KR20190046875A

KR20190046875A - 중수소화 3-(4,5-치환 아미노피리미딘) 페닐 유도체 및 그의 응용

Info

Publication number: KR20190046875A
Application number: KR1020197007580A
Authority: KR
Inventors: 용치앙 쥬; 자오강 리우; 차오 펑; 스허 후; 하오 천; 언허 바이; 지아 왕; 징미아오 스
Original assignee: 난징 추앙트어 파마슈티컬 테크놀로지 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2016-09-19
Filing date: 2017-09-18
Publication date: 2019-05-07
Also published as: AU2017326029B2; AU2017326029A1; JP6746794B2; EP3498708B1; JP2019529551A; CN109689657B; US10654851B2; US20190225610A1; CA3037097A1; EP3498708A4; CN109689657A; ES2863925T3; WO2018050108A1; EP3498708A1; CA3037097C; KR102245280B1

Abstract

본 발명은 중수소화 3-(4,5-치환 아미노피리미딘) 페닐 유도체(deuterated 3-(4,5-substituted pyrimidinamine) phenyl derivatives) 및 그의 응용에 관한 것으로서, 식 (I) 구조를 가진 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 상기 화합물 또는 그의 염은 특정한 돌연변이체 형태의 표피성장인자 수용체(EGFRs)를 통해 질병 또는 병세를 치료 또는 예방하는데 사용되며, 다양한 종양세포의 성장을 효과적으로 억제할 수 있다. 또한 EGFR, Her 패밀리 기타 프로테아제(protease)에 대하여 억제 작용을 나타내어 항종양 약물을 제조하는데 사용할 수 있다.

Description

중수소화 3-(4,5-치환 아미노피리미딘) 페닐 유도체 및 그의 응용

본 발명은 항종양 약물 기술 분야에 관한 것으로서, 중수소화 3-(4,5-치환 아미노피리미딘) 페닐 유도체(deuterated 3-(4,5-substituted pyrimidinamine) phenyl derivatives) 및 이를 항종양 약물 제조에 사용하는 응용에 관한 것이다.

종래의 암 치료 과정에서는 화학요법이 주요 치료 수단이었다. 화학요법 약물은 비특이적으로 세포분열을 차단함으로써 세포를 사멸시키는데, 이는 종양세포를 사멸시킬 뿐만 아니라 인체의 정상세포 생장까지 훼손하는 단점이 있다. 많은 사람들이 화학요법의 심각한 부작용 때문에 이에 비관적이거나 심지어 치료를 포기하기도 한다. 또한 화학요법은 약물내성까지 있어 비소세포폐암(NSCLC)에 대한 치료효과가 낙관적이지 않고 화학요법의 주기가 길어 그 독성 부작용만 늘어날 뿐 치료효과는 좋아지지 않는다. 비소세포폐암의 암세포는 화학요법, 통상적인 화학요법에 민감하지 않으며 총 관해율이 25%가량에 불과하다. 이러한 요인 때문에 비소세포폐암 환자는 5년 생존율이 20% 미만이다.

50 내지 80%의 NSCLC 환자는 표피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR)가 과다발현하여 암변이가 일어난다. 표적 EGFR 약물은 주로 두 가지 유형이 있다. 하나는 수용체 세포내 구역에 작용하는 소분자 티로신 키나아제 억제제(TKI)이고, 다른 하나는 수용체 세포외 구역에 작용하는 단일클론항체(MAb)이다. 이미 임상에 응용되는 1세대 EGFR 억제제에는 이레사(Iressa), 엘로티닙(Erlotinib), 라파티닙(Lapatinib) 등이 있으며, 이는 NSCLC 폐암의 치료에 상당한 효과가 있었으며 비소세포폐암 환자의 5년 생존율을 높여주었다. 또한 화학요법에 비해 골수억제가 일어나지 않고 메스꺼움과 신경 독성 등의 부작용이 나타나지 않는 장점이 있었다. 그러나 단독 치료 시 약물효과가 비교적 낮고 상당히 현저한 피부 발진과 설사 등 부작용이 있었으며 사용 1년 후 환자가 약물에 내성을 보였다. 연구 자료에 따르면, EGFR 유전자 T790M 위치의 돌연변이가 이러한 약물 내성을 유발하는 주요 요인으로 보인다. 임상사례 데이터에 따르면, 후천적 약물내성을 가진 환자의 약 50%가 T790M 위치의 돌연변이에서 초래된 것으로 나타났다. 또 다른 연구에서는 EGFR 유전자 T790M 돌연변이, 즉 코딩한 트레오닌(threonine)이 메티오닌(methionine)으로 전환되어 입체 장해가 일어나고 이것이 억제제와 ATP 결합 구역의 결합을 방해해 최종적으로 억제제 활성이 상실되게 만드는 것으로 증명되었다. 최근 연구결과에서도 T790M 위치의 돌연변이가 억제제와 EGFR의 친화성에 직접적으로 영향을 미치지는 않으나 EGFR와 ATP의 친화성을 크게 증가시켜 억제제와 EGFR의 친화성을 상대적으로 크게 저하시키는 것으로 나타났다(억제제와 ATP는 경쟁적 결합). 2세대 억제제에는 아파티닙(Afatinib), 다코미티닙(Dacomitinib)이 있으며, 이는 1세대에 비해 EGFR에 대한 식별성이 높아 종양세포와 정상세포를 판별할 수 있기 때문에 부작용이 적은 장점이 있다. 그러나 이러한 분자는 EGFR의 T790M 돌연변이에 대한 선택성이 떨어지기 때문에 약물 임상에서 내약 용량이 비교적 적고, 그 최대 내약 용량(MTD) 하에서 약물이 체내에 그 유효 농도에 도달할 수 없기 때문에 다수 내약 환자에게 효과가 없는 단점이 있다.

결론적으로, 종래의 EGFR-TKI은 약물 내성으로 인한 임상 수요를 충족시킬 수 없으며 종래의 약물은 다수가 퀴나졸린(quinazoline) 또는 퀴놀린아민(quinolinamine)을 기본 모핵으로 하는 EGFR 가역 또는 비가역 억제제인데, 이는 야생형 세포에 대한 선택성이 떨어짐으로 인한 독성 부작용도 피할 수 없다. 따라서 임상 측면에서 새로운 유형, 특히 신규한 골격의 화합물을 통해 약물내성, 낮은 선택성 등의 문제를 해결하는 것이 시급하다.

본 발명의 목적은 중수소화 3-(4,5-치환 아미노피리미딘) 페닐 유도체를 제안하는 데에 있다.

본 발명의 목적은 이하의 방법을 통해 구현할 수 있다.

본 발명의 중수소화 3-(4,5-치환 아미노피리미딘) 페닐 유도체는 식 (I) 구조를 가진 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염이다.

여기에서 R₁, R₂는 -CH₃ 또는 -CD₃에서 선택하고, R₃ 및 R₄는 -CH₃, CD₃또는 H에서 선택하고, R₁, R₂, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나는 -CD₃이다.

더 나아가, 상기 식 (I) 구조를 가진 화합물은 바람직하게는 R₁는 -CH₃이다.

본 발명의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서 일부 구체적인 화합물은 이하에서 선택한다.

일반식 (I)의 화합물 제조 노선은 이하와 같다.

상기 제조 노선의 구체적인 단계는 이하와 같다.

단계 1: 화합물 II와 2,4-디클로로피리미딘(dichloropyrimidine)을 용매에 용해시키고, 루이스산(Lewis acid) 하에서 친핵성 치환 반응을 통해 III을 수득하며, 여기에서 용매는 디메톡시에테인(dimethoxyethane, DME), 톨루엔, 클로로벤젠 또는 그의 혼합에서 선택하고, 루이스산은 알루미늄 트리클로라이드(aluminum trichloride) 또는 삼불화붕소에서 선택한다.

단계 2: 중간체 III과 4-플루오로-2-메톡시-5-니트로아닐린(nitroaniline)을 용매에 용해시키고, p-톨루엔 술포닉산(p-toluene sulphonic acid) 작용 하에서 IV를 수득하며, 여기에서 용매는 1,4-디옥산(dioxane), N,N-디메틸포름아미드(dimethylformamide, DMF) 또는 그의 혼합에서 선택한다.

단계 3: 중간체 IV와 유기 아민(organic amine)을 용매에 용해시키고, DIPEA의 작용 하에서 반응시켜 중간체 V를 수득하며, 여기에서 용매는 디메틸 아디페이트(dimethyl adipate, DMA), 디메틸 아세트아미드(dimethylacetamide, DMAc), N,N-디메틸포름아미드(DMF) 또는 그의 혼합에서 선택한다.

단계 4: 중간체 V를 용매에 용해시키고 Pd/C를 환원제로 삼아 중간체 V를 중간체 VI로 환원시키며 여기에서 용매는 메탄올 또는 에탄올에서 선택한다.

