KR20180054791A - 안정한 항-pd-1 항체 약학적 제조물 및 의료에서의 그의 적용 - Google Patents

안정한 항-pd-1 항체 약학적 제조물 및 의료에서의 그의 적용 Download PDF

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얀 팡
웨이캉 타오
리안샨 장
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Abstract

본 발명은 안정한 항-PD-1 항체 약학적 제조물 및 의료에서의 그의 적용에 관한 것이다. 상기 항-PD-1 항체 약학적 제조물은 항-PD-1 항체 및 버퍼를 포함하고, 적어도 하나의 유형의 안정화제를 추가로 포함할 수 있으며, 선택적으로 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 항-PD-1 항체 약학적 제조물은 항체의 응집과 탈아민화를 효과적으로 저해하여, 항체 생성물의 분해를 방지하고, 안정한 주사용 약학적 제조물을 수득할 수 있다.

Description

안정한 항-PD-1 항체 약학적 제조물 및 의료에서의 그의 적용
본 발명은 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 절편을 포함하는 약학적 제형, 상기 제형의 제조 방법 및 상기 제형의 용도에 관한 것이다.
종양의 면역 탈출 메커니즘과 종양에 대한 체내 면역 반응 사이에는 매우 복잡한 상관관계가 있다. 암 면역치료법의 초기 단계에서, 종양-특이적 킬러 T 세포가 생물학적 활성을 갖지만, 종양 성장의 말기 단계에는 살해 능력을 잃는다. 종양에 대한 환자 자신의 면역계 반응을 최대로 향상시키기 위하여, 종양 면역치료법의 핵심은 기존의 면역계 반응을 활성화시키는 것뿐만 아니라 상기 면역계 반응의 기간 및 강도를 유지하는 것이다.
1992년에 발견된 프로그램화 죽음(programmed death)-1(PD-1)은 T 세포 표면에 발현되는 단백질 수용체이며, 세포의 아폽토시스(apoptosis)와 연관된다. PD-1은 CD28 패밀리에 속하며, 세포독성 T 림프구 항원 4(cytotoxic T lymphocyte antigen 4, CTLA-4)와 23% 아미노산 상동성을 나타낸다; CTLA-4와 달리, PD-1은 주로 활성화된 T 세포, B 세포 및 골수성 세포에서 발현된다. PD-1은 각각 PD-L1 및 PD-L2의 2 개의 리간드를 갖는다. 새로운 연구는 유방암, 폐암, 위암, 장암, 신장암, 흑색종과 같은 인간 종양 조직에서 PD-L1 단백질의 발현이 높음을 발견하였으며, PD-L1의 발현 레벨은 환자의 임상적 반응 및 예후와 매우 연관된다. PD-L1은 제 2 신호전달 경로에서 T 세포 증식을 억제하기 때문에, PD-L1은 PD-L1에 대한 PD-1의 결합을 차단함으로써 암 면역치료법 분야에서 매우 유망한 새로운 표적이 된다.
WO2015/085847은 높은 친화도와 긴 수명으로 특정되고 전술한 질환들에 대해 더 나은 치료 효과를 가질 것으로 기대되는 신규한 항-PD-1 항체를 개시한다. 그러나, 상기 새로운 항-PD-1 항체는 매우 불안정하며, 임상적으로 이용가능한 제조물의 형태로 제형화되기 어렵다. 이들이 제형화되는 방법에 대해 개시하고 있는 PCT 출원은 없다. 따라서, 안정하고 편리한 임상적 용도를 위한 제형을 얻기 위하여 상기 항체의 심층 연구를 수행할 필요가 있다.
본 발명의 목적은 안정한 항-PD-1 항체 제형을 제공하는 것이다.
본 발명의 안정한 약학적 제형은 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 절편 및 버퍼(buffer)를 함유한다. 상기 약학적 제형은 적어도 하나의 안정화제 및 선택적으로 계면활성제를 추가로 함유한다.
본 발명의 약학적 제형에 있어서, 상기 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 절편은 다음의 서열 또는 다음의 서열과 적어도 85%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로부터 선택되는 임의의 하나 이상의 CDR 영역 서열을 포함한다:
항체 중쇄 가변 영역(variable region) HCDR 서열: 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3; 및
항체 경쇄 가변 영역 LCDR 서열: 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6.
상기 아미노산 서열은 다음의 표에 나타나 있다.
도메인 항-PD-1 항체
서열 서열번호
VH HCDR1 SYMMS 1
HCDR2 TISGGGANTYYPDSVKG 2
HCDR3 QLYYFDY 3
VL LCDR1 LASQTIGTWLT 4
LCDR2 TATSLAD 5
LCDR3 QQVYSIPWT 6
상기 서열 상동성은 항체의 친화도 또는 면역원성 또는 안정성을 개선하기 위한 종래의 방법 또는 다른 종래의 물리적 및 화학적 특성 또는 생물학적 활성으로부터 도출될 수 있다.
추가적인 바람직한 항-PD-1 항체는 서열번호 7의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 8의 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
서열번호 7
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGANTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK,
서열번호 8
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQTIGTWLTWYQQKPGKAPKLLIYTATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYSIPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
본 발명의 항-PD-1 항체의 농도는 1 ㎎/㎖ 내지 60 ㎎/㎖, 바람직하게는 20-50 ㎎/㎖, 보다 바람직하게는 35-45 ㎎/㎖, 가장 바람직하게는 40 ㎎/㎖일 수 있다.
본 발명의 버퍼는 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트 및 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이며, 상기 포스페이트는 나트륨 디하이드로겐 포스페이트 및 칼륨 디하이드로겐 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된다; 바람직한 버퍼는 아세테이트이고, 그 양은 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 구현예에서 예를 들면 1 내지 50 mM, 바람직하게는 2 내지 20 mM, 보다 바람직하게는 5 내지 15 mM, 및 가장 바람직하게는 10 mM이다.
본 발명에 있어서, 상기 제형의 pH는 4.5 내지 6.0, 바람직하게는 4.8 내지 5.6의 범위이고, 가장 바람직하게는 pH 5.2이다.
본 발명의 상기 적어도 하나의 안정화제는 사카라이드 또는 아미노산으로부터 선택된다. 여기서, 상기 사카라이드는 바람직하게는 수크로오스, 락트산, 트레할로오스 및 말토오스로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 트레할로오스이며, 가장 바람직하게는 α,α-트레할로오스 디하이드레이트인 디사카라이드이다. 사용되는 디사카라이드의 양은 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 구현예에서 예를 들면 30 내지 120 ㎎/㎖, 바람직하게는 60 내지 100 ㎎/㎖, 보다 바람직하게는 85 내지 95 ㎎/㎖, 가장 바람직하게는 90 ㎎/㎖이다.
