KR20160134758A - 이형 폴리펩티드의 분비를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

이형 폴리펩티드의 분비를 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 단백질 기술 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 박테리아로부터 유래한 이형 폴리펩티드의 분비를 위한 신호 서열에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 재조합 폴리펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

이형 폴리펩티드의 분비를 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR SECRETION OF HETEROLOGOUS POLYPEPTIDES}
관련 출원의 교차 참조
본원은 미국 가출원 번호 61/953,629 (2014년 3월 14일 출원), 미국 특허 출원 번호 62/107,981 (2015년 1월 26일 출원), 및 미국 특허 출원 번호 62/108,476 (2015년 1월 27일 출원)을 우선권으로 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다.
서열목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하고, 이의 전문은 본원에 참조로 인용된다. 2015년 3월 12일에 생성된 상기한 ASCII 복사본은 P5804R1-WO_SL.txt로 지칭되고, 크기는 21,971 바이트이다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 단백질 기술 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 박테리아로부터 유래한 이형 폴리펩티드에 대한 신호 펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 원핵생물에 의해 생산된 (prokaryotically produced) 재조합 폴리펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다.
최근, 다양한 장애 및 질환에 대한 진단성 및 치료성 제제로서의, 이형 폴리펩티드, 예를 들어, 항체의 사용에 대한 높은 전망이 예견되고 있다. 많은 연구 및 임상 적용은 많은 양의 기능적 폴리펩티드를 요구하며, 이에 의하여 폴리펩티드 생산을 위한 보다 범위가 넓은, 그러나 경제적인 시스템이 요구되고 있다. 특히 유용한 것은 원핵생물, 예컨대 이. 콜라이 또는 고초균(B. subtilis )에서부터 효모, 식물, 곤충 세포 및 포유동물 세포에 이르는 범위의 다양한 발현 숙주를 사용한 항체의 재조합 생산이다. Kipriyanov and Little (1999) Mol . Biotech . 12:173-201.
다른 폴리펩티드 생산계와 비교하여, 박테리아, 특히 이. 콜라이는 많은 특이한 장점을 제공한다. 사용된 원료 (즉, 박테리아 세포)는 저렴하고 재배가 용이하여, 생성물의 단가를 낮춘다. 원핵생물 숙주는 예를 들어, 포유동물 세포보다 훨씬 더 빨리 자라며, 이는 유전적 조작의 더욱 빠른 분석을 가능케한다. 보다 짧은 생성 시간 및 규모 증대의 용이성은 또한 박테리아 발효를 다량의 단백질 생산을 위한 수단을 더욱 매력적이도록 한다. 이 . 콜라이를 포함하는 많은 박테리아 종의 게놈 구조 및 생물학적 활성은 깊이 연구되어 왔으며, 넓은 범위의 적합한 벡터가 이용가능하여, 원하는 항체의 발현을 더욱 편리하게 만들었다. 진핵생물과 비교하여, 재조합 유전자 조작, 다중 사본의 숙주로의 안정한 변형, 발현 유도 및 생성물의 특징화를 포함하는 생산 공정과 연관되는 단계가 보다 적다. Pluckthun and Pack (1997) Immunotech 3:83-105.
박테리아 내 재조합 폴리펩티드를 제조하는 다양한 접근이 사용되었다. 재조합 단백질은 세포질 내 발현된 봉입체의 재접힘을 통하여, 또는 발현 이후 박테리아 주변세포질을 통하여 박테리아로부터 수득될 수 있다. 분비 및 재접힘 사이의 선택은 일반적으로 수개의 고려에 의하여 인도된다. 분비는 보통, 항체 생산을 위한 더욱 빠르고 일반적인 전략이다. Kipriyanov and Little (1999), 상기 참조. 그러나, 이. 콜라이 분비 및 재접힘 용량은 종종, 기타 발현 숙주와 비교하여, 더욱 낮은 수준으로 제한된다.
원핵생물계에서의 항체 발현은 상이한 범위로 수행될 수 있다. 이 . 콜라이에서의 항체 생산의 일반적인 고찰을 위하여, 다음을 참고한다: Pluckthun and Pack (1997) Immunotech 3:83-105; Pluckthun et al. (1996) in Antibody Engineering: A Practical Approach, pp 203-252 (Oxford Press); Pluckthun (1994) in Handbook of Exp Pharmcol vol 3: The Pharmcol of Monoclonal Antibodies, pp269-315 (ed. M. Rosenberg 및 G.P. Moore; Springer-Verlag, Berlin).
많은 생물학적 검정 (예컨대 X-선 결정학) 및 임상 적용 (예컨대 단백질 요법)은 다량의 단백질을 필요로 한다. 따라서, 적절하게 조립된, 용해성 및 기능성 이형 폴리펩티드, 예컨대 항체 생산을 위한 고수율임에도 단순한 시스템에 대한 요구가 존재한다.
특허 출원 및 공보를 포함한, 본원에 인용된 모든 참조는, 그 전체가 참고로 본원에 통합되어 있다.
발명의 요약
본 발명은 항체와 같은 이형 단백질의 생산을 증가시키기 위한 신규한 수단을 제공한다. 이형 단백질 (예를 들어, 항체)의 고-수준 생산을 위한 수단으로서 주변세포질 분비의 사용은 수개의 빈번히 대두되는 문제에 의하여 제한될 수 있다. 우선, 관심 단백질의 분비 효율은 낮을 수 있다. 두번째로, 많은 경우에서 전구체의 성숙한 단백질로의 과정은 불완전하다. 세번째로, 과발현된 이형 단백질은 종종 불완전하게 접히거나, 비용해성 봉입체로 응집되거나, 또는 이. 콜라이 프로테아제에 의하여 단백질분해(proteolyzed)된다. 네번째로, 항체는 2개의 상이한 폴리펩티드, 중쇄 및 경쇄로부터 제조된 복합 다량체 단백질이며, 이는 주변세포질로 유출되고, 적절하게 접히며, 그리고 적절한 이황화 결합을 형성해야 한다. 이러한 단백질 접힘 및 분비의 복합성은 이 콜라이 내에서 제조된 항체 유발에 부가된다. 이. 콜라이 분비 및 재접힘 용량은 종종, 기타 발현 숙주와 비교하여, 더욱 낮은 수준으로 제한된다. TIR 최적화가 더욱 효율적인 단백질 분비의 생성을 위하여 유용할 수 있는 것으로 나타난 한편, 다른 접근은 이 콜라이 내의 이형 단백질의 분비를 일상적으로 개선하는 것으로 나타나지 않았다. 예를 들어, 신호 단백질의 최적화는 재조합 사이클로덱스트린 탄수화물분해효소 (CGTase)의 주변세포질 공간으로의 분비를 감소시키는 것으로 나타났다. Jonet et al., J Mol Microbiol Biotechnol (2012); 22:48-58.
현 연구에서, 발명자들은, 신호 펩티드의 증가하는 평균 소수성이, 용해성 항체의 이 콜라이 주변세포질로의 분비를 증가시킨다는 것을 예증하였다. 증가된 평균 소수성을 갖는 변이체 신호 펩티드가 개발되었고, 발명자들은, 증가된 평균 소수성을 갖는 신호 펩티드 변이체가 사용될 경우, 용해성 항체의 증가된 주변세포질 분비 및 감소된 평균 소수성을 갖는 신호 펩티드 변이체가 사용될 경우, 용해성 항체의 감소된 주변세포질 분비를 예증하였다.
일 양태에서, 하기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 이. 콜라이 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 이. 콜라이 숙주 세포로부터 유래한 항체 중쇄 및/또는 항체 경쇄의 분비를 증가시키는 방법이 제공된다: (1) 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제1 신호 펩티드를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 (여기서 신호 펩티드의 평균 소수성은 약 0.5 초과이다); 및/또는 (2) 항체 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 제2 신호 펩티드를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드 (이에 의하여 숙주 세포 내 항체 발현 상에서, 신호 펩티드의 평균 소수성은 약 0.5 초과이고, 중쇄 및 경쇄는 생물학적으로 활성인 항체를 형성하도록 접힘 및 조립된다).
일 양태에서, 하기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 이. 콜라이 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 이. 콜라이 숙주 세포로부터 유래한 항체 중쇄 및/또는 항체 경쇄를 제조하는 방법이 제공된다: 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제1 신호 펩티드를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 (여기서 신호 펩티드의 평균 소수성은 약 0.5 초과이다); 및/또는 (2) 항체 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 제2 신호 펩티드를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드 (이에 의하여 숙주 세포 내 항체 발현 상에서, 신호 펩티드의 평균 소수성은 약 0.5 초과이고, 중쇄 및 경쇄는 생물학적으로 활성인 항체를 형성하도록 접힘 및 조립된다). 일부 구현예에서, 상기 방법은 숙주 세포 배양물로부터 이형 폴리펩티드를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 이형 폴리펩티드는 숙주 세포 배양 배지로부터 회수된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 이형 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 제형을 제조하기 위하여 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 담체를 상기 회수된 이형 폴리펩티드와 조합하는 단계를 추가로 포함한다.
일 양태에서, 하기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 이. 콜라이 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 이. 콜라이 숙주 세포로부터 유래한 항체 중쇄 및/또는 항체 경쇄를 제조하는 방법이 제공된다: 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제1 신호 펩티드를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 (여기서 신호 펩티드의 평균 소수성은 약 0.5 초과이다); 및/또는 (2) 항체 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 제2 신호 펩티드를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드 (이에 의하여 숙주 세포 내 항체 발현 상에서, 신호 펩티드의 평균 소수성은 약 0.5 초과이고, 중쇄 및 경쇄는 생물학적으로 활성인 항체를 형성하도록 접힘 및 조립된다).
일 양태에서, 하기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 이. 콜라이 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 이. 콜라이 숙주 세포로부터 유래한 항체 중쇄 및/또는 항체 경쇄의 전좌 방법이 제공된다: 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제1 신호 펩티드를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 (여기서 신호 펩티드의 평균 소수성은 약 0.5 초과이다); 및/또는 (2) 항체 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 제2 신호 펩티드를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드 (이에 의하여 숙주 세포 내 항체 발현 상에서, 신호 펩티드의 평균 소수성은 약 0.5 초과이고, 중쇄 및 경쇄는 생물학적으로 활성인 항체를 형성하도록 접힘 및 조립된다).
일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드의 평균 소수성은 약 0.6 초과이다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드의 평균 소수성은 약 0.7 초과이다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드의 평균 소수성은 약 0.6 초과이다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드의 평균 소수성은 약 0.7 초과이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 신호 펩티드의 평균 소수성은 유사 (예를 들어, 대략 동등)하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 신호 펩티드의 평균 소수성은 상이하다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 신호 펩티드는 변이체 공-번역 신호 펩티드이다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 신호 펩티드는 변이체 DsbA 신호 펩티드이다. 일부 구현예에서, 변이체 DsbA 신호 펩티드는 잔기 L11에서의 변이를 포함하고, 여기서 상기 변이체 DsbA 신호 펩티드는 서열 번호: 3의 야생형 DsbA 신호 펩티드보다 더 큰 평균 소수성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변이는 L11I 또는 S18Y이다. 일부 구현예에서, 변이체 DsbA 신호 펩티드는 서열 번호: 13 또는 15의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 신호 펩티드는 Sfmc 신호 펩티드이다. 일부 구현예에서, Sfmc 신호 펩티드는 야생형 Sfmc 신호 펩티드의 TIR 강도와 상이한 TIR 강도를 갖는다. 일부 구현예에서, Sfmc 신호 펩티드의 상대적 번역 강도 (또한 TIR 강도라고 불림)는 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 또는 그 이상, 예컨대 약 8, 약 9, 또는 그 이상이다. 일부 구현예에서, Sfmc 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 1 내지 3, 2 내지 4, 3 내지 5, 4 내지 6, 5 내지 7, 6 내지 8이다. 일부 구현예에서, Sfmc 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 2 내지 5, 3 내지 7, 또는 4 내지 8이다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 FlgI, NikA, AsmA, TolB, YraI, FecB, CemH, TreA, FocC, TraU, SfmL, 또는 TorT이다. 일부 구현예에서, FlgI, NikA, AsmA, TolB, YraI, FecB, CemH, TreA, FocC, TraU, SfmL, 또는 TorT 신호 펩티드는 야생형 FlgI, NikA, AsmA, TolB, YraI, FecB, CemH, TreA, FocC, TraU, SfmL, 또는 TorT 신호 펩티드의 상대적 번역 강도와 상이한 상대적 번역 강도를 갖는다. 일부 구현예에서, FlgI, NikA, AsmA, TolB, YraI, FecB, CemH, TreA, FocC, TraU, SfmL, 또는 TorT 신호 펩티드의 TIR 강도는 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 또는 그 이상, 예컨대 약 8, 약 9, 또는 그 이상이다. 일부 구현예에서, FlgI, NikA, AsmA, TolB, YraI, FecB, CemH, TreA, FocC, TraU, SfmL, 또는 TorT 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 1 내지 3, 2 내지 4, 3 내지 5, 4 내지 6, 5 내지 7, 6 내지 8이다. 일부 구현예에서, FlgI, NikA, AsmA, TolB, YraI, FecB, CemH, TreA, FocC, TraU, SfmL, 또는 TorT 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 2 내지 5, 3 내지 7, 또는 4 내지 8이다.
일부 구현예에서, 신호 펩티드는 Sfmc가 아니다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 TorT가 아니다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 FlgI, NikA, AsmA, TolB, YraI, FecB, CemH, TreA, FocC, TraU, SfmL, 또는 TorT 중 임의의 하나 이상의 것이 아니다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 또는 약 8이다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 약 5이고, 제2 신호 서열의 상대적 번역 강도는 약 8이다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 약 8이고, 제2 신호 서열의 상대적 번역 강도는 약 5이다. 일부 구현예에서, Sfmc 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 1 내지 3, 2 내지 4, 3 내지 5, 4 내지 6, 5 내지 7, 6 내지 8이다. 일부 구현예에서, Sfmc 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 2 내지 5, 3 내지 7, 또는 4 내지 8이다.
일부 구현예에서, 숙주 세포 내 폴리뉴클레오티드는 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 phoA, tac, lpp, lac-lpp, lac, ara, 및 T7 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 원핵생물 프로모터이다.
일부 구현예에서, 이. 콜라이 숙주 세포는, 내인성 프로테아제 활성이 결여된 균주의 것이다. 일부 구현예에서, 이. 콜라이의 유전자형은 degP 및 prc 유전자가 없으며, 돌연변이체 spr 유전자를 갖는다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 DsbA, DsbC, DsbG 및 FkpA로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 원핵생물 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 DsbA 및 DsbC 둘 다를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 숙주 세포 배양물로부터의 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 숙주 세포 배양 배지로부터 회수된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 항체를 포함하는 약제학적 제형을 제조하기 위하여 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 담체를 상기 회수된 항체와 조합하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 형성된 적어도 50%의 면역글로불린 폴리펩티드 복합체는 항체이다. 일부 구현예에서, 형성된 적어도 70%의 면역글로불린 폴리펩티드 복합체는 항체이다. 일부 구현예에서, 형성된 적어도 80%의 면역글로불린 폴리펩티드 복합체는 항체이다. 일부 구현예에서, 형성된 적어도 90%의 면역글로불린 폴리펩티드 복합체는 항체이다.
일부 구현예에서, 항체는 단클론성 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 키메라 항체, 친화도 성숙된 항체, 이중특이적 항체, 인간화된 항체, 또는 인간 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 이중특이적 항체이다.
또 다른 양태에서, 변이체 DsbA 신호 펩티드가 제공되며, 상기 변이체는 0.5 초과의 평균 소수성을 갖는 H 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, 변이체 DsbA 신호 펩티드는 잔기 S11에서의 변이를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 3의 DsbA 신호 펩티드보다 더 큰 평균 소수성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변이는 L11I 및/또는 S18Y이다.
또 다른 양태에서, 변이체 STII 신호 펩티드는 잔기 S11에서의 변이를 포함하고, 여기서 상기 변이체 STII는 서열 번호: 1의 STII 신호 펩티드보다 더 큰 평균 소수성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변이는 S11A, S11I 또는 S11L이다.
또 다른 양태에서, 서열 번호: 8, 11, 13, 15, 31, 또는 33의 서열을 포함하거나 필수적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된 변이체 신호 펩티드가 제공된다.
또 다른 양태에서, 이형 단백질에 융합된, 본원에 개시된 변이체 신호 펩티드 중 임의의 것이 제공된다. 일부 구현예에서, 이형 폴리펩티드는 항체 중쇄이다. 일부 구현예에서, 이형 폴리펩티드는 항체 경쇄이다. 일부 구현예에서, 이형 폴리펩티드는 항체 경쇄 및 중쇄이다. 일부 구현예에서, 이형 폴리펩티드는 다량체 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 이형 폴리펩티드는 면역접합체(immunoadhesin)이다.
또 다른 양태에서, 본원에 개시된 변이체 신호 펩티드 중 임의의 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이 제공된다.
또 다른 양태에서, 숙주 세포 내 이형 폴리펩티드의 발현 상에서, 이형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되는, 본원에 개시된 변이체 신호 펩티드 중 임의의 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이 제공되며, 이형 폴리펩티드는 생물학적으로 활성인 이형 폴리펩티드를 형성하기 위하여 접힘 및 조립된다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 원핵생물 숙주 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 이. 콜라이이다.
또 다른 양태에서, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 상기 폴리뉴클레오티드는 하기를 포함한다: (1) 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제1 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 (2) 항체 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 제2 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (이에 의하여 숙주 세포 내 항체 발현 상에서, 중쇄 및 경쇄는 생물학적으로 활성인 항체를 형성하도록 접힘 및 조립되고, 제1 신호 펩티드는 본원에 개시된 변이체 신호 펩티드 중 임의의 것의 변이체 신호 펩티드이다). 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 서열 번호: 8, 11, 13, 15, 31, 33, 또는 42의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 변이체 DsbA 신호 펩티드이며, 여기서 상기 변이체는 평균 소수성이 0.5 초과인 H 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 잔기 S11에서의 변이를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 3의 DsbA 신호 펩티드보다 더 큰 평균 소수성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변이는 L11I 및/또는 S18Y이다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 잔기 S11에서의 변이를 포함하는 변이체 STII 신호 펩티드이고, 여기서 상기 변이체 STII 신호 펩티드는 서열 번호: 1의 STII 신호 펩티드보다 더 큰 평균 소수성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변이는 S11A, S11I 또는 S11L이다.
일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드는 신호 펩티드이다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드는 서열 번호: 8, 11, 13, 15, 31, 33, 또는 42의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드는 변이체 DsbA 신호 펩티드이며, 여기서 상기 변이체는 평균 소수성이 0.5 초과인 H 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드는 잔기 S11에서의 변이를 포함하고, 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 3의 DsbA 신호 펩티드보다 더 큰 평균 소수성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변이는 L11I 및/또는 S18Y이다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드는 잔기 S11에서의 변이를 포함하는 변이체 STII 신호 펩티드이고, 여기서 상기 변이체 STII 신호 펩티드는 서열 번호: 1의 STII 신호 펩티드보다 더 큰 평균 소수성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변이는 S11A, S11I 또는 S11L이다.
일부 구현예에서, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하기를 포함한다: (3) Fc 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제3 신호 펩티드를 암호화하는 폴리펩티드. 제3 신호 펩티드는, 예를 들어, 본원에 개시된 변이체 신호 펩티드 중 임의의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 제3 신호 펩티드는 서열 번호: 8, 11, 13, 15, 31, 33, 또는 42의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 이형 폴리펩티드와 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 phoA, tac, lpp, lac-lpp, lac, ara, trp, 및 T7 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 원핵생물 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 phoA 프로모터이다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 (a) 제1 프로모터 (상기 제1 프로모터는 경쇄와 작동가능하게 연결됨) 및 (b) 제2 프로모터 (상기 제2 프로모터는 중쇄와 작동가능하게 연결됨)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 프로모터는 둘 다 phoA 프로모터이다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 (c) 제3 프로모터를 추가로 포함하고, 여기서 상기 제3 프로모터는 Fc 폴리펩티드와 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 phoA 프로모터이다.
일부 구현예에서, 상기 이형 폴리펩티드는 프로테아제, 면역접합체, 수용체의 세포외 도메인, 이형다량체 단백질 또는 항체이다.
일부 구현예에서, 항체는 단클론성 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 키메라 항체, 이중특이적 항체, 인간화된 항체, 항체 단편, 또는 인간 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 이중특이적 항체이다.
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터. 일부 구현예에서, 벡터는 발현 벡터이다.
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는, 조성물.
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는, 숙주 세포. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 원핵생물 세포이다. 일부 구현예에서, 원핵생물 세포는 이. 콜라이이다. 일부 구현예에서, 이. 콜라이는, 내인성 프로테아제 활성이 결여된 균주의 것이다. 일부 구현예에서, 이. 콜라이의 유전자형은 degP 및 prc 유전자가 없으며, 돌연변이체 spr 유전자를 갖는다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 원핵생물 샤프론 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 원핵생물 샤프론 단백질은 DsbA 및/또는 DsbC이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 원핵생물 샤프론 단백질을 과발현한다.
또 다른 양태에서, 이형 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기술된 숙주 세포 중 임의의 것을 배양하여 핵산이 발현되도록 하는 단계를 포함하며, 숙주 세포 내 이형 폴리펩티드의 발현 상에서, 이형 폴리펩티드는 생물학적으로 활성인 이형 폴리펩티드를 형성하기 위하여 접혀진다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 숙주 세포 배양물로부터 이형 폴리펩티드를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 이형 폴리펩티드는 숙주 세포 배양 배지로부터 회수된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 이형 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 제형을 제조하기 위하여 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 담체를 상기 회수된 이형 폴리펩티드와 조합하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 세포로부터 이형 폴리펩티드를 분비하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기술된 숙주 세포 중 임의의 것을 배양하여 핵산이 발현되고, 상기 이형 폴리펩티드가 분비되도록 하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 세포로부터 이형 폴리펩티드의 전좌 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기술된 숙주 세포 중 임의의 것을 배양하여 핵산이 발현되고, 상기 이형 폴리펩티드가 전좌되도록 하는 단계를 포함한다.
본원에 제공된 방법 중 임의의 것에 의하여 수득된, 이형 폴리펩티드. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 항체이다.
일부 구현예에서, 변이체 신호 펩티드의 사용은 하기를 유발한다: 예컨대, 이형 폴리펩티드 (예컨대, 항체, 예컨대, 중쇄 및/또는 경쇄)의 증가된 생산, 이형 폴리펩티드 (예컨대, 항체)의 증가된 분비, 성숙 이형 폴리펩티드 (예컨대, 항체)의 증가된 생산, 성숙 이형 폴리펩티드 (예컨대, 항체)의 증가된 분비, 용해성 이형 폴리펩티드 (예컨대, 항체)의 증가된 생산, 용해성 이형 폴리펩티드 (예컨대, 항체)의 증가된 분비, 주변세포질 측면 상에서의 봉입체의 증가된 국지화, 및/또는 이형 폴리펩티드의 증가된 생산 (이에 의하여 이형 폴리펩티드는, 예컨대 야생형 (비-변이체) 신호 펩티드의 사용과 비교 시, 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 (예컨대, 항체)로 분비, 접힘 및 조립된다). 일부 구현예에서, 변이체 신호 펩티드 및 야생형 (비-변이체) 신호 펩티드의 상대적 번역 강도 (또한 TIR 강도라고 불림)는 약 1이다. 일부 구현예에서, 변이체 신호 펩티드 및 야생형 (비-변이체) 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 또는 그 이상, 예컨대 약 8 또는 그 이상이다. 일부 구현예에서, 변이체 신호 펩티드 및 야생형 (비-변이체) 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 약 4이다. 일부 구현예에서, 변이체 신호 펩티드 및 야생형 (비-변이체) 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 약 5이다. 일부 구현예에서, 변이체 신호 펩티드 및 야생형 (비-변이체) 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 약 6이다. 일부 구현예에서, 변이체 신호 펩티드 및 야생형 (비-변이체) 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 약 8이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 대략 동등하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 상이하다.
일 양태에서, 본원의 변이체 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이 제공된다. 일부 구현예에서, 변이체는 PhoA, MalE, DsbA 또는 STII 신호 펩티드의 것이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 8, 11, 12, 13, 14, 15, 31, 32, 33, 34, 또는 35의 아미노산을 암호화한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 하기 서열 번호의 아미노산 서열을 암호화한다. 8, 11, 또는 13. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 12 또는 15의 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 31 또는 33의 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 32, 34, 또는 35의 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 36, 37, 38, 39 또는 40의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 23, 24, 25, 26, 또는 28의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 29의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 27 또는 30의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 36 또는 38의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 37, 39 또는 40의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 숙주 세포 (예를 들어, 원핵생물 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 숙주 세포) 내 이형 폴리펩티드의 발현 상에서, 이형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되는, 본원의 변이체 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 이형 폴리펩티드는 생물학적으로 활성인 이형 폴리펩티드를 형성하기 위하여 접힘 및 조립된다. 이형 폴리펩티드의 예시가 추가로 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 이형 폴리펩티드는 항체 중쇄이다. 일부 구현예에서, 이형 폴리펩티드는 항체 경쇄이다. 일부 구현예에서, 이형 폴리펩티드는 Fc 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 이형 폴리펩티드는 다량체 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 이형 폴리펩티드는 이형다량체이다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 본원에 개시된 변이체 신호 펩티드 중 임의의 것이다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열 번호: 8, 11, 12, 13, 14, 15, 31, 32, 33, 34, 또는 35의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열 번호: 8, 11, 또는 13의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열 번호: 12 또는 15의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열 번호: 31 또는 33의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열 번호: 32, 34, 또는 35의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 변이체 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 44, 45, 또는 46의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 변이체 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 23, 26, 28, 30, 36, 37, 38, 45 또는 46의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 변이체 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 29의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 변이체 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 27 또는 30의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 변이체 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 36 또는 38의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 변이체 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 37, 39 또는 40의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 변이체 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 45 또는 46의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다.
또 다른 양태에서, 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 상기 폴리뉴클레오티드는 하기를 포함한다: (1) 제1 이형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제1 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 (2) 제2 이형을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 제2 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (이에 의하여 숙주 세포 내 항체 발현 상에서, 제1 및 제2 이형 폴리펩티드는 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 복합체를 형성하도록 접힘 및 조립된다).
또 다른 양태에서, 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 상기 폴리뉴클레오티드는 하기를 포함한다: (1) 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제1 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 (2) 항체 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 제2 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (이에 의하여 숙주 세포 내 항체 발현 상에서, 항체 중쇄 및 경쇄는 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 복합체를 형성하도록 접힘 및 조립된다).
일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 신호 펩티드 (예컨대, 본 분야에 알려진 임의의 신호 펩티드)이다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 공-번역 신호 펩티드이다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 DsbA 신호 펩티드이다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 STII 신호 펩티드이다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 본원에 개시된 변이체 신호 펩티드 중 임의의 것이다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 서열 번호: 8, 11, 12, 13, 14, 15, 31, 32, 33, 34, 또는 35의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 서열 번호: 8, 11, 또는 13의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 서열 번호: 12 또는 15의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 서열 번호: 31 또는 33의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 서열 번호: 32, 34, 또는 35의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 23, 24, 25, 26, 28, 36, 37, 38, 39 또는 40의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 29의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 27 또는 30의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 36 또는 38의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 37, 39 또는 40의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다.
일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드는 신호 펩티드 (예컨대, 본 분야에 알려진 임의의 신호 펩티드)이다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드는 DsbA 신호 펩티드이다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드는 STII 신호 펩티드이다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드는 본원에 개시된 변이체 신호 펩티드 중 임의의 것이다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드는 서열 번호: 8, 11, 12, 13, 14, 15, 31, 32, 33, 34, 또는 35의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드는 서열 번호: 8, 11, 또는 13의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드는 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드는 서열 번호: 12 또는 15의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드는 서열 번호: 31 또는 33의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드는 서열 번호: 32, 35, 또는 35의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 30, 36, 37, 38, 39 또는 40의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 23, 24, 25, 26, 또는 28의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 29의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 27 또는 30의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 36 또는 38의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 37, 39 또는 40의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다.
일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 신호 펩티드 (예컨대, 본 분야에 알려진 임의의 신호 펩티드)를 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성되고, 제2 신호 펩티드는, 본원에 개시된 신호 펩티드, 예를 들어 하기 서열 번호 중 임의의 것의 신호 펩티드 (예컨대, 본 분야에 알려진 임의의 신호 펩티드)를 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다: 8, 11, 12, 13, 14, 15, 31, 32, 33, 34, 및 35 (일부 구현예에서, 하기 서열 번호 중 임의의 것: 8, 11, 및 13, 그리고 일부 구현예에서, 하기 서열 번호 중 임의의 것: 36 및 38). 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드는 서열 번호: 8, 11, 12, 13, 14, 15, 31, 32, 33, 34, 또는 35의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드는 서열 번호: 8, 11, 또는 13의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드는 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드는 서열 번호: 12 또는 15의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드는 서열 번호: 36 또는 38의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드는 서열 번호: 37, 39 또는 40의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 30, 36, 37, 38, 39 또는 40의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 23, 24, 25, 26, 또는 28의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 29의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 27 또는 30의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 36 또는 38의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 37, 39 또는 40의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다.
일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드는 신호 펩티드 (예컨대, 본 분야에 알려진 임의의 신호 펩티드)를 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성되고, 제1 신호 펩티드는, 본원에 개시된 신호 펩티드, 예를 들어 하기 서열 번호 중 임의의 것의 아미노산 서열 (예컨대, 본 분야에 알려진 임의의 신호 펩티드)를 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다: 8, 11, 12, 13, 14, 15, 31, 32, 33, 34, 및 35 (일부 구현예에서, 하기 서열 번호 중 임의의 것: 8, 11, 및 13, 그리고 일부 구현예에서, 하기 서열 번호 중 임의의 것: 31 및 33). 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 서열 번호: 8, 11, 12, 13, 14, 15, 31, 32, 33, 35 또는 35의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 서열 번호: 8, 11, 또는 13의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 서열 번호: 12 또는 15의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 서열 번호: 31 또는 33의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 서열 번호: 33, 34 또는 35의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.30, 36, 37, 38 39 또는 40의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 23, 24, 25, 26, 28, 36, 37, 38, 39 또는 40의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 29의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 27 또는 30의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 36 또는 38의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 37, 39 또는 40의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다.
일부 구현예에서, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 추가로 하기를 포함한다: (3) Fc 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제3 신호 펩티드를 암호화하는 폴리펩티드. 일부 구현예에서, 제3 신호 펩티드는 본원에 개시된 신호 펩티드, 예를 들어 8, 11, 12, 13, 14, 15, 31, 32, 33, 34, 및 35의 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다 (일부 구현예에서, 서열 번호: 8, 11, 및 13, 그리고 일부 구현예에서, 하기 서열 번호 중 임의의 것: 31 및 33). 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 서열 번호: 8, 11, 또는 13의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 하기 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제3 신호 펩티드는 서열 번호: 12 또는 15의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제3 신호 펩티드는 서열 번호: 31 또는 33의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제3 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 30, 36, 37, 38, 39 또는 40의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제3 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 23, 24, 25, 26, 28, 36, 37, 38, 39 또는 40의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제3 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 29의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제3 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 27 및 30의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제3 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 36 또는 38의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제3 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 37, 39 또는 40의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제3 신호 펩티드는 신호 펩티드 (예컨대, 본 분야에 알려진 임의의 신호 펩티드)이다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 추가로 하기를 포함하며: (3) 제3 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 상기 제1 신호 펩티드는 신호 펩티드 (예를 들어, 본 분야에 알려진 임의의 신호 펩티드)를 포함하고, 상기 제2 신호 펩티드는 신호 펩티드 (예를 들어, 본 분야에 알려진 임의의 신호 펩티드)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드는 본원에 개시된 신호 펩티드, 예컨대 하기 서열 번호 중 임의의 것의 신호 펩티드를 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다: 8, 11, 12, 13, 14, 15, 36, 37, 38, 39 및 40 (일부 구현예에서, 하기 서열 번호 중 임의의 것: 8, 11, 및 13, 그리고 일부 구현예에서, 하기 서열 번호 중 임의의 것: 31 및 33). 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드는 신호 펩티드를 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성되고, 제1 신호 펩티드는 본원에 개시된 신호 펩티드, 예컨대 하기 서열 번호 중 임의의 것의 신호 펩티드를 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다: 8, 11, 12, 13, 14, 15, 36, 37, 38, 39 및 40 (일부 구현예에서, 하기 서열 번호 중 임의의 것: 8, 11, 및 13, 그리고 일부 구현예에서, 하기 서열 번호 중 임의의 것: 31 및 33). 일부 구현예에서, 예컨대, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하기를 추가로 포함하며: (3) 제3 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 상기 제1 신호 펩티드는 본원에 개시된 신호 펩티드, 예컨대 하기 서열 번호 중 임의의 것의 신호 펩티드를 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성되며: 8, 11, 12, 13, 14, 15, 36, 3, 38, 39 및 40 (일부 구현예에서, 하기 서열 번호 중 임의의 것: 8, 11, 및 13, 그리고 일부 구현예에서, 하기 서열 번호 중 임의의 것: 31 및 33), 그리고 제2 신호 펩티드는 본원에 개시된 신호 펩티드, 예를 들어 8, 11, 12, 13, 14, 15, 36, 37, 38, 39 및 40의 임의의 것의 신호 펩티드를 포함하거나, 필수적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다 (일부 구현예에서, 서열 번호: 8, 11, 및 13, 그리고 일부 구현예에서, 하기 서열 번호 중 임의의 것: 31 및 33).
