JPH06253850A - ヘパリン結合性神経栄養因子遺伝子配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は、ヘパリン結合性神経栄養因子（Ｈ
ＢＮＦ）のための新規なＤＮＡ及びアミノ酸配列に関す
る。ＨＢＮＦタンパク質の製造方法に有用な発現ベクタ
ー及び宿主細胞にも関する。 【効果】ＨＢＮＦの遺伝子配列を同定したことにより、
ＨＢＮＦ遺伝子の発現が可能なトランスジェニック細胞
を構築することができ、神経細胞の成長及び分化、神経
細胞の維持及び修復が従来よりも簡素化される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヘパリン結合性神経栄
養因子(heparin-binding neurotrophic factor)（ＨＢ
ＮＦ）のための新規なＤＮＡ配列に関する。本発明の配
列は、生体内及び生体外の両方において、神経細胞成長
及び分化及び神経細胞維持及び修復を誘発することがで
きるタンパク質をコードしている。

【０００２】問題のタンパク質は、普通はヒトの脳内で
生産され、そして多数の異なる種において相同性の形態
が存在する。このタンパク質は、これまでヘパリン結合
性脳マイトジェン（ＨＢＢＭｓ）とも言われてきた。精
製したタンパク質が知られているけれども、このタンパ
ク質の唯一の入手可能なソースは脳組織抽出物である。
脳組織から単離する方法は、骨が折れそして得られるＨ
ＢＮＦの量は比較的少量である。

【０００３】ヒトＨＢＮＦをコード化する遺伝子は、新
生のヒト脳幹ＲＮＡから得られたｃＤＮＡライブラリー
から単離された。それは、約１５ＫＤの分子量を有する
１３６個のアミノ酸を有するタンパク質を予測する４１
１個のヌクレオチド配列である。この遺伝子は、配列決
定されそして大腸菌で発現され、そのようにした得られ
たタンパク質は、自然のＨＢＮＦの神経栄養活性(neuro
trophic activity)を保持している。

【０００４】近年、成長因子として知られた多数の比較
的小さなポリペプチドが同定されそして単離された。
“成長因子”という用語は、或る種の動物の成長及び分
化に影響を与えるシグナル発生物質のクラスを指す。こ
の効果は動物及び組織培養物の両方で見られる。所定の
成長因子は１種より多くの細胞に対して効果を与えるこ
とがある。

【０００５】良く知られた成長因子の多くは、有意な神
経栄養活性を有する。即ち、それらは神経細胞の成長を
維持又は刺激することができる。このような神経栄養性
因子の最も早い発見は、神経成長因子［ＮＧＦ：ゴスポ
ダロビクス(Gospodarowicz)、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem)、２５０：２
５１５−２５２０、１９７５７］であった。ＮＧＦと同
じ群内にある同様な成長因子は、脳由来の神経栄養因子
［ＢＤＮＦ：レイブロック(Leibrock)等、ネイチャー
３４１：１４９−１５３、１９８９］及び神経栄養因子
−３［ＮＴ−３：マイソンピエール(Maisonpierre)等、
サイエンス ２４７：１４４６−１４５１、１９９０］
である。追加の成長因子には、毛様体神経栄養因子［Ｃ
ＮＴＦ：リン（Lin)等、サイエンス ２４６：１０２３
−１０２５、１９８０）、ＩＧＦ−ＩＩ［ミル（Mill）
等、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユーエスエー
(PNAS USA)８２：７１２６−７１３０、１９８５］、ア
クチビン(activin)［シューベルト(Schubert)等、ネイ
チャー ３４４：８６８−８７０、１９９０］及びプル
プリン(purpurin）［ベルマン（Berman)等、セル(Cell)
５１：１３５−１４２、１９８７］が包含される。

【０００６】多数の他の公知の因子が繊維芽細胞成長因
子（ＦＧＦ）に関係した上科に入る・これは、塩基性Ｆ
ＧＦ（ｂＦＧＦ）［エッシュ（Esch)等、プロシーディ
ングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシズ・オブ・ザ・ユーエスエー(PNAS USA) ８
１：５３６４−５３６８；プロシーディングス・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オ
ブ・ザ・ユーエスエー(PNAS USA) ８２：６５０７−６
５１１］、酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）［ボーレン(Bohlen)
等、ヨーロピアン・モレキュラー・バイオロジー・オル
ガニゼーション・ジャーナル(EMBO.J)、４：１９５１−
１９５６、１９８５； ギメネッツ−ガレゴ(Gimenez-G
allego)等、サイエンス ２３０：１３８５−１２８
８、１９８５］及び発がん遺伝子部(oncogenes)ｉｎｔ
−２の生成物［ディケンス(Dickens)及びピーターズ(Pe
ters)、ネイチャー ３２６：８３３、１９８４］、ｈ
ｓｔ／ＫＳ［デリ・ボビ(Delli Bovi)等、セル ５０：
７２９−７３７、１９８７］、ＦＧＦ−５［ザーン(Zah
n)等、モレキュラー・アンド・セル・バイオロジー(Mo
l.Cell Biol) ８：３４８７−３４９５、１９８８］、
ＦＧＦ−６［マリクス(Marics)等、オンコジェネ(Oncog
ene) ４：３３５−３４０、１９８９］及びＫＧＦ［フ
ィンチ(Finch)等、サイエンス ２４５：７５２−７５
５、１９８９］を包含する。これらは、すべて（ＫＧＦ
を除いて）血管内皮細胞のマイトジェンであり、そして
又すべてヘパリンに強く結合する。ＶＥＧＦ／ＶＰＦの
如き他のヘパリン結合性成長因子も知られている［ケッ
ク(Keck)等、サイエンス ２４６：１３０９−１３１
２、１９８９］。これらのヘパリン結合性成長因子も又
しばしば脳組織から単離されそして脳細胞の成長及び発
展に重要な役割を果す。

