JP2023515010A - 免疫原性細胞死を促進するためのｍｉＲＮＡ－１９３ａ - Google Patents

免疫原性細胞死を促進するためのｍｉＲＮＡ－１９３ａ Download PDF

Info

Publication number
JP2023515010A
JP2023515010A JP2022549305A JP2022549305A JP2023515010A JP 2023515010 A JP2023515010 A JP 2023515010A JP 2022549305 A JP2022549305 A JP 2022549305A JP 2022549305 A JP2022549305 A JP 2022549305A JP 2023515010 A JP2023515010 A JP 2023515010A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
mirna
cancer
cells
use according
preferred
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022549305A
Other languages
English (en)
Inventor
サナズ イェヒェネジャド，
ブライオニー テルフォード，
デン ボシュ， マリオン ファン
ミール ファルシード アレムデイ，
ガンスト， マテウス マリア デ
ピンクステレン， ローレンス アドリアヌス ヘンドリクス ファン
ルーラント クイリーヌス ジョゼフ シャープフェルト，
ミシェル ジャニコ，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Interna Technologies BV
Original Assignee
Interna Technologies BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/EP2020/055965 external-priority patent/WO2021028081A1/en
Application filed by Interna Technologies BV filed Critical Interna Technologies BV
Publication of JP2023515010A publication Critical patent/JP2023515010A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs

Abstract

本発明は遺伝子発現を調節するためのｍｉＲＮＡ－１９３ａの使用に関し、特にそれはＣＲＴの細胞表面発現を促進するＣＲＴアゴニストとしてのｍｉＲＮＡ－１９３ａの使用に関する。これは、ＣＲＴの低い表面発現の有る無しでがんの有利な処置を可能にする。本発明は、そのような処置において使用するためのｍｉＲＮＡを含む組成物にさらに関する。【選択図】 なし

