KR20180056768A

KR20180056768A - 인간화된 항-인간 cd19 항체 및 사용 방법

Info

Publication number: KR20180056768A
Application number: KR1020187012264A
Authority: KR
Inventors: 가이 조르주; 에케하르트 뫼스너; 로랑 라리비에르; 알렉산더 하스; 후버트 케텐베르거; 콜러 클라우디아 퍼라라; 틸만 슐로타우어; 미카엘 몰호즈
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2015-10-01
Filing date: 2016-09-30
Publication date: 2018-05-29
Also published as: TWI747842B; CN108137696B; ES2791989T3; RS60250B1; CN114349862A; SI3356408T1; IL288457A; CA3000562A1; EP3356408B1; PE20181054A1; TW201731875A; JP2018529733A; WO2017055541A1; MY185171A; HUE049083T2; RU2731156C1; CO2018002265A2; BR112018006579A2; TW202210522A; IL257679B

Abstract

본 명세서에 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 항체뿐만 아니라 상기 항체의 사용 방법을 보고하며, 여기에서 상기 항체는 (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (c) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (d) 서열번호 20 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.

Description

인간화된 항-인간 CD19 항체 및 사용 방법

본 발명은 인간 CD19에 대한 인간화된 항체(항-인간 CD19 항체), 그의 생성 방법, 상기 항체를 함유하는 약학 조성물, 및 그의 용도에 관한 것이다.

인간 CD19는 B-세포 및 여포성 수지상 세포상에서 독점적으로 발현되는 95 kDa 막관통 단백질(B-세포 공-수용체)이다. CD19는 CD21 및 CD81과 함께 발견된다. CD19 및 CD21은 정상적인 B-세포 분화에 요구된다(문헌[Carter, R.H., et al., Immunol. Res. 26 (2002) 45-54]). CD19에 대한 항체는 다수의 임상 시험에 사용되었다(예를 들어 문헌[Hekman, A., et al., Cancer Immunol. Immunother. 32 (191) 364-372]; 문헌[Vlasfeld, L.T., et al., Cancer Immunol. Immunother. 40 (1995) 37-47]; 문헌[Conry, R.M., et al., J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 18 (1995) 231-241]; 문헌[Manzke, O., et al., Int. J. Cancer 91 (2001) 516-522]을 참조하시오).

CD19에 대한 항체는 예를 들어 WO 2004/106381, WO 2005/012493, WO 2006/089133, WO 2007/002223, WO 2006/133450, WO 2006/121852, WO 2003/048209, 미국특허 제 7,109,304 호, US 2006/0233791, US 2006/0280738, US 2006/0263357, US 2006/0257398, EP 1648512, EP 1629012, US 2008/0138336, WO 2008/022152 및 문헌[Bruenke, J., et al., Br. J. Hematol. 130 (2005) 218-228]; 문헌[Vallera, D.A., et al., Cancer Biother. Radiopharm. 19 (2004) 11-23]; 문헌[Ghetie, M.A., et al., Blood 104 (2004) 178-183]; 문헌[Lang, P., et al., Blood 103 (2004) 3982-3985]; 문헌[Loeffler, A., et al., Blood 95 (2000) 2098-2103]; 문헌[Le Gall, F., et al., FEBS Lett. 453 (1999) 164-168]; 문헌[Li, Q., et al., Cancer Immunol. Immunother. 47 (1998) 121-130]; 문헌[Eberl, G., et al., Clin. Exp. Immunol. 114 (1998) 173-178]; 문헌[Pietersz, G.A., et al., Cancer Immunol. Immunother. 41 (1995) 53-60]; 문헌[Myers, D.E., et al., Leuk. Lymphoma. 18 (1995) 93-102]; 문헌[Bejcek, B.E., et al., Cancer Res. 55 (1995) 2346-2351]; 문헌[Hagen, I.A., et al, Blood 85 (1995) 3208-3212]; 문헌[Vlasfeld, L.T., et al., Cancer Immunol. Immunother. 40 (1995) 37-47]; 문헌[Rhodes, E.G. et al., Bone Marrow Transplant. 10 (1992) 485-489]; 문헌[Zola, H., et al., Immunol. Cell Biol. 69 (1991) 411-422]; 문헌[Watanabe, M., et al., Cancer Res. 50 (1990) 3245-3248]; 문헌[Uckun, F.M., et al., Blood 71 (1988) 13-29]; 문헌[Pezzutto, A., et al.; J Immunol. 138 (1987) 2793-2799]에 언급되어 있다. 단클론 항체 SJ25-C1을 상업적으로 입수할 수 있다(제품 번호 4737, 시그마 알드리치 캄파니(Sigma-Aldrich Co.) USA, 서열번호 21 내지 24). FcγRIIIA에 대해 증가된 친화성을 갖는 항체들이 WO 2008/022152에 언급되어 있다.

CD19에 대한 항체는 B-세포 활성화에 대해 억제 또는 자극 효과를 가질 수 있다. 미토젠-자극된 B-세포에의 CD19 항체의 결합은 Ca2+의 후속적인 상승을 억제하며 생성되는 상기 세포의 활성화 및 증식 및 B-세포 증식 및 분화는, 사용되는 분열촉진 자극 및 상기 항체에 의한 가교결합 정도에 따라 CD19 항체에 의해 억제되거나 증대될 수 있다.

WO 2004/106381에서 B-세포 관련된 질환의 치료를 위한 이중특이성 항-CD3, 항-CD19 항체 구조물을 포함하는 약학 조성물을 보고한다. 항-CD19 항체가 WO 2005/012493에 보고되어 있다. WO 2006/089133에서 항-CD19 항체 및 종양학에서의 용도를 보고한다. 항-CD19 항체 및 그의 용도가 WO 2007/002223에 보고되어 있다. WO 2006/133450에서 이식에 대한 항-CD19 항체 요법을 보고한다.

WO 2011/147834에서 CD19에 대한 항체 및 그의 용도를 보고한다.

본 명세서에서 자가면역 질병, 류머티스성 관절염, 루푸스, 건선, 또는 골 질병의 치료 또는 종양 치료를 위한 치료제로서 유용한 (인간) CD19에 대한 항체를 제공한다.

본 발명은 부분적으로, 인간화된 항-인간 CD19 항체 중의 다수의 탈아미드화 핫스폿을 제거하는데 단일 돌연변이면 충분하다는 발견을 근거로 한다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 항체는 B-세포의 병적인 증가와 관련된 질병을 앓고 있는 환자에게 이점을 유발하는 성질들을 갖는다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 항체이며, 여기에서 상기 항체는

(a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,

(b) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,

(c) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,

(d) 서열번호 20 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,

(e) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및

(f) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3

을 포함한다.

하나의 실시태양에서 상기 항체는 단클론 항체이다.

하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간, 인간화된 또는 키메릭 항체이다.

하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 항체 단편이다.

하나의 실시태양에서 상기 항체는

(a) 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 VH 서열 및 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 VL 서열, 또는

(b) 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 VH 서열 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 VL 서열, 또는

(c) (a) 또는 (b)에서와 같은 VH 서열 및 VL 서열

을 포함한다.

하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간 CD19 및 제2의 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체이다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 제형이다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 B-세포암의 치료를 위한 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체이다. 하나의 실시태양에서 상기 B-세포암은 CLL, NHL 및 DLBCL로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 약제로서 사용하기 위한 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체이다.

하나의 실시태양에서 상기 약제는 B-세포암, 염증 질병, 자가면역 질병, 류머티스성 관절염, 루푸스, 건선 또는 골 질병의 치료를 위한 것이다. 하나의 실시태양에서 상기 약제는 B-세포의 고갈을 위한 것이다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 B-세포암, 염증 질병, 자가면역 질병, 류머티스성 관절염, 루푸스, 건선 또는 골 질병의 치료에 사용하기 위한 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체이다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 B-세포 고갈에 사용하기 위한 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체이다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 약제의 제조에서 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체의 용도이다. 하나의 실시태양에서 상기 약제는 B-세포암, 염증 질병, 자가면역 질병, 류머티스성 관절염, 루푸스, 건선 또는 골 질병의 치료를 위한 것이다. 하나의 실시태양에서 상기 약제는 B-세포의 고갈을 위한 것이다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 B-세포암을 갖는 개체에게 유효량의 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체를 투여함을 포함하는 상기 개체의 치료 방법이다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 개체에게 유효량의 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체를 투여함을 포함하는 상기 개체에서 B-세포를 고갈시키는 방법이다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체를 포함하는 질병 치료용 약제의 제조 방법이다. 하나의 실시태양에서 상기 질병은 B-세포암, 염증 질병, 자가면역 질병, 류머티스성 관절염, 루푸스, 건선 또는 골 질병이다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체를 암호화하는 단리된 핵산이다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 본 명세서에 보고된 바와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포이다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 항체가 생성되도록 상기 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 상기 세포 또는 배양 배지로부터 상기 항체를 회수하고 상기 항체를 정제시킴을 포함하는 항체의 생성 방법이다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체이다.

I. 정의

본 발명의 목적을 위한 "수용체 인간 프레임워크"는 하기에 정의되는 바와 같은, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로 부터 유래된" 수용체 인간 프레임워크는 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 아미노산 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. 일부 실시태양에서, 상기 VL 수용체 인간 프레임워크는 상기 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서일이 일치한다.

"친화성"은 분자(예를 들어 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합짝(예를 들어 항원)간의 비-공유 상호작용들의 총 합의 강도를 지칭한다. 달리 가리키지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "결합 친화성"은 결합쌍(예를 들어 항체 및 항원)의 구성원들간의 1:1 상호작용을 반영하는 본래의 결합 친화성을 지칭한다. 분자 X의 그의 짝 Y에 대한 친화성을 일반적으로 해리 상수(k_d)로 나타낼 수 있다. 친화성을 본 명세서에 기재된 것들을 포함하여 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정할 수 있다.

"친화성 성숙된" 항체는 하나 이상의 고가변 영역(HVR) 중에 하나 이상의 변경을 갖지 않는 모 항체에 비해, 상기 변경을 갖는 항체를 지칭하며, 상기와 같은 변경은 항원에 대한 항체의 친화성을 개선시킨다.

"항-CD19 항체" 및 "인간 CD19에 특이적으로 결합하는 항체"란 용어는 상기 항체가 인간 CD19를 표적화하는 진단제 및/또는 치료제로서 유용하기에 충분한 친화성으로 인간 CD19에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 관련되지 않은 비-CD19 단백질에의 항-인간 CD19 항체의 결합 정도는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같은 인간 CD19에 대한 상기 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 몇몇 실시태양에서, 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 항체는 10^-8 M 이하의 해리 상수(K_D)를 갖는다.

본 명세서에서 "항체"란 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며 다양한 항체 구조물들, 예를 들어 비제한적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이성 항체(예를 들어 이중특이성 항체), 및 항체 단편(목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한)을 포함한다.

"항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)"이란 용어는 Fc 수용체 결합에 의해 매개되는 기능이며 효과기 세포의 존재하에서 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체에 의한 표적 세포의 용해를 지칭한다. ADCC는 하나의 실시태양에서 효과기 세포, 예를 들어 새로 단리된 PBMC(말초 혈액 단핵세포) 또는 단핵세포 또는 NK(자연 살해) 세포와 같은 버피 코트로부터 정제된 효과기 세포의 존재하에서 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체에 의한, 적혈구 세포(예를 들어 재조합 인간 CD19를 발현하는 K562 세포)를 발현하는 CD19 제제의 처리에 의해 측정된다. 표적 세포를 ⁵¹Cr로 표지하고 후속으로 상기 항체와 배양시킨다. 상기 표지된 세포를 효과기 세포와 배양하고 상등액을 방출된 ⁵¹Cr에 대해 분석한다. 대조용은 표적 내피 세포와 효과기 세포와의 배양(그러나 항체 없이)을 포함한다. ADCC를 매개하는 초기 단계를 유도하는 상기 항체의 능력을, Fcγ 수용체 발현 세포, 예를 들어 FcγRI 및/또는 FcγRIIA 또는 NK 세포(필수적으로 FcγRIIIA를 발현한다)를 재조합적으로 발현하는 세포에의 상기 항체의 결합을 측정함으로써 조사한다. 하나의 바람직한 실시태양에서 NK 세포상의 FcγR에의 결합을 측정한다.

"항체 단편"은 완전 항체가 결합하는 항원에 결합하는 상기 완전 항체의 일부를 포함하는 상기 완전 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; 다이아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들어 scFv); 및 항체 단편으로부터 형성되는 다중특이성 항체를 포함한다.

"키메릭" 항체란 용어는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 출처 또는 종으로부터 유래하는 반면 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 출처 또는 종으로부터 유래하는 항체를 지칭한다.

항체의 "부류"는 상기 항체의 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5개의 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 다수는 하위부류(아이소타입)들, 예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂로 추가로 세분될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류들에 상응하는 중쇄 불변 도메인을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "세포독성제"란 용어는 세포 기능을 억제하거나 방지하고/하거나 세포사 또는 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 세포독성제는 비제한적으로 방사성 동위원소(예를 들어 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물(예를 들어 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제); 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예를 들어 핵산분해 효소; 항생제; 독소, 예를 들어 소분자 독소 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 및 이들의 단편 및/또는 변이체; 및 하기에 개시하는 다양한 항종양 또는 항암제를 포함한다.

"보체-의존성 세포독성(CDC)"이란 용어는 보체의 존재하에서 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체에 의해 유도되는 세포의 용해를 지칭한다. CDC를 하나의 실시태양에서, 보체의 존재하에서 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체에 의한, 인간 내피 세포를 발현하는 CD19의 처리에 의해 측정한다. 상기 세포를 하나의 실시태양에서 칼세인으로 표지한다. CDC는 상기 항체가 30 ㎍/㎖의 농도로 표적 세포의 20% 이상의 용해를 유도하는 경우 발견된다. 보체 인자 C1q에의 결합을 ELISA에서 측정할 수 있다. 상기와 같은 분석에서 원칙적으로 ELISA 플레이트를 일련의 농도 범위의 항체로 코팅하고, 여기에 정제된 인간 C1q 또는 인간 혈청을 가한다. C1q 결합을 C1q에 대한 항체에 이어서 페록시다제-표지된 접합체에 의해 검출한다. 결합(최대 결합 B_max)의 검출을, 페록시다제 기질 ABTS(등록상표)(2,2'-아지노-다이-[3-에틸벤즈티아졸린-6-설포네이트(6)])에 대한 405 ㎚에서의 광학 밀도(OD405)로서 측정한다.

"효과기 기능"은 항체의 Fc-영역에 기인할 수 있는 생물 활성들을 지칭하며, 상기 활성들은 상기 항체 부류에 따라 변한다. 항체 효과기 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.

Fc 수용체 결합 의존성 효과기 기능은 항체의 Fc-영역과 Fc 수용체(FcR)(상기는 조혈 세포상의 분화된 세포 표면 수용체이다)와의 상호작용에 의해 매개될 수 있다. Fc 수용체는 면역글로불린 상과에 속하며, 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)을 통해, 면역 복합체의 식작용에 의한 항체-코팅된 병원체의 제거, 및 상응하는 항체로 코팅된 적혈구 및 다양한 다른 세포 표적(예를 들어 종양 세포)의 용해를 모두 매개하는 것으로 입증되었다(예를 들어 문헌[Van de Winkel, J.G. and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524]을 참조하시오). FcR은 면역글로불린 아이소타입에 대한 그의 특이성에 의해 한정된다: IgG 항체에 대한 Fc 수용체를 FcγR이라 칭한다. Fc 수용체 결합이 예를 들어 문헌[Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492]; 문헌[Capel, P.J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34]; 문헌[de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341]; 및 문헌[Gessner, J.E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248]에 기재되어 있다.

IgG 항체의 Fc-영역에 대한 수용체(FcγR)의 가교결합은 식작용, 항체-의존성 세포 세포독성, 및 염증 매개체의 방출뿐만 아니라 면역 복합체 제거 및 항체 생산의 조절을 포함한 광범위하게 다양한 효과기 기능을 촉발시킨다. 인간에서, FcγR의 3가지 부류가 특성화되었으며, 이들은 하기와 같다:

- FcγRI(CD64)는 높은 친화성으로 단량체성 IgG와 결합하며 대식세포, 단핵세포, 호중구 및 호산구상에서 발현된다. 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327 및 P329(카밧의 EU 지수에 따른 넘버링) 중 적어도 하나에서 Fc-영역 IgG의 변형은 FcγRI에의 결합을 감소시킨다. 233 내지 236번 위치의 IgG2 잔기는 IgG1 및 IgG4로 치환되고 FcγRI에의 결합을 10³배 까지 감소시키며 항체-감작된 적혈구에 대한 인간 단핵세포 응답을 제거하였다(문헌[Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624]).

- FcγRII(CD32)는 복합체화된 IgG와 중간 내지 낮은 친화성으로 결합하며 광범위하게 발현된다. 상기 수용체를 2개의 하위-유형, FcγRIIA 및 FcγRIIB로 나눌 수 있다. FcγRIIA는 살해와 관련된 다수의 세포들(예를 들어 대식세포, 단핵세포, 호중구)상에서 발견되며 살해 과정을 활성화시킬 수 있는 것으로 보인다. FcγRIIB는 억제 과정에 한 역할을 하는 것으로 보이며, B-세포, 대식세포 및 비만세포 및 호산구상에서 발견된다. B-세포상에서 상기는 추가의 면역글로불린 생산 및 예를 들어 IgE 부류로의 아이소타입 전환을 억제하는 기능을 하는 것으로 보인다. 대식세포상에서, FcγRIIB는 FcγRIIA를 통해 매개되는 바와 같이 식작용을 억제하는 작용을 한다. 호산구 및 비만세포상에서 B-형태는 그의 별도의 수용체에의 IgE 결합을 통해 이들 세포의 활성화를 억제하는 것을 도울 수 있다. FcγRIIA에 대해 감소된 결합은 예를 들어 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292, 및 K414(카밧의 EU 지수에 따른 넘버링) 중 적어도 하나에서 돌연변이를 갖는 IgG Fc-영역을 포함하는 항체들에 대해서 발견된다.

- FcγRIII(CD16)는 IgG와 중간 내지 낮은 친화성으로 결합하며 2개의 유형으로서 존재한다. FcγRIIIA는 NK 세포, 대식세포, 호산구 및 일부 단핵세포 및 T 세포상에서 발견되며 ADCC를 매개한다. FcγRIIIB는 호중구상에서 고도로 발현된다. FcγRIIIA에 대해 감소된 결합은 예를 들어 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 및 D376(카밧의 EU 지수에 따른 넘버링) 중 적어도 하나에서 돌연변이를 갖는 IgG Fc-영역을 포함하는 항체들에 대해서 발견된다.

Fc 수용체에 대한 인간 IgG1상의 결합 부위의 맵핑, 상기 언급한 돌연변이 부위 및 FcγRI 및 FcγRIIA의 결합의 측정 방법은 문헌[Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604]에 기재되어 있다.

작용제, 예를 들어 약학 제형의 "유효량"은 목적하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 성취하기에 필요한 투여량에서 및 상기에 필요한 기간 동안 상기 성취에 유효한 양을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "Fc 수용체"란 용어는 상기 수용체와 관련된 세포질 ITAM 서열의 존재를 특징으로 하는 활성화 수용체를 지칭한다(예를 들어 문헌[Ravetch, J.V. and Bolland, S., Annu. Rev. Immunol. 19 (2001) 275-290]을 참조하시오). 상기와 같은 수용체는 FcγRI, FcγRIIA 및 FcγRIIIA이다. "FcγR의 결합이 없음"이란 용어는 10 ㎍/㎖의 항체 농도에서 NK 세포에 대한 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체의 결합이 WO 2006/029879에 보고된 바와 같은 항-OX40L 항체 LC.001에 대해 발견되는 결합의 10% 이하임을 나타낸다.

IgG4는 감소된 FcR 결합을 나타내지만, 다른 IgG 하위부류의 항체들은 강한 결합을 나타낸다. 그러나, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297(Fc 탄수화물 상실), Pro329 및 234, 235, 236 및 237 Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434, 및 His435는, 변경되는 경우 또한 감소된 FcR 결합을 제공하는 잔기들이다(문헌[Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604]; 문헌[Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119]; 문헌[Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324]; 및 EP 0 307 434). 하나의 실시태양에서 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체는 IgG1 또는 IgG2 하위부류의 것이며 돌연변이 PVA236, GLPSS331, 및/또는 L234A/L235A를 포함한다. 하나의 실시태양에서 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체는 IgG4 하위부류의 것이며 돌연변이 L235E를 포함한다. 하나의 실시태양에서 상기 항체는 돌연변이 S228P를 추가로 포함한다.

본 명세서에서 "Fc-영역"이란 용어는 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 한정하는데 사용된다. 상기 용어는 고유 서열 Fc-영역 및 변형 Fc-영역을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 상기 중쇄의 카복시-말단까지 연장된다. 그러나, 상기 Fc-영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재할 수도, 존재하지 않을 수도 있다. 본 명세서에서 달리 명시되지 않는 한, 상기 Fc-영역 또는 불변 영역 중 아미노산 잔기들의 넘버링은 문헌[Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242]에 개시된 바와 같은 EU 넘버링 시스템(또한 EU 지수라 칭함)에 따른다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 항체는 Fc-영역으로서, 하나의 실시태양에서 인간 기원으로부터 유래된 Fc-영역을 포함한다. 하나의 실시태양에서 상기 Fc-영역은 인간 불변 영역의 모든 부분을 포함한다. 항체의 Fc-영역은 보체 활성화, C1q 결합, C3 활성화 및 Fc 수용체 결합에 직접적으로 관련된다. 상기 보체 시스템에 대한 항체의 영향은 몇몇 조건에 따라 변하지만, C1q에의 결합은 Fc-영역 중의 한정된 결합 부위들에 의해 야기된다. 상기와 같은 결합 부위는 최신으로 공지되어 있으며 예를 들어 문헌[Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560]; 문헌[Brunhouse, R., and Cebra, J. J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917]; 문헌[Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344]; 문헌[Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004]; 문헌[Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184]; 문헌[Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168]; 문헌[Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324]; 및 EP 0 307 434에 기재되어 있다. 상기와 같은 결합 부위는 예를 들어 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329(카밧의 EU 지수에 따른 넘버링; 본 명세서에 달리 명시되지 않는 한, 상기 Fc-영역 또는 불변 영역 중의 아미노산 잔기들의 넘버링은 문헌[Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242]에 기재된 바와 같은 EU 넘버링 시스템(또한 EU 지수라 칭한다)에 따른다)이다. 하위부류 IgG1, IgG2 및 IgG3의 항체들은 대개 보체 활성화, C1q 결합 및 C3 활성화를 나타내는 반면, IgG4는 상기 보체 시스템을 활성화하지 않고, C1q에 결합하지 않으며 C3을 활성화하지 않는다. "항체의 Fc-영역"은 숙련가에게 주지된 용어이며 항체의 파파인 절단을 기준으로 한정된다. 하나의 실시태양에서 상기 Fc-영역은 인간 Fc-영역이다. 하나의 실시태양에서 상기 Fc-영역은 돌연변이 S228P 및/또는 L235E(카밧의 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함하는 인간 IgG4 하위부류의 것이다. 하나의 실시태양에서 상기 Fc-영역은 돌연변이 L234A 및 L235A(카밧의 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함하는 인간 IgG1 하위부류의 것이다.