일부 구현예에서, 변이체 신호 펩티드의 사용은 하기를 유발한다: 예컨대, 이형 폴리펩티드 (예컨대, 항체)의 증가된 생산, 이형 폴리펩티드 (예컨대, 항체)의 증가된 분비, 성숙 이형 폴리펩티드 (예컨대, 항체)의 증가된 생산, 성숙 이형 폴리펩티드 (예컨대, 항체)의 증가된 분비, 용해성 이형 폴리펩티드 (예컨대, 항체)의 증가된 생산, 용해성 이형 폴리펩티드 (예컨대, 항체)의 증가된 분비, 이형 폴리펩티드의 증가된 생산 (이에 의하여 이형 폴리펩티드는, 예컨대 야생형 (비-변이체) 신호 펩티드의 사용과 비교 시, 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 (예컨대, 항체)로 분비, 접힘 및 조립된다). 일부 구현예에서, 변이체 신호 펩티드의 사용은 하기를 유발한다: 예컨대, 이형 폴리펩티드 (예컨대, 항체)의 증가된 생산, 이형 폴리펩티드 (예컨대, 항체)의 증가된 분비, 성숙 이형 폴리펩티드 (예컨대, 항체)의 증가된 생산, 성숙 이형 폴리펩티드 (예컨대, 항체)의 증가된 분비, 용해성 이형 폴리펩티드 (예컨대, 항체)의 증가된 생산, 용해성 이형 폴리펩티드 (예컨대, 항체)의 증가된 분비, 이형 폴리펩티드의 증가된 생산 (이에 의하여 이형 폴리펩티드는, 예컨대 야생형 (비-변이체) 신호 펩티드의 사용과 비교 시, 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 (예컨대, 항체)로 분비, 접힘 및 조립되고, 변이체 신호 펩티드 및 야생형 (비-변이체) 신호 펩티드의 상대 번역 강도는 대략 동등하다). 일부 구현예에서, 변이체 신호 펩티드 및 야생형 (비-변이체) 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 약 1이다. 일부 구현예에서, 변이체 신호 펩티드 및 야생형 (비-변이체) 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 또는 그 이상, 예컨대 약 8 또는 그 이상이다. 일부 구현예에서, 변이체 신호 펩티드 및 야생형 (비-변이체) 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 약 4이다. 일부 구현예에서, 변이체 신호 펩티드 및 야생형 (비-변이체) 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 약 5이다. 일부 구현예에서, 변이체 신호 펩티드 및 야생형 (비-변이체) 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 약 6이다. 일부 구현예에서, 변이체 신호 펩티드 및 야생형 (비-변이체) 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 약 8이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 대략적으로 동등하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 상이하다.
일 양태에서, 본 발명은 질환, 예컨대 암, 종양, 세포 증식 장애, 및/또는 면역 (예컨대 자가면역) 장애 및/또는 혈관형성-관련 장애의 치료학적 및/또는 예방학적 치료를 위한 약제의 제조에 있어서, 본 발명의 방법을 사용하여 생성된 이형 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 이형 폴리펩티드는 항체, 항체 단편, 폴리펩티드 (예컨대, 올리고펩티드), 또는 이의 조합을 포함하는, 본원에 개시된 임의의 형태의 것일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 질환, 예컨대 암, 종양, 세포 증식 장애, 및/또는 면역 (예컨대 자가면역) 장애의 치료학적 및/또는 예방학적 치료를 위한 약제의 제조에 있어서, 본원에 개시된 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 본원에 개시된 신호 펩티드의 용도를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 질환, 예컨대 암, 종양, 세포 증식 장애, 및/또는 면역 (예컨대 자가면역) 장애의 치료학적 및/또는 예방학적 치료를 위한 약제의 제조에 있어서, 본원에 개시된 발현 벡터의 용도를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 질환, 예컨대 암, 종양, 세포 증식 장애, 및/또는 면역 (예컨대 자가면역) 장애의 치료학적 및/또는 예방학적 치료를 위한 약제의 제조에 있어서, 본원에 개시된 발현 숙주 세포의 용도를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 질환, 예컨대 암, 종양, 세포 증식 장애, 및/또는 면역 (예컨대 자가면역) 장애의 치료학적 및/또는 예방학적 치료를 위한 약제의 제조에 있어서, 본원에 개시된 제조 물품의 용도를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 질환, 예컨대 암, 종양, 세포 증식 장애, 및/또는 면역 (예컨대 자가면역) 장애의 치료학적 및/또는 예방학적 치료를 위한 약제의 제조에 있어서, 본원에 개시된 키트의 용도를 제공한다.
도 1a, 1b, 및 1c: 5D5 전장 항체 상에서의, 그리고 중쇄 수준의 신호 펩티드 변이체의 효과를 도시한다. 발현 벡터를 갖는 이. 콜라이 숙주 균주 64B4를 진탕 플라스크 내 완전 C.R.A.P. 포스페이트 제한 배지에서 24시간 동안 재배하였으며, 종료점 샘플을 OD550로 정규화하였다. (1a) 상부 패널: 용해성 중쇄-함유 종의 웨스턴 블랏 pBR-mSTII1-bSTII1-5D5 (mSTII1, bSTII1), pBR-mSTII1-bMalE1-5D5 (mSTII1, bMalE1), pBR-mSTII1-bDsbA1-5D5 (mSTII1, bDsbA1), 또는 pBR-mSTII1-bPhoA1-5D5 (mSTII1, bPhoA1)을 갖는 64B4 세포를 용해시키고, 수성 용해성 분획을 비-환원 SDS-PAGE 전기영동, 이후 HRP 콘주게이트 αFc 항체로 탐침하는 웨스턴 블랏으로 분리하였다. 생성된 블랏은, 중쇄-함유 종이 상부로부터 하부로 전장 5D5 항체, 중쇄-중쇄-경쇄 및 중쇄-경쇄와 상응한다는 것을 나타낸다. 하부 패널: 종료점 샘플을 1 OD550로 정규화하고 펠렛화하였다. 총 단백질을 변성시키고, 0.2M DTT를 함유한 트리신 샘플 완충액과 혼합시킴으로써 환원시켰다. 중쇄를, 약 49 kDa의 분자량에서 SDS-PAGE 상의 단일 대역으로서 이동시켰으며, αFc 항체로 탐침하였다. 겔 상에서 보다 느리게 이동하는 중쇄 대역은, 애드만(Edman) 단백질 서열분석에서 확인된 바와 같이, 전구체를 함유하였다. (1b) 주변세포질 내의 용해성 중쇄 수준 pBR-mSTII1-bSTII1-5D5 (mSTII1, bSTII1), pBR-mSTII1-bMalE1-5D5 (mSTII1, bMalE1), pBR-mSTII1-bDsbA1-5D5 (mSTII1, bDsbA1), 또는 pBR-mSTII1-bPhoA1-5D5 (mSTII1, bPhoA1)을 갖는 64B4 세포의 종료점 샘플을 삼투압충격법으로 처리하였다. 상청액을 수집하고, 변성시키고, 0.2M DTT를 함유한 트리신 샘플 완충액으로 환원시켰다. 환원된 중쇄를, 약 49 kDa의 분자량에서 단일 대역으로서 이동시켰으며, αFc 항체로 탐침하였다. (1C) 상부 패널: pBR-mSTII1-bSTII1-5D5 (mSTII1, bSTII1), pBR-mSTII1-bDsbA1-5D5 (mSTII1, bDsbA1), pBR-mSTII1-mPhoA1-5D5 (mSTII1, mPhoA1), 및 pBR-mSTII1-mMalE1-5D5 (mSTII1, mMalE1)을 갖는 64B4 세포의 비-환원 웨스턴 블랏 중앙 패널: 상동한 샘플의 1 OD550 펠렛 내의 총 중쇄를 DTT로 환원시키고, 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 하부 패널: 상동한 샘플의 주변세포질 추출물을 환원시키고, αFc 항체로의 웨스턴 블랏에 의하여 분석하였다. 모든 발현 플라스미드를 다음과 같이 명칭화하였다: 제1 신호 펩티드 TIR 변이체는 경쇄를 위한 것이고, 제2 신호 펩티드 TIR 변이체는 중쇄를 위한 것이다. 예를 들어, mSTII1-bSTII1-5D5는 경쇄 및 mluI 제한 부위 업스트림에 대하여 1의 TIR을 갖는 STII 신호 서열을 의미하고; bSTII1는 bst 신호 서열 업스트림을 갖는 HC에 대하여 1의 TIR을 갖는 STII 신호 서열을 의미하고; 5D5는 항체 명칭이다.
도 2a 및 2b: 면역금(immunogold) 전자 현미경관찰에 의한, 중쇄의 세포 국지화 상에서의 상이한 신호 펩티드 사용의 효과를 도시한다. 다양한 신호 펩티드를 발현하는 작제물을 갖는 A64B4 세포를 24시간 동안 진탕 플라스크에 배양하였다. 종료점 샘플을 고정시키고, 포매시키고, 그리고 동결절편화하였다. 동결절편을 HRP-콘주게이트 αFc 항체 및 금 콘주게이트 αHRP 2차 항체로 탐침하였다. 면역염색된 샘플을 투과 전자 현미경 (TEM)에 의하여 시각화하였다. (2a)는 pBR-mSTII1-bSTII1-5D5 (mSTII1, bSTII1)를 갖는 A64B4 세포를 나타낸다. (2b)는 pBR-mSTII1-bDsbA1-5D5 (mSTII1, bDsbA1)를 갖는 A64B4 세포를 나타낸다. 주변세포질 공간을 흑색 화살표로 표시하였다. 면역금 신호를 흑색 화살촉(arrowhead)으로 표시하였다.
도 3a 및 3b: 주변세포질 내의 중쇄 누적에서의 신호 펩티드 소수성의 효과를 도시한다. (3a)는 경쇄의 부재하에 주변세포질 용해성 중쇄의 수준을 나타낸다. pBR-bDsbA1-5D5HC (bDsbA1), pBR-bDsbA1 L11I-5D5HC (bDsbA1 L11I), pBR-bDsbA1 L11S-5D5HC (bDsbA1 L11S), pBR-bSTII1-5D5HC (bSTII1), pBR-bSTII1 S11L 코돈1-5D5HC (bSTII1 코돈1), 또는 pBR-bSTII1 S11L 코돈2-5D5HC (bSTII1 코돈2)를 갖는 64B4 세포로부터의 주변세포질 추출물을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 환원된 중쇄를, 약 49 kDa에서 이동시켰으며, αFc 항체로 탐침하였다. (3b)는 경쇄의 공-발현을 갖는 주변세포질 용해성 중쇄의 수준을 나타낸다. pBR-mSTII1-bSTII1-5D5 (mSTII1, bSTII1), pBR-mSTII1-bMalE1-5D5 (mSTII1, bMalE1), pBR-mSTII1-bDsbA1-5D5 (mSTII1, bDsbA1), pBR-mSTII1-bPhoA1-5D5 (mSTII1, bPhoA1), pBR-mSTII1-bDsbA1 L11I-5D5 (mSTII1, bDsbA1 L11I), pBR-mSTII1-bDsbA1 L11S-5D5 (mSTII1, bDsbA1 L11S), pBR-mSTII1-bSTII1 S11L-5D5 (mSTII1, bSTII1 S11L), 또는 pBR-mSTII1-bSTII1 S11I-5D5 (mSTII1, bSTII1 S11I)를 갖는 64B4 세포로부터의 주변세포질 추출물을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 환원된 중쇄를 αFc 항체포 검출하였다.
도 4a 및 4b: 전장 5D5 수준에서의 신호 펩티드 소수성의 효과를 도시한다. 상부 패널: (A) pBR-mSTII1-bSTII1-5D5 (mSTII1, bSTII1), pBR-mSTII1-bDsbA1 L11I-5D5 (mSTII1, bDsbA1 L11I), pBR-mSTII1-bDsbA1 L11S-5D5 (mSTII1, bDsbA1 L11S), pBR-bDsbA1-5D5HC (bDsbA1) (B) pBR-mSTII1-bSTII1-5D5 (mSTII1, bSTII1), pBR-bDsbA1-5D5HC (bDsbA1), pBR-mSTII1-bSTII1 S11L-5D5 (mSTII1, bSTII1 S11L), 또는 pBR-mSTII1-bSTII1 S11I-5D5 (mSTII1, bSTII1 S11I)을 갖는 64B4로부터의 전체 세포 용해물을 비-환원 SDS-PAGE 겔, 이후 αFc 항체로의 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 중쇄-함유 종이 표시된다. 하부 패널: 상부 패널에서 사용된 상동한 샘플로부터의, 1 OD550 펠렛 내의 총 중쇄 단백질을 SDS-PAGE 겔의 환원 및 웨스턴 블랏에 의하여 분석하였다. 49 kDa에서 이주된 중쇄를 αFc 항체로 탐침하였다.
도 5: 봉입체의 세포 국지화에서의 신호 펩티드 및 이의 소수성의 효과를 도시한다. pBR-mSTII1-bSTII1-5D5 (mSTII1, bSTII1), pBR-mSTII1-bMalE1-5D5 (mSTII1, bMalE1), pBR-mSTII1-bPhoA1-5D5 (mSTII1, bPhoA1), pBR-mSTII1-bDsbA1-5D5 (mSTII1, bDsbA1), pBR-mSTII1-bDsbA1 L11S-5D5 (mSTII1, bDsbA1 L11S), pBR-mSTII1-bSTII1 S11L-5D5 (mSTII1, bSTII1 S11L), pBR-mSTII1-mMalE1-5D5 (mSTII1, mMalE1), 또는 pBR-mSTII1-mPhoA1-5D5 (mSTII1, mPhoA1)를 갖는 64B4의 배양물로부터의 종료점 샘플을 초박 절편으로 고정, 포매, 절편화하고, TEM 하에서 시각화하였다. 세포질 공간을 화살표로 표시하고, 봉입체를 화살촉(arrowhead)으로 표시하였다.
도 6: C-말단 영역 내의 Ser/Tyr 변이의 웨스턴 블랏 분석을 도시한다. 상부 패널: pBR-mSTII1-bSTII1-5D5 (mSTII1, bSTII1), pBR-mSTII1-bSTII1 Y22S-5D5 (mSTII1, bSTII1 Y22S), pBR-bDsbA1-5D5HC (bDsbA1), 또는 pBR-bDsbA1 S18Y-5D5HC (bDsbA1 S18Y)을 갖는 64B4 세포로부터의 전체 세포 용해물을 αFc 항체로의 비-환원 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 전장 5D5, 중-중-경 및 중-경을 포함하는 중쇄-함유 종을 표시하였다. 하부 패널: 1 OD550 펠렛 내의 총 단백질을 DTT로 환원시키고, 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 환원된 증쇄를 ~49 kDa에서 이동시켰다.
도 7a 및 7b: mAb1 및 mAb2에 대한 전장 항체 수준 및 주변세포질 용해성 중쇄 수준에서의 신호 펩티드 소수성의 효과를 도시한다. (7a) 상부 패널은 pBR-mSTII1-bSTII1-mAb1 (mSTII1, bSTII1), pBR-mSTII1-bSTII1 S11L-mAb1 (mSTII1, bSTII1 S11L), pBR-mSTII1-bDsbA1-mAb1 (mSTII1, bDsbA1), 및 pBR-mSTII1-bDsbA1 L11S-mAb1 (mSTII1, bDsbA1 L11S)을 갖는 64B4로부터의 전체 세포 용해물을 나타내고, 이를 비-환원 SDS-PAGE 겔, 이후 αFc 항체로의 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 중쇄-함유 종을 화살표로 표시하였다. 중앙 패널: 상동한 샘플로부터의 주변세포질 단백질을 나타내며, 이를 추출하고, DTT로 환원, 그리고 SDS-PAGE 겔, 이후 αFc 항체로의 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 하부 패널은 DTT로 환원되고, 웨스턴 블랏으로 분석된 상동한 샘플의 1 OD550 펠렛 내의 총 중쇄를 나타냈다. (7b) 상부 패널은 pBR-mSTII1-bSTII1-mAb2 (mSTII1, bSTII1), pBR-mSTII1-bSTII1 S11L-mAb2 (mSTII1, bSTII1 S11L), pBR-mSTII1-bDsbA1-mAb2 (mSTII1, bDsbA1), 및 pBR-mSTII1-bDsbA1 L11S-mAb2 (mSTII1, bDsbA1 L11S)을 갖는 64B4로부터의 전체 세포 용해물을 나타내고, 이를 비-환원 SDS-PAGE 겔, 이후 αFc 항체로의 웨스턴 블랏 탐침으로 분석하였다. 중쇄-함유 종을 화살표로 표시하였다. 중앙 패널은 상동한 샘플로부터의 주변세포질 단백질을 나타내며, 이를 추출하고, DTT로 환원, 그리고 SDS-PAGE 겔, 이후 αFc 항체로의 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 하부 패널은 DTT로 환원되고, 웨스턴 블랏으로 분석된 상동한 샘플의 1 OD550 펠렛 내의 총 중쇄를 나타냈다.
일반적인 기술
본원에 기술 또는 참조된 기술 및 절차는, 본 분야의 숙련가에 의하여 기존의 방법, 예컨대 예를 들어, 하기 기술된 널리 이용되는 방법들을 사용하여 잘 이해되고, 통상적으로 채용될 것이다: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. eds., (2003)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, 및 ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)).
정의
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 그것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한 종류는 추가의 DNA 분절을 이에 결찰시킬 수 있는 환형 이중가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 벡터의 또 다른 유형은 파지 벡터이다. 벡터의 또 다른 유형은 바이러스벡터이며, 여기서 추가의 DNA 분절은 바이러스 게놈으로 결찰될 수 있다. 특정 벡터들은 이들이 도입된 숙주 세포에서 자율적으로 복제될 수 있다 (이를 테면, 복제의 세균성 원점 및 에피좀성 포유동물 벡터들을 보유하는 세균성 벡터들). 다른 벡터들 (이를 테면, 비-에피좀성 포유동물 벡터들)은 숙주 세포 안으로 도입시에 숙주 세포의 게놈안에 통합될 수 있고, 이로 인하여 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 주도할 수 있다. 그러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는, 간략히 "재조합 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 플라스미드가 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "시스트론"은 폴리펩티드 쇄 및 인접 조절 영역에 대한 뉴클레오티드 서열 암호화를 포함하는 번역 단위와 넓은 범위에서 상당한 유전 요소를 지칭하는 것으로 의도된다. "인접 조절 영역"은, 예를 들어, 번역 개시 영역 (TIR; 본원에 하기 정의된 바와 같음) 및 종결 영역을 포함한다.
"다시스트론성" 발현 벡터는 하나의 단일 프로모터의 조절적 조절 하에서, 다중 시스트론을 함유 및 발현하는 단일 벡터를 지칭한다. 다시스트론성 벡터의 통상적인 예시는 1개의 프로모터의 조절 하에서 2개의 상이한 폴리펩티드를 함유 및 발현하는 "디시스트론성(dicistronic)" 벡터이다. 디시스트론성 또는 다시스트론성 벡터의 발현에서, 다중 유전자는 우선 단일 번역 단위로 전사되고, 이후 개별적으로 번역된다.
본 발명에 따른 "개별 시스트론" 발현 벡터는 적어도 2개의 개별 프로모터-시스트론 쌍을 포함하는 단일 벡터를 지칭하고, 여기서 각 시스트론은 이의 고유 프로모터의 조절 하에 있다. 개별 시스트론 발현 벡터의 발현에서, 상이한 유전자의 전사 및 번역 둘 다는 개별적이고 독립적이다.
"번역 개시 영역" 또는 TIR 또는 번역 개시 영역 또는 번역 개시 서열은, 본원에서 사용된 바와 같이, 관심 유전자의 번역 개시의 효율성을 제공하는 핵산 영역을 지칭한다. 일반적으로, 특정 시스트론 내의 TIR은 리보솜 결합 부위 (RBS) 및 RBS로의 5' 및 3' 서열을 포괄한다. RBS는 최소한으로, 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 및 개시 코돈 (AUG)을 함유하도록 정의된다. 따라서, TIR은 또한 번역될 핵산 서열 중 적어도 부분을 포함한다. 바람직하게는, TIR은 시스트론 내 경쇄 또는 중쇄에 대하여 암호화하는 서열에 선행하는 신호 펩티드를 암호화하는 분비 신호 서열을 포함한다. TIR 변이체는, TIR의 특성, 예컨대 본원 하기에 정의된 번역 강도를 변경하는, TIR 영역 내 서열 변이체 (특히 치환)을 함유한다. 바람직하게는, 본 발명의 TIR 변이체는 시스트론 내 경쇄 또는 중쇄에 대하여 암호화하는 서열에 선행하는 분비 신호 서열의, 우선 2 내지 약 14개, 바람직하게는 4 내지 12, 더욱 바람직하게는 약 6개 코돈 내의 서열 치환을 함유한다.
용어 "번역 강도"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 조절 시스템 내 분비된 폴리펩티드의 측정치를 지칭하며, 여기서 TIR의 하나 이상의 변이체는, 상동한 배양 및 검정 조건 하에서 야생형 TIR 또는 일부 다른 대조군과 비교하여, 폴리펩티드의 분비 및 그 결과를 지시하는데 사용된다.
"신호 펩티드" (또한 "신호 서열"로 불림)는 짧은 펩티드를 지칭하며, 이는 세포 막, 일반적으로 원핵생물의 내부 막 또는 내부 막과 외부 막 둘 다를 통하여 새롭게 합성된 관심 단백질을 지시하는데 사용될 수 있다. 분비 신호 서열에 의하여 암호화된 신호 펩티드는 숙주 세포에 내인성이거나, 이는 외인성일 수 있다 (발현될 폴리펩티드에 천연인 신호 펩티드를 포함). 신호 펩티드는 전형적으로, 발현될 폴리펩티드의 아미노 말단에서 존재하고, 전형적으로 세포질로부터의 폴리펩티드의 생합성 및 분비 사이에서 효소적으로 제거된다. 따라서, 신호 펩티드는 일반적으로 성숙 단백질 생성물에서는 존재하지 않는다. 신호 펩티드 (예컨대, 원핵생물의, 예를 들어, 이 콜라이 신호 펩티드)는 통상적으로 3개의 개별 영역으로 구성된다: 전형적으로 적어도 1 또는 2개의 양으로 하전된 아미노산 잔기를 함유하는 N-말단 영역, H-영역 (또한 H 도메인으로 지칭됨)으로 지칭되는 소수성 코어 영역, 및 신호 펩티다제로 인식된 C-말단 영역. 본 분야의 숙련가는 소정의 신호 펩티드의 N-말단 영역, H-영역 및 C-말단 영역을 정의 방법을 잘 알고 있다.
펩티드 (또는 펩티드 부분)의 "평균 소수성"은 하기 식을 사용하여 산출한 바와 같이, 평균 소수성을 의미한다: 펩티드 (또는 펩티드의 부분)의 평균 소수성 = 펩티드 (또는 펩티드의 부분)의 총(총합) 소수성 / 펩티드 (또는 펩티드의 부분) 내의 아미노산 수. "총" 또는 "총합" 소수성은 하기에 따른 정규화된 공동 소수성 값을 펩티드 (또는 펩티드의 부분) 내의 각 아미노산에 분배하고: Eisenberg, D. et al, J Mol Biol (1984) 179:125-142. 표 I (페이지 126), 이후 펩티드 (또는 펩티드의 부분) 내 아미노산에 대한 정규화된 공통 소수성 값을 더함으로써 산출된다. 일부 구현예에서, 평균 소수성은 신호 펩티드의 H-도메인에 대하여 산출된다.
"작동가능하게 연결된"은, 2개 이상의 성분의 병치를 지칭하며, 기술된 상기 성분은 그것들이 그들의 의도된 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있다. 예를 들면, 프로모터는, 이것이 연결된 서열의 전사 또는 발현을 조절 또는 조절하기 위하여 시스로 작용할 경우, 암호화 서열에 작동가능하게 연결된다. 필수적인 것은 아니나 일반적으로, "작동가능하게 연결된" DNA 서열은 연속적이고, 2개의 단백질 암호화 영역을 결합시킬 필요가 있거나 분비 리더의 경우에, 연속적이고 판독 프레임에 있다. 그러나, 작동가능하게 연결된 프로모터가 일반적으로 암호화 서열의 업스트림에 위치하더라도, 이는 그것과 필수적으로 인접하는 것은 아니다. 작동가능하게 연결된 인핸서는 암호화 서열의 업스트림, 또는 그 내부, 또는 다운스트림에, 그리고 프로모터로부터 상당한 거리에 위치할 수 있다. 연결은, 본 분야에 알려진 재조합 방법, 예를 들어 PCR 방법을 사용하여, 어닐링에 의하여, 또는 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의하여 달성된다. 편리한 제한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커는 통상적인 관행에 따라 사용된다.
"조절 요소"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 이형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 폴리펩티드로 전사 및 번역하는데 필요한, 시스로 존재하는 뉴클레오티드 서열이다. 전사 조절 요소는 일반적으로 발현될 유전자 서열 5' 프로모터, 전사 개시 및 종결 부위 및 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다. 용어 "전사 개시 부위"는 제1 전사체, 즉, mRNA 전구체로 편입된 제1 핵산에 상응하는 작제물 내의 핵산을 지칭하며; 전사 개시 부위는 프로모터 서열과 중첩된다.
"프로모터"는 이와 작동가능하게 연결된 유전자 또는 서열의 전사를 조절하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 프로모터는 RNA 중합체라아제 결합 및 전사 개시에 대한 신호를 포함한다. 사용된 프로모터는 선택된 서열의 발현이 고려되는 숙주 세포의 세포 유형에서 기능적일 것이다. 다양한 상이한 공급원으로부터 유래된 구성적이고, 유도가능하고, 그리고 억제가능한 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터는 본 분야에 잘 알려져 있고 (그리고 GenBank와 같은 데이터베이스에서 동정됨), (예를 들어, 보관소, 예컨대 ATCC, 뿐만 아니라 다른 상업적 또는 개인적 공급원으로부터 유래된) 클로닝된 폴리뉴클레오티드 내로, 또는 이로서 이용가능하다. 유도가능한 프로모터로, 프로모터의 활성은 신호에 반응하여 증가 또는 감소된다.
용어 "숙주 세포" (또는 "재조합 숙주 세포")는, 본원에 사용된 바와 같이, 외인성 폴리뉴클레오티드, 예컨대 재조합 플라스미드 또는 벡터의 유도에 의하여 유전적으로 변경된, 또는 유전적으로 변경될 수 있는 세포를 지칭한다. 그러한 용어는 특정 대상체 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적인 자손을 지칭하는 것으로 의도된다는 것이 이해된다. 특정 변형이, 예를 들면, 돌연변이 또는 환경적 영향에 기인하여 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 그러한 자손은 사실, 친계 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다.
"단리된" 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)는 이의 자연 환경의 성분으로부터 동정 및 분리되고/되거나 회수된 것이다. 그 천연 환경의 오염물질 성분은 항체에 대한 진단적 또는 치료적 사용을 방해할 물질이며, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질이 포함될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 폴리펩티드는 (1) 로리법에 의해 측정 시, 항체의 중량으로 95% 초과로, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과로, (2) 회전 컵 배열결정장치의 이용에 의해 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 최소한 15개 잔기를 획득하는데 충분한 정도까지, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 황산도데실나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 균질성까지 정제될 것이다. 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포 내에서 원위치로 폴리펩티드를 포함하는데, 이는 폴리펩티드의 자연 환경의 최소한 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나 일반적으로, 단리된 폴리펩티드는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"단리된" 핵산 분자는, 본래 핵산의 천연 공급원과 관계된 적어도 하나의 오염물질 핵산 분자로부터 동정 및 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는, 자연에서 발견되는 형태 또는 설정에서의 것 이외의 것이다.
본원에서 상호교환가능하게 사용된 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 나타내며, DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합체라아제에 의하여, 또는 합성 반응에 의하여, 중합체로 포함될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드와 같은 변형된 뉴클레오티드 및 그들의 유사체를 포함할 수 있다. 존재한다면, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조합 이전 또는 이후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의하여 저해될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성 후에 예를 들어 표지로의 콘주케이션에 의하여 추가적으로 변형될 수 있다. 변형의 다른 유형들은, 예를 들어, "캡(cap)", 하나 또는 그 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 예컨대 비하전된 연결 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스터, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 을 갖는 및 하전된 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것들과 같은 뉴클레오티드간 변형, 측쇄(pendant) 모이어티를 함유하는, 예를 들어 단백질들 (예를 들어 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, ply-L-리신, 등)과 같은 것을, 삽입제를 갖는 것들 (예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등), 킬레이터를 갖는 것들 (예를 들어 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등), 알킬화제를 함유하는 것들, 변형된 연결을 갖는 것들 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등), 뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드(들)의 비변형된 형태를 포함한다. 더욱이, 당에 보통 존재하는 히드록실 기의 임의의 것은 예를 들어 포스포네이트 기, 포스페이트 기로 대체될 수 있으며, 표준 보호기에 의하여 보호되거나, 또는 부가적인 뉴클레오티드들로 부가적인 연결을 제조하기 위하여 활성화될 수 있으며, 또는 고형 지지체로 콘주게이트될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 1 내지 20의 탄소 원자들의 아민 또는 유기 캐핑(capping) 기 모이어티로 포스포릴화 또는 치환될 수 있다. 다른 히드록실 또한 표준 보호기로 유도될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 리보오스 또는 데옥시리보오스 당이 유사 형태를 포함할 수 있으며, 이는 본 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로, 또는 2'-아지도-리보오스, 탄소환식 당 유사체, 알파-아노머 당, 아라비노스, 자일로스 또는 릭소오스와 같은 에피머 당, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로오스, 비고리 유사체 및 메틸 리보시드와 같은 무염기 뉴클레오시드 유사체를 함유한다. 하나 또는 그 이상의 포스포디에스터 연결은 대안적인 연결기로 대체될 수 있다. 이러한 대안적인 연결기는, 비제한적으로 구현예들을 포함하며, 여기서 포스페이트는 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("폼아세탈(formacetal)")로 대체될 수 있으며, 여기서 각 R 또는 R'은 독립적으로 H 또는 임의로 에테르 (--O--) 연결, 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 또는 아랄딜을 함유하는 치환된 또는 비치환된 알킬 (1-20 C)이다. 폴리뉴클레오티드에서 모든 연결이 상동할 필요는 없다. 선행하는 기재사항은 본원에 언급된, RNA 및 DNA를 포함하는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
"올리고뉴클레오티드"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 일반적으로, 짧고, 일반적으로 단일 가닥이고, 일반적으로 합성인, 필수적인 것은 아니나 일반적으로, 길이가 약 200 뉴클레오티드 미만인, 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 기술은 올리고뉴클레오티드에 동등하게, 그리고 완전하게 적용가능하다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 일반적으로, 약 10개 초과의 아미노산을 갖는 임의의 세포 공급원으로부터 유래한 펩티드 및 단백질에 관한 것이다. "이형" 폴리펩티드는, 이. 콜라이에 의하여 생산된 인간 단백질과 같이, 이용된 숙주 세포와 다른 폴리펩티드이다. 이형 폴리펩티드가 원핵생물 또는 진핵생물의 것일 수 있지만, 바람직하게는 이는 진핵생물의 것이고, 더욱 바람직하게는 포유동물의 것, 그리고 가장 바람직하게는 인간의 것이다. 바람직하게는, 이는 재조합으로 생산되거나, 재조합 폴리펩티드이다. "이형" 폴리펩티드는, 이. 콜라이에 의하여 생산된 인간 단백질과 같이, 이용된 숙주 세포와 다른 폴리펩티드이다. 이형 폴리펩티드가 원핵생물 또는 진핵생물의 것일 수 있지만, 바람직하게는 이는 진핵생물의 것이고, 더욱 바람직하게는 포유동물의 것, 그리고 가장 바람직하게는 인간의 것이다. 바람직하게는, 이는 재조합으로 생산되거나, 재조합 폴리펩티드이다.