Description

［発明の分野］
本発明は遺伝子発現を調節するためのｍｉＲＮＡ－１９３ａの使用に関し、特にそれはがん細胞で免疫原性細胞死を達成する手段としてのｍｉＲＮＡ－１９３ａの使用に関する。これは、様々ながん型、特にカルレティキュリンの発現が低いがんの有利な処置を可能にする。本発明は、そのような状態を処置することにおいて使用するためのｍｉＲＮＡを含む組成物にさらに関する。
［背景技術］
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、標的ｍＲＮＡにおける相補的配列に結合し、それによって、翻訳を阻害するか又はｍＲＮＡ分解を誘導することによって遺伝子発現を制御する、天然に存在する、一本鎖の低分子非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、近年、発生中の遺伝子発現の重要な調節因子として出現し、ヒトの疾患状態、例えばがんにおいて誤って発現される頻度が高い。実際に、ｍｉＲＮＡは、特定のがん遺伝子をサイレンシングさせるために使用することができる。いくつかのｍｉＲＮＡは、がんの有効なモジュレーターであると報告されている。例えば、ｍｉＲＮＡ－１９３ａは黒色腫の処置で有効であると記載されている（ＷＯ２０１２００５５７２）。
免疫原性細胞死（ＩＣＤ）は、死細胞関連の抗原に対して適応性免疫系を活性化する、調節された細胞死の特異なクラスである。したがって、ＩＣＤは抗原特異的免疫応答を導き出すことが可能である（Ｇａｌｌｕｚｚｉ、Ｌｏｒｅｎｚｏ及びＩｌｉｏ Ｖｉｔａｌｅ。２０１８年。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ：Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ２０１８年」、４８６～５４１頁；及びＫｒｏｅｍｅｒ、Ｇｕｉｄｏ、Ｌｏｒｅｎｚｏ Ｇａｌｌｕｚｚｉ、Ｏｌｉｖｅｒ Ｋｅｐｐ及びＬａｕｒｅｎｃｅ Ｚｉｔｖｏｇｅｌ。２０１３年。「Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」を参照する。）瀕死の細胞に対して適応性免疫応答を促すことにおけるＩＣＤの可能性を考慮すると、腫瘍細胞でのＩＣＤの誘導は強化された抗腫瘍免疫細胞媒介細胞傷害性に、及びより重要なことに腫瘍抗原に対する免疫学的記憶の形成に最終的に達する。したがって、腫瘍細胞におけるＩＣＤ誘導は、抗腫瘍免疫を活性化する強力な免疫療法アプローチと考えられている（Ｏｂｅｉｄ、Ｍｉｃｈｅｌ、Ａｎｔｏｉｎｅ Ｔｅｓｎｉｅｒｅら。２００７年。「Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ Ｅｘｐｏｓｕｒｅ Ｄｉｃｔａｔｅｓ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ」１３（１）：５４～６１頁；及びＰａｌｕｃｋａ、Ｋａｒｏｌｉｎａ及びＪａｃｑｕｅｓ Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ。２０１２年。「ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃ Ａｃｃｅｓｓ。」Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ １２（４）：２６５～７７頁を参照）。
ＩＣＤは傷害関連の分子パターン（ＤＡＭＰ）として知られる一連の免疫原性分子パターンと関連している。ＤＡＭＰは、生前の小胞体ストレス及び自己貪食の結果として分泌、放出又は表面曝露される分子である。これらの分子は、免疫系を活性化するアジュバント又は危険性シグナルとして次に機能することができる。ＤＡＭＰには、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）（ＨＳＰ７０及びＨＳＰ９０を含む）及びシャペロンカルレティキュリン（ＣＲＴ）の原形質膜の外部表面への転位、並びに高移動性群ボックス１タンパク質（ＨＭＧＢ１）及びアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を含む可溶性媒介物の放出が含まれる（Ｋｒｙｓｋｏ、Ｄｍｉｔｒｉ Ｖ、Ａｂｈｉｓｈｅｋ Ｄ Ｇａｒｇら、２０１２年。Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ １２（１２）：８６０～７５頁；Ｃａｓａｒｅｓ、Ｎｏｅｌｉａ、Ｍａｒｉｅ Ｏ Ｐｅｑｕｉｇｎｏｔら、２００５年。「Ｃａｓｐａｓｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ」２０２（１２）を参照）。ＣＲＴ、ＡＴＰ及びＨＭＧＢ１は樹状細胞（ＤＣ）受容体ＣＤ９１、Ｐ２ＲＸ７及びＴＬＲ４にそれぞれ結合する。これらの結合は、ＤＣの成熟、腫瘍微小環境への成熟ＤＣの動員（ＡＴＰによって刺激される）、ＤＣによる腫瘍抗原の貪食（ＣＲＴによって刺激される）、及びＴ細胞の増殖及び活性化につながるＴ細胞への腫瘍細胞関連抗原の最適な抗原提示（ＨＭＧＢ１によって刺激される）を促進する。全体として、これらのプロセスは細胞傷害性Ｔ細胞を含む強力な抗腫瘍免疫応答をもたらす（上で引用したＫｒｏｅｍｅｒら、を参照する）。
ＤＮＡアルキル化剤シクロホスファミド、アントラサイクリンドキソルビシン及びミトキサントロン、並びにプラチナ誘導体オキサリプラチンを限定されずに含む選択された承認済み化学療法剤は、ＩＣＤを誘発する、したがって抗がん免疫応答を活性化する能力を有する。これらの薬物は、***及び卵巣、結腸直腸及び前立腺がん並びに骨髄性及びリンパ性白血病を含む異なる種類の血液学的及び固形悪性腫瘍を処置するために使用される（Ｖａｃｃｈｅｌｌｉ、Ｅｒｉｋａ、Ｌａｕｒａ Ｓｅｎｏｖｉｌｌａら、２０１３年。「Ｔｒｉａｌ Ｗａｔｃｈ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｉｎｄｕｃｅｒｓ Ｔｒｉａｌ Ｗａｔｃｈ。」；及びＧａｒｇ、Ａｂｈｉｓｈｅｋ Ｄ、Ｓａｎｋｅｔ Ｍｏｒｅら、「Ｔｒｉａｌ Ｗａｔｃｈ：Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」６（１２）：１～１８頁を参照。）さらに、免疫原性を導き出すことにおける従来の化学療法の適応外の可能性を調査するいくつかの継続中の臨床試験がある（Ｓｈｏｗａｌｔｅｒ、Ａｎｎｅ、Ａｒａｔｉ Ｌｉｍａｙｅら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９７（５月）：１２３～３２頁を参照。）しかし、限られた数の細胞死インデューサーだけが本物のＩＣＤを導き出すことができ、この能力は構造的又は機能的類似性に基づいて予測することができない（上で引用したＧａｒｇら、を参照する）。
ＩＣＤを引き起こす特異的刺激の能力を評価するアプローチは、ワクチン接種実験に依存する。この設定では、免疫適格マウスは死同系腫瘍細胞でワクチン接種され、選択の細胞傷害剤によってｉｎ ｖｉｔｒｏで殺される。後に、ワクチン接種をされたマウスは同じ種類の生きている腫瘍細胞で抗原投与される。腫瘍を生じないマウスの割合は、評価する細胞傷害剤によって誘導される細胞死の免疫原性の程度を反映する。それらはＩＣＤの検出のための一般的アプローチを構成するが、免疫適格マウス及び同系がん細胞に依存するワクチン接種アッセイは大きなスクリーニングと本質的に相容れない。この問題を回避し、ＩＣＤ誘導のための異なる細胞傷害剤の速い能力評価を可能にするために、１つ又は複数のＩＣＤ発現の検出を可能にする様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ技術が開発されている。それらには、細胞表面ＣＲＴ曝露、ＡＴＰ分泌及びＨＭＧＢ１放出を含む代わりのＩＣＤバイオマーカーを検出する方法が含まれる（Ｋｅｐｐ、Ｏｌｉｖｅｒ、Ｌａｕｒａ Ｓｅｎｏｖｉｌｌａ、Ｉｌｉｏ Ｖｉｔａｌｅら、２０１４年。「Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ。」を参照）
カルレティキュリン（ＣＲＴ）は、通常小胞体の内腔に存在するが、がん細胞の表面に曝露されることがあるタンパク質である（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２０１０年、ＤＯＩ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－０９－２８９１）。それは汎用性バイオマーカーでなく、全てのがんがそれらの表面でカルレティキュリンを発現するとは限らない。例えば、Ｈａｒａｄａら（Ｏｎｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．２０１７年、ｄｏｉ：１０．３８９２／ｏｌ．２０１７年。６０６２）は、免疫組織化学によって決定したとき、１１１人の口扁平上皮癌（ＯＳＣＣ）患者からとられた組織試料で、ＣＲＴの高発現が４４人の患者（３９．６％）で観察されたが、低発現が６７人の患者（６０．４％）で観察されたことを見出した。ＣＲＴが低いがんは、全体的生存確率の増加と関連することが報告された（Ｈａｒａｄａ、上記参照）。
ＣＲＴ発現の低いがんは、既存の抗がん療法の免疫介在性成分に難治性である。アントラサイクリンなどの化学療法薬によって導き出されるとき、ＣＲＴの曝露経路は、アポトーシス前小胞体（ＥＲ）ストレス及び真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ２αのキナーゼＰＥＲＫによるリン酸化によって、続いてＥＲ固着性タンパク質ＢＡＰ３１のカスパーゼ８媒介タンパク質分解、アポトーシス促進タンパク質Ｂａｘ及びＢａｋの活性化、ＥＲからゴルジ装置へのＣＲＴの前方輸送、並びにＣＲＴ含有小胞のエキソサイトーシスによって活性化され、最後に原形質膜表面へのＣＲＴ転位をもたらす。この複雑な経路の中断はＣＲＴ曝露を撤廃し、それはアポトーシスの免疫原性を消滅させる。
ホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）は４７ｋＤａタンパク質であり、１９９７年に、広範囲の腫瘍型で損失を示すことが知られている染色体１０ｑ２３の領域からのそのポジショナルクローニングの後にがん抑制遺伝子候補として最初に特定された。それ以来、ＰＴＥＮの変異が、***、甲状腺、神経膠芽腫、子宮内膜及び前立腺がん及び黒色腫を含む様々なヒトがんで検出されている。この遺伝子では継承した変異は、キャリアーがカウデン病、遺伝性のがんリスク症候群及びいくつかの関連した状態を起こす素因にもなる。ＰＴＥＮは、様々ながんでその活性が欠失、変異によって、又は後成変化を通して失われるので、がん抑制因子と分類される。ＰＴＥＮの分子機構の研究は、腫瘍抑制におけるその関与の根拠への洞察を提供した。ＰＴＥＮタンパク質は、タンパク質ホスファターゼ及び脂質ホスファターゼ活性の両方を有する。ＰＴＥＮの腫瘍抑制機能はその脂質ホスファターゼ活性に主に帰されているが、細胞周期調節及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞侵入の阻害におけるＰＴＥＮタンパク質ホスファターゼ活性の役割も示唆されている。ＰＴＥＮ機能の損失は、ＰＴＥＮ欠損黒色腫の表現型形質の多くの原因であるようであり、したがって、ＰＴＥＮは薬物開発の潜在的標的の役割をすることができる。ＰＴＥＮの変異が最小限の作用を及ぼすときでも、それは他の遺伝子変化との関連で腫瘍形成にしばしば寄与する（Ａｇｕｉｓｓａ－Ｔｏｕｒｅら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ６９：１４７５～１４９１頁（２０１２年））。
ＰＴＥＮアゴニストは当技術分野で公知であり、がんの処置におけるそれらの使用が記載されている（ＷＯ２００９１２６８４２）。それらの活性は、ｍＴＯＲの阻害から生じることができる。既知のＰＴＥＮアゴニストには、ラパマイシン（シロリムス）及びその化学的類似体、例えばＣＣＩ－７７９（テムシロリムス）及びＲＡＤ－００１（エベロリムス）が含まれる。多くのＰＴＥＮアゴニストは小分子である（すなわち、比較的低い分子量、多くの場合５００又は６００ｋＤａ未満、又はラパマイシンなどのマクロライドの場合約１０００ｋＤａ未満を有する化合物）。他のアゴニストには、ＰＴＥＮに結合してその転写を活性化するように工学操作された、モノクローナル抗体、及びジンクフィンガータンパク質又はそれをコードする核酸が含まれる（国際公開第００／００３８８号を参照する）。他のＰＴＥＮアゴニストは、米国特許出願公開第２００７０２８０９１８号に記載される。ヒトＰＴＥＮ及びｍＴＯＲ（ＦＲＡＰｌ）の例示的な配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ６０４８４及びＰ４２３４５が割り当てられる。
ＰＴＥＮアゴニストの欠点は、それらがいくつかの有害作用と関連していることである。例えば、ＰＴＥＮアゴニストシロリムスは、末梢水腫、高コレステロール血症、腹痛、頭痛、吐き気、下痢、疼痛、便秘、高トリグリセリド血症、高血圧、クレアチニン上昇、発熱、***症、貧血、関節痛及び血小板減少に加えて糖尿病様症状、及びＵＶ照射曝露から皮膚がんになるリスクの増加でさえと同じくらい多様な作用と一般的に（３０％を超える発生率）関連する（「Ｒａｐａｍｕｎｅ Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、Ｗｙｅｔｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、２０１５年５月、を参照する）。ＰＴＥＮアゴニストテムシロリムスは、疲労、皮膚発疹、粘膜炎、ヘモグロビン減少及びリンパ球減少と関連している（Ｂｅｌｌｍｕｎｔら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２００８年ＤＯＩ：１０．１０９３／ａｎｎｏｎｃ／ｍｄｎ０６６）。
したがって、がん細胞の細胞表面でＣＲＴの発現又は提示を増加させるための代替の及び向上したＣＲＴアゴニスト又は方法への継続した必要性がある。代替の及び向上したＰＴＥＮアゴニストへの継続した必要性がある。腫瘍に対するマイクロＲＮＡ療法を改善するための継続的な必要性、及び処置に関する新たな戦略を切り開くことができる、腫瘍のマイクロＲＮＡ処置へのより深い推定機構のための継続的な必要性が存在する。障害のある免疫原性細胞死経路を回復するための、及びがん細胞の免疫原性細胞死を促進するための手段への継続した必要性がある。
［発明の概要］
本発明は、カルレティキュリン（ＣＲＴ）の低発現と関連する状態を処置することにおける使用のための、ｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はそのソースを提供する。好ましくは、ｍｉＲＮＡ－１９３ａはＣＲＴアゴニストである。好ましくは、ｍｉＲＮＡ－１９３ａはｍｉＲＮＡ－１９３ａ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はその模倣体であり、ここで、それは好ましくは配列番号２２で表されるシード配列の７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含むシード配列を有するオリゴヌクレオチドである。好ましくは、ｍｉＲＮＡのソースが、ｍｉＲＮＡの前駆体であり、少なくとも５０ヌクレオチド長の核酸である。好ましくは、前記ｍｉＲＮＡは配列番号５６、１２１又は１２２のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有し、及び／又は前記ｍｉＲＮＡが、１５～３０ヌクレオチド長であり、及び／又はｍｉＲＮＡの前記ソースは前記ｍｉＲＮＡの前駆体であり、配列番号５又は１３のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有する。好ましくは、低いＣＲＴ発現と関連する状態は、低ＣＲＴがんである。好ましくは、低ＣＲＴがんは、低ＣＲＴ肉腫、脳がん、頭頸部がん、乳がん、肺がん、腎臓がん、肝がん、結腸がん、卵巣がん、黒色腫、膵がん、甲状腺がん、過誤腫、造血器腫及びリンパ系腫瘍の腫瘍又は前立腺がんである。好ましくは、ｍｉＲＮＡ－１９３ａは、ＣＲＴ、ＨＭＧＢ１、ＲＰＳ６ＫＢ２、ＫＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＢ、ＳＯＳ２、ＴＧＦＢＲ３、ＣＡＳＰ９、ＩＮＰＰＬ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＫ２、ＣＢＬ、ＰＤＰＫ１、ＣＣＮＤ１、ＢＣＡＲ１、ＭＡＧＩ３、ＭＤＭ２、ＹＷＨＡＺ及びＭＣＬ１からなる群から、好ましくは、ＲＰＳ６ＫＢ２、ＫＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＢ、ＣＡＳＰ９、ＩＮＰＰＬ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＫ２、ＣＢＬ、ＰＤＰＫ１、ＣＣＮＤ１、ＢＣＡＲ１、ＭＡＧＩ３、ＭＤＭ２、ＹＷＨＡＺ、ＭＣＬ１からなる群から選択される、より好ましくはＰＤＰＫ１又はＩＮＰＰＬ１から選択される遺伝子の発現をモジュレートする。
本発明は、上で定義された使用のための、上で定義されたｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はそのソースを含む組成物をさらに提供する。好ましくは、組成物は、さらなるｍｉＲＮＡ又はその前駆体をさらに含み、ここで、さらなるｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ－３２３、ｍｉＲＮＡ－３４２、ｍｉＲＮＡ－５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ－５２０ｆ－ｉ３、ｍｉＲＮＡ－３１５７及びｍｉＲＮＡ－７又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体からなる群から選択される。それは好ましくは、ＰＰ２Ａメチル化剤、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の阻害剤、抗体、ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＯＸ４０の結合剤などのＴ細胞副刺激分子の結合剤、及び化学療法剤からなる群から好ましくは選択される、追加の薬学的に活性な化合物をさらに含む。
本発明は、上で定義された使用のためのナノ粒子組成物をさらに提供し、ナノ粒子は、ジアミノ脂質及び上で定義されたｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はそのソースを含み、ジアミノ脂質は一般式（Ｉ）
Figure 2023515010000001
（式中、
ｎは、０、１又は２であり、
Ｔ１、Ｔ２及びＴ３は、それぞれ独立して、任意選択で不飽和であり、０、１、２、３又は４つの置換基を有するＣ１０～Ｃ１８鎖であり、置換基は、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルケニル、及びＣ１～Ｃ４アルコキシからなる群から選択される）のものである。
好ましくは、ナノ粒子は、２０～６０モル％のジアミノ脂質、及び０～４０モル％のリン脂質、及び３０～７０モル％のステロール、及び０～１０モル％の水溶性ポリマー及び親油性アンカーのコンジュゲートを含む。
本発明は、ＣＲＴをアゴナイズするためのｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの方法も提供し、本方法は、細胞を上で定義されたｍｉＲＮＡ、又は上で定義された組成物と接触させるステップを含む。
本発明は、低ＣＲＴがんを処置するための方法も提供し、本方法は、対象に上で定義されたｍｉＲＮＡ－１９３ａ又は上で定義された組成物を投与するステップを含む。
［発明の概要］
［課題を解決するための手段］
驚くべきことに、本発明者らはｍｉＲＮＡ－１９３ａをＣＲＴアゴニストとして特定し、低いＣＲＴ発現と関連した疾患又は状態、特に低ＣＲＴ腫瘍を処置するためのｍｉＲＮＡ－１９３ａの使用を可能にした。したがって、本発明は、低いＣＲＴ発現と関連した状態を処置することにおける使用のための、ｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はそのソースを提供する。そのようなｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はそのソースは、以降で、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡ又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡ－１９３ａと呼ばれる。好ましくは、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、ＣＲＴアゴニストである。より好ましくは、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、カルレティキュリン曝露経路を増加させるか、活性化するか、誘導するか、促進するためのものである。
本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、ＰＢＭＣに、好ましくはＴ細胞に腫瘍細胞を感作させることにおいて使用するためのものであってもよく、それは好ましくは、ＰＢＭＣ又はＴ細胞の細胞毒性に腫瘍細胞を感作させることを含む。本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、ＰＢＭＣへの、好ましくはＴ細胞への腫瘍細胞の脆弱さを増加させることにおいて使用するためのものであってもよく、それは好ましくは、ＰＢＭＣ又はＴ細胞の細胞毒性への腫瘍細胞の脆弱さを増加させることを含む。好ましくは、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、トランスフェクトされた腫瘍細胞からのシグナルの放出を刺激するためのものであり、これらのシグナルは、ＰＢＭＣを、好ましくはＴ細胞を活性化することができる。シグナルの放出は、好ましくはＨＧＭＢ１の放出、ＡＴＰの放出、及び／又はカルレティキュリン（ＣＲＴ）の表面発現、より好ましくはＡＴＰの放出及びＣＲＴの表面発現、最も好ましくはＣＲＴの表面発現を含む。
本明細書で使用されるように、「ＣＲＴのアゴニスト」又は「ＣＲＴアゴニスト」は、細胞内でのＣＲＴ ｍＲＮＡの生成を刺激する薬剤、又は細胞表面でＣＲＴの所望の発現を刺激する薬剤、又はＣＲＴの表面提示のための欠陥のある経路を修復する薬剤、又は細胞内でのＣＲＴタンパク質の発現を刺激するか若しくはＣＲＴタンパク質の活性を刺激する薬剤、又は、例えば細胞表面でのＣＲＴの発現を調節することにおけるＣＲＴの機能の１つ又は複数を提供することができる薬剤を指す。好ましくは、ＣＲＴアゴニストは細胞でＣＲＴの表面提示若しくは表面発現を増加させるか、又はＣＲＴ表面発現経路を回復する。
本明細書で使用されるように、低ＣＲＴは、ＣＲＴ表面発現のレベルが低いがんを指す。例えば小胞体におけるＣＲＴレベルは正常であっても、又は低くても、又は高くてもよい。ＣＲＴ表面発現は、好ましくはＫｕｒａｍｉｔｓｕら（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１０年；３０：２０９３～２０９９頁）によって記載される方法によって決定される。簡潔には、がん性組織からのがん細胞におけるＣＲＴ染色の強度は、正常組織のそれと比較される。陽性細胞のパーセンテージは、０、０％免疫陽性細胞；１、＜５０％陽性細胞；２、≧５０％陽性細胞、にグレード分けされる。染色強度は、０、陰性；１、弱い；２、中等度；３、強い、にグレード分けされる。陽性細胞のパーセンテージ及び染色強度の割り当てられた値の合計は、免疫反応スコアとみなされる。０～２の間のスコアは低ＣＲＴとみなされ、３～５の間のスコアは高ＣＲＴとみなされる。ＣＲＴ発現の免疫反応性は、好ましくは複数の異なる顕微鏡専門家によって、又は自動画像認識ツールによって評価される。
ｍｉＲＮＡ、ｉｓｏｍｉＲ、模倣体又はそのソース
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、１７～２５ヌクレオチドの小さなＲＮＡであり、真核生物における遺伝子発現のレギュレーターとして機能する。ｍｉＲＮＡは、一次ｍｉＲＮＡ（プリ－ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる長い一次転写産物の一部として、核内で最初に発現される。核の内部では、プリ－ｍｉＲＮＡが、酵素Ｄｒｏｓｈａによって部分的に消化され、活性分子であるより短い成熟ｍｉＲＮＡへと、Ｄｉｃｅｒによってさらに処理するために細胞質へと輸送される、６５～１２０ヌクレオチド長のヘアピン前駆体ｍｉＲＮＡ（プリ－ｍｉＲＮＡ）を形成する。動物では、これらの短いＲＮＡは、５’の近位「シード」領域（一般的には、ヌクレオチド２～８）を含み、これは、ｍｉＲＮＡの、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）への対合特異性の主要な決定因子であると考えられる。
ｍｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ模倣体又はｍｉＲＮＡ ｉｓｏｍｉＲ又はそれらのいずれかのソースに関する以下に与えられる定義のそれぞれを、この出願において述べられている、特定されたｍｉＲＮＡ、分子若しくは模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲ又はそのソース：ｍｉＲＮＡ－１９３ａ、ｍｉＲＮＡ－３２３、ｍｉＲＮＡ－３４２、ｍｉＲＮＡ－５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ－５２０ｆ－ｉ３、ｍｉＲＮＡ－３１５７、及びｍｉＲＮＡ－７、若しくはｉｓｏｍｉＲ若しくは模倣体又はそのソースのそれぞれに対して使用するべきである。好ましい成熟配列（配列番号５１～５７）、シード配列（配列番号１７～５０、ここで、配列番号１７～２３は、カノニカルなｍｉＲＮＡのシード配列であり、配列番号２４～５０は、ｉｓｏｍｉＲに関するシード配列である）、ｉｓｏｍｉＲ配列（配列番号５８～１２５）、又は前記ｍｉＲＮＡ分子又はその模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲのソースの配列（配列番号１～８のようなＲＮＡ前駆体、又は配列番号９～１６のようなＲＮＡ前駆体をコードするＤＮＡ））は、それぞれ、配列表において特定される。
この本発明との関連で、ｍｉＲＮＡ－１９３ａはｍｉＲＮＡ－１９３ａ分子（すなわちカノニカルなオリゴヌクレオチド）、又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体を指す。好ましくは、ｍｉＲＮＡ－１９３ａはｍｉＲＮＡ－１９３ａ－３ｐ、より好ましくはｍｉＲＮＡ－１９３ａ－３ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はその模倣体であり、配列番号２２のシード配列に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、及びより好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド、又はそれ以上の長さを有する。ｍｉＲＮＡ－１９３ａ分子では（すなわちカノニカルなｍｉＲＮＡでは）、好ましいシード配列は配列番号２２である。ｍｉＲＮＡ－１９３ａのｉｓｏｍｉＲでは、好ましいシード配列は配列番号２２である。
ｍｉＲＮＡ－１９３ａの好ましい模倣体はセンス鎖及びアンチセンス鎖を有し、アンチセンス鎖は配列番号２２のシード配列に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、アンチセンス鎖は、好ましくは少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド、又はそれ以上の長さを有し、アンチセンス鎖は、好ましくは配列番号５６、１２１、１２２又は２１９、好ましくは５６又は２１９、より好ましくは２１９にわたって、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは配列番号１３１、１９６、１９７、２０６又は２１８、より好ましくは２１８にわたって、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド、又はそれ以上の長さを有する。
模倣体は、ｍｉＲＮＡ分子と類似するか又は同一の活性を有する分子である。この文脈では、類似する活性は、活性の許容されるレベルと同じ意味を与えられる。模倣体は、機能的決定において、ａｎｔａｇｏｍｉｒに対抗する。好ましい模倣体は、好ましくは、ロックド核酸モノマーなどの１つ若しくは複数のヌクレオチド類似体を含む合成オリゴヌクレオチド、並びに／又は足場修飾を含むヌクレオチド及び／若しくは塩基修飾を含むヌクレオチドである。模倣体は、ｍｉＲＮＡに関するか又はｉｓｏｍｉＲに関する模倣体であってもよい。好ましい模倣体は、ｍｉＲＮＡ又はｉｓｏｍｉＲの模倣体である。好ましい模倣体は、二本鎖模倣体である。
好ましい模倣体は、センス鎖（パッセンジャー鎖とも呼ばれる）及びアンチセンス鎖（ガイド鎖とも呼ばれる）を含む二重鎖オリゴヌクレオチドである。天然に存在するようなカノニカルなｍｉＲＮＡは、天然に存在する標的のセンス配列に対して相補的であるため、アンチセンス配列を有するものとして、本明細書において定義される。本発明による使用に対して好ましい模倣体である二重鎖模倣体において、一方がセンス鎖として設計され、もう一方がアンチセンス鎖として設計されている二本鎖が存在することになる。アンチセンス鎖は、ｍｉＲＮＡと、若しくはｍｉＲＮＡの前駆体と、若しくはｉｓｏｍｉＲと同じ配列を有してもよく、又はその断片と同じ配列を有するか、若しくは同じ配列を含むか、若しくはその断片と同じ配列を含んでもよい。センス鎖は、アンチセンス鎖に対して少なくとも部分的に逆相補的であり、二重鎖模倣体の形成を可能にする。センス鎖はそれ自体必ずしも生物学的に活性であるとは限らず、その重要な機能の１つはアンチセンス鎖を安定させること、又はその分解を阻止すること、又はその送達を促進することである。成熟ｍｉＲＮＡのセンス鎖の例は、配列番号１３１である。ｉｓｏｍｉＲのセンス鎖の例は、配列番号１９６又は１９７である。
ｍｉＲＮＡ－１９３ａの好ましい模倣体はセンス鎖及びアンチセンス鎖を有し、アンチセンス鎖は配列番号２２のシード配列に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、アンチセンス鎖は、好ましくは少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド、又はそれ以上の長さを有し、アンチセンス鎖は、好ましくは配列番号５６、１２１、１２２又は２１９、好ましくは５６、より好ましくは２１９にわたって、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは配列番号１３１、１９６、１９７、２０６又は２１８、より好ましくは２１８にわたって、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド、又はそれ以上の長さを有する。
好ましい実施形態では、アンチセンス鎖は、好ましくは、架橋核酸ヌクレオチド、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオシド、２’－Ｏ－アルキルヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオシド、２’－フルオロヌクレオシド、及び２’－アジドヌクレオシド、好ましくは２’－Ｏ－アルキルヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオシドからなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む。このような少なくとも１つの修飾ヌクレオシドによって、１番目若しくは最後のＲＮＡヌクレオシドが置き換えられるか、又は２番目若しくは最後から２番目のＲＮＡヌクレオシドが置き換えられることが好ましい。好ましい実施形態では、少なくとも２つの修飾ヌクレオシドによって、最初の２つの又は最後の２つのＲＮＡヌクレオシドが置き換えられる。より好ましくは、１番目と最後のＲＮＡヌクレオシドの両方が置き換えられ、さらにより好ましくは、最初の２つと最後の２つの両方が置き換えられる。修飾ヌクレオシドを置き換えることが、置き換えられるヌクレオシドと同じ対合能を有すること、好ましくは、同じ核酸塩基を有することが理解されるべきである。好ましくは、アンチセンス鎖は、最初の２つ又は最後の２つのＲＮＡヌクレオシドを除いて修飾ヌクレオシドを含まない。好ましい実施形態では、アンチセンス鎖の最後の塩基は、ＤＮＡヌクレオシドであり；より好ましくは、アンチセンス鎖の最後の２つの塩基は、ＤＮＡヌクレオシドである。好ましくは、アンチセンス鎖がセンス鎖と対を形成する場合、アンチセンス鎖の最後の１つ又は２つの残基がオーバーハングを形成し；より好ましくは、アンチセンス鎖の最後の２つの残基が、このようなオーバーハングを形成する。好ましくは、アンチセンス鎖は、最後の２つのヌクレオシドを除いて、又はオーバーハングを除いて、ＤＮＡヌクレオシドを含まない。好ましくは、センス鎖は、ＲＮＡヌクレオシドのみを含む。
好ましい実施形態では、センス鎖は、好ましくは架橋核酸ヌクレオシド、例えばロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオシド、２’－Ｏ－アルキルヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－メチルヌクレオシド、２’－フルオロヌクレオシド、及び２’－アジドヌクレオシドからなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオシド、好ましくは２’－Ｏ－アルキルヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－メチルヌクレオシドを含む。そのような少なくとも１つの修飾ヌクレオシドが最初の若しくは最後のＲＮＡヌクレオシドを置き換えるか、又は第２の若しくは第２から最後のＲＮＡヌクレオシドを置き換えることが好ましい。好ましい実施形態では、少なくとも２つの修飾ヌクレオシドが最初の２つ又は最後の２つのＲＮＡヌクレオシドを置き換える。より好ましくは、最初の及び最後のＲＮＡヌクレオシドが置き換えられ、さらにより好ましくは最初の２つ及び最後の２つが置き換えられる。置き換える修飾ヌクレオシドは、それが置き換えるヌクレオシドと同じ対合能を有することを理解すべきであり、好ましくは、それは同じ核酸塩基を有する。好ましくは、センス鎖は最初の２つ及び最後の２つのＲＮＡヌクレオシド以外の修飾ヌクレオシドを含まない。好ましい実施形態では、センス鎖の３’プライム末端はＤＮＡヌクレオシドによって伸長し；より好ましくは、センス鎖の最後の２つの塩基はＤＮＡヌクレオシドであり、さらに好ましくは、ＤＮＡヌクレオシドはデオキシチミジンである。好ましくは、センス鎖がアンチセンス鎖と対を形成する場合、センス鎖の最後の１、２の残基はオーバーハングを形成し；より好ましくは、センス鎖の最後の２つの残基が、このようなオーバーハングを形成する。好ましくは、センス鎖は最後の２つのヌクレオシドを除いて、又はオーバーハングを除いて、ＤＮＡヌクレオシドを含まない。特に好ましい実施形態では、模倣体は、ＲＮＡヌクレオシドだけを含むアンチセンス鎖及び上記のような修飾を含むセンス鎖を含む。
好ましくは、センス鎖とアンチセンス鎖は、完全には重複せず、３’末端に１、２、３、又は４つの追加の塩基を有し、好ましくは３’末端に２つの追加の塩基を有し、付着末端を形成する。したがって、対応するアンチセンス鎖では、３’末端の１、２、３、又は４つの塩基は、好ましくは、センス鎖に逆相補的塩基を有さず、付着末端も形成し；より好ましくは、センス鎖の最初の２つの塩基は、付着末端を形成し、アンチセンス鎖に相補的塩基を有さない。センス鎖は、必ずしも生物学的に活性ではなく、アンチセンス鎖の安定性を増加させるために主に作用する。模倣体に関するセンス／アンチセンス対の好ましい配列の例は、センス鎖では配列番号２０６及び２１８、より好ましくはセンス鎖では配列番号２１８並びにアンチセンス鎖では配列番号２１９である。好ましい対は、配列番号２０６又は２１８及び配列番号２１９、より好ましくは配列番号２１８及び配列番号２１９である。
好ましい実施形態では、模倣体は、センス鎖とアンチセンス鎖を含む二重鎖オリゴヌクレオチドであり、両方の鎖は、１５～３０ヌクレオチド長、好ましくは１７～２７ヌクレオチド長を有し、アンチセンス鎖は、配列番号５６、１２１又は１２２のうちのいずれか１つと７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の配列同一性を有し、センス鎖は、配列番号１３１、１９６又は１９７、好ましくは１３１又は１９６のうちのいずれか１つと７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の配列同一性を任意選択で有し、センス鎖とアンチセンス鎖は、好ましくはアニーリングして、前記二重鎖オリゴヌクレオチドを形成することができ、任意選択で、オリゴヌクレオチドの一方又は両方の末端は、１、２、３、又は４つの、好ましくは２つのヌクレオチドの重複を有する付着末端であり、センス鎖は、化学修飾されたヌクレオチドを任意選択で含む。好ましくは、二重鎖模倣体の二本鎖は、同じ長さを有するか、又は１、２、３、４、５、若しくは６ヌクレオチド長で異なる。
別段に指定されていなければ、本出願の全文脈内で、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ分子、ｍｉＲ、ｉｓｏｍｉＲ、若しくは模倣体、又はそのソース若しくは前駆体と称される場合もある。本明細書で特定される各配列は、本出願の本文で使用される配列番号として、又は配列表における対応する配列番号として特定することができる。この出願において定義される配列番号は、前記ｍｉＲＮＡ、ｉｓｏｍｉＲ、模倣体、又は前駆体などのそのソースの塩基配列を指し得る。全ての配列番号について、一部の塩基が交換可能であることを当業者は認識している。例えば、各例のＴは、Ｕで個々に置換可能であり、その逆も同様である。成熟ｍｉＲＮＡに与えられるＲＮＡ配列は、例えば、ＲＮＡヌクレオチドの代わりにＤＮＡヌクレオチドを使用して、ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして合成され得る。このような場合には、ウラシル塩基の代わりにチミン塩基が使用され得る。或いは、デオキシリボース足場のチミン塩基が使用され得る。当業者は、塩基対合挙動が正確な配列よりも重要であり、Ｔ及びＵがこのような目的で一般的に交換可能であることを理解する。したがって、模倣体は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子のいずれかであってもよく、又は本明細書で後に定義されているように、さらに修飾されたオリゴヌクレオチドであってもよい。
本発明の文脈では、ｍｉＲＮＡ分子又は模倣体又はｉｓｏｍｉＲは、一般的定義に掲げられた部分においてさらに定義されているように、合成であるか又は天然であるか又は組換えであるか又は成熟しているか又は成熟ｍｉＲＮＡ若しくはヒトｍｉＲＮＡの一部であってもよく、又はヒトｍｉＲＮＡから導出されてもよい。ヒトｍｉＲＮＡ分子は、ヒトの細胞、組織、器官又は体液中に見られるｍｉＲＮＡ分子である（すなわち、内因性ヒトｍｉＲＮＡ分子）。ヒトｍｉＲＮＡ分子は、ヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加によって内因性ヒトｍｉＲＮＡ分子から導出されるヒトｍｉＲＮＡ分子でもあり得る。ｍｉＲＮＡ分子又は模倣体又はｉｓｏｍｉＲは、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ分子であり得る。
好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子又はその模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲは、６～３０ヌクレオチド長、好ましくは１２～３０ヌクレオチド長、好ましくは１５～２８ヌクレオチド長であり、より好ましくは、前記分子は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子又は模倣体又はｉｓｏｍｉＲは、前記ｍｉＲＮＡ分子又はその模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲ（配列番号１７～５０）のシード配列に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含む。好ましくは、この実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子又は模倣体又はｉｓｏｍｉＲは、６～３０ヌクレオチド長であり、より好ましくは、前記ｍｉＲＮＡ分子又は模倣体又はｉｓｏｍｉＲのシード配列に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含む。さらにより好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子又は模倣体又はｉｓｏｍｉＲは、１５～２８ヌクレオチド長であり、より好ましくは、シード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、さらにより好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
この文脈では、シード配列に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含むことは、最大１つの位置でシード配列と異なる７ヌクレオチドの連続ストレッチを指すことを意図する。或いは、これは、単一ヌクレオチドの脱落によってのみシード配列と異なる６ヌクレオチドの連続ストレッチを指し得る。本出願全体を通して、より好ましいｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、模倣体、若しくはその前駆体は、示されたシード配列に存在する７ヌクレオチドのうちの７つ全てを含むか、又は、言い換えれば、前記シード配列と１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ｍｉＲＮＡ、ｉｓｏｍｉＲ、又は模倣体中に含まれる場合、シード配列は、ヌクレオチド番号１、２、又は３で始まり、ヌクレオチド番号７、８、９、１０、又は１１で終わり；最も好ましくは、このようなシード配列は、ヌクレオチド番号２で始まり、ヌクレオチド番号８で終わる。
本発明による使用のためのｍｉＲＮＡ－１９３ａは、ｍｉＲＮＡ－３２３、ｍｉＲＮＡ－３４２、ｍｉＲＮＡ－５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ－５２０ｆ－ｉ３、ｍｉＲＮＡ－３１５７及びｍｉＲＮＡ－７又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体からなる群から選択されるさらなるｍｉＲＮＡと組み合わせることができる。
好ましいｍｉＲＮＡ－３２３は、ｍｉＲＮＡ－３２３－５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号１７又は２４～２８のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
ｍｉＲＮＡ－３２３の好ましい模倣体は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有し、アンチセンス鎖は、配列番号１７又は２４～２８のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、アンチセンス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有し、アンチセンス鎖は、好ましくは、配列番号５１、５８～６８、又は２０９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、配列番号１２６、１３３～１４３、２０１、又は２０８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
好ましいｍｉＲＮＡ－３４２は、ｍｉＲＮＡ－３４２－５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号１８又は２９～４２のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つ含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
ｍｉＲＮＡ－３４２の好ましい模倣体は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有し、アンチセンス鎖は、配列番号１８又は２９～４２のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、アンチセンス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有し、アンチセンス鎖は、好ましくは、配列番号５２、６９～１１３、又は２１１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、配列番号１２７、１４４～１８８、２０２、又は２１０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
好ましいｍｉＲＮＡ－５２０ｆは、ｍｉＲＮＡ－５２０ｆ－３ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号１９又は４３～４４のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
ｍｉＲＮＡ－５２０ｆの好ましい模倣体は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有し、アンチセンス鎖は、配列番号１９又は４３～４４のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、アンチセンス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有し、アンチセンス鎖は、好ましくは、配列番号５３、１１４、１１５、又は２１３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、配列番号１２８、１８９、１９０、２０３、又は２１２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
さらに好ましいｍｉＲＮＡ－５２０ｆは、ｍｉＲＮＡ－５２０ｆ－３ｐ－ｉ３分子又はその模倣体であり、配列番号２０のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
ｍｉＲＮＡ－５２０ｆ－３ｐ－ｉ３の好ましい模倣体は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有し、アンチセンス鎖は、配列番号２０のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、アンチセンス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有し、アンチセンス鎖は、好ましくは、配列番号５４又は２１５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、配列番号１２９、２０４、又は２１４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
好ましいｍｉＲＮＡ－３１５７は、ｍｉＲＮＡ－３１５７－５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号２１又は４５～４８のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
ｍｉＲＮＡ－３１５７の好ましい模倣体は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有し、アンチセンス鎖は、配列番号２１又は４５～４８のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、アンチセンス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有し、アンチセンス鎖は、好ましくは、配列番号５５、１１６～１２０、又は２１７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、配列番号１３０、１９１～１９５、２０５、又は２１６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
好ましいｍｉＲＮＡ－７は、ｍｉＲＮＡ－７－５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号２３又は５０のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
ｍｉＲＮＡ－７の好ましい模倣体は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有し、アンチセンス鎖は、配列番号２３又は５０のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、アンチセンス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有し、アンチセンス鎖は、好ましくは、配列番号５７、１２３～１２５、又は２２１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、配列番号１３２、１９８～２００、２０７、又は２２０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、センス鎖は、好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有し、配列番号１７～５０のうちのいずれか１つの所与のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、配列番号５１～１２５のうちのいずれか１つの成熟配列全体に対して少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
或いは、好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド以下の長さを有し、配列番号１７～５０のうちのいずれか１つの所与のシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含み、配列番号５１～１２５のうちのいずれか１つの成熟配列全体に対して少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
別の好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子のｉｓｏｍｉＲは、配列番号５８～１２５のうちのいずれか１つのｉｓｏｍｉＲ配列全体に対して少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれを超える。好ましくは、この実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子のｉｓｏｍｉＲ又はその模倣体は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有する。
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ－３２３分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、ｍｉＲＮＡ－３２３－５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号１７、２４～２８として特定されるシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含む及び／又は配列番号５１、５８～６８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有する及び／又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド長若しくはそれより長いヌクレオチド長を有する。
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ－３２３分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、ｍｉＲＮＡ－３２３－５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号１７、２４～２８として特定されるシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含む及び／又は配列番号５１、５８～６８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有する及び／又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド長若しくはそれより長いヌクレオチド長を有する。
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ－３４２分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、ｍｉＲＮＡ－３４２－５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号１８、２９～４２として特定されるシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含む及び／又は配列番号５２、６９～１１３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有する及び／又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド長若しくはそれより長いヌクレオチド長を有する。
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ－５２０ｆ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、ｍｉＲＮＡ－５２０ｆ－３ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号１９、４３～４４として特定されるシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含む及び／又は配列番号５３、１１４～１１５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有する及び／又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド長若しくはそれより長いヌクレオチド長を有する。さらに好ましいｍｉＲＮＡ ５２０ｆ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、ｍｉＲＮＡ－５２０ｆ－３ｐ－ｉ３分子又はその模倣体であり、配列番号２０として特定されるシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含む及び／又は配列番号５４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有する及び／又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド長若しくはそれより長いヌクレオチド長を有する。
したがって、好ましいｍｉＲＮＡー３１５７分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、ｍｉＲＮＡ－３１５７－５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号２１、４５～４８として特定されるシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含む及び／又は配列番号５５、１１６～１２０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有する及び／又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド長若しくはそれより長いヌクレオチド長を有する。
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ－１９３ａ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、ｍｉＲＮＡ－１９３ａ－３ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号２２として特定されるシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含む及び／又は配列番号５６、１２１～１２２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有する及び／又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド長若しくはそれより長いヌクレオチド長を有する。