【０００７】従来未知のヘパリン結合性タンパク質がＥ
Ｐ ３２６ ０７５号に記載されており、そしてその中
でＨＢＢＭと呼ばれている。それは、脳マイトジェン及
び特に神経組織のための組織形成、維持及び修復因子と
して開示されている。それは、上記の成長因子のいずれ
にも構造的には関係がないが、但しそれは、その遺伝子
が従来ＭＫと呼ばれたタンパク質［カドマツ(Kadomats
u)等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーション(Biochem Biophys.Res.Com
m)及び本出願人の米国同時係属及び同時出願番号第０７
／５６８，４７３号に開示された、ヒト型のＭＫタンパ
ク質に構造的に関係しているように思われる。ＨＢＮＦ
とＭＫ遺伝子及びタンパク質間の相同性は非常に高く、
それらは、新しい群の神経栄養因子を構成すると推測さ
れる。この“ＨＢＢＭ”タンパク質は、本発明の“ＨＢ
ＮＦ”タンパク質である。しかしながら、前記したヨー
ロッパ出願に示されたように、いくつかのクロマトグラ
フィー工程を伴う方法により脳組織から直接そのタンパ
ク質を単離することがこれまでは必要であったのであ
り、完全なタンパク質配列も遺伝子配列もこれまで知ら
れていなかった。

【０００８】もっと最近では、ＨＢＮＦタンパク質は、
ラット［ラウバラ(Rauvala)、ヨーロピアン・モレキュ
ラー・バイオロジー・オルガニゼーション・ジャーナル
(EMBO J)、８：２９３３−２９４１、１９８９； フー
バー(Huber)等、ニューロケミカル・リサーチ（Neuroch
em Res)、１５：４３５−４３９、１９９０］及びウシ
(cow)［ミルナー(Milner)等、バイオケミカル・アンド
・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション(B
iochem. Biophys. Res. Comm)、１６５：１０９６−１
１０３、１９８９； フーバー等、ニューロケミカル・
リサーチ、１５：４３５−４３９、１９９０］の両者か
ら単離されそしてアミノ酸配列が決定された。同様に、
ヒト及びニワトリタンパク質のＮ末端アミノ酸配列が決
定された［ＥＰ ３２６ ０７５号：フーバー等、ニュ
ーロケミカル・リサーチ、１５：４３５−４３９、１９
９０］。更に、ＨＢＮＦのＤＮＡ配列の決定は、これま
で達成されていない。本発明は、ヒトＨＢＮＦの全遺伝
子配列及び該遺伝子を発現しそして純粋なＨＢＮＦタン
パク質を製造することができるクローニングベクター及
び宿主細胞を提供する。本発明は、生体外及び生体内の
神経細胞の成長、修復及び維持を促進する方法も提供す
る。

【０００９】図１は、ヒトＨＢＮＦの相補的ＤＮＡクロ
ーニング、ヌクレオチド及び推定されたアミノ酸配列に
関する。（Ａ）ＨＢＮＦをコード化している４つのオー
バーラップする部分的ｃＤＮＡｓの線図。頂部の線は、
それぞれＨＢＮＦコード化領域及び仮定された３′ポリ
（Ａ）領域を表す黒色ボックス及び平行線の陰影を付け
たボックスを有するｍＲＮＡを示す。制限部位：Ｈ＝Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ、Ｋ＝Ｋｐｎｌ、Ｐ＝ＰｓｔＩ；ｎｔ＝ク
ローンのヌクレオチド長さ。（Ｂ）推定されたアミノ酸
配列（１文字コード）を伴うクローンＨＨＣ７、８、１
０及び１２の一緒にしたヌクレオチド配列。普通のタイ
プで示されたアミノ酸は、可能な(potential)１６８個
のアミノ酸前駆体タンパク質を表す、追加の３２個の肉
太で描いたアミノ酸により先行された成熟ヒトＨＢＮＦ
の１３６個のアミノ酸を示す。アンダーラインを施した
アミノ酸配列は、遺伝子をクローニングするのに使用さ
れるオリゴヌクレオチドプローブのデザインのために利
用される２つのペプチドを示す。クローンＨＨＣ７にお
いて欠けている３つのヌクレオチドは、ボックスで囲ま
れておりそして成熟タンパク質の開始は矢印により示さ
れている。

【００１０】図２は、ヒトＨＢＮＦタンパク質の発現及
び機能的特徴付けを示す。（Ａ）ＨＢＮＦタンパク質試
料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動。タンパク質標準は
ＢＲＬからのものであった。レーンＮは、精製したウシ
ＨＢＮＦタンパク質（１００ｎｇ）であり、レーン＋及
び−は、バクテリア発現構築物ｐＥＴＨＨ８を含むイソ
プロピル−Ｂ−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴ
Ｇ）誘導及び非誘導培養物である。

【００１１】（Ｂ）ラットの脳ＨＢＮＦの不存在下の
（Ａ）又はラット脳ＨＢＮＦの存在下(３２０ｎｇ／ｍ
ｌ）のＢ）、バクテリアにより生産された精製したヒト
ＨＢＮＦ（１６０ｎｇ／ｍｌ）（Ｃ）又は（３２０ｎｇ
／ｍｌ）（Ｄ）の存在下のラット脳ニューロンにおける
神経突起成長アッセイ（Neurite outgrowth assay)。

【００１２】図３は、成熟マウス及びヒトの組織におけ
るＨＢＮＦｍＲＮＡのノザーンブロット分析を示す。
（Ａ）各組織、心臓、肺、脳、胸腺、胃、足筋肉、肝
臓、腎臓、脾臓から、２０μｇの全ＲＮＡをレーン当た
り施した。（Ｂ）成熟マウス及びヒト脳からの１０μｇ
の全ＲＮＡを比較するＲＮＡ分析。