본 발명의 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유, 글리세롤 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스테르로부터 선택될 수 있고, 상기 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스테르는 폴리솔베이트 20, 40, 60 또는 80으로부터 선택될 수 있다. 사용되는 계면활성제의 양은 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 구현예에서 예를 들면 0.01 내지 1 ㎎/㎖, 바람직하게는 0.05 내지 0.5 ㎎/㎖, 보다 바람직하게는 0.1 내지 0.4 ㎎/㎖, 가장 바람직하게는 0.2 ㎎/㎖이다.
본 발명의 안정한 약학적 제형은 주사가능한 약학적 제형이다.
본 발명의 한 구현예에서, 상기 안정화된 약학적 제형은 항-PD-1 항체, 버퍼, 디사카라이드 및 계면활성제로 이루어지고, 선택적으로 물을 포함한다.
본 발명의 한 구현예에서, 상기 안정화된 약학적 제형은 다음을 포함한다:
항-PD-1 항체, 여기서 상기 인간 항체는 서열번호 7의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 8의 경쇄 아미노산 서열을 포함한다; 및
(ⅰ) 90 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트 및 10 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.2; 또는
(ⅱ) 90 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 10 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.2; 또는
(ⅲ) 90 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 20 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.4; 또는
(ⅳ) 60 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.4 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 20 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.0; 또는
(ⅴ) 60 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.1 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 20 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.2; 또는
(ⅵ) 60 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 10 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.2; 또는
(ⅶ) 30 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.4 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 10 mM의 아세테이트 버퍼, pH 4.8; 또는
(ⅷ) 30 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 30 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.2; 또는
(ⅸ) 30 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.4 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 10 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.6.
상기 주사가능한 약학적 제형은 주사제의 형태이거나, 동결건조된 형태로 제조될 수 있다. 상기 동결건조된 분말은 본 기술분야의 종래의 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 동결건조된 분말의 재구성에 의해 얻어지고 주사용으로 직접 사용될 수 있는 주사제를 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 항체의 응집 및 탈아민화를 효과적으로 저해하여 항체 생성물의 분해를 방지할 수 있으며, 25℃에서 6개월 동안 보관될 수 있고, 2-8℃에서 12개월 동안 안정하다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 단백질의 산화적 분해에 대한 보호 효과를 가지며, 유리 및 스테인리스 스틸 용기와 호환되고, 상기 용기 내에서 안정하게 존재할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 PD-1 매개성 질환 및 질병의 예방 또는 치료용으로 사용되며, 상기 질환 또는 질병은 바람직하게는 암; 보다 바람직하게는 PD-L1을 발현하는 암; 가장 바람직하게는 유방암, 폐암, 위암, 장암, 신장암, 흑색종으로부터 선택되는 암; 가장 바람직하게는 비-소세포성 폐암, 흑색종 및 신장암이다.
본 발명의 약학적 제형의 용도는 PD-1 매개성 질환 또는 질병의 예방 또는 치료용 약물의 제조에 있으며, 상기 질환 또는 질병은 바람직하게는 암; 보다 바람직하게는 PD-L1을 발현하는 암이다; 상기 암은 가장 바람직하게는 유방암, 폐암, 위암, 장암, 신장암, 흑색종, 가장 바람직하게는 비-소세포성 폐암, 흑색종 및 신장암이다.
PD-1 매개성 질환 또는 질병의 예방 또는 치료 방법이 제공되며, 상기 질환 또는 질병은 바람직하게는 암; 보다 바람직하게는 PD-L1을 발현하는 암이다; 상기 암은 가장 바람직하게는 유방암, 폐암, 위암, 장암, 신장암, 흑색종; 가장 바람작하게는 비-소세포성 폐암, 흑색종 및 신장암이며, 상기 방법은 본 발명의 약학적 제형을 투여하는 단계를 포함한다.
도 1은 항-PD-1 항체의 열 안정성에 대한 버퍼 시스템의 효과를 보여준다.
도 2는 항-PD-1 항체의 열 안정성에 대한 사카라이드의 효과를 보여준다.
용어
본 발명은 PD-1에 대한 고농도의 항체를 포함하는 안정한 약학적 액체 제형에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, "항체"는 2 개의 동일한 중쇄 및 2 개의 동일한 경쇄가 이황화 결합에 의해 서로 연결되어 형성된 4 개의 펩티드 사슬 구조의 면역글로불린을 나타낸다.
본 발명의 항체는 쥐과(murine) 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 바람직하게는 인간화 항체를 포함한다.
항체의 "항원-결합 절편"(또는 단순히 "항체 절편")이란 용어는 항원(예컨대, PD-1)에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체의 하나 이상의 절편을 나타낸다. 항체의 항원-결합 기능은 전장(full-length) 항체의 절편에 의해 실현될 수 있는 것으로 나타났다. 항원-결합 부위는 재조합 DNA 기술, 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있다.
"CDR"이란 용어는 항원 결합에 주로 기여하는 항체의 가변 도메인 내의 6 개의 초가변(hypervariable) 영역 중 하나를 나타낸다. 상기 6 개의 CDR에 대한 정의로 가장 흔히 사용되는 정의 중 하나는 Kabat E.A. 등에 의해 제공되었다(Kabat E.A. et al , (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242). 본 명세서에서 사용된 것과 같이, CDR의 Kabat 정의는 경쇄 가변 도메인의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 뿐만 아니라 중쇄 가변 도메인의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3에만 적용된다.
본 발명에 있어서, 본 명세서에 기재된 항체 경쇄 가변 영역은 인간 또는 쥐과 κ, λ 사슬 또는 그의 변이체를 포함하는 경쇄 불변 영역(constant region)을 추가로 포함한다.
본 발명에 있어서, 본 명세서에 기재된 항체 중쇄 가변 영역은 인간 또는 쥐과 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다.
"키메라 항체"란 용어는 쥐과 항체의 가변 영역을 인간 항체의 불변 영역과 융합함으로써 형성되는 항체이며, 상기 키메라 항체는 쥐과 항체-유도성 면역 반응을 완화할 수 있다. 키메라 항체를 확립하기 위하여, 특정 쥐과 모노클론 항체를 분비하는 하이브리도마(hybridoma)가 먼저 확립될 것이고, 가변 영역 유전자가 쥐과 하이브리도마로부터 클로닝된 후, 원하는 인간 항체의 불변 영역 유전자가 필요에 따라 클로닝되고, 상기 쥐과 가변 영역 유전자가 인간 불변 영역 유전자에 결합되어 발현 캐리어(carrier) 내로 삽입될 수 있는 키메라 유전자를 형성하며, 최종적으로 상기 키메라 항체 분자가 진핵생물 또는 원핵생물 시스템에서 발현된다.