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ－７分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、ｍｉＲＮＡ－７－５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体であり、配列番号２３又は５０として特定されるシード配列中に存在する７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含む及び／又は配列番号５７、１２３～１２５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有する及び／又は少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド長若しくはそれより長いヌクレオチド長を有する。
別の好ましいｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体は、配列番号１７～５０のうちのいずれか１つのシード配列と、又は配列番号５１～５７のいずれか１つの成熟配列と、又は配列番号１～１６のいずれか１つ、好ましくは配列番号１～８のいずれか１つの前駆体配列と、又は配列番号９～１６のいずれか１つのＲＮＡ前駆体をコードするＤＮＡと、又は配列番号５８～１２５のいずれか１つのｉｓｏｍｉＲ配列と、少なくとも６０％の同一性を有する。同一性は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％であり得る。同一性は、所与の配列番号で特定されるように、配列番号全体に関して評価されるのが好ましい。しかし、同一性はまた、所与の配列番号の一部に関して評価されてもよい。一部とは、その配列番号の長さの少なくとも５０％、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％を意味し得る。
前駆体配列は、成熟プロセスに応じて２つ以上のｉｓｏｍｉＲ配列を生じる場合がある－例えば、ある特定の組織において、複数のｉｓｏｍｉＲが特定されている（配列番号５８～６８）ｍｉＲＮＡ－３２３（成熟配列の配列番号５１）を参照されたい。ｍｉＲＮＡ分子のｉｓｏｍｉＲは同じ前駆体に由来し、逆に、前駆体は複数のｍｉＲＮＡ分子をもたらす可能性があり、そのうちの１つはカノニカルなｍｉＲＮＡと称され（例えば、ｍｉＲＮＡ－３２３－５ｐ、配列番号５１）、その他はｉｓｏｍｉＲと称される（例えば、配列番号５８～６８によって表されるオリゴヌクレオチド）。カノニカルなｍｉＲＮＡとそのｉｓｏｍｉＲの間の差は、それらの蔓延度においてのみ存在すると考えられるが、一般的には、最も蔓延している分子がカノニカルなｍｉＲＮＡと呼ばれ、一方、その他はｉｓｏｍｉＲである。種類、環境、生活環における位置、又は細胞の病理学的状態に応じて、個々のｉｓｏｍｉＲ又はｍｉＲＮＡは異なるレベルで発現される可能性があり；発現は、人種又は性別間でさらに異なる可能性がある（Ｌｏｈｅｒら、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ（２０１４年）ＤＯＩ：１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２４０５頁）。
ｍｉＲＮＡ分子若しくは模倣体又はそのソースの、或いはｍｉＲＮＡの又はｉｓｏｍｉＲの模倣体におけるセンス鎖又はアンチセンス鎖のヌクレオチドの化学構造を修飾して、安定性、結合親和性及び／又は特異性を増加させてもよい。前記センス鎖又はアンチセンス鎖は、ＲＮＡ分子又は好ましくは修飾されたＲＮＡ分子を含むか又はそれからなってもよい。好ましい修飾されたＲＮＡ分子は、修飾された糖を含んでもよい。このような修飾の１つの例は、ヌクレアーゼ耐性及びＲＮＡに対する結合親和性を改善するための、核酸における２’－Ｏ－メチル又は２’－Ｏ－メトキシエチル基若しくは２’フルオリド基の導入である。このような修飾の別の例は、立体構造をロックし（ロックド核酸（ＬＮＡ））、相補的一本鎖ＲＮＡへの親和性を改善するための、２’－Ｏ原子と核酸の４’－Ｃ原子を接続するメチレン架橋の導入である。第３の例は、ヌクレアーゼの攻撃に対する安定性を改善するための、ＲＮＡ鎖における核酸間のリンカーとしてのホスホロチオエート基の導入である。第４の修飾は、安定性及び細胞内送達を改善するための、コレステロールなどの分子の３’末端における親油性部分のコンジュゲーションである。
好ましい実施形態では、模倣体のセンス鎖の最初の２塩基は、修飾糖、好ましくは２’－Ｏ－メチル修飾を有する。好ましい実施形態では、模倣体のセンス鎖の最後の４塩基のうちの最初の２塩基は、修飾糖、好ましくは２’－Ｏ－メチル修飾を有する。好ましい実施形態では、模倣体のセンス鎖の最初の２塩基と最後の４塩基のうちの最初の２塩基とは、修飾糖、好ましくは２’－Ｏ－メチル修飾を有する。好ましい実施形態では、模倣体のセンス鎖の最後の２塩基は、修飾糖、好ましくは２’－Ｏ－メチル修飾を有する。好ましい実施形態では、模倣体のセンス鎖の最初の２塩基と最後の２塩基とは、修飾糖、好ましくは２’－Ｏ－メチル修飾を有する。好ましい実施形態では、模倣体のセンス鎖の最後の２塩基は、ＤＮＡ塩基である。好ましい実施形態では、模倣体のセンス鎖の最初の２塩基と最後の４塩基のうちの最初の２塩基は、修飾糖、好ましくは２’－Ｏ－メチル修飾を有し、前記センス鎖の最後の２塩基は、ＤＮＡ塩基である。好ましい実施形態では、模倣体のセンス鎖の最初の２塩基は、修飾糖、好ましくは２’－Ｏ－メチル修飾を有し、前記センス鎖の最後の２塩基は、ＤＮＡ塩基である。好ましい実施形態では、模倣体のセンス鎖の最後の４塩基のうちの最初の２塩基は、修飾糖、好ましくは２’－Ｏ－メチル修飾を有し、前記センス鎖の最後の２塩基は、ＤＮＡ塩基である。
ｍｉＲＮＡのソース又は模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲのソースは、本明細書において特定されるｍｉＲＮＡ分子の又は模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲの産生を誘導することができ、好ましくはヘアピン様構造及び／若しくは二本鎖核酸分子を含む任意の分子であってもよい。ヘアピン様構造の存在は、８０、１００及び１２０ｎｔ又はそれを超えるスライディングウインドウを使用するＲＮＡｓｈａｐｅｓプログラム（Ｓｔｅｆｆｅｎ Ｐら ２００６年）を使用して評価することができる。ヘアピン様構造は、ｍｉＲＮＡ分子の天然又は内因性ソースに通常存在するが、二本鎖核酸分子は、ｍｉＲＮＡ分子の又はｉｓｏｍｉＲ若しくはその模倣体の組換え又は合成ソースに通常存在する。
ｍｉＲＮＡ分子の又は模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲのソースは、一本鎖、二本鎖ＲＮＡ又は部分的に二本鎖のＲＮＡであってもよく、又は三本鎖を含んでもよく、その例は、国際公開第２００８／１０５５８号に記載されている。本明細書で使用される場合、部分的に二本鎖とは、５’及び／又は３’末端に、一本鎖構造も含む二本鎖構造を指す。ｍｉＲＮＡ分子の各鎖が同じ長さを有さない場合も生じ得る。一般的に、このような部分的に二本鎖のｍｉＲＮＡ分子は、７５％未満の二本鎖構造及び２５％を超える一本鎖構造、又は５０％未満の二本鎖構造及び５０％を超える一本鎖構造、又はより好ましくは、２５％、２０％若しくは１５％未満の二本鎖構造及び７５％、８０％、８５％を超える一本鎖構造を有してもよい。
或いは、ｍｉＲＮＡ分子の又はその模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲのソースは、ｍｉＲＮＡ分子又はその模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲの前駆体をコードするＤＮＡ分子である。この文脈では、好ましいＤＮＡ分子は、配列番号９～１６である。本発明による使用のためのｍｉＲＮＡでは、配列番号１３が好ましい。本発明は、前記配列番号１３と少なくとも７０％の同一性を有するｍｉＲＮＡ分子の前駆体をコードするＤＮＡ分子の使用を包含する。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。好ましくは、この実施形態では、ＤＮＡ分子は、少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有し、配列番号１３のＤＮＡ配列と少なくとも７０％の同一性を有する。
所与のｍｉＲＮＡ分子の又は模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲの産生の誘導は、前記ソースが、以下に定義されているように、１つのアッセイを使用して細胞中に導入される場合に得られることが好ましい。本発明に包含される細胞は、後で定義される。
ｍｉＲＮＡ分子の又はその模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲの好ましいソースは、その前駆体、より好ましくは前記ｍｉＲＮＡ分子又はその模倣体若しくはｉｓｏｍｉＲをコードする核酸である。好ましい前駆体は、天然に存在する前駆体である。前駆体は、合成又は組換え前駆体であってもよい。合成又は組換え前駆体は、天然に存在する前駆体を発現することができるベクターであってもよい。好ましい実施形態では、この態様は、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡを提供し、ここで、ｍｉＲＮＡのソースが、ｍｉＲＮＡの前駆体であり、少なくとも５０ヌクレオチド長の核酸である。好ましい実施形態では、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はそのソースが提供され、前記ｍｉＲＮＡは配列番号５６、１２１又は１２２のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有し、及び／又は前記ｍｉＲＮＡが、１５～３０ヌクレオチド長であり、及び／又はｍｉＲＮＡの前記ソースは前記ｍｉＲＮＡの前駆体であり、配列番号５又は１３のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有する。より好ましくは、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡ－１９３ａは、配列番号５６、１２１又は１２２のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有し、１５～３０ヌクレオチド長である；より好ましくはｍｉＲＮＡ－１９３ａの前記ソースは前記ｍｉＲＮＡ－１９３ａの前駆体であり、配列番号５又は１３のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有する。
所与のｍｉＲＮＡ分子の好ましい前駆体は、配列番号１～１６のうちのいずれか１つで表される配列を有する。本発明は、前記配列と少なくとも７０％の同一性を有する、ｍｉＲＮＡ分子の又はそのｉｓｏｍｉＲ若しくは模倣体の前駆体の使用を包含する。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。好ましくは、この実施形態では、ＤＮＡ分子は、少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有し、配列番号１～１６のうちのいずれか１つで表される配列と少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、この実施形態では、前駆体は、配列番号１７～５０によって表される群から選択されるシード配列と、７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを共有するシード配列を含む。より好ましくは、前駆体は、配列番号１７～５０によって表される群から選択されるシード配列を含む。所与のｍｉＲＮＡ分子のより好ましい前駆体は、配列番号１～８のうちのいずれか１つで表される配列を有する。本発明は、前記配列と少なくとも７０％の同一性を有する、ｍｉＲＮＡ分子の又はそのｉｓｏｍｉＲ若しくは模倣体の前駆体の使用を包含する。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。好ましくは、この実施形態では、ＤＮＡ分子は、少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有し、配列番号１～８のうちのいずれか１つで表される配列と少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、この実施形態では、前駆体は、配列番号１７～５０によって表される群から選択されるシード配列と、７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを共有するシード配列を含む。より好ましくは、前駆体は、配列番号１７～５０によって表される群から選択されるシード配列を含む。
したがって、ｍｉＲＮＡ－３２３分子の好ましいソースは、配列番号１又は９、好ましくは配列番号１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を任意選択で有し、配列番号１７又は２４～２８のうちのいずれか１つの７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを共有するシード配列を任意選択で含む。このようなソースは、ｍｉＲＮＡ－３２３分子の及びｍｉＲＮＡ－３２３ ｉｓｏｍｉＲの前駆体である。
したがって、ｍｉＲＮＡ－３４２分子の好ましいソースは、配列番号２又は１０、好ましくは配列番号２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を任意選択で有し、配列番号１８又は２９～４２のうちのいずれか１つの７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを共有するシード配列を任意選択で含む。このようなソースは、ｍｉＲＮＡ－３４２分子の及びｍｉＲＮＡ－３４２ ｉｓｏｍｉＲの前駆体である。
したがって、ｍｉＲＮＡ－５２０ｆ分子の好ましいソースは、配列番号３又は１１、好ましくは配列番号３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を任意選択で有し、配列番号１９、２０、４３、又は４４のうちのいずれか１つの７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを共有するシード配列を任意選択で含む。このようなソースは、ｍｉＲＮＡ－５２０ｆ分子の及びｍｉＲＮＡ－５２０ｆ－３ｐ－ｉ３などのｍｉＲＮＡ－５２０ｆ ｉｓｏｍｉＲの前駆体である。
したがって、ｍｉＲＮＡ－３１５７分子の好ましいソースは、配列番号４又は１２、好ましくは配列番号４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を任意選択で有し、配列番号２１又は４５～４８のうちのいずれか１つの７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを共有するシード配列を任意選択で含む。このようなソースは、ｍｉＲＮＡ－３１５７分子の及びｍｉＲＮＡ－３１５７ ｉｓｏｍｉＲの前駆体である。
したがって、ｍｉＲＮＡ－１９３ａ分子の好ましいソースは、配列番号５又は１３、好ましくは配列番号５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を任意選択で有し、配列番号２２のうちのいずれか１つの７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを共有するシード配列を任意選択で含む。このようなソースは、ｍｉＲＮＡ－１９３ａ分子の及びｍｉＲＮＡ－１９３ａ ｉｓｏｍｉＲの前駆体である。
したがって、ｍｉＲＮＡ－７分子の好ましいソースは、配列番号６～８又は１４～１６、好ましくは配列番号６～８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を任意選択で有し、配列番号２３又は５０のうちのいずれか１つの７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを共有するシード配列を任意選択で含む。このようなソースは、ｍｉＲＮＡ－７分子の及びｍｉＲＮＡ－７ ｉｓｏｍｉＲの前駆体である。
この文脈では、所与の成熟ｍｉＲＮＡ分子のいくつかの前駆体が同一のｍｉＲＮＡ分子をもたらす場合があることが指摘される。例えば、ｍｉＲＮＡ－７は、前駆体ｍｉＲＮＡ－７－１、ｍｉＲＮＡ－７－２又はｍｉＲＮＡ－７－３（好ましくは、それぞれ、配列番号６、７、又は８として特定される）に由来してもよい。また、この文脈では、所与の成熟ｍｉＲＮＡ分子のいくつかのｉｓｏｍｉｒが同一のシード配列を有するｍｉＲＮＡ分子をもたらす場合があることが指摘される。例えば、成熟ｍｉＲＮＡ－３２３－５ｐ（配列番号５１）及び配列番号５８又は５９を少なくとも有するｉｓｏｍｉｒは全て、同じシード配列（好ましくは、配列番号１７として特定される）を共有する。
好ましいソース又は前駆体は、本明細書の他の箇所で定義されている。好ましいソースは、前記ｍｉＲＮＡの前記前駆体をコードする、核酸、すなわち、ＤＮＡを含む発現構築物を含むか（ｉｎｃｌｕｄｅ）又は含み（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）、より好ましくは、前記発現構築物は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス及びレトロウイルスに基づいて、遺伝子療法ベクターから選択されるウイルス性遺伝子療法ベクターである。好ましいウイルス遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶ又はレンチウイルスベクターである。他の好ましいベクターは、腫瘍溶解性ウイルスベクターである。このようなベクターについては、本明細書の以下においてさらに記載される。或いは、ソースは、一般的定義に掲げられた部分でさらに定義されているように、合成ｍｉＲＮＡ分子又は化学的模倣体であってもよい。
ＰＴＥＮ欠乏症と関連する状態
本発明による使用は、ＰＴＥＮ欠乏症と関連する状態を処置することにおける使用である。そのような状態又は疾患は、ＰＴＥＮ欠乏状態と本明細書で呼ばれる。本発明は、ｍｉＲＮＡ－１９３ａのこの新規の医学的使用を提供する。この使用は、医薬の製造における組成物又はｍｉＲＮＡの使用であってもよい。組成物は、後のセクションで定義される。処置は好ましくは状態を防止すること、軽快させること、回復させること、治癒させること及び／又は遅延させることを指す。ＰＴＥＮ欠乏状態がＰＴＥＮ欠乏腫瘍であるとき、好ましい処置は抗腫瘍効果を得ることであってよい。
本明細書で使用される用語「処置すること」及びその派生語は、治療的療法を意味する。特定の状態に関して、処置することは以下を意味する：（１）状態又は状態の生物学的徴候の１つ又は複数を軽快させること；（２）（ａ）状態につながるか若しくはその原因である生物学的カスケードの中の１つ又は複数のポイント、又は（ｂ）状態の生物学的徴候の１つ又は複数に干渉すること；（３）状態と関連する症状、作用若しくは副作用のうちの１つ又は複数、又は状態若しくはその処置と関連する症状、作用若しくは副作用のうちの１つ又は複数を軽減すること；（４）状態又は状態の生物学的徴候の１つ又は複数の進行を遅延させること、及び／又は（５）状態の生物学的徴候の１つ又は複数を、寛解の期間にわたって追加の処置なしにその徴候の寛解の状態であるとみなされる期間、排除又は低減する（好ましくは検出不能なレベルまで）ことによって、前記状態又は状態の生物学的徴候の１つ又は複数を治療すること。当業者は、特定の疾患又は状態の寛解とみなされる期間を理解する。防止的療法も企図される。当業者は、「防止」が必ずしも絶対的用語でないことを理解する。医学において、「防止」は薬物の防止的投与を指すものと、状態若しくはその生物学的徴候の可能性若しくは重症度を実質的に減らすものと、又はそのような状態若しくはその生物学的徴候の開始を遅延させるものと理解される。防止的療法は、例えば対象ががんを起こすリスクが高いとみなされるとき、例えば、対象ががんの強力な家族歴を有するとき、又は対象が発がん物質に曝露したとき、又はＰＴＥＮ欠乏症が患者で診断されるとき適当である。
Ｔ細胞媒介免疫療法は、有望ながん療法である。しかし、多くの患者は、これらの療法になお応答することができない。免疫抵抗性の分子決定因子は、十分に理解されていない。黒色腫の前臨床モデルにおける腫瘍細胞中のＰＴＥＮの損失は、Ｔ細胞媒介腫瘍殺滅を阻害し、腫瘍へのＴ細胞輸送を減少させる。患者（例えば、対象）では、ＰＴＥＮ損失は腫瘍部位におけるＴ細胞侵入の減少、切除された腫瘍からの良好なＴ細胞増大の可能性の低減、及びＰＤ－１阻害療法による劣った結果と相関する。腫瘍細胞におけるＰＴＥＮ損失は、免疫抑制サイトカインの発現を増加させ、腫瘍におけるＴ細胞侵入の減少をもたらし、自己貪食を阻害し、そのことはＴ細胞媒介細胞死を減少させた。選択的ＲＩ３Ｋｂ（ＰＩ３Ｋｂ）阻害剤による処置は、マウスモデルにおいて抗ＰＤ－１及び抗ＣＴＬＡ－４抗体の有効性を向上させることができる。これらの所見は、ＰＴＥＮ損失が免疫抵抗性を促進することを実証し、免疫療法及びＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ経路阻害剤の組み合わせを探る理論的根拠を支持する。Ｐｅｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ６：２０２～２１６頁（２０１６年）を参照する。
増殖及び生存を含むいくつかの決定的な細胞プロセスを調節することによって、ＰＩ３Ｋ経路はがんで決定的な役割を演ずる。この経路ががんにおいて活性化される最も一般的な方法の１つは、ＰＩ３Ｋシグナル伝達の活性を弱める脂質ホスファターゼであるがん抑制因子ＰＴＥＮの発現の損失によるものである。複数の腫瘍型で、ＰＴＥＮの損失は、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ経路の活性化の増加に対応する。ＰＴＥＮの損失はがんで普遍的ではない－例えば、それは黒色腫の最高３０％で起こる。
本明細書で使用されるように、「ＰＴＥＮ欠乏性」又は「ＰＴＥＮ欠乏症」は、好ましくはＰＴＥＮのがん抑制因子機能の欠損、例えばＰＴＥＮがん抑制因子の発現の損失によって引き起こされるか又はそれによって悪化する状態を指す。そのような欠乏症には、好ましくはＰＴＥＮ遺伝子における変異、ＰＴＥＮ野生型と比較したときのＰＴＥＮタンパク質の低減若しくは不在、又はＰＴＥＮ機能の抑制を引き起こす他の遺伝子の変異若しくは不在が含まれる。それには、より好ましくは、欠失、変異によって又は後成変化を通して失われるＰＴＥＮの活性又は発現が含まれる。ＰＴＥＮの調節には、転写、ｍＲＮＡ安定性、ｍｉＲＮＡ標的化、翻訳及びタンパク質安定性を含む複数の機構が存在する。ＰＴＥＮは、ＰＴＥＮ欠乏性の子宮内膜、胃、肺、甲状腺、***及び卵巣の腫瘍並びに神経膠芽腫においてプロモーターメチル化によって転写がサイレンシングされる。ＰＴＥＮの機能の損失又はレベルの低減、並びにＰＴＥＮの欠失又は変化をもたらす変異は、いくつかの散発性の腫瘍で見出される。Ａｇｕｉｓｓａ－Ｔｏｕｒｅら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ６９：１４７５～１４９１頁（２０１２年）を参照。当業者は、がんなどの状態がＰＴＥＮ欠乏性であるかどうかについて決定する方法を知っている。ＰＴＥＮ欠乏症は、Ｑ－ＰＣＲ又はＥＬＩＳＡ又は免疫組織化学などの方法によって決定することができる。ヒトＰＴＥＮ ｑＰＣＲプライマー対は、例えば、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ及びＧｅｎｅｃｏｐｏｅｉａから市販されている。ＰＴＥＮ（ヒト）ＥＬＩＳＡキットは、例えば、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ及びＡｂｅａｍから市販されている。免疫組織化学プロトコールは、例えば、Ｓａｋｒら、Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．１８：３７１～３７４頁（２０１０年）で提供される。ＰＴＥＮ抗体は、例えば、Ａｂｅａｍ及びＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから市販されている。参考のために、ヒトＰＴＥＮ ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００３１４．４である；タンパク質配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＨ０５８２１．１である。
ＰＴＥＮ欠乏状態は当技術分野で公知であり、前記のように、状態のＰＴＥＮ欠乏性はルーチンのアッセイを使用して容易に確立することができる。ＰＴＥＮ欠乏性バリアントが存在する状態の例は、がん、自閉症、巨大頭蓋症、良性腫瘍及び非がん性新生物である。ＰＴＥＮ欠乏性バリアントが存在する好ましい状態は、がん、良性腫瘍及び非がん性新生物であり、それらは本明細書ではＰＴＥＮ欠乏性腫瘍と総称される。非がん性新生物の例は、過誤腫、例えばバナヤン－ゾナナ症候群、バナヤン－ライリー－ルバルカバ症候群、プロテウス症候群、プロテウス様症候群、カウデン病、ＰＴＥＮ過誤腫腫瘍症候群（ＰＨＴＳ）及びレルミット－デュクロ病で起こるそれらである。最も好ましいＰＴＥＮ欠乏性腫瘍は、ＰＴＥＮ欠乏性がんである。
好ましいＰＴＥＮ欠乏性状態は腫瘍であり、言い換えると、本発明による好ましい使用はＰＴＥＮ欠乏性腫瘍、より好ましくはＰＴＥＮ欠乏性がんを処置することにある。一般的に、本明細書で使用されるように、がんの処置への言及は、ＰＴＥＮ欠乏性がんの処置を指すものである。別途指示がない限り、抗腫瘍作用は、処置された対象において好ましくは処置の前に、及び少なくとも１週、２週、３週、４週、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月又はそれ以上後に評価又は検出される。抗腫瘍効果は：
増殖の阻害又は腫瘍細胞の増殖の検出可能な低下又は腫瘍細胞若しくはメラニン形成細胞の細胞生存率の低下、並びに／或いは
腫瘍細胞の分化能の増加、並びに／或いは
腫瘍細胞の生存の低下と等しい、腫瘍細胞死の増加、並びに／或いは
転移及び／又は腫瘍細胞の移動の発生の遅延、並びに／或いは
腫瘍重量又は成長の増加の阻害又は防止又は遅延、並びに／又は
少なくとも１カ月、数カ月又はそれより長い期間の患者の生存の延長（処置されていないか若しくは対照で処置されたものと比較して、又は処置の開始時の対象と比較して）、並びに／或いは
腫瘍サイズ又は体積の減少
として対象において特定されるのが好ましい。
本発明の文脈では、患者は、生存していてもよく、疾患を有さないとみなされてもよい。或いは、疾患又は状態が、停止又は遅延又は消失していてもよい。腫瘍細胞の増殖の阻害は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％又はそれより高い割合であってもよい。細胞の増殖は、公知の技法を使用して評価することができる。腫瘍細胞又はメラニン形成細胞の細胞生存率の低下は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％又はそれより高い割合の低下であってもよい。このような低下は、所与のｍｉＲＮＡ分子、その等価物又はソースによるトランスフェクションの４日後に評価されてもよい。細胞生存率は、ＭＴＳアッセイなどの公知の技法によって評価することができる。
腫瘍又はがんの処置は、腫瘍体積の低減又は腫瘍細胞生存率の低下であり得る。腫瘍体積の低減は、カリパスを使用して評価することができる。腫瘍体積又は細胞生存率又は生存の低下は、少なくとも、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合の低下であり得る。腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導又は腫瘍細胞死の誘導は、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合であり得る。腫瘍細胞生存率又は生存又は死滅は、当業者に公知の技法を使用して評価することができる。腫瘍細胞生存率及び死滅は、ＭＲＩ、ＣＴ若しくはＰＥＴなどの通常の撮像法、及びその派生法、又は生検を使用して評価することができる。腫瘍細胞生存率は、いくつかの時点で、病変の拡大を可視化することによって評価されてもよい。少なくとも一度に観察される病変の１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合の低下が、腫瘍細胞生存率の低下と考えられることになる。
腫瘍細胞の増殖の阻害は、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合であり得る。細胞の増殖は、標準的な増殖アッセイのような公知の技法を使用して評価することができる。このような増殖アッセイは、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）などの生体染色を使用してもよい。これには、代謝酵素によって蛍光分子へと変換される基質分子が含まれる。その後、蛍光のレベルが、生きている、代謝的に活性な細胞の数を反映する。或いは、このような増殖アッセイは、有糸***指数を決定し得る。有糸***指数は、全腫瘍細胞数と比較した、増殖段階にある腫瘍細胞数に基づく。増殖細胞の標識化は、抗体Ｋｉ－６７及び免疫組織化学染色を使用して実施することができる。腫瘍細胞の増殖の阻害は、有糸***指数が少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％又はそれより高い割合で低減する場合に見ることができる（Ｋｅａｒｓｌｅｙ Ｊ．Ｈら、１９９０年、ＰＭＩＤ：２３７２４８３頁に記載されているように）。
転移及び／又は腫瘍細胞の移動の発生の遅延は、少なくとも１週間、１カ月、数カ月、１年又はそれより長い期間の遅延であり得る。転移の存在は、ＭＲＩ、ＣＴ若しくはエコー検査又は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出を可能とする技法を使用して評価することができる。後者の検査の例は、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ ＣＴＣ検査（Ｖｅｒｉｄｅｘ）、すなわち、末梢血由来のＣＴＣのＥｐＣａｍに基づく磁気選別である。
ある特定の実施形態では、腫瘍重量の阻害若しくは低下又は腫瘍成長の遅延又は腫瘍成長の阻害は、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合であり得る。腫瘍重量又は腫瘍成長の体積は、当業者に公知の技法を使用して評価することができる。腫瘍成長の検出又は腫瘍細胞の増殖の検出は、グルコース類似体２－［１８Ｆ］－フルオロ－２－デオキシ－Ｄ－グルコース（ＦＤＧ－ＰＥＴ）又は［１８Ｆ］－３’－フルオロ－３’－デオキシ－Ｌ－チミジン ＰＥＴによるポジトロン放出断層撮影によって、グルコース利用の変化を測定することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで評価することができる。ｅｘ ｖｉｖｏでの代替法は、Ｋｉ６７による腫瘍生検の染色であり得る。腫瘍細胞の分化能の増加は、特異的分化マーカーを使用し、処置細胞におけるこのようなマーカーの存在を追跡して評価することができる。好ましいマーカー又はパラメーターは、ｐ１６、Ｔｒｐ－１及びＰＬＺＦ、ｃ－Ｋｉｔ、ＭＩＴＦ、チロシナーゼ、及びメラニンである。これは、ＲＴ－ＰＣＲ、ウエスタンブロッティング又は免疫組織化学を使用してなされる。分化能の増加は、特定された技法のいずれかを使用して、処置の少なくとも１週間後の少なくとも検出可能な増加であり得る。好ましくは、増加は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又はそれより高い割合の増加であり、したがって、所与の試料内の分化細胞数が増加することになる。ある特定の実施形態では、腫瘍成長は、少なくとも１週間、１カ月、２カ月又はそれより長い期間遅延され得る。ある特定の実施形態では、転移の発生は、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月又はそれより長い期間遅延される。
好ましい実施形態では、ＰＴＥＮ欠乏性腫瘍は、ＰＴＥＮ欠乏性の肉腫、脳がん、頭頸部がん、乳がん、肺がん、腎臓がん、肝がん、結腸がん、卵巣がん、黒色腫、膵がん、甲状腺がん、過誤腫、造血器腫及びリンパ系腫瘍の腫瘍、又は前立腺がんである。他のより好ましい実施形態では、ＰＴＥＮ欠乏性腫瘍は、ＰＴＥＮ欠乏性の肉腫、脳がん、頭頸部がん、乳がん、肺がん、腎臓がん、肝がん、結腸がん、卵巣がん、膵がん、甲状腺がん、過誤腫、造血器腫及びリンパ系腫瘍の腫瘍、又は前立腺がんである。他のより好ましい実施形態では、ＰＴＥＮ欠乏性腫瘍は、ＰＴＥＮ欠乏性の肉腫、脳がん、頭頸部がん、卵巣がん、甲状腺がん又は過誤腫である。他のより好ましい実施形態では、ＰＴＥＮ欠乏性腫瘍は、ＰＴＥＮ欠乏性肺がん（好ましくは非小細胞肺がん）、肝がん（好ましくは肝細胞癌）、乳がん（好ましくは三重陰性乳がん）及び黒色腫（好ましくは活性化ＢＲＡＦ変異による黒色腫）である。他のより好ましい実施形態では、ＰＴＥＮ欠乏性腫瘍は、ＰＴＥＮ欠乏性肺がん（好ましくは非小細胞肺がん）、肝がん（好ましくは肝細胞癌）又は乳がん（好ましくは三重陰性乳がん）である。
本発明による処置に好適であるがんのさらなる例には、限定されずに、頭頸部、***、肺、結腸、卵巣及び前立腺のがんの原発性及び転移性の型が含まれる。好ましくは、がんは下から選択される：脳（神経膠腫）、神経膠芽腫、星状細胞腫、多形性神経膠芽腫、バナヤン－ゾナナ症候群、カウデン病、レルミット－デュクロ病、***、炎症性乳がん、ウィルム腫瘍、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、結腸、頭頸部、腎臓、肺、肝臓、黒色腫、卵巣、膵臓、前立腺、肉腫、骨肉腫、骨の巨大細胞腫瘍、甲状腺、リンパ芽球Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、毛様細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、ＡＭＬ、慢性好中球性白血病、急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、形質細胞腫、免疫芽細胞大細胞白血病、マントル細胞白血病、多発性骨髄腫、巨核芽球白血病、多発性骨髄腫、急性巨核球白血病、前骨髄球性白血病、赤白血病、悪性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ芽球性Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、神経芽細胞腫、膀胱がん、尿路上皮性がん、肺がん、外陰がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、中皮腫、食道がん、唾液腺がん、肝細胞がん、胃がん、鼻咽頭がん、口内がん、口のがん、ＧＩＳＴ（消化管間質腫瘍）及び精巣がん。好ましい過誤腫は、バナヤン－ゾナナ症候群、バナヤン－ライリー－ルバルカバ症候群、プロテウス症候群、プロテウス様症候群、カウデン病、ＰＴＥＮ過誤腫腫瘍症候群（ＰＨＴＳ）及びレルミット－デュクロ病である。
さらに、処置される（ＰＴＥＮ欠乏性の場合）がんの例には、バレットの腺癌；胆管の癌腫；乳がん；子宮頸がん；胆管癌；神経膠芽腫、星状細胞腫（例えば、多形性神経膠芽腫）及び上衣細胞腫などの原発性ＣＮＳ腫瘍、及び二次性のＣＮＳ腫瘍（すなわち、中枢神経系の外で始まる腫瘍の中枢神経系への転移）を含む中枢神経系腫瘍；大腸結腸癌を含む結腸直腸がん；胃がん；頭頸部の扁平上皮癌を含む頭頸部の癌；急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、脊髄形成異常症候群、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、巨核芽球白血病、多発性骨髄腫及び赤白血病などの白血病及びリンパ腫を含む血液がん；肝細胞癌；小細胞肺がん及び非小細胞肺がんを含む肺がん；卵巣がん；子宮内膜がん；膵がん；下垂体腺腫；前立腺がん；腎臓がん；肉腫；黒色腫を含む皮膚がん；並びに甲状腺がんが含まれる。
好ましい実施形態では、がんは：脳（神経膠腫）、神経膠芽腫、星状細胞腫、多形性神経膠芽腫、バナヤン－ゾナナ症候群、カウデン病、レルミット－デュクロ病、乳がん、結腸がん、頭頸部がん、腎臓がん、肺がん、肝がん、黒色腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、肉腫及び甲状腺がんからなる群から選択される。他の好ましい実施形態では、がんは：卵巣、乳がん、膵がん及び前立腺がんからなる群から選択される。他の好ましい実施形態では、がんは非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、膀胱がん又は転移性ホルモン抗療性の前立腺がんである。他の好ましい実施形態では、がんは乳がん、甲状腺がん、神経膠芽腫、子宮内膜がん、前立腺がん又は黒色腫である。他の好ましい実施形態では、がんは乳がん、甲状腺がん、神経膠芽腫、子宮内膜がん又は前立腺がんである。
好ましい実施形態では、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、ソラフェニブ抵抗性がんなどの化学療法抵抗性がんの処置で使用するためのものである。
好ましい実施形態では、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、癌腫の処置において使用するためのものである。より好ましくは、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、化学療法耐性の癌腫、例えば、ソラフェニブ耐性の癌腫の処置において使用するためのものである。
好ましい実施形態では、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、肝細胞癌（ＨＣＣ）の処置において使用するためのものである。より好ましくは、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ＶＥＧＦ受容体阻害剤、例えば、アキシチニブ、セジラニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、パゾパニブ、レゴラフェニブ、セマクサニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、チボザニブ、トセラニブ、又はバンデタニブ、好ましくはソラフェニブに耐性である肝細胞癌腫（ＨＣＣ）などの化学療法耐性のＨＣＣの処置において使用するためのものである。
好ましい実施形態では、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の処置において使用するためのものである。より好ましくは、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、プラチナ系細胞周期非特異的抗腫瘍剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、ジシクロプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、又はサトラプラチン、好ましくはシスプラチン又はカルボプラチン）に耐性であるか、又はタキサン（例えば、カバジタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセル、又はテセタキセル、好ましくはパクリタキセル又はドセタキセル、より好ましくはパクリタキセル）に耐性であるか、又はピリミジン系抗代謝薬（例えば、フルオロウラシル、カペシタビン、ドキシフルリジン、テガフール、カルモフール、フロクスウリジン、シタラビン、ゲムシタビン、アザシチジン、又はデシタビン、好ましくはゲムシタビン）に耐性であるか、又はビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンフルニン、ビンデシン、又はビノレルビン、好ましくはビノレルビン）に耐性であるか、又は葉酸抗代謝薬（アミノプテリン、メトトレキサート、ペメトレキセド、プララトレキサート、又はラルチトレキセド、好ましくはペメトレキセド）に耐性である、ＮＳＣＬＣなどの化学療法耐性ＮＳＣＬＣの処置において使用するためのものである。
好ましい実施形態では、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）の処置において使用するためのものである。より好ましくは、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、アントラサイクリン耐性ＴＮＢＣ、例えば、アクラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アムルビシン、ピラルビシン、バルルビシン、又はゾルビシン、好ましくはドキソルビシンに耐性のＴＮＢＣなどの化学療法耐性ＴＮＢＣの処置において使用するためのものである。
好ましい実施形態では、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、黒色腫の処置において使用するためのものである。より好ましくは、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、非古典的細胞周期非特異的抗腫瘍剤（例えば、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド、アルトレタミン、ミトブロニトール、又はピポブロマン、好ましくはダカルバジン又はテモゾロミド）に耐性であるか、又はタキサン（例えば、カバジタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセル、又はテセタキセル、好ましくはパクリタキセル、例えば、アルブミン結合パクリタキセル）に耐性であるか、又はプラチナ系細胞周期非特異的抗腫瘍剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、ジシクロプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、又はサトラプラチン、好ましくはシスプラチン又はカルボプラチン）に耐性であるか、又はビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンフルニン、ビンデシン、又はビノレルビン、好ましくはビンブラスチン）に耐性である、黒色腫などの化学療法耐性黒色腫の処置において使用するためのものである。他の好ましい実施形態では、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、黒色腫の処置で使用するためのものでない。
好ましい実施形態では、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、膵臓がんの処置において使用するためのものである。より好ましくは、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、タキサン（例えば、カバジタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセル、又はテセタキセル、好ましくはパクリタキセル、例えば、アルブミン結合パクリタキセル）に耐性であるか、又はピリミジン系抗代謝薬（例えば、フルオロウラシル、カペシタビン、ドキシフルリジン、テガフール、カルモフール、フロクスウリジン、シタラビン、ゲムシタビン、アザシチジン、又はデシタビン、好ましくはフルオロウラシル又はゲムシタビン）に耐性であるか、又はトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、カンプトテシン、コシテカン、ベロテカン、ジマテカン、エキサテカン イリノテカン、ラルトテカン、シラテカン、トポテカン、ルビテカン、好ましくはイリノテカン）に耐性である、膵臓がんなどの化学療法耐性膵臓がんの処置において使用するためのものである。
好ましい実施形態では、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、結腸がんの処置において使用するためのものである。より好ましくは、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、ピリミジン系抗代謝薬（例えば、フルオロウラシル、カペシタビン、ドキシフルリジン、テガフール、カルモフール、フロクスウリジン、シタラビン、ゲムシタビン、アザシチジン、又はデシタビン、好ましくはフルオロウラシル又はカペシタビン）に耐性であるか、又はトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、カンプトテシン、コシテカン、ベロテカン、ジマテカン、エキサテカン、イリノテカン、ラルトテカン、シラテカン、トポテカン、ルビテカン、好ましくはイリノテカン）に耐性であるか、又はプラチナ系細胞周期非特異的抗腫瘍剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、ジシクロプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、又はサトラプラチン、好ましくはオキサリプラチン）に耐性であるか、又はトリフルリジン若しくはチピラシル、又はトリフルリジンとチピラシルの組合せに耐性である、結腸がんなどの化学療法耐性結腸がんの処置において使用するためのものである。
好ましい実施形態では、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、腎細胞がん（ＲＣＣ）の処置において使用するためのものである。より好ましくは、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ＶＥＧＦ受容体阻害剤、例えば、アキシチニブ、セジラニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、パゾパニブ、レゴラフェニブ、セマクサニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、チボザニブ、トセラニブ、又はバンデタニブ、好ましくはスニチニブ、ソラフェニブ、又はパゾパニブ、より好ましくはソラフェニブに耐性であるＲＣＣなどの化学療法耐性ＲＣＣの処置において使用するためのものである。
好ましい実施形態では、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、頭頚部がん（ＨＮＳＣＣ）の処置において使用するためのものである。より好ましくは、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、タキサン（例えば、カバジタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセル、又はテセタキセル、好ましくはパクリタキセル又はドセタキセル）に耐性であるか、又はピリジン系抗代謝薬（例えば、フルオロウラシル、カペシタビン、ドキシフルリジン、テガフール、カルモフール、フロクスウリジン、シタラビン、ゲムシタビン、アザシチジン、又はデシタビン、好ましくはフルオロウラシル）に耐性であるか、又は葉酸抗代謝薬（アミノプテリン、メトトレキサート、ペメトレキセド、プララトレキサート、又はラルチトレキセド、好ましくはメトトレキサート）に耐性であるか、又はプラチナ系細胞周期非特異的抗腫瘍剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、ジシクロプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、又はサトラプラチン、好ましくはシスプラチン）に耐性であるか、又はアントラサイクリン（例えば、アクラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アムルビシン、ピラルビシン、バルルビシン、又はゾルビシン、好ましくはドキソルビシン）に耐性であるか、又はインターカレート架橋剤（例えば、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン、好ましくはブレオマイシン又はマイトマイシン）に耐性である、ＨＮＳＣＣなどの化学療法耐性ＨＮＳＣＣの処置において使用するためのものである。
好ましい実施形態では、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、前立腺がんの処置において使用するためのものである。より好ましくは、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、タキサン（例えば、カバジタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセル、又はテセタキセル、好ましくはドセタキセル）に耐性であるか、又はアントラセンジオン（例えば、ミトキサントロン又はピクサントロン、好ましくはミトキサントロン）に耐性であるか、又はアルキル化抗腫瘍剤（例えば、エストロゲン系アルキル化抗腫瘍剤、例えば、アレストラムスチン、アトリムスチン、シテストロールアセテート（ｃｙｔｅｓｔｒｏｌ ａｃｅｔａｔｅ）、エストラジオールマスタード、エストラムスチン、エストロムスチン、スチルボスタット（ｓｔｉｌｂｏｓｔａｔ）；又はフェネストロール、好ましくはエストラムスチン）に耐性である、前立腺がんなどの化学療法耐性前立腺がんの処置において使用するためのものである。
好ましい実施形態では、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、造血器腫瘍及びリンパ系腫瘍の腫瘍の処置において使用するためのものである。より好ましくは、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、ボルテゾミブに耐性であるか、若しくはレナリドミドに耐性である骨髄腫など、又はシクロホスファミドに若しくはヒドロキシダウノルビシンなどのアントラサイクリンに若しくはオンコビンに若しくはプレドニゾンに対する耐性など、ＣＨＯＰに若しくはリツキシマブに耐性であるリンパ腫など、又はビンクリスチン、アントラサイクリン、例えば、ドキソルビシン、Ｌ－アスパラギナーゼ、シクロホスファミド、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、クロラムブシル、シクロホスファミド、コルチコステロイド、例えば、プレドニゾン若しくはプレドニゾロン、フルダラビン、ペントスタチン、若しくはクラドリビンに耐性である白血病などの、造血器腫瘍及びリンパ系腫瘍の化学療法耐性腫瘍の処置において使用するためのものである。本明細書に記載のソラフェニブ耐性がんなどの化学療法耐性がんの処置は、ソラフェニブ処置などの化学療法が、有効でないこと、又は所期若しくは所望の効果よりも低いことが判明した場合に、セカンドライン処置となり得る。
固形腫瘍は、もともと上皮系であることが多い（すなわち、癌腫）。上皮細胞マーカー（例えば、Ｅ－カドヘリン）の損失及び間葉細胞マーカー（例えば、Ｎ－カドヘリン及びビメンチン）の取得は、前立腺がんを含む患者の腫瘍試料に対して公知である。がん細胞は、このいわゆる上皮間葉転換（ＥＭＴ）によって脱分化し得る。ＥＭＴの間、細胞間の細胞結合が破壊され、それによって、腫瘍細胞に、周囲組織へと又は血管壁を通って移動及び侵入する能力が与えられる。このような表現型の変化は、疾患の伝播において重要な役割を果たし、最終的に疾患の進行をもたらし、これは、患者にとって予後不良を伴うことが多い。
Ｅ－カドヘリン発現の損失は、ＥＭＴの分子ホールマークとみなされる。腫瘍細胞におけるＥＭＴは、細胞の転写再プログラミングから生じる。特に、Ｅ－カドヘリン（ＣＤＨ１）遺伝子プロモーターの転写抑制は、ＥＭＴ表現型を誘発することが示されている。Ｅ－カドヘリンタンパク質は、上皮細胞／組織において細胞間の接触を媒介する最も重要なカドヘリン分子の１つである。ＣＤＨ１は、転写抑制因子、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＴＣＦ３、ＴＷＩＳＴ、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２又はＫＬＦ８の、ＣＤＨ１近位プロモーター領域の３つのいわゆるＥ－ボックスへの結合によって抑制される。これらの抑制因子のＣＤＨ１プロモーターへの結合を阻害することにより、間葉上皮転換（ＭＥＴ）とも呼ばれるＥＭＴが回復し、腫瘍細胞の侵入及び腫瘍進行が阻害される。
好ましい実施形態では、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、ＥＭＴと関連する疾患又は状態の処置、防止、遅延又は軽快で使用するためのものであり、この場合、そのような疾患又は状態はＰＴＥＮ欠乏と関連する。本明細書で、ｍｉＲＮＡは好ましくはｍｉＲＮＡ－５１８ｂ分子、ｍｉＲＮＡ－５２０ｆ分子又はｍｉＲＮＡ－５２４分子；又はそのｉｓｏｍｉＲ若しくは模倣体、又はその前駆体と組み合わされる。ＥＭＴに関連する疾患又は状態は、好ましくはがん、より好ましくは膀胱がん又は前立腺がんである。この使用は、間葉上皮転換を誘導することによるのが好ましい。
好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物（本発明による使用のための組成物は本明細書で後に定義される）又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、免疫抑制腫瘍微小環境を下方制御することによるがんの処置、防止、遅延又は軽快で使用するためのものである。関連する好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、腫瘍による宿主免疫の回避を防止又は低減することによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。このような使用は、例えば、アデノシンを産生するためにＡＴＰを脱リン酸化するものなどの細胞表面エクトエンザイムの活性を阻害又は低減することによって、アデノシン生成を防止、阻害、又は低減するのに好ましい。このような使用は、ＮＴ５Ｅ発現を低減する及び／又はＥＮＴＰＤ１発現を低減する及び／又はアデノシン生成を阻害するのにより好ましい。より好ましくは、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、ＮＴ５Ｅ発現を低減するためのものである。より好ましくは、本発明による使用のためのこの組成物又は本発明による使用のためのこのｍｉＲＮＡは、ＥＮＴＰＤ１発現を低減するためのものである。より好ましくは、本発明による使用のためのこの組成物又は本発明による使用のためのこのｍｉＲＮＡは、アデノシン生成を阻害するためのものである。さらにより好ましい実施形態では、本発明による使用のためのこの組成物又は本発明による使用のためのこのｍｉＲＮＡは、がん細胞の移動を低減するためのものであり、好ましくは、アデノシン誘導性のがん細胞の移動を低減するためのものであり、最も好ましくは、ＮＴ５Ｅ発現に関連するアデノシン誘導性のがん細胞の移動を低減するためのものである。ＮＴ５Ｅ又はＥＮＴＰＤ１発現の低減は、ルシフェラーゼアッセイによって又はＲＴ－ＰＣＲによって、評価されるのが好ましい。がん細胞の移動の低減は、好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスウェルアッセイによって、評価される。
好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、がん細胞における、好ましくは肝臓がん細胞における、肺がん細胞における、膵臓がん細胞における、癌腫細胞における、又は黒色腫細胞における、より好ましくは、肝臓がん細胞における、癌腫細胞における、又は黒色腫細胞における、さらにより好ましくは、肝細胞癌細胞における又は黒色腫細胞における、Ｇ２／Ｍアレストを促進又は増加させることによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。このような使用は、ＭＰＰ２及び／又はＳＴＭＮ１などの細胞骨格に関連することによって、細胞***及び／又は増殖を調節する因子の発現又は活性を低減するのに好ましい。このような使用は、ＹＷＨＡＺ及び／又はＣＣＮＡ２などの、サイクリン依存性キナーゼに結合及び／又はそれを封鎖する因子を促進又は増加させるのに好ましい。好ましくは、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、ＭＰＰ２、ＳＴＭＮ１、ＹＷＨＡＺ、及びＣＣＮＡ２のうちの少なくとも１つの発現又は活性を低減することによる、より好ましくは、少なくともＹＷＨＡＺ又はＳＴＭＮ１の、さらにより好ましくは、少なくともＹＷＨＡＺの、最も好ましくは、ＭＰＰ２、ＳＴＭＮ１、ＹＷＨＡＺ、及びＣＣＮＡ２のそれぞれの発現又は活性を低減することによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。Ｇ２／Ｍアレストの増加は、未処置細胞と比較した場合の増加であることが好ましく、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０％又はそれより高い割合の増加であることが好ましい。これは、ＤＮＡ染色と、その後の、ＤＮＡ含量に基づく核強度を決定するための顕微鏡画像によって評価されるのが好ましい。ＭＰＰ２、ＳＴＭＮ１、ＹＷＨＡＺ、及びＣＣＮＡ２のうちの少なくとも１つの発現又は活性の低減は、好ましくは、ＲＴ－ＰＣＲを使用して評価される。
