CN110448691A - 抗pd-1抗体联合il-15蛋白复合物在制备***的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗PD‑1抗体联合IL‑15蛋白复合物在制备***的药物中的用途。本发明所述肿瘤选自黑色素瘤、皮肤癌、淋巴瘤、肾细胞癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、***癌、血癌、B细胞瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性随性白血病、皮肤T细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、尿路上皮/膀胱癌、肺癌、食道癌、头颈癌、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤和鳞状细胞头颈癌。PD‑1和IL‑15联合***，相比对单药治疗，可以显著减少肿瘤体积。

Description

抗PD-1抗体联合IL-15蛋白复合物在制备***的药物中 的用途

技术领域

抗PD-1抗体或其抗原结合片段和IL-15复合物联合在制备***的药物中的用途。

背景技术

白细胞介素15(IL-15)是Grabstein等人于1994年发现的一种约为12-14kD的细胞因子，可在机体正常的免疫应答中发挥作用，如促进T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞的增殖。IL-15需通过与其受体结合发挥生物学活性。IL-15受体由三个受体亚基组成：IL-15受体α(IL-15Rα)、IL-2受体β(IL-2Rβ)和γc。IL-15Rα内含一个Sushi结构域，能与IL-15结合，并且是使结合后的IL-15发挥生物学功能所必需的。近年发现，IL-15与其受体IL-15Rα形成复合物后，可显著增强IL-15的生物学活性。

由于IL-15在肿瘤免疫治疗领域的良好预期，国内外有不少公司或研究机构在从事IL-15免疫治疗方面的相关研究，比如CN100334112C(上海海欣生物技术有限公司)专利所涉及的IL-15-hIgG4Fc同源二聚体蛋白用于抗微生物感染的治疗；CN103370339B公开了一种IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合蛋白复合物，其IL-15多肽包含N72D突变，该突变体较原始IL-15显示减少的对IL-15βγC受体结合活性；WO2016095642A公开了一种IL-15蛋白复合物，由IL-15多肽和IL-15Rα/Fc组成，其在IL-15和IL-15Rα之间引入二硫键，能够提高分子稳定性及生物活性，同时也能够简化制备工艺。

PD-1抑制剂是当前备受瞩目的新一类肿瘤免疫治疗药物，目前有多家跨国制药公司在研发针对PD-1/PD-L1信号通路的单克隆抗体，WO2017054646A公开了一种抗PD-1单克隆抗体的序列和制备方法，该抗体已处于临床Ⅲ期，安全性良好，已报到的临床研究结果已经显示出其具有一定的抗肿瘤作用([J].Journal of Clinical Oncology 35(2017):e15572-e15572)。

联合用药是影响药物作用的重要因素之一。两种或两种以上药物联合应用时,既可以产生协同作用,也可以产生拮抗作用。目前抗PD-1抗体已在临床上和多种药物联用***，但仍然存在着肿瘤缓解率不高等问题，抗PD-1抗体和IL-15蛋白复合物是否能够成功应用于临床仍值得深入研究。

发明内容

本发明提供一种抗PD-1抗体和IL-15或其蛋白复合物联合在制备***的药物中的用途，其中所述肿瘤优选黑色素瘤、皮肤癌、淋巴瘤、肾细胞癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、***癌、血癌、B细胞瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性随性白血病、皮肤T细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、尿路上皮/膀胱癌、肺癌、食道癌、头颈癌、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤和鳞状细胞头颈癌。

在本发明一个优选的实施方案中，其中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段选自：AMP-224、GLS-010、IBI-308、REGN-2810、PDR-001、BGB-A317、Pidilizumab、PF-06801591、Genolimzumab、CA-170、MEDI-0680、JS-001、TSR-042、Camrelizumab、Pembrolizumab、LZM-009、AK-103和Nivolumab。

在本发明一个优选的实施方案中，其中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3所述的PD-1抗体的重链可变区包含分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

