク領域（ＦＲ）に散在している相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に更に区分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４の順序で配列された３個のＣＤＲと４個のＦＲフラグメントとから構成される。

「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗原に結合する抗体中の領域である。ＶＨには３個のＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）が存在し、ＶＬには３個のＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ（Ｗｕ ａｎｄ Ｋａｂａｔ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３２：２１１−２５０，１９７０；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ Ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１−９１７，１９８７）、及びＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ Ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５−７７，２００３）などの様々な表現を用いて定義することができる。異なる表現と可変領域の番号付けとの間の対応については記載されている（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５−７７，２００３；Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０９：６５７−７０，２００１；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース；ウェブリソース，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇを参照）。ＵＣＬ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ ＰＬＣによるａｂＹｓｉｓなどの利用可能なプログラムを使用して、ＣＤＲを表現することができる。本明細書で使用されている「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、及び「ＬＣＤＲ３」という用語は、本明細書において別途記載のない限り、上掲のＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、又はＩＭＧＴにより記載されている方法のいずれかにより定義されるＣＤＲを含む。

免疫グロブリンは、重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じて、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの主要なクラスに割り当てることができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。あらゆる脊椎動物種の抗体軽鎖は、その定常領域のアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なるタイプ、すなわち、カッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの一方に割り当てることができる。

「抗原結合断片」は、元の完全長抗体の抗原結合特性を保持している免疫グロブリン分子の部分を指す。代表的な抗原結合フラグメントとしては、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、２及び／又は３、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、２及び／又は３、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ及びＶＬ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖフラグメント、並びに１個のＶＨドメイン又は１個のＶＬドメインのいずれかからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）がある。ＶＨ及びＶＬドメインは、合成リンカーを介して互いに連結されて、ＶＨ／ＶＬドメインが、分子内で、又はＶＨ及びＶＬドメインが別々の鎖によって発現される場合には分子間で対形成して、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）などの一価の抗原結合部位又はダイアボディを形成する様々な種類の一本鎖抗体の設計を形成することができる。例えば、国際公開第１９９８／４４００１号、同第１９８８／０１６４９号、同第１９９４／１３８０４号、同第１９９２／０１０４７号に記載されている。

「ＣＨ２−ＣＨ３領域」は、ヒト抗体定常ドメインの一部を指し、アミノ酸残基２３１〜４４６（ＥＵインデックスによる残基の番号付け）を含む。ＣＨ２−ＣＨ３領域は、４４７位のＣ末端リシンが欠失していてもよい。

「モノクローナル抗体」は、抗体重鎖からＣ末端リジンを除去するなどの可能な周知の変更を除き、各重鎖及び各軽鎖において単一のアミノ酸組成を有する抗体集団を指す。モノクローナル抗体は通常、１個の抗原性エピトープに特異的に結合するが、二重特異性又は多重特異性モノクローナル抗体は、２つ以上の異なる抗原性エピトープに特異的に結合する。モノクローナル抗体は、抗体集団内で不均一なグリコシル化を有し得る。モノクローナル抗体は、単一特異性若しくは多重特異性、又は一価、二価、若しくは多価であり得る。二重特異性抗体は、モノクローナル抗体という用語に含まれる。

「単離された」とは、組み換え細胞などの分子が産生されるシステムに関係する他の成分から実質的に分離及び／又は精製されている、分子の均質な集団（例えば、合成ポリヌクレオチド又は抗体などのタンパク質）に加えて、少なくとも１つの精製又は単離工程に供されたタンパク質を指す。「単離された抗体」とは、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない抗体のことを指し、より高純度、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の純度にまで単離された抗体を包含する。

「ヒト化抗体」とは、ＣＤＲ配列が非ヒト種に由来し、フレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体を指す。ヒト化抗体は、フレームワーク内に置換を含む可能性があることから、フレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン又はヒト免疫グロブリン生殖系列遺伝子の配列の正確なコピーでなくてもよい。

「ヒト抗体」とは、ヒト対象に投与される場合の免疫応答が最小限であるように最適化された抗体のことを指す。ヒト抗体の可変領域は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。抗体が定常領域又は定常領域の一部を含む場合、当該定常領域もヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。

ヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に「由来する」重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を含む。このような代表的な系としては、ファージ又は哺乳類細胞に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリー、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するマウス又はラットなどの非ヒトトランスジェニック動物がある。「ヒト抗体」は、例えば体細胞変異の導入、フレームワーク又はＣＤＲにおける意図的な置換の導入、並びにヒト以外の動物におけるクローニング及びＶＪＤ組み換えの間に導入されたアミノ酸変化により、ヒトにおいて発現される免疫グロブリン配列と比較した場合に、アミノ酸の相違を通常有する。「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされるアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が通常、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。いくつかの場合では、「ヒト抗体」は、例えばＫｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７−８６，２０００に記載されるヒトフレームワーク配列分析から得られたコンセンサスフレームワーク配列、又は例えばＳｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５−３９６，２０１０及び国際公開第２００９／０８５４６２号に記載される、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーに組み込まれた合成ＨＣＤＲ３を含み得る。ＣＤＲが非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。

「組み換え体」とは、組み換え手段によって調製、発現、作製、又は単離された抗体及びその他のタンパク質を指す。

「多重特異性」とは、２つ以上の異なる抗原、又は同じ抗原内の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する抗体などのタンパク質を指す。多重特異性タンパク質は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー、ｃｈｉｍｐ）、又はＣａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ（コモンマーモセット、ｍａｒｍｏｓｅｔ）などの、他の種（ホモログ）からの同じ抗原に対し交差反応性を有するか、又は、２つ以上の異なる抗原間で共有されたエピトープに結合することができる。

「二重特異性」とは、２つの異なる抗原、又は同じ抗原中の２つの異なるエピトープと特異的に結合する抗体などのタンパク質を指す。二重特異性タンパク質は、他の関連する抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー、ｃｈｉｍｐ）、又はＣａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ（コモンマーモセット、ｍａｒｍｏｓｅｔ）などの他の種（ホモログ）に由来する同じ抗原に対して交差反応性を有するか、又は、２つ以上の異なる抗原間で共有されたエピトープに結合することができる。

「単一特異性」とは、１つの別個の抗原又は別個のエピトープに特異的に結合する抗体などのタンパク質を指す。単一特異性タンパク質は、他の関連する抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー、ｃｈｉｍｐ）、又はＣａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ（コモンマーモセット、ｍａｒｍｏｓｅｔ）などの他の種（ホモログ）に由来する同じ抗原に対して交差反応性を有するか、又は、２つ以上の異なる抗原間で共有されたエピトープに結合することができる。

「ベクター」とは、生物系内で複製可能な、又はそのような系間を移動することができる、ポリヌクレオチドを指す。ベクターポリヌクレオチドは、通常、生物系（例えば、細胞、ウイルス、動物、植物など）及び再構成された生物系におけるこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進する機能を有する、複製起点、ポリアデニル化シグナル、又は選択マーカーなどの要素を含んでいる。

「プロテインＡリガンド親和性クロマトグラフィー」とは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に対するタンパク質ＡリガンドのＩｇＧ結合ドメインの親和性を利用した親和性クロマトグラフィー法を指す。このＦｃ領域は、ヒト又は動物の免疫グロブリン定常ドメインＣＨ２及びＣＨ３、又はこれらと実質的に同様の免疫グロブリンドメインを含む。プロテインＡリガンドには、黄色ブドウ球菌の細胞壁由来の天然プロテインＡ、組み換え法又は合成法によって作製されたプロテインＡ、及びＦｃ領域に結合する能力を保持する変異体が含まれる。実際には、プロテインＡリガンドクロマトグラフィーでは、固体支持体に固定化されたプロテインＡリガンドを使用することを伴う。Ｇａｇｎｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．１５５−１９８，Ｖａｌｉａｔｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，１９９６を参照されたい。固体支持体は、プロテインＡリガンドが付着する非水性マトリックスである。このような周知の支持体としては、アガロース、セファロース、ガラス、シリカ、ポリスチレン、ニトロセルロース、炭、砂、セルロース、及び他の任意の適当な材料が挙げられる。任意の適当な周知の方法を使用して、第２のタンパク質を固体支持体に付着させることができる。固定化されたプロテインＡリガンドを有する、及び有さないこのような固体支持体は、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆ．）、ＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの一部門，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｐａｌｌ（Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｎ．Ｙ．）及びＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓ．）などの多くの商業的供給元から容易に入手可能である。細孔ガラスマトリックスに固定化されたプロテインＡリガンドは、ＰＲＯＳＥＰ（登録商標）Ａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）として市販されている。固相はまた、アガロースベースのマトリックスであってもよい。アガロースマトリックス上に固定化されたプロテインＡリガンドは、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）として市販されている。

「発現ベクター」とは、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの翻訳を指令するために、生物系又は再構成された生物系において利用できるベクターを指す。

「ポリヌクレオチド」とは、糖−リン酸骨格又は他の等価な共有結合化学によって共有結合したヌクレオチド鎖を含む合成分子を指す。ｃＤＮＡは、合成ポリヌクレオチドの典型例である。

「ポリペプチド」又は「タンパク質」とは、ペプチド結合によって連結されてポリペプチドを形成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を指す。５０個未満のアミノ酸からなる小分子ポリペプチドは、「ペプチド」と称され得る。

「変異体」とは、１つ以上の改変、例えば、１つ以上の置換、挿入、又は欠失によって参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドとは異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。

「価数」とは、分子中の抗原に対して特異的な結合部位が明記された数で存在することを指す。そのため、用語「一価」、「二価」、「四価」、及び「六価」はそれぞれ、抗原に対して特異的な結合部位が分子中に１個、２個、４個、及び６個存在することを指す。

「プロテインＡリガンド」とは、天然に存在する、又は改変された黄色ブドウ球菌プロテインＡを指し、操作されたプロテインＡドメインを含む。操作されたプロテインＡは、例えば、Ｚドメイン、Ｚドメイン、Ｙドメインの変異体、又はＤ及びＥドメインを欠く操作されたプロテインＡであってよい。操作されたプロテインＡドメインは、免疫グロブリンのＶＨ３ドメインには結合できない（又は結合するにしても極めて低い親和性で結合する）が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のＣＨ２−ＣＨ３領域には依然結合することができる。

「Ｚドメイン」は、プロテインＡの野生型のＢドメインと比較した場合に変異Ａ１Ｖ及びＧ２９Ａを有する黄色ブドウ球菌プロテインＡのＢドメインの合成操作変異体である。Ｚドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。更なるＺドメイン変異体としては、配列番号９９、１００及び１０１のアミノ酸配列、並びに米国特許出願公開第２００６／０１９４９５０号に記載の変異体がある。

配列番号１
ＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ

配列番号９９
ＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤＣ

配列番号１００
ＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ

配列番号１０１
ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤ

本明細書の全体を通じ、抗体定常領域のアミノ酸残基の番号付けは、別途記載のない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載されるＥＵインデックスに従う。異なる定常ドメインの番号付けシステム間の対応付けは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース；ウェブリソース、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）で入手可能である。

本明細書では、表１に示すような従来の１文字及び３文字アミノ酸コードを用いる。

物質の組成：多重特異性抗体
本発明は、プロテインＡリガンドクロマトグラフィーを用いた精製を容易とする多重特異性抗体及びＣＨ２−ＣＨ３領域に非対称の変異を有する他の多量体ＣＨ２−ＣＨ３領域含有タンパク質、それらをコードするポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞、並びにそれらを製造する及び使用する方法を提供するものである。

完全長の二重特異性治療抗体を製造及び精製するには、過剰な親及び／又は中間分子から二重特異性抗体を効率的に分離することが求められる。本明細書では、変異を導入した重鎖の、プロテインＡリガンドとの結合を低減するＦｃ変異を特定している。したがって、これらのＦｃ変異を非対称的な形で（例えば、一方の重鎖のみに）有する二重特異性抗体は、プロテインＡリガンド親和性カラムからの差次的な溶出プロファイルに基づいて親抗体から精製することができる。

ＩｇＧ重鎖又は半分子同士を特異的にペアリングするための様々な方法が開発されており、ノブインホール（例えば、米国特許第７，６９５，９３６号を参照）、ＣｒｏｓｓＭＡｂ（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８：１１１８７−１１１９２，２０１１）、制御されたＦａｂアーム交換（Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０：５１４５−５１５０，２０１３）、共通軽鎖（例えば、米国特許第７，９５１，９１７号を参照）、及び直交Ｆａｂ界面（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２：１９１−１９８，２０１４を参照）が挙げられる。本明細書に記載される組成物及び方法は、二重特異性抗体を作製及び精製するための更に改良された方法を提供するものである。

ＦｃＲｎは、母体ＩｇＧの胎児への移動、及びリソソーム分解からの血清ＩｇＧの保護に関わっている。これらのプロセスはいずれも、リサイクリングエンドソーム中で酸性ｐＨ（＜６．５）にてＩｇＧと約６００ｎＭのＫ_Ｄで結合し、中性ｐＨで解離してＩｇＧを血清中に再び放出するＦｃＲｎの性質に依存している（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ ａｎｄ Ａｋｉｌｅｓｈ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７：７１５−７２５，２００７）。ＩｇＧはＣＨ２−ＣＨ３界面でＦｃＲｎに結合するため、１個のＦｃは２個の同じＦｃＲｎ結合部位を有している。構造的及び生化学的研究によって、１個のＦｃが２個のＦｃＲｎヘテロ二量体に結合するが、細胞内トラフィッキングは膜表面上でのＦｃＲｎ自体の多量体化を伴い得ることが示されている。いくつかの研究では、ＦｃとＦｃＲｎとの相互作用を調節することが、血清中寿命に強く影響することが示されており（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９：５１７１−５１８０，２００２；Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３−６２１６，２００４ Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７６：３４６−３５６，２００６、Ｖａｃｃａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１２８３−１２８８，２００５、Ｙｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８２：７６６３−７６７１，２００９、Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２：５９９，２０１１）、ＦｃＲｎが成人におけるＩｇＧの血清中寿命を決定する主な役割を担っているという結論が導かれる。

ＡｂｓのプロテインＡリガンド結合特性を調節しようとする試みは、プロテインＡ及び新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）がどちらもＦｃ上の結合部位を共有していることから、血清中半減期の顕著な低下をしばしば伴う。本明細書で導入される変異は、ＦｃのＦｃＲｎに対する結合を低下させないため、操作された抗体の血清中半減期を低減させない。導入される変異の１つであるＱ３１１Ｒによって、ＦｃＲｎに対する結合がわずかに高められ、抗体の血清中半減期の増大につながった。

実施例では、親抗体からの多重特異性完全長抗体の効果的な遺伝子操作及び精製について述べるが、本明細書に記載される技術は、２個のＣＨ２−ＣＨ３領域を含むあらゆる多量体タンパク質に適用可能である。

本発明は、単離された多重特異性抗体であって、変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ、又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域とを含み、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された多重特異性抗体を提供する。

非対称的なＱ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ変異を有する単離された多重特異性抗体は、プロテインＡリガンド親和性クロマトグラフィーを用いて親抗体から効率的に精製することができる。導入されたＱ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ及びＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ変異は、操作された抗体のＦｃＲｎ又はＦｃγＲに対する結合を低下させないため、抗体の半減期又はエフェクター機能を変化させるとは予想されない。導入されたＱ３１１Ｒ変異は、抗体のＦｃＲｎに対する結合及び血清中半減期を増大させた。

本発明はまた、単離された多重特異性抗体であって、変異Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と、３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域とを含み、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された多重特異性抗体も提供する。

本発明はまた、単離された多重特異性抗体であって、変異Ｑ３１１Ｋを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と、３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域とを含み、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された多重特異性抗体も提供する。

本発明はまた、単離された多重特異性抗体であって、変異Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と、３０７及び３０９位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域とを含み、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された多重特異性抗体も提供する。

本発明はまた、単離された多重特異性抗体であって、変異Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と、３０７及び３０９位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域とを含み、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された多重特異性抗体も提供する。

本発明はまた、単離された多重特異性抗体であって、変異Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域とを含み、基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された多重特異性抗体も提供する。

本発明はまた、単離された多重特異性抗体であって、変異Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域とを含み、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された多重特異性抗体も提供する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域は、第２のＣＨ２−ＣＨ３領域と比較してプロテインＡリガンドに対する結合が低下している。

プロテインＡリガンドに対する結合は、任意の適当な方法を用いて実験的に決定することができる。かかる方法では、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００又はＫｉｎＥｘＡ機器を使用することができる。測定される親和性は、異なる条件（例えば、モル浸透圧濃度、ｐＨ）下で測定した場合に異なり得る。したがって、親和性及び他の結合パラメータ（例えば、Ｋ_Ｄ、ｋ_ｏｎ、ｋ_ｏｆｆ）の測定は、一般的には、標準化された条件及び本明細書に記載される緩衝液などの標準化された緩衝液を用いて行われる。あるいは、プロテインＡリガンドに対する結合は、ｐＨ勾配を用いたプロテインＡリガンドクロマトグラフィーを用いて直接評価することもできる。プロテインＡリガンドに対する結合が低下した分子は、より高いｐＨで溶出する。例示的なプロテインＡリガンドクロマトグラフィーでは、ｍＡｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用することができ、試料は、約ｐＨ４．７、ｐＨ４．２又はｐＨ３．４のｐＨで５０ｍＭクエン酸塩を含む緩衝液を使用して３段階で溶出させることができる。

いくつかの実施形態では、プロテインＡリガンドは、黄色ブドウ球菌のプロテインＡを含む。

いくつかの実施形態では、プロテインＡリガンドは、Ｚドメインを含む。

いくつかの実施形態では、Ｚドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、プロテインＡリガンドは、Ｙドメインを含む。

いくつかの実施形態では、プロテインＡリガンドは、配列番号９９のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、プロテインＡリガンドは、配列番号１００のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、プロテインＡリガンドは、配列番号１０１のアミノ酸配列を有する。

