PT2027156E - Proteínas de ligação ao factor de crescimento de hepatócito (hgf) - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO AO FACTOR DE CRESCIMENTO DE HEPATÓCITO (HGF)

PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o beneficio e prioridade em relação aos Pedidos Provisórios U.S. N°s. 60/810 714, apresentado em 2 de Junho de 2006 e 60/860 509, apresentado em 21 de Novembro de 2006.

CAMPO DA INVENÇÃO O campo da invenção é a biologia molecular, a imunologia e a oncologia. Mais particularmente, o campo é o das proteínas de ligação à base de anticorpo que se ligam ao factor de crescimento do hepatócito humano (HGF).

ANTECEDENTES O Factor de Crescimento do Hepatócito (HGF), também conhecido como Factor de Espalhamento (SF)5 é uma proteína heterodimérica multifuncional produzida predominantemente pelas células do mesênquima, e é um efector de células que expressam o receptor da quinase de tirosina Met (Bottaro et al. (1991) SCIENCE 251: 802-804, Rubin et al. (1993) biochem. BIOPHYS. ACTA 1155: 357-371). O receptor Met humano é também conhecido como "c-Met." O HGF maduro contém duas cadeias polipeptídicas, a cadeia α e a cadeia β. Os estudos publicados sugerem que é a cadeia α que contém o domínio de ligação ao receptor c-Met do HGF. 1 ΕΡ2027156Β9

Quando se liga ao seu receptor cognato, o HGF medeia várias actividades celulares. A via de sinalização HGF-Met desempenha um papel na regeneração do figado, na cicatrização de feridas, regeneração neuronal, angiogénese e malignidades. Ver, e. g., Cao et al. (2001) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 98: 7443-7448, Burgess et al. (2006) CÂNCER RES. 66: 1721-1729, e Patentes U.S. N°s. 5 997 868 e 5 707 624. Os investigadores desenvolveram vários moduladores de HGF, incluindo anticorpos, para tratar vários distúrbios que envolvem actividade de HGF, por exemplo, certos cancros responsivos a HGF. Ver, e. g., Publicação de Pedido Internacional N°. WO 2005/017107. A estrutura básica comum para todos os anticorpos é apresentada esquematicamente na Figura 1. Os anticorpos são proteínas multiméricas que contêm quatro cadeias polipeptídicas. Duas das cadeias polipeptídicas são denominadas cadeias pesada ou H e duas das cadeias polipeptídicas são denominadas cadeias leves ou L. As cadeias de imunoglobulina pesada e leve são ligadas por uma ligação persulfureto intercadeia. As cadeias de imunoglobulina pesada são ligadas por várias ligações persulfureto intercadeia. Uma cadeia leve é composta por uma região variável (VL na Figura 1) e uma região constante (CL na Figura I), enquanto a cadeia pesada é composta por uma região variável (VH na Figura 1) e pelo menos três regiões constantes (CHi, CH2 e CH3 na Figura 1) . As regiões variáveis determinam a especificidade do anticorpo e as regiões constantes possuem outras funções. A informação de aminoácidos estrutural indica que cada região variável compreende três regiões hipervariáveis (também conhecidas como regiões de determinação de 2 ΕΡ2027156Β9 complementaridade ou CDRs) flanqueadas por quatro regiões de grelha relativamente conservadas ou FRs. As três CDRs, referidas como CDRi, CDR2, e CDR3, são responsáveis pela especificidade de ligação dos anticorpos individuais. Quando os anticorpos se destinam a ser utilizados como agentes de diagnóstico e terapêutica, é tipicamente desejável criar anticorpos que possuem a especificidade de ligação e afinidade para a molécula alvo mais elevadas. Crê-se que as diferenças nas regiões variáveis podem possuir efeitos profundos na especificidade e afinidade do anticorpo.

No documento WO2005/017107A, são descritos anticorpos contra a proteína de HGF humano. A Patente U.S. N°. 5 707 624 descreve a utilização de anticorpos anti-HGF no tratamento do sarcoma de Kaposi. De um modo semelhante, a Patente U.S. N°. 5 997 868 descreve o tratamento de um tumor através da administração de um anticorpo anti-HGF ao doente a ser tratado de modo a bloquear a capacidade do HGF endógeno para promover angiogénese no tumor. Mais recentemente, os investigadores propõem que os anticorpos que se ligam à cadeia β de HGF podem ter potencial como agentes terapêuticos em doentes com tumores dependentes de HGF (Burgess (2006) supra). Não obstante, ainda existe uma necessidade para moduladores de HGF adicionais que podem ser utilizados como agentes terapêuticos e diagnósticos. 3 ΕΡ2027156Β9

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção baseia-se, em parte, na descoberta de uma família de proteínas de ligação que se ligam especificamente a HGF, em particular, HGF humano. As proteínas de ligação são baseadas em anticorpo na medida em que elas contêm sítios de ligação ao antigénio (i. e., HGF) com base nas CDRs de uma família de anticorpos que se ligam especificamente a HGF. As CDRs conferem a especificidade de ligação das proteínas de ligação a HGF. As proteínas de ligação podem ser utilizados como agentes de diagnóstico e terapêuticos. Quando se utilizaram como um agente terapêutico, as proteínas de ligação são modificadas (e. g., humanizadas), de modo a reduzir ou eliminar o risco de induzir uma resposta imunitária contra a proteína de ligação quando administradas ao recipiente (e. g., um humano).

As proteínas de ligação neutralizam a actividade de HGF e, por isso, podem ser utilizadas como um agente terapêutico. Em certas formas de realização, as proteínas de ligação evitam que o HGF se ligue ao seu receptor cognato, c-Met, neutralizando desse modo a actividade do HGF. Uma vez que o HGF foi implicado no crescimento e proliferação de células cancerosas, as proteínas de ligação podem ser utilizadas para inibir a proliferação de células cancerosas. Para além disso, quando administradas a um mamífero, as proteínas de ligação podem inibir ou reduzir o crescimento do tumor num mamífero. A invenção proporciona uma proteína de ligação isolada que se liga ao factor de crescimento de hepatócito humano (HGF), compreendendo: 4 ΕΡ2027156Β9 (a) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreendendo a estrutura CDRHi-CDRH2-CDRH3, em que (i) CORhi compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N°. 15, (ii) CDRh2 compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°. 204 e SEQ ID N°. 205, e (iii) CDRH3 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N°. 17, e (b) uma região variável da cadeia leve da imunoglobulina compreende a estrutura CDRLi-CDRL2-CDRL3, em que (i) CDRl1 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N°. 18, (ii) CDRL2 compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N° . 19 e SEQ ID N°. 206, e (iii) CDRL3 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N°. 20, em que a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina e a região variável da cadeia leve de imunoglobulina em conjunto definem um sitio de ligação simples para ligar o HGF humano. 5 ΕΡ2027156Β9 A invenção proporciona ainda um ácido nucleico isolado que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica uma a região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a estrutura CDRLi-CDRL2-CDRL3, em que (i) CDRL1 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N°. 18, (ii) CDRL2 compreende sequência de aminoácidos SEQ ID N°. 206, e (iii) CDRl3 compreende sequência de aminoácidos SEQ ID N°. 20 e um vector de expressão que compreende o referido ácido nucleico. A invenção proporciona ainda um ácido nucleico isolado que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina que compreende a estrutura CDRHi-CDRH2-CDRH3, em que (i) CORhi compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N°. 15, (ii) CDRh2 compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N° . 204 e SEQ ID N°. 205, e (iii) CDRh3 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N° . 17 6 ΕΡ2027156Β9 e um vector de expressão que compreende o referido ácido nucleico. É também proporcionado um vector de expressão que compreende um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a estrutura CDRL1-CDRL2-CDRL3, em que (i) CDRli compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N° . 18, (ii) CDRl2 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N°. 206, e (iii) CDRl3 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N°. 20 e um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina que compreende a estrutura CDRHi-CDRH2-CDRH3, em que (i) CDRHi compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N°. 15, (ii) CDRh2 compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°. 204 e SEQ ID N°. 205, e (iii) CDRH3 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N°. 17. 7 ΕΡ2027156Β9 A invenção também proporciona uma célula hospedeira que compreende pelo menos um vector de expressão que codifica uma região variável leve de imunoglobulina que compreende a estrutura CDRL1-CDRL2-CDRL3, em que (i) CDRLi compreende sequência de aminoácidos SEQ ID N°. 18, (ii) CDRL2 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N°. 206, e (iii) CDRl3 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N°. 20. É também proporcionada uma célula hospedeira que compreende pelo menos um vector de expressão que codifica uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina que compreende a estrutura CDRHi-CDRH2-CDRH3, em que (i) CDRhi compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N°. 15, (ii) CDRh2 compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°. 204 e SEQ ID N°. 205, e (iii) CDRh3 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N°. 17. A invenção proporciona ainda a célula hospedeira que compreende pelo menos um vector de expressão que codifica uma 8 ΕΡ2027156Β9 região variável leve de imunoglobulina que compreende a estrutura CDRLi-CDRL2-CDRL3, em que (i) CDRLi compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N°. 18, (ii) CDRl2 compreende sequência de aminoácidos SEQ ID N°. 206, e (iii) CDRl3 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N° . 20 e uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina que compreende a estrutura CDRhi-CDRh2-CDRh3, em que (i) CDRHi compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N°. 15, (ii) CDRH2 compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°. 204 e SEQ ID N°. 205, e (iii) CDRH3 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N°. 17.

Noutro aspecto a invenção proporciona um método de produzir um polipéptido que compreende uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina ou um método de produzir um polipéptido que compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina, compreendendo o método: (i) cultivar a célula hospedeira da invenção em condições de modo a que a célula hospedeira expresse o 9 ΕΡ2027156Β9 polipéptido que compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina ou o polipéptido que compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina, respectivamente; e (ii) purificar o polipéptido que compreende a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina ou o polipéptido que compreende a região variável da cadeia leve de imunoglobulina, respectivamente.

Noutras formas de realização, a proteína de ligação isolada que se ligam ao factor de crescimento de hepatócito humano (HGF) compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina e uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina seleccionadas a partir do grupo que consiste em: (a) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 193, e uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 183; (b) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 193, e uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 189; (c) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 199, e uma região variável da cadeia pesada da 10 ΕΡ2027156Β9 imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N° . 183; e (d) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 199, e uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 189.

Numa forma de realização preferida, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°.199, e uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°. 189.

Noutras formas de realização, a proteína de ligação isolada que se liga ao factor de crescimento de hepatócito humano (HGF) compreende uma sequência da cadeia leve da imunoglobulina e uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina seleccionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 197, e uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 187; (b) uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 197, e uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 191; 11 ΕΡ2027156Β9 (c) uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 201, e uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 187; e (d) uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 201, e uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 191.

Numa forma de realização preferida, a proteína de ligação compreende uma cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 201, e uma cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 191. É também proporcionada a proteína de ligação da invenção para utilização em terapia. Em certas formas de realização, a proteína de ligação da invenção destina-se a utilização na inibição ou redução da proliferação de uma célula tumoral ou para utilização na inibição ou redução do crescimento tumoral num mamífero.

Noutro aspecto, a invenção proporciona um método de produção de uma proteína de ligação que se liga ao factor de crescimento de hepatócito humano (HGF), que é um anticorpo intacto, tal como um anticorpo monoclonal, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, cujo método compreende: (i) cultivar a célula hospedeira da invenção em condições de modo a que a célula hospedeira expresse um 12 ΕΡ2027156Β9 polipéptido que compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina e um polipéptido que compreende a região variável da cadeia leve de imunoglobulina; e (ii) purificar o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio do anticorpo.

Estes e outros aspectos e vantagens da invenção tornar-se-ão óbvios tendo em consideração as seguintes figuras, descrição detalhada, e reivindicações.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A invenção pode ser entendida mais completamente com referência aos seguintes desenhos. A Figura 1 é uma representação esquemática de um anticorpo tipico. A Figura 2 é um diagrama esquemático apresentando a sequência de aminoácidos que define a região variável da cadeia pesada da imunoglobulina completa dos anticorpos designados como 1A3, 1D3, 1F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6 e 3D11. As sequências de aminoácidos para cada anticorpo são alinhadas contra uma outra e as regiões que definem o péptido sinal, CDRi CDR2, e CDR3 são identificadas nas caixas. As sequências que não estão em caixas representam sequências FR. A Figura 3 é um diagrama esquemático que apresenta as sequências CDRi, CDR2, e CDR3 para cada uma das 13 ΕΡ2027156Β9 sequências da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina apresentadas na Figura 2. A Figura 4 é um diagrama esquemático que apresenta a sequência de aminoácidos que define a região variável completa da cadeia leve da imunoglobulina dos anticorpos 1A3, 1D3, 1F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6, e 3D11. As sequências de aminoácidos para cada anticorpo são alinhadas uma contra a outra e as regiões que definem o péptido sinal, CDRi, CDR2, e CDR3 são identificadas em caixas. As sequências que não estão em caixas representam as sequências FR. A Figura 5 é um diagrama esquemático que apresenta as sequências CDRi, CDR2, e CDR3 para cada uma das sequências da região variável da cadeia leve da imunoglobulina apresentadas na Figura 4. A Figura 6 é um gráfico que resume os resultados de uma experiência que mede a actividade inibidora tumoral dos anticorpos anti-HGF 1D3, 1F3, 1A3 e 2B8 num modelo de xenoenxerto U87MG. Os losangos correspondem a PBS; os triângulos correspondem ao anticorpo anti-HGF 1A3; X corresponde ao anticorpo anti-HGF 1D3; os quadrados correspondem ao anticorpo anti-HGF 1F3, e os círculos correspondem ao anticorpo anti-HGF 2B8. A Figura 7 é um gráfico que resume os resultados de uma experiência para medir a actividade inibidora tumoral dos anticorpos anti-HGF 1D3, 1F3, 1A3 e 2B8 num modelo de xenoenxerto U118. Os losangos correspondem a IgG; os quadrados correspondem ao anticorpo anti-HGF 1F3, os 14 ΕΡ2027156Β9 triângulos ao anticorpo anti-HGF 1D3; X corresponde ao anticorpo anti-HGF 1A3; e os círculos correspondem ao anticorpo anti-HGF 2B8. A Figura 8 é uma tabela que resume os resultados da ressonância de plasmão de superfície na afinidade de ligação ao antigénio e na cinética de interacção entre HGF humana e anticorpos 2B8 quiméricos, quiméricos/humanizados, ou humanizados. A tabela lista os pares de cadeia leve Kapa e cadeia pesada IgGi testadas. Os anticorpos com desvios padrão (STDEV) listados foram analisados em três experiências independentes. A Figura 9 é um gráfico de barras que resume os resultados experimentais que indicam que o Hu2B8 se liga a um epitopo mutuamente exclusivo ao anticorpo monoclonal de murino, 2B8. 0 2B8 humanizado ou quimérico foi capturado num chip anti-humano Fc. Foi então ligado HGF a um 2B8 humanizado ou quimérico. A capacidade de 2B8 de murganho ou o anticorpo de controlo (anticorpo policlonal de cabra anti-HGF) para se ligar a HGF capturado foi medida. Ambos os anticorpos humanizados 2B8 e quimérico 2B8 previnem que ο 2B8 de murino se ligue a HGF. As barras brancas correspondem ao anticorpo quimérico 2B8; as barras cinzentas correspondem ao anticorpo humanizado Hu2B8 (região variável kapa Kvl-39.1 e região variável da cadeia pesada Hv5-51.1); as barras pretas correspondem ao anticorpo humanizado Hu2B8 (região variável kapa Kv3-15.1 e região variável da cadeia pesada Hv5-51.1). 15 ΕΡ2027156Β9

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção baseia-se, em parte, na descoberta de uma família de proteínas de ligação que se ligam especificamente, e neutralizam, a actividade de HGF, em particular, HGF humano. As proteínas de ligação podem ser utilizadas numa variedade de aplicações em diagnóstico e terapêutica. As proteínas de ligação baseiam-se nos sítios de ligação ao antigénio de um anticorpo monoclonal que foi seleccionado em função da sua capacidade para se ligar a, e neutralizar a actividade de, HGF. Em particular, as proteínas de ligação contêm sequências da região variável CDR da imunoglobulina que, conjuntamente, definem um sítio de ligação para HGF. À luz da actividade neutralizadora destes anticorpos, eles são particularmente úteis na modulação do crescimento e/ou proliferação de células responsivas para HGF, por exemplo, células cancerosas. Quando utilizadas como um agente terapêutico, as proteínas de ligação podem ser modificadas de modo a minimizar ou eliminar o risco de indução de uma resposta imunitária contra as proteínas de ligação quando administradas ao recipiente. Para além disso, dependendo da aplicação particular, está contemplado que as proteínas de ligação possam ser conjugadas com outras unidades, por exemplo, marcadores detectáveis, por exemplo, marcadores com marcação radioactiva, e moléculas efectoras, por exemplo, outra proteína e terapêutica à base de moléculas pequenas. Cada uma destas características e aspectos da invenção são discutidos abaixo com maior detalhe. 16 ΕΡ2027156Β9

I - Proteínas de Ligação que se Ligam a HGF

Num aspecto, a invenção proporciona uma proteína de ligação isolada que se liga ao HGF humano. A proteína de ligação compreende (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende a estrutura CDRLi-CDRL2-CDRL3, e (ii) uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende três regiões de determinação de complementaridade (CDRs), em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina e a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina juntamente definem um sítio de ligação simples para ligação a HGF humano. Como aqui descrito, o CDRli compreende a sequência de aminoácidos Xi X2 Ser X4 X5 X6 X7 X8 Xg Xio Xn X12 X13 Xi4 Xi5f em que o aminoácido Xi é Arg, Lys, ou Ser, X2 é Ala ou Thr, X4 é Glu, Gin ou Ser, X5 é Asn, Asp, ou Ser, X6 é Ile ou Vai, X7 é Asp, Lys, Ser, Vai, ou Tyr, X8 é uma ligação peptídica ou Tyr, X9 é uma ligação peptídica ou Asp, X10 é uma ligação peptídica ou Gly, Xn é uma ligação peptídica ou Asn, X22 é uma ligação peptídica, Ile, ou Ser, X23 é Asn ou Tyr, Xi4 é Ile, Leu, Met, ou Vai, X35 é Ala, Asn, His, ou Ser. CDRL2 compreende a sequência de aminoácidos X16 X17 X18 X19 x20 x21 X22 , em que o aminoácido X16 é Ala, Asp, Arg, Gly, ou Vai, Xi7 é Ala, Thr, ou Vai, Xi8 é Asn, Ser, ou Thr, x19 é Arg, Asn, Lys, ou His, X20 é Leu ou Arg, x21 é Ala, Asn, Glu, Vai, ou Pro, X22 é Asp, Ser, ou Thr. CDRl3 compreende a sequência de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 Pro X30 Thr, em que 0 aminoácido X23 é Leu, Gly, ou Gin, X24 é His ou Gin, X25 é Phe, Ser, Trp, ou Tyr, X26 é Asp, Ile, Ser, Trp, ou Tyr, X27 é Gly, Glu, Asn, ou Ser, X28 é Asp, Asn, Phe, Thr, ou Tyr, X30 é Leu, Phe, Pro, ou Tyr. 17 ΕΡ2027156Β9

Noutro aspecto, a invenção proporciona uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano que compreende (i) uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a estrutura CDRHi-CDRH2-CDRH3 e (ii) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende três regiões de determinação de complementaridade (CDRs), em que a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina e a região variável da cadeia leve de imunoglobulina em conjunto definem um sítio de ligação simples para ligação a HGF humano. Como aqui descrito, CDRHi compreende a sequência de aminoácidos Xi Tyr X3 X4 X5, em que o aminoácido X3 é Asp, Asn, Ser, ou Thr, X3 é Phe, Ser, Tip, ou Tyr, X4 é Ile, Leu, ou Met, X5 é Asn, His, ou Ser. CDRH2 compreende a sequência de aminoácidos X6 Ile X8 X9 Χίο X11 Gly X13 X14 X15 Tyr X17 X48 X19 X20 X21 X221 em que o aminoácido X6 é Lys, Gin, Glu, Vai, ou Tyr, X8 é Asn, Gly, Ser, Trp, ou Tyr, X9 é Ala, Pro ou Ser, Xi0 é Gly ou Thr, Xn é uma ligação peptídica, Asp, Asn, Gly, ou Ser, Xi3 é Asp, Asn, His, ou Ser, X14 é Ser ou Thr, X35 é Asn ou Tyr, X17 é Asn ou Pro, Xis é Ala, Asp, Gly, Gin, Glu, Pro, ou Ser, X49 é Asn, Lys, Met, ou Ser, X2o é Leu, Phe ou Vai, X21 é Lys, Met, ou Gin, X22 é Asp, Gly ou Ser. CDRH3 compreende a sequência de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 X34 Tyr, em que o aminoácido X23 é Arg, Asn, Gin, ou Glu, X24 é Gly, Leu, Arg, ou Tyr, X25 é uma ligação peptídica, Asp, ou Gly, X26 é uma ligação peptídica ou Gly, X27 é uma ligação peptídica ou Tyr, X28 é uma ligação peptídica, Leu, ou Tyr, X29 é uma ligação peptídica, Gly, Leu, Arg, ou Vai, X30 é uma ligação peptídica, Asp, Gly, ou Glu, X34 é uma ligação peptídica, Asn, Arg, Ser, ou Tyr, X32 é uma ligação peptídica, Ala, Gly, Ile, ou Tyr, X33 é Met ou Phe, X34 é Ala ou Asp. 18 ΕΡ2027156Β9

Entende-se que a proteína de ligação pode compreender ambas as sequências da cadeia leve da imunoglobulina e a cadeia pesada da imunoglobulina ou seus fragmentos, referidos acima. Para além disso, entende-se que a proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, ou um sítio de anticorpo biossintético.

Em certas formas de realização, as sequências de CDR da cadeia leve da imunoglobulina e da cadeia pesada da imunoglobulina são interpostas com regiões de grelha (FR).

Em certas outras formas de realização, as sequências de CDR da cadeia leve da imunoglobulina e da cadeia pesada da imunoglobulina são interpostas entre regiões de grelha humanas ou humanizadas.

Numa forma de realização, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma CDRLi que compreende a sequência da SEQ ID N°. 18 (2B8), uma CDRL2 que compreende a sequência da SEQ ID N°. 19 (2B8) ou SEQ ID N°. 206 (LRMR2B8LC) , e uma CDRL3 que compreende a sequência da SEQ ID N°. 20 (2B8).

Em cada uma das formas de realização anteriores, as sequências de CDRLi, CDRL2, e CDRL3 são preferencialmente interpostas entre imunoglobulinas de FRs humanas ou humanizadas. Entende-se que a proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto, um seu fragmento de ligação ao antigénio, ou um sítio de anticorpo biossintético. 19 ΕΡ2027156Β9

Noutra forma de realização, a proteína de ligação compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRHi que compreende a sequência da SEQ ID N°. 15 (2B8); uma CDRH2 que compreende a sequência da SEQ ID N°. 204 (LR2B8HC) ou SEQ ID N°. 205 (LRMR2B8HC); e uma CDRH3 que compreende a sequência da SEQ ID N° . 17 (2B8).

Em cada uma das formas de realização anteriores, as sequências de CDRHi, CDRH2, e CDRH3 são preferencialmente interpostas entre imunoglobulinas de FRs humanas ou humanizadas. Entende-se que a proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto, um seu fragmento de ligação ao antigénio, ou um sítio de anticorpo biossintético.

Noutro aspecto, a invenção proporciona uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano que compreende (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina seleccionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°. 193 (região variável da cadeia leve de LR2B8LC), e SEQ id N°. 199 (região variável da cadeia leve de LRMR2B8LC); e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina seleccionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°. 183 (região variável da cadeia pesada de LR2B8HC), e SEQ ID N°: 189 (região variável da cadeia pesada de LRMR2B8HC). A proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto, um seu fragmento de ligação ao antigénio, ou um sítio de anticorpo biossintético.

Noutro aspecto, a invenção proporciona uma proteína de ligação isolada que se liga ao HGF humano que compreende (i) e cadeia leve da imunoglobulina seleccionada a partir do 20 ΕΡ2027156Β9 grupo que consiste na SEQ ID N°. 197 (LR2B8LC + constante Kapa (Km (3) alotipo (alelo 1)), e SEQ ID N°. 201 (LRMR2B8LC + constante Kapa (Km (3) alotipo (alelo 1)); e (ii) uma cadeia pesada de imunoglobulina seleccionada a partir do grupo que consiste na SEQ N°. 187 (LR2B8HC + IgGl Constante (Glm (3) alotipo) (alelo 1)), e SEQ ID N° . 191 (LRMR2B8HC +IgGl Constante (Glm(3) alotipo) (alelo 1)). A proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto, um seu fragmento de ligação ao antigénio, ou um sítio de anticorpo biossintético. É também aqui descrita uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano reduzido. A proteína de ligação compreende (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende três CDRs, e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende três CDRs. As CDRs são tipicamente interpostas entre FRs. As CDRs da cadeia leve da imunoglobulina e da cadeia pesada da imunoglobulina em conjunto definem um sítio de ligação que se liga ao HGF humano reduzido, por exemplo, a cadeia α do HGF reduzido. O HGF reduzido refere-se a HGF tratado com uma quantidade de agente de redução, por exemplo, ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol, ou glutationa suficiente para reduzir a ligação de persulfureto entre a cadeia α e a cadeia β. Concentrações exemplares incluem, por exemplo, 100 mM de DTT e 5% de 2-mercaptoetanol. É também descrita uma proteína de ligação que compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende pelo menos uma CDR seleccionada a partir do grupo que consiste na CDRL1, CDRL2 e CDRL3. Opcionalmente, a proteína de ligação compreende duas CDRs, por exemplo, CDRLi e CDRL2, ou CDRli e CDRl3, ou CDRLi e CDRL3 · Opcionalmente, a proteína 21 ΕΡ2027156Β9 de ligação compreende todas as três CDRs, i. e., CDRLi, CDRL2 e CDRl3. A CDRl1 aqui descrita compreende a sequência de aminoacidos Xi X2 Ser X4 X5 X8 X7 X8 X9 X40 Xh X12 X13 X14 X15, cm que o aminoácido Xi é Arg ou Lys, X2 é Ala ou Thr, X4 é Glu ou Gin, X5 é Asn, Ser, ou Asp, Xê é Ile ou Vai, X7 é Tyr, Asp, ou Lys, X8 é uma ligação peptidica ou Tyr, X9 é uma ligação peptidica ou Asp, Χχ0 é uma ligação peptidica ou Gly, Xn é uma ligação peptidica ou Asn, X12 é uma ligação peptidica ou Ser, X13 é Asn ou Tyr, X14 é Ile ou Leu, X15 é Ala, Asn, ou Ser. A CDRl2 compreende a sequência de aminoácidos Xi6 X17 Xi8 X19 Leu X21 X22, em que o aminoácido Xi6 é Ala, Asp, Vai, ou Arg, Xi7 é Ala ou Vai, X78 é Asn, Ser, ou Thr, X19 é Arg, Asn, ou His, X21 é Ala, Glu, Vai, ou Pro, X22 é Asp ou Ser. A CDRl3 compreende a sequência de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 Pro X3o Thr, em que o aminoácido X23 é Leu ou Gin, X24 é His ou Gin, X25 é Phe, Ser, ou Tyr, X26 é Asp, Ile, ou Trp, X27 é Gly ou Glu, X28 é Asp, Phe, ou Thr, X30 é Phe, Pro, ou Tyr. É também descrita uma proteína de ligação que compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende pelo menos uma CDR seleccionada a partir do grupo que consiste na CDRHi, CDRh2, e CDRh3. Opcionalmente, a proteína de ligação compreende duas CDRs, por exemplo, CDRHi e CDRH2, ou CDRhi e CDRh3, ou CDRHi e CDRh3. Opcionalmente, a proteína de ligação compreende todas as três CDRs, í. e., CDRHi, CDRh2 e CDRh3. A CDRHi aqui descrita compreende a sequência de aminoácidos Xi Tyr X3 X4 X5, em que o aminoácido Xi é Asp, Asn, Ser, ou Thr, X3 é Phe, Trp, ou Tyr, X4 é Ile ou Met, X5 é Asn, His, ou Ser. A CDRh2 compreende a sequência de aminoácidos X6 Ile X8 X9 Gly Xn Gly X13 Xi4 X15 Tyr Xn X18 X19 X2o Lys X22, em que o aminoácido Χε é Lys, Gin, ou Tyr, Xs é Gly, Ser, ou Tyr, X9 é Pro ou Ser, Xn é Asp, Gly, ou Ser, X13 22 ΕΡ2027156Β9 é Asp ou Ser, X44 é Ser ou Thr, Xi5 é Asn ou Tyr, Xi7 é Asn ou Pro, Xis é Ala, Asp, Gly, ou Glu, X19 é Asn, Met, ou Ser, X20 é Phe ou Vai, X22 é Asp ou Gly. A CDRH3 compreende a sequência de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 Asp Tyr, em que o aminoácido X23 é Arg ou Gin, X24 é Gly ou Leu, X25 é Asp, Gly, ou uma ligação peptidica, X26 é Gly ou uma ligação peptidica, X27 é uma ligação peptidica ou Tyr, X2s é Leu, uma ligação peptidica ou Tyr, X2g é uma Gly, Arg ou Leu, X30 é Asp, Gly ou Glu, X31 é uma Tyr, Arg ou Asn, X32 é Ala, Gly ou Tyr, X33 é Met ou Phe.