其中，前面所述的各CDR序列如下表所示：

名称	序列	编号
			HCDR1	SYMMS	SEQID NO：1
HCDR2	TISGGGANTYYPDSVKG	SEQID NO：2
			HCDR3	QLYYFDY	SEQID NO：3
LCDR1	LASQTIGTWLT	SEQID NO：4
			LCDR2	TATSLAD	SEQID NO：5
LCDR3	QQVYSIPWT	SEQID NO：6

优选的，所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段为抗PD-1人源化抗体。

优选的，人源化抗体轻链可变区序列为如SEQ ID NO:10所示的序列或其变体；所述的变体优选在轻链可变区有0-10的氨基酸变化；更优选为A43S的氨基酸变化。所述人源化抗体重链可变区序列为如SEQ ID NO:9所示的序列或其变体；所述变体优选在重链可变区有0-10的氨基酸变化；更优选为G44R的氨基酸变化。

前述的人源化抗体重、轻链的可变区序列如下所示：

重链可变区

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGANTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLYYFDYWGQGTTVTVSS

SEQID NO：9

轻链可变区

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQTIGTWLTWYQQKPGKAPKLLIYTATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYSIPWTFGGGTKVEIK

SEQID NO：10

优选的，人源化抗体轻链序列为如SEQ ID NO:8所示的序列或其变体；所述的变体优选在轻链可变区有0-10的氨基酸变化；更优选为A43S的氨基酸变化。所述人源化抗体重链序列为如SEQ ID NO:7所示的序列或其变体；所述变体优选在重链可变区有0-10的氨基酸变化；更优选为G44R的氨基酸变化。

在本发明一个优选的实施方案中，人源化抗体轻链序列为如SEQ ID NO:8所示的序列，重链序列为如SEQ ID NO:7所示的序列。

前述的人源化抗体重、轻链的序列如下所示：

重链

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGANTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQID NO：7

轻链

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQTIGTWLTWYQQKPGKAPKLLIYTATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYSIPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQID NO：8

在本发明一个优选的实施方案中，其中所述IL-15蛋白复合物由可溶性融合蛋白(I)和可溶性融合蛋白(Π)组成；其中可溶性融合蛋白(I)包含IL-15多肽或其功能性片段；可溶性融合蛋白(Π)包含IL-15Rα多肽或其功能性片段；可溶性融合蛋白(I)或可溶性融合蛋白(Π)上具有一个或多个氨基酸位点突变成Cys，与对应的可溶性融合蛋白(Π)或可溶性融合蛋白(I)氨基酸位点上突变成的Cys配对形成二硫键。

在本发明一个优选的实施方案中，其中可溶性融合蛋白(Π)还包含Fc片段或其突变体；优选地，可溶性融合蛋白(Π)由IL-15Rα多肽或其功能性片段连接在Fc片段的N端组成；更优选地，所述的Fc片段为SEQ ID NO：11。

EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO：11

在本发明一个优选的实施方案中，其中所述的可溶性融合蛋白(I)的序列为SEQID NO：12。

NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISCESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

SEQ ID NO：12

在本发明一个优选的实施方案中，其中所述IL-15蛋白复合物的氨基酸Cys突变位点发生在IL-15多肽或其功能性片段上的L45、Q48、V49、L52、E53、C88或E89上，优选发生在L52、E53或E89上，更优选L52。

在本发明一个优选的实施方案中，其中所述IL-15蛋白复合物氨基酸Cys突变位点发生在IL-15Rα多肽或其功能性片段上的K34、L42、A37、G38或S40上，优选发生在A37、G38或S40上，更优选S40。

在本发明一个优选的实施方案中，其中可溶性融合蛋白(Π)的序列选自SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16，优选SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14。

ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTCSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO：13

EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTCSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTT

SEQ ID NO：14

ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTCSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO：15

EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTCSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQR

SEQ ID NO：16

在本发明一个优选的实施方案中，所述IL-15蛋白复合物选自如下可溶性融合蛋白(I)和可溶性融合蛋白(Π)的组合：

在本发明一个优选的实施方案中，其中所述结直肠癌接受过手术治疗。

在本发明一个优选的实施方案中，其中所述结直肠癌接受过5-氟尿嘧啶、亚叶酸钙、卡培他滨、伊立替康、奥沙利铂、贝伐单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、阿柏西普和瑞格菲尼中一种或多种组合治疗。

在本发明一个优选的实施方案中，所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段剂量选自1-10mg/kg，优选自1mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、10mg/kg，最优选3mg/kg。

在本发明一个优选的实施方案中，所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段剂量选自50-600mg，优选自60mg、100mg、200mg、400mg、600mg，最优选200mg。

在本发明一个优选的实施方案中，其中所述的IL-15或其蛋白复合物剂量选自1-100ug/kg，优选自1ug/kg、2ug/kg、3ug/kg、4ug/kg、5ug/kg、6ug/kg、7ug/kg、8ug/kg、9ug/kg、10ug/kg、11ug/kg、12ug/kg、13ug/kg、14ug/kg、15ug/kg、16ug/kg、17ug/kg、18ug/kg、19ug/kg、20ug/kg、21ug/kg、22ug/kg、23ug/kg、24ug/kg、25ug/kg、26ug/kg、27ug/kg、28ug/kg、29ug/kg、30ug/kg、31ug/kg、32ug/kg、33ug/kg、34ug/kg、35ug/kg、36ug/kg、37ug/kg、38ug/kg、39ug/kg、40ug/kg、41ug/kg、42ug/kg、43ug/kg、44ug/kg、45ug/kg、46ug/kg、47ug/kg、48ug/kg、49ug/kg、50ug/kg、55ug/kg、60ug/kg、65ug/kg、70ug/kg、75ug/kg、80ug/kg、85ug/kg、90ug/kg、95ug/kg、100ug/kg。

在本发明优选的实施方案中，所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段以注射的方式给药，例如皮下或静脉注射，注射前需将抗PD-1抗体或其抗原结合片段配制成可注射的形式。特别优选的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的可注射形式是注射液或冻干粉针，其包含抗PD-1抗体或其抗原结合片段、缓冲剂、稳定剂，任选地还含有表面活性剂。缓冲剂可选自醋酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、以及磷酸盐中的一种或几种。稳定剂可选自糖或氨基酸，优选二糖，例如蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖。表面活性剂选自聚氧乙烯氢化蓖麻油、甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯，优选所述聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯为聚山梨酯20、40、60或80，最优选聚山梨酯20。最为优选的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的可注射形式包含抗PD-1抗体或其抗原结合片段、醋酸盐缓冲剂、海藻糖和聚山梨酯20。

在本发明还提供了一种治疗的办法，包括向患者施用前述的有效量的抗PD-1抗体或其抗原结合片段和IL-15或其蛋白复合物。

本发明还提供了一种药物套组，或者一种药物包装盒，其中含有前述的有效量的抗PD-1抗体或其抗原结合片段和IL-15或其蛋白复合物。

本发明还提供了一种药物组合物，包含前述的有效量的抗PD-1抗体或其抗原结合片段和IL-15或其蛋白复合物，以及一种或多种可药用的赋型剂、稀释剂或载体。

发明详述

一、术语

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的抗体可变抗体反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。在本发明一个优选的实施方案中，所述的PD-1人源化抗体小鼠的CDR序列选自SEQ ID NO:1，2，3，4，5，6。

术语“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab‘片段，F(ab’)2片段，以及与人PD-1结合的Fv片段sFv片段；包含本发明所述抗体的选自SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:6中的一个或多个CDR区。Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体(single chain antibody)或单链Fv(sFv)。本发明的术语“与PD-1结合”，指能与人PD-1相互作用。本发明的术语“抗原结合位点”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。