黄色ブドウ球菌プロテインＡ（ｓｐＡ）は、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、及びＣとして示される５つの相同な螺旋状ＩｇＧ結合ドメインを有している（Ｕｈｌｅｎ，Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．１９８４）。これらのドメインのそれぞれはＦｃ領域に結合するうえで充分であるが、ｓｐＡは、ヒトＶＨ３ファミリーメンバーのＶＨ領域にも結合する（Ｒｏｍａｇｎａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２９：５９６−６０２，１９８２；Ｓａｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４７：１８７７−１８８３，１９９１）。ＳｐＡのＢドメイン又はＣドメインに安定性を高める変異を導入したところ、それぞれ、高ｐＨ処理に対する耐性を有し、Ｆｃにのみ結合する合成Ｚドメイン及びＹドメインを生じた。タンデム若しくは四量体Ｚドメイン、四量体Ｙドメイン、又は天然のｓｐＡが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＣ−６５０Ｆ及びＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａなどの市販の親和性樹脂に組み込まれている。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプである。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプである。

実施例では、ＩｇＧ１多重特異性抗体の効果的な作製及び精製に関する実験データを提供するが、残基３０７及び３１１は３つすべてのアイソタイプで保存されており、３０９位はＩｇＧ１とＩｇＧ４との間で保存され、ＩｇＧ２ではＬｅｕがＶａｌに保存的に置換されているため、特定された変異は、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のアイソタイプでも機能するものと予想される。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体のＦｃγＲとの結合は、変異を有さない親抗体の結合と同等である。

いくつかの実施形態では、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、及び／又はＦｃγＲＩＩＩａである。

いくつかの実施形態では、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩである。

いくつかの実施形態では、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩＩａである。

いくつかの実施形態では、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩＩｂである。

いくつかの実施形態では、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩＩＩａである。

ＦｃγＲに対する同等の結合を有する例示的な多重特異性抗体としては、Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ変異を有する多重特異性抗体がある。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体のＦｃＲｎとの結合は、変異を有さない親抗体の結合と同等である。

ＦｃＲｎに対する同等の結合を有する例示的な多重特異性抗体としては、Ｑ３１１Ｋ又はＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ変異を有する多重特異性抗体がある。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体のＦｃＲｎとの結合は、ＦｃＲｎに対する変異を有さない親抗体の結合と比較して向上している。

ＦｃＲｎに対する結合が向上した例示的な多重特異性抗体としては、Ｑ３１１Ｒ変異を有する抗体がある。

本発明はまた、単離された多重特異性抗体であって、変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ、又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域とを含み、残基の番号付けはＥＵインデックスに従い、多重特異性抗体は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域内に非対称の安定化変異を更に有する、単離された多重特異性抗体も提供する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域における、又は第２のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第１のＣＨ２−ＣＨ３領域における非対称の安定化変異は、
それぞれ、Ｆ４０５Ｌ及びＫ４０９Ｒ、
それぞれ、野生型及びＦ４０５Ｌ／Ｒ４０９Ｋ、
それぞれ、Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、
それぞれ、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ及びＴ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、
それぞれ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ及びＴ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、
それぞれ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、
それぞれ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ及びＴ３９４Ｗ、
それぞれ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ及びＦ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、
それぞれ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ及びＦ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、
それぞれ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、
それぞれ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、
それぞれ、Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、
それぞれ、Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５６Ｋ及びＫ４０９Ｄ／Ｋ３９２Ｄ、又は
それぞれ、Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５６Ｋ／Ｅ３５７Ｋ及びＫ４０９Ｄ／Ｋ３９２Ｄ／Ｋ３７０である。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域における、又は第２のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第１のＣＨ２−ＣＨ３領域における非対称の安定化変異は、それぞれ、Ｆ４０５Ｌ及びＫ４０９Ｒである。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域における、又は第２のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第１のＣＨ２−ＣＨ３領域における非対称の安定化変異は、それぞれ、野生型及びＦ４０５Ｌ／Ｒ４０９Ｋである。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域における、又は第２のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第１のＣＨ２−ＣＨ３領域における非対称の安定化変異は、それぞれ、Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖである。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域における、又は第２のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第１のＣＨ２−ＣＨ３領域における非対称の安定化変異は、それぞれ、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ及びＴ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔである。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域における、又は第２のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第１のＣＨ２−ＣＨ３領域における非対称の安定化変異は、それぞれ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ及びＴ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａである。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域における、又は第２のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第１のＣＨ２−ＣＨ３領域における非対称の安定化変異は、それぞれ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓである。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域における、又は第２のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第１のＣＨ２−ＣＨ３領域における非対称の安定化変異は、それぞれ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ及びＴ３９４Ｗである。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域における、又は第２のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第１のＣＨ２−ＣＨ３領域における非対称の安定化変異は、それぞれ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ及びＦ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖである。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域における、又は第２のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第１のＣＨ２−ＣＨ３領域における非対称の安定化変異は、それぞれ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ及びＦ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖである。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域における、又は第２のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第１のＣＨ２−ＣＨ３領域における非対称の安定化変異は、それぞれ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆである。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域における、又は第２のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第１のＣＨ２−ＣＨ３領域における非対称の安定化変異は、それぞれ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆである。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域における、又は第２のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第１のＣＨ２−ＣＨ３領域における非対称の安定化変異は、それぞれ、Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆである。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域における、又は第２のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第１のＣＨ２−ＣＨ３領域における非対称の安定化変異は、それぞれ、Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５６Ｋ及びＫ４０９Ｄ／Ｋ３９２Ｄである。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域における、又は第２のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第１のＣＨ２−ＣＨ３領域における非対称の安定化変異は、それぞれ、Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５６Ｋ／Ｅ３５７Ｋ及びＫ４０９Ｄ／Ｋ３９２Ｄ／Ｋ３７０である。

非対称の安定化変異を二重特異性又は多重特異性抗体に導入することで、過剰な親又は中間分子からそれらを分離する下流プロセスを促進することができる。

例示的な非対称の安定化変異は、２個の親抗体間のＦａｂアーム交換（例えば、半分子交換、重鎖−軽鎖ペア上の交換）を促進するようなものである。この技術では、２個の親抗体半分子のヘテロ二量体形成に有利に働く変異を、無細胞環境中インビトロで、又は同時発現を用いて、各親抗体の重鎖ＣＨ３界面に導入する。例えば、第１の親抗体の変異Ｆ４０５Ｌ及び第２の親抗体のＫ４０９Ｒを用いてＩｇＧ１のＦａｂアーム交換を促進することができる。ＩｇＧ４抗体では、野生型の第１の親抗体及び第２の親抗体のＦ４０５Ｌ／Ｒ４０９Ｋ変異を用いることができる。

更なる非対称の安定化変異は、ノブインホール変異（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、又は静電的に一致した残基を導入する変異である（Ｃｈｕｇａｉ，Ａｍｇｅｎ，ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ，Ｏｎｃｏｍｅｄ）。例示的なノブインホール変異（第１の親抗体における変異位置／第２の親抗体における変異位置として表す）は、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである。静電的に一致した残基を導入する例示的な変異としては、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、同第２００９／０１８２１２７号、同第２０１０／０２８６３７号、又は同第２０１１／０１２３５３２号に記載されるものがある。更なる非対称の安定化変異としては、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は同第２０１３／０１９５８４９号に記載されるＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗがある。

変異は、通常、標準的な方法を用いて、抗体の定常ドメインなどの分子に対してＤＮＡレベルで導入される。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域のＱ３１１Ｒ／Ｆ４０５Ｌ変異、及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＫ４０９Ｒ変異を含む。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域のＱ３１１Ｋ／Ｆ４０５Ｌ変異、及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＫ４０９Ｒ変異を含む。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域のＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｆ４０５Ｌ変異、及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＫ４０９Ｒ変異を含む。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域のＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ／Ｆ４０５Ｌ変異、及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＫ４０９Ｒ変異を含む。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域のＱ３１１Ｒ／Ｋ４０９Ｒ変異、及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＦ４０５Ｌ変異を含む。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域のＱ３１１Ｋ／Ｋ４０９Ｒ変異、及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＦ４０５Ｌ変異を含む。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域のＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｋ４０９Ｒ変異、及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＦ４０５Ｌ変異を含む。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域のＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ／Ｋ４０９Ｒ変異、及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＦ４０５Ｌ変異を含む。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域のＱ３１１Ｒ変異、及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＦ４０５Ｌ／Ｒ４０９Ｋ変異を含む。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域のＱ３１１Ｋ変異、及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＦ４０５Ｌ／Ｒ４０９Ｋ変異を含む。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域のＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ変異、及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＦ４０５Ｌ／Ｒ４０９Ｋ変異を含む。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域のＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ変異、及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＦ４０５Ｌ／Ｒ４０９Ｋ変異を含む。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域のＱ３１１Ｒ／Ｔ３６６Ｗ変異、及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域のＱ３１１Ｋ／Ｔ３６６Ｗ変異、及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域のＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｔ３６６Ｗ変異、及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域のＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ／Ｔ３６６Ｗ変異、及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域のＱ３１１Ｒ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異、及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＴ３６６Ｗ変異を含む。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域のＱ３１１Ｋ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異、及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＴ３６６Ｗ変異を含む。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域のＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異、及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＴ３６６Ｗ変異を含む。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域のＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異、及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＴ３６６Ｗ変異を含む。

本発明の多重特異性抗体の例示的なＣＨ２−ＣＨ３領域のアミノ酸配列を表２及び表３に示す。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号２及び２２のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号３及び２２のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号４及び２２のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号５及び２２のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号６及び２３のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号７及び２３のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号８及び２３のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号９及び２３のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号１０及び２４のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号１１及び２４のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号１２及び２４のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号１３及び２４のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号１４及び２５のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号１５及び２５のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号１６及び２５のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号１７及び２５のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号１８及び２６のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号１９及び２６のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号２０及び２６のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号２１及び２６のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号５２及び５４のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号５２及び５５のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号５３及び５４のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号５３及び５５のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号５６及び５４のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、それぞれ配列番号５６及び５５のアミノ酸配列を有する。

本発明の多重特異性抗体は、過剰な親又は中間分子から多重特異性抗体を分離する下流プロセスを更に促進するために、共通の軽鎖を更に含んでもよい。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、第１の軽鎖及び第２の軽鎖を含む。

いくつかの実施形態では、第１の軽鎖及び第２の軽鎖は、同じアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。

ＩｇＧ２が３０９位にバリンを有する点を除き、３０７、３０９及び３１１位はアイソタイプにわたって保存されているため、変異は、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプに移行し得る。３６６、３６８及び４０７位はまた、抗体アイソタイプにわたっても保存されている。Ｆ４０５Ｌは保存されているが、ＩｇＧ４は４０９位にＲを有する。ヒトＩｇＧ４抗体のＦａｂアーム交換を促進するには、一方の親抗体を、Ｆ４０５Ｌ／Ｒ４０９Ｋ変異を有するように操作し、他方の親抗体は野生型とする。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、少なくとも２個の抗原に結合する。

いくつかの実施形態では、抗原は、ＡＢＣＦ１、ＡＣＶＲ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＣＶＲ２、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＣＶＲＬ１、ＡＤＯＲＡ２Ａ、アグリカン、ＡＧＲ２、ＡＩＣＤＡ、ＡＩＦ１、ＡＩＧ１、ＡＫＡＰ１、ＡＫＡＰ２、アルブミン、ＡＭＨ、ＡＭＨＲ２、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＰＥＰ、ＡＰＣ、ＡＰＯＣ１、ＡＰＯＥ、ＡＲ、ＡＺＧＰ１（亜鉛結合性ａ−糖タンパク質）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＢＡＤ、ＢＡＦＦ、ＢＡＧ１、ＢＡＩ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＢＤＮＦ、ＢＬＮＫ、ＢＬＲ１（ＭＤＲ１５）、ＢｌｙＳ、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦ１０）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＢＭＰＲ２、ＢＰＡＧ１（プレクチン）、ＢＲＣＡ１、ＢＴＬＡ、Ｃ１９ｏｒｆ１０（ＩＬ２７ｗ）、Ｃ３、Ｃ４Ａ、Ｃ５、Ｃ５Ｒ１、ＣＡＮＴ１、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ４、ＣＡＶ１、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＬ１（１−３０９）、ＣＣＬ１１（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−１ｄ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ−４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ−３ｂ）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＭＣＡＦ、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３ａ）、ＣＣＬ２１（ＭＩＰ−２）、ＳＬＣ、エクソダス−２、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ−１）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ−１）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１ａ）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１ｂ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２）、ＣＣＮＡ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＥ２、ＣＣＲ１（ＣＫＲ１／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ−１ＲＢ／ＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ−Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩ１）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ−Ｌ１）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ−９−６）、ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）、ＣＣＲＬ２（Ｌ−ＣＣＲ）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３７、ＣＤ１６４、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ１Ｃ、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ−２２、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ８９、ＣＤ９６、ＣＤＨ１（Ｅ−カドヘリン）、ＣＤＨ１０、ＣＤＨ１２、ＣＤＨ１３、ＣＤＨ１８、ＣＤＨ１９、ＣＤＨ２０、ＣＤＨ５、ＣＤＨ７、ＣＤＨ８、ＣＤＨ９、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７、ＣＤＫ９、ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１Ｗａｐ１／Ｃｉｐ１）、ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７Ｋｉｐ１）、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１６ＩＮＫ４ａ）、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＫＮ３、ＣＥＢＰＢ、ＣＥＲ１、ＣＨＧＡ、ＣＨＧＢ、キチナーゼ、ＣＨＳＴ１０、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ７（クローディン−７）、ＣＬＮ３、ＣＬＵ（クラスタリン）、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）、ＣＮＲ１、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＲ２、ＣＲＰ、ＣＳＦ１（Ｍ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）、ＣＴＬＡ４、ＣＴＮＮＢ１（ｂ−カテニン）、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤ１）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＬ１（ＧＲＯ１）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ／ＩＰ−９）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２（ＧＲＯ２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲＯ３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８／ＬＩＸ）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ−２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ−Ｌ２）、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＣＹＢ５、ＣＹＣ１、ＣＹＳＬＴＲ１、ＤＡＢ２ＩＰ、ＤＥＳ、ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８、ＤＮＡＭ−１、ＤＮＣＬ１、ＤＰＰ４、Ｅ２Ｆ１、ＥＣＧＦ１、ＥＤＧ１、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ３、ＥＦＮＢ２、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥＬＡＣ２、ＥＮＧ、ＥＮＯ１、ＥＮＯ２、ＥＮＯ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＯ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ−２）、ＥＲＥＧ、ＥＲＫ８、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、Ｆ３（ＴＦ）、ＦＡＤＤ、ＦａｓＬ、ＦＡＳＮ、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ２、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＧＦ、ＦＧＦ１（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、ＦＧＦ３（ｉｎｔ−２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ−２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ３、ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＦＩＬ１（ＥＰＳＩＬＯＮ）、ＦＩＬ１（ＺＥＴＡ）、ＦＬＪ１２５８４、ＦＬＪ２５５３０、ＦＬＲＴ１（フィブロネクチン）、ＦＬＴ１、ＦＯＳ、ＦＯＳＬ１（ＦＲＡ−１）、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）、ＧＡＧＥＢ１、ＧＡＧＥＣ１、ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ−６ＳＴ、ＧＡＴＡ３、ＧＤＦ５、ＧＦＩ１、ＧＧＴ１、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＮＡＳ１、ＧＮＲＨ１、ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ４４、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＧＲＣＣ１０（Ｃ１０）、ＧＲＰ、ＧＳＮ（ゲルゾリン）、ＧＳＴＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７Ａ、ＨＤＡＣ９、ＨＧＦ、ＨＩＦ１Ａ、ＨＩＰ１、ヒスタミン及びヒスタミン受容体、ＨＬＡ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＭ７４、ＨＭＯＸ１、ＨＵＭＣＹＴ２Ａ、ＨＶＥＭ、ＩＣＥＢＥＲＧ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＩＤＯ、ＩＤ２、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮγ、ＩＦＮＷ１、ＩＧＢＰ１、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ６、ＩＬ−１、ＩＬ１０、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ−１２、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ１９、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ１Ｆ５、ＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ７、ＩＬ１Ｆ８、ＩＬ１Ｆ９、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ２、ＩＬ２０、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３、ＩＬ３０、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）、ＩＬ７、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ８、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＬＫ、ＩＮＨＡ、ＩＮＨＢＡ、ＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ４、インスリン、インスリン受容体、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ６（ａ６インテグリン）、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリン）、ＪＡＧ１、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＪＵＮ、Ｋ６ＨＦ、ＫＡＩ１、ＫＤＲ、ＫＩＴＬＧ、ＫＩＲ、ＫＬＦ５（ＧＣＢｏｘＢＰ）、ＫＬＦ６、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、ＫＬＫ１５、ＫＬＫ３、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ９、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１９（ケラチン１９）、ＫＲＴ２Ａ、ＫＲＴＨＢ６（毛髪特異的ＩＩ型ケラチン）、ＬＡＧ−３、ＬＡＭＡ５、ＬＤＬ、ＬＥＰ（レプチン）、ＬＦＡ、Ｌｉｎｇｏ−ｐ７５、Ｌｉｎｇｏ−Ｔｒｏｙ、ＬＰＳ、ＬＴＡ（ＴＮＦ−ｂ）、ＬＴＢ、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＬＴＢ４Ｒ２、ＬＴＢＲ、ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＧ又はＯｍｇｐ、ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ−Ｊｕｎ）、ＭＤＫ、メソテリン、ＭＩＢ１、ミッドカイン、ＭＩＦ、ＭＩＰ−２、ＭＫＩ６７（Ｋｉ−６７）、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＳ４Ａ１、ＭＳＭＢ、ＭＴ３（メタロチオネクチン−ＩＩＩ）、ＭＴＳＳ１、ＭＵＣ１（ムチン）、ＭＹＣ、ＭＹＤ８８、ＮＣＫ２、ニューロカン、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢ２、ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）、ＮＧＦＲ、ＮｇＲ−Ｌｉｎｇｏ、ＮｇＲ−Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）、ＮｇＲ−ｐ７５、ＮｇＲ−Ｔｒｏｙ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＮＭＥ１（ＮＭ２３Ａ）、ＮＯＸ５、ＮＰＰＢ、ＮＲ０Ｂ１、ＮＲ０Ｂ２、ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ１Ｄ２、ＮＲ１Ｈ２、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲＩＩ２、ＮＲＩＩ３、ＮＲ２Ｃ１、ＮＲ２Ｃ２、ＮＲ２Ｅ１、ＮＲ２Ｅ３、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ３Ｃ２、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ６Ａ１、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＮＴ５Ｅ、ＮＴＮ４、ＯＤＺ１、ＯＰＲＤ１、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０Ｌ、Ｐ２ＲＸ７、ＰＡＰ、ＰＡＲＴ１、ＰＡＴＥ、ＰＡＷＲ、ＰＣＡ３、ＰＣＮＡ、ＰＤ−１、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＥＣＡＭ１、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＧＦ、ＰＧＲ、ホスファカン、ＰＩＡＳ２、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）、ＰＬＧ、ＰＬＸＤＣ１、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＰＰＩＤ、ＰＲ１、ＰＲＫＣＱ、ＰＲＫＤ１、ＰＲＬ、ＰＲＯＣ、ＰＲＯＫ２、ＰＳＡＰ、ＰＳＣＡ、ＰＴＡＦＲ、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ−２）、ＰＴＮ、ＲＡＣ２（ｐ２１Ｒａｃ２）、ＲＡＲＢ、ＲＧＳ１、ＲＧＳ１３、ＲＧＳ３、ＲＮＦ１１０（ＺＮＦ１４４）、ＲＯＢＯ２、ＲＯＲ１、ＳＩ００Ａ２、ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリンＢ）、ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン２）、ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）、ＳＣＹＥ１（内皮単球活性化サイトカイン）、ＳＤＦ２、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＲＰＩＮＢ５（マスピン）、ＳＥＲＰＩＮＥ１（ＰＡＩ−１）、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＨＢＧ、ＳＬＡ２、ＳＬＣ２Ａ２、ＳＬＣ３３Ａ１、ＳＬＣ４３Ａ１、ＳＬＩＴ２、ＳＰＰ１、ＳＰＲＲ１Ｂ（Ｓｐｒ１）、ＳＴ６ＧＡＬ１、ＳＴＡＢ１、ＳＴＡＴ６、ＳＴＥＡＰ、ＳＴＥＡＰ２、ＴＢ４Ｒ２、ＴＢＸ２１、ＴＣＰ１０、ＴＤＧＦ１、ＴＥＫ、ＴＦ（トランスフェリン受容体）、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ１１１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＨ１Ｌ、ＴＨＢＳ１（トロンボスポンジン−１）、ＴＨＢＳ２、ＴＨＢＳ４、ＴＨＰＯ、ＴＩＥ（Ｔｉｅ−１）、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３、ＴＩＭＰ３、組織因子、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＮＦ、ＴＮＦ−ａ、ＴＮＦＡＩＰ２（Ｂ９４）、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）、ＴＮＦＲＳＦ７、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰＯ３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ−Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド）、ＴＯＬＬＩＰ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＴＯＰ２Ａ（トポイソメ