好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、がん細胞の移動、がん細胞の付着、若しくはがん細胞の増殖を低下させるか若しくは低減することによる、又はがん細胞のアポトーシスを増加させるか若しくは促進することによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。これらのがん細胞は、好ましくは、肺がん細胞、肝臓がん細胞、乳がん細胞、黒色腫細胞、又は癌腫細胞、より好ましくは肺がん細胞、肝臓がん細胞、乳がん細胞、又は癌腫細胞、さらにより好ましくは肺がん細胞、例えば、Ａ５４９及びＨ４６０、肝臓がん細胞、例えば、Ｈｅｐ３Ｂ及びＨｕｈ７、乳がん細胞、例えば、ＢＴ５４９、並びに皮膚がん細胞、例えば、Ａ２０５８である。より好ましい実施形態では、がんの処置、防止、遅延、又は軽快におけるこの使用は、ＦＯＸＲＥＤ２、ＥＲＭＰ１、ＮＴ５Ｅ、ＳＨＭＴ２、ＨＹＯＵ１、ＴＷＩＳＴＮＢ、ＡＰ２Ｍ１、ＣＬＳＴＮ１、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＤＡＺＡＰ２、Ｃ１ＱＢＰ、ＳＴＡＲＤ７、ＡＴＰ５ＳＬ、ＤＣＡＦ７、ＤＨＣＲ２４、ＤＰＹ１９Ｌ１、ＡＧＰＡＴ１、ＳＬＣ３０Ａ７、ＡＩＭＰ２、ＵＢＰ１、ＲＵＳＣ１、ＤＣＴＮ５、ＡＴＰ５Ｆ１、ＣＣＤＣ２８Ａ、ＳＬＣ３５Ｄ２、ＷＳＢ２、ＳＥＣ６１Ａ１、ＭＰＰ２、ＦＡＭ６０Ａ、ＰＩＴＰＮＢ、及びＰＯＬＥ３からなる群から選択される、さらにより好ましくは、ＮＴ５Ｅ及びＴＮＦＲＳＦ２１からなる群から選択される、少なくとも１つの遺伝子の発現又は活性を低下させることによるものであり；好ましくは、アポトーシス、細胞の移動、付着、及び増殖に関する上記の使用は、これらの遺伝子の少なくとも１つと関連するアポトーシス、細胞の移動、付着、及び／又は増殖に関する使用である。発現は、好ましくは、ＲＴ－ＰＣＲによって評価される。
好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、がん細胞のアポトーシスを増加させるか又は促進することによる、好ましくは、ＫＣＮＭＡ１、ＮＯＴＣＨ２、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＹＷＨＡＺ、ＣＡＤＭ１、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＹＡＡ、ＥＴＳ１、ＡＩＭＰ２、ＳＱＳＴＭ１、ＺＭＡＴ３、ＴＧＭ２、ＣＥＣＲ２、ＰＤＥ３Ａ、ＳＴＲＡＤＢ、ＮＩＰＡ１、ＭＡＰＫ８、ＴＰ５３ＩＮＰ１、ＰＲＮＰ、ＰＲＴ１、ＧＣＨ１、ＤＨＣＲ２４、ＴＧＦＢ２、ＮＥＴ１、ＰＨＬＤＡ２、及びＴＰＰ１からなる群から、より好ましくは、ＮＯＴＣＨ２、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＹＷＨＡＺ、ＥＴＳ１、ＴＧＦＢ２、及びＭＡＰＫ８からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子と関連するアポトーシスを増加させるか又は促進することによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。遺伝子の発現又は活性は、本発明による使用のための組成物によって又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡによって、低減されるのが好ましい。
好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、血管新生、好ましくはがん細胞に関連する血管新生を低下させるか又は阻害することによる、より好ましくはＣＲＫＬ、ＣＴＧＦ、ＺＭＩＺ１、ＴＧＭ２、ＥＬＫ３、ＬＯＸ、ＵＢＰ１、ＰＬＡＵ、ＣＹＲ６１、及びＴＧＦＢ２、さらにより好ましくはＣＲＫＬ，ＴＧＦＢ２又はＰＬＡＵ、最も好ましくはＰＬＡＵからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子と関連する血管新生を低下させるか又は阻害することによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。遺伝子の発現又は活性は、本発明による使用のための組成物によって又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡによって、低減されるのが好ましい。
好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、がん細胞の小胞体ストレス応答をモジュレートすることによる、より好ましくはＥＲＭＰ１、ＮＣＥＨ１、ＳＥＣ３１Ａ、ＣＬＳＴＮ１、ＦＯＸＲＥＤ２、ＳＥＰＮ１、ＥＸＴＬ２、ＨＹＯＵ１、ＳＬＣ３５Ｄ１、ＳＵＬＦ２、ＰＴＰＬＢ、ＨＨＡＴ、ＥＲＡＰ２、ＦＡＦ２、ＤＰＭ３、ＰＤＺＤ２、ＳＥＣ６１Ａ１、ＤＨＣＲ２４、ＩＤＳ、ＭＯＳＰＤ２、ＤＰＭ、ＰＲＮＰ、及びＡＧＰＡＴ１からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子と関連する小胞体ストレス応答をモジュレートすることによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。遺伝子の発現又は活性は、本発明による使用のための組成物によって又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡによって、低減されるのが好ましい。小胞体ストレス応答のモジュレーションは、好ましくは、小胞体ストレス応答の阻害又は低減である。
好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、がん細胞の走化性を低下させるか又は阻害することによる、より好ましくはＣＸＣＬ１、ＲＡＣ２、ＣＸＣＬ５、ＣＹＲ６１、ＰＬＡＵＲ、ＫＣＮＭＡ１、ＡＢＩ２、及びＨＰＲＴ１、最も好ましくはＰＬＡＵＲからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子と関連する走化性を低下させるか又は阻害することによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。遺伝子の発現又は活性は、本発明による使用のための組成物によって又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡによって、低減されるのが好ましい。
好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、がん細胞におけるタンパク質輸送を低下させるか又は阻害することによる、より好ましくはＳＴＯＮ２、ＲＡＢ１１ＦＩＰ５、ＳＲＰ５４、ＹＷＨＡＺ、ＳＹＮＲＧ、ＧＣＨ１、ＴＨＢＳ４、ＳＲＰ５４、ＴＯＭＭ２０、ＳＥＣ３１Ａ、ＴＰＰ１、ＳＬＣ３０Ａ７、ＴＧＦＢ２、ＡＫＡＰ１２、ＡＰ２Ｍ１、ＩＴＧＢ３、ＧＮＡＩ３、ＳＯＲＬ１、ＫＲＡＳ、ＳＬＣ１５Ａ１、ＳＥＣ６１Ａ１、ＡＰＰＬ１、ＬＲＰ４、ＰＬＥＫＨＡ８、ＳＴＲＡＤＢ、ＳＣＡＭＰ４、ＨＦＥ、ＣＡＤＭ１、ＺＭＡＴ３、ＡＲＦ３、ＶＡＭＰ８、ＮＵＰ５０、ＤＨＣＲ２４、ＲＡＢ１１ＦＩＰ５、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２、ＳＱＳＴＭ１、及びＷＮＫ４、さらにより好ましくは，ＹＷＨＡＺ，ＴＧＦＢ２，又はＫＲＡＳ、最も好ましくはＹＷＨＡＺからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子と関連するタンパク質輸送を低下させるか又は阻害することによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。遺伝子の発現又は活性は、本発明による使用のための組成物によって又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡによって、低減されるのが好ましい。
好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、がん細胞におけるヌクレオシドの代謝を低下させるか又は阻害することによる、より好ましくはＮＵＤＴ３、ＮＵＤＴ１５、ＮＵＤＴ２１、ＤＥＲＡ、ＮＴ５Ｅ、ＧＣＨ１、及びＨＰＲＴ１、最も好ましくはＮＴ５Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子と関連するヌクレオシドの代謝を低下させるか又は阻害することによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。遺伝子の発現又は活性は、本発明による使用のための組成物によって又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡによって、低減されるのが好ましい。
好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、がん細胞のグリコシル化を低下させるか又は阻害することによる、より好ましくはＳＬＣ３５Ｄ１、ＳＴ３ＧＡＬ５、ＳＵＬＦ２、ＬＡＴ２、ＧＡＬＮＴ１、ＮＣＥＨ１、ＳＴ３ＧＡＬ４、ＣＨＳＴ１４、Ｂ３ＧＮＴ３、ＤＰＭ３、ＧＡＬＮＴ１３、ＤＨＣＲ２４、ＮＵＤＴ１５、ＩＤＨ２、ＰＰＴＣ７、ＨＰＲＴ１、ＥＸＴＬ２、ＳＥＣ６１Ａ１、ＥＲＡＰ２、及びＧＡＬＮＴ１４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子と関連するグリコシル化を低下させるか又は阻害することによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。遺伝子の発現又は活性は、本発明による使用のための組成物によって又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡによって、低減されるのが好ましい。
好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、発癌を低下させるか又は阻害することによる、より好ましくはＣＣＮＤ１、ＣＢＬ、ＣＸＣＬ１、ＣＲＫＬ、ＭＡＸ、ＫＣＮＭＡ１、ＴＢＬ１ＸＲ１、ＧＮＡＩ３、ＹＷＨＡＺ、ＲＡＣ２、ＥＴＳ１、ＰＴＣＨ１、ＭＡＰＫ８、ＬＡＭＣ２、ＰＩＫ３Ｒ１、ＣＤＫ６、ＣＢＬ、ＡＰＰＬ１、ＧＮＡＩ３、ＰＤＥ３Ａ、ＴＧＦＢ２、ＡＢＩ２、ＭＡＸ、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸ、ＣＸＣＬ５、ＡＲＰＣ５、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、及びＴＨＢＳ４からなる群から選択される、さらにより好ましくはＣＲＫＬ、ＴＧＦＢ２、ＹＷＨＡＺ、ＥＴＳ１、ＭＡＰＫ８、及びＣＤＫ６から、最も好ましくはＹＷＨＡＺ、ＥＴＳ１、ＭＡＰＫ８、及びＣＤＫ６から選択される少なくとも１つの遺伝子と関連する発癌を低下させるか又は阻害することによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。遺伝子の発現又は活性は、本発明による使用のための組成物によって又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡによって、低減されるのが好ましい。
好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、機能障害性創傷治癒を低下させるか又は阻害することによる、より好ましくはＮＯＴＣＨ２、ＫＣＮＭＡ１、ＣＸＣＬ１、ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＵ、ＣＣＮＤ１、ＺＭＩＺ１、ＥＬＫ３、ＹＷＨＡＺ、ＩＬ１１、ＰＬＡＵＲ、ＬＯＸ、ＣＴＧＦ、及びＴＧＦＢ２からなる群から選択される、さらにより好ましくはＴＧＦＢ２、ＮＯＴＣＨ２、ＰＬＡＵ、ＹＷＨＡＺ、及びＰＬＡＵＲから、最も好ましくはＮＯＴＣＨ２、ＰＬＡＵ、ＹＷＨＡＺ、及び任意選択でＰＬＡＵＲから選択される、少なくとも１つの遺伝子と関連する機能障害性創傷治癒を低下させるか又は阻害することによる、がんの処置、防止、遅延、軽快において使用するためのものである。遺伝子の発現又は活性は、本発明による使用のための組成物によって又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡによって、低減されるのが好ましい。
好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、免疫活性化、好ましくはがんに対する免疫応答と関連する免疫活性化を増加させるか又は促進することによる、より好ましくはＮＯＴＣＨ２、ＬＡＴ２、ＣＲＫＬ、ＬＲＲＣ８Ａ、ＹＷＨＡＺ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＩＲＦ１、ＴＧＦＢ２、ＩＬ１１、ＵＮＧ、ＣＤＫ６、及びＨＰＲＴ１からなる群から選択される、さらにより好ましくはＣＲＫＬ、ＴＧＦＢ２、ＮＯＴＣＨ２、ＹＷＨＡＺ、及びＣＤＫ６から、最も好ましくはＮＯＴＣＨ２、ＹＷＨＡＺ、及びＣＤＫ６から選択される、少なくとも１つの遺伝子と関連する免疫活性化を増加させるか又は促進することによる、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。遺伝子の発現又は活性は、本発明による使用のための組成物によって又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡによって、低減されるのが好ましい。
本発明は、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡで、又は本発明による使用のための組成物で処置した対象から得られたＴ細胞も提供する。このようなＴ細胞は、本明細書の他の箇所に記載したがんの処置において使用するためのものであり得る。その使用では、Ｔ細胞は、好ましくは本発明による使用のためのｍｉＲＮＡで、又は本発明による使用のための組成物で処置された対象から前もって得られる。Ｔ細胞は、ヒト対象に由来することが好ましい。ワクチンとして、又はがんの再発若しくは転移を防止するのに使用するためのものであることが好ましい。
好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、ＣＤＫ６、ＥＩＦ４Ｂ、ＥＴＳ１、ＩＬ１７ＲＤ、ＭＣＬ１、ＭＡＰＫ８、ＮＯＴＣＨ２、ＮＴ５Ｅ、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、ＴＮＦＲＳＦ２１、及びＹＷＨＡＺからなる群から選択される、より好ましくはＮＯＴＣＨ２、ＮＴ５Ｅ、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、及びＹＷＨＡＺから選択される、少なくとも１つの遺伝子と関連するがんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。
好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＲＫＬ、ＮＴ５Ｅ、ＨＭＧＢ１、ＩＬ１７ＲＤ、ＫＲＡＳ、ＫＩＴ、ＨＤＡＣ３、ＲＴＫ２、ＴＧＦＢ２、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＰＬＡＵ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、及びＹＡＰ１からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子と関連するがんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。これらの遺伝子は、抗腫瘍免疫における関与が知られている。
好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、ＥＴＳ１、ＹＷＨＡＺ、ＭＰＰ２、ＰＬＡＵ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＩＦ４Ｂ、ＲＡＤ５１、ＣＣＮＡ２、ＳＴＭＮ１、及びＤＣＡＦ７からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子と関連するがんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものである。これらの遺伝子は、細胞周期の調節に関与する。
好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、がんの処置、防止、遅延、又は軽快において使用するためのものであり、好ましいがんは、結腸癌などの結腸がん、肺癌などの肺がん、黒色腫、細網肉腫などのリンパ腫、膵腺癌などの膵臓がん、肝細胞癌又は肝細胞腫などの肝臓がん、乳癌などの乳がん、前立腺がん、腎腺癌などの腎臓がん、腺癌又は結腸、肺、肝臓、膵臓、腎臓、若しくは乳癌などの癌腫、及び膵腺癌又は腎腺癌などの腺癌からなる群から選択されるがんである。より好ましいがんは、結腸癌などの結腸がん、肺癌などの肺がん、黒色腫、細網肉腫などのリンパ腫、膵腺癌などの膵臓がん、肝細胞癌などの肝臓がん、乳癌などの乳がん、前立腺がん、腺癌又は結腸、肺、肝臓、膵臓、若しくは乳癌などの癌腫、及び膵腺癌などの腺癌からなる群から選択されるがんである。さらにより好ましいがんは、結腸癌などの結腸がん、肺癌などの肺がん、黒色腫、細網肉腫などのリンパ腫、及び結腸、肺などの癌腫からなる群から選択されるがんである。
さらに好ましい実施形態では、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、がんの処置において使用するためのものであり、組成物は、ソラフェニブなどのさらなる化学療法剤と組み合わされる。これは、以降で、本発明による組合せと称される。本発明による組合せは、本発明による使用のための組成物として、上記のように、使用するためのものであることが好ましい。
本発明による組合せは、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡを含む、及びがんの処置に好適なキナーゼ阻害剤薬物などの化学療法剤を含む組合せ、例えば、本発明による使用のための組成物を含む、及びソラフェニブを含む、又は、例えば、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡを含む及びソラフェニブを含む組合せなどである。
好適な化学療法剤は、ソラフェニブなどのキナーゼ阻害剤薬物又はＢ－ｒａｆ阻害剤又はＭＥＫ阻害剤又はＲＮＲ阻害剤又はＡＵＲＫＢ阻害剤である。好ましいＢ－ｒａｆ阻害剤は、ベムラフェニブ及び／又はダブラフェニブである。好ましくはＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブ及び／又はセルメチニブである。好ましいＲＮＲ阻害剤は、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、ｃｌｏｌａｒ クロファラビン及びトリアピンからなる群から選択される。
Ｂ－ｒａｆ阻害剤は、ＢＲＡＦ遺伝子の変異形態をコードする、Ｂ－ｒａｆタンパク質を特異的に阻害する化合物である。ＢＲＡＦ遺伝子のいくつかの変異は、黒色腫を引き起こすことが知られており、Ｂ－ｒａｆタンパク質の変異形態を阻害する特異的化合物が開発されてきた。Ｂ－ｒａｆ阻害剤は、当技術分野で公知であり、これらに限定されないが、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、トラメチニブ、ＧＤＣー０８７９、ＰＬＸー４７２０、ソラフェニブ、ＳＢ５９０８８５、ＰＬＸ４７２０、ＸＬ２８１及びＲＡＦ２６５を含む。Ｂ－ｒａｆ阻害剤は、例えば、Ｗｏｎｇ Ｋ．Ｋ．らに記載されている。１つのＢ－ｒａｆ阻害剤は、本発明による組合せにおいて他のＢ－ｒａｆ阻害剤と一緒に使用されてもよい。本発明で使用される好ましいＢ－ｒａｆ阻害剤は、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ又はベムラフェニブとダブラフェニブの混合物である。ベムラフェニブは、ＲＧ７２０４又はＮ－（３－｛［５－（４－クロロフェニル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－３－イル］カルボニル｝－２，４ージフルオロフェニル）プロパン－１－スルホンアミドとしても知られており、Ｚｅｌｂｏｒａｆとして市販されている。ダブラフェニブは、Ｎ－｛３－［５－（２－アミノピリミジン－４－イル）－２－（１，１－ジメチルエチル）チアゾール－４－イル］－２－フルオロフェニル－２，６－ジフルオロベンゼンスルホンアミドとしても知られている。
ＭＥＫ阻害剤は、ＭＥＫタンパク質を特異的に阻害する化合物である。いくつかのＭＥＫ阻害剤は、当技術分野で公知であり、これらに限定されないが、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、セルメチニブ（ＡＺＤ－６２４４）、ＸＬ５１８、ＣＩ－１０４０、ＰＤ０３５９０１を含む。トラメチニブは、Ｎ－（３－（３－シクロプロピル－５－（２－フルオロ－４－ヨードフェニルアミノ）－６，８－ジメチル－２，４，７－トリオキソ－３，４，６，７－テトラヒドロピリド［４，３－ｄ］ピリミジン－１（２Ｈ）－イル）フェニル）アセトアミドとしても公知である。セルメチニブは、６－（４－ブロモ－２－クロロフェニルアミノ）－７－フルオロ－Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－３－メチル－３Ｈベンゾ［ｄ］イミダゾール－５－カルボキサミドとしても公知である。ＭＥＫ阻害剤は、例えば、Ｗｏｎｇ，Ｋ．Ｋ．（ＰＭＩＤ：１９１４９６８６）に記載されている。１つのＭＥＫ阻害剤は、本発明による組合せにおいて、他のＭＥＫ阻害剤と一緒に使用されてもよい。いくつかのＭＥＫ阻害剤は、いくつかの別個のＭＥＫ阻害剤と同義である。本発明において使用される好ましいＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブ及び／又はセルメチニブである。
ＲＮＲ及び／又はＡＵＲＫＢ阻害剤は、ＲＮＡ及び／又はＡＵＲＫＢタンパク質を特異的に阻害する化合物である。ＲＮＲは、リボヌクレオチド還元酵素（ＲＮＲ）であり、それ自体、リボヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）のデオキシリボヌクレオシド二リン酸（ｄＮＤＰ）へのｄｅ ｎｏｖｏ変換を担う唯一の酵素である（Ｚｈｏｕら ２０１３年）。ＲＮＲは、細胞内のｄＮＴＰ供給の重要な調節因子である。均衡なｄＮＴＰプールの維持は、ＤＮＡ合成及び修復のための基質における不均衡の結果に変異誘発及び細胞死が含まれるため、基礎的な細胞機能である。ヒトＲＮＲは、酵素調節因子に対する触媒部位と２つの結合部位を含有するサブユニット（ＲＲＭ１）及び触媒に必要な安定したチロシルラジカルを生じる二核鉄補因子（ｂｉｎｕｃｌｅａｒ ｉｒｏｎ ｃｏｆａｃｔｏｒ）を有するｂサブユニット（ＲＲＭ２）から構成される。ＲＮＲの阻害剤は、ＲＲＭ１及び／又はＲＲＭ２を阻害し得る。好ましいＲＮＲ阻害剤は、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、ｃｌｏｌａｒ クロファラビン及びトリアピンからなる群から選択される。
ＡＵＲＫＢ（Ａｕｒｏｒａ Ｂキナーゼ）は、セントロメアへの紡錘体の付着において機能するタンパク質である。有糸***及び減数***の間の染色体分離は、キナーゼとホスファターゼによって調節される。Ａｕｒｏｒａキナーゼは、染色体移動及び分離の間の微小管に関連する。がん細胞では、これらの酵素の過剰発現が、がんのホールマークである異数体細胞を作成する、遺伝情報の不均一な分布をもたらす。
化学療法剤は、本明細書で定義される抗がん作用を誘導又は促進することができる薬物である。好ましい化学療法剤は、キナーゼ阻害剤又はＲＮＲ阻害剤又はＡＵＲＫＢ阻害剤である。このような阻害剤の例は、ＲＮＲ及び／又はＡＵＲＫＢタンパク質を特異的に阻害する化合物である。ＲＮＲ及び／又はＡＵＲＫＢタンパク質を阻害する治療用化合物の能力を評価するために、リードアウトとしてＲＮＲ（ＲＲＭ１及び／又はＲＲＭ２）又はＡＵＲＫＢタンパク質を用いるウエスタンブロッティングを実施することができる。細胞を６ウェルプレートにプレーティングし、０．０１、０．１及び１μＭの前記化合物で７２時間処置した。処置後、ＲＩＰＡ溶解緩衝液としての溶解緩衝液中に細胞をスクレープする。等量のタンパク質抽出物を１０％のＳＤＳ ＰＡＧＥを使用することによって分離し、次いで、ポリフッ化ビニリデンの膜に移した。０．１％のＴｗｅｅｎ ２０と５％の無脂肪乳を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中で１時間ブロッキングした後、ＲＮＲ（すなわち、ＲＲＭ１及び／又はＲＲＭ２）及び／又はＡＵＲＫＢ一次抗体、続いて、フィルム上での化学蛍光検出のための西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされた二次抗体で膜をプローブした。チューブリンをローディング対照として使用する。使用される好ましいＲＲＭ２抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（製品番号 ｓｃ－１０８４６）に由来し、及び／又は好ましいＡＵＲＫＢ抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ（製品番号 ３０９４）に由来する。前記ＲＮＲ及び／又はＡＵＲＫＢ阻害剤の治療能力の評価は、ノーザンブロットを行うことによって又はＰＣＲによってＲＮＡレベルでも評価することができる。
本発明による好ましい組合せは：
ｉ）本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡ、並びに
ｉｉ）
ａ．ＶＥＧＦ受容体阻害剤などの受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、アキシチニブ、セジラニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、パゾパニブ、レゴラフェニブ、セマクサニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、チボザニブ、トセラニブ、又はバンデタニブ、好ましくはスンチニブ、ソラフェニブ、又はパゾパニブ、より好ましくはソラフェニブ；
ｂ．プラチナ系細胞周期非特異的抗腫瘍剤、例えば、カルボプラチン、シスプラチン、ジシクロプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、又はサトラプラチン、好ましくはシスプラチン又はカルボプラチン又はオキサリプラチン；
ｃ．タキサン、例えば、カバジタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセル、又はテセタキセル、好ましくはパクリタキセル又はドセタキセル、より好ましくはパクリタキセル又はドセタキセル；
ｄ．ピリミジン系抗代謝薬、例えば、フルオロウラシル、カペシタビン、ドキシフルリジン、テガフール、カルモフール、フロクスウリジン、シタラビン、ゲムシタビン、アザシチジン、又はデシタビン、好ましくはフルオロウラシル又はゲムシタビン又はカペシタビン；
ｅ．ビンカアルカロイド、例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンフルニン、ビンデシン、又はビノレルビン、好ましくはビノレルビン又はビンブラスチン；
ｆ．葉酸抗代謝薬、アミノプテリン、メトトレキサート、ペメトレキセド、プララトレキサート、又はラルチトレキセド、好ましくはペメトレキセド又はメトトレキサート；
ｇ．アントラサイクリン、例えば、アクラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アムルビシン、ピラルビシン、バルルビシン、又はゾルビシン、好ましくはドキソルビシン；
ｈ．非古典的細胞周期非特異的抗腫瘍剤、例えば、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド、アルトレタミン、ミトブロニトール、又はピポブロマン、好ましくはダカルバジン又はテモゾロミド；
ｉ．タキサン、例えば、カバジタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセル、又はテセタキセル、好ましくはパクリタキセル、例えば、アルブミン結合パクリタキセル；
ｊ．トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、カンプトテシン、コシテカン、ベロテカン、ジマテカン、エキサテカン、イリノテカン、ラルトテカン、シラテカン、トポテカン、ルビテカン、好ましくはイリノテカン；
ｋ．トリフルリジン又はチピラシル、又はトリフルリジンとチピラシルの組合せ；
ｌ．インターカレート架橋剤、例えば、アクチノマイシン、ブレオマイシ、マイトマイシン、プリカマイシン、好ましくはブレオマイシン又はマイトマイシン；
ｍ．アントラセンジオン、例えば、ミトキサントロン又はピクサントロン、好ましくはミトキサントロン；及び
ｎ．アルキル化抗腫瘍剤、例えば、エストロゲン系アルキル化抗腫瘍剤、例えば、アレストラムスチン、アトリムスチン、シテストロールアセテート、エストラジオールマスタード、エストラムスチン、エストロムスチン、スチルボスタット；又はフェネストロール、好ましくはエストラムスチン
からなる群から選択される、少なくとも１つの化学療法剤
を含む。
好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、がんの処置において使用するためのものであり、組成物は、がん細胞への免疫応答を増加させる。これは、免疫応答が存在しない場合に、免疫応答が開始することを意味し得る。
免疫応答を増加させるためにより好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、サイトカイン、例えば、ＩＬ－２を活性化する免疫系の生成を増加させるためのものである。好ましくは、サイトカイン産生は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合で増加され、好ましくは、ＦＡＣＳによって、検出されるのが好ましい。サイトカインを活性化する免疫系を、処置の１週間後に、三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）に関する４Ｔ１マウスモデルで増加させる。サイトカインの増加により、がんの免疫抑制の上昇が導かれ、そうでなければ免疫抑制に感受性ではないがんの免疫抑制又は部分的免疫抑制がもたらされ得る。好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、Ｔ細胞の機能を増大させる、例えば、ＩＦＮγ及びＩＬ－２の産生を増加させるためのものである。
免疫応答を増加させるためのより好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、調節性Ｔ細胞集団を減少させるためのものである。調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、免疫抑制調節性Ｔ細胞であり、Ｔｒｅｇを減少させることは、がんに対する免疫応答を増加させる。好ましくは、Ｔｒｅｇは、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合で減少する。Ｔｒｅｇの減少は、ＦＯＸＰ３又はＬＡＧ３の決定によって、決定することができる。この効果は、上記のように、サイトカイン産生の増加と並行することが好ましい。
ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の動員は、処置の２週間後に、三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）に関する４Ｔ１マウスモデルで増加し、Ｔ細胞の機能が誘導される一方、Ｔｒｅｇ集団は減少する。したがって、免疫応答を増加させるための好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、Ｔ細胞の出現頻度を増加させるためのものである。好ましくは、このような増加は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合である。このような増加は、ＣＤ８を測定することによって、決定することができる。免疫応答を増加させるための好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、Ｔ細胞の機能を誘導させるため、好ましくは、ＩＦＮγ産生を誘導することによってＴ細胞の機能を誘導するためのものである。最も好ましくは、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、Ｔ細胞の出現頻度を増加させ、好ましくは同時に調節性Ｔ細胞集団を減少させながら、同時にＴ細胞の機能を誘導するためのものである。Ｔｒｅｇが減少し、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞が増加した腫瘍は、「ホット」腫瘍と称され、免疫抑制された微小環境を有さない腫瘍である。逆に、免疫抑制された微小環境における腫瘍は、「コールド」腫瘍と称される。
さらに、本発明による組成物は、ＥＮＴＰＤ１（ＣＤ３９）又はＴＩＭ－３などの免疫抑制標的遺伝子の発現を低減することができる。このような低減は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合であることが好ましい。ＴＩＭ－３又はＥＮＴＰＤ１発現は、ｑＰＣＲによって、決定することができる。ＥＮＴＰＤ１は、トリホスホ及びジホスホヌクレオシドのγ－及びβーホスフェート残基のモノホスホヌクレオシド誘導体への加水分解を触媒するエクトヌクレオチダーゼである。これは、多量のアデノシンの生成によって免疫抑制の役割を有する。ＥＮＴＰＤ１発現の低減は、腫瘍細胞への免疫応答を増加させる。ＴＩＭ－３は、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＨＡＶＣＲ２）としても知られており、免疫抑制マーカーとして作用する阻害性受容体である、免疫チェックポイントである。ＴＩＭ－３は、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞上で主に発現され、マクロファージの活性化を抑制する。ＴＩＭ－３発現の低減は、腫瘍細胞への免疫応答を増加させる。好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、ＥＮＴＰＤ１の若しくはＴＩＭ－３の発現を低減するためのものであるか又はＥＮＴＰＤ１及びＴＩＭ－３の発現を低減するためのものである。
免疫系に関する本発明による組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡのプラスの効果は、それが、腫瘍細胞及びがん細胞に関するため、新たな腫瘍の成長を防止するか、転移を防止するか、又は例えば、手術によって、サイズで除去された腫瘍の成長を低減するのに好適である、本発明をもたらす。例えば、本発明による使用のための組成物による処置によって、手術によって切除された腫瘍の再成長が低減され、このような腫瘍の転移が低減され、罹患した対象の生存が増加する。転移が由来する腫瘍は、原発腫瘍と称される。さらに、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡで処置された特定の腫瘍型を有する対象は、既に処置されたのと同じ型の新たな腫瘍細胞を再度負荷した場合に、腫瘍取込みの制限を示す。腫瘍取込みの制限後に、腫瘍は完全に退縮する。異なる腫瘍型を負荷した場合、腫瘍を完全に取り込むが、次に、完全に退縮もする。
したがって、好ましい実施形態では、本発明による組成物及び本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、がん又は転移性がんを防止する、低減する、又は遅延させるための医薬品として使用するためのものである。この文脈では、好ましいがんは、乳がん、癌腫、及び肝臓がん、より好ましくは乳がん及び肝臓がんである。
したがって、好ましい実施形態では、本発明による組成物及び本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、がんワクチンとして使用するためのものであり、好ましくは、がんの防止又は処置のためのがんワクチンとして使用するためのものである。このようなワクチンは、好ましくは、原発腫瘍の再成長又は再発を防止又は低減するためのものである。好ましくは、再成長は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合で低減される。別の使用では、このようなワクチンは、好ましくは、転移性がんを低減又は処置するためのものである。好ましくは、転移性がんは、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合で低減され、或いはがん細胞の運動能は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合で低減される。この文脈では、好ましいがんは、乳がん、癌腫、及び肝臓がん、より好ましくは乳がん及び肝臓がんである。
したがって、好ましい実施形態では、本発明による組成物及び本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、医薬として使用するためのものであり、医薬は、転移性がんの防止、低減、又は処置のためのものであり、好ましくは、原発腫瘍は、手術によって切除されているか又は退縮しており、より好ましくは、原発腫瘍は、手術によって切除されている。好ましくは、転移性がんは、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合で低減される。この文脈では、好ましいがんは、乳がん、癌腫、及び肝臓がん、より好ましくは乳がん及び肝臓がんである。
したがって、好ましい実施形態では、本発明による組成物及び本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、医薬として使用するためのものであり、医薬は、手術による切除後に、がんの再成長又は再発の防止、低減、又は処置のためのものである。好ましくは、再成長又は再発は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合で低減される。この文脈では、好ましいがんは、乳がん、癌腫、及び肝臓がん、より好ましくは乳がん及び肝臓がんである。
したがって、好ましい実施形態では、本発明による組成物及び本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、医薬として使用するためのものであり、医薬は、前記がんが退縮したか又は処置に成功した後の、がんの再成長又は再発の防止、低減、又は処置のためのものである。好ましくは、再成長又は再発は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合で低減される。この文脈では、好ましいがんは、乳がん、癌腫、及び肝臓がん、より好ましくは乳がん及び肝臓がんである。
好ましい実施形態では、本発明による組成物又は本発明によるｍｉＲＮＡは、免疫原性細胞死を誘導することにおいて使用するためのものである。好ましくは、この使用は、腫瘍細胞を死滅させること及び樹状細胞の成熟の刺激を包含する。本明細書で定義されるｍｉＲＮＡ－１９３ａは、免疫原性細胞死を誘導するのに好適であることが見出された。
好ましい実施形態では、本発明による（使用のための）組成物又は本発明による（使用のための）ｍｉＲＮＡは、樹状細胞の成熟を促進するための、好ましくは単球からの樹状細胞の成熟を促進するためのものである。樹状細胞（又は、それらの前駆体単球）は、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡを含む細胞に近接するときに、例えばトランスフェクションのため、又は増強された発現のために、特に増強された速度で成熟する。樹状細胞の成熟は、表面マーカー、好ましくはＣＤ８０又はＭＨＣＩＩの発現をモニタリングすることによって決定することができる。好ましくは、対象を本発明による使用のためのｍｉＲＮＡで処置した後に、樹状細胞はプラセボ対照と比較して少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９又は９．５倍多くの表面マーカーを発現する。この文脈では、処置される好ましい対象は、本明細書の他の場所で記載される状態を患い、さらに障害のある免疫系も患う対象である。本明細書で定義されるｍｉＲＮＡ－１９３ａは、樹状細胞の成熟を促進するのに好適であることが見出された。
好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、腫瘍細胞の増殖を阻害するためのものである。本発明による組成物は、Ｋ－ＲＡＳ及びＭＣＬ１の発現を低減し、腫瘍細胞の増殖の低減をもたらすことができる。ＫＲＡＳ、Ｋ－ｒａｓ、Ｋｉ－ｒａｓとしても知られているＫ－ＲＡＳは、当技術分野で公知の癌原遺伝子である。ＭＣＬ１は、誘導性骨髄性白血病細胞分化タンパク質Ｍｃｌ－１としても公知である。これは、アポトーシスを阻害することによって、がん細胞の生存を促進し得る。Ｋ－ＲＡＳとＭＣＬ１は両方とも、がん細胞の増殖を促進する。好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、Ｋ－ＲＡＳ若しくはＭＣＬ１の発現を低減するためのもの、又はＫ－ＲＡＳ及びＭＣＬ１の発現を低減するためのものである。好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、Ｋ－ＲＡＳ及びＭＣＬ１及びＥＮＴＰＤ１及びＴＩＭ－３の発現を低減するためのものである。
増殖の阻害は、アポトーシスの誘導によることが好ましい。本発明による組成物は、カスパーゼの活性化及びＰＡＲＰ切断によるＰＡＲＰの不活性化によって、がん細胞のアポトーシスを誘導する。好ましいカスパーゼの活性化は、カスパーゼ３／７の活性化である。ＰＡＲＰは、ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼとしても公知であり、プログラム細胞死に関与するタンパク質のファミリーを指す。これは、カスパーゼ３によって及びカスパーゼ７によって、ｉｎ ｖｉｖｏで切断され、アポトーシスを誘発する。ＰＡＲＰの切断は、ブロッティング技法によって決定することができ、カスパーゼの活性化は、ブロッティングによりＰＡＲＰの切断を決定することによって、又はｑＰＣＲによって、アッセイすることができる。好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、がん細胞においてアポトーシスを誘導するためのものである。好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、カスパーゼ３及びカスパーゼ７を活性化するためのものである。好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、ＰＡＲＰを不活性化するためのものである。好ましくは、ＰＡＲＰは、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合で不活性化される。ＰＡＲＰの不活性化は、ブロッティング技法によってモニタリングし、未切断酵素のより小さい断片を検出することができる。好ましくは、カスパーゼの活性は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合で増加する。
さらなる好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、Ｋ－ＲＡＳ、ＭＣＬ１、ＥＮＴＰＤ１、ＴＩＭ－３、ｃ－Ｋｉｔ、ＣｙｃｌｉｎＤ１、及びＣＤ７３からなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を低減するためのものである。ｃ－Ｋｉｔは、チロシン－タンパク質キナーゼキット又はＣＤ１１７としても知られている癌原遺伝子であり、受容体チロシンキナーゼタンパク質をコードする。サイクリンＤ１の過剰発現は、早期のがん発症及び腫瘍進行と相関する。ＣＤ７３は、５’－ヌクレオチダーゼ（５’－ＮＴ）として、及びエクト－５’－ヌクレオチダーゼとしても公知である。ＣＤ７３によってコードされる酵素は、エクト－５－プライム－ヌクレオチダーゼ（５－プライム－リボヌクレオチドホスホヒドロラーゼ；ＥＣ ３．１．３．５）であり、中性ｐＨで、プリン５－プライムモノヌクレオチドのヌクレオシドへの変換を触媒し、好ましい基質はＡＭＰである。このような遺伝子の発現は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合で低減されるのが好ましく、例えば、ｑＰＣＲ技法によって決定することができる。
好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、アデノシンＡ２Ａ受容体経路を調節するためのものである。ＡＤＯＲＡ２Ａとしても知られているアデノシンＡ２Ａ受容体は、免疫細胞を抑制することができるアデノシン受容体である。上記のように、ＣＤ７３の及び／又はＥＮＴＰＤ１の発現を低減する際の、本発明による組成物の活性は、Ａ２Ａ受容体経路を妨害し、免疫抑制を低減する。これは、免疫監視を回避する腫瘍細胞の能力が低減されるため、抗腫瘍効果をもたらす。好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、免疫監視に対する腫瘍細胞の感受性を増加させるためのものである。このような増加は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％若しくは７５％、又はそれより高い割合の腫瘍体積の低減をもたらすのが好ましい。より好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物又は本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の動員を増加させながら、好ましくは、ＬＡＧ３の若しくはＦｏｘＰ３の、又は両方の発現を低減することなどによって、Ｔｒｅｇを減少させながら、免疫監視に対する腫瘍細胞の感受性を増加させるためのものである。免疫監視に対して増加した感受性は、腫瘍体積の低減をもたらすことが好ましい。
本発明者らは、ｍｉＲＮＡ－１９３ａがいくつかの経路及び遺伝子をモジュレートすることを見出した。ｍｉＲＮＡ－１９３ａのこの活性は、それらの経路又は遺伝子と関連する状態を処置するために使用することができる。したがって、好ましい実施形態では、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はそのソースが提供され、ここでｍｉＲＮＡ－１９３ａは、ＲＰＳ６ＫＢ２、ＫＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＢ、ＳＯＳ２、ＴＧＦＢＲ３、ＣＡＳＰ９、ＩＮＰＰＬ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＫ２、ＣＢＬ、ＰＤＰＫ１、ＣＣＮＤ１、ＢＣＡＲ１、ＭＡＧＩ３、ＭＤＭ２、ＹＷＨＡＺ及びＭＣＬ１、及び任意選択でＨＭＧＢ２からなる群から、好ましくはＲＰＳ６ＫＢ２、ＫＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＢ、ＣＡＳＰ９、ＩＮＰＰＬ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＫ２、ＣＢＬ、ＰＤＰＫ１、ＣＣＮＤ１、ＢＣＡＲ１、ＭＡＧＩ３、ＭＤＭ２、ＹＷＨＡＺ、ＭＣＬ１からなる群から選択される、より好ましくはＰＤＰＫ１又はＩＮＰＰＬ１から選択される遺伝子の発現をモジュレートする。このモジュレーションは、好ましくは下方制御である。好ましい実施形態では、ＰＤＰＫ１はｍｉＲＮＡによってモジュレートされ、好ましくは下方制御される。好ましい実施形態では、ＩＮＰＰＬ１はｍｉＲＮＡによってモジュレートされ、好ましくは下方制御される。一実施形態では、遺伝子はＨＭＧＢ１であり、それは好ましくは下方制御される。
モジュレーションは、本明細書の他の箇所で定義される。上方制御は、発現の増加を指し、それは増加した転写、ｍＲＮＡの生成、翻訳、遺伝子産物の生成及び／又は遺伝子産物の活性を指すことができる。下方制御は発現の減少を指し、減少した転写、ｍＲＮＡの生成、翻訳、遺伝子産物の生成及び／又は遺伝子産物の活性を指すことができる。好ましくは、上方制御及び下方制御はｍＲＮＡの生成の転写を指す。他の好ましい実施形態では、上方制御及び下方制御は遺伝子産物の活性を指す。上方制御及び下方制御は、好ましくは参照と、例えば健常な細胞と、又は、例えばさもなければ同一の条件の下で培養されるときの未処置の細胞と比較したものである。例えば、ｍｉＲＮＡ－１９３ａが細胞中のＩＮＰＰＬ１の下方制御のために使用されるならば、ｍｉＲＮＡ－１９３ａは、好ましくはｍｉＲＮＡ－１９３ａと接触しなかった細胞（同じ種類の）と比較して、その細胞でのＩＮＰＰＬ１の発現を減少させる。発現の変化は、好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、２００、２５０％又はそれ以上、より好ましくは少なくとも５０％以上、さらにより好ましくは少なくとも１００％以上である。下方制御の場合には、任意選択で下方制御の後にはいかなる検出可能な発現もない。
本発明による使用のための組成物及び本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、腫瘍細胞において細胞周期アレストを促進する。好ましい実施形態では、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡ又は本発明による使用のための組成物は、がんの処置における使用のためのものであり、この使用は、細胞周期アレストを誘導するためのものである。細胞周期アレストプロファイルは、例えば核画像化又はフローサイトメトリーを実行することによって測定することができ、好ましくは実施例で実証される通りである。この文脈では、細胞周期アレストは、好ましくはＧ２／Ｍ又はＳｕｂＧ１細胞周期アレストプロファイルの誘導である。好ましくは、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％又はそれ以上の腫瘍細胞が細胞周期アレストを受ける。好ましくは、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡが、ＰＴＥＮ欠乏性の黒色腫、肝がん、癌腫、肺がん又は膵がんを処置するためのものである場合、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡは、細胞周期アレストプロファイルを増加させるためのものである。
組成物
本発明は、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡを含む組成物にも関し、ここで、組成物はその同じ使用のためのものである。そのような組成物は、本発明による使用に関するｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はそのソースを含む。それは、本発明による使用のための組成物と以降で呼ばれる。好ましくは、そのような組成物は、医薬組成物である。そのような組成物は、好ましくは薬学的に許容される溶媒、又は薬学的に許容される賦形剤、又は薬学的に許容される希釈剤、又は薬学的に許容される担体をさらに含む。
本発明による使用のための好ましい組成物は、ｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はそのソースを含み、ここで好ましくは、ｍｉＲＮＡ－１９３ａはｍｉＲＮＡ－１９３ａ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はその模倣体である。より好ましくは、本発明による使用のための組成物は、ｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はそのソースを含み、ここで、ｍｉＲＮＡ－１９３ａはｍｉＲＮＡ－１９３ａ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はその模倣体であり、配列番号２２で表されるシード配列の７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含むシード配列を有するオリゴヌクレオチドである。非常に好ましい組成物は、後に本明細書で定義されるようなナノ粒子を含む。
好ましい実施形態では、この態様は、さらなるｍｉＲＮＡ又はその前駆体をさらに含む、本発明による使用のための組成物を提供し、ここで、さらなるｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ－３２３、ｍｉＲＮＡ－３４２、ｍｉＲＮＡ－５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ－５２０ｆ－ｉ３、ｍｉＲＮＡ－３１５７及びｍｉＲＮＡ－７又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体からなる群から選択される。
本発明者らは、本発明による使用のための組成物として使用するとき、ジアミノ脂質を含むナノ粒子製剤が優れた結果を提供することを驚くべきことに見出した。したがって、好ましい実施形態では、本発明による使用のための組成物はナノ粒子組成物であり、ナノ粒子はジアミノ脂質及び上で定義されたｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はそのソースを含み、
ジアミノ脂質は一般式（Ｉ）
Figure 2023515010000002
（式中、
ｎは、０、１又は２であり、
Ｔ１、Ｔ２及びＴ３はそれぞれ独立して、任意選択で不飽和であり、０、１、２、３又は４つの置換基を有するＣ１０～Ｃ１８鎖であり、置換基は、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルケニル、及びＣ１～Ｃ４アルコキシからなる群から選択される）のものである、ナノ粒子組成物。
そのような組成物は、本発明による使用のためのナノ粒子組成物と以降で呼ばれる。この出願の文脈では、ナノ粒子は、ナノメートル範囲、又は一部の場合にはマイクロメートル範囲の寸法を有する粒子である。好ましくは、ナノ粒子は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ナノメートル又はそれを超えるナノメートルの直径であり、直径は、好ましくは、ナノ粒子の集団の平均径である。好ましくは、ナノ粒子は、最大１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、２０００、５０００、又は１００００ナノメートルの直径である。より好ましくは、ナノ粒子は、４０～３００ｎｍの、さらにより好ましくは５０～２００ｎｍの、さらにより好ましくは５０～１５０ｎｍの、最も好ましくは６５～８５ｎｍの、例えば約７０ｎｍの平均径を有する。
本発明による使用のためのナノ粒子組成物は、オリゴヌクレオチドをさらに含む脂質ナノ粒子を含む。オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子のカーゴ又はペイロードと考えることができる。したがって、ナノ粒子は、例えば、ミセル、リポソーム、リポプレックス、単層ベシクル、多層ベシクル、又はその架橋バリアントであり得る。ナノ粒子は、ミセル、リポソーム、又はリポプレックスであることが好ましい。ナノ粒子の組成について言及される場合、ジアミノ脂質及び任意選択でさらなる賦形剤への言及が意図され、いずれのカーゴ物質への言及も意図されない。非限定的な例として、ナノ粒子が５０モル％のジアミノ脂質及び５０モル％の他の賦形剤を含むと考えられる場合、モルパーセンテージは、ジアミノ脂質及び他の賦形剤のみに関し、オリゴヌクレオチドのモル分率又は溶媒のモル分率は考慮されていない。
本発明が複数のｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、模倣体又はそのソースを含む組成物に関するとき、各ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、模倣体又はそのソースはそれぞれ別個の組成物に存在してもよいことが包含される。各組成物は、逐次的に若しくは同時に対象へ投与することができるか、又は使用前に単一の組成物中に混合されてもよい。或いは、複数のｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、模倣体又はそのソースが、本明細書に定義される単一の組成物中に存在することも包含される。