포유동물 폴리펩티드는 하기를 포함한다: 분자 예컨대, 예를 들면, 레닌, 성장 호르몬 (인간 성장 호르몬 포함); 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 리포단백질; 1-항트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 트롬보포이에틴; 여포자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰빌레브란트 인자; 항-응고 인자 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨(naturietic) 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성제, 예컨대 우로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성제 (t-PA) 및 이의 변이체 예컨대 RETEVASE™ 및 TNKASE™; 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; ErbB2 도메인(들)로의 항체 예컨대 2C4 (WO 01/00245; 혼성세포 ATCC HB-12697) (ErbB2의 세포외 도메인 영역에 결합 (예를 들면, 약 잔기 22 내지 약 잔기 584의 ErbB2 영역 내에서, 상기 영역 내 임의의 하나 이상의 잔기, 포함)), 엔케팔리나제; 혈청 알부민 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러관 억제 서브스턴스; 릴락신 A-사슬; 릴락신 B-사슬; 프로릴락신; 마우스 성선자극호르몬-관련된 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 인테그린; 단백질 A 또는 D; 류마티스성 인자; 신경친화성 인자 예컨대 뇌-유도된 신경친화성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자 예컨대 NGF; 카디오트로핀 (심장 비대증 인자) 예컨대 카디오트로핀-1 (CT-1); 혈소판-유도된 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF) 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타 (TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4, 또는 TGF-5 포함); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(I-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질 예컨대 CD-3, CD-4, CD-8, 및 CD-19; 에리트로포이에틴; 골유도성 인자; 면역독소; 골 형성 단백질 (BMP); 인터페론 예컨대 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 소 혈청 알부민 (BSA); 집락 자극 인자 (CSF), 예를 들면, M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터루킨 (IL), 예를 들면, IL-1 내지 IL-10; 항-HER-2 항체; Apo2 리간드; 수퍼록사이드 디스무타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원 예컨대, 예를 들면, AIDS 엔빌로프 부분; 수송 단백질; 귀소 수용체; 아드레신; 조절 단백질; 항체; 및 상기-열거된 폴리펩티드의 임의의 단편.
일부 구현예에서, 본원의 폴리펩티드는 하기를 포함한다: 인간 혈청 알부민 (HSA), 2C4, 조직 인자, 항-조직 인자, 항-CD20, 항-HER-2, 헤레굴린, 항-IgE, 항-CD11a, 항-CD18, VEGF 및 이에 대한 수용체 및 항체 예컨대 rhuFab V2 및 아바스틴™, 성장 호르몬 및 그것의 변이체, 예컨대 hGH, 성장 호르몬 수용체, 성장 호르몬 방출 단백질 (GHRP), LIV-1 (EP 1,263,780), TRAIL, 종양 괴사 인자 (TNF) 및 이에 대한 항체, TNF 수용체 및 관련된 항체, TNF-수용체-IgG, TNF 수용체 관련된 인자 (TRAF) 및 이의 저해제, 인자 VIII, 인자 VIII B 도메인, 인터페론 예컨대 인터페론-감마, 형질전환 성장 인자 (TGF) 예컨대 TGF-베타, 항-TGF 예컨대 항-TGF-베타, 액티빈, 인히빈, 항-액티빈, 항-인히빈, 조직-플라스미노겐 활성제 및 그것의 변이체 예컨대 t-PA, 레테플라제™, 및 TNKase, 항-Fas 항체, 아포-2 리간드; 아포-2 리간드 저해제; 아포-2 수용체, 아포-3, 세포자멸적 인자, Ced-4, DcR3, 사멸 수용체 및 작용제 항체 (DR4, DR5), 림프독소 (LT), 프로락틴, 프로락틴 수용체, SOB 단백질, WISP (wnt-유도된 분비된 단백질), 신경독소-3 (NT-3), 신경 성장 인자 (NGF) 및 항-NGF, DNase, 간염 항원, 단순 포진 항원, 렙틴, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF) 예컨대 IGF-1 및 IGF-2 및 그것의 결합 단백질 및 수용체 예컨대 IGFBP-1-IGFBP-6, 인슐린, 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 예컨대 FGF-17, Toll 단백질, TIE 리간드, CD40 및 항-CD40, 면역접합체, 서브틸리신, 간세포 성장 인자 (HGF), 트롬보포이에틴 (TPO), 인터루킨 예컨대 IL-2, IL-12, IL-17, IL-22, IL-8, IL-9, 및 이에 대한 항체, 및 전립선(prostrate)-특이적 암 항원 (PSCA).
특히 바람직한 폴리펩티드는, 재조합 폴리펩티드이고, 일부 구현예에서, 단클론성 항체 및 인간화된 항체를 포함하는 항체이다. 그러한 항체는 전장 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 항체는 인간의 또는 인간화된 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 항-c-met, 항-IgE, 항-CD18, 항-VEGF, 항-조직 인자, 2C4, 항-Her-2, 항-CD20, 항-CD40, 또는 항-CD11a 항체이다. 폴리펩티드의 정의 내에서 포괄된 항체 단편은, 일부 구현예에서, 경쇄를 포함하고, 일부 구현예에서는, 카파 경쇄를 포함한다. 그러한 예시적인 단편은, 예를 들어, 하기를 포함한다: Fab, Fab', F(ab′')2, 또는 F(ab')2-류신 지퍼(leucine zipper) (LZ) 융합, 및 단일-아암(one-armed) 항체.
단백질 "발현"은 유전자 내 암호화된 정보의 메신저 RNA (mRNA)로의, 이후 단백질로의 전환을 지칭한다.
"면역콘주게이트(immunoconjugate)" ("항체-약물 콘주게이트" 또는 "ADC"와 상호교환가능하게 지칭됨)는 하나 이상의 세포독성 제제, 예컨대 화학치료제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원 (이의 단편 및/또는 변이체 포함)의 효소적활성 독소), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사콘주게이트(radioconjugate))에 콘주게이트된 항체를 의미한다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는, 그것이 결합되는 항원의 생물학적 활성을 억제시키거나 또는 감소시키는 것이다. 일부 구현예에서, 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 완전히 억제한다.
"작용제 항체"는, 본원에 사용된 바와 같이, 관심 폴리펩티드 (예컨대, HGF)의 기능적 활성 중 적어도 하나를 모방하는 항체이다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자(예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예를 들면, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 전체 합의 강도를 의미한다. 달리 표시되지 않은 한, 본 명세서에 기재된 "결합 친화도"는 결합쌍(예를 들면, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 의미한다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)로 표시될 수 있다. 바람직하게는, Kd는 1 x 10-7, 1 x 10-8, 5 x 10-8, 1 x 10-9, 3 x 10-9, 5 x 10-9, 또는 심지어 1 x 10-10 또는 그 이상이다. 여기에 기재된 방법을 비롯하여 당해 분야에 알려진 일반 방법에 의해 친화도를 측정할 수 있다. 저친화도 항체는 일반적으로 항원에 천천히 결합하고 용이하게 분해되는 경향이 있고, 고친화도 항체는 일반적으로 항원에 신속히 결합하고 더 오래 결합된 채 있는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법은 본 분야에 알려져 있고, 이의 임의의 것은 본 발명의 목적을 위하여 사용될 수 있다. 구체적인 예시적 구현예가 하기에 기재되어 있다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은, 일련의 비표지된 항원의 적정의 존재 하에서 (125I)-표지된 최소 농도를 갖는 Fab로 평형화시키고, 이후 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포집함으로써 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도를 측정하는 하기 검정에 의하여 기술된 바와 같은, 관심 항체의 Fab 버젼 및 이의 항원으로 수행된 방사성표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의하여 측정된다 (Chen, et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881). 상기 검정에 대한 조건을 수립하기 위하여, 마이크로티터 플레이트 (Dynex)를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 내의 5 μg/ml의 포집 항-Fab 항체 (Cappel Labs)로 밤새 코팅하고, 이후 실온 (대락 23℃)에서 2 내지 5시간 동안 PBS 중 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 차단하였다. 비-흡착 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심 Fab의 일련의 희석으로 혼합하였다 (예를 들어, 하기에서와 같이 항-VEGF 항체, Fab-12의 측정과 일치하도록: Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). 관심 Fab를 이후 밤새 항온처리하였다; 그러나 상기 항온처리는 평형에 도달하는 것을 확인하기 위하여 더욱 긴 기간동안 지속될 수 있다 (예를 들어 65 시간). 그 이후로, 혼합물을 실온에서 항온처리를 위하여 포집 플레이트에 이동시켰다 (예를 들어, 1시간 동안). 용액을 이후 제거하고, 플레이트를 PBS 중 0.1% 트윈(Tween)-20으로 8회 세정하였다. 플레이트가 건조되어 있을 경우, 150 μl/웰의 발광제(scintillant; MicroScint-20; Packard)를 첨가하고, 플레이트를 10분간 탑카운트 감마(Topcount gamma) 카운터 (Packard) 상에서 카운팅하였다. 20% 이하의 최대 결합을 나타내는 각 Fab의 농도를 경쟁 결합 검정에 사용되기 위하여 선택하였다. 또 다른 구현예에 따라서, Kd 또는 Kd 값을 BIAcoreTM-2000 또는 BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 사용하여 25℃에서 ~10 반응 단위 (RU)에서 고정화된 항원 CM5로 표면 플라스몬 공명 검정을 사용하여 측정하였다 간략하게, 카복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore Inc.)을, 제조사의 설명서에 따라, N-에틸-N'- (3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화하였다. 항원을, 커플링된 단백질의 대략 10개의 반응 단위 (RU)를 달성하기 위하여 5μl/분의 유동 속도로 주입하기 전에 pH 4.8, 10mM의 아세트산 나트륨으로 5μg/ml (~0.2μM)이도록 희석하였다. 항원의 주사 후, 1M 에탄올아민을 미반응 군을 차단하기 위하여 주사하였다. 역학적 측정을 위하여, Fab의 2배의 일련의 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 25℃ 에서 25 μL/분의 유동 속도로 0.05% 트윈(Tween) 20 (PBST)으로 PBS 중 주입하였다. 일부 구현예에서, 하기 변형은 표면 플라스몬 공명 검정 방법에 사용된다: 항체를 대략 400 RU를 달성하기 위하여 CM5 바이오센서 칩에 고정화하고, 역학적 측정을 위하여, 표적 단백질의 2배의 일련의 희석액을 25℃ 에서 약 30 uL/분의 유동 속도로 PBST 완충액 중 주입하였다. 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 결합 및 해리 센서그램의 동시 피팅(simultaneous fitting)에 의하여 단순한 일 대 일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (BIAcore Evaluation Software version 3.2)을 사용하여 산출하였다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비율 koff/kon로 산출된다. [참조: 예를 들면, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. 온-레이트(on-rate)가 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의하여 106 M-1 S- 1를 초과할 경우, 온-레이트는, 교반 적색 큐벳(stir red cuvette)을 갖는 분광기, 예컨대 중단-유동 설비 분광광도계 (stop-flow equipped spectrophometer; Aviv Instruments) 또는 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광광도계 (ThermoSpectronic) 내에서 측정 시, 농도가 증가하는 항원의 존재 하에서, pH 7.2, PBS 중 20nM의 항-항원 항체 (Fab 유형)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역-통과(band-pass))에서의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용함에 의하여 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 "온-레이트" 또는 "결합의 속도" 또는 "결합 속도" 또는 "kon"은 또한 BIAcoreTM-2000 또는 BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 사용하여 25℃에서 ~10 반응 단위 (RU)에서 고정화된 항원 CM5로 표면 플라스몬 공명 검정을 사용하여 측정하였다. 간략하게, 카복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore Inc.)을, 제조사의 설명서에 따라, N-에틸-N'- (3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화하였다. 항원을, 커플링된 단백질의 대략 10개의 반응 단위 (RU)를 달성하기 위하여 5μl/분의 유동 속도로 주입하기 전에 pH 4.8, 10mM의 아세트산 나트륨으로 5μg/ml (~0.2μM)이도록 희석하였다. 항원의 주사 후, 1M 에탄올아민을 미반응 군을 차단하기 위하여 주사하였다. 역학적 측정을 위하여, Fab의 2배의 일련의 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 25℃ 에서 25 μL/분의 유동 속도로 0.05% 트윈(Tween) 20 (PBST)으로 PBS 중 주입하였다. 일부 구현예에서, 하기 변형은 표면 플라스몬 공명 검정 방법에 사용된다: 항체를 대략 400 RU를 달성하기 위하여 CM5 바이오센서 칩에 고정화하고, 역학적 측정을 위하여, 표적 단백질의 2배의 일련의 희석액을 25℃ 에서 약 30 uL/분의 유동 속도로 PBST 완충액 중 주입하였다. 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 결합 및 해리 센서그램의 동시 피팅(simultaneous fitting)에 의하여 단순한 일 대 일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (BIAcore Evaluation Software version 3.2)을 사용하여 산출하였다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비율 koff/kon로 산출된다. [참조: 예를 들면, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. 온-레이트(on-rate)가 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의하여 106 M-1 S- 1를 초과할 경우, 온-레이트는, 바람직하게는, 교반 적색 큐벳(stir red cuvette)을 갖는 분광기, 예컨대 중단-유동 설비 분광광도계 (stop-flow equipped spectrophometer; Aviv Instruments) 또는 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광광도계 (ThermoSpectronic) 내에서 측정 시, 농도가 증가하는 항원의 존재 하에서, pH 7.2, PBS 중 20nM의 항-항원 항체 (Fab 유형)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역-통과(band-pass))에서의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용함에 의하여 측정된다.
"네이키드(naked) 항체"는 이형 분자, 예컨대 세포독성 모이어티 또는 방사성 표지에 콘주게이트되지 않은 항체이다.
지정된 항체의 "생물학적 특성"을 갖는 항체는, 상동한 항원에 결합하는 다른 항체와 구별되는 항체의 생물학적 특성 중 하나 이상을 갖는 것이다.
관심 항원에 의하여 결합된 항원 상에서, 에피토프에 결합하는 항체에 대한 스크리닝을 위하여, 일상적 교차-차단 검정, 예컨대 Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)에 기술된 것이 수행될 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열을 함유하는 항체 또는 폴리펩티드의 반감기를 증가시키기 위하여, 항체 (특히 항체 단편)에 구제 수용체(salvage receptor) 결합 에피토프를, 미국 특허 5,739,277에 기술된 바와 같이 부착할 수 있다. 예를 들어, 구제 수용체 결합 에피토프를 암호화하는 핵산 분자는 본 발명의 폴리펩티드 서열을 암호화하는 핵산에 틀 내 연결되어, 이로써 상기 조작된 핵산 분자에 의하여 발현된 융합 단백질이 본 발명의 구제 수용체 결합 에피토프 및 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있도록 할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "구제 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 Fc 영역의 에피토프를 지칭하며 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), 이는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는데 원인으로 작용한다 (예를 들어, Ghetie et al., Ann. Rev. Immunol . 18:739-766 (2000), 표 1). 이의 Fc 영역 내의 치환 및 증가된 혈청 반감기를 갖는 항체는 또한 하기에 기술된다: WO00/42072, WO 02/060919; Shields et al., J. Biol . Chem . 276:6591-6604 (2001); Hinton, J . Biol . Chem. 279:6213-6216 (2004)). 또 다른 구현예에서, 혈청 반감기는, 예를 들어 다른 폴리펩티드 서열을 부착함에 의하여 또한 증가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 유용한 항체 또는 다른 폴리펩티드는, 혈청 알부민, 또는 FcRn 수용체에 결합하는 혈청 알부민의 일부, 또는 혈청 알부민 결합 펩티드에 부착되어 이로써 혈청 알부민이 항체 또는 폴리펩티드에 결합될 수 있으며, 그러한 폴리펩티드 서열은, 예컨대 WO01/45746에 개시된다. 일 바람직한 구현예에서, 부착될 혈청 알부민 펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다: DICLPRWGCLW (서열 번호: 48). 또 다른 구현예에서, Fab의 반감기는 이러한 방볍에 의하여 증가된다. 또한 참고 : Dennis et al. J. Biol . Chem . 277:35035-35043 (2002) (혈청 알부민 결합 펩티드 서열에 대하여).
"단편"은 참조 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 전체 길이의, 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 그 이상을 함유하는 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 부분을 의미한다. 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100, 200, 300, 400, 500, 600개 이상의 뉴클레오티드 또는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200개 이상의 아미노산을 함유할 수 있다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 개념에서 사용되며, 이들이 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 비제한적으로 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함하는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 부분을 포함하는, 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다.　 항체 단편들의 예시들은 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자 (예컨대, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
참조 항체로서의 "상동한 에피토프에 결합하는 항체"는, 경쟁 검정에서 참조 항체의 이의 항원의 결합을 50% 이상 만큼 차단하는 항체를 지칭하며, 역으로, 참조 항체는 경쟁 검정에서 항체의 이의 항원의 결합을 50% 이상 만큼 차단한다.　 예시적인 경쟁 검정이 본원에 제공된다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래한 항체를 지칭하며, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래한다.
항체의 "부류"는 이의 중쇄에 의하여 점유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다.　 항체의 하기와 같은 5개의 주요 부류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있으며, 이들 중 몇몇은 하위 부류(이소형), 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가 구분될 수 있다.　 상이한 부류의 면역글로불린에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
본원에서 용어 "Fc 도메인"은 불변 영역의 최소한 일부분을 내포하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 이용된다.　 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다.　 일 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 중쇄의 Cys226 또는 Pro230으로부터 카복실-말단까지 연장된다.　　하지만, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있다.　 본원에서 달리 특정되지 않으면, Fc 영역 또는 불변 영역 내에 아미노산 잔기의 넘버링은 하기에서 설명된 바와 같이, EU 인덱스로 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다.　 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4가지 FR 도메인으로 구성된다:　 FR1, FR2, FR3, 및 FR4.　 따라서, HVR과 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서로 출현한다:　 FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
본원에서 사용된 용어들 "전장 항체", "온전한 항체" 및 "전체 항체"는 상호교환적으로 천연 항체 구조와 실질적으로 유사하거나, 본원에서 정의된 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 구조를 갖는 항체를 지칭한다.
"인간 항체"는, 인간 또는 인간 세포에 의하여 생산되거나, 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 이용한 비-인간 공급원으로부터 유래한 항체의 그것과 상응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다.　 인간 항체의 상기 정의에는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체가 배제된다.
"인간 공통 프레임워크"는, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 통상적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다.　 일반적으로, VL 또는 VH 서열의 인간 면역글로불린의 선택은 가변 도메인 서열의 하위그룹으로부터 유래된다.　 일반적으로, 서열의 하위그룹은 하기에서와 같은 하위그룹이다: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3.　일 구현예에서, VL에 대하여, 하위그룹은 Kabat et al., 상기에서와 같은 하위그룹 카파(kappa) I이다.　 일 구현예에서, VH에 대하여, 하위그룹은 Kabat et al., 상기에서와 같은 하위그룹 III이다.
"인간화된" 항체는, 비-인간 HVR으로부터 유래된 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다.　 특정 구현예에서, 인간화된 항체는 하기와 같은 적어도 하나의, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인 중 실질적으로 전체를 포함할 것이다: HVR (예컨대 CDR)의 전체 또는 실질적으로 전체는 비-인간 항체의 그것과 상응하고, FR의 실질적으로 전체는 인간 항체의 그것과 상응한다.　인간화된 항체는 임의로, 인간 항체로부터 유래된 적어도 일부의 항체 불변 영역을 포함할 수 있다.　항체의 "인간화된 형태", 예를 들어 비-인간 항체는, 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "초가변 영역", "HVR" 은 서열이 초가변성 ("상보적 결정 영역" 또는 "CDR")이고/이거나 구조적으로 정의된 루프 ("초가변 루프")를 형성하고/하거나 항원-접촉 잔기 ("항원 접촉부")를 함유하는 항체-가변 도메인 영역을 나타낸다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6 개의 HVR을 하기와 같이 포함한다: VH (H1, H2, H3) 중 3개, 및 VL (L1, L2, L3) 중 3개.　본원에서 예시적인 HVR은 하기를 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에서 발생하는 초가변 루프 (Chothia and Lesk, J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3)에서 발생하는 CDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3)에서 발생하는 항원 접촉부 (MacCallum et al. J. Mol . Biol . 262: 732-745 (1996)); 및
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 및 94-102 (H3)를 포함하는, (a), (b), 및/또는 (c)의 조합.
다르게 언급되지 않는 한, 가변 도메인 내의 HVR 잔기 및 기타 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 상기 기재된 Kabat et al.에 따라 넝버링된다.
용어 "다중특이적 항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 특히 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체를 포괄한다. 그러한 다중특이적 항체는 비제한적으로 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하고, 여기서 VHVL 단위는 하기를 갖는다: 폴리에피토프 특이성, 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체 (상이한 에피토프에 결합하는 각각의 VHVL 단위를 가짐), 2개 이상의 단일 가변 도메인을 갖는 항체 (상이한 에피토프에 결합하는 각각의 단일 가변 도메인을 가짐), 전장 항체, 항체 단편 (예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디 및 트리아바디), 공유적이거나 비-공유적으로 연결된 항체 단편. "다중에피토프 특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들)상에 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 언급한다. "단일특이적"은 단지의 하나의 에피토프에 결합하는 능력을 언급한다. 일 구현예에 따라서, 다중특이적 항체는 5 μM 내지 0.001 pM, 3 μM 내지 0.001 pM, 1 μM 내지 0.001 pM, 0.5 μM 내지 0.001 pM, 또는 0.1 μM 내지 0.001 pM의 친화도로 각 에피토프에 결합하는 IgG 항체이다.
용어 "단일-아암(one-armed) 항체" 또는 "단일-아암 항체들"은 하기를 포함하는 항체를 지칭한다: (1) CH2 도메인, CH3 도메인 또는 CH2-CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드에의 펩티드 결합에 의하여 결합된 가변 도메인, 및 (2) 제2 CH2, CH3 또는 CH2-CH3 도메인을 포함하며, 여기서 가변 도메인은 상기 제2 CH2, CH3 또는 CH2-CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드에의 펩티드 결합에 의하여 결합되지 않는다. 일 구현예에서, 단일-아암 항체는 하기 3개 폴리펩티드를 포함한다: (1) 가변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드 (예컨대, VH), CH1, CH2 및 CH3, (2) 가변 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드 (예컨대, VL) 및 CL 도메인, 및 (3) CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 제3 폴리펩티드. 일 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 가변 도메인을 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 단일-아암 항체는 가변 중쇄를 연결하는 이황화 결합을 형성하는 2개의 시스테인 잔기를 함유하는 부분적 힌지 영역을 갖는다. 일 구현예에서, 단일 아암 항체의 가변 도메인은 항원 결합 영역을 형성한다. 또 다른 구현예에서, 단일-아암 항체의 가변 도메인은 단일 가변 도메인이며, 여기서 각 단일 가변 도메인은 항원 결합 영역이다.
본원에 언급된 바와 같이, 용어 "크놉-인투-홀(knob-into-hole)" 또는 "KnH"는, 돌출부 (크놉)을 일 폴리펩티드에, 공동(홀)을 다른 폴리펩티드에 그들이 상호작용하는 계면에 도입함으로써 시험관내 또는 생체내 2개의 폴리펩티드를 함께 짝짓기하도록 지시하는 기술을 지칭한다. 예를 들어, KnH는 항체의 Fc:Fc 결합 계면, CL:CH1 계면 또는 VH/VL 계면 내에 도입된다 (예를 들어, US2007/0178552, WO 96/027011, WO 98/050431and Zhu et al. (1997) Protein Science 6:781-788). 이는 특히 다중특이적 항체의 제조 동안 2개의 상이한 중쇄를 함께 짝짓기하는 것을 촉진하는데 유용하다. 예를 들어, 이들의 Fc 영역 내 KnH를 갖는 다중특이적 항체는 추가로, 각 Fc 영역에 연결된 단일 가변 도메인을 포함하거나, 또는 추가로, 유사하거나 상이한 경쇄 가변 도메인과 쌍을 이루는 상이한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. KnH 기술은 또한, 2개의 상이한 수용체 세포외 도메인을 함께, 또는 상이한 표적 인식 서열 (예컨대, 아피바디, 펩티바디, 및 기타 Fc 융합)을 포함하는 임의의 기타 폴리펩티드를 짝짓기하는데 사용될 수 있다.
항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편을 생산하고, 그리고 쉽게 결정화하는 능력을 반영하는 명칭인 잔여 "Fc" 단편을 생산한다. Fab 단편은 하기에 따른 전체 L 쇄로 구성된다: H 쇄의 가변 도메인 (VH), 및 일 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1). 항체의 펩신 처리는 단일의 큰 F(ab')2 단편을 산출하고, 이는 일상적으로 2가 항원-결합 활성을 갖는 2개의 이황화 연결된 Fab 단편에 상응하고, 여전히 항원과 가교결합할 수 있다. Fab' 단편은 항체-힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 추가의 소수 잔기를 가짐에 의하여 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 자유 티올 그룹을 보유하는 Fab'에 대해 본원에서 지정된다. F(ab')2 항체 단편은 본래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역접합체(immunoadhesin)"는 이형 단백질 ("접합체")의 결합 특이성을 면역글로불린 불변 도메인의 효과기 기능과 조합하는 분자를 가리킨다. 구조적으로, 면역접합체는 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열의 융합을 포함하고, 이의 아미노산은 항체의 항원 인식 및 결합 부위 (즉, 항체의 불변 영역과 비교하여 "이형"임) 및 면역글로불린 불변 도메인 서열 (예를 들어, IgG의 CH2 및/또는 CH3 서열) 이외의 것이다. 예시적인 접합체 서열은 관심 단백질에 결합하는 수용체 또는 리간드의 부분을 포함하는 인접 아미노산 서열을 포함한다. 접합체 서열은 또한 관심 단백질에 결합하는 서열일 수 있으나, 수용체 또는 리간드 서열 (예를 들어, 펩티바디 내 접합체 서열)이 아니다. 그러한 폴리펩티드 서열은 파지 디스플레이 기술 및 높은 처리율 분류 방법을 포함한 다양한 방법에 의하여 선택 및 동정될 수 있다. 면역접합체 내의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린, 예컨대 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 하위유형, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD, 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다.
항체 또는 절반-항체의 맥락에서, "힌지 영역"은 일반적으로 인간 IgG1의 Glu216로부터 Pro230까지 연신되는 것으로 정의된다 (Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)). 다른 IgG 이소형의 힌지 영역이 중쇄간 S-S 결합을 형성하는 첫 번째와 마지막 시스테인 잔기를 동일한 위치 내에 배치함으로써 IgG1 서열과 함께 정렬될 수 있다.
Fc 영역의 "보다 낮은 힌지 영역"은 잔기가 C-말단으로부터 힌지 영역으로 바로 연신되는, 즉 Fc 영역의 잔기 233으로부터 239까지 연신되는 것으로 일반적으로 정의된다. 본 발명에 앞서, Fc감마R 결합은 일반적으로 IgG Fc 영역의 보다 낮은 힌지 영역 내의 아미노산 잔기로 인하여 발생한다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인"은 보통, IgG의 잔기 약 231로부터 약 340까지 연신된다. CH2 도메인은 다른 도메인과 밀접하게 쌍을 이루지 않는 독특한 것이다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 쇄가 손상되지 않은 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 개재되어 있다. 탄수화물은 도메인-도메인 쌍에 대한 치환체를 제공하고, CH2 도메인을 안정화하는데 도움을 줄 수 있는 것으로 고려된다. Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985).
"CH3 도메인"은, Fc 영역 내 잔기 C-말단으로부터 CH2 도메인으로의 연신 (즉, IgG의 아미노산 잔기 약 341로부터 아미노산 잔기 약 447까지)을 포함한다.
"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "효과기 기능"을 갖는다. 예시적인 "효과기 기능"은 하기를 포함한다: C1q 결합; CDC; Fc 수용체 결합; ADCC; 식균 작용; 세포 표면 수용체의 다운스트림 조절 (예컨대 B 세포 수용체; BCR), 등.　 그러한 효과기 기능은 일반적으로 결합 도메인(예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 Fc 영역을 필요로 하며, 예를 들어, 본원에서의 정의에서 개시된 바와 같은 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 천연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 하기를 포함한다: 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 동종이인자형 및 A 동종이인자형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 뿐만 아니라 이의 천연 발생 변이체.
"변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형, 바람직하게는 하나 이상의 아니모산 치환(들)로 인하여 천연 서열 Fc 영역의 그것과 상이한 아미노산 서열을 포함한다.　 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은, 친계 폴리펩티드의 Fc 영역 또는 천연 서열 Fc 영역과 비교하여, 적어도 하나의 아미노산 치환, 예컨대 약 1 내지 약 10의 아미노산 치환을 가지고, 바람직하게는 친계 폴리펩티드 Fc 영역 내에서, 또는 천연 서열 Fc 영역 내에서 약 1 내지 약 5의 아미노산 치환을 갖는다.　 본원의 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 친계 폴리펩티드의 Fc 영역 및/또는 천연 서열 Fc 영역과 적어도 약 80% 상동성을 가질 것이고, 가장 바람직하게는 이들과 적어도 약 90%의 상동성을, 더욱 바람직하게는 이들과 적어도 약 95%의 상동성을 가질 것이다.
"Fc 복합체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 함께 상호작용하는 Fc 영역의 2개의 CH2 도메인 및/또는 함께 상호작용하는 Fc 영역의 2개의 CH3 도메인을 지칭하며, 여기서 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인은 펩티드 결합이 아닌 결합 및/또는 힘 (예컨대, 반데르발스, 소수성, 친수성 힘)을 통하여 상호작용한다.
본원에서 사용된 "Fc 성분"은 힌지 영역, Fc 영역의 CH2 도메인 또는 CH3 도메인을 지칭한다.
본원에 사용된 "Fc CH 성분" 또는 "FcCH"는 Fc 영역의 CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, "항체 돌연변이체" 또는 "항체 변이체"는 표준 항체의 아미노산 서열 변이체를 지칭하고, 여기서, 종-의존적 항체의 아미노산 잔기들 중 하나 이상은 변형되었다. 상기 돌연변이체는 종-의존적 항체와 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는다. 일 구현예에서, 항체 돌연변이체는 종-의존적 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 75% 아미노산 서열 동일성 또는 유사성, 보다 바람직하게는, 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90% 및 가장 바람직하게는 적어도 95%의 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 상기 서열과 관련된 동일성 또는 유사성은 본원에서 필요하다면 최대 퍼센트 서열 동일성을 성취하기 위해 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후 종-의존적 항체 잔기와 동일(즉, 동일 잔기) 또는 유사(즉, 통상의 측쇄 성질을 기초로 하는 동일한 그룹 유래의 아미노산 잔기)한 후보 서열에서 아미노산 잔기들의 %로서 본원에 정의된다. 일부 구현예에서, N 말단, C 말단, 또는 내부 연장, 결실 또는 가변 도메인의 항체 서열 외부로의 삽입의 어느 것도 서열 동일성 또는 유사성에 영향을 미치는 것으로 해석되지 않는다.
장애 및 질환은 본원의 물질/분자 또는 방법으로의 치료에 의하여 이점을 제공받을 임의의 병태이다. 이는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다 (포유동물에 상기 장애에 대한 의심 소인이 있는 병리학적 조건을 포함). 본원에서 치료될 장애의 비제한적인 예시는 하기와 같은 악성 및 양성 종양을 포함한다: 암종, 아세포종, 및 육종.
"치료"는 예방적 치료 및 예방학적 또는 방지적 수단을 지칭한다. 치료를 필요로 하는 개체들은, 양성, 전-암성, 또는 비-전이성 종양을 이미 가진 개체를 뿐만 아니라, 암의 발생 또는 재발을 예방할 개체들도 포함한다.
용어 "치료적 유효량"은 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 치료제의 양을 나타낸다. 암의 경우, 치료제의 치료적 유효량은 암 세포의 갯수를 감소시키고/시키거나; 종양 크기를 감소시키고/시키거나; 말초 기관 내로의 암 세포 침윤을 억제하고(즉, 얼마간 지연하고 바람직하게는 중지시키고)/하거나; 종양 전이를 억제하고(즉, 얼마간 지연하고 바람직하게는 중지시키고)/하거나; 종양 성장을 얼마간 억제하고/하거나; 상기 장애와 관련된 하나 이상의 증상을 얼마간 경감시킬 수 있다. 약물이 현존하는 암 세포의 성장을 방지하고/하거나 사멸시킬 수 있는 정도까지, 이는 세포증식억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 암 요법을 위해, 생체내 효능은, 예를 들면 생존 기간, 질환 진행까지의 시간 (TTP), 반응률(RR), 반응 기간, 및/또는 삶의 질 평가에 의해 측정될 수 있다.