"프레임워크" 또는 "FR"은 고가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인, 즉 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 상응하게, 상기 HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기의 순서로 존재한다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

"전장 항체", "완전 항체" 및 "전체 항체"란 용어들은 본 발명에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 Fc-영역을 함유하는 중쇄를 갖거나 또는 고유 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭하는데 호환적으로 사용된다.

"숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"이란 용어는 호환적으로 사용되며 상기와 같은 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이들은 계대의 수와 상관 없이 1차 형질전환된 세포 및 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일할 필요는 없으며, 돌연변이를 함유할 수도 있다. 원래 형질전환된 세포에 대해 선별되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손은 본 발명에 포함된다.

"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택시 가장 통상적으로 존재하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위그룹으로부터이다. 일반적으로, 상기 서열의 하위그룹은 문헌[Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3]에서와 같은 하위그룹이다. 하나의 실시태양에서, VL의 경우, 상기 하위 그룹은 상기 문헌[Kabat et al.,]에서와 같은 하위그룹 카파 I이다. 하나의 실시태양에서, VH의 경우, 상기 하위 그룹은 상기 문헌[Kabat et al.,]에서와 같은 하위그룹 III이다.

"인간화된" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메릭 항체를 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기에서 상기 HVR(예를 들어 CDR)의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 항체의 것들에 상응하며, 상기 FR의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화된 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "고가변 영역" 또는 "HVR"이란 용어는 서열이 고가변성("상보성 결정 영역" 또는 "CDR")이고/이거나 구조적으로 한정된 고리("고가변 고리")를 형성하고/하거나, 항원-접촉 잔기("항원 접촉부")를 함유하는 아미노산 잔기 신장부를 포함하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역들을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH 중 3개(H1, H2, H3) 및 VL 중 3개(L1, L2, L3)를 포함한다.

HVR은 하기를 포함한다:

(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에 존재하는 고가변 고리들(문헌[Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917]);

(b) 아미노산 잔기 24-34 ( L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3)에 존재하는 CDR(문헌[Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242]);

(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3)에 존재하는 항원 접촉부(문헌[MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)]); 및

(d) (a), (b) 및/또는 (c)의 조합, 예를 들어 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 및 94-102 (H3).

달리 가리키지 않는 한, 가변 도메인 중의 HVR 잔기 및 다른 잔기(예를 들어 FR 잔기)를 본 명세서에서 상기 카밧(Kabat) 등에 따라 넘버링한다.

"면역접합체"는 비제한적으로 세포독성제를 포함하여, 하나 이상의 이종 분자(들), 예를 들어 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈에 접합된 항체이다.

"개체" 또는 "피실험자"는 포유동물이다. 포유동물은 비제한적으로 가축(예를 들어 소, 양, 개, 고양이 및 말), 영장류(예를 들어 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 개체 또는 피실험자는 인간이다.

"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 실시태양에서, 항체를 예를 들어 전기영동(예를 들어 SDS-PAGE, 등전점 전기영동(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정되는 바와 같이 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제시킨다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 리뷰를 위해서, 예를 들어 문헌[Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848(2007) 79-87]을 참조하시오.

"단리된" 핵산은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은, 통상적으로 핵산 분자를 함유하지만 상기 핵산 분자가 염색체외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재하는 세포 중에 함유된 핵산 분자를 포함한다.

"항-인간 CD19 항체를 암호화하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자(또는 그의 단편), 예를 들어 단일 벡터 또는 별도의 벡터 중의 상기와 같은 핵산 분자(들)를 지칭하며, 상기와 같은 핵산 분자(들)는 숙주 세포 중의 하나 이상의 위치에 존재한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "단클론 항체"란 용어는 실질적으로 동종인 항체들의 집단으로부터 획득되는 항체를 지칭한다, 즉 상기 집단을 포함하는 개별적인 항체들은 동일하고/하거나, 상기 단클론 항체의 생성 중 발생할 수 있는 가능한 변이체(상기와 같은 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다)를 제외하고 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 상기 항원상의 단일 결정인자에 대한 것이다. 따라서, "단클론"이라는 수식어구는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 획득된다는 항체의 특징을 가리키며, 임의의 특정한 방법에 의한 상기 항체의 생성을 요구하는 것으로서 해석해서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체를 다양한 기법들, 예를 들어 비제한적으로 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 상기 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 부분을 함유하는 트랜스제닉 동물을 사용하는 방법에 의해 제조할 수 있으며, 상기와 같은 방법 및 단클론 항체의 다른 예시적인 제조 방법들은 본 명세서에 개시되어 있다.

"네이키드 항체"는 이종 부분(예를 들어 세포독성 부분) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 상기 네이키드 항체는 약학 제형 중에 존재할 수 있다.

"고유 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어 고유 IgG 항체는 다이설파이드-결합되는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. N-에서부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 영역(VH)(또한 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라 칭한다)에 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 가지며, 이때 상기 첫 번째와 두 번째 불변 도메인 사이에 힌지 영역이 위치한다. 유사하게, N-에서부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 영역(VL)(또한 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라 칭한다)에 이어서 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄를 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 근거로, 카파(κ) 및 람다(λ)라 칭하는 2가지 유형 중 하나로 지정할 수 있다.

"패키지 삽입물"이란 용어는 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 용량, 투여, 복합 요법, 금기 및/또는 경고에 관한 정보를 함유하는 상기 치료 제품의 상업적인 패키지 중에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하는데 사용된다.

기준 폴리펩타이드 서열에 관한 "아미노산 서열 일치성 퍼센트(%)"는, 필요한 경우 최대의 서열 일치성 퍼센트를 성취하기 위해서, 및 상기 서열 일치성의 부분으로서 어떠한 보존적인 치환도 고려하지 않고, 서열과 도입 틈을 정렬시킨 후에, 기준 폴리펩타이드 서열 중의 아미노산 잔기들과 일치하는 후보 서열 중의 아미노산 잔기들의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 일치성 퍼센트를 측정하기 위한 정렬은 당해 분야의 기술 내에 있는 다양한 방식들로, 예를 들어 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALGN 또는 메그얼라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 성취될 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 서열들을 정렬시키기에 적합한 매개변수들, 예를 들어 비교하는 서열들의 전체길이에 대해 최대의 정렬을 성취하기 위해 필요한 임의의 연산을 결정할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적을 위해서, 아미노산 서열 일치성%를 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성시킨다. 상기 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 저술되었으며, 소스 암호는 미국 저작권 관청(미국 워싱톤 D.C. 20559 소재)에 사용자 문서와 함께 제출되었다(이때 상기 코드는 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다). 상기 ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 제넨테크 인코포레이티드로부터 공개적으로 입수할 수 있거나, 또는 상기 소스 암호로부터 편집될 수 있다. 상기 ALIGN-2 프로그램을, 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여, UNIX 실행 시스템상에서 사용하기 위해 편집해야 한다. 모든 서열 비교 매개변수들은 상기 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다.

ALIGN-2를 아미노산 서열 비교를 위해 사용하는 경우에, 주어진 아미노산 서열 A의 주어진 아미노산 서열 B에의, 상기 B와의, 또는 상기 B에 대한 아미노산 서열 일치성%(이는 한편으로 주어진 아미노산 서열 B에, 상기 B와, 또는 상기 B에 대해 일정한 아미노산 서열 일치성%를 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)를 하기와 같이 계산한다:

100 x X/Y 분수

상기에서, X는 A 및 B의 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2의 정렬에서 상기 프로그램에 의해 일치성 합치로서 채점되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B 중 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A 대 B의 아미노산 서열 일치성%는 B 대 A의 아미노산 서열 일치성%와 동일하지 않음을 알 것이다. 달리 구체적으로 서술되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 아미노산 서열 일치성% 값들은 상기 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞의 단락에 개시된 바와 같이 획득된다.

"약학 제형"이란 용어는 제형 중에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태로 존재하고 상기 제형이 투여되는 환자에게 허용 가능하지 않게 독성인 추가적인 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.

"약학적으로 허용 가능한 담체"는 환자에게 무독성인, 활성 성분 이외의 약학 제형 중의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 비제한적으로 완충제, 부형제, 안정제, 또는 보존제를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "CD19"란 용어는 인간 B-림프구 항원 CD19(또 다른 명칭(들)은 분화 항원 CD19, B-림프구 표면 항원 B4, T-세포 표면 항원 Leu-12; UniProtKB P15391-1(동형 1; 서열번호 33) 및 P15391-2(동형 2; 서열번호 34)이다)를 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 인간 CD19뿐만 아니라, 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체가 결합되는 한, 세포에서의 가공으로부터 생성되는 임의의 형태의 인간 CD19를 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "치료"(및 "치료하다" 및 "치료하는"과 같은 그의 문법상 어미변화)는 치료 중인 개체의 자연적인 과정을 변경시키고자 하는 임상적 중재를 지칭하며, 예방을 위해서 또는 임상적 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 비제한적으로 질병의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 상기 질병의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질병 진행속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체를 사용하여 질병의 발생을 지연시키거나 또는 질병의 진행을 늦춘다.

"가변 영역" 또는 "가변 도메인"이란 용어는 항원에 대한 항체의 결합과 관련된 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 고유 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조들을 가지며, 이때 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 고가변 영역(HVR)을 포함한다(예를 들어 문헌[Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91]을 참조하시오). 단일의 VH 또는 VL 도메인이면 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 더욱 또한, 특정 항원에 결합하는 항체를, 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 선별하기 위해 상기 항원에 결합하는 상기 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리시킬 수 있다(예를 들어 문헌[Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887]; 문헌[Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628]을 참조하시오).

본 명세서에 사용된 바와 같은 "벡터"란 용어는 결합된 또 다른 핵산을 전파할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조물로서 벡터뿐만 아니라 상기 벡터가 도입된 숙주 세포의 게놈내에 통합된 벡터를 포함한다. 몇몇 벡터는 상기 벡터가 작동적으로 연결되는 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 상기와 같은 벡터를 본 명세서에서 "발현 벡터"라 칭한다.

II. 조성물 및 방법

하나의 태양에서, 본 발명은 부분적으로, 인간화된 항-인간 CD19 항체 중의 다수의 탈아미드화 핫스폿을 제거하는데 단일 돌연변이면 충분하다는 발견을 근거로 한다. 몇몇 실시태양에서, 인간 CD19에 결합하는 항체를 제공한다. 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체는 예를 들어 진단 또는 치료에 유용하다.

A. 예시적인 항-인간 CD19 항체

야생형 인간화된 항-인간 CD19 항체는 HVR-L1 중에 3개의 탈아미드화 핫스폿을 갖는 것으로 밝혀졌다: N S N G N T(서열번호 36). 또한 HVR-H2 중에 추가의 탈아미드화 핫스폿이 존재하는 것으로 밝혀졌다: KF N G(서열번호 37).

하나의 태양에서, 본 명세서에 인간 CD19에 특이적으로 결합하고 다른 인간화된 변이체에 비해 개선된 안정성, 특히 중쇄 및 경쇄 HVR인 HVR-H2 및 HVR-L1에서 탈아미드화 안정성을 갖는 단리된 인간화된 항체를 제공한다. 상기 개선된 인간화된 항-인간 CD19 항체에서 모 마우스 항체의 인간/시노몰구스 교차-반응성은 유지된다.

상기 HVR-H2 중의 탈아미드화 핫스폿을 어드레스하기 위해서 64번 위치(카밧에 따른 넘버링)에 N(Asn)에서 Q(Gln)로의 점 돌연변이를 도입시켰다. 따라서, 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체는 아미노산 서열 TEKFQG(서열번호 38)를 포함하는 HVR-H2를 갖는다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 인간화된 항-인간 CD19 항체는 아미노산 서열 YINPYNDGSK YTEKFQG(서열번호 11)를 갖는 HVR-H2를 포함한다.

경쇄 중의 탈아미드화 핫스폿을 어드레스하고 개선된 탈아미드화 안정성을 갖는 인간화된 항-인간 CD19 항체를 수득하기 위해서 카밧 위치 27d, 27e, 28 및 29에 개별적인 돌연변이 및 27e 및 28(카밧에 따른 넘버링)번 위치에 이중 돌연변이를 도입시켰다. 야생형 인간화된 항체(var.0; 서열번호 59 및 69)의 총 9개의 변이체(var.1 내지 var.9; 서열번호 60 내지 68 및 70)가 생성되었다.

카밧 2222 카밧 6

위치 7789 위치 4

LC: de HC:

var.0:wt QSLENSNGNTYL TEKFNGKATL

var.1:N27dH QSLEHSNGNTYL TEKFQGRVTM

var.2:N27dQ QSLEQSNGNTYL TEKFQGRVTM

var.3:S27eA QSLENANGNTYL TEKFQGRVTM

var.4:S27eV QSLENVNGNTYL TEKFQGRVTM

var.5:S27eP QSLENPNGNTYL TEKFQGRVTM

var.6:N28Q QSLENSQGNTYL TEKFQGRVTM

var.7:G29A QSLENSNANTYL TEKFQGRVTM

var.8:G29V QSLENSNVNTYL TEKFQGRVTM

var.9:S27eP/N28S QSLENPSGNTYL

카밧에 따른 27e 위치에서 S(세린)에서 P(프롤린)으로의 단일 돌연변이와 함께 HVR-L1 중의 모든 탈아미드화 핫스폿들을 어드레스할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이는 탈아미드화 용이한 N(아스파라진) 잔기가 아니라 이웃하는 잔기의 돌연변이이다.

따라서, 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체는 아미노산 서열 LENPNGNT(서열번호 39)를 포함하는 HVR-L1을 갖는다. 하나의 실시태양에서 상기 인간화된 항-인간 CD19 항체는 아미노산 서열 LENPSGNT(서열번호 40)를 갖는 HVR-L1을 포함한다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 인간화된 항-인간 CD19 항체는 아미노산 서열 RSSQSLENPN GNTYLN(서열번호 20)을 갖는 HVR-L1을 포함한다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 인간화된 항-인간 CD19 항체는 아미노산 서열 RSSQSLENPS GNTYLN(서열번호 28)을 갖는 HVR-L1을 포함한다.

추가로 이들 항체는 하기 표에 나타낸 바와 같이 시노몰구스 CD19에 대한 교차-반응성을 유지한다.

따라서, 하나의 실시태양에서 상기 항-인간 CD19 항체는 인간 CD19 및 시노몰구스 CD19에 특이적으로 결합한다.

야생형 인간화된 항-인간 CD19 항체(var.0)는 정제 후에 대략 7.5% 탈아미드화를 나타낸다. pH 7.4에서 2주 동안 보관 후에 탈아미드화된 항체의 양은 대략 18.5%까지 증가한다. S27eP 돌연변이를 갖는 변형 항체(var.5)는 정제 후 대략 2% 탈아미드화 및 2% 숙신이미드 형성을 나타낸다. pH 7.4에서 2주 동안 보관하는 동안 단지 약 7.5%의 탈아미드화된 항체가 존재한다.

하나의 태양에서, 본 명세서에 서열번호 11의 HVR-H2 및 서열번호 20 또는 28의 HVR-L1을 포함하는 인간 CD19 및 시노몰구스 CD19에 특이적으로 결합하는 단리된 인간화된 항체를 제공한다.

하나의 태양에서, 본 명세서에 (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (c) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-인간 CD19 항체를 제공한다.

하나의 태양에서, 본 명세서에 (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (c) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-인간 CD19 항체를 제공한다.

하나의 태양에서, 본 명세서에 (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 중에서 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 3개의 VH HVR 서열 모두를 포함하는 항-인간 CD19 항체를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 항체는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.

또 다른 태양에서, 본 명세서에 (a) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 3개의 VL HVR 서열 모두를 포함하는 항체를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 항체는 (a) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.

또 다른 태양에서, 본 명세서에 (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 3개의 VL HVR 서열 모두를 포함하는 항체를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 항체는 (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.

또 다른 태양에서, 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체는 (a) (i) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 중에서 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 3개의 VH HVR 서열 모두를 포함하는 VH 도메인, 및 (b) (i) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 3개의 VL HVR 서열 모두를 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

또 다른 태양에서, 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체는 (a) (i) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 중에서 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 3개의 VH HVR 서열 모두를 포함하는 VH 도메인, 및 (b) (i) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택된 적어도 하나, 적어도 둘 또는 3개의 VL HVR 서열 모두를 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

또 다른 태양에서, 본 명세서에 (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (c) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 명세서에 (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (c) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 항-인간 CD19 항체는 인간화된 항체이다. 하나의 실시태양에서, 상기 인간화된 항-인간 CD19 항체는 상기 실시태양들 중 어느 하나에서와 같은 HVR을 포함하며, 수용체 인간 프레임워크, 예를 들어 인간 면역글로불린(생식세포계열) 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 추가로 포함한다.

또 다른 태양에서, 항-인간 CD19 항체는 서열번호 9의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-인간 CD19 항체는 인간 CD19에 결합하는 능력을 유지한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 9에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실은 상기 HVR 밖의(즉 FR 중의) 영역에서 발생한다. 임의로, 상기 항-인간 CD19 항체는 서열번호 9의 VH 서열을 포함하며, 상기 서열의 번역-후 변형을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 VH는 (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 중에서 선택된 하나, 둘 또는 3개의 HVR을 포함한다.

또 다른 태양에서, 항-인간 CD19 항체를 제공하며, 여기에서 상기 항체는 서열번호 19 또는 서열번호 27(서열번호 19 및 서열번호 27은 단일의 아미노산 위치에서 상이하다)의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-인간 CD19 항체는 인간 CD19에 결합하는 능력을 유지한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 19 또는 서열번호 27에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 상기 치환, 삽입 또는 결실은 상기 HVR 밖의(즉 FR 중의) 영역에서 발생한다. 임의로, 상기 항-인간 CD19 항체는 서열번호 19의 VL 서열을 포함하며, 상기 서열의 번역-후 변형을 포함한다. 임의로, 상기 항-인간 CD19 항체는 서열번호 27의 VL 서열을 포함하며, 상기 서열의 번역-후 변형을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 VL은 (a) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택된 하나, 둘 또는 3개의 HVR을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 VL은 (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택된 하나, 둘 또는 3개의 HVR을 포함한다.

또 다른 태양에서, 항-인간 CD19 항체를 제공하며, 여기에서 상기 항체는 상기에 제공된 실시태양들 중 어느 하나에서와 같은 VH, 및 상기 제공된 실시태양들 중 어느 하나에서와 같은 VL을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 항체는 각각 서열번호 9 및 서열번호 19 또는 27의 VH 및 VL 서열을 포함하며, 이들 서열의 번역-후 변형을 포함한다.

추가의 태양에서, 본 명세서에, 본 명세서에 보고된 바와 같은 항-인간 CD19 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 몇몇 실시태양에서, 서열번호 9의 VH 서열 및 서열번호 19의 VL 서열을 포함하는 항-인간 CD19 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.

하나의 실시태양에서, 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 항-인간 CD19 항체는 단클론 항체이다. 하나의 실시태양에서, 항-인간 CD19 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 다이아바디, 또는 F(ab')₂ 단편이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체는 전장 항체, 예를 들어 완전한 IgG1 또는 IgG4 항체 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 아이소타입이다.

모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는

i) 임의로 돌연변이 P329G, L234A 및 L235A를 갖는 인간 IgG1 하위부류의 동종이량체성 Fc-영역, 또는

ii) 임의로 돌연변이 P329G, S228P 및 L235E를 갖는 인간 IgG4 하위부류의 동종이량체성 Fc-영역, 또는

iii) 돌연변이(P329G, L234A, L235A) I253A, H310A, 및 H435A, 또는 돌연변이(P329G, L234A, L235A) H310A, H433A, 및 Y436A를 갖는 인간 IgG1 하위부류의 동종이량체성 Fc-영역, 또는

iv) a) 하나의 Fc-영역 폴리펩타이드가 돌연변이 T366W를 포함하고 다른 Fc-영역 폴리펩타이드는 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V를 포함하거나, 또는

b) 하나의 Fc-영역 폴리펩타이드가 돌연변이 T366W 및 Y349C를 포함하고 다른 Fc-영역 폴리펩타이드는 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 S354C를 포함하거나, 또는

c) 하나의 Fc-영역 폴리펩타이드가 돌연변이 T366W 및 S354C를 포함하고 다른 Fc-영역 폴리펩타이드는 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하는

이종이량체성 Fc-영역, 또는

v) 2개의 Fc-영역 폴리펩타이드가 모두 돌연변이 P329G, L234A 및 L235A를 포함하고,

a) 하나의 Fc-영역 폴리펩타이드가 돌연변이 T366W를 포함하고 다른 Fc-영역 폴리펩타이드는 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V를 포함하거나, 또는

인간 IgG1 하위부류의 이종이량체성 Fc-영역, 또는

vi) 2개의 Fc-영역 폴리펩타이드가 모두 돌연변이 P329G, S228P 및 L235E를 포함하고,

인간 IgG4 하위부류의 이종이량체성 Fc-영역, 또는

vii) iii) 중 하나와 vi), v) 및 vi) 중 하나와의 조합

을 포함한다(모든 위치는 카밧의 EU 지수를 따른다).

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은

a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제1 경쇄 및 제1 중쇄, 및

b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제2 경쇄 및 제2 중쇄

를 포함하고, 상기 제2 경쇄 및 제2 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체되는 2가의 이중특이성 항체이며,

여기에서 상기 제1 항원 또는 제2 항원은 인간 CD19이다.

상기 a) 하의 항체는 b) 하에서 보고된 바와 같은 변형을 함유하지 않으며 a) 하의 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄들이다.

b) 하의 항체에서

경쇄내에서

가변 경쇄 도메인 VL은 상기 항체의 가변 중쇄 도메인 VH에 의해 교체되고,

중쇄내에서

가변 중쇄 도메인 VH는 상기 항체의 가변 경쇄 도메인 VL에 의해 교체된다.