本発明による使用のためのナノ粒子組成物は、一般式（Ｉ）のジアミノ脂質を含むが、それはさらなる脂質を含むこともできる。好ましい実施形態では、ジアミノ脂質は、モルパーセントでナノ粒子中に最も多く見られる脂質である。本明細書で使用されるように、用語脂質はＣＨ２Ｃｌ２などの無極性の溶媒に可溶性である物質を指す。本発明で使用するジアミノ脂質は、スペーサーに連結される３つのテイルを有し、したがって天然に存在するトリグリセリド脂質に似ている。いくつかのこのような脂質が公知である（米国特許第８６９１７５０号）。
一般式（Ｉ）のジアミノ脂質は、様々な長さの脂肪族スペーサーによって分離されている２つの第三級アミンを含む。スペーサーは、脂質の頭部サイズを決定する助けとなる。ｎは、０、１、又は２であり得、そのため、スペーサーは、事実上、１，２－エチレン、ｎ－１，３－プロピレン、又はｎ－１，４－ブチレンスペーサーである。特に好ましい実施形態では、ｎは、０である。特に好ましい実施形態では、ｎは、１である。特に好ましい実施形態では、ｎは、２である。ｎが１であることが最も好ましい。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、本発明による使用のためのナノ粒子組成物を提供し、ジアミノ脂質は一般式（Ｉ）（式中、ｎは１である）のものである、ナノ粒子組成物。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、本発明による使用のためのナノ粒子組成物を提供し、ジアミノ脂質は一般式（Ｉ－１）
Figure 2023515010000003
（式中、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、任意選択で不飽和であり、０、１、２、３、又は４つの置換基を有するＣ１０～Ｃ１８鎖であり、置換基は、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルケニル、及びＣ１～Ｃ４アルコキシからなる群から選択される）
のものである。
Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、脂質のテイルと考えることができ、任意選択で不飽和であり、最大４つの任意選択の置換基を有する脂肪族Ｃ１０～Ｃ１８である。Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、独立して選択されてもよく、又はＴ１、Ｔ２、及びＴ３のうちの２若しくは３つについて、同じ選択がなされてもよい。好ましい実施形態では、この態様は、本発明による使用のためのナノ粒子組成物であって、ジアミノ脂質が、一般式（Ｉ）（式中、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は同一である）のものである、ナノ粒子組成物を提供する。同一であることは、同位体の天然存在比を考慮すべきであることを意味するほど狭くに解釈されるべきではなく－同一であることは、好ましくは、描写された構造式で表される分子構造だけを指すに過ぎない。
鎖が長いほど、一般的には、より強固な脂質膜をもたらすことになる。この出願では、Ｃ１０～Ｃ１８における数値は、Ｃの総含量ではなく、決定することができる最も長い連続した鎖を指す。非限定的な例として、６位にｎ－プロピル置換基を有するｎ－ドデシル鎖は、１５Ｃ原子を含むが、最も長い連続鎖が１２Ｃ原子の長さを有することから、Ｃ１２鎖である。不飽和であることは、不飽和が鎖のｃｉｓにある場合、より強固ではない膜をもたらし、それを曲げることができる。好ましい不飽和は、ｃｉｓである。好ましい実施形態では、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、０、１、２、３、又は４つの不飽和を含有する。より好ましい実施形態では、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、１、２、３、又は４つの不飽和を含有する。さらにより好ましい実施形態では、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、１、２、又は３つの不飽和、好ましくは３つの不飽和を含有する。
任意選択の置換基は、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルケニル、及びＣ１～Ｃ４アルコキシからなる群から選択される。好ましい任意選択の置換基は、Ｃ１～Ｃ４アルキルであり、より好ましくはＣ１～Ｃ２アルキルであり、最も好ましくはメチル（－ＣＨ３）である。このような置換基のうちの０、１、２、３、又は４つが存在し、このことは、置換基が存在しない可能性もあることを意味する。このように、置換基は任意選択的である。好ましくは、０、１、２、又は３つのこのような置換基が存在する。
好ましい実施形態では、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、任意選択で不飽和であり、０、１、２、３、又は４つの置換基を有するＣ１０～Ｃ１８鎖であり、置換基は、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルケニル、及びＣ１～Ｃ４アルコキシからなる群から選択される。より好ましい実施形態では、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、任意選択で不飽和であり、０、１、２、３、又は４つの置換基を有するＣ１０～Ｃ１４鎖であり、置換基は、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルケニル、及びＣ１～Ｃ４アルコキシからなる群から選択される。最も好ましくは、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、任意選択で不飽和であり、０、１、２、３、又は４つの置換基を有するＣ１２鎖であり、置換基は、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルケニル、及びＣ１～Ｃ４アルコキシからなる群から選択される。
好ましい実施形態では、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、１、２、３、又は４つの不飽和を有し、０、１、２、３、又は４つの置換基を有するＣ１０～Ｃ１８鎖であり、置換基は、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルケニル、及びＣ１～Ｃ４アルコキシからなる群から選択される。
好ましい実施形態では、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、１、２、又は３つの不飽和を有し、１、２、３、又は４つの置換基を有するＣ１０～Ｃ１８鎖であり、置換基は、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルケニル、及びＣ１～Ｃ４アルコキシからなる群から選択される。
好ましい実施形態では、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、１、２、又は３つの不飽和を有し、１、２、３、又は４つの置換基を有するＣ１０～Ｃ１８鎖であり、置換基は、Ｃ１～Ｃ４アルキルからなる群から選択される。
好ましい実施形態では、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、１、２、又は３つの不飽和を有し、１、２、又は３つの置換基を有するＣ１０～Ｃ１４鎖であり、置換基は、Ｃ１～Ｃ２アルキルからなる群から選択される。
Ｔ１、Ｔ２及びＴ３のための好ましい実施形態は（名前は系統的なＣｎ番号付けによる、コロンの後の数字（Ｃ１２：３におけるような）は不飽和の程度を示す）、（２Ｅ、６Ｅ）－ファルネシル（Ｃ１２：３）、ラウリル（Ｃ１２）、トリデシル（Ｃ１３）、ミリスチル（Ｃ１４）、ペンタデシル（Ｃ１５）、セチル（Ｃ１６）、マルガリル（Ｃ１７）、ステアリル（Ｃ１８）、α－リノレニル（Ｃ１８：３）、γ－リノレニル（Ｃ１８：３）、リノレイル（Ｃ１８：２）、ステアリジル（Ｃ１８：４）、ワクセニル（Ｃ１８：１）、オレイル（Ｃ１８：１）、エライジル（Ｃ１８：１）、パルミトレイル（Ｃ１６：１）、（２Ｅ、６Ｚ）－ファルネシル、（２Ｚ、６Ｅ）－ファルネシル、（２Ｚ、６Ｚ）－ファルネシル及び３，７，１１－トリメチルドデシルである。
したがって、好ましい実施形態では、この態様は、本発明による使用のためのナノ粒子組成物であって、ジアミノ脂質が、一般式（Ｉ）（式中、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、ファルネシル、ラウリル、トリデシル、ミリスチル、ペンタデシル、セチル、マルガリル、ステアリル、α－リノレニル、γ－リノレニル、リノレイル、ステアリジル、ワクセニル、オレイル、エライジル、パルミトレイル及び３，７，１１－トリメチルドデシルからなる群から選択される）のものである、ナノ粒子組成物を提供する。好ましくは、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、ファルネシル、ラウリル、トリデシル、ミリスチル、ペンタデシル、セチル、α－リノレニル、γ－リノレニル、リノレイル、ステアリジル、オレイル、パルミトレイル、及び３，７，１１－トリメチルドデシルからなる群から選択される。より好ましくは、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、ファルネシル、ラウリル、トリデシル、ミリスチル、ステアリジル、パルミトレイル、及び３，７，１１－トリメチルドデシルからなる群から選択される。さらにより好ましくは、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、ファルネシル、ラウリル、トリデシル、ミリスチル、及び３，７，１１－トリメチルドデシルからなる群から選択される。さらにより好ましくは、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、ファルネシル、ラウリル、及び３，７，１１－トリメチルドデシルからなる群から選択される。最も好ましくは、Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、ファルネシル、例えば、（２Ｅ，６Ｅ）ファルネシル、（２Ｅ，６Ｚ）ファルネシル、（２Ｚ，６Ｅ）ファルネシル、又は（２Ｚ，６Ｚ）ファルネシルであり、好ましくは、それらは、それぞれ、（２Ｅ，６Ｅ）ファルネシルである。
ファルネシルは、３，７，１１－トリメチルドデカ－２，６，１０－トリエニルとしても公知であり、不飽和直鎖状Ｃ１２鎖であり；（２Ｅ，６Ｅ）、（２Ｅ，６Ｚ）、（２Ｚ，６Ｅ）、又は（２Ｚ，６Ｚ）であり得；好ましくは、（２Ｅ，６Ｅ）である。ラウリルは、ドデシルとしても知られており、飽和直鎖状Ｃ１２鎖である。トリデシルは、飽和直鎖状Ｃ１３鎖である。ミリスチルは、テトラデシルとしても知られており、飽和直鎖状Ｃ１４鎖である。ペンタデシルは、飽和直鎖状Ｃ１５鎖である。セチルは、パルミチルとしても知られており、飽和直鎖状Ｃ１６鎖である。マルガリルは、ヘプタデシルとしても知られており、飽和直鎖状Ｃ１７鎖である。ステアリルは、オクタデシルとしても知られており、飽和直鎖状Ｃ１８鎖である。α－リノレニルは、（９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）－９，１２，１５－オクタデカトリエニルとしても知られており、不飽和直鎖状Ｃ１８鎖である。γ－リノレニルは、（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）－６，９，１２－オクタデカトリエニルとしても知られており、不飽和直鎖状Ｃ１８鎖である。リノレイルは、（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエニルとしても知られており、不飽和直鎖状Ｃ１８鎖である。ステアリジルは、（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）－６，９，１２，１５－オクタデカテトラエニルとしても知られており、不飽和直鎖状Ｃ１８鎖である。バクセニルは、（Ｅ）－オクタデカ－１１－エニルとしても知られており、不飽和直鎖状Ｃ１８鎖である。オレイルは、（９Ｚ）－オクタデカ－９－エニルとしても知られており、不飽和直鎖状Ｃ１８鎖である。エライジルは、（９Ｅ）－オクタデカ－９－エニルとしても知られており、不飽和直鎖状Ｃ１８鎖である。パルミトレイルは、（９Ｚ）－ヘキサデカ－９－エニルとしても知られており、不飽和直鎖状Ｃ１８鎖である。３，７，１１－トリメチルドデシルは、飽和ファルネシルであり、飽和直鎖状Ｃ１２鎖である。
組成物は、溶媒及び／又は賦形剤、好ましくは薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことができる。好ましい溶媒は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、ＰＢＳ又はクエン酸緩衝液などの水性溶液である。好ましいクエン酸緩衝液は、好ましくはＮａＯＨを使用して設定された、ｐＨ２．５～３．５、例えば、ｐＨ３の５０ｍＭのクエン酸塩を含む。好ましいＰＢＳは、ｐＨ７～８、例えば、ｐＨ７．４である。ＰＢＳは、二価のカチオン、例えば、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まないのが好ましい。別の好ましい薬学的に許容される賦形剤は、エタノールである。最も好ましくは、組成物は、生理的緩衝液、例えば、ＰＢＳ又はグッドの緩衝液又はＨｅｐｅｓ緩衝食塩水又はハンクス平衡塩類溶液又はリンガー平衡塩類溶液又はＴｒｉｓ緩衝液を含む。好ましい組成物は、医薬組成物である。組成物は、さらなる賦形剤を含んでもよい。これらのさらなる賦形剤は、ナノ粒子中に含まれてもよい。
好ましい実施形態では、この態様は、アドステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、コレカルシフェロール、コレステンジオン、コレステノール、コレステロール、デルタ－７－スチグマステロール、デルタ－７－アベナステロール、ジヒドロタキステロール、ジメチルコレステロール、エルゴカルシフェロール、エルゴステロール、エルゴステノール、エルゴスタトリエノール、エルゴスタジエノール、エチルコレステノール、フシジン酸、ラノステロール、ノルコレスタジエノール、β－シトステロール、スピナステロール、スチグマスタノール、スチグマステノール、スチグマスタジエノール、スチグマスタジエノン、スチグマステロール及びスチグマステノンからなる群から好ましくは選択されるステロール、より好ましくはコレステロールをさらに含む、本発明による使用のためのナノ粒子組成物を提供する。より詳細には、好ましい実施形態では、この態様は、本発明による使用のためのナノ粒子組成物を提供し、ナノ粒子は、アドステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、コレカルシフェロール、コレステンジオン、コレステノール、コレステロール、デルタ－７－スチグマステロール、デルタ－７－アベナステロール、ジヒドロタキステロール、ジメチルコレステロール、エルゴカルシフェロール、エルゴステロール、エルゴステノール、エルゴスタトリエノール、エルゴスタジエノール、エチルコレステノール、フシジン酸、ラノステロール、ノルコレスタジエノール、β－シトステロール、スピナステロール、スチグマスタノール、スチグマステノール、スチグマスタジエノール、スチグマスタジエノン、スチグマステロール及びスチグマステノンからなる群から好ましくは選択されるステロール、より好ましくはコレステロールをさらに含む。
好ましくは、このようにさらに含まれるステロールは、いずれの部分にもコンジュゲートされない。コンジュゲートされたステロールはまた、本明細書で後に説明されるように含まれ得る。このように、コンジュゲートされたステロールとコンジュゲートされていないステロールの両方が含まれ得る。別段に明示的に示されていなければ、ステロールへの言及は、コンジュゲートされていないステロールへの言及を意図する。
ステロールが組成物中に含まれる場合、ナノ粒子中に含まれることが好ましく、好ましくは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は７０モル％のステロールが含まれ；好ましくは、最大８０、７５、７０、６５、６０、６５、５０、４５、４０、３５、又は３０モル％のステロールが含まれる。上記で説明されたように、このモルパーセンテージは、脂質ナノ粒子を作製する物質に関するに過ぎず、溶媒又はオリゴヌクレオチドなどのカーゴに関するものではない。ステロールが組成物中に含まれる場合、好ましくは５～７０モル％、１５～６０モル％、２５～６０モル％、３５～６０モル％、４０～６０モル％、又は４５～５５モル％が含まれ；より好ましくは４０～６０モル％又は４５～５５モル％が含まれ、最も好ましくは４５～５５モル％、例えば、４８モル％又は５４モル％が含まれる。
好ましい実施形態では、この態様は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥｇｇＰＣ）、ダイズホスファチジルコリン（ＳｏｙＰＣ）からなる群から好ましくは選択されるリン脂質、より好ましくはジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）をさらに含む、本発明による使用のためのナノ粒子組成物を提供する。より詳細には、好ましい実施形態では、この態様は、本発明による使用のためのナノ粒子組成物を提供し、ナノ粒子は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥｇｇＰＣ）、ダイズホスファチジルコリン（ＳｏｙＰＣ）からなる群から好ましくは選択されるリン脂質、より好ましくはジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）をさらに含む。
好ましくは、このようにさらに含まれるリン脂質は、いずれの部分にもコンジュゲートされない。コンジュゲートされたリン脂質はまた、本明細書で後に説明されるように含まれ得る。このように、コンジュゲートされたリン脂質とコンジュゲートされていないリン脂質の両方が含まれ得る。
リン脂質が組成物中に含まれる場合、ナノ粒子中に含まれることが好ましく、好ましくは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０モル％のリン脂質が含まれ；好ましくは、最大６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、又は５モル％のリン脂質が含まれる。上記で説明されたように、このモルパーセンテージは、脂質ナノ粒子を作製する物質に関するに過ぎず、溶媒又はオリゴヌクレオチドなどのカーゴに関するものではない。リン脂質が組成物中に含まれる場合、好ましくは０～４０モル％、０～３５モル％、０～３０モル％、５～３０モル％、５～２５モル％、又は５～２０モル％が含まれ；より好ましくは５～２０モル％又は５～１５モル％が含まれ、最も好ましくは５～１５モル％、例えば、１０モル％又は１１モル％が含まれる。
好ましい実施形態では、この態様は、水溶性ポリマー及び親油性アンカーのコンジュゲートをさらに含む、本発明による使用のためのナノ粒子組成物を提供し、
ここで：
ｉ）水溶性ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ヒドロキシエチル－ｌ－アスパラギン）（ＰＨＥＡ）、ポリ－（ヒドロキシエチル－Ｌ－グルタミン）（ＰＨＥＧ）、ポリ（グルタミン酸）（ＰＧＡ）、ポリグリセロール（ＰＧ）、ポリ（アクリルアミド）（ＰＡＡｍ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ＰＨＰＭＡ）、及びポリ（２－オキサゾリン）（ＰＯｘ）、例えば、ポリ（２－メチル－２－オキサゾリン）（ＰＭｅＯｘ）及びポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（ＰＥｔＯｘ）、又はそのコポリマーからなる群から選択され、
ｉｉ）親油性アンカーが、ステロール、脂質、及びビタミンＥ誘導体からなる群から選択される。好ましくは、親油性アンカーは、脂質、より好ましくはジグリセリドである。
より詳細には、好ましい実施形態では、この態様は、本発明による使用のためのナノ粒子組成物を提供し、ここで、ナノ粒子は上で定義された水溶性ポリマー及び親油性アンカーのコンジュゲートをさらに含む。水溶性ポリマーは、一般的に、親油性アンカーを介して連結されている、ナノ粒子のコロイド安定性を増大させる。一般的に、親油性アンカーは、脂質二重層又はミセル中に埋め込まれ、よって、水溶性ポリマーをナノ粒子表面に連結させる。このために、このような水溶性ポリマーを使用することは、当技術分野で公知である（Ｋｎｏｐら、２０１０年、ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎｉｅ．２００９０２６７２）。好ましい水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）である。好ましくは、水溶性ポリマーは、約７５０Ｄａ～約１５０００Ｄａ、より好ましくは約１０００Ｄａ～約６０００Ｄａ、さらにより好ましくは約１０００Ｄａ～約３０００Ｄａ、最も好ましくは約１５００Ｄａ～約３０００Ｄａの範囲の、例えば、約２０００Ｄａの分子量を有する。したがって、ＰＥＧ－２０００は、上記のように、コンジュゲートにおいて使用するのに好ましい水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーは、直鎖状ポリマーであることが好ましく、その２つの末端のうちの１つでコンジュゲートされていることが好ましい。他の末端は、生理的条件で非荷電であること、例えば、ヒドロキシル基又はメチル若しくはエチルエーテルであることが好ましい。好ましくは、コンジュゲートされていない末端は、メチルエーテル又はヒドロキシル基、最も好ましくはメチルエーテルである。
水溶性ポリマーがコンジュゲートされる親油性アンカーは、一般的に、水溶性ポリマーとナノ粒子の間の接続を確保するために機能する。ポリマーとアンカー間の特定のコンジュゲーションは重要でなく、当業者は任意の好適な化学結合、例えばエステル結合、アミド結合、エーテル結合、トリアゾール又は水溶性ポリマーを親油性アンカーにコンジュゲートすることから生じる任意の他の部分を選択することができる。コハク酸又はグルタル酸などの小さなリンカーの使用も想定される。親油性アンカーは、ステロール、脂質、及びビタミンＥ誘導体からなる群から選択される。好ましいステロールは上記されている。好ましいビタミンＥ誘導体は、トコフェロール及びトコトリエノール、例えば、アルファ－トコフェロール、ベータ－トコフェロール、ガンマ－トコフェロール、デルタ－トコフェロール、及び対応するトコトリエノールである。好ましくは、親油性アンカーは、脂質、より好ましくはジグリセリド又はリン脂質である。好ましい脂質の例は上記されており、好ましいジグリセリドの例は、ジステアロイルグリセロール、好ましくは、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、ジパルミトイルグリセロール、好ましくは１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロール、ジオレオイルグリセロール、好ましくは１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロール、及びジアラキドイルグリセロール、好ましくは１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロールである。最も好ましいジグリセリドは、ジステアロイルグリセロール、好ましくは１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロールである。
上記のように、コンジュゲートの好適な例は、（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール）－［メトキシ（ポリエチレングリコール－２０００）］エーテル、（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール）－［メトキシ（ポリエチレングリコール－１５００）］エーテル、（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール）－［メトキシ（ポリエチレングリコール－３０００）］エーテル、（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール）－［ヒドロキシ（ポリエチレングリコール－２０００）］エーテル、（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール）－［ヒドロキシ（ポリエチレングリコール－１５００）］エーテル、（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール）－［ヒドロキシ（ポリエチレングリコール－３０００）］エーテル、（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセリル）－［メトキシ（ポリエチレングリコール－２０００）カルボキシレート］、（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセリル）－［メトキシ（ポリエチレングリコール－１５００）カルボキシレート］、（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセリル）－［メトキシ（ポリエチレングリコール－３０００）カルボキシレート］、（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセリル）－［ヒドロキシ（ポリエチレングリコール－２０００）カルボキシレート］、（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセリル）－［ヒドロキシ（ポリエチレングリコール－１５００）カルボキシレート］、（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセリル）－［ヒドロキシ（ポリエチレングリコール－３０００）カルボキシレート］、（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセリル）－［メトキシ（ポリエチレングリコール－２０００）カルバメート］、（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセリル）－［メトキシ（ポリエチレングリコール－１５００）カルバメート］、（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセリル）－［メトキシ（ポリエチレングリコール－３０００）カルバメート］、（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセリル）－［ヒドロキシ（ポリエチレングリコール－２０００）カルバメート］、（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセリル）－［ヒドロキシ（ポリエチレングリコール－１５００）カルバメート］、及び（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセリル）－［ヒドロキシ（ポリエチレングリコール－３０００）カルバメート］であり、ステアロイル部分は、他の脂肪酸によって、好ましくは他のＣ１０～Ｃ２０脂肪酸によって任意選択で置き換えることができる。上記のように、カルバメート及びエステルでは、親アミン及び親アルコール及び親カルボン酸を入れ替えることもでき、例えば、ＰＥＧ－アルコールをジグリセリドのカルボン酸類似体と反応させることができる。コンジュゲートの最も好ましい例は、ＤＳＧ－ＰＥＧ（ＣＡＳ番号：３０８８０５ー３９－２）としても知られている、（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール）－［メトキシ（ポリエチレングリコールー２０００）］エーテル、及びそのエステル類似体（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセリル）－［メトキシ（ポリエチレングリコール－２０００）カルボキシレート］、及びそのカルバメート類似体（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセリル）－［メトキシ（ポリエチレングリコールー２０００）カルバメート］又はＤＳＡ－ＰＥＧ、及びそのアミド類似体としても知られている、１，２－ジステアロイルオキシプロピルアミン３－Ｎ－メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００カルバモイルである。
上記のようなコンジュゲートが組成物中に含まれる場合、ナノ粒子中に含まれることが好ましく、好ましくは、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、又は５．０モル％のコンジュゲートが含まれ；好ましくは、最大６．５、６．０、５．５、５．０、４．５、４．０、３．５、３．０、２．５、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、又は０．５モル％のコンジュゲートが含まれる。上記で説明されているように、このモルパーセンテージは、脂質ナノ粒子を作製する物質に関するに過ぎず、溶媒又はオリゴヌクレオチドなどのカーゴに関するものではない。コンジュゲートが組成物中に含まれる場合、好ましくは、０～４モル％、０～３モル％、０．３～３モル％、０．５～３モル％、０．５～２．５モル％、又は１～２．５モル％が含まれ、より好ましくは、０．５～２．５モル％又は０．７～２．５モル％が含まれ、最も好ましくは、０．８～２．４モル％、例えば、１モル％又は２モル％が含まれる。
好ましいナノ粒子は、ジアミノ脂質及びステロールを含む。さらに好ましいナノ粒子は、ジアミノ脂質及びリン脂質を含む。さらに好ましいナノ粒子は、ジアミノ脂質及び水溶性ポリマーと親油性アンカーのコンジュゲートを含む。好ましいナノ粒子は、ジアミノ脂質及びステロール及びリン脂質を含む。好ましいナノ粒子は、ジアミノ脂質及びステロール及び水溶性ポリマーと親油性アンカーのコンジュゲートを含む。好ましいナノ粒子は、ジアミノ脂質及びリン脂質及び水溶性ポリマーと親油性アンカーのコンジュゲートを含む。最も好ましいナノ粒子は、ジアミノ脂質及びステロール及びリン脂質及び水溶性ポリマーと親油性アンカーのコンジュゲートを含む。
好ましい実施形態では、この態様は、本発明による使用のためのナノ粒子組成物を提供し、ナノ粒子は以下を含む：
ｉ）２０～６０モル％のジアミノ脂質、及び
ｉｉ）０～４０モル％のリン脂質、及び
ｉｉｉ）３０～７０モル％のステロール、好ましくはコレステロール、及び
ｉｖ）０～１０モル％の水溶性ポリマー及び上で定義された親油性アンカーのコンジュゲート。
さらなる好ましい実施形態では、ナノ粒子は、
ｉ）２５～５５モル％のジアミノ脂質、及び
ｉｉ）１～３０モル％のリン脂質、及び
ｉｉｉ）３５～６５モル％のステロール、好ましくはコレステロール、及び
ｉｖ）０．１～４モル％の、水溶性ポリマーと親油性アンカーのコンジュゲート
を含む。
さらなる好ましい実施形態では、ナノ粒子は、
ｉ）３０～５０モル％のジアミノ脂質、及び
ｉｉ）５～１５モル％のリン脂質、及び
ｉｉｉ）４０～６０モル％のステロール、好ましくはコレステロール、及び
ｉｖ）０．５～２．５モル％の、水溶性ポリマーと親油性アンカーのコンジュゲート
を含む。
さらなる好ましい実施形態では、ナノ粒子は、
ｉ）約３８～４２モル％のジアミノ脂質、及び
ｉｉ）約８～１２モル％のリン脂質、及び
ｉｉｉ）約４６～５０モル％のステロール、好ましくはコレステロール、及び
ｉｖ）約１．８～２．２モル％の、水溶性ポリマーと親油性アンカーのコンジュゲート
を含む。
本発明による使用のための組成物は、追加の治療的活性剤を有利に含むことができる。好ましい実施形態では、ＰＰ２Ａメチル化剤、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の阻害剤、抗体、ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＯＸ４０の結合剤などのＴ細胞副刺激分子の結合剤、及び化学療法剤からなる群から好ましくは選択される、追加の薬学的に活性な化合物をさらに含む、本発明による使用のための組成物が提供される。化学療法剤は、本明細書で後に定義される。
ＰＰ２Ａメチル化剤はＰＰ２Ａを活性化することができ、それはｐ５３などのがん抑制因子を次に活性化する（米国特許出願公開第２００７２８０９１８号を参照する）。特に好ましいＰＰ２Ａメチル化剤は、ベタイン（水和ベタイン又はさらにトリメチルアンモニオ－２酢酸塩）又はその薬学的に許容される塩の１つ、特にクエン酸ベタインである。ＨＧＦ阻害剤はＨＧＦを阻害することができ、それは肺、結腸、直腸、胃、腎臓、卵巣、皮膚、多発性骨髄腫及び甲状腺組織に由来する腫瘍を含む、様々なヒト固形腫瘍の上で同時発現され、しばしば過剰発現される（国際出願２００９１２６８４２を参照する）。好ましいＨＧＦ阻害剤は、トランケーションされたＨＧＦタンパク質、例えば、ＮＫ１（Ｎ末端ドメインプラスクリングルドメイン１；Ｌｏｋｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１７１４５、１９９３年）；ＮＫ２（Ｎ末端ドメインプラスクリングルドメイン１及び２；Ｃｈａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１３８２、１９９１年）；及び、ヌードマウスモデルでマウスの肺腫瘍ＬＬＣの一次増殖及び転移を部分的に阻害することが示された（Ｋｕｂａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：６７３７、２０００年）ＮＫ４（Ｎ末端ドメインプラス４つのクリングルドメイン）、抗ＨＧＦｍＡｂ、例えばＬ２Ｇ７（Ｋｉｍら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２：１２９２、２００６年、及び米国特許第７，２２０，４１０号）、ＨｕＬ２Ｇ７（国際公開０７１１５０４９Ａ２）、国際出願２００５／０１７１０７Ａ２に記載されるヒトｍＡｂ、及び国際公開０７１４３０９０Ａ２又は国際公開０７１４３０９８Ａ２に記載されるＨＧＦ結合性タンパク質である。ＰＩ３Ｋ阻害剤は公知である。好ましいＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＧＳＫ２６３６７７１Ｂ、ＧＳＫ２６３６７７１、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ及びアルペリシブである。Ａｋｔ阻害剤は公知である。好ましいＡｋｔ阻害剤は、ＶＱＤ－００２、ペリホシン、ミルテフォシン、ＭＫ－２２０６、ＡＺＤ５３６３及びイパタセルチブである。ｍＴＯＲ阻害剤は公知である。好ましいｍＴＯＲ阻害剤は、シロリムス、エベロリムス、リダホロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス及びゾタロリムスである。Ｔ細胞副刺激分子の結合剤は、国際出願２０１９１０６６０５に記載されている。好ましいそのような結合剤は、ＯＸ４０に対する抗体などのＯＸ４０の結合剤である。
ＰＴＥＮをアゴナイズするための方法
本発明は、ＰＴＥＮをアゴナイズするための方法も提供し、本方法は、細胞を上の使用について定義されるｍｉＲＮＡ－１９３ａと、又は上の使用について定義される組成物と接触させるステップを含む。したがって、細胞はｍｉＲＮＡ－１９３ａ分子、ｉｓｏｍｉＲ、模倣体又はそのソースと接触させる。本方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの方法であってよく、好ましくは、それはｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの方法である。ＰＴＥＮをアゴナイズすることは本明細書の他の箇所で定義される通りであり、好ましくはＰＴＥＮの発現を増加させるか、ＰＴＥＮタンパク質の活性を増加させるか、又はＰＴＥＮタンパク質のレベルを増加させ、より好ましくは、それはＰＴＥＮタンパク質の活性を増加させる。ＰＴＥＮの活性又はレベルは好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも２５％増加する。細胞を接触させる方法は、当技術分野で公知である；好ましくは、ｍｉＲＮＡはさらなる賦形剤なしで細胞培地に加えられるか、又はそれは例えばトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトされる。
一般的定義
この文書及びその特許請求の範囲では、動詞「含むこと（ｔｏ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその活用形は、その語の後に続く項目が含まれることを意味するために非限定的意味で使用されるが、具体的に述べられていない項目を除外するものではない。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への言及は、文脈が要素のうちの１つ及び１つだけが存在することを明確に要求していなければ、要素の２つ以上が存在する可能性を除外するものではない。よって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
「約（ａｂｏｕｔ）」又は「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という語は、数値と共に使用される場合（例えば、約１０）、好ましくは、その値が、その値の１％多いか又は少ない所与の値であってもよいことを意味する。分子の部分又は下位構造が同一であると言われる場合、同位体の天然存在度分布は説明されない。同一の性質は、描かれるであろう構造式を指す。
本明細書で使用される場合、モル％は、モル分率（ｍｏｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）又はモル分率（ｍｏｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ）又はモルパーセント又は物質量分率としても公知である、モルパーセンテージを指す。これは、混合物中の全成分の総量で除した、成分のモル量を指し、モルでも表される。
本発明の文脈では、評価されるパラメーターの低下又は増加は、そのパラメーターに対応する値の少なくとも５％の変化を意味する。より好ましくは、値の低下又は増加は、少なくとも１０％、さらにより好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、又は１００％の変化を意味する。この後者の場合には、パラメーターと関連する検出可能な値がもはや存在しない場合であり得る。
この文書において記載されているように、医薬としての物質の使用は、医薬の製造における前記物質の使用として解釈することもできる。同様に、物質が処置のために又は医薬として使用される際は常に、その物質は、処置のための医薬の製造のためにも使用することができる。使用のための製品は処置の方法で、例えばＰＴＥＮ欠乏症、好ましくはＰＴＥＮ欠乏性がんと関連した状態を処置するための方法で使用するのに好適であり、本方法は、対象に本発明による使用のためのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又は本発明による使用のための組成物を投与するステップを含む。
本発明は、いくつかの例示的な実施形態に関して上記されている。いくつかの部品又は要素の修飾及び代替的実施が可能であり、添付の特許請求の範囲に定義されているように、保護の範囲内に含まれる。文献及び特許文書についての引用は全て、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用されるように、例えば遺伝子の発現に関して「モジュレートする」は、機能の任意の天然又は既存のレベルを変更することを意味し、例えば、それは増加又は低減することによって発現に影響を及ぼすことを意味する。モジュレーションは、例えばシグナル伝達を上方制御又はアゴナイズすること、並びにシグナル伝達又は不変の若しくはモジュレートされていない状態で生じるリガンド若しくは化合物若しくは分子との相互作用を下方制御、拮抗又はブロックすることを含む。したがって、モジュレーターはアゴニスト又はアンタゴニストであってよい。アゴニスト又はアンタゴニストの活性は、当技術分野で公知である様々なアッセイ、例えば、限定されずに、細胞シグナル伝達、細胞増殖、免疫細胞活性化マーカー及びサイトカイン生成の測定によってｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することができ、任意選択でモジュレートされていない参照試料との比較を含む。アゴニスト又はアンタゴニストの活性は、代用エンドポイントを測定する様々なアッセイ、例えば、限定されずに、Ｔ細胞増殖又はサイトカイン生成の測定によってｉｎ ｖｉｖｏで測定することもできる。
本明細書で言及される一般的技術
マイクロＲＮＡ分子（「ｍｉＲＮＡ」）は、１７ヌクレオチド長から最大２５ヌクレオチド長であることが報告されているが、一般的には、２１～２２ヌクレオチド長である。したがって、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５の任意の長さが本発明に包含される。ｍｉＲＮＡはそれぞれ、より長い前駆体ＲＮＡ分子（「前駆体ｍｉＲＮＡ」）からプロセシングされる。前駆体ｍｉＲＮＡは、非タンパク質コード遺伝子から転写される。前駆体は、少なくとも５０、７０、７５、８０、８５、１００、１５０、２００ヌクレオチド長又はそれより長いヌクレオチド長を有し得る。前駆体ｍｉＲＮＡは、動物においてＤｉｃｅｒ及びＤｒｏｓｈａと呼ばれる酵素によって切断される、ステム－ループ－又はフォールド－バック様構造の形成を可能にする２つの相補的な領域を有する。Ｄｉｃｅｒ及びＤｒｏｓｈａは、リボヌクレアーゼＩＩＩ様ヌクレアーゼである。プロセシングされたｍｉＲＮＡは、典型的には、ステムの一部である。
プロセシングされたｍｉＲＮＡ（「成熟ｍｉＲＮＡ」とも称される）は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）という複合体として知られている大きな複合体の一部となり、特定の標的遺伝子を（下方又は上方）調節する。動物のｍｉＲＮＡの例には、ｍＲＮＡ標的と完全に又は不完全に塩基対合し、それぞれ、ｍＲＮＡ分解又は翻訳の阻害をもたらすものを含む（Ｏｌｓｅｎら、１９９９年、Ｓｅｇｇｅｒｓｏｎら、２００２年）。ＳｉＲＮＡ分子もＤｉｃｅｒによってプロセシングされるが、長い、二本鎖ＲＮＡ分子からはプロセシングされない。ＳｉＲＮＡは、動物細胞で天然には見られないが、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中のこのような細胞では機能し、ｍＲＮＡ標的の配列特異的切断を指示することができる（Ｄｅｎｌｉら ２００３年）。
内因性ｍｉＲＮＡ分子の研究は、米国特許出願第６０／５７５，７４３号に記載されている。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡにハイブリダイズするｍＲＮＡの翻訳を調節するタンパク質複合体が、成熟した、一本鎖ＲＮＡに結合する場合に、ｍｉＲＮＡは、細胞において明らかに活性である。内因的に発現したｍｉＲＮＡと同じように細胞に影響を及ぼす外因性ＲＮＡ分子を導入することは、内因性の成熟ｍｉＲＮＡと同じ配列の一本鎖ＲＮＡ分子が、翻訳の制御を容易にするタンパク質複合体によって取り込まれることを必要とする。種々のＲＮＡ分子の設計が評価されている。ｍｉＲＮＡ経路によって所望の一本鎖ｍｉＲＮＡの取込みを最大化する３つの一般的な設計が特定されている。３つの設計のうちの少なくとも１つを有するｍｉＲＮＡ配列を有するＲＮＡ分子は、合成ｍｉＲＮＡと称される場合がある。
本発明のｍｉＲＮＡ分子は、内因性ｍｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性を置き換えるか又は補うことができる。このような分子の例、このような分子及びこのような分子を含む組成物の好ましい特徴及び修飾について、国際公開第２００９／０９１９８２号に記載されている。
本発明のｍｉＲＮＡ分子又はそのｉｓｏｍｉＲ若しくは模倣体若しくはソースは、一部の実施形態では、２つのＲＮＡ分子を含み、１つのＲＮＡは、天然に存在する、成熟ｍｉＲＮＡと同一である。成熟ｍｉＲＮＡと同一であるＲＮＡ分子は、活性鎖又はアンチセンス鎖と称される。第２のＲＮＡ分子は、相補鎖又はセンス鎖と称され、活性鎖に少なくとも部分的に相補的である。活性鎖と相補鎖はハイブリダイズされ、二本鎖ＲＮＡを生じ、これは、細胞内のｍｉＲＮＡ活性化の直前に、タンパク質複合体が結合する天然に存在するｍｉＲＮＡ前駆体に類似する。前記ｍｉＲＮＡの活性を最大化することは、翻訳のレベルで遺伝子発現を調節するｍｉＲＮＡタンパク質複合体によって、活性鎖の取込みを最大化し、相補鎖の取込みを最小化することを必要とする。最適なｍｉＲＮＡ活性をもたらす分子設計は、相補鎖の修飾を含む。２つの設計は、相補鎖の化学的修飾を組み込んでいる。第１の修飾は、５’末端にホスフェート又はヒドロキシル以外の基を有する相補的ＲＮＡを生じることを含む。５’修飾の存在は、相補鎖の取込みを明らかに排除し、次に、ｍｉＲＮＡタンパク質複合体による活性鎖の取込みを支持する。５’修飾は、ＮＨ２、ＮＨＣＯＣＨ３、ビオチン、その他を含む種々の分子のいずれかであり得る。ｍｉＲＮＡ経路による相補鎖の取込みを有意に低減する第２の化学的修飾戦略は、相補鎖の最初の２～６ヌクレオチドに糖修飾を有するヌクレオチドを組み込むことである。第２の設計戦略と一致する糖修飾を、ｍｉＲＮＡ活性をさらに促進する第１の設計戦略と一致する５’末端修飾と結びつけることができることに留意すべきである。第３のｍｉＲＮＡ設計は、活性鎖に相補的ではない相補鎖の３’末端にヌクレオチドを組み込むことを含む。得られた活性且つ相補的ＲＮＡのハイブリッドは、活性鎖の３’末端で非常に安定であるが、活性鎖の５’末端では比較的不安定である。ｓｉＲＮＡに関する研究によって、５’ハイブリッドの安定性が、ＲＮＡ干渉をサポートするタンパク質複合体によるＲＮＡ取込みの重要な指標であり、少なくとも細胞内のｍｉＲＮＡ経路に関連することが示される。本発明者らは、相補的ＲＮＡ鎖におけるミスマッチの賢明な使用によって、前記ｍｉＲＮＡの活性が有意に促進されることが見出された。
核酸、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸類似体、修飾されたヌクレオチドのさらなる定義、核酸の調製、ｍｉＲＮＡの設計、５’ブロッキング剤、宿主細胞及び標的細胞、送達方法、並びにナノ粒子官能基化は、好ましくは国際出願２０１３／０９５１３２に記載されている通りである。
治療適用
表現型形質に影響を及ぼすｍｉＲＮＡは、治療適用及び診断適用に対する介入点を提供する（特定のｍｉＲＮＡの有無又は特定のｍｉＲＮＡの変更された濃度についてスクリーニングすることによって）。本発明のＲＮＡ分子を使用して、前出の項目で議論した疾患又は状態のいずれかを処置できることが具体的に企図される。さらに、上記方法のいずれかを、本発明の治療態様及び診断態様に関して用いることもできる。例えば、ｍｉＲＮＡを検出すること又はそれをスクリーニングすることに関する方法を、診断の文脈で用いることもできる。治療適用では、有効量の本発明のｍｉＲＮＡが、動物におけるものであってもそうでなくてもよい細胞に投与される。一部の実施形態では、治療有効量の本発明のｍｉＲＮＡが、疾患又は状態の処置のために個体に投与される。用語「有効量」は、本明細書で使用される場合、それが投与される細胞又は組織において所望の生理学的変化をもたらすのに必要である、本発明の分子の量として定義される。本明細書で使用される用語「治療的有効量」は、前に本明細書で定義されている疾患又は状態と関連した疾患又は状態に関して所望の効果を達成する、本発明の分子の量と定義される。当業者は、多くの場合、分子は、治癒をもたらさないかもしれないが、部分的な利益、例えば、少なくとも１つの症状の軽減又は改善をもたらすことができることを容易に認識する。一部の実施形態では、いくつかの利益を有する生理学的変化は、治療上有益であるとも考えられる。よって、一部の実施形態では、生理学的変化をもたらす分子の量は、「有効量」又は「治療有効量」とみなされる。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含んでもよい。他の実施形態では、活性化合物は、２％～７５％の重量の単位、又は例えば、２５％～６０％、及びその中から導き出せる任意の範囲を含んでもよい。他の非限定的な例では、用量は、投与当たり、体重１ｋｇ当たり１マイクログラム未満、又は体重１ｋｇ当たり１マイクログラム、体重１ｋｇ当たり５マイクログラム、体重１ｋｇ当たり１０マイクログラム、体重１ｋｇ当たり５０マイクログラム、体重１ｋｇ当たり１００マイクログラム、体重１ｋｇ当たり２００マイクログラム、体重１ｋｇ当たり３５０マイクログラム、体重１ｋｇ当たり５００マイクログラム、体重１ｋｇ当たり１ミリグラム、体重１ｋｇ当たり５ミリグラム、体重１ｋｇ当たり１０ミリグラム、体重１ｋｇ当たり５０ミリグラム、体重１ｋｇ当たり１００ミリグラム、体重１ｋｇ当たり２００ミリグラム、体重１ｋｇ当たり３５０ミリグラム、又は体重１ｋｇ当たり５００ミリグラムから体重１ｋｇ当たり１０００ｍｇ又はそれを超える量、及びその中から導き出せる任意の範囲を含んでもよい。本明細書に列挙した数値から導き出せる範囲の非限定的な例では、体重１ｋｇ当たり５ｍｇ～体重１ｋｇ当たり１００ｍｇ、体重１ｋｇ当たり５マイクログラム～体重１ｋｇ当たり５００ミリグラムなどの範囲を、上記数値に基づいて投与することができる。
いずれの場合にも、組成物は、１つ又は複数の構成成分の酸化を遅らせるための様々な抗酸化剤を含んでもよい。さらに、微生物の作用の防止は、これらに限定されないが、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール又はこれらの組合せを含む、様々な抗菌剤及び抗真菌剤などの保存剤によってもたらすことができる。
分子は、遊離塩基、中性又は塩形態で組成物中に製剤化され得る。薬学的に許容される塩は、酸付加塩、例えば、タンパク性組成物の遊離アミノ基により形成されたもの、又は例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸のような有機酸により形成されたものを含む。遊離のカルボキシル基により形成された塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム若しくは水酸化鉄などの無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカインのような有機塩基に由来してもよい。
組成物は、一般的に、水性媒体中のナノ粒子の懸濁液である。しかし、これは、凍結乾燥されても、粉末として提供されてもよく、粉末は、ナノ粒子と任意選択で緩衝塩又は他の賦形剤を含む。
有効投薬量
本発明の分子は、一般的に、意図される目的を達成するために有効な量で使用される。疾患状態を処置又は防止するための使用では、本発明の分子、又はその医薬組成物は、治療有効量で投与又は適用される。治療有効量は、症状を軽快させるか又は防止するのに、又は処置される患者の生存を延長するのに有効な量である。治療有効量の決定は、特に、本明細書で提供される詳細な開示を考慮して、十分に、当業者の能力の範囲内である。全身投与では、治療有効用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイから最初に推定することができる。例えば、用量は、細胞培養において決定されるＥＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するために、動物モデルで製剤化することができる。このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。初期投薬量は、当技術分野で周知の技法を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏデータ、例えば、動物モデルから推定することもできる。当業者は、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができる。投与量と投与間隔は、個々に調整され、治療効果を維持するのに十分な分子の血漿レベルをもたらすことができる。注射による投与のための通常の患者の投薬量は、１日に０．０１～０．１ｍｇ／ｋｇ、又は１日に０．１～５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１日に０．５～１ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。治療上有効な血漿レベルは、毎日複数用量を投与することによって達成することができる。
局所投与又は選択的取込みの場合には、タンパク質の有効な局所濃度は、血漿濃度に関連しなくてもよい。当業者であれば、過度な実験なしで、治療上有効な局所投薬量を最適化することができるであろう。投与される分子の量は、当然のことながら、処置される対象、対象の重量、苦痛の重症度、投与方式及び処方する医師の判断に依存することになる。治療は、症状が検出可能である間又は症状が検出可能でない場合でさえ、断続的に繰り返すことができる。治療は、単独で又は他の薬物若しくは処置（手術を含む）と組み合わせて提供されてもよい。
配列同一性
「配列同一性」は、本明細書において、配列を比較することによって決定される、２つ又はそれより多い核酸（ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ）配列の間の関係として定義される。当技術分野では、「同一性」は、核酸配列間の配列の関連性の程度も意味し、場合場合で、このような配列のストリング間のマッチによって決定される。「同一性」及び「類似性」は、これらに限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ， Ａ． Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ． Ｍ．、及びＧｒｉｆｆｉｎ， Ｈ． Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｅ， Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；並びにＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． 及びＤｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１年；並びにＣａｒｉｌｌｏ， Ｈ．，、及びＬｉｐｍａｎ， Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、４８：１０７３頁（１９８８年）に記載されているものを含む、公知の方法によって容易に算出することができる。実施形態では、同一性は、所与の配列番号の全長に関して評価される。
同一性を決定するための好ましい方法は、検査される配列間に最大マッチを与えるように設計される。同一性及び類似性を決定するための方法は、公に利用可能なコンピュータープログラムで体系化される。２つの配列間の同一性及び類似性を決定するために好ましいコンピュータープログラム方法は、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）： ３８７頁（１９８４年））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ．ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３～４１０頁（１９９０年）を含む。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及び他の供給源から公に利用可能である（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．ら、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３～４１０頁（１９９０年）。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して、同一性を決定してもよい。
核酸の比較に対して好ましいパラメーターは、以下のものを含む：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３～４５３頁（１９７０年）；比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；ギャップペナルティ：５０；ギャップレングスペナルティ：３。ウィスコンシン州マディソンに位置するＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐからのギャッププログラムとして利用可能である。上記は、核酸比較のデフォルトパラメーターである。
化学療法剤