단계 5: 테트라히드로푸란(tetrahydrofuran)/물을 용매로 사용하여, 중간체 VI와 클로로프로피오닐 클로라이드(chloropropionyl chloride)를 반응시켜 중간 화합물을 수득하여 분리하지 않고 곧바로 수산화나트륨을 첨가해 계속해서 반응하여 식 (I) 구조를 가진 화합물을 수득한다.

본 발명 중의 화합물이 형성할 수 있는 염도 본 발명의 범위에 속한다. 별도의 설명이 있는 경우를 제외하고는 본 발명 중의 화합물은 그 염류를 포함하는 것으로 이해한다. 예를 들어 일반식 (I)의 화합물과 일정한 당량의 산 또는 염기를 반응시키고, 매질에서 염을 석출하거나 수용액에서 동결 건조시키는 것이다. 본 발명 중의 화합물에 함유된 염기성 단편은 아민 또는 피리딘 또는 이미다졸 고리를 포함하나 이에만 한정되지 않으며, 유기 또는 무기산과 염을 형성할 수 있다. 형성할 수 있는 전형적인 염에는 아세테이트(acetate), 아디페이트(adipate), 알지네이트(alginate), 아스코베이트(ascorbate), 아스파르테이트(aspartate), 벤조에이트(benzoate), 벤젠 설포네이트(benzene sulfonate), p-톨루엔 설포네이트(p-toluenesulfonate), 하이드로설페이트(hydrosulfate), 보레이트(borate), 부티레이트(butyrate), 시트레이트(citrate), 캄포레이트(camphorate), 캄포설포네이트(camphorsulfonate), 시클로펜탄프로피오네이트(cyclopentanepropionate), 디글리콜레이트(diglycolate), 라우릴설페이트(lauryl sulfate), 에탄설포네이트(ethanesulfonate), 푸마레이트(fumarate), 글루셉테이트(gluceptate), 글리세로포스페이트(glycerophosphate), 헵틸레이트(heptylate), 카프로에이트(caproate), 히드로클로라이트(hydrochloride), 히드로브로메이트(hydrobromate), 히드리오데이트(hydriodate), 이세티오네이트(isethionate), 락테이트(lactate), 말레이트(maleate), 메탄설포네이트(methanesulfonate), 나프탈렌 설포네이트(naphthalene sulphonate), 하이드로클로레이트(hydrochlorate), 니트레이트(nitrate), 옥사레이트(oxalate), 펙테이트(pectate), 퍼설페이트(persulfate), 펜프로피오네이트(phenpropionate), 포스페이트 (phosphate), 피크레이트(picrate), 피발레이트(pivalate), 프로피오네이트(propionate), 살리실레이트(salicylate), 석시네이트(succinate), 설페이트(sulfate), 설포네이트(sulfonate), 타르트레이트(tartrate), 티오시아네이트(thiocyanate)이 포함된다.

본 발명 중의 화합물은 순서대로 제조, 분리 및 정제를 통해 수득한 화합물은 그 중량 함량이 90% 이상인데, 예를 들어 95% 이상, 99% 이상("상당히 순수한" 화합물)이며 본문에서 설명하여 나열하였다. 여기에서 "상당히 순수한" 본 발명의 화합물도 본 발명의 일부분이다.

본 발명은 상기 일반식 (I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 종양 예방 또는 치료 약물을 제조하는데 응용하는 것을 더 공개하였다.

상기 종양은 비소세포폐암, 소세포폐암, 췌장암, 유선암, 전립선암, 간암, 피부암, 상피세포암, 위장간기질종양, 백혈병, 조직세포성 림프종, 비인두암을 포함하나 여기에 국한되지 않는다.

본 발명은 일측면에서 식 (I)의 화합물을 제안하며, 이는 EGFR 매개성 또는 활성 돌연변이체 또는 저항성 돌연변이체의 EGFR 매개성 질환, 장애, 장해 또는 병세를 치료 또는 예방하는 데에 사용된다.

EGFR 매개성 또는 활성 돌연변이체 또는 저항성 돌연변이체의 EGFR 매개성 질환, 장애, 장해 또는 병세에는 비소세포폐암, 소세포폐암, 췌장암, 유선암, 전립선암, 간암, 피부암, 상피세포암, 위장간기질종양, 백혈병, 조직세포성 림프종, 비인두암이 포함되나 여기에 국한되지 않는다.

상기 활성 돌연변이체 또는 저항성 돌연변이체 형태의 EGFR에는 L858R 활성 돌연변이체, Exon19 결실 활성 돌연변이체와 T790M 저항성 돌연변이체가 포함되나 여기에 국한되지 않는다.

본 발명에 있어서 일반식 (I)의 화합물은 비슷한 병의 증상을 치료 또는 개선하는 종래에 공지된 기타 약물과 함께 사용할 수 있다. 함께 투약할 경우 원래 약물의 투여 방식과 용량은 변경하지 않으며, 동시에 또는 이어서 식 (I)의 화합물을 복용한다. 식 (I) 화합물과 기타 하나 또는 복수개 약물을 동시에 복용할 때, 바람직하게는 하나 또는 복수개의 종래에 공지된 약물과 식 (I) 화합물을 포함한 약물 조성물을 동시에 사용한다. 약물을 함께 사용하는 것에는 중첩된 시간 단계에 식 (I) 화합물과 기타 하나 또는 복수개의 종래에 공지된 약물을 복용하는 것도 포함된다. 식 (I) 화합물과 기타 하나 또는 복수개의 약물을 함께 사용할 경우, 식 (I) 화합물과 종래에 공지된 약물의 용량은 약을 단독 복용할 때의 용량보다 적을 수 있다. 식 (I) 화합물과 함께 사용하는 약물 또는 활성 성분에는:

에스트로겐 수용체 조절제, 안드로겐 수용체 조절제, 레티날 수용체, 세포독성/세포 억제제, 항증식제, 단백질 전이효소 억제제, HMG-CoA 환원효소 억제제, HIV 단백질 키나아제 억제제, 역전사효소 억제제, 혈관생성 억제제, 세포증식 및 생존신호 억제제, 세포주기 검사 간섭 약물과 세포자살 유도제, 세포독성 약물, 티로신 단백질 억제제, EGFR 억제제, VEGFR 억제제, 세린(serine)/트레오닌(threonine) 단백질 억제제, Bcr-Abl 억제제, c-Kit 억제제, Met 억제제, Raf 억제제, MEK 억제제, MMP 억제제, 토포이소머라아제(topoisomerase) 억제제, 히스톤 탈아세틸화효소(histone deacetylase) 억제제, 프로테아좀(proteasome) 억제제, CDK 억제제, Bcl-2 패밀리 단백질 억제제, MDM2 패밀리 단백질 억제제, IAP 패밀리 단백질 억제제, STAT 패밀리 단백질 억제제, PI3K 억제제, ATK 억제제, 인테그린(integrin) 길항제, 인터페론(interferon), 인터류킨(interleukin)-12, COX-2 억제제, P53, P53 활성제, VEGF 항체와 EGF 항체 등의 물질이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