하나의 실시태양에서

i) 상기 a) 하의 제1 경쇄의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산(카밧에 따른 넘버링)은 양으로 하전된 아미노산에 의해 치환되고, 여기에서 상기 a) 하의 제1 중쇄의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산 또는 213번 위치의 아미노산(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)은 음으로 하전된 아미노산에 의해 치환되거나, 또는

ii) 상기 b) 하의 제2 경쇄의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산(카밧에 따른 넘버링)은 양으로 하전된 아미노산에 의해 치환되고, 여기에서 상기 b) 하의 제2 중쇄의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산 또는 213번 위치의 아미노산(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)은 음으로 하전된 아미노산에 의해 치환된다.

하나의 바람직한 실시태양에서

i) 상기 a) 하의 제1 경쇄의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 넘버링)(하나의 바람직한 실시태양에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로 치환되고), 여기에서 상기 a) 하의 제1 중쇄의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산 또는 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환되거나(카밧 EU 지수에 따른 넘버링), 또는

ii) 상기 b) 하의 제2 경쇄의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 넘버링)(하나의 바람직한 실시태양에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로 치환되고), 여기에서 상기 b) 하의 제2 중쇄의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산 또는 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).

하나의 실시태양에서 상기 제2 중쇄의 불변 도메인 CL에서 124번 및 123번 위치의 아미노산들은 K에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).

하나의 실시태양에서 상기 제2 경쇄의 불변 도메인 CH1에서 147번 및 213번 위치의 아미노산들은 E에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).

하나의 바람직한 실시태양에서 상기 제1 경쇄의 불변 도메인 CL에서 124번 및 123번 위치의 아미노산들은 각각 R 및 K에 의해 치환되고, 상기 제1 중쇄의 불변 도메인 CH1에서 147번 및 213번 위치의 아미노산들은 E에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).

하나의 실시태양에서 상기 제2 중쇄의 불변 도메인 CL에서 124번 및 123번 위치의 아미노산들은 K에 의해 치환되고, 여기에서 상기 제2 경쇄의 불변 도메인 CH1에서 147번 및 213번 위치의 아미노산들은 E에 의해 치환되고, 상기 제1 경쇄의 가변 도메인 VL에서 38번 위치의 아미노산은 K에 의해 치환되고, 상기 제1 중쇄의 가변 도메인 VH에서 39번 위치의 아미노산은 E에 의해 치환되고, 상기 제2 중쇄의 가변 도메인 VL에서 38번 위치의 아미노산은 K에 의해 치환되고, 상기 제2 경쇄의 가변 도메인 VH에서 39번 위치의 아미노산은 E에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은

를 포함하고, 상기 제2 경쇄 및 제2 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체되고, 상기 제2 경쇄 및 제2 중쇄의 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교체되는 2가의 이중특이성 항체이며,

여기에서 상기 제1 항원 또는 제2 항원은 인간 CD19이다.

b) 하의 항체에서

경쇄내에서

가변 경쇄 도메인 VL은 상기 항체의 가변 중쇄 도메인 VH에 의해 교체되고, 불변 경쇄 도메인 CL은 상기 항체의 불변 중쇄 도메인 CH1에 의해 교체되며;

중쇄내에서

가변 중쇄 도메인 VH는 상기 항체의 가변 경쇄 도메인 VL에 의해 교체되고, 불변 중쇄 도메인 CH1은 상기 항체의 불변 경쇄 도메인 CL에 의해 교체된다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은

를 포함하고, 상기 제2 경쇄 및 제2 중쇄의 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교체되는 2가의 이중특이성 항체이며,

여기에서 상기 제1 항원 또는 제2 항원은 인간 CD19이다.

상기 a) 하의 항체는 b) 하에 보고된 바와 같은 변형을 함유하지 않으며 상기 a) 하의 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄들이다.

b) 하의 항체에서

경쇄내에서

불변 경쇄 도메인 CL은 상기 항체의 불변 중쇄 도메인 CH1에 의해 교체되고; 중쇄내에서

불변 중쇄 도메인 CH1은 상기 항체의 불변 경쇄 도메인 CL에 의해 교체된다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은

a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어지는 전장 항체, 및

b) 1 내지 4개의 추가의 항원에 특이적으로 결합하는(즉 제2 및/또는 제3 및/또는 제4 및/또는 제5 항원, 바람직하게는 하나의 추가의 항원, 즉 제2 항원에 특이적으로 결합하는) 1, 2, 3 또는 4개의 단쇄 Fab 단편

을 포함하는 다중특이성 항체이며,

여기에서 상기 b) 하의 단쇄 Fab 단편은 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C- 또는 N-말단에서 펩타이드 링커를 통해 상기 a) 하의 전장 항체에 융합되고,

여기에서 상기 제1 항원 또는 추가의 항원들 중 하나는 인간 CD19이다.

하나의 실시태양에서, 제2 항원에 결합하는 1 또는 2개의 동일한 단쇄 Fab 단편은 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C 말단에서 펩타이드 링커를 통해 상기 전장 항체에 융합된다.

하나의 실시태양에서, 제2 항원에 결합하는 1 또는 2개의 동일한 단쇄 Fab 단편은 상기 전장 항체의 중쇄의 C 말단에서 펩타이드 링커를 통해 상기 전장 항체에 융합된다.

하나의 실시태양에서, 제2 항원에 결합하는 1 또는 2개의 동일한 단쇄 Fab 단편은 상기 전장 항체의 경쇄의 C 말단에서 펩타이드 링커를 통해 상기 전장 항체에 융합된다.

하나의 실시태양에서, 제2 항원에 결합하는 2개의 동일한 단쇄 Fab 단편은 상기 전장 항체의 각 중쇄 또는 경쇄의 C 말단에서 펩타이드 링커를 통해 상기 전장 항체에 융합된다.

하나의 실시태양에서, 제2 항원에 결합하는 2개의 동일한 단쇄 Fab 단편은 상기 전장 항체의 각 중쇄의 C 말단에서 펩타이드 링커를 통해 상기 전장 항체에 융합된다.

하나의 실시태양에서, 제2 항원에 결합하는 2개의 동일한 단쇄 Fab 단편은 상기 전장 항체의 각 경쇄의 C 말단에서 펩타이드 링커를 통해 상기 전장 항체에 융합된다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은

b) ba) 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 또는

bb) 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 불변 도메인 1(CH1)

으로 이루어지는 제1 폴리펩타이드(여기에서 상기 제1 폴리펩타이드는 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 C-말단에 펩타이드 링커를 통해 그의 VH 도메인의 N-말단과 융합된다)

c) ca) 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 또는

cb) 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL)

으로 이루어지는 제2 폴리펩타이드(여기에서 상기 제2 폴리펩타이드는 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 다른 하나의 C-말단에 펩타이드 링커를 통해 VL 도메인의 N-말단과 융합된다)

를 포함하는 3가의, 이중특이성 항체이며,

여기에서 상기 제1 폴리펩타이드의 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 상기 제2 폴리펩타이드의 항체 경쇄 가변 도메인(VL)은 함께 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 형성하고,

여기에서 상기 제1 항원 또는 제2 항원은 인간 CD19이다.

하나의 실시태양에서, b) 하의 폴리펩타이드의 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 c) 하의 폴리펩타이드의 항체 경쇄 가변 도메인(VL)은 하기 위치들 사이에 다이설파이드 결합의 도입에 의해 쇄간 다이설파이드 가교를 통해 연결되고 안정화된다:

(i) 중쇄 가변 도메인 44번 위치 내지 경쇄 가변 도메인 100번 위치, 또는

(ii) 중쇄 가변 도메인 105번 위치 내지 경쇄 가변 도메인 43번 위치, 또는

(iii) 중쇄 가변 도메인 101번 위치 내지 경쇄 가변 도메인 100번 위치(항상 카밧 EU 지수에 따른 넘버링).

안정화를 위해 비천연 다이설파이드 가교를 도입시키는 기법은 예를 들어 WO 94/029350, 문헌[Rajagopal, V., et al., Prot. Eng. (1997) 1453-59]; 문헌[Kobayashi, H., et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25 (1998) 387-393]; 또는 문헌[Schmidt, M., et al., Oncogene (1999) 18 1711-1721]에 기재되어 있다. 하나의 실시태양에서 상기 b) 및 c) 하의 폴리펩타이드의 가변 도메인들 사이의 임의의 다이설파이드 결합은 중쇄 가변 도메인 44번 위치와 경쇄 가변 도메인 100번 위치 사이이다. 하나의 실시태양에서 상기 b) 및 c) 하의 폴리펩타이드의 가변 도메인들 사이의 임의의 다이설파이드 결합은 중쇄 가변 도메인 105번 위치와 경쇄 가변 도메인 43번 위치 사이이다(항상 카밧에 따른 넘버링). 하나의 실시태양에서 상기 단쇄 Fab 단편의 가변 도메인 VH 및 VL 사이에 상기 임의의 다이설파이드 안정화가 없는 4가의 이중특이성 항체가 바람직하다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은

a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 제1 경쇄 및 제1 중쇄, 및

b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 제2(변형된) 경쇄 및 제2(변형된) 중쇄(여기에서 상기 가변 도메인 VL 및 VH는 서로에 의해 교체되고/되거나 상기 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로에 의해 교체된다)

를 포함하고,

c) 하나 또는 2개의 추가의 항원(즉 제3 및/또는 제4 항원)에 특이적으로 결합하는 1 내지 4개의 항원 결합 펩타이드가 a) 및/또는 b)의 경쇄 또는 중쇄의 C- 또는 N-말단에 펩타이드 링커를 통해 융합되는

삼중 특이성 또는 사중특이성 항체이며,

여기에서 상기 제1 항원 또는 상기 제2 항원 또는 추가의 항원들 중 하나는 인간 CD19이다.

상기 a) 하의 항체는 b) 하에 보고된 바와 같은 변형을 함유하지 않고 상기 a) 하의 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄들이다.

하나의 실시태양에서, 상기 삼중특이성 또는 사중특이성 항체는 c) 하에서 하나 또는 2개의 추가의 항원에 특이적으로 결합하는 하나 또는 2개의 항원 결합 펩타이드를 포함한다.

하나의 실시태양에서, 상기 항원 결합 펩타이드는 scFv 단편 및 scFab 단편의 그룹 중에서 선택된다.

하나의 실시태양에서, 상기 항원 결합 펩타이드는 scFv 단편이다.

하나의 실시태양에서, 상기 항원 결합 펩타이드는 scFab 단편이다.

하나의 실시태양에서, 상기 항원 결합 펩타이드는 a) 및/또는 b)의 중쇄의 C-말단에 융합된다.

하나의 실시태양에서, 상기 삼중특이성 또는 사중특이성 항체는 c) 하에서 하나의 추가의 항원에 특이적으로 결합하는 하나 또는 2개의 항원 결합 펩타이드를 포함한다.

하나의 실시태양에서, 상기 삼중특이성 또는 사중특이성 항체는 c) 하에서 제3 항원에 특이적으로 결합하는 2개의 동일한 항원 결합 펩타이드를 포함한다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기와 같은 2개의 동일한 항원 결합 펩타이드는 둘 다 a) 및 b)의 중쇄의 C-말단에 동일한 펩타이드 링커를 통해 융합된다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 2개의 동일한 항원 결합 펩타이드는 scFv 단편 또는 scFab 단편이다.

하나의 실시태양에서, 상기 삼중특이성 또는 사중특이성 항체는 c) 하에서 제3 및 제4 항원에 특이적으로 결합하는 2개의 항원 결합 펩타이드를 포함한다. 하나의 실시태양에서 상기 2개의 항원 결합 펩타이드는 둘 다 a) 및 b)의 중쇄의 C-말단에 동일한 펩타이드 연결자를 통해 융합된다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 2개의 항원 결합 펩타이드는 scFv 단편 또는 scFab 단편이다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은

a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는(및 2개의 Fab 단편을 포함하는) 항체의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄,

b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 2개의 추가적인 Fab 단편(여기에서 상기 추가적인 Fab 단편들은 둘 다 a)의 중쇄의 C- 또는 N-말단에 펩타이드 링커를 통해 융합된다)

을 포함하고, 여기에서 상기 Fab 단편에서 하기의 변형들이 수행된 이중특이성, 4가 항체이다:

(i) a)의 2개의 Fab 단편 모두에서, 또는 b)의 2개의 Fab 단편 모두에서, 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교체되거나, 또는

(ii) a)의 2개의 Fab 단편 모두에서 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체되고, 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교체되며,

b)의 2개의 Fab 단편 모두에서 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체되거나, 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교체되거나, 또는

(iii) a)의 2개의 Fab 단편 모두에서 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체되거나, 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교체되고,

b)의 2개의 Fab 단편 모두에서 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체되고, 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교체되거나, 또는

(iv) a)의 2개의 Fab 단편 모두에서, 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체되고 b)의 2개의 Fab 단편 모두에서, 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교체되거나, 또는

(v) a)의 2개의 Fab 단편 모두에서, 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교체되고 b)의 2개의 Fab 단편 모두에서, 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체되며,

여기에서 상기 제1 항원 또는 상기 제2 항원은 인간 CD19이다.

하나의 실시태양에서, 상기 추가적인 Fab 단편들을 모두 펩타이드 링커를 통해 상기 a)의 중쇄의 C-말단 또는 상기 a)의 중쇄의 N-말단에 융합시킨다.

하나의 실시태양에서, 상기 추가적인 Fab 단편들을 모두 펩타이드 링커를 통해 상기 a)의 중쇄의 C-말단에 융합시킨다.

하나의 실시태양에서, 상기 추가적인 Fab 단편들을 모두 펩타이드 링커를 통해 상기 a)의 중쇄의 N-말단에 융합시킨다.

하나의 실시태양에서, Fab 단편에서 하기의 변형을 수행한다:

i) a)의 2개의 Fab 단편 모두에서, 또는 b)의 2개의 Fab 단편 모두에서, 가변 도메인 VL 및 VH를 서로에 의해 교체시키고/시키거나

불변 도메인 CL 및 CH1을 서로에 의해 교체시킨다.

i) a)의 2개의 Fab 단편 모두에서, 가변 도메인 VL 및 VH를 서로에 의해 교체시키고/시키거나

불변 도메인 CL 및 CH1을 서로에 의해 교체시킨다.

i) a)의 2개의 Fab 단편 모두에서, 불변 도메인 CL 및 CH1을 서로에 의해 교체시킨다.

i) b)의 2개의 Fab 단편 모두에서, 가변 도메인 VL 및 VH를 서로에 의해 교체시키고/시키거나

불변 도메인 CL 및 CH1을 서로에 의해 교체시킨다.

i) b)의 2개의 Fab 단편 모두에서, 불변 도메인 CL 및 CH1을 서로에 의해 교체시킨다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은

a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고 제1 VH-CH1 도메인 쌍을 포함하는 제1 항체의 (변형된) 중쇄(여기에서 상기 중쇄의 C 말단에 상기 제1 항체의 제2 VH-CH1 도메인 쌍의 N-말단을 펩타이드 링커를 통해 융합시킨다),

b) 상기 a)의 제1 항체의 2개의 경쇄,

c) 제2 항원에 특이적으로 결합하고 제1 VH-CL 도메인 쌍을 포함하는 제2 항체의 (변형된) 중쇄(여기에서 상기 중쇄의 C 말단에 상기 제2 항체의 제2 VH-CL 도메인 쌍의 N-말단을 펩타이드 링커를 통해 융합시킨다), 및

d) 상기 c)의 제2 항체의 2개의 (변형된) 경쇄(각각 CL-CH1 도메인 쌍을 포함한다)

를 포함하는 이중특이성의 4가 항체이며,

여기에서 상기 제1 항원 또는 상기 제2 항원은 인간 CD19이다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은

a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 전장 항체의 중쇄 및 경쇄, 및

b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 전장 항체의 중쇄 및 경쇄(여기에서 상기 중쇄의 N-말단은 펩타이드 링커를 통해 상기 경쇄의 C-말단에 연결된다)

를 포함하는 이중특이성 항체이며,

여기에서 상기 제1 항원 또는 상기 제2 항원은 인간 CD19이다.

상기 a) 하의 항체는 b) 하에 보고된 바와 같은 변형을 함유하지 않으며 상기 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄들이다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은

b) VH² 도메인 및 VL² 도메인을 포함하는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 단편(여기에서 상기 두 도메인은 모두 다이설파이드 가교를 통해 서로에 연결된다)

을 포함하는 이중특이성 항체이며,

여기에서 오직 VH² 도메인 또는 VL² 도메인만이 펩타이드 링커를 통해, 제1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄에 융합되고,

여기에서 상기 제1 항원 또는 상기 제2 항원은 인간 CD19이다.

상기 이중특이성에서 상기 a) 하의 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄들이다.

하나의 실시태양에서, 상기 VH² 도메인 또는 VL² 도메인의 다른 하나는 펩타이드 링커를 통해, 제1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄에 융합되지 않는다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 모든 태양에서 상기 제1 경쇄는 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하고 상기 제1 중쇄는 VH 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은

a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 2개의 Fab 단편,

b) CH1 및 CL 도메인이 서로에 대해 교환되는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 하나의 CrossFab 단편,

c) 제1 Fc-영역 중쇄 및 제2 Fc 영역 중쇄를 포함하는 하나의 Fc-영역

을 포함하는 이중특이성의 3가 항체이며,

여기에서 상기 2개의 Fab 단편의 CH1 도메인의 C-말단은 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드의 N-말단에 연결되고,

여기에서 상기 CrossFab 단편의 CL 도메인의 C-말단은 상기 Fab 단편 중 하나의 VH 도메인의 N-말단에 연결되며,

여기에서 상기 제1 항원 또는 상기 제2 항원은 인간 CD19이다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은

a) 제1 항원에 각각 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 Fab 단편,

을 포함하는 이중특이성의 3가 항체이며,

여기에서 상기 제1 Fab 단편의 CH1 도메인의 C-말단은 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드 중 하나의 N-말단에 연결되고, 상기 CrossFab 단편의 CL 도메인의 C-말단은 다른 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드의 N-말단에 연결되며,

여기에서 상기 제2 Fab 단편의 CH1 도메인의 C-말단은 제1 Fab 단편의 VH 도메인의 N-말단 또는 상기 CrossFab 단편의 VH 도메인의 N-말단에 연결되고,

여기에서 상기 제1 항원 또는 상기 제2 항원은 인간 CD19이다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은

a) 제1 항원에 각각 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 Fab 단편,

b) VH 및 VL 도메인이 서로에 대해 교환되는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 하나의 CrossFab 단편,

을 포함하는 이중특이성의 3가 항체이며,

여기에서 상기 제1 Fab 단편의 CH1 도메인의 C-말단은 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드 중 하나의 N-말단에 연결되고, 상기 CrossFab 단편의 CH1 도메인의 C-말단은 다른 중쇄 Fc-영역 폴리펩타이드의 N-말단에 연결되며,

여기에서 상기 제2 Fab 단편의 CH1 도메인의 C-말단은 제1 Fab 단편의 VH 도메인의 N-말단 또는 상기 CrossFab 단편의 VL 도메인의 N-말단에 연결되고,

여기에서 상기 제1 항원 또는 상기 제2 항원은 인간 CD19이다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은

b) 중쇄 단편 및 경쇄 단편을 포함하는 VH² 도메인 및 VL² 도메인을 포함하는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 단편(여기에서

상기 경쇄 단편내에서

상기 가변 경쇄 도메인 VL²는 상기 항체의 가변 중쇄 도메인 VH²에 의해 교체되고,

상기 중쇄 단편내에서

상기 가변 중쇄 도메인 VH²는 상기 항체의 가변 경쇄 도메인 VL²에 의해 교체된다)

을 포함하는 이중특이성 항체이며, 여기에서 상기 중쇄 Fab 단편은 상기 전장 항체의 중쇄 중 하나의 CH1 도메인과 상기 전장 항체의 각 Fc-영역 사이에 삽입되고, 상기 경쇄 Fab 단편의 N 말단은 상기 중쇄 Fab 단편이 삽입된 전장 항체의 중쇄와 짝을 이루는 상기 전장 항체의 경쇄의 C-말단에 접합되며,

여기에서 상기 제1 항원 또는 상기 제2 항원은 인간 CD19이다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 하나의 태양은

상기 경쇄 단편내에서

상기 중쇄 단편내에서

을 포함하는 이중특이성 항체이며, 여기에서 상기 Fab 단편의 중쇄 단편의 C-말단은 상기 전장 항체의 중쇄 중 하나의 N-말단에 접합되고 상기 Fab 단편의 경쇄 단편의 C-말단은 상기 Fab 단편의 중쇄 단편이 접합되는 전장 항체의 중쇄와 짝을 이루는 상기 전장 항체의 경쇄의 C-말단에 접합되며,

여기에서 상기 제1 항원 또는 상기 제2 항원은 인간 CD19이다.

모든 태양의 하나의 실시태양에서 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체는 적어도 2개의 중쇄 폴리펩타이드의 이종이량체화를 필요로 하는 다중특이성 항체이며, 여기에서 상기 항체는 인간 트랜스페린 리포터 및 제2 비-인간 트랜스페린 수용체 항원에 특이적으로 결합한다.

이종이량체화를 지지하기 위해서 CH3-변형에 대한 다수의 접근법들이 예를 들어 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO　2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO　2013/096291에 기재되었으며, 이들은 본 발명에 참고로 포함된다. 전형적으로, 당해 분야에 공지된 접근법에서, 제1 중쇄의 CH3 도메인 및 제2 중쇄의 CH3 도메인을 모두, 하나의 조작된 CH3 도메인을 포함하는 중쇄가 동일한 구조의 또 다른 중쇄와 더 이상 동종이량체화할 수 없도록(예를 들어 CH3-조작된 제1 중쇄가 또 다른 CH3-조작된 제1 중쇄와 더 이상 동종이량체화할 수 없고; CH3-조작된 제2 중쇄가 또 다른 CH3-조작된 제2 중쇄와 더 이상 동종이량체화할 수 없도록) 상보적인 방식으로 조작한다. 이에 의해 하나의 조작된 CH3 도메인을 포함하는 중쇄는 상기 CH3 도메인을 포함하는 또 다른 중쇄와 강제로 이종이량체화된다(상보적인 방식으로 조작된다). 상기 실시태양에 대해서, 상기 제1 중쇄의 CH3 도메인 및 상기 제2 중쇄의 CH3 도메인을 아미노산 치환에 의해 상보적인 방식으로 조작하며, 따라서 상기 제1 중쇄 및 제2 중쇄는 강제로 이종이량체화하는 반면, 상기 제1 중쇄 및 제2 중쇄는 더 이상 동종이량체화할 수 없다(예를 들어 입체공간적인 이유로 인해).