本发明所述的“蛋白复合物”或“复合蛋白”是指两个不同的单体蛋白质结合而成的蛋白。本发明中组成蛋白复合物的“单体蛋白质”(即可溶性融合蛋白(I)、可溶性融合蛋白(Π))可以是融合蛋白或非融合蛋白。

本发明所述的“融合蛋白”是指，通过用基因重组方法、化学方法或其它适当方法将两个或多个基因的编码区连接，在同一调控序列控制下表达基因重组所得的蛋白质产物。在本发明的一些实施方案中，可溶性融合蛋白(I)为IL-15或其变体与生物活性多肽如Fc片段融合或非融合表达得到的单体蛋白质；可溶性融合蛋白(Π)为IL-15Rα或其变体与生物活性多肽如Fc片段融合或非融合表达得到的单体蛋白质。本发明的融合蛋白中，两个或多个基因的编码区之间可由编码肽接头的序列于一个或数个位置融合。肽接头也可用于构建本发明的融合蛋白。

本发明所述的IL-15或功能性片段可以是任何IL-15(白介素15)或其突变体，如人IL-15或非人哺乳动物IL-15或非哺乳动物IL-15。示例性非人哺乳动物如猪、兔、猴、猩猩、鼠等，非哺乳动物如鸡等。优选为人的IL-15及其功能性片段。人白介素15成熟分子见数据库UniProtKB，登录号P40933，49-162aa。“IL-15功能性片段”指通过一个或多个氨基酸替换、增加或者缺失突变获得的对IL-15生物功能有影响或其他性质发生改变的突变体，通过这类氨基酸变化可以增加或者降低IL-15与其受体IL-15Rα或IL-15Rβ之间的相互作用能力；或者增加或者降低IL-15生物学活性比如其刺激免疫细胞增殖活性；或者通过氨基酸突变在IL-15和其受体之间建立共价键或者使共价连接更加稳定等。如IL-15(L52C)，即在52位上亮基酸L被半胱氨酸C替换，通过该位点和IL-15Rα对应某个氨基酸突替换成C并与之形成二硫键。

本发明所述的IL-15Rα或功能性片段可以是任何物种的IL-15Rα或者其功能性片段，如人IL-15Rα或非人哺乳动物IL-15Rα或非哺乳动物IL-15Rα。示例性非人哺乳动物如猪、兔、猴、猩猩、鼠等，非哺乳动物如鸡等。优选人的IL-15Rα，更优选的是人的IL-15Rα胞外区部分，简称IL-15RαECD，见数据库UniProtKB，登录号Q13261，31-205aa。术语“IL-15Rα功能性片段”，优选IL-15Rα胞外域片段的缩短形式，即通过一个或多个氨基酸替换、***或者缺失突变所得的包含sushi结构域的具有人白介素15受体α活性的分子，如IL-15Rα-sushi+。

术语“Fc片段”指的是人免疫球蛋白链恒定区，特别是免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分，无抗原结合活性，是抗体分子与效应分子和细胞相互作用的部位。例如，免疫球蛋白Fc区可包括重链CH1、CH2、CH3、CH4的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。根据重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类，主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-4；IgA-1和IgA-2以及不同的基因型。

“Fc片段”优选包括至少一个免疫球蛋白绞链区，以及IgG的CH2和CH3区。更优选包括IgG1的一个CH2结构域，一个CH3结构域和一个免疫球蛋白绞链区，铰链区起始氨基酸位置可以变动。

本发明中所述的“联合”是一种给药方式，是指在一定时间期限内给予至少一种剂量的抗PD-1抗体或其抗原结合片段和至少一种剂量的IL-15复合物，其中两种物质都显示药理学作用。所述的时间期限可以是一个给药周期内，优选4周内，3周内，2周内，1周内，或24小时以内。可以同时或依次给予抗PD-1抗体或其抗原结合片段和IL-15复合物。这种期限包括这样的治疗，其中通过相同给药途径或不同给药途径给予给予抗PD-1抗体或其抗原结合片段和IL-15复合物。