일실시예에 있어서, 식 (I) 화합물과 함께 사용하는 약물 또는 활성 성분에는: 알데스류킨(aldesleukin), 알렌드론산(alendronic acid), 인터페론, 알리트레티노인(alitretinoin), 알로푸리놀(allopurinol), 알로퓨리놀 소디움(allopurinol sodium), 팔로노세트론 하이드로클로라이드(palonosetron hydrochloride), 알트레타민(altretamine), 아미노 글루테티미드(amino glutethimide), 아미포스틴(amifostine), 암루비신(amrubicin), 암사크린(amsacrine), 아나스트로졸(anastrozole), 돌라세트론(dolasetron), 아라네스프(aranesp), 아글라빈(arglabin), 삼산화 비소(arsenic trioxide), 아로마신(aromasin), 아자시티딘(5-azacytidine), 아자치오프린(azathioprine), BCG 백신 또는 tice BCG 백신, 베스타틴(Bestatin), 베타메타존 아세테이트(betamethasone acetate), 베타메타존 소디움 포스페이트(betamethasone sodium phosphate) 억제제, 벡사로텐(bexarotene), 블레오마이신 설페이트(bleomycin sulfate), 브로모우리딘(bromouridine), 보르테조밉(bortezomib), 카르필조밉(carfilzomib), 부설판(busulfan), 칼시토닌(calcitonin), 알렘투주마브 캠패스(alemtuzumab campath 주사제, 카페시타빈(capecitabine), 카보플라틴(carboplatin), 카소덱스(Casodex), 세페존(cefesone), 셀몰루킨(Celmoleukin), 다우노루비신(daunorubicin), 클로람부실(chlorambucil), 시스플라틴(cisplatin), 클라드리빈(cladribine), 클로드로닉산(clodronic acid), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 사이타라빈(cytarabine), 다카르바진(dacarbazine), 악티노마이신 D(actinomycin D), 다우노루비신(daunorubicin) 리포좀, 덱사메타손(dexamethasone), 덱사메타손 포스페이트(dexamethasone phosphate), 에스트라디올 발러레이트(estradiol valerate), 데니루킨 디프티톡스 2(denileukin diftitox 2), 데포 메드롤(depo-medrol), 데슬로렐린(deslorelin), 덱스라족산(dexrazoxane), 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol), 디푸루칸(Diflucan), 도세탁셀(docetaxel), 독시플루리딘(doxifluridine), 독소루비신(doxorubicin), 드로나비놀(dronabinol), 홀뮴-166-키토산 복합체(holmium-166-chitosan complex), 엘리가드(el igrand), 라스부리카제(rasburicase), 에피루비신 하이드로클로라이드(epirubicin hydrochloride), 아프레피탄트(aprepitant), 에피루비신(epirubicin), 에포에틴 알파(epoetin alfa), 에리스로포이에틴(erythropoietin), 엡타플라틴(Eptaplatin), 레바미솔 정제 (levamisole tablets), 에스트라디올(estradiol) 억제제, 17-β-에스트라디올(estradiol), 에스트라무스틴 포스페이트 소디움(estramustine sodium phosphate), 에티닐에스트라디올(ethinylestradiol), 아미포스틴(Amifostine), 하이드록시포스포릭산(hydroxyphosphoric acid), 에토포포스(Etopophos), 에토포시드(etoposide), 파드로졸(Fadrozole), 타목시펜(tamoxifen) 제제, 필그라스팀(filgrastim), 피나스테라이드(finasteride), 플록수리딘(floxuridine), 플루코나졸(fluconazole), 플루다라빈(fludarabine), 5-플루오로디옥시우리딘 모노포스페이트(5-Fluorodeoxyuridine monophosphate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 플루옥시메스테론(fluoxymesterone), 플루타마이드(flutamide), 포메스테인(formestane), 1-피리미딘(1-pyrimidine), 아라비노푸라노스 시티딘-5 푸란 스테아로일 포스페이트(arabinofuranose cytidine-5 furan stearoyl phosphate), 포테무스틴(Fotemustine), 풀베스트란트(fulvestrant), 면역글로불린(gamma globulin), 젬시타빈(gemcitabine), 젬투주맙 오조가마이신(gemtuzumab ozogamicin), 이마티닙 메실레이트(imatinib mesylate), 카무스틴 라이스 페이퍼 캡슐(carmustine rice paper capsules), 고세렐린(goserelin), 그라니세트론 하이드로클로라이드(granisetron hydrochloride), 히스트렐린(histrelin), 토포테칸 하이드로클로라이드(topotecan hydrochloride), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 에리트로-하이드록시 노닐 아데닌(erythro-hydroxy nonyl adenine), 하이드록시유레아(hydroxyurea), 이브리투모맙 튜세탄(ibritumomab tiuxetan), 아이다루비신(Idarubicin), 이포스파마이드(ifosfamide), 인터류킨-2, 인트로(intron) A, 이레사(Iressa), 이리노테칸(Irinotecan), 카이트릴(kytril), 레티난 설페이트(lentinan sulfate), 레트로졸(letrozole), 류코보린(leucovorin), 류프로라이드(leuprolide), 류프로라이드 아세테이트(leuprolide acetate), 레바미솔(Levamisole), 칼슘 레보폴리네이트(calcium levofolinate), 레보티록신 소디움(levothyroxine sodium), 레보티록신 소디움 제제, 로무스틴(lomustine), 로니다민(lonidamine), 드로나비놀(dronabinol), 나이트로젠 머스터드(nitrogen mustard), 메코발라민(Mecobalamin), 메드록시프로제스테론 아세테이트(medroxyprogesterone acetate), 메게스트롤 아세테이트(megestrol acetate), 멜팔란(melphalan), 에스테르화 에스트로겐(esterified estrogen), 6-메르캅토푸린(6-Mercaptopurine), 메스나(mesna), 메토트렉세이트(methotrexate), 메틸 아미노레불리네이트(methyl aminolevulinate), 밀테포신(miltefosine), 미노사이클린(minocycline), 미토마이신 C(mitomycin C), 미토탄(mitotane), 미톡산트론(mitoxantrone), 트릴로스탄(trilostane), 독소루비신 시트레이트(doxorubicin citrate liposome), 네다플라틴(Nedaplatin), 페그필화 필그라스팀(pegylated filgrastim), 오프렐베킨(oprelvekin), 뉴포젠(neupogen), 닐루타미드(nilutamide), 타목시펜(tamoxifen), NSC-631570, 재조합체 인간 인터루킨 1 그룹(recombinant human interleukin-1 group), 옥트레오타이드(octreotide), 온단세트론 하이드로클로라이드(ondansetron hydrochloride), 데하이드로코르티손 경구 용액(dehydrocortisone oral solution), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 프레드니손 소듐 포스페이트(prednisone sodium phosphate) 제제, 페가스파가제(pegaspargase), 페가시스(Pegasys), 펜토스타틴(pentostatin), 피시바닐(picibanil) 제제, 필로카프린 하이드로클로라이드(pilocarpine hydrochloride), 피라루비신(pirarubicin), 플리카마이신(plicamycin), 프로피머 소디움(porfimer sodium), 프레드니무스틴(prednimustine), 프레드니솔론 스테글레이트(prednisolone Steaglate), 프레드니손(prednisone), 프레마린(premarin), 프로카르바진(procarbazine), 재조합체 인간 에리스로포에틴(recombinant human erythropoietin), 랄티트렉스드(raltitrexed), 레비프(rebif), 에티드로네이트 레늄-186(rhenium-186 etidronate), 리툭시맙(rituximab), 레독손-A(redoxon-A), 로무르타이드(romurtide), 필로카르핀 하이드로클로라이드정(pilocarpine hydrochloride tablet), 옥트레오타이드(octreotide), 사그라모스팀(Sargramostim), 세무스틴(semustine), 시조필란(sizofiran), 소부족세인(sobuzoxane), 메틸프리드니솔론 소듐 석시네이트(methylprednisolone sodium succinate), 스파-포스 산(spar-fosic acid), 줄기세포 치료, 스트렙토조신(streptozocin), 스트론튬-89 클로라이드(strontium-89 chloride), 레보티록신 소디움(levothyroxine sodium), 타목시펜(tamoxifen), 탐스로신(tamsulosin), 타소네르민(tasonermin), 타스토락톤(tastolactone), 탁소테레(taxotere), 테세류킨(teceleukin), 테모졸로마이드(temozolomide), 테니포사이드(teniposide), 테스토스테론 프로피오네이트(testosterone propionate), 티오구아닌(thioguanine), 티오테파(thiotepa), 갑상샘 자극 호르몬(thyroid stimulating hormone), 틸루드론산(Tiludronic acid), 토포테칸(topotecan), 토레미펜(toremifene), 토시투모맙(tositumomab), 트라스투주맙(trastuzumab), 트레오설판(Treosulfan), 레티노산 (retinoic acid), 메토트렉사트정(methotrexate tablet), 트리메틸 멜라민(trimethyl melamine), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 트렙토렐린 아세테이트(triptorelin acetate), 트립토렐린 파모에이트 (triptorelin pamoate), UFT, 우리딘(uridine), 발루비신(valrubicin), 베스날리논(vesnarinone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(Vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 비룰리진(virulizin), 덱스라족산(dexrazoxane), 지노스타틴 스티말라머 (zinostatin stimalamer), 온단세트론(ondansetron), 파클리탁셀(paclitaxel) 단백질 안정제제, 아콜비펜(acolbifene), 아피니텍(affinitak), 아미노프레린(aminopterin), 아족시펜(arzoxifene), 아소프리스닐(asoprisnil), 아타메스테인(atamestane), BAY43-9006, 아바스틴(avastin), CCI-779, CDC-501, 세레브렉스(celebrex), 세툭시맙(cetuximab), 크리스나톨(crisnatol), 시프로테론 아세테이트(cyproterone acetate), 데시타빈(decitabine), DN-101/독소루비신-MTC(Doxorubicin-MTC), dSLIM, 두타스테라이드(dutasteride), 에도테카린(edotecarin), 에플로르니틴(eflornithine), 엑사테칸(Exatecan), 펜레티나이드(Fenretinide), 히스타민 디하이드로클로라이드(histamine dihydrochloride), 히스트렐린 히드로겔 임플란트(histrelin hydrogel implant), 홀뮴(holmium)-166DOTMP, 이반드로닉산(ibandronic acid), 익사베필론(ixabepilone), 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), L-651582, 란레오타이드(Lanreotide), 라소폭시펜(lasofoxifene), 리브라(libra), 로나파밉(lonafamib), 미프록시펜(miproxifene), 미노드로네이트(minodronate), MS-209, 리포좀 MEP-PE, MX-6, 나파레린(Nafarelin), 네모루비신(nemorubicin), 네오바스타트(neovastat), 노라트렉스드(nolatrexed), 오블리메르센(oblimersen), 온코(onco)-TCS, 오시뎀(osidem), 파클리탁셀 폴리글루타메이트(paclitaxel polyglutamate), 소듐 파미드로네이트(sodium pamidronate), PN-401, OS-21, 쿠아제팜(quazepam), R-1549, 랄록시펜(raloxifene), 온코나아제(onconase) 、13-씨스-레티노산(13-cis-retinoic acid), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 세오칼시톨(seocalcitol), T-138067, 타쎄바(tarceva), 파클리탁셀 도코사헥사에노에이트 (paclitaxel docosahexaenoate), 티모신 알파1(thymosin α), 티아조푸린(tiazofurin), 티피파르닙(tipifarnib), 티라파자민(tirapazamine), TLK-286, 토레미펜(toremifene), 트랜스 MID-lo7R, 발스포다르(valspodar), 바프레오타이드(vapreotide), 바탈라닙(vatalanob), 베르테포르핀(verteporfin), 빈플루닌(Vinflunine), Z-100 및 졸레드론산(zoledronic acid) 또는 이들의 조합으로 이루어진 물질이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 약물 조성물을 더 제안하며, 상기 약물 조성물은 상기 식 (I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염과 약학적으로 허용 가능한 보조재 또는 캐리어를 포함한다. 여기에서 사용하는 단어 "약학적으로 허용 가능한 보조재 또는 캐리어"라 함은 약학적으로 허용되는 재료, 성분 또는 매질을 말하며, 예를 들어 액체 또는 고체 충진재, 희석제, 보조원료, 용매 또는 패키징 재료가 있고, 하나의 기관 또는 신체의 특정 부위에서 다른 기관 또는 신체의 특정 부위로 휴대 또는 운송하는 주요 약학적 시약을 포함한다. 각 캐리어는 반드시 "허용 가능한" 것이어야 하며 기타 형태의 약물 성분을 수용하여 환자에게 상해를 입히지 않아야 한다. 약학적으로 허용 가능한 일부 캐리어의 예시에는 젖당, 포도당 및 수크로스(sucrose)와 같은 당; 소맥전분과 감자전분과 같은 전분; 카르복시메틸셀룰로오스나트륨(carboxymethylcellulose sodium), 에틸 셀룰로오스(ethyl cellulose), 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate), 분말상 트라가칸스(tragacanth), 맥아, 젤라틴, 탤컴 파우더(talcum powder)와 같은 셀룰로오스 및 그의 유도체; 카카오 오일과 좌약 왁스와 같은 보조재; 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유, 콩기름과 같은 오일; 부탄디올(butanediol)과 같은 글리콜(glycol); 글리세롤(glycerol), 소르비톨(sorbitol), 마니톨(mannitol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 같은 폴리올(polyol); 올레인산 에틸(ethyl oleate), 에틸 라우레이트(ethyl laurate)와 같은 에스테르; 한천; 수산화 마그네슘, 수산화 알루미늄과 같은 완충제; 알긴산(alginic acid); 발열성 물질 제거수(pyrogen-free water); 생리식염수; 링거액; 에탄올; 인산염 완충액, 및 기타 무독성의 약물 제제에 응용할 수 있는 허용 가능한 물질이 포함된다.