Entende-se que a proteína de ligação pode compreender ambas as sequências da cadeia pesada da imunoglobulina e da cadeia leve das imunoglobulinas ou seus fragmentos, notadas acima. Para além disso, entende-se que a proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, ou um sítio de anticorpo biossintético.

Entende-se que cada uma das proteínas de ligação discutidas acima pode ser um anticorpo intacto, por exemplo, um anticorpo monoclonal. Alternativamente, a proteína de ligação pode ser um fragmento de anticorpo de ligação ao antigénio, ou pode ser um sítio de ligação ao anticorpo biossintético. Os fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', (Fab')2 ou Fv. Técnicas para produzir esses fragmentos de anticorpo são conhecidos dos especialistas na técnica. São conhecidos na técnica vários sítios de ligação ao anticorpo biossintético e incluem, por exemplo, moléculas de Fv ou sFv simples, descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. N°s. 5 476 786. Outros sítios de ligação ao anticorpo biossintético incluem proteínas de ligação biespecíficas ou bifuncionais, por exemplo, anticorpos biespecíficos ou 23 ΕΡ2027156Β9 bifuncionais, que são anticorpos ou fragmentos de anticorpo que se ligam a pelo menos dois antigénios diferentes. Por exemplo, proteínas de ligação biespecíficas podem ligar-se a HGF, por exemplo, HGF humano, e outro antigénio de interesse. Métodos para produzir anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica e, incluem, por exemplo, através de fusão de hibridomas ou através de fragmentos Fab' de ligação. Ver, e. g., Songsivilai et al. (1990) CLIN. Exp. IMMUNOL. 79: 315-325; Kostelny et al. (1992) J. IMMUNOL. 148: 1547-1553.

As proteínas de ligação de uma invenção podem ligar-se a hHGF contendo uma substituição de cisteína para arginina na posição 561 ou uma substituição de glicina para glutamato na posição 555.

Noutro aspecto, a invenção proporciona uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano com um kd de 4,0xl0~5 s"1 ou inferior, 3,0xl0"5 s"1 ou inferior, ou 2,0xl0~5 s’1 ou inferior. As proteínas de ligação isoladas podem ligar-se a HGF humano com uma kd desde 5, 0xl0“5 s_1 até 0,5xl0~5 s"1, ou desde 4,0xl0“5 s"1 até Ι,ΟχΙΟ"5 s"1, ou desde 3, OxlCT5 s_1 até l,5xl0~5 s-1. Noutro aspecto, a invenção proporciona uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano com uma KD de 100 pM ou inferior, ou 20 pM ou inferior, ou 10 pM ou inferior, ou 5 pM ou inferior. As proteínas de ligação isoladas podem ligar-se a HGF humano com uma KD desde 100 pM até 5 pM, ou desde 20 pM até 5 pM, ou desde 15 pM até 10 pM, ou desde 20 pM até 10 pM, ou desde 15 pM até 5 pM. Salvo especificado em contrário, os valores de KD são determinados pelos métodos, e nas condições descritas no Exemplo 6. 24 ΕΡ2027156Β9

Noutro aspecto, a invenção proporciona uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano, em que o anticorpo se liga a HGF humano com KD inferior a 37°C do que a 25°C. A proteína de ligação liga-se opcionalmente ao HGF humano com uma KD inferior a 5 pM a 37 °C.

Noutros aspectos e formas de realização, as proteínas de ligação podem inibir o hHGF de se ligar a c-Met. Por exemplo, as proteínas de ligação pode possuir uma IC50 (concentração a 50% de inibição máxima) de pelo menos cerca de 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, e 7,0 nM quando ensaiado utilizando o protocolo descrito no Exemplo 7 (a) . Em algumas outras formas de realização, as proteínas de ligação podem neutralizar a incorporação de HGF BrdU em células 4 MBr-5 (ATCC, N° de Catálogo CCL208) utilizando o método descrito no Exemplo 7 (b) .

As proteínas de ligação possuem uma IC50 de 50 nM ou inferior, preferencialmente 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 1, 0,5 nM ou inferior, quando ensaiadas utilizando o protocolo descrito no Exemplo 7 (b). Em algumas outras formas de realização, as proteínas de ligação podem ser utilizadas para inibir a fosforilação de c-Met estimulada por HGF em células PC-3 (ATCC, Manassus, VA N° de Catálogo CRL- 1435) utilizando o ensaio descrito no Exemplo 9. As proteínas de ligação inibem a fosforilação de c-Met estimulada por HGF (1,25 nM) em células PC-3 com uma IC50 de 2 nM ou inferior (Tabela 8), utilizando o ensaio descrito no Exemplo 9. 25 ΕΡ2027156Β9 II - Produção de Proteínas de ligação

Proteínas de ligação da invenção podem ser produzidas de vários modos utilizando abordagens conhecidas na técnica. Por exemplo, moléculas de ADN que codificam regiões variáveis de cadeia leve e regiões variáveis de cadeia pesada podem ser sintetizadas quimicamente, utilizando um sintetizador comercial e a informação de sequência aqui proporcionada. Essas moléculas de DNA sintéticas podem ser ligadas a outras sequências de nucleótidos apropriadas, incluindo, e. g., sequências que codificam a região constante, e sequências de controlo de expressão, para produzir construções de expressão genética convencionais que codificam as proteínas de ligação desejadas. A produção de construções genéticas definidas está dentro da rotina de um especialista na técnica. Alternativamente, as sequências aqui proporcionadas podem ser clonadas foram dos hibridomas através de técnicas de hibridação convencionais ou técnicas de PCR, utilizando sondas de ácido nucleico sintético cujas sequências são baseadas na informação de sequências aqui proporcionada ou informação de sequências da técnica anterior, em relação a genes que codificam as cadeias leve e pesada de anticorpos de murino em células de hibridoma. A produção e utilização dessas sondas está dentro da especialidade na técnica.

Os ácidos nucleicos que codificam as proteínas de ligação desejadas podem ser introduzidos (ligados) em vectores de expressão, que podem ser introduzidos numa célula hospedeira através de técnicas de transfecção ou transformação convencionais, conhecidas na técnica. Células hospedeiras exemplares incluem, por exemplo, células de E. coli, células de ovário de hamster Chinês (CHO), células 26 ΕΡ2027156Β9

HeLa, células de rim de hamster bebé (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (e. g., Hep G2) , e células de mieloma que de outra forma não produzem proteína imunoglobulina. As células hospedeiras transfectadas podem ser cultivadas em condições que permitem que as células hospedeiras expressem os genes de interesse, por exemplo, os genes que codificam as regiões variáveis de cadeia leva ou pesada da imunoglobulina. Os produtos de expressão resultantes podem ser recuperados utilizando técnicas conhecidas na técnica.

As condições particulares de expressão e purificação irão variar dependendo de qual o sistema de expressão que é empregue. Por exemplo, se o gene se destina a ser expresso em E. coli, é primeiro clonado num vector de expressão. Isto é alcançado através do posicionamento do gene modificado a jusante de um promotor bacteriano adequado, e. g., Trp ou Tac, e uma sequência sinal, e. g., uma sequência que codifica o fragmento B da proteína A (FB) . A proteína de fusão expressa resultante acumula-se tipicamente em corpos refrácteis ou de inclusão no citoplasma das células, e pode ser recolhida após rebentamento das células através de prensa Francesa ou sonicação. Os corpos refrácteis são então solubilizados, e as proteínas expressas redobradas e clivadas através dos métodos já estabelecidos para muitas outras proteínas recombinantes.

Se o gene modificado se destina a ser expressos em células hospedeiras eucarióticas, por exemplo, células de mieloma ou células CHO, ele é primeiro inserido num vector de expressão contendo um promotor eucariótico adequado, um sinal de secreção, intensificadores de imunoglobulina, e vários 27 ΕΡ2027156Β9 intrões. Este vector de expressão pode conter opcionalmente sequências que codificam a totalidade ou parte de uma região constante, permitindo que seja expressa uma cadeia pesada ou leve inteira, ou uma parte desta. A construção genética pode ser transfectada em células de mieloma ou células CHO utilizando protocolos de transfecção estabelecidas. Essas células transfectadas podem expressar fragmentos VL ou VH, heterodimeros VL-VH, polipéptidos de cadeia simples VH-VL ou VL-VH, cadeias de imunoglobulina pesada ou leve completas, ou porções destas, cada uma das quais pode estar ligada a um dominio de proteína que possua outra função (e. g., citotoxicidade). III - Modificações das Proteínas de Ligação

Entende-se que as proteínas de ligação podem ser modificadas para optimizar o desempenho dependendo a utilização pretendida para as proteínas de ligação. Por exemplo, quando a proteína de ligação está a ser utilizada como um agente terapêutico, a proteína de ligação pode ser modificada para reduzir a sua imunogenicidade no recipiente pretendido. Alternativamente, ou adicionalmente, a proteína de ligação pode ser fundida ou acoplada a outra proteína ou péptido, por exemplo, uma factor de crescimento, citoquina, ou citotoxina. Essas modificações podem ser alcançadas utilizando técnicas de manipulação genética de rotina conhecidas na técnica. São conhecidas na técnica várias técnicas para a redução da antigenicidade de anticorpos e fragmentos de anticorpo. Estas técnicas podem ser utilizadas para reduzir ou eliminar a antigenicidade das proteínas de ligação de uma invenção. 28 ΕΡ2027156Β9

Por exemplo, quando as proteínas de ligação se destinam a ser administradas a um humano, as proteínas de ligação são preferencialmente modificadas de modo a reduzir a sua antigenicidade em humanos. Este processo é muitas vezes referido como humanização. Preferencialmente, as proteínas de ligação humanizadas possuem afinidade igual ou substancialmente igual para o antigénio do que a proteína de ligação original não humanizada da qual deriva.

Numa abordagem de humanização bem conhecida, são criadas proteínas quiméricas nas quais as regiões constantes de imunoglobulina dos anticorpos de uma espécie, e. g., de murganho, são substituídas com regiões constantes de imunoglobulina a partir de uma segunda espécie diferente, e. g., um humano. Neste exemplo, o anticorpo resultante é uma quimera de murganho-humano, em que as sequências da região constante humana, em princípio, são menos imunogénicas do que as sequências da sua contrapartida de murino. Este tipo de engenharia de anticorpo é descrito, por exemplo, Morrison, et al. (1984) PROC. NAT. ACAD. Sei. 81: 6851-6855, Neuberger et al. (1984) NATURE 312: 604-608; Patente U.S. N°s. 6 893 625 (Robinson); 5 500 362 (Robinson); e 4 816 567 (Cabilly).

Noutra abordagem, conhecida como enxertia de CDR, as CDRs das regiões variáveis de cadeia leve e pesada de um anticorpo de interesse são enxertados em gralhas (FRs) de outra espécie. Por exemplo, CDRs de murino podem ser enxertados em sequências FR humanas. Em algumas formas de realização, as CDRs das regiões variáveis de cadeia leve e pesada de um anticorpo anti-HGF são enxertados em FRs humanas ou FRs humanas de consenso. De modo a criar FRs humanos de consenso, as FRs de várias sequências de aminoácidos de 29 ΕΡ2027156Β9 cadeia pesada ou de cadeia leve humanas são alinhadas para identificar uma sequência de aminoácidos de consenso. A enxertia de CDR é descrita, por exemplo, nas Patentes U.S. N°s. 7 022 500 (Queen); 6 982 321 (Winter); 6 180 370 (Queen) ; 6 054 297 (Cárter); 5 693 762 (Queen); 5 859 205 (Adair) ; 5 693 761 (Queen); 5 565 332 (Hoogenboom); 5 585, 089 (Queen); 5 530 101 (Queen); Jones et ai. (1986) NATURE 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) NATURE 332: 323-327; Verhoeyen et ai. (1988) SCIENCE 239: 1534-1536; e Winter (1998) FEBS LETT 430: 92-94.

Numa abordagem denominada "super-humanização", os anticorpos nos quais a imunogenicidade humana é reduzida ou eliminada são criados através de uma forma alternativa de enxertia. Em super-humanização, as sequências FR humanas são escolhidas a partir de um conjunto de genes da linha germinal humana com base na semelhança estrutural das CDRs humanas em relação às do anticorpo de murganho a ser humanizado. Esta abordagem é descrita, por exemplo, na Patente U.S. N°. 6 881 557 (Foote) e em Tan et al. (2002) J. IMMUNOL 169:1119-1125:

Outras abordagens para reduzir a imunogenicidade incluem, técnicas que são conhecidas como "remodelagem" "hiperquimerização" ou "folheação/repavimentação" para produzir anticorpos humanizados. Ver, e. g., Vaswami et al. (1998) ANNALS OF ALLERGY, ASTHMA, & IMMUNOL. 81: 105; Roguska et al. (1996) PROT. ENGINEER 9: 895-904; e Patente U.S. N°. 6 072 035 (Hardman). Na abordagem de folheação/repavimentação, os resíduos de aminoácidos acessíveis à superfície no anticorpo de murino são substituídos por resíduos de aminoácidos mais frequentemente encontrados nas mesmas posições num anticorpo humano. Este tipo de repavimentação de 30 ΕΡ2027156Β9 anticorpo é descrito, por exemplo, na Patente U.S. N°. 5 639 641 (Pedersen).

Uma abordagem exemplar para converter um anticorpo de murganho numa forma adequada para utilização médica em humanos é conhecida como tecnologia ACTIVMAB™ (Vaccinex, Inc., Rochester, NY) , que envolve um vector à base de virus vaccinia para expressar anticorpos em células de mamiferos. Os níveis elevados de diversidade combinatória de cadeias de imunoglobulina pesada e leve são referidos como sendo produzidos. Ver, e. g., Patente U.S. N°s. 6 706 477 (Zauderer); 6 800 442 (Zauderer); e 6 872 518 (Zauderer).

Outra abordagem exemplar para converter um anticorpo de murganho numa forma adequada para utilização em humanos é a tecnologia praticada comercialmente por KaloBios Pharmaceuticals, Inc. (Paio Alto, CA) . Esta tecnologia envolve a utilização de uma biblioteca de "aceitador" humano proprietário para produzir uma biblioteca "focada em epitopo" para a selecção de anticorpo.

Outra abordagem exemplar para modificar um anticorpo de murganho numa forma adequada para utilização médica em humanos é a tecnologia de HUMAN ENGINEERING™ (HE™), que é praticada comercialmente por XOMA (US) LLC. Ver, e. g., Publicação do Pedido Internacional No. WO 93/11794 e Patentes U.S. N°s. 5 766 886; 5 770 196; 5 821 123; e 5 869 619.

Qualquer abordagem adequada, incluindo qualquer uma das abordagens acima, pode ser utilizada para reduzir ou eliminar a imunogenicidade humana de uma proteína de ligação de interesse. 31 ΕΡ2027156Β9

Adicionalmente, é possível criar anticorpos totalmente humanos em murganhos. Nesta abordagem, os anticorpos humanos são preparados utilizando um murganho transgénico no qual os genes que produzem o anticorpo de murganho foram substituídos por uma porção substancial dos genes que produzem o anticorpo humano. Esses murganhos produzem imunoglobulina humana em vez de moléculas de imunoglobulina de murino. Ver, e.g., WO 98/24893 (Jacobovitz et ai.) e Mendez et ai. (1997) NATURE GENETICS 15: 146-156. Os anticorpos monoclonais anti-HGF totalmente humanos podem ser produzidos utilizando a seguinte abordagem. Murganhos transgénicos contendo genes de imunoglobulina humana são imunizados com o antigénio de interesse, e.g., HGF. As células linfáticas dos murganhos foram então obtidas a partir de murganhos, que são então fundidas com uma linha celular de tipo mielóide para preparar linhas celulares de hibridoma imortais. As linhas celulares de hibridoma são rastreadas e seleccionadas para identificar linhas celulares de hibridoma que produzem anticorpos específicos para HGF.

As proteínas de ligação da invenção podem ser conjugadas com outras moléculas, dependendo da sua utilização pretendida. Por exemplo, se a proteína de ligação vai ser utilizada como uma terapêutica, quando a proteína de ligação pode ser conjugada com outro agente, por exemplo, uma molécula efectora que modula, ou de outra forma promove a terapia. Na medida em que o efector é um agente baseado em não proteína, por exemplo, um fármaco de pequena molécula, um marcador radioactivo ou toxina, em que o agente pode ser acoplado quimicamente à proteína de ligação utilizando químicas de acoplamento in vitro convencionais. Se, por outro lado, a molécula efectora é uma proteína ou péptido, por 32 ΕΡ2027156Β9 exemplo, uma enzima, receptor, toxina, factor de crescimento, citoquina ou outro imunomodulador, então a proteína de ligação pode estar ligado quimicamente ao efector utilizando químicas de acoplamento in vitro ou pode estar acoplado ao efector como uma proteína de fusão. As proteínas de fusão podem ser construídas e expressas utilizando as técnicas semelhantes aquelas discutidas na secção II. IV - Utilização de Proteínas de ligação

As proteínas de ligação aqui descritas podem ser utilizadas como um agente de diagnóstico ou um agente terapêutico. (1) Aplicações Terapêuticas

Dado que as proteínas de ligação da invenção neutralizam a actividade de HGF, elas podem ser utilizadas em vários pedidos terapêuticos. Por exemplo, certas proteínas de ligação da invenção são úteis na prevenção ou tratamento de doenças ou distúrbios hiperproliferativos, e. g., várias formas de cancro.

As proteínas de ligação podem ser utilizadas para inibir ou reduzir a proliferação de células tumorais. Nessa abordagem, as células tumorais são expostas a uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação de modo a inibir ou reduzir a proliferação da célula tumoral. Em certas formas de realização, as proteínas de ligação inibem a proliferação de célula tumoral em pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100%. 33 ΕΡ2027156Β9

Em certas formas de realização, a proteína de ligação é utilizada para inibir ou reduzir a proliferação de uma célula tumoral em que a proteína de ligação reduz a capacidade de hHGF para se ligar a c-Met. A proteína de ligação pode ser utilizada para inibir ou reduzir a proliferação de uma célula tumoral mesmo quando a proteína de ligação se liga a hHGF mas não inibe substancialmente a ligação de hHGF a c-Met, como demonstrado pelo anticorpo 3B6 nas Tabelas 5 e 6.

Adicionalmente, a proteína de ligação pode ser utilizada para inibir, ou retardar o crescimento ou desenvolvimento do tumor num mamífero. Nesse método, é administrada uma quantidade eficaz da proteína de ligação ao mamífero de modo a inibir ou retardar o crescimento tumoral no mamífero. Consequentemente, as proteínas de ligação podem ser utilizadas para tratar tumores, por exemplo, num mamífero. 0 método compreende administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação. A proteína de ligação pode ser administrada isoladamente ou em combinação com outra molécula farmaceuticamente activa, de modo a tratar o tumor.

Está contemplado que as proteínas de ligação da invenção possam ser utilizadas no tratamento de uma variedade de distúrbios responsivos a HGF, incluindo, por exemplo, células tumorais responsivas a HGF em cancro do pulmão, cancro da mama, cancro do cólon, cancro da próstata, cancro do ovário, cancro da cabeça e pescoço, cancro ovárico, mieloma múltiplo, cancro do fígado, cancro gástrico, cancro do esófago, cancro do rim, cancro nasofaríngico, cancro pancreático, mesotelioma, melanoma e glioblastoma. 34 ΕΡ2027156Β9

Como aqui utilizado, "tratar", "tratando" e "tratamento" refere-se ao tratamento de um estado de doença num mamífero, particularmente num humano, e inclui: (a) prevenir o estado de doença de ocorrer num mamífero, em particular, quando esse mamífero está predisposto a um estado de doença mas ainda não foi diagnosticado como possuindo essa doença; (b) inibir o estado de doença, í. e., interromper o seu desenvolvimento; e/ou (c) aliviar o estado de doença, i. e., provocando a regressão do estado de doença.

De um modo geral, a quantidade terapeuticamente eficaz do componente activo estará no intervalo desde cerca de 0,1 mg/kg até cerca de 100 mg/kg, opcionalmente desde cerca de 1 mg/kg até cerca de 100 mg/kg, opcionalmente desde cerca de 1 mg/kg até 10 mg/kg. A quantidade administrada irá depender de variáveis tais como o tipo e extensão da doença ou indicação a ser tratada, o estado global de saúde do doente particular, a eficácia biológica relativa da proteína de ligação distribuída, a formulação da proteína de ligação, a presença e tipos de excipientes na formulação, e a via de administração. A dosagem inicial administrada pode ser aumentada para além do nível superior, de modo a alcançar rapidamente o nível desejado no sangue ou no tecido, ou a dosagem inicial pode ser menor do que a dosagem óptima e a dosagem diária pode ser aumentada progressivamente aumentada durante o curso do tratamento dependendo da situação particular. A dosagem humana pode ser optimizada, e. g., num estudo de escala de dose de Fase I convencional concebido para aplicar desde 0,5 mg/kg até 20 mg/kg. A frequência da dosagem pode variar, dependendo de factores tais como via de administração, quantidade de dosagem e o estado de doença a ser tratado. Frequências de dosagem exemplares são de uma vez 35 ΕΡ2027156Β9 por dia, uma vez por semana e uma vez a cada duas semanas. Uma via de administração preferida é a parentérica, e. g., infusão intravenosa. A formulação de fármacos à base de anticorpo monoclonal está dentro da capacidade ordinária na técnica. Em algumas formas de realização da invenção, a proteína de ligação, e. g., anticorpo monoclonal, é liofilizada e reconstituída em soro fisiológico tamponado no momento da administração.

As proteínas de ligação podem ser administradas isoladamente ou em combinação com outros ingredientes farmaceuticamente activos. Os outros ingredientes activos, e. g., imunomoduladores, podem ser administrados conjuntamente com a proteína de ligação, ou podem ser administrados antes ou após a proteína de ligação.

As formulações que contêm as proteínas de ligação para utilização terapêutica, incluem tipicamente as proteínas de ligação combinadas com um veículo farmaceuticamente aceitável. Como aqui utilizado, "veículo farmaceuticamente aceitável" significa tampões, veículos, e excipientes, que estão dentro do âmbito de juízo médico sólido, adequado para utilização em contacto com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, proporcionado com uma proporção de risco/benefício adequada. 0(s) veículo(s) devem ser "aceitáveis" no sentido de serem compatíveis com os outros ingredientes das formulações e não prejudiciais para o receptor. Veículos farmaceuticamente aceitáveis, neste sentido, pretendem incluir qualquer um e todos os tampões, solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes isotónicos e retardamento de absorção, e semelhantes, 36 ΕΡ2027156Β9 compatível com a administração farmacêutica. A utilização desses meios e agentes para as substâncias farmaceuticamente activas é conhecida na técnica.

As formulações podem ser apresentadas convenientemente numa forma de unidade de dosagem e podem ser preparadas através de qualquer método adequado, incluindo qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica farmacêutica. Uma composição farmacêutica da invenção deve ser formulada para ser compatível com a sua via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração incluem administração parentérica ou administração não parentérica, por exemplo, administração intravenosa, intradérmica, inalação, transdérmica (tópica), transmucosal, e rectal. Soluções úteis para administração oral ou parentérica podem ser preparadas através de qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica farmacêutica, descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. (Mack Publishing Company, 1990).

Formulações adequadas para administração oral podem estar na forma de: unidades discretas tais como injectáveis, cápsulas, cápsulas de gelatina, saquetas, comprimidos, trociscos, ou pastilhas, cada um contendo uma quantidade predeterminada da proteína de ligação; uma composição em pó ou granular; uma solução ou uma suspensão num líquido aquoso ou não aquoso; ou uma emulsão de óleo-em-água ou uma emulsão de água-em-óleo.

Formulações adequadas para administração parentérica incluem, por exemplo, os seguintes componentes: um diluente estéril tal como água para injecção, solução salina, óleos 37 ΕΡ2027156Β9 fixados, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tais como álcool benzilico ou metilparabenos; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminatetra-acético; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para acertar a tonicidade, tal como cloreto de sódio ou dextrose. 0 pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parentérica pode ser fechada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de dose múltipla compostos por vidro ou plástico.

Em geral, as composições adequadas para utilização injectável incluem soluções aquosas (quando são solúveis em água) ou dispersões e pós para a preparação extemporânea de soluções injectáveis estéreis ou dispersão. Para administração intravenosa, veículos adequados incluem soro fisiológico, água bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) ou soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) . Deve ser estável nas condições de fabrico e armazenamento e deve ser preservado contra a acção contaminante dos microrganismos tais como bactérias e fungos. 0 veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido), e misturas adequadas deste.

As formulações farmacêuticas são preferencialmente estéreis. A esterilização pode ser realizada, por exemplo, através de filtração através de membranas de filtração estéreis. Quando a composição é liofilizada, a esterilização 38 ΕΡ2027156Β9 utilizando este método pode ser realizada antes de, ou após liofilização e reconstituição. Assim que a composição farmacêutica tenha sido formulada, pode ser armazenada, por exemplo, em frascos como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido, ou como um pó desidratado ou liofilizado. (2) Aplicações de Diagnóstico

Quando as proteínas de ligação são utilizadas para objectivos de diagnóstico, quer seja in vitro ou in vivo, as proteínas de ligação tipicamente são marcadas quer directamente ou indirectamente com uma unidade detectável. A unidade detectável pode ser qualquer unidade que é capaz de produzir, seja directamente ou indirectamente, um sinal detectável. Por exemplo, a unidade detectável pode ser um radioisótopo, tal como 3Hidrogénio (3H), 14Carbono (14C), 32Fósforo (32P) , 35Enxofre (35S), ou 125Iodo (125I); um composto fluorescente ou quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ou luciferina; uma enzima, tal como fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou peroxidase de rábano; uma sonda de spin, tal como um marcador de spin; ou uma partícula colorida, por exemplo, uma partícula de látex ou de ouro. Entende-se que a proteína de ligação pode ser conjugada à unidade detectável utilizando várias abordagens conhecidas na técnica, por exemplo, como descrito em Hunter et al. (1962) NATURE 144: 945; David et al. (1974) BIOCHEMISTRY 13: 1014; Pain et al. (1981) J. IMMUNOL. METH. 40: 219; e Nygren (1982) J. HISTOCHEM. AND CYTOCHEM. 30: 407. Os marcadores podem ser detectados, e. g., visualmente ou com o auxílio de um espectrofotómetro ou outro detector. 39 ΕΡ2027156Β9

As proteínas de ligação podem ser empregues numa vasta gama de técnicas de imunoensaio disponíveis na técnica, imunoensaios exemplares incluem, por exemplo, imunoensaios de sanduíche, imunoensaios competitivos, processos imuno-histoquímicos.

Num imunoensaio de sanduíche, são utilizados dois anticorpos que se ligam a um analito ou antigénio de interesse, e. g., um imobilizado a um suporte sólido, e um livre em solução e marcado com uma unidade detectável. Quando uma amostra contém o antigénio é introduzida neste sistema, o antigénio liga-se tanto ao anticorpo imobilizado como ao anticorpo marcado, para formar um complexo de "sanduíche" imunitário na superfície do suporte. A proteína complexada é detectada através da remoção por lavagem dos componentes não ligados à amostra e o anticorpo marcado em excesso, e medindo a quantidade do anticorpo marcado complexado com a proteína na superfície do suporte. Alternativamente, o anticorpo isento na solução pode ser detectado por um terceiro anticorpo marcado com uma unidade detectável que se liga ao anticorpo livre. Uma revisão detalhada da concepção do ensaio imunológico, teoria e protocolos pode ser encontrada em numerosos textos, incluindo Butt, ed., (1984) PRACTICAL IMMUNOLOGY, Mareei Dekker, New York; Harlow et al. eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY APPROACH, Cold Spring Harbor Laboratory; e Diamandis et al., eds. (1996) IMMUNOASSAY, Academic Press, Boston.

Está contemplado que as proteínas de ligação marcadas são úteis como agentes de imagem In vivo, em que as proteínas de ligação podem direccionar os agentes de imagem para tecidos de interesse particulares no recipiente. Uma unidade 40 ΕΡ2027156Β9 detectável remotamente preferida para detecção de imagem in vivo inclui o átomo radioactivo Tecnécio-99"1 (99mTc), um emissor gama com uma semi-vida de cerca de seis horas. Unidades não radioactivas também úteis em sistemas de imagem in vivo incluem marcadores de spin de nitróxido assim como lantânio e iões de metal de transição em que todos eles induzem relaxação de protão, in situ. Adicionalmente a imagem imunitária, as unidades radioactivas complexadas podem ser utilizadas em protocolos de radioimunoterapia convencional para destruir a célula direccionada. Os nucleótidos preferidos para radioimunoterapia de dose elevada incluem os átomos radioactivos 90Ytítrio (90Yt), 131Iodo (131I) e 11:1índio (mIn) . A proteína de ligação pode ser marcada com 131I, niIn e 99mTC utilizando técnicas de acoplamento conhecidas nas artes de imagem. De uma forma semelhante, os processos para preparar e administrar o agente de imagem, assim como capturar e processar imagens são bem conhecidos na técnica de imagem e por isso não são aqui discutidos em detalhe. De um modo semelhante, os métodos para realizar imunoterapias à base de anticorpo são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Patente U.S. N°. 5 534 254.