ラーゼＩｉａ）、ＴＰ５３、ＴＰＭ１、ＴＰＭ２、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、ＴＲＰＣ６、ＴＳＬＰ、ＴＷＥＡＫ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、バーシカン、ＶＨＬＣ５、ＶＩＳＴＡ、ＶＬＡ−４、ＸＣＬ１（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ−１ｂ）、ＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１）、ＹＹ１、及びＺＦＰＭ２である。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体はＣＤ３に結合する。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体はＣＤ３及び腫瘍抗原に結合する。

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、２個の抗原に結合し、２個の抗原は、ＰＤ１、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＮＫＰ４６、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＫＩＲａ、ＣＤ７３、ＣＤ３９、ＩＤＯ、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＤ３０、ＨＶＥＭ、ＤＮＡＭ−１、ＬＦＡ、腫瘍抗原、ＥＧＦＲ、ｃＭｅｔ、ＦＧＦＲ、ＲＯＲ１、ＣＤ１２３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＦＧＦＲ、メソテリン、ＣＤ３、Ｔ細胞受容体、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３２ａ、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＰ４６、ＣＤ２８、ＣＤ４７、ＤＬＬ、ＣＤ８、ＣＤ８９、ＨＬＡ、Ｂ細胞受容体又はＣＤ１３７のうちの任意の２つである。

本発明の多重特異性抗体の遺伝子操作
本発明の多重特異性抗体に更なるＦｃ変異を導入することにより、エフェクター機能及び薬物動態特性を調節することができる。従来の免疫機能では、抗体−抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用の結果、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞障害、及び食作用から免疫調整性シグナル、例えば、リンパ球の増殖及び抗体の分泌の制御に及ぶ広範な応答が生じる。これらの相互作用はすべて、抗体又は免疫複合体のＦｃ領域の、特化した細胞表面受容体への結合を介して開始される。抗体及び免疫複合体によって誘発される細胞応答の多様性は、Ｆｃ受容体の構造的異種性に起因する。すなわち、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、活性化性Ｆｃγ受容体（すなわち、免疫系を増強）であり、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２Ｂ）は、阻害性Ｆｃγ受容体である（すなわち、免疫系の減弱）。ＦｃＲｎ受容体への結合は、抗体の半減期を調節する。

いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、ＦｃγＲに対する抗体の結合を調節する少なくとも１つの変異を更に有する。

いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、又はＦｃＲｎに対する抗体の結合を調節する少なくとも１つの変異を更に有する。

多重特異性抗体の半減期を延ばす代表的な変異としては、変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、及びＴ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａがある。多重特異性抗体の半減期を短くする代表的な変異としては、変異Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ、及びＨ４３５Ｒがある。

いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、活性化性Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）に対する抗体の結合を低下させ、かつ／又は、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、若しくは貪食作用（ＡＤＣＰ）のようなＦｃエフェクター機能を低下させる少なくとも１つの変異を含む。

活性化性ＦｃγＲに対する本発明の多重特異性抗体の結合を低下させ、かつ／又は抗体エフェクター機能を最小に抑える例示的な変異としては、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、すべてのＩｇアイソタイプにおけるＮ２９７Ａ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、ＩｇＧ１におけるＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ１におけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓがある。

活性化性Ｆｃγに対する本発明の多重特異性抗体の結合を増大させ、かつ／又は抗体エフェクター機能を増強する例示的な変異としては、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ａ、Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ、Ｓ２６７Ｅ／Ｓ３２４Ｔ及びＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔがある。

周知のＳ２２８ＰをＩｇＧ４抗体に導入することでＩｇＧ４の安定性を高めることができる。

「抗体依存性細胞傷害」、「抗体依存性細胞介在細胞傷害」、すなわち「ＡＤＣＣ」は、エフェクター細胞で発現されるＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）によって、抗体被覆標的細胞の、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージ、及び好中球などの溶解活性を有するエフェクター細胞との相互作用に依存して、細胞死を誘導する機序である。例えば、ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩａを発現し、一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩａを発現する。抗体でコートされた標的細胞の死滅は、膜孔形成タンパク質及びプロテアーゼの分泌を通してのエフェクター細胞活性の結果として生じる。本発明の抗体のＡＤＣＣ活性を評価するため、抗体を免疫エフェクター細胞と共に所望の抗原を発現する細胞に加えることができ、免疫エフェクター細胞は抗原抗体複合体によって活性化され、その結果、標的細胞の細胞溶解を生じ得る。細胞溶解は、溶解した細胞からの標識（例えば、放射性基質、蛍光染料、又は天然の細胞内タンパク質）の放出によって検出することができる。そのようなアッセイの代表的なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びＮＫ細胞が挙げられる。例示的な標的細胞としては、内因的に又は組み換えによって所望の抗原を発現する細胞が挙げられる。例示的なアッセイでは、標的細胞を、標的細胞１に対してエフェクター細胞５０の比で使用する。標的細胞をＢＡＴＤＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により３７℃で２０分間前標識し、２回洗浄し、ＤＭＥＭ、１０％熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより）中に再懸濁する。標的細胞（１×１０^４個）及びエフェクター細胞（０．５×１０^６個）を一緒にし、１００μＬの細胞を９６ウェルＵ字底プレートのウェルに加える。追加の１００μＬを、試験抗体と共に、又は試験抗体なしで添加する。プレートを２００ｇで３分間遠心分離し、３７℃で２時間インキュベートし、次いで、２００ｇで３分間再び遠心分離する。１ウェル当たり合計２０μＬの上清が除去され、細胞溶解が、２００μＬのＤＥＬＰＨＩＡ Ｅｕｒｏｐｉｕｍ系試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の添加によって測定される。０．６７％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）による最大の細胞傷害に対してデータを正規化し、また任意の抗体の非存在下における標的細胞からのＢＡＴＤＡの自然放出によって最小対照を求める。

「抗体依存性細胞貪食作用」（「ＡＤＣＰ」）とは、例えばマクロファージ又は樹状細胞などの貪食細胞による取り込みにより、抗体被覆標的細胞を排除する機序を指す。ＡＤＣＰは、エフェクター細胞として単球由来マクロファージを用い、ＧＦＰ又は他の標識分子を発現するように操作された標的細胞として、Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２１３（商標））、又は所望の抗原を発現するＢ細胞性白血病若しくはリンパ腫若しくは腫瘍の細胞を用いて評価することができる。エフェクター：標的細胞比は、例えば４：１とすることができる。エフェクター細胞は、本発明の抗体を添加し又は添加せずに、標的細胞と共に４時間インキュベートしてよい。インキュベーション後、細胞は、アクターゼを用いて剥離できる。マクロファージは、蛍光標識に結合した抗ＣＤ１１ｂ抗体及び抗ＣＤ１４抗体により識別され得るが、貪食作用の割合は、標準的な方法を用いて、ＣＤ１１^＋及びＣＤ１４^＋マクロファージにおけるＧＦＰ蛍光の割合（％）に基づいて決定され得る。

「補体依存性細胞傷害」すなわち（ＣＤＣ）とは、標的結合抗体のＦｃエフェクタードメインが補体成分Ｃ１ｑに結合してこれを活性化し、かかる補体成分Ｃ１ｑが次に補体カスケードを活性化して標的細胞の細胞死をもたらす、細胞死を誘導するための機序を指す。補体の活性化はまた、標的細胞表面に対する補体成分の沈着を生じさせ得、白血球への補体受容体（例えば、ＣＲ３）の結合によって、ＡＤＣＣを容易にする。ＣＤＣは、例えば、Ｄａｕｄｉ細胞を、１×１０^５個細胞／ウェル（５０μＬ／ウェル）でＲＰＭＩ−Ｂ（１％のＢＳＡを添加したＲＰＭＩ）に蒔き、５０μＬの試験抗体を、０〜１００μｇ／ｍＬの終濃度でウェルに添加し、反応を１５分間室温でインキュベートし、１１μＬのプールしたヒト血清をウェルに添加し、反応を４５分間３７℃でインキュベートすることにより測定することができる。溶解した細胞の割合（％）は、標準法を使用して、ＦＡＣＳアッセイにおけるヨウ化プロピジウム染色細胞の％として検出され得る。

ＦｃｙＲＩＩｂに対する抗体の結合を増大させる更なる変異を、本発明の多重特異性抗体に更に導入することができる。例示的なかかる変異としては、変異Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２６７Ｄ、Ｓ２６７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｇ２３６Ｄ／Ｓ２６７Ｅ、及びＥ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ／Ｐ２３８Ｄがある。

一般的には、活性化性ＦｃγＲに対する結合を増大させ、阻害性ＦｃＲγＩＩｂに対する結合を低下させる変異を、癌及び感染症の治療用など、対象における免疫応答を増強するために使用される抗体に遺伝子操作により導入することができる。ＦｃγＲに対する結合を低下させる、又は阻害性ＦｃＲγＩＩｂに対する結合を増大させる変異を、炎症性又は自己免疫疾患の治療用など、対象における免疫応答を減弱するために使用される抗体に遺伝子操作により導入することができる。阻害性ＦｃγＲＩＩｂに対する結合を増大させる変異を、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーに結合してそれらのアゴニスト活性を増強するアゴニスト抗体に導入することもできる。

本発明の多重特異性抗体のＡＤＣＣを誘導する能力は、当該抗体のオリゴ糖成分を遺伝子操作することによって強化することができる。ヒトＩｇＧ１はＡｓｎ２９７でＮ−グリコシル化され、グリカンの大部分は、公知の二分岐Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ２又はＧ２Ｆの形態である。遺伝子操作されていないＣＨＯ細胞により生成される抗体は、典型的には、少なくとも約８５％のグリカンフコース含量を有する。Ｆｃ領域に付加された二分岐の複合体型オリゴ糖からのコアフコースの除去は、抗原結合又はＣＤＣ活性を変更することなく、ＦｃγＲＩＩＩａ結合の改善によって抗体のＡＤＣＣを増強する。かかるｍＡｂは、培養モル浸透圧の制御、宿主細胞株としての変異体ＣＨＯ株Ｌｅｃ１３の適用、宿主細胞株としての変異体ＣＨＯ株ＥＢ６６の適用、宿主細胞株としてのラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０の適用、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子に特異的な小干渉ＲＮＡの導入、又はβ−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ及びゴルジα−マンノシダーゼＩＩ若しくは強力なα−マンノシダーゼＩ阻害剤であるキフネンシンの同時発現など、Ｆｃオリゴ糖の二分岐複合体型を有する比較的高く脱フコシル化された抗体の効果的な発現につながることが報告されている異なる方法を用いて得ることができる。

いくつかの実施形態において、本発明の多重特異性抗体は、約０％〜約１５％、例えば、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％ １０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又は０％のフコース含量を有する二分岐グリカン構造を有する。

いくつかの実施形態において、本発明の多重特異性抗体は、約５０％、４０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％ １０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又は０％のフコース含量を有する二分岐グリカン構造を有する。

「フコース含量」とは、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコース単糖類の量を意味する。フコースの相対量は、フコース含有構造の全糖構造に対する割合である。これらは、複数の方法、例えば、１）Ｎ−グリコシダーゼＦ処理試料のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（例えば、複合体、ハイブリッド、並びにオリゴ構造及び高マンノース構造）の使用、２）Ａｓｎ２９７グリカンの酵素放出、その後の誘導体化、並びに蛍光検出を備えたＨＰＬＣ（ＵＰＬＣ）及び／又はＨＰＬＣ−ＭＳ（ＵＰＬＣ−ＭＳ）による検出／定量化、３）第１のＧｌｃＮＡｃ単糖類と第２のＧｌｃＮＡｃ単糖類との間を切断し、フコースを第１のＧｌｃＮＡｃに付加されたままにさせる、Ｅｎｄｏ Ｓ又は他の酵素によるＡｓｎ２９７グリカンの処理を伴うか又はこの処理なしでの、天然又は還元ｍＡｂのインタクトプロテイン分析、４）酵素を用いた消化（例えば、トリプシン又はエンドペプチダーゼＬｙｓ−Ｃ）による、ｍＡｂの成分ペプチドへの消化、並びにそれに続くＨＰＬＣ−ＭＳ（ＵＰＬＣ−ＭＣ）による分離、検出、及び定量化、あるいは５）Ａｓｎ２９７でＰＮＧａｓｅ Ｆを用いた酵素による特異的酵素脱グリコシル化による、ｍＡｂタンパク質からのｍＡｂオリゴ糖の分離、により特性評価され、定量化され得る。放出されるオリゴ糖は、フルオロフォアで標識され、分離され、グリカン構造の細かな特性評価を可能にする様々な補足的技術、すなわち、実測された質量の理論上の質量との比較によるマトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析、イオン交換ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ Ｃ）によるシアル化の程度の決定、順相ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ Ｎ）による親水性基準に準拠するオリゴ糖型の分離及び定量、並びに高性能キャピラリー電気泳動−レーザ誘起蛍光（ＨＰＣＥ−ＬＩＦ）によるオリゴ糖の分離及び定量によって特定することが可能である。

「低フコース」又は「低フコース含量」とは、約０％〜約１５％のフコース含量を有する抗体を指す。

「正常なフコース」又は「正常なフコース含量」とは、約５０％を超える、通常は約６０％、７０％、８０％を超える、又は８５％を超えるフコース含量を有する抗体を指す。

本発明の多重特異性抗体は、グリコシル化、異性化、脱グリコシル化、又は天然に生じない共有結合性の修飾（例えば、ポリエチレングリコール部分の付加（ＰＥＧ化）及び脂質化）などのプロセスにより、翻訳後修飾を受けてもよい。こうした修飾はインビボあるいはインビトロで行われ得る。例えば、本明細書に記載の本発明の抗体は、ポリエチレングリコールとコンジュゲート（ペグ化）させることによって薬物動態的なプロファイルを改善することができる。コンジュゲートは当業者に既知の技術によって行われ得る。治療用抗体のＰＥＧとのコンジュゲートによって、機能を低下させずに薬力学的動態が増強することが示されている。

安定性、選択性、交差反応性、親和性、免疫原性、又は他の望ましい生物学的若しくは生物物理学的特性を改善するために改変され得る本発明の多重特異性抗体は、本発明の範囲内である。抗体の安定性は、（１）固有の安定性に影響を及ぼす個々のドメインのコアパッキング、（２）ＨＣとＬＣとのペアリングに影響を及ぼすタンパク質／タンパク質の界面相互作用、（３）極性及び荷電残基の埋め込み、（４）極性及び荷電残基のためのＨ結合ネットワーク、並びに（５）他の分子内及び分子間力における表面電荷及び極性残基の分布、を含む幾つかの因子によって影響を受ける（Ｗｏｒｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ２００１）。構造を不安定化させる可能性のある残基は、抗体の結晶構造に基づいて、又は場合によっては分子モデリングによって同定することができ、また、抗体の安定性に対する残基の効果は、同定された残基において変異を保有する変異体を作製及び評価することによって試験することができる。抗体の安定性を高める方法の１つには、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）によって測定したときの熱転移中点温度（Ｔ_ｍ）を高くするというものがある。一般に、タンパク質のＴ_ｍはその安定性と相関し、溶液中でのアンフォールディング及び変性に対する感度、並びに、タンパク質のアンフォールディングのし易さに応じた分解プロセスと逆相関する。配合物の研究により、ＦａｂのＴ_ｍは、対応するｍＡｂの長期物理的安定性と密接な関係があることが示唆されている。