본원에서 "자가면역 질환"은 개체의 고유 조직으로부터 유래하고 이에 대해 지시된 비-악성 질환 또는 장애이다. 본원에서 자가면역 질환은 특이적으로 하기를 배제한다: 악성 또는 암성 질환 또는 병태 (특히 B 세포 림프종, 급성 림프아구성 백혈병 (ALL), 만성적 림프구성 백혈병 (CLL), 모발 세포 백혈병 및 만성적 골수아세포 백혈병 배제). 자가면역 질환 또는 장애의 예시는 비제한적으로 하기를 포함한다: 염증성 반응 예컨대 염증성 피부 질환 (건선 및 피부염 포함) (예를 들면 아토피 피부염); 전신 경피증 및 경화증; 염증성 장 질환과 관련된 반응 (예컨대 크론병 및 궤양성 대장염); 호흡기 곤란 증후군 (성인 호흡기 곤란 증후군; ARDS 포함); 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 대장염; 사구체신염; 알러지성 병태 예컨대 습진 및 천식 및 다른 병태 (T 세포의 침윤 및 만성적 염증성 반응 포함); 죽상경화증; 백혈구 부착 결핍; 류마티스성 관절염; 전신 홍반성 낭창 (SLE); 진성 당뇨병 (예를 들면 유형 I 진성 당뇨병 또는 인슐린 의존적 진성 당뇨병); 다발성 경화증; 레이노 증후군; 자가면역 갑상선염; 알러지성 뇌척수염; 조르젠(Sjorgen's) 증후군; 유년 발병형 당뇨병; 및 급성 및 지연된 과민증과 관련된 면역 반응 (사이토카인 및 T-림프구에 의하여 매개됨; 전형적으로 결핵, 유육종증, 다발성근염, 육아종증 및 혈관염에서 발견됨); 악성 빈혈 (애디슨(Addison's) 질환); 백혈구 누출을 포함하는 질환; 중추신경계 (CNS) 염증성 장애; 다발성 장기 부상 증후군; 용혈성 빈혈 (비제한적으로 크라이오글로빈혈증(cryoglobinemia) 또는 쿱스(Coombs) 양성 빈혈 포함) ; 중증 근무력증; 항원-항체 복합체매개된 질환; 항-사구체 기저막 질환; 항인지질 증후군; 알러지성 신경염; 그레이브스병; 램버트-이튼(Lambert-Eaton) 근무력증 증후군; 수포성 유사천포창; 천포창; 자가면역 다발성내분비병; 라이터 질환; 강직인간 증후군; 베체트병; 거대세포 동맥염; 면역 복합 신염; IgA 신병증; IgM 다발성신경병증; 면역 혈소판감소성 자반병 (ITP) 또는 자가면역 혈소판감소증 등.
용어들 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리적 상태를 나타내거나 설명한다. 상기 정의에는 양성 및 악성 암이 포함된다. "초기 단계 암" 또는 "초기 단계 종양"은 침습성 또는 전이성이 아니거나 0, I, 또는 II 단계의 암으로 분류된 암을 의미한다. 암의 예시는 비제한적으로, 하기를 포함한다: 암종, 림프종, 모세포종 (수모세포종 및 망막모세포종 포함), 육종 (지방육종 및 활막 세포 육종 포함), 신경내분비 종양 (유암종, 가스트린종, 및 소도세포 암 포함), 중피종, 신경집종 (청신경종 포함), 수막종, 선암종, 흑색종, 및 백혈병 또는 림프모양 악성종양. 상기 암의 더욱 특정한 예시는 하기를 포함한다: 편평상피 세포 암 (예를 들면 상피성 편평상피 세포 암), 폐암 (소세포 폐암 (SCLC), 비-소세포 폐암 (NSCLC), 폐의 선암종 및 폐의 편평상피 암종 포함), 복막 암, 간세포 암, 위 또는 위암 (위장 암 포함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암 (전이성 유방암 포함), 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액샘 암종, 신장 또는 신장 암, 전립선암, 외음부 암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 고환암, 식도암, 담관 종양, 뿐만 아니라 두경부 암 및 다발성 골수종.
용어 "전-암성"은 전형적으로 암에 선행하거나 암으로 발병하는 병태 또는 성장을 지칭한다. "전-암성" 성장은 하기로 특징화된 세포를 가질 것이다: 비정상 세포 주기 조절, 증식 또는 분화 (비정상 세포 주기 조절, 증식 또는 분화의 마커에 의하여 측정될 수 있음).
"이형성증"은 조직, 기관, 또는 세포의 임의의 비정상적 성장 또는 발달을 의미한다. 바람직하게는, 이형성증은 높은 등급 또는 전암성이다.
"전이"는 암 세포의 원발성 부위로부터 신체의 다른 부분으로의 확산을 의미한다. 암 세포는 원발성 종양으로부터 촉발하여, 림프관 또는 혈관을 통하여 침투하고, 혈류를 통하여 순환하고, 그리고 체내 정상 세포 내의 원격 병소 내에서 성장 (전이)할 수 있다. 전이는 국지적이거나 원격일 수 있다. 전이는, 원발성 종양으로부터 촉발하여, 혈류를 통하여 이동하고, 그리고 원격 부위에서 중지하는 종영 세포 상에 따른 순차적 과정이다. 신규 부위에서, 세포는 혈액 공급을 수립하고, 생명-위협적인 덩어리(mass)를 형성하도록 성장할 수 있다.
종양 세포 내의 자극성 및 억제성 분자 경로 둘 다는 이의 행위를 조절하고, 원격 부위 내의 종양 세포 및 숙주 세포 사이의 상호작용은 또한 유의미하다.
"비-전이성"은 원발성 부위에 남아있거나 양성이고, 원발성 부위 이외의 림프관 또는 혈관계로 침투하지 않은 암을 의미한다. 일반적으로, 비-전이성 암은 단계 0, I, 또는 II 암이고, 때때로 단계 III 암이다.
"원발성 종양" 또는 "원발성 암"은 본래의 암을 의미하며, 대상체의 체내에서 또 다른 조직, 기관, 또는 위치에 위치한 전이성 병변을 의미하지 않는다.
"양성 종양" 또는 "양성 암"은 본래 부위에 국지화되어 남아있고, 원격 부위로 침윤, 침투, 또는 전이될 능력을 갖지 않은 종양을 의미한다.
"종양 과중(tumor burden)"는 체내 암 세포의 수, 종양의 크기, 또는 암의 양을 의미한다. 종양 과중은 또한 종양 부하(tumor load)를 지칭한다.
"종양 수"는 종양의 수를 의미한다.
"대상체"는 포유동물를 의미하는데, 비제한적으로, 인간 또는 비인간, 예컨대 소, 말, 개, 양 또는 고양이가 포함된다. 더욱 바람직하게는, 대상체는 인간이다.
용어 "항-암 요법"은 암을 치료하는데 유용한 요법을 지칭한다. 항암 치료제의 예시에는 비제한적으로 화학치료 제제, 성장 억제제, 세포독성제, 방사선 요법에서 사용되는 제제, 항-신생혈관제, 세포자멸제, 항-튜불린 제제, 및 암을 치료하기 위한 다른 제제, 항-CD20 항체, 혈소판 유도된 성장 인자 억제제(예를 들면, Gleevec™ (이마티닙 메실레이트)), COX-2 억제제(예를 들면, 셀레콕시브), 인터페론, 사이토카인, 하나 이상의 하기 표적 중 하나 이상에 결합하는 길항제 (예컨대, 중화 항체): ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-베타, BlyS, APRIL, BCMA VEGF, 또는 VEGF 수용체(들), TRAIL/Apo2에 결합하는 길항제(예를 들면, 중화 항체), 및 다른 생물활성 및 유기 화학 제제 등이 포함된다. 이들의 조합도 본 발명에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "세포독성 제제"는 세포의 기능을 억제 또는 예방하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 상기 용어 하기를 포함하도록 유도된다: 방사성 동위원소 (예를 들면 I131, I125, Y90 및 Re186), 화학치료제, 및 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원 (이의 단편 및/또는 변이체 포함)의 독소 예컨대 효소적활성 독소.
"화학치료제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료 제제의 예시에는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이 포함된다. 화학치료제의 예시는 하기를 포함한다: 알킬화제 예컨대 티오테파 및 사이톡산® 사이클로포스파마이드; 알킬 설포네이트 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민(methylamelamine) (알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸롤로멜라민 포함); 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 바이젤레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드 예컨대 클로르암부실, 클로르나파진, 콜로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 우라실 머스타드; 나이트로수레아 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님무스틴; 항생제 예컨대 엔디인 항생제 (예를 들면, 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 감마1I 및 칼리키아마이신 오메가I1 (참고, 예를 들면, Agnew, Chem Intl . Ed. Engl ., 33: 183-186 (1994)); 다이네마이신 (다이네마이신 A 포함); 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색소단백질 엔디인 항생(antiobiotic) 발색단), 아클라시노마이신(aclacinomysin), 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신® 독소루비신 (모폴리노-독소루비신, 시아노모폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신 예컨대 아미노글루테티마이드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파마이드 글리코사이드; 아미노레벌린산; 에닐루라실; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소크산트론; 포도필린ic 산; 2- 에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK® 다당류 복합체 (JHS 천연 생성물, Eugene, OR); 라족산; 라이족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아진산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라바이노시드 ("Ara-C"); 사이클로포스파마이드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들면, 탁솔® 파클리탁셀 (Bristol- Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANETM 파클리탁셀의 크레모포어-없는, 알부민-조작된 나노입자 제형 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), 및 탁소테르® 독세탁셀 (
Figure pct00001
- Poulenc Rorer, Antony, France); 클로란부실; 젬자르® 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파마이드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 나벨빈® 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트(edatrexate); 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (캄프토사르, CPT-11) (5-FU 및 류코보린을 갖는 이리노테칸의 치료 레지멘 포함); 토포이소머라제 저해제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(difluorometlhylornithine) (DMFO); 레티노이드 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 벨케이드 보르테조밉; 레블리미드 레날리도마이드; 류코보린 (LV); 옥살리플라틴 (옥살리플라틴 치료 레지멘 포함) (폴폭스); PKC-알파, Raf, H-Ras, EGFR 저해제 (예를 들면, 에를로티닙 (TarcevaTM)) 및 세포 증식을 감소시키는 VEGF-A 및 상기 임의의 것의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체.
이러한 정의에는 하기가 또한 포함된다: 종양 상에서 호르몬 작용을 조절 또는 저해하는 항호르몬제 예컨대 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절물질 (SERM), (하기를 포함: 예를 들면, 타목시펜 (놀바덱스® 타목시펜 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케녹시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 FARESTON· 토레미펜); 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 방향화효소(aromatase)를 저해하는 방향화효소 저해제, 예컨대, 예를 들면, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티마이드, MEGASE® 메게스트롤 아세테이트, 아로마신® 엑세메스탄, 포르메스타니, 파드로졸, RIVISOR® 보로졸, FEMARA® 레트로졸, 및 아리미덱스® 아나스트로졸; 및 항-안드로겐 예컨대 플루타미드, 닐루타마이드, 바이칼루타마이드, 류프롤라이드, 및 고세렐린; 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오사이드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상 세포 증식과 관련된 신호전달 경로 내의 유전자의 발현을 억제하는 것들, 예컨대, 예를 들면, PKC-알파, Raf 및 H-Ras; 리보자임 예컨대 VEGF 발현 저해제 (예를 들면, 안지오자임® 리보자임) 및 HER2 발현 저해제; 백신 예컨대 유전자 요법 백신, 예를 들면, ALLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신, 및 VAXID® 백신; PROLEUKIN® rIL-2; 루르토테칸® 토포이소머라제 1 저해제; 아바렐릭스® rmRH; 비노렐빈 및 에스페라마이신 (참고 미국 특허 번호 4,675,187), 및 상기 중 임의의 것의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전구약물"은 친계 약물과 비요하여 종양 세포에 덜 세포독성이고, 더욱 활성인 친계 형태로 전환 또는 효소적으로 활성화될 수 있는 약제학적 활성 물질의 전구체 또는 유도체를 지칭한다. [참조: 예를 들면, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) 및 Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). 본 발명의 전구약물은 비제한적으로 하기를 포함한다: 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 설페이트-함유 전구약물, 펩티드-함유 전구약물, D-아미노산-변형된 전구약물, 당화된 전구약물, β-락탐-함유 전구약물, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 전구약물 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 다른 5-플루오로우리딘 전구약물 (보다 더 활성인 세포독성 없는(cytotoxic free) 약물로 전환될 수 있음). 본 발명에서의 사용을 위하여 전구약물 형태로 유도될 수 있는 세포독성 약물의 예시는 비제한적으로 상기 기재된 화학치료제를 포함한다.
"방사선 요법"은 세포를 정상적으로 기능하도록 하거나 세포를 파괴하는 것을 함께 제한하기 위하여 세포에 충분한 손상을 유도하기 위하여 지시된 감마선 또는 베타선의 사용을 의미한다. 치료의 투여량 또는 기간을 결정하기 위하여 본 분야에서 많은 방법이 있을 것이라는 것이 고려된다. 전형적인 치료를 1회성 투여로 실시하였으며, 전형적인 투여량은 1일 당 10 내지 200 단위 (Grays)의 범위이다.
"생물학적으로 활성인" 또는 "기능적인" 폴리펩티드 (예컨대 이형 폴리펩티드)는 구조적, 조절적, 생화학적, 또는 생체물리적 사건에서 이의 천연 활성 중 하나 이상을 행사할 수 있는 것이다.
"생물학적으로 활성인" 또는 "기능적인" 항체는 구조적, 조절적, 생화학적, 또는 생체물리적 사건에서 이의 천연 활성 중 하나 이상을 행사할 수 있는 것이다. 예를 들어, 생물학적으로 활성인 항체는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 가질 수 있고, 상기 결합은 세포성 또는 분자성 사건, 예컨대 신호전달 형질도입 또는 효소적 활성을 차례로 유도 또는 변경할 수 있다. 생물학적으로 활성인 항체는 또한 수용체의 리간드 활성을 차단하거나 작용제 할체로서 작용할 수 있다. 항체의 이의 중성 활성 중 하나 이상을 행사하는 능력은, 폴리펩티드 쇄의 적절한 접힘 및 조립을 포함하는 수개의 인자에 따라 달라진다.
본 발명의 조성물 및 이를 이용하는 방법.
본원에서, 예를 들어, 이형 폴리펩티드 (예컨대, 항체, 예를 들어, 전장 항체)를 생산하는 방법으로 적절한 신호 펩티드 및 변이체 신호 펩티드를 사용한 방법이 제공된다. 신호 펩티드를 특징화하기 위한 방법이 본 분야에 알려져 있다. 일 도식에서, 신호 펩티드는 통상적으로 하기 3개의 개별 영역으로 구성된다: 1 또는 2개의 양으로 하전된 아미노산 잔기를 함유하는 N-말단 영역, H-영역 (또한 H 도메인으로 지칭됨)으로 지칭되는 소수성 코어 영역, 및 신호 펩티다제로 인식된 C-말단 영역. 일부 구현예에서, H-영역은 길이가 약 10-16 잔기이다. 신호 펩티드의 소수성은 에이젠버그(Eisenberg) 단위를 사용하여 산출된다. 참고: Eisenberg, D. et al, J Mol Biol (1984) 179:125-142. 간략하게, 각 아미노산에 정규화된 공통 소수성 값이 배정된다 (참고: Eisenberg, et al. 상기 표 I (페이지 126)). 소수성 총합 (또한 총 소수성으로 불림)은 신호 펩티드의 각 아미노산에 대해 공통 소수성 값을 더함으로써 (또는 예를 들어 H 영역에 대한 총 소수성을 산출하기 위하여, H 영역 내의 각 아미노산에 대한 공통 소수성 값을 더함) 산출된다. 평균 소수성은 하기 공식에 의하여 산출된다: 평균 소수성 = 총 (총합) 소수성 / 아미노산의 수. 일부 구현예에서, 전체 신호 펩티드의 평균 소수성이 산출된다. 일부 구현예에서, H-영역 (또한 H-도메인으로 불림)의 평균 소수성이 산출된다.
신호 펩티드 서열의 변이가 본 분야에서 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다. DNA를 이러한 방식으로 유전학적으로 변형시키기 위한 기술은 하기에 검토되었고: Mutagenesis : a Practical Approach, M.J. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, UK. (1991), 예를 들어, 부위-지향적 돌연변이생성, 카세트 돌연변이유발 및 중합체라제 쇄 반응(PCR) 돌연변이유발을 포함한다. 돌연변이생성을 위한 다른 방법은 퀵체인지(QuickChange) 부위-지시된 돌연변이 생성 및 중첩 연장 PCR을 포함한다.
또 다른 양태에서, 예를 들어, 본 발명의 하기의 방법에 사용되기 위한 DsbA 신호 펩티드 보다 큰 평균 소수성 (예컨대, H 영역의 평균 소수성, 또는 전체 신호 펩티드의 평균 소수성)의 용도가 제공된다: 이형 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)의 제조 방법, 세포로부터 이형 폴리펩티드를 분비하는 방법, 용해성 이형 폴리펩티드를 제조하는 방법, 용해성 이형 폴리펩티드를 주변세포질로 분비하는 방법, 성숙 이형 폴리펩티드를 제조하는 방법, 성숙 이형 폴리펩티드를 주변세포질로 분비하는 방법, 이형 폴리펩티드를 전좌시키는 방법, 및 이형 폴리펩티드의 분비를 최적화하는 방법. DsbA보다 더 큰 평균 소수성을 갖는 예시적인 신호 펩티드는 하기를 포함한다: FlgI, NikA, AsmA, TolB, YraI, FecB, CemH, TreA, FocC, TraU, SfmL, TorT, SfmC.
일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드의 평균 소수성은 약 0.5 초과이다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드의 평균 소수성은 약 0.6 초과이다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드의 평균 소수성은 약 0.7 초과이다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드의 평균 소수성은 약 0.52, 0.53, 0.54, 0.55, 0.56, 0.57, 0.58, 0.59, 0.6, 0.61, 0.62, 0.63, 0.64, 0.65, 0.66, 0.67, 0.68, 0.69, 0.7 또는 그 이상을 초과한다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드의 평균 소수성은 약 0.6 초과이다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드의 평균 소수성은 약 0.7 초과이다. 일부 구현예에서, 제2 신호 펩티드의 평균 소수성은 약 0.52, 0.53, 0.54, 0.55, 0.56, 0.57, 0.58, 0.59, 0.6, 0.61, 0.62, 0.63, 0.64, 0.65, 0.66, 0.67, 0.68, 0.69, 0.7 또는 그 이상을 초과한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 신호 펩티드의 평균 소수성은 유사 (예를 들어, 대략 동등)하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 신호 펩티드의 평균 소수성은 상이하다.
DsbA 및 STII 신호 펩티드는 당분야에서 널리 공지된다. DsbA 및 STII 신호 펩티드의 서열은 표 7 및 8에서 나타난다. DsbA 및 STII N-말단 영역, H-영역, 및 C-말단 영역의 서열이 표 7 및 8에서 나타난다.
이형 폴리펩티다의 생산 및 분비를 특징화하는 방법은 본 분야에 알려져 있으며, 일부 방법이 본원에 기술되고 예시된다. 예를 들어, 이형 단백질 (예를 들어, 항체)와 작동가능하게 연결된 변이체 신호 펩티드를 암호화하는 발현 벡터(들)을 갖는 숙주 균주를 배양하고, 폴리펩티드를 추출한다. 용해성 분획을, 생산된 전장 이형 단백질의 수준을 측정하기 위하여, 비-환원 SDS 페이지(Page) 전기영동, 이후 웨스턴 블랏 분석에 의하여 분리시켰다. 성숙 대 전구체 폴리펩티드의 수준의 존재 또는 부재는, 본 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 예를 들어, 신호 펩티드를 갖거나 없는 단리된 폴리펩티드의 특징화 및 웨스턴 겔 상의 대역으로부터 단리된 단백질의 에드만 (Edman) 서열분석에 의하여 측정될 수 있다. 전체 항체 (또는 예를 들어, 다른 이종다량체 단백질)의 생산은, 변성 조건 하에서 웨스턴 블랏을 구동함으로써 측정될 수 있다. 이형 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)의 활성은 본 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 일상적 기능 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 단백질의 기능은 적절한 단백질 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 결합 활성은 ELISA, Biacore 및 본 분야에 알려진 다른 방법을 사용하여 시험될 수 있다. 다른 기능은 특이적 이형 폴리펩티드에 대한 적절한 것으로서 본 분야에서 잘 알려진 검정을 사용하여, 시험될 수 있다.
번역 개시 영역 (TIR)은 단백질의 전체 번역 수준의 주요 결정인자이다. TIR은 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 샤인-달가르노 서열의 업스트림으로부터 바로 개시 코돈의 다운스트림에서의 대략 20개의 뉴클레오티드로 연신된다. 이러한 폴리펩티드 서열의 변형 (일부 구현예에서, 신호 서열을 암호화하는 서열의 제1 약 2 내지 약 14개, 약 4 내지 약 12개, 약 6개의 코돈 내의 변형)은 번역 개시의 효율을 변경시켜, 이로써 상기 다운스트림 단백질의 변역 수준을 조정할 수 있다. TIR은 상이한 번역 강도를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 번역 개시 영역 (예를 들어, 제1 및 제2 이형 폴리펩티드와 작동가능하게 연결된) (그리고 일부 구현예에서, 예를 들어, 제3 이형 폴리펩티드와 작동가능하게 연결된 제3 번역 개시 영역)은 대략 동등한 번역 강도를 제공한다. 일부 구현예에서, 상대적 번역 강도는 약 1 또는 2이다. 일부 구현예에서, 상대적 번역 강도는 약 1이다. 일부 구현예에서, 상대적 번역 강도는 약 2이다. 일부 구현예에서, 상대적 번역 강도는 1 및/또는 2이다. 일부 구현예에서, 상대적 번역 강도는 약 3 또는 약 4이다. 일부 구현예에서, 상대적 번역 강도는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상 (예컨대 6 또는 7 또는 그 이상)이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 TIR의 상대적 번역 강도는 약 1이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 TIR의 상대적 번역 강도 (또한 TIR 강도로 불림)는 약 2이다. 일부 구현예에서, 제1, 제2, 및 제3 TIR의 상대적 번역 강도는 약 1이다. 일부 구현예에서, 제1, 제2, 및 제3 TIR의 상대적 번역 강도는 약 2이다. 일부 구현예에서, 상대적 번역 강도는 약 2, 약 3, 대략 4, 약 5, 약 6, 약 7, 또는 그 이상, 예컨대 약 8, 약 9, 또는 그 이상이다. 일부 구현예에서, 상대적 번역 강도는 1 내지 3, 2 내지 4, 3 내지 5, 4 내지 6, 5 내지 7, 또는 6 내지 8이다. 일부 구현예에서, 상대적 번역 강도는 2 내지 5, 3 내지 7, 또는 4 내지 8이다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 대략 6, 약 7, 또는 약 8이다. 일부 구현예에서, 제1 신호 펩티드의 상대적 번역 강도는 약 5이고, 제2 신호 서열의 상대적 번역 강도는 약 8이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 TIR의 상대적 번역 강도는 대략 동등하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 TIR의 상대적 번역 강도는 상이하다.
일부 구현예에서, 신호 펩티드 (예컨대 변이체 신호 펩티드)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 관심 유전자의 발현을 위하여 적절한 요소와 함께 벡터 내에서 제공될 것이다. 일부 구현예에서, 벡터는 신호 서열 5' 프로모터, 관심 유전자 또는 리포터 유전자의 삽입을 위한 신호 서열에 대한 제한 효소 인식 부위 3', 및 생성된 플라스미드로 변형된 박테리아의 선택 및/또는 유지를 위한, 선택가능한 마커, 예컨대 약물 내성 마커를 포함한다. 플라스미드 벡터는 추가로 본원에 검토되고 예시된다. 원핵생물 숙주와 함께 사용되기 위한 적절한 프로모터는 본 분야에 알여져 있으며, 이중 일부는 본원에 예시 및 기술된다.
임의의 리포터 유전자가 사용될 수 있으며, 이는 일부 방식으로 정량화될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 알칼리성 인산가수분해효소 생산은 phoA 유전자 생성물의 분비 수준의 측정치로서 정량화될 수 있다. 다른 예시는, 예를 들어, β-락타마제 유전자이다.
폴리펩티드의 분비 수준은, 예를 들어, 관심 폴리펩티드에 대한 기능적 검정, 이용가능하다면, 방사면역검정 (RIA), 효소-연결 면역검정 (ELISA)에 의하여, 또는 PAGE 및 관심 폴리펩티드의 정확한 분자량의 가시화에 의하여 측정될 수 있다. 분비된 폴리펩티드의 수준 측정을 위한 방법은 본 분야에 잘 알려져 있고, 일부는 본원에 예시된다.
폴리펩티드
예시적인 이종성 폴리펩티드는 하기를 포함한다: 막통과 분자 (예를 들면 수용체, 예컨대 수용체 티로신 키나제) 또는 리간드 예컨대 성장 인자. 예시적인 이종성 폴리펩티드는 하기를 포함한다: 분자 예컨대 레닌; 성장 호르몬 (인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬 포함); 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 리포단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 여포자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자 (TF), 및 폰빌레브란트 인자; 항-응고 인자 예컨대 단백질 C; 심방나트륨 이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성제, 예컨대 우로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (발현 및 분비된 T 세포의 정상 활성화 상에서 조절됨); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러관 억제 서브스턴스; 릴락신 A-사슬; 릴락신 B-사슬; 프로릴락신; 마우스 성선자극호르몬-관련된 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련된 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스성 인자; 신경친화성 인자 예컨대 골-유도된 신경친화성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자 예컨대 NGF-β; 혈소판-유도된 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF) 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타 (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5 포함); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 및 CD40; 에리트로포이에틴; 골유도성 인자; 면역독소; 골 형성 단백질 (BMP); 인터페론 예컨대 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 집락 자극 인자 (CSFs), 예를 들면, M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터루킨 (IL), 예를 들면, IL-1 내지 IL-10; 수퍼록사이드 디스무타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원 예컨대, 예를 들면, AIDS 엔빌로프의 부분; 수송 단백질; 귀소 수용체; 아드레신; 조절 단백질; 인테그린 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련된 항원 예컨대 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 상기-열거된 폴리펩티드 중 임의의 단편.
면역접합체는 본원에 따른 이형 폴리펩티드로 명확하게 고려된다.
항체
항체 또는 이형다량체 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 또는 면역접합체에 대한 예시적인 표적은, 비제한적으로, 하기 목록을 포함한다:
BMPI, BMP2, BMP3B (GDFIO), BMP4, BMP6, BMP8, CSFI (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), EPO, FGFI (aFGF), FGF2 (bFGF), FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF9, FGF10, FGF1 1 , FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21 , FGF23, IGF1 , IGF2, IFNAI, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNBI, IFNG, IFNWI, FELI, FELI (EPSELON), FELI (ZETA), IL1A, IL1 B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL1 1 , IL12A, I L12B, IL13, IL14, IL15, I L16, IL17, IL17B, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, I L29, IL30, PDGFA, PDGFB, TGFA, TGFB1 , TGFB2, TGFB3, LTA (TNF-b), LTB, TNF (TNF-a), TNFSF4 (OX40 리간드), TNFSF5 (CD40 리간드), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27 리간드), TNFSF8 (CD30 리간드), TNFSF9 (4-1 BB 리간드), TNFSFIO (TRAIL), TNFSF1 I (TRANCE), TNFSF12 (AP03L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM- L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, HGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, ILIR1 , IL1 R2, IL1 RL1 , IL1 RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, ILIORA, ILIORB, IL1 1 RA, IL12RB1 , IL12RB2, IL13RA1 , IL13RA2, IL15RA, IL17R, IL18R1 , IL20RA, IL21 R, IL22R, IL1 HY1 , IL1 RAP, IL1 RAPL1 , IL1 RAPL2, IL1 RN, IL6ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIFI, HGF, LEP (렙틴), PTN, THPO, CCLI (I- 309), CCL2 (MCP - 1 / MCAF), CCL3 (MIP-la), CCL4 (MIP-lb), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP- 3), CCL8 (mcp- 2), CCLH (에오탁신), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP-ld), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MDP-3b), CCL20 (MIP- 3a), CCL21 (SLC / 엑소두스-2), CCL22 (MDC / STC-I), CCL23 (MPIF-I), CCL24 (MPIF-2 / 에오탁신-2), CCL25 (TECK), CCL26 (에오탁신- 3), CCL27 (CTACK / ILC), CCL28, CXCLI (GROI), CXCL2 (GR02), CXCL3 (GR03), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP 10), CXCL1 1 (I- TAC), CXCL12 (SDFI), CXCL13, CXCL14, CXCL16, PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7), CX3CL1 (SCYDI), SCYEI, XCLI (림포탁틴), XCL2 (SCM-lb), BLRI (MDR15), CCBP2 (D6 / JAB61 ), CCR1 (CKRI / HM145), CCR2 (mcp-IRB / RA), CCR3 (CKR3 / CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBR5 / ChemR13), CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6), CCR7 (CKR7 / EBII), CCR8 (CMKBR8 / TERI / CKR- LI), CCR9 (GPR-9-6), CCRLI (VSHKI), CCRL2 (L- CCR), XCRI (GPR5 / CCXCRI), CMKLRI, CMKORI (RDCI), CX3CR1 (V28), CXCR4, GPR2 (CCRIO), GPR31 , GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / Bonzo), HM74, IL8RA (IL8Ra), IL8RB (IL8Rb), LTB4R (GPR16), TCPIO, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5R1 , CSF3, GRCCIO (CIO), EPO, FY (DARC), GDF5, HDFIA, DL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREMI, TREM2, VHL, ABCFI; ACVRI; ACVRIB; ACVR2; ACVR2B; ACVRLI; AD0RA2A; 아그레칸; AGR2; AICDA; AIFI; AIGI; AKAPI; AKAP2; AMH; AMHR2; ANGPTI; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOCI; AR; AZGPI (아연-a- 당단백질); B7.1 ; B7.2; BAD; BAFF (BLys); BAGI; BAH; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLRI (MDR15); BMPI; BMP2; BMP3B (GDFIO); BMP4; BMP6; BMP8; BMPRIA; BMPRIB; BMPR2; BPAGI (플렉틴); BRCAI; C19orflO (IL27w); C3; C4A; C5; C5R1 ; CANTI; CASP1 ; CASP4; CAVI; CCBP2 (D6 / JAB61 ); CCLI (1 -309); CCLII (에오탁신); CCL13 (MCP-4); CCL15 (MlP-ld); CCL16 (HCC-4); CCL17 (TARC); CCL18 (PARC); CCL19 (MIP-3b); CCL2 (MCP -1 ); MCAF; CCL20 (MIP-3a); CCL21 (MTP-2); SLC; 엑소두스-2; CCL22 (MDC / STC-I); CCL23 (MPIF- 1 ); CCL24 (MPIF-2 / 에오탁신-2); CCL25 (TECK); CCL26 (에오탁신-3); CCL27 (CTACK / ILC); CCL28; CCL3 (MTP-la); CCL4 (MDP-lb); CCL5 (RANTES); CCL7 (MCP-3); CCL8 (mcp-2); CCNAI; CCNA2; CCNDI; CCNEI; CCNE2; CCRI (CKRI / HM145); CCR2 (mcp-IRB / RA);CCR3 (CKR3 / CMKBR3); CCR4; CCR5 (CMKBR5 / ChemR13); CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6); CCR7 (CKR7 / EBII); CCR8 (CMKBR8 / TERI / CKR-LI); CCR9 (GPR-9-6); CCRLI (VSHKI); CCRL2 (L-CCR); CD164; CD19; CDIC; CD20; CD200; CD22; CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD52; CD69; CD72; CD74; CD79A; CD79B; CD8; CD80; CD81 ; CD83; CD86; CDHI (E-카드헤린); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKNIA (p21Wapl/Cipl); CDKNIB (p27Kipl); CDKNIC; CDKN2A (P16INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CERI; CHGA; CHGB; 키티나제; CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3; CLDN7 (크라우딘- 7); CLN3; CLU (클러스테린); CMKLRI; CMKORI (RDCI); CNRI; COL18A1 ; COLIAI; COL4A3; COL6A1 ; CR2; CRP; CSFI (M-CSF); CSF2 (GM-CSF); CSF3 (GCSF); CTLA4; CTNNBI (b- 카테닌); CTSB (카텝신 B); CX3CL1 (SCYDI); CX3CR1 (V28); CXCLI (GROI); CXCL10 (IP-10); CXCLII (l-TAC / IP-9); CXCL12 (SDFI); CXCL13; CXCL14; CXCL16; CXCL2, (GR02); CXCL3 (GR03); CXCL5 (ENA-78 / LIX); CXCL6 (GCP-2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / Bonzo); CYB5; CYCI; CYSLTRI; DAB2IP; DES; DKFZp451 J01 18; DNCLI; DPP4; E2F1 ; ECGFI; EDGI; EFNAI; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; EN01 ; EN02; EN03; EPHB4; EPO; ERBB2 (Her-2); EREG; ERK8; ESRI; ESR2; F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCERIA; FCER2; FCGR3A; FGF; FGFI (aFGF); FGF10; FGF1 1 ; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2 (bFGF); FGF20; FGF21 ; FGF22; FGF23; FGF3 (int-2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST-2); FGF7 (KGF); FGF8; FGF9; FGFR3; FIGF (VEGFD); FELI (엡실론); FILI (ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRTI (파이브로넥틴); FLTI; FOS; FOSLI (FRA-I); FY (DARC); GABRP (GABAa); GAGEBI; GAGECI; GALNAC4S-6ST; GAT A3; GDF5; GFI 1 ; GGT1 ; GM- CSF; GNASI; GNRHI; GPR2 (CCRIO); GPR31 ; GPR44; GPR81 (FKSG80); GRCCIO (CIO); GRP; GSN (겔솔린); GSTPI; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIFIA; HDPI; 히스타민 및 히스타민 수용체; HLA-A; HLA-DRA; HM74; HMOXI ; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; ID2; IFN-a; IFNAI; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1 ; IFN감마; DFNWI; IGBPI ; IGFI; IGFIR; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL-I; IL10; MORA; IL10RB; IL1 1 ; IL1 1 RA; IL-12; IL12A; IL12B; IL12RB1 ; IL12RB2; IL13; IL13RA1 ; IL13RA2; IL14; IL15; IL15RA; IL16; IL17; IL17B; IL17C; IL17R; IL18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; IL19; IL1A; IL1 B; ILIF10; IL1 F5; IL1 F6; IL1 F7; IL1 F8; IL1 F9; IL1 HYI; IL1 Rl; IL1 R2; IL1 RAP; IL1 RAPL1 ; IL1 RAPL2; IL1 RL1 ; IL1 RL2, ILIRN; IL2; IL20; IL20RA; IL21 R; IL22; IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; I L28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST (당단백질 130); EL7; EL7R; EL8; IL8RA; DL8RB; IL8RB; DL9; DL9R; DLK; INHA; INHBA;INSL3; INSL4; IRAKI; ERAK2; ITGAI; ITGA2; ITGA3; ITGA6 (a6 인테그린); ITGAV; ITGB3; ITGB4 (b 4 인테그린); JAGI; JAKI; JAK3; JUN; K6HF; KAN; KDR; KITLG; KLF5 (GC 박스 BP); KLF6; KLKIO; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1 ; KRT19 (케라틴 19); KRT2A; KHTHB6 (모발-특이적 유형 H 케라틴); LAMAS; LEP (렙틴); Lingo-p75; Lingo- Troy; LPS; LTA (TNF-b); LTB; LTB4R (GPR16); LTB4R2; LTBR; MACMARCKS; MAG 또는 Omgp ; MAP2K7 (c-Jun); MDK; MIBI; 미드카인; MEF; MIP-2; MKI67; (Ki-67); MMP2; MMP9; MS4A1 ; MSMB; MT3 (메탈로티오넥틴-lll); MTSSI; MUCI (뮤신); MYC; MYD88; NCK2; 뉴로칸; NFKBI; NFKB2; NGFB (NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR- Nogo66 (Nogo); NgR- p75; NgR-Troy; NMEI (NM23A); N0X5; NPPB; NROBI; NR0B2; NRIDI; NR1 D2; NR1 H2; NR1 H3; NR1 H4; NR1 I2; NR1 I3; NR2C1 ; NR2C2; NR2E1 ; NR2E3; NR2F1 ; NR2F2; NR2F6; NR3C1 ; NR3C2; NR4A1 ; NR4A2; NR4A3; NR5A1 ; NR5A2; NR6A1 ; NRPI; NRP2; NT5E; NTN4; ODZI; OPRDI; P2RX7; PAP; PARTI; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PDGFA; PDGFB; PECAMI; PF4 (CXCL4); PGF; PGR; 포스파칸; PIAS2; PIK3CG; PLAU (uPA); PLG; PLXDCI; PPBP (CXCL7); PPID; PRI; PRKCQ; PRKDI; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA; PTAFR; PTEN; PTGS2 (COX-2); PTN; RAC2 (p21 Rac2); RARB; RGSI; RGS13; RGS3; RNFIIO (ZNF144); ROB02; S100A2; SCGB1 D2 (리포필린 B); SCGB2A1 (맘마글로빈2); SCGB2A2 (맘마글로빈(mammaglobin) 1 ); SCYEI (내피 단핵구-활성 사이토카인); SDF2; 세르핀AI; 세르핀A3; SERP1 NB5 (마스핀); 세르핀I (PAI-I); SERPDMF1 ; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1 ; SLC43A1 ; SLIT2; SPPI; SPRRIB (Sprl); ST6GAL1 ; STABI ; STAT6; STEAP; STEAP2; TB4R2; TBX21 ; TCPIO; TDGFI; TEK; TGFA; TGFBI; TGFBIII; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBRI; TGFBR2; TGFBR3; THIL; THBSI (트롬보스폰딘-1 ); THBS2; THBS4; THPO; TIE (Tie-1 ); TMP3; 조직 인자; TLRIO; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TNF; TNF-a; TNFAEP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSFIIA; TNFRSFIA; TNFRSFIB; TNFRSF21 ; TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSFIO (TRAIL); TNFSFI 1 (TRANCE); TNFSF12 (AP03L); TNFSF13 (April); TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSF15 (VEGI); TNFSF18; TNFSF4 (OX40 리간드); TNFSF5 (CD40 리간드); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (CD27 리간드); TNFSF8 (CD30 리간드); TNFSF9 (4-1 BB 리간드); TOLLIP; Toll-유사 수용체; TOP2A (토포이소머라제 Ea); TP53; TPMI; TPM2; TRADD; TRAFI; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREMI; TREM2; TRPC6; TSLP; TWEAK; VEGF; VEGFB; VEGFC; 베르시칸; VHL C5; VLA-4; XCLI (림포탁틴); XCL2 (SCM-lb); XCRI(GPR5 / CCXCRI); YYI; 및 ZFPM2.