본 발명의 화합물을 약제로서 사람과 동물에게 투약하여 치료할 때, 이는 그 자체를 약물로서 또는 약물 조성물로서 투약할 수 있다. 예를 들어 0.1 내지 99.5%(바람직하게는 0.5 내지 90%)의 활성 성분과 약학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함한다.

본 발명의 화합물은 정맥주사, 근육주사, 복강주사, 피하주사, 외용, 경구, 또는 기타 허용 가능한 방법으로 질병을 치료할 수 있다.

본 발명은 약품 포장 또는 키트를 더 제안하며, 여기에는 하나 또는 복수개의 포장이 포함되고, 여기에서 본 발명 중 하나 또는 복수개 성분에 대한 약물 조합이 포함된다. 선택적으로 상기 유형의 포장은 공고의 형식으로 정부기관 규범에 따라 생산하며 생산 법규에서 허가한 공개 방법으로 약품 또는 바이오 제품을 사용하거나 판매하고 사람에 대한 치료 제제로 사용하거나 판매한다.

종래 기술과 비교해 본 발명의 유익한 효과는 이하와 같다.

본 발명의 중수소화 화합물은 AZD9291에 가까운 효소와 세포 레벨 생물 활성을 가지며 심장 독성이 더욱 낮다. 본 발명의 중수소화 화합물은 신규한 항종양 약물에 더 많은 선택의 여지를 부여하며 약물 응용의 전망이 더욱 밝다.

이하에서는, 본 발명의 예시적인 실시형태들을 도면을 통해 보다 상세히 설명하며 이는 본 발명의 보호범위를 제한하지 않는다. 사실상, 여기에서 설명한 내용을 제외하고 본 발명 중 문건의 모든 내용은 인용한 과학기술문헌과 특허의 예시에 의거하여 진행한 각종 수식과 많은 추가적인 변화를 포함하여 모두 본 발명이 속한 기술분야의 당업자가 잘 알 수 있는 것이다. 이하의 참고문헌 인용은 본 발명의 내용을 설명하는데 도움이 된다는 것을 이해하도록 한다.

실시예 1

합성 노선은 이하와 같다.

화합물 1

250mL 1구 플라스크에 각각 N-메틸다이에탄올아민(N-Methyldiethanolamine)(10g, 133.1mmol), TEA(26.9g, 266.3mmol), 아세토나이트릴(acetonitrile)(100mL)을 첨가한 후, 염화벤질(benzyl chloride)(23.9g, 139.8mmol)을 0℃에서 천천히 반응액 내에 점적하고, 실온에서 계속해서 1시간 동안 교반하여 TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 감압증류를 통해 용매를 제거하고, 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 21g의 무색 액체 화합물 1을 수득하며 수율은 95.5%이다.

화합물 2

250mL 복숭아형 플라스크에 화합물 1(21g, 127.1mmol), TEA(25.7g, 254.2mmol)과 DCM(100mL)을 첨가한 후, MsCl(14.6g, 127.1mmol)을 0℃에서 천천히 반응액 내에 점적한다. 반응액은 실온에서 3시간 동안 교반하여 TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 감압증류를 통해 용매를 제거하고, 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 20g의 담황색 액체 화합물 2를 수득하며 수율은 85.6%이다.

화합물 3

500mL 밀봉 관에 화합물 2(20g, 108.9mmol), 암모니아수(215mL)를 첨가하고 혼합액을 40℃에서 하룻밤 동안 교반하여 TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 15g의 무색 액체 화합물 3을 수득하며 수율은 84%이다.

화합물 4

500mL 복숭아형 플라스크에 화합물 3(15g, 91.3mmol), DCM(200mL)을 첨가하고 실온에서 천천히 Boc₂O(19.9g, 91.3mmol)을 점적한다. 점적 완료 후 혼합액을 실온에서 3시간 동안 교반하여 TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 감압증류를 통해 용매를 제거하고, 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 21g의 백색 고체 화합물 4를 수득하며 수율은 87%이다.

화합물 5

100mL 복숭아형 플라스크에 화합물 4(10g, 37.8mmol), DMF(40mL)을 첨가한 후 회차를 나누어 NaH(2.3g, 56.7mmol)를 첨가해 30분간 교반한다. TsOCD₃(7.9g, 41.6mmol)의 DMF(10mL) 용액을 첨가한 후 실온에서 3시간 동안 교반하여 TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 150mL H₂O를 첨가해 켄칭(quenching)을 진행하고 EA(50mL*3) 추출한다. 유기상을 합쳐 브라인(brine)으로 세정하고 무수 Na₂SO₄로 건조하며 감압증류를 통해 용매를 제거하고, 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 8.5g의 백색 고체 화합물 5를 수득하며 수율은 80%이다.

화합물 6

250mL 복숭아형 플라스크에 화합물 5(8.5g, 30.18mmol), THF(80mL)을 첨가한 후 빙점조에서 회차를 나누어 LiAlH₄(3.4g, 90.59mmol)를 첨가한 후 60℃까지 하룻밤 가열한다. TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 천천히 Na₂SO₄ㆍ10H₂O를 첨가해 켄칭을 진행하고 여과해 고체를 제거하고 여과액을 수집한 후 감압증류를 통해 용매를 제거하며 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 4.5g의 무색 액체 화합물 6을 수득하며 수율은 76.3%이다.

화합물 7

100mL 복숭아형 플라스크에 화합물 6(4.5g, 23mmol), MeOH(50mL), Pd(OH)₂/C(200mg)을 첨가하고 진공펌프로 수소를 3회 배출시켜 실온에서 하룻밤 동안 교반한다. TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 Pd(OH)₂/C를 여과하여 제거한 후 반응액 pH값을 산성으로 조절하고 감압증류를 통해 용매를 제거하여 2.8g의 백색 고체 화합물 7을 수득하며 수율은 85.9%이다.