【００１３】図４は、ラット胚形成中のＨＢＮＦ遺伝子
の発現を示す。各組織から２０μｇの全ＲＮＡをレーン
当たり施し、³²Ｐ標識ヒトＨＢＮＦｃＤＮＡプローブと
ハイブリダイゼーションさせた。ＲＮＡ単離に使用した
組織は、Ｅ８及びＥ１０については全胚プロパー（tota
l embryo proper）であり、Ｅ１２及びＥ１４について
は頭であり、Ｅ１６、Ｅ１８、Ｅ２０、Ｐ２及び成人に
ついては全脳であった。

【００１４】図５は、ウシＨＢＮＦの部分的１１４アミ
ノ酸配列を示す。

【００１５】本発明は、本明細書ではＨＢＮＦと呼ぶヘ
パリン結合性神経栄養因子をコード化する新規な精製し
た遺伝子及びＤＮＡ配列に関する。ヒトタンパク質の完
全なアミノ酸配列及びウシタンパク質の部分的アミノ酸
配列も開示される。

【００１６】遺伝子配列が入手可能であることは、種々
の宿主細胞中でのＨＢＮＦタンパク質の発現を可能とす
る。かくして、本発明は、宿主細胞をＨＢＮＦ遺伝子で
形質転換しそして、宿主中での遺伝子の発現を可能とす
る条件下に宿主細胞を培養することを含む、精製したＨ
ＢＮＦタンパク質の製造方法にも関する。ＨＢＮＦタン
パク質の回収は、宿主中での発現の方法に依存して、培
養上澄液から又は宿主細胞から直接に行うことができ
る。宿主の形質転換は、直接裸のＤＮＡにより又は、ヒ
トＨＢＮＦをコード化するＤＮＡ配列を有するように工
学的に造られた発現ベクターにより達成することができ
る。故に、本発明は、特許請求の範囲に記載のＤＮＡ配
列で形質転換された宿主細胞及び該配列を含んで成る発
現ベクターも包含する。

【００１７】ＨＢＮＦタンパク質は、組織、特に神経組
織の維持、成長及び修復に有用である。かくして、本発
明は、ＨＢＮＦ投与による処置を必要としている個体
に、有効量のＨＢＮＦを生体内で投与することより成る
治療方法にも関する。これは、精製したタンパク質の直
接投与により達成することができるか、又はこのような
処置を必要としている身体の領域に、該タンパク質を生
産することができるトランスジェニック宿主細胞を移植
することによっても達成することができる。

【００１８】精製したＨＢＮＦタンパク質は、細胞培養
物中で細胞が成長するのを維持するために、細胞培養
物、特に神経細胞培養物中の成分としての有用性も有す
る。

【００１９】ＨＢＮＦをコード化するヒトＤＮＡ配列
は、ポリメラーゼチェインリアクシヨン(ＰＣＲ）及び
新生のヒト脳幹細胞由来のｃＤＮＡライブラリーのスク
リーニングの組み合わせを利用することによりクローニ
ングされる。ＰＣＲ増幅反応のためのオリゴヌクレオチ
ドをデザインするための出発点として、ウシＨＢＮＦア
ミノ酸配列が使用される。ウシＨＢＮＦの部分的１１４
アミノ酸配列は、第５図に示される。このタンパク質の
全長は、ヒトタンパク質の場合と同様に、１３６アミノ
酸であることが予想される。ポリ（Ａ）＋成熟ラット脳
からのＲＮＡを逆転写して相補的ｃＤＮＡ鎖を生成す
る。この鎖は、次いで、配列特異的プライマーを用い
る、ＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用され
る。次いで予想される２８２塩基対ＰＣＲ生成物を単離
しそして適当なベクターにクローニングする。ＤＮＡ配
列決定は、ラットＨＢＮＦペプチドをコード化している
クローニングされた断片を同定する。クローニングされ
たインサートを単離し、標識し、そしてプローブとして
使用してファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グする。約１５０万のファージからスクリーニングされ
た、４つの候補のｃＤＮＡクローンがすべて単離され、
サブクローニングされそして配列決定される。ヒトＨＢ
ＮＦのＤＮＡ配列は図１に示されている。

【００２０】上記ｃＤＮＡ配列は、ヒトＨＢＮＦタンパ
ク質が１３６個のアミノ酸の長さであることを示す。残
基９８においてウシ配列とは１個のアミノ酸が異なる
（ウシではＡｓｐ、ヒトではＧｌｕ）。Ｎ末端タンパク
質及びｃＤＮＡ完全配列情報に基づいて、このタンパク
質の予想される分子量は１５ＫＤであり、これは、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで先に観察された１８ＫＤタンパク質より
は小さい［ラウバラ、ヨーロピアン・モレキュラー・バ
イオロジー・オルガニゼーション・ジャーナル（EMBO.
J)、８：２９３３−２９４１、１９８９； ミルナー(M
ilner)等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル
・リサーチ・コミュニケーション(BiochemBiophys.Res.
Comm)、１５４：１０９６−１１０３、１９８９］。故
に、観測されたサイズの差はゲル上の移動に関するタン
パク質の塩基性度の効果によるものであると推測され
る。

【００２１】二つのより小さな形態のヒトタンパク質も
又以前に同定された（ＥＰ ３２６０７５）。これら
は、多分、酵素阻害剤が存在しないときの抽出／単離中
の変化により発生した完全長タンパク質のＣ末端を切り
取られた形態を表す。推定上のメチオニン翻訳開始コド
ンは、成熟タンパク質のＮ末端グリシンから３２アミノ
酸前に位置付けられている。この前配列は、以前に同定
されたシグナル配列とは同様ではない［フォン・ヘイエ
ネ(Von Heijne)、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー、１８４：９９−１０５、１９８５］。しか
しながら、このタンパク質の翻訳がこのメチオニンで開
始されるならば、この前配列は、それがなければ高度に
親水性の該タンパク質における唯一の疎水性領域を表す
であろう。成熟ＨＢＮＦタンパク質の前のタンパク質プ
ロセッシング部位は、成熟タンパク質からのシグナル配
列の切断のための構造的決定部と一致する［フォン・ヘ
イエネ(Von Heijne)、ヌクレイク・アシッズ・リサーチ
(Nucleic.Acids.Res)、１４：４６８３−４６９０、１
９８６］。