Ao longo da descrição, quando as composições são descritas como possuindo, incluindo, ou que compreendem componentes específicas, está contemplado que as composições também consistem essencialmente em, ou consistem em, os componentes recitados. De um modo semelhante, quando os processos são descritos como possuindo, incluindo, ou que compreendem passos de processo específicos, os processos também consistem essencialmente em, ou consistem em, os passos de processamento recitados. Excepto quando indicado em contrário, a ordem dos passos ou ordem para realizar certas 41 ΕΡ2027156Β9 acções são imateriais desde que a invenção permaneça operável. Para além disso, salvo referência em contrário, dois ou mais passos ou acções podem ser realizadas em simultâneo.

EXEMPLOS

Os Exemplos seguintes discutem a produção e caracterização de vários anticorpos monoclonais anti-hHGF. Sequências que não estão dentro do âmbito das reivindicações estão incluídas para referência.

Exemplo 1 - Produção de Anticorpos Monoclonais Anti-hHGF

Este Exemplo descreve a produção de vários anticorpos monoclonais anti-hHGF.

Imunizações, fusões, e rastreios primários foram realizados na MBS Inc. (Portland, ME), seguinte o protocolo de Sítios Múltiplos de Imunização Repetitiva (Immunization Multiple Sites, RIMMS). Cinco murganhos AJ e cinco murganhos Balb/c foram imunizados com HGF humano recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN; N° de Catálogo 294-HGN-025). Dois murganhos com soros apresentando a actividade anti-HGF mais elevada por Ensaio de Imunoabsorção Ligado a Enzima (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA) foram seleccionados para subsequente fusão. Foram recolhidos os baços e os nódulos linfáticos a partir de murganhos apropriados. Foram então recolhidas células B e fundidas com uma linha de mieloma. Os produtos de fusão foram diluídos em série em uma ou mais placas até próximo da globalidade. Os sobrenadantes das fusões resultantes foram rastreados quanto à sua ligação a 42 ΕΡ2027156Β9 hHGF por ELISA. Os sobrenadantes identificados como contendo anticorpos contra HGF foram ainda caracterizados através de testes funcionais in vitro como discutido nos exemplos seguintes. Um painel de hibridomas foi seleccionado e os hibridomas foram subclonados e expandidos. Os anticorpos monoclonais foram então purificados por cromatografia de afinidade em condições convencionais em Proteina A/resina G.

Exemplo 2 - Análise de Sequência de Anticorpos Monoclonais anti-hHGF

Este Exemplo descreve o isotipo e a análise de sequências dos anticorpos monoclonais anti-hHGF produzidos no Exemplo 1. a. Determinação do Isotipo do Anticorpo Monoclonal de HGF de Murino 0 tipo da cadeia leve e o isotipo da cadeia pesada de cada anticorpo monoclonal foram determinados utilizando o Kit "IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping" de acordo com as instruções do fabricante (Roche Applied Science).

Todos os anticorpos foram determinados como contendo uma cadeia leve da imunoglobulina Kapa e uma cadeia pesada da imunoglobulina IgGl. b. Determinação das Sequências de Nucleótidos que Codificam as Regiões Variáveis de Cadeia Pesada e Leve de Imunoglobulina 43 ΕΡ2027156Β9 0 RNA total foi extraído a partir de cada linha celular de hibridoma monoclonal utilizando o RNeasy Miniprep kit de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen Venlo, Holanda). 0 cDNA da primeira cadeia de comprimento total foi criado utilizando o BD SMART™ RACE cDNA Amplification Kit de acordo com as instruções do fabricante (Clontech) utilizando os iniciadores nucleotídicos BD SMART II A (5' aagcagtggtatcaacgcagagtacgcggg 3') (SEQ ID N°. 85) e o iniciador 5'-RACE CDS (5' tttttttttttttttttttttttttvn 3', em que v = a, g, ou c e n = a, g, c, ou t) (SEQ ID N°. 86) para o objectivo de 5' RACE (Amplificação Rápida das Extremidades de cDNA/Rapid Amplification of cDNA Ends).

As regiões variáveis das cadeias de imunoglobulina Kapa e Pesada (IgGl) foram amplificadas por PCR (Reacção em Cadeia pela Polimerase/Polymerase Chain Reaction) utilizando o Sistema Expand High-Fidelity PCR System (Roche Applied Science) de acordo com as instruções do fabricante. As regiões variáveis de cadeia pesada foram amplificadas com a mistura de iniciadores de oligonucleótidos 5' Universal Primer Mix A (mistura de 5' ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt 3' (SEQ ID N°. 87) e 5' ctaatacgactcactatagggc 3' (SEQ ID N°. 88)) e um iniciador específico da Região Constante 3' IgGl, seja 5' tatgcaaggcttacaaccaca 3' (SEQ ID N°. 89) ou 5' gccagtggatagacagatgggggtgtcg 3' (SEQ ID N°. 90). As regiões variáveis da cadeia Kapa foram amplificados com a mistura de iniciadores de oligonucleótidos 5' Universal Primer Mix A e um iniciador específico para a Região Constante Kapa 3', quer 5' ctcattcctgttgaagctcttgacaat 3' (SEQ ID N°. 91) ou 5' cgactgaggcacctccagatgtt 3' (SEQ ID N°. 92). 44 ΕΡ2027156Β9

Os produtos de PCR individuais foram fraccionados através de electroforese em gel de agarose e purificados utilizando o Qiaquick Gel Purification kit de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen) . Os produtos de PCR foram subsequentemente clonados no plasmideo pCR2.1 TOPO utilizando o kit de clonagem à base de topoisomerase TOPO TA Cloning® Kit (com o vector pCR®2.1-TOPO®) de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA) e transformado em bactérias DH5 utilizando técnicas de transformação convencional. 0 DNA de plasmideo isolado a partir dos clones bacterianos transformados foi sequenciado utilizando os iniciadores T7 (5' TAATACGACTCACTATAGGG 3') (SEQ ID N°. 93), M13 Forward (5' GTAAAACGACGGCCAGT 3') (SEQ ID N°. 94), e M13 Reverse (5' CAGGAAACAGCTATGACC 3') (SEQ ID N° . 95) por Agencourt Bioscience utilizando métodos de sequenciaçâo de DNA por didesoxilo convencionais para identificar uma sequência das sequências da região variável. As sequências foram analisadas utilizando o Vector NTI software (Invitrogen, Carlsbad, CA) e o IMGT/V-Quest Webserver (http://imgt. cines.fr/textes/vquest) para identificar e confirmar as sequências de região variável. c. Determinação de Sequências de Nucleótidos que Codificam as Sequências da Região Constante da Cadeia Pesada e Leve da Imunoglobulina para as cadeias 1A3, 1D3, 1F3, e 2B8 Kapa e IgGl

Os cDNAs de comprimento total para as cadeias de IgGl 1A3, 1D3, e 1F3 foram amplificados por PCR a partir do cDNA criado acima utilizando o iniciador de sentido directo 5' ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatgaactttgggctcagattgatt ttcc 3' (codão inicial sublinhado) (SEQ ID N°. 96) e o 45 ΕΡ2027156Β9 iniciador reverso 5' ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcatttaccaggagagtggga-gagg 3' (codão de terminação sublinhado) (SEQ ID N°. 97). 0 cDNA de comprimento total para a cadeia de IgGl 2B8 foi amplificado a partir do cDNA criado acima utilizando o iniciador de sentido directo 5' ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatgggatggagctatat- catcctcttt 3' (codão inicial sublinhado) (SEQ ID N°. 98) e iniciador reverso 5' ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcatttaccagga-gagtgggagag 3' (codão de terminação sublinhado) (SEQ ID N°. 99). 0 cDNA de comprimento total para a cadeia kapa 2B8 foi amplificado utilizando o iniciador de sentido directo 5' ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatggaatcacagactctggtcttcat a 3' (codão inicial sublinhado) (SEQ ID N°. 100) e o iniciador reverso 5' ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctaacactcattcctgttgaag-ctc 3' (codão de terminação sublinhado) (SEQ ID N°. 101). Os fragmentos de PCR foram subclonados em pDONR221 (Invitrogen, Carlsbad, CA) através da reacção de recombinação de Gateway BP (Invitrogen, Carlsbad, CA) e sequenciado por Agencourt Bioscience utilizando métodos de sequenciação de DNA por didesoxilo convencionais para identificar a sequência da região constante e ainda confirmar as sequências da região variável. d. Análise de Sequência

As regiões Variáveis (texto normal) foram identificadas utilizando IMGT/V-QUEST Webserver software (http://imgt. cines.fr/ textes/vquest/). As sequências de Péptido Sinal 46 ΕΡ2027156Β9 foram previstas com base na identificação do codão de iniciação em grelha (ATG) que estava a montante da Região Variável identificada. As sequências de Péptido Sinal foram identificadas e estão sublinhadas abaixo. 0 último nucleótido de cada região variável é a primeira base do codão seguinte criado pela junção da região variável/constante. Este nucleótido está incluido na região variável porque é parte desse exão. As sequências de aminoácidos das regiões constantes listadas abaixo incluem a tradução deste codão de junção.

De modo a criar as sequências de anticorpo da cadeia pesada ou cadeia kapa completa, as sequências da região variável apresentada são combinadas com as suas respectivas sequências da região constante (as sequências sinal estão sublinhadas). (1) Região Variável da Cadeia Pesada 1A3 (SEQ ID N°.l) 1 atgaactttg ggctcaqatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcagcct ctgaattcac tttcagtaac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tgcagtgggt cgcatacatt agtcctggtg gtggtagctc ctactatcca 241 gccagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgcaag acaaggggat 361 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcag 47 ΕΡ2027156Β9 (2) Região Variável da Cadeia Leve Kapa (SEQ ID N°. 3) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgttt ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttat agtaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaagc tggaaataaa ac (3) Região Variável da Cadeia Pesada 2b8 (SEQ ID N°. 11) 1 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgt ccactcccag 61 gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt gaagctgtcc 121 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgaa tcagaggcct 181 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 301 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc ag (4) 2B8 Região Variável da Cadeia Leve Kapa (SEQ ID N°. 13) 1 atggaatcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg tgctgatggg 61 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 48 ΕΡ2027156Β9 121 ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca 181 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat 241 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct 301 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaggc tggaaataaa ac (5) Região Variável da Cadeia Pesada 2F8 (SEQ ID N°. 21) 1 atggaatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactgccag 61 gtccagctga agcagtctgg agctgagctg gtgaggcctg ggacttcagt gaagatgtcc 121 tgcaaggctt ctggctacac cttcactacc tactatatac actgggtgaa tcagaggcct 181 ggacagggcc ttgagtggat tggaaagatt ggtcctggaa gtggtagtac ttactacaat 241 gagatgttca aagacaaggc cacattgact gtagacacat cctccagcac agcctacatg 301 cagctcagca gcctgacatc tgacgactct gcggtctatt tctgtgcaag aaggggactg 361 ggacgtggct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc ag (6) Região Variável da Cadeia Leve Kapa 2F8 (SEQ ID N°. 23) 1 atqqaqacag acacaatcct qctatqqgtg ctgctgctct qqqttccaqq ctccactqqt 61 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 121 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggta atagttatat caactggtac 181 caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctatg ttgcatccaa tctagaatct 241 qqqatcccag ccaggtttag tqqcagtggg tctqqqacag acttcaccct caacatccat 301 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtattga ggatcctccc 49 ΕΡ2027156Β9 361 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaac (7) Região Variável da Cadeia Pesada 3B6 (SEQ id n°. 31) 1 atggaatggc cttgtatctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgaaggtgt ccactcccag 61 gttcagctgc agcagtctgg ggctgaactg gtgaggcctg ggtcctcagt gaagatttcc 121 tgcaaggctt ctggctatgt attcagtagc tactggatga actgggtgaa gcagaggcct 181 ggacagggtc ttgagtggat tggacagatt tatcctggag atggtgatag taactacaat 241 ggaaacttca agggtaaagc cacactgact gcagacaaat cctccagtac agcctacatg 301 cagctcagca gcctaacatc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcatc ccagctcggg 361 ctacgtgaga actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcag (8) Região Variável da Cadeia Leve Kapa 3B6 (2 possíveis códões de iniciação ATG (em maiusculas)) (SEQ ID N°. 33) 1 ATGgacATGa ggacccctgc tcagtttctt ggaatcttgt tgctctggtt tccaggtatc 61 aaatgtgaca tcaagatgac ccagtctcca tcttccatgt atgcatctct aggagagaga 121 gtcacaatca cttgcaaggc gagtcaggac attaaaagct atrtaagctg gttccagcag 181 aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgtaa acagattggt agatggggtc 241 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg caagattctt ctctcaccat caccagcctg 301 gagaatgaag atatgggaat ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc gttcacgttc 361 ggagggggga ccaagctgga aataaagc 50 ΕΡ2027156Β9 (9) Região Variável da Cadeia Pesada 3D11 (SEQ ID N°. 41) 1 atggctgtec cggtgctgtt cctctgcctg gttgcatttc caagctgtgt cctgtcccag 61 gtacagctga aggagtcagg acctggcctg gtggcgccct cacagagcct gtccatcact 121 tgcactgtct ctgggttttc attaaccagc tatagtttac actgggttcg ccagcctcca 181 ggaaagggtc tggaatggct gggagtaata tgggctggtg gaaacacaaa ttataattcg 241 tctctcatgt ccagactgac catcaggaaa gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa 301 atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc atgtactact gtgccagaga gaggtttgct 361 tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcag (10) Regiões Variáveis da Cadeia Leve Kapa 3D11 (SEQ ID N°. 43) 1 atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt caaaatatcc 61 agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatatcc aggggagaag 121 gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 181 tcaggcacct cccccaaaag atggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccct 241 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactccc tcacaatcag tagtatggag 301 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccact cacgttcggt 361 gctgggacca agctggagct gaaac (11) Região Variável da Cadeia Pesada 1D3 (SEQ ID N°. 51) 1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca 51 ΕΡ2027156Β9 181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc cgagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatatatt actgtgtgag acaaggggat 361 ggttattacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt catcgtctcc 421 tcag (12) Regiões Variáveis da Cadeia Leve Kapa 1D3 (SEQ ID N°. 53) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgtcagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gaacaagtga gaatatttac agtaatttag cgtggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct aatctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca ggatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggaggtatta ctgtcaacat ttttggggga ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaaac tggaaataaa ac (13) Região Variável da Cadeia Pesada 1F3 (SEQ ID N°. 61) 1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgag 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagtctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcggcct ctggattcac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatatatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctct agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggggat 52 ΕΡ2027156Β9 361 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcag (14) Região Variável da Cadeia Leve Kapa 1F3 (SEQ ID N°. 63) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgat gcaacacact taccagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggagttatta ptgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gtttggaggg 361 gggaccagac tggaaattaa ac (15) Região Variável da Cadeia Pesada 3A12 (SEQ ID N°. 71) 1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaaatctcc 121 tgtgcagcct ctggatttac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca . 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgaaca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggagat 361 ggttactatg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcag (16) Região Variável da Cadeia Leve Kapa 3A12 (SEQ ID N°. 73) 53 ΕΡ2027156Β9 1 atqaqtqtqc ccactcaqqt cctqqqqttq ctqctqctqt qqcttacaqa tqccaqatqt 61 gacatccaga tgactcagtc gccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac attaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtccatgct gcaacaaagt tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaaac tagaaataaa ac (17) Regiões Constantes da Cadeia Pesada IgGl de Murganho de Referência (J00453) (SEQ ID N°. 81) 1 ccaaaacgac acccccatct gtctatccac tggcccctgg atctgctgcc caaactaact 61 ccatggtgac cctgggatgc ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtg acagtgacct 121 ggaactctgg atccctgtcc agcggtgtgc acaccttccc agctgtcctg gagtctgacc 181 tctacactct gagcagctca gtgactgtcc cctccagccc tcggcccagc gagaccgtca 241 cctgcaacgt tgcccacccg gccagcagca ccaaggtgga caagaaaatt gtgcccaggg 301 attgtggttg taagccttgc atatgtacag tcccagaagt atcatctgtc ttcatcttcc 361 ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg tgtgttgtgg 421 tagacatcag caaggatgat cccgaggtcc agttcagctg gtttgtagat gatgtggagg 481 tgcacacagc tcagacgcaa ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc cgctcagtca 541 gtgaacttcc catcatgcac caggactggc tcaatggcaa ggagttcaaa tgcagggtca 601 acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggcagaccga 54 ΕΡ2027156Β9 661 aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag gataaagtca 721 gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag tggcagtgga 781 atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catgaacacg aatggctctt 841 acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga aatactttca 901 cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc ctctcccact 961 ctcctggtaa atga

(18) Regiões Constantes da Cadeia Pesada IgGl de Murganho Determinadas para 1A3, 1D3, 1F3, e 2B8 (derivadas da estirpe de murganhos AJ) (SEQ ID N°. 82) 1 ccaaaacgac acccccatct gtctatccac tggcccctgg atctgctgcc caaactaact 61 ccatggtgac cctgggatgc ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtg acagtgacct 121 ggaactctgg atccctgtcc agcggtgtgc acaccttccc agctgtcctg cagtctgacc 181 tctacactct gagcagctca gtgactgtcc cctccagcac ctggcccagc gagaccgtca 241 cctgcaacgt tgcccacccg gccagcagca ccaaggtgga caagaaaatt gtgcccaggg 301 attgtggttg taagccttgc atatgtacag tcccagaagt atcatctgtc ttcatcttcc 361 ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg tgtgttgtgg 421 tagacatcag caaggatgat cccgaggtcc agttcagctg gtttgtagat gatgtggagg 481 tgcacacagc tcagacgcaa ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc cgctcagtca 541 gtgaacttcc catcatgcac caggactggc tcaatggcaa ggagttcaaa tgcagggtca 601 acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggcagaccga 661 aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag gataaagtca 55 ΕΡ2027156Β9 721 gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag tggcagtgga 781 atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catggacaca gatggctctt 841 acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga aatactttca 901 cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc ctctcccact 961 ctcctggtaa atga (19) Região Constante da Cadeia Leve Kapa de Murganho de Referência (V00807) e Região Constante da Cadeia Leve Kapa de Murganho Determinada para 1D3, 1F3, e 2B8 (derivada da estirpe de murganho AJ) (SEQ ID N°. 83) 1 gggctgatgc tgcaccaact gtatccatct tcccaccatc cagtgagcag ttaacatctg 61 gaggtgcctc agtcgtgtgc ttcttgaaca acttctaccc caaagacatc aatgtcaagt 121 ggaagattga tggcagtgaa cgacaaaatg gcgtcctgaa cagttggact gatcaggaca 181 gcaaagacag cacctacagc atgagcagca ccctcacgtt gaccaaggac gagtatgaac 241 gacataacag ctatacctgt gaggccactc acaagacatc aacttcaccc attgtcaaga 301 gcttcaacag gaatgagtgt tag (20) Região Constante da Cadeia Leve Kapa de Murganho Determinada para 1A3 contendo um nucleótido alterado em comparação com 1D3, 1F3, e 2B8 (sublinhado) (SEQ ID N°. 84) 1 gggctgatgc tgcaccaact gtatccatct tcccaccatc cagtgagcag ttaacatctg 61 gaggtgcctc agtcgtgtgc ttcttgaaca acttctaccc caaagacatc aatgtcaagt 121 ggaagattga tggcagtgaa cgacaaaatg gcgtcctgaa cagttggact gatcaggaca 181 gcaaagacag cacctacagc atgagcagca ccctcatgtt gaccaaggac gagtatgaac 241 gacataacag ctatacctgt gaggccactc acaagacatc aacttcaccc attgtcaaga 56 ΕΡ2027156Β9 301 gcttcaacag gaatgagtgt tag

Cada uma das sequências de aminoácidos que definem as regiões variáveis da cadeia pesada da imunoglobulina para os anticorpos produzidos no Exemplo 1 são apresentadas na Figura 2. Cada uma das sequências são alinhadas uma com a outra e as sequências que definem o péptido sinal, CDRi, CDR2 e CDR3 são identificados por caixas. Figura 3 apresenta um alinhamento das sequências de CDRi, CDR2 e CDR3 separadas para cada um dos anticorpos.

Cada uma das sequências de aminoácidos que definem as regiões variáveis da cadeia leve da imunoglobulina para cada um dos anticorpos produzidos no Exemplo 1 são apresentadas na Figura 4. Cada uma das sequências são alinhadas uma com a outra e as sequências que definem o péptido sinal, CDRi, CDR2 e CDR3 estão identificadas por caixas. A Figura 5 apresenta um alinhamento das sequências separadas de CDRi, CDR2 e CDR3 para cada um dos anticorpos.

Por conveniência, a Tabela 1 proporciona um gráfico de concordância que apresenta a correspondência entre as sequências de anticorpo discutidas neste Exemplo com aquelas apresentadas na Listagem de Sequência. TABELA 1 SEQ.ID N2 Proteína ou Ácido Nucleico 1 Região Variável da Cadeia Pesada 1A3 - ácido nucleico 2 Região Variável da Cadeia Pesada 1A3 - proteína 3 Região Variável da Cadeia Leve (kapa) 1A3 - ácido nucleico 4 Região Variável da Cadeia Leve (kapa) 1A3 - proteína 5 Cadeia Pesada CDR1 1A3 57 ΕΡ2027156Β9 6 Cadeia Pesada CDR2 1A3 7 Cadeia Pesada CDR3 1A3 8 Cadeia Leve (kapa) CDR1 1A3 9 Cadeia Leve (kapa) CDR2 1A3 10 Cadeia Leve (kapa) CDR3 1A3 11 Região Variável da Cadeia Pesada 2B8 - ácido nucleico 12 Região Variável da Cadeia Pesada 2B8 - proteína 13 Região Variável da Cadeia Leve (kapa) 2B8 - ácido nucleico 14 Região Variável da Cadeia Leve (kapa) 2B8 - proteína 15 Cadeia Pesada CDR1 2B8 16 Cadeia Pesada CDR2 2B8 17 Cadeia Pesada CDR3 2B8 18 Cadeia Leve (kapa) CDRl 2B8 19 Cadeia Leve (kapa) CDR2 2B8 20 Cadeia Leve (kapa) CDR3 2B8 21 Região Variável da Cadeia Pesada 2F8 - ácido nucleico 22 Região Variável da Cadeia Pesada 2F8 - proteína 23 Região Variável da Cadeia Leve (kapa) 2F8 -ácido nucleico 24 Região Variável da Cadeia Leve (kapa) 2F8 - proteína 25 Cadeia Pesada CDRl 2F8 26 Cadeia Pesada CDR2 2F8 27 Cadeia Pesada CDR3 2F8 28 Cadeia Leve (kapa) CDRl 2F8 29 Cadeia Leve (kapa) CDR2 2F8 (continuação) SEQ.ID N2 Proteína ou Ácido Nucleico 30 Cadeia Leve (kapa) CDR3 2F8 31 Região Variável da Cadeia Pesada 3B6 - ácido nucleico 32 Região Variável da Cadeia Pesada 3B6 - proteína 33 Região Variável da Cadeia Leve (kapa) 3B6 -ácido nucleico 34 Região Variável da Cadeia Leve (kapa) 3B6 - proteína 35 Cadeia Pesada CDRl 3B6 36 Cadeia Pesada CDR2 3B6 58 ΕΡ2027156Β9 37 Cadeia Pesada CDR3 3B6 38 Cadeia Leve (kapa) CDR1 3B6 39 Cadeia Leve (kapa) CDR2 3B6 40 Cadeia Leve (kapa) CDR3 3B6 41 Região Variável da Cadeia Pesada 3D11 - ácido nucleico 42 Região Variável da Cadeia Pesada 3D11- proteína 43 Região Variável da Cadeia , . , Ί . T ,, , acido nucleico Leve (kapa) 3D11 - 44 Região Variável da Cadeia Leve (kapa) 3D 11- proteína 45 Cadeia Pesada CDR1 3D11 46 Cadeia Pesada CDR2 3D11 47 Cadeia Pesada CDR3 3D 11 48 Cadeia Leve (kapa) CDR1 3D11 49 Cadeia Leve (kapa) CDR2 3D11 50 Cadeia Leve (kapa) CDR3 3D11 51 Região Variável da Cadeia Pesada 1D3 - ácido nucleico 52 Região Variável da Cadeia Pesada 1D3 - proteína 53 Região Variável da Cadeia Leve (kapa) 1D3 -ácido nucleico 54 Região Variável da Cadeia Leve (kapa) 1D3 - proteína 55 Cadeia Pesada CDR1 1D3 56 Cadeia Pesada CDR2 1D3 57 Cadeia Pesada CDR3 1D3 58 Cadeia Leve (kapa) CDRl 1D3 (continuação) SEQ.ID NS Proteína ou Ácido Nucleico 59 Cadeia Leve (kapa) CDR2 1D3 60 Cadeia Leve (kapa) CDR3 1D3 61 Região Variável da Cadeia Pesada 1F3 -ácido nucleico 62 Região Variável da Cadeia Pesada 1F3 - proteína 63 Região Variável da Cadeia Leve (kapa) 1F3 -ácido nucleico 64 Região Variável da Cadeia Leve (kapa) 1F3 - proteína 65 Cadeia Pesada CDRl IF3 66 Cadeia Pesada CDR2 IF3 59 ΕΡ2027156Β9 67 Cadeia Pesada CDR3 IF3 68 Cadeia Leve (kapa) CDR1 1 F3 69 Cadeia Leve (kapa) CDR2 1F3 70 Cadeia Leve (kapa) CDR3 1F3 71 Região Variável da Cadeia Pesada 3A12 - ácido nucleico 72 Região Variável da Cadeia Pesada 3A12 - proteína 73 Região Variável da Cadeia , . . , . /i v n»n acido nucleico Leve (kapa) 3A12 - 74 Região Variável da Cadeia Leve (kapa) 3A12 - proteína 75 Cadeia Pesada CDRl 3A12 76 Cadeia Pesada CDR2 3A12 77 Cadeia Pesada CDR3 3A12 78 Cadeia Leve (kapa) CDRl 3A12 79 Cadeia Leve (kapa) CDR2 3A12 80 Cadeia Leve (kapa) CDR3 3A12

Também, por conveniência, as seguintes sequências representam as sequências verdadeiras ou contempladas de cadeia pesada e leve de comprimento total (í. e., contendo ambas as sequências da região variável e constante) para cada um dos anticorpos descritos neste Exemplo. Note-se que as regiões constantes dos anticorpos de murino 2F8, 3A12, 3B6, e 3D11 não foram sequenciados mas presume-se que possuam as mesmas sequências da região constante que os anticorpos 1D3, 1F3, e 2B8, que foram sequenciados, na medida em que derivaram todos da estirpe de murganhos AJ. Contudo, entende-se, que as sequências da região variável aqui descritas possam ser ligadas a cada uma de várias outras sequências da região constante conhecidas dos especialistas na técnica para produzir cadeias pesada e leve de imunoglobulina de comprimento total activas. 60 ΕΡ2027156Β9 (1) Sequência de Ácido Nucleico que Codifica a Sequência de Cadeia Pesada de Comprimento Total 1A3 (Região Variável da Cadeia Pesada 1A3 e Região Constante IgGl) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N°. 122) 1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctc gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcagcct ctgaattcac tttcagtaa tattacatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tgcagtgggt cgcatacatt agtcctggtg gtggtagctc ctactatcca 241 gccagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgcaag acaaggggat 361 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcagccaaaa cgacaccccc atctgcctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 481 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 541 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 601 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 661 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 721 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 781 ttccccccaa agcccaagga cgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 841 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 61 ΕΡ2027156Β9 1081 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1141 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1201 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1261 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1381 cactctcctg gtaaatga (2) Sequência de Proteínas que Definem uma Sequência de Cadeia Pesada de Comprimento Total 1A3 (1A3 Região Variável da Cadeia Pesada e Região

Constante de IgGl) sem a sequência sinal) (SEQ ID N°. 123) 1 evqlvesggg lvqpggslkl scaaseftfs nyymswvrqt pekrlqwvay ispgggssyy 61 pasvkgrfti srdnakntly lqmsslksed tamyycarqg dgyygdyamd ywgqgtsvtv 121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtwnsgslss gvhtfpavlq 181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssvf 241 ifppkpkdvl titltpkvtc vvvdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr 301 svselpimhq dwlngkefkc rvnsaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd 361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn 421 tftcsvlheg lhnhhteksl shspgk (3) Sequência de ácido nucleico que codifica a Sequência da Cadeia Leve de Comprimento Total 1A3) (Região variável Kapa e Região Constante de IA3) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N°. 124) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggtbg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgttt ctgtgggaga aactgtcacc 62 ΕΡ2027156Β9 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttat agtaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgcatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaagc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcatg 601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag (4) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Leve de 1A3 de