화합물 8

250mL 복숭아형 플라스크에 2,4-디클로로피리미딘(dichloropyrimidine)(11.37g, 76.33mmol), 알루미늄클로라이드(aluminum chloride(10.18g, 76.33mmol)과 100mL 디메톡시에탄(DME)를 각각 첨가하고, 실온에서 20분간 교반한다. 그 후 화합물 II(10.00g, 63.61mmol)을 첨가해 80도까지 올려 6시간 반응시킨다. 반응이 끝나면 실온으로 냉각하고 100mL 물을 첨가해 2시간 교반하여 여과한 후 고체는 에탄올로 세정하며 진공건조를 통해 적색 조생성물 15.46g 화합물 III를 수득하며 수율은 90.1%이다.

300mL 1,4-디옥산을 500mL 복숭아형 플라스크를 취하여 화합물 III(20.00g, 82.07mmol), 화합물 4-불소-2-메톡시-5-니트로아닐린(16.80g, 90.28mmol)과 p-톨루엔 술포닉산(17.17g, 90.28mmol)을 각각 첨가한다. 85도까지 끌어올려 8시간 동안 반응시킨 후 실온으로 냉각하고 물을 첨가해 교반하며 40% 수산화나트륨 용액을 pH=9까지 점적해 여과한다. 고체는 에탄올로 세정하고 진공건조를 통해 황색 고체 30.00g 화합물 8을 수득하며 수율은 92.9%이다.

화합물 9

120mL 밀봉 관에 화합물 8(2g, 4.77mmol), 7(810mg, 5.72mmol), DIPEA(1.23g, 9.54mmol), DMA(10mL)를 첨가한다. 그 후 밀봉 관을 140℃에서 6시간 동안 반응시키고 TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 반응액을 실온으로 냉각하고 20mL 물을 첨가해 고체를 석출 및 여과한다. 그 후 여과 케이크를 2mL 메탄올에 첨가해 타출 세정하고, 여과 및 건조를 거쳐 1.7g의 적색 고체 화합물 9를 수득하며 수율은 70.6%이다.

화합물 10

250mL 1구 플라스크에 각각 화합물 9(1.7g, 3.37mmol), Pd/C(200mg), MeOH(100mL)를 첨가하고, 진공펌프로 수소를 3회 배출시켜 실온에서 하룻밤 동안 교반한다. TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 Pd/C를 여과하여 제거한 후 감압증류를 통해 용매를 제거하여 녹황색 고체를 수득하며 칼럼 크로마토그래피로 정제를 진행한 후 용리제(DCM:MeOH:NH₃H₂O=20:1:0.1)로 용리하여 1.2g의 녹황색 고체 화합물 10을 수득하며 수율은 75%이다.

화합물 11

20mL 1구 플라스크에 화합물 10(500mg, 1.05mmol), DCM(30mL)을 첨가한 후 3-클로로프로피오닐 클로라이드(3-chloropropionyl chloride)(133.7mg, 1.05mmol)을 첨가하고 0℃에서 천천히 반응액 내로 점적하여 실온에서 계속하여 30분간 교반한다. TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 NaOH(168mg, 4.2mmol)를 첨가하여 65℃까지 끌어올려 하룻밤 동안 교반한다. HPLC로 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 감압증류를 통해 용매를 제거하고 칼럼 크로마토그래피로 정제를 진행한 후 용리제(DCM:MeOH=10:1)로 용리하여 280mg의 담황색 고체 화합물 11을 수득하며 수율은 50.4%이다.

¹H NMR (400MHz, CDCl3) δ 10.19 (s, 1H), 9.88 (s, 1H), 9.12 (s, 1H), 8.39 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 7.85 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.26 - 7.14 (m, 2H), 7.00 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.82 (s, 1H), 6.49 (dd, J = 16.9, 2.2 Hz, 1H), 6.39 (dd, J = 16.9, 9.8 Hz, 1H), 5.73 (dd, J = 9.8, 2.2 Hz, 1H), 4.49 - 4.32 (m, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.05 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.95 - 2.87 (m, 2H), 2.73 (s, 3H), 2.39 - 2.23 (m, 7H), 1.82 (s, 3H). LC-MS [M+H]⁺528.7

실시예 2

합성 노선은 이하와 같다.

화합물 12

120mL 밀봉 관에 화합물 8(500mg, 1.19mmol), N-메틸다이에탄올아민(107.26mg, 1.42mmol), DIPEA(307.59mg, 2.38mmol), DMA(5mL)를 첨가한다. 그 후 밀봉 관을 140℃에서 6시간 동안 반응시키고 TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 반응액을 실온으로 냉각하고 20mL 물을 첨가해 고체를 석출 및 여과한다. 그 후 여과 케이크를 2mL 메탄올에 첨가해 타출 세정하고, 여과 및 건조를 거쳐 480mg의 적갈색 고체 화합물 12를 수득하며 수율은 85%이다.

화합물 13

20mL 복숭아형 플라스크에 화합물 12(450mg, 1.05mmol), TEA(159.39mg, 1.57mmol)과 DCM(5ml)을 첨가한다. 0℃에서 천천히 MsCl(120.28mg, 1.05mmol)을 점적하고, 점적을 완료한 후 상기 온도에서 1시간 동안 교반하여 TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 감압증류를 통해 용매를 제거하고 칼럼 크로마토그래피로 정제를 진행한 후 320mg의 적색 고체 화합물 13을 수득하며 수율은 55.15%이다.

화합물 14

5mL 밀봉 관에 화합물 13(220mg, 0.40mmol), 중수소화 디메틸아민(deuterated dimethylamine)(175.16mmg, 2mmol), DIPEA(103.39mg, 0.8mmol), THF(2mL)를 첨가한다. 그 후 80℃에서 하룻밤 동안 교반하고 TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 감압증류를 통해 용매를 제거하여 적색 고체를 수득하고 칼럼 크로마토그래피로 정제를 진행한 후 용리제(DCM:MeOH:NH₃H₂O=40:1:0.1)로 용리하여 90mg의 적색 고체 화합물 14를 수득하며 수율은 44.32%이다.

화합물 15

250mL 1구 플라스크에 화합물 14(90mg, 0.18mmol), Pd/C(30mg), MeOH(10mL)을 첨가하고 진공펌프로 수소를 3회 배출시켜 실온에서 하룻밤 동안 교반한다. TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 Pd/C를 여과하여 제거한 후 감압증류를 통해 용매를 제거하여 녹황색 고체를 수득하고 칼럼 크로마토그래피로 정제를 진행한 후 용리제(DCM:MeOH:NH₃H₂O=20:1:0.1)로 용리하여 40mg의 녹황색 고체 화합물 15를 수득하며 수율은 46.53%이다.

화합물 16

10mL 1구 플라스크에 화합물 15(40mg, 0.08mmol), DCM(4mL)을 첨가한 후 3-클로로프로피오닐 클로라이드(10.63mg, 0.08mmol)을 첨가하고 0℃에서 천천히 반응액 내로 점적하여 실온에서 계속하여 30분간 교반한다. TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 NaOH(16mg, 0.4mmol)를 첨가하여 65℃까지 끌어올려 하룻밤 동안 교반한다. HPLC로 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 감압증류를 통해 용매를 제거하고 칼럼 크로마토그래피로 정제를 진행한 후 용리제(DCM:MeOH:NH₃H₂O=40:1:0.1)로 용리하여 38mg의 담황색 고체 화합물 16을 수득하며 수율은 89.34%이다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.12 (s, 1H), 9.88 (s, 1H), 9.10 (s, 1H), 8.39 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.19 (dd, J = 17.1, 6.5 Hz, 2H), 7.00 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.46 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.73 (dd, J = 8.6, 3.1 Hz, 1H), 4.51 - 4.28 (m, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.05 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.98 - 2.87 (m, 2H), 2.72 (s, 3H), 2.31 (dd, J = 16.4, 11.2 Hz, 4H). LC-MS [M+H]⁺ 531.7

실시예 3

합성 노선은 이하와 같다.

화합물 17

2L 3구 플라스크에 각각 CD₃OH(15g, 415.8mmol), THF(600mL)을 첨가한 후 -40℃에서 천천히 n-BuLi(174.6mL, 436.6mmol)를 점적한다. 1시간 교반 후 TsCl(79.3g, 415.8mmol)의 테트라하이드로퓨란 용액을 점적하며, 점적 완료 후 3시간 동안 계속해서 교반한다. TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 천천히 600mLH₂O를 첨가해 켄칭을 진행하고 EA 추출(200mL*3)을 진행해 브라인(brine)으로 세정하고 무수 Na₂SO₄로 건조하며 유기상을 합쳐 감압증류를 통해 용매를 제거하고, 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 73g의 백색 고체 화합물 17을 수득하며 수율은 92.7%이다.