【００２２】真核細胞タンパク質の汚染のない成熟ヒト
ＨＢＮＦタンパク質のソースを得るために、クローンの
１つ、ＨＨＣ８を、Ｎ末端グリシンのすぐ５′側（図１
Ｂ）にメチオニンコドンを配置するようにデザインされ
たプライマーを用いるＰＣＲ増幅のためのテンペレート
として使用する。増幅された生成物は、発現ベクターｐ
ＥＴ−３ａの修飾された形態［スチュディール(Studie
r)等、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Meth.Enzymo
l)、１８５：６０−６９、１９９０］中にクローニング
し、そして得られるプラスミドｐＥＴＨＨ８を菌株ＢＬ
２１ ＬｙｓＳ（ｉｄ．）中に形質転換する。ｐＥＴＨ
Ｈ８を含むＩＰＴＧ誘発培養物のタンパク質抽出物（図
２Ａーン３）は、非誘発培養物（レーン２）の対応する
位置での弱いタンパク質バンドに比較して、成熟ウシＨ
ＢＮＦ（レーン１）とほぼ同じサイズの強いタンパク質
バンドを示す。バクテリアにより生産されたＨＢＮＦが
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでウシ及びラット由来のＨＢＮＦと同
じ位置に移動しそして、生物学的に活性であるという事
実は、大腸菌で発現されたＨＢＮＦに比較して自然のＨ
ＢＮＦタンパク質の翻訳後の修飾は、あるとしても、最
小であるということを示唆する。ＨＢＮＦ配列中の認識
可能なグリコシル化シグナルの欠如は、更にこの仮説を
支持する。

【００２３】ヒトＨＢＮＦタンパク質は、ヘパリンに対
する親和性を利用することにより、ＩＰＴＧ誘発バクテ
リア培養物から精製される。そのＮ末端アミノ酸配列
は、タンパク質配列決定により確認されそして、このタ
ンパク質は神経突起成長アッセイにおいて神経栄養活性
についてアッセイされる。このバクテリアにより誘導さ
れたヒトＨＢＮＦは、ウシ及びラットＨＢＮＦの活性に
匹敵する活性を示した（図２Ｂ）。かくして、上述の観
察と合致して、我々は、成熟ＨＢＮＦは神経栄養活性を
有することを見いだした。

【００２４】下記の実施例は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラー
ゼ発現系におけるＨＢＮＦ遺伝子のクローニング及び発
現を説明する。しかしながら、Ｔ７発現系は極めて効率
的であることが証明されているけれども、これが、ヒト
ＨＢＮＦを組換えにより製造することができる唯一の手
段ではないことは理解されるべきである。ＨＢＮＦの製
造は、任意の適当な発現ベクターへのＨＢＮＦ遺伝子の
組込み及びその後のこのベクターによる適当な宿主細胞
の形質転換により達成することができ、或いは、宿主細
胞の形質転換は、ベクターを使用しないで裸のＤＮＡに
より直接達成することができる。真核細胞又は原核細胞
によるＨＢＮＦの製造は、本発明により包含される。好
適な真核細胞の例には、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母
細胞及び昆虫細胞が包含される。同様に、好適な原核細
胞の例は、大腸菌の外に、枯草菌(Bacillus subtilis)
が包含される。

【００２５】他の好適な発現ベクターも使用することが
でき、これらは、宿主細胞の選択に基づいて選ばれる。
例えば、バクテリア細胞を形質転換するのに使用するの
に好適な多数のベクターが周知されている。例えば、プ
ラスミド及びλファージの如きバクテリオファージは、
バクテリア宿主、特に大腸菌用の最も良く使用されるベ
クターである。哺乳動物及び昆虫細胞の両方において、
細胞外由来のＤＮＡの発現を達成するのに、ウイルスベ
クターがしばしば使用される。特に、哺乳動物細胞はＳ
Ｖ４０又はポリオーマウイルスによりよく形質転換さ
れ、また培養における昆虫細胞はバキュロウイルス発現
ベクターにより形質転換されうる。酵母ベクター系に
は、酵母動原体(yeast centromere)プラスミド、酵母エ
ピソームプラスミド及び酵母組込みプラスミド（yeast
integrating plasmids)が包含される。