상기에 인용되고 포함된, 당해 분야에 공지된 중쇄 이종이량체화를 지지하기 위한 상이한 접근법들은, 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항체로부터 유래된 "교차되지 않은 Fab 영역", 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항체로부터 유래된 "교차된 Fab 영역"을 상술한 특정한 아미노산 치환과 함께 포함하는, 본 명세서에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체를 제공하는데 사용되는 상이한 대안으로서 간주된다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체의 CH3 도메인을 "놉-인투-홀" 기술에 의해 변경시킬 수 있으며, 상기 기술은 다수의 예와 함께, 예를 들어 WO　96/027011, 문헌[Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621]; 및 문헌[Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681]에 상세히 기재되어 있다. 상기 방법에서 2개의 CH3 도메인의 상호작용 표면들을, 이들 2개의 CH3 도메인을 함유하는 2개의 중쇄 모두의 이종이량체화를 증가시키도록 변경시킨다. 상기 2개의 CH3 도메인(2개의 중쇄의)은 각각 "놉"일 수 있는 반면, 다른 것은 "홀"이다. 다이설파이드 가교의 도입은 상기 이종이량체를 추가로 안정화시키고(문헌[Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35]) 수율을 증가시킨다.

하나의 바람직한 실시태양에서 본 명세서에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체는 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 T366W 돌연변이 및 "홀-쇄"의 CH3 도메인에 T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함한다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 상기 CH3 도메인들간의 추가적인 쇄간 다이설파이드 가교를, 예를 들어 상기 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 Y349C 돌연변이 및 상기 "홀 쇄"의 CH3 도메인에 S354C 돌연변이를 도입시킴으로써 또한 사용할 수 있다(문헌[Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681]). 따라서 또 다른 바람직한 실시태양에서, 본 명세서에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체는 상기 2개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C 및 T366W 돌연변이 및 상기 2개의 CH3 도메인 중의 다른 하나에 E356C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하거나, 또는 본 명세서에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체는 상기 2개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C 및 T366W 돌연변이 및 상기 2개의 CH3 도메인 중의 다른 하나에 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함한다(하나의 CH3 도메인 중의 추가적인 Y349C 돌연변이 및 다른 CH3 도메인 중의 추가적인 E356C 또는 S354C 돌연변이는 쇄간 다이설파이드 가교를 형성한다)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).

그러나 또한 EP 1 870 459A1에 기재된 바와 같은 다른 놉-인투-홀 기술들을 대안으로 또는 추가로 사용할 수 있다. 하나의 실시태양에서 본 명세서에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체는 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 R409D 및 K370E 돌연변이 및 상기 "홀-쇄"의 CH3 도메인에 D399K 및 E357K 돌연변이를 포함한다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).

하나의 실시태양에서 본 명세서에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체는 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 T366W 돌연변이 및 상기 "홀-쇄"의 CH3 도메인에 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이 및 추가로 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 R409D 및 K370E 돌연변이 및 상기 "홀 쇄"의 CH3 도메인에 D399K 및 E357K 돌연변이를 포함한다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).

하나의 실시태양에서 본 명세서에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체는 상기 2개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C 및 T366W 돌연변이 및 상기 2개의 CH3 도메인 중의 다른 하나에 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하거나, 또는 본 명세서에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체는 상기 2개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C 및 T366W 돌연변이 및 상기 2개의 CH3 도메인 중의 다른 하나에 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이 및 추가로 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 R409D 및 K370E 돌연변이 및 상기 "홀 쇄"의 CH3 도메인에 D399K 및 E357K 돌연변이를 포함한다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).

상기 "놉-인투-홀 기술"과 별개로 이종이량체화를 실행하기 위해 다중특이성 항체의 중쇄의 CH3 도메인을 변형시키기 위한 다른 기법들이 당해 분야에 공지되어 있다. 이들 기술, 특히 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 및 WO 2013/096291에 기재된 것들이 본 명세서 보고된 바와 같은 다중특이성 항체와 함께 상기 "놉-인투-홀 기술"에 대한 대안으로서 간주된다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체의 하나의 실시태양에서 EP 1870459에 기재된 접근법을 사용하여 상기 다중특이성 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지한다. 이러한 접근법은 상기 제1 및 제2 중쇄 둘 다의 사이의 CH3/CH3-도메인-접촉면 중의 특이적인 아미노산 위치에 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산을 도입시킴을 기본으로 한다.

상응하게, 상기 실시태양은 본 명세서에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체에 관한 것으로, 상기 항체의 3차 구조에서 상기 제1 중쇄의 CH3 도메인 및 상기 제2 중쇄의 CH3 도메인은 각 항체 CH3 도메인 사이에 위치하는 접촉면을 형성시키며, 여기에서 상기 제1 중쇄의 CH3 도메인의 각 아미노산 서열 및 상기 제2 중쇄의 CH3 도메인의 아미노산 서열은 각각 상기 항체의 3차 구조 중의 상기 접촉면내에 위치하는 일련의 아미노산을 포함하고, 여기에서 하나의 중쇄의 CH3 도메인 중의 접촉면 중에 위치하는 아미노산 세트로부터 제 1 아미노산이 양으로 하전된 아미노산에 의해 치환되고 상기 다른 중쇄의 CH3 도메인 중의 접촉면 중에 위치하는 아미노산 세트로부터 제 2 아미노산이 음으로 하전된 아미노산에 의해 치환된다. 상기 실시태양에 따른 다중특이성 항체를 본 명세서에서 또한 "CH3(+/-)-조작된 다중특이성 항체"(여기에서 약어 "+/-"는 각 CH3 도메인 중에 도입된 반대로 하전된 아미노산들을 나타낸다)라 칭한다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 CH3(+/-)-조작된 다중특이성 항체의 하나의 실시태양에서 양으로 하전된 아미노산은 K, R 및 H 중에서 선택되고, 음으로 하전된 아미노산은 E 또는 D 중에서 선택된다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 CH3(+/-)-조작된 다중특이성 항체의 하나의 실시태양에서 상기 양으로 하전된 아미노산은 K 및 R 중에서 선택되고, 음으로 하전된 아미노산은 E 또는 D 중에서 선택된다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 CH3(+/-)-조작된 다중특이성 항체의 하나의 실시태양에서 양으로 하전된 아미노산은 K이고, 음으로 하전된 아미노산은 E이다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 CH3(+/-)-조작된 다중특이성 항체의 하나의 실시태양에서, 상기 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 409번 위치의 아미노산 R은 D에 의해 치환되고 위치의 아미노산 K는 E에 의해 치환되며, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 399번 위치의 아미노산 D는 K에 의해 치환되고 357번 위치의 아미노산 E는 K에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).

본 명세서에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체의 하나의 실시태양에서, WO 2013/157953에 기재된 접근법을 사용하여 상기 다중특이성 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지한다. 본 명세서에 보고된 바와 같은 상기 다중특이성 항체의 하나의 실시태양에서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 366번 위치의 아미노산 T는 K에 의해 치환되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 351번 위치의 아미노산 L은 D에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 본 명세서에 보고된 바와 같은 상기 다중특이성 항체의 또 다른 실시태양에서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 366번 위치의 아미노산 T는 K에 의해 치환되고 351번 위치의 아미노산 L은 K에 의해 치환되며, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 351번 위치의 아미노산 L은 D에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).

본 명세서에 보고된 바와 같은 상기 다중특이성 항체의 또 다른 실시태양에서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 366번 위치의 아미노산 T는 K에 의해 치환되고 351번 위치의 아미노산 L은 K에 의해 치환되며, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 351번 위치의 아미노산 L은 D에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 추가로 하기의 치환들 중 적어도 하나가 다른 중쇄의 CH3 도메인 중에 포함된다: 349번 위치의 아미노산 Y는 E에 의해 치환되고, 349번 위치의 아미노산 Y는 D에 의해 치환되고, 368번 위치의 아미노산 L은 E에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 하나의 실시태양에서 368번 위치의 아미노산 L은 E에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).

본 명세서에 보고된 바와 같은 상기 다중특이성 항체의 하나의 실시태양에서, WO 2012/058768에 기재된 접근법을 사용하여 상기 다중특이성 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지한다. 본 명세서에 보고된 바와 같은 상기 다중특이성 항체의 하나의 실시태양에서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 351번 위치의 아미노산 L은 Y에 의해 치환되고 407번 위치의 아미노산 Y는 A에 의해 치환되며, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 366번 위치의 아미노산 T는 A에 의해 치환되고 409번 위치의 아미노산 K는 F에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 또 다른 실시태양에서 상기 언급한 치환들 외에, 상기 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 411번 위치(원래 T), 399번 위치(원래 D), 400번 위치(원래 S), 405번 위치(원래 F), 390번 위치(원래 N), 및 392번 위치(원래 K)의 아미노산들 중 적어도 하나가 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 바람직한 치환은 하기와 같다:

- 411번 위치의 아미노산 T의, N, R, Q, K, D, E 및 W(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 중에서 선택된 아미노산에 의한 치환,

- 399번 위치의 아미노산 D의, R, W, Y 및 K(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 중에서 선택된 아미노산에 의한 치환,

- 400번 위치의 아미노산 S의, E, D, R 및 K(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 중에서 선택된 아미노산에 의한 치환,

- 405번 위치의 아미노산 F의, I, M, T, S, V 및 W(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 중에서 선택된 아미노산에 의한 치환,

- 390번 위치의 아미노산 N의, R, K 및 D(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 중에서 선택된 아미노산에 의한 치환,

- 392번 위치의 아미노산 K의, V, M, R, L, F 및 E(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 중에서 선택된 아미노산에 의한 치환.

본 명세서에 보고된 바와 같은 상기 다중특이성 항체의 또 다른 실시태양에서(WO 2012/058768에 따라 조작된다), 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 351번 위치의 아미노산 L을 Y에 의해 치환시키고 407번 위치의 아미노산 Y를 A에 의해 치환시키며, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 366번 위치의 아미노산 T를 V에 의해 치환시키고 409번 위치의 아미노산 K를 F에 의해 치환시킨다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 본 명세서에 보고된 바와 같은 상기 다중특이성 항체의 또 다른 실시태양에서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 407번 위치의 아미노산 Y를 A에 의해 치환시키고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 366번 위치의 아미노산 T를 A에 의해 치환시키고 409번 위치의 아미노산 K를 F에 의해 치환시킨다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 상기 최종의 상기 언급한 실시태양에서, 상기 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 392번 위치의 아미노산 K를 E에 의해 치환시키고, 411번 위치의 아미노산 T를 E에 의해 치환시키고, 399번 위치의 아미노산 D를 R에 의해 치환시키고, 400번 위치의 아미노산 S를 R에 의해 치환시킨다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).

본 명세서에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체의 하나의 실시태양에서, WO 2011/143545에 기재된 접근법을 사용하여 상기 다중특이성 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지한다. 본 명세서에 보고된 바와 같은 상기 다중특이성 항체의 하나의 실시태양에서, 상기 2개의 중쇄 모두의 CH3 도메인에서 아미노산 변형을 368번 및/또는 409번 위치에 도입시킨다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).

본 명세서에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체의 하나의 실시태양에서, WO 2011/090762에 기재된 접근법을 사용하여 상기 다중특이성 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지한다. WO 2011/090762는 "놉-인투-홀" 기술에 따른 아미노산 변형에 관한 것이다. 본 명세서에 보고된 바와 같은 상기 CH3(KiH)-조작된 다중특이성 항체의 하나의 실시태양에서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 366번 위치의 아미노산 T는 W에 의해 치환되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 407번 위치의 아미노산 Y는 A에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 본 명세서에 보고된 바와 같은 상기 CH3(KiH)-조작된 다중특이성 항체의 또 다른 실시태양에서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 366번 위치의 아미노산 T는 Y에 의해 치환되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 407번 위치의 아미노산 Y는 T에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).

본 명세서에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체(IgG2 아이소타입의 것이다)의 하나의 실시태양에서, WO 2011/090762에 기재된 접근법을 사용하여 상기 다중특이성 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지한다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체의 하나의 실시태양에서, WO 2009/089004에 기재된 접근법을 사용하여 상기 이중특이성 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지한다. 본 명세서에 보고된 바와 같은 상기 다중특이성 항체의 하나의 실시태양에서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 392번 위치의 아미노산 K 또는 N은 음으로 하전된 아미노산(하나의 실시태양에서 E 또는 D에 의해, 하나의 바람직한 실시태양에서 D에 의해)에 의해 치환되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 399번 위치의 아미노산 D, 356번 위치의 아미노산 E 또는 D 또는 357번 위치의 아미노산 E는 양으로 하전된 아미노산(하나의 바람직한 실시태양에서 K 또는 R, 하나의 바람직한 실시태양에서 K에 의해, 하나의 바람직한 실시태양에서 399 또는 356번 위치의 아미노산은 K에 의해 치환된다)에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 하나의 추가의 실시태양에서, 상기 언급한 치환 외에, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 409번 위치의 아미노산 K 또는 R은 음으로 하전된 아미노산(하나의 실시태양에서 E 또는 D에 의해, 하나의 바람직한 실시태양에서 D에 의해)에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 하나의 훨씬 추가의 태양에서, 상기 언급한 치환 외에 또는 상기에 대신하여, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 439번 위치의 아미노산 K 및/또는 370번 위치의 아미노산 K는 독립적으로 음으로 하전된 아미노산(하나의 바람직한 실시태양에서 E 또는 D에 의해, 하나의 바람직한 실시태양에서 D에 의해)에 의해 서로 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).

본 명세서에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체의 하나의 실시태양에서, WO 2007/147901에 기재된 접근법을 사용하여 상기 다중특이성 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지한다. 본 명세서에 보고된 바와 같은 상기 다중특이성 항체의 하나의 실시태양에서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 253번 위치의 아미노산 K는 E에 의해 치환되고, 282번 위치의 아미노산 D는 K에 의해 치환되고, 322번 위치의 아미노산 K는 D에 의해 치환되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 239번 위치의 아미노산 D는 K에 의해 치환되고, 240번 위치의 아미노산 E는 K에 의해 치환되고, 292번 위치의 아미노산 K는 D에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).

본 명세서에 보고된 바와 같은 다중특이성 항체의 하나의 실시태양에서, WO 2007/110205에 기재된 접근법을 사용하여 상기 다중특이성 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지한다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 모든 태양 및 실시태양 중 하나의 실시태양에서 상기 다중특이성 항체는 이중특이성 항체 또는 삼중특이성 항체이다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 다중특이성 항체는 이중특이성 항체이다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 모든 태양의 하나의 실시태양에서, 상기 항체는 2가 또는 3가 항체이다. 하나의 실시태양에서 상기 항체는 2가 항체이다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 모든 태양의 하나의 실시태양에서, 상기 다중특이성 항체는 IgG 유형 항체의 불변 도메인 구조를 갖는다. 본 명세서에 보고된 바와 같은 모든 태양의 하나의 추가의 실시태양에서, 상기 다중특이성 항체는 상기 다중특이성 항체가 인간 하위부류 IgG1의 것, 또는 돌연변이 L234A 및 L235A를 갖는 인간 하위부류 IgG1의 것임을 특징으로 한다. 본 명세서에 보고된 바와 같은 모든 태양의 하나의 추가의 실시태양에서, 상기 다중특이성 항체는 상기 다중특이성 항체가 인간 하위부류 IgG2의 것임을 특징으로 한다. 본 명세서에 보고된 바와 같은 모든 태양의 하나의 추가의 실시태양에서, 상기 다중특이성 항체는 상기 다중특이성 항체가 인간 하위부류 IgG3의 것임을 특징으로 한다. 본 명세서에 보고된 바와 같은 모든 태양의 하나의 추가의 실시태양에서, 상기 다중특이성 항체는 상기 다중특이성 항체가 인간 하위부류 IgG4의 것, 또는 추가적인 돌연변이 S228P를 갖는 인간 하위부류 IgG4의 것임을 특징으로 한다. 본 명세서에 보고된 바와 같은 모든 태양의 하나의 추가의 실시태양에서, 상기 다중특이성 항체는 상기 다중특이성 항체가 인간 하위부류 IgG1 또는 인간 하위부류 IgG4의 것임을 특징으로 한다. 본 명세서에 보고된 바와 같은 모든 태양의 하나의 추가의 실시태양에서, 상기 다중특이성 항체는 상기 다중특이성 항체가 돌연변이 L234A 및 L235A(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 인간 하위부류 IgG1의 것임을 특징으로 한다. 본 명세서에 보고된 바와 같은 모든 태양의 하나의 추가의 실시태양에서, 상기 다중특이성 항체는 상기 다중특이성 항체가 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 인간 하위부류 IgG1의 것임을 특징으로 한다. 본 명세서에 보고된 바와 같은 모든 태양의 하나의 추가의 실시태양에서, 상기 다중특이성 항체는 상기 다중특이성 항체가 돌연변이 S228P 및 L235E(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 인간 하위부류 IgG4의 것임을 특징으로 한다. 본 명세서에 보고된 바와 같은 모든 태양의 하나의 추가의 실시태양에서, 상기 다중특이성 항체는 상기 다중특이성 항체가 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 갖는 인간 하위부류 IgG4의 것임을 특징으로 한다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 모든 태양의 하나의 태양에서, 본 명세서에 명시된 바와 같은 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체는 C-말단 글리신-리신 다이펩타이드(G446 및 K447, 카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다. 본 명세서에 보고된 바와 같은 모든 태양의 하나의 실시태양에서, 본 명세서에 명시된 바와 같은, CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체는 추가적인 C-말단 글리신 잔기(G446, 카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 항체는 하나의 실시태양에서 돌연변이 PVA236, L234A/L235A, 및/또는 GLPSS331(카밧의 EU 지수에 따른 넘버링)을 갖는 인간 하위부류 IgG1의 것, 또는 하위부류 IgG4의 것임을 특징으로 한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 E233, L234, L235, G236, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 및/또는 P329(카밧이 EU 지수에 따른 넘버링)에서 적어도 하나의 돌연변이를 함유하는 임의의 IgG 부류의 것(하나의 실시태양에서 IgG1 또는 IgG4이다)임을 특징으로 한다. 추가로 하나의 실시태양에서 상기 IgG4 부류의 항체는 돌연변이 S228P, 또는 돌연변이 S228P 및 L235E(문헌[Angal, S., et al., Mol. Immunol. 30 (1993) 105-108])(카밧이 EU 지수에 따른 넘버링)를 함유한다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 항체의 중쇄의 C-말단은 아미노산 잔기 PGK로 종결되는 완전한 C-말단일 수 있다. 상기 중쇄의 C-말단은 상기 C 말단 아미노산 잔기 중 하나 또는 2개가 제거된 단축된 C-말단일 수 있다. 하나의 바람직한 태양에서, 상기 중쇄의 C-말단은 PG로 종결되는 단축된 C-말단이다.

몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체를, 당해 분야에 공지되고 쉽게 입수할 수 있는 하나 이상의 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈을 함유하도록 추가로 변형시킬 수 있다.

상기 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈은 혈액-뇌-장벽 수용체에 대한 결합 특이성을 가짐을 특징으로 한다. 이러한 결합 특이성은 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈을 본 명세서에 보고된 바와 같은 항-인간 CD19 항체에 융합시킴으로써 획득되거나 또는 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 다중특이성 항체의 결합 특이성 중 하나로서 상기 혈액-뇌-장벽 수용체에 결합 특이성을 도입시킴으로써 획득될 수 있으며, 따라서 상기 특이성은 본 명세서에 보고된 바와 같은 항-인간 CD19 항체의 결합 특이성 및 상기 혈액-뇌-장벽 수용체에 대한 결합 특이성을 포함한다.

하나 이상의 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈을 본 명세서에 보고된 바와 같은 항-인간 CD19 항체의 경쇄 또는 중쇄의 임의의 말단에 융합시킬 수 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈을 상기 중쇄의 C-말단에 융합시킨다.

상기 하나 이상의 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈을 직접 또는 링커 펩타이드를 통해 각각의 항체쇄에 융합시킬 수 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 링커 펩타이드는 아미노산 서열 GGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 41)을 갖는다.

상기 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈은 항체 scFv 단편일 수 있다. 하나의 실시태양에서 상기 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈은 N- 에서 C-말단 순서로 경쇄 가변 도메인 - 경쇄 불변 도메인 - 링커 펩타이드 - 중쇄 가변 도메인 - 중쇄 불변 도메인1을 포함하는 scFv이다.

하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈은 (G4S)₆ 링커 펩타이드를 갖는 항-트랜스페린 수용체-항체 8D3의 scFv 단편 또는 그의 인간화된 변이체이다.

그의 인간화된 변이체란 용어는 마우스 8D3 항체의 CDR을 인간 프레임워크상에, 프레임워크 영역(FR) 및/또는 고가변 영역(HVR) 각각에서 서로 독립적으로 1 내지 3개의 돌연변이를 임의로 도입시켜 접목시킴으로써 획득된 분자를 나타낸다.

하나의 태양에서, 본 명세서에 항-인간 CD19 항체, 2개의 펩타이드 링커 및 혈액-뇌-장벽 수용체에 결합하는 2개의 1가 결합 존재를 포함하는 항-인간 CD19 항체 융합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기에서 상기 링커는 상기 항-인간 CD19 항체를 상기 혈액-뇌-장벽 수용체에 결합하는 1가의 결합 존재에 결합시킨다.

하나의 태양에서, 본 명세서에 항-인간 CD19 항체, 펩타이드 링커 및 혈액-뇌-장벽 수용체에 결합하는 하나의 1가 결합 존재를 포함하는 항-인간 CD19 항체 융합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기에서 상기 링커는 상기 항-인간 CD19 항체를 상기 혈액-뇌-장벽 수용체에 결합하는 1가의 결합 존재에 결합시킨다.

하나의 실시태양에서 상기 혈액-뇌-장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 존재는 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.

하나의 실시태양에서, 상기 혈액-뇌-장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 존재는 혈액-뇌-장벽 수용체 리간드, scFv, Fv, scFab, VHH, 하나의 바람직한 실시태양에서 scFv 및 scFab로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 분자를 포함한다.