CDR-이식된(grafted) 항체로도 알려져 있는 "인간화 항체"란 용어는 인간 항체 가변 영역 골격(framework) 내로 이식된 쥐과 CDR 서열에 의해 생성된 항체를 나타내며, 인간 생식계열(germline) 항체 골격과 상이한 유형의 서열을 포함한다. 인간화 항체는 다수의 쥐과 성분들을 갖고 있는 키메라 항체에 의해 유도되는 동종이계(allogenic) 반응을 방지한다. 이러한 골격 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 아우르는 공공의 DNA 데이터베이스로부터 입수되거나, 공개된 참고문헌들로부터 입수될 수 있다.
"약학적 제형"이란 용어는 활성 성분의 분명한 효과적인 생물학적 활성을 허용하는 형태이고 상기 제형이 투여되는 대상체에게 독성인 추가적인 성분들을 함유하지 않는 제조물을 나타낸다.
본 발명에 따른 제형과 연관되어 본 명세서에서 사용된 것과 같은 "액체"란 용어는 대기압 하에 적어도 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 액체인 제형을 나타낸다.
"안정화제"란 용어는 제조, 보관 및 적용 동안에 활성 약학적 성분 및/또는 제형을 화학적 및/또는 물리적 분해로부터 보호하는 약학적으로 허용가능한 부형제를 나타낸다. 단백질 약제의 화학적 및 물리적 분해 경로는 다음의 문헌들에 의해 리뷰된다: Cleland, J.L., M.F. Powell, et al. (1993). "The development of stable protein formulations: a close look at protein aggregation, deamidation, and oxidation." Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 10(4): 307-77, Wang, W. (1999). "Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals." Int J Pharm 185(2): 129-88., Wang, W. (2000). "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int J Pharm 203(1-2): 1-60. 및 Chi, E.Y.,. S. Krishnan, et al. (2003). "Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation." Pharm Res 20(9): 1325-36. 안정화제는 이하에 정의되는 것과 같은 사카라이드, 아미노산, 폴리올, 계면활성제, 항산화제, 보존제, 시클로덱스트린, 폴리에틸렌글리콜(예컨대, PEG 3000, 3350, 4000, 6000), 알부민(예컨대, 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA), 소(bovine) 혈청 알부민(BSA)), 염(예컨대, 염화나트륨, 염화마그네슘, 염화칼슘), 킬레이터(예컨대, EDTA)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 구체적으로 사용되는 안정화제는 사카라이드로부터 선택된다. 보다 구체적으로, 상기 안정화제는 수크로오스, 트레할로오스 및 솔비톨로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 안정화제는 30 ㎎/㎖ 내지 100 ㎎/㎖, 바람직하게는 60 ㎎/㎖ 내지 90 ㎎/㎖의 양으로 제형 내에 존재할 수 있다. 보다 구체적으로, 수크로오스 또는 트레할로오스는 90 ㎎/㎖의 양으로 안정화제로서 사용되었다.
"안정한" 제형은 그 내부의 단백질, 예컨대 항체가 그 물리적 및 화학적 안정성을 본질적으로 유지하고, 따라서 보관하는 동안에 그 생물학적 활성을 유지하는 제형이다.
"안정한 액체 약학적 항체 제형"은 냉장 온도(2-8℃)에서 적어도 12 개월, 바람직하게는 2 년, 보다 바람직하게는 3 년 동안 현저한 변화가 관찰되지 않는 액체 항체 제형이다. 안정성에 대한 기준은 다음과 같다: 크기 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC)에 의해 측정될 때 항체 모노머의 10%, 특히 5% 이하가 분해된다. 또한, 상기 용액은 시각적 분석에 의해 무색이거나 투명 내지 약간 유백색이다. 상기 제형의 단백질 농도는 ±10% 이하의 변화를 갖는다. 10%, 특히 5% 이하의 응집이 형성된다. 상기 안정성은 UV 분광법, 크기 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC), 이온-교환 크로마토그래피(IE-HPLC), 비탁법 및 시각적 검사와 같이 본 기술분야에 알려진 방법에 의해 측정된다.
"프로그램화 죽음 1", "프로그램화 세포 죽음 1", "단백질 PD-1", "PD-1", "PD1", "PDCD1", "hPD-1" 및 "hPD-F"란 용어는 상호교환적으로 사용되며, 인간 PD-1의 변이체, 이소형(isoform), 종 상동체(species homolog) 및 PD-1과 적어도 하나의 공통 에피토프(epitope)를 갖는 유사체(analog)를 포함한다. 완전한 PD-1 서열은 NCBI 참조 서열: NM_005018.1 하에 발견될 수 있다.
"항-PD-1 항체", "PD-1에 대한 항체" 및 "항-PD-1 항체"란 용어는 충분한 친화도로 PD-1에 결합하여서, 항체가 PD-1의 표적화에 있어서 진단 및/또는 치료제로 유용할 수 있는 항체를 나타낸다. 본 명세서에서 사용된 것과 같은 "PD-1에 대한 결합"이란 용어는 BIAcore 분석법(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden) 또는 정제된 PD-1 또는 PD-1 CHO 형질감염체(transfectant)가 미세적정(microtiter) 플레이트에 코팅된 ELISA에서의 PD-1에 대한 항체의 결합을 의미한다.