【００２６】本発明の実施は、図１に定義されたヒトＨ
ＢＮＦ遺伝子の正確な配列の使用に限定されるものでは
ないことも理解されるべきである。得られるタンパク質
分子における無症状の変化(silent changes)を生じる配
列における欠失、挿入又は置換などの如き配列に対する
修飾も又包含される。例えば、遺伝子コードの縮重(deg
eneracy)を反映する又は所定の部位での化学的に同等な
アミノ酸の生産をもたらす遺伝子配列の変更が包含さ
れ、かくして、疎水性アミノ酸であるアラニンのための
コドンが、グリシンの如き他の疎水性の少ない残基、又
はバリン、ロイシン又はイソロイシンの如きより疎水性
の大きい残基をコード化しているコドンにより置換され
ることがある。同様に、グルタミン酸の代わりにアスパ
ラギン酸で置換するなどのような、１つの負に荷電した
残基で他の残基を置換させるか又はアルギニンの代わり
にリシンで置換するなどのような、１つの正に荷電した
残基を他の残基で置換させる変化もまた、生物学的に同
等な生成物を生じると予想され得る。更に、種間で保存
されるているのは主としてタンパク質の中心部分である
ので、タンパク質分子のＮ末端又はＣ末端の変更をもた
らすヌクレオチドの変化は、タンパク質の活性を変える
とは予想されないであろう。実際、ＥＰ３２６，０７５
に開示された“ＨＢＢＭ”サイズ変異体は、ＨＢＮＦタ
ンパク質のＣ末端切断したものを含む。配列中に存在す
るシステインの１個又はそれより多くを除去するのがの
ぞましいこともある。何故ならば、システインの存在
は、タンパク質が組換えにより製造されるときマルチマ
ー(multimers)の望ましくない形成をもたらし、それに
より精製及び結晶化プロセスを複雑にする可能性がある
からである。提唱された修飾の各々は、コード化された
生成物の生物学的活性の保持の決定と同じく、当業者に
とってルーチンな熟練の範囲内にある。故に、用語“Ｈ
ＢＮＦ ＤＮＡ配列”又は“ＨＢＮＦ遺伝子”が明細書
及び特許請求の範囲で使用される場合、それは、生物学
的に同等なＨＢＮＦタンパク質の製造をもたらすすべて
のこのような修飾及び変更を包含するものと理解される
であろう。特に、本発明は、マニアチス(Maniatis)等
［モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マ
ニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー、１９８２(Molecular cloning. A Laboratory Man
ual. Cold Spring Harbor Laboratory,1982)］）に記載
の条件の如き、標準的な高いストリンジェンシーのサザ
ーンハイブリダイゼーション条件下に、図１の配列との
ハイブリダイゼーションを可能とするように、図１の配
列の充分に複製的であるこれらのＤＮＡ配列を包含す
る。

【００２７】上記しそして下記実施例に示されるよう
に、ＨＢＮＦ遺伝子配列によりコード化されたタンパク
質は、生体内神経栄養活性を有することが示された。特
に、このタンパク質は、培養物中のペリネータルニュー
ロン(perinatal neurons)に加えられるとき、神経突起
成長を刺激する。それ自体として、ＨＢＮＦタンパク質
は、末梢及び中枢神経系に神経細胞の成長、維持及び修
復において、生体内及び生体外の両方で有用である。生
体外適用の例は、パーキンソン病の治療に使用するため
に現在提唱されている胚脳移植体(embryonic brain imp
lants)の維持にある。

【００２８】ＨＢＮＦの生体内投与は、特に中枢又は末
梢神経系損傷の治療において、この遺伝子配列の発見に
より有意に簡素化される。この遺伝子及びその配列の同
定は、ＨＢＮＦ遺伝子の発現を可能とするように工学的
に作り出すことができそして神経変性疾患、手術の後の
末梢神経修復、又は神経細胞成長及び／又は修復の向上
が望ましい状態の処置のための移植片として使用するこ
とができる、繊維芽細胞、単球、又はマクロファージの
如きトランスジェニック細胞の構築を可能とする。

【００２９】更に、ＨＢＮＦの治療的使用は、ヒトの治
療のみに限定されるものではない。事実、遠い関係の種
間でのこのタンパク質の保存されている性質に鑑みる
と、いかなる形態でのＨＢＮＦの投与でも、獣医学的用
途には有利である。治療組成物は、製薬学的に許容しう
る液体又は固体担体と組み合わせて、所望の生物学的効
果を生じさせるのに十分な量のＨＢＮＦを含有して成
る。或いは、組成物は、末梢及び中枢神経系修復又は分
化処理のための移植片として、生体内でＨＢＮＦを発現
することができる適合性のトランスジェニック細胞の製
薬学的に許容しうる集合体を含有して成る。

【００３０】分化におけるＨＢＮＦの見かけの役割に鑑
みて、上記タンパク質は、一般的な組織分化因子として
も提唱される。特に、ＨＢＮＦは、分化した状態への逆
転を誘発するのに腫瘍細胞の処置に有用である。

【００３１】下記の実施例は、説明の目的でのみ示され
ており、本発明の範囲を限定するものであるとみなすべ
きではない。

【００３２】

【実施例】

（１）ＨＢＮＦタンパク質精製及びアミノ酸配列分析 ＨＢＮＦタンパク質を、ＥＰ３２６０７５号に以前に述
べられたプロトコルによりウシ脳から単離する。ＥＰ３
２６０７５号は、ここに掲げることによりその内容をそ
のまま本明細書に加入する。簡単に言えば、逆相ＨＰＬ
Ｃ精製ＨＢＮＦを、メルカプトエタノール中での還元及
び以前に述べられた方法に従うヨード−（２−１４Ｃ）
−酢酸によるシステイン残基のアルキル化［ガオッチ・
ソバ(Gautschi-Sova)等、バイオケミカル・アンド・バ
イオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション(Bioch
em.Biophys.Res.Comm) １４０：１８７４−１８８０、
１９８６］により化学的に修飾する。カルボキシメチル
化タンパク質を、移動相としてアセトニトリル中の０．
１％トリフルオロ酢酸勾配を使用するブラウンリー・ア
クアポア(Brownlee Aquapore)Ｃ８カラム［２５×０．
４６ｃｍ、７ｕｍ粒径、アプライド・バイオシステム
ス］を使用する逆相ＨＰＬＣにより精製する。カルボキ
シメチル化ＨＢＮＦ３ナノモルに相当するアリクォート
を、酵素消化緩衝液で希釈して、試料のアセトニトリル
濃度を約１０％に減少させそして下記のプロテアーゼで
消化する。黄色ぶどう球菌(Staphylococcus aureus)Ｖ
８（グルタミン酸残基後の切断）、Ａｒｇ−Ｃ（アルギ
ニン後の切断）、Ａｓｐ−Ｎ（アスパラギン酸後の切
断）及びキモトリプシン（芳香族残基後の優先的な切
断）。酵素はベーリンガー・マンハイム(Boehringer Ma
nheim)からのものであり、切断は、本質的に製造業者に
より示唆されたとおりに行う。消化の後、ペプチドを、
ペプチド溶離のために０．１％トリフルオロ酢酸中のア
セトニトリルの９０分線形勾配（消化のタイプに依存し
て、始めのアセトニトリル含有率：１２−１６％、終わ
り：３０−４４％）を使用してＣ８カラムでの逆相ＨＰ
ＬＣにより分離する。精製したペプチドの均一性を確か
めるために、ペプチド物質を含む画分を第２逆相ＨＰＬ
Ｃ工程に付す（Ｃ８カラム、適当な浅いアセトニトリル
勾配における０．１％ヘプタフルオロ酪酸）。単離した
ペプチド５−５００ピコモルのアリクォートをアプライ
ド・バイオシステムス４７７Ａガス／液体相マイクロシ
ークエネーターで配列決定する。フェニルチオヒダント
イン（ＰＴＨ）アミノ酸誘導体を、モデル１２０Ａオン
ラインＰＴＨアミノ酸アナライザー（アプライド・バイ
オシステムス）で同定する。両手順のための実験プロト
コルは、機器製造業者により提供されたとおりである。
最初の１１４アミノ酸（予想される１３６からの）の配
列が図５に示される。