화합물 18

250mL 복숭아형 플라스크에 화합물 17(8g, 42.3mmol), N-벤질아미노에탄올(benzylaminoethanol)(5.3g,35.2mmol),트리에틸아민(triethylamine)(9.8ml, 70.4mmol), 테트라하이드로퓨란(100mL)을 첨가한다. 혼합액은 환류 하에서 8시간 동안 반응시키고 TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 감압증류를 통해 용매를 제거하며 칼럼 크로마토그래피로 정제를 진행한 후 5g의 무색 점성 액체 화합물 18을 수득하며 수율은 84.4%이다.

화합물 19

50mL 복숭아형 플라스크에 화합물 18(3g, 15.87mmol), 트리에틸아민(triethylamine)(3.2g, 31.74mmol), 디클로로메탄(dichloromethane)(20mL)를 첨가한 후 0℃에서 천천히 메탄설포닐 클로라이드(Methanesulfonyl chloride)(2.18g, 19.05mmol)을 첨가하고, 반응액은 실온에서 3시간 동안 교반하며 TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 감압증류를 통해 용매를 제거하여 담황색 점성 액체를 수득하고, 칼럼 크로마토그래피로 정제를 진행한 후 2.8g의 담황색 액체 화합물 19를 수득하며 수율은 71.6%이다.

화합물 20

10mL 밀봉 관에 각각 화합물 19(2.8g, 11.37mmol), 디메틸아민(dimethylamine)(1.5mL), THF(3mL)을 첨가한다. 혼합액은 80℃에서 5시간 동안 교반하고 TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한다. 5mL 물을 첨가해 희석시키고 에틸 아세테이트(5mL^*3)을 첨가하며 유기상을 합치고 포화식염수로 세정하여 무수 Na₂SO4로 건조하며 감압증류를 통해 용매를 제거하고, 중간 압력 하에 정제하여 2g의 무색 액체 화합물 20을 수득하며 수율은 75%이다.

화합물 21

100mL 복숭아형 플라스크에 화합물 20(2g, 10.2mmol), 10% Pd/C(500mg), 메탄올(30mL)을 각각 첨가한 후 35℃ 수소 하에서 하룻밤 동안 교반한다. TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 고체를 여과시키고 여과액에는 HCl(in EA)을 pH가 산성이 될 때까지 점적하며, 감압증류를 통해 용매를 제거하여 900mg의 백색 고체 화합물 21을 수득하며 수율은 62.3%이다.

화합물 22

120mL 밀봉 관에 화합물 8(965mg, 2.3mmol), 21(467mg, 2.76mmol), 디아이소프로필 에틸아민(diisopropylethylamine)(1.18g, 9.2mmol), DMA(5mL)을 첨가한다. 그 후 밀봉 관을 140℃에서 6시간 동안 반응시키고 TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한다. 반응액을 실온으로 냉각시켜 20mL 물을 첨가해 고체를 석출하여 여과한 후 여과 케이크를 2mL 메탄올에 넣어 세정하고 여과 및 건조를 통해 900mg 적색 고체 화합물 22를 수득하며 수율은 77.5%이다.

화합물 23

250mL 1구 플라스크에 각각 화합물 22(900mg, 1.78mmol), Pd/C(300mg), MeOH(100mL)를 첨가하고, 진공펌프로 수소를 3회 배출시켜 실온에서 하룻밤 동안 교반한다. TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 Pd/C를 여과하여 제거하고 감압증류를 통해 용매를 제거하여 녹황색 고체를 수득하며 칼럼 크로마토그래피로 정제를 진행한 후 용리제(DCM:MeOH:NH₃H₂O=20:1:0.1)로 용리하여 600mg의 녹황색 고체 화합물 23을 수득하며 수율은 71%이다.

화합물 24

20mL 1구 플라스크에 화합물 23(300mg, 0.63mmol), THF(6mL)와 H₂O(1mL)를 첨가한 후 3-클로로프로피오닐 클로라이드(80.36mg, 0.63mmol)을 0℃에서 천천히 반응액 내로 점적하여 실온에서 계속하여 30분간 교반한다. TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 NaOH(100.8mg, 2.52mmol)를 첨가하여 65℃까지 끌어올려 하룻밤 동안 교반한다. HPLC로 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 감압증류를 통해 용매를 제거하고 칼럼 크로마토그래피로 정제를 진행한 후 용리제(DCM:MeOH=10:1)로 용리하여 170mg의 담황색 고체 화합물 24를 수득하며 수율은 51%이다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.07 (s, 1H), 9.87 (s, 1H), 9.10 (s, 1H), 8.39 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 7.85 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.25 - 7.14 (m, 2H), 7.00 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.57 - 6.38 (m, 2H), 5.74 (dd, J = 8.2, 3.8 Hz, 1H), 4.49 - 4.30 (m, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.05 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.98 - 2.89 (m, 2H), 2.42 - 2.21 (m, 13H).LC-MS [M+H]⁺ 528.7

실시예 4

합성 노선은 이하와 같다.

화합물 25

1L 1구 플라스크에 각각 N-메틸다이에탄올아민(40.0g, 0.532mol), 트리에틸아민(80.8g, 0.8mol), 디클로로메탄(500mL)를 첨가한 후 염화벤질(67.4g, 0.5mol)를 0℃에서 천천히 반응 내에 점적하고 실온에서 하룻밤 동안 교반한다. TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 200mL 물을 첨가해 추출 분리하고 100mL 디클로로메탄으로 수상을 추출한다. 유기상을 포화식염수로 3회 세정하여 무수 황산나트륨으로 건조하고 감압증류를 진행해 칼럼 크로마토그래피로 정제를 진행한 후 73g의 무색 액체 산물 25를 수득하며 수율은 83.1%이다.

화합물 26

1L 1구 플라스크에 각각 25(71.0g, 0.4mol), 디클로로메탄(400mL)를 첨가한 후 수조에서 천천히 염화 티오닐(thionyl chloride)(76.7g, 0.6mol)을 점적하고 실온에서 12시간 동안 반응시킨다. TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 감압증류를 진행해 칼럼 크로마토그래피로 정제를 진행한 후 60.0g의 담황색 액체 산물 26을 수득하며 수율은 76.1%이다.

화합물 27

2L 1구 플라스크에 각각 26(60.0g, 0.3mol), 암모니아수(1L)을 첨가하고 혼합액은 40℃에서 하룻밤 동안 교반한다. TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 감압증류를 진행해 칼럼 크로마토그래피로 정제를 진행한 후 40.0g의 무색 액체 산물 27을 수득하며 수율은 74.7%이다.

화합물 28

2L 복숭아형 플라스크에 27(40.0g, 0.3mol), 디클로로메탄(250mL)을 첨가하고 실온에서 천천히 Boc₂O(55.2g, 0.3mol)을 점적한다. 점적 완료 후 혼합액은 실온에서 3시간 동안 교반하며 TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 감압증류를 진행해 칼럼 크로마토그래피로 정제를 진행한 후 58.0g의 무색 액체 산물 28을 수득하며 수율은 86.7%이다.

화합물 29

500mL 복숭아형 플라스크에 28(26.0g, 98.3mmol), N,N-디메틸포름아미드(100mL)을 첨가하고 빙점조에서 회차를 나누어 NaH(5.9g, 147.5mmol)를 첨가하여 30분간 교반한다. TsOCD₃(27.9g, 147.5mmol)의 N,N-디메틸포름아미드(10mL) 용액을 첨가한 후 실온에서 3시간 동안 교반한다. TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 300mL 물을 첨가해 켄칭을 진행하고 에틸 아세테이트(100mL*3)을 첨가하며 유기상을 합치고 포화식염수로 세정하여 무수 황산나트륨으로 건조하며 감압증류를 통해 용매를 제거하고, 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 21.0g의 백색 고체 산물 29를 수득하며 수율은 75.9%이다.

화합물 30

250mL 복숭아형 플라스크에 29(21.0g, 74.7mmol), 메탄올(100mL), Pd/C(4.2g)을 각각 첨가하고 진공펌프로 수소를 3회 배출시켜 40℃에서 하룻밤 동안 반응시킨다. TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 Pd/C를 여과하여 제거한 후 감압증류를 통해 용매를 제거하여 12.0g의 백색 고체 산물 30을 수득하며 수율은 84.0%이다.

화합물 31

120mL 밀봉 관에 8(6.1g, 14.5mmol), 30(5g, 26.1mmol), DIPEA(3.8g, 29mmol), DMAc(30mL)를 첨가한다. 그 후 밀봉 관을 140℃에서 6시간 동안 반응시키고 TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 반응액을 실온으로 냉각하고 60mL 물을 첨가해 고체를 석출 및 여과한다. 그 후 여과 케이크를 20mL 메탄올에 첨가해 타출 세정하고, 여과 및 건조를 거쳐 7.0g의 적색 고체 산물 31을 수득하며 수율은 81.7%이다.