本発明による組合せにおいて使用するための化学療法剤の例としては、チオテパ及びシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホロアミド、トリエチレンチオホスホロアミド及びトリメチロールメラミンを含むエチレンイミン及びメチロールメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；アセトゲニン（特に、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（アドゼレシン、カルゼルシン及びビセレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオルカマイシン（合成類似体、ＫＷ－２１８９及びＣＢＩ－ＴＭＩを含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニマスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなどのニトロソウレア；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ及びカリケアマイシンオメガ）；ジネマイシンＡを含むジネマイシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラマイシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カルビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン（ｍｏｒｐｈｏｌｍｏ－ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｍ）、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリン－ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾトシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの抗代謝薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フォリン酸などの葉酸補填剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルミチン；エリプチニウム酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；ガリウムトリニトラート；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシン及びアンサマイトシンなどのマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ－２トキシン、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル及びドセタキセル；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンなどの白金配位錯体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ－ＩＩ）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；ゲフィチニブ、並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体が挙げられる。
この定義には、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹＩ１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェンを含む抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）などの、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤；例えば、４（５）－イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール、エキセメスタン、ホルメスタニー（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ボロゾール、レトロゾール、及びアナストロゾールなどの副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤；並びにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン；並びにトロキサシタビン（ｔｒｏｘａｃｉｔａｂｉｎｅ）（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、ＰＫＣ－α、Ｒａｆ及びＨ－Ｒａｓなどの、特に異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの；ＶＥＧＦ発現阻害剤及びＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム；遺伝子療法ワクチンなどのワクチン並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体も含まれる。認可された指示を伴う米国ＦＤＡ認可癌薬物のリストは、ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｃｄｅｒ／ｏｎｃｔｏｏｌｓ／ｄｒｕｇｌｉｓｔ．ｃｆｍにおけるワールドワイドウェブ上で見出すことができる。好適なＲＮＲ阻害剤は、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、ｃｌｏｌａｒ、クロファラビン、及びトリアピンからなる群から選択される。好適なＡＵＲＫＢ阻害剤は、ＡＺＤ１１５２、ＶＸ－６８０、ＭＬＮ８０５４、ＭＬＮ８２３７、ＰＨＡ６８０６３２、ＰＨ７３９３５８、ヘスペリジン、ＺＭ４４７４３９、ＪＮＪ７７０６２１、ＳＵ６６６８、ＣＣＴ１２９２０２、ＡＴ９２８３、ＭＰ５２９、ＳＮＳ３１４、Ｒ７６３、ＥＮＭＤ２０７６、ＸＬ２２８、ＴＴＰ６８７、ＰＦ０３８１４７３５及びＣＹＣ１１６からなる群から選択される。別の好適な抗がん薬は、ゲフィチニブである。
正規経路分析を示す図である。（Ａ）Ｐ値に基づいてランク付けされた２４時間後の少なくとも３つの細胞株においてｍｉＲ－１９３ａによって調節された上位２５の正規経路。点線は、Ｐ＜０．０１を示す。白色のバー：活性化された、黒色のバー：阻害された、灰色のバー：方向決定されず。（Ｂ）少なくとも４つの有意な経路で特定された遺伝子のツリーマップ。ボックスサイズは、遺伝子が差示的に発現された経路の数に対応する。 正規経路分析を示す図である。（Ａ）Ｐ値に基づいてランク付けされた２４時間後の少なくとも３つの細胞株においてｍｉＲ－１９３ａによって調節された上位２５の正規経路。点線は、Ｐ＜０．０１を示す。白色のバー：活性化された、黒色のバー：阻害された、灰色のバー：方向決定されず。（Ｂ）少なくとも４つの有意な経路で特定された遺伝子のツリーマップ。ボックスサイズは、遺伝子が差示的に発現された経路の数に対応する。 ＰＴＥＮ経路でｍｉＲ－１９３ａによって下方制御された遺伝子を示す図である。少なくとも３つの細胞株で２４時間後にｍｉＲ－１９３ａによって有意に下方制御された（ｍｏｃｋ＜１と比較した平均の相対的発現、Ｐ＜０．０５）遺伝子は、網掛けなしで示される。ＰＴＥＮは、黒で強調される。尖頭矢印は刺激を示し、バーヘッド矢印は阻害を示す。 ｍｉＲＮＡ－１９３ａによって影響を受ける生物学的機能を示す図である。ｚスコアが＜－２及び＞２の（腫瘍）細胞に関連する生物学的機能。全てのＰ値は０．００００１より小さい。 ＰＴＥＮ経路におけるｍｉＲ－１９３ａ－３ｐ標的のウエスタンブロットを示す図である。ヒト腫瘍細胞株を１０ｎＭのスクランブル対照又は１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａでトランスフェクトさせ、７２時間後に溶解した。透明にした全細胞ライセートを、ＦＡＫ、Ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＩＫ３Ｒ１及びＴＧＦＢＲＩＩＩについてイムノブロットにかけた。ビンキュリン及びチューブリンは、ローディング対照である。ボックスは、タンパク質下方制御を示す。 ＰＴＥＮ経路におけるリンタンパク質のウエスタンブロットを示す図である。ヒト腫瘍細胞株を１０ｎＭのスクランブル対照又は１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａでトランスフェクトさせ、７２時間後に溶解した。透明にした全細胞ライセートを、ｐＳｅｒ４７３ ＡＫＴ、ＡＫＴ、ｐＴｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４ ＥＲＫ１／２、ＥＲＫ１／２、ｐＳｅｒ２５９ ｃ－ＲＡＦ及びｃ－ＲＡＦについてイムノブロットにかけた。ビンキュリン及びチューブリンは、ローディング対照である。完全なボックスはタンパク質の下方制御を示し、破線のボックスはタンパク質の上方制御を示す。 ｍｉＲＮＡ－１９３ａによるトランスフェクションは、Ａ２０５８、ＨＥＰ３Ｂ、ＨＣＴ１１６及びＨｕｈ７細胞におけるＣＲＴの表面発現を誘導することを示す図である。（Ａ－Ｂ）グラフは、それらの表面でＣＲＴを発現する生（ＤＡＰＩ－）及び瀕死（ＤＡＰＩｌｏｗ）であるが死（ＤＡＰＩ＋）ではないＡ２０５８及びＨＥＰ３Ｂ細胞のパーセンテージを示す。細胞は、０．１、１、３及び１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はｍｏｃｋトランスフェクション対照でトランスフェクトした。（Ｃ－Ｄ）パネルは、トランスフェクションの７２時間後に分析したＡ２０５８（Ｃ）及びＨＥＰ３Ｂ（Ｄ）細胞の細胞蛍光測定プロットを示す。（Ｅ－Ｆ）グラフは、１及び１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はｍｏｃｋトランスフェクション対照によるトランスフェクションの９６時間後の、それらの表面でＣＲＴを発現する生（ＤＡＰＩ－）ＨＣＴ１１６及びＨｕｈ７細胞のパーセンテージを示す。（Ｇ－Ｈ）パネルは、トランスフェクションの９６時間後に分析したＨＣＴ１１６（Ｇ）及びＨｕｈ７（Ｈ）細胞の細胞蛍光測定プロットを示す。 ｍｉＲＮＡ－１９３ａによるトランスフェクションは、Ａ２０５８、ＨＥＰ３Ｂ、ＨＣＴ１１６及びＨｕｈ７細胞におけるＣＲＴの表面発現を誘導することを示す図である。（Ａ－Ｂ）グラフは、それらの表面でＣＲＴを発現する生（ＤＡＰＩ－）及び瀕死（ＤＡＰＩｌｏｗ）であるが死（ＤＡＰＩ＋）ではないＡ２０５８及びＨＥＰ３Ｂ細胞のパーセンテージを示す。細胞は、０．１、１、３及び１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はｍｏｃｋトランスフェクション対照でトランスフェクトした。（Ｃ－Ｄ）パネルは、トランスフェクションの７２時間後に分析したＡ２０５８（Ｃ）及びＨＥＰ３Ｂ（Ｄ）細胞の細胞蛍光測定プロットを示す。（Ｅ－Ｆ）グラフは、１及び１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はｍｏｃｋトランスフェクション対照によるトランスフェクションの９６時間後の、それらの表面でＣＲＴを発現する生（ＤＡＰＩ－）ＨＣＴ１１６及びＨｕｈ７細胞のパーセンテージを示す。（Ｇ－Ｈ）パネルは、トランスフェクションの９６時間後に分析したＨＣＴ１１６（Ｇ）及びＨｕｈ７（Ｈ）細胞の細胞蛍光測定プロットを示す。 ｍｉＲＮＡ－１９３ａによるトランスフェクションは、Ａ２０５８、ＨＥＰ３Ｂ、ＨＣＴ１１６及びＨｕｈ７細胞におけるＣＲＴの表面発現を誘導することを示す図である。（Ａ－Ｂ）グラフは、それらの表面でＣＲＴを発現する生（ＤＡＰＩ－）及び瀕死（ＤＡＰＩｌｏｗ）であるが死（ＤＡＰＩ＋）ではないＡ２０５８及びＨＥＰ３Ｂ細胞のパーセンテージを示す。細胞は、０．１、１、３及び１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はｍｏｃｋトランスフェクション対照でトランスフェクトした。（Ｃ－Ｄ）パネルは、トランスフェクションの７２時間後に分析したＡ２０５８（Ｃ）及びＨＥＰ３Ｂ（Ｄ）細胞の細胞蛍光測定プロットを示す。（Ｅ－Ｆ）グラフは、１及び１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はｍｏｃｋトランスフェクション対照によるトランスフェクションの９６時間後の、それらの表面でＣＲＴを発現する生（ＤＡＰＩ－）ＨＣＴ１１６及びＨｕｈ７細胞のパーセンテージを示す。（Ｇ－Ｈ）パネルは、トランスフェクションの９６時間後に分析したＨＣＴ１１６（Ｇ）及びＨｕｈ７（Ｈ）細胞の細胞蛍光測定プロットを示す。 ｍｉＲＮＡ－１９３ａによるトランスフェクションは、Ａ２０５８、ＨＥＰ３Ｂ、ＨＣＴ１１６及びＨｕｈ７細胞におけるＣＲＴの表面発現を誘導することを示す図である。（Ａ－Ｂ）グラフは、それらの表面でＣＲＴを発現する生（ＤＡＰＩ－）及び瀕死（ＤＡＰＩｌｏｗ）であるが死（ＤＡＰＩ＋）ではないＡ２０５８及びＨＥＰ３Ｂ細胞のパーセンテージを示す。細胞は、０．１、１、３及び１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はｍｏｃｋトランスフェクション対照でトランスフェクトした。（Ｃ－Ｄ）パネルは、トランスフェクションの７２時間後に分析したＡ２０５８（Ｃ）及びＨＥＰ３Ｂ（Ｄ）細胞の細胞蛍光測定プロットを示す。（Ｅ－Ｆ）グラフは、１及び１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はｍｏｃｋトランスフェクション対照によるトランスフェクションの９６時間後の、それらの表面でＣＲＴを発現する生（ＤＡＰＩ－）ＨＣＴ１１６及びＨｕｈ７細胞のパーセンテージを示す。（Ｇ－Ｈ）パネルは、トランスフェクションの９６時間後に分析したＨＣＴ１１６（Ｇ）及びＨｕｈ７（Ｈ）細胞の細胞蛍光測定プロットを示す。 ｍｉＲＮＡ－１９３ａによるトランスフェクションは、Ａ２０５８、ＨＥＰ３Ｂ、ＨＣＴ１１６及びＨｕｈ７細胞におけるＣＲＴの表面発現を誘導することを示す図である。（Ａ－Ｂ）グラフは、それらの表面でＣＲＴを発現する生（ＤＡＰＩ－）及び瀕死（ＤＡＰＩｌｏｗ）であるが死（ＤＡＰＩ＋）ではないＡ２０５８及びＨＥＰ３Ｂ細胞のパーセンテージを示す。細胞は、０．１、１、３及び１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はｍｏｃｋトランスフェクション対照でトランスフェクトした。（Ｃ－Ｄ）パネルは、トランスフェクションの７２時間後に分析したＡ２０５８（Ｃ）及びＨＥＰ３Ｂ（Ｄ）細胞の細胞蛍光測定プロットを示す。（Ｅ－Ｆ）グラフは、１及び１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はｍｏｃｋトランスフェクション対照によるトランスフェクションの９６時間後の、それらの表面でＣＲＴを発現する生（ＤＡＰＩ－）ＨＣＴ１１６及びＨｕｈ７細胞のパーセンテージを示す。（Ｇ－Ｈ）パネルは、トランスフェクションの９６時間後に分析したＨＣＴ１１６（Ｇ）及びＨｕｈ７（Ｈ）細胞の細胞蛍光測定プロットを示す。 ｍｉＲＮＡ－１９３ａによるトランスフェクションは、Ａ２０５８、ＨＥＰ３Ｂ、ＨＣＴ１１６及びＨｕｈ７細胞におけるＣＲＴの表面発現を誘導することを示す図である。（Ａ－Ｂ）グラフは、それらの表面でＣＲＴを発現する生（ＤＡＰＩ－）及び瀕死（ＤＡＰＩｌｏｗ）であるが死（ＤＡＰＩ＋）ではないＡ２０５８及びＨＥＰ３Ｂ細胞のパーセンテージを示す。細胞は、０．１、１、３及び１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はｍｏｃｋトランスフェクション対照でトランスフェクトした。（Ｃ－Ｄ）パネルは、トランスフェクションの７２時間後に分析したＡ２０５８（Ｃ）及びＨＥＰ３Ｂ（Ｄ）細胞の細胞蛍光測定プロットを示す。（Ｅ－Ｆ）グラフは、１及び１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はｍｏｃｋトランスフェクション対照によるトランスフェクションの９６時間後の、それらの表面でＣＲＴを発現する生（ＤＡＰＩ－）ＨＣＴ１１６及びＨｕｈ７細胞のパーセンテージを示す。（Ｇ－Ｈ）パネルは、トランスフェクションの９６時間後に分析したＨＣＴ１１６（Ｇ）及びＨｕｈ７（Ｈ）細胞の細胞蛍光測定プロットを示す。 ｍｉＲＮＡ－１９３ａによるトランスフェクションは、Ａ２０５８、ＨＥＰ３Ｂ、ＨＣＴ１１６及びＨｕｈ７細胞におけるＣＲＴの表面発現を誘導することを示す図である。（Ａ－Ｂ）グラフは、それらの表面でＣＲＴを発現する生（ＤＡＰＩ－）及び瀕死（ＤＡＰＩｌｏｗ）であるが死（ＤＡＰＩ＋）ではないＡ２０５８及びＨＥＰ３Ｂ細胞のパーセンテージを示す。細胞は、０．１、１、３及び１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はｍｏｃｋトランスフェクション対照でトランスフェクトした。（Ｃ－Ｄ）パネルは、トランスフェクションの７２時間後に分析したＡ２０５８（Ｃ）及びＨＥＰ３Ｂ（Ｄ）細胞の細胞蛍光測定プロットを示す。（Ｅ－Ｆ）グラフは、１及び１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はｍｏｃｋトランスフェクション対照によるトランスフェクションの９６時間後の、それらの表面でＣＲＴを発現する生（ＤＡＰＩ－）ＨＣＴ１１６及びＨｕｈ７細胞のパーセンテージを示す。（Ｇ－Ｈ）パネルは、トランスフェクションの９６時間後に分析したＨＣＴ１１６（Ｇ）及びＨｕｈ７（Ｈ）細胞の細胞蛍光測定プロットを示す。 ｍｉＲＮＡ－１９３ａによるトランスフェクションは、Ａ２０５８、ＨＥＰ３Ｂ、ＨＣＴ１１６及びＨｕｈ７細胞におけるＣＲＴの表面発現を誘導することを示す図である。（Ａ－Ｂ）グラフは、それらの表面でＣＲＴを発現する生（ＤＡＰＩ－）及び瀕死（ＤＡＰＩｌｏｗ）であるが死（ＤＡＰＩ＋）ではないＡ２０５８及びＨＥＰ３Ｂ細胞のパーセンテージを示す。細胞は、０．１、１、３及び１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はｍｏｃｋトランスフェクション対照でトランスフェクトした。（Ｃ－Ｄ）パネルは、トランスフェクションの７２時間後に分析したＡ２０５８（Ｃ）及びＨＥＰ３Ｂ（Ｄ）細胞の細胞蛍光測定プロットを示す。（Ｅ－Ｆ）グラフは、１及び１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はｍｏｃｋトランスフェクション対照によるトランスフェクションの９６時間後の、それらの表面でＣＲＴを発現する生（ＤＡＰＩ－）ＨＣＴ１１６及びＨｕｈ７細胞のパーセンテージを示す。（Ｇ－Ｈ）パネルは、トランスフェクションの９６時間後に分析したＨＣＴ１１６（Ｇ）及びＨｕｈ７（Ｈ）細胞の細胞蛍光測定プロットを示す。 ｍｉＲＮＡ－１９３ａでトランスフェクトした細胞は、共培養アッセイで単球からの樹状細胞の成熟を著しく刺激することができることを示す図である。単球は、ｍｏｃｋトランスフェクトされたか又はｍｉＲＮＡ－１９３ａでトランスフェクト（１又は１０ｎＭ）されたＡ２０５８細胞との共培養に保った。成熟したＤＣのマーカーとしてのＣＤ８０及びＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現は、共培養から７日後にフローサイトメトリーで測定した。ＴＮＦαは、公知のＤＣ成熟刺激物質として使用した。 ｍｉＲＮＡ－１９３ａでトランスフェクトした細胞は、共培養アッセイで単球からの樹状細胞の成熟を著しく刺激することができることを示す図である。単球は、ｍｏｃｋトランスフェクトされたか又はｍｉＲＮＡ－１９３ａでトランスフェクト（１又は１０ｎＭ）されたＡ２０５８細胞との共培養に保った。成熟したＤＣのマーカーとしてのＣＤ８０及びＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現は、共培養から７日後にフローサイトメトリーで測定した。ＴＮＦαは、公知のＤＣ成熟刺激物質として使用した。 ｍｉＲＮＡ－１９３ａでトランスフェクトしたＡ２０５８腫瘍細胞との共培養は、Ｔ細胞の増殖を増強することを示す図である。ＰＢＭＣはＣＦＳＥで標識し、単独で培養に、又はｍｏｃｋトランスフェクトしたか又はｍｉＲＮＡ－１９３ａでトランスフェクトしたＡ２０５８細胞との共培養に保った。細胞蛍光測定プロットは、共培養の２日又は６日後の、ＣＤ３＋Ｔ細胞のＣＦＳＥのレベルを示す。 ヒト黒色腫Ａ２０５８及びＮＳＣＬＣ Ａ５４９腫瘍細胞に及ぼすヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の作用を示す図である。ヒト黒色腫Ａ２０５８（Ａ）及びＮＳＣＬＣ Ａ５４９（Ｂ）腫瘍細胞は、ヒト抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体（Ｔ細胞活性化因子）の不在下又は存在下で、ヒトＰＢＭＣの腫瘍細胞に対する指示された比で７２時間共培養した。次に生存細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色した。生存細胞の相対的パーセンテージ（ＰＢＭＣがない場合の類似の実験条件と比較した）は、染色された細胞の比色分析によって定量化した（Ｆｅｏｋｔｉｓｔｏｖａら、２０１６年）。エラーバーは、３つの独立した複製の平均へのＳＤを表す。 ｍｉＲＮＡ－１９３ａによる腫瘍細胞トランスフェクションの時の、ヒト黒色腫Ａ２０５８（Ａ）及びＮＳＣＬＣ Ａ５４９（Ｂ）腫瘍細胞に及ぼすヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の影響を示す図である。ヒト黒色腫Ａ２０５８及びＮＳＣＬＣ Ａ５４９腫瘍細胞は、陰性ｍｉＲＮＡ対照又はｍｉＲ－１９３ａ－３ｐの指示された濃度でトランスフェクトし（ＲＮＡｉＭＡＸ）、その後、細胞はヒトＰＢＭＣの腫瘍細胞に対する指示された比で指示された時間共培養した。次に生存細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色した。生存細胞の相対的パーセンテージ（ｍｏｃｋトランスフェクトした条件と比較した）は、染色された細胞の比色分析によって定量化した（Ｆｅｏｋｔｉｓｔｏｖａら、２０１６年）。Ｎ．Ｓ．：有意でない、＊：ｐ＜０．０５及び＊＊：ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定（漸近有意性［両側］）によって決定。エラーバーは、３つの独立した複製の平均へのＳＤを表す。
［実施例］
実施例１－ｍｉＲＮＡ－１９３ａによる異なるがん細胞株の処置の後のＲＮＡシーケンシング、差示的遺伝子発現及び経路分析
ハイスループットＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）の実施は、遺伝子及びエクソンレベルで、全トランスクリプトームの包括的特徴に対して、並びに高い解像度及び有効性で、差示的に発現した遺伝子、新規遺伝子及び転写物を特定する特有の能力に関する強力なツールとなっている。しかし、今日まで、がん発症におけるその特異的役割について非常に少ないｍｉＲＮＡしか特徴付けられてこなかった。したがって、本発明者らは、１０ｎＭのｍｉＲ－１９３ａによるトランスフェクションの２４時間後に、Ａ５４０及びＨ４６０（共に肺がん）、Ｈｕｈ７及びＨｅｐ３Ｂ（共に肝がん）及びＢＴ５４９（乳がん）を含む５つの異なるがん細胞株でｍｉＲＮＡ－１９３ａ（すなわちｍｉＲＮＡ－１９３ａ－３ｐ模倣体）を過剰発現させた後に、ハイスループットＲＮＡシーケンシングを使用した。遺伝子発現は対照としてｍｏｃｋと比較し、差示的に発現された遺伝子及びそれらの細胞経路をその後特定した。
１．１ 材料及び方法
１．１．１ ＲＮＡシーケンシングのための細胞調製
ヒトがん細胞株を適当な培地（表１）で培養し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用した１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａ－３ｐ模倣体又はｍｏｃｋによるトランスフェクションの２４時間前に６ウェルプレートに播種した。模倣体は二本鎖模倣体であって、アンチセンス鎖は配列番号５６（カノニカルなｍｉＲＮＡ－１９３ａ－３ｐ）を有するＲＮＡオリゴヌクレオチドからなり、センス鎖は配列番号２１８で表されるオリゴヌクレオチドからなった。
トランスフェクションの１６時間後に試薬を吸い取り、新たな６ウェルプレートに細胞を継代した。トランスフェクションの後に培地を２４時間吸引し、プレートを－８０℃で保存した。各細胞株について、３つの独立した複製を実施した。
Figure 2023515010000004
１．１．２ ＲＮＡシーケンシングのためのＲＮＡ単離
ＲＮＡは、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。手順には、カラムの上でのＤＮａｓｅ処理が含まれた。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏｄｒｏｐＯｎｅで測定した。１５０ｎｇのそれぞれ独立した複製をプールし、４５０ｎｇの試料（試料ＩＤ Ａ５４９ Ｍｏｃｋ＿２４、Ａ５４９ ｍｉＲＮＡ－１９３ａ－３ｐ＿２４、ＢＴ５４９ Ｍｏｃｋ＿２４、ＢＴ５４９ｍｉＲＮＡ－１９３ａ－３ｐ＿２４、Ｈ４６０ Ｍｏｃｋ＿２４、Ｈ４６０ ｍｉＲＮＡ－１９３ａ－３ｐ＿２４、ＨＥＰ３Ｂ Ｍｏｃｋ＿２４、ＨＥＰ３Ｂ ｍｉＲＮＡ－１９３ａ－３ｐ＿２４、ＨＵＨ７ Ｍｏｃｋ＿２４及びＨＵＨ７ ｍｉＲＮＡ－１９３ａ－３ｐ＿２４を有する）をＧｅｎｏｍｅＳｃａｎ ＢＶ（Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）にかけた。
１．１．３ ＲＮＡシーケンシング手順
ポリＡ富化を実行し、続いてＧｅｎｏｍｅＳｃａｎＢＶでＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ６０００を使用して次世代ＲＮＡシーケンシングが実行された。データ処理ワークフローは、生データ品質管理、アダプタートリミング、及び短いリードのアラインメントを含んだ。参照ＧＲＣｈ３７．７５．ｄｎａ．ｐｒｉｍａｒｙ＿ａｓｓｅｍｂｌｙを各試料に対するリードのアラインメントに使用した。アラインメントファイルにマッピングした位置に基づいて、どの程度の頻度でリードが転写物にマッピングされたかを決定した（特徴集計）。集計をカウントファイルに保存し、下流ＲＮＡ－Ｓｅｑ示差発現分析のためのインプットとした。
１．１．４ ＲＮＡシーケンシングのためのデータ分析
ＧｅｎｏｍｅＳｃａｎ ＢＶによって設定された短いリードデータに関して、示差発現分析を実施した。リード集計をＲ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｖ３．４．４内の統計パッケージであるＤＥＳｅｑパッケージ ｖ１．３０．０にローディングした。試料サイズが小さく、過剰に分散したＲＮＡ－ｓｅｑデータに関して、２つの条件（ｍｏｃｋ対ｍｉＲＮＡ－１９３ａ－３ｐ）の間の示差発現遺伝子を見つけるために、ＤＥＳｅｑを特異的に開発した。示差発現比較の群分けを表に示す。
Figure 2023515010000005
１．１．５ 経路分析
本発明者らのＲＮＡシーケンシングデータセットで有意に（Ｐ＜０．０５）差示的に発現された遺伝子のリストをアップロードし、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ソフトウェア（ｗｗｗ．ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍ）を使用して分析した。
１．２ 結果
１．２．１ 固形腫瘍細胞株でｍｉＲ－１９３ａ－３ｐ模倣体によって調節された遺伝子
トランスフェクションの２４時間後に有意に（Ｐ＜０．０５）差示的に発現された遺伝子（相対的発現ｍｉＲＮＡ－１９３ａ／相対的発現ｍｏｃｋ）のリストを、全ての細胞株のために作製した（発明の説明を参照する）。ほとんどの遺伝子は、ｍｏｃｋと比較して下方制御された（相対的発現ｍｉＲＮＡ－１９３ａ／相対的発現ｍｏｃｋ＜１）（表３を参照する）。
Figure 2023515010000006
表４は、各細胞株におけるｍｉＲＮＡ－１９３ａによって下方制御されたがんで公知の役割を有する遺伝子を示す。全ての細胞株で下方制御された遺伝子には、以下が含まれる：ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ６、ＫＲＡＳ、ＭＣＬ１、ＮＴ５Ｅ、ＳＴＭＮ１、ＴＧＦＢＲ３及びＹＷＨＡＺ。
Figure 2023515010000007
１．２．２ 固形腫瘍細胞株でｍｉＲ－１９３ａによって調節された細胞経路
差示的発現データに基づき、ｍｏｃｋと比較してｍｉＲＮＡ－１９３ａ処置細胞で影響を受けるカノニカルな経路を特定するために、ＩＰＡを実行した。目的が、がん型にわたってｍｉＲ－１９３ａの作用方式をより精細に定義することによって新規の処置オプションを開発することであったので、本発明者らは、少なくとも３つの細胞株で差示的に発現される遺伝子によって調節された経路を次に分析した。この分析は、細胞増殖及び腫瘍進行を誘導する多くの増殖因子シグナル伝達経路を含め、経路の大半は影響を受けたか又は阻害された（図１Ａ）ことを示した。最も富化されたカノニカルな経路、腫瘍抑制性ＰＴＥＮ経路は、活性化された（２．３０９のｚスコア）ことが示された。この経路で差示的に発現された遺伝子には、ＲＰＳ６ＫＢ２、ＫＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＢ、ＳＯＳ２、ＴＧＦＢＲ３、ＣＡＳＰ９、ＩＮＰＰＬ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＫ２、ＣＢＬ、ＰＤＰＫ１、ＣＣＮＤ１、ＢＣＡＲ１及びＭＡＧＩ３が含まれる（図２）。
ニューレグリンシグナル伝達（－２．３３３のｚスコア）及びＨＧＦシグナル伝達（－３．１６２のｚスコア）を含め、他の特定された経路は有意に阻害された。これらの経路に参加する本発明者らの差示的発現データセットからの遺伝子は図１ｂで示され、ＰＩ３ＫＲ１、ＫＲＡＳ、ＳＯＳ２及びＰＴＫ２を含む。多くは、増殖因子シグナル伝達及びマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の重要な成分であり、細胞増殖及び腫瘍進行のための核シグナルを誘導する。
その後、生物学的機能及び疾患プロセスに及ぼす観察された遺伝子発現変化の下流側影響を予測するために、ＩＰＡソフトウェアを使用した。２４時間後の１９３ａによって変更された１００個の最も有意な生物学的機能のうち、阻害された（ｚスコア＜－２）ものは細胞の生存、増殖、移動又はがんに関連し、活性化された（ｚスコア＞２）ものは（腫瘍）細胞死に関連していた（図３）。さらに、影響を受けた生物学的機能の過半数（２４時間後に５５％）は、がんのカテゴリーに属した（表５、２４時間後のｍｉＲＮＡ－１９３ａによって調節された機能（全てＰ＜０．００００１）の数に基づいてランク付けされた上位１００個の生物学的機能のカテゴリーを示す）。
Figure 2023515010000008
実施例２－ｍｉＲＮＡ－１９３ａによる異なるがん細胞株の処置の後のＲＮＡシーケンシング、差示的遺伝子発現及び経路分析
ｍｉＲＮＡ－１９３ａを、異なるがん細胞株で試験した（表２．１を参照する）。細胞は、実施例１に記載されるように異なる濃度（１、３、１０ｎＭ）でｍｉＲＮＡ－１９３ａによって処置した。対照（ｍｏｃｋ、未処置及びスクランブル化）は、全ての細胞型について測定した。アッセイは、２４時間後、４８時間後及び７２時間後に実行した。表２．１は、指示された時点における１０ｎＭ濃度の結果を示す。結果を定量化し、ｍｏｃｋ対照に正規化した。細胞がその濃度で毒性作用の徴候を示さなかったので、１０ｎＭは好適な濃度であった。
Figure 2023515010000009
ＭＴＳアッセイ又は細胞計数によって測定される通り、がん細胞株でのｍｉＲＮＡ－１９３ａ処置は細胞生存率を経時的に減少させた。カスパーゼ３／７アポトーシスアッセイによって測定される通り、アポトーシス誘導は経時的に増強された。細胞周期アレストプロファイルは、核画像化又はフローサイトメトリーを実行することによって測定した。ｍｉＲＮＡ－１９３ａ処置は、細胞株に依存する方法でＧ２／Ｍ又はＳｕｂＧ１細胞周期アレストプロファイルを誘導した。指示された方法によりＨＵＨ７では明らかな細胞周期アレストプロファイルは観察されなかったが、この細胞株でのｍｉＲＮＡ－１９３ａ処置の後、ウエスタンブロット（データ示さず）におけるカスパーゼ３／７活性化及び切断ｐａｒｐタンパク質の増強によって示されるアポトーシスの増加が観察された。この結果は、ｍｉＲＮＡ－１９３ａ処置が細胞の生存能に影響を及ぼすことを示す。ボイデンチャンバーアッセイを通して調査された通り、２つの細胞株の細胞運動能は処置の後に有意に減少した。
結論
ｍｉＲＮＡ－１９３ａ処置は、一部アポトーシスを誘導することによって、及び細胞周期アレストプロファイルの増加によって細胞生存率を減少させた。ｍｉＲＮＡ－１９３ａ処置は、がん細胞の細胞運動能も減少させ、がん細胞移動の阻害におけるその役割を示す。
実施例３－ＰＴＥＮ経路活性化のさらなる研究
実施例１は、ＩＰＡ分析が腫瘍抑制性ＰＴＥＮ経路を、ｍｉＲＮＡ－１９３ａによって活性化された最も富化されたカノニカルな経路として特定したことを示す。ここで、ＦＡＫ（ＰＴＫ２）、Ｐ７０Ｓ６（ＲＰＳ６ＫＢ２）、ＰＩ３ＫＲ１、ＴＧＦＢＲＩＩＩ並びにＰ－ＡＫＴ、ＡＫＴ、ｐ－ＥＲＫ１／２、ＥＲＫ１／２、ｐ－ｃ－ＲＡＦ及びｃ－ＲＡＦを含む他の重要なシグナル伝達分子を含む選択されたｍｉＲＮＡ－１９３ａ標的の調節は、ウエスタンブロッティングによってタンパク質レベルで分析され、全ての因子はＰＴＥＮ経路の中にある。
材料及び方法
細胞調製
ヒトがん細胞株を適当な培地（下の表を参照する）で培養し、実施例１に記載された１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａ－３ｐ模倣体、１０ｎＭのスクランブルしたランダム対照、又はｍｏｃｋによる、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用したトランスフェクションの前に、６ウェルプレートに播種した。トランスフェクションの後に培地を７２時間吸引し、プレートを－８０℃で保存した。
３．１．細胞株詳細
Figure 2023515010000010
タンパク質単離及び定量化
プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテルを補ったＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）を、採取した細胞に加えた。ライセートを１５，０００ｇにより４℃で１時間遠心分離し、細胞破片ペレットを除去することによって透明にした。タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して決定した。
電気泳動及びイムノブロッティング
ミニプロテアンＴＧＸ無染色成型ゲル（Ｂｉｏ Ｒａｄ）でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、試料を１２０Ｖで分離した。タンパク質は、転移緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール）の中でＰＶＤＦ膜に２００ｍＡで２時間転移させた。膜は、Ｔｗｅｅｎを含有するＴｒｉｓ－緩衝食塩水（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ）中の５％ミルク又は５％ＢＳＡを使用してブロックした。ブロットは、一次及びホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体で調べた。タンパク質は、ＥＣＬ試薬を使用して検出した。膜は剥脱緩衝液（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１００ｍＭ２－メルカプトエタノール）の中で５０℃で３０分間剥脱し、適宜再び調べた。
結果
選択された予測されたｍｉＲ－１９３ａ－３ｐ標的遺伝子のタンパク質レベル並びにＰＴＥＮ経路の重要なシグナル伝達タンパク質のリン酸化状態を調査するために、実施例１に記載される１０ｎＭのスクランブル化対照又は１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａ－３ｐ模倣体でトランスフェクトした細胞からのライセートをイムノブロットにかけた。試験した全細胞株（Ａ５４９、ＨＵＨ７、ＳＮＵ４４９、ＢＴ５４９、Ｈ４６０、Ａ２０５８、ＨＥＰ３Ｂ及びＰＡＮＣ－１）では、ＰＴＫ２とも呼ばれるＦＡＫの下方制御が、ｍｏｃｋ及びスクランブルされた対照と比較してｍｉＲＮＡ－１９３ａ試料で観察された（図４）。構成的発現レベルを観察することができる細胞株（Ａ５４９、ＨＵＨ７、ＳＮＵ４４９、ＢＴ５４９及びＨ４６０）で、ｍｉＲＮＡ－１９３ａによってＴＧＦＢＲＩＩＩも下方制御された。ＰＩ３Ｋの調節サブユニットであるＰＩＫ３Ｒ１のタンパク質レベルは、ＳＮＵ４４９以外は全ての細胞株で減少した。ＲＰＳ６ＫＢ２とも呼ばれるＰ７０Ｓ６は、Ｈ４６０、Ａ２０５８及びＨＥＰ３Ｂにおいて下方制御された。ビンキュリン及びチューブリンは、ローディング対照として使用した。Ａ５４９及びＨ４６０では、チューブリンはｍｉＲＮＡ－１９３ａの影響を受けたが、ビンキュリンは安定しており、ｍｉＲＮＡ－１９３ａは一般的なタンパク質レベルを低減しないことを示した。さらに、本発明者らはほとんどの細胞株（Ａ５４９、Ａ２０５８、ＳＮＵ４４９、ＨＵＨ７、Ｈ４６０及びＨＥＰ３Ｂ）でｍｉＲＮＡ－１９３ａによるＡＫＴリン酸化の下方制御を観察した（図５）。興味深いことに、ｍｉＲＮＡ－１９３ａは、少なくとも２つの細胞株（Ａ５４９及びＡ２０５８）でＥＲＫのリン酸化を増加させた。ＳＮＵ４４９では、ＥＲＫリン酸化及びＥＲＫ全タンパク質レベルは上方制御された。ｃ－ＲＡＦのリン酸化は、ＰＡＮＣ－１で下方制御されるだけだった。
結論
これらの結果は、前に得られたＲＮＡシーケンシングデータと一致している。ｍｉＲＮＡ－１９３ａ－３ｐ模倣体ｍｉＲＮＡ－１９３ａは、複数のヒト腫瘍細胞株においてＦＡＫ、Ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＩＫ３Ｒ１及びＴＧＦＢＲＩＩＩのタンパク質発現を減少させた。さらに、ｍｉＲＮＡ－１９３ａ－３ｐ模倣体ｍｉＲＮＡ－１９３ａによる細胞の処置は、ＡＫＴのリン酸化の低減につながり、それはＰＩＫ３Ｒ１及びＦＡＫなどの上流のシグナル伝達タンパク質の下方制御によるかもしれない。さらに、本発明者らは、ＥＲＫのリン酸化の増加を観察し、それはＲＡＦへの作用を通したＡＫＴ活性の減少の結果であるかもしれないが、ｃ－ＲＡＦのリン酸化は１細胞株（ＰＡＮＣ－１）だけで減少した。ＥＲＫのリン酸化の増加は、ホスファターゼ活性の減少又は上流キナーゼ活性の増加を含む、他の上流の事象の結果であるかもしれない。
実施例４－ｍｉＲＮＡ－１９３ａは、免疫原性細胞死（ＩＣＤ）インデューサーである
序論：免疫原性細胞死（ＩＣＤ）の概念は、傷害関連の分子パターン（ＤＡＭＰ）として知られる危険シグナルの空間時間的に定義されたセットの放出を通して抗原特異的適応性免疫応答を導き出すことが可能な、調節された細胞死の特異なクラスとして定義されている（Ｋｒｙｓｋｏら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、２０１２年；Ｃａｓａｒｅｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２００５年；Ｋｒｏｅｍｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１３年）。最も注目すべきＤＡＭＰは以下の通りである：ＨＧＭＢ１の放出、ＡＴＰの放出及びカルレティキュリン（ＣＲＴ）の表面発現であり、これはＥＲストレスの印である。がん細胞死の誘導の後の一部の（特異的）抗がん剤によるＩＣＤの誘導は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）へのＤＡＭＰの放出につながり、それはそれらの成熟を加速するために樹状細胞（ＤＣ）によって発現される受容体の上で作動し、次に、Ｔ細胞への腫瘍関連抗原の提示を刺激し、Ｔ細胞の活性化及び増殖につながり、最終的に腫瘍細胞に対する増強された細胞毒性及び腫瘍抗原に対する免疫学的記憶の形成に達する。
材料及び方法
トランスフェクション：Ａ２０５８黒色腫、ＨＥＰ３Ｂ及びＨｕｈ７肝細胞及びＨＣＴ１１６結腸腫瘍細胞を、実施例１に記載される異なる濃度のｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はｍｏｃｋ（「偽のトランスフェクション」）対照でトランスフェクトした。簡潔には、５×１０５のＡ２０５８又はＨＥＰ３Ｂ細胞を、６ウェル細胞培養プレートの中の１．５ｍＬの完全培地に播種した。両方の細胞株は、４時間後にトランスフェクトした。７．５μＬのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）及び適当な濃度のｍｉＲＮＡ－１９３ａ－３ｐを含有する５００μＬのトランスフェクションミックスを、各ウェルに加えた。含まれたトランスフェクション条件は、０．１、１、３又は１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａ及びｍｏｃｋトランスフェクトされた陰性対照であった。Ｈｕｈ７及びＨＣＴ１１６細胞株は、２４時間後にトランスフェクトした。最初に、培地を１．５ｍＬの新鮮な培地に置き換えた。次に、７．５μＬのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ及び適当な濃度のｍｉＲＮＡ－１９３ａを含有する５００μＬのトランスフェクションミックスを、各ウェルに加えた。含まれたトランスフェクション条件は、１又は１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａ及びｍｏｃｋトランスフェクトされた陰性対照であった。培地を５ｍＬ管に吸引して保持し、ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）により１×洗浄し、脱離まで１０～１２分間インキュベートすることによるトランスフェクションから１６時間後に、全ての細胞株を２４ウェルプレートに継代培養した。細胞を１ｍＬの新鮮な培地で収集し、保持された培地に加えた。管を１，５００ＲＰＭで５分間遠心分離し、上清を除去した。細胞を５００μＬの新鮮な培地に再懸濁させ、Ｌｕｎａ－ＩＩ細胞カウンター（Ｗｅｓｔｂｕｒｇ）を使用してトリパンブルーによる１：１の希釈溶液を使用して数えた。１ｍＬの新鮮培地中の５×１０４細胞を各ウェルに播種した。
フローサイトメトリー：トランスフェクション後の指摘された時間のフローサイトメトリー分析のために、ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）で１×洗浄し、脱離まで１０～１２分間インキュベートした後に細胞を採取した。各条件のために、５×１０４細胞を含有する２００μＬの単一の細胞懸濁液を、４ｍＬポリプロピレン管の中で調製した。１：２００希釈溶液の中で細胞を蛍光標識抗体で染色した。ＣＲＴの発現は、ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）４８８コンジュゲート抗ヒトカルレティキュリン（ＣＲＴ）抗体（クローンＦＭＣ７５、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。ＤＣの成熟状態を検出するために、ＣＤ８０及びＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現を、それぞれＰｅｒＣＰ／Ｃｙａｎｉｎｅ５．５抗ヒトＣＤ８０抗体（クローン２Ｄ１０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＡＰＣ抗ヒトＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ抗体（クローンＴｕ３９、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して測定した。さらに、生／死細胞を検出するためにＤＡＰＩ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を２μＭの最終濃度で加え、死細胞はさらなる分析から排除した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してフローサイトメトリーを実行し、データはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ社）で分析した。
ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣとの共培養：ＳｅｐＭａｔｅ（商標）－５０管（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）を製造業者のプロトコールに従って使用して、ＰＢＭＣを新鮮な血液バフィーコート（Ｓａｎｑｕｉｎ）から単離した。Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、密度勾配培地として使用した。ＣＦＳＥ細胞***トラッカーキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を製造業者のプロトコールに従って使用して、ＰＢＭＣをＣＦＳＥで次に標識した。Ａ２０５８細胞をトランスフェクトし、トランスフェクションの１６時間後に、前に説明した通り細胞を２４ウェルプレートに継代培養した。３×１０４のＡ２０５８細胞を各ウェルの０．５ｍＬの新鮮な培地に播種した。さらに、１．２×１０５のＰＢＭＣを含有する０．５ｍＬのＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣ懸濁液を各ウェルに加えた。Ａ２０５８細胞なしの同量のＰＢＭＣを、「ＰＢＭＣのみ」の対照条件として培養した。共培養は、指摘した時間３７℃でインキュベートした。Ｔ細胞の検出のために、細胞を１：２００の希釈溶液中でＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０（商標）抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＵＣＨＴ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色した。
ＰＢＭＣからの単球の単離：ＭＡＣＳ細胞分離システム及び汎単球単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を製造業者のプロトコールに従って使用して、単球をＰＢＭＣから単離した。簡潔には、単球以外のＰＢＭＣに存在する全ての異なる主要な細胞型で発現される抗原に対するビオチンコンジュゲートモノクローナル抗体のカクテルでＰＢＭＣを標識した。標識細胞は、次にモノクローナル抗ビオチン抗体とコンジュゲートされたマイクロビーズを含有するカラムを通った。このアプローチは、磁気標識非単球細胞の消失によって、高度に純粋な非標識及び無傷な単球の単離を可能にした。
単球とのＡ２０５８細胞の共培養：前に説明したように、Ａ２０５８細胞は１若しくは１０ｎＭ濃度のｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はｍｏｃｋトランスフェクトした陰性対照でトランスフェクトした。前に説明した通り細胞はトランスフェクションの１６時間後に採取し、９６ウェルプレートに播種した。１００μＬの新鮮培地中の４×１０３の細胞を、各ウェルに播種した。４時間後に、４×１０３、４×１０４又は０単球（「単球：腫瘍細胞比」条件による）を含有する１００μＬのＤＣ生成培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を、各ウェルに加えた。共培養を開始した４日後に、全てのウェルの培地を１５０μＬの新鮮なＤＣ生成培地で置き換えた。成熟したＤＣのための陽性対照を有するために、共培養に細胞を入れてから６日後に、ＤＣ成熟刺激物質としてＴＮＦαを含有するＤＣ生成サイトカインパック（Ｃ－２８０５０、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）の成分Ｂを、陽性対照条件でウェルに加えた（５０００Ｕ／ｍＬの最終ＴＮＦα濃度を有するために、１．５μＬ／ウェルの成分Ｂサイトカインパック）。共培養から７日目、成熟したＤＣの細胞表面マーカーに対する蛍光抗体で細胞を染色し、前に説明した通りフローサイトメトリーで分析した。
結果
腫瘍細胞に及ぼすｍｉＲＮＡ－１９３ａの影響を調査するために、ｍｉＲＮＡ－１９３ａでトランスフェクトした腫瘍細胞の表面でのＣＲＴの発現を、フローサイトメトリーによって調査した。図６に示すように、ｍｉＲＮＡ－１９３ａは、それぞれわずか５％及び１０％の表面ＣＲＴ＋細胞を含有するｍｏｃｋトランスフェクトした細胞と比較して、Ａ２０５８細胞（７２時間後に最高４６％）（図６－Ａ及びＣ）及びＨＣＴ１１６細胞（９６時間後に最高６５％）（図６－Ｅ及びＧ）において細胞表面のＣＲＴマーカーの発現を誘導した。それぞれわずか４％及び２３％の表面ＣＲＴ＋細胞を含有するｍｏｃｋトランスフェクトした細胞と比較して、ＣＲＴマーカーの誘導は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（７２時間後に最高８％）（図６－Ｂ及びＤ）及びＨｕｈ７細胞（９６時間後に最高３５％）（図６－Ｆ及びＨ）においてもより少ない程度で観察された。さらに、２つの主要なエクトヌクレオチダーゼＣＤ３９及びＣＤ７３を標的にすることを通して、ｍｉＲＮＡ－１９３ａはＡＤＰ、ＡＭＰ及びアデノシンへの細胞外ＡＴＰの変換を阻止することができ、それによってＴＭＥのＡＴＰ含有量を保持する。
次に、Ａ２０５８細胞に及ぼすｍｉＲＮＡ－１９３ａの細胞傷害性の作用が完全に成熟したＤＣへの単球の成熟プロセスを刺激することができるかどうかについて本発明者らは調査した。これに対処するために、単球をｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はｍｏｃｋでトランスフェクトしたＡ２０５８細胞との共培養に置いた。共培養から７日後、成熟したＤＣ表面マーカー（ＣＤ８０及びＭＨＣＩＩ）を発現する細胞の頻度を、フローサイトメトリー分析で測定した。陽性対照を作製するために、ＴＮＦαを公知のＤＣ成熟インデューサーとして使用した。図７に示すように、単球を１０ｎＭのｍｉＲＮＡ－１９３ａでトランスフェクトしたＡ２０５８細胞と１０対１の比で共培養したとき、ＣＤ８０＋及びＭＨＣＩＩ＋細胞の頻度は、ｍｏｃｋトランスフェクトした細胞との共培養と比較して有意に増加した（それぞれ、１０×及び４．９×）。これらの結果は、ｍｉＲＮＡ－１９３ａでトランスフェクトしたＡ２０５８細胞が、細胞ベースのアッセイで単球からの樹状細胞の成熟を著しく刺激することができることを示す。
最後に、本発明者らはｍｉＲＮＡ－１９３ａでトランスフェクトした腫瘍細胞との共培養においてＴ細胞の増殖に及ぼすｍｉＲＮＡ－１９３ａの影響を扱った。ＰＢＭＣは、細胞の中で保持することができ、細胞***ごとに希釈される蛍光性無毒マーカーであるＣＦＳＥで標識した。フローサイトメトリーによって測定したＣＦＳＥのレベルは、３つの条件の間で比較した：１）培養中のＰＢＭＣだけ、２）ｍｏｃｋトランスフェクトしたＡ２０５８細胞による培養中のＰＢＭＣ、及び３）ｍｉＲＮＡ－１９３ａ １ｎＭでトランスフェクトしたＡ２０５８細胞による培養中のＰＢＭＣ。結果は、ｍｉＲＮＡ－１９３ａでトランスフェクトしたＡ２０５８細胞との共培養にＰＢＭＣを保つことは、Ｔ細胞の増殖を増強したことを示す（図８）。
さらに、ＰＢＭＣとの共培養の後の生存した腫瘍細胞の固定、染色及び比色定量化が示す通り、ｍｉＲＮＡ－１９３ａは、ＰＢＭＣ媒介細胞毒性への腫瘍細胞の脆弱さを増加させた。興味深いことに、同系マウスの４Ｔ１同所性乳がんモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ実験は、ｍｉＲＮＡ－１９３ａ処置動物、又はｍｉＲＮＡ－１９３ａ処置マウスから養子Ｔ細胞転移を受けたナイーブマウスにおいて、長期のＴ細胞媒介抗腫瘍免疫の形成を確認した。
まとめると、これらの結果は、ｍｉＲＮＡ－１９３ａが、全体的抗腫瘍有効性を増強するためにＰＢＭＣ媒介細胞毒性を刺激するだけでなく、ＤＣ成熟も刺激し、適応性抗腫瘍免疫の形成を活性化する方法で腫瘍細胞を死滅させる、本物のＩＣＤインデューサーであることを強く示唆する。
実施例５－ヒト腫瘍細胞でのトランスフェクションの後のヒトＰＢＭＣ媒介腫瘍細胞死滅に及ぼすｍｉＲＮＡ－１９３ａの影響
がん生物学の理解における最も近年の進展の１つは、免疫腫瘍学（ＩＯ）の分野である。しばしば、腫瘍はがん免疫監視を避ける能力を提示し、それはがんの特質の１つを表す（Ｈａｎａｈａｎら、２０１１年）。したがって、がん免疫療法の主な目標は、腫瘍認識及び免疫抑制機構の破壊のためのその能力を向上させることによって腫瘍への患者の免疫応答を強化することである（Ｃｈｅｎら、２０１７年）。腫瘍の顕著な免疫抑制を支える誘導機構の一部として、腫瘍学における新規治療的介入を開発するために、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）中のアデノシンレベルがかなりの注目を近年集めている。腫瘍微小環境（ＴＭＥ）中のアデノシンは、エクトヌクレオチダーゼＣＤ３９（ＥＮＴＰＤ１；細胞外アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）をアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）に、次にアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）に変換する）及びＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ；ＡＭＰからのアデノシンの生成を担う）によって主に生成される（Ｓｔａｇｇら、２０１０年）。ＮＴ５Ｅによって生成される遊離アデノシンは細胞性免疫応答を阻害し、それによって腫瘍細胞の免疫エスケープを促進するので、ＮＴ５Ｅは阻害性免疫チェックポイント分子として作用することができる。実際、アデノシンは、低酸素又は虚血によって開始される細胞性ストレスなどの炎症誘発性刺激に応答して生成される、強力な免疫抑制代謝産物である。Ｏｈｔａ及び同僚らによる画期的な研究は、腫瘍免疫エスケープのためのアデノシンの重要性を強調した（Ｏｈｔａら、２００６年）。固形腫瘍における細胞外アデノシン濃度は、正常な生理的条件下より高いことが報告されている（Ｂｌａｙら、１９９７年）。
本発明者らのトランスクリプトーム分析は、その発現が実施例１に記載されるｍｉＲ－１９３ａ－３ｐの模倣体による影響を受けた遺伝子の間で、免疫関連遺伝子のプールを特定した。それらには、ＣＤ７３などのＴＭＥの調節剤が含まれた。さらに、マウスモデルにおける本発明者らのｉｎ ｖｉｖｏ研究は、ｍｉＲ－１９３ａ－３ｐが、他の作用を抑えて、免疫細胞が腫瘍細胞を死滅させることにおいてより活性になる方法で腫瘍細胞と免疫系の間の相互作用を修飾することを強く示唆した。ヒト細胞におけるｍｉＲ－１９３ａ－３ｐのＩＯ関連の作用を調査し、さらにｍｉＲ－１９３ａ－３ｐ媒介のＩＯ作用の機構を調査するために、本発明者らは腫瘍細胞が健常なドナーの末梢血から単離されたヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）と共培養されたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを確立し、腫瘍細胞に及ぼすｈＰＢＭＣの細胞傷害性作用を、ｍｉＲ－１９３ａ－３ｐによるトランスフェクションの有る無しで調査した（実施例４を参照する）。
第１のステップとして、及びそのような細胞ベースのアッセイの技術的正当性を確立するために、ヒト抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞活性化因子抗体（陽性対照）を腫瘍細胞及びＰＢＭＣ共培養に加えた。使用した活性化因子は、ＣＤ３及びＣＤ２８免疫細胞表面リガンドに結合する可溶性四量体抗体複合体を含む。この結合はＣＤ３及びＣＤ２８の架橋をもたらし、それによって、有効なＴ細胞活性化のために必要な一次及び共刺激シグナルを提供する（Ｒｉｄｄｅｌｌら、１９９０年；Ｂａｓｈｏｕｒら、２０１４年）。図９に例示されるように、刺激されていないヒトＰＢＭＣは腫瘍細胞生存（共培養）への限定的な作用を示したが、共培養への抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体の追加は、腫瘍細胞生存の顕著な低下につながり、これは、おそらく効率的なＴ細胞活性化及び以降のＴ細胞媒介腫瘍細胞殺滅の結果であろう。興味深いことに、一次ヒト真皮線維芽細胞で実行された類似の研究では、線維芽細胞の生存能に及ぼす抗ＣＤ３／ＣＤ２８の影響は観察されず（データ示さず）、実験的なＴ細胞活性化がＴ細胞によって媒介される正常な線維芽細胞殺滅につながらないことを強く示唆した。
次に、ヒト黒色腫Ａ２０５８及びＮＳＣＬＣ Ａ５４９腫瘍細胞をｍｉＲ－１９３ａ－３ｐの漸増濃度でトランスフェクトし、その後、それらをヒトＰＢＭＣと（異なるＰＢＭＣ：腫瘍細胞比で）異なる時間共培養した。独立したドナーからのヒトＰＢＭＣは、実施例１に記載されるｍｉＲＮＡ－１９３ａによる腫瘍細胞のトランスフェクションの後に時間依存性の顕著な腫瘍細胞殺滅を誘導することができたが、（陰性）ｍｉＲＮＡ対照（スクランブル化）はできず、ｍｉＲＮＡ－１９３ａ活性の配列特異性を立証した（図１０）。
まとめると、本発明者らの結果は、ｍｉＲ－１９３ａ－３ｐによる腫瘍細胞のトランスフェクションは、腫瘍細胞をＰＢＭＣに感作させることによって、及び／又はＴ細胞含有ＰＢＭＣを活性化するシグナルをトランスフェクトした腫瘍細胞から放出させることによって、ヒトＰＢＭＣ細胞毒性への腫瘍細胞（例えば、Ａ２０５８及びＡ５４９腫瘍細胞）の脆弱さを明らかに増加させることを実証する。