附图说明

图1.IL-15融合蛋白和PD-1单独或联合给药对小鼠肿瘤体积的影响。

图2.IL-15融合蛋白和PD-1单独或联合给药对小鼠体重的影响。

具体实施方式

以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。

1、实验目的：本实验在人PD-1转基因小鼠皮下接种小鼠MC38系结肠癌细胞建立肿瘤模型，通过肿瘤的体积及小鼠体重来评价联合用药对抗肿瘤作用及其安全性。联合药物治疗是腹腔给予一定剂量的抗PD-1抗体，同时静脉注射一定剂量的IL-15融合蛋白。

2、实验材料和方法：

2.1实验动物和材料：

人PD-1转基因小鼠：42只，由Cephrim公司动物中心繁殖，原始的3对人PD-1转基因小鼠购自英国的Isis公司，SPF级饲养。

溶媒：5％葡萄糖，PBS

人IgG：来自血清(Sigma-Aldrich)，产品编号：I4506-50MG

抗PD-1抗体：其重、轻链的序列如本发明中SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，冻干粉，注射用水溶解后，再用5％葡萄糖稀释，最终浓度为0.3mg/ml，批号P1636。IL-15融合蛋白：由江苏恒瑞医药提供，序列如编号3所述，其由可溶性融合蛋白(I)(SEQ ID NO：12)和可溶性融合蛋白(Π)(SEQ ID NO:15)组成，注射用水溶解后，再用PBS稀释，最终浓度为25μg/ml，批号P1640。

MC38细胞：DMEM培养基，10％胎牛血清，37℃，5％CO₂培养。选择用于植入的细胞符合以下四个标准：1)快速生长；2)传代次数少；3)接种前一天更换培养基和4)具有高生存力。

2.2实验方法：

在接种当天收获MC38细胞，将细胞(5x10⁵)接种于42只人PD-1转基因小鼠(雌雄都有)右肋部皮下，待小鼠平均肿瘤体积达到100mm³左右时，选取32只，随机分成4组，每组8只。分组后根据方案给予腹腔注射(IP)抗PD-1抗体，及静脉注射(IV)IL-15融合蛋白。每周两次测量肿瘤体积，称体重，记录数据，肿瘤体积变化率见图1，小鼠体重变化率见图2。

2.3实验分组及给药方案

表1：实验分组及给药方案

	分组	剂量	给药方案	给药方式
					组1	对照(hIgG和溶媒)	3mg/kg	Q2D×7	IP
组2	PD-1	3mg/kg	Q2D×7	IP
					组3	IL-15融合蛋白	5μg/只	QW×3	IV
组4	PD-1+IL-15融合蛋白	3mg/kg+5μg/只	Q2D×7+QW×3	IP+IV

注：Q2D×7：两天一次，给药7次；QW×3：一周一次，给药3次；

3、数据表达和统计学处理

各组动物的体重、肿瘤体积及瘤重，数据用平均值±标准差(Mean±SEM)表示，T-test对数据进行统计学分析。肿瘤体积计算公式：体积＝0.5236×长×短×高4、实验结果

表2.肿瘤体积(mm³)

**p<0.01vs.组1；#P<0.05vs组3。

结论：与对照组相比，PD-1和IL-15联合给药肿瘤体积抑制率显著上升，小鼠体重变化基本相同。

序列表

<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司

苏州盛迪亚生物医药有限公司

<120> 抗PD-1抗体联合IL-15蛋白复合物在制备***的药物中的用途

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 1

Ser Tyr Met Met Ser

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 2

Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 3

Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 4

Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Thr

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 5

Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 6

Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(443)

<223> 重链序列

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295 300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

305 310 315 320

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

340 345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

405 410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<210> 8

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(214)

<223> 轻链序列

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp

20 25 30

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 9

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(116)

<223> 重链可变区

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> 轻链可变区

<400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp

20 25 30

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 11

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 12

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1 5 10 15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