하나의 실시태양에서, 상기 혈액-뇌-장벽 수용체는 트랜스페린 수용체, 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장인자 수용체, 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8, 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1 및 헤파린-결합 상피 성장인자-유사 성장인자로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 혈액-뇌-장벽 수용체는 트랜스페린 수용체이다.

하나의 실시태양에서, 상기 혈액-뇌-장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 존재는 상기 트랜스페린 수용체에 대한 하나의 scFab 또는 하나의 scFv, 보다 특히 서열번호 42, 43 및 44의 아미노산 서열내에 포함된 트랜스페린 수용체 중의 에피토프를 인식하는 scFab 또는 scFv를 포함한다.

하나의 실시태양에서, 상기 혈액-뇌-장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 존재는 상기 링커에 의해 상기 항-인간 CD19 항체의 중쇄의 C-말단 단부에 결합된다.

하나의 실시태양에서, 상기 펩타이드 링커는 적어도 15 아미노산의 길이, 보다 바람직하게는 18 내지 25 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열이다.

하나의 실시태양에서, 상기 항-인간 CD19 항체는 전장 항체, 하나의 바람직한 실시태양에서 전장 IgG이다. 전장 항체란 용어는 2개의 항체 경쇄 폴리펩타이드 및 2개의 항체 중쇄 폴리펩타이드로 이루어지는 항체를 나타내며 여기에서 상기 두 항체 중쇄 폴리펩타이드 중에 C-말단 리신 잔기(K)는 존재하거나 존재하지 않을 수 있다.

하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 항-인간 CD19 항체 융합 폴리펩타이드는 뇌 효과기 존재로서 전장 IgG 항-인간 CD19 항체, 서열 GGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 41)의 링커 및 혈액 뇌 수용체로서 인간 트랜스페린 수용체에 결합하는 1가 결합 존재로서 하나의 scFab를 포함하며, 여기에서 상기 scFab는 상기 링커에 의해 상기 전장 항-인간 CD19 항체의 중쇄 중 하나의(Fc 부분의) C-말단 단부에 결합되고, 상기 scFab는 서열번호 52, 53 및 54의 아미노산 서열내에 포함된 인간 트랜스페린 수용체 중의 에피토프를 인식한다.

하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 항-인간 CD19 항체 융합 폴리펩타이드는 뇌 효과기 존재로서 전장 IgG 항-인간 CD19 항체, 서열 GGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 41)의 링커 및 혈액 뇌 수용체로서 인간 트랜스페린 수용체에 결합하는 1가 결합 존재로서 하나의 scFv를 포함하며, 여기에서 상기 scFab는 상기 링커에 의해 상기 전장 항-인간 CD19 항체의 중쇄 중 하나의(Fc 부분의) C-말단 단부에 결합되고, 상기 scFab는 서열번호 42, 43 및 44의 아미노산 서열내에 포함된 인간 트랜스페린 수용체 중의 에피토프를 인식한다.

하나의 실시태양에서, 상기 항-인간 CD19 항체의 제1 중쇄는 제1 이량체화 모듈을 포함하고 상기 항체의 제2 중쇄는 제2 이량체화 모듈을 포함하여 상기 2개 중쇄의 이종이량체화를 허용한다.

하나의 실시태양에서, 상기 항-인간 CD19 항체의 제1 중쇄의 제1 이량체화 모듈은 놉 중쇄이고 상기 항-인간 CD19 항체의 제2 중쇄의 이량체화 모듈은 홀 중쇄(놉-인투-홀 전략에 따른)이다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 항-인간 CD19 항체 융합 폴리펩타이드를, 상기 항-인간 CD19 항체를 상기 혈액 뇌 장벽을 통해 수송하는데 사용할 수 있다.

하나의 실시태양에서, 인간 트랜스페린 수용체에 결합하는 1가 결합 존재로서 scFab에 Fc-영역의 C-말단 단부에서 결합하는 항-인간 CD19 항체의 중쇄는 N- 에서 C-말단 방향으로 하기의 구조를 갖는다:

·IgG 중쇄,

·상기 IgG 중쇄의 Fc-영역의 C-말단 단부를 scFab의 VL 도메인의 N-말단 단부에 결합시키는 펩타이드 링커, 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 펩타이드 링커는 아미노산 서열 GGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 41)을 갖는다,

·상기 scFab의 가변 경쇄 도메인(VL) 및 C-카파 경쇄 도메인,

·상기 scFab의 C-카파 경쇄 도메인의 C-말단 단부를 상기 scFab의 VH 도메인의 N-말단 단부에 결합시키는 펩타이드 링커, 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 펩타이드 링커는 아미노산 서열 (G₄S)₆GG(서열번호 45)를 갖는다,

·상기 scFab 항체의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 IgG CH1 중쇄 도메인.

하나의 실시태양에서, 인간 트랜스페린 수용체에 결합하는 1가 결합 존재로서 scFv에 Fc-영역의 C-말단 단부에서 결합하는 항-인간 CD19 항체의 중쇄는 N- 에서 C-말단 방향으로 하기의 구조를 갖는다:

·IgG 중쇄,

·상기 IgG 중쇄의 Fc-영역의 C-말단 단부를 scFv의 VL 도메인의 N-말단 단부에 결합시키는 펩타이드 링커, 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 펩타이드 링커는 아미노산 서열 GGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 41)을 갖는다,

·가변 경쇄 도메인(VL),

·상기 가변 경쇄 도메인의 C-말단 단부를 상기 scFv의 VH 도메인의 N-말단 단부에 결합시키는 펩타이드 링커, 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 펩타이드 링커는 아미노산 서열 (G₄S)₆GG(서열번호 45)를 갖는 펩타이드이다,

·상기 scFv 항체 단편의 가변 중쇄 도메인(VH).

하나의 실시태양에서, 상기 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈/혈액-뇌-장벽 수용체에 대한 scFab 또는 scFv는 인간화된 항-트랜스페린 수용체 항체 8D3으로부터 유래한다(예를 들어 문헌[Boado, R.J., et al., Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 1251-1258]을 참조하시오). 마우스 중쇄 가변 도메인은

EVQLVESGGG LVQPGNSLTL SCVASGFTFS NYGMHWIRQA PKKGLEWIAM IYYDSSKMNY ADTVKGRFTI SRDNSKNTLY LEMNSLRSED TAMYYCAVPT SHYVVDVWGQ GVSVTVSS

(서열번호 46)의 아미노산 서열을 갖는다.

마우스 경쇄 가변 도메인(변이체 1)은

DIQMTQSPAS LSASLEEIVT ITCQASQDIG NWLAWYQQKP GKSPQLLIYG ATSLADGVPS RFSGSRSGTQ FSLKISRVQV EDIGIYYCLQ AYNTPWTFGG GTKLELK

(서열번호 47)의 아미노산 서열을 갖고,

마우스 경쇄 가변 도메인(변이체 2)은

DIQMTQSPAS LSASLEEIVT ITCQASQDIG NWLAWYQQKP GKSPQLLIYG ATSLADGVPS RFSGSRSGTQ FSLKISRVQV EDIGIYYCLQ AYNTPWTFGG GTKVEIK

(서열번호 48)의 아미노산 서열을 갖는다.

하나의 실시태양에서 상기 항-트랜스페린 수용체 항체 또는 트랜스페린 수용체 결합 특이성은 (a) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 53, 54 또는 55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.

하나의 실시태양에서 상기 항-트랜스페린 수용체 항체는 상기 트랜스페린 수용체용 결합 부위를 형성하는 서열번호 49의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 50의 경쇄 가변 도메인의 적어도 한 쌍을 포함한다.

하나의 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈

하나의 태양에서 상기 항-인간 CD19 항체 또는 항-인간 CD19 항체 융합 폴리펩타이드는 정확히 하나의 혈액-뇌-장벽 결합 특이성 또는 셔틀 모듈을 포함하며, 따라서 적어도 이중특이성이고, 여기에서 상기 혈액-뇌-장벽 결합 특이성 또는 셔틀 모듈은 상기 항-인간 트랜스페린 수용체 항체 8D3의 인간화된 가변 도메인 또는 서열번호 49의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 50의 경쇄 가변 도메인의 쌍을 포함하며, 이때 상기 혈액-뇌-장벽 결합 특이성 또는 셔틀 모듈은 상기 항-인간 CD19 항체를 상기 혈액-뇌-장벽을 통과하여 수송한다.

하나 또는 2개의 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈

하나의 태양에서 상기 항-인간 CD19 항체 또는 항-인간 CD19 항체 융합 폴리펩타이드는 하나 또는 2개의 혈액-뇌-장벽 결합 특이성 또는 셔틀 모듈(들)을 포함하며, 따라서 적어도 이중특이성이고, 여기에서 상기 혈액-뇌-장벽 셔틀 결합 부위 또는 모듈은 혈액-뇌-장벽 수용체(BBB-R, BBB-R 결합 특이성)에 낮은 친화성으로 결합하는 항체로부터 유래되고, 이때 상기 혈액-뇌-장벽 수용체에 낮은 친화성으로 결합하는 항체로부터 유래된 혈액-뇌-장벽 결합 특이성 또는 셔틀 모듈은 상기 항-인간 CD19 항체를 상기 혈액-뇌-장벽을 통과하여 수송한다.

하나의 실시태양에서, 상기 BBB-R은 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장인자 수용체(IGF 수용체), 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질(LRP8), 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1(LRP1), 및 헤파린-결합 상피 성장인자-유사 성장인자(HB-EGF)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 또 다른 상기와 같은 태양에서, 상기 BBB-R은 인간 BBB-R이다. 하나의 상기와 같은 태양에서, 상기 BBB-R은 TfR이다. 또 다른 상기와 같은 태양에서, 상기 BBB-R은 TfR이고, 상기 항체는 TfR 활성을 억제하지 않는다. 또 다른 상기와 같은 태양에서, 상기 BBB-R은 TfR이고 상기 항체는 TfR의 트랜스페린에의 결합을 억제하지 않는다.

하나의 실시태양에서, 상기 항체는 상기 BBB-R의, 그의 고유 리간드 중 하나 이상에의 결합을 손상시키지 않는다. 하나의 상기와 같은 실시태양에서, 상기 항체는 인간 트랜스페린 수용체(hTfR)에, 상기 항체가 상기 hTfR의 인간 트랜스페린에의 결합을 억제하지 않는 방식으로 특이적으로 결합한다.

하나의 실시태양에서, 상기 항-BBB-R 결합 특이성은 약 1 nM 내지 약 100 μM의 BBB-R에 대한 IC₅₀을 갖는다. 하나의 실시태양에서, 상기 IC₅₀은 약 5 nM 내지 약 100 μM이다. 하나의 실시태양에서, 상기 IC₅₀은 약 50 nM 내지 약 100 μM이다. 하나의 실시태양에서, 상기 IC₅₀은 약 100 nM 내지 약 100 μM이다. 하나의 실시태양에서, 상기 BBB-R 결합 특이성은 약 5 nM 내지 약 10 μM의 BBB-R에 대한 친화성을 갖는다. 하나의 실시태양에서, 상기 BBB-R 결합 특이성은 항-인간 CD19에 접합되거나 포함될 때 약 30 nM 내지 약 1 μM의 BBB-R에 대한 친화성을 갖는다. 하나의 실시태양에서, 상기 BBB-R 결합 특이성은 상기 항-인간 CD19 항체에 접합되거나 포함될 때 약 50 nM 내지 약 1 μM의 BBB-R에 대한 친화성을 갖는다. 하나의 실시태양에서, 상기 BBB-R에 대한 상기 BBB-R 결합 특이성 또는 항-인간 CD19 항체 융합 폴리펩타이드의 친화성을 스캐차드 분석을 사용하여 측정한다. 하나의 실시태양에서, 상기 BBB-R에 대한 상기 BBB-R 결합 특이성 또는 상기 항-인간 CD19 항체 융합 폴리펩타이드의 친화성을 BIACORE 분석을 사용하여 측정한다. 하나의 실시태양에서, 상기 BBB-R에 대한 상기 BBB-R 결합 특이성 또는 상기 항-인간 CD19 항체 융합 폴리펩타이드의 친화성을 경쟁 ELISA를 사용하여 측정한다.

항체 융합 폴리펩타이드를 함유하는 혈액-뇌-장벽 셔틀의 용도

또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 항-인간 CD19 항체에의 CNS의 노출을 증가시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 항-인간 CD19 항체를 BBB-R에 낮은 친화성으로 결합하는 항체 또는 항체 단편에 결합시키고, 이에 의해 상기 항-인간 CD19 항체에의 CNS의 노출이 증가한다. 상기 "결합시키다"란 용어는 상기 항-BBB-R 항체 결합 특이성이 적어도 이중특이성 항-인간 CD19/BBB-R 항체 중에 제2 결합 특이성으로서 도입되는 경우를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 항-인간 CD19 항체에의 CNS 노출의 증가를 상기 BBB-R에 대해 강하된 친화성을 갖지 않는 전형적인 항체와 결합된 항-인간 CD19 항체의 CNS 노출과 비교하여 측정한다. 하나의 실시태양에서, 상기 항-인간 CD19 항체에의 CNS 노출의 증가를 투여후 혈청 중에서 발견되는 양과 비교된, 상기 CNS 중에서 발견된 항-인간 CD19 항체의 양의 비로서 측정한다. 하나의 실시태양에서, 상기 CNS 노출의 증가는 0.1%를 초과하는 비를 생성시킨다. 하나의 실시태양에서, 상기 항-인간 CD19 항체에의 CNS 노출의 증가를 결합된 항-BBB-R 항체의 부재하에서의 항-인간 CD19 항체의 CNS 노출과 비교하여 측정한다. 하나의 실시태양에서, 상기 항-인간 CD19 항체에의 CNS 노출의 증가를 영상화에 의해 측정한다. 하나의 실시태양에서, 상기 항-인간 CD19 항체에의 CNS 노출의 증가를 하나 이상의 생리학적 증상들의 변화와 같은 간접적인 정보에 의해 측정한다.

피실험자에게 투여되는 항-인간 CD19 항체의 CNS 중에서의 체류의 증가 방법에서, 상기 항-인간 CD19 항체를 BBB-R에 낮은 친화성으로 결합하는 항체 또는 항체 단편에 결합시키며, 따라서 상기 항-인간 CD19 항체의 CNS 중에서의 체류가 증가한다.

또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 피실험자의 CNS에서 유효하도록 항-인간 CD19 항체의 약동학 및/또는 약역학을 최적화시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 항-인간 CD19 항체를 BBB-R에 낮은 친화성으로 결합하는 항체 또는 항체 단편에 결합시키고, 이때 상기 항체 또는 항체 단편을 상기 항-인간 CD19 항체에의 결합 후에 상기 BBB-R에 대한 그의 친화성이, 상기 CNS에서의 상기 항-인간 CD19 항체의 약동학 및/또는 약역학을 최적화하는, 상기 BBB를 통과하는 상기 항-인간 CD19 항체에 접합된 항체 또는 항체 단편의 수송량을 생성시키도록 선택한다.

또 다른 실시태양에서 본 명세서에 포유동물을, BBB-R에 결합하고 항-인간 CD19 항체에 결합하는 항체 또는 항체 단편으로 치료함을 포함하는, 상기 포유동물에서 신경학적 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 항체는 상기 BBB-R에 대해 낮은 친화성을 갖도록 선택되었고 이에 의해 상기 항체 및 결합된 항-인간 CD19 항체의 CNS 흡수를 개선시킨다. 하나의 실시태양에서, 상기 치료는 질환 증상의 감소 또는 제거를 생성시킨다. 또 다른 태양에서, 상기 치료는 상기 신경학적 질환의 개선을 생성시킨다.

모든 선행 태양들 중 하나의 실시태양에서, 상기 항-BBB-R 항체는 약 1 nM 내지 약 100 μM의 BBB-R에 대한 IC₅₀을 갖는다. 또 다른 상기와 같은 실시태양에서, 상기 IC₅₀은 약 5 nM 내지 약 100 μM이다. 또 다른 상기와 같은 실시태양에서, 상기 IC₅₀은 약 50 nM 내지 약 100 μM이다. 또 다른 상기와 같은 실시태양에서, 상기 IC₅₀은 약 100 nM 내지 약 100 μM이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체는 약 5 nM 내지 약 10 μM의 BBB-R에 대한 친화성을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체는 항-인간 CD19 항체에 결합될 때 약 30 nM 내지 약 1 μM의 BBB-R에 대한 친화성을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체는 항-인간 CD19 항체에 결합될 때 약 50 nM 내지 약 1 μM의 BBB-R에 대한 친화성을 갖는다. 하나의 실시태양에서, 상기 BBB-R에 대한 상기 항-BBB-R 항체 또는 항-인간 CD19 항체 융합 폴리펩타이드의 친화성을 스캐차드 분석을 사용하여 측정한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 BBB-R에 대한 상기 항-BBB-R 항체 또는 항-인간 CD19 항체 융합 폴리펩타이드의 친화성을 BIACORE 분석을 사용하여 측정한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 BBB-R에 대한 상기 항-BBB-R 항체 또는 항-인간 CD19 항체 융합 폴리펩타이드의 친화성을 경쟁 ELISA를 사용하여 측정한다.

또 다른 실시태양에서, 상기 항-인간 CD19 항체 융합 폴리펩타이드를 표지한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항-BBB-R 항체 또는 단편은 그의 고유 리간드 중 하나 이상에 대한 상기 BBB-R의 결합을 손상시키지 않는다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항-BBB-R 항체는 hTfR의 인간 트랜스페린에의 결합을 억제하지 않는 방식으로 상기 hTfR에 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항-인간 CD19 항체 융합 폴리펩타이드를 포유동물에게 투여한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 포유동물은 인간이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 포유동물은 신경학적 질환을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 상기 신경학적 질환은 알쯔하이머병(AD), 뇌졸중, 치매, 근이영양증(MD), 다발성 경화증(MS), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 낭성 섬유증, 엔젤만 증후군, 리들 증후군, 파킨슨병, 픽병, 파제트병, 암 및 외상성 뇌 손상으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.

혈액-뇌 장벽 셔틀로서 비-공유 복합체

상기 비-공유 복합체의 한 부분은 합텐에 대한 제1 결합 특이성 및 혈액-뇌-장벽 수용체(BBBR)에 대한 제2 결합 특이성을 갖는 이중특이성 항체인 혈액 뇌 장벽-셔틀 모듈(BBB-셔틀 모듈)이다. 상기와 같은 BBB-셔틀 모듈은 상기 혈액 뇌 장벽상의 세포외 배출 가능한(transcytoseable) 세포 표면 표적(예를 들어 TfR, LRP 또는 다른 표적, BBB-R)을 인식하고 동시에 합텐화된 항-인간 CD19 항체에 결합한다.

보다 상세히, 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 항체는 합텐과 접합되며 상기 혈액 뇌 장벽 셔틀의 합텐-결합 부위에 의해 복합체화된다. 상기 복합체는 한정되고 안정하며 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 합텐화된 항체를 상기 혈액 뇌 장벽에 전달한다. 상기 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 합텐화된 항체는 상기 혈액-뇌-장벽 셔틀에 의해 비-공유적인 방식으로 복합체화되므로, 상기 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 합텐화된 항체는 한편으로, 순환하는 동안 그의 전달 비히클(=혈액-뇌-장벽 셔틀=이중특이성 항체)에 결합하지만 또한 다른 한편으로 세포외 배출 후에 효율적으로 방출될 수 있다. 상기 합텐과의 접합을 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 항체의 활성을 방해하지 않으면서 수행할 수 있다. 상기 혈액-뇌-장벽 셔틀은 특이한 공유적 부가를 함유하지 않으며 따라서 면역원성의 임의의 위험을 제거한다. 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 합텐화된 항체와 상기 합텐-특이성 결합 부위를 함유하는 이중특이성 항체와의 복합체는 상기 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 항체에 대해 양성의 생물물리학적 양상을 부여한다. 더욱 또한, 상기와 같은 복합체는 상기 이중특이성 항체의 제2 결합 특이성에 의해 인식되는 항원을 나타내는 세포 또는 조직에 대한 부담을 표적화할 수 있다.

상기 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 항체는, 합텐화될 뿐만 아니라 상기 혈액-뇌-장벽 셔틀에 의해 복합체화(=이중특이성 항체)됨에도 불구하고 그의 기능을 유지한다. 또한, 상기 이중특이성 항체의 혈액-뇌-장벽 수용체 결합 부위는 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 복합체화된 합텐화된 항체의 존재하에서 그의 결합 특이성 및 친화성을 유지한다. 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 합텐화된 항체와 본 명세서에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체와의 복합체를 사용하여, 상기 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 항체를, 상기 혈액-뇌-장벽 수용체를 발현하는 세포에 특이적으로 표적화할 수 있다. 상기 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 합텐화된 항체는 상기 이중특이성 항체에 비-공유적인 방식으로 결합되기 때문에 상기 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 항체는 내면화 또는 세포외 배출 후에 방출될 수 있다.

추가의 태양에서, 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 항-인간 CD19 항체는 하기 섹션 1 내지 5에 기재된 바와 같은 특징들 중 임의의 특징을 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다:

1. 항체 친화성

몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 제공된 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, 또는 ≤ 10 nM(예를 들어 10^-8 M 이하, 예를 들어 10^-7 M 내지 10^-8 M)의 K_D 값을 갖는다.

예를 들어, K_D를 BIACORE(등록상표) 표면 플라스몬 공명 분석을 사용하여 측정할 수 있다. BIACORE(등록상표)-2000 또는 BIACORE(등록상표)-3000(비아코어 인코포레이티드(BIAcore, Inc.), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 사용하는 분석을, 약 10 응답 단위(RU)에서 고정화된 항원 CM5 칩으로 25 ℃에서 수행한다. 상기 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 비아코어 인코포레이티드)을 공급자의 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 4.8)로 5 ㎍/㎖(약 0.2 μM)로 희석한 후에 5 ㎕/분의 유량으로 주입하여 대략 10 응답 단위(RU)의 결합된 단백질을 성취한다. 상기 항원의 주입에 이어서, 1 M 에탄올아민을 주입하여 반응되지 않은 그룹들을 차단한다. 동역학적 측정을 위해서, Fab의 2배 연속 희석물(0.78 nM 내지 500 nM)을 25 ℃에서 대략 25 ㎕/분의 유량으로 0.05% 폴리솔베이트 20(트윈-20(상표)) 계면활성제(PBST)와 함께 PBS 중에서 주입한다. 결합율(k_on) 및 해리율(k_off)을 결합 및 해리 센서그램을 동시에 정합시킴으로써 간단한 1 대 1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델(비아코어(등록상표) 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수(K_D)를 k_off/k_on 비로서 계산한다(예를 들어 문헌[Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293(1999) 865-881]을 참조하시오).