Ｃ末端リシン（ＣＴＬ）は、血流中の内因性の循環カルボキシペプチダーゼによって、注射された抗体から除去され得る。製造中、米国特許出願公開第２０１４０２７３０９２号に記載のとおり、細胞外Ｚｎ^２＋、ＥＤＴＡ又はＥＤＴＡ−Ｆｅ^３＋の濃度を制御することによって、ＣＴＬの除去を最高レベル未満に制御することができる。抗体のＣＴＬ含量は、公知の方法を用いて測定することができる。

いくつかの実施形態において、本発明の多重特異性抗体は、約１０％〜約９０％、約２０％〜約８０％、約４０％〜約７０％、約５５％〜約７０％、又は約６０％の、Ｃ末端リジン含量を有する。

いくつかの実施形態において、本発明の多重特異性抗体は、約０％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のＣ末端リジン含量を有する。

本発明はまた、同じアミノ酸配列を有する２個の重鎖と２個の軽鎖とを含む単離された抗体であって、２個の同じ重鎖が、変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有し、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された抗体も提供する。

本発明はまた、同じアミノ酸配列を有する２個の重鎖と２個の軽鎖とを含む単離された抗体であって、２個の同じ重鎖が変異Ｑ３１１Ｒを有し、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された抗体も提供する。

本発明はまた、同じアミノ酸配列を有する２個の重鎖と２個の軽鎖とを含む単離された抗体であって、２個の同じ重鎖が変異Ｑ３１１Ｋを有し、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された抗体も提供する。

本発明はまた、同じアミノ酸配列を有する２個の重鎖と２個の軽鎖とを含む単離された抗体であって、２個の同じ重鎖が変異Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ有し、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された抗体も提供する。

本発明はまた、同じアミノ酸配列を有する２個の重鎖と２個の軽鎖とを含む単離された抗体であって、２個の同じ重鎖が変異Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑを有し、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された抗体も提供する。

本発明はまた、同じアミノ酸配列を有する２個の重鎖と２個の軽鎖とを含む単離された抗体であって、２個の同じ重鎖が変異Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有し、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された抗体も提供する。

本発明はまた、同じアミノ酸配列を有する２個の重鎖と２個の軽鎖とを含む単離された抗体であって、２個の同じ重鎖が変異Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有し、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された抗体も提供する。

単離された抗体は、本発明の多重特異性抗体を作製するための親抗体として有用である。

いくつかの実施形態では、単離された抗体は、変異Ｆ４０５Ｌ、Ｋ４０９Ｒ、Ｆ４０５Ｌ／Ｒ４０９Ｋ、Ｔ３６６Ｗ又はＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを更に有する。

いくつかの実施形態では、単離された抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプである。

本発明の操作された多重特異性抗体の作製方法
親多重特異性抗体と比較して変化したアミノ酸配列を有する本発明の操作された多重特異性抗体は、標準的なクローニング及び発現技術を用いて作製することができる。例えば、部位特異的変異誘発又はＰＣＲ介在変異誘発を行って変異（複数可）を導入することができ、抗体の結合又は他の対象とする特性に対する影響を、周知の方法及び本明細書の実施例で述べる方法を用いて評価することができる。

抗体のアロタイプ
治療用抗体の免疫原性は、注入反応のリスク増大及び治療応答の期間短縮に関連している（Ｂａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８：６０２−０８）。宿主において治療用抗体が免疫応答を誘導する程度は、抗体のアロタイプによって部分的に決定され得る（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２：２１３−２１）。抗体のアロタイプは、抗体の定常領域配列における特定の位置のアミノ酸配列の変異に関連する。

表４は、選択されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のアロタイプを示す。

いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、Ｇ２ｍ（ｎ）、Ｇ２ｍ（ｎ−）、Ｇ２ｍ（ｎ）／（ｎ−）、ｎＧ４ｍ（ａ）、Ｇ１ｍ（１７）又はＧ１ｍ（１７，１）アロタイプのものである。

本発明の多重特異性抗体の作製及び単離
本発明の多重特異性抗体は、標準的な分子生物学技術を使用し、親抗体のＦａｂアーム交換を促進することで作製することができる。本発明の多重特異性抗体は、プロテインＡリガンド親和性クロマトグラフィーを用いて精製することができる。

本発明はまた、変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１の重鎖又はそのフラグメントと、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２の重鎖又はそのフラグメントとを含む、単離された多重特異性抗体を製造する方法であって、
変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１の重鎖又はそのフラグメントと第１の軽鎖とを含む第１の親抗体を与えることと、
３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２の重鎖又はそのフラグメントと第２の軽鎖とを含む第２の親抗体を与えることと、
第１の親抗体と第２の親抗体とを試料中で接触させることと、
試料をインキュベートすることと、
プロテインＡリガンド親和性クロマトグラフィーを使用して多重特異性抗体を精製することとを含む、方法も提供する。

本発明はまた、変異Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑを有する第１の重鎖又はそのフラグメントと、３０７及び３０９位に野生型アミノ酸残基を有する第２の重鎖又はそのフラグメントとを含む、単離された多重特異性抗体を製造する方法であって、
変異Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑを有する第１の重鎖又はそのフラグメントと第１の軽鎖とを含む第１の親抗体を与えることと、
３０７及び３０９位に野生型アミノ酸残基を有する第２の重鎖又はそのフラグメントと第２の軽鎖とを含む第２の親抗体を与えることと、
第１の親抗体と第２の親抗体とを試料中で接触させることと、
試料をインキュベートすることと、
プロテインＡリガンド親和性クロマトグラフィーを使用して多重特異性抗体を精製することとを含む、方法も提供する。

本発明はまた、変異Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑを有する第１の重鎖又はそのフラグメントと、３０７及び３０９位に野生型アミノ酸残基を有する第２の重鎖又はそのフラグメントとを含む、単離された多重特異性抗体を製造する方法であって、
変異Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑを有する第１の重鎖又はそのフラグメントと第１の軽鎖とを含む第１の親抗体を与えることと、
３０７及び３０９位に野生型アミノ酸残基を有する第２の重鎖又はそのフラグメントと第２の軽鎖とを含む第２の親抗体を与えることと、
第１の親抗体と第２の親抗体とを試料中で接触させることと、
試料をインキュベートすることと、
プロテインＡリガンド親和性クロマトグラフィーを使用して多重特異性抗体を精製することとを含む、方法も提供する。

本発明はまた、変異Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１の重鎖又はそのフラグメントと、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２の重鎖又はそのフラグメントとを含む、単離された多重特異性抗体を製造する方法であって、
変異Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１の重鎖又はそのフラグメントと第１の軽鎖とを含む第１の親抗体を与えることと、
３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２の重鎖又はそのフラグメントと第２の軽鎖とを含む第２の親抗体を与えることと、
第１の親抗体と第２の親抗体とを試料中で接触させることと、
試料をインキュベートすることと、
プロテインＡリガンド親和性クロマトグラフィーを使用して多重特異性抗体を精製することとを含む、方法も提供する。

本発明はまた、変異Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１の重鎖又はそのフラグメントと、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２の重鎖又はそのフラグメントとを含む、単離された多重特異性抗体を製造する方法であって、
変異Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１の重鎖又はそのフラグメントと第１の軽鎖とを含む第１の親抗体を与えることと、
３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２の重鎖又はそのフラグメントと第２の軽鎖とを含む第２の親抗体を与えることと、
第１の親抗体と第２の親抗体とを試料中で接触させることと、
試料をインキュベートすることと、
プロテインＡリガンド親和性クロマトグラフィーを使用して多重特異性抗体を精製することとを含む、方法も提供する。

多重特異性抗体のＶＨ及びＶＬ領域は、所望の抗原に特異的な抗体の既存のＶＨ／ＶＬ領域に由来するか、又は新規に作製された親抗体のＶＨ／ＶＬドメインに由来するものとすることができる。

親抗体は、様々な技術を使用して新規に作製することができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５，１９７５のハイブリドーマ法を使用して親抗体を作製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス又は他の宿主動物、例えばハムスター、ラット又はサルなどを、抗原で免疫した後、標準的な方法を使用して、免疫した動物由来の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）。１個の不死化したハイブリドーマ細胞から発生したコロニーを、結合特異性、交差反応性又はその欠如、及び抗原親和性などの所望の特性を有する抗体の作製についてスクリーニングする。

ゲノム内にヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を有するトランスジェニックマウスを使用して、所望の抗原に対する親抗体を作製することができ、例えば、国際公開第９０／０４０３６号、米国特許第６１５０５８４号、国際公開第９９／４５９６２号、同第０２／０６６６３０号、同第０２／４３４７８号、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−９，１９９４；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ ７：１３−２１，１９９４；Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−９５，１９９８；Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：６５−９３，１９９５；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：１３２３−１３２６，１９９１；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：８４５−８５１，１９９６；Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １５：１４６−１５６，１９９７；Ｇｒｅｅｎ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１−２３，１９９９；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９：１２３６−１２４３，１９９９；Ｂｒuｇｇｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｇ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５−４５８，１９９７；国際公開第０２／０４３４７８号）に記載されている。そのようなマウスにおける内因性免疫グロブリン遺伝子座は、破壊又は欠失されてよく、相同又は非相同組み換え、導入染色体（transchromosome）、又はミニ遺伝子を使用して、少なくとも１つの完全な又は部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座をマウスゲノム内に挿入することができる。Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ＿ｃｏｍ）、Ｈａｒｂｏｕｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｈａｒｂｏｕｒａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ＿ｃｏｍ）、Ｏｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（ＯＭＴ）（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｏｍｔｉｎｃ＿ｎｅｔ）、ＫｙＭａｂ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｋｙｍａｂ＿ｃｏｍ）、Ｔｒｉａｎｎｉ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ．ｔｒｉａｎｎｉ＿ｃｏｍ）、及びＡｂｌｅｘｉｓ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ａｂｌｅｘｉｓ＿ｃｏｍ）などの企業は、上記の技術を使用して、選択抗原を標的としたヒト抗体を提供するべく取り組んでいる場合がある。

親抗体はファージディスプレイライブラリーから選択することもでき、ここでファージは、ヒト免疫グロブリン、あるいは例えばＦａｂ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、又は非対化若しくは対化抗体可変領域などのそれらの部分を発現するよう改変されている。親抗体は、例えば、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５−９６，２０１０及び国際公開第０９／０８５４６２号に記載されているバクテリオファージｐＩＸ被覆タンパク質との融合タンパク質として抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を発現するファージディスプレイライブラリーから、単離され得る。ライブラリーを、所望の抗原に対するファージの結合についてスクリーニングして、得られた陽性クローンの特性評価を更に行い、Ｆａｂをクローンのライセートから単離し、完全長のＩｇＧとして発現させることができる。ヒト抗体を単離するためのかかるファージディスプレイ法は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５８０，７１７号、同第５，９６９，１０８号、同第６，１７２，１９７号、同第５，８８５，７９３号、同第６，５２１，４０４号、同第６，５４４，７３１号、同第６，５５５，３１３号、同第６，５８２，９１５号、及び同第６，５９３，０８１号に記載されている。

単離されたＶＨ／ＶＬ領域は、標準的なクローニング法を使用して、任意のＩｇアイソタイプ、又はＣＨ２−ＣＨ３領域のような抗体定常ドメインの一部としてクローニングすることができる。標準的な方法を用いて、Ｆｃ変異を親抗体に導入することができる。

いくつかの実施形態では、第１の親抗体及び第２の親抗体は、精製抗体として与えられる。

いくつかの実施形態では、第１の親抗体及び第２の親抗体は、第１の親抗体及び第２の親抗体を発現する細胞から回収された細胞培地中で与えられる。

いくつかの実施形態では、第１の親抗体及び第２の親抗体は、細胞内で同時発現される。

本明細書では、本発明の多重特異性抗体の作製は、親抗体が未精製抗体として粗抽出物中に与えられる場合に生じることが実証されている。粗抽出物から多重特異性抗体を精製することが可能であれば、１つの精製工程しか必要とされないために下流処理のコストが低減される。

親抗体同士が互いに接触させられた時点でインキュベーション工程が行われる。

いくつかの実施形態では、インキュベーションは、約２０℃〜約３７℃の温度で行われる。

いくつかの実施形態では、インキュベーションは、約２５℃〜約３７℃の温度で行われる。

いくつかの実施形態では、インキュベーションは、約２５℃〜約３７℃の温度で約９０分〜約６時間行われる。

いくつかの実施形態では、インキュベーション工程中に還元剤を添加する。

いくつかの実施形態では、還元剤は、２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）である。

いくつかの実施形態では、還元剤は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）である。

いくつかの実施形態では、還元剤は、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）である。

いくつかの実施形態では、還元剤は、グルタチオンである。

いくつかの実施形態では、還元剤は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である。

いくつかの実施形態では、還元剤は、Ｌ−システインである。

いくつかの実施形態では、還元剤は、β−メルカプトエタノールである。

いくつかの実施形態では、還元剤は、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で存在する。

いくつかの実施形態では、２−ＭＥＡは、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で存在する。

いくつかの実施形態では、２−ＭＥＡは、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭの濃度で存在する。

例えば、少なくとも２０℃の温度で、少なくとも２５ｍＭの２−ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５〜８、例えばｐＨ７．０又はｐＨ７．４で、少なくとも９０分間のインキュベートを用いることができる。

いくつかの実施形態では、プロテインＡリガンドクロマトグラフィーでｐＨ勾配を用いる。

いくつかの実施形態では、ｐＨ勾配は、約ｐＨ７．０〜約ｐＨ３．０である。

いくつかの実施形態では、ｐＨ勾配は、約ｐＨ４．６〜約ｐＨ３．４である。

いくつかの実施形態では、多量体抗体は、約ｐＨ４．４〜約ｐＨ４．１で溶出する。

いくつかの実施形態では、ｐＨ勾配は、ｐＨ ４．６、ｐＨ ４．１及びｐＨ ３．４の段階勾配である。

いくつかの実施形態では、プロテインＡリガンドクロマトグラフィーは、クエン酸塩緩衝液を用いる。

いくつかの実施形態では、プロテインＡリガンドクロマトグラフィーは、５０ｍＭクエン酸塩緩衝液を用いる。

いくつかの実施形態では、プロテインＡリガンドクロマトグラフィーは、酢酸塩緩衝液を用いる。

いくつかの実施形態では、プロテインＡリガンドクロマトグラフィーは、４０ｍＭ酢酸塩緩衝液を用いる。

プロテインＡクロマトグラフィーは、ｍＡｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、又はバッチモードで行うことができる。培養上清は、製造者のカラム仕様に従って、追加の処理を行うことなくカラムに直接ロードする。５０ｍＭクエン酸塩ｐＨ４．７、ｐＨ４．２又はｐＨ３．４を含む緩衝液を用い、ｐＨ段階勾配を用いて抗体を溶出させる。溶出画分を回収し、分析に先立って１ｍｇ／ｍＬ超の濃度まで濃縮する。単離された多量体抗体の純度は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて評価することができる。

物質の組成：本発明の多量体タンパク質
本明細書で特定される変異は、多量体タンパク質が、非対称のＱ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ変異を有するＣＨ２−ＣＨ３領域をそれぞれが有する少なくとも２個のポリペプチド鎖を有するものである限り、任意の多量体タンパク質をその親タンパク質から単離するために使用することができる。

本発明はまた、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む多量体タンパク質であって、第１のポリペプチドが、変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域を含み、第２のポリペプチドが、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域を含み、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、多量体タンパク質も提供する。

本発明はまた、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む多量体タンパク質であって、第１のポリペプチドが、変異Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域を含み、第２のポリペプチドが、３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域を含み、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、多量体タンパク質も提供する。

本発明はまた、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む多量体タンパク質であって、第１のポリペプチドが、変異Ｑ３１１Ｋを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域を含み、第２のポリペプチドが、３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域を含み、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、多量体タンパク質も提供する。

本発明はまた、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む多量体タンパク質であって、第１のポリペプチドが、変異Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域を含み、第２のポリペプチドが、３０７及び３０９位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域を含み、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、多量体タンパク質も提供する。

本発明はまた、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む多量体タンパク質であって、第１のポリペプチドが、変異Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域を含み、第２のポリペプチドが、３０７及び３０９位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域を含み、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、多量体タンパク質も提供する。

本発明はまた、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む多量体タンパク質であって、第１のポリペプチドが、変異Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域を含み、第２のポリペプチドが、３０７、３０９、３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域を含み、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、多量体タンパク質も提供する。

本発明はまた、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む多量体タンパク質であって、第１のポリペプチドが、変異Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域を含み、第２のポリペプチドが、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域を含み、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、多量体タンパク質も提供する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、ＩｇＧ１アイソタイプである。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、ＩｇＧ２アイソタイプである。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、ＩｇＧ４アイソタイプである。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域は、第２のＣＨ２−ＣＨ３領域と比較してプロテインＡリガンドに対する結合が低下している。

いくつかの実施形態では、プロテインＡリガンドは、黄色ブドウ球菌のプロテインＡを含む。

いくつかの実施形態では、プロテインＡリガンドは、Ｚドメインを含む。

いくつかの実施形態では、プロテインＡリガンドは、Ｙドメインを含む。

いくつかの実施形態では、Ｚドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、プロテインＡリガンドは、配列番号９９、１００、又は１０１のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、多量体タンパク質は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域に非対称安定化変異を更に有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域における、又は第２のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第１のＣＨ２−ＣＨ３領域における非対称の安定化変異は、
それぞれＦ４０５Ｌ及びＫ４０９Ｒ、
それぞれ、野生型及びＦ４０５Ｌ／Ｒ４０９Ｋ、
それぞれ、Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、
それぞれ、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ及びＴ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、
それぞれ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ及びＴ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、
それぞれ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、
それぞれ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ及びＴ３９４Ｗ、
それぞれ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ及びＦ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、
それぞれ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ及びＦ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、
それぞれ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、
それぞれ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、
それぞれ、Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、
それぞれ、Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５６Ｋ及びＫ４０９Ｄ／Ｋ３９２Ｄ、又は
それぞれ、Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５６Ｋ／Ｅ３５７Ｋ及びＫ４０９Ｄ／Ｋ３９２Ｄ／Ｋ３７０である。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、
それぞれ、配列番号２及び２２、
それぞれ、配列番号３及び２２、
それぞれ、配列番号４及び２２、
それぞれ、配列番号５及び２２、
それぞれ、配列番号６及び２３、
それぞれ、配列番号７及び２３、
それぞれ、配列番号８及び２３、
それぞれ、配列番号９及び２３、
それぞれ、配列番号１０及び２４、
それぞれ、配列番号１１及び２４、
それぞれ、配列番号１２及び２４、
それぞれ、配列番号１３及び２４、
それぞれ、配列番号１４及び２５、
それぞれ、配列番号１５及び２５、
それぞれ、配列番号１６及び２５、
それぞれ、配列番号１７及び２５、
それぞれ、配列番号１８及び２６、
それぞれ、配列番号１９及び２６、
それぞれ、配列番号２０及び２６、
それぞれ、配列番号２１及び２６、
それぞれ、配列番号５２及び５４、
それぞれ、配列番号５２及び５５、
それぞれ、配列番号５３及び５４、
それぞれ、配列番号５３及び５５、
それぞれ、配列番号５６及び５４、又は、
それぞれ、配列番号５６及び５５のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び／又は第２のＣＨ２−ＣＨ３領域は、異種タンパク質と結合される。

いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、ペプチドである。

いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、受容体の細胞外ドメインである。

いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、リガンドの細胞外ドメインである。

いくつかの実施形態では、異種タンパク質は分泌タンパク質である。

いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、ｓｃＦＶである。

いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、重鎖可変領域（ＶＨ）である。

いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、軽鎖可変領域（ＶＬ）である。

いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインである。

いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、ファイノマーである。

いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び／又は第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＮ末端に、必要に応じてリンカーを介して結合される。

いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び／又は第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＣ末端に、必要に応じてリンカーを介して結合される。

いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、９２、９３、９４、９５、９６、９７又は９８のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、多量体タンパク質は、抗体である。

いくつかの実施形態では、抗体は、多重特異性である。

いくつかの実施形態では、抗体は、二重特異性である。

いくつかの実施形態では、抗体は、単一特異性である。

いくつかの実施形態では、多量体タンパク質は、２個のポリペプチド鎖を含む。

いくつかの実施形態では、多量体タンパク質は、３個のポリペプチド鎖を含む。

いくつかの実施形態では、多量体タンパク質は、４個のポリペプチド鎖を含む。

本発明に包含される例示的な多量体タンパク質のフォーマットを表５に示す。このフォーマットでは、ペプチド（Ｐ）は、受容体の細胞外ドメイン、リガンドの細胞外ドメイン、分泌タンパク質、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、又はファイノマーであってよい。このフォーマットでは、リンカー（Ｌ）は、場合により存在しなくてもよい。例示的なリンカーを表６に示す。表中のアスタリスク（^＊）は、本明細書に記載されているように、２個のＣＨ２−ＣＨ３ドメインが非対称な変異を有することを示す。

本発明の多量体タンパク質は、標準的な方法を使用して、多重特異性抗体について本明細書に記載されるように更に改変することができる。本発明の多量体タンパク質は、標準的なクローニング法を用いて作製することができる。

ポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞
本発明はまた、本発明の多量体タンパク質のＣＨ２−ＣＨ３領域、抗体重鎖、抗体軽鎖、又はポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドも提供する。

本発明はまた、単離されたポリヌクレオチドであって、
変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域をコードするポリヌクレオチドを含むか、
変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域とをコードするポリヌクレオチドを含むか、又は
配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、８７、８８又は９１のポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドも提供する。

本発明のポリヌクレオチド配列は、目的とする宿主細胞内でのヌクレオチド配列の発現を可能とするプロモーター又はエンハンサーのような１つ以上の調節エレメントと機能的に連結されてもよい。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡであってもよい。

本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。このようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現用ベクター、トランスポゾンベースのベクター、又は任意の手段によって所与の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明の合成ポリヌクレオチドを導入するのに好適な任意の他のベクターであってよい。本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドがコードするＣＨ２−ＣＨ３領域を確実に発現させる発現ベクター（複数可）内の制御配列と機能的に連結されてもよい。このような制御配列としては、シグナル配列、プロモーター（例えば、天然に付随する又は異種のプロモーター）、エンハンサーエレメント、及び転写終結配列が挙げられ、抗体を発現するように選択された宿主細胞と適合するように選択される。ベクターを適当な宿主に取り込ませた後、取り込まれたポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質の高レベルの発現に適した条件下に宿主を維持する。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２７及び４７のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２８及び４７のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２９及び４７のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号３０及び４７のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号３１及び４８のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号３２及び４８のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号３３及び４８のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号３４及び４８のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号３５及び４９のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号３６及び４９のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号３７及び４９のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号３８及び４９のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号３９及び５０のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４０及び５０のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４１及び５０のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４２及び５０のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４３及び５１のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４４及び５１のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４５及び５１のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４６及び５１のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号８７及び８９のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号８７及び９０のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号８８及び８９のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号８８及び９０のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号９２及び８９のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号９２及び９０のポリヌクレオチドを含む。

表７は、代表的なＣＨ２−ＣＨ３領域のｃＤＮＡ配列を示す。

好適な発現ベクターは、典型的には、エピソームとして、又は宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分として、宿主生物において複製可能である。通常、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするため、アンピシリン耐性、ヒグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性、又はネオマイシン耐性などの選択マーカーを含む。

好適なプロモーター及びエンハンサーエレメントは、当該技術分野において既知である。真核細胞における発現の場合、代表的なプロモーターとしては、軽鎖及び／又は重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーター及びエンハンサーエレメント、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、早期及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルス由来の末端反復配列中に存在するプロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター、並びに様々な分野で公知の組織特異的プロモーターが挙げられる。適切なベクター及びプロモーターの選択は、当業者の技量の範囲内である。

多くの適当なベクター及びプロモーターが知られており、その多くが組み換えコンストラクトを作製するために市販されている。代表的なベクターとしては、ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓ ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））、並びに、ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などの真核生物ベクターなどの、細菌での発現用のベクターがある。

本発明はまた、本発明の１つ以上のベクターを含む宿主細胞を提供する。「宿主細胞」は、ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代、また特定の対象細胞から生成された安定な細胞株も指すことを意図すると理解される。変異又は環境による影響のいずれかにより、後続世代においてある特定の改変が生じる可能性があるため、そのような後代は親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内には依然として含まれる。そのような宿主細胞は、真核細胞、原核細胞、植物細胞、又は古細菌細胞であってよい。原核宿主細胞の例は、大腸菌（Escherichia coli）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）などの桿菌、並びにサルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）、及び様々なシュードモナス属（Pseudomonas）の種などの他の腸内細菌科のものである。酵母などの他の微生物も発現に有用である。好適な酵母宿主細胞の例は、サッカロミセス（Saccharomyces）（例えば、Ｓ．セレビジアエ（S. cerevisiae））及びピキア（Pichia）である。代表的な真核細胞は、哺乳動物、昆虫、鳥類、又は他の動物由来のものであってもよい。哺乳類真核細胞としては、不死化細胞株（例えばハイブリドーマ）又は骨髄腫細胞株（例えばＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ、ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）マウス細胞株）が挙げられる。例示的なヒト骨髄腫細胞株は、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ））、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−６１）、又はＤＧ４４などの、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するものが挙げられる。

本発明はまた、多重特異性抗体が発現される条件下で本発明の宿主細胞を培養することと、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを用いて多重特異性抗体を精製することとを含む、本発明の単離された多重特異性抗体を製造する方法も提供する。

医薬組成物、投与、及び治療方法
本発明はまた、本発明の多重特異性抗体又は多量体タンパク質と、製薬上許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。治療用途では、本発明の多重特異性抗体又は多量体タンパク質は、製薬上許容される担体中に活性成分として有効量の本発明の多重特異性抗体又は多量体タンパク質を含有する医薬組成物として調製することができる。「担体」とは、活性化合物と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。このようなビヒクルは、水、及び石油、動物、植物又は合成物由来のものを含む油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いることができる。これらの溶液は滅菌され、一般には粒子状物質を含まない。これらは、通常の周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。この組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる医薬的に許容される補助物質、例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤等を含有することができる。そのような医薬製剤中の本発明の多重特異性抗体又は多量体タンパク質の濃度は幅広く異なってもよく、即ち約０．５重量％未満から、通常は少なくとも約１重量％まで、最大で１５又は２０重量％までであってよく、また、選択される特定の投与方法に従って、必要とされる用量、流体体積、粘度等に主に基づいて選択される。好適なビヒクル、及び他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ ２００６，Ｐａｒｔ ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｐ６９１−１０９２に記載され、特にｐｐ．９５８−９８９を参照されたい。

本発明の多重特異性抗体又は多量体タンパク質の治療用途での投与方法は、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は皮下、肺内；経粘膜（口内、鼻腔内、膣内、直腸）投与で、錠剤、カプセル剤、液剤、散剤、ゲル剤、粒剤状の製剤を用いて、また注射器、埋め込み式装置、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ内に収容させて、又は当該技術分野では周知の、当業者により認識される他の手段などの、宿主に薬剤を送達する任意の適当な経路とすることができる。部位特異的投与は、例えば、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮送達によって達成され得る。

医薬組成物は、本明細書に述べられる医薬組成物を含む容器を含むキットとして供給することができる。医薬組成物は、例えば１回又は複数用量用の注射用溶液の形態で、又は注射の前に戻される滅菌粉末として提供することができる。あるいは、かかるキットは、医薬組成物を投与するための乾燥粉末分散器、液体エアゾール発生器、又はネブライザーを含むことができる。かかるキットは、医薬組成物の指示及び使用について書かれた情報を更に含むことができる。

多重特異性抗体及び他の多量体タンパク質は、それらの特異性に応じてヒト対象の任意の状態を治療するために使用することができる。

本発明は一般論として記述されてきているが、本発明の実施形態は、特許請求の範囲を限定するように解釈されるべきではない以下の実施例で更に開示される。

実施例１．プロテインＡへのＦｃの結合を低減し得るＦｃ突然変異の設計
ＦｃＲｎ及びプロテインＡのＺドメインは、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの界面でＦｃに結合し、Ｆｃ上の同じ残基の多くと接触する。マウスＩｇＧ２ａ／ｂは、ヒトＩｇＧ１よりも弱くＺドメインに結合するのに対してＦｃＲｎにはいずれも結合することから、マウスＩｇＧ２ａのＣＨ２ドメインでは保存されていない位置が、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインのＺドメイン結合界面で特定された。図１Ａは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインとマウスＩｇＧ２ａのＣＨ２ドメインの残基３０５と３１５との間のアラインメントを示す。３０５、３０７、３０９、３１４及び３１５位の残基がヒト配列とマウス配列とで異なっていたことから、ヒトＩｇＧ１に逆変異Ｔ３０７Ｐ及び／又はＬ３０９Ｑを導入することによって、ＦｃＲｎとの相互作用に影響を及ぼすことなく、プロテインＡとの結合性が低下した操作されたＩｇＧ１変異体が生じるものと仮定された。ヒトＩｇＧ１のバリン３０５はＣＨ２ドメインのβ鎖内に位置し、プロテインＡともＦｃＲｎとも相互作用しない。ロイシン３１４及びアスパラギン３１５は、ヒトＩｇＧとマウスＩｇＧとで異なっているが、それらの相違は保存的である（例えば、ヒトＩｇＧのＬ３１４は、マウスＩｇＧでは別の疎水性残基Ｌ／Ｍ３１４に変わっており、Ｎ３１５はマウスＩｇＧでは別の極性残基Ｓ３１５に変わっている）。したがって、３０７及び３０９位における変化が、ヒトＩｇＧ１のプロテインＡ及びＦｃＲｎとの相互作用に最も大きな影響を及ぼすものと推論された。

ＺドメインとＦｃとの複合体（Ｚ３４Ｃペプチド、Ｚドメインに由来するジスルフィド結合した２個の螺旋のバンドル、ＰＤＢ ＩＤ：１Ｌ６Ｘ）の結晶構造の分析により、ＩｇＧ１のＦｃの残基Ｑ３１１は、主として疎水性相互作用を介してＺドメイン上のＦ９、Ｌ１３、Ｒ２３、Ｎ２４及びＩ２７（残基の番号付けは配列番号９９に従う）と相互作用することが明らかになった（図１Ｂ）。これに対して、ＩｇＧ１のＦｃの残基Ｑ３１１は、ＦｃＲｎのαサブユニットのＥ１１５及びＥ１１６（配列番号１０３の残基Ｅ４及びＥ５に対応）を含むＦｃＲｎの主として酸性の表面と相互作用した（ＰＤＢ ＩＤ：４Ｎ０Ｕ）。Ｆｃの残基Ｑ３１１を変異させることによって、得られる変異体（複数可）のＺドメイン及びＦｃＲｎとの結合に異なる影響が及ぼされるものと仮定された。図１Ｂは、カットオフ距離５ÅでＦｃＲｎ又はＺドメインと接触しているＦｃ残基を示す。

実施例２．実験に使用した単一特異性及び二重特異性抗体の作製
変異Ｔ３０７Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｑ３１１Ｋ、Ｑ３１１Ｅ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ又はＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを、標準的な分子生物学的手法を用いて異なる単一特異性抗体の両方の重鎖に遺伝子操作により導入した。

一般的な軽鎖技術を用いるか、又はＤｕｏｂｄｙ（登録商標）技術又はノブインホール技術を用いてＦａｂアーム交換を促進することによって二重特異性ｍＡを作製した。一般的な軽鎖技術では、軽鎖を共有することが知られている抗ＴＮＦα抗体及び抗αＶβ５抗体を使用した。ノブインホール技術では、ノブ（Ｔ３６６Ｗ変異）又はホール（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異）のいずれかを親単一特異性抗体に導入した。Ｄｕｏｂｄｙ（登録商標）技術では、Ｆ４０５Ｌ又はＫ４０９Ｒ変異を親単一特異性抗体に導入した。

作製された二重特異性抗体は、一方の重鎖のみにプロテインＡ結合を阻害又は低減し得る変異（複数可）を保有していた（Ｔ３０７Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｑ３１１Ｋ、Ｑ３１１、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ及びＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ）（例えば、非対称変異）。

Ａｂを、軽鎖：重鎖のプラスミド＝３：１のモル比を用い、製造者のプロトコールに従ってＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で発現させた。同時トランスフェクション物を、軽鎖：重鎖１：重鎖２のプラスミド＝３：０．５：０．５のモル比を用いて調製した。培養上清を、５日間の発現期間後に濾過により回収した。既知の濃度のアイソタイプコントロール標準に対して表面二重層干渉法を用いて力価を推定した。製造者のプロトコールに従ってＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより親Ａｂを精製した。プロテインＡとの結合性を変化させた変異体を、製造者のプロトコールに従ってプロテインＧ親和性クロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。

表８は、作製した単一特異性抗体を示す。

表９は、作製した二重特異性（ｂｓ）抗体を示す。

作製した抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列：
配列番号６８ ｇｐ１２０−Ｒ ＨＣ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＱＡＳＧＹＲＦＳＮＦＶＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＦＥＷＭＧＷＩＮＰＹＮＧＮＫＥＦＳＡＫＦＱＤＲＶＴＦＴＡＤＴＳＡＮＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＧＰＹＳＷＤＤＳＰＱＤＮＹＹＭＤＶＷＧＫＧＴＴＶＩＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号６９ ｇｐ１２０−Ｒ ＬＣ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＦＳＣＲＳＳＨＳＩＲＳＲＲＶＡＷＹＱＨＫＰＧＱＡＰＲＬＶＩＨＧＶＳＮＲＡＳＧＩＳＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＴＲＶＥＰＥＤＦＡＬＹＹＣＱＶＹＧＡＳＳＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＲＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

配列番号７０ ＲＳＶ−Ｌ ＨＣ
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号７１ ＲＳＶ ＬＣ
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＱＳＶＤＹＮＧＩＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＰＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＩＩＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

配列番号７２ ＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ａ］ＨＣ
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＡＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号７３ ＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｋ］ＨＣ
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＫＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号７４ ＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］ＨＣ（Ｑ３１１Ｒ／Ｆ４０５Ｌ）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＲＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号７５ ＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｈ］ＨＣ（Ｑ３１１Ｈ／Ｆ４０５Ｌ）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＨＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号７６ ＲＳＶ−Ｌ［ＴＬ］ＨＣ（Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｆ４０５Ｌ）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＶＱＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号７７ ＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］ＨＣ（Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ／Ｆ４０５Ｌ）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＶＱＨＲＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号７８ ＲＳＶ−Ｌ［Ｉ２５３Ｄ］ＨＣ（Ｉ２５３Ｄ／Ｆ４０５Ｌ）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＤＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号７９ ａＶｂ５ ＨＣ
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＲＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＦＤＧＳＮＫＹＹＶＧＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＥＮＴＬＹＬＱＶＮＩＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＡＲＧＳＹＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号８０ ＴＮＦ及び抗ａＶｂ５ ＬＣ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

配列番号８１ ＴＮＦ ＨＣ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＳＬＳＣＡＡＳＧＦＩＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＮＧＬＥＷＶＡＦＭＳＹＤＧＳＮＫＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＥＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＩＡＡＧＧＮＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号８２ ＴＮＦ−［Ｑ３１１Ｒ］ＨＣ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＳＬＳＣＡＡＳＧＦＩＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＮＧＬＥＷＶＡＦＭＳＹＤＧＳＮＫＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＥＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＩＡＡＧＧＮＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＲＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号８３ ＴＮＦ−［ＴＬＱ］ＨＣ（Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＳＬＳＣＡＡＳＧＦＩＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＮＧＬＥＷＶＡＦＭＳＹＤＧＳＮＫＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＥＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＩＡＡＧＧＮＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＶＱＨＲＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号８４ ＴＮＦ−ノブ［Ｑ３１１Ｒ］ＨＣ（Ｑ３１１Ｒ／Ｔ３６６Ｗ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＳＬＳＣＡＡＳＧＦＩＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＮＧＬＥＷＶＡＦＭＳＹＤＧＳＮＫＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＥＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＩＡＡＧＧＮＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＲＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号８５ ＴＮＦ−ノブ［ＴＬＱ］ＨＣ（Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ／Ｔ３６６Ｗ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＳＬＳＣＡＡＳＧＦＩＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＮＧＬＥＷＶＡＦＭＳＹＤＧＳＮＫＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＥＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＩＡＡＧＧＮＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＰＶＱＨＲＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号８６ ａＶｂ５−ホールＨＣ（Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＲＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＦＤＧＳＮＫＹＹＶＧＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＥＮＴＬＹＬＱＶＮＩＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＡＲＧＳＹＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