Comprimento Total (Região Variável kapa e Região Constante de 1A3) (sem a sequência sinal) (SEQ ID N°. 125) 1 diqmtqspas lsvsvgetvt itcraseniy snlawyqqkq gkspqllvya atnladgvps 61 rfsgsgsgtq fslkinslqs edfgtyycqh fwgtpytfgg gtkleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga swcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlm 181 ltkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec (5) Sequência de Ácido Nucleico que Codifica a Sequência da Cadeia Pesada de 2B8 de Comprimento Total (Região Variável da Cadeia Pesada e Região

Constante de IgGl 2B8) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N°. 126) 1 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgt ccactcccag 61 gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt gaagctgtcc 63 ΕΡ2027156Β9 121 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccac tactggatgc actgggtgaa tcagaggcct 181 ggacaaggcc ttgagtggac tggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 301 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc agccaaaacg 421 acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 481 accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 541 ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgccc tgcagtctga cctctacat 601 ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 661 gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 721 tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 781 cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 841 agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 901 gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcatt tccgctcagt cagtgaactt 961 cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1021 gctttccctg ccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1081 caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1141 tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1201 ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 64 ΕΡ2027156Β9 1261 tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1321 gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctcca ctctcctggt 1381 aaatga (6) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Pesada de Comprimento Total de 2B8 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgGl 2B8) (sem sequência sinal) (SEQ ID N°. 127) 1 qvqlqqpgae lvkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqr pgqglewige inptnghtny 61 nekfkskatl tvdkssstay mqlssltsed savyycarny vgsifdywgq gttltvssak 121 ttppsvypla pgsaaqtnsm vtlgclvkgy fpepvtvtwn sgslssgvht fpavlqsdly 181 tlsssvtvps stwpsetvtc nvahpasstk vdkkivprdc gckpcictvp evssvfifpp 241 kpkdvltitl tpkvtcvvvd iskddpevqf swfvddvevh taqtqpreeq fnstfrsvse 301 lpimhqdwln gkefkcrvns aafpapiekt isktkgrpka pqvytipppk eqmakdkvsl 361 tcmitdffpe ditvewqwng qpaenykntq pimdtdgsyf vysklnvqks nweagntftc 421 svlheglhnh htekslshsp gk (7) Sequência de Ácido Nucleico que Codifica a Sequência de Cadeia Leve de 2B8 de Comprimento Total (Região Variável Kapa e Região Constante de 2B8) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N°. 128) 1 atggaatcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg tgctgatggg 61 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 121 ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca 181 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat 241 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct 65 ΕΡ2027156Β9 301 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaggc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag (8) Sequência de Proteína que Define a Seguência da Cadeia Leve de 2B8 de Comprimento Total (Região Variável Kapa e Região Constante de 2B8) (sem sequência sinal) (SEQ ID N°. 129) 1 nivmtqspks msmsvgervt lsckasenvv syvswyqqkp aqspklliyg asnrntgvpd 61 rftgsgsatd ftltissvra edladyhcgq synypytfgg gtrleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga swcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlfc 181 ltkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec (9) Sequência de Ácido Nucleico Que Codifica a Sequência de Cadeia Pesada de 2F8 de Comprimento Total (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgGl de 2F8) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N°. 130) 1 atggaatgga gccgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ccgcaggtgt ccactgccag 61 gtccagctga agcagtctgg agctgagctg gtgaggcctg ggacttcagt gaagatgtcc 121 tgcaaggctt ctggctacac cttcatacc tactatatac actgggtgaa tcagaggcct 181 ggacagggcc ttgagtggat tggaaagatt ggtcctggaa gtggtagtac ttactacaat 241 gagatgttca aagacaaggc cacattgact gtagacacac cctccagcac agcctacatg 66 ΕΡ2027156Β9 301 cagctcagca gcctgacatc tgacgactct gcggtctatt tctgtgcaag aaggggactg 361 ggacgtggct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc agccaaaacg 421 acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 481 accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 541 ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 601 ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 661 gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 721 tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 781 cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 841 agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 901 gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 961 cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1021 gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1081 caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1141 tgcatgataa cagacttctt cctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1201 ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1261 tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1321 gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 67 ΕΡ2027156Β9 (10) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Pesada de 2F8 de Comprimento Total (Região Variável da Cadeia Pesada e Regiões Constantes de IgGl de 2f8) (sem sequência sinal) (SEQ ID N°.131) 1 qyqlkqsgae lvrpgtsvkm sckasgytft tyyihwvnqr pgqglewigk igpgsgstyy 61 nemfkdkatl tvdtssstay mqlssltsdd savyfcarrg lgrgfdywgq gttltvssak 121 ttppsvypla pgsaaqtnstn vtlgclvkgy fpepvtvtwn sgslssgvht fpavlqsdly 181 tlsssvtvps stwpsetvtc nvahpasstk vdkkivprdc gckpcictvp evssvfifpp 241 kpkdvltitl tpkvtcvvvd iskddpevqf swfvddvevh taqtqpreeq fnstfrsvse 301 lpimhqdwln gkefkcrvns aafpapiekt isktkgrpka pqvytipppk eqmakdkvsl 361 tcmitdffpe ditvewqwng qpaenykntq pimdtdgsyf vysklvqks nweagntftc 421 svlheglhnh htekslshsp gk (11) Sequência de Ácido Nucleico que Codifica a Sequência da Cadeia Leve de 2F8 de Comprimento Total (Região Variável Kapa de 2F8 e Região

Constante) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N°. 132) 1 atggagacag acacaatcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 61 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 121 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggta atagttatat caactggtac 181 caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctatg ttgcatccaa tctagaatct 241 gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 301 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtattga ggatcctccc 361 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 421 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 68 ΕΡ2027156Β9 481 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 541 aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 601 agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 661 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag (12) Seguência de Proteína gue Define a Sequência de Cadeia Leve de 2F8 de Comprimento Total (Região Variável Kapa de 2f8 e Região Constante) (sem seguência sinal) (SEQ ID N°. 133) 1 divltqspas lavslgqrat isckasqsvd ydgnsyinwy qqkpgqppkv liyvasnles 61 giparfsgsg sgtdftlnih pveeedaaty ycqqsiedpp tfgagtklel kradaaptvs 121 ifppsseqlt sggaswcfl nnfypkdinv kwkidgserq ngvlnswtdq dskdstysms 181 stltltkdey erhnsytcea thktstspiv ksfnrnec (13) Sequência de Ácido Nucleico que Codifica a Sequência da Cadeia Pesada de 3B6 de Comprimento Total (Região Variável da Cadeia Pesada de 3B6 e Região Constante de IgGl) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N°. 134) 1 atggaatqgc cttgtatctt tctcttcctc ctgfccagtaa ctgaaggtgt ccactcccag 61 gttcagcfcgc agcagtctgg ggctgaactg gtgaggcctg ggtcctcagt gaagatttcc 121 tgcaaggctt ctggctatgt attcagtagc tactggatga actgggtgaa gcagaggccc 181 ggacagggtc ttgagtggat tggacagatt tatcctggag atggtgatag taactacaat 241 ggaaacttca agggtaaagc cacactgact gcagacaaat cctccagtac agcctacatg 301 cagctcagca gcctaacatc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcatc ccagctcggg 361 otacgtgaga actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc 69 ΕΡ2027156Β9 421 aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg gcccctggat ctgctgccca aactaactcc 481 atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc tatttccctg agccagtgac agtgacctgg 541 aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac accttcccag ctgtcctgca gtctgacctc 601 tacactctga gcagctcagt gactgtcccc tccagcacct ggcccagcga gaccgtcacc 661 tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat 721 tgtggttgta agccttgcat atgtacagtc ccagaagtat catctgtctt catcttcccc 781 ccaaagccca aggatgtgct caccattact ctgactccta aggtcacgtg tgttgtggta 841 gacatcagca aggatgatcc cgaggtccag ttcagctggt ttgtagatga tgtggaggtg 901 cacacagctc agacgcaacc ccgggaggag cagttcaaca gcactttccg ctcagtcagt 961 gaacttccca tcatgcacca ggactggctc aatggcaagg agttcaaatg cagggtcaac 1021 agtgcagctt tccctgcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg cagaccgaag 1081 gctccacagg tgtacaccat tccacctccc aaggagcaga tggccaagga taaagtcagt 1141 ctgacctgca tgataacaga ctccttccct gaagacatta ctgtggagtg gcagtggaat 1201 gggcagccag cggagaacta caagaacact cagcccatca tggacacaga tggctcttac 1261 ttcgtctaca gcaagctcaa tgtgcagaag agcaactggg aggcaggaaa tactttcacc 1321 tgctctgtgt tacatgaggg cctgcacaac caccatactg agaagagcct ctcccactct 1381 cctggtaaat ga (14) Sequência de Proteína que Define a Sequência de Cadeia Pesada de 3B6 de Comprimento Total (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgGl de 3B6) (sem sequência sinal) (SEQ ID N°. 135) 1 qyqlqqsgae lvrpgssvki sckasgyvfs sywmnwvkqr pgqglewigq iypgdgdsny 70 ΕΡ2027156Β9 61 ngnfkgkatl tadkssstay mglssltsed savyfcasql glrenyfdyw gqgttltvss 121 akttppsvyp lapgsaaqtn smvtlgclvk gyfpepvtvt wnsgslssgv htfpavlqsd 181 lytlsssvtv psstwpsetv tcnvahpass tkvdkkivpr dcgckpcict vpevssvfif 241 ppkpkdvlti tltpkvtcvv vdiskddpev qfswfvddve vhtaqtqpre eqfnstfrsv 301 selpimhqdw lngkefkcrv nsaafpapie ktisktkgrp kapqvytipp pkeqmakdkv 361 sltcmitdff peditvewqw ngqpaenykn tqpimdtdgs yfvysklnvq ksnweagntf 421 tcsvlheglh nhhtekslsh spgk (15) Sequência de Ácido Nucleico que Codifica a Sequência da Cadeia Leve de 3B6 de Comprimento Total (Região variável Kapa de 3B6 e Região Constante) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N°. 136) 1 ATGgacATGa ggacccctgc tcagtttett ggaatcttgt tgcfcctggtt tccaggtatc 61 , aaatgtgaca tcaagatgac ccagtcfccca tcttccatgt atgcatctct aggagagaga 121 gtcacaatca cttgcaaggc gagtcaggac attaaaagct atttaagctg gttccagcag 181 aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgtaa acagattggt agatggggtc 241 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg caagattctt ctctcaccat caccagcctg 301 gagaatgaag atatgggaat ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc gbtcacgttc 361 ggagggggga ccaagctgga aataaagcgg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc 421 ccaccatcca gtgagcagtt aacatctgga ggtgcctcag tcgtgtgctt cttgaacaac 481 ttctacccca aagacatcaa tgtcaagtgg aagattgatg gcagtgaacg acaaaatggc 541 gtcctgaaca gttggactga tcaggacagc aaagacagca cctacagcat gagcagcacc 601 ctcacgttga ccaaggacga gtatgaacga cataacagct atacctgtga ggccactcac 71 ΕΡ2027156Β9 661 aagacatcaa cttcacccat tgtcaagagc ttcaacagga atgagtgtta g (16) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Leve de 3B6 de Comprimento Total (Região Variável Kapa e Região Constante de 3B6) (sem sequência sinal) (SEQ ID N°. 137) 1 dikmtqspss myaslgervt itckasqdik sylswfqqkp gkspktliyr vnrlvdgvps 61 rfsgsgsgqd ssltifcslen edmgiyyclq ydefpftfgg gtkleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga svvcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt 181 ltkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec

(17) Sequência de Ácido Nucleico que Codifica a Sequência de Cadeia Pesada de Comprimento Total de 3D11 Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgGl de 3D11) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N°. 138) 1 atggctgtcc cggtgctgtt cctctgcctg gttgcatttc caagctgtgt cctgtcccag 61 gtacagctga aggagtcagg acctggcctg gtggcgccct cacagagcct gtccatcact 121 tgcactgtct ctgggttttc attaaccagc tatagtttac actgggttcg ccagcctcca 181 ggaaagggtc tggaatggct gggagtaata tgggctggtg gaaacacaaa ttataattcg 241 tctctcatgt ccagactgac catcaggaaa gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa 301 atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc atgtactact gtgccagaga gaggtttgct 361 tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcagcca aaacgacacc cccatctgtc 421 tatccactgg cccctggatc tgctgcccaa actaactcca tggtgaccct gggatgcctg 481 gtcaagggct atttccctga gccagtgaca gtgacctgga actctggatc cctgtccagc 541 ggtgtgcaca ccttcccagc tgtcctgcag tctgacctct acactctgag cagctcagtg 72 ΕΡ2027156Β9 601 actgtcccct ccagcacctg gcccagcgag accgtcacct gcaacgttgc ccacccggcc 661 agcagoacca aggtggacaa gaaaattgtg cccagggatt gtggttgtaa gccttgcata 721 tgtacagtcc cagaagtatc atctgtcttc atcttcoccc caaagcccaa ggatgtgctc 781 accattactc tgactcctaa ggtcacgtgt gttgtggtag acatcagcaa ggatgatccc 841 gaggtccagt tcagctggtt tgtagatgat gtggaggtgc acacagctca gacgcaaccc 901 cgggaggagc agttcaacag cactttccgc tcagtcagtg aacttcccat catgcaccag 961 gactggctca atggcaagga gttcaaatgc agggtcaaca gtgcagcttt ccctgccccc 1021 atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggc agaccgaagg ctccacaggt gtacaccatt 1081 ccacctccca aggagcagat ggccaaggat aaagtcagtc tgacctgcat gataacagac 1141 ttcttccctg aagacattac tgtggagtgg cagtggaatg ggcagccagc ggagaactac 1201 aagaacactc agcccatcat ggacacagat ggctcttact tcgtctacag caagctcaat 1261 gtgcagaaga gcaactggga ggcaggaaat actttcacct gctctgtgtt acatgagggc 1321 ctgcacaacc accatactga gaagagcctc tcccactctc ctggtaaatg (18) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Pesada de

Comprimento Total de 3D11 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgGl de 3D11) (sem sequência sinal) (SEQ ID N°. 139) 1 qvqlkesgpg lvapsqslsi tctvsgfsit syslhwvrqp pgkglewlgv iwaggntnyn 61 sslmsrltir kdnsksqvfl kmnslqtddt amyycarerf aywgqgtlvt vsaakttpps 121 vyplapgsaa qtnsmvtlgc lvkgyfpepv tvtwnsgsls sgvhtfpavl qsdlytlsss 181 vtypsstwps etvtcnvahp asstkvdkki vprdcgckpc ictvpevssv fifppkpkdv 241 ltitltpkvt cvvvdiskdd pevqfswfvd dvevhtaqtq preeqfnstf rsvselpimh 73 ΕΡ2027156Β9 301 qdwlngkefk crvnsaafpa piektisktk grpkapqvyt ipppkeqmak dkvsltcmit 361 dffpeditve wqwngqpaen ykntqpimdt dgsyfvyskl nvqksnweag ntftcsvlhe 421 glhnhhteks lshspgk (19) Sequência de Ácido Nucleico que Codifica a Sequência de Cadeia Leve de Comprimento Total de 3D11 (Região Variável Kapa e Regiões Constantes de 3D11) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N°. 140) 1 atgqattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt caaaatatcc 61 agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatatcc aggggagaag 121 gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 181 tcaggcacct cccccaaaag atggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccct 241 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactccc tcacaatcag tagtatggag 301 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccact cacgttcggt 361 gctgggacca agctggagct gaaacgggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca 421 ccatccagtg agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc 481 taccccaaag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc 541 ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc 601 acgttgacca aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag 661 acatcaactt cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgttag (20) Sequência de Proteína que Define a Sequência de Cadeia Leve de Comprimento Total de 3D11 (Região Variável Kapa e Região Constante de 3D11) (sem sequência sinal) (SEQ ID N°. 141) 1 qivltqspai msaypgekvt mtcsasssvs ymhwyqqksg tspkrwiydt sklasgvpar 74 ΕΡ2027156Β9 61 fsgsgsgtsy sltissmeae daatyycqqw ssnpltfgag tklelkrada aptvsifpps 121 seqltsggas wcflnnfyp kdinvkwkid gserqngvln swtdqdskds tysmsstltl 181 tkdeyerhns ytceathkts tspivksfnr nee (21) Sequência de Ácido Nucleico aue Codifica a Sequência da Cadeia Pesada de Comprimento Total de 1D3 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgGl de 1D3) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N°. 142) 1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctfc gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcagoct ctggattcac tttcagtgac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc cgagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatatatt actgtgtgag acaaggggat 361 ggttattacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt catcgtctcc 421 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 481 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 541 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 601 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 661 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 721 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 781 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 75 ΕΡ2027156Β9 841 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1081 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1141 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1201 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1261 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1381 cactctcctg gtaaatga (22) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Pesada de Comprimento Total de 1D3 Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgGl de 1D3) (sem sequência sinal) (SEQ ID N°. 143) 1 evqlvesggg lvqpggslkl scaasgftfs dyymswvrqt pekrlewvay issgggstyy 61 pdsvkgrfti srdnakntly lqmsslksed Caiyycvrqg dgyygdyamd ywgqgtsviv 121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtwnsgslss gvhtfpavlq 181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssvf 241 ifppkpkdvl titltpkvtc vvvdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr 301 svselpimhq dwlngkefkc rvnsaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd 361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn 421 tftcsvlheg lhiihhteksl shspgk 76 ΕΡ2027156Β9 (23) Sequência de Ácido Nucleico Que Codifica a Sequência de Cadeia Leve de Comprimento Total de 1D3 (Região Variável Kapa e Região Constante de 1D3) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N°. 144) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggtcg ctgctgctgt ggcttacaga tgtcagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gaacaagtga gaatatttac agtaatttag cgtggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct aatctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca ggatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggaggtatta ctgtcaacat ttttggggga ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaaac tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 661 tcaactbcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag (24) Sequência de Proteína que Define a Sequência de Cadeia Leve de Comprimento Total de 1D3 Região Variável Kapa e Região Constante de 1D3) (sem sequência sinal) (SEQ ID N°, 145) 1 diqmtqspas lsvsvgetvt itcrtseniy snlawyqqkq gkspqlliya atnladgvps 61 rfsgsgsgtq fslrinslqs edfgryycqh fwgtpytfgg gtkleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga swcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt 181 ltkdeyerlin sytceathkt stspivksfn rnec 77 ΕΡ2027156Β9 (25) Sequência de Ácido Nucleico Que Codifica a Sequência da Cadeia Pesada de Comprimento Total de 1F3 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de 1F3 de EgGl) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N°. 146) 1 atgaactttg qqctcaqatt gattttcctt qtccttqttt taaaaggtgt qaagtgtqaq 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagtctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcggcct ctggattcac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatatatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctct agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggggat 361 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 481 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 541 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 601 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 661 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 721 agggattgtg gctgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 781 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 841 gtggcagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 78 ΕΡ2027156Β9 1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1081 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1141 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1201 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1261 tcttacttcg tccacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1381 cactctcctg gtaaatga (26) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Pesada de Comprimento Total de 1F3 (Região Variável da Cadeia Pesada e Regiões Constantes de 1F3 de IgGl) (sem seguência sinal) (SEQ ID N°. 147) 1 evqlvesggg lvqsggslkl scaasgftfs nyfmswvrqt pekrlewvay issgggstyy 61 pdsvkgrfti srdnakntly lqmsslksed tamyycvrqg dgyygdyamd ywgqgtsvtv 121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtvmsgslss gvhtfpavlq 181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssvf 241 ifppkpkdvl titltpkvtc vvvdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr 301 svselpimhq dwlngkefkc rvnsaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd 361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn 421 tftcsvlheg lhnhhteksl shspgk (27) Sequência de Ácido Nucleico que Codifica a Sequência de Cadeia Leve de Comprimento Total de 1F3 (Região Variável Kapa e Região Constante de 1F3) (Sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N°. 148) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 79 ΕΡ2027156Β9 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgat gcaacacact taccagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gtttggaggg 361 gggaccagac tggaaattaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 601 ttgacaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag (28) Sequência de Proteína que Define a Sequência de Cadeia Leve de Comprimento Total de 1F3 (Região Variável Kapa e Região Constante de 1F3) (sem sequência sinal) (SEQ ID N°. 149) 1 diqmtqspas lsvsvgetvt itcraseniy snlawyqqkq gkspqllvyd athlpdgvps 61 rfsgsgsgtq fslkinslqs edfgsyycqh fwgtpytfgg gtrleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga svvcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd styamsstlt 181 ltkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec 80 ΕΡ2027156Β9

(29) Sequência de Ácido Nucleico Que Codifica a Sequência da Cadeia Pesada de Comprimento Total de 3A12 Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgGl de 3A12) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N°. 150) 1 atgaactttg qqcbcaqatt gatfcttcctt qtccttqttt taaaaggtgt qaaqtqtqaa 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaaatctcc 121 tgtgcagcct ctggatttac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgaaca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggagat 361 ggttactatg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 481 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 541 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 601 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 661 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 721 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 781 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc actactctga ctcccaaggt cacgtgtgtt 841 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 81 ΕΡ2027156Β9 1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1081 ccgaaggctc cacaggtgta caecattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1141 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1201 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1261 tcttacttcg cctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1381 cactctcctg gtaaatga (30) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Pesada de Comprimento Total de 3A12 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgGl de 3A12) (sem sequência sinal) (SEQ ID N°. 151) 1 evqlvesggg lvqpggslki scaasgftfs nyfmswvrqt pekrlewvay issgggstyy 61 pdsvkgrfti srdnakntly lqmnslksed tamyycvrqg dgyygdyamd ywgqgtsvtv 121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtwnsgslss gvhtfpavlq 181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssvf 241 ifppkpkdvl titltpkvtc vvvdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr 301 svselpimhq dwlngkefkc rvnsaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd 361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn 421 tftcsvlheg lhnihteksl shspgk (31) Sequência de Ácido Nucleico que Codifica a Sequência de Cadeia Leve de Comprimento Total de 3A12 (Região Variável Kapa e Região Constante de 3A12) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N°. 152) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 82 ΕΡ2027156Β9 61 gacatccaga tgactcagtc gccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac attaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtccatgct gcaacaaagt tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaaac tagaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag (32) Sequência de Proteína gue Define a Sequência de Cadeia Leve de Comprimento Total de 3A12 (Região Variável Kapa e Região Constante de 3A12) (sem seguência sinal) (SEQ ID N°. 153) 1 diqmtqspas lsvsvgetvc itcraseniy inlawyqqkq gkspqllvha atkladgvps 61 rfsgsgsgtq yslkinslqs edfgsyycqh fwgtpytfgg gtkleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga swcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt 181 ltkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec

Para conveniência, a Tabela 2 proporciona um gráfico de concordância apresentando a correspondência entre as sequências de comprimento Total dos anticorpos discutidos 83 ΕΡ2027156Β9 neste Exemplo com aqueles apresentados na Listagem de Sequência.

TaABELA 2 SEQ ID N2 Proteína ou Ácido Nucleico 122 Variável Pesada 1A3 + constante de IgGl - ácido nucleico 123 Variável Pesada 1A3 + constante de IgGl -proteína 124 Variável Leve 1A3 + constante - ácido nucleico 125 Variável Leve 1A3 + constante - proteína 125 Variável Pesada 2B8 + constante de IgGl - ácido nucleico 127 Variável Pesada 2B8 + constante de IgGl -proteína 128 Variável Leve 2B8 + constante - ácido nucleico 129 Variável Leve 2B8 + constante - proteína 130 Variável Pesada 2F8 + constante de IgGl-ácido nucleico 131 Variável Pesada 2F8 + constante de IgGl-proteína 132 Variável Leve 2F8 + constante - ácido nucleico (continuação) SEQ.ID N2 Proteína ou Ácido Nucleico 133 Variável Leve 2F8+ constante - proteína 134 Variável Pesada 3B6 + constante de IgGl - ácido nucleico 135 Variável Pesada 3B6 + constante de IgGl -proteína 136 Variável Leve 3B6 + constante - ácido nucleico 137 Variável Leve 3B6 + constante- proteína 138 Variável Pesada 3D11 + constante de IgGl - ácido nucleico 139 Variável Pesada 3D11 + constante de IgGl - proteína 140 Variável Leve 3D11 + constante-ácido nucleico 141 3D11 Variável Leve + constante - proteína 142 Variável Pesada 1D3 + constante de IgGl - ácido nucleico 143 Variável Pesada 1D3+ constante de IgGl -proteína 144 Variável Leve 1D3 + constante - ácido nucleico 145 Variável Leve 1D3 + constante-proteína 84 ΕΡ2027156Β9 146 Variável Pesada 1F3+ constante de IgGl-ácido nucleico 147 Variável Pesada 1F3 + constante de IgGl -proteína 148 Variável Leve 1F3 + constante - ácido nucleico 149 Variável Leve 1F3 + constante - proteína 150 Variável Pesada 3A12 + constante de IgGl - ácido nucleico 151 Variável Pesada 3A12 + constante de IgGl-proteína 152 Variável Leve 3A12 + constante - ácido nucleico 153 Variável Leve 3A12 + constante - proteína

Exemplo 3 - Produção de Várias Proteínas de hHGF

Recombinantes

Este Exemplo descreve a clonagem e a expressão de várias proteínas recombinantes utilizadas para caracterizar os anticorpos criados no Exemplo 1 e no Exemplo 14. Em particular, este Exemplo descreve a clonagem e a expressão da proteína de hHGF recombinante, uma proteína de hHGF recombinante que contém uma substituição de glicina para glutamato na posição 555 (G555E), uma proteína de hHGF recombinante contendo um substituição de cisteína para arginina na posição 561 (C561R), uma proteína de HGF quimérica recombinante murganho-humano-murganho (mhm) contendo a sequência de HGF humana de V495-L585 disposta numa sequência de HGF de murganho, uma proteína de HGF quimérica recombinante de mhm contendo a sequência de HGF humano 1499-R566 disposta na sequência de HGF de murganho, e uma proteína de HGF quimérica de mhm recombinante contendo a sequência de HGF humana W507-L585 disposta na sequência de HGF de murganho. 85 ΕΡ2027156Β9 AS seguintes construções de expressão foram criadas utilizando técnicas moleculares convencionais e as sequências de cDNA resultante foram confirmadas através de sequenciação de DNA: a. hHGF-Fc

Numa primeira ronda de PCR, foram criados dois fragmentos de PCR sobreponiveis introduzindo um sitio Not I e que codifica uma marcação 6xHis entre hHGF e hlgFc. Os fragmentos de PCR sobreponiveis serviram como molde numa segunda ronda para amplificar hHGF-his-IgFc. 0 fragmento resultante foi digerido por Nhel e BamRI e clonado em pcDNAS5/FRT (Invitrogen, #35-3014). Depois, o hHGF foi amplificado a partir de Invitrogen clone ID: IOH29794 (cDNA de HGF humano). Verificou-se que a sequência corresponde à sequência depositada no NCBI com o número de acesso NM_000601.4 .

(1) Iniciador 5'hHGF NheI ACTGGCTAGCATGTGGGTGACCAAACTCCT (SEQ ID N° . 102) (2) Iniciador 3' hHGF NotI His Tag GTGATGGTGATGGTGATGGCGGCCGCATGACTGTGGTACCTTATATG (SEQ ID N° . 103) (3) Iniciador 5' HisIqFc ACTGGCGGCCGCCATCACCATCACCATCAC (SEQ ID N°. 104) 86 ΕΡ2027156Β9

(4) Iniciador 3' IgFc BamEI

ACTGGGATCCTCACTATTTACCCGGGGACAG (SEQ ID N°. 105) b. hHGF-Fc G555E e hHGF-Fc C561R

Foram criados mutantes de hHGF-Fc, G555E e C561R através da mutagénese dirigida a um sitio utilizando o QuikChange II XL site-directed mutagenesis kit (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. (1) Iniciador de Sentido hHGF-Fc (G555E) CATGATGTCCACGAAAGAGGAGATGAG (SEQ ID N°. 106) (2) Iniciador Anti-Sentido hHGF-Fc (G555E) CTCATCTCCTCTTTCGTGGACATCATG (SEQ ID N°. 107) (3) Iniciador de Sentido hHGF-Fc (C561R) GGAAGAGGAGATGAGAAACGCAAACAGGTTCTCAATG (SEQ ID N°. 108) (4) Iniciador Anti-Sentido hHGF-Fe (C561R) CATTGAGAACCTGTTTGCGTTTCTCATCTCCTCTTCC (SEQ ID N°. 109) c. Fc de quimera murganho-humano-murganho A quimera de IgFc de murganho-humano-murganho contém mHGF cadeia alfa-hHGF, aminoácidos de cadeia β Vai 495-Leu 585 de HGF humano, e mHGF cadeia beta C-terminal seguida pelo marcador 6xHis e IgG-Fc. 87 ΕΡ2027156Β9 0 cDNA de HGF humano que codifica os aminoácidos V4 95-L585 foi amplificado a partir de clone da Invitrogen ID: IOH29794 (cDNA de HGF humano). A sequência corresponde à sequência depositada no NCBI sob o número de acesso NM_000601.4. As sequências de HGF de murganho foram amplificadas por RT-PCR a partir de RNA total de figado de murganho (Clontech, # 636603) utilizando o Super Script One Step RT-PCR kit da Invitrogen (#10928-034) de acordo com as instruções do fabricante. A sequência de cDNA de mHGF corresponde à sequência depositada no NCBI sob o número de acesso D10213.1.