【００３３】（２）ポリメラーゼチェインリアクシヨン
（ＰＣＲ） ＰＣＲ増幅反応からの縮重オリゴヌクレオチドをデザイ
ンするのに、ウシＨＢＮＦアミノ酸配列を使用する。完
全縮重センスプライマー(completely degenerate sense
primer)は、アミノ酸配列：ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位で
出発しそしてＤＮＡ配列：

【００３４】

【化１】 から成るＤＣＧＥＷＯＷ（図１）に構成される。完全縮
重アンチセンスプライマー(completely degenerate ant
isense primer)は、アミノ酸配列：ＥｃｏＲＩ制限部位
で出発しそしてＤＮＡ配列

【００３５】

【化２】 から成るＮＡＤＣＱＫＴ（図１）に構成される。

【００３６】全ラット脳ＲＮＡを、イソチオシアン酸グ
アニジウム−塩化セシウム法によりスプレーグ・ドーリ
ーラットの脳から単離しそしてポリ（Ａ）＋ＲＮＡをオ
リゴ（ｄＴ）−セルロースへの２サイクルの結合により
選ぶ［アビブ(Aviv)及びレーダー(Leder)、プロシーデ
ィグス・オブ・ザ・アカデミー・オブ・サイエンシズ・
オブ・ザ・ユーエスエー(PNAS USA) ６９：１４０８８
−１４１２、１９７２］。ラット脳ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ
を、オリゴ（ｄｔ）及びＡＭＶ逆転写酵素を用いて逆転
写する［マニアチス等、モレキュラー・クローニング、
ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク、コールドス
プリングハーバー １９８２(Maniatis et al., Molecu
lar cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harb
or Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1982)］。Ｐ
ＣＲ反応を、３０サイクルで、Ｔａｇ ＤＮＡポリメラ
ーゼ(Tag DNA polymerase)(USB)を使用して３０サイク
ルの間、５０℃で１分間のアニーリングで、７２℃で２
分間の伸長及び９４℃で１分間の変性で、相補的ＤＮＡ
テンプレート上で行う。

【００３７】（３）ヒトＨＢＮＦのクローニング及び配
列決定 ２８２塩基対ラットＨＢＮＦ ＰＣＲ生成物をブルー・
スクライブ（＋）ベクター(Blue Scribe (＋) vector)
（ストラタジェネ）(Stratagene)にクローニングしそし
て新生のヒト脳幹及び脳幹神経節λ ｇｔ １１ ｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングする際のプローブと
して使用する［カムホルツ(Kamholz)、プロシーディグ
ス・オブ・ザ・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ
・ザ・ユーエスエー(PNAS USA) ８３：４９６２−４９
６６，１９８６］。３０のＨＨＣクローンを最初に同定
し、予備的制限分析の後、４つのクローンを単離し、ブ
ルー・スクライブ（＋）のＥｃｏＲＩ部位にサブクロー
ニングし、ジデオキシヌクレオチド・チェイン・ターミ
ネイション法により配列決定する［サンガー等、プロシ
ーディングス・オブ・ザ・アカデミー・オブ・サイエン
シズ・オブ・ザ・ユーエスエー(PNAS USA) ７４：５４
６３−５４６７、１９８８］。

【００３８】上記クローンの３つは、コード化領域にお
いて同じ配列を有しており、４番目のクローンは、位置
１１９のアラニンの除去をもたらす３ヌクレオチドイン
フレーム欠失(in-frame deletion)を有する。これらの
配列は図１に示されている。

【００３９】（４）組換えＨＢＮＦの発現 Ｎ末端グリシンのすぐ５′側にメチオニンコドン及びＮ
ｄｅｌ制限部位を配置するようにデザインされたプライ
マーを用いるＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使
用するのにクローンＨＨＣ８（図１Ａ）を選ぶ。精製し
たＰＣＲ生成物を、１４００ｂｐのＳａｌｌ／ＰｖｕＩ
Ｉ断片の欠失及び複製起点ｆ１のＥｃｏＲＩ部位への挿
入により修飾されている発現ベクターｐＥＴ−３ａの誘
導体にクローニンクする。インサートを配列決定してＰ
ＣＲ増幅の忠実度を確かめた後、プラスミド（ｐＥＴＨ
Ｈ８と名付ける）を菌株ＢＬ２１ ｌｙｓＳ中に形質転
換し、そして述べられたＩＰＴＧによるタンパク質生産
を誘発させる（スタディール等、前記文献）。１ｍｌ培
養物からのペレットをＳＤＳ緩衝液［レムリ（Laemml
i)、ネイチャー（Nature) ２２７：６８０−６８５、
１９７０］１００ｕｌに再懸濁させ、そして２．５ｕｌ
を１５％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに通す。
ゲルをクーマシーブルーで染色する。自然のＨＢＮＦは
ラットの脳から精製され、そして組換えＨＢＮＦは、１
０ｍＭトリス、ｐＨ７．０中のヘパリンセファロースＣ
Ｌ−６Ｂ（ファーマシア）樹脂でバクテリア抽出物から
精製されそして０−２Ｍ ＮａＣｌの勾配で１−１．１
３ＭＮａＣｌで溶離される。更なる精製は、溶離のため
に０から１Ｍ ＮａＣｌに増加する塩濃度の勾配を使用
して、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８中のＭｏ
ｎｏ Ｓ（ファーマシア）カラムで達成される。