일부 구현예에서, 표적은 하기를 포함한다: CD 단백질 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD20, CD34; ErbB 수용체 패밀리의 CD64, CD200 구성원 예컨대 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 부착 분자 예컨대 LFA-1 , Mad , p150.95, VLA-4, ICAM-1 , VCAM, 알파4/베타7 인테그린, 및 알파v/베타3 인테그린 (이의 알파 또는 베타 하부단위 포함 (예를 들면, 항-CD1 1a, 항-CD18 또는 항-CD1 1 b 항체); 성장 인자 예컨대 VEGF-A, VEGF-C; 조직 인자 (TF); 알파 인터페론 (알파lFN); TNF알파, 인터루킨, 예컨대 IL-1 베타, IL-3, IL-4, IL-5, I L-8, I L-9, IL-13, IL17A/F, IL-18, IL-13R알파1 , IL13R알파2, IL-4R, IL-5R, IL-9R, IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; RANKL, RANK, RSV F 단백질, 단백질 C 등, 낮은-밀도 지질단백질 수용체-관련된 단백질 (LRP)-1 또는 LRP-8 또는 트랜스페린 수용체, 및 하기로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 표적: 1 ) 베타-세크레타제 (BACE1 또는 BACE2), 2) 알파- 세크레타제, 3) 감마-세크레타제, 4) 타우-세크레타제, 5) 아밀로이드 전구단백질 (APP), 6) 사멸 수용체 6 (DR6), 7) 아밀로이드 베타 펩티드, 8) 알파-시누클레인, 9) 파킨(Parkin), 10) 헌팅틴, 1 1 ) p75 NTR, 및 12) 카스파제-6.
하기가 이해된다: 항체 (예를 들면, 다중특이적 항체, 예를 들면, 이중특이적 항체)는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 2개의 표적 분자, 예를 들면, 적어도 2개의 표적 분자에 결합할 수 있다: I L-1 알파 및 IL-1 베타, IL-12 및 IL-18; IL-13 및 IL-9; IL-13 및 IL-4; IL-13 및 IL-5; IL-5 및 IL-4; IL-13 및 IL-1 베타; IL-13 및 IL- 25; IL-13 및 TARC; IL-13 및 MDC; IL-13 및 MEF; IL-13 및 TGF-β; IL-13 및 LHR 작용제; IL-12 및 TWEAK, IL-13 및 CL25; IL-13 및 SPRR2a; IL-13 및 SPRR2b; IL-13 및 ADAM8, IL-13 및 PED2, IL17A 및 IL17F, CD3 및 CD19, CD138 및 CD20; CD138 및 CD40; CD19 및 CD20; CD20 및 CD3; CD38 및 CD138; CD38 및 CD20; CD38 및 CD40; CD40 및 CD20; CD-8 및 IL-6; CD20 및 BR3, TNF알파 및 TGF-베타, TNF알파 및 IL-1 베타; TNF알파 및 IL-2, TNF 알파 및 IL-3, TNF알파 및 IL-4, TNF알파 및 IL-5, TNF알파 및 IL6, TNF알파 및 IL8, TNF알파 및 IL-9, TNF알파 및 IL-10, TNF알파 및 IL-1 1 , TNF알파 및 IL-12, TNF알파 및 IL-13, TNF알파 및 IL-14, TNF알파 및 IL-15, TNF알파 및 IL-16, TNF알파 및 IL-17, TNF알파 및 IL-18, TNF알파 및 IL-19, TNF알파 및 IL-20, TNF알파 및 IL-23, TNF알파 및 IFNalpha, TNF알파 및 CD4, TNF알파 및 VEGF, TNF알파 및 MIF, TNF알파 및 ICAM-1 , TNF알파 및 PGE4, TNF알파 및 PEG2, TNF알파 및 RANK 리간드,. TNF알파 및 Te38; TNF알파 및 BAFF; TNF알파 및 CD22; TNF알파 및 CTLA-4; TNF알파 및 GP130; TNFa 및 IL-12p40; VEGF 및 HER2, VEGF-A 및 HER2, VEGF-A 및 PDGF, HER1 및 HER2, VEGF-A 및 VEGF-C, VEGF-C 및 VEGF-D, HER2 및 DR5,VEGF 및 IL-8, VEGF 및 MET, VEGFR 및 MET 수용체, VEGFR 및 EGFR, HER2 및 CD64, HER2 및 CD3, HER2 및 CD16, HER2 및 HER3; EGFR(HERI ) 및 HER2, EGFR 및 HER3, EGFR 및 HER4, IL-13 및 CD40L, IL4 및 CD40L, TNFR1 및 IL-1 R, TNFR1 및 IL-6R 및 TNFR1 및 IL-18R, EpCAM 및 CD3, MAPG 및 CD28, EGFR 및 CD64, CSPGs 및 RGM A; CTLA-4 및 BTN02; IGF1 및 IGF2; IGF1/2 및 Erb2B; MAG 및 RGM A; NgR 및 RGM A; NogoA 및 RGM A; OMGp 및 RGM A; PDL-I 및 CTLA-4; 및 RGM A 및 RGM B.
일부 구현예에서, 상기 표적은 항-VEGF, 항-c-met, 항-IgE, 항-CD11, 항-CD18, 항-CD40, 항-조직 인자 (TF), 항-HER2, 및 항-TrkC 항체이다. 비-폴리펩티드 항원 (예컨대 종양-관련된 당지질 항원)에 대하여 지시된 항체가 또한 고려된다. 본 발명에 의하여 포괄된 항체에 대한 추가의 예시적인 표적은 하기를 포함한다: CD 단백질 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34, 및 CD46; ErbB 수용체 패밀리 구성원 예컨대 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 접합 분자 예컨대 LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, α4/β7 인테그린, 및 αv/β3 인테그린 (이의 α 또는 β 하부단위 포함) (예를 들면 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); 성장 인자 예컨대 VEGF; 조직 인자 (TF); TGF-β, 알파 인터페론 (α-IFN); 인터루킨, 예컨대 IL-8; IgE; 혈액형 항원 Apo2, 사멸 수용체; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C 등. 이중특이적 항체가 본 발명에 의하여 명확히 고려된다.
일 구현예에서, 항체(들), 예컨대 본원의 방법에서 사용된 항체(들)은 하기 섹션 1-6에 기술된 바와 같이, 특징 중 임의의 것, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
1. 항체 단편
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편의 예시는, 비제한적으로 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 및 scFv 단편, 단일-아암(one-armed) 항체 및 하기 기술된 기타 단편을 포함한다. 특정 항체 단편에 대한 고찰을 위하여, 하기를 참조한다: Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). scFv 단편의 고찰을 위하여, 예를 들어 하기를 참조하고:
Figure pct00002
, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); 또는 하기를 참조한다: WO 93/16185; 및 U.S. 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458. 구제 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고, 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 고찰을 위하여, 하기를 참조한다: 미국 특허 번호 5,869,046.
디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어 하기를 참조한다: EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). 트리아바디 및 테트라바디는 또한 하기에 기술된다: Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가면 도메인의 부분 또는 전체, 또는 경쇄 가변 도메인의 부분 또는 전체를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, 하기 참고: 미국 특허 번호 6,248,516 B1).
단일-아암(one-armed) 항체 (즉, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가면 도메인은 단일 항원 결합 아암(arm)을 형성한다)는 예를 들어, 하기에 개시된다: WO2005/063816; Martens et al, Clin Cancer Res (2006), 12: 6144. 길항적 기능을 요구하는, 그리고 항체의 2가가 바람직하지 않은 작용적 효과를 유발하는 병리학적 병태의 치료를 위하여, 단일-아암 항체 (즉, 단일 항원 결합 아암을 포함하는 항체)의 1가 특성은 표적 분자로의 항체의 결합에서 길항적 기능을 유발하고/하거나 보장한다. 더욱이, Fc 영역을 포함하는 단일-아암 항체는, 유사한/실질적으로 동일한 항원 결합 특성을 갖는 Fab 유형과 비교하여, 보다 우월한 약동학적 속성 (예컨대 체내 개선된 반감기 및/또는 감소된 청소율)에 의하여 특징화되어, 이로써 기존 1가 Fab 항체의 사용에 있어 주요 단점을 극복한다. 단일-아암 항체의 제조를 위한 기술은 비제한적으로 하기를 포함한다: "크놉-인-홀(knob-in-hole)" 공학 (예를 들어, 하기 참조: 미국 특허 번호 5,731,168). 오나투주맙은 단일-아암 항체의 예시이다.
항체 단편은, 본원에 기술된 온전한 항체의 단백질분해 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포에 의한 생산 (예컨대 이. 콜라이 또는 파지)를 비제한적으로 포함하는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 이. 콜라이 또는 파지).
2. 키메라 항체 및 인간화 항체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어, 하기에 기술된다: 미국 특허 번호 4,816,567; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). 일 예에서, 키메라성 항체는 비-인간 가변 영역(예를 들면, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이에서 유도된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가 예에서, 키메라성 항체는 부류 또는 하위부류가 친계 항체의 것에서 변화된 "부류 스위칭된" 항체이다. 키메라성 항체에는 이들의 항원-결합 단편이 포함된다.
특정 구현예에서, 키메라 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 친계 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 보유하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들면, CDR(또는 이들의 일부)이 비-인간 항체에서 유도되고, FR(또는 이들의 일부)이 인간 항체 서열에서 유도되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 인간화 항체에서의 일부 FR 잔기는, 예를 들면 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 향상하기 위해 비-인간 항체(예를 들면, HVR 잔기가 유도되는 항체)로부터의 대응 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 이들의 제조 방법은, 예를 들면 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633(2008)]에서 검토되며, 추가로 예를 들면 [Riechmann 등, Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 번호 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (하기를 기술: SDR (a-CDR) 그래프팅); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (describing "resurfacing"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (describing "FR shuffling"); 및 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) and Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링(shuffling)에 대한 "안내된 선택" 접근을 기술함).
인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역에는 비제한적으로 하기: "최적-피팅" 방법을 이용해서 선택된 프레임워크 영역(예를 들면, Sims et al. J. Immunol. 151:2296(1993) 참고); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위그룹의 인간 항체 공통 서열에서 유도된 프레임워크 영역(예를 들면, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623(1993) 참고); 인간 성숙(체세포적으로 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역(예를 들면, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633(2008) 참고); 및 FR 라이브러리 스크리닝에서 유도된 프레임워크 영역(예를 들면, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996) 참고).
3. 인간 항체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해기술에 공지된 다양한 기술을 이용해서 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 하기에 기술된다: van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74(2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).
인간 항체는, 항원 유발접종에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 온전한 인간 항체 또는 온전한 항체를 생산하기 위해 변형된 형질전환 동물에 면역원을 투여하는 단계에 의해 제조될 수 있다. 그와 같은 동물은 전형적으로 내인성 면역글로불린 유전자위를 대체하거나, 염색체외로 존재하거나 동물의 염색체 내로 무작위로 통합된 인간 면역글로불린 유전자위의 전부 또는 일부를 포함한다. 그와 같은 형질전환 마우스에서, 내인성 면역글로불린 유전자위는 일반적으로 불활성화되었다. 형질전환 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 하기를 참조한다: Biotech. 23:1117-1125 (2005). 또한, 예를 들면, 하기를 참조한다: 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (XENOMOUSETM 기술을 기술함); 미국 특허 번호 5,770,429 (HuMab® 기술을 기술함); 미국 특허 번호 7,041,870 (K-M MOUSE® 기술을 기술함), 및 미국 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900, VelociMouse® 기술을 기술함). 그와 같은 동물에 의해 산출된 온전한 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들면 상이한 인간 불변 영역과 조합하여 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 혼성세포-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 단클론성 항체의 생성을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이형골수종 세포주가 기술되었다. (참조: 예를 들면, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) 인간 B-세포 혼성세포 기술을 통해 생성된 인간 항체는 또한 하기에 기술된다: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). 추가 방법은 예를 들어, 하기에 기재된 것들을 포함한다: 미국 특허 번호 7,189,826(혼성세포 세포주로부터의 단클론성 인간 IgM 항체 생성을 기술함) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268(2006)(인간-인간 혼성세포를 기술함). 인간 혼성세포 기술(트리오마(Trioma) 기술)은 또한 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937(2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91(2005)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유도된 파아지 디스플레이 라이브러리에서 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리하여 생성될 수 있다. 이어서 그와 같은 가변 도메인 서열은 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기에 기술된다.
4. 라이브러리-유도된 항체
본 발명의 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들면, 파아지 디스플레이 라이브러리의 산출 및 원하는 결합 특성을 보유하는 항체에 대해 그와 같은 라이브러리의 스크리닝을 위한 다양한 방법이 당해기술에 공지되어 있다. 그러한 방법은 예를 들어, 하기에서 고찰되며: Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001), 추가로 예를 들어, 하기에서 기술된다: the McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).
일부 파아지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자 레퍼토리는 중합체라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝되고 파아지 라이브러리에서 무작위로 재조합되며, 이어서 [Winter 등, Ann. Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455(1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파아지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파아지는 전형적으로 단일-사슬 Fv(scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 항체 단편을 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 혼성세포의 구축을 필요로 하지 않고 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 미접촉 레퍼토리는 [Griffiths 등, EMBO J, 12: 725-734(1993)]에 기재된 바와 같이 임의의 면역화 없이, 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공하기 위해 클로닝될 수 있다(예를 들면, 인간으로부터). 마지막으로, 미접촉 라이브러리는 또한 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388(1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절의 클로닝 및 크게 가변적인 CDR3 영역을 암호화하고 시험관내 재배열을 수행하기 위해 랜덤 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 이용하여 합성적으로 제조될 수 있다. 인간 항체 파아지 라이브러리를 기재하는 특허 공보에는, 예를 들면 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공보 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360가 포함된다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 고려된다.
5. 다중특이적 항체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어, 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 단클론성 항체이다. 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 c-met에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 c-met의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 c-met을 발현하는 세포에 세포독성 제제를 국지화하도록 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체의 제조를 위한 기술은 비제한적으로 하기를 포함한다: 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (참고: Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983), WO 93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), 및 "크놉-인-홀(knob-in-hole)" 공학 (예를 들어, 하기 참조: 미국 특허 번호 5,731,168). 다중-특이적 항체는 하기에 의하여 제조될 수 있다: 항체 Fc-이종이량체 분자의 제조를 위한 정전 스티어링 (electrostatic steering) 효과를 조작함으로써 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교결합함으로써 (참고: 예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); 이중특이적 항체를 생산하기 위하여 류신 지퍼(leucine zipper)를 사용함으로써 (참고: 예를 들어, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 "디아바디" 기술을 사용함으로써 (참고: 예를 들어, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); 그리고 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용함으로써 (참고: 예를 들어, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); 그리고 예를 들어 하기에 기술된 바와 같이, 삼중특이적 항체를 제조함으로써: Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
"옥토푸스(Octopus) 항체"를 포함하는, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함되어 있다 (예를 들어, 참고: US 2006/0025576A1).
본원에서 항체 또는 단편은 또한 c-met 뿐만 아니라 또 다른, 상이한 항원, 예컨대 EGFR과 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용(Dual Acting) FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (예를 들어, 참고: US 2008/0069820).
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 본 분야에 알려져 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 전장 이중특이적 항체의 전통적 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공-발현에 근거하며, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다(Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 집합으로 인하여, 이러한 혼성세포 (4혼성체(quadroma))는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하며, 이중 오직 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 보통 친화도 크로마토그래피 단계에 의하여 수행되는, 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물 산출량은 낮다. 유사한 절차가 하기에 개시된다: WO 93/08829 (1993년 5월 13일 공보됨), 및 Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991).
상이하고 더욱 바람직한 접근에 따라, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 조합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열로 융합된다. 상기 융합은, 바람직하게는, 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 상기 융합 중 적어도 하나에서 존재하는, 경쇄 결합에 대해 필요한 부위를 함유하는, 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합 및, 원할 시 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA는 개별 발현 벡터에 삽입되고, 적절한 숙주 유기체에 공-형질감염된다. 이는, 작제에 사용되는 3개의 폴리펩티드 쇄의 비평형 비율이 최적 산출량을 제공할 경우의 구현예에서, 3개 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어 큰 유연성을 제공한다. 이는, 그러나, 동일 비의 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현이 고수율로 유발되는 경우, 2개 또는 전체 3개 폴리펩티드 사슬에 대한 암호화 서열을 단일 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다.
이러한 접근의 바람직한 구현예에서, 이중특이적 항체는 하나의 아암 내의 제1 결합 특이성을 갖는 혼성체 면역글로불린 중쇄 및 다른 아암 내의 혼성체 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 오직 1/2 내의 면역글로불린 경쇄의 존재가 분리의 용이한 방법을 제공하므로, 이러한 비대칭 구조는 원치않는 면역글로불린 쇄 조합으로부터의 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 촉진하는 것으로 발견되었다. 이러한 접근은 WO 94/04690에 개시된다. 이특이적 항체 생성의 추가적인 세부사항에 대해서는, 예를 들어, 하기를 참조한다: Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
또 다른 접근에 따르면, 항체 분자 페어 간의 계면은 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 이종이량체 백분율을 최대화하기 위해 조작될 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판) (크놉(knob) 또는 돌출부(protuberance))로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 작은 것(예컨대, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체하여 큰 측쇄(들)에 대해 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "공동(cavity)" (홀(hole))이 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종 산물에 비해 이종이량체 수율을 증가시키기 위한 기전을 제공한다. 크놉(knob) 및 홀(hole)은 추가로 본원에 기술된다.
6. 항체 변이체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 이는 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하기 위하여 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로의 적절한 변형을 도임함으로써, 또는 펩티드 합성에 의하여 제조될 수 있다. 그러한 변형은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실, 및/또는 이것으로의 삽입, 및/또는 이의 치환을 포함한다. 결실, 삽입, 치환의 임의의 조합은 최종 작제물을 달성하기 위하여 제조될 수 있으며, 단, 상기 최종 생성물은 원하는 특성, 예컨대 항원-결합을 갖는다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환형 돌연변이생성에 대한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 아미노산 치환은 관심 항체, 및 원하는 활성, 예컨대 보유된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대하여 스크리닝된 생성물로 도입될 수 있다.
치환형 변이체의 일 유형은 친계 항체 (예컨대, 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위하여 선택된 생성된 변이체(들)은 친계 항체와 비교하여 특정 생물학적 특성 (예컨대, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)에서 변형 (예컨대, 개선)을 가지고/가지거나, 친계 항체의 실질적으로 보유된 특정 생물학적 특성을 가질 것이다. 예시적인 치환형 변이체는 친화도 성숙 항체이며, 이는, 예를 들어, 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술, 예컨대 본원에 기술된 것들을 사용하여 용이하게 생성될 수 있다. 간략하게, 하나 이상의 HVR 잔기는 변이되고, 변이체 항체는 파지 상에 디스플레이되고, 특정 생물학적 활성 (예컨대, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
아미노산 서열 삽입은, 길이가 1 잔기 내지 100 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예시는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입형 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드, 또는 효소 (예컨대 ADEPT에 대한)에 대한 항체의 N- 또는 C- 말단에의 융합을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 아미노산 서열을 변경함으로써 용이하게 달성되어, 이로써 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성 또는 제거될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함할 경우, 이에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의하여 생산된 천연 항체는, Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297으로의 N-연결에 의하여 일반적으로 부착된 분지된, 이분지(biantennary) 올리고당을 포함한다. [참조: 예를 들면, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토오스, 및 시알산, 뿐만 아니라 이분지 올리고당 구조의 "줄기" 내에 GlcNAc에 부착된 푸코오스를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 내의 올리고당의 변형은, 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위하여 만들어질 수 있다.
일 구현예에서, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코오스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 그러한 항체 내의 푸코오스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65%, 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코오스의 양은, 예를 들어, WO 2008/077546에 기술된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광계에 의하여 측정 시, Asn 297에 부착된 모든 당구조(glycostructure) (예를 들어, 복합체, 혼성체 및 고 만노스 구조)의 총합과 비교하여, Asn297에서의 당 쇄 내의 푸코오스의 평균 양을 산출함으로써 측정될 수 있다. Asn297는 Fc 영역 내의 약 위치 297에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하며 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링); 그러나 Asn297는, 항체 내의 소수의 서열 변이로 인하여, 위치 297, 즉, 위치 294 및 300 사이의 약 ± 3의 아미노산의 업스트림 또는 다운스트림에서 또한 위치할 수 있다. 그러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 참조: 예를 들면, 미국 특허 공보 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). "탈푸코실화된(afucosylated)" 또는 "푸코오스-결핍의" 항체 변이체에 관한 공보의 예시는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). 탈푸코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예시는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포를 포함한다 (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US Pat Appl No US 2003/0157108 A1, Presta, L; 및 WO 2004/056312 A1, Adams et al., 특히 실시예 11에서), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실전달효소 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 참고: Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107).
항체 변이체는 추가로, 예컨대 항체의 Fc 영역에 부착된 이분지 올리고당이 GlcNAc에 의하여 이등분된, 이등분된 올리고당으로 제공될 수 있다. 그러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 그러한 항체 변이체의 예시는 예를 들어, 하기에 기술된다: WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.). Fc 영역에 부착된 올리고당 내의 적어도 하나의 갈락토오스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 그러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 그러한 항체 변이체가 하기에 기술된다: 예를 들어, WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.).
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어, 이로써 Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예컨대, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 일부의, 그러나 전체가 아닌 효과기 기능을 갖는 항체 변이체를 고려하며, 이는 항체의 체내 반감기가 중요하나, 특정 효과기 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)가 불필요 또는 유해한 적용에 있어 바람직한 후보물이 되도록 한다.
감소된 효과기 기능을 갖는 항체는, Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 그러한 Fc 돌연변이체는 하기를 포함한다: 잔기 265 및 297 내지 알라닌의 치환을 갖는, 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서의 치환을 갖는 Fc 변이체 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcR에 대한 개선 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기술된다. (참조: 예를 들면, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)
특정 구현예에서, 항체 변이체는, ADCC, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서의 치환을 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 변경은 예를 들어 하기에 기술된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 유발하는 Fc 영역 내에서 제조된다: 6,194,551, WO 99/51642, 및 Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
증가된 반감기 및 태아로의 모체 IgG의 이동에 원인으로 작용하는, 신생아 Fc 수용체 (FcRn)로의 개선된 결합을 갖는 항체 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976); 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))이 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기술된다.　이러한 항체는 FcRn로의 Fc 영역의 결합을 개선시키는, 그 안에 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 그러한 Fc 변이체는 하기와 같은 Fc 영역 잔기에서의 치환을 갖는 것들을 포함한다: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434, 예컨대, Fc 잔기 434의 치환 (미국 특허 번호 7,371,826).
또한 하기를 참조한다: Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351 (Fc 영역 변이체의 다른 예시에 관하여).
특정 구현예에서, 이는 시스테인 조작된 항체, 예컨대 "티오MAb(thioMAb)" (항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환됨)을 생성하는데 바람직할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 발생한다. 그러한 잔기의 시스테인으로의 치환에 의하여, 반응성 티올 기는 이로써 항체의 접근가능한 부위에 위치하고, 본원에 추가로 기술된 바와 같이, 면역콘주게이트를 생성하기 위하여, 약물 모이어티, 또는 링커-약물 모이어티와 같은 다른 모이어티에 항체를 콘주게이트하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 임의의 하나 이상의 하기 잔기는 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카밧 넘버링); 중쇄의A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는 하기에 기술된 바와 같이 생성될 수 있다: 예를 들어, 미국 특허 번호 7,521,541.
홀(hole) 내의 크놉(knob)
다중특이적 항체 및/또는 단일-아암 항체 및/또는 면역접합체를 생산하는 방법으로서의 홀 내의 크놉의 용도는 본 분야에 잘 알려져 있다. 참고: 미국 특허 번호 5,731,168 (Genentech에 1998년 3월 24일 등록), PCT 공보 번호 WO2009089004 (2009년 7월 16에 공보되고, Amgen에 배정), 및 미국 특허 공보 번호 20090182127 (2009년 7월 16일에 공보되고, Novo Nordisk A/S에 배정). 또한 하기 참조: Marvin and Zhu, Acta Pharmacologica Sincia (2005) 26(6):649-658 및 Kontermann (2005) Acta Pharacol. Sin., 26:1-9. 간단한 고찰이 본원에 제공된다.
"돌출부"는 제1 폴리펩티드의 계면으로부터 돌출되고, 따라서 이종이량체를 안정화시키기 위하여, 인접 계면 (즉, 제2 폴리펩티드의 계면) 내의 보충적 공동 내에 위치가능하고, 그리고 이로써 이종다량체 형성을, 예를 들어 동종다량체의 형성보다 용이하게 하는 적어도 하나의 아미노산 측쇄를 지칭한다. 돌출부는 본래의 계면에 존재할 수 있거나 합성적으로(예를 들어, 계면을 암호화하는 핵산을 변화시킴에 의해) 도입될 수 있다. 정상적으로, 제1 폴리펩티드의 계면을 암호화하는 핵산은 돌출부(protuberance)을 암호화하도록 변형된다. 이를 성취하기 위해, 제1 폴리펩티드의 계면에서 적어도 하나의 "본래의" 아미노산 잔기를 암호화하는 핵산은 본래의 아미노산 잔기보다 큰 측쇄 용적을 갖는 적어도 하나의 "유입(import) 아미노산 잔기"를 암호화하는 핵산으로 대체된다. 하나 이상의 본래 및 상응하는 유입 잔기일 수 있음을 인지할 것이다. 대체되는 본래의 잔기들의 수에 대한 상한치는 제1 폴리펩티드의 계면에서 잔기들의 총수이다. 다양한 아미노산 잔기의 측쇄 용적은 하기 표 에 나타난다.
표 B
아미노산 잔기의 특성
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a 아미노스 분자량에서 물의 분자량을 감함. 하기로부터의 값: Handbook of Chemistry and Physics, 43rd ed. Cleveland, Chemical Rubber Publishing Co., 1961.
b 하기로부터의 값: A.A. Zamyatnin, Prog . Biophys . Mol . Biol . 24:107-123, 1972.
c 하기로부터의 값: C. Chothia, J. Mol . Biol . 105:1-14, 1975. 접근가능한 표면적은 이 참조문헌의 도 6 내지 20에서 정의된다.
돌출부를 형성하기 위한 바람직한 유입 잔기는 일반적으로 천연 발생 아미노산 잔기이고 바람직하게 아르기닌(R), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y) 및 트립토판 (W)으로부터 선택된다. 가장 바람직한 것은 트립토판 및 티로신이다. 일 구현예에서, 돌출부의 형성에 대한 본래 잔기는 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글리신, 세린, 트레오닌, 또는 발린과 같이 작은 측쇄 용적을 갖는다. 돌출부를 형성하기 위한 CH3 도메인 내의 예시적인 아미노산 치환은 비제한적으로 T366W 치환을 포함한다.