상기 약학적 제형에 포함되는 PD-1에 대한 항체의 농도는 1 ㎎/㎖ 내지 60 ㎎/㎖의 범위, 바람직하게는 20 ㎎/㎖ 내지 50 ㎎/㎖의 범위, 가장 바람직하게는 40 ㎎/㎖이다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 "계면활성제"란 용어는 교반(agitation) 및 전단(shearing)과 같은 기계적 스트레스에 대해 단백질 제형을 보호하기 위해 사용되는 약학적으로 허용가능한 부형제를 나타낸다. 약학적으로 허용가능한 계면활성제의 예는 폴리옥시에틸렌솔비탄 지방산 에스테르(Tween), 폴리옥시 에틸렌 알킬 에스테르(예를 들면, Brij™의 상표명으로 상업적으로 수득되는 것들) 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 코폴리머(폴록사머, 플루로닉)를 포함한다. 폴리옥시에틸렌솔비탄-지방산 에스테르의 예는 폴리솔베이트 20(Tween 20™의 상표명으로 상업적으로 수득됨) 및 폴리솔베이트 80(Tween 80™의 상표명으로 상업적으로 수득됨)이다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 "버퍼"란 용어는 약학적 제형의 pH를 안정화시키는 약학적으로 허용가능한 부형제를 나타낸다. 적합한 버퍼는 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 문헌에서 발견될 수 있다. 바람직한 약학적으로 허용가능한 버퍼는 히스티딘-버퍼, 시트레이트-버퍼, 숙시네이트-버퍼, 아세테이트-버퍼, 아르기닌-버퍼, 포스페이트-버퍼 또는 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 특히 관심있는 버퍼는 시트레이트-버퍼 또는 아세테이트-버퍼로부터 선택되며, 그 pH는 본 기술분야에 알려진 산 또는 염기로 조정된다. 전술한 버퍼는 일반적으로 약 1 mM 내지 50 mM, 바람직하게는 약 10 mM 내지 30 mM, 보다 바람직하게는 약 10 mM의 양으로 사용된다. 사용되는 버퍼와 무관하게, 상기 pH는 본 기술분야에 알려진 산 또는 염기, 예컨대 염산, 아세트산, 인산, 황산 및 시트르산, 수산화나트륨 및 수산화칼륨을 이용하여 4.5 내지 6.0의 범위의 값, 바람직하게는 4.8 내지 5.6 범위의 값, 및 가장 바람직하게는 pH 5.2로 조정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 안정한 항-PD-1 항체 약학적 제형은 제 2 안정화제로서 항산화제를 포함한다. "항산화제"는 활성 약학적 성분의 산화를 방지하는 약학적으로 허용가능한 부형제이다. 항산화제는 EDTA, 시트르산, 아스코르브산, 부틸화 히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene, BHT), 부틸화 히드록시 아니솔(anisole)(BHA), 나트륨 설파이트, p-아미노 벤조산, 글루타치온, 프로필 갈레이트, 시스테인, 메티오닌, 에탄올, 벤질 알코올 및 n-아세틸 시스테인과 같은 킬레이트화제를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 "사카라이드"란 용어는 모노사카라이드 또는 올리고사카라이드를 나타낸다. 모노사카라이드는 산에 의해 가수분해되지 않는 모노머성 탄수화물이며, 단순 사카라이드 및 그의 유도체, 예컨대 아미노사카라이드를 포함한다. 모노사카라이드의 예는 글루코오스, 프럭토오스, 갈락토오스, 만노오스, 소르보오스, 리보오스, 데옥시리보오스, 뉴라민산을 포함한다. 올리고사카라이드는 글루코시드 결합(들)을 통해 연결되어 분기되거나 사슬로 되는 하나 이상의 모노머성 사카라이드 유닛으로 이루어지는 탄수화물이다. 올리고사카라이드 내의 모노머성 사카라이드 유닛은 동일하거나 상이할 수 있다. 모노머성 사카라이드 유닛의 수에 따라, 상기 올리고사카라이드는 디-, 트리-, 테트라-, 펜타-사카라이드 등이 된다. 폴리사카라이드와 대조적으로, 상기 모노사카라이드 및 올리고사카라이드는 수용성이다. 올리고사카라이드의 예는 수크로오스, 트레할로오스, 락토오스, 말토오스 및 라피노오스를 포함한다. 특히, 사카라이드는 수크로오스 및 트레할로오스로부터 선택된다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 "아미노산"이란 용어는 카르복시기의 α-위치에 위치하는 아미노 모이어티(moiety)를 갖고 있는 약학적으로 허용가능한 유기 분자를 나타낸다. 아미노산의 예는 아르기닌, 글리신, 오르니틴, 리신, 히스티딘, 글루탐산, 아스파라긴산, 이소류이신, 류이신, 알라닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 세린, 프롤린을 포함한다. 아미노산은 일반적으로 약 5 내지 500 mM의 양, 바람직하게는 약 5 내지 약 200 mM의 양, 보다 바람직하게는 약 100 내지 약 150 mM의 양으로 사용된다.
"안정화제"란 용어는 또한 동결건조보호제(lyoprotectant)를 포함한다. "동결건조보호제"란 용어는 동결건조 공정 동안의 탈안정화 조건과, 후속 보관 및 재구성에 대하여 불안정한(labile) 활성 성분(예컨대, 단백질)을 보호하는 약학적으로 허용가능한 부형제를 나타낸다. 동결건조보호제는 사카라이드, 폴리올(예컨대, 당 알코올) 및 아미노산으로 이루어지는 군을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 특히, 동결건조보호제는 수크로오스, 트레할로오스, 락토오스, 글루코오스, 만노오스, 말토오스, 갈락토오스, 프럭토오스, 소르보오스, 라피노오스와 같은 사카라이드, 뉴라민산, 글루코사민, 갈락토사민, N-메틸글루코사민("메글루민")과 같은 아미노사카라이드, 만니톨 및 솔비톨과 같은 폴리올, 및 아르기닌 및 글리신과 같은 아미노산 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 동결보호제는 바람직하게는 디사카라이드이다. 본 발명은 놀랍게도 디사카라이드가 모노사카라이드, 폴리올 및 아미노산의 경우보다 더 나은 제형의 안정화 효과를 나타냄을 발견하였다.
상기 약학적 제형은 또한 긴장성제(tonicity agent)를 함유할 수 있다. 본 명세서에 사용된 것과 같은 "긴장성제"란 용어는 제형의 긴장성을 조절하기 위해 사용되는 약학적으로 허용가능한 긴장성제를 나타낸다. 상기 제형은 저장성, 등장성 또는 고장성일 수 있다. 등장성은 일반적으로 대개 인간 혈청의 삼투압에 대한 용액의 상대적인 삼투압에 관한 것이다. 본 발명에 따른 제형은 저장성, 등장성 또는 고장성일 수 있지만, 바람직하게는 등장성일 것이다. 등장성 제형은 액체 또는 고형(예컨대, 동결건조된 형태)으로부터 재구성된 액체이며, 생리적 염 용액 및 혈청과 같이 비교되는 다른 용액의 경우와 동일한 긴장성을 갖는 용액을 나타낸다. 적합한 긴장성제는 염화나트륨, 염화칼륨, 글리세린, 및 아미노산, 사카라이드, 특히 글루코오스로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 성분을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 긴장성제는 일반적으로 약 5 mM 내지 약 500 mM의 양으로 사용된다. 안정화제 및 긴장성제에 있어서, 안정화제 및 긴장성제 모두로 동시에 작용할 수 있는 화합물의 군이 있다. 그 예는 사카라이드, 아미노산, 폴리올, 시클로덱스트린, 폴리에틸렌글리콜 및 염의 군에서 발견될 수 있다. 안정화제 및 긴장성제 모두로 작용할 수 있는 사카라이드의 예는 트레할로오스이다.
상기 약학적 제형은 또한 보존제, 습윤제, 에멀전화제 및 분산제와 같은 어주번트(adjuvant)를 함유할 수 있다. 미생물의 존재의 방지는 살균 절차에 의해, 그리고 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등의 다양한 항균 및 항진균제를 포함시킴으로써 보장될 수 있다. 보존제는 일반적으로 약 0.001 내지 약 2%(v/v)의 양으로 사용된다. 보존제는 에탄올, 벤질 알코올, 페놀, m-크레졸, p-클로로-m-크레졸, 메틸 또는 프로필 파라벤, 염화 벤즈알코늄을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 안정한 항-PD-1 항체 약학적 제형은 PD-1 매개성 질환 또는 질병의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있으며, 상기 질환 또는 질병은 바람직하게는 암; 보다 바람직하게는 PD-L1을 발현하는 암이다; 상기 질환 또는 질병은 가장 바람직하게는 유방암, 폐암, 위암, 장암, 신장암, 흑색종; 가장 바람직하게는 비-소세포성 폐암, 흑색종 및 신장암이다.