実施例３．Ｚドメイン及びＦｃＲｎへの結合に対するＴ３０７、Ｌ３０９及び／又はＱ３１１変異の影響
Ｚドメインに対する単一特異性ＩｇＧ１変異体の結合
表８に示すようなＦｃ変異を有する単一特異性抗ＲＳＶ抗体を実験に使用した。

ｐＨ４．０９でプロテインＡ樹脂からＲＳＶ−Ｌが溶出した。Ｔ３０７Ａ変異がプロテインＡの結合に影響を及ぼさなかった（データは示さず）のに対して、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ変異（ｍＡｂ ＲＳＶ−Ｌ［ＴＬ］）は、プロテインＡへの結合の中度の低下をもたらし、このｍＡｂをｐＨ ４．４８で溶出させた。プロテインＡとの結合に対する更なる減弱効果は、対称的なＱ３１１Ｋ又はＱ３１１Ｒ変異によって得られたが、Ｑ３１１Ａ変異によっては得られなかった。三重変異Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ（ｍＡｂ ＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］）の導入により、溶出ｐＨの上昇（ｐＨ４．７０）によって示されるようにプロテインＡとの相互作用は更に妨げられた。表１０は、作製したＩｇＧ１変異体の溶出ｐＨの値を示す。

これらの結果は、Ｑ３１１Ｋ、Ｑ３１１Ｒ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ及びＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ対称変異のそれぞれが、プロテインＡへの変異体ＩｇＧ１の結合性を低下させ、親変異体ＩｇＧ１から作製された非対称変異を有する二重特異性抗体の、差次的なプロテインＡの溶出に基づいた精製及び分離を可能とし得ることを示すものである。

ＩｇＧ１変異体のＦｃＲｎへの結合
３１１位における導入された単一位置変異体（Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ａ、Ｑ３１１Ｋ及びＱ３１１Ｈ）のいずれにおいても、単一特異性抗体のＦｃＲｎとの相互作用は阻害されなかった。Ｑ３１１Ｒ変異は、ＦｃＲｎとの結合能力をある程度向上させ、この変異が血清中半減期を延長させる可能性を示唆した。ＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］は、ＲＳＶ−Ｌと比較した場合に同様の親和性でＦｃＲｎに結合した。非対称Ｆ４０５Ｌ Ｑ３１１Ｒ（ｂｓＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］）又はＦ４０５Ｌ／Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ変異（ｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］）を有する二重特異性ＩｇＧ１抗体も、野生型ＩｇＧ１と比較して同等の親和性でＦｃＲｎに結合した。図２Ａは、Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ａ、Ｑ３１１Ｋ又はＱ３１１Ｈ変異を有するＩｇＧ１変異体のＦｃＲｎに対する競合結合の用量反応曲線を示す。図２Ｂは、対称（例えば、単一特異性ｍＡｂとしてＲＳＶ−Ｌ、ＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］、ＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］）又は非対称（例えば、二重特異性ｍＡｂとしてｂｓＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］、ｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］）のＱ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ変異のいずれかを有するＩｇＧ１変異体のＦｃＲｎに対する競合結合の用量反応曲線を示す。Ｉ２５３Ｄ変異は、ＦｃＲｎとの相互作用を阻害することが知られており、これをネガティブコントロールとして用いた。

Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ａ、Ｑ３１１Ｋ又はＱ３１１Ｈの変異は、ＦｃＲｎとの相互作用を阻害しなかった。Ｑ３１１Ｒの変異は、ＦｃＲｎとの相互作用を高めた。一方又は両方の重鎖へのＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ変異の導入は、ＦｃＲｎとの相互作用を阻害しなかった。これらの結果は、非対称のＱ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ変異を有する二重特異性抗体は、差次的なプロテインＡ精製によってそれらの親単一特異性抗体から単離及び精製することが可能であることを示唆するものである。更に、これらの抗体は、野生型ＩｇＧ１と比較して血清中半減期がより長くなり得る。

方法
Ｔ３０７Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｑ３１１Ｋ、Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｈ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ及びＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ変異を、単一特異性の親抗ＲＳＶ抗体又は抗ｇｐ１２０抗体に遺伝子操作により導入した。Ｆａｂアーム交換を用いて二重特異性抗ＲＳＶ／ｇｐ１２０抗体を作製するため、親抗体を、Ｆ４０５Ｌ変異（抗ＲＳＶ ｍＡｂ）又はＫ４０９Ｒ変異（抗ｇｐ１２０ ｍＡｂ）を有するように更に操作した。これらの変異がＺドメイン及びＦｃＲｎとの結合をどの程度調節するかを評価した。

実験で使用したＺドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。

プロテインＡとの結合
両方のアームに変異を有する各親ｍＡｂについて、１ｍｇを１ｍＬのｍＡｂＳｅｌｅｃｔ ｓｕｒｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし、１×ＰＢＳ（ｐＨ ７．２）〜５０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ ３．５）までの３０ｍＬの勾配を用いて１ｍＬ／分で溶出した。２８０ｎｍの吸光度及びｐＨをモニターした。ピーク最大でのｐＨ値を用いて分取実験用の溶出ｐＨを決定した。

ＦｃＲｎとの結合
α−スクリーンアッセイを用いてＦｃＲｎとの結合をインビトロで評価した。これらのアッセイでは、ビオチン化ＩｇＧをストレプトアビジンでコーティングしたドナービーズに結合させ、Ｈｉｓタグ化したＦｃＲｎをＮｉコーティングしたアクセプタービーズに結合させた。２つのタンパク質間の結合によって発光シグナルが生じた。標識されていない野生型又は変異体ＩｇＧを使用して結合を競合させたところ、シグナルは用量依存的に低下した。ｍＡｂを、ＳｕｒｅＬＩＮＫ Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｉｃ Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ＫＰＬ Ｉｎｃ．）を使用して製造業者のプロトコールに従ってビオチン化した。Ｈｉｓタグ化したＦｃＲｎをＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。０．０５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を添加した、ｐＨ ６．０に調整した１×ＰＢＳ中でアッセイを行った。１μｇ／ｍＬのビオチン化した野生型ＩｇＧ１を、ストレプトアビジンを結合させたドナービーズに結合させ、０．２μｇ／ｍＬのＨｉｓタグ化したＦｃＲｎを、ニッケルを結合させたアクセプタービーズに結合させた。競合Ａｂを０．４ｍｇ／ｍＬで調製し、各点で３倍に連続希釈した。ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して５２０〜６２０ｎｍの発光を記録した。Ｐｒｉｓｍ６．０１ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）及び上記に述べたような４パラメータ競合モデルを用いた当てはめ（Ｖａｆａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：１１４−１２６，２０１４）を用いて、データを分析した。

実施例４．Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｑ、及びＱ３１１Ｒ変異は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）結合にも抗体安定性にも影響を及ぼさない
ＣＨ２−ＣＨ３界面における変異は、Ｆｃの構造を変化させ、Ｆｃの動力学を高め、熱安定性を低下させ、Ｆｃγ受容体との相互作用を変化させることが報告されている（Ｍａｊｕｍｄａｒ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ７：８４−９５，２０１５）。Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ変異がＦｃの構造に同様の影響を有するかどうかを調べるため、これらの変異を有する抗体を、Ｆｃγ受容体に結合する能力及びそれらの熱安定性に関して評価した。

それぞれ、単一特異性又は二重特異性抗体における対称性又は非対称性のＱ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ変異のいずれも、Ｆｃγ受容体とインビトロで相互作用する変異体ＩｇＧ１の能力に影響を及ぼさなかった。Ｆｃγ受容体はＣ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３の界面の代わりにＣ_Ｈ２−ヒンジの界面に結合することから、この結果はある程度予想されたとおりであった。これらの結果はまた、導入された変異が、Ｆｃの全体の構造にも影響しなかったことも示唆した。図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ及び図３Ｄはそれぞれ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩＩａに対する選択された抗体の競合結合の用量反応曲線を示す。グラフは、競合抗体の濃度に対してプロットした最大シグナル（％）を示している。

操作したＩｇＧのＴ_ｍ値の比較により、Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ変異はｍＡｂの熱安定性に影響しないことを示した。表１１は、試験した抗体の示差走査熱量測定（Ｔｍ及びエンタルピー値）のパラメータを示す。これらの結果を合わせると、Ｑ３１１Ｒ及びＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ変異の影響は、プロテインＡとＦｃＲｎとの相互作用に限定されていることが示唆される。

方法
αスクリーンアッセイを使用し、若干の改変を行った実施例２に述べたプロトコールを用いて、ＩｇＧ１変異体のＦｃγＲへの結合を評価した。Ｃ末端Ｈｉｓタグを有するＦｃγＲの可溶性細胞外ドメインをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓより購入した。０．０５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を添加した、１×ＰＢＳ（ｐＨ ７．２）中でアッセイを行った。１μｇ／ｍＬのビオチン化した野生型ＩｇＧ１を、ストレプトアビジンを結合させたドナービーズに結合させ、Ｈｉｓタグ化したＦｃγＲを、ニッケルを結合させたアクセプタービーズに結合させた。ＦｃγＲＩについては、野生型ＩｇＧ１よりも弱く受容体に結合したビオチン化ＩｇＧ１−Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異体を使用してシグナルウインドウを大きくした。使用したＦｃγＲの濃度は、２００ｎｇ／ｍＬ（ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩａ）、１０ｎｇ／ｍＬ（ＦｃγＲＩＩａ）、又は１４ｎｇ／ｍＬ（ＦｃγＲＩＩｂ）とした。競合Ａｂを０．４ｍｇ／ｍＬで調製し、各点で３倍に連続希釈した。

示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して、抗体のアンフォールディングのＴ_ｍ及びエンタルピーを決定した。試料を１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２中で１ｍｇ／ｍＬに希釈した。試料を２５℃で１５分間平衡化した後、１℃／分の速度で２５〜９５℃まで昇温させた。Ｏｒｉｇｉｎソフトウェアを使用してデータを分析した。

実施例５．プロテインＡ樹脂からの溶出による、精製抗体のインビトロＦａｂアーム交換後の親単一特異性ｍＡｂからの二重特異性抗体の分離
二重特異性抗体への非対称的Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ変異の導入によって、親単一特異性ｍＡｂからの二重特異性抗体の精製が容易となった。

インビトロＦａｂアーム交換後に作製された親抗体ＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］及びｇｐ１２０−Ｒ並びに二重特異性ｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］の１：１：１混合物を、差次的なプロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製し、溶出ピークをプールしてＨＩＣにより分析した。

図４Ａは、ＨＩＣクロマトグラフ使用し、開発された条件を用いて、親ｍＡｂ及び二重特異性ｍＡｂの両方を分離できたことを示す。図４Ｂは、プロテインＡカラムに注入された抗体の等モル混合物のＨＩＣクロマトグラフを示す。図４Ｃは、２種の親抗体及び二重特異性抗体の存在と一致する、ｐＨ ４．７、ｐＨ ４．２、及びｐＨ ３．４に３つの異なる溶出ピークを生じた、プロテインＡ樹脂からの抗体混合物の溶出プロファイルを示す。図４Ｄは、プロテインＡの溶出ピークのＨＩＣ分析を示す。ＨＩＣによる溶出ピークの分析は、高ｐＨでの溶出液（ｐＨ４．８）が主に親ＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］ｍＡｂを含有していたのに対して、ｐＨ ３．４の溶出液は主にｇｐ１２０−Ｒ親ｍＡｂを含有していたことを示す。中間ｐＨの溶出液（ｐＨ４．２）は、約９４％の純粋な二重特異性ｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］ｍＡｂを含有していた。表１２は、差次的なプロテインＡ精製から得られたｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］の溶出純度を示す。

方法
親抗体としてＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］及びｇｐ１２０−Ｒを、二重特異性としてｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］ｍＡｂを実験に使用した。

ＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］はプロテインＧ親和性クロマトグラフを使用して精製し、１×ＰＢＳ中に透析した。ｇｐ１２０−ＲはプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製し、１×ＰＢＳ中に透析した。次いで、１ｍｇ／ｍＬの２つの親ｍＡｂでＦａｂアーム交換を行った。簡単に述べると、５ｍｇの各親抗体を、１×ＰＢＳ、７５ｍＭの２−メルカプトエチルアミンを含む緩衝液中で混合し、３１℃で５時間インキュベートした後、１×ＰＢＳに対して重点的に透析を行った。次いで、９５％超のＢｓＡｂを含む得られた材料を、２つの精製した親ｍＡｂと１：１：１のモル比で混合し、この混合物を差次的なプロテインＡの精製実験で使用した。

１ｍＬのｍＡｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、差次的なプロテインＡの精製を行った。５０ｍＭのクエン酸（ｐＨ ４．７、ｐＨ ４．２又はｐＨ ３．４）を含む緩衝液を用いて混合物を３段階で溶出させた。溶出画分を回収し、分析を行う前に１ｍｇ／ｍＬ超の濃度に濃縮した。

差次的なプロテインＡ精製から得られた溶出ピークを、ブチルＮＰＲカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により分析した。約３０μｇの各サンプルをカラムに注入し、１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、１．５Ｍの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、又は１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）を含む緩衝液の０〜１００％の勾配を用いて溶出した。

実施例６．プロテインＡ樹脂からの溶出による、粗上清中でのインビトロＦａｂアーム交換後の親単一特異性ｍＡｂからの二重特異性抗体の分離
上清中での交差材料から作製された二重特異性抗体に非対称Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを導入することによって、親抗体から作製された二重特異性抗体の精製が容易となった。

二重特異性抗体を作製するためのＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）技術では、Ｆａｂアーム交換を行う前に親ｍＡｂを個々に精製する必要がある。しかしながら、ｃＦＡＥ反応は、しばしば二価の親ｍＡｂの残留量を有し、更なる下流での精製工程が必要となる場合がある。したがって、ｐＨ勾配を用いた差次的なプロテインＡクロマトグラフィーの使用によって二重特異性抗体の精製を単純化することができる。精製工程の数を減らすための別の方法として、培養上清を使用してＦａｂアーム交換のプロトコールを行うことがある。この方法では、親ｍＡｂが１：１のモル比で混合されるように、親ｍＡｂの力価を正確に決定する。培養上清を用いたＦａｂアーム交換を制御して行うことにより、プロテインＡの精製工程の数が１つ少なくなり、２回の親抗体精製及び特性評価を行う必要がなく時間が節約されることから、二重特異性抗体を作製するコストを低減することができる。

等当量の親抗体ＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］及びｇｐ１２０−Ｒを含有する細胞培養上清中でのＦａｂアーム交換を用いてｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］及びｂｓＦＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］を作製し、得られた試料をプロテインＡ親和性カラムにかけた。

図５Ａは、ｐＨ ４．７、４．２及び３．４で溶出する３つの異なるピークを示す、上清中でＦａｂアーム交換したｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］の試料のプロテインＡクロマトグラムを示す。

図５Ｂは、上清中でＦａｂアーム交換したｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］からの試料のプロテインＡ親和性カラムのｐＨ ４．７の溶出液のＨＩＣ分析を示す。

図５Ｃは、上清中でＦａｂアーム交換したｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］からの試料のプロテインＡ親和性カラムのｐＨ ４．２の溶出液のＨＩＣ分析を示す。

図５Ｄは、上清中でＦａｂアーム交換したｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］からの試料のプロテインＡ親和性カラムのｐＨ ３．４の溶出液のＨＩＣ分析を示す。

図６Ａは、ｐＨ ４．７、４．２及び３．４で溶出する３つの異なるピークを示す、上清中でＦａｂアーム交換したｂｓＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］の試料のプロテインＡクロマトグラムを示す。

図６Ｂは、上清中でＦａｂアーム交換したｂｓＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］からの試料のプロテインＡ親和性カラムのｐＨ ４．７の溶出液のＨＩＣ分析を示す。

図６Ｃは、上清中でＦａｂアーム交換したｂｓＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］からの試料のプロテインＡ親和性カラムのｐＨ ４．２の溶出液のＨＩＣ分析を示す。

図６Ｄは、上清中でＦａｂアーム交換したｂｓＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］からの試料のプロテインＡ親和性カラムのｐＨ ３．４の溶出液のＨＩＣ分析を示す。

ｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］を作製する上清中Ｆａｂアーム交換では、残留する親ＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］は、ｐＨ ４．７で溶出することにより除去し（図５Ｂ）、残留する親ｇｐ１２０−Ｒは、ｐＨ ３．４で溶出することにより除去した（図５Ｄ）。ｐＨ４．２では、ｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］のみが溶出した（図５Ｃ）。いくらかのｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］がｐＨ ３．４（図５Ｄ）及びｐＨ ４．７（図５Ｂ）で溶出し、精製ｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］の最終収率の低下につながった。表１３は、上清中Ｆａｂアーム交換により作製されたｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］の差次的なプロテインＡ精製による溶出液の純度を示したものである。ｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］は９５％超の純度で単離された。

ｂｓＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］を作製する上清中Ｆａｂアーム交換では、残留する親ＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］は、ｐＨ ４．６で溶出することにより除去し（図６Ｂ）、残留する親ｇｐ１２０−Ｒは、ｐＨ ３．４で溶出することにより除去した（図６Ｄ）。単一変異の、三重変異体Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒよりも強いプロテインＡとの結合のため、親ＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］の効率的な溶出には若干より酸性のｐＨを必要とした。ｐＨ４．２では、ＢｓＡｂのみが溶出した（図６Ｃ）。いくらかのｂｓＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］がｐＨ ３．４（図６Ｄ）及びｐＨ ４．６（図６Ｂ）で溶出し、精製ＢｓＡｂの最終収率の低下につながった。

表１４は、上清中Ｆａｂアーム交換により作製されたｂｓＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］の差次的なプロテインＡ精製による溶出液の純度を示したものである。ｂｓＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］は９５％超の純度で精製された。

結論として、この実験により、上清中Ｆａｂアーム交換によって作製された二重特異性抗体を効率的に分離するうえでＱ３１１Ｒ及びＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ変異の有用性が実証された。