2. 항체 단편

몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 비제한적으로 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, Fv, 및 scFv 단편, 및 하기에 개시되는 다른 단편들을 포함한다. 몇몇 항체 단편의 리뷰를 위해서, 문헌[Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134]을 참조하시오. scFv 단편의 리뷰를 위해서 예를 들어 문헌[Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315]; 또한 WO 93/16185; 미국특허 제 5,571,894 호 및 미국특허 제 5,587,458 호를 참조하시오. 구조 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')₂ 단편에 대한 논의에 대해서, 미국특허 제 5,869,046 호를 참조하시오.

다이아바디는 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어 EP 0 404 097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134]; 및 문헌[Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448]을 참조하시오. 트라이아바디 및 테트라바디가 또한 문헌[Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (20039 129-134)]에 개시되어 있다.

단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부 또는 경쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 항체 단편이다. 몇몇 실시태양에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(문헌[Domantis, Inc., Waltham, MA]; 예를 들어 미국특허 제 6,248,516 호를 참조하시오).

항체 단편을 본 명세서에 개시된 바와 같은 다양한 기법들, 예를 들어 비제한적으로 완전 항체의 단백질분해 절단뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예를 들어 에스케리키아 콜라이 또는 파지)에 의한 생산에 의해 제조할 수 있다.

3. 키메릭 및 인간화된 항체

본 명세서에 제공된 항체는 키메릭 항체이다. 몇몇 키메릭 항체들이 예를 들어 미국특허 제 4,816,567 호; 및 문헌[Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855)]에 개시되어 있다. 일례로, 키메릭 항체는 비-인간 가변 영역(예를 들어 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예를 들어 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메릭 항체는 상기 부류 또는 하위부류가 모 항체의 부류 또는 하위부류로부터 변화된 "부류 전환된(switched)" 항체이다. 키메릭 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.

인간화된 항체는 키메릭 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화성은 유지하면서 인간에 대한 면역원성이 감소하도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVR, 예를 들어 CDR(또는 그의 부분들)이 비-인간 항체로부터 유래되고 FR(또는 그의 부분들)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 또한 포함할 것이다. 일부 실시태양에서, 인간화된 항체 중의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화성을 복원하거나 개선시키기 위해서 비-인간 항체(예를 들어 HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.

인간화된 항체 및 그의 제조 방법들이 예를 들어 문헌[Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633]에 리뷰되어 있으며, 예를 들어 문헌[Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329]; 문헌[Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033]; 미국특허 제 5,821,337 호, 미국특허 제 7,527,791 호, 미국특허 제 6,982,321 호 및 미국특허 제 7,087,409 호; 문헌[Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34](특이성 결정 영역(SDR) 접목을 개시함); 문헌[Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498]("재표면화"를 개시함); 문헌[Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60]("FR 셔플링"을 개시함); 및 문헌[Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68] 및 문헌[Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260](FR 셔플링으로의 "유도된 선택" 접근을 개시함)에 추가로 개시되어 있다.

인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 비제한적으로 "최적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역(예를 들어 문헌[Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308]을 참조하시오); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위그룹의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들어 문헌[Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289]; 및 문헌[Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632]을 참조하시오); 인간 성숙한(체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식세포계열 프레임워크 영역(예를 들어 문헌[Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633]을 참조하시오); 및 선별 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들어 문헌[Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684] 및 문헌[Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618)]을 참조하시오)을 포함한다.

4. 다중특이성 항체

몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 제공된 항체는 다중특이성 항체, 예를 들어 이중특이성 항체이다. 다중특이성 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 단클론 항체이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 결합 특이성 중 하나는 인간 CD19에 대한 것이고 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 몇몇 실시태양에서, 이중특이성 항체는 인간 CD19의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이성 항체를 또한, 인간 CD19를 발현하는 세포에 세포독성제를 국소화시키기 위해 사용할 수 있다. 이중특이성 항체를 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조할 수 있다.

다중특이성 항체의 제조 기법은 비제한적으로 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시-발현(문헌[Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540], WO 93/08829, 및 문헌[Traunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659]을 참조하시오), 및 "놉-인투-홀" 공학(예를 들어 미국특허 제 5,731,168 호를 참조하시오)을 포함한다. 다중특이성 항체를 또한, 항체 Fc-이종이량체성 분자의 제조를 위해 정전기적 조향(steering) 효과를 조작하고(WO 2009/089004); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교결합시키고(예를 들어 미국특허 제 4,676,980 호, 및 문헌[Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83]을 참조하시오); 류신 지퍼를 사용하여 이중특이성 항체를 생성시키고(예를 들어 문헌[Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553]을 참조하시오); 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위한 "다이아바디" 기술을 사용하고(예를 들어 문헌[Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448]을 참조하시오); 단쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용하고(예를 들어 문헌[Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374]을 참조하시오); 예를 들어 문헌[Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69]에 개시된 바와 같이 삼중특이성 항체를 제조함으로써 제조할 수 있다.

"옥토퍼스 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본 발명에 포함된다(예를 들어 US　2006/0025576을 참조하시오).

본 명세서에서 항체 또는 단편은 또한 인간 CD19뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 Fab" 또는 "DAF"를 포함한다(예를 들어 US 2008/0069820을 참조하시오).

본 발명에서 항체 또는 단편은 또한 WO　2009/080251, WO　2009/080252, WO　2009/080253, WO　2009/080254, WO　2010/112193, WO　2010/115589, WO　2010/136172, WO　2010/145792, 및 WO 2010/145793에 개시된 다중특이성 항체들을 포함한다.

5. 항체 변이체

몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체를 고려한다. 예를 들어, 상기 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질들을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체를, 상기 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 적합한 변형을 도입시키거나, 또는 펩타이드 합성에 의해 제조할 수 있다. 상기와 같은 변형은 예를 들어 상기 항체의 아미노산 서열로부터의 잔기들의 결실, 및/또는 상기 서열내로의 잔기들의 삽입 및/또는 상기 서열내에서 잔기들의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 최종 구조물에 도달하도록 수행할 수 있으나, 단 최종 구조물은 목적하는 특성, 예를 들어 항원-결합성을 가져야 한다.

a) 치환, 삽입 및 결실 변이체

몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체를 제공한다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환을 하기 표에서 "바람직한 치환"의 제목하에 나타낸다. 보다 실질적인 변화를 표 1에 "예시적인 치환"의 제목하에, 및 하기에 추가로 개시하는 바와 같이 아미노산 측쇄 부류와 관련하여 제공한다. 아미노산 치환을 관심 항체에 도입시키고 생성물을 목적하는 활성, 예를 들어 유지된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별할 수 있다.

아미노산들을 공통 측쇄 성질에 따라 분류할 수도 있다:

(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존적인 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류에 대해 교환함을 수반할 것이다.

치환 변이체의 한 가지 유형은 모 항체(예를 들어 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 고가변 영역 잔기를 치환시킴을 수반한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택되는 상기 생성되는 변이체(들)는 모 항체에 비해 몇몇 생물학적 성질들(예를 들어 증가된 친화성, 감소된 면역원성)의 변형(예를 들어 개선)을 갖고/갖거나, 상기 모 항체의 몇몇 생물학적 성질들을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화성 성숙된 항체이며, 상기 항체를 편의상, 예를 들어 파지 디스플레이-기재 친화성 성숙 기법, 예를 들어 본 발명에 개시된 것들을 사용하여 생성시킬 수 있다. 간단히, 하나 이상의 HVR 잔기를 돌연변이시키고 변이체 항체를 파지상에 표시하고 특정한 생물학적 활성(예를 들어 결합 친화성)에 대해 선별한다.

변경(예를 들어 치환)을, 예를 들어 항체 친화성을 개선시키기 위해 HVR에서 수행할 수 있다. 상기와 같은 변경을 HVR "핫스폿", 즉 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 암호화된 잔기(예를 들어 문헌[Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196]을 참조하시오), 및/또는 항원과 접촉하는 잔기에서 수행할 수 있으며, 이때 생성되는 변형 VH 또는 VL을 결합 친화성에 대해 시험한다. 2차 라이브러리로부터의 제작 및 재선택에 의한 친화성 성숙이 예를 들어 문헌[Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37]에 개시되었다. 친화성 성숙의 일부 실시태양에서, 다양한 방법들 중 임의의 방법(예를 들어 오류유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오타이드-지시된 돌연변이유발)에 의해 성숙화용으로 선택된 가변 유전자내에 다양성을 도입시킨다. 이어서 2차 라이브러리를 생성시킨다. 이어서 상기 라이브러리를 목적하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 선별한다. 다양성을 도입시키는 또 다른 방법은 HVR-지시된 접근법을 포함하며, 상기 접근법에서 다수의 HVR 잔기들(예를 들어 한 번에 4 내지 6개의 잔기)이 무작위화된다. 항원 결합에 관련된 HVR 잔기를 예를 들어 알라닌 주사 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 특이적으로 확인할 수 있다. 특히 CDR-H3 및 CDR-L3를 종종 표적화한다.

몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실이, 상기와 같은 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어 본 명세서에 제공되는 바와 같은 보존적 치환)를 HVR에서 수행할 수 있다. 상기와 같은 변경은 예를 들어 상기 HVR 중의 항원 접촉 잔기의 밖에서 있을 수 있다. 상기에 제공된 변형 VH 및 VL 서열의 몇몇 실시태양에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.

돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법을 문헌[Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244(1989) 1081-1085]에 개시된 바와 같이 "알라닌 주사 돌연변이유발"이라 칭한다. 상기 방법에서, 표적 잔기들(예를 들어 하전된 잔기, 예를 들어 arg, asp, his, lys 및 glu)의 잔기 또는 그룹이 확인되며 이들을, 상기 항원과 항체와의 상호작용이 영향을 받는지를 측정하기 위해 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 치환시킨다. 추가의 치환을 상기 아미노산 위치들에 도입시켜 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 입증할 수 있다. 한편으로, 또는 추가로, 항체와 항원간의 접촉 지점들을 확인하기 위한 상기 항원-항체 복합체의 결정 구조. 상기와 같은 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기들을 치환용 후보로서 표적화하거나 제거할 수 있다. 변이체를, 상기 변이체가 목적하는 성질을 함유하는지를 측정하기 위해서 선별할 수도 있다.

아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기에서부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드까지의 길이 범위에 이르는 아미노- 및/또는 카복시-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기들의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소(예를 들어 ADEPT를 위한) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드에의 항체의 N- 또는 C-말단에의 융합을 포함한다.

b) 글리코실화 변이체

몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체를 상기 항체가 글리코실화되는 정도가 증가하거나 또는 감소하도록 변경시킨다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 첨가 또는 결실을 편의상 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 수행할 수 있다.

상기 항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 상기에 부착된 탄수화물을 변경시킬 수도 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 고유 항체는 전형적으로 상기 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 일반적으로 부착되는 분지된, 이중촉각 올리고사카라이드를 포함한다(예를 들어 문헌[Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조하시오). 상기 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물들, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코스아민(GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산뿐만 아니라 상기 이중촉각 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 중 GlcNAc에 부착된 퓨코스를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체에서 상기 올리고사카라이드의 변형을 몇몇 개선된 성질들을 갖는 항체 변이체를 생성시키기 위해 수행할 수도 있다.

하나의 실시태양에서, Fc 영역에 부착된(직접 또는 간접적으로) 퓨코스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체를 제공한다. 예를 들어, 상기와 같은 항체 중 퓨코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 상기 퓨코스의 양을, 예를 들어 WO 2008/077546에 개시된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 측정된 바와 같이 Asn297에 부착된 모든 당구조물들(예를 들어 복합체, 하이브리드 및 고 만노스 구조물)의 합에 대해, Asn297에서 상기 당 쇄 중 퓨코스의 평균량을 계산함으로써 측정한다. Asn297은 상기 Fc 영역 중 대략 297번(카밧에 따른 Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치한 아스파라진 잔기를 지칭하나; Asn297은 또한 297번 위치의 상류 또는 하류 대략 ±3 아미노산에, 즉 항체 중 작은 서열 변동으로 인해 294 내지 300번 위치에 위치할 수도 있다. 상기와 같은 퓨코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어 US 2003/0157108; US 2004/0093621을 참조하시오. "탈퓨코실화된" 또는 "퓨코스-결핍된" 항체 변이체에 관한 발행물들의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌[Okazaki, A. et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; 문헌[Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87: 614-622 (2004)]. 탈퓨코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 퓨코실화 결함 Lec13 CHO 세포(문헌[Ripka, J. et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; US 2003/0157108; 및 WO　2004/056312(특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예를 들어 알파-1,6-퓨코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예를 들어 문헌[Yamane-Ohnuki, N. et al. Biotech. Bioeng. 87: 614-622 (2004)]; 문헌[Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94:680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107을 참조하시오)를 포함한다.

이등분된 올리고사카라이드, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이중촉각 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된 항체 변이체를 추가로 제공한다. 상기와 같은 항체 변이체는 감소된 퓨코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 상기와 같은 항체 변이체의 예는 예를 들어 WO 2003/011878; 미국특허 제 6,602,684 호; 및 US 2005/0123546에 개시되어 있다. 상기 Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 중에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체를 또한 제공한다. 상기와 같은 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상기와 같은 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764에 개시되어 있다.

c) Fc-영역 변이체

몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 변형을 본 명세서에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입시켜 Fc 영역 변이체를 생성시킬 수 있다. 상기 Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.

몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 일부(전부는 아닌) 효과기 기능(이는 항체 변이체를, 생체내에서 항체의 반감기가 중요하지만 몇몇 효과기 기능(예를 들어 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 유해한 용도에 바람직한 후보로 만든다)을 갖는 항체 변이체를 제공한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들어 Fc 수용체(FcR) 결합 분석을, 항체가 FcγR 결합은 없지만(따라서 ADCC 활성이 없는 듯하다) FcRn 결합 능력은 유지함을 확실히 하기 위해 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포, NK 세포는 Fc(RIII 만을 발현하는 반면, 단세포는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈세포상의 FcR 발현이 문헌[Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 464 페이지, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비제한적인 예들이 미국특허 제 5,500,362 호(예를 들어 문헌[Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)] 및 문헌[Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)]을 참조하시오); 미국특허 제 5,821,337 호(문헌[Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)]을 참조하시오)에 개시되어 있다. 한편으로, 비-방사성 분석 방법을 사용할 수도 있다(예를 들어 유식 세포측정을 위한 ACTI(상표) 비-방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 참조하시오). 상기와 같은 분석에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 한편으로, 또는 추가로, 상기 관심 분자의 ADCC 활성을 생체내에서, 예를 들어 문헌[Clynes R., et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수도 있다. C1q 결합 분석을 또한, 항체가 C1q에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 없음을 확인하기 위해서 수행할 수 있다. 예를 들어 WO　2006/029879 및 WO　2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조하시오. 보체 활성화를 평가하기 위해서, CDC 분석을 수행할 수도 있다(예를 들어 문헌[Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202:163-171 (1996)]; 문헌[Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)]; 및 문헌[Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)]을 참조하시오). FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 측정을 또한 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다(예를 들어 문헌[Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18:1759-1769 (2006)]을 참조하시오).

감소된 효과기 기능을 갖는 항체들은 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국특허 제 6,737,056 호). 상기와 같은 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체(알라닌으로의 잔기 265 및 297의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함(미국특허 제 7,332,581 호))를 포함한다.

FcR에 대한 개선된 또는 감소된 결합을 갖는 몇몇 항체 변이체들이 개시되어 있다(예를 들어 미국특허 제 6,737,056 호; WO 2004/056312, 및 문헌[Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276: 6591-6604 (2001)]을 참조하시오).

몇몇 실시태양에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 상기 Fc 영역의 298, 333 및/또는 334번 위치(잔기의 EU 넘버링)의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.

일부 실시태양에서, 예를 들어 미국특허 제 6,194,551 호, WO　99/51642, 및 문헌[Idusogie, E.E. et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 개시된 바와 같이, Fc 영역에서, 변경된(즉 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적인 세포독성(CDC)을 생성시키는 변경을 수행한다.

증가된 반감기 및 신생아 Fc 수용체(FcRn)(모 IgG의 태아로의 전달을 맡고 있다)(문헌[Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117:587-593 (1976)] 및 문헌[Kim J.K. et al., J. Immunol. 24:2429-2434 (1994)])에의 개선된 결합을 갖는 항체들이 US2005/0014934에 개시되어 있다. 상기 항체들은 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 상기 Fc 영역을 포함한다. 상기와 같은 Fc 변이체들은 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 및 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434에서의 치환(미국특허 제 7,371,826 호)을 갖는 것들을 포함한다.

또한 Fc 영역 변이체의 다른 예들에 관한 문헌[Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322:738-740 (1988)]; 미국특허 제 5,648,260 호; 미국특허 제 5,624,821 호; 및 WO 94/29351을 참조하시오.

d) 시스테인 조작된 항체 변이체

몇몇 실시태양에서, 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 "티오MAb"를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 치환된 잔기는 상기 항체의 접근 가능한 부위에 존재한다. 상기 잔기를 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올기가 상기 항체의 접근 가능한 부위에 위치되며 이를 사용하여 본 발명에 추가로 개시된 바와 같이 상기 항체를 다른 부분, 예를 들어 약물 부분 또는 링커-약물 부분에 접합시켜 면역접합체를 생성시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 하기의 잔기들 중 임의의 하나 이상을 시스테인으로 치환시킬 수도 있다: 경쇄의 V205(카밧 넘버링); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체를 예를 들어 미국특허 제 7,521,541 호에 개시된 바와 같이 생성시킬 수 있다.

e) 항체 유도체

몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 제공된 항체를 당해 분야에 공지되고 쉽게 입수할 수 있는 추가적인 비단백질성 부분을 함유하도록 추가로 변형시킬 수 있다. 상기 항체의 유도체화에 적합한 부분은 비제한적으로 수용성 중합체를 포함한다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 그의 수 중 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 상기 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있으며 분지되거나 분지되지 않을 수도 있다. 상기 항체에 부착된 중합체들의 수는 변할 수 있으며, 하나보다 많은 중합체가 부착되는 경우, 이들 중합체는 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 상기 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형을 비제한적으로, 개선시키고자 하는 상기 항체의 특정한 성질, 상기 항체 유도체를 한정된 조건하에서 치료법에 사용할 것인지의 여부 등을 포함한 고려사항을 기준으로 결정할 수 있다.

또 다른 실시태양에서, 방사선에의 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체 및 비단백질성 부분의 접합체를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 비단백질성 부분은 탄소 나노튜브이다(문헌[Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 상기 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있으며, 비제한적으로 통상적인 세포에는 해롭지 않지만 상기 비단백질성 부분을 상기 항체-비단백질성 부분에 근접한 세포를 죽이는 온도로 가열하는 파장을 포함한다.

B. 재조합 방법 및 조성물

항체를 예를 들어 미국특허 제 4,816,567 호에 개시된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생성시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 명세서에 개시된 항-인간 CD19 항체를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 상기와 같은 핵산은 항체(예를 들어 상기 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)의 VH을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 상기와 같은 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어 발현 벡터)를 제공한다. 추가의 실시태양에서, 상기와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 하나의 상기와 같은 실시태양에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 상기 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 상기 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 상기 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다(예를 들어 이들 벡터로 형질전환되었다). 하나의 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 진핵생물, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프양 세포(예를 들어 Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 하나의 실시태양에서, 항-인간 CD19 항체의 제조 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 항체의 발현에 적합한 조건하에서, 상기에 제공된 바와 같은, 상기 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 임의로 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 회수함을 포함한다.

항-인간 CD19 항체의 재조합 생성을 위해서, 예를 들어 상술한 바와 같은, 항체를 암호화하는 핵산을 단리하고 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입한다. 상기와 같은 핵산을 통상적인 과정을 사용하여(예를 들어 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 탐침을 사용함으로써) 쉽게 단리하고 서열분석할 수 있다.

항체-암호화 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본 발명에 개시된 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체를, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우, 세균에서 생성시킬 수 있다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩타이드의 발현에 대해서, 예를 들어 미국특허 제 5,648,237 호, 미국특허 제 5,789,199 호 및 미국특허 제 5,840,523 호를 참조하시오. (또한 에스케리키아 콜라이에서의 항체 단편의 발현을 개시하는 문헌[Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254]을 참조하시오). 발현 후에, 상기 항체를 용액 분획 중 세균 세포 페이스트로부터 단리하고 추가로 정제할 수 있다.

원핵생물 외에, 진핵 미생물, 예를 들어 섬유상 진균 또는 효모, 예를 들어 글리코실화 경로가 "인간화되어" 부분적인 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생산하는 진균 및 효모 균주가 항체-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌[Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414]; 및 문헌[Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215]을 참조하시오.

글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포이다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 동정되었다.

식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어 미국특허 제 5,959,177 호, 미국특허 제　6,040,498 호, 미국특허 제 6,420,548 호, 미국특허 제 7,125,978 호 및 미국특허 제　6,417,429 호(트랜스제닉 식물에서 항체를 생성시키기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)(상표) 기술을 개시한다)를 참조하시오.

척추동물 세포를 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어 현탁액에서 증식시키기에 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통; 인간 배아 신장 계통(예를 들어 문헌[Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74]에 개시된 바와 같은 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예를 들어 문헌[Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252]에 개시된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK; 버팔로 래트 간세포(BRL 3A); 인간 폐세포(W138); 인간 간세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); 예를 들어 문헌[Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68]에 개시된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예를 들어 DHFR^- CHO 세포(문헌[Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220]); 및 골수종 세포주, 예를 들어 Y0, NS0 및 Sp2/0를 포함한다. 항체 생산에 적합한 몇몇 포유동물 숙주 세포주에 대한 리뷰에 대해서, 예를 들어 문헌[Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268]을 참조하시오.

C. 분석

본 명세서에 제공된 항-인간 CD19 항체를 당해 분야에 공지된 다양한 분석에 의해 그의 물리/화학적 성질 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인하거나, 선별하거나 특성화할 수 있다.

1. 결합 분석 및 다른 분석

하나의 태양에서, 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체를 예를 들어 공지된 방법, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블럿 등에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 시험한다.

2. 활성 분석

하나의 태양에서, 생물학적 활성을 갖는 항-인간 CD19 항체를 확인하기 위한 분석을 제공한다. 생물학적 활성은 예를 들어 B-세포 증식의 억제 또는 B-세포의 살해를 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내에서 상기와 같은 생물학적 활성을 갖는 항체들을 또한 제공한다.

몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체를 상기와 같은 생물학적 활성에 대해 시험한다.

D. 면역접합체

본 명세서에 또한 하나 이상의 세포독성제, 예를 들어 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된 본 명세서에 보고된 바와 같은 항-인간 CD19 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.

하나의 실시태양에서, 면역접합체는, 항체가 하나 이상의 약물, 예를 들어 비제한적으로 메이탄시노이드(미국특허 제　5,208,020 호, 미국특허 제 5,416,064 호 및 EP 0 425 235 B1를 참조하시오); 아우리스타틴, 예를 들어 모노메틸 아우리스타틴 약물 부분 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국특허 제 5,635,483 호, 미국특허 제 5,780,588 호, 및 미국특허 제 7,498,298 호); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그의 유도체(미국특허 제 5,712,374 호, 미국특허 제 5,714,586 호, 미국특허 제 5,739,116 호, 미국특허 제 5,767,285 호, 미국특허 제 5,770,701 호, 미국특허 제 5,770,710 호, 미국특허 제 5,773,001 호, 및 미국특허 제 5,877,296 호; 문헌[Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342]; 및 문헌[Lode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928]을 참조하시오); 안트라사이클린, 예를 들어 다우노마이신 또는 독소루비신(문헌[Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523]; 문헌[Jeffrey, S.C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362]; 문헌[Torgov, M.Y. et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721]; 문헌[Nagy, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834]; 문헌[Dubowchik, G.M. et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532]; 문헌[King, H.D. et al., J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343]; 및 미국특허 제 6,630,579 호를 참조하시오); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예를 들어 도세탁셀, 패클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀; 트라이코테센; 및 CC1065를 포함하는 약물에 접합된 항체-약물 접합체(ADC)이다.

또 다른 실시태양에서, 면역접합체는 효소 활성 독소 또는 그의 단편, 예를 들어 비제한적으로 디프테리아-A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알류라이테스 포르디이 단백질, 다이안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트라이코테센에 접합된 본 발명에 개시된 바와 같은 항체를 포함한다.

또 다른 실시태양에서, 면역접합체는 방사성 원자에 접합되어 방사성접합체를 형성하는 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소들을 방사성접합체의 생성에 이용할 수 있다. 예를 들어 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹², 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 상기 방사성접합체가 검출에 사용되는 경우 상기 접합체는 섬광조영술 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 TC^99m 또는 I¹²³, 또는 핵자기 공명(NMR) 영상화(또한 자기공명 영상화, MRI로서 공지됨)용 스핀 표지, 예를 들어 다시 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.

항체 및 세포독성제의 접합체를 다양한 이중기능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스터의 이중작용성 유도체(예를 들어 다이메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스터(예를 들어 다이숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들어 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예를 들어 비스(p-아지도벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예를 들어 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소시아네이트(예를 들어 톨루엔 2,6-다이아이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌[Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104]에 개시된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-아이소티오시아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민 펜타아세트산(MX-DTPA)은 상기 항체에의 방사성핵종의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO 94/11026을 참조하시오. 상기 링커는 세포 중의 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "절단성 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정성 링커, 다이메틸 링커 또는 다이설파이드-함유 링커(문헌[Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131]; 미국특허 제 5,208,020 호)를 사용할 수 있다.

상기 면역접합체 또는 ADC는 가교결합제 시약, 예를 들어 비제한적으로 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB(숙신이미딜-4-(비닐설폰)벤조에이트)(이들은 예를 들어 피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology, Inc.), 미국 일리노이주 록빌 소재)로부터 상업적으로 입수할 수 있다)로 제조된 상기와 같은 접합체가 본 발명에서 명백히 고려된다.

E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물

몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 제공된 항-인간 CD19 항체 중 어느 하나는 생물학적 샘플 중의 인간 CD19 제공 세포의 존재를 검출하기에 유용하다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "검출하는"이란 용어는 정량적인 또는 정성적인 검출을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예를 들어 혈액, 혈청, 또는 혈장을 포함한다.

하나의 실시태양에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-인간 CD19 항체를 제공한다. 추가의 태양에서, 생물학적 샘플 중의 인간 CD19 제공 세포의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 방법은 상기 생물학적 샘플을 상기 항-인간 CD19 항체의 인간 CD19에의 결합을 허용하는 조건하에서 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-인간 CD19 항체와 접촉시키고, 상기 항-인간 CD19 항체와 인간 CD19 간에 복합체가 형성되는 지를 검출함을 포함한다. 상기와 같은 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 항-인간 CD19 항체를 사용하여, 예를 들어 인간 CD19가 환자의 선택을 위한 생물마커인 경우, 항-인간 CD19 항체에 의한 요법에 적격인 피실험자를 선택한다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적인 질환은 다발성 골수종을 제외한 B-세포암, 예를 들어 B-세포 림프종 및 B-세포 백혈병, 예를 들어 비-호지킨 골수종 및 급성 림프모구성 백혈병을 포함한다.

몇몇 실시태양에서, 표지된 항-인간 CD19 항체를 제공한다. 표지는 비제한적으로 직접 검출되는 표지 또는 부분(예를 들어 형광성, 발색성, 전자-밀집성, 화학발광성 및 방사성 표지)뿐만 아니라, 예를 들어 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 부분들, 예를 들어 효소 또는 리간드를 포함한다. 예시적인 표지는 비제한적으로 방사성동위원소 ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H 및 ¹³¹I, 형광단, 예를 들어 희토 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리페라제, 예를 들어 개똥벌레 루시페라제 및 세균 루시페라제(미국특허 제 4,737,456 호), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제(과산화 수소를 사용하여 염료 전구체, 예를 들어 HRP를 산화시키는 효소와 결합된), 락토퍼옥시다제, 또는 미세퍼옥시다제, 비오틴/아비딘, 회전 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함한다.

F. 약학 제형

본 명세서에 보고된 바와 같은 항-인간 CD19 항체의 약학 제형을, 목적하는 정도의 순도를 갖는 상기와 같은 항체를 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성이며, 상기 담체는 비제한적으로 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 보존제(예를 들어 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 대이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 본 명세서에서 예시적인 약학적으로 허용 가능한 담체는 간질성 약물 분산제, 예를 들어 용해성 중성-활성 히아루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어 인간 용해성 PH-20 히아루로니다제 당단백질, 예를 들어 rhuPH20(하이레넥스(HYLENEX)(등록상표), 박스터 인터내셔널 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rhuPH20을 포함한 몇몇 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법이 미국특허 공보 2005/0260186 및 2006/0104968에 개시되어 있다. 하나의 태양에서, sHASEGP를 하나 이상의 추가적인 클리코스아미노글리카나제, 예를 들어 콘드로이티나제와 병용한다.

예시적인 동결건조된 제형들이 미국특허 제 6,267,958 호에 개시되어 있다. 수성 항체 제형은 미국특허 제 6,171,586 호 및 WO2006/044908에 개시된 것들을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.

본 명세서에서 상기 제형은 또한 치료하려는 특정 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 성분들, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보성 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 상기와 같은 활성 성분들은 적합하게는 의도된 목적에 유요한 양으로 함께 존재한다.

활성 성분을 예를 들어 코아세르베이션 기법에 의해서 또는 계면 중합에 의해서 제조된 미세캡슐, 예를 들어 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어 리포솜, 알부민 미소구, 미세유화액, 나노-입자 및 나노캡슐) 중의 또는 거대유화액 중의 각각의 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메트아크릴레이트) 미세캡슐 중에 포집할 수 있다. 상기와 같은 기법들은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)]에 개시되어 있다.

서방성 제제를 제조할 수도 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 상기 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 기질(상기 기질은 성형품, 예를 들어 필름 또는 미세캡슐의 형태이다)을 포함한다.

생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 수행될 수 있다.

G. 치료 방법 및 조성물

본 명세서에 제공된 항-인간 CD19 항체 중 임의의 항체를 치료 방법에, 단독으로 또는 함께, 단일특이성 항체 또는 다중특이성 항체로서 사용할 수 있다.

CD19는 줄기 세포 및 형질 세포를 제외하고 대부분의 B-세포(범-B-세포 마커)상에서 발현되며, 대부분의 인간 B-세포암(종양 관련 항원)상에서, 예를 들어 다발성 골수종을 제외한 골수종 및 백혈병 상에서, 예를 들어 비-호지킨 림프종 및 급성 림프모구성 백혈병에서 흔히 발현된다.

상이한 세포 집단상의 2개의 세포 표면 단백질을 인식하는 이중특이성 항체는 병원성 표적 세포의 파괴를 위해 세포독성 면역 세포를 재지시할 가망을 갖는다.

하나의 태양에서, 약제로서 사용하기 위한 항-인간 CD19 항체를 제공한다. 추가의 태양에서, B-세포암의 치료에 사용하기 위한 항-인간 CD19 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-인간 CD19 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 B-세포암을 갖는 개체에게 유효량의 항-인간 CD19 항체를 투여함을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 항-CD19 항체를 제공한다. 하나의 상기와 같은 실시태양에서, 상기 방법은 상기 개체에게 유효량의 적어도 하나의 추가적인 치료제를 투여함을 추가로 포함한다. 추가의 실시태양에서, 본 명세서에 B-세포의 고갈에 사용하기 위한 항-인간 CD19 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 개체에게 B-세포 고갈에 유효한 항-인간 CD19 항체를 투여함을 포함하는 상기 개체에서 B-세포의 고갈 방법에 사용하기 위한 항-인간 CD19 항체를 제공한다. 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 "개체"은 바람직하게는 인간이다. 상기 B-세포암은 하나의 실시태양에서 B-세포 림프종 또는 B-세포 백혈병이다. 하나의 실시태양에서 상기 B-세포암은 비-호지킨 림프종 또는 급성 림프모구성 백혈병이다.

추가의 태양에서, 암 면역요법에 사용하기 위한 항-인간 CD19 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 암 면역요법의 방법에 사용하기 위한 항-인간 CD19 항체를 제공한다. 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 "개체"은 바람직하게는 인간이다.

추가의 태양에서, 본 명세서에 약제의 제작 또는 제조에서 항-인간 CD19 항체의 용도를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 약제는 B-세포암 치료용이다. 추가의 실시태양에서, 상기 약제는 B-세포암이 있는 개체에게 유효량의 상기 약제를 투여함을 포함하는 상기 암의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 하나의 상기와 같은 실시태양에서, 상기 방법은 상기 개체에게 유효량의, 예를 들어 하기에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 치료제를 투여함을 또한 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 약제는 B-세포 고갈용이다. 추가의 실시태양에서, 상기 약제는 개체에게 B-세포 고갈에 유효한 양의 상기 약제를 투여함을 포함하는 상기 개체에서 B-세포의 고갈 방법에 사용하기 위한 것이다. 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 "개체"은 바람직하게는 인간이다. 상기 B-세포암은 하나의 실시태양에서 B-세포 림프종 또는 B-세포 백혈병이다. 하나의 실시태양에서 상기 B-세포암은 비-호지킨 림프종 또는 급성 림프모구성 백혈병이다.

추가의 실시태양에서, 본 명세서에 B-세포암을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 방법은 상기와 같은 B-세포암을 갖는 개체에게 유효량의 항-인간 CD19 항체를 투여함을 포함한다. 하나의 상기와 같은 실시태양에서, 상기 방법은 상기 개체에게 유효량의, 하기에 기재하는 바와 같은 적어도 하나의 추가적인 치료제를 투여함을 또한 포함한다. 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 "개체"은 인간일 수 있다. 상기 B-세포암은 하나의 실시태양에서 B-세포 림프종 또는 B-세포 백혈병이다. 하나의 실시태양에서 상기 B-세포암은 비-호지킨 림프종 또는 급성 림프모구성 백혈병이다.

추가의 태양에서, 본 명세서에 개체에서 B-세포를 고갈시키기 위한 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 방법은 상기 개체에게 B-세포 고갈에 유효한 양의 항-인간 CD19 항체를 투여함을 포함한다. 하나의 실시태양에서, "개체"은 인간이다. 상기 B-세포암은 하나의 실시태양에서 B-세포 림프종 또는 B-세포 백혈병이다. 하나의 실시태양에서 상기 B-세포암은 비-호지킨 림프종 또는 급성 림프모구성 백혈병이다.

추가의 태양에서, 본 명세서에 예를 들어 상기 치료학적 방법들 중 어느 하나에 사용하기 위한, 본 명세서에 보고된 바와 같은 항-인간 CD19 항체들 중 어느 하나를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 약학 제형은 본 명세서에 보고된 바와 같은 항-인간 CD19 항체 중 어느 하나 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 약학 제형은 본 명세서에 보고된 바와 같은 항-인간 CD19 항체들 중 어느 하나 및 적어도 하나의 추가적인 치료제를 포함한다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 항체를 하나의 치료법에서 단독으로 또는 다른 작용제들과 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체를 적어도 하나의 추가적인 치료제와 동시-투여할 수 있다.

상기에 나타낸 상기와 같은 복합 요법은 병행 투여(이때 2개 이상의 치료제를 동일한 또는 별도의 제형 중에 포함시킨다), 및 별도 투여(이 경우에 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체의 투여를 추가적인 치료제 또는 치료제들의 투여 전에, 상기 투여와 동시에, 및/또는 상기 투여에 이어서 수행할 수 있다)를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 항-인간 CD19 항체의 투여 및 추가적인 치료제의 투여는 서로 약 1개월 이내에, 또는 약 1, 2 또는 3주 이내에, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6일 이내에 일어난다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 항체(및 임의의 추가적인 치료제)를 임의의 적합한 수단, 예를 들어 비경구, 폐내 및 비내, 및 국소 치료를 원하는 경우, 병변내 투여에 의해 투여할 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 부분적으로 투여가 짧은지 또는 만성적인지에 따라, 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다. 본 발명에서는 비제한적으로 다양한 시점들에 걸친 단일 또는 수회 투여, 일시 투여, 및 펄스 주입을 포함한 다양한 투여 스케줄이 고려된다.

본 명세서에 보고된 바와 같은 항체를 양호한 의학적 실행과 일관되는 방식으로 제형화하고, 복용시키고, 투여할 수 있다. 이와 관련하여 고려되는 인자들은 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개체 환자의 임상적 조건, 질환의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 종사자에게 공지된 다른 인자들을 포함한다. 상기 항체를 문제의 질환을 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와, 필요하지는 않지만, 임의로 제형화한다. 상기와 같은 다른 작용제의 유효량은 상기 제형 중에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 치료제의 유형, 및 상기에 논의된 다른 인자들에 따라 변한다. 이들은 본 발명에 개시된 바와 동일한 투여량으로 및 투여 경로에 따라, 또는 본 발명에 개시된 투여량의 대략 1 내지 99%, 또는 실험적으로/임상적으로 적합한 것으로 결정된 임의의 투여량으로 및 임의의 경로에 의해 일반적으로 사용된다.

질병의 예방 또는 치료를 위해서, 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체의 적합한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가적인 치료제와 함께 사용될 때)은 치료되는 질병의 유형, 항체의 유형, 상기 질병의 중증도 및 과정, 상기 항체가 예방 또는 치료 목적으로 사용되는지의 여부, 선행 치료법, 환자의 임상 병력 및 상기 항체에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 변할 것이다. 상기 항체를 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여한다. 상기 질병의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/㎏ 내지 15 ㎎/㎏(예를 들어 0.5 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏)의 항체가, 예를 들어 1회 이상의 분리 투여에 의한 것이든 또는 연속 주입에 의한 것이든 간에, 상기 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 임의의 전형적인 1일 투여량은 상기 언급한 인자들에 따라 약 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸쳐 반복된 투여를 위해서, 상기 조건에 따라, 상기 치료를 일반적으로는 질병 증상의 목적하는 억제가 발생할 때까지 지속할 수 있다. 상기 항체의 하나의 예시적인 투여량은 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 4.0 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏(또는 이들의 임의의 조합)의 1회 이상의 용량을 상기 환자에게 투여할 수 있다. 상기와 같은 용량을 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다(예를 들어 상기 환자가 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 상기 항체를 수령하도록) 투여할 수 있다. 초기의 보다 높은 부하 용량에 이어서 하나 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수도 있다. 그러나, 다른 복용 섭생이 유용할 수도 있다. 상기 치료법의 진행을 통상적인 기법 및 분석에 의해 용이하게 모니터한다.

본 명세서에 염증 질병, 자가면역질병, 류머티스성 관절염, 루푸스, 건선 및 골 질병이 있는 것으로 진단된(따라서 치료법이 필요한) 환자에게 본 명세서에 보고된 바와 같은 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 항체를 투여함을 포함하는, 상기 질병의 치료 방법을 추가로 제공한다. 상기 항체를 약학 조성물 중에서, 단독으로 또는 한편으로 염증 질병, 자가면역질병, 류머티스성 관절염, 루푸스, 건선 또는 골 질병의 치료를 위한 다른 약제와 함께 투여할 수 있다. 상기 항체를 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.

본 명세서에 염증 질병, 자가면역질병, 류머티스성 관절염, 루푸스, 건선 또는 골 질병의 치료를 위한, 및 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체를 포함하는 약학 조성물의 제조를 위한 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체의 용도를 추가로 제공한다. 또한, 본 명세서에, 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 명세서에 염증 질병, 자가면역질병, 류머티스성 관절염, 루푸스, 건선 또는 골 질병의 치료를 위한 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체를 추가로 제공한다.

본 명세서에 염증 질병, 자가면역질병, 류머티스성 관절염, 루푸스, 건선 또는 골 질병의 치료를 위한 약학 조성물의 제조를 위한 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체의 용도를 추가로 제공한다. 상기 항체는 약학적으로 유효한 양으로 사용된다.

상기 제형들 및 치료 방법들 중 어느 하나를 항-인간 CD19 항체 대신에 또는 상기 항체 외에 본 명세서에 보고된 바와 같은 면역접합체를 사용하여 수행할 수 있는 것으로 생각된다.

III. 제품

또 다른 태양에서, 상술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품을 제공한다. 상기 제품은 용기 및 상기 용기 상의 또는 상기 용기와 결합된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등을 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질들, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 조성물을 단독으로, 또는 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 함께 유지하며 멸균 출입구를 가질 수 있다(예를 들어 상기 용기는 정맥내 용액 주머니 또는 피하주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 상기 조성물 중의 적어도 하나의 활성제는 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체이다. 상기 표지 또는 패키지 삽입물은 상기 조성물이 선택 상태의 치료에 사용됨을 가리킨다. 더욱이, 상기 제품은 (a) 조성물이 함유된 제1 용기(여기에서 상기 조성물은 본 명세서에 보고된 바와 같은 항체를 포함한다); 및 (b) 조성물이 함유된 제2 용기(여기에서 상기 조성물은 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 상기 실시태양에서 제품은 상기 조성물을 사용하여 특정 상태를 치료할 수 있음을 가리키는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 한편으로, 또는 추가로, 상기 제품은 약학적으로 허용 가능한 완충제, 예를 들어 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 물품은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직할 수 있는 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수도 있다.

상기 제품 중 임의의 물품이 항-인간 CD19 항체 대신에 또는 상기 항체 외에 본 명세서에 보고된 바와 같은 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 생각된다.

IV. 서열 목록의 설명

서열번호: 1 마우스 항-인간 CD19 항체 8B8 중쇄 가변 도메인

서열번호: 2 마우스 항-인간 CD19 항체 8B8 경쇄 가변 도메인

서열번호: 3 마우스 항-인간 CD19 항체 8B8 HVR-H1

서열번호: 4 마우스 항-인간 CD19 항체 8B8 HVR-H2

서열번호: 5 마우스 항-인간 CD19 항체 8B8 HVR-H3

서열번호: 6 마우스 항-인간 CD19 항체 8B8 HVR-L1

서열번호: 7 마우스 항-인간 CD19 항체 8B8 HVR-L2

서열번호: 8 마우스 항-인간 CD19 항체 8B8 HVR-L3

서열번호: 9 인간화된 중쇄 가변 도메인

서열번호: 10 내지 28 교번하는 인간화된 경쇄 가변 도메인 변이체 및 인간 화된 HVR-L1 변이체의 서열

V. 항체 명명법

VI. 실시예

하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예들이다. 상기에 제공된 일반적인 설명이 제공되는 경우, 다양한 다른 실시태양들을 실행할 수 있는 것으로 생각된다.

상기 발명을 명확한 이해를 위해 예시 및 실시예에 의해 일부 상세히 개시하였지만, 상기 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석해서는 안 된다. 본 명세서에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 명세는 내용 전체가 특별히 참고로 포함된다.

실시예 1

마우스 항-인간 CD19 항체( 하이브리도마 )의 면역화 및 생성

Balb/c 마우스를 CD19-형질감염된 HEK293 세포(평균 수용체 밀도 35,000/세포)로 6회 면역시키고 추가 면역시켰다. 상기 면역 응답을 인간 CD19-형질감염된 NIH-3T3 세포상에서 CD19-세포-ELISA로 혈청 샘플을 시험함으로써 모니터하였다. 항-인간 CD19 항체의 충분한 역가를 갖는 마우스로부터의 비장 세포를 마우스 골수종 세포주 P3X63 Ag8.653과의 융합에 의해 불멸화에 사용하였다. 3회의 융합을 수행하였으며 하이브리도마 상등액을 인간 CD19-형질감염된 NIH-3T3 세포상에서의 세포-ELISA 및 항-인간 CD19 특이성 항체에 대한 다우디(Daudi)(CD19⁺) 및 CD19^- 세포를 사용하는 FACS 결합 분석에 의해 선별하였다.

실시예 2

항-CD19 항체의 하이브리도마 선별 및 세포 생물학적 기능 평가

hCD19에 대한 항체 선별을 위한 세포-ELISA

세포 ELISA를 하이브리도마의 선별, 및 인간-CD19에 대한 항체를 분비하는 하이브리도마의 확인을 위해 적용하였다. 인간-CD19로 형질감염된 NIH3T3 세포를 양성 세포로서 사용하였으며; 형질감염되지 않은 NIH3T3 세포를 음성 대조용 세포로서 사용하였다. 상기 양성 하이브리도마의 평가를 위해서 형질감염된 및 형질감염되지 않은 NIH3T3 세포간의 OD 비를 정량분석하였다.