"공동(cavity)"은 제2 폴리펩티드의 계면으로부터 오목하고, 따라서 제1 폴리펩티드의 인접한 계면 상에 상응하는 돌출부 ("크놉")을 수용하는 적어도 하나의 아미노산 측쇄를 지칭한다. 공동은 본래의 계면에 존재할 수 있거나 합성적으로(예를 들어, 계면을 암호화하는 핵산을 변화시킴에 의해) 도입될 수 있다. 정상적으로, 제2 폴리펩티드의 계면을 암호화하는 핵산은 공동(cavity)을 암호화하도록 변형된다. 이를 성취하기 위해, 제2 폴리펩티드의 계면에서 적어도 하나의 "본래의" 아미노산 잔기를 암호화하는 핵산은 본래의 아미노산 잔기보다 작은 측쇄 용적을 갖는 적어도 하나의 "유입(import) 아미노산 잔기"를 암호화하는 DNA로 대체된다. 하나 이상의 본래 및 상응하는 유입 잔기일 수 있음을 인지할 것이다. 대체되는 본래의 잔기들의 수에 대한 상한치는 제2 폴리펩티드의 계면에서 잔기들의 총수이다. 다양한 아미노산 잔기의 측쇄 용적은 상기 표 B에 나타난다. 공동을 형성하기 위한 바람직한 유입 잔기는 일반적으로 천연 아미노산 잔기이고 바람직하게 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 및 발린(V)으로부터 선택된다. 가장 바람직한 것은 세린, 알라닌 또는 트레오닌이다. 일 구현예에서, 공동의 형성에 대한 본래 잔기는 티로신, 아르기닌, 페닐알라닌 또는 트립토판과 같이 큰 측쇄 용적을 갖는다. 공동을 형성하기 위한 CH3 도메인 내의 예시적인 아미노산 치환은 비제한적으로 T366S, L368A 및 Y407A 치환을 포함한다.
"본래의" 아미노산 잔기는 본래의 잔기보다 작거나 큰 측쇄 용적을 가질 수 있는 "유입" 잔기에 의해 대체되는 잔기이다. 유입 아미노산 잔기는 천연적으로 존재하거나 비천연적으로 존재하는 아미노산 잔기일 수 있고 바람직하게는 전자이다. "천연 발생" 아미노산 잔기는 유전적 코드에 의하여 암호화되고, 상기 표 B에서 열거된, 그러한 잔기이다. "비천연적으로 존재하는" 아미노산 잔기란 유전자 코드에 의해 암호화되지 않지만 폴리펩티드 쇄에서 인접한 아미노산 잔기(들)을 공유적으로 결합할 수 있는 잔기를 의미한다. 비천연적으로 존재하는 아미노산 잔기의 예는 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린, 및 예를 들어,하기 문헌에 기재된 것들과 같은 다른 아미노산 잔기 유사체이다: 예를 들어, Ellman et al., Meth . Enzym . 202:301-336 (1991). 상기 비천연적으로 존재하는 아미노산 잔기를 생성하기 위해, 문헌[참조: Noren et al. Science 244: 182 (1989) 및 Ellman et al., 상기]의 절차를 사용할 수 있다. 간략하게, 이것은 비천연적으로 존재하는 아미노산 잔기로 서프레서 tRNA를 화학적으로 활성화시키고 이어서 RNA의 시험관내 전사 및 해독을 포함한다. 본 발명의 방법은 적어도 하나의 본래의 아미노산 잔기를 대체함을 포함하지만 1 초과의 본래의 잔기는 대체될 수 있다. 일반적으로, 제1 또는 제2 폴리펩티드의 계면에서 총수 이하의 잔기는 대체된 본래의 아미노산 잔기를 포함한다. 전형적으로, 대체를 위한 본래의 잔기는 "묻혀(buried)"있다. "묻혀"있는 이란 잔기가 근본적으로 용매에 접근불가능한 것임을 의미한다. 일반적으로, 유입 잔기는 이황화 결합의 가능한 산화 또는 잘못된 쌍형성을 막기 위해 시스테인이 아니다.
상기 돌출부는 공동에 "위치할 수 있고" 이것은 각각 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 계면 상에 돌출부 및 공동의 공간적 위치가 상기 돌출부가 계면에서 제1 및 제2 폴리펩티드의 정상적 연합을 상당히 교란시키는 것 없이 공동에 위치할 수 있도록 함을 의미한다. Tyr, Phe 및 Trp와 같은 돌출부는 전형적으로 계면의 축으로부터 직각으로 연장하지 않고 바람직한 형태를 갖기 때문에, 상응하는 공동과 돌출부의 배열은 X선 결정학 또는 핵 자기 공명(NMR)에 의해 수득된 것과 같은 3차원 구조를 기준으로 돌출부/공동 쌍을 모델링하는 것에 의존한다. 이는 본 분야에서 널리 수용된 기술을 사용하여 달성될 수 있다.
"본래의 핵산"이란 돌출부 또는 공동을 암호화하도록 "변형된"(즉, 유전학적으로 가공되거나 돌연변이된) 것일 수 있는 관심 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 의미한다. 본래의 또는 개시 핵산은 천연적으로 존재하는 핵산일 수 있거나 사전 변형된 핵산(예를 들어, 인간화된 항체 단편)을 포함할 수 있다. 핵산을 "변형"시키는 것이란 본래의 핵산이 관심 아미노산 잔기를 암호화하는 적어도 하나의 코돈을 삽입하거나, 결실시키거나 대체함에 의해 돌연변이됨을 의미한다. 일반적으로, 본래의 잔기를 암호화하는 코돈은 유입 잔기를 암호화하는 코돈에 의해 대체된다. DNA를 이러한 방식으로 유전학적으로 변형시키기 위한 기술은 하기에 검토되었고: Mutagenesis : a Practical Approach, M.J. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, UK. (1991), 예를 들어, 부위-지향적 돌연변이생성, 카세트 돌연변이유발 및 중합체라제 쇄 반응(PCR) 돌연변이유발을 포함한다. 본래/주형 핵산을 변이시킴으로써, 본래/주형 핵산에 의하여 암호화된 본래/주형 폴리펩티드는 이에 따라 상응하여 변경된다.
돌출부 또는 공동은 합성 수단에 의해, 예를 들어, 재조합 기술, 시험관내 펩티드 합성, 이전에 기재된 비천연적으로 발생하는 아미노산 잔기들을 도입하기 위한 기술, 펩티드의 효소적 또는 화학적 커플링에 의하여, 또는 이들 기술의 일부 조합에 의해 제1 및 제2 폴리펩티드의 계면으로 "도입"될 수 있다. 따라서, "도입된" 돌출부 또는 공동은 "비천연적으로 존재하거나", "비천연"이고, 이는 이것이 천연적으로 또는 본래의 폴리펩티드(예를 들어, 인간화된 단클론성 항체)에 존재하지 않음을 의미한다.
일반적으로, 돌출부를 형성하기 위한 유입 아미노산 잔기들은 비교적 소수의 "로타머(rotamer)"(예를 들어, 약 3-6)를 갖는다. "로타머"는 아미노산 측쇄의 에너지학적으로 우호적인 형태이다. 다양한 아미노산 잔기에 대한 로타머의 수는 하기 문헌에서 검토된다: Ponders and Richards, J. Mol. Biol. 193: 775-791 (1987).
일 구현예에서, 제1 Fc 폴리펩티드 및 제2 Fc 폴리펩티드는 계면에서 계합/상호작용한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드가 계면에서 계합할 때, 제2 Fc 폴리펩티드 (서열)의 계면은 돌출부 (또한 "크놉"이라고 불림)을 포함하고, 이는 제1 Fc 폴리펩티드 (서열)의 계면 내에서 공동 (또한 "홀"이라고 불림) 내에서 위치가능하다. 일 구현예에서, 제1 Fc 폴리펩티드는 공동을 암호화하기 위하여 주형/본래 폴리펩티드로부터 변경되거나, 제2 Fc 폴리펩티드는 돌출부, 또는 둘 다를 암호화하기 위하여 주형/본래 폴리펩티드로부터 변경된다. 일 구현예에서, 제1 Fc 폴리펩티드는 공동을 암호화하기 위하여 주형/본래 폴리펩티드로부터 변경되고, 제2 Fc 폴리펩티드는 돌출부를 암호화하기 위하여 주형/본래 폴리펩티드로부터 변경된다. 일 구현예에서, 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드의 계면은, 제1 Fc 폴리펩티드의 계면 내 공동에서 위치가능한 돌출부를 포함하고, 공동 또는 돌출부, 또는 둘 다는 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드 각각의 계면으로 도입된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드가 계면에서 계합할 때, 제1 Fc 폴리펩티드 (서열)의 계면은 돌출부를 포함하고, 이는 제2 Fc 폴리펩티드 (서열)의 계면 내에서 공동 내에서 위치가능하다. 일 구현예에서, 제2 Fc 폴리펩티드는 공동을 암호화하기 위하여 주형/본래 폴리펩티드로부터 변경되거나, 제1 Fc 폴리펩티드는 돌출부, 또는 둘 다를 암호화하기 위하여 주형/본래 폴리펩티드로부터 변경된다. 일 구현예에서, 제2 Fc 폴리펩티드는 공동을 암호화하기 위하여 주형/본래 폴리펩티드로부터 변경되고, 제1 Fc 폴리펩티드는 돌출부를 암호화하기 위하여 주형/본래 폴리펩티드로부터 변경된다. 일 구현예에서, 제1 Fc 폴리펩티드의 계면은, 제2 Fc 폴리펩티드의 계면 내의 공동 에서 위치가능한 돌출부를 포함하고, 공동 또는 돌출부, 또는 둘 다는 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드 각각의 계면으로 도입된다.
일 구현예에서, 돌출부 및 공동은 각각 천연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 일 구현예에서, 돌출부를 포함하는 Fc 폴리펩티드는 주형/본래 폴리펩티드의 계면으로부터의 본래 잔기를, 본래 잔기보다 더 큰 측쇄 용적을 갖는 유입 잔기로 대체함으로서 생성된다. 일 구현예에서, 돌출부를 포함하는 Fc 폴리펩티드는, 상기 폴리펩티드의 계면으로부터의 본래 잔기를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 본래 보다 더 큰 측쇄 용적을 갖는 유입 잔기를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 대체되는 단계를 포함하는 방법에 의하여 생성된다. 일 구현예에서, 본래 잔기는 트레오닌이다. 일 구현예에서, 본래 잔기는 T366이다. 일 구현예에서, 유입 잔기는 아르기닌 (R)이다. 일 구현예에서, 유입 잔기는 페닐알라닌 (F)이다. 일 구현예에서, 유입 잔기는 티로신 (Y)이다. 일 구현예에서, 유입 잔기는 트립토판 (W)이다. 일 구현예에서, 유입 잔기는 R, F, Y 또는 W이다. 일 구현예에서, 돌출부는 주형/본래 폴리펩티드 내의 2개 이상의 잔기를 대체함으로써 생성된다. 일 구현예에서, 돌출부를 포함하는 Fc 폴리펩티드는 위치 366에서 트레오닌의 트립토판으로의 대체를 포함하며, 이는 하기의 EU 넘버링에 따른 아미노산 넘버링에 따른다: Kabat et al. (pp. 688-696 in Sequences of proteins of immunological interest, 5th ed., Vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, MD)).
일부 구현예에서, 공동 포함하는 Fc 폴리펩티드는 주형/본래 폴리펩티드의 계면으로부터의 본래 잔기를, 본래 잔기보다 더 작은 측쇄 용적을 갖는 유입 잔기로 대체함으로서 생성된다. 예를 들어, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는, 상기 폴리펩티드의 계면으로부터의 본래 잔기를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 본래 보다 더 작은 측쇄 용적을 갖는 유입 잔기를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 대체되는 단계를 포함하는 방법에 의하여 생성된다. 일 구현예에서, 본래 잔기는 트레오닌이다. 일 구현예에서, 본래 잔기는 류신이다. 일 구현예에서, 본래 잔기는 티로신이다. 일 구현예에서, 유입 잔기는 시스테인 (C)이 아니다. 일 구현예에서, 유입 잔기는 알라닌 (A)이다. 일 구현예에서, 유입 잔기는 세린 (S)이다. 일 구현예에서, 유입 잔기는 트레오닌 (T)이다. 일 구현예에서, 유입 잔기는 발린 (V)이다. 공동은 주형/본래 폴리펩티드의 하나 이상의 본래 잔기를 대체함으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 트레오닌, 류신, 및 티로신으로 구성된 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 본래 아미노산의 대체를 포함한다. 일 구현예에서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 알라닌, 세린, 트레오닌, 및 발린으로 구성된 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 유입 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 트레오닌, 류신, 및 티로신으로 구성된 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 본래 아미노산의 대체를 포함하고, 상기 본래 아미노산은 알라닌, 세린, 트레오닌, 및 발린으로 구성된 그룹으로부터 선택된 유입 잔기로 대체된다. 일부 구현예에서, 대체된 본래 아미노산은 T366, L368 및/또는 Y407이다. 일 구현예에서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 위치 366에서 트레오닌의 세린으로의 대체를 포함하며, 이는 다음의 EU 넘버링에 따른 아미노산 넘버링에 따른다: Kabat et al. 상기. 일 구현예에서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 위치 368에서 류신의 알라닌으로의 대체를 포함하며, 이는 다음의 EU 넘버링에 따른 아미노산 넘버링에 따른다: Kabat et al. 상기. 일 구현예에서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 위치 407에서 티로신의 발린으로의 대체를 포함하며, 이는 다음의 EU 넘버링에 따른 아미노산 넘버링에 따른다: Kabat et al. 상기. 일 구현예에서, 공동을 포함하는 Fc 폴리펩티드는 T366S, L368A 및 Y407V으로 구성된 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 아미노산 대체를 포함하며, 이는 다음의 EU 넘버링에 따른 아미노산 넘버링에 따른다: Kabat et al. 상기. 이러한 항체 단편의 일부 구현예에서, 돌출부를 포함하는 Fc 폴리펩티드는 위치 366에서 트레오닌의 트립토판으로의 대체를 포함하며, 이는 하기의 EU 넘버링에 따른 아미노산 넘버링에 따른다: Kabat et al. 상기.
일 구현예에서, 항체는, WO2005/063816에서 기술된 바와 같이, "크놉" 및 "홀"을 구성하는 Fc 변이를 포함한다. 예를 들어, 홀 변이는 Fc 폴리펩티드 내의 T366A, L368A 및/또는 Y407V 중 하나 이상일 수 있으며, 크놉 변이는 T366W일 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 항체는 추가로 변형되어 본 분야에서 알려지고 용이하게 이용가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 할 수 있다. 항체의 유도에 적절한 모이어티는 수용성 중합체를 비제한적으로 포함한다. 수용성 중합체의 비제한적인 예시는 하기를 포함한다: 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/폴리프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체) 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥실에틸화된 폴리올 (예컨대, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이의 혼합물. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 이의 수안정성으로 인하여 제조상의 장점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량의 것일 수 있고, 분지 또는 비분지될 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 달라질 수 있으며, 만약 1 초과의 중합체가 부착되면, 그들은 동일하거나 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 하기를 비제한적으로 포함하는 고려에 기반하여 결정될 수 있다: 개선될 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 정의된 조건 하의 요법에서 사용될 것인지의 여부 등.
또 다른 구현예에서, 방사선 노출에 의하여 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티 및 항체의 콘주게이트가 제공된다. 일 구현예에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사선선은 임의의 파장일 수 있고, 비제한적으로, 본래 세포를 저해하지 않으나, 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포가 사멸되는 온도로 비단백질성 모이어티가 가열되는 파장을 포함한다.
일 구현예에서, 약제는, 하나 이상의 세포독성 제제, 예컨대 화학치료제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원 (이의 단편 및/또는 변이체 포함)의 효소적활성 독소), 또는 방사성 동위원소에 콘주게이트되는 항체 (예컨대 c-met 항체)를 포함하는 면역콘주게이트이다.
일 구현예에서, 면역콘주게이트는, 항체가 비제한적으로 하기를 포함하는 하나 이상의 약물과 콘주게이트되는, 항체-약물 콘주게이트 (ADC)이다: 메이탄시노이드 (참고: 미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1); 오리스타틴 예컨대 모노메틸오리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (참고: 미국 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588, 및 7,498,298); 돌라스타틴(dolastatin); 칼리키아마이신 또는 이의 유도체 (참고: 미국 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 및 5,877,296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); and Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); 안트라사이클린 다우노마이신 및 독소루비신 (참고: Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); 및 U.S. 특허 번호 6,630,579); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065.
또 다른 구현예에서, 면역콘주게이트 효소적으로 활성인 독소 또는 이의 단편에 콘주게이트된 본원에 기술된 바와 같은 항체를 포함하고, 이는 비제한적으로 하기를 포함한다: 디프테리아 A 독소, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 에어루기노사 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모덱신 A 사슬, 알파-사르신, 알류라이테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 저해제, 젤로닌, 마이토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코티신.
또 다른 구현예에서, 면역콘주게이트는 방사콘주게이트를 형성하기 위하여 방사성 원자와 콘주게이트된, 본원에 기술된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사콘주게이트의 생산을 위하여 이용가능하다. 예시는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사콘주게이트가 검출에 사용될 경우, 이는 섬광계수법 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들면 tc99m 또는 I123, 또는 핵자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상, mri로도 알려짐)를 위한 스핀 표지, 예컨대 요오드-123, 또한 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성 약물의 콘주게이트는 다양한 이작용성 단백질 커플링제 예컨대 하기를 이용하여 제조될 수 있다: N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디석신이미딜 우베레이트), 알데하이드 (예컨대 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디나이트로벤젠). 예를 들어, 리신 면역독소는 하기에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다: Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체로의 방사뉴클레오티드(radionucleotide)의 콘주게이션을 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO94/11026를 참조한다. 링커는 세포 내 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정한 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광-불안정 링커, 디메틸 링커 또는 이황화물-함유 링커 (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); 미국 특허 번호 5,208,020)가 사용될 수 있다.
본원에서 면역콘주게이트 또는 ADC, 비제한적으로 하기를 포함하는 가교-결합제 시약으로 제조되는 그러한 콘주게이트가 비제한적으로 명확히 고려된다: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB (석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트) (상업적으로 이용가능함 (예를 들면, 하기로부터: Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A)).
벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
이형 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)의 재조합 생산을 위하여, 이것을 암호화하는 핵산은 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위하여 복제가능한 벡터로 단리 및 삽입된다. 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)를 암호화하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 용이하게 단리 및 서열분석될 수 있다 (예컨대, 항원 결합 작제물의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써). 많은 벡터들이 이용가능하다. 벡터의 선택은 부분적으로 사용될 숙주 세포에 따라 달라진다. 일반적으로, 바람직한 숙주 세포는 원핵생물 기원의 것이다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE를 포함하는, 임의의 이소형의 불변 영역이, 이러한 목적을 이용하여 사용될 수 있고, 그러한 불변 영역이 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
a. 원핵생물 숙주 세포를 사용한 항체 생성
i. 벡터 작제
본 발명의 폴리펩티드 (예컨대, 항체)의 폴리펩티드 성분을 암호화하는 폴리펩티드 서열이 표준 재조합 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 원하는 폴리뉴클레오티드 서열은 항체 생성 세포, 예컨대 혼성세포로부터 단리 및 서열분석될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 합성기 또는 PCR 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 일단 수득되면, 폴리펩티드를 암호화하는 서열은, 원핵생물 숙주 내 이형 폴리뉴클레오티드를 복제 및 발현할 수 있는 재조합 벡터에 삽입된다. 이용가능하고 본 분야에 알려진 많은 벡터가 본 발명의 목적을 위하여 사용될 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 벡터에 삽입될 핵산의 크기 및 벡터로 변형될 특정 숙주세포에 따라 달라질 것이다. 각 벡터는 이의 기능 (이형 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 다) 및 이것이 상주하는 특정 숙주 세포와의 호환성에 따라 다양한 성분을 함유한다. 벡터 성분은 일반적으로, 비제한적으로 하기를 포함한다: 복제 기점, 선택 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위 (RBS), 신호 서열, 이형 핵산 삽입체 및 전사 종결 서열.
일반적으로, 숙주 세포와 호환가능한 종으로부터 유래된 복제단위 및 조절 서열을 함유하는 플라스미드 벡터는 이러한 숙주와 연결되어 사용된다. 이러한 벡터는 본래, 복제 부위, 뿐만 아니라 변형된 세포 내 표현형 선택이 가능한 마킹(marking) 서열을 수반한다. 예를 들어, 이. 콜라이는 전형적으로 pBR322, 이. 콜라이 종으로부터 유래된 플라스미드를 사용하여 변형된다. pBR322는 암피실린 (Amp) 및 테트라사이클린 (Tet)을 내성을 암호화하는 유전자를 함유하며, 따라서 변형된 세포를 동정하기 위한 용이한 수단을 제공한다. pBR322, 이의 유도체, 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파지는 또한, 내인성 단백질의 발현을 위하여 미생물 유기체에 의하여 사용될 수 있는 프로모터를 또한 함유하거나, 함유하도록 변형될 수 이다. 특정 항체의 발현을 위하여 사용된 pBR322 유도체의 예시는 하기에 자세히 기술된다: Carter et al., 미국 특허 번호 5,648,237.
또한, 숙주 미생물과 호환가능한 복제단위 및 조절서열을 함유하는 파지 벡터는 이러한 숙주와 연결되어 변형 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 박테리오파지, 예컨대 λGEM.TM.-11는 재조합 벡터의 제조에서 사용될 수 있으며, 이는 민감한 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 LE392를 변형시키기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 폴리펩티드 성분 각각을 암호화하는 2개 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있다. 프로모터는 이의 발현을 조절하는 시스트론에 업스트림 (5')에 위치한 비번역된 조절 서열이다. 원핵생물 프로모터는 전형적으로 2개 부류, 유도가능한 부류 및 구성적 부류로 분류된다. 유도가능한 프로모터는 배양 조건, 예를 들면, 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도의 변화에서 일부 변화에 반응하여 이들의 조절하에 시스트론의 증가된 전사 수준을 개시하는 프로모터이다.
다양한 잠재적 숙주 세포로 인식된 다수의 프로모터는 익히 공지되어 있다. 선택된 프로모터는, 제한 효소 소화를 통한 공급원 DNA로부터의 프로모터를 제거함으로써, 그리고 본 발명의 벡터로 단리된 프로모터 서열을 삽입함으로써 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 시스트론 DNA로 작동가능하게 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 많은 이형 프로모더 둘 다는 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시하기 위하여 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이형 프로모터가 이용되며, 이는 그들이 일반적으로, 천연 표적 폴리펩티드 프로모터와 비교하여, 발현된 표적 유전자의 보다 큰 전사 및 보다 높은 수율을 허용하기 때문이다.
원핵생물 숙주와 함께 사용되기에 적절한 프로모터는, PhoA 프로모터, β-락타마제 및 락토오스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터, 및 혼성체 프로모터 예컨대 tac 또는 trc 프로모터를 포함한다. 그러나, 박테리아 (예컨대 기타 알려진 박테리아 또는 파지 프로모터) 내의 기능적인 다른 프로모터 또한 적절하다. 이들의 뉴클레오티드 서열은 공표되었으며, 이로써 숙련가가 작동가능하게 이들을 표적 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 시스트론과 결찰시킬 수 있도록 하였다 (Siebenlist et al., (1980) Cell 20: 269) (임의의 요구되는 제한 부위를 공급하는 링커 또는 어댑터를 사용하여).
번역 개시 영역 (TIR)은 단백질의 전체 번역 수준의 주요 결정인자이다. TIR은 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 샤인-달가르노 서열의 업스트림으로부터 바로 개시 코돈의 다운스트림에서의 대략 20개의 뉴클레오티드로 연신된다. 일반적으로, 벡터는 TIR을 포함할 것이고, TIR 및 변이체 TIR은 본 분야에 알려져 있고, TIR을 생성하기 위한 방법은 본 분야에 알려져 있다 일련의 핵산 서열 변이체는 일정 범위의 번역 강도로 생성되어, 이로써 많은 상이한 폴리펩티드의 최적 분비를 위하여 이러한 인자를 조정하는 용이한 수단을 제공할 수 있다. 이러한 변이체, 예컨대 PhoA에 융합된 리포터 유전자의 사용은, 상이한 번역 개시 영역의 상대적 번역 강도를 정량화하는 방법을 제공한다. 변이체 또는 돌연변이체 TIR은 플라스미드 벡터의 배경에서 제공되어, 이로써, 성숙 폴리펩티드의 최대 발현을 위하여 최적 범위의 번역 강도를 수립하기 위하여 관심 유전자가 삽입되고, 이의 발현이 측정되는 플라스미드 세트를 제공할 수 있다. 변이체 TIR은 USP 8,241,901에 개시된다.
본 발명의 일 측면에서, 재조합 벡터 내의 각 시스트론은 막에 걸쳐 발현된 폴리펩티드의 전좌를 지시하는 분비 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 이는 벡터 내로 삽입되는 표적 폴리펩티드 DNA의 부분일 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여 선택된 신호 서열은 숙주 세포에 의하여 인식 및 점유 (즉, 신호 펩티다제에 의하여 절단된) 것일 것이다. 이형 폴리펩티드에 천연인 신호 서열을 인식하고 점유하지 못하는 원핵생물 숙주 세포에 대하여, 신호 서열은 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드로부터 선택된 원핵생물 신호 서열에 의하여 치환된다. 또한, 벡터는 알칼라인 알칼리포스파타제, 페니실린, Lpp, 또는 열-안정 엔테로톡신 II (STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA, 및 MBP로부터 선택된 신호 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 발현 벡터)는 총체적으로 항체를 암호화한다. 일 구현예에서, 단일 폴리뉴클레오티드는 항체의 경쇄를 암호화하고, 개별 폴리뉴클레오티드는 항체의 중쇄를 암호화한다. 일 구현예에서, 단일 폴리뉴클레오티드는 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 발현 벡터)는 총체적으로 단일-아암 항체를 암호화한다. 일 구현예에서, 단일 폴리뉴클레오티드는 (a) 단일-아암(one-armed) 항체의 경쇄 및 중쇄, 및 (b) Fc 폴리펩티드를 암호화한다. 일 구현예에서, 단일 폴리뉴클레오티드는 단일-아암(one-armed) 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하고, 개별 폴리뉴클레오티드는 Fc 폴리펩티드를 암호화한다. 일 구현예에서, 개별 폴리뉴클레오티드는 단일-아암(one-armed) 항체의 경쇄 성분, 단일-아암 항체의 중쇄 성분 및 Fc 폴리펩티드를 각각 암호화한다. 단일-아암(one-armed) 항체의 생산은 예를 들어, WO2005063816에 기술된다.
본 발명의 항체를 발현하기에 적절한 원핵생물 숙주세포는 고세균(Archaebacteria) 및 진정세균(Eubacteria), 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체를 포함한다. 유용한 박테리아의 예시는 하기를 포함한다: 에세리키아(Escherichia) (예컨대 이. 콜라이), 바킬루스(Bacilli) (예컨대 B. 서브틸리스), 엔테로박테리아(Enterobacteria), 슈도모나스(Pseudomonas) 종 (예컨대 P. 에어루기노사), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium ), 세라티아 마르세스캔스 ( Serratia marcescans, 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 쉬겔라(Shigella), 리조비아(Rhizobia), 비트레오실라(Vitreoscilla), 또는 파라코커스(Paracoccus). 일 구현예에서, 그람-음성 세포가 사용된다. 일 구현예에서, 이. 콜라이 세포는 본 발명을 위한 숙주로서 사용된다. 이 . 콜라이 균주의 예시는 균주 W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC 수탁 번호 27,325) 및 이의 유도체를 포함한다 (유전자형 W3110 △fhuA (△tonA) ptr3 lac Iq lacL8 △ompT△(nmpc-fepE) degP41 kanR (미국 특허 번호 5,639,635)를 갖는 균주33D3 및 균주 63C1, 66F8 및 64B4를 포함). 다른 균주 또는 이의 유도체, 예컨대 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 B, 이. 콜라이λ 1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 RV308(ATCC 31,608)가 또한 적절하다. 이러한 실시예는 제한적이기보다 예시적이다. 정의된 유전자형을 갖는 상기-언급된 박테리아 중 임의의 것의 유도체를 작제하는 방법은 본 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 하기에 기술된다: Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990). 일반적으로, 박테리아의 세포 내 복제 단위의 복제를 고려한 적절한 박테리아를 선택하는 것이 필요하다. 예를 들어, 이. 콜라이 세라티아(Serratia) 또는 살모넬라(Salmonella) 종은, 잘 알려진 플라스미드, 예컨대 pBR322, pBR325, pACYC177, 또는 pKN410이 복제단위를 공급하는데 사용될 경우, 숙주 세포로 적절하게 사용될 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 단백질분해 효소의 최소량을 분비할 것이며, 추가의 프로테아제 억제제는 세포 배양물로 바람직하게 편입될 수 있다.
ii. 항체 생산
숙주 세포는 상기 기술된 발현 벡터로 변형되고, 프로모터를 유도하거나, 변형체를 선택하거나, 또는 원하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭하는데 적절한 것으로서 변형된 기존 영양 배지 내에서 배양된다.
변형은 DNA를 원핵생물 숙주에 도입하여, 이로써 DNA가 염색체외 요소로서, 또는 염색체 구성성분에 의하여 복제가능하도록 하는 것을 의미한다. 사용된 숙주 세포에 따라서, 변형은 그러한 세포에 적절한 표준 기술을 사용하여 완료된다. 염화칼슘을 채용한 칼슘 처리는 일반적으로 실질적인 세포-벽 장벽을 함유한 박테리아 세포에 사용된다. 변형을 위한 또 다른 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 채용한다. 사용된 또 다른 기술은 전기천공이다.
본 발명의 폴리펩티드를 생산하는데 사용되는 원핵생물 세포는 본 분야에 알려지고 선택된 숙주 세포의 배양에 적절한 배지에서 성장한다. 적절한 배이의 예시는 루리아(Luria) 브로쓰 (LB)에 더하여 필수적인 영양 보충물을 포함한다. 일부 구현예에서, 배지는, 발현 벡터를 함유하는 원핵생물 세포의 성장을 선택적으로 허용하는, 발현 벡터의 작제를 기반으로 선택된, 선택 제제를 또한 함유한다. 예를 들어, 암피실린은 암피실린 내성 유전자를 발현하는 세포의 성장을 위한 배지에 첨가된다.
탄소, 질소, 및 무기 포스페이트 공급원을 제외한 임의의 필요한 보충물이 단독으로, 또는 다른 보충물 또는 배지 예컨대 복합 질소 공급원과의 혼합물로서 도입된 적절한 농도로 또한 포함될 수 있다. 임의로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 환원제를 함유한다.
원핵생물 숙주 세포는 적절한 온도에서 배양된다. 이 . 콜라이 성장을 위하여, 예를 들어, 바람직한 온도는 하기 범위이다: 약 20°C 내지 약 39°C, 더욱 바람직하게는 약 25°C 내지 약 37°C, 더 더욱 바람직하게는 약 30°C. 배지의 pH는, 주로 숙주 유기체에 따라서, 약 5 내지 약 9 범위인 임의의 pH일 수 있다. 이 . 콜라이에 대하여, pH는 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7.4이고, 더욱 바람직하게는 약 7.0이다.
유도가능한 프로모터가 본 발명의 발현 벡터로 사용될 경우, 단백질 발현은 프로모터의 활성화에 적절한 조건 하에서 유도된다. 본 발명의 일 양태에서, PhoA 프로모터는 폴리펩티드의 전사를 조절하게 위하여 사용된다. 따라서, 변형된 숙주 세포는 유도를 위하여 포스페이트-제한 배지에서 배양된다. 바람직하게는, 포스페이트-제한 배지는 C.R.A.P 배지 (예컨대, 참고: Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147) 또는 WO2002/061090에 기술된 배지이다. 본 분야에 알려진 바와 같이, 채용된 벡터 작제물에 따라, 다양한 유도제가 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 발현된 폴리펩티드는 숙주 세포의 주변세포질로 분비되고 회수된다. 단백질 회수는 전형적으로, 삼투압 충격법, 음파처리 또는 용해와 같은 수단에 의하여 미생물을 교란하는 것을 포함한다. 일단 세포가 교란되면, 세포 파편 또는 전체 세포는 원심분리 또는 여과에 의하여 제거될 수 있다. 단백질은 예를 들어, 친화도 수지 크로마토그래피에 의하여 추가로 정제될 수 있다. 대안적으로, 단백질은 배양 배지에 이동되고, 그 안에 단리될 수 있다. 세포는 생산된 단백질의 추가의 정제를 위하여 여과되고 농축된 배양물 및 배양 상청액으로부터 제거될 수 있다. 발현된 폴리펩티드는, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 및 웨스턴 블랏 검정과 같은 통상적으로 알려진 방법을 사용하여 추가로 단리 및 동정될 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 항체 생산은 발효 과정에 의하여 다량으로 수행된다. 다양한 대규모 공급-뱃치(공급-뱃치) 발료 절차는 재조합 단백질의 생산을 위하여 이용가능하다. 대규모 발효는 적어도 1000 리터의 용량, 바람직하게는 약 1,000 내지 100,000 리터의 용량을 갖는다. 이러한 발효기는 산소 및 영양분, 특히 글루코스 (바람직한 탄소/에너지 공급원)를 분배하기 위하여 교반기 임펠러를 사용한다. 소규모 발효는 일반적으로, 용적 용량이 대략 100 리터 미만이고, 약 1 리터 내지 약 100 리터 범위일 수 있는 발효기 내에서의 발효를 지칭한다.