方法
親ｍＡｂとしてＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］又はＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］とｇｐ１２０−ＲとをＥｘｐｉ２９３細胞で発現させ、抗体力価を決定した（Ｏｃｔｅｔ，ＦｏｒｔｅＢｉｏ）。二重特異性抗体ｂｓＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］及びｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］を作製するため、等ミリグラム量のＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］及びｇｐ１２０−Ｒ、又はＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］及びｇｐ１２０−Ｒを含有する培養上清同士を加え合わせ、２−メルカプトエチルアミンを最終濃度７５ｍＭにまで添加した後、３１℃で５時間インキュベートし、１×ＤＰＢＳ（ｐＨ ７．４）中に重点的に透析することにより、０．２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度でＦａｂアーム交換反応を行った（Ｌａｂｒｉｊｎ Ａｒａｎ Ｆ，Ｍｅｅｓｔｅｒｓ Ｊｏｙｃｅ Ｉ ｅｔ ａｌ．２０１４）。透析後、タンパク質を１ｍＬのｍＡｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラム（ＧＥ）にかけ、ｐＨ段階勾配を用いて溶出した。

精製を行う前に、１ｍｇ等当量の精製親ｍＡｂ及び二重特異性抗体を含むコントロール混合物を、１ｍＬのｍＡｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラム（ＧＥ）で分離することによって最適な溶出条件を決定した。ＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］、ｇｐ１２０−Ｒ及びｂｓＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］を含む精製タンパク質ミックスは、３０カラム容量（ＣＶ）にわたって５０ｍＭクエン酸（ｐＨ ４．６）で、次いで３０ＣＶにわたって５０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ ４．２）で、次いで２０ＣＶにわたって５０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ３．４）で溶出することにより、ＢｓＡｂからの親ｍＡｂの最適な分離を示した。ＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］、ｇｐ１２０−Ｒ及びｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］を含む精製タンパク質ミックスは、３０ＣＶにわたって５０ｍＭクエン酸（ｐＨ４．７）で、次いで３０ＣＶにわたって５０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ ４．２）で、次いで２０ＣＶにわたって５０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ３．４）で溶出することにより、二重特異性ｍＡｂからの親ｍＡｂの最適な分離を示した。

したがって、上清中で交差させた親ｍＡｂから作製されたｂｓＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］を、その後の実験において、３０ＣＶにわたって５０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ４．６）で、次いで３０ＣＶにわたって５０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ４．２）で、次いで２０ＣＶにわたって５０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ３．４）で溶出させた。上清中で交差させた親ｍＡｂから作製されたｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］を、その後の実験において、３０ＣＶにわたって５０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ４．７）で、次いで３０ＣＶにわたって５０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ４．２）で、次いで２０ＣＶにわたって５０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ３．４）で溶出させた。それぞれの二重特異性抗体のペアの最適な溶出条件を後の実験で使用した。

疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して分離効率を評価した。各ｐＨ段階からの溶出画分をプールし、Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）で中和し、分析用に濃縮した。試料を等タンパク質濃度で調製し、結合バッファー（０．１ＭのＮａＨＰＯ_４（ｐＨ６．５）、１．５Ｍの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）中に１：２に希釈し、０．１ＭのＮａＨＰＯ_４（ｐＨ６．５）、１．５Ｍの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４で平衡化した４．６ｍｍ×１０ｃｍのＴＳＫｇｅｌ Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＬＬＣ）にかけ、２５分間にわたる０．１ＭのＮａＨＰＯ_４（ｐＨ６．５）までの勾配を用いて０．５ｍＬ／分で溶出させた。

実施例７．同時トランスフェクトした材料から出発する、インビトロＦａｂアーム交換後の親単一特異性ｍＡｂからの二重特異性抗体の分離
Ｆａｂアーム交換の代わりに共通軽鎖技術を利用して作製された二重特異性抗体を精製するうえで、Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ変異を利用することの有用性を評価した。

作製された二重特異性抗体ｂｓＴＮＦ−［ＴＬＱ］及びｂｓＴＮＦ−［Ｑ３１１Ｒ］を、上記の実施例で述べた３段階のｐＨ溶出法を用いて９５％超の純度まで単離した。ｂｓＴＮＦ−［ＴＬＱ］及びｂｓＴＮＦ−［Ｑ３１１Ｒ］はｐＨ４．２で溶出した。更に、親ＴＮＦ−［ＴＬＱ］及びＴＮＦ−［Ｑ３１１Ｒ］はｐＨ ４．７で効率的に溶出し、他の溶出液中でｍＡｂは検出されなかった。ｐＨ ４．２の溶出液から単離されたｂｓＴＮＦ［ＴＬＱ］及びｂｓＴＮＦ［Ｑ３１１Ｒ］の純度は高かったが、これらの二重特異性抗体の収率は、同時トランスフェクトした際の２つの親ｍＡｂの発現レベルが大きく異なっていたことにより（ａＶｂ５の約３５ｍｇ／Ｌに対してＴＮＦ−［ＴＬＱ］の親では約３００ｍｇ／Ｌ）、Ｆａｂアーム交換を用いて作製された二重特異性抗体と比較して若干低かった。親ｍＡの発現レベルの約１０倍の差にもかかわらず、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ変異の導入によって、初期試料中の全抗体集団のわずか１０％程度を占めていたｂｓＴＮＦ−［ＴＬＱ］の９５％超の純度での単離が促進された。表１５に、共通軽鎖技術を用いて作製されたｂｓＴＮＦ−［ＴＬＱ］の差次的なプロテインＡ精製から得られた溶出液の純度を示す。表１６に、共通軽鎖技術を用いて作製されたｂｓＴＮＦ−［Ｑ３１１Ｒ］の差次的なプロテインＡ精製から得られた溶出液の純度を示す。

図７Ａは、ｐＨ ４．７、４．２及び３．４で溶出した３つの異なるピークを示す、共通軽鎖技術を用いて作製されたｂｓＴＮＦ−［ＴＬＱ］の試料のプロテインＡクロマトグラムを示す。

図７Ｂは、共通軽鎖技術を使用して作製されたｂｓＴＮＦ−［ＴＬＱ］の試料のプロテインＡ親和性カラムのｐＨ４．７の溶出液のＨＩＣ分析を示す。

図７Ｃは、共通軽鎖技術を使用して作製されたｂｓＴＮＦ−［ＴＬＱ］の試料のプロテインＡ親和性カラムのｐＨ４．２の溶出液のＨＩＣ分析を示す。

図７Ｄは、共通軽鎖技術を使用して作製されたｂｓＴＮＦ−［ＴＬＱ］の試料のプロテインＡ親和性カラムのｐＨ３．４の溶出液のＨＩＣ分析を示す。

同様のクロマトグラムが、共通軽鎖技術を使用して作製されたｂｓＴＮＦ−［Ｑ３１１Ｒ］の試料から得られた。

方法
親抗体ＴＮＦ−［Ｑ３１１Ｒ］、ＴＮＦ−［ＴＬＱ］及びａＶｂ５（表８を参照）を実験で使用した。親の抗ＴＮＦ抗体と抗αＶβＶ抗体とは共通の軽鎖を共有しており、したがって、これらのｍＡｂを実験で使用することにより、軽鎖のミスペアリングによって生じ得るｍＡｂ種を最小限に抑えた。

ＴＮＦ−［Ｑ３１１Ｒ］とａＶｂ５、又はＴＮＦ−［ＴＬＱ］とａＶｂ５の同時トランスフェクションを、０．５：０．５：３．０のＴＮＦ−［Ｑ３１１Ｒ］又はＴＮＦ−［ＴＬＱ］の重鎖：ａＶｂ５の重鎖：軽鎖のプラスミドのモル比を用い、製造者のプロトコールに従ってＥｘｐｉ２９３細胞で行った。およその相対発現レベルを決定するため、親ｍＡｂの別々のトランスフェクションも、１．０：３．０の重鎖：軽鎖のプラスミドのモル比を用いて行い、Ｏｃｔｅｔを使用して力価を決定した。約５０ｍＬの各上清を１ｍＬのｍＡｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラムにかけ、５０ｍＭクエン酸塩のｐＨ ４．７（又は４．６）、４．２、及び３．４の３段階のｐＨ勾配を用いて溶出し、画分を回収し、濃縮して１×ＰＢＳにバッファー交換した後、ＨＩＣ分析を行った。

実施例８．Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ変異は、抗体の血清中半減期に影響を及ぼさない
Ｔｇ３２系ヘミ接合体マウスを用いて、選択された抗体のＰＫ特性を調べた。これらの実験では、ＲＳＶ−Ｌは約７日の半減期を有していた。Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ変異のいずれかを有するホモ二量体の親Ａｂ（抗体ＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］及びＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］）はどちらも、少なくとも野生型ｍＡｂと同程度の長さの半減期を有した（それぞれ約７日及び９日）。これらの変異は、二重特異性抗体に非対称に導入された場合にも血清中半減期にほとんど影響を及ぼさなかった。ｂｓＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］及びｂｓＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］は、それぞれ１１／１±３．６日及び４．８±２．０日の血清中半減期を有していた。ＲＳＶ−Ｌの血清中半減期は７．０±３．９日であり、ＲＳＶ−Ｌ［ＴＬＱ］の半減期は９．０±４．０日であり、ＲＳＶ−Ｌ［Ｑ３１１Ｒ］の血清中半減期は６．７±３．４日であった。Ｉ２５３Ｄ変異体ＡｂはＦｃＲｎに結合せず、この実験のコントロールとして使用した。

図８は、選択された変異体の薬物動態分析の結果を示す。これらの結果は、インビトロＦｃＲｎ結合分析（実施例３）と一致している。これらの実験結果は、広範な技術を使用して作製された二重特異性抗体に非対称に導入されたＱ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ変異が、正常な血清中半減期を保持し、混在する親単一特異性抗体からの二重特異性抗体の差次的なプロテインＡ親和性精製が可能な抗体を生じることを示している。

方法
Ｔｇ３２系ヘミ接合体マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓストック番号０１４５６５）を抗体の薬物動態（ＰＫ）試験に使用した。これらのマウスは、ＦｃＲｎのヒトαミクログロブリンサブユニットの形質転換体であり、したがってヒトにおける血清中半減期の予測に役立つ（Ｐｅｔｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：１７５９−１７６９，２００６）。マウスに、尾静脈を介して、２ｍｇ／ｋｇの用量の試験Ａｂを各群４匹の動物に静脈内注射した。１ｈ、１ｄ、３ｄ、７ｄ、１４ｄ及び２１ｄの時点を取った。示した時点で、ＣＯ_２麻酔下のマウスの後眼窩静脈叢から連続採血を行い、最後の血液は心臓穿刺により採血した。室温で３０分後に、血液試料を３，０００×ｇで１５分間遠心し、分析用の血清を採取した。

マウス血清中の試験Ａｂの検出には、電気化学発光イムノアッセイを用いた。ストレプトアビジン金マルチアレイ９６ウェルプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を、Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ）中で、５０μＬ／ウェルの３μｇ／ｍＬビオチン−Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントｇ抗ｈ ＩｇＧ（Ｆｃフラグメント特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０９−０６６−００８）で一晩コーティングした後、Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）で洗浄した。血清試料を、Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ（１：２０、次いで２倍連続希釈）中で５％ ＣＤ−１マウス血清に希釈し、プレート上で２時間インキュベートしてから洗浄した。１％ ＢＳＡ−ＴＢＳＴに加えたＲｕ^＋＋標識抗ｈ ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）_２（Ｊａｃｋｓｏｎ １０９−００６−０９７から調製したもの）を添加し、プレート上で１．５時間インキュベートしてから洗浄した。界面活性剤を含むＲｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒを２００μＬ／ウェルで加え、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００プレートリーダーでプレートを読み取った。ＩｇＧ２ｂ Ａｂの血清中濃度を、Ｐｒｉｓｍ ６．０１ソフトウェアの４パラメータ非線形回帰プログラムを使用して標準曲線から決定した。

Ｐｒｉｓｍバージョン６．０１ソフトウェアを使用して自然対数濃度対時間の非線形回帰によりフィッティングした１相指数関数的減衰モデルを用い、ＰＫ試験の排出期（β期）の終末相半減期（ｔ_１／２）の計算値を求めた。最小二乗非線形減衰モデルを、フィッティングした濃度の逆数により重み付けした。式ｔ_１／２＝ｌｎ２／β（式中、βは、初回の投与後に開始する最小二乗法による回帰分析によりフィッティングされた直線の傾きである）を使用して、排出期（β期）の半減期の計算値を求めた。試験群内の各動物について算出されたｔ_１／２値の平均をとることにより、Ａｂの終末相半減期値を求めた。

Claims (79)