Três fragmentos, referidos como os Fragmentos 1, 2, e 3, foram criados utilizando iniciadores de PCR sobreponiveis e emparelhados em rondas consecutivas de amplificação por PCR. O produto final foi clivado com NheI e NotI e clonado em pcDNA5/FRT IgGFc.

(1) Iniciadores do Fragmento 1 para a cadeia alfa de mHGF 5'NheI 5' ATCGGCTAGCATGATGTGGGGGACCAAAC (SEQ ID N°. 110) 3' GAATCCCATTTACAACCCGCAGTTGTTTTGTTTTGG (SEQ ID N°. 111)

(2) Iniciadores do Fragmento 2 para os aa V495-L585 da cadeia beta de hHGF 5' CCAAAACAAAACAACTGCGGGTTGTAAATGGGATTC (SEQ ID N°. 112) 3' CAGGATTGCAGGTCGAGCAAGCTTCATTAAAACCAGATCT (SEQ ID N° . 88 113) ΕΡ2027156Β9

Iniciador do fragmento 3 para o terminal C da cadeia beta de mHGF 3' NotI 5' AGATCTGGTTTTAATGAAGCTTGCTCGACCTGCAATCCTG (SEQ ID N°. 114) 3' GTAATTTTGACATACAAGTTGTGCGGCCGCCATCACCATCACCATCAC (SEQ ID N° . 115) d. Construção de hHGF e quimera mhm

Os vectores que codificam hHGF e quimera mhm (V495-L585), pcDNA5/FRT hHGF e quimera pcDNA5/FRT-mhm (V495-L585), sem Fc-tag foram criados através de mutagénese dirigida. Foi introduzido um codão de terminação a 3' do marcador 6xHis utilizando o QuikChange II XL site-directed mutagenesis kit (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. O iniciador de mutagénese incluiu o Iniciador 1: CATCACCATCACCATCACTAAGCGGGTCT-GGTGCCACG (SEQ ID N° . 116), e

Iniciador 2: CGTGGCACCAGACCCGCTTA-GTGATGGTGATGGTGATG (SEQ ID N° . 117) .

Adicionalmente, foram criadas duas quimeras mhm adicionais a partir da construção pcDNA5/FRT-mhm (V495-L585) através de mutagénese dirigida utilizando o QuikChange II XL site-directed mutagenesis kit (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. Uma construção mhm continha a região de I499-R556 de hHGF disposta entre sequências de murino. A outra construção de mhm continha a região de W507-L585 de hHGF disposta entre sequências de murino.

Para a quimera mhm (I499-R556), foram realizadas as seguintes mutações pontuais em ordem na construção de molde 89 ΕΡ2027156Β9 pcDNA5/FRT-quimera mhm (V495-L585): D558E, C561R, V564I, V567I e M583L, utilizando as sequências de oligonucleótidos apropriadas. Para a quimera de mhm (W507-L585), foram introduzidas as seguintes mutações pontuais num único passo na construção molde pcDNA5/FRT-quimera mhm (V495-L585) : Q502R, N504T e 1505V, utilizando as sequências de oligonucleótidos apropriados. A sequência de nucleótidos resultante da proteína hHGF-Fc é apresentada como SEQ ID N°. 118, incluindo a sequência sinal (nucleótidos 1-93) e pró-domínio (nucleótidos 94-162) . A sequência de aminoácidos da proteína hHGF-Fc é apresentada como SEQ ID N°. 119. A sequência de nucleótidos resultante que codifica a proteína mhm (V495-L585)-Fc quimérica é apresentada na SEQ ID N°. 120, incluindo a sequência sinal (nucleótidos 1-96) e pró-domínio (nucleótidos 97-165) . A sequência de aminoácidos da proteína mhm (V495-L585)-Fc quimérica é apresentada na SEQ ID N°. 121.

A sequência de nucleótidos resultante codificante, e a sequência de proteína que define, a construção mhm (V495-L585) são apresentados nas SEQ ID N°S. 211 e 212, respectivamente. A sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID N°. 211 inclui a sequência sinal (nucleótidos 1-96) e o pró-domínio (nucleótidos 97-165), e a sequência de proteína apresentada na SEQ ID N°. 212 inclui a sequência da proteína activa (sem a sequência sinal ou o pró-domínio). A sequência de nucleótidos resultante codificante, e a sequência de proteína que define, a construção mhm (I499-R556) são apresentados nas SEQ ID N°S. 213 e 214, respectivamente. A 90 ΕΡ2027156Β9 sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID N°. 213 inclui a sequência sinal (nucleótidos 1-96) e o pró-domínio (nucleótidos 97-165), e a sequência de proteínas apresentada na SEQ ID N°. 214 inclui a sequência da proteína activa (sem a sequência sinal ou o pró-domínio). A sequência de nucleótidos resultante codificante, e a sequência de proteína que define, o mhm (W507-L585) são apresentados nas SEQ ID N°S. 215 e 216, respectivamente. A sequência de ácido nucleico apresentada em SEQ ID N°. 215 inclui a sequência sinal (nucleótidos 1-96) e o pró-domínio (nucleótidos 97-165), e a sequência de proteína apresentada na SEQ ID N°. 216 inclui a sequência de proteína activa (sem a sequência sinal ou o pró-domínio). e. Expressão de Proteína (1) Cultura de Células Células CHO Flpln (Invitrogen, N° de Catálogo. R758-07)) foram cultivadas em meio F12K (ATCC, N° de Catálogo 30-2004), 10% FCS (Invitrogen, N° de Catálogo 10438026), 1% de

Penicilina (10 000 unidades/mL)/Estreptomicina (10,000 pg/mL) (Invitrogen, N° de Catálogo 15140-122) a 37 °C, 5% CO2, 100 pg/mL de Zeocina (Invitrogen, N° de Catálogo R250-01). (2) Criação de Linhas Celulares CHO Flpln Estáveis

Foram transfectadas células hospedeiras CHO Flpln com uma proporção de 9:1 de pOG44:pcDNA5/DNA do plasmídeo de expressão de FRT utilizando lipofectamina 2000 de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, N° de Catálogo 11668-027) . Como controlos, as células foram transfectadas 91 ΕΡ2027156Β9 com pcDNA5/FRT vector/pOG44 vazio e plasmídeo pOG44 (Invitrogen, N° de Catálogo 35-3018) isoladamente. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram separadas, e após quarenta e oito horas foi adicionado às células 0,5 mg/mL de Higromicina B (Sigma, N° de Catálogo H0654-SPEC). A selecção policlonal de células estáveis foi realizada em F12K, 10% FCS, 1% Penicilina/Estreptomicina, 0,5 mg/mL de

Higromicina B. (3) Expressão de Proteína em linhas celulares CHO Flpln estáveis

Foram semeadas aproximadamente 2xl06 células em placas de 15 cm e cultivadas em F12K (ATCC, N° de Catálogo 30-2004)/DMEM com nível elevado de glucose (Invitrogen, N° de Catálogo 11995065) 1:1,5% ultra low IgG FCS (Invitrogen, #16250-78) a 37°C, 5% CO2 durante 5-6 dias. Os sobrenadantes foram recolhidos e as proteínas resultantes analisadas por ELISA e por ressonância de plasmão de superfície.

Exemplo 4 - Características de ligação de Anticorpos monoclonais anti-hHGF

Os anticorpos monoclonais produzidos no Exemplo 1 foram caracterizados quanto à sua capacidade para se ligarem a hHGF, e algumas das proteínas recombinantes de HGF produzidas no Exemplo 3.

Os anticorpos foram analisados por ressonância de plasmão de superfície utilizando um instrumento BIAcore T100 para avaliar a sua capacidade para se ligar a HGF e a certas proteínas de fusão discutido no Exemplo 3. Cada anticorpo foi 92 ΕΡ2027156Β9 imobilizado num chip sensor de dextrano carboximetilado CM5 (BIAcore, N° de Catálogo BR-1006-68) através de acoplagem à amina (BIAcore, N° de Catálogo BR-1000-50) utilizando um protocolo de acoplamento convencional de acordo com as instruções do fabricante.

As análises foram efectuadas a 25 °C utilizando PBS (GIBCO, N° de Catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensioactivo P20 (BIAcore, N° de Catálogo R-1000-54), 2 mg/mL de BSA (EMD, N° de Catálogo 2930) e 10 mg/mL de sal de sódio CM-Dextrano (Fluka, N° de Catálogo 86524) como tampão de migração. O sobrenadante contendo diferentes proteínas de fusão de HGF ou sobrenadante das células transfectadas com vector vazio foram injectadas com cada anticorpo a uma taxa de fluxo de 30 yL/min durante 3 minutos. A ligação resultante foi determinada como unidades de ressonância (RU) contra uma linha de base de 30 segundos após o final da injecção. A ligação foi comparada com a HGF humana (R&D Systems, N° de Catálogo 294-HGN-025) diluída tampão de migração. A ligação não específica foi monitorizada por comparação da ligação à superfície de controlo quando a IgG de murganho (Rockland, N° de Catálogo 010-0102) foi imobilizada utilizando o mesmo procedimento de acoplamento de amina.

Os resultados são resumidos na Tabela 3. TABELA 3

Anticorpo rhGHF (R&D Systems) rmHGF (R&D Systems) quimera mhm (V495-L585) HGF humana G555E C561R 1A3 Sim Não Não Sim Sim Sim 1D3 Sim Não Sim Sim Sim Sim 1F3 Sim Sim Sim Sim Sim Sim 2B8 Sim Não Sim Sim Sim Sim 93 ΕΡ2027156Β9 2F8 Sim Sim Não Sim Sim Sim 3A12 Sim Não Não Sim Sim Sim 3B6 Sim Não Não Sim Sim Sim 3D11 Sim Não Não Sim Sim Sim

Os resultados na Tabela 3 demonstram que cada um dos anticorpos ligam rHGF e HGF humana purificada. Além disso, todos os anticorpos ligam hHGF contendo mutações pontuais G555E e C561R. Em geral, todos os anticorpos, excepto 1F3 e 2F8, não se ligaram a HGF de murino demonstrando que os anticorpos 1A3, 1D3, 2B8, 3A12, 3B6, e 3D11 ligavam especificamente a HGF humana. Os anticorpos 1D3, 1F3, e 2B8 ligaram a quimera murganho-humano-murganho enquanto os restantes anticorpos não. Os resultados sugerem que os anticorpos 1D3 e 2B8, pelo menos, em parte, se ligam aos resíduos 495-585 da HGF humana. Os anticorpos 1A3, 3A12, 3B6, e 3D11 parecem ligar outras porções de hHGF humana para além dos resíduos 495-585. Presentemente, é incerto porque 2F8 não se liga à quimera uma vez que parece ligar-se a ambas as hHGF e mHGF.

Exemplo 5 - Capacidade dos Anticorpos Monoclonais Anti-hHGF Ligarem HGF Reduzido e Não Reduzido

Neste Exemplo, anticorpos os monoclonais anti-hHGF produzidos no Exemplo 1 foram analisados quanto à sua capacidade de ligar HGF reduzido e não reduzido. A reactividade dos soros anti-HGF com o recombinante hHGF foi avaliada por imunotransferência. Oito yg de proteína recombinante hHGF em tampão de migração NuPAGE MOPS SDS (Invitrogen) com ou sem tampão de redução de amostra NuPAGE (Invitrogen) foi fraccionada num gel de 4-12% de Bis-Tris com 94 ΕΡ2027156Β9 poços 1,0 mmX2D (Invitrogen, Carlsbad, CA). As proteínas fraccionadas foram então transferidas para uma membrana de nitrocelulose utilizando procedimentos convencionais. As membranas de nitrocelulose foram bloqueadas com 5% de solução de leite em pó magro em Salino tamponado com Tris com 0,1% de Tween-20® (TBST), e depois montado num dispositivo Mini Protean II Multi-Screen (BioRad) para poterior bloqueamento.

As membranas resultantes foram pesquisadas com os anticorpos purificados num dispositivo Multi-Screen. Os anticorpos purificados foram diluídos para 5 yg/mL em tampão de bloqueamento. A membrana de nitrocelulose foi então removida do dispositivo, e incubada com anticorpos anti-IgG de murganho marcados com peroxidase de rábano. Os resultados são resumidos na Tabela 4, onde os números reflectem a extensão da ligação com - representando o mínimo (pouca ou nenhuma ligação) e 3+ representando a ligação máxima. TABELA 4

Anticorpo Reduzido (exposição: 3-5 min) Não Reduzido (exposição: 20 s) 1A3 2 + 2 + 1D3 2 + 2 + 1F3 2 + 2 + 2B8 - 1 + 2F8 2 + 2 + 3A12 - 2 + 3B6 3+ 2 + 3D11 - 3+

Os dados na Tabela 4 demonstram que todos os anticorpos se ligam a rhHGF não reduzida. Em contraste, os anticorpos monoclonais 1A3, 1D3, 1F3, 2F8, 3B6 ligam-se a rhHGF reduzida 95 ΕΡ2027156Β9 mas os anticorpos 2B8, 3A12, e 3D11 não se ligam a rhHGF reduzida.

Exemplo 6 - Afinidades de Ligação

As afinidades de ligação e cinéticas de interacção de cada um dos anticorpos produzidos no Exemplo 1 contra hHGF foram medidas por ressonância de plasmão de superfície.

As imunoglobulinas anti-murganho de coelho (BIAcore, N° de Catálogo BR-1005-14) foram imobilizadas em chips sensores CMS de dextrano carboximetilado (BIAcore, N° de Catálogo BR-1006-68) por acoplamento de amina (BIAcore, N° de Catálogo BR- 1000-50) utilizando um protocolo de acoplamento convencional de acordo com as instruções do fabricante. As análises foram efectuadas a 25 °C utilizando PBS (GIBCO, N° de Catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensioactivo P20 (BIAcore, N° de Catálogo BR-1000-54) , 2 mg/mL de BSA (EMD, N° de Catálogo 2930), e 10 mg/mL de sal de CM-Dextrano de Sódio (Fluka, N° de Catálogo 86524) como tampão de migração.

Os anticorpos foram capturados numa célula de fluxo individual a uma taxa de fluxo de 10 pL/min. O tempo de injecção foi variável para cada anticorpo para produzir aproximadamente 20 RU de anticorpo capturado para cada ciclo. Tampão ou HGF (R&D Systems, N° de Catálogo 294-HGN-025) diluídos em tampão de migração foram injectados sequencialmente numa superfície de referência (sem anticorpo capturado) e a superfície activa (anticorpo a ser testado) durante 2 minutos a 60 pL/min. A fase de dissociação foi monitorizada durante 15 ou 90 minutos, dependendo da concentração. A superfície foi então regenerada com 10 mM de 96 ΕΡ2027156Β9

Glicina-HCl, pH 1,7 (BIAcore, N° de Catálogo Bur-1003-54) injectado durante 3 minutos a uma taxa de fluxo de 60 yL/min antes de ter sido iniciado outro ciclo. As concentrações de HGF testadas foram de 0,46 nM a 7,5 nM.

Os parâmetros cinéticos foram determinados utilizando a função cinética do programa de computador BIAevalutation com subtracção da referência. Os parâmetros cinéticos para cada anticorpo, ka (constante da taxa de associação), ka (constante da taxa de dissociação) e KD (constantes de equilíbrio de dissociação) são resumidos na Tabela 5. TABELA 5

Anticorpo ka (1/Ms) SE (ka) kd (1/s) SE (kd) KD (pM) SD 1A3 1,7xl06 7.3xl04 5.2xl0-5 8.4xl0-7 30.1 5.6 1D3 1,7xl06 3.lxlO4 8.2xl0-5 1.7xl0-6 54.2 27.4 1F3 1.5xl06 5.OxlO4 2.βχΙΟ-5 β.βχΙΟ-7 18.1 8.2 2B8 Ι.βχΙΟ6 2.9xl04 2.1xl0_5 1.4xl0"7 13.5 4.4 3A12 Ι.βχΙΟ6 3.7xl04 Ι.βχΙΟ-4 Ι.βχΙΟ-6 103.0 10.4 3B6 2.OxlO6 6.5xl04 3.9xl0-5 3.2x10" ' 17.0 3.4

Os dados na Tabela 5 demonstram que os anticorpos ligam hHGF com um KD de cerca de 100 pM ou menos, cerca de 50 pM ou menos, ou 20 pM ou menos.

Exemplo 7 - Actividade de Neutralização de Anticorpos Anti-hHGF

Neste Exemplo, os anticorpos produzidos no Exemplo 1 foram caracterizados quanto à sua capacidade para (a) inibir a ligação de hHGF a c-Met, e (b) inibir a incorporação de BedU estimulada por HGF em células 4MBr-5. 97 ΕΡ2027156Β9 a. Ensaio de Inibição da ligação HGF-Met (Ensaio de Neutralização)

Os anticorpos foram testados por ELISA quanto à sua capacidade para inibir a ligação de hHGF a c-Met.

Especificamente, as placas do ensaio DELFIA Wallac de 96 poços (Wallac Inc., N° de Catálogo AAAND-0001) foram revestidas com 100 pL de 6,25 pg/mL de HGF (R&D Systems, N° de Catálogo 294-HGN-025) em tampão de revestimento de carbonato (15 mM de Na2C03 e 34 mM de NaHC03 pH 9,0) durante 16 horas a 4 °C. As placas foram então bloqueadas com 200 pL de 5% de leite magro em pó em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente. Os anticorpos foram preparados numa placa separada por adição de concentrações crescentes dos anticorpos sob investigação (0,033-667 nM, 3-vezes de diluição seriada) a 2 nM de c-Met (R&D Systems, N° de Catálogo 358- MT/CF) em 5% de leite magro em pó em PBS. 100 pL de amostra por poço foram transferidos para a placa do ensaio e incubados durante a noite a 4°C. As placas do ensaio foram então lavadas 3 vezes com PBS-0,1% de Tween 20, e incubadas durante 2 horas à temperatura ambiente com 100 pL/poço de 2 pg/mL de anticorpo biotinilado anti-c-Met humana (R&D Systems, N° de Catálogo BAF358) preparado em 5% de leite magro em pó em PBS.

As placas resultantes foram então lavadas três vezes com PBS-0,1% de Tween 20, e incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com Estreptavidina marcada com Eu (Wallac, N° de Catálogo 1244-360) diluída 1:1000 em tampão de ensaio DELFIA (Wallac, N° de Catálogo 4002-0010) . As placas resultantes foram lavadas 3 vezes com solução de lavagem 98 ΕΡ2027156Β9 DELFIA (Wallac, N° de Catálogo 4010-0010) e incubadas com 100 pL/poço de solução de melhoramento DELFIA (Wallac #4001-0010) durante 15 minutos à temperatura ambiente com agitação.

As placas foram lidas num instrumento Victor 3V (Perkin Elmer) utilizando o método Europium. Os valores de IC50 foram calculados e são resumidos na Tabela 6. TABELA 6

Anticorpo IC50 (nM) DP 1A3 5, 65 0,91 1D3 4,43 2,27 1F3 6,57 0,28 2B8 5, 57 1,19 2F8 5,36 0,88 3A12 5,26 2,11 3B6 - - 3D11 5, 66 2,75

Os resultados demonstram que todos os anticorpos (i. e., 1D3, 1A3, 2B8, 3A12, 1F3, 3D11, e 2F8) para além de 3B6 neutralizam eficientemente a ligação de HGF a c-Met. b. Neutralização de Incorporação de BrdU Estimulada por HGF em células 4MBr-5

Dez pL de 12,5 nM de hHGF foram dispensados em poços individuais de uma placa de microtitulação de cultura de tecidos de 96 poços (Costar N° de Catálogo 3903) . Dez pL de anticorpos diluídos serialmente em concentrações de 6667, 2222, 740, 247, 82, 27, 9.1, 3.0, 1,0, 0,33 nM foram adicionados a cada poço. A mistura de anticorpo para HGF foi então incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos. As 99 ΕΡ2027156Β9 células epiteliais de brônquios de macaco 4MBr-5 (ATCC, CCL208) cultivada em F-12K (ATCC, 30-2004), 15% de FBS (Gibco 10438-026), 30 ng/mL de EGF (Sigma E9644), 1% de penicilina/estreptomicina (PS, Gibco N° de Catálogo 15140-122) foram dissociadas com Tripsina (Gibco N° de Catálogo 25200-056), ressuspendidas em meio de ensaio (F-12K, 2,5% de FBS, 1% de PS) a 75 000 células/mL, e 80 pL da suspensão de células foram dispensadas na mistura de anticorpo para HGF.

As células resultantes foram incubadas a 37°C, 5% de C02. Quarenta e oito horas mais tarde, foram adicionados 10 pL de 100 pM de BrdU (Roche N° de Catálogo 1669915) . Setenta e duas horas mais tarde, o meio foi removido, as placas foram secas com um secador de cabelo e foram processados com a BrdU ELISA de acordo com as instruções do fabricante (Roche N° de Catálogo 1669915). O sinal luminescente foi quantificado por um leitor de placa Synergy HT (Bio-Tek). Os dados enquadravam-se numa resposta a dose sigmoidal com declive variável com a equação y = fundo + (topo-fundo)/(1+10Λ(log(EC50-x)*declive da elevação)) no Graph- Pad Prism (GraphPad Software). Cada experiência foi repetida, pelo menos, 3 vezes em duplicados, e os valores médios de EC50 são apresentados na Tabela 7. TABELA 7

Anticorpo IC50 (nM) 1A3 4, 69 1D3 4, 99 1F3 1, 94 2B8 1,41 2F8 19,24 3A12 30,30 100 ΕΡ2027156Β9 3B6 36,08 3D11 51,12

Os resultados na Tabela 7 demonstram que todos os anticorpos, 1A3, 1D3, 1F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6, e 3D11 inibem a proliferação induzida por HGF em células 4MBr-5.

Exemplo 8 - Actividade Anti-Espalhamento de Anticorpos Anti-hHGF

Este Exemplo descreve uma caracterização dos anticorpos produzidos no Exemplo 1 da sua capacidade para inibir a actividade de disseminação induzida por HGF. 0 HGF induz "disseminação" (motilidade) de conjuntos em células MDCK (ATCC, Manassas, VA, N° de Catálogo CCL-34).

As células MDCK foram semeadas em placas de cultura de tecidos de 96 poços da Costar (Corning Incorporated, Corning, NY, N° de Catálogo 3595) numa densidade de 4xl03 células por poço em 80 pL de MEM (ATCC, Manassas, VA, N° de Catálogo 30-2003) contendo 10% de Soro fetal de bovino (Invitrogen N° de Catálogo 10438026), e 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen N° de Catálogo 15140122). Cada um dos anticorpos a ser investigados foi diluído para 6,667 nM em MEM contendo 10% de Soro fetal de bovino e 1% de penicilina-estreptomicina. Cada uma das diferentes diluições de anticorpo, assim como MEM contendo 10% de Soro fetal de bovino e 1% de penicilina-estreptomicina sem anticorpo, depois foi separadamente combinada com um igual volume de MEM contendo 10% de Soro fetal de bovino e 1% de penicilina-estreptomicina, e 100 ng/mL de HGF (R&D Systems N° de Catálogo 294-HGN-025). As diluições de anticorpo/HGF foram 101 ΕΡ2027156Β9 incubadas durante 30 minutos a 25°C. Foram adicionados vinte pL de cada diluição de anticorpo/HGF separadamente a poços individuais, produzindo uma concentração final de anticorpo de 666,7 nM, e uma concentração final de HGF de 10 ng/mL. As células MDCK foram então incubadas durante 24 horas a 37°C com 5% de C02.

Após 24 horas de incubação, as células MDCK foram cuidadosamente lavadas uma vez com 100 pL por poço de PBS arrefecido em gelo (Invitrogen N° de Catálogo 14190144), e fixadas com 100 pL por poço metanol arrefecido em gelo em agitação durante 10 minutos a 25°C. As placas foram então lavadas cuidadosamente uma vez com água destilada. Um volume de 100 pL de solução de violeta de cristal, consistindo em 0,5% de violeta de cristal (Sigma, St. Louis, MO, N° de Catálogo C3886) e 50% de etanol em água destilada, foi adicionado a cada poço, e as células foram incubadas durante 20 minutos a 25°C em agitação.

Após coloração com solução de violeta de cristal, as células foram lavadas cuidadosamente três vezes com água destilada. Depois, foi adicionado PBS a cada poço para prevenir a secagem de amostras. As células foram visualizadas utilizando o microscópio Leica DMIRB (Leica Microsystems GmbH, Wetzler, Alemanha), câmara DC500 (Leica Microsystems GmbH, Wetzler, Alemanha), e o programa de computador MagnaFire 2.1C (Optronics, Goleta, CA), e as amostras foram classificadas quanto ao nível de disseminação. Os resultados são resumidos na Tabela 8. 102 ΕΡ2027156Β9 TABELA 8

Inibição do Espalhamento de Células de MDCK Induzido por HGF Anticorpo Ensaio 1 Ensaio 2 1A3 ++ + 1D3 ++ ++ 1F3 + + 2B8 +++ +++ 2F8 + + 3A12 - -/+ 3B6 ++ ++ 3D11 - - - Sem Inibição +++ Inibição muito forte, quase completa ++ Inibição forte + Inibição Detectável

Os resultados na Tabela 8 demonstram que o anticorpo 2B8 inibiu a disseminação induzida por HGF mais do que outros anticorpos. Os anticorpos 1D3 e 3B6 apresentaram um nivel intermédio de inibição; o anticorpo 1A3 apresentou um nivel baixo a intermédio de inibição: os anticorpos 1F3 e 2F8 apresentaram um baixo nivel de inibição; e os anticorpos 3A12 e 3D11 produziram pouca inibição ou não detectável.

Exemplo 9 - Inibição de Fosforilação de c-Met estimulada por HGF

Este Exemplo descreve uma caracterização dos anticorpos produzidos no Exemplo 1 quanto à sua capacidade para inibir a fosforilação de c-Met estimulada por HGF em células PC-3. 0 HGF induz fosforilação de Met em células PC-3 (ATCC No. CRL-1435). 103 ΕΡ2027156Β9

As células PC-3 foram semeadas em poços individuais de placas de cultura de tecido de 96 poços da Costar (Corning N° de Catálogo 3595) a uma densidade de 4,5xl04 de células por poço em 100 pL de F-12K (ATCC, Manassas, VA, N° de Catálogo 30-2004) contendo 10% de Soro fetal de bovino (Invitrogen N° de Catálogo 10438026) e 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen N° de Catálogo 15140122) . Após 24 horas a 37 °C com 5% de C02, o meio foi removido, e as células foram lavadas uma vez com F-12K isento de soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina. As células foram então incubadas durante 24 horas em 100 pL de F-12K isento de soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina.

As seguintes 10 diferentes diluições de cada um dos anticorpos a ser investigadas foram preparadas em F-12K isento de soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina: 6667 nM, 2222 nM, 741 nM, 247 nM, 82,3 nM, 27,4 nM, 9,1 nM, 3,0 nM, 1,0 nM, e 0,3 nM. Cada diluição de anticorpo, e, F-12K isento de soro contendo 1% penicilina-estreptomicina sem anticorpo, foram separadamente combinados com um volume igual de F-12K isento de soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina e 500 ng/mL HGF (R&D Systems N° de Catálogo 294-HGN-025) . Estas diluições de anticorpo/HGF foram incubadas durante 30 minutos a 25 °C. Isto resultou numa concentração final de 1,25 nM de HGF.

As células PC-3 foram então lavadas uma vez com F-12K isento de soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina. A seguir, 70 pL de F-12K isento de soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina foi adicionado às células, seguido por 10 pL de 10 mM de NaaVCh (Sigma N° de Catálogo S6508) em F-12K isento de soro contendo 1% de penicilina- 104 ΕΡ2027156Β9 estreptomicina. As células foram então incubadas durante 60 minutos a 37 °C com 5% de C02. Após esta incubação, 20 pL de cada diluição de anticorpo/HGF foram adicionados separadamente a poços separados, produzindo uma concentração final de HGF de 50 ng/mL, e as seguintes concentrações finais de cada anticorpo: 666,7 nM, 222,2 nM, 74,1 nM, 24,7 nM, 8,23 nM, 2,74 nM, 0,91 nM, 0,30 nM, 0,10 nM, 0,03 nM. As células foram depois incubadas durante 10 minutos a 37 °C com 5% de C02 ponto a partir do qual a mistura meios/anticorpo/HGF foi removida, as placas foram colocadas em gelo. As células foram então lavadas uma vez com 100 pL por poço de PBS arrefecido em gelo (Invitrogen N° de Catálogo 14190144) contendo 1 mM de Na3V04. As células foram então incubadas durante 30 minutos a 4 °C em 100 pL por poço de tampão de lise arrefecido em gelo consistindo em 1% de OmniPur Triton X-100 (MERCK KGaA, Darmstadt, Alemanha, N° de Catálogo 9410), 50 mM de Tris-HCl pH 8,0, 100 mM de NaCl, 0,3 mM de Na3V04, lx cocktail inibidor de protease (Sigma N° de Catálogo P8340), e lx cocktail inibidor de fosfatase 2 (Sigma N° de Catálogo 5726) . O anticorpo biotinilado anti-HGF humana-R (c-met) (R&D Systems N° de Catálogo BAF358) foi diluida a uma concentração de 2 pg/mL em Tampão de Ensaio DELFIA (PerkinElmer, Turku, Finlândia, N° de Catálogo 4002-0010) contendo 1% albumina de soro bovino (Sigma N° de Catálogo A2153) , e 50 pL desta diluição foi adicionada por poço de placas de microtitulação de estreptavidina amarelas (PerkinElmer N° de Catálogo AAAND-0005). As placas foram depois incubadas com anticorpo durante 30 minutos a 25 °C com agitação. Após a incubação, as placas foram lavadas com solução de lavagem DELFIA (PerkinElmer N° de Catálogo 4010-0010), e foram adicionados 80 pL de cada um dos diferentes lisados celulares PC-3 separadamente a poços 105 ΕΡ2027156Β9 individuais das placas microtitulação de estreptavidina lavadas.