발효 과정에서, 단백질 발현의 유도는 전형적으로, 세포가 초기 고정 상 단계에 있는, 원하는 밀도, 예컨대 약 180-220의 OD550의 적절한 조건 하에서 성장한 후 개시된다. 본 분야에 알려지고 상기 기술된 바와 같이, 채용된 벡터 작제물에 따라, 다양한 유도제가 사용될 수 있다. 세포는 유도 전에 보다 짧은 기간 동안 재배할 수 있다. 세포는 일반적으로 약 12-50 시간 동안 유도되나, 보다 길거나 짧은 유도 시간이 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 생산 수율 및 품질을 개선하기 위하여, 다양한 발효 조건이 변형될 수 있다. 예를 들어, 분비된 항체 폴리펩티드의 적절한 조립 및 접힘을 개선하기 위하여, 샤프론 단백질, 예컨대 Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD, 및/또는 DsbG) 또는 FkpA (샤프론 활성을 갖는 펩티딜프롤일 시스, 트랜스-이성질화효소)을 과발현하는, 추가의 벡터가 숙주 원핵생물 세포를 공-변형시키기 위하여 사용될 수 있다. 샤프론 단백질은, 박테리아 숙주 세포 내 생산된 이형 단백질의 적절한 접힘 및 용해성을 촉진하기 위한 것으로 예증되었다. Chen et al., (1999) J. Biol. Chem. 274:19601-19605; Georgiou et al., 미국 특허 번호 6,083,715; Georgiou et al., 미국 특허 번호 6,027,888; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm and Pluckthun, (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al., (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210. 일부 구현예에서, DsbA 및 C는 박테리아 숙주 세포 내에서 발현 (예를 들어, 과-발현)된다. 일부 구현예에서, DsbA, DsbC 및 FkpA는 박테리아 숙주 세포 내에서 발현 (예를 들어, 과-발현)된다.
발현된 이형 단백질 (특히 단백질분해적으로 민감한 것들)의 단백질분해를 최소화하기 위하여, 단백질분해 효소가 결핍된 특정 숙주 균주가 본 발명을 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 숙주세포 균주는 알려진 박테리아 프로테아제, 예컨대 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI, 및 이의 조합을 암호화하는 유전자 내에서 유전자 변이(들)을 초래하도록 변형될 수 있다. 일부 이.콜라이 프로테아제-결핍 균주는 예를 들어, 하기에서 기술되며 이용가능하다: Joly et al., (1998), 상기; Georgiou et al., 미국 특허 번호 5,264,365; Georgiou et al., 미국 특허 번호 5,508,192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).
일 구현예에서, 단백질가수분해 효소가 결핍되고, 하나이상의 샤프론 단백질 및/또는 FkpA를 과발현하는 플라스미드로 변형된 이. 콜라이 균주가 본 발명의 발현계에서 숙주 세포로서 사용된다.
iii. 항체 정제
본 분야에서의 표준 단백질 정제 방법이 채용될 수 있다. 하기 절차는 적절한 정제 절차에 대한 예시이다: 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, DEAE와 같은 양이온-교환 수지 상의 또는 실리카 상의 크로마토그래피, 크로마토초점맞춤, SDS-PAGE, 황산암모늄 적정 및 예를 들어, 세파덱스(Sephadex) G-75를 사용한 겔 적정.
일 양태에서, 고체 상에 고정화된 단백질 A는 본 발명의 항체 생성물의 면역친화성 정제를 위하여 사용된다. 단백질 A는 항체의 Fc 영역으로 고친화성으로 결합하는 스타필로코커스 아우레아스 (Staphylococcus aureas )로부터 유래된 41kD 세포벽 단백질이다. Lindmark et al., (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. 단백질 A가 고정화되는 고체 상은, 바람직하게는 유리 또는 실리카 표면을 포함하는 칼럼이고, 더욱 바람직하게는 조절된 공극 유리 칼럼 또는 규산 칼럼이다. 일부 적용에서, 칼럼을 오염물의 비특이적 부착을 예방하기 위한 시도로서 글리세롤과 같은 시약으로 코팅하였다.
정제의 제1 단계로서, 상기 기술된 세포 배양물로부터 유래된 제조물을 단백질 A 고정화된 고체 상에 적용하여 단백질 A로의 관심 항체의 특이적 결합이 가능하도록 하였다, 이러한 고체 상을 이후 세정하여 고체 상과 비-특이적으로 결합된 오염물을 제거하였다. 최종적으로, 관심 항체는 용출에 의하여 고체 상으로부터 회수된다.
본 발명은 또한, "면역콘주게이트(immunoconjugate)" ("항체-약물 콘주게이트" 또는 "ADC"와 상호교환가능하게 지칭됨)는 예를 들어, 세포독성 제제, 예컨대 화학치료제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원 (이의 단편 및/또는 변이체 포함)의 효소적활성 독소), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사콘주게이트(radioconjugate))에 콘주게이트된 본원에 기술된 임의의 항체를 의미한다.
용도
이형 폴리펩티드는 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 방법을 비롯하여 그것이 인식하는 특정 폴리펩티드를 예를 들면 정제, 검출 및 표적화하는 데 사용될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 항체는 생물학적 시료내 특정 항원을 정성적 및 정량적으로 측정하기 위한 면역분석에 사용될 수 있다. 항원-항체 결합을 검출하기 위한 종래 방법은 예를 들면 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 방사성 면역분석법(RIA) 또는 면역조직화학법을 포함한다. 많은 방법이 검출 목적을 위해 항체에 결합된 표지를 사용할 수 있다. 항체와 함께 사용되는 표지는 항체의 결합을 방해하지 않는 임의의 검출가능한 작용기이다. 다양한 표지가 알려져 있으며, 예를 들면, 방사성 동위원소 32P, 32S, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광체 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시퍼라제 예컨대 반딧불 루시퍼라제 및 박테리아성 루시퍼라제(미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진다이온, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 예컨대 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, 헤테로사이클릭 옥시다제 예컨대 본 우리카제 및 잔틴 옥시다제, 락토퍼옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼, 조영 방사성핵종(예컨대 테크네튬) 등을 포함한다.
종래 방법은 이들 표지를 이형 폴리펩티드에 공유 결합시킬 수 있다. 예를 들면, 디알데히드, 카보디이미드, 디말레이미드, 비스-이미데이트, 비스-디아조화 벤지딘 등과 같은 커플링제를 상술한 형광체, 화학 발광체 및 효소 표지로 항체를 태깅하는 데 사용할 수 있다. 예를 들면, US 3,940,475(형광측정기) 및 US 3,645,090(효소); 문헌[Hunter et al. Nature 144: 945 (1962)]; 문헌[David et al. Biochemistry 13:1014-1021 (1974)]; 문헌[Pain et al. J. Immunol . Methods 40:219-230 (1981)]; 및 문헌[Nygren Histochem . and Cytochem 30:407-412 (1982)] 참조. 본원에서 바람직한 표지는 양고추냉이 퍼옥시다제 및 알칼리포스파타제와 같은 효소이다. 효소와 같은 표지과 항체 폴리펩티드의 접합은 면역분석 기법 분야의 당업자에게는 표준 조작 과정이다. 예를 들면, 문헌[O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay," in Methods in Enzymology, ed. J. J. Langone and H. Van Vunakis, Vol. 73 (Academic Press, New York, N.Y., 1981), pp. 147-166] 참조. 이러한 접합 방법은 본 발명의 이형 폴리펩티드와 함께 사용하기에 적합하다.
이형 폴리펩티드를 표지화하는 것에 대한 대안으로, 검출가능한 물질로 표지된 항원 표준시료와 비-표지된 이형 폴리펩티드의 경쟁을 이용하여 경쟁 면역분석법에 의해 생물학적 유체에서 항원을 분석할 수도 있다. 이 분석에서는, 생물학적 샘플, 표지된 항원 표준시료 및 이형 폴리펩티드를 결합시키고, 비-표지된 이형 폴리펩티드에 결합된 표지된 표준시료의 양을 결정한다. 생물학적 샘플에서의 시험 항원의 양은 이형 폴리펩티드에 결합된 표지된 항원 표준시료의 양에 반비례한다.
일 양태에서, 이형 폴리펩티드(예컨대 항체)는 시험관내 또는 생체내 특정 표면 항원의 발현을 검출하고 프로파일링하는 데 특히 유용하다. 앞서 논의된 바와 같이, 일반적으로, 아글리코실화된 항체는 효과기(effector) 기능(즉, ADCC 또는 CDC 활성)을 나타내지 않는다. 따라서, 항체가 세포 표면 항원에 결합하는 경우, 불필요한 세포독성 환경을 개시하지 않을 것이다. 표면 항원은 특정 세포 또는 조직 유형에 특이적일 수 있으며, 따라서 세포 또는 조직 유형의 마커(marker)로서 작용할 수 있다. 바람직하게는, 표면 항원 마커는 특정 세포 또는 조직 유형의 다양한 분화 단계에서 차등적으로 발현된다. 따라서, 이러한 표면 항원을 지향하는 항체는 상기 마커를 발현하는 세포 또는 조직 집단의 선별을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포와 같은 줄기 세포의 선별 및 단리를 위해 사용될 수 있다. 항체는 또한 종양-관련 표면 항원 예컨대 c-met, HER2, HER3 또는 HER4 수용체를 발현하는 종양 세포를 검출하는 데 사용될 수 있다.
항체 또는 다른 이형 폴리펩티드는 친화성 정제제로 사용될 수 있다. 이 과정에서, 폴리펩티드는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 고체 상 예컨대 세파덱스 수지 또는 필터 페이퍼 상에 고정화된다. 고정화된 폴리펩티드를 정제할 항원을 함유하는 샘플과 접촉시키고, 그 후 지지체를, 고정화된 폴리펩티드에 결합된 정제할 항원을 제외한 샘플내 모든 물질을 실질적으로 제거하는 적합한 용매로 세척한다. 최종적으로, 폴리펩티드로부터 항원을 방출시키는 다른 적합한 용매 예컨대 글리신 완충액(pH 5.0)으로 상기 지지체를 세척한다.
일 양태에서, 본 발명은 암, 종양, 세포 증식성 장애 및/또는 면역(예컨대, 자가 면역) 장애와 같은 질환의 치료 및/또는 예방적 치료를 위한 약제의 제조에서 본 발명의 방법을 사용하여 생성된 이형 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 이형 폴리펩티드는 항체, 항체 단편, 폴리펩티드(예컨대, 올리고펩티드) 또는 이들의 조합을 비롯하여 본원에 기술된 임의의 형태의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 인간 단백질 분자이고, 대상체는 인간이다.
폴리펩티드는, 악성 및 양성 종양; 비-백혈병 및 림프 악성 종양; 신경세포, 교세포, 성상세포, 시상하부 및 기타 선세포, 대식세포, 상피세포, 간질 및 포배강 장애; 및 염증성 혈관신생 및 면역 장애를 포함하나 이들로 국한되지 않는 질환, 장애 또는 하나 이상의 항원 분자의 비정상적 발현 및/또는 활성과 관련된 증상을 진단, 치료, 억제 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 단백질(예컨대, 항체)이 대상체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 항체를 포함하는 면역콘주게이트가 대상체에게 투여된다. 바람직하게는, 결합되는 면역콘주게이트 및/또는 항원은 세포에 내장되어 있다.
이형 폴리펩티드는 단독으로 또는 다른 치료 조성물과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 이형 폴리펩티드 항체, 화학 요법제(화학 요법제의 칵테일을 포함함), 다른 세포독성제, 항-혈관신생제, 사이토킨 및/또는 성장 억제제와 공동 투여될 수 있다. 이형 폴리펩티드가 종양 성장을 억제하는 경우, 종양 성장을 억제하는 하나 이상의 다른 치료제와 이형 폴리펩티드를 결합하는 것이 특히 바람직할 수 있다. 다르게는 또는 부가적으로, 환자는 조합된 방사선 치료(예컨대, 항체와 같은 방사성 표지 제제와 함께 외부 빔 조사 또는 치료)를 받을 수 있다. 위에 언급된 이러한 조합 치료는 조합 투여(둘 이상의 제제가 동일하거나 별개의 제형에 포함됨) 및 분리 투여를 포함하며, 이 경우, 항체의 투여는 보조 치료제의 투여 전 및/또는 그 후에 이루어질 수 있다.
이형 폴리펩티드(및 임의적으로 보조 치료제)는 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비강, 및 병변 관리를 위해 필요한 경우, 병변내 투여 등을 비롯한 임의의 적절한 수단에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 항체는 특히 항체의 감소하는 투여량에 의한 펄스 주입(pulse infusion)에 의해 적절하게 투여된다. 바람직하게는, 상기 투여는 부분적으로 상기 투여가 간단한 것인지 또는 만성적인 것인지에 따라 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공된다.
이형 폴리펩티드는 괜찮은 의료 관행에 부합되는 방식으로 제형화되고 투약되고 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려할 인자는 특정 치료 장애, 특정 치료 포유동물, 개별 환자의 이상 상태, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정 및 기타 의료 실무자에게 알려져 있는 인자들을 포함한다. 항체는 문제의 장애를 예방하거나 치료하는 데 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 함께 제형화될 필요는 없지만 임의적으로 이들과 함께 제형화된다. 이러한 다른 제제의 유효량은 제형에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형 및 기타 상기 논의된 인자들에 의존한다. 이들은 일반적으로 본원에 앞서 사용된 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로 사용되거나 또는 지금까지 사용된 용량의 약 1 내지 99%로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 항체의 적합한 투여량은 (단독으로 또는 화학 요법제와 같은 다른 제제와 병용하여 사용되는 경우) 치료 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는 것인지 여부, 종전 치료, 환자의 병력 및 항체에 대한 반응, 및 주치의의 재량 여부 등에 의존하게 된다. 항체는 적합하게는 한 번에 또는 일련의 치료를 통해 환자에게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg(예컨대, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 항체가, 예를 들면, 하나 이상의 개별 투여에 의한 것인지 또는 연속 주사에 의한 것인지에 따라, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 증상에 따라 몇 일 또는 그 이상에 걸쳐 반복 투여하는 경우, 치료는 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 지속된다. 항체의 바람직한 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 ㎎/kg의 범위에 있을 것이다. 초기에는 보다 높은 투여량을 적재한 후에 하나 이상의 보다 낮은 투여량을 투여할 수 있다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수도 있다. 이러한 치료의 진행은 통상적인 기술 및 분석에 의해 용이하게 모니터링된다.
제조 물품
본 발명의 또 다른 구현예에서, 전술한 장애의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 용기 상에 위치하거나 용기와 관련된 표지 또는 패키지 삽입체를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들면 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 증상의 치료에 효과적인 조성물을 보유하며 멸균 액세스 포트를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 상기 조성물 중에 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체이다. 표지 또는 패키지 삽입체는 조성물이 암과 같은 선택 증상의 치료에 사용됨을 나타낸다. 또한, 제조 물품은 (a) 항체를 포함하는 조성물이 함유된 제 1 용기; 및 (b) 추가적인 세포독성제를 포함하는 조성물이 함유된 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 구현예에서 제조 물품은 상기 제 1 및 제 2 항체 조성물이 암을 치료하는 데 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입체를 추가로 포함할 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 제조 물품은 또한 예를 들면 정균성 주사용수(BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액과 같은 약학적으로 허용가능한 완충액을 포함하는 제 2(또는 제 3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 기타 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 비롯하여 상업적인 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수도 있다.
하기 실시예는 본 발명의 실시를 단지 예시하기 위한 것일 뿐 제한하는 것으로 제공되지 않는다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 원용된다.
실시예
물질 및 방법
균주 및 플라스미드. 본 연구에 사용된 균주 및 플라스미드를 표 1에 나열하였다. 중쇄-전용 발현 벡터를 구성하기 위해, 전장 항체 발현 벡터를 SpeI 및 NsiI(뉴 잉글랜드 바이오랩스(Biolabs))로 분해하였다. 신호 펩티드 서열 및 중쇄 서열을 포함하는 생성된 단편을 절단 경쇄 단편(122-237), 중쇄 서열에 융합된 phoA 프로모터 및 람다 t0 전사 종결인자를 포함하는 pBR322-유래 클로닝 벡터의 SpeI와 NsiI 부위에 클로닝하였다. ακLc 항체로 탐지되는 웨스턴 블랏 분석은 경쇄가 중쇄-전용 벡터로 표현되지 않음을 확인하였다. 번역 강도 측정을 위한 PhoA 리포터 플라스미드를 구성하기 위해, 관심 신호 펩티드 변이체를 정규 PCR 또는 스플라이싱 오버랩 확장(SOE) PCR을 통해 phoA 유전자에 융합시켰다. 생성 단편을 pPhoA51의 SpeI 및 NotI(뉴 잉글랜드 바이오랩스) 부위로 클로닝하였다[1]. 신호 펩티드 서열에서의 부위-특이적 변이는 퀵체인지 부위-지향적 돌연변이생성 키트(QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit)(스트라타진(Stratagene))에 의해 도입하였다.
[표 1] 본 연구에 사용된 균주 및 플라스미드
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박테리아 성장. 박테리아를 지시된 바와 같은 37℃ 또는 30℃에서 배플 진탕 플라스크(baffled shake flask) 내의 라우리아-베리타니(Lauria-Bertani)(LB) 또는 전체 C.R.A.P. 배지에서 성장시켰다(문헌[Simmons et al ., Journal of immunological methods, 2002]). 항생제는 다음의 농도로 첨가하였다: 카르베니실린 50 μg/ml, 테트라사이클린 20 μg/ml. 단백질 발현을 유도하기 위해, 전장 항체 발현 벡터 또는 중쇄-전용 발현 벡터를 보유하는 숙주 균주 64B4을 20 μL/mL 테트라시클린 및 5 mM의 인산나트륨 pH 7로 보충되고 30℃에서 밤새 진탕 항온처리시킨 5 mL의 LB에 접종하였다. 0.5 mL의 밤새 배양물을 25 mL의 전체 C.R.A.P. 포스페이트-제한 배지에 접종하고[2], 박테리아를 24시간 동안 진탕하면서 30℃에서 성장시켰다. 종료점 배양물의 광학 밀도는 550 nm에서 측정하였다. 박테리아 샘플을 웨스턴 블랏 분석 또는 N-말단 서열분석을 위해 수집하였다.
번역 강도 측정. 신호 펩티드 변이체의 번역 강도는 이전 공보로부터 채택된 알칼리포스파타제 분석에 의해 측정하였다[1,3]. PhoA 리포터 벡터를 수용하는 균주 27C7을 5 mL의 선택적 LB에 접종하고 밤새 진탕하면서 30℃에서 성장시켰다. 밤새 배양물을 5 mL의 선택적 LB 내로 100배 희석하고, 또 다른 4시간 동안 진탕하면서 30℃에서 항온처리하였다. 박테리아를 파장 600 nm에서 1 OD로 정규화하고 펠렛화했다. 펠렛을 즉시 1 mL 정밀한 AP 배지에 현탁시키고(문헌[Simmons et al., Nature Biotechnology, 1996]), -20℃에서 밤새 저장하였다. 다음 날, 박테리아를 해동시키고 적어도 1시간 동안 37℃에서 진탕하면서 20 μL의 톨루엔과 함께 항온처리하였다. 이어서, 40 μL의 각각의 샘플을 1 mM-니트로페닐 포스페이트 이나트륨 염 6수화물(PNPP, 시그마-알드리치)을 함유하는 1 mL의 1M 트리스-HCL pH 8에 가하고, 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 이어서, 100 μL의 1 M 인산나트륨 pH 6.5를 가해 상기 반응을 정지시켰다. 200 μL의 각각의 샘플을 즉시 96 웰 플레이트의 웰에 옮기고 OD410을 플레이트 판독기(몰레큘러 테크놀로지스(Molecular Technologies))로 측정하였다. 상대적 번역 강도는 각 샘플의 A410에서 27C7/pBR322(빈 벡터)의 A410을 뺀 다음 그 수를 27C7/pPhoA86의 A410로 나누어 계산하였다. pPhoA86의 상대적 TIR 강도를 1로 정의하였다.
항체 추출 및 웨스턴 블랏 분석. 진탕 플라스크 배양물로부터 종료점 샘플을 수집하였다. 전체 중쇄 수준을 측정하기 위해, 박테리아를 550 nm에서 1 OD로 정규화하고, 3분 동안 4℃에서 16,000 ×g로 원심분리하여 수확하였다. 펠렛을 0.2 M 디티오트레이톨(DTT, 시그마)과 함께 200 μL의 트리신 완충액에 재현탁하고 5분 동안 95℃에서 가열하여 이황화 결합을 분열시키고 단백질을 변성시켰다.
박테리아로부터 수용성 단백질을 추출하기 위해, 전체 세포 배양물을 차가운 용해 완충액(10 mM 트리스, pH 6.8, 5 mM EDTA, 0.2 ㎎/mL 리소자임 및 5 mM 요오도아세트산) 내로 3의 최종 OD550으로 희석시키고 10분 동안 얼음 위에서 항온처리하였다. 이어서, 샘플을 10 × 1초-펄스로 2회 초음파 처리하고, 4℃ 및 16,000 ×g로 15분 동안 원심분리하였다. 상등액을 조심스럽게 회수하였다. 100 μL의 상등액을 100 μL의 트리신 완충액과 혼합하고, 5분 동안 95℃에서 비등시켰다.
주변세포질 단백질을 기재된 바와 같이 추출하였다[4,5]. 간략하게, 10 OD550 세포를 20분 동안 4℃ 및 3000 ×g로 원심분리하여 수거하였다. 펠렛을 1개 정제의 프로테아제 억제제 칵테일(로슈)과 함께 1 mL의 차가운 TBS 완충액(200 mM 트리스, pH 8.0, 0.5 mM 수크로즈, 1 mM EDTA)에서 부드럽게 재현탁하였다. 샘플을 30분 동안 빙상에서 항온처리하고 30분 동안 16,000 ×g 및 4℃에서 원심분리하였다. 상등액을 조심스럽게 회수하였다. 100 μL의 상등액을 0.2 M DTT와 함께 100 μL의 트리신 완충액과 혼합하고 5분 동안 95℃에서 가열하였다.
DTT 유무에 관계없이 트리신 완충액 중의 단백질 샘플을 10% 비스-트리스 SDS-PAGE 겔(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))에 로딩하고 전기영동으로 분리하였다. 동일한 양의 총 단백질이 로딩되었는지 확인하기 위해, 1 OD 용해물을 갖는 겔을 쿠마시(Coomassie) 블루로 염색하였다. 비-염색된 겔 내의 단백질을 CAPS 완충액(10 mM N-사이클로헥실-3-아미노프로판설폰산, 3% 메탄올, pH 11)과 함께 아이블롯(iBlot) 반-건조 전송(라이프 테크놀로지스) 또는 습식 전송(바이오라드(Biorad))에 의해 셀룰로오스 막(바이오라드)으로 전송했다. 중쇄-함유 종을 HRP 접합된 염소 항-인간 Fc 2차 항체(피어스(Pierce))로 탐침하였다. 경쇄-함유 종은 HRP 접합된 염소 항-인간 kLc 항체(베틸 래보로토리스(Bethyl Laboratories))로 탐침하였다. 면역 블롯 상의 표적 단백질을 증강 화학발광(지이 헬스케어(GE Healthcare))에 의해 검출하였다.
중쇄의 N-말단의 에드만(Edman) 서열분석. 진탕 플라스크 배양물로부터의 종료점 샘플을 1 OD550로 정규화하고, 3분 동안 16,000 xg에서 원심분리로 수확하였다. 펠렛을 0.2 M DTT와 함께 200 μL의 트리신 완충액에 재현탁시키고 5분 동안 95℃에서 가열하였다. 단백질은 8% 또는 10% 비스-트리스 에스디에스-페이지(SDS-PAGE) 겔(라이프 테크놀로지스) 상에서 전기영동에 의해 분리하였다. 빈 pBR322 벡터를 보유하는 64B4로부터의 1 OD550 또는 4 OD550의 세포 용해물을 또한 대조군으로서 로딩하였다. 전기영동 후, 단백질을 CAPS 완충액 중에서 습식 전송(바이오라드)에 의해 PVDF 막으로 옮겼다. 막 상의 약 49 kDa에서 중쇄 대역을 잘라내고 어플라이드 바이오시스템즈 프로사이즈 시퀀서 모델(Applied Biosystems Procise Sequencer Model) 494HT를 사용하여 에드만 서열분석에 의해 분석하였다. 전구체에 대한 성숙한 중쇄의 비율은 피크 강도에 기초하여 산정하였다. 반-정량화를 위해, 각 아미노산의 피코몰 값을 보정 전의 페닐티오하이단티온 아미노산 표준시료에 대한 서열분석 프로그램 SEQX에 의해 계산하였다(문헌[Henzel et al., Journal of Chromatography, 1987]). 평균 10 사이클을 사용하여 반복적인 수율을 도시하여 선형 회귀를 계산하고, 크고 작은 서열의 초기 수율을 상기 도시된 라인의 y-절편으로 정의하였다. 중쇄 가공 효율을 분비된 중쇄의 비율(성숙한 중쇄의 초기 수율/(전구체의 초기 수율 + 성숙한 중쇄의 초기 수율))로서 계산하였다.
투과 전자 현미경(TEM). 진탕 플라스크 배양물로부터의 종료점 샘플을 먼저 변형 카르노프스키(Karnovsky)의 고정액(0.1 M 나트륨 카코딜레이트 완충액, pH 7.2 중의 2% 파라폼알데히드 및 2.5% 글루타르알데히드)에 고정한 다음, 1시간 동안 1% 수성 오스뮴 테트록사이드(이엠 사이언스(EM Science), 펜실베니아주 하트필드)에 후-고정시키고, 이어서 40C에서 0.5% 우라닐 아세테이트 중에서 밤새 항온처리하였다. 이어서, 일련의 에탄올 농도(50%, 70%, 90%, 100%)를 통해 탈수한 다음, 프로필렌 옥사이드(각 단계는 15 분이었음)로 탈수하고, 에포네이트(Eponate) 12(테드 펠라(Ted Pella), 캘리포니아주 레딩)에 장입시켰다. 초박 절편(80 nm)을 울트라컷(Ultracut) 마이크로톰(microtome)(라이카(Leica))으로 절단하고, 0.2% 납 시트레이트로 염색하고, 120 kV에서 JEOL JEM-1400 투과 전자 현미경(TEM)으로 검사하였다. 디지털 이미지를 가탄 울트라스캔(GATAN Ultrascan) 1000 CCD 카메라로 촬영했다.
면역금 전자 현미경(immunoEM). 면역금 EM 실험에서, 샘플을 동결절편화를 위해 제조하였다. 동결절편화를 위해, 세포들을 포스페이트 완충액(0.1 M; pH 7.2) 중의 0.1% 글루타르알데히드와 함께 4% 파라포름알데히드에 고정시키고, PBS로 수회 세척하고, 12% 젤라틴에 장입시키고, 4℃에서 밤새 2.3 M 수크로오스에 침투시켰다. 이어서, 샘플을 (액체 질소가 공급된) 동결절편화 챔버에서 냉동시킨 초저온-초박절단(cryo-ultramicrotomy)용 핀에 장착하였다. 초박 동결절편(100 nm)을 동결절편화 챔버가 구비된 울트라마이크로톰(울트라컷; 라이카)을 사용하여 -80℃에서 다이아몬드 나이프(다이아톰(Diatome))로 제조하였다. 해동 동결절편을 2.3 M 수크로즈를 적하하면서 폼바르(Formvar)- 및 탄소-코팅된 EM 그리드(니켈(Nickel))로 옮기고 면역표지시키고(하기 참조) 실온에서 1분 동안 2% 메틸셀룰로오스 중의 0.5% 우라닐아세테이트로 EM에 대해 대조염색하였다.
면역금 표지화의 경우: 그리드 상의 해동된 동결절편을 30분 동안 차단제(오리온 인코포레이티드(Aurion Inc))로 차단하고, 실온에서 45분 동안 HRP-접합된 염소 항-인간 Fc 항체(피어스)와 함께 항온처리한 후, 30분 동안 염소 항-HRP 금-접합된 항체(잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))와 항온처리하였다. 이어서, 절편을 상술한 바와 같이 대조염색하였다. 면역금-표지된 절편을 120 kV에서 JEOL JEM-1400 투과 전자 현미경(TEM)으로 시각화하고 관찰하였다. 디지털 이미지를 가탄(GATAN) 울트라스캔(Ultrascan) 1000 CCD 카메라로 촬영했다.
결과 및 고찰
이. 콜라이 중의 항체(예컨대, 전장 항체)의 제조는 세포질로부터 주변세포질로 항체 중쇄 및 경쇄를 분비함으로써 달성될 수 있다[2]. 상기 분비는 중쇄 및 경쇄의 N-말단에 융합되어 있는 이. 콜라이 신호 펩티드에 의해 매개된다. 주변세포질의 산화 환경 및 효소는 중쇄 및 경쇄의 항체 내로의 조립을 용이하게 한다. 고 수준의 이형 단백질(예컨대, 항체)의 제조를 위한 수단으로서 주변세포질 분비의 사용은 자주 발생하는 몇몇 문제에 의해 제한될 수 있다. 첫째, 관심 단백질(예컨대, 항체)의 분비 효율이 낮을 수 있다. 둘째, 많은 경우에 전구체는 성숙한 단백질로 불완전하게 처리된다. 셋째, 과-발현 이형 단백질은 종종 부적절하게 접히거나 불용성 봉입체 내로 응집되거나 또는 이. 콜라이 프로테아제에 의해 단백질 분해된다. 넷째, 항체는 2개의 상이한 폴리펩티드(중쇄(HC) 및 경쇄(LC))로 제조되는 복잡한 다량체 단백질로서, 이는 주변세포질로 유출된 다음 제대로 접혀서 적절한 이황화 결합을 형성해야 한다. 이러한 단백질 접힘과 분비의 복잡성은 이. 콜라이에서의 항체 제조의 문제점을 더한다.
TIR 최적화가 보다 효율적으로 분비된 단백질을 생성하기에 유용한 것으로 나타났지만, 다른 접근은 통상적으로 이. 콜라이에서의 이형 단백질의 분비를 개선시키지 않는 것으로 나타났다. 예를 들어, 신호 단백질의 최적화는 주변 세포질 공간 내로의 재조합 시클로덱스트린 탄수화물분해효소(CGTase)의 분비를 감소시키는 것으로 나타났다(문헌[Jonet et al J Mol Microbiol Biotechnol (2012); 22:48-58]).
신호 펩티드의 두 양태는 주변세포질내 단백질 축적에 영향을 준다: 번역 강도 및 전좌 효율. 번역 개시 영역(TIR)은 단백질의 전체 번역 수준의 주요 결정 인자이다. TIR은 신호 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 샤인-델가노(Shine-Delgarno) 서열의 바로 업스트림로부터 개시 코돈의 약 20개 뉴클레오티드 다운스트림까지 연장된다. 이 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은 번역 개시의 효율을 변화시켜 다운스트림 단백질의 번역 수준을 조정할 수 있다. 돌연변이 신호 펩티드 서열의 영향을 조사하는 종래 연구는 일반적으로 핵산 서열의 변화에 의한 TIR 강도의 잠재적인 영향에 대해 조절하지 않았다; 그러나, 본 발명자들의 이전 연구에서는, 전체 항체 생산을 유도하기 위한 서로 다른 신호 펩티드의 사용은 TIR 강도를 조절하면서 검사하였다. 약 1의 상대적 TIR 강도에서, 중쇄에 대한 DsbA 신호 펩티드의 융합은 일반적으로 STII, MalE 또는 PhoA의 신호 펩티드(경쇄 신호 펩티드는 각 연구에서 STII이었음)의 융합보다 더 높은 수준의 전장 항체 생산을 초래하였다(도 1a 참조). 본 연구에서, 본 발명자들은 DsbA 신호 펩티드가 테스트되는 다른 신호 펩티드보다 더 소수성인 것으로 가정하고, 본 발명자들은 상기 신호 펩티드의 소수성이 주변세포질 및 전장 항체 생산을 위한 중쇄 전좌에 중요하다는 것을 증명하였다.