1. 単離された多重特異性抗体であって、変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ、又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域とを含み、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された多重特異性抗体。
2. 前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１に記載の単離された多重特異性抗体。
3. 前記第２のＣＨ２−ＣＨ３領域と比較して、前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域のプロテインＡリガンドに対する結合が低下している、請求項１又は２に記載の単離された多重特異性抗体。
4. 前記プロテインＡリガンドが、黄色ブドウ球菌のプロテインＡ、Ｚドメイン又はＹドメインを含む、請求項３に記載の単離された多重特異性抗体。
5. 前記Ｚドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の単離された多重特異性抗体。
6. 前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び前記第２のＣＨ２−ＣＨ３領域に非対称の安定化変異を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離された多重特異性抗体。
7. 前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び前記第２のＣＨ２−ＣＨ３領域における、又は前記第２のＣＨ２−ＣＨ３領域及び前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域における、前記非対称の安定化変異が、
   ａ）それぞれ、Ｆ４０５Ｌ及びＫ４０９Ｒ、
   ｂ）それぞれ、野生型及びＦ４０５Ｌ／Ｒ４０９Ｋ、
   ｃ）それぞれ、Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、
   ｄ）それぞれ、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ及びＴ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、
   ｅ）それぞれ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ及びＴ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、
   ｆ）それぞれ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、
   ｇ）それぞれ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ及びＴ３９４Ｗ、
   ｈ）それぞれ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ及びＦ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、
   ｉ）それぞれ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ及びＦ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、
   ｊ）それぞれ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、
   ｋ）それぞれ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、
   ｌ）それぞれ、Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、
   ｍ）それぞれ、Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５６Ｋ及びＫ４０９Ｄ／Ｋ３９２Ｄ、又は
   ｎ）それぞれ、Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５６Ｋ／Ｅ３５７Ｋ及びＫ４０９Ｄ／Ｋ３９２Ｄ／Ｋ３７０
   である、請求項６に記載の単離された多重特異性抗体。
8. 前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び前記第２のＣＨ２−ＣＨ３領域が、
   ａ）それぞれ、配列番号２及び２２、
   ｂ）それぞれ、配列番号３及び２２、
   ｃ）それぞれ、配列番号４及び２２、
   ｄ）それぞれ、配列番号５及び２２、
   ｅ）それぞれ、配列番号６及び２３、
   ｆ）それぞれ、配列番号７及び２３、
   ｇ）それぞれ、配列番号８及び２３、
   ｈ）それぞれ、配列番号９及び２３、
   ｉ）それぞれ、配列番号１０及び２４、
   ｊ）それぞれ、配列番号１１及び２４、
   ｋ）それぞれ、配列番号１２及び２４、
   ｌ）それぞれ、配列番号１３及び２４、
   ｍ）それぞれ、配列番号１４及び２５、
   ｎ）それぞれ、配列番号１５及び２５、
   ｏ）それぞれ、配列番号１６及び２５、
   ｐ）それぞれ、配列番号１７及び２５、
   ｑ）それぞれ、配列番号１８及び２６、
   ｒ）それぞれ、配列番号１９及び２６、
   ｓ）それぞれ、配列番号２０及び２６、
   ｔ）それぞれ、配列番号２１及び２６、
   ｕ）それぞれ、配列番号５２及び５４、
   ｖ）それぞれ、配列番号５２及び５５、
   ｗ）それぞれ、配列番号５３及び５４、
   ｘ）それぞれ、配列番号５３及び５５、
   ｙ）それぞれ、配列番号５６及び５４、又は
   ｚ）それぞれ、配列番号５６及び５５
   のアミノ酸配列を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された多重特異性抗体。
9. 前記単離された多重特異性抗体が、ＦｃγＲ又はＦｃＲｎに対する前記抗体の結合を調節する少なくとも１つの変異を更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離された多重特異性抗体。
10. ＦｃγＲ又はＦｃＲｎに対する前記抗体の結合を調節する前記少なくとも１つの変異が、Ｌ２３４Ａ、Ｆ２３４Ａ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ａ、Ｐ３３１Ｓ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｓ２６７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ又はＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅである、請求項９に記載の単離された多重特異性抗体。
11. 第１の軽鎖及び第２の軽鎖を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離された多重特異性抗体。
12. 前記第１の軽鎖及び前記第２の軽鎖が同じアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の単離された多重特異性抗体。
13. 前記単離された多重特異性抗体が、２つ以上の抗原に結合する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離された多重特異性抗体。
14. 前記２つの抗原が、ＰＤ１、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＮＫＰ４６、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＫＩＲａ、ＣＤ７３、ＣＤ３９、ＩＤＯ、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＤ３０、ＨＶＥＭ、ＤＮＡＭ−１、ＬＦＡ、腫瘍抗原、ＥＧＦＲ、ｃＭｅｔ、ＦＧＦＲ、ＲＯＲ１、ＣＤ１２３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＦＧＦＲ、メソテリン、ＣＤ３、Ｔ細胞受容体、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３２ａ、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＰ４６、ＣＤ２８、ＣＤ４７、ＤＬＬ、ＣＤ８、ＣＤ８９、ＨＬＡ、Ｂ細胞受容体、又はＣＤ１３７のうちのいずれか２つである、請求項１３に記載の単離された多重特異性抗体。
15. 二重特異性抗体である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離された多重特異性抗体。
16. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離された多重特異性抗体を含む、医薬組成物。
17. ａ）変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域をコードするポリヌクレオチドを含み、
    ｂ）変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する前記第２のＣＨ２−ＣＨ３領域とをコードするポリヌクレオチドを含み、
    ｃ）配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、８７、８８又は９１のポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
18. ａ）変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域をコードする前記単離されたポリヌクレオチドと、
    ｂ）配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、８７、８８又は９１のポリヌクレオチド配列を有する、前記単離されたポリヌクレオチドと、
    ｃ）変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する前記第２のＣＨ２−ＣＨ３領域とをコードするポリヌクレオチドを含む、前記単離されたポリヌクレオチドと、
    ｄ）
    ｉ）配列番号２７及び４７、それぞれ、
    ｉｉ）配列番号２８及び４７、それぞれ、
    ｉｉｉ）配列番号２９及び４７、それぞれ、
    ｉｖ）配列番号３０及び４７、それぞれ、
    ｖ）配列番号３１及び４８、それぞれ、
    ｖｉ）配列番号３２及び４８、それぞれ、
    ｖｉｉ）配列番号３３及び４８、それぞれ、
    ｖｉｉｉ）配列番号３４及び４８、それぞれ、
    ｉｘ）配列番号３５及び４９、それぞれ、
    ｘ）配列番号３６及び４９、それぞれ、
    ｘｉ）配列番号３７及び４９、それぞれ、
    ｘｉｉ）配列番号３８及び４９、それぞれ、
    ｘｉｉｉ）配列番号３９及び５０、それぞれ、
    ｘｉｖ）配列番号４０及び５０、それぞれ、
    ｘｖ）配列番号４１及び５０、それぞれ、
    ｘｖｉ）配列番号４２及び５０、それぞれ、
    ｘｖｉｉ）配列番号４３及び５１、それぞれ、
    ｘｖｉｉｉ）配列番号４４及び５１、それぞれ、
    ｘｉｘ）配列番号４５及び５１、それぞれ、
    ｘｘ）配列番号４６及び５１、それぞれ、
    ｘｘｉ）配列番号８７及び８９、それぞれ、
    ｘｘｉｉ）配列番号８７及び９０、それぞれ、
    ｘｘｉｉｉ）配列番号８８及び８９、それぞれ、
    ｘｘｉｖ）配列番号８８及び９０、それぞれ、
    ｘｘｖ）配列番号９２及び８９、それぞれ、又は
    ｘｘｖｉ）配列番号９２及び９０それぞれ、
    を有する前記単離されたポリヌクレオチドと
    を含む、ベクター。
19. 請求項１８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
20. 前記宿主細胞が、ハイブリドーマ、骨髄腫、ＳＰ２／０、ＮＳ０、Ｕ２６６、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＤＧ４４又はＨｅｋ２９３である、請求項１９に記載の宿主細胞。
21. 請求項１に記載の単離された多重特異性抗体を製造する方法であって、
    ａ）前記多重特異性抗体が発現される条件下で請求項１９に記載の宿主細胞を培養することと、
    ｂ）プロテインＡリガンド親和性クロマトグラフィーを使用して前記多重特異性抗体を精製することと、を含む、方法。
22. 変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１の重鎖又はそのフラグメントと、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２の重鎖又はそのフラグメントとを含む、単離された多重特異性抗体を製造する方法であって、
    ａ）前記変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ を有する前記第１の重鎖又はそのフラグメントと第１の軽鎖とを含む第１の親抗体を与えることと、
    ｂ）３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する前記第２の重鎖又はそのフラグメントと第２の軽鎖とを含む第２の親抗体を与えることと、
    ｃ）前記第１の親抗体と前記第２の親抗体とを試料中で接触させることと、
    ｄ）前記試料をインキュベートすることと、
    ｅ）プロテインＡリガンド親和性クロマトグラフィーを使用して前記多重特異性抗体を精製することと、を含む、方法。
23. 前記単離された多重特異性抗体が、前記第１の重鎖又はそのフラグメント及び前記第２の重鎖又はそのフラグメントに非対称の安定化変異を更に有する、請求項２２に記載の方法。
24. 前記第１の重鎖若しくはそのフラグメント及び前記第２の重鎖若しくはそのフラグメントにおける、又は前記第２の重鎖若しくはそのフラグメント及び前記第１の重鎖若しくはそのフラグメントにおける、前記非対称の安定化変異が、
    ａ）それぞれ、Ｆ４０５Ｌ及びＫ４０９Ｒ、
    ｂ）それぞれ、野生型及びＦ４０５Ｌ／Ｒ４０９Ｋ、
    ｃ）それぞれ、Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、
    ｄ）それぞれ、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ及びＴ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、
    ｅ）それぞれ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ及びＴ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、
    ｆ）それぞれ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、
    ｇ）それぞれ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ及びＴ３９４Ｗ、
    ｈ）それぞれ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ及びＦ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、
    ｉ）それぞれ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ及びＦ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、
    ｊ）それぞれ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、
    ｋ）それぞれ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、
    ｌ）それぞれ、Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、
    ｍ）それぞれ、Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５６Ｋ及びＫ４０９Ｄ／Ｋ３９２Ｄ、又は
    ｎ）それぞれ、Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５６Ｋ／Ｅ３５７Ｋ及びＫ４０９Ｄ／Ｋ３９２Ｄ／Ｋ３７０
    である、請求項２３に記載の方法。
25. 前記単離された多重特異性抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記第１の軽鎖及び前記第２の軽鎖が同じアミノ酸配列を有する、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記第１の親抗体及び前記第２の親抗体が、精製抗体として与えられる、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記第１の親抗体及び前記第２の親抗体が、前記第１の親抗体及び前記第２の親抗体を発現する細胞から回収された細胞培地中で与えられる、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
29. 工程ｄ）において還元剤が添加される、請求項２２に記載の方法。
30. 前記還元剤が、２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ−システイン又はβ−メルカプトエタノールである、請求項２９に記載の方法。
31. ２−ＭＥＡが、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で存在する、請求項３０に記載の方法。
32. ２−ＭＥＡが、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭの濃度で存在する、請求項３１に記載の方法。
33. 工程ｄ）が、約２０℃〜約３７℃の温度で約９０分〜約６時間行われる、請求項２２に記載の方法。
34. プロテインＡリガンド親和性クロマトグラフィーが、ｐＨ勾配を用いる、請求項２２〜３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記ｐＨ勾配が、約ｐＨ７．０〜約３．０である、請求項３４に記載の方法。
36. 前記ｐＨ勾配が、約ｐＨ４．６〜約３．４である、請求項３４に記載の方法。
37. 多量体抗体が、約ｐＨ ４．４〜約ｐＨ ４．１で溶出する、請求項３４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
38. プロテインＡリガンド親和性クロマトグラフィーが、クエン酸塩緩衝液を用いる、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、請求項２２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 同じアミノ酸配列を有する２個の重鎖又はそのフラグメントと２個の軽鎖又はそのフラグメントとを含む、単離された抗体であって、前記２個の重鎖が、変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有し、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、単離された抗体。
41. 前記２個の重鎖又はそのフラグメントが、変異Ｆ４０５Ｌ、Ｋ４０９Ｒ、Ｆ４０５Ｌ／Ｒ４０９Ｋ、Ｔ３６６Ｗ又はＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを更に有する、請求項４０に記載の単離された抗体。
42. 前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求項４０又は４１に記載の単離された抗体。
43. 配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、５２、５３又は５６の重鎖ＣＨ２−ＣＨ３領域を含む、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の単離された抗体。
44. ａ）配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、５２、５３又は５６の前記ＣＨ２−ＣＨ３領域を含む抗体重鎖をコードするか、又は
    ｂ）配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、８７、８８又は９１の前記ポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
45. 請求項４４に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
46. 請求項４５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
47. 請求項４０に記載の単離された抗体を製造する方法であって、前記抗体が発現される条件下で、請求項４６に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
48. 第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む多量体タンパク質であって、前記第１のポリペプチドが、変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域を含み、前記第２のポリペプチドが、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域を含み、残基の番号付けはＥＵインデックスに従う、多量体タンパク質。
49. 前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び前記第２のＣＨ２−ＣＨ３領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求項４８に記載の多量体タンパク質。
50. 前記第２のＣＨ２−ＣＨ３領域と比較して、前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域のプロテインＡリガンドに対する結合が低下している、請求項４８又は４９に記載の多量体タンパク質。
51. 前記プロテインＡリガンドが、黄色ブドウ球菌のプロテインＡ、Ｚドメイン又はＹドメインを含む、請求項５０に記載の多量体タンパク質。
52. 前記Ｚドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項５１に記載の多量体タンパク質。
53. 前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び前記第２のＣＨ２−ＣＨ３領域に非対称の安定化変異を更に有する、請求項４８〜５２のいずれか一項に記載の多量体タンパク質。
54. 前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び前記第２のＣＨ２−ＣＨ３領域における、又は前記第２のＣＨ２−ＣＨ３領域及び前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域における、前記非対称の安定化変異が、
    ａ）それぞれ、Ｆ４０５Ｌ及びＫ４０９Ｒ、
    ｂ）それぞれ、野生型及びＦ４０５Ｌ／Ｒ４０９Ｋ、
    ｃ）それぞれ、Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、
    ｄ）それぞれ、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ及びＴ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、
    ｅ）それぞれ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ及びＴ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、
    ｆ）それぞれ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、
    ｇ）それぞれ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ及びＴ３９４Ｗ、
    ｈ）それぞれ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ及びＦ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、
    ｉ）それぞれ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ及びＦ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、
    ｊ）それぞれ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、
    ｋ）それぞれ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、
    ｌ）それぞれ、Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、
    ｍ）それぞれ、Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５６Ｋ及びＫ４０９Ｄ／Ｋ３９２Ｄ、又は
    ｎ）それぞれ、Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５６Ｋ／Ｅ３５７Ｋ及びＫ４０９Ｄ／Ｋ３９２Ｄ／Ｋ３７０
    である、請求項５３に記載の多量体タンパク質。
55. 前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び前記第２のＣＨ２−ＣＨ３領域が、
    ａ）それぞれ、配列番号２及び２２、
    ｂ）それぞれ、配列番号３及び２２、
    ｃ）それぞれ、配列番号４及び２２、
    ｄ）それぞれ、配列番号５及び２２、
    ｅ）それぞれ、配列番号６及び２３、
    ｆ）それぞれ、配列番号７及び２３、
    ｇ）それぞれ、配列番号８及び２３、
    ｈ）それぞれ、配列番号９及び２３、
    ｉ）それぞれ、配列番号１０及び２４、
    ｊ）それぞれ、配列番号１１及び２４、
    ｋ）それぞれ、配列番号１２及び２４、
    ｌ）それぞれ、配列番号１３及び２４、
    ｍ）それぞれ、配列番号１４及び２５、
    ｎ）それぞれ、配列番号１５及び２５、
    ｏ）それぞれ、配列番号１６及び２５、
    ｐ）それぞれ、配列番号１７及び２５、
    ｑ）それぞれ、配列番号１８及び２６、
    ｒ）それぞれ、配列番号１９及び２６、
    ｓ）それぞれ、配列番号２０及び２６、
    ｔ）それぞれ、配列番号２１及び２６、
    ｕ）それぞれ、配列番号５２及び５４、
    ｖ）それぞれ、配列番号５２及び５５、
    ｗ）それぞれ、配列番号５３及び５４、
    ｘ）それぞれ、配列番号５３及び５５、
    ｙ）それぞれ、配列番号５６及び５４、又は
    ｚ）それぞれ、配列番号５６及び５５
    のアミノ酸配列を有する、請求項４８〜５４のいずれか一項に記載の多量体タンパク質。
56. 前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び／又は前記第２のＣＨ２−ＣＨ３領域が異種タンパク質に結合されている、請求項４８〜５５のいずれか一項に記載の多量体タンパク質。
57. 前記異種タンパク質が、ペプチド、受容体の細胞外ドメイン、リガンドの細胞外ドメイン、分泌タンパク質、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン及び／又はファイノマーである、請求項５６に記載の多量体タンパク質。
58. 前記異種タンパク質が、前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び／又は前記第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＮ末端又はＣ末端に、必要に応じてリンカーを介して結合される、請求項５７に記載の多量体タンパク質。
59. 前記リンカーが、配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、９２、９３、９４、９５、９６、９７又は９８のアミノ酸配列を有する、請求項６８に記載の多量体タンパク質。
60. 前記多量体タンパク質が抗体である、請求項４８に記載の多量体タンパク質。
61. 前記抗体が、多重特異性、二重特異性又は単一特異性である、請求項６０に記載の多量体タンパク質。
62. ２個、３個又は４個のポリペプチド鎖を含む、請求項４８〜６１のいずれか一項に記載の多量体タンパク質。
63. 請求項４８〜６２のいずれか一項に記載の多量体タンパク質を含む、医薬組成物。
64. 変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する第１のＣＨ２−ＣＨ３領域と、３０７、３０９及び３１１位に野生型アミノ酸残基を有する第２のＣＨ２−ＣＨ３領域とを含む単離された多量体タンパク質を製造する方法であって、
    ａ）前記変異Ｑ３１１Ｒ、Ｑ３１１Ｋ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ、Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒ又はＴ３０７Ｐ／Ｖ３０９Ｑ／Ｑ３１１Ｒを有する前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域を含む第１の親タンパク質を与えることと、
    ｂ）３０７、３０９及び３１１位に前記野生型アミノ酸残基を有する前記第２のＣＨ２−ＣＨ３領域を含む第２の親タンパク質を与えることと、
    ｃ）前記第１の親タンパク質と前記第２の親タンパク質とを試料中で接触させることと、
    ｄ）前記試料をインキュベートすることと、
    ｅ）プロテインＡリガンド親和性クロマトグラフィーを使用して多重特異性タンパク質を精製することとを含む、前記方法。
65. 前記多量体タンパク質が、前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び前記第２のＣＨ２−ＣＨ３領域に非対称の安定化変異を更に有する、請求項６４に記載の方法。
66. 前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び前記第２のＣＨ２−ＣＨ３領域における、又は前記第２のＣＨ２−ＣＨ３領域及び前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域における、前記非対称の安定化変異が、
    ａ）それぞれ、Ｆ４０５Ｌ及びＫ４０９Ｒ、
    ｂ）それぞれ、野生型及びＦ４０５Ｌ／Ｒ４０９Ｋ、
    ｃ）それぞれ、Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、
    ｄ）それぞれ、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ及びＴ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、
    ｅ）それぞれ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ及びＴ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、
    ｆ）それぞれ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、
    ｇ）それぞれ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ及びＴ３９４Ｗ、
    ｈ）それぞれ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ及びＦ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、
    ｉ）それぞれ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ及びＦ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、
    ｊ）それぞれ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、
    ｋ）それぞれ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、
    ｌ）それぞれ、Ｙ４０７Ａ及びＴ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、
    ｍ）それぞれ、Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５６Ｋ及びＫ４０９Ｄ／Ｋ３９２Ｄ、又は
    ｎ）それぞれ、Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５６Ｋ／Ｅ３５７Ｋ及びＫ４０９Ｄ／Ｋ３９２Ｄ／Ｋ３７０
    である、請求項６５に記載の方法。
67. 前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び前記第２のＣＨ２−ＣＨ３領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求項６４〜６６のいずれか一項に記載の方法。
68. 前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び前記第２のＣＨ２−ＣＨ３領域が、
    ａ）それぞれ、配列番号２及び２２、
    ｂ）それぞれ、配列番号３及び２２、
    ｃ）それぞれ、配列番号４及び２２、
    ｄ）それぞれ、配列番号５及び２２、
    ｅ）それぞれ、配列番号６及び２３、
    ｆ）それぞれ、配列番号７及び２３、
    ｇ）それぞれ、配列番号８及び２３、
    ｈ）それぞれ、配列番号９及び２３、
    ｉ）それぞれ、配列番号１０及び２４、
    ｊ）それぞれ、配列番号１１及び２４、
    ｋ）それぞれ、配列番号１２及び２４、
    ｌ）それぞれ、配列番号１３及び２４、
    ｍ）それぞれ、配列番号１４及び２５、
    ｎ）それぞれ、配列番号１５及び２５、
    ｏ）それぞれ、配列番号１６及び２５、
    ｐ）それぞれ、配列番号１７及び２５、
    ｑ）それぞれ、配列番号１８及び２６、
    ｒ）それぞれ、配列番号１９及び２６、
    ｓ）それぞれ、配列番号２０及び２６、
    ｔ）それぞれ、配列番号２１及び２６、
    ｕ）それぞれ、配列番号５２及び５４、
    ｖ）それぞれ、配列番号５２及び５５、
    ｗ）それぞれ、配列番号５３及び５４、
    ｘ）それぞれ、配列番号５３及び５５、
    ｙ）それぞれ、配列番号５６及び５４、又は
    ｚ）それぞれ、配列番号５６及び５５
    のアミノ酸配列を有する、請求項６４〜６７のいずれか一項に記載の方法。
69. 前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び／又は前記第２のＣＨ２−ＣＨ３領域が異種タンパク質に結合されている、請求項６４〜６８のいずれか一項に記載の方法。
70. 前記異種タンパク質が、ペプチド、受容体の細胞外ドメイン、リガンドの細胞外ドメイン、分泌タンパク質、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン及び／又はファイノマーである、請求項６９に記載の方法。
71. 前記異種タンパク質が、前記第１のＣＨ２−ＣＨ３領域及び／又は前記第２のＣＨ２−ＣＨ３領域のＮ末端又はＣ末端に、必要に応じてリンカーを介して結合される、請求項６９又は７０に記載の方法。
72. 前記リンカーが、配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、９２、９３、９４、９５、９６、９７又は９８のアミノ酸配列を有する、請求項７１に記載の方法。
73. 前記第１の親タンパク質及び前記第２の親タンパク質が、精製タンパク質として与えられる、請求項６４〜７２のいずれか一項に記載の方法。
74. 前記第１の親タンパク質及び前記第２の親タンパク質が、前記第１の親タンパク質及び前記第２の親タンパク質を発現する細胞から回収された細胞培地中で与えられる、請求項６４〜７２のいずれか一項に記載の方法。
75. 工程ｄ）において還元剤が添加される、請求項６４に記載の方法。
76. 前記還元剤が、２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ−システイン又はβ−メルカプトエタノールである、請求項７５に記載の方法。
77. ２−ＭＥＡが、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で存在する、請求項７６に記載の方法。
78. ２−ＭＥＡが、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭの濃度で存在する、請求項７６に記載の方法。
79. 工程ｄ）が、約２５℃〜約３７℃の温度で約９０分〜約６時間にわたって行われる、請求項６４に記載の方法。

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