As placas de microtitulação de estreptavidina contendo lisados de células PC-3 foram incubadas durante 60 minutos a 25°C com agitação, e depois lavadas com solução de lavagem DELFIA. Foram adicionados 100 pL de 600 ng/mL de anticorpo DELFIA Eu-Nl P-Tyr-100 (PerkinElmer N° de Catálogo AD0159) diluído em Tampão de Ensaio DELFIA contendo 1% de albumina de soro bovino em cada poço das placas de microtitulação de estreptavidina lavadas previamente incubadas com lisados de células PC-3. As placas foram incubadas durante 60 minutos a 25°C, com agitação. As placas foram lavadas uma última vez com solução de lavagem DELFIA. Depois, foram adicionados 200 pL de Solução de Melhoramento DELFIA (PerkinElmer N° de Catálogo 4001-0010) a cada poço das placas de microtitulação de estreptavidina lavadas, e as placas foram incubadas no escuro durante 5 minutos a 25°C, com agitação. O sinal foi então medido utilizando o protocolo Europium no leitor Victor3V (PerkinElmer) . Os valores de EC50 foram calculados utilizando o Prism 4 para Windows (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) e a equação sigmoidal de resposta a dose.

Os resultados resumidos como EC50s em nM são tabuladas na Tabela 9. 106 ΕΡ2027156Β9 TABELA 9

Anticorpo Média de Dois Ensaios Desvio Padrão 1A3 0,684 0,242 1D3 0,984 0,129 1F3 1,19 1,01 2B8 0,287 0,104 2F8 1,39 2,12 3 AI 2 2,00 0,553 3B6 1,01 i,n 3D11 2.28 N/A

Os dados na Tabela 9 demonstram que todos os oito anticorpos são potentes inibidores da fosforilação de c-Met induzida por HGF em células PC-3.

Exemplo 10 - Inibição de Tumor no Modelo de Xenoenxerto U87MG A capacidade dos anticorpos monoclonais de murino da invenção para inibir crescimento de tumor foi testada num modelo de xenoenxerto U87MG. As células U87MG (ATCC) foram expandidas em cultura a 37°C numa atmosfera contendo 5% de C02 e 95% de ar, utilizando um meio compreendendo meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal de bovino, 100 unidades/mL de penicilina e 100 pg/mL estreptomicina. As células foram subcultivadas e mantidas por raspagem das células da parede da placa de cultura utilizando tripsina-EDTA.

As células quase confluentes foram recolhidas por tripsinização e depois 5xl06 células em Matrigel a 50% (BD Biosciences; catálogo n° 356237) foram injectadas 107 ΕΡ2027156Β9 subcutaneamente na área dorsal superior entre as omoplatas de murganhos SCID ICR fêmeas de 7 semanas de idade (Taconic Labs) . Os diâmetros longo (L) e curto (W) (mm) de tumores foram medidos com a compasso de calibre. 0 volume de tumor (vol.) foi calculado como: volume (mm3) = L x W2/2. Quando os tumores cresceram até aproximadamente 200 mm3, os murganhos portadores de tumor foram divididos aleatoriamente em 5 grupos de 10 murganhos cada. Um grupo recebeu PBS. Cada um dos outros 4 grupos receberam um dos anticorpos 1A3, 1D3, 1F3 ou 2B8. Todos os anticorpos foram doseados a 1 mg/kg de peso corporal, duas vezes por semana, por injecções intra-peritoneais de 5 doses. Os volumes de tumor e os pesos corporais de murganho foram registados duas vezes por semana. A inibição de crescimento de tumor foi analisada utilizando o teste T de Student. Os resultados são resumidos na Figura 6 e Tabela 10.

Tabela 10

Percentagem de Inibição 2B8 vs PBS 93% p=0,001 1A3 vs PBS 73% p=0,0075 1D3 vs PBS 51% p=0,075 1F3 vs PBS 60% p=0,027 A regressão parcial foi conseguida no grupo tratado com 2B8 (Figura 6) . A inibição de crescimento estatisticamente significativa foi observada nos grupos tratados com 1A3 e tratados com 1F3 (Tabela 10). Existiu uma inibição de crescimento de tumor de 51% para 1D3 com um valor de p de 0,075. Não foi observada perda de peso corporal significativa. 108 ΕΡ2027156Β9

Exemplo 11- Inibição de Tumor no Modelo de Xenoenxerto U118 A capacidade dos anticorpos 1A3, 1D3, 1F3 e 2B8 para inibir o crescimento de tumor foi testada num modelo de xenoenxerto U1118. As células U118 (ATCC) foram expandidas como descrito no Exemplo 10 (acima) com respeito as células U87MG.

Os tumores subcutâneos foram estabelecidos como descrito no Exemplo 10 acima, excepto que os murganhos utilizados foram murganhos sem pêlo NCr fêmeas de 7 semanas de idade (Taconic), e o tratamento foi iniciado quando os tumores cresceram até aproximadamente 80 mm3. Como no modelo U87MG, todos os anticorpos foram doseados a 1 mg/kg de peso corporal duas vezes por semana através de injecções intra-peritoneais para 4 doses. Os volumes de tumor e pesos corporais dos murganhos foram registados duas vezes por semana. A inibição de crescimento de tumor foi analisada utilizando o teste t de Student. Os resultados são resumidos na Figura 7 e Tabela 11.

Tabela 11

Percentagem de Inibição 2B8 vs IgG 75% p=0,007 1A3 vs IgG 57% 1-1 o o II a 1D3 vs IgG 47% p=0,12 1F3 vs IgG 30% p=0,39 A inibição de crescimento de tumor estatisticamente significativa foi observada em grupos tratados de 2B8 e 1A3 (Figura 7) . Existiu uma modesta inibição de crescimento de tumor nos grupos 1F3 e 1D3 com valores de p inferiores a 0,05, que foi definido como estatisticamente significativo 109 ΕΡ2027156Β9 neste estudo (Tabela 11) . Não foi observada perda de peso corporal significativa.

Exemplo 12 - Humanização de Anticorpos Monoclonais de Murino

Este Exemplo descreve a humanização do anticorpo 2B8 de murino, em conjunto com a caracterização dos anticorpos humanizados resultantes. As Regiões Variáveis Pesada e Leve de 2B8 de murino foram "humanizadas" por dois métodos. A. Procedimento de Humanização 1

No primeiro método, três regiões variáveis de cadeias pesadas humanizadas e duas regiões variáveis de cadeia leve kapa humanizadas foram concebidas com base no método de "super-humanização" descrito em Hwang et al. (2005) METHODS 36: 35-42; Tan et al. (2002) J. IMMUNOL. 169:1119-1125; Patente U. S. N° 6 881 557. A classe estrutural canónica Chothia foi determinada para cada CDR de 2B8 de murganho com base no comprimento do CDR e composição de aminoácidos. As regiões variáveis da linha germinal humana consistindo na mesma classe estrutural canónica Chothia das regiões variáveis leves e pesadas foram identificadas com base nos conhecidos alelos de referência de região variável humana da linha germinal descrita no sitio da internet da International Immunogentics Information System (IMGT) (disponível na internet em imgt.cines.fr e biochem.unizh.ch/antibody/Sequences/index.html). Estas regiões variáveis da linha germinal humana da mesma classe estrutural foram comparadas com as regiões variáveis de 2B8 de murino por cálculo da percentagem de identidade ou de 110 ΕΡ2027156Β9 semelhança entre os resíduos de aminoácidos do CDR. Estas regiões variáveis da linha germinal com a maior identidade e/ou semelhança com os resíduos do CDR de 2B8 de murganho foram seleccionados para enxerto de CDR. Os resíduos estruturais das regiões variáveis da linha germinal foram preservados enquanto os resíduos do CDR do 2B8 de murganho foram utilizados para substituir os resíduos correspondentes da região variável da linha germinal humana que eram diferentes entre o CDR de 2B8 de murganho e os CDRs da linha germinal humana. A região J humana que foi mais semelhante com a região J de 2B8 de murganho foi então adicionada ao terminal carboxilo da região variável "super-humanizada". Foi então adicionada uma sequência sinal ao terminal amino das regiões variáveis "super-humanizadas" e estas sequências de aminoácidos foram convertidas em sequências de ácido nucleico. A sequência completa de ácido nucleico da região variável foi construída utilizando métodos de síntese de genes por PCR (Young et al. (2004) NUCL. ACIDS RES. 32:e59) e clonada num vector de expressão de mamífero (com base em pcDNA3.2 DEST (Invitrogen)) contendo regiões constantes de IgGl humana (alotipo Glm(17,l)) ou de Kapa (alotipo Km(3) (alelo 2)) (a jusante das regiões variáveis) utilizando técnicas convencionais de biologia molecular. Todos os quatro anticorpos de cadeia pesada de IgGl (2B8 quimérico e 3 cadeias pesadas humanizadas (Hu2B8 Hvl-f.l, Hu2B8 Hv5-a.l, Hu2B8 Hv5-51.1) foram expressos nas combinações possíveis com todos os 3 anticorpos de cadeia kapa (quimera 2B8 e 2 cadeias leves humanizadas (Hu2B8 Kvl-39.1 e Hu2B8 Kv3-15.1) criando 12 diferentes proteínas de anticorpo. A ligação dos anticorpos quimérico, quimérico/humanizado, e humanizados à 111 ΕΡ2027156Β9 HGF humana foi então medida como descrito a seguir e os resultados são resumidos na Figura 8. Cada uma das combinações possíveis de regiões variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina e de cadeia leve de imunoglobulina são apresentadas a seguir na Tabela 12A.

Tabela 12Ά

Região Variável de Cadeia Pesada Região Variável de Cadeia Leve Quimérico 2B8 (SEQ ID N° 12) Quimérico 2B8 (SEQ ID N° 14) Quimérico 2B8 (SEQ ID N° 12) Hu2B8 Kvl-39.1 (SEQ ID N° 173) Quimérico 2B8 (SEQ ID N° 12) Hu2B8 Kv3-15.1 (SEQ ID N° 179) Hu2B8 Hvl-f.l (SEQ ID N° 159) Quimérico 2B8 (SEQ ID N° 14) Hu2B8 Hvl-f.l (SEQ ID N° 159) Hu2B8 Kvl-39.1 (SEQ ID N° 173) Hu2B8 Hvl-f.l (SEQ ID N° 159) Hu2B8 Kv3-15.1 (SEQ ID N° 179) Hu2B8 Hv5-a.1 (SEQ ID N° 165) Quimérico 2B8 (SEQ ID N° 14) Hu2B8 Hv5-a.1 (SEQ ID N° 165) Hu2B8 Kvl-39.1 (SEQ ID N° 173) Hu2B8 Hv5-a.1 (SEQ ID N° 165) Hu2B8 Kv3-15.1 (SEQ ID N° 179) Hu2B8 Hv5-51.1 (SEQ ID N° 169) Quimérico 2B8 (SEQ ID N° 14) Hu2B8 Hv5-51.1 (SEQ ID N° 169) Hu2B8 Kvl-39.1 (SEQ ID N° 173) Hu2B8 HV5-51.1 (SEQ ID N° 169) Hu2B8 Kv3-15.1 (SEQ ID N° 179)

Cada uma das possíveis combinações de cadeias pesadas de imunoglobulina e de cadeias leves de imunoglobulina são apresentadas a seguir na Tabela 12B.

Tabela 12B

Cadeia Pesada de Imunoglobulina ID N°155) Cadeia Leve de Imunoglobulina Quimérico 2B8 IgGl (SEQ Quimérico 2b8 Kapa (Km(3)) (SEQ ID N° 157) Quimérico 2B8 IgGl (SEQ ID N° 155) Hu2b8 Kvl-39.1 + Constante Kapa (alotipo Km (3)) (alelo 2) (SEQ ID N° 177) Quimérico 2B8 IgGl (SEQ ID N° 155) Hu2b8 Kv3-15.1 + Constante Kapa (alotipo Km (3)) (alelo 2) (SEQ ID N° 181) Hu2b8 HVl-f.l + Constante de Quimérico 2B8 Kapa (Km(3)) (SEQ ID N° 112 ΕΡ2027156Β9

IgGl alotipo (G1G1M(17,1) ) (SEQ ID N° 163) 157) Hu2B8 Hvl-f.l + Constante de Hu2B8 Kvl-39.1 + Constante Kapa (alotipo IgGl alotipo (G1M(17,1)) (SEQ ID N° 163) Km(3)) (alelo 2) (SEQ ID N° 177) Hu2B8 Hvl-f.l + Constante de Hu2B8 Kv3-15.1 + Constante Kapa (alotipo IgGl alotipo (G1M(17,1)) (SEQ ID N° 163) Km(3)) (alelo 2) (SEQ ID N° 181) Hu2B8 Hv5-a.l + Constante de Quimérico 2B8 Kapa (Km (3)) (SEQ ID N° IgGl alotipo (GlM(17,l)) (SEQ ID N° 167) 157) Hu2B8 Hv5-a.l + Constante de Hu2B8 Kvl-39.1 + Constante Kapa (alotipo IgGl alotipo (G1M(17,1)) (SEQ ID N° 167) Km(3)) (alelo 2) (SEQ ID N° 177) Hu2B8 Hv5-a.l + Constante de Hu2B8 Kv3-15.1 + Constante Kapa (alotipo IgGl alotipo (G1M(17,1) ) (SEQ ID N° 167) Km(3)) (alelo 2) (SEQ ID N° 181) Hu2B8 Hv5-51.1 + Constante Quimérico 2B8 Kapa (Km (3)) (SEQ ID N° de IgGl alotipo (G1M (17,1) (SEQ ID N° 171) 157) Hu2B8 Hv5-51.1 + Constante Hu2B8 Kvl-39.1 + Constante Kapa (alotipo de IgGl alotipo (G1M(17,1)) (SEQ ID N° 171) Km(3)) (alelo 2) (SEQ ID N° 177) Hu2B8 Hv5-51.1 + Constante Hu2B8 Kv3-15.1 + Constante Kapa (alotipo de IgGl alotipo (G1M(17,1)) (SEQ ID N° 171) Km(3)) (alelo 2) (SEQ ID N° 181)

Duas das possíveis construções de anticorpo contendo o comprimento total das cadeias pesada e leve de imunoglobulinas contendo regiões variáveis humanizadas são designadas a seguir: sh2B8-9 (Glm(17,l)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ região constante de IgGl (alotipo Glm(17,l)) (SEQ ID N° 171) mais 113 ΕΡ2027156Β9 hu2B8 Kv 1-39.1 (+ região constante Kapa (alotipo Km (3) (alelo 2))) (SEQ ID N° 177) sh2B8-12 (Glm(17,1)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ região constante de IgGl (alotipo Glm(17,1))) (SEQ ID N° 171) mais hu2B8 Kv 3-15.1 (+ região constante de Kapa (alotipo Km (3) (alelo 2))) (SEQ ID N° 181) .

As sequências de ácido nucleico que codificam e as sequências de proteína que definem cada um dos anticorpos humanizados são resumidos a seguir. Nesta secção, o último nucleótido de cada região variável é a primeira base do codão seguinte produzido pela junção da região variável/constante. Este nucleótido é incluído na Região Variável porque é parte desse exão. As sequências de aminoácidos de Regiões Constantes listadas a seguir incluem a tradução deste codão de junção. (1) Sequência de Ácido Nucleico Codificando o Comprimento Total da Cadeia Pesada do Quimérico 2B8 (Região Variável de Murganho e Região Constante da IgGl Humana) (alotipo Glm(17,l)) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N° 154) 1 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgt ccactcccag 61 gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt gaagctgtcc 121 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgaa tcagaggcct 181 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 114 ΕΡ2027156Β9 241 gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 301 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaaggc accactctca ccgtctcctc agcctccacc 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga 115 ΕΡ2027156Β9 (2) Sequência de Proteína Definindo o Comprimento Total da Cadeia Leve do Quimérico 2b8 (Quimérico 2B8 IgGl (alotipo Glm(17.1)) (sem sequência sinal) (SEQ ID N° 155) 1 qvqlqqpgae lvkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqr pgqglewige inptnghtny 61 nekfkskatl tvdkssstay mqlssltsed savyycarny vgsifdywgq gttltvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk (3) Sequência de Ácido Nucleico Codificando o Comprimento Total da Cadeia Leve do Quimérico 2B8 (Região Variável de Murganho e Região Constante

Humana) (Quimérico 2B8 Kapa (Km(3))) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N° 156) 1 atggaatcac agactctggt cttcatabcc atactgctct ggttatatgg tgctgatggg 61 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 121 ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca 181 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat 241 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct 301 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaggc tggaaataaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 116 ΕΡ2027156Β9 421 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttccat 481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 601 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttga

(4) Sequência de Proteína Definindo o Comprimento Total da Cadeia Leve do Quimérico 2B8 (Quimérico 2B8 Kapa (Km(3))) (sem sequência sinal) (SEQ ID N° 157) 1 nivmtqspks msmsvgervt lsckasenvv syvswyqqkp aqspklliyg asnrntgvpd 61 rftgsgsatd ftltissvra edladyhcgq synypytfgg gtrleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 181 lskadyekhk vyacevthqg lsspvtksfn rgec (5) Sequência de Ácido Nucleico Codificando a Região Variável de Cadeia Pesada Humanizada Hu2B8 Hvl-f.l (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N° 158) 1 atggactgca cctggaggat cctcctcttg gtggcagcag ctacaggcac ccacgccgag 61 gtccagctgg tacagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggctacagt gaaaatctcc 121 tgcaaggttt ctggatacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgca acaggcccct 181 ggaaaagggc ttgagtggat gggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 gagaagttcc agggcagagt caccataacc gcggacacgt ctacagacac agcctacatg 301 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaac aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc ag 117 ΕΡ2027156Β9 (6) Sequência de Proteína Definindo Humanizada Hu2b8 Hvl-f.l Região Variável de Cadeia Pesada (sem sequência sinal) (SEQ ID N° 159) 1 evqlvqsgae vkkpgatvki sckvsgytft tywmhwvqqa pgkglewmge inptnghtny 61 nekfqgrvti tadtstdtay melsslrsed tavyycatny vgsifdywgq gtlvtvss (7) Sequência de Ácido Nucleico Codificando a Região Constante de Cadeia Pesada da IgGl Humana (alotipo Glm(17,l)) (SEQ ID N°160) 1 cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 61 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 121 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 181 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 241 acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca 301 aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 361 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 421 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 481 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 541 gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 601 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 661 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc 721 tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 781 ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 841 tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 118 ΕΡ2027156Β9 901 agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 961 agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga (8) Sequência de Proteína Definindo a Região Constante de Cadeia Pesada da IgGl Humanas (alotipo Glm(17,l)) (SEQ ID N° 161). O primeiro aminoácido é derivado da tradução do último nucleótido da região variável e os dois nucleótidos iniciais da sequência de Cadeia Pesada de IgGl. 1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss 61 glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkkvep kscdkthtcp pcpapellgg 121 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn 181 styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsrde 241 ltknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw 301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk (9) Sequência de Ácido Nucleico Codificando o Comprimento Total da Região Variável da Cadeia Pesada Humanizada Hu2B8 Hvlf.l e Região Constante de Cadeia Pesada da IgGl Humana (alotipo Glm(17,l)) (Sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N° 162) 1 atggactgca cctggaggat cctcctcttg gtggcagcag ctacaggcac ccacgccgag 61 gtccagctgg tacagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggctacagt gaaaatctcc 121 tgcaaggttt ctggatacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgca acaggcccct 181 ggaaaagggc ttgagtggat gggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 gagaagttcc agggcagagt caccataacc gcggacacgt ctacagacac agcctacatg 301 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaac aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 119 ΕΡ2027156Β9 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggachcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga (10) Sequência de Proteína Definindo o Comprimento Total da Região Variável da Cadeia Pesada Humanizada Hu2b8 Hvlf.l e da Região Constante de Cadeia Pesada da IgGl Humana (alotipo Glm(17,l)) (sem sequência sinal) (SEQ ID N° 163) 120 ΕΡ2027156Β9 1 evqlvqsgae vkkpgatvki sckvsgytft tywmhwvqqa pgkglewmge inptnghtny 61 nekfqgrvti tadtstdtay melsslrsed tavyycatny vgsifdywgq gtlvtvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqyy tlppsrdelt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk (11) Sequência de Ácido Nucleico Codificando a Região Variável de Cadeia Pesada Humanizada Hu2b8 Hv5a.l (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N° 164) 1 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaggatctcc 121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 ccgtccttcc aaggccacgt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtcaccgtctcctc ag (12) Sequência de Proteína Definindo a Região Variável de Cadeia Pesada Humanizada Hu2B8 Hv5a.l (sem sequência sinal) (SEQ ID N° 165) 1 evqlvqsgae vkkpgeslri sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 121 ΕΡ2027156Β9 61 npsfqghvti sadksistay lqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvss (13) Sequência de Ácido Nucleico Codificando o Comprimento Total da Região Variável de Cadeia Pesada Humanizada Hu2B8 Hv5a.l e da Região Constante de Cadeia Pesada da IgGl Humana (alotipo Glm(17.1)) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N° 166) 1 atggggtcaa ccgccatcct egccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaggatctcc 121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 ccgtccttcc aaggccacgt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 122 ΕΡ2027156Β9 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga (14) Sequência de Proteína Definindo o Comprimento Total da Região Variável de Cadeia Pesada Humanizada Hu2b8 Hv5a.l e Região Constante de Cadeia Pesada da IgGl Humana (alotipo Glm(17,l)) (sem sequência sinal) (SEQ ID N° 167) 1 evqlvqsgae vkkpgeslri sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 61 npsfqghvti sadksistay lqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk 123 ΕΡ2027156Β9 (15) Sequência de Ácido Nucleico Codificando a Região Variável de Cadeia Pesada Humanizada Hu2B8 Hv5-51.1 (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N° 168) 1 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc ag (16) Sequência de Proteína Definindo a Sequência Variável de Cadeia Pesada Humanizada Hu2b8 Hv5-51.1 (sem sequência sinal) (SEQ ID N° 169) 1 evqlvqsgae vkkpgeslki sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 61 npsfqgqvti sadksistay lqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvss (17) Sequência de Ácido Nucleico Codificando o Comprimento Total da Região Variável de Cadeia Pesada Humanizada Hu2b8 Hv5-51.1 e da Região Constante da Cadeia Pesada da IG1 Humana (alotipo Glm(17,l)) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N° 170) 1 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 124 ΕΡ2027156Β9 301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga 125 ΕΡ2027156Β9 (18) Sequência de Proteína Definindo o Comprimento Total da Região Variável de Cadeia Pesada Humanizada Hu2b8 Hv5-51.1 e da Região Constante da Cadeia Pesada da IgGl Humana (alotipo Glm(17,l)) (sem sequência sinal) (SEQ ID N° 171). 1 evqlvqsgae vkkpgeslki sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 61 npsfqgqvti sadksistay lqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt 351 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk (19) Sequência de Ácido Nucleico Codificando a Região Variável da Cadeia Kapa Humanizada Hu2B8 Kvi-39.1 (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N° 172). Dois possíveis ATGs iniciais são apresentados em maiusculas. 1 ATGgacATGa gggtccccgc tcagctcctg gggctcctqc tactctggct ccgaggtqcc 61 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 121 gtcaccatca cttgcaaggc cagtgagaat gtggtttctt atgtatcctg gtatcagcag 181 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatggggcat ccaaccggaa cactggggtc 241 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 301 caacctgaag attttgcaac ttactactgt gggcagagtt acaactatcc gtacacgttt 361 ggccagggga ccaagctgga gatcaaac 126 ΕΡ2027156Β9 (20) Sequência de Proteína Definindo a Região Variável da Cadeia Kapa Humanizada Hu2b8 Kvl-39.1 (sem sequência sinal) (SEQ ID N° 173) 1 diqmtqspss lsasvqdrvt itckasenvv syvswyqqkp qkapklliyg asnrntgvps 61 rfsgsgsgtd ftltisslqp edfatyycgq synypytfgq gtkleik (21) Sequência de Ácido Nucleico Codificando a Região Constante de Cadeia Kapa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 2) (SEQ ID N° 174) 1 gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg 61 gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt 121 ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca 181 gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga 241 aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga 301 gcttcaacag gggagagtgt tga (22) Sequência de Proteína Definindo Região Constante de Cadeia Kapa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 2) (SEQ ID N° 175). O primeiro aminoácido é derivado da tradução do último nucleótido da região variável e dos dois nucleótidos inicia da sequência da Cadeia Leve Kapa. 1 rtvaapsvfi fppsdeqlks gtasvvclln nfypreakvq wkvdnalqsg nsqesvteqd 61 skdstyslss tltlskadye khkvyacevt hqglsspvtk sfnrgec (23) Sequência de Ácido Nucleico Codificando o Comprimento Total da Região Variável de Cadeia Leve Humanizada Hu2B8 Kvl-39.1 e Região

Constante de Cadeia Kapa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 2) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N° 176) 1 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 61 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 127 ΕΡ2027156Β9 121 gtcaccatca cttgcaaggc cagtgagaat gtggtttctt atgtatcctg gtatcagcag 181 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatggggcat ccaaccggaa cactggggtc 241 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 301 caacctgaag attttgcaac ttactactgt gggcagagtt acaactatcc gtacacgttt 361 ggccagggga ccaagctgga gatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 421 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 481 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 541 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 601 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 561 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgttg a (24) Sequência de Proteína Definindo o Comprimento Total da Região Variável de Cadeia Leve Humanizada Hu2B8 Kvl-39.1 e da Região Constante de Cadeia Kapa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 1) (SEQ ID N° 177) 1 diqmtqspss lsasvgdrvt itckasenvv syvswyqqkp gkapklliyg asnrntgvps 61 rfsgsgsgtd ftltisslqp edfatyycgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 181 lskadyekhk vyacevthqg lsspvtksfn rgec (25) Sequência de Ácido Nucleico Codificando a Região Variável de Cadeia Leve Humanizada Hu2B8 Kv3-15.1 (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N° 178) 1 atggaagccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccactcga 61 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 128 ΕΡ2027156Β9 121 ctctcctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtacca gcagaaacct 181 ggccaggctc ccaggctcct catctatggg gcatccaacc ggaacactgg tatcccagcc 241 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 301 gaagattttg cagtttatta ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gtttggccag 361 gggaccaagc tggagatcaa ac (26) Sequência de Proteína Definindo a Região Variável de Cadeia Leve Humanizada Hu2B8 Kv3-15.1 (sem sequência sinal) (SEQ ID N° 179) 1 eivmtqspat lsvspgerat lsckasenvv syvswyqqkp gqaprlliyg asnrntgipa 61 rfsgsgsgte ftltisslqs edfavyycgq synypytfgq gtkleik (27) Ácido Nucleico Codificando o Comprimento Total da Região Variável de Cadeia Leve Humanizada Hu2b8 Kv3-15.1 e Região Constante de Cadeia Kapa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 2) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N° 180) 1 atggaagccc cagcgcaqct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaqa taccactgga 61 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 121 ctctcctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtacca gcagaaacct 181 ggccaggctc ccaggctcct catctatggg gcatccaacc ggaacactgg tatcccagcc 241 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 301 gaagattttg cagtttatta ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gtttggccag 361 gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 421 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 129 ΕΡ2027156Β9 541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 601 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttga (28) Sequência de Proteína Definindo a Região Variável de Cadeia Leve Humanizada Hu2B8 Kv3-15.1 e a Região Constante de Cadeia Kapa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 2) (sem sequência sinal) (SEQ ID N° 181) 1 eivmtqspat lsvspgerat lsckasenvv syvswyqqkp gqaprlliyg asnrntgipa 61 rfsgsgsgte ftltisslqs edfavyycgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 181 lskadyekhk vyacevthqg lsspvtksfn rgec

Por conveniência, a Tabela 13 proporciona um quadro concordante que apresenta a correspondência entre as sequências de comprimento total e os anticorpos discutidos nesta secção com os apresentados na Listagem de Sequências. TABELA 13 SEQ.ID.N2 Proteína ou Ácido Nucleico 154 Quimérico 2B8 IgGl (Glm(17,1))-ácido nucleico 155 Quimérico 2B8 IgGl (Glm(17,1))-proteína 156 Quimérico 2B8 Kapa (Km (3)) - ácido nucleico 157 Quimérico 2B8 Kapa (Km (3)) - proteina 158 Hu2B8 Hvlf.l Região Variável de Cadeia Pesada - ácido nucleico 159 Hu2B8 Hvlf.l Região Variável de Cadeia Pesada proteina 160 Região Constante de Cadeia Pesada da IgGl Humana alotipo (Glm (17,1))-ácido nucleico 161 Região Constante de Cadeia Pesada da IgGl Humana (alotipo Glm(17,1))-proteína 130 ΕΡ2027156Β9 162 Hu2B8 Hvlf.l + Constante de IgGl (alotipo Glm(17,l))-ácido nucleico 163 Hu2B8 Hvlf.l + Constante de IgGl (alotipo Glm(17,l)) -proteína 164 Hu2B8 Hv5a.l Região Variável de Cadeia Pesada - ácido nucleico 165 Hu2B8 Hv5a.l Região Variável de Cadeia Pesada proteína 166 Hu2B8 Hv5a.l + Constante de IgGl (alotipo Glm(17,l))-ácido nucleico 167 Hu2b8 Hv5a.l + Constante de IgGl (alotipo Glm(17,l))-proteína 168 Hu2B8 Hv5-51.1 Região Variável de Cadeia Pesada ácido nucleico 169 Hu2b8 Hv5-51.1 Região Variável de Cadeia Pesada proteína 170 Hu2b8 Hv5-51.1 + Constante de IgGl (alotipo Glm(17,l)-ácido nucleico 171 Hu2b8 Hv5-51.1 + Constante de IgGl (alotipo Glm(17,l)-proteína 172 Hu2b8 Kvl-39.1 Região Variável de Cadeia Kapa-ácido nucleico 173 Hu2b8 Kvl-39.1 Região Variável da Cadeia Kapa-proteína 174 Região Constante de Cadeia Kapa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 2) - ácido nucleico 175 Região Constante de Cadeia Kapa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 2) - proteína 176 Hu2b8 Kvl-39.1 + Constante Kapa (alotipo Km(3)) (alelo 2)- ácido nucleico 177 Hu2b8 Kvl-39.1 + Constante Kapa (alotipo Km(3)) (alelo 2)- proteína 178 Hu2B8 Kv3-15.1 Região Variável de Cadeia Kapa- ácido nucleico 179 Hu2B8 Kv3-15.1 Região Variável de Cadeia Kapa-proteína 180 Hu2B8 Kv3-15.1 + Constante Kapa (alotipo Km(3)) (alelo 2)- ácido nucleico 131 ΕΡ2027156Β9 181

Hu2B8 Kv3-15.1 + Constante Kapa (alotipo Km(3)) (alelo 2)- proteína B. Procedimento de Humanização 2 0 segundo método de humanização empregue para reduzir imunogenicidade do anticorpo 2B8 de murganho é baseado no método descrito em Studnicka et al. (1994) PROTEIN ENG. 7:805-814. As regiões variáveis pesadas e kapa da linha germinal humana mais idênticas (ao nivel dos aminoácidos) às do 2B8 de murganho foram identificadas. Os resíduos que diferiram entre o murganho e o humano foram convertidos na sequência humana dependendo do risco provável de que tal alteração afectaria a ligação ou imunogenicidade. Os resíduos de baixo risco (i. e., resíduos que quando alterados provavelmente não alteram a ligação a antigénio e pode também reduzir a potencial imunogenicidade) foram alterados para os aminoácidos humanos na região variável pesada (criando LR2B8HC) e na região variável kapa (criando LR2B8LC).