화합물 32

250mL 1구 플라스크에 31(7.0g, 12.5mmol), Pd/C(1.4g), 메탄올(100mL)을 첨가하고, 진공펌프로 수소를 3회 배출시켜 실온에서 하룻밤 동안 교반한다. TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 Pd/C를 여과하여 제거한 후 감압증류를 통해 용매를 제거하여 녹황색 고체를 수득하며 칼럼 크로마토그래피로 정제를 진행한 후 용리제(디클로로메탄: 메탄올: 암모니아수=20:1:0.1)로 용리하여 3.5g의 녹황색 고체 산물 32를 수득하며 수율은 50.9%이다.

화합물 33

100mL 1구 플라스크에 32(1.1g, 2.0mmol), 테트라하이드로퓨란(30mL), 물(3mL)을 첨가한 후 0℃에서 3-클로로프로피오닐 클로라이드(274mg, 2.2mmol)을 반응액 내로 천천히 점적하여 실온에서 계속하여 1시간 동안 교반한다. TLC에서 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 NaOH(1.3g, 31.4mmol)를 첨가하여 65℃까지 끌어올려 하룻밤 동안 교반한다. HPLC로 잔여 원료가 없는 것으로 검출한 후 감압증류를 통해 용매를 제거하고 칼럼 크로마토그래피로 정제를 진행한 후 용리제(디클로로메탄:메탄올:암모니아수=40:1:0.1)로 용리하여 800mg의 담황색 고체 산물 33을 수득하며 수율은 66.4%이다.

화합물 34

25mL 1구 플라스크에 33(320mg, 0.5mmol), 디클로로메탄(3mL), 물(3mL)을 첨가한 후 실온에서 메탄술폰산(methanesulfonic acid) 0.3mL를 천천히 반응액 내에 점적하고 계속하여 1시간 동안 교반한다. 감압증류를 통해 디클로로메탄을 제거한 후 에틸 아세테이트 12.5mL과 에탄올 2.5mL를 첨가하고 음파파쇄하고, 실온에서 교반하면서 결정을 석출하여 여과하고, 여과 케이크 에틸 아세테이트는 세정하고(2mL^*2), 여과 케이크를 건조시켜 300mg 황색 고체 산물 34를 수득하며 수율은 71.8%이다.

¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.52 (s, 1H), 8.83 (s, 1H), 8.64 (s, 2H), 8.35 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.45 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.06 (d, J = 5.7 Hz, 3H), 6.86 (dd, J = 16.9, 10.3 Hz, 1H), 6.25 (d, J = 16.9 Hz, 1H), 5.77 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 4.38-4.23 (m, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.29 (d, J = 5.4 Hz, 2H), 3.21-3.18 (m, 2H), 2.97-2.92 (m, 2H), 2.66 (s, 3H), 2.19-2.11 (m, 2H), 2.41 (s, 9H).

실시예 5: 제조한 화합물의 생물 활성 테스트

1) 상기 화합물은 EGFR 야생형, EGFR(T790M, L858R) 이중 돌연변이형 및 EGFR(L858R) 단일 돌연변이형의 키나아제 활성 IC₅₀를 테스트하였다. 상기 키나아제는 인비트로젠(Invitrogen) 상하이무역유한회사에서 구매하였다.

균질적 시간 분해 형광측정법(HTRF, homogenous time resolved fluorescence)을 채택해 EGFR 야생형, EGFR(T790M, L858R) 이중 돌연변이형 및 EGFR(L858R) 단일 돌연변이형의 키나아제 활성 검출 방법을 구축해 화합물의 억제 활성을 측정하였다. 8uL의 반응액을 배치하며 여기에는 1Хenzymatic buffer(Cisbio, HTRF KinEASE^TM-TK), 5mM MgCl2, 1mM MnCl2, 1mM DTT, 0.5μM TK substrate-biotin(Cisbio, HTRF KinEASE^TM-TK) 10μM ATP, 농도 기울기의 화합물 및 0.04ng/μL EGFR 또는 0.025ng/μL의 EGFR(T790M, L858R) 또는 EGFR(L858R)이 포함된다. 화합물 반응 농도는 1000nM에서 3배 희석한 9개 농도이다. 반응계는 DMSO 농도가 2%이다. 효소와 화합물은 15분간 사전 배양한 후 ATP를 첨가해 기질과 반응을 시작한다. 모든 효소 촉매 반응은 25℃ 하에서 60분간 진행한다. 효소 촉매 반응 종료 후 반응액에 4μL TK antibody-cryptate와 4μL streptavidin-XL665(반응 농도는 62.5nM)를 첨가하고 계속해서 25℃에서 60분간 배양한다. 배양 종료 후 CLARIOstar(BMG LABTECH) 상에서 HTRF 형광값을 검출하며 GraphPad Prism 5.0을 사용해 IC₅₀을 계산한다.

표 1 체외 효소학 활성 테스트 데이터(IC₅₀, nM)

본 발명의 중수소화 화합물은 AZD9291과 유사한 효소 생물활성을 가진다.

2) EGFR 야생형, EGFR Exon19 결실(활성 단일 돌연변이체) 및 EGFR(T790M, L858R) 이중 돌연변이형 세포 인산화 테스트를 진행하였다.

테스트 1: EGFR 야생형 세포 인산화 테스트

사람 피부 편평세포암 세포주 A431은 야생형 EGFR을 발현하였으며 중국과학원 세포은행에서 구매하였다. A431은 10% 소태아혈청을 함유한 EMEM 배지 내에 유지시킨다. 세포가 5% CO₂의 가습 배양상자에서 37℃ 환경으로 생장하도록 만든다. Phospho-EGFR HTRF kit(Cisbio, 화물번호 #64HR1PEG)에 설명된 방법에 따라 세포용해액 중 내인성 p-EGFR을 검출한다. 100μL의 양의 완전 배지에 세포를 96웰 플레이트(50000 세포/웰) 내에 접종하고 37℃에서 5% CO₂세포 배양상자 내에서 하룻밤 동안 배양한다. 연속으로 4배 희석한 화합물을 세포에 첨가하고 반응 최고 농도는 10μM으로 한다. 계속해서 2시간 동안 배양한 후 100ng/웰의 EGF를 37℃에서 10분간 배양한 후 배양액을 버리고 즉시 25μL/웰 용해 완충액을 첨가하여 실온에서 10분간 세포를 용해시킨다. 그 후 12μL/웰의 세포 용해액을 취하여 Greiner 백색 저체적 384웰 플레이트에 첨가하고, 검출 항체(Anti-phospho EGFR-d2 및 Anti-EGFR-Tb)를 첨가하며 25℃에서 60분간 배양한다. 배양 종료 후 CLARIOstar(BMG LABTECH) 상에서 HTRF 형광값을 검출하며 GraphPad Prism 5.0을 사용해 IC₅₀을 계산한다.

테스트 2: Exon19 결실 EGFR(활성 단일 돌연변이체) 세포 인산화 테스트

사람 비소세포폐암 세포주 HCC827(Exon19 결실 EGFR, 활성 단일 돌연변이체)으로 중국과학원 세포은행에서 구매하였다. HCC827은 10% 소태아혈청을 함유한 RPMI1640 배지 내에 유지시킨다. 세포가 5% CO₂의 가습 배양상자에서 37℃ 환경으로 생장하도록 만든다. Phospho-EGFR HTRF kit(Cisbio, 화물번호 #64HR1PEG)에 설명된 방법에 따라 세포용해액 중 내인성 p-EGFR을 검출한다. 100μL세포를 96웰 플레이트(50000 세포/웰) 내에 접종하고 37℃에서 5% CO₂세포 배양상자 내에서 하룻밤 동안 배양한다. 연속으로 4배 희석한 화합물을 세포에 첨가하고 반응 최고 농도는 10μM으로 한다. 계속해서 2시간 동안 배양한 후 배양액을 버리고 즉시 25μL/웰 용해액을 첨가하여 실온에서 10분간 세포를 용해시킨다. 그 후 12μL/웰을 취하여 Greiner 백색 저체적 384웰 플레이트에 첨가하고, 검출 항체(Anti-phospho EGFR-d2 및 Anti-EGFR-Tb)를 첨가하며 25℃에서 60분간 배양한다. 배양 종료 후 CLARIOstar(BMG LABTECH) 상에서 HTRF 형광값을 검출하며 GraphPad Prism 5.0을 사용해 IC₅₀을 계산한다.