Claims (15)

  1. カルレティキュリン（ＣＲＴ）の低発現と関連する状態又は障害のある免疫原性細胞死（ＩＣＤ）経路と関連する状態を処置することにおける使用のためのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はそのソース。
  2. 前記ｍｉＲＮＡ－１９３ａが、ＣＲＴアゴニストであるか又はＣＲＴの細胞表面発現を促進するか、又は前記ＩＣＤ経路をレスキュー若しくは回復する、請求項１に記載の使用のためのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はそのソース。
  3. 前記ｍｉＲＮＡ－１９３ａが、ｍｉＲＮＡ－１９３ａ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はその模倣体であり、好ましくは配列番号２２で表されるシード配列の７ヌクレオチドのうちの少なくとも６つを含むシード配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項１又は２に記載の使用のためのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はそのソース。
  4. ｍｉＲＮＡのソースが、ｍｉＲＮＡの前駆体であり、少なくとも５０ヌクレオチド長の核酸である、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のためのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はそのソース。
  5. 前記ｍｉＲＮＡが、配列番号５６、１２１又は１２２のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有し、
    及び／又は前記ｍｉＲＮＡが、１５～３０ヌクレオチド長であり、
    及び／又はｍｉＲＮＡの前記ソースが、前記ｍｉＲＮＡの前駆体であり、配列番号５又は１３のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有する、
    請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のためのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はそのソース。
  6. ＣＲＴの低発現と関連する前記状態が、低ＣＲＴがん又はＩＣＤ経路に障害のあるがんである、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のためのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はそのソース。
  7. 前記低ＣＲＴがんが、低ＣＲＴ肉腫、脳がん、頭頸部がん、乳がん、肺がん、腎臓がん、肝がん、結腸がん、卵巣がん、黒色腫、膵がん、甲状腺がん、過誤腫、造血器腫及びリンパ系腫瘍の腫瘍又は前立腺がんである、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のためのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はそのソース。
  8. 前記ｍｉＲＮＡ－１９３ａが、ＣＲＴ、ＲＰＳ６ＫＢ２、ＫＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＢ、ＳＯＳ２、ＴＧＦＢＲ３、ＣＡＳＰ９、ＩＮＰＰＬ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＫ２、ＣＢＬ、ＰＤＰＫ１、ＣＣＮＤ１、ＢＣＡＲ１、ＭＡＧＩ３、ＭＤＭ２、ＹＷＨＡＺ及びＭＣＬ１、及び任意選択でＨＭＧＢ１からなる群から、好ましくはＲＰＳ６ＫＢ２、ＫＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＢ、ＣＡＳＰ９、ＩＮＰＰＬ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＫ２、ＣＢＬ、ＰＤＰＫ１、ＣＣＮＤ１、ＢＣＡＲ１、ＭＡＧＩ３、ＭＤＭ２、ＹＷＨＡＺ、ＭＣＬ１からなる群から選択される、より好ましくはＰＤＰＫ１又はＩＮＰＰＬ１から選択される遺伝子の発現をモジュレートする、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のためのｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はそのソース。
  9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のための、請求項１～８のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はそのソースを含む組成物。
  10. さらなるｍｉＲＮＡ又はその前駆体をさらに含み、前記さらなるｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ－３２３、ｍｉＲＮＡ－３４２、ｍｉＲＮＡ－５２０ｆ、ｍｉＲＮＡ－５２０ｆ－ｉ３、ｍｉＲＮＡ－３１５７及びｍｉＲＮＡ－７又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はその模倣体からなる群から選択される、請求項９に記載の使用のための組成物。
  11. ＰＰ２Ａメチル化剤、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の阻害剤、抗体、ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＯＸ４０の結合剤などのＴ細胞副刺激分子の結合剤、及び化学療法剤からなる群から好ましくは選択される、追加の薬学的に活性な化合物をさらに含む、請求項９又は１０に記載の使用のための組成物。
  12. 請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のためのナノ粒子組成物であって、前記ナノ粒子は、ジアミノ脂質及び請求項１～８のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ－１９３ａ又はそのソースを含み、前記ジアミノ脂質は一般式（Ｉ）であり、
    Figure 2023515010000011
    式中、
    ｎは、０、１又は２であり、
    Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３は、それぞれ独立して、任意選択で不飽和であり、０、１、２、３又は４つの置換基を有するＣ１０～Ｃ１８鎖であり、置換基は、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルケニル、及びＣ１～Ｃ４アルコキシからなる群から選択される、ナノ粒子組成物。
  13. 前記ナノ粒子が、
    ｉ）２０～６０モル％のジアミノ脂質、及び
    ｉｉ）０～４０モル％のリン脂質、及び
    ｉｉｉ）３０～７０モル％のステロール、及び
    ｉｖ）０～１０モル％の水溶性ポリマー及び親油性アンカーのコンジュゲート
    を含む、請求項１２に記載の使用のためのナノ粒子組成物。
  14. ＣＲＴをアゴナイズするための、又はＣＲＴの細胞表面発現を増加させるためのｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの方法であって、細胞を請求項１～８のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ、又は請求項９～１３のいずれか一項に記載の組成物と接触させるステップを含む、方法。
  15. 低ＣＲＴがんを処置するための方法であって、対象に請求項１～８のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ－１９３ａ、又は請求項９～１３のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
JP2022549305A 2020-02-28 2021-02-26 免疫原性細胞死を促進するためのｍｉＲＮＡ－１９３ａ Pending JP2023515010A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20160235 2020-02-28
EP20160235.6 2020-02-28
EPPCT/EP2020/055965 2020-03-06
PCT/EP2020/055965 WO2021028081A1 (en) 2019-08-12 2020-03-06 New treatments involving mirna-193a
PCT/EP2021/054801 WO2021170786A1 (en) 2020-02-28 2021-02-26 miRNA-193a FOR PROMOTING IMMUNOGENIC CELL DEATH