Adicionalmente, os de baixo risco e médio risco (i. e., resíduos que quando alterados têm de algum modo probabilidade de possuir efeito nos resíduos de ligação a antigénio e podem também reduzir a potencial imunogenicidade) foram alterados para os aminoácidos humanos na região variável pesada (criando LRMR2B8HC) e a região variável kapa (criando LRMR2B8LC) . A região constante da cadeia pesada de IgGl humana (alotipo Glm(3) (alelo 1)) foi adicionada ao terminal carboxilo das duas regiões variáveis pesadas humanas manipuladas e a região constante Kapa humana (alotipo Km (3) (alelo 1)) foi adicionada ao terminal carboxilo das duas regiões variáveis leves humanas manipuladas, criando deste 132 ΕΡ2027156Β9 modo quatro cadeias humanas manipuladas de anticorpo. As sequências de ácido nucleico da região variável foram primeiro sintetizadas pelos métodos de síntese de genes e depois adicionadas às sequências da região constante humana. Estes anticorpos manipulados humanos foram clonados em vectores de expressão de proteína de mamíferos, e proteína foi expressa em quatro possíveis combinações de cadeia pesada mais cadeia leve. A ligação dos anticorpos quiméricos, quimérico/humanizado, ou humanizados à HGF humana foi medida utilizando técnicas convencionais, como descrito a seguir.

As sequências de ácido nucleico que codifica e as sequências de proteína que definem cada um dos anticorpos humanizados são resumidos a seguir. Nesta secção, o último nucleótido de cada região variável é a primeira base do codão seguinte produzido pela junção da região variável/constante. Este nucleótido está incluído na Região Variável porque é parte desse exão. As sequências de aminoácido das Regiões Constantes listadas a seguir incluem a tradução deste codão de junção. (1) Sequência de Ácido Nucleico Codificando a Região Variável de Cadeia Pesada da Humanizada LR2B8HC (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N° 182) 1 atqqqctqqt catatattat tctctttctt qttqctaccq ctaccqatqt qcactctcaa 61 gtccaactcg tacaaccagg cgctgaagtc gtaaaacccg gaacatctgt taaactctca 121 tgcaaagcct caggatacac tttcacaact tactggatgc attgggtcaa tcaagccccc 181 ggacaaggcc tcgaatggat tggcgaaatt aacccaacta acggacatac taattataat 241 gaaaaattta agggcaaagc tacactcacc gtcgataaat caacctctac agcttatatg 133 ΕΡ2027156Β9 301 gaactttcat ccctgagatc agaagataca gccgtctact attgcgccag aaactacgta 361 ggatcaatat tcgattactg gggtcaaggc actctcctca cagtcagctc ag (2) Sequência de Proteína Definindo a Região Variável de Cadeia Pesada Humanizada LR2B8HC (sem sequência sinal) (SEQ ID N° 183) 1 qvqlvqpgae vvkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqa pgqglewige inptnghtny 61 nekfkgkatl tvdkststay melsslrsed tavyycarny vgsifdywgq gtlltvss (3) Sequência de Ácido Nucleico Codificando a Região Constante de Cadeia Pesada da IgGl Humana (alotipo Glm(3)) (alelo 1) (SEQ ID N° 184) 1 ccagcacaaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 61 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 121 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 181 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 241 acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca 301 aatcttgtga caaaactcac acatgtccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 361 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 421 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 481 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 541 gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 601 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 661 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga 721 tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 134 ΕΡ2027156Β9 781 ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 841 tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 901 agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 961 agaagagcct ctccctgtcc ccgggtaaat ga (4) Sequência de Proteína Definindo a Região Constante de Cadeia Pesada da IgGl Humana (alotipo Glm(3)) (alelo 1 ou 2) (SEQ ID N° 185). O primeiro aminoácido é derivado da tradução último nucleótido da região variável e dos primeiros dois nucleótidos da sequência de Cadeia Pesada de IgGl. 1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss 61 glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep kscdkthtcp pcpapellgg 121 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfhw yvdgvevhna ktkpreeqyn 181 styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsree 241 mtknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw 301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk (5) Sequência de Ácido Nucleico Codificando o Comprimento Total da Região Variável de Cadeia Pesada da Cadeia Pesada Humanizada LR2B8HC e Região Constante de Cadeia Pesada da IgGl Humana (alotipo Glm(3)) (alelo 1) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N° 186) 1 atgggctggt catatattat tctctttctt gttgctaccg ctaccgatgc gcactctcaa 61 gtccaactcg tacaaccagg cgctgaagtc gtaaaacccg gaacatctgt taaactctca 121 tgcaaagcct caggatacac tttcacaact tactggatgc attgggtcaa tcaagccccc 181 ggacaaggcc tcgaatggat tggcgaaatt aacccaacta acggacatac taattataat 135 ΕΡ2027156Β9 241 gaaaaattta agggcaaagc tacactcacc gtcgataaat caacctctac agctcatatg 301 gaactttcat ccctgagatc agaagataca gccgtctact attgcgccag aaactacgta 361 ggatcaatat tcgattactg gggtcaaggc actctcctca cagtcagctc agccagcaca 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 501 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaato acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgtcc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ccccgggtaa atga 136 ΕΡ2027156Β9 (6) Sequência de Proteína Definindo o Comprimento Total Região Variável de Cadeia Pesada da Cadeia Pesada Humanizada LR2B8HC e Região Constante de Cadeia Pesada da IgGl Humana (alotipo Glm(3)) (alelo 1) (sem sequência sinal) (SEQ ID N° 187) 1 qvqlvqpgae vvkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqa pgqglewige inptnghtny 61 nekfkgkatl tvdkststay melsslrsed tavyycarny vgsifdywgq gtlltvssas 121 tkgpsvfpla psskstaggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkrvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsreemt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk (7) Sequência de Acido Nucleico Codificando a Região Variável de Cadeia Pesada Humanizada LRMR2B8HC (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N° 188) 1 atgggttggt catatattat actctttctc gtagccaccg ccaccgacgt acaetctcag 61 gttcaactcg tacaacccgg cgccgaagtc aagaaaccag gaacatcagt caaactctca 121 tgtaaagcaa gcggatacac ctttactact tattggatgc attgggtaag acaagccccc 181 ggacaaggac tcgaatggat aggcgaaata aatcccacta atggacatac aaattataat 241 caaaaatttc aaggacgcgc tacactcacc gtcgataaat caacctcaac cgcatacatg 301 gaactcagct ccctccgatc cgaagacact gccgtttatt attgtgccag aaactatgta 361 ggatctattttcgattactg gggacaaggaacacttctcaccgtaagctc ag 137 ΕΡ2027156Β9 (8) Sequência de Proteína Definindo a Região Variável de Cadeia Pesada Humanizada LRMR2B8HC (sem sequência sinal) (SEQ ID M° 189) 1 qvqlvqpgae vkkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvrqa pgqglewige inptnghtny 61 nqkfqgratl tvdkststay melsslrsed tavyycarny vgsifdywgq gtlltvss (9) Sequência de Ácido Nucleico Codificando o Comprimento Total da Região Variável de Cadeia Pesada da Cadeia Pesada de Humanizada LRMR2B8HC e Região Constante de Cadeia Pesada da IgGl Humana (alotipo Glm(3)) (alelo 1) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N° 190) 1 atgggttggt catatattat actctttctc gtagccaccg ccaccgacgt acaetctcag 61 gttcaactcg tacaacccgg cgccgaagtc aagaaaccag gaacatcagt caaactctca 121 tgtaaagcaa gcggatacac ctttactact tattggatgc attgggtaag acaagccccc 181 ggacaaggac tcgaatggat aggcgaaata aatcccacta atggacatac aaattataat 241 caaaaatttc aaggacgcgc tacactcacc gtcgataaat caacctcaac cgcatacatg 301 gaactcagct ccctccgatc cgaagacact gccgtttatt attgtgccag aaactatgta 361 ggatctattt tcgattactg gggacaagga acacttctca ccgtaagctc agccagcaca 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgtcc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 138 ΕΡ2027156Β9 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ccccgggtaa atga (10) Sequência de Proteína Definindo o Comprimento Total Regiões Variáveis de Cadeias Pesadas da Cadeia Pesada Humanizada LRMR2B8HC e Região Constante de Cadeia Pesada da IgGl Humana (alotipo Glm(3)) (alelo 1) (sem sequência sinal) (SEQ ID N° 191) 1 qvqlvqpgae vkkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvrqa pgqglewige inptnghtny 61 nqkfqgratl tvdkststay melsslrsed tavyycarny vgsifdywgq gtlltvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkrvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcwvdvsiie dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsreemt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq 139 ΕΡ2027156Β9 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk (11) Sequência de Ácido Nucleico Codificando a Humanizada Região Variável de Cadeia Leve LR2B8LC (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N° 192) 1 atqgaaagtc agacccttgt attcatctct attcttcttt ggttqtatqq agcagacqqc 61 gacattgtga tgacccaatc ccccgatagt atggccatga gtgtaggaga aagagtcacc 121 cttaattgca aagcctccga aaatgtcgtt tcatatgtgt cttggtatca acaaaaaccc 181 ggccaatcac ccaaacttct catatacggc gcttcaaaca gaaacacagg cgttcccgac 241 agatttagtg gatccggatc agctacagat ttcaccctta ccatcagttc agttcaagca 301 gaagacgttg cagactatca ttgcggacaa tcttataact acccttacac attcggacaa (12) Sequência de Proteína Definindo Humanizada LR2B8LC Região Variável de Cadeia Leve (sem sequência sinal) (SEQ ID N° 193) 1 divmtqspds mamsvgervt lnckasenvv syvswyqqkp gqspklliyg asnrntgvpd 61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleik (13) Sequência de Ácido Nucleico Codificando the Região Constante de Cadeia Kapa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 1) (SEQ ID N° 194) 1 gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg 61 gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt 121 ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca 181 gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga 241 aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga 301 gcttcaacag gggagagtgt tag 140 ΕΡ2027156Β9 (14) Sequência de Proteína Definindo a Região Constante de Cadeia Kapa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 1) (SEQ ID N° 195). 0 primeiro aminoácido derivou da tradução do último nucleótido da região variável e nos dois nucleótidos iniciais da sequência da Cadeia Leve Kapa. 1 rtvaapsvfi fppsdeqlks gtaswclln nfypreakvq wkvdnalqsg nsqesvteqd 61 skdstyslss tltlskadye khkvyacevt hqglsspvtk sfhrgec (15) Sequência de Ácido Nucleico Codificando o Comprimento Total da Região Variável de Cadeia Leve Humanizada LR2B8LC e a Região Constante de Cadeia Kapa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 1) (SEQ ID N° 196) 1 atggaaagtc agacccttgt attcatctct attcttcttt ggttgtatgg agcagacggc 61 gacattgtga tgacccaatc ccccgatagt atggccatga gtgtaggaga aagagtcacc 121 cttaattgca aagcctccga aaatgtcgtt tcatatgtgt cttggtatca acaaaaaccc 181 ggccaatcac ccaaacttct catatacggc gcttcaaaca gaaacacagg cgttcccgac 241 agatttagtg gatccggatc agctacagat ttcaccctta ccatcagttc agttcaagca 301 gaagacgttg cagactatca ttgcggacaa tcttataact acccttacac attcggacaa 361 ggaaccaaac tcgaaattaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 421 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 501 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 141 ΕΡ2027156Β9 (16) Sequência de Proteína Codificando o Comprimento Total Região Variável de Cadeia Leve Humanizada LR2B8LC e a Região Constante de Cadeia Kapa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 1) (SEQ ID N° 197) 1 divmtqspds mamsvgervt lnckasenvv syvswyqqkp gqspklliyg asnrntgvpd 61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 181 lskadyekhk vyacevthqg lsspvtksfn rgec (17) Sequência de Ácido Nucleico Codificando a Região Variável de Cadeia Leve Humanizada LRMR2B8LC (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N° 198) 1 atqqaatccc aaacccttqt tttcatctct atccttctct qgctttatgg cgccqacqqa 61 gacatcgtaa tgacacaatc ccctgactct cttgctatga gcttgggcga acgagtaaca 121 cttaactgca aagcatccga aaatgtcgta tcttacgtat cctggtatca gcaaaaacct 181 ggtcaaagtc ctaaacttct tatatatggt gcaagtaatc gtgaaagtgg cgtcccagac 241 agatttagcg gttcaggttc agcaactgac tttacactta caatttctag cgttcaggcc 301 gaagacgttg cagactatca ttgtggacaa tcttataact atccttatac tttcggacaa 361 ggcactaaac ttgaaattaa ac (18) Sequência de Proteína Definindo the Humanizada LRMR2B8LC Região Variável de Cadeia Leve (sem sequência sinal) (SEQ ID N° 199) 1 divmtqspds lamslgervt lnckasenw syvswyqqkp gqspklliyg asnresgvpd 61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleik 142 ΕΡ2027156Β9 (19) Sequência de Ácido Nucleico Codificando o Comprimento Total de Região Variável de Cadeia Leve Humanizada LRMR2B8LC e a Região Constante de Cadeia Kapa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 1) (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N° 200) 1 atggaatccc aaacccttgt tttcatctct atccttctct ggccttatgg cgccgacgga 61 gacatcgtaa tgacacaatc ccctgactct cttgctatga gcttgggcga acgagtaaca 121 cttaactgca aagcatccga aaatgtcgta tcttacgtat cctggtatca goaaaaacct 181 ggtcaaagtc ctaaacttct tatatatggt gcaagtaatc gtgaaagtgg cgtcccagac 241 agatttagcg gttcaggttc agcaactgac tttacactta caatttctag cgttcaggcc 301 gaagacgttg cagactatca ttgtggacaa tcttataact atccttatac tttcggacaa 361 ggcactaaac ttgaaattaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 421 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 601 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag (20) Sequência de Proteína Definindo o Comprimento Total de Região Variável de Cadeia Leve LRMR2B8LC Humanizada e a Região Constante de

Cadeia Kapa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 1) (SEQ ID N° 201) 1 divmtqspds lamslgervt lnckasenvv syvswyqqkp gqspklliyg asnresgvpd 61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 143 ΕΡ2027156Β9 181 lskadyekhk vyacevthqg lsspvtksfn rgec

Para conveniência, a Tabela 14 proporciona um quadro concordante que apresenta a correspondência entre as sequências de comprimento total e dos anticorpos discutidos nesta secção com os apresentados na Listagem de Sequências. TABELA 14 SEQ.ID.NO. Proteína ou Ácido Nucleico 182 LR2B8HC Região Variável de Cadeia Pesada - ácido nucleico 183 LR2B8HC Região Variável de Cadeia Pesada - proteína 184 Região Constante de Cadeia Pesada da IgGl Humana (alotipo Glm(3)) (alelo 1)-ácido nucleico 185 Região Constante de Cadeia Pesada da IgGl Humana (alotipo Glm(3)) (alelo 1)-proteína 186 LR2B8HC + Constante de IgGl(alotipo Glm(3)) (alelo 1) - ácido nucleico 187 LR2B8HC + Constante de IgGl(alotipo Glm(3)) (alelo 1) - proteína 188 LRMR2B8HC Região Variável de Cadeia Pesada - ácido nucleico 189 LRMR2B8HC Região Variável de Cadeia Pesada - proteína 190 LRMR2B8HC + Constante de IgGl(alotipo Glm(3)) (alelo 1) - ácido nucleico 191 LRMR2B8HC + Constante de IgGl(alotipo Glm(3)) (alelo 1) - proteína 192 LR2B8LC Região Variável de Cadeia Leve - ácido nucleico 193 LR2B8LC Região Variável de Cadeia Leve - proteína 194 Região Constante de Cadeia Kapa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 1) - ácido nucleico 195 Região Constante de Cadeia Kapa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 1)- proteína 196 LR2B8LC + Constante Kapa (alotipo Km(3)) (alelo 1) -ácido nucleico 144 ΕΡ2027156Β9 197 LR2B8LC + Constante Kapa (alotipo Km(3)) (alelo 1) -proteína 198 LRMR2B8LC Região Variável de Cadeia Leve - ácido nucleico 199 LRMR2B8LC Região Variável de Cadeia Leve - proteína 200 LRMR2B8LC + Constante Kapa (alotipo Km(3)) (alelo 1) - ácido nucleico 201 LRMR2B8LC + Constante Kapa (alotipo Km(3)) (alelo 1) - proteína A Tabela 15 resume as sequências CDR de cadeia pesada (Definição de Kabat) dos anticorpos humanizados 2B8 preparados pelo procedimento de humanização 1 e pelo procedimento de humanização 2 aqui descrito acima neste Exemplo. TABELA 15

Anticorpo CRD1 CRD2 CRD3 Região Variável da Cadeia Pesada de Comprimento Total 2B8 Pesada de Murino TYWMH (SEQ ID N° 15) EINPTNGHTNYNEKFKS (SEQ ID N° 16) NYVGSIFDY (SEQ ID N° 17) SEQ ID N° 12 Hu2B8Hvlf.1 TYWMH (SEQ ID N° 15) EINPTNGHTNYNEKFQG (SEQ ID N° 202) NYVGSIFDY (SEQ ID N° 17) SEQ ID N° 159 Hu2B8 Hv5a.1 TYWMH (SEQ ID N° 15) EINPTNGHTNYNPSFQG (SEQ ID N° 203) NYVGSIFDY (SEQ ID N° 17) SEQ ID N° 165 Hu2B8Hv5- TYWMH EINPTNGHTNYNPSFQG NYVGSIFDY (SEQ SEQ ID N° 51.1 (SEQ ID N° 15) (SEQ ID N° 203) ID N° 17) 169 145 ΕΡ2027156Β9 LR2B8HC TYWMH (SEQ ID N° 15) EINPTNGHTNYNEKFKG (SEQ ID N° 204) NYVGSIFDY (SEQ ID N° 17) SEQ ID N° 183 LRMR2B8HC TYWMH EINPTNGHTNYNQKFQG NYVGSIFDY SEQ ID N° (SEQ ID (SEQ ID N° 205) (SEQ ID N° 17) 189 N° 15) A Tabela 16 resume as sequências CDR de cadeia leve (Definição de Kabat) dos anticorpos humanizados 2B8 preparados pelo procedimento de humanização 1 e pelo procedimento de humanização 2 aqui descrito acima neste Exemplo, TABELA 16

Anticorpo CRD1 CRD2 CRD3 Região Variável da Cadeia Leve de Comprimento Total 2B8 Leve de Murino KASENWSYVS (SEQ ID N° 18) GASNRNT (SEQ ID N° 19) GQSYNYPYT (SEQ ID N° 20) SEQ ID N° 14 Hu2B8 Kvl-39.1 KASENWSYVS (SEQ ID N° 18) GASNRNT (SEQ ID N° 19) GQSYNYPYT (SEQ ID N° 20) SEQ ID N° 173 Hu2B8Kv3- 15.1 KASENWSYVS (SEQ ID N° 18) GASNRNT (SEQ ID N° 19) GQSYNYPYT (SEQ ID N° 20) SEQ ID N° 179 LR2B8LC KASENWSYVS (SEQ ID N° 18) GASNRNT (SEQ ID N° 19) GQSYNYPYT (SEQ ID N° 20) SEQ ID N° 193 LRMR2B8LC KASENWSYVS (SEQ ID N° 18) GASNRES (SEQ ID N° 206) GQSYNYPYT (SEQ ID N° 20) SEQ ID N° 199 C. Ligação por Afinidade de Anticorpos Humanizados 2B8 A afinidade de ligação ao antigénio e as cinéticas de interacção foram avaliadas por tecnologia de ressonância de 146 ΕΡ2027156Β9 plasmão de superfície utilizando a BIAcore T100 instrument. Mouse anti-imunoglobulinas humanas (Jackson ImmunoResearch Labs, 209-005-098) foram imobilizadas em "carboxymethylated dextran CM4 sensor chips" (BIAcore, N° de Catálogo BR-1005-34) por acoplamento de amina (BIAcore, N° de Catálogo BR-1000-50) utilizando a protocolo de acoplamento convencional de acordo com as recomendações do fabricante. As análises foram efectuadas a 25 °C utilizando PBS (GIBCO, N° de Catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensioactivo P20 (BIAcore, N° de Catálogo BR-1000-54), 2 mg/mL BSA (EMD, N° de Catálogo 2930) e 10 mg/mL CM-Dextran Sodium salt (Fluka, N° de Catálogo 86524) como tampão de migração.

Os anticorpos foram capturados numa célula de fluxo original a uma taxa de fluxo de 10 pL/min. O tempo de injecção foi variável para cada anticorpo para produzir aproximadamente 20 RU de anticorpo capturado para cada ciclo. Tampão ou HGF (R&D Systems, N° de Catálogo 294-HGF-025) diluído em tampão de migração foram injectados sequencialmente numa superfície de referência (no anticorpo capturado) e a superfície activa (anticorpo a ser testado) durante 2 minutos a 60 pL/min. A fase de dissociação foi monitorizada durante 15 ou 90 minutos, dependendo da concentração. A superfície foi então regenerada com 10 mM de Glicina-HCl, pH 2,0 (BIAcore, N° de Catálogo BR-1003-55) injectada durante 3 minutos a uma taxa de fluxo de 60 pL/min antes de ter sido iniciado outro ciclo. As concentrações de HGF testadas foram 1,88, 3,75 e 7,5 nM. A determinação dos parâmetros cinéticos foi conseguida utilizando a função cinética do programa de computador BIAevalutation com subtracção da referência. Os parâmetros cinéticos para cada anticorpo, ka (constante da taxa de associação), kd 147 ΕΡ2027156Β9 (constante da taxa de dissociação) e KD (constante de equilíbrio de dissociação) são resumidos na Figura 8.

Os resultados resumidos na Figura 8 mostram que certas combinações de cadeias pesadas super-humanizadas (Hu2B8 Hv5a.l, Hu2B8 Hv5-51.1 ou Hu2B8 Hvl-f.l) e cadeias leves (Hu2B8 Kvl-39.1 ou Hu2B8 Kv3-15.1) retêm afinidade de ligação semelhante (Kd) para HGF como ο 2B8 quimérico (regiões variáveis de murganho com regiões constantes humanas) e 2B8 (Tabela 5) . D. Ensaio de Ligação Mutuamente Exclusiva A ligação mutuamente exclusiva a HGF foi verificada por tecnologia de ressonância de plasmão de superfície utilizando um instrumento BIAcore T100. As anti-imunoglobulinas humanas de murganho (Jackson ImmunoResearch Labs, 209-005-098) foram imobilizadas em chips sensores CM5 de dextrano carboximetilado (BIAcore, N° de Catálogo BR-1006-68) por acoplamento de amina (BIAcore, N° de Catálogo BR-1000-50) utilizando um protocolo de acoplamento convencional de acordo com as recomendações do fabricante. As análises foram efectuadas a 25°C utilizando PBS (GIBCO, N° de Catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensioactivo P20 (BIAcore, #BR-1000-54), 2 mg/mL de BSA (EMD, N° de Catálogo 2930) e 10 mg/ml de sal de sódio de CM-Dextrano (Fluka, N° de Catálogo 86524) como tampão de migração.

Os anticorpos humanizados foram capturados numa célula de fluxo original a uma taxa de fluxo de 30 yL/min. O tempo de injecção foi variável para cada anticorpo para produzir aproximadamente 150 RU de anticorpo capturado para cada 148 ΕΡ2027156Β9 ciclo. 0 HGF (R&D Systems, N° de Catálogo 294-HGN-025) diluído em tampão de migração a uma concentração final de 7,5 pg/mL foi injectado durante 90 seg a 30 pL/min com os anticorpos humanizados capturados. A ligação de HGF foi monitorizada antes da subsequente injecção de anticorpo 2B8 de murganho ou anticorpo policlonal anti-HGF de cabra (R&D Systems, AF294) durante 3 min a 30 pL/min. A superfície foi então regenerada com 10 mM de Glicina-HCl, pH 2,0 (BIAcore, N° de Catálogo BR-1003-55) injectada durante 3 min a uma taxa de fluxo de 60 pL/min antes que outro anticorpo fosse testado. Os resultados são resumidos na Figura 9.

Os resultados resumidos na Figura 9 mostram que ambos os anticorpos humanizados 2B8 e anticorpos quiméricos 2B8 evitam a ligação de 2B8 de murino a HGF. Estes resultados demonstram que os anticorpos humanizados ligam-se ainda ao mesmo epitopo de HGF como o anticorpo 2B8 original.