신호 펩티드는 항체 중쇄의 주변세포질 축적 및 가공에 영향을 미쳤다. 본 발명자들은 주변세포질내 중쇄 축적에 대한 신호 펩티드 변이체의 영향을 조사하였다. 모든 변이체에서, 상대적 TIR 강도를 약 1로 하여 전사 강도에 대한 신호 펩티드의 소수성 변화에 있을 수 있는 영향을 조절하도록 하였다. 종래 연구는 일반적으로 변형된 신호 펩티드의 번역 강도를 조절하지 못했다. 본 연구에서와 같이 주의 깊게 조절되지 않으면, 신호 펩티드의 소수성 조절은 TIR의 번역 강도를 가능하게는 (예컨대, TIR 폴리뉴클레오티드 서열의 변화를 통해) 변화될 수 있다. TIR의 번역 강도의 변화는 분비 효율과 단백질 생산 수준에 영향을 줄 수 있다.
항체 5D5 중쇄의 N-말단을 STII 신호 펩티드(bSTII1), DsbA 신호 펩티드(bDsbA1), MalE 신호 펩티드(bMalE1) 또는 PhoA 신호 펩티드(bPhoA1)(이들은 각각 유사한 번역 수준을 가짐)에 융합시켰다(표 3). 각각의 경우에, 항체 5D5 경쇄를 동일한 STII 신호 펩티드(mSTII1)에 융합시켰다. 중쇄 및 경쇄의 발현은 진탕 플라스크 배양물 내의 포스페이트 제한시 유도되었다. 주변세포질 단백질 추출물을 삼투압 충격법 및 원심 분리에 의해 단리하였다. 상등액의 웨스턴 블랏 분석은, DsbA의 신호 펩티드의 사용이 STII, MalE 또는 PhoA 신호 펩티드의 사용보다 현저히 높은 수준의 가용성 주변세포질 중쇄를 생성하였다는 것을 나타냈다 (도 1b). bMalE1 및 bPhoA1의 TIR 강도가 bSTII1 및 bDsbA1보다 높기 때문에, 높은 TIR이 비효율적인 분비를 일으킬 수 있는 가능성을 배제하기 위해, 본 발명자들은 bSTII1 및 bDsbA1보다 약간 낮은 TIR 강도를 가지는 2개의 추가적인 신호 펩티드 mMalE1 및 mPhoA1을 설계하였다(표 3). 중쇄에 융합된 mMalE1 및 mPhoA1은 bDsbA1보다 현저히 낮은 전장 5D5를 생성하였고 bDsbA1보다 더 가용성인 주변세포질 중쇄를 생성하였다(도 1c).
세포질에서 주변세포질로의 중쇄 분비에 미치는 신호 펩티드의 영향을 결정하기 위해, 본 발명자들은 성숙한 중쇄 및 전구체 중쇄의 존재를 모니터링하였다. 세포질 또는 내부 막에 존재하는 비-분비된 주변세포질 단백질은 신호 펩티드 서열을 유지할 것이다. 주변세포질로의 전좌 동안, 신호 펩티드는 펩티다제에 의해 절단된다[6,7]. 따라서, 주변세포질로 방출되는 성숙한 단백질은 신호 펩티드를 함유하지 않을 것이다. 전구체와 성숙한 중쇄 간의 분자량 차이는 SDS-PAGE 상에 분해되기 어려운 단지 1 내지 2 kDa에 그쳤다. 따라서, 전구체와 성숙한 중쇄를 구별하기 위해 N-말단 단백질 서열분석을 수행하였다. 전체 세포 샘플로부터 감소된 중쇄는 SDS-PAGE 상의 단일 대역으로서 전송하였다. SDS-PAGE에 있는 단백질은 PVDF 막에 전송하였다. 상기 PVDF 막으로부터 중쇄 대역을 절단하고 에드만 서열분석을 수행하였다. 중쇄가 STII, MalE 또는 PhoA 신호 펩티드에 융합될 때, 서열은 전구체 또는 성숙한 중쇄 모두와 일치하는 서열이 검출되었으며(표 4), 이는 일부 중쇄가 세포질 또는 내부 막에 있음을 시사한다. 중쇄가 DsbA 신호 펩티드에 융합되는 경우, 전구체와 일치하는 서열은 매우 적거나 또는 비-검출가능하였다. 본 발명자들은 피크 강도를 사용하여 전구체 중쇄에 대한 성숙한 중쇄의 비율을 산출하고, 초기 수율을 사용하여 분비된 중쇄의 비율을 반-정량화하였다. 두 가지 방법 모두 DsbA 신호 펩티드에 융합될 때, 서열분석된 펩티드의 대부분은 성숙한 중쇄에 관심하였으며(표 4), 이는 중쇄가 주변세포질 공간으로 효율적으로 분비되었음을 나타낸다(표 4). 따라서, DsbA 신호 펩티드가 STII, MalE 또는 PhoA 신호 펩티드보다 (중쇄 전구체로부터 성숙한 중쇄로) 더 효율적인 중쇄 가공을 매개하였다.
본 발명자들은 또한 서로 다른 신호 펩티드에 융합될 때 중쇄의 세포 편재화를 직접적으로 시각화하기 위해 면역금 전자 현미경(이뮤노이엠(immunoEM))을 수행하였다. 진탕 플라스크 배양물로부터 수집된 박테리아를 동결절편화하고, αFc-HRP 항체로 탐침한 후, αHRP-18nm 금 입자 2차 항체로 탐침하고, 투과 전자 현미경(TEM)으로 분석하였다. STII-경쇄 및 STII-중쇄를 발현시키는 박테리아의 경우, 극소수의 면역금 신호가 주변세포질에서 발견되었다. 금 표지화의 대부분은 세포질 측에서 관찰되었으며, 이는 중쇄가 주로 세포질에 포집되었음을 나타낸다(도 2a). 반면, STII-경쇄 및 DsbA-중쇄를 발현시키는 박테리아의 경우, 금 표지화는 주로 주변세포질 측에서 검출되었다(도 2b). 종합적으로, 이러한 결과는, 유사한 번역 수준에서, DsbA 신호 펩티드의 사용이 다른 세 개의 신호 펩티드의 사용보다 주변세포질에서 더 많은 중쇄 축적과 더 효율적인 중쇄 전좌 결과를 낳는다는 것을 보여준다.
신호 펩티드의 소수성은 주변세포질 내의 항체 중쇄 분비 및 축적에 중요하다. DsbA 신호 펩티드가 중쇄 분비에 더욱 효과적인 이유에 대한 기전을 조사하기 위해, 본 발명자들은 DsbA 신호 펩티드의 아미노산 서열을 STII, MalE 및 PhoA 신호 펩티드와 비교하였다. 1차 서열의 다양성에도 불구하고, 신호 펩티드는 일반적으로 세 개의 구별되는 영역으로 구성된다: 1 또는 2개의 양으로 하전된 아미노산 잔기를 함유하는 N-말단 영역, 흔히 H-영역이라고도 하는 소수성 코어 영역 및 신호 펩티다제로 인식되는 C-말단 영역[8]. DsbA 신호 펩티드의 H-영역과 전장 서열은 모두 STII, MalE 및 PhoA 신호 펩티드보다 더 소수성이다(표 2). 본 발명자들은 신호 펩티드의 소수성이 주변세포질에 대한 항체 중쇄 전좌에서 중요한 역할을 하는지를 알아보았다.
DsbA 및 STII 신호 펩티드의 소수성은 부위-지향적 돌연변이생성에 의해 조절되었다. DsbA 신호 펩티드에서 류신11(L11)을 세린(S)으로 치환함으로써 DsbA 신호 펩티드의 전체 및 평균 소수성을 감소시켰다(표 7 및 표 2). DsbA 신호 펩티드에서의 류신11 대 이소류신(I) 변이를 대조군으로서 생성하였다. STII 신호 펩티드 서열에서, 세린11을 류신 또는 이소류신으로 변이시켜 소수성을 증가시켰다(표 7 및 표 2). 변이된 신호 펩티드는 각각 TIR 강도 측정을 위해 성숙한 PhoA 단백질에 융합시켰다. STII 신호 펩티드 TIR1 또는 DsbA 신호 펩티드 TIR1과 유사한 TIR 강도를 갖는 소수성 신호 펩티드 변이체(표 3)를 항체 5D5 중쇄에 융합시켰다. 경쇄와 잠재적으로 상호작용하고/하거나 동일한 분비 기계와 경쟁하는 경쇄로 인한 있을 수 있는 영향을 배제하기 위해, 본 발명자들은 경쇄가 아닌 중쇄만을 발현하는 플라스미드를 설계했다.
주변세포질 내의 중쇄 축적에 미치는 신호 펩티드의 소수성 변이체의 영향은 주변세포질 추출물의 웨스턴 블랏 분석에 의해 모니터링하였다(도 3b). 경쇄 발현의 부재 하에서, DsbA 신호 펩티드의 사용은 STII 신호 펩티드의 사용보다 주변세포질에서 더 많은 가용성 중쇄를 생성하였다. L11S 변이에 의한 DsbA 신호 펩티드의 소수성 감소는 가용성 중쇄의 주변세포질 수준을 크게 증가시키는 반면, DsbA 신호 펩티드 L11I 대조군의 사용은 중쇄 수준에서의 큰 변화를 보여주지 않았다(도 3a). 한편, STII 신호 펩티드의 소수성을 증가시키는 것은 주변세포질내 가용성 중쇄의 수준을 증가시켰다(도 3a).
5D5 중쇄 분비에 미치는 신호 펩티드의 소수성의 영향을 추가로 확인하기 위해, 다른 소수성 범위의 추가적인 신호 펩티드 변이체를 만들고(표 2; 표 8), 이들을 5D5 중쇄에 융합시켰다. STII 신호 서열에서, 세린11을, 전체 및 평균 소수성을 증가시키는 알라닌(A), 소수성을 단지 약간 증가시키는 티로신(Y), 또는 STII의 소수성을 감소시키는 글루타민(Q)으로 변이시켰다. 본 발명자들은 또한 Ala6(A6)을 류신으로, 알라닌 10(A10)을 류신으로, 그리고 세린 11(S11)을 류신으로(STII A6L, A10L, S11L) 삼중 변이시킴으로써 강한 소수성의 STII 신호 펩티드 변이체를 만들었다. DsbA 서열에서, 류신 11을 알라닌(A) 또는 글루타민(Q)으로 변이시켜 전체 및 평균 소수성을 감소시켰다. 신호 펩티드 변이체는 모두 STII 신호 펩티드 TIR1 또는 DsbA 신호 펩티드 TIR1과 유사한 TIR 강도를 가졌다 (도 3).
경쇄의 부재 하에서 주변세포질로의 5D5 중쇄의 분비 효율은 전술한 바와 같이 N-말단 서열분석에 의해 결정하였다(표 5). DsbA 신호 펩티드의 사용은 대부분의 성숙한 중쇄 및 매우 소량의 전구체 중쇄를 생산했으며, 이는 DsbA 신호 펩티드에 의해 매개되는 5D5 중쇄의 분비가 효율적임을 나타낸다. 유사한 결과가 대조군인 DsbA L11I 변이체에서 관찰되었다. L11A, L11S 또는 L11Q에 의해 DsbA 신호 펩티드의 소수성을 감소시키는 것은 성숙한 5D5 중쇄보다 더 많은 전구체를 검출시키므로 분비 효율이 감소하였다. 한편, STII 또는 STII S11Q 어느 것도 비-정량적 에드만 서열분석을 이용하여 5D5 중쇄의 효율적인 분비를 매개하지 못하지만, STII S11L은 상기 분비를 향상시켰다. 반-정량적 에드만 서열분석은 STII 및 STII S11Y가 5D5 중쇄의 비효율적인 분비를 매개하지만, STII S11Q 변이는 분비된 5D5 중쇄의 비율을 증가시켰다. S11A 또는 S11L 변이에 의한 STII 신호 펩티드의 소수성을 증가시키면 분비 효율이 증가하였다. 또한, 유사한 번역 강도를 갖는 소수성이 강한 STII 신호 펩티드 신호 변이체(STII A6L, A10L, S11L)는 분비 효율을 더 이상 증가시키지 못하기 때문에, S11L 단일 잔기 변이가 효율적인 5D5 중쇄 분비에 충분했다. 종합적으로, TIR 강도를 조절하면서 신호 펩티드의 소수성을 조정하는 것은 주변세포질에 대한 5D5 중쇄의 분비 효율에 큰 영향을 준다.
경쇄가 중쇄와 공동 발현되는 경우, 유사한 결과가 관찰되었다. 항체 5D5 경쇄가 STII 신호 펩티드(mSTII1)에 융합되는 경우, DsbA L11S 신호 펩티드 변이체의 사용은 DsbA 또는 DsbA L11I 신호 펩티드의 사용보다 주변세포질에서 훨씬 적은 수성 가용성 중쇄를 생성하였다. 유사하게, STII S11L 또는 STII S11I 신호 펩티드의 사용은 STII 신호 펩티드에 비해 주변세포질에서 더 가용성인 중쇄 축적을 매개하였다(도 3b). 전체적으로, 신호 펩티드의 소수성 조정은 주변세포질에서의 5D5 중쇄 축적을 현저히 변화시켰다. 단일 아미노산에 의해 소수성을 증가시키면 가용성 중쇄의 세포질 수준을 상당히 향상시키지만, 소수성을 감소시키면 반대 효과를 가져왔다.
본 발명자들은 추가로 N-말단 서열분석에 의해 중쇄 처리에 대한 신호 펩티드의 소수성의 영향을 분석하였다(표 4). 각각의 경우에, 5D5 경쇄를 STII 신호 펩티드(mSTII1)에 융합시켰다. 중쇄가 DsbA 및 DsbA L11I 신호 펩티드에 융합될 때 주요 성숙한 중쇄 신호 및 매우 작은 전구체 신호가 N-말단 서열분석에 의해 검출되었다. 피크 강도에 기초한 추정에 의하면, DsbA 신호 펩티드를 이용한 구조체에서의 성숙한 중쇄 대 전구체 중쇄의 비율은 10:1 이상이었다. DsbA 신호 펩티드 내의 L11S 변이는 성숙/전구체 비율을 1:3으로 감소시켰고, 이는 성숙한 중쇄 신호보다 더 많은 전구체가 검출되었기 때문이다. STII 신호 펩티드는 전구체 신호보다 덜 성숙한 중쇄 신호를 제공하였으며, 성숙/전구체 비율은 1:3이었다. S11L 또는 S11I 변이에 의해 STII 신호 펩티드의 소수성을 향상시키면 성숙한 중쇄가 전구체 중쇄보다 더 많이 생성되었다(3:1, 4:1). 에드만 서열분석로부터 초기 수율을 이용한 반-정량화로 인해 5D5 중쇄 분비에 대한 신호 펩티드의 소수성의 영향이 확인되었다. DsbA 신호 펩티드의 사용은 약 86%의 중쇄 분비를 초래하였고; L11S 변이는 분비된 중쇄의 비율을 39%로 감소시켰다. STII는 39%의 분비된 중쇄를 매개하였고; S11L 및 S11I 변이는 중쇄 분비를 60% 이상 증가시켰다. 또한, 신호 펩티드의 소수성은 항체 중쇄 가공 및 주변세포질로의 분비에 중요하다.
5D5 분비에 대한 신호 펩티드 소수성의 영향은 또한 SfmC로부터의 강한 소수성 신호 펩티드의 연구에 의해 지지되었다. SfmC는 주변세포질에 편재화된 예측된 필린(pilin) 단백질이다. SfmC의 분비는 공동-번역 분비 경로에서의 신호 인식 입자(SRP)에 의존한다(문헌[Huber et al., J Bacteriol. 2005. 2983-2991; Zhou et al., 2014. PLOS One]). SfmC의 신호 펩티드는 DsbA 또는 STII 중 어느 하나의 신호 펩티드보다 더 소수성이다(표 3). 본 발명자들은 SfmC 신호 펩티드의 TIR1과 TIR2 변이체를 생성하고 이들을 각각 5D5 중쇄에 융합시켰다. 두 변이체는 모두 5D5 중쇄의 매우 효율적인 분비를 매개하였다(100% 중쇄 분비).
전장 항체 수준에 대한 신호 펩티드의 소수성의 영향. 본 발명자들은 다음으로 전장 항체 생산에 대한 신호 펩티드의 소수성의 영향을 분석하였다. 5D5 중쇄 및 경쇄를 발현하는 숙주 세포로부터의 용해물을 회수하고, 완전히 조립된 항체 5D5의 수준을 비-환원성 SDS-PAGE 전기영동에 이은 웨스턴 블랏에 의해 분석하였다. 각각의 경우에, 5D5 경쇄를 (mSTII1 핵산 서열을 사용하여) STII 신호 펩티드에 융합시켰다. 중쇄에 융합된 DsbA L11S 신호 펩티드는 중쇄에 융합된 DsbA 또는 DsbA L11I 신호 펩티드의 사용에 비해 전장 5D5 수준의 상당한 감소를 초래하였다(도 4a). 한편, STII 신호 펩티드에서의 S11L 및 L11I 변이는 모두 STII 신호 펩티드의 사용에 비해 전장 5D5 항체 수준을 증가시켰다(도 4b). 따라서, 신호 펩티드의 소수성을 증가시키는 것은 전장 5D5 항체의 생산을 촉진하였다.
본 발명자들은 신호 펩티드의 소수성의 영향이 다른 항체 중쇄의 분비에 적용되는지 여부를 알고 싶었다. 이를 위해, 본 발명자들은 mAb1 또는 mAb2의 중쇄에 STII, STII S11L, DsbA 또는 DsbA L11S TIR1 신호 펩티드를 융합시키고, 에드만 서열분석을 사용하여 경쇄의 부재 하에서 중쇄의 분비 효율을 측정하였다(표 6). 두 항체 중쇄의 경우, DsbA가 STII보다 더 많이 분비된 중쇄를 매개하였다. L11S 변이에 의해 DsbA의 소수성을 감소시키면 분비된 중쇄의 비율이 감소하였고, S11L 변이에 의해 STII의 소수성을 증가시키면 반대 효과를 보였다.
본 발명자들은 상기 두 개의 다른 단클론성 항체 mab 1 및 mab 2의 전장 항체 생산에 대한 신호 펩티드의 소수성의 영향을 추가로 시험하였다(도 7). mab 1 및 mab 2는 각각 전장 IgG1 항체들이다. 두 경우 모두에서, 경쇄는 mSTII1에 융합시키고, 중쇄는 유사한 TIR 강도를 가지는 STII, DsbA, STII S11L 또는 DsbA L11S에 융합시켰다. 전장 항체 수준, 주변세포질 가용성 중쇄 수준 및 총 중쇄 수준을 전술한 바와 같이 측정하였다. mAb1의 경우, 중쇄에 융합된 STII 또는 DsbA 신호 펩티드는 전장 항체 및 주변세포질 가용성 중쇄를 생성하였지만; 감소된 소수성을 가지는 DsbA L11S 신호 펩티드의 사용은 전장 mAb1 및 주변세포질 가용성 중쇄의 수준을 현저히 감소시켰다. 이는 신호 펩티드의 소수성이 여전히 mAb1 생산 및 주변세포질로의 분비에 중요한 인자임을 시사한다. mAb2의 경우, STII 신호 펩티드의 사용은 DsbA 신호 펩티드의 사용보다 전장 항체 및 주변세포질 가용성 중쇄를 덜 생성하였다. S11L 변이에 의해 STII 신호 펩티드의 소수성을 증가시키면 전장 mAb2뿐만 아니라 주변세포질 가용성 중쇄 축적의 증가를 일으키는 반면, L11S에 의해 DsbA 신호 펩티드의 소수성을 감소시키면 반대 효과를 일으켰다. 따라서, 신호 펩티드의 소수성은 이. 콜라이 주변세포질 내로의 mAb2 생산 및 분비에 중요하다.
신호 펩티드의 소수성의 조정은 봉입체의 세포 편재를 변화시켰다. 이. 콜라이에서 과잉 발현된 재조합 단백질은 종종 세포질에서 또는 주변세포질에서 봉입체로 알려진 큰 불용성 응집체에 함유된다. 관심 단백질을 함유하는 봉입체의 형성은 흔히 낮은 수준의 가용성 표적 단백질과 연관된다. 또한, 세포질내 봉입체의 형성은 주변세포질에 대한 비효율적인 단백질의 분비를 나타낸다. 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여, 본 발명자들은 mSTII1에 융합된 경쇄 및 STII, MalE 또는 PhoA 신호 펩티드에 융합된 중쇄를 발현하는 숙주 세포의 세포질에서 눈에 띄는 봉입체를 관찰하였으며(도 5), 이는 이들 세포에서의 비효율적인 단백질 분비를 시사한다. 대조적으로, STII-LC 및 DsbA-HC를 발현하는 숙주 세포의 경우, 봉입체는 덜 흔히 관찰되며 주로 주변세포질에 대부분 편재되었는데(도 5), 이는 효율적인 단백질 분비를 나타낸다. 흥미롭게도, (증가된 소수성을 갖는) S11L STII 신호 펩티드의 사용은 DsbA 신호 펩티드와 유사한 표현형을 나타내었다: 봉입체는 주로 주변세포질 쪽에 편재되었다(도 5). (감소된 소수성을 갖는) DsbA L11S 신호 펩티드의 사용은 주변세포질에서 주로 관찰되는 봉입체를 나타내었다(도 5). 요컨대, 신호 펩티드의 소수성의 조정은 봉입체의 세포 편재화를 변화시켰다.
신호 펩티드의 C-말단 도메인의 변이는 전장 항체 생산을 변화시키지 못했다. 신호 펩티드의 C-말단 영역은 펩티다제에 의한 신호 펩티드의 절단에 중요하다. 종래의 연구는 이러한 영역이 전형적으로 절단 부위에 위치한 -1 및 -3 위치에서 작은 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 선호하는 것을 나타낸다[6]. STII 및 DsbA 신호 펩티드는 모두 -1 및 -3 위치에서 작은 잔기(Ala)를 갖는다(도 3a). 그러나, DsbA 서열의 -2 위치에는, 작은 잔기 Ser이 존재하는 반면, STII 서열의 동일한 위치에는 벌키 잔기(Tyr(Y))가 존재한다. 도 6은 절단 부위의 -2 아미노산 위치에서 측쇄 크기의 변화가 항체 5D5 생산에 영향을 미치지 않음을 보여준다. STII 신호 펩티드내 Tyr22의 Ser로의 변이는 5D5 수준을 변화시키지 않았다. 유사하게, DsbA 신호 펩티드내 Ser18의 Tyr로의 변이는 5D5 수준에 아무런 영향을 미치지 않았다. 따라서, -2 아미노산 위치에서의 측쇄 부피는 주변세포질내 5D5 수준에 영향을 미치지 않는다.
표 2: 신호 펩티드 변이체의 아미노산 서열
Figure pct00008
Figure pct00009
밑줄 = 아미노산 서열의 변이
합계 소수성(sum hydro)은 아이젠버그(Eisenberg) 등에 의해 개발된 정규화 공통 척도에 기초하여 계산된다[20].
평균 소수성(Ave hydro) = 신호 서열의 합계 소수성을 아미노산 잔기의 개수로 나눈다.
합계 소수성(H) = H-영역의 합계 소수성
평균 소수성(H) = H-영역의 평균 소수성
표 3. 신호 펩티드 변이체의 DNA 서열 및 상대적 TIR 강도
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
굵게(bold) = BssHII, MluI 또는 XbaI 제한 부위
밑줄 = 아미노산 서열을 변경하기 위한 변이
표 4. 5D5 경쇄가 공동-발현된 5D5 중쇄의 분비
Figure pct00013
* 추정된 성숙/전구체 비는 피크 강도의 대략적인 추정에 기초한다.
** 물질 및 방법 부분에서 기술된 바와 같이, 분비된 HC%는 성숙한 중쇄 및 전구체의 초기 수율의 반-정량화에 의해 결정된다.
표 5. 5D5 경쇄의 부재 하에서의 5D5 중쇄의 분비
Figure pct00014
* 물질 및 방법 부분에서 기술된 바와 같이, 분비된 HC%는 성숙한 중쇄 및 전구체의 초기 수율의 반-정량화에 의해 결정된다.
표 6. 경쇄의 부재 하에서의 mAb1 중쇄 및 mAb2 중쇄의 분비
Figure pct00015
* 물질 및 방법 부분에서 기술된 바와 같이, 분비된 HC%는 성숙한 중쇄 및 전구체의 초기 수율의 반-정량화에 의해 결정된다.
표 7. DsbA 신호 서열, STII 신호 서열 및 변경된 소수성을 가지는 변이체 신호 서열의 아미노산 서열. N-말단 영역은 굵은 글씨체로 표시되어 있고, H-영역은 이탤릭 글씨체이고, C-말단 영역은 일반 글씨체이다. 변이된 잔기는 밑줄로 표시하였다.
Figure pct00016
표 8. DsbA 신호 서열, STII 신호 서열, 변경된 소수성을 가지는 변이체 신호 서열 및 SfmC 신호 서열의 아미노산 서열. N-말단 영역은 굵은 글씨체로 표시되어 있고, H-영역은 이탤릭 글씨체이고, C-말단 영역은 일반 글씨체이다. 변이된 잔기는 밑줄로 표시하였다.
Figure pct00017
부분적 참고 목록
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본 발명이 명확성 및 이해를 위해 예시 및 실시예에 의해 상당히 상세하게 기재되었음에도 불구하고, 상기 기술내용 및 실시예가 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 명백히 그 전문이 본원에 참고로 인용된다.
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Claims (81)

  1. 이. 콜라이 숙주 세포로부터 항체 중쇄 및/또는 항체 경쇄의 분비를 증가시키는 방법으로서,
    (1) 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제 1 신호 펩티드를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드(이때, 상기 신호 펩티드의 평균 소수성은 약 0.5 초과임); 및/또는 (2) 항체 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제 2 신호 펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드(이때, 상기 제 2 신호 펩티드의 평균 소수성은 약 0.5 초과임)를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 이. 콜라이 숙주 세포를 배양하고, 이에 의해 숙주 세포 내에서의 상기 항체의 발현시, 상기 중쇄 및 경쇄가 접힘 및 조립되어 생물학적으로 활성인 항체를 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 신호 펩티드의 소수성이 약 0.6 초과인, 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 제 2 신호 펩티드의 소수성이 약 0.6 초과인, 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및/또는 제 2 신호 펩티드가 변이체 공-번역 신호 펩티드인, 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및/또는 제 2 신호 펩티드가 변이체 DsbA 신호 펩티드인, 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 변이체 DsbA 신호 펩티드가 잔기 L11에서의 변이를 포함하고, 상기 변이체 DsbA 신호 펩티드가 서열번호: 3의 야생형 DsbA 신호 펩티드보다 큰 평균 소수성을 갖는, 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 변이가 L11I 또는 S18Y인, 방법.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 변이체 DsbA 신호 펩티드가 서열번호: 13 또는 15의 서열을 포함하는, 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호 펩티드가 Sfmc 신호 펩티드인, 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및/또는 제 2 신호 펩티드의 TIR 강도가 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7 또는 약 8인, 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 제 1 신호 펩티드의 TIR 강도가 약 5이고, 상기 제 2 신호 서열의 TIR 강도가 약 8인, 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포내 상기 폴리뉴클레오티드가 프로모터(promoter)를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 프로모터가 phoA, tac, lpp, lac-lpp, lac, ara 및 T7 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 원핵생물 프로모터(prokaryotic promoter)인, 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이. 콜라이 숙주 세포가 내인성 프로테아제 활성 결핍된 균주인, 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 이. 콜라이의 유전자형은 degP 및 prc 유전자가 결여되어 있고, 돌연변이체 spr 유전자를 보유하는, 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 DsbA, DsbC, DsbG 및 FkpA로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 원핵생물 폴리펩티드(prokaryotic polypeptide)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 DsbA 및 DsbC를 모두 암호화하는 것인, 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 숙주 세포 배양물로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 항체가 상기 숙주 세포 배양 배지로부터 회수되는, 방법.
  20. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 방법이 상기 회수된 항체를 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 담체와 조합하여 상기 항체를 포함하는 약학 제형을 제조하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 형성되는 면역글로불린 폴리펩티드 복합체의 적어도 50%가 상기 항체인, 방법.
  22. 제 19 항에 있어서, 형성되는 면역글로불린 폴리펩티드 복합체의 적어도 70%가 상기 항체인, 방법.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 단클론성(monoclonal) 항체인, 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 항체가 키메라성 항체, 친화도 성숙된(affinity matured) 항체, 이중특이적 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체인, 방법.
  25. 제 23 항에 있어서, 상기 항체가 이중특이적 항체인, 방법.
  26. 변이체 DsbA 신호 펩티드로서,
    상기 변이체가 0.5 초과의 평균 소수성을 갖는 H 영역을 포함하는, 변이체 DsbA 신호 펩티드.
  27. 변이체 DsbA 신호 펩티드로서,
    상기 변이체가 서열번호: 3의 DsbA 신호 펩티드보다 큰 평균 소수성을 갖는, 잔기 S11에서의 변이를 포함하는, 변이체 DsbA 신호 펩티드.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 변이가 L11I 및/또는 S18Y인, 변이체 DsbA 신호 펩티드.
  29. 변이체 STII 신호 펩티드로서,
    상기 변이체 STII 신호 펩티드가 서열번호: 1의 STII 신호 펩티드보다 큰 평균 소수성을 갖는, 잔기 S11에서의 변이를 포함하는, 변이체 STII 신호 펩티드.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 변이가 S11A, S11I 또는 S11L인, 변이체 STII 신호 펩티드.
  31. 서열번호: 8, 11, 13, 15, 31 또는 33의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 이루어지거나 또는 이를 포함하는, 변이체 신호 펩티드.
  32. 제 26 항 또는 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 이형 단백질에 융합된, 변이체 신호 펩티드.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 이형 폴리펩티드가 항체 중쇄인, 변이체 신호 펩티드.
  34. 제 32 항에 있어서, 상기 이형 폴리펩티드가 항체 경쇄인, 변이체 신호 펩티드.
  35. 제 32 항에 있어서, 상기 이형 폴리펩티드가 항체 경쇄 및 중쇄인, 변이체 신호 펩티드.
  36. 제 32 항에 있어서, 상기 이형 폴리펩티드가 다량체성 폴리펩티드(multimeric polypeptide)인, 변이체 신호 펩티드.
  37. 제 32 항에 있어서, 상기 이형 폴리펩티드가 면역접합체(immunoadhesin)인, 변이체 신호 펩티드.
  38. 제 26 항 또는 제 30 항 중 어느 한 항의 변이체 신호 펩티드를 암호화하는, 폴리뉴클레오티드 서열.
  39. 제 38 항에 있어서, 이형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되어, 숙주 세포내에서의 상기 이형 폴리펩티드의 발현시, 상기 이형 폴리펩티드가 접힙 및 조립되어 생물학적으로 활성인 이형 폴리펩티드를 형성하는, 폴리뉴클레오티드 서열.
  40. 제 39 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 원핵생물 숙주 세포인, 폴리뉴클레오티드.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 이. 콜라이인, 폴리뉴클레오티드.
  42. 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리뉴클레오티드는:
    (1) 항체 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제 1 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 (2) 항체 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제 2 신호 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함함으로써, 숙주 세포내에서의 상기 항체의 발현시, 상기 중쇄 및 경쇄가 접힘 및 조립되어 생물학적으로 활성인 항체를 형성하고,
    상기 제 1 신호 펩티드가 제 26 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항의 변이체 신호 펩티드이거나, 또는 상기 제 1 신호 펩티드가 서열번호: 8, 11, 13, 15, 31, 33 또는 42의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 이루어지거나, 또는 이를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  43. 제 42 항에 있어서, 상기 제 1 신호 펩티드가 제 26 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항의 변이체 신호 펩티드인, 폴리뉴클레오티드.
  44. 제 42 항에 있어서, 상기 제 1 신호 펩티드가 서열번호: 8, 11, 13, 15, 31, 33 또는 42의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 이루어지거나, 또는 이를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  45. 제 42 항 또는 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 신호 펩티드가 신호 펩티드인, 폴리뉴클레오티드.
  46. 제 42 항 또는 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 신호 펩티드가 제 26 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항의 변이체 신호 펩티드이거나, 또는 상기 제 2 신호 펩티드가 서열번호: 8, 11, 13, 15, 31, 33 또는 42의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 이루어지거나, 또는 이를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  47. 제 42 항 또는 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 신호 펩티드가 제 26 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항의 변이체 신호 펩티드인, 폴리뉴클레오티드.
  48. 제 42 항 또는 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 신호 펩티드가 서열번호: 8, 11, 13, 15, 31, 33 또는 42의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 이루어지거나, 또는 이를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  49. 제 42 항 또는 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드가 (3) Fc 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제 3 신호 펩티드를 암호화하는 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  50. 제 49 항에 있어서, 상기 제 3 신호 펩티드가 제 26 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항의 변이체 신호 펩티드이거나, 또는 상기 제 3 신호 펩티드가 서열번호: 8, 11, 13, 15, 31, 33 또는 42의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 이루어지거나, 또는 이를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  