【００４０】（５）ＨＢＮＦ神経栄養活性のアッセイ 組換えＨＢＮＦの神経栄養活性を決定するために、自然
のラット脳ＨＢＮＦと比較してラット脳ニューロンを刺
激する能力を観察した。手順は、上記の０．６Ｍ Ｎａ
ＣｌでＭｏｎｏ Ｓから溶離された組換えＨＢＮＦを使
用して、ラウバラ(Rauvala)及びピーラスカリ(Pihlaska
ri)（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー ２６５２：１６６２５−１６６３５、１９８７）の
方法に従って行う。１８日目の仔ラットからの脳を無菌
条件下に取り出す。脳を無菌の５ｍｌ注射器を使用して
１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中に単一細胞に分散させ
る。細胞懸濁液を５００ＲＰＭで１−２分間遠心分離
し、上澄液を除去しそしてクルターカウンター(Coulter
counter)で細胞を計数する。濃度をＤＭＥＭ／１０％
ＦＣＳ中５×１０⁵細胞／ｍｌに調節し、細胞懸濁液
を、５０ｕｇ／ｍｌのポリ−ｃ−リシンで室温で３０分
間プレコートされた組織培養皿の上に置いた。培養物を
３７℃、１０％ＣＯ₂で２４時間インキュベーション
し、その後培地を１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含むＤＭＥＭに
変え、ＨＢＮＦを下記の量で加える：ラット脳ＨＢＮＦ
３２０ｎｇ／ｍｌ、組換えヒトＨＢＮＦ−１６０ｎｇ／
ｍｌ及び３２０ｎｇ／ｍｌ。図２Ｂに示された結果は、
組換えＨＢＮＦが自然のラットＨＢＮＦの神経栄養活性
と同等な神経栄養活性を有することを示す。

【００４１】（６） マウス組織中のＨＢＮＦの発現 ＨＢＮＦ遺伝子の発現をマウス組織において調べた。全
細胞ＲＮＡを、イソチオシアン酸グアニジウム−塩化セ
シウム法により単離し、０．６６Ｍホルムアルデヒドを
含む１％アガロースゲルで分析し、ランダムオリゴヌク
レオチドプライミングにより製造した³²Ｐ標識ｃＤＮＡ
プローブによりナイロン膜フィルターホルムアミドにブ
ロットする。フィルターを１ｘＳＳＣ（０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム ｐＨ７．０）中
で６５℃で洗浄し、Ｘ線フィルムに暴露する。プローブ
としてヒトＨＢＮＦ ｃＤＮＡを使用する種々の組織か
らのマウスＲＮＡのノザンハイブリダイゼーション分析
は、脳のみが１６５０ヌクレオチドメッセージを発現す
ることを示す（図３Ａ）。これは、ＨＢＮＦタンパク質
の局在に関するこれまでの研究と合致しており、これ
は、ウシ子宮にその存在も示している最近の報告［ミル
ナー等、バイオケミカル・アンド・バイオフイジカル・
リサーチ・コミュニケーション(Biochem.Biophhys.Res.
Comm) １６５：１０９６−１１０３、１９８９］と対
照的に、脳にのみそれが存在していることを示す［フバ
ー（Huber)等、前記文献； ラウバラ等、ヨーロピアン
・モレキュラー・バイオロジー・オルガニゼーション・
ジャーナル(EMBO J) ８：２９３３−２９４１、１９８
９］。全ヒトＲＮＡの分析は、ヒトｍＲＮＡが、マウス
のものより僅かに短い、長さが約１６００ヌクレオチド
であることを示す（図３Ｂ）。

【００４２】（７）生物学的物質の寄託 プラスミドｐＥＴＨＨ８を含む大腸菌株ＢＬ ２１ ｌ
ｙｓＳは、ニューヨーク、パールリバーに維持されてい
るアメリカン・シアナミド社のカルチャー・コレクショ
ンに寄託され、そしてメリーランド州、ロックビレ、１
２３０１パークラウンドライブの、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションに、受け入れ番号ＡＴＣＣ
６８３８５の下に、１９９０年８月１３日に寄託され
た。

【００４３】配列同定 Ｎｏ．：１ 配列のタイプ： 核酸及びタンパク質 配列の長さ： １３８３塩基対；１６８アミノ酸 鎖構造(Strandedness)： 一重鎖 トポロジー： 線状 ソース生物： ヒト 特徴： アミノ酸残基３３からアミノ酸残基
１６８迄−成熟タンパク質

【００４４】

【化３】配列同定 Ｎｏ．：２ 配列のタイプ： タンパク質 配列の長さ： １１４アミノ酸 鎖構造(Strandedness)： 一重鎖 トポロジー： 線状 ソース生物： ウシ

【００４５】

【化４】 本発明の主な特徴及び態様は以下のとおりである。

【００４６】１．ヘパリン結合性神経栄養性因子（ＨＢ
ＮＦ）をコード化している精製され且つ単離された遺伝
子。

【００４７】２．生物学的に活性なＨＢＮＦタンパク質
をコード化している、図１に示された配列又はその一部
を有する上記１に記載の遺伝子。

【００４８】３．標準的高ストリンジェンシー条件下に
図１に示された配列とハイブリダイゼーション可能な、
上記１に記載の遺伝子。

【００４９】４．宿主細胞を上記１に記載の遺伝子で形
質転換し、該宿主細胞を、該宿主細胞による該遺伝子の
発現を可能とする条件下に培養することを含む、実質的
に純粋なＨＢＮＦタンパク質の製造方法。