Exemplo 13 - Produção de variantes 2B8 Humanizadas a. Anticorpos HUMAN ENGINEERED™

As cadeias leves (LR2B8LC e LRMR2B8LC, respectivamente) e cadeias pesadas (LR2B8HC e LRMR2B8HC, respectivamente) Humanas Manipuladas optmizadas para os codões e expressão de baixo risco e de risco baixo a moderado foram clonadas em fase nos vectores de expressão de anticorpo transiente em XOMA, que contêm módulos de regiões constantes humanas Kapa e Gama-1. As quatro variantes Humanas Manipuladas de 2B8 foram produzidas por transfecção transiente em células HEK293E. Foram produzidos os seguintes quatro anticorpos: 149 ΕΡ2027156Β9 ΗΕ2Β8-1 = LR2B8HC (+ região constante de IgGl (alotipo Glm(3) (alelo 1)) (SEQ ID N° 187) mais LR2B8LC (+ região constante Kapa (alotipo Km(3) (alelo 1))) (SEQ ID N° 197) HE2B8-2 = LR2B8HC (+ região constante de IgGl (alotipo Glm (3) (alelo 1)) (SEQ ID N° 187) mais LRMR2B8LC ( + região constante Kapa (alotipo Km(3) (alelo 1))) (SEQ ID N° 201) HE2B8-3 = LRMR2B8HC (+ região constante de IgGl (alotipo Glm(3) (alelo 1)) (SEQ ID N° 191) mais LR2B8LC (+ região constante Kapa (alotipo Km(3) (alelo 1))) (SEQ ID N° 197) HE2B8-4 = LRMR2B8HC (+ região constante de IgGl (alotipo Glm (3) (alelo 1)) (SEQ ID N° 191) mais LRMR2B8LC ( + região constante Kapa (alotipo Km(3) (alelo 1))) (SEQ ID N° 201)

As cadeias leves e pesadas foram co-transfectadas em células HEK293E adaptadas à suspensão XOMA cultivadas em meio IS293 (Irvine Scientific, Irvine, CA) utilizando frascos de agitação de 2 litros. Após 24 horas nos frascos de agitação, 200 mL de células transfectadas foram centrifugadas, ressuspendidas em 4 mL de meio fresco e transferida para frascos Integra (Wilson Wolf Manufacturing Inc., MN) para produção. Após incubação durante sete dias, as suspensões de células foram removidas dos frascos Integra, centrifugadas e os sobrenadantes de cultura retidos. Os anticorpos nos sobrenadantes de cultura foram purificados em colunas de 150 ΕΡ2027156Β9 centrifugação de proteína A (Pro-Chem), dialisados contra PBS, concentrados e filtrados em esterilidade. b. Anticorpos SUPERHUMANIZED™ 0 cDNA de Hu2B8_Hv5-51.1 de comprimento total + o domínio constante de IgGl humana (alotipo Glm(3)) foi clonado em pEE6.4 (Lonza Biologics, Berkshire, UK) utilizando os sítios de restrição HindIII e EcoRI. 0 cDNA de comprimento total da região variável de Hu2B8_Kvl-39.1 + domínio constante Kapa humano e o cDNA de comprimento total da região variável de Hu2B8_Kv3-15.1 + domínio constante Kapa humano foram cada um clonados no pEE14.4 (Lonza Biologics) utilizando os sítios de restrição HindIII e EcoRI. 0 cDNA do promotor de hCMV-MIE + Hu2B8 Hv5-51.1 de comprimento total + domínio constante de IgGl humana (alotipo Glm(3)) + fragmento poli A de SV4 0 (em pEE6.4) foi removido por digestão com NotI/SalI e inserido no vector pEE14.4 de cadeia Kapa nos sítios NotI/SalI, criando deste modo 2 diferentes vectores de expressão em que cada um expressa simultaneamente a cadeia pesada e leve para produzir os seguintes anticorpos: sh2B8-9 (Glm(3)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ região constante de IgGl (alotipo Glm(3)) (alelo 2)) (SEQ ID N° 210) mais hu2B8 Kv 1-39.1 (+ região constante Kapa (alotipo Km(3) (alelo 2))) (SEQ ID N° 177) sh2B8-12 (Glm(3)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ região constante de

IgGl (alotipo Glm(3)) (alelo 2)) (SEQ ID N° 210) mais 151 ΕΡ2027156Β9 hu2B8 Kv 3-15.1 (+ região constante Kapa (alotipo Km(3) (alelo 2))) (SEQ ID No. 181)

As sequências de ácido nucleico que codificam e as sequências de proteina que definem a sequência de ácido nucleico codificante da região constante da cadeia pesada da IgGl humana (alotipo Glm(3)) (alelo 2) e cada uma das sequências de cadeia pesada de comprimento total estão apresentada a seguir. As sequências de cadeia leve foram as mesmas como descrito no Exemplo 12 (1) Sequência de Ácido Nucleico Codificante da Região Constante da Cadeia Pesada da IgGl Humana (alotipo Glm(3)) (alelo 2) (SEQ ID N° 207) 1 cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 61 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 121 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 181 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 241 acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca 301 aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 361 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 421 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 481 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 541 gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 601 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaag accatctcca 152 ΕΡ2027156Β9 661 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga 721 tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 781 ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 841 tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 901 agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 961 agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga (2) Sequência de Proteína Definindo a Região Constante da Cadeia Pesada da IgGl Humana (alotipo Glm(3)) (alelo 1 ou 2) (SEQ ID N° 208). O primeiro aminoácido é derivado da tradução do último nucleótido da região variável e os dois nucleótidos iniciais da sequência da Cadeia Pesada de

IgGl. 1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss 61 glyslsswt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep kscdkthtcp pcpapellgg 121 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvwdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn 181 sryrwsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsree 241 mtknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw 301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk (3) Sequência de Ácido Nucleico Codificante da Cadeia de Comprimento Total Contendo a Região Variável Da Cadeia Pesada de Hu2B8 Hv5~51.1 Humanizada e um alotipo Glm(3) (alelo 2) da Região Constante da cadeia Pesada de IgGl humana (sequência sinal sublinhada) (SEQ ID N° 209). 1 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 153 ΕΡ2027156Β9 121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gctgacaagc ccatcagcac tgcctacctg 301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgto gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggbgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga agaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 154 ΕΡ2027156Β9 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga

(4) Sequência de Proteína Definindo a Cadeia Pesada de Comprimento Total Contendo Hu2B8 Hv5~51.1 Humanizado e o alotipo Glm(3) (alelo 2) da Região Constante da Cadeia Pesada da IgGl Humana (sem sequência sinal) (SEQ ID N° 210) . 1 evqlvqsgae vkkpgeslki sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 61 npsfqgqvhi sadksistay lqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkrvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsreemt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesnggpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk

Cada vector de expressão duplo foi transfectado em células 293T para expressão transiente utilizando DMEM com 10% de soro fetal de bovino. Quarenta e oito horas após transfecção, as células foram lavadas com e depois substituídas por meio isento de soro, IS GRO™ (Irvine

Scientific, Santa Ana, CA) contendo 4 mM de L-Glutamina. O sobrenadante foi recolhido diariamente e substituídas por meio fresco durante 10 dias. Os sobrenadantes de cultura foram centrifugados, filtrados (0,45 ym) e concentrados 10-100 vezes. Os anticorpos foram purificados em resina ProSep 155 ΕΡ2027156Β9 vA (Millipore), dialisados contra PBS, concentrados e filtrados em esterilidade.

Exemplo 14 - Características das Variantes 2B8 Humanizadas

Os anticorpos humanizados produzidos no Exemplo 13 foram caracterizados quanto à sua capacidade de se ligarem a hHGF e às proteínas recombinantes de HGF produzidas no Exemplo 3.

Os anticorpos foram analisados por ressonância de plasmão de superfície utilizando um instrumento BIAcore T100 para avaliar a sua capacidade de se ligar a hHGF e às proteínas de fusão discutidas no Exemplo 3. Cada anticorpo foi imobilizado num chip sensor CM5 de dextrano carboximetilado (BIAcore, N° de Catálogo BR-1006-68) por acoplamento de amina (BIAcore, N° de Catálogo BR- 1000-50) utilizando a protocolo de acoplamento convencional de acordo com instruções do fabricante.

As análises foram efectuadas a 25°C utilizando PBS (GIBCO, N° de Catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensioactivo P20 (BIAcore, N° de Catálogo R-1000-54), 2 mg/mL BSA (EMD, N° de Catálogo 2930) e 10 mg/mL de Sal de Sódio CM-Dextrano (Fluka, N° de Catálogo 86524) como tampão de migração. O sobrenadante contendo diferentes proteínas de fusão de HGF ou sobrenadante das células transfectadas com vector vazio foram injectadas com cada anticorpo a uma taxa de fluxo de 30 yL/min durante 3 minutos. A ligação resultante foi determinada como unidades de ressonância (RU) com uma linha de base de 30 segundos após o fim da injecção. A ligação foi comparada com HGF humana (R&D Systems, N° de Catálogo 294-HGN-025) diluída tampão de migração. A ligação 156 ΕΡ2027156Β9 não específica foi monitorizada por comparação com a ligação a uma superfície de controlo. Os resultados são resumidos na

Tabela 17. TABELA 17

Anticorpo rhHGF (R&D Systems) rmHGF (R&D Systems) MHM quimera (495-585) MHM quimera (507-585) MHM quimera (499-556) 2B8 Sim Não Sim Sim Sim HE2B8-1 Sim Não Sim Sim Sim HE2B8-2 Sim Não Sim Sim Sim HE2B8-3 Sim Não Sim Sim Sim HE2B8-4 Sim Não Sim Sim Sim sh2B8-9 (Glm (3)) Sim Não Sim Sim Sim sh2B8-12 (Glm (3)) Sim Não Sim Sim Sim

Os resultados na Tabela 17 demonstram que cada um dos anticorpos com base em 2B8 humanizados se liga a rhHGF e todas as três quimeras murganho-humano-murganho.

Exemplo 15 - Afinidades de Ligação das Variantes 2B8 Humanizadas

As afinidades de ligação e cinéticas de interacção dos anticorpos listados na Tabela 15 foram medidos por ressonância de plasmão de superfície.

As anti-imunoglobulinas humanas de murganho (Jackson Labs, N° de Catálogo 209-005) foram imobilizadas em chips sensores CM4 de dextrano carboximetilado (BlAcore, N° de Catálogo BR-1006-68) por acoplamento de amina (BlAcore, N° de Catálogo BR- 1000-50) utilizando um protocolo de acoplamento 157 ΕΡ2027156Β9 convencional de acordo com instruções do fabricante. As análises foram efectuadas a 25°C utilizando PBS (GIBCO, N° de Catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensioactivo P20 (BIAcore, N° de Catálogo BR 1000-54), e 2 mg/mL BSA (EMD, N° de Catálogo 2930).

Os anticorpos foram capturados numa célula de fluxo individual a uma taxa de fluxo de 10 yL/min. O tempo de injecção foi variável para cada anticorpo para produzir aproximadamente 20 RU de anticorpo capturado para cada ciclo. Tampão ou HGF (R&D Systems, N° de Catálogo 294-HGN-025) diluidos em tampão de migração foram injectados sequencialmente numa superfície de referência (sem anticorpo capturado) e a superfície activa (anticorpo a ser testado) durante 2 minutos a 60 yL/min. A fase de dissociação foi monitorizada durante 15 ou 90 minutos, dependendo da concentração. A superfície foi então regenerada com 10 mM de Glicina-HCl, pH 2,2 (BIAcore, N° de Catálogo BR-1003-54) injectado durante 3 minutos a uma taxa de fluxo de 60 yL/min antes de ter sido iniciado outro ciclo. As concentrações de HGF testadas foram 0,46 nM a 7,5 nM.

Os parâmetros cinéticos foram determinados utilizando a função cinética do programa de computador BIAevalutation™ com subtracção da referência. Os parâmetros cinéticos para cada anticorpo, ka (constante da taxa de associação), kd (constante da taxa de dissociação) e KD (constante de equilíbrio de dissociação) são resumidos na Tabela 18. 158 ΕΡ2027156Β9 TABELA 18

Anticorpo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (pM) DP 2B8 1,4xlOb 1, 0xl0‘b 7,3 - HE2B8-1 2,2xlOb 1, 4xl0'b 7,1 5,2 HE2B8-2 1,8xlOb 9, 6xl0"b 5,2 2,7 HE2B8-3 2,0xl0b 4, lxl0“b 2,0 1,1 HE2B8-4 1,7xlOb 1,lxlO-5 6,5 1,3 sh2B8-9 (Glm(17,1) 2,0xl0b 1,7xl0-b \—1 co 5, 3 sh2B8-12 (Glm(17,1) 1,9xlOb 2,3xl0“b 12 0,4

Estes dados mostram que os anticorpos humanizados possuem taxas de associação rápidas (ka), taxas de dissociação muito lentas (kd), e afinidades muito elevadas (KD). Em particular, os anticorpos possuem afinidades que variam de 2,0-12 pM.

Exemplo 16 - Comparação de Afinidades de Ligação a 25°C e 37°C

As afinidades de ligação e cinética de interacção do anticorpo HE2B8-4, sh2B8-9, sh2B8-12, e 2B8 de murino foram medidas por ressonância de plasmão de superfície sob diferentes condições.

As imunoglobulinas de murganho anti-imunoglobulinas humanas (Jackson Labs, N° de Catálogo 209-005) ou anti-imunoglobulinas de murganho de coelho (BIAcore, N° de Catálogo BR-1005-14) foram imobilizadas em chips sensores de CM4 em dextrano carboximetilado (BIAcore, N° de Catálogo BR- 159 ΕΡ2027156Β9 1006-68) por acoplamento de aminas (BIAcore, N° de Catálogo BR-1000-50) utilizando um protocolo de acoplamento convencional de acordo com instruções do fabricante. Não caso de medições a 25°C para sh2b8-9 e sh2B8-12, foi utilizado um chip sensor CM5 (BIAcore, N° de Catálogo BR-1006-68) . As análises foram efectuadas a 25°C e 37 °C utilizando PBS (GIBCO, N° de Catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensioactivo P20 (BIAcore, N° de Catálogo BR-1000-54), e 2 mg/mL BSA (EMD, N° de Catálogo 2930) como tampão de migração.

Os anticorpos foram capturados numa célula de fluxo individual a uma taxa de fluxo de 10 pL/min. O tempo de injecção foi variável para cada anticorpo para produzir aproximadamente 20 RU de anticorpo capturado para cada ciclo. Tampão ou HGF (R&D Systems, N° de Catálogo 294-HGN-025) diluídos em tampão de migração foi injectado sequencialmente numa superfície de referência (no anticorpo capturado) e a superfície activa (anticorpo a ser testado) durante 2 minutos a 60 pL/min. A fase de dissociação foi monitorizada durante 15 ou 90 minutos, dependendo da concentração. A superfície de chips sensores de anti-imunoglobulinas humanas de murganho foi então regenerada com 10 mM de Glicina-HCl, pH 2,2 (BIAcore, N° de Catálogo BR-1003-54) injectada durante 3 minutos a uma taxa de fluxo de 60 pL/min antes de se ter iniciado outro ciclo. A superfície de chips sensores anti-imunoglobulinas de murganho de coelho foi regenerado com 10 mM de Glicina-HCl, pH 1,7 (BIAcore, N° de Catálogo BR-1003-54) injectada durante 3 minutos a uma taxa de fluxo de 60 pL/min antes que outro ciclo fosse iniciado. As concentrações de HGF testadas foram de 0,46 nM a 7,5 nM. 160 ΕΡ2027156Β9

Os parâmetros cinéticos foram determinados utilizando a função cinética do programa de computador BIAevaluation com subtracção da referência. Os parâmetros para cada anticorpo, ka (constante de taxa de associação), kd (constante de taxa de dissociação) e KD (constante de equilíbrio de dissociação) são resumidos a seguir na Tabela 19. TABELA 19

Anticorpo Temp. (°C) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (pM) 2B8 25 1,6xlOb 2, lxlO-5 13,5 2B8 37 2,8xlOfe 1,3xl0-5 4,5 HE2B8-4 25 2,OxlOb 1,2xl0"b LO HE2B8-4 37 3,lxlOb 1, OxlO"b 3,3 sh2B8-9 25 2,OxlOb 1, 7xl0"b \—1 co (Glm (3)) 2,5xlOb 1, 4xl0"b 00 LO sh2B8-12 (Glm(17,1)) 25 1,9xlOb 2,3xl0"b 12,0 sh2BS-12 37 2,4xlOb 1, lxlO'b CO

Como esperado, as constantes de taxa de associação aumentaram com um aumento na temperatura. Surpreendentemente, as constantes de dissociação não se alteram significativamente com um correspondente aumento na temperatura. Consequentemente, as constantes de dissociação (KD) de equilíbrio globais foram de aproximadamente 1,4 a 3 vezes inferiores (maior afinidade) à temperatura fisiológica (37°C) . 161 ΕΡ2027156Β9

Exemplo 17 - Actividade de Neutralização das Variantes 2B8 Humanizadas

Os anticorpos descritos no Exemplo 14 foram caracterizado quanto à sua capacidade de (a) inibirem a ligação de hHGF a c-Met, e (b) inibirem incorporação de BedU estimulada por HGF em células 4MBr-5. 0 Ensaio de Inibição da Ligação HGF-Met (Ensaio de Neutralização) foi realizado como descrito como se segue. Os anticorpos foram testados por ELISA quanto à sua capacidade para inibir a ligação de HGF a c-Met. Especificamente, as placas de ensaio Wallac de 96-poços DELFIA (Wallac Inc., N° de Catálogo AAAND-0001) foram revestidas com 100 pL de 6,25 pg/mL de HGF (R&D Systems, N° de Catálogo 294-HGN-025) em tampão de revestimento de carbonato (15 mM de Nâ2C03 e 34 mM NaHC03, pH 9,0) durante 16 horas a 4°C. As placas foram depois bloqueadas com 200 pL de 5% leite magro em pó em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente. Os anticorpos foram preparados numa placa separada por adição de concentrações crescentes dos anticorpos sob investigação (0,033-250 nM, diluição seriada de 2 vezes) a 2 nM de c-Met biotinilada em 5% de leite magro em pó em PBS. c-Met (R&D Systems, N° de Catálogo 358-MT/CF) é biotinilado de acordo com as instruções do fabricante de uma proporção 10:1 de biotina para c-Met (Pierce, N° de Catálogo 21335) . 100 pL de amostra por poço foram transferidos para a placa do ensaio e incubados durante 2 horas à temperatura ambiente. As placas resultantes foram lavadas três vezes com PBS-0,1% de Tween 20, e incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com Estreptavidina marcada com EU (Wallac, N° de Catálogo 1244-360) diluída 1:1000 em tampão de ensaio DELFIA (Wallac, N° de Catálogo 162 ΕΡ2027156Β9 4002-0010) . As placas resultantes foram lavadas 3 vezes com solução de lavagem DELFIA (Wallac, N° de Catálogo 4010-0010) e incubadas com 100 yL/poço de solução de melhoramento DELFIA (Wallac #4001-0010) durante 15 minutos à temperatura ambiente com agitação. As placas foram lidas num instrumento Victor3V (Perkin Elmer) utilizando o método de Europium. Os valores de IC50 foram calculados utilizando Prism.

Os valores de IC50 obtidos são apresentados na Tabela 20. TABELA 20

Anticorpo IC50 (nM) DP 2B8 9,2 1,2 HE2B8-1 6,0 1,2 HE2B8-2 5,7 1,1 HE2B8-3 5,9 1,1 HE2B8-4 6,5 1,2 sh2B8-9 (Glm(3)) 4,2 - sh2B8-12 (Glm(3)) 6,8 -

Estes resultados da Tabela 20 demonstram que os anticorpos humanizados testados neutralizam eficientemente ligação de HGF a c-Met.

Os anticorpos na Tabela 17 foram também testados no ensaio de proliferação celular descrito no Exemplo 7(b). Os resultados são resumidos a seguir na Tabela 21. 163 ΕΡ2027156Β9 TABELA 21

Anticorpo IC5o (nM) DP 2B8 0,86 0,35 HE2B8-1 0,47 0,15 HE2B8-2 0,66 0,13 HE2B8-3 0,55 0,28 HE2B8-4 0,58 0,26 sh2B8-9 (Glm(3)) 0,52 0,11 sh2B8-12 (Glm(3)) 0,81 0,22

Os resultados da Tabela 21 demonstram que todos os anticorpos humanizados testados inibem proliferação induzida por HGF de células 4MBr-5.

Exemplo 18 - Actividade Anti-Espalhamento das Variantes 2B8 Humanizadaas

Os anticorpos na Tabela 17 foram testados no ensaio anti-disseminação descrita no Exemplo 8. Os resultados são resumidos a seguir na Tabela 22. TABELA 22

Inibição de Espalhamento de Células MDCK Induzidas por HGF Anticorpo Ensaio 1 Ensaio 2 2B8 ++ ++ HE2B8-1 ++ ++ HE2B8-2 ++ ++ HE2B8-3 ++ ++ HE2B8-4 ++ ++ sh2B8-9 (Glm(3)) ++ ++ 164 ΕΡ2027156Β9 sh2B8-12 (Glm(3)) ++ ++ - Sem Inibição +++ Muito forte, inibição quase completo ++ Forte inibição + Inibição Detectável

Os resultados na Tabela 22 demonstram que todos os anticorpos humanizados testados inibiram a disseminação induzida por HGF na mesma extensão do anticorpo monoclonal de murino 2B8.

Exemplo 19 - Inibição de Fosforilação de c-Met estimulada por HGF

Os anticorpos na Tabela 17 foram testados no ensaio de fosforilação de c-Met descrito no Exemplo 9. Os resultados são resumidos a seguir na Tabela 23. TABELA 23

Anticorpo Média de dois ensaios Desvio padrão 2B8 0,91 0,02 he2B8-l 0,80 0,04 he2B8-2 0,88 0,15 he2B8-3 0,79 0,05 he2B8-4 0,75 0,14 sh2B8-9 (Glm(3)) 0, 93 0,03 sh2B8-12 (Glm(3)) 0,81 0,07

Os resultados na Tabela 23 demonstram que todos os anticorpos humanizados testados são potentes inibidores de fosforilação de c-Met induzida por HGF em células PC-3. 165 ΕΡ2027156Β9

Exemplo 20 - Inibição de Tumor no Modelo de Xenoenxerto U87MG A capacidade dos anticorpos monoclonais humanizados da invenção para inibir o crescimento de tumor foi testada num modelo de xenoenxerto U87MG. As células U87MG células (ATCC) foram expandidas em cultura a 37 °C numa atmosfera contendo 5% de C02 e 95% de ar, utilizando um meio compreendendo meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% soro fetal de bovino, 100 unidades/mL de penicilina e 100 pg/mL de estreptomicina. As células foram subcultivadas e mantidas por descolamento das células da parede da placa de cultura utilizando tripsina-EDTA.

As células quase confluentes foram recolhidas por tripsinização e depois 5 xlO6 células em Matrigel a 50% (BD Biosciences; catálogo n° 356237) foram injectadas subcutaneamente na área dorsal superior entre as omoplatas de murganhos SCID ICR fêmeas de 7 semanas de idade (Taconic Labs). Os diâmetros longos (L) e curtos (W) (mm) de tumores foram medidos com um compasso de calibre. O volume de tumor (vol.) foi calculado como: volume (mm3) = L x W2/2. Quando os tumores cresceram para aproximadamente 200 mm3, os murganhos portadores de tumor foram distribuídos aleatoriamente em 5 grupos de 10 murganhos cada. Um grupo recebeu PBS e um grupo recebeu IgG humana de controlo. Cada um dos outros 4 grupos recebeu um dos anticorpos humanizados (HE2B8-1, HE2B8-2, HE2B8-3, e HE2B8-4) . Todos os anticorpos foram doseados a 0,25 mg/kg de peso corporal, duas vezes por semana, por injecções intraperitoneais de 5 doses. Os volumes de tumor e pesos corporais dos murganhos foram registados duas vezes por semana. A inibição de crescimento de tumor foi analisada utilizando o teste T de Student. 166 ΕΡ2027156Β9

Os anticorpos humanizados testados foram activos in vivo. Verificou-se 57% de inibição de crescimento de tumor para HE2B8-1 com um valor de p de 0,02, 61% de inibição de crescimento de tumor para HE2B8-2 com um valor de p de 0,02, 85% de inibição de crescimento de tumor para HE2B8-3, com um valor de p de 0, 0004, e 74% de inibição de crescimento de tumor para HE2B8-4 com um valor de p de 0,001. Não foi observada perda de peso corporal significativa.

Um estudo subsequente foi realizado como descrito acima em murganhos sem pelo NCR fêmea (Taconic Labs) portadores de tumores subcutâneos U87MG inoculados no flanco. Cada grupo (10 murganhos cada) recebeu um dos seguintes tratamentos a 0,5 mg/kg: PBS veículo de controlo, hulgG de controlo, HE2B8-4, ou sh2B8-9. O tratamento foi administrado de modo intra-peritoneal duas vezes por semana durante um mínimo de 5 semanas. Cada grupo de tratamento demonstrou regressão de tumor semelhante com inibição de crescimento de tumor de 113% para sh2B8-9 e 115% para HE2B8-4, e um retardamento de crescimento de tumor mínimo de 30 dias. Ambos os tratamentos foram bem tolerados sem perda de peso corporal significativo.

Lisboa, 11 de Abril de 2011 167

Claims (21)

1. ΕΡ2027156Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína de ligação isolada que se liga ao factor de crescimento de hepatócitos humanos (HGF), compreendendo: (a) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a estrutura CDRHi-CDRH2-CDRH3j em que (i) CDRHi compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 15, (ii) CDRH2 compreende uma sequência de aminoácidos seleccionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID N° 204 e SEQ ID N° 205, e (iii) CDRH3 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 17, e (b) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a estrutura CDRli-CDRL2-CDRL3, em que (i) CDRl1 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 18, (ii) CDRl2 compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID N° 19 e SEQ ID N° 206, e (iii) CDRl3 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 20, em que a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina e a região variável de 1 ΕΡ2027156Β1 cadeia leve de imunoglobulina definem em conjunto um sitio de ligação único para ligação de HFG humano.
2. 2. Proteína de ligação da reivindicação 1, em que a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende a estrutura CDRHi-CDRh2-CDRh3, em que (i) CDRhi compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 15, (ii) CDRH2 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 205, e (iii) CDRh3 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 17, e a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende a estrutura CDRLi-CDRL2-CDRL3, em que (i) CDRli compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 18, (ii) CDRl2 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 206, e (iii) CDRl3 compreende sequência de aminoácidos SEQ ID N° 20.
3. 3. Proteína de ligação da reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que regiões determinantes de complementaridade (CDRs) 2 ΕΡ2027156Β1 são interpostas entre regiões de estrutura de imunoglobulina humana ou humanizada.
4. 4. Proteína de ligação de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a proteína de ligação é um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio.
5. 5. Proteína de ligação da reivindicação 4, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
6. 6. Ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina de qualquer uma das reivindicações 2-5.
7. 7. Ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de qualquer uma das reivindicações 1-5.
8. 8. Vector de expressão compreendendo a sequência de ácido nucleico da reivindicação 6 e/ou reivindicação 7.
9. 9. Célula hospedeira compreendendo, pelo menos, um vector de expressão que codifica uma região variável de cadeia pesada e/ou leve de imunoglobulina de qualquer uma das reivindicações 2-5.
10. 10. Método de produzir um polipéptido compreendendo uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo o método: (i) crescimento da célula hospedeira da reivindicação 9 sob condições em que a célula hospedeira expressa o polipéptido compreendendo a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina; e 3 ΕΡ2027156Β1 (ii) purificação do polipéptido compreendendo a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina.
11. 11. Método de produzir um polipéptido compreendendo uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina, compreendendo o método: (i) crescimento da célula hospedeira da reivindicação 9 sob condições em que a célula hospedeira expressa o polipéptido compreendendo a região variável da cadeia leve de imunoglobulina; e (ii) purificação o polipéptido compreendendo a região variável da cadeia leve de imunoglobulina.
12. 12. Proteína de ligação isolada de qualquer uma das reivindicações 1-5, em que a proteína de ligação se liga ao factor de crescimento de hepatócitos humanos com um kd de 4,0xl0"5 s-1 ou inferior.
13. 13. Proteína de ligação isolada de qualquer uma das reivindicações 1-5, em que a proteína de ligação se liga ao factor de crescimento de hepatócitos humanos com um KD de 20 pM ou inferior.
14. 14. Proteína de ligação da reivindicação 1 que se liga ao factor de crescimento de hepatócitos humanos (HGF) compreendendo uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina seleccionada a partir do grupo consistindo em: (a) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 4 ΕΡ2027156Β1 193, e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 183; (b) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 193, e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 189; (c) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 199, e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 183; e (d) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 199, e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 189.
15. 15. Proteína de ligação da reivindicação 14, em que a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°199, e a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 189.
16. 16. Proteína de ligação da reivindicação 1 que se liga ao factor de crescimento de hepatócitos humanos (HGF) compreendendo uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina 5 ΕΡ2027156Β1 e sequência de cadeia pesada de imunoglobulina seleccionada a partir do grupo consistindo em: (a) uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 197, e sequência de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 187; (b) uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 197, e sequência de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 191; (c) uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 201, e sequência de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 187; e (d) uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 201, e sequência de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 191.
17. 17. Proteína de ligação da reivindicação 16, em que a cadeia leve de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 201, e a cadeia pesada de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 191. ΕΡ2027156Β1
18. 18. Proteína de ligação de qualquer uma das reivindicações 1-5 ou 14-17 para utilização em terapia.
19. 19. Proteína de ligação de qualquer uma das reivindicações 1-5 ou 14-17 para utilização em inibição ou redução da proliferação de uma célula de tumor.
20. 20. Proteína de ligação de qualquer uma das reivindicações 1-5 ou 14-17 para utilização em inibição ou redução do crescimento de tumor num mamífero.
21. 21. Método de produzir a proteína de ligação que se liga ao factor de crescimento de hepatócitos humanos (HGF), que é um anticorpo intacto, tal como um anticorpo monoclonal, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, compreendendo o método: (i) crescimento da célula hospedeira da reivindicação 9 sob condições em que a célula hospedeira expressa um polipéptido compreendendo a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina e um polipéptido compreendendo a região variável da cadeia leve de imunoglobulina; e (ii) purificação do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antigénio do anticorpo. Lisboa, 11 de Abril de 2011 7