본 발명에 따른 안정한 항-PD-1 항체 약학적 제형은 정맥내(i.v.), 피하(s.c.) 또는 약학 기술분야에 알려진 것들과 같은 임의의 다른 비경구 투여 수단에 의해 투여될 수 있다.
이들의 높은 안정성의 관점에서, 본 발명에 따른 약학적 제형은 인-라인(in-line) 필터의 필요 없이 정맥내 투여될 수 있고, 따라서 인-라인 필터를 통해 투여될 필요가 있는 종래의 제형보다 취급이 훨씬 더 편리하다. Sterifix®와 같은 인-라인 필터는 정맥내 용액 또는 라인 내에 존재할 수 있는 임의의 입자, 공기 또는 미생물을 방지하기 위하여 정맥내 처방약의 주입 라인 내에 설치되어야 한다. 5 내지 20 미크론 및 더 큰 크기의 입자는 폐 모세관을 통한 혈류를 방해하는 능력을 가지며, 이는 폐 색전증과 같은 문제를 일으킬 수 있다. 외래 입자는 또한 주사 부위에서 정맥염을 초래할 수 있고, 필터는 정맥염 발생이 감소되는 것을 도울 수 있다.
생체내 투여용으로 사용되기 위한 안정한 제형은 살균되어야 한다. 이것은 살균 여과막을 통한 여과에 의해 즉시 달성된다.
본 발명에 따른 안정한 항-PD-1 항체 약학적 제형은, 예컨대 한외여과/정용여과, 투석, 부가 및 혼합, 동결건조, 재구성 및 이들의 조합과 같은 본 기술분야에 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 제형의 제조의 예는 본 명세서에서 이하에 발견될 수 있다.
본 발명에 따른 안정한 항-PD-1 항체 약학적 제형은 또한 동결건조된 형태 또는 상기 동결건조된 형태로부터 재구성된 액체 형태일 수 있다. 상기 "동결건조된 형태"는 본 기술분야에 알려진 동결건조 방법에 의해 제조된다. 상기 동결건조물은 대개 약 0.1 내지 5%(w/w)의 잔류 수분 함량을 가지며, 분말 또는 생리적으로 안정한 케이크로 존재한다. 상기 "재구성된 형태"는 재구성 매질에 첨가한 후 신속히 용해시킴으로써 상기 동결건조물로부터 수득될 수 있다. 적합한 재구성 매질은 주사용수(water for injection, WFI), 주사용 제균수(bacteriostatic water for injection, BWFI), 염화나트륨 용액(예컨대, 0.9%(w/v) NaCl), 글루코오스 용액(예컨대, 5%(w/v) 글루코오스), 계면활성제-함유 용액(예컨대, 0.01%(w/v) 폴리솔베이트 20) 및 pH-버퍼화 용액(예컨대, 포스페이트-버퍼화 용액)을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명은 다음의 실시예를 참조하여 보다 상세히 기술된다; 그러나, 하기 실시예는 단지 예시적인 목적일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 의도는 아니다.
구체적인 조건이 개시되지 않은 본 발명의 실시예에서, 실험은 일반적으로 종래의 조건 하에, 또는 물질 또는 제품 생산자에 의해 제안된 조건 하에 수행된다. 시약의 공급원이 구체적으로 기재되어 있지 않으면, 상기 시약은 상업적으로 이용가능한 종래의 시약이다.
실시예
본 발명의 제조 방법은 다음과 같다:
단계 1: 항-PD-1 항체 스톡(stock) 용액을 여과하기 전에, 중간 대조군(middle control)에서 항체 단백질 농도를 검출하기 위하여 샘플을 추출하였다. 상기 중간 대조군을 통과한 후, 상기 스톡 용액을 0.22 ㎛ PVDF 필터를 통해 통과시켰고, 여과물을 수집하였다. 상기 PD-1 항체는 서열번호 7에 나타낸 중쇄 아미노산 서열과 서열번호 8에 나타낸 경쇄 아미노산 서열을 가지며, WO2015/085847에 개시된 방법에 따라 제조하였다.
단계 2: 로딩 부피(loading volume)를 5.3 ㎖로 조정하고, 상기 여과물을 하프 스토퍼(half stopper)를 이용해 20 ㎖ 바이알에 충진하였으며, 로딩 차이를 각각 충진 시작, 중간 및 종료 시에 샘플에 의해 검출하였다.
단계 3: 스토퍼를 갖는 용액을 동결건조 챔버 내로 충진하였고, 다음의 동결건조 공정에 따라 동결건조하였다. 상기 동결건조 절차가 완료된 후, 동결건조된 분말을 진공 하에 막았다.
파라미터 온도
(℃)		 시간 세팅
(분)		 유지 시간
(분)		 진공 정도
(mbar)
예비-냉동 -5 10 60 /
-45 40 120 /
1차 건조 -5 40 2,100 0.1
2차 건조 25 60 400 0.01
단계 4: 캡핑(capping) 기계를 열고, 알루미늄 커버를 넣고, 상기 커버를 돌린다.
단계 5: 시각적인 조사를 수행하여 제품의 붕괴 없음, 로딩 부피의 정확성 및 다른 결점들을 확인하였다. 바이알 라벨을 인쇄 및 부착한다; 카톤(carton) 라벨을 인쇄하고, 상기 카톤을 접고, 포장 및 라벨링을 수행한다.
상기 중간 대조군 동안의 단백질의 농도를 자외선 분광광도계에 의해 측정하였고, 280 ㎚에서의 흡수 피크를 측정하였다(Thermo: Nanodrop 2000).
0.22 ㎛ PVDF 필터는 Millipore Millipak-100이다.
충진 기계는 Chutian Technology KGS8/2-X2 선형 충진 기계이다.
로딩 부피 차이는 전자 저울 칭량기(제조사: Sartorius, model BSA423S)를 이용해 검출하였다.
Tofflon Lyo-B(SIP.CIP) 진공 냉동 건조기를 동결건조를 위해 사용하였다.
Shandong Penglai DZG-130 나이프 타입 자동 캡핑 기계를 캡핑 기계로서 사용하였다.
Tianjin Jingtuo YB-2A 투명도 검출기를 시각적 외형 조사를 위해 사용하였다.