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023515010A true JP2023515010A (ja) 2023-04-12

Family

ID=69743030

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022549305A Pending JP2023515010A (ja) 2020-02-28 2021-02-26 免疫原性細胞死を促進するためのｍｉＲＮＡ－１９３ａ

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230136088A1 (ja)
EP (1) EP4110917A1 (ja)
JP (1) JP2023515010A (ja)
CN (1) CN115461461A (ja)
AU (1) AU2021227002A1 (ja)
CA (1) CA3167367A1 (ja)
WO (1) WO2021170786A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022543555A (ja) * 2019-08-12 2022-10-13 インテアールエヌエー テクノロジーズ ビー．ヴイ． ｍｉＲＮＡ－１９３ａに関する新たな処置

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU1089600A (en) 1998-05-15 2000-01-17 Tcs Engineering Services, Inc. Enhanced aircraft cockpit configuration
US7220410B2 (en) 2003-04-18 2007-05-22 Galaxy Biotech, Llc Monoclonal antibodies to hepatocyte growth factor
JP5105874B2 (ja) 2003-07-18 2012-12-26 アムジエン・インコーポレーテツド 肝細胞増殖因子に対する特異的結合因子
FR2872704B1 (fr) 2004-07-12 2007-11-02 Laurent Schwartz Pluritherapie contre le cancer
AR059922A1 (es) 2006-04-01 2008-05-07 Galaxy Biotech Llc Anticuerpos monoclonales humanizados para el factor de crecimiento de hepatocitos
JP4686634B2 (ja) 2006-06-02 2011-05-25 アベオ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 肝細胞成長因子（ｈｇｆ）結合蛋白質
AR061170A1 (es) 2006-06-02 2008-08-06 Aveo Pharmaceuticals Inc Proteinas que se unen con el factor de crecimiento de hepatocitos (hgf)
EP2050397B1 (en) 2006-07-20 2013-05-22 Panasonic Corporation Ultrasonic probe
WO2009091982A1 (en) 2008-01-18 2009-07-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Mir-122 agonist
TW200948380A (en) 2008-04-11 2009-12-01 Galaxy Biotech Llc Combination of HGF inhibitor and PTEN agonist to treat cancer
CA2804599C (en) 2010-07-06 2023-01-31 Interna Technologies Bv Mirna and its diagnostic and therapeutic uses in diseases or conditions associated with melanoma, or in diseases or conditions associated with activated braf pathway
US8691750B2 (en) 2011-05-17 2014-04-08 Axolabs Gmbh Lipids and compositions for intracellular delivery of biologically active compounds
US10174314B2 (en) 2011-12-22 2019-01-08 Interna Technologies B.V. MiRNA for treating head and neck cancer
WO2019106605A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Combination treatment for cancer

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021170786A1 (en) 2021-09-02
AU2021227002A1 (en) 2022-09-15
CA3167367A1 (en) 2021-09-02
US20230136088A1 (en) 2023-05-04
CN115461461A (zh) 2022-12-09
EP4110917A1 (en) 2023-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Porru et al. Targeting KRAS in metastatic colorectal cancer: current strategies and emerging opportunities
Hanna et al. Inhibition of Hedgehog signaling reprograms the dysfunctional immune microenvironment in breast cancer
Yu et al. Downregulation of miR‐29 contributes to cisplatin resistance of ovarian cancer cells
Tripathi et al. Recent updates on the resistance mechanisms to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors and resistance reversion strategies in lung cancer
JP2020535173A (ja) Ｈｓｐ９０阻害剤に関係する治療方法
US20210038732A1 (en) Anticancer microrna and lipid formulations thereof
JP2022543555A (ja) ｍｉＲＮＡ－１９３ａに関する新たな処置
US20240009223A1 (en) 6-thio-2'-deoxyguanosine (6-thio-dg) results in telomerase dependent telomere dysfunction and cell death in various models of therapy-resistant cancer cells
WO2018172508A1 (en) Methods and compositions for treating melanoma
US20230136088A1 (en) miRNA-193a for Promoting Immunogenic Cell Death
JP6445573B2 (ja) ヒト患者の固形腫瘍の治療に用いるためのホスホジエステラーゼ阻害剤含有組成物
Wei et al. Noncoding RNAs: An emerging modulator of drug resistance in pancreatic cancer
Wang et al. AURKB enhances chromosomal remodeling of telomeric genes and accelerates tumorigenesis of uveal melanoma
Xiong et al. Insight into the molecular mechanisms of gastric cancer stem cell in drug resistance of gastric cancer
Hays et al. Trends in Precision Oncology and Precision Medicine 2.0
Wang et al. Chemotherapy-elicited extracellular vesicle CXCL1 from dying cells promotes triple-negative breast cancer metastasis by activating TAM/PD-L1 signaling
Siolas et al. Tumor-Intrinsic Gain-of-Function p53 R172H Mutation Drives Accumulation of Neutrophils in the Pancreatic Tumor Microenvironment that Promotes Resistance to Immunotherapy
Wang et al. Dying cell-released exosomal CXCL1 promotes breast cancer metastasis by activating TAM/PD-L1 signaling
O'Brien Investigating Epigenetic Therapies and Combinations for the Treatment of Cancers
Kanikarla Marie et al. Preeti Kanikarla Marie1†, Alexey V. Sorokin1†, Lea A. Bitner1, Rebecca Aden1, Michael Lam1, Ganiraju Manyam2, Melanie N. Woods1, Amanda Anderson1, Anna Capasso3, Natalie Fowlkes 4, Michael J. Overman1, David G. Menter1 and Scott Kopetz1
Tripathi et al. peer review: awaiting peer review
Edwards et al. Regulation of fatty acid delivery to metastases by tumor endothelium
Alati et al. QUALITY OF LIFE AT DIAGNOSIS IN ELDERLY PATIENTS WITH ACUTE MYELOID LEUKEMIA CONSIDERED FIT FOR INDUCTION OF REMISSION CHEMOTHERAPY
Yan Role of Mir-29b in the Regulation of Progranulin and Dna Methyltransferases 3a and 3b Expression: Therapeutic Potential in Glioblastoma
Costa Role of miR-29b in the regulation of progranulin and dna methyltransferases 3A and 3B expression: therapeutic potential in glioblastoma

Legal Events

Date Code Title Description
RD01 Notification of change of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426

Effective date: 20221107