20 25 30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

35 40 45

Val Ile Ser Cys Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

50 55 60

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

65 70 75 80

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

85 90 95

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

100 105 110

Thr Ser

<210> 13

<211> 417

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val

1 5 10 15

Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly

20 25 30

Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Cys Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn

35 40 45

Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile

50 55 60

Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val

65 70 75 80

Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly

85 90 95

Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr

100 105 110

Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro

115 120 125

Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr

130 135 140

Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser

145 150 155 160

His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Gly

165 170 175

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys

180 185 190

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

195 200 205

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

210 215 220

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

225 230 235 240

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

245 250 255

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

260 265 270

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

275 280 285

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

290 295 300

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

305 310 315 320

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

325 330 335

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

340 345 350

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

355 360 365

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

370 375 380

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

385 390 395 400

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

405 410 415

Lys

<210> 14

<211> 417

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

225 230 235 240

Gly Ser Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile

245 250 255

Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn

260 265 270

Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Cys Ser Leu Thr Glu Cys Val

275 280 285

Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys

290 295 300

Cys Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser

305 310 315 320

Thr Val Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro

325 330 335

Ser Gly Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala

340 345 350

Ala Thr Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys

355 360 365

Ser Pro Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His

370 375 380

Gly Thr Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser

385 390 395 400

Ala Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr

405 410 415

Thr

<210> 15

<211> 315

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val

1 5 10 15

Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly

20 25 30

Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Cys Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn

35 40 45

Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile

50 55 60

Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

65 70 75 80

Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

85 90 95

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

100 105 110

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

115 120 125

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

130 135 140

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

145 150 155 160

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

165 170 175

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

180 185 190

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

195 200 205

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

210 215 220

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

225 230 235 240

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

245 250 255

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

260 265 270

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

275 280 285

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

290 295 300

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

305 310 315

<210> 16

<211> 315

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

225 230 235 240

Gly Ser Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile

245 250 255

Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn

260 265 270

Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Cys Ser Leu Thr Glu Cys Val

275 280 285

Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys

290 295 300

Cys Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg

305 310 315

Claims (21)

1.抗PD-1抗体和IL-15或其蛋白复合物联合在制备***的药物中的用途，其中所述肿瘤优选黑色素瘤、皮肤癌、淋巴瘤、肾细胞癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、***癌、血癌、B细胞瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性随性白血病、皮肤T细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、尿路上皮/膀胱癌、肺癌、食道癌、头颈癌、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤和鳞状细胞头颈癌。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段选自：AMP-224、GLS-010、IBI-308、REGN-2810、PDR-001、BGB-A317、Pidilizumab、PF-06801591、Genolimzumab、CA-170、MEDI-0680、JS-001、TSR-042、Camrelizumab、Pembrolizumab、LZM-009、AK-103和Nivolumab。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3所述的PD-1抗体的重链可变区包含分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述抗PD-1抗体为人源化抗体。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述人源化抗体的轻链可变区序列为如SEQ IDNO:10所示的序列或其变体，所述的变体优选在轻链可变区有0-10的氨基酸变化，更优选为A43S的氨基酸变化；重链可变区序列为如SEQ ID NO:9所示的序列或其变体，所述变体优选在重链可变区有0-10的氨基酸变化，更优选为G44R的氨基酸变化。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述人源化抗体轻链序列为如SEQ ID NO:8所示的序列或其变体，所述的变体优选在轻链可变区有0-10的氨基酸变化，更优选为A43S的氨基酸变化；重链序列为如SEQ ID NO:7所示的序列或其变体，所述变体优选在重链可变区有0-10的氨基酸变化；更优选为G44R的氨基酸变化。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述的人源化抗体轻链序列为如SEQ ID NO:8所示的序列，重链序列为如SEQ ID NO:7所示的序列。