샘플 내의 HPLC(SEC 및 IEC) 측정을 Agilent 1200DAD 고압 액체 크로마토그래피(TSK gel SuperSW mAb HR 300×7.8 ㎜ 칼럼 및 ProPac™ WCX-10 BioLC™, 250×4 ㎜ 칼럼)을 이용해 수행하였다.
상기 단백질의 열 변성 온도(Tm)를 GE MicroCal VP-Capillary DSC 시차 주사 열량계를 이용해 측정하였다.
DLS(Dynamic Light Scattering)의 평균 입자 크기를 Malvern Zetasizer Nano ZS 나노-입자 크기 전위차계를 이용해 측정하였다.
실시예 1
항-PD-1 항체를 pH 4.8-5.6에서 각각 10 mM의 (나트륨) 아세테이트, 90 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트 및 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20을 함유하는 제조물로서 제형화하였다. 상기 항체 단백질의 농도는 40 ㎎/㎖ 였다. 각각의 제형을 여과하였고, 동결건조를 위하여 5 ㎖/병으로 20 ㎖의 중성 보로실리케이트 유리 주사기 병 내에 충진하였으며, 상기 유리병을 주사를 위해 사용된 할로겐화 부틸 고무 스토퍼를 이용해 밀봉하였고, 멸균 분말을 동결건조하였다. 상기 동결건조된 생성물을 안정성 분석을 위해 25℃ 및 40℃에 보관하였다. 그 결과는 상기 항-PD-1 항체는 pH 4.8-5.6에서 매우 안정함을 보여주었다.
항-PD-1 항체의 분해에 대한 pH의 효과
테스트 색인 보관 조건 및 시간 pH 4.8 pH 5.0 pH 5.2 pH 5.4 pH 5.6
SEC 모노머
(%)		 0 포인트 98.0 97.9 97.9 97.9 97.9
40℃, 35일 97.3 97.5 97.6 97.6 97.4
25℃, 30일 97.6 97.7 97.8 97.8 97.8
IEC 메인 피크
(%)		 0 포인트 66.2 66.4 66.6 66.4 66.4
40℃, 35일 64.7 64.1 64.7 65.9 65.3
25℃, 30일 64.7 65.6 65.6 65.4 66.0
실시예 2
다음의 버퍼 용액 내에 1 ㎎/㎖의 단백질 농도를 갖는 항-PD-1 항체 제형을 제조하였다.
1) 버퍼 1: 10 mM의 (나트륨) 아세테이트, pH 5.0;
2) 버퍼 2: 10 mM의 이나트륨 수소 포스페이트 (시트르산), pH 5.0;
3) 버퍼 3: 10 mM의 (나트륨) 숙시네이트, pH 5.0;
4) 버퍼 4: 10 mM의 (나트륨) 시트레이트, pH 5.0.
각각의 제형 내의 항-PD-1 항체의 열 안정성을 시차 주사 열량계(DSC)에 의해 검출하였다. 상기 약물의 열 변성 중앙 온도(Tm) 분석은 아세테이트 버퍼 염 시스템 내의 항-PD-1 항체의 안정성이 숙시네이트, 시트레이트, 이나트륨 수소 포스페이트 버퍼 시스템의 경우보다 명확하게 더 뛰어남을 보여주었다. 그 결과는 도 1에 나타나 있다.
실시예 3
1 ㎎/㎖ 농도의 단백질 및 상이한 농도의 상이한 사카라이드를 포함하는 PD-1 항체 제형을 DSC 기술을 이용해 스크리닝하였다:
1) 버퍼 1: 10 mM의 (나트륨) 아세테이트, 90 ㎎/㎖의 수크로오스, pH 5.2;
2) 버퍼 2: 10 mM의 (나트륨) 아세테이트, 30 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, pH 5.2;
3) 버퍼 3: 10 mM의 (나트륨) 아세테이트, 60 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, pH 5.2;
4) 버퍼 4: 10 mM의 (나트륨) 아세테이트, 90 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, pH 5.2.
도 2에 따르면, Tm은 α,α-트레할로오스 디하이드레이트의 농도가 90 ㎎/㎖에 도달할 때 상기 항-PD-1 항체가 최고의 열 안정성을 갖고 있음을 보여준다.
실시예 4
40 ㎎/㎖ 농도의 PD-1 항체 단백질, 10 mM의 (나트륨) 아세테이트 및 90 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, pH 5.2를 포함하는 항-PD-1 항체 제형을 상이한 농도의 계면활성제를 함유하는 다음의 버퍼 용액에서 제조하였다:
1) 계면활성제 없음;
2) 0.1 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20;
3) 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20;
4) 0.3 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20;
5) 0.4 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20;
6) 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 80.
각각의 제형을 5 ㎖/바이알로 20 ㎖의 바이알에 충진하였고, 상기 바이알을 플라스틱 필름 스토퍼로 밀봉하였다. 상기 약물을 25℃에 온도조절 교반기(thermostat shaker)에 두고 500 rpm으로 교반하였다. 안정화 결과는 0.1-0.4 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20이 상기 항-PD-1 항체의 응집과 큰 입자의 형성을 효과적으로 방지함을 보여주었다.
25℃, 500 rpm 교반에서 항-PD-1 항체의 응집에 대한 계면활성제의 효과
테스트
색인		 교반 시간
(시)		 1 2 3 4 5 6
외형 0 투명 투명 투명 투명 투명 투명
0.2 탁함 투명 투명 투명 투명 투명
2 N/A 투명 투명 투명 투명 투명
6 N/A 투명 투명 투명 투명 투명
24 N/A 투명 투명 투명 투명 투명
DLS
평균
직경
(㎚)		 0 6.222 6.740 6.224 6.728 6.174 6.444
0.2 8.102 7.725 6.384 6.642 6.598 6.574
2 N/A 7.794 6.475 6.764 6.570 6.610
6 N/A 7.435 6.286 6.710 6.280 6.750
24 N/A 6.812 6.295 6.801 6.287 7.418
SEC
모노머
(%)		 0 97.9 98.3 97.9 98.1 97.9 98.0
0.2 97.9 98.3 98.0 98.1 98.0 98.0
2 N/A 98.2 98.0 98.1 98.0 98.0
6 N/A 97.9 97.6 98.0 97.7 97.0
24 N/A 97.3 97.6 97.9 97.7 96.3
실시예 5
항-PD-1 항체를 10 mM의 (나트륨) 아세테이트, 90 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트 및 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20, pH 5.2를 포함하는 용액에서 40 ㎎/㎖로 제조하였다. 상기 제형을 5 ㎖/바이알로 20 ㎖ 바이알에 충진하고 동결건조하였으며, 상기 바이알을 동결건조 스토퍼로 밀봉하였다. 상기 동결건조된 샘플을 4,500±500 Lx 광 조사 하에 10일 동안 두거나, 40±2℃에서 10일 동안 두거나, 4℃∼40℃의 저온의 사이클을 3회 거치거나, -20℃∼40℃에서 냉동-해동의 사이클을 3회 거쳤다. 약물 안정성을 단백질 함량, 순도 및 활성 분석에 의해 평가하였고, 그 결과는 상기 PD-1 항체가 상기 처방에서 안정하고, 강한 광, 고온 또는 저온 및 냉동-해동 사이클의 처리 후에도 여전히 요구사항을 충족할 수 있음을 보여주었다.