【００５０】５．上記１に記載の遺伝子を含んで成る発
現ベクター。

【００５１】６．上記１に記載の遺伝子を含んで成る宿
主細胞。

【００５２】７．ＡＴＣＣ ６８３８５としてアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されてい
る上記６に記載の細胞。

【００５３】８．図１又は図５に記載の配列を有する、
精製され、単離されたＨＢＮＦタンパク質及びＨＢＮＦ
生物学的活性を保持しているその相同体又は断片。

【００５４】９．製薬学的に許容しうる担体と一緒に、
有効量の上記８に記載のタンパク質を含んで成る治療組
成物。

【００５５】１０．有効量の上記８に記載のタンパク質
の存在下に神経細胞を培養することを特徴とする、生体
外での神経細胞の成長を維持又は促進させる方法。

【００５６】１１．損傷した神経細胞の修復又は処理を
必要としている個体に、上記８に記載のタンパク質を発
現することができる有効量の適合性のトランスジェニッ
ク細胞を投与することを特徴とする、損傷した神経細胞
を修復又は処理する方法。

【００５７】１２．未分化細胞に有効量のＨＢＮＦタン
パク質を適用することを特徴とする、未分化細胞の分化
を誘発させる方法。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＨＢＮＦの相補的ＤＮＡクローニング、ヌ
クレオチド及び推定アミノ酸配列を示す。 （Ａ）ＨＢＮＦをコード化している４つの部分的ｃＤＮ
Ａの線図。 （Ｂ）推定されたアミノ酸配列と共に、クローンＨＨＣ
７、８、１０及び１２の一緒にしたヌクレオチド配列を
示す図である。

【図２】ヒトＨＢＮＦタンパク質の発現及び機能的特徴
付けを示す図である。 （Ａ）ＨＢＮＦタンパク質試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
電気泳動。 （Ｂ）ラットの脳ＨＢＮＦの不存在下又は存在下、バク
テリアにより生産された生成したヒトＨＢＮＦの存在下
でのラット脳ニユーロンにおける神経突起成長アッセ
イ。

【図３】成熟マウス及びヒトの組織におけるＨＢＮＦ
ｍＲＮＡのノザーンブロット分析を示す図である。

【図４】ラット胚形成中のＨＢＮＦ遺伝子の発現を示す
図である。

【図５】ウシＨＢＮＦの部分的１１４アミノ酸配列を示
す図である。

【化３】

【化３】

【化３】

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年９月８日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＢＮＦをコードする４種のオーバラップする
ｃＤＮＡ部分を示す略図である。

【図２】ヒトＨＢＮＦの相補的ＤＮＡクローニング、ヌ
クレオチド及び推定アミノ酸配列を示す図である。推定
されたアミノ酸配列と共に、クローンＨＨＣ７、８、１
０及び１２の組み合わさったヌクレオチド配列を示す。

【図３】図２に連続するネクレオチド配列及び推定アミ
ノ酸配列を示す図である。

【図４】ＨＢＮＦタンパク質試料のＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動の結果を表わす図面に代わる写真
である。これはヒトＨＢＮＦタンパク質の発現及び機能
的特徴付けを示す

【図５】ラットの脳ＨＢＮＦの不存在下又は存在下、バ
クテリアにより生産された生成したヒトＨＢＮＦの存在
下でのラット脳ニユーロンにおける神経突起成長の様子
（生物の形態）を表わす図面に代わる写真である。この
写真はヒトＨＢＮＦタンパク質の発現及び機能的特徴付
けを示す。

【図６】成熟マウス及びヒトの組織におけるＨＢＮＦ
ｍＲＮＡの電気泳動（ノーザンハイブリッド形成処理済
み）の結果を表わす図面に代わる写真である。

【図７】ラット胚形成中のＨＢＮＦ遺伝子の発現を示
す、各組織からのＲＮＡのゲル電気泳動（ノーザンハイ
ブリッド形成処理済み）の結果を表わす図面に代わる写
真である。

【図８】ウシＨＢＮＦの部分的１１４アミノ酸配列を示
す図である。

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図３】

【図２】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 8214−4Ｂ // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 7823−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/18 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヘパリン結合性神経栄養性因子（ＨＢＮ
   Ｆ）をコード化している精製され且つ単離された遺伝
   子。
2. 【請求項２】 宿主細胞を請求項１に記載の遺伝子で形
   質転換し、該宿主細胞を、該宿主細胞による該遺伝子の
   発現を可能とする条件下に培養することを含む、実質的
   に純粋なＨＢＮＦタンパク質の製造方法。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の遺伝子を含んで成る発
   現ベクター。
4. 【請求項４】 請求項１に記載の遺伝子を含んで成る宿
   主細胞。
5. 【請求項５】 第１図又は第５図に記載の配列を有す
   る、精製され、単離されたＨＢＮＦタンパク質及びＨＢ
   ＮＦ生物学的活性を保持しているその相同体又は断片。
6. 【請求項６】 製薬学的に許容しうる担体と一緒に、有
   効量の請求項５に記載のタンパク質を含んで成る治療組
   成物。
7. 【請求項７】 有効量の請求項５に記載のタンパク質の
   存在下に神経細胞を培養することを特徴とする、生体外
   での神経細胞の成長を維持又は促進させる方法。
8. 【請求項８】 損傷した神経細胞の修復又は処理を必要
   としている個体に、請求項５に記載のタンパク質を発現
   することができる有効量の適合性のトランスジェニック
   細胞を投与することを特徴とする、損傷した神経細胞を
   修復又は処理する方法。
9. 【請求項９】 未分化細胞に有効量のＨＢＮＦタンパク
   質を適用することを特徴とする、未分化細胞の分化を誘
   発させる方法。