8.根据权利要求1所述的用途，其中所述IL-15蛋白复合物由可溶性融合蛋白(I)和可溶性融合蛋白(Π)组成；其中可溶性融合蛋白(I)包含IL-15多肽或其功能性片段；可溶性融合蛋白(Π)包含IL-15Rα多肽或其功能性片段；可溶性融合蛋白(I)或可溶性融合蛋白(Π)上具有一个或多个氨基酸位点突变成Cys，与对应的可溶性融合蛋白(Π)或可溶性融合蛋白(I)氨基酸位点上突变成的Cys配对形成二硫键。

9.根据权利要求8所述的用途，其中可溶性融合蛋白(Π)还包含Fc片段或其突变体；优选地，可溶性融合蛋白(Π)由IL-15Rα多肽或其功能性片段连接在Fc片段的N端组成；更优选地，所述的Fc片段为SEQ ID NO：11。

10.根据权利要求8所述的用途，其中所述的可溶性融合蛋白(I)的序列为SEQ ID NO：12。

11.根据权利要求8至10任一项所述的用途，其中所述IL-15蛋白复合物的氨基酸Cys突变位点发生在IL-15多肽或其功能性片段上的L45、Q48、V49、L52、E53、C88或E89上，优选发生在L52、E53或E89上，更优选L52。

12.根据权利要求8至10任一项所述的用途，其中所述IL-15蛋白复合物氨基酸Cys突变位点发生在IL-15Rα多肽或其功能性片段上的K34、L42、A37、G38或S40上，优选发生在A37、G38或S40上，更优选S40。

13.根据权利要求8至12任一项所述的用途，其中可溶性融合蛋白(Π)的序列选自SEQID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16，优选SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14。

14.根据权利要求8所述的用途，所述IL-15蛋白复合物选自如下可溶性融合蛋白(I)和可溶性融合蛋白(Π)的组合：

15.根据权利要求1至14任一项所述的用途，其中所述结直肠癌接受过手术治疗。

16.根据权利要求1至14任一项所述的用途，其中所述结直肠癌接受过5-氟尿嘧啶、亚叶酸钙、卡培他滨、伊立替康、奥沙利铂、贝伐单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、阿柏西普和瑞格菲尼中一种或多种组合治疗。

17.根据权利要求1至7任一项所述的用途，其中所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段剂量选自1-10mg/kg，优选自1mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、10mg/kg，最优选3mg/kg。

18.根据权利要求1至7任一项所述的用途，其中所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段剂量选自50-600mg，优选自60mg、100mg、200mg、400mg、600mg，最优选200mg。

19.根据权利要求1、8至14任一项所述的用途，其中所述的IL-15或其蛋白复合物剂量选自1-100ug/kg，优选自1ug/kg、2ug/kg、3ug/kg、4ug/kg、5ug/kg、6ug/kg、7ug/kg、8ug/kg、9ug/kg、10ug/kg、11ug/kg、12ug/kg、13ug/kg、14ug/kg、15ug/kg、16ug/kg、17ug/kg、18ug/kg、19ug/kg、20ug/kg、21ug/kg、22ug/kg、23ug/kg、24ug/kg、25ug/kg、26ug/kg、27ug/kg、28ug/kg、29ug/kg、30ug/kg、31ug/kg、32ug/kg、33ug/kg、34ug/kg、35ug/kg、36ug/kg、37ug/kg、38ug/kg、39ug/kg、40ug/kg、41ug/kg、42ug/kg、43ug/kg、44ug/kg、45ug/kg、46ug/kg、47ug/kg、48ug/kg、49ug/kg、50ug/kg、55ug/kg、60ug/kg、65ug/kg、70ug/kg、75ug/kg、80ug/kg、85ug/kg、90ug/kg、95ug/kg、100ug/kg。

20.一种药物包装盒，包含有权利要求1-19任意一项所述的有效量的抗PD-1抗体或其抗原结合片段和IL-15或其蛋白复合物。

21.一种药物组合物，包含有权利要求1-19任意一项所述的有效量的抗PD-1抗体或其抗原结合片段和IL-15或其蛋白复合物，以及一种或多种可药用的赋型剂、稀释剂或载体。