강한 광, 고온 또는 저온 및 냉동-해동 사이클에 노출될 때의 항-PD-1 항체 제형의 안정성
테스트 색인 허용가능한
한계		 널(null)
포인트		 강한 광 고온 저온 사이클 냉동 및 해동 사이클
단백질 농도
(㎎/바이알)		 200.0±20.0 ㎎/바이알 195.4 197.5 201.0 197.5 190.5
SEC 모노머
(%)		 ≥93.0% 97.6 97.4 97.2 97.6 97.6
IEC
메인 피크
(%)		 ≥55.0% 66.5 64.2 64.1 65.2 65.5
비-환원성
CE-SDS
메인 피크
(%)		 ≥90.0% 95.6 95.8 95.7 94.9 95.1
환원성
CE-SDS
메인 피크
(%)		 ≥93.0% 98.2 98.1 98.2 97.9 98.2
활성(%) 70%∼130% 92 104 108 91 85
실시예 6
항-PD-1 항체를 10 mM의 (나트륨) 아세테이트, 90 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트 및 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20, pH 5.2를 포함하는 용액에서 40 ㎎/㎖로 제조하였다. 상기 제형을 유리병과 316L 스테인리스 스틸 탱크에 각각 충진하고, 실온에서 24시간 동안 두었다. 단백질 함량 및 순도 분석은 항-PD-1 항체가 24시간 내에 안정함을 보여주었다. 상기 제조물은 316L 스테인리스 스틸 탱크와 호환가능하다.
스테인리스 스틸 탱크에서의 항-PD-1 항체의 안정성
테스트 색인 품질 표준 보관 시간
(시)		 유리 316L 스테인리스
스틸 탱크
단백질 농도
(㎎/㎖)		 40.0±4.0
㎎/㎖		 0 39.4 39.4
3 39.2 39.0
6 38.9 39.0
24 39.3 38.7
SEC 모노머
(%)		 ≥93.0% 0 96.2 96.2
3 96.1 96.1
6 96.1 96.1
24 96.8 96.5
IEC 메인 피크
(% )		 ≥55.0% 0 68.2 68.2
3 68.1 68.0
6 68.3 68.5
24 68.0 67.5
실시예 7
항-PD-1 항체를 10 mM의 (나트륨) 아세테이트, 90 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트 및 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20, pH 5.2를 포함하는 용액에서 40 ㎎/㎖로 제조하였다. 상기 제형을 5 ㎖/바이알로 20 ㎖의 바이알 내에 충진하고, 각각 -15℃, -10℃ 및 -5℃의 1차 건조 온도에서 동결건조하였으며, 상기 바이알을 돌결건조 스토퍼로 밀봉하였다. 상기 동결건조된 생성물을 25℃에서 보관하고, 그 안정성을 분석하였다. 상기 결과는 -10℃∼-5℃의 온도가 동결건조 공정을 위한 최고의 1차 건조 온도임을 보여준다.
상이한 1차 건조 공정으로 제조된 항-PD-1 항체 제형의 안정성
1차 건조 온도 저장 기간
(개월)		 SEC 모노머
순도 (%)		 DLS 평균
직경 (㎚)		 수분 함량
(%)
-15℃ 0 97.8 7.177 1.5
1 97.9 7.172 N/A
2 97.8 10.097 N/A
-10℃ 0 97.9 7.991 1.2
1 97.9 7.318 N/A
2 97.5 7.349 N/A
-5℃ 0 98.0 8.120 1.0
1 97.6 7.781 N/A
2 97.5 9.018 N/A
실시예 8. 다른 제형들
본 발명은 항-PD-1 항체(서열번호 7의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 8의 경쇄 아미노산 서열) 및 다음으로부터 선택적으로 선택되는 안정화 버퍼를 포함하는 안정한 약학적 제형을 제공한다:
(ⅰ) 90 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트 및 10 mM 아세테이트 버퍼, pH 5.2;
(ⅱ) 90 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 10 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.2;
(ⅲ) 90 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 20 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.4;
(ⅳ) 60 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.4 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 20 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.0;
(ⅴ) 60 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.1 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 20 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.2;
(ⅵ) 60 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 10 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.2;
(ⅶ) 30 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.4 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 10 mM의 아세테이트 버퍼, pH 4.8;
(ⅷ) 30 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 30 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.2; 또는
(ⅸ) 30 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.4 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 10 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.6.
상기 예들에서, 항-PD-1 항체의 농도는 1 ㎎/㎖ 내지 60 ㎎/㎖, 바람직하게는 20-50 ㎎/㎖, 보다 바람직하게는 35-45 ㎎/㎖, 및 가장 바람직하게는 40 ㎎/㎖ 이내였다. 수행될 수 있는 구현예는 다음의 조합으로부터 선택될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다:
(1) 40 ㎎/㎖의 항-PD-1 항체, 90 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 10 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.2;
(2) 1 ㎎/㎖의 항-PD-1 항체, 30 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 10 mM의 아세테이트 버퍼, pH 4.5;
(3) 20 ㎎/㎖의 항-PD-1 항체, 60 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 1 mM의 아세테이트 버퍼, pH 4.8;
(4) 35 ㎎/㎖의 항-PD-1 항체, 85 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 2 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.6;
(5) 45 ㎎/㎖의 항-PD-1 항체, 95 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 5 mM의 아세테이트 버퍼, pH 6.0;
(6) 50 ㎎/㎖의 항-PD-1 항체, 100 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 15 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.2;
(7) 60 ㎎/㎖의 항-PD-1 항체, 90 ㎎/㎖ sucrose, 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 400, and 30 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.2;
(8) 40 ㎎/㎖의 항-PD-1 항체, 90 ㎎/㎖의 수크로오스, 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 60 및 50 mM의 아세테이트 버퍼, pH 4.5;
(9) 40 ㎎/㎖의 항-PD-1 항체, 90 ㎎/㎖의 트레할로오스, 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 80 및 10 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.2;
(10) 40 ㎎/㎖의 항-PD-1 항체, 90 ㎎/㎖의 말토오스, 0.2 ㎎/㎖의 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유 및 10 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.2;
(11) 40 ㎎/㎖의 항-PD-1 항체, 90 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.01 ㎎/㎖의 글리세린 지방산 에스테르 및 10 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.2;
(12) 40 ㎎/㎖의 항-PD-1 항체, 90 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.05 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 10 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.2;
(13) 40 ㎎/㎖의 항-PD-1 항체, 90 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.4 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 10 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.2;
(14) 40 ㎎/㎖의 항-PD-1 항체, 90 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.5 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 10 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.2;
(15) 40 ㎎/㎖의 항-PD-1 항체, 90 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 1 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 10 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.2.