- 배양 배지: - DMEM 고 글루코스(4.5　㎎/㎖), 10　% FCS, Na-피루베이트, NEAA, 글루타민

- 양성 대조용 항체: 항 CD19 단클론 항체(IgG1) 파밍겐(Pharmingen) Cat# 555409 c = 1　㎎/㎖

- 검출 항체: 염소 항-마우스 IgG(H+L) HRP 접합체 바이오 래드(Bio-Rad) Cat# 170-06516

- 희석 1x ELISA 차단 시약 중 1:2000

- 다른 시약들: 피브로넥틴 롯슈(Roche) Cat# 838039 c = 1　㎎/㎖

- 글루타르다이알데하이드: 25　% 모액 // 아가 과학 등급(Grade Agar Scientific) #R102 최종 농도: PBS 중 0.05　%

- ELISA 차단 시약: 10x 모액 // 롯슈 Cat# 1112589

- TMB 기질: 롯슈 Cat# 11432559

- 정지액: 1　M H₂SO₄

- 바이오래드 Cat# 170-6516 희석 1x ELISA 차단 시약 중 1:2000

제1일:

- 피브로넥틴 코팅: PBS 중의 5 ㎍/㎠; 96 웰 플레이트 = 32 ㎠; 6 ㎖ 중의 160 ㎍/플레이트

- PBS, 50 ㎕/웰

- RT에서 45분 배양, 코팅액 흡출

- 96 웰 플레이트에서 50 ㎕ 배양 배지 중에서 1.25 x 10⁴ 세포/웰 시딩

- 37 ℃에서 40시간 배양

- 상기 플레이트의 상부 절반까지 가함: CD19를 발현하는 NIH3T3 세포

- 상기 플레이트의 하부 절반까지 가함: 형질감염되지 않은 NIH3T3 세포

제3일:

- 50 ㎕ 배양 배지 중의 양성 대조용 항체 또는 샘플(상등액 또는 마우스 혈청)의 첨가

- 4 ℃에서 2시간 동안 배양

- 배지 제거, 세포를 100 ㎕ 글루타르다이알데하이드(PBS 중의 0.05%)로 고정시킴

- 200 ㎕ PBS로 2회 세척

- 검출 항체의 첨가 1:2000, 50 ㎕/웰

- RT에서 2시간 배양

- 200 ㎕ PBS로 3회 세척

- 50 ㎕ TMB 첨가, RT에서 30분 동안 배양,

- 25 ㎕ 1 M H₂SO₄의 첨가에 의해 정지시킴; 450 ㎚/620 ㎚에서 소광 판독

- 결과의 계산: NIH3T3 CD19 OD:형질감염되지 않은 NIH3T3 OD의 비

실시예 3

항-CD19 항체의 인간화

마우스 항체의 CD19 결합 특이성을, 인체가 이물질로서 인식하는 서열 신장부로부터 제기되는 잠재적인 면역원성 문제를 제거하기 위해서 인간 수용체 프레임워크상으로 전달하였다. 이를, 상기 마우스(공여체) 항체의 전체 상보성 결정 영역(CDR)을 인간(수용체) 항체 프레임워크상에 접목시킴으로써 수행하였으며, 이를 CDR-접목 또는 항체 인간화라 칭한다.

상기 마우스 아미노산 서열을 인간 생식세포계열 항체 V 유전자의 콜렉션과 정렬시키고, 서열 일치성 및 상동성에 따라 분류하였다. 하나의 특정한 수용체 서열을 선택하기 전에, 상기 공여체 항체의 소위 정규 고리 구조를 결정해야 한다(문헌[Morea, V., et al., Methods, Vol 20, Issue 3 (2000) 267-279]). 상기 정규 고리 구조는 소위 정규 위치에 존재하는 잔기들의 유형에 의해 결정된다. 상기 위치는 (부분적으로) 상기 CDR 영역 밖에 놓이며, 모(공여체) 항체의 CDR 입체구조를 유지하기 위해서 최종 구조물 중에서 기능상 균등하게 유지되어야 한다. 상기 인간 생식세포계열 서열 VBASE_VH1_1이 상기 중쇄에 대한 수용체로서 선택되었고 서열 VBASE_VK2_5가 상기 경쇄에 대해 선택되었다. 이는 야생형 인간화된 항체를 생성시켰다.

실시예 4

CD19 결합 항체의 발현

항체 가변 도메인 암호화 서열을 유전자 합성에 의해 생성시켰다.

각각의 점 돌연변이들을 도입시키기 위해서, 33머 프라이머 기재 고속 변화 반응을 수행하였다. 모든 서열을 서열분석(세퀴서브(SequiServe), 바테르스테텐(Vaterstetten), 독일 소재)에 의해 확인하였다. 모든 서열을, 에스케리키아 콜라이에서 선택 및 번식을 가능하게 하는 벡터에 클로닝시켰다(벡터 pUC18로부터의 복제 기원, 암피실린 내성의 경우 베타-락타마제). 상기 벡터는 포유동물 세포에서 발현을 가능하게 하는 카세트를 추가로 함유한다(엡스타인 바 바이러스(EBV)의 복제 기원, OriP, 인간 거대세포바이러스(HCMV)로부터의 전초기 인헨서 및 프로모터 및 폴리아데닐화 서열).

항체 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 모든 유전자 분절들에 신호 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열(MGWSCIILFLVATATGVHS; 서열번호 29)이 선행한다. 상기 단백질은 현탁액 중의 일시 형질감염 인간 배아 신장 HEK 293 세포에 의해 발현되었다. 상기 세포를 37 ℃ 및 8% CO₂에서 배양하였다. 형질감염 당일에, 세포를 새로운 배지에 1 내지 2x10⁶ 생육성 세포/㎖의 밀도로 시딩하였다. 동몰량의 중쇄 및 경쇄 플라스미드 DNA를 모두 동시-형질감염시켰다. 세포 배양 상등액을 형질감염 후 7일째에 수확하고, 원심분리시키고(4 ℃에서 45분 동안 14,000 x g), 후속으로 0.22-㎛ 필터를 통해 여과하였다. 상기 상등액을 정제 전에 동결시키고 -20 ℃에서 보관할 수 있었다.

실시예 5

CD19 결합 항체의 정제

일반적인 방법:

무세포 발효 상등액(HEK 293F)을 5분의 접촉시간으로 예비-평형화된(포스페이트 완충된 염수, PBS) 단백질 A 친화성 컬럼(MabSelect(상표)SuRe, GE 헬쓰케어, 8 x 100 ㎜)상에 로딩한다. 세척(PBS, 5 컬럼 부피) 후에 상기 항체를 25 mM 시트르산/NaOH(pH 3.0)로 용출시킨다. 용출물을 1 M 트리스로 pH 5.5로 조절하고 4 ℃에서 밤새 배양한다. 그 후에 최종 여과(0.45 ㎛)를 수행한다:

항-인간 CD19 항체 변이체 5(S27eP)의 정제:

무세포 발효 상등액(244 ㎖, HEK 293F)을 5분의 접촉시간으로 예비-평형화된(포스페이트 완충된 염수, PBS) 단백질 A 친화성 컬럼(MabSelect(상표)SuRe, GE 헬쓰케어, 8 x 100 ㎜)상에 로딩하였다. 세척(PBS, 5 컬럼 부피) 후에 상기 항체를 25 mM 시트르산/NaOH(pH 3.0)로 용출시켰다. 용출물을 1 M 트리스로 pH 5.5로 조절하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 최종 여과(0.45 ㎛)는 31.3 ㎎(5.7 ㎖, 5.45 ㎎/㎖) 99.0%(SEC) 순수한 생성물을 생성시켰다.

항-인간 CD19 항체 변이체 9(S27eP/N28S)의 정제:

무세포 발효 상등액(260 ㎖, HEK 293F)을 5분의 접촉시간으로 예비-평형화된(PBS) 단백질 A 친화성 컬럼(MabSelect(상표)SuRe, GE 헬쓰케어, 8 x 100 ㎜)상에 로딩하였다. 세척(PBS, 5 컬럼 부피) 후에 표적 단백질을 25 mM 시트르산/NaOH(pH 3.0)로 용출시켰다. 용출물을 1 M 트리스(pH 9.0)로 pH 5.5로 조절하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 최종 여과(0.2 ㎛)는 9.1 ㎎(5.2 ㎖, 1.75 ㎎/㎖) 98.0%(SEC) 순수한 생성물을 생성시켰다.

실시예 6

CD19 ECD 발현 세포의 제공 및 상기에 대한 항체의 결합

HEK293 세포를 리포펙타민(LipofectAmine) 2000을 사용하여 1 ㎍의 플라스미드 DNA/1.5 x 10⁶ 세포로 형질감염시키고 그 후에 37 ℃에서 48시간 동안 배양하였다. 상기 플라스미드는 세포외 제시를 위해 인간 PSCA GPI 고정 서열(DTDLCNASGA HALQPAAAIL ALLPALGLLL WGPGQL; 서열번호 31)에 융합된 인간 CD19(PEEPLVVKVE EGDNAVLQCL KGTSDGPTQQ LTWSRESPLK PFLKLSLGLP GLGIHMRPLA IWLFIFNVSQ QMGGFYLCQP GPPSEKAWQP GWTVNVEGSG ELFRWNVSDL GGLGCGLKNR SSEGPSSPSG KLMSPKLYVW AKDRPEIWEG EPPCLPPRDS LNQSLSQDLT MAPGSTLWLS CGVPPDSVSR GPLSWTHVHP KGPKSLLSLE LKDDRPARDM WVMETGLLLP RATAQDAGKY YCHRGNLTMS FHLEITARPV LWHWLLRTGG WK; 서열번호 30) 또는 시노몰구스 원숭이 CD 19(PQEPLVVKVE EGDNAVLQCL EGTSDGPTQQ LVWCRDSPFE PFLNLSLGLP GMGIRMGPLG IWLLIFNVSN QTGGFYLCQP GLPSEKAWQP GWTVSVEGSG ELFRWNVSDL GGLGCGLKNR SSEGPSSPSG KLNSSQLYVW AKDRPEMWEG EPVCGPPRDS LNQSLSQDLT MAPGSTLWLS CGVPPDSVSR GPLSWTHVRP KGPKSSLLSL ELKDDRPDRD MWVVDTGLLL TRATAQDAGK YYCHRGNWTK SFYLEITARP ALWHWLLRIG GWKV; 서열번호 31) 세포외 도메인(ECD)을 암호화하였다. 상기 각각의 형질감염된 세포를 FACS 완충제(5% 소 태아 혈청(FCS)을 함유하는 PBS)에서 2회 세척하고 FACS 완충제 중에 5.0*10⁴ 세포/25 ㎕/웰에 상응하는 2*10⁶ 세포/㎖의 최종 농도로 재현탁시켰다. 상기 항체의 출발 농도를 60 ㎍/㎖(2x 최종 농도)로 설정하고 이어서 1:3(v/v) 적정 시리즈로 희석하였다. 1차 항체를 실온에서 1시간 동안 상기 세포상에서 배양한 다음, 2회 세척 단계를 수행하였다. 2차 검출을 위해서, 30 ㎍/㎖의 농도로 알렉사(Alexa)488에 접합된 항-huIgG(H+L) 항체를 사용하였다. 상기 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 후속으로, 상기 세포를 2회 세척하고 70 ㎕/웰 FACS 완충제에 재현탁시키고 BD FACS Canto를 사용하여 분석하였다.

상기 인간화된 야생형 항체 및 변이체 5(S27eP) 및 9(S27eP/M28S)에 대한 각각의 EC₅₀ 값을 하기 표에 나타낸다.

실시예 7

질량 분광분석법(LC-MS/MS)

항체 물질(대략 80 ㎍)을 대략 7 M 구아니디늄-HCl을 포함하는 200 mM 히스티딘-HCl 완충제(pH 6.0)에서 변성시키고, 10 mM TCEP를 사용하여 환원시키고, 제바 스핀(Zeba Spin) 컬럼 7K MWCO(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))을 사용하여 200 mM 히스티딘-HCl(pH 6.0)로 완충제 교환하였다. 최종적으로, 상기 물질을 37 ℃에서 16시간 동안 2.5 ㎍ 트립신 또는 써모리신(프로메가(Promega))으로 절단하였다. 데이터 획득을 나노액퀴티(NanoAcquity) UPLC 시스템(워터스(Waters))을 사용하는 액퀴티 BEH300 C18 컬럼(워터스)상에서 RP-UPLC 구배에 이어서 나노전기분무 이온화 소스로서 트라이벌사 나노메이트(TriVersa NanoMate)(애드비온(Advion))를 갖는 오르비트랩 퓨전 트라이브리드(Orbitrap Fusion Tribrid) 질량 분광계(써모 사이언티픽)상에서 CID 기재 MS/MS로 수행하였다. 상기 데이터를 마스코트(Mascot) MS/MS 이온 써치스(Ion Searches)(매트릭스 사이언스(Matrix Science)) 및 펩타이드 분석기(롯슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics) GmbH), 사내 MS 데이터 평가 소프트웨어를 사용하여 평가하였다. 정량분석을, 상응하는 펩타이드의 추출된 이온 전류 크로마토그램의 적분에 의해 수행하였다.

결과:

야생형 인간화된 항-CD19 항체(변이체 0: wt)의, PBS 완충제 중에서 pH 7.4에서 2주 동안 37 ℃에서 배양시 탈아미드화 및 숙신이미드 형성의 수준을 하기 표에 나타낸다(사용된 단편: SSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYR; 서열번호 35).

상기 인간화된 항-CD19 항체 변이체 5(S27eP)의 배양시 탈아미드화 및 숙신이미드 형성의 수준을 하기 표에 나타낸다(사용된 단편: SSQSLENPNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYR; 서열번호 35).

상기 인간화된 항-CD19 항체 변이체 3(S27eA)의 배양시 탈아미드화 및 숙신이미드 형성의 수준을 하기 표에 나타낸다(사용된 단편: SSQSLENPNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYR; 서열번호 35).

상기 인간화된 항-CD19 항체 변이체 7(G29A)의 배양시 탈아미드화 및 숙신이미드 형성의 수준을 하기 표에 나타낸다(사용된 단편: SSQSLENPNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYR; 서열번호 35).

실시예 8

CD19 친화성 측정

표면 플라스몬 공명(SPR) 기재 분석을 사용하여 상기 항-인간 CD19 항체와 재조합 인간 CD19 수용체의 세포외 도메인간의 결합의 동역학적 매개변수들을 측정하였다.

프로토콜 1:

상기 항-인간 CD19 항체를 포획하기 위해서 포획 항체로서 항-인간 F(ab)'2 항체 단편을 사용하였다(잭슨 임뮤노 리써치(Jackson Immuno Research); 주문 코드: 109-006-006). 상기 포획 항체 중에서 20 ㎍/㎖을 제조사의 설명(GE 헬쓰케어)에 따라 아민 커플링 키트를 사용함으로써 pH 4.5에서 CM5 칩(GE 헬쓰케어; BR-1005-30)상에 고정화시켰다. 상기 샘플 및 실행 완충제는 HBS-EP+(GE 헬쓰케어; BR-1006-69)였다. 유동 셀을 25 ℃로 설정하였다. 샘플 블록을 12 ℃로 설정하였다. 상기 둘을 모두 실행 완충제로 프라이밍하였다. 항-인간 CD19 항체를, 35 nM 용액을 60초 동안 20 ㎕/분의 유량으로 주입함으로써 포획하였다. 1:3 희석으로 900 nM 및 총 5개 농도로 출발하여, 50 ㎕/분의 유량으로 120초 동안 용액 중 다양한 농도로 재조합 인간 CD19 ECD를 주입함으로써 결합을 측정하였다. 해리 단계를 600초 이하 동안 모니터하고 상기 샘플 용액으로부터 실행 완충제로 전환시킴으로써 촉발시켰다. 표면을 30 ㎕/분 유량의 10 mM 글리신 용액(pH 1.5)으로 60초 및 30초 세척에 의해 2회 재생시켰다. 벌크 굴절률 차이를, 염소 항-인간 F(ab)'2 표면으로부터 획득한 응답을 공제함으로써 보정하였다. 블랭크 주입을 또한 공제하였다(=이중 참조). 겉보기 KD 및 다른 동역학적 매개변수의 계산을 위해서, 랭뮤어 1:1 모델을 사용하였다.

프로토콜 2:

상기 항-인간 CD19 항체를 포획하기 위해서 항-인간 Fab 포획 항체를 사용하였다. 먼저 30 ㎍/㎖ 염소 항-인간 Fab 항체(주문 코드: 28958325; GE 헬쓰케어 바이오-사이언시즈 AB)를 제조사의 설명에 따라 아민 커플링 키트(GE 헬쓰케어)를 사용함으로써 pH 5.0에서 CM5 칩(GE 헬쓰케어; BR-1005-30)상에 고정화시켰다. 상기 샘플 및 실행 완충제는 HBS-EP+(GE 헬쓰케어; BR-1006-69)였다. 유동 셀을 25 ℃로 설정하였다. 샘플 블록을 12 ℃로 설정하였다. 상기 둘을 모두 실행 완충제로 프라이밍하였다. 항-인간 CD19 항체를, 10 nM 용액을 60초 동안 10 ㎕/분의 유량으로 주입함으로써 포획하였다. 250 nM의 농도에서 10 ㎕/분의 유량으로 90초 동안 재조합 인간 CD19 ECD를 주입함으로써 결합을 측정하였다. 해리 단계를 600초 이하 동안 모니터하고 상기 샘플 용액으로부터 실행 완충제로 전환시킴으로써 촉발시켰다. 표면을 10 ㎕/분 유량의 10 mM 글리신 용액(pH 2.1)으로 60초 세척에 의해 재생시켰다. 벌크 굴절률 차이를, 블랭크 표면으로부터의 응답을 공제함으로써 보정하였다.

계산:

샘플의 상대적인 결합은 상기 포획 수준 및 결합 수준으로부터 계산된 비(RU 포획으로 나눈 RU 결합)이다:

rel_결합 = (결합_수준)/(포획_수준)

상기 샘플의 상대적인 활성 농도는 참조 샘플과 비교된 바와 같은 샘플의 비이다:

rel_활성_농도 = (rel_결합_샘플)/(rel_결합_참조)

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> HUMANIZED ANTI-HUMAN CD19 ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> P33094 <140> PCT/EP2016/073412 <141> 2016-09-30 <150> EP15187820.4 <151> 2015-10-01 <160> 70 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ala Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ile Met His Trp Val Lys Gln Lys Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe 50 55 60 Asn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Asp Ala Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Leu 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Leu Gln Leu 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Asp Tyr Ile Met His 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Asn 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Leu Gln Leu Thr His Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 9 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized VH <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N27dH VL <400> 10 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized HVR-H2 <400> 11 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N27dH HVR-L1 <400> 12 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 13 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N27dQ VL <400> 13 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Gln Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N27dQ HVR-L1 <400> 14 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Gln Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 15 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S27eA VH <400> 15 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ala 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S27eA HVR-L1 <400> 16 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ala Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 17 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S27eV VL <400> 17 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Val 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S27eV HVR-L1 <400> 18 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Val Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 19 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S27eP VL <400> 19 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Pro 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S27eP HVR-L1 <400> 20 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Pro Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 21 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N28Q VL <400> 21 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser 20 25 30 Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N28Q HVR-L1 <400> 22 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 23 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G29A VL <400> 23 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser 20 25 30 Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G29A HVR-L1 <400> 24 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 25 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G29V VL <400> 25 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser 20 25 30 Asn Val Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G29V HVR-L1 <400> 26 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser Asn Val Asn Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 27 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S27eP/N28S VH <400> 27 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Pro 20 25 30 Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S27eP/N28S HVR-L1 <400> 28 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Pro Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 29 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 29 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 30 <211> 272 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val 1 5 10 15 Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr 20 25 30 Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly 35 40 45 Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe 50 55 60 Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro 65 70 75 80 Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val 85 90 95 Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly 100 105 110 Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro 115 120 125 Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg 130 135 140 Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser 145 150 155 160 Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr 165 170 175 Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro 180 185 190 Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser 195 200 205 Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu 210 215 220 Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr 225 230 235 240 Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr 245 250 255 Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys 260 265 270 <210> 31 <211> 274 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 31 Pro Gln Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val 1 5 10 15 Leu Gln Cys Leu Glu Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Val 20 25 30 Trp Cys Arg Asp Ser Pro Phe Glu Pro Phe Leu Asn Leu Ser Leu Gly 35 40 45 Leu Pro Gly Met Gly Ile Arg Met Gly Pro Leu Gly Ile Trp Leu Leu 50 55 60 Ile Phe Asn Val Ser Asn Gln Thr Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro 65 70 75 80 Gly Leu Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Ser Val 85 90 95 Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly 100 105 110 Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro 115 120 125 Ser Gly Lys Leu Asn Ser Ser Gln Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg 130 135 140 Pro 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S27eP/N28S mutation <400> 40 Leu Glu Asn Pro Ser Gly Asn Thr 1 5 <210> 41 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 41 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human transferrin receptor fragment <400> 42 Ile Gly Gln Asn Met Val Thr Ile Val Gln Ser Asn Gly Asn Leu 1 5 10 15 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human transferrin receptor fragment <400> 43 Asn Met Val Thr Ile Val Gln Ser Asn Gly Asn Leu Asp Pro Val 1 5 10 15 <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human transferrin receptor fragment <400> 44 Gln Ser Asn Gly Asn Leu Asp Pro Val Glu Ser Pro Glu Gly Tyr 1 5 10 15 <210> 45 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptidic linker <400> 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 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Claims

인간 CD19에 특이적으로 결합하는 항체로서,
(a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
(c) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
(d) 서열번호 20 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(e) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(f) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 항체.
제 1 항에 있어서,
단클론 항체인 항체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
인간, 인간화된 또는 키메릭 항체인 항체.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 CD19에 특이적으로 결합하는 항체 단편인 항체.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 일치성을 갖는 VH 서열 및 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 일치성을 갖는 VL 서열, 또는
(b) 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 일치성을 갖는 VH 서열 및 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 일치성을 갖는 VL 서열, 또는
(c) (a) 또는 (b)에서와 같은 VH 서열 및 VL 서열
을 포함하는 항체.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 제형.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
약제로서 사용하기 위한 항체.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
B-세포암의 치료를 위한 항체.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
B-세포의 고갈에 사용하기 위한 항체.
약제의 제조에서 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
제 10 항에 있어서,
약제가 B-세포암의 치료를 위한 것인 용도.
제 10 항에 있어서,
약제가 B-세포의 고갈을 위한 것인 용도.
B-세포암이 있는 개체에게 유효량의 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 투여함을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법.
개체에게 B-세포 고갈에 유효한 양의 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 투여함을 포함하는 상기 개체에서 B-세포를 고갈시키는 방법.