테스트 3: EGFR(T790M, L858R) 이중 돌연변이형 세포 인산화 테스트

사람 비소세포폐암 세포주 NCI-H1975는 EGFR(T790M, L858R) 이중 돌연변이형을 발현하였으며 중국과학원 세포은행에서 구매하였다. NCI-H1975는 10% 소태아혈청을 함유한 RPMI1640 배지 내에 유지시킨다. 세포가 5% CO₂의 가습 배양상자에서 37℃ 환경으로 생장하도록 만든다. Phospho-EGFR HTRF kit(Cisbio, 화물번호 #64HR1PEG)에 설명된 방법에 따라 세포용해액 중 내인성 p-EGFR을 검출한다. 100μL세포를 96웰 플레이트(50000 세포/웰) 내에 접종하고 37℃에서 5% CO₂세포 배양상자 내에서 하룻밤 동안 배양한다. 연속으로 4배 희석한 화합물을 세포에 첨가하고 반응 최고 농도는 10μM으로 한다. 계속해서 2시간 동안 배양한 후 배양액을 버리고 즉시 25μL/웰 용해액을 첨가하여 실온에서 10분간 세포를 용해시킨다. 그 후 12μL/웰을 취하여 Greiner 백색 저체적 384웰 플레이트에 첨가하고, 검출 항체(Anti-phospho EGFR-d2 및 Anti-EGFR-Tb)를 첨가하며 25℃에서 60분간 배양한다. 배양 종료 후 CLARIOstar(BMG LABTECH) 상에서 HTRF 형광값을 검출하며 GraphPad Prism 5.0을 사용해 IC₅₀을 계산한다.

표 2 세포 레벨 EGFR 야생 및 돌연변이체 인산화 테스트(IC₅₀, nM)

본 발명의 중수소화 화합물은 AZD9291과 유사한 세포 레벨 생물활성을 가진다.

3) 제조한 화합물의 hERG 칼륨 이온 채널 작용에 대한 테스트

안정적인 발현 hERG 채널의 HEK293 세포는 35mm 배양기구에서 배양하며, 37℃/5% CO₂배양상자에서 24시간 이상 방치한 후 실험에 사용한다. 세포 배지는 10% 소태아혈청을 함유한 250μg/mL G418의 DMEM이다.

전세포 패치클램프(Whole-cell patch clamp) 실험용 세포외액의 성분(mM)은 NaCl, 137; KCl, 4; CaCl2, 1.8; MgCl2, 1; HEPES, 10; glucose 10; pH 7.4(NaOH 적정)이다. 모든 시험 화합물과 대조 화합물 용액은 모두 0.3% DMSO를 함유한다. 세포내액(mM)은: K Aspartate, 130; MgCl2, 5; EGTA 5; HEPES, 10; Tris-ATP 4; pH 7.2(KOH 적정)이다.

매회 실험마다 배양기구를 하나 꺼내어 세포외액을 이용해 2회 세정한 후 도립 현미경 재물대 위에 거치한다. 전세포 패치클램프 실험은 실온에서 진행하며 사용하는 붕규산 유리 미소전극 점 전극(point electrode) 저항은 3 내지 5MΩ이다. 전세포 기록 모드 후 막전위를 -80mV로 클램핑하고 30초마다 세포+50mV 탈분극 전압 자극을 주며 이어서 2초 후 -50mV까지 재분극시키고 이어서 3초 후 hERG 테일 전류(tail current)를 인출할 수 있다. 탈분극 전압 자극 전에 먼저 세포에 50ms, -50mV 재분극 전압을 공급하며, 상기 전압 하에서 기록한 전류는 hERG 테일 전류를 계산하는 기초선으로 삼는다. 화합물을 첨가하기 전에 hERG 테일 전류는 세포외액에서 적어도 안정적으로 3분간 기록한다. 관류 투약한 후의 hERG 테일 전류폭의 변화가 <5%일 때 약물 작용이 정상 상태에 도달한 것으로 간주한다. 데이터 수집과 분석은 pCLAMP 10.1 소프트웨어 프로그램을 사용한다. 선택한 화합물을 첨가하기 전에 전류는 정상 상태의 4 내지 5개 sweep에 처하면 피크값의 평균치를 계산하여 대조 전류폭 값으로 삼는다. 선택한 화합물을 첨가한 후 전류가 정상 상태의 4 내지 5개 sweep에 처하면 피크값의 평균치를 계산하여 전류가 억제된 후의 잔여폭 값으로 삼는다. 테스트하려는 화합물의 hERG 전류에 대한 억제율은 이하 방정식에 따라 계산한다.

% 억제율={1-(전류 잔여폭 값)/(대조 전류폭 값)}Х100

상기 계산방법에 의거하여 테스트하려는 화합물의 복수개 농도의 hERG 전류에 대한 억제율(평균값±표준차)을 수득한 후, logistic 방정식을 사용해 데이터를 조절해 IC₅₀을 얻는다.

표 3 세포 레벨에서 화합물의 hERG 칼륨 이온 채널 억제에 대한 IC₅₀（μM）

본 발명의 중수소화 화합물은 AZD9291보다 더욱 낮은 심장 독성을 가진다.

Claims

R₁, R₂는 -CH₃ 또는 -CD₃에서 선택하고, R₃ 및 R₄는 -CH₃, -CD₃또는 -H에서 선택하고, R₁, R₂, R₃ 및 R₄ 중 적어도 하나는 -CD₃인 식 (I) 구조를 가진 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항에 있어서,
R₁는 -CH₃인 것을 특징으로 하는 식 (I) 구조를 가진 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염.
이하에서 선택하는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기의 약학적으로 허용 가능한 염은 아세테이트(acetate), 아디페이트(adipate), 알지네이트(alginate), 아스코베이트(ascorbate), 아스파르테이트(aspartate), 벤조에이트(benzoate), 벤젠 설포네이트(benzene sulfonate), p-톨루엔 설포네이트(p-toluenesulfonate), 하이드로설페이트(hydrosulfate), 보레이트(borate), 부티레이트(butyrate), 시트레이트(citrate), 캄포레이트(camphorate), 캄포 설포네이트(camphorsulfonate), 시클로펜탄프로피오네이트(cyclopentanepropionate), 디클리콜린산염(diglycolate), 라우릴설페이트(lauryl sulfate), 에탄설포네이트(ethanesulfonate), 푸마레이트(fumarate), 글루셉테이트(gluceptate), 글리세로포스페이트(glycerophosphate), 헵틸레이트(heptylate), 카프로에이트(caproate), 히드로클로라이트(hydrochloride), 히드로브로메이트(hydrobromate), 히드리오데이트(hydriodate), 이세티오네이트(isethionate), 락테이트(lactate), 말레이트(maleate), 메탄설포네이트(methanesulfonate), 나프탈렌 설포네이트(naphthalene sulphonate), 하이드로클로레이트 (hydrochlorate), 니트레이트(nitrate), 옥사레이트(oxalate), 펙테이트(pectate), 퍼설페이트(persulfate), 펜프로피오네이트(phenpropionate), 포스페이트(phosphate), 피크레이트(picrate), 피발레이트(pivalate), 프로피오네이트(propionate), 살리실레이트(salicylate), 석시네이트(succinate), 설페이트(sulfate), 설포네이트(sulfonate), 타르트레이트(tartrate) 또는 티오시아네이트(thiocyanate)에서 선택하는 것을 특징으로 하는 식 (I) 구조를 가진 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 4항 중 어느 한 항에 따른 식 (I) 구조를 갖는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 약학적으로 허용 가능한 보조재를 포함하는 약물 조성물.
제1항 내지 4항 중 어느 한 항의 식 (I) 구조를 갖는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염이 종양을 치료 또는 예방하는 약물 제조에 사용하는 용도.
제6항에 있어서,
상기 종양은 비소세포폐암, 소세포폐암, 췌장암, 유선암, 전립선암, 간암, 피부암, 상피세포암, 위장간기질종양, 백혈병, 조직세포성 림프종 또는 비인두암에서 선택하는 것을 특징으로 하는 용도.
제1항 내지 4항 중 어느 한 항의 식 (I) 구조를 갖는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 EGFR이 매개하는 또는 활성 돌연변이체 또는 저항성 돌연변이체 형태의 EGFR이 매개하는 질병, 장애, 장해 또는 병세를 치료 또는 예방하는 약물 제조에 사용하는 용도.
제8항에 있어서,
상기의 EGFR이 매개하는 또는 활성 돌연변이체 또는 저항성 돌연변이체 형태의 EGFR이 매개하는 질병, 장애, 장해 또는 병세는 비소세포폐암, 소세포폐암, 췌장암, 유선암, 전립선암, 간암, 피부암, 상피세포암, 위장간기질종양, 백혈병, 조직세포성 림프종, 또는 비인두암에서 선택하는 것을 특징으로 하는 용도.
제8항에 있어서,
상기 활성 돌연변이체 또는 저항성 돌연변이체 형태의 EGFR는 L858R 활성 돌연변이체, Exon19 결실 활성 돌연변이체와 T790M 저항성 돌연변이체에서 선택하는 것을 특징으로 하는 용도.