<110> JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO.,LTD; SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO.,LTD. <120> STABLE ANTI-PD-1 ANTIBODY PHARMACEUTICAL PREPARATION AND APPLICATION THEREOF IN MEDICINE <130> 2018-FPA-8610 <160> 8 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 FORM HCDR1 <400> 1 Ser Tyr Met Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 FORM HCDR2 <400> 2 Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 FORM HCDR3 <400> 3 Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 FORM LCDR1 <400> 4 Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Thr 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 FORM LCDR2 <400> 5 Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 FORM LCDR3 <400> 6 Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 FORM Heavy chain <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 340 345 350 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 8 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 FORM Light chain <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp 20 25 30 Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (21)

  1. 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 절편 및 버퍼를 포함하는 안정한 항-PD-1 항체 약학적 제형.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 절편은 다음의 서열 또는 다음의 서열과 적어도 85%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 하나 이상의 CDR 영역 서열을 포함하는 약학적 제형:
    항체 중쇄 가변 영역 HCDR 서열: 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3; 및
    항체 경쇄 가변 영역 LCDR 서열: 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 항-PD-1 항체는 서열번호 7의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 8의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 약학적 제형.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-PD-1 항체의 농도는 1 ㎎/㎖ 내지 60 ㎎/㎖, 바람직하게는 20-50 ㎎/㎖, 보다 바람직하게는 35-45 ㎎/㎖의 범위이고, 가장 바람직하게는 40 ㎎/㎖인 약학적 제형.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 버퍼는 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트 및 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이고, 바람직하게는 아세테이트 버퍼인 약학적 제형.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 버퍼의 농도는 1-50 mM, 바람직하게는 2-30 mM, 보다 바람직하게는 5-15 mM, 가장 바람직하게는 10 mM인 약학적 제형.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제형의 pH는 4.5 내지 6.0, 바람직하게는 4.8 내지 5.6의 범위이고, 가장 바람직하게는 pH 5.2인 약학적 제형.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 안정화제를 추가로 포함하는 약학적 제형.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 적어도 하나의 안정화제는 사카라이드 또는 아미노산으로부터 선택되는 약학적 제형.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 사카라이드는 디사카라이드이고, 바람직하게는 수크로오스, 락토오스, 트레할로오스, 말토오스로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 트레할로오스이고, 가장 바람직하게는 α,α-트레할로오스 디하이드레이트인 약학적 제형.
  11. 청구항 9 또는 청구항 10에 있어서,
    상기 디사카라이드의 농도는 30 ㎎/㎖ 내지 120 ㎎/㎖, 바람직하게는 60 ㎎/㎖ 내지 100 ㎎/㎖, 보다 바람직하게는 85 ㎎/㎖ 내지 95 ㎎/㎖, 가장 바람직하게는 90 ㎎/㎖인 약학적 제형.
  12. 청구항 8 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    계면활성제를 추가로 포함하고, 상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유, 글리세롤 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스테르로부터 선택되며, 바람직하게는 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스테르는 폴리솔베이트 20, 40, 60 또는 80이고, 가장 바람직하게는 폴리솔베이트 20인 약학적 제형.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 계면활성제의 농도는 0.01 ㎎/㎖ 내지 1 ㎎/㎖, 바람직하게는 0.05 ㎎/㎖ 내지 0.5 ㎎/㎖, 보다 바람직하게는 0.1 ㎎/㎖ 내지 0.4 ㎎/㎖, 가장 바람직하게는 0.2 ㎎/㎖인 약학적 제형.
  14. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 7의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 8의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-1 항체; 및 다음을 포함하는 약학적 제형:
    (ⅰ) 90 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트 및 10 mM 아세테이트 버퍼, pH 5.2; 또는
    (ⅱ) 90 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 10 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.2; 또는
    (ⅲ) 90 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 20 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.4; 또는
    (ⅳ) 60 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.4 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 20 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.0; 또는
    (ⅴ) 60 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.1 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 20 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.2; 또는
    (ⅵ) 60 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 10 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.2; 또는
    (ⅶ) 30 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.4 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 10 mM의 아세테이트 버퍼, pH 4.8; 또는
    (ⅷ) 30 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.2 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 30 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.2; 또는
    (ⅸ) 30 ㎎/㎖의 α,α-트레할로오스 디하이드레이트, 0.4 ㎎/㎖의 폴리솔베이트 20 및 10 mM의 아세테이트 버퍼, pH 5.6.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학적 제형은 주사용 물을 추가로 포함하는 주사가능한 약학적 제형인 안정한 항-PD-1 항체 약학적 제형.
  16. 청구항 15에 따른 약학적 제형으로부터 제조되는 동결건조된 분말.
  17. 청구항 16에 있어서,
    동결건조 공정의 최적 건조 온도는 -10℃ 내지 -5℃인 동결건조된 분말.
  18. 청구항 15 또는 청구항 16에 따른 동결건조된 분말을 용해시켜 수득되는 주사제.
  19. PD-1 매개성 질환 또는 질병의 예방 또는 치료를 위한 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 따른 안정한 항-PD-1 항체 약학적 제형으로서, 상기 질환 또는 질병은 바람직하게는 암이고; 보다 바람직하게는 PD-L1을 발현하는 암이며; 가장 바람직하게는 상기 질환 또는 질병은 유방암, 폐암, 위암, 장암, 신장암, 흑색종이고; 가장 바람직하게는 비-소세포 폐암, 흑색종 및 신장암인 안정한 항-PD-1 항체 약학적 제형.
  20. PD-1 매개성 질환 또는 질병의 예방 또는 치료용 약물의 제조를 위한 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 따른 안정한 항-PD-1 항체 약학적 제형의 용도로서, 상기 PD-1 매개성 질환 또는 질병은 바람직하게는 암이고; 보다 바람직하게는 PD-L1을 발현하는 암이며; 가장 바람직하게는 상기 암은 유방암, 폐암, 위암, 장암, 신장암, 흑색종이고; 가장 바람직하게는 비-소세포 폐암, 흑색종 및 신장암인 용도.
  21. PD-1 매개성 질환 또는 질병의 예방 또는 치료 방법으로서, 상기 질환 또는 질병은 바람직하게는 암이고; 보다 바람직하게는 PD-L1을 발현하는 암이며; 가장 바람직하게는 상기 암은 유방암, 폐암, 위암, 장암, 신장암, 흑색종이고; 가장 바람직하게는 비-소세포 폐암, 흑색종 및 신장암이며, 상기 방법은 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 따른 안정한 항-PD-1 항체 약학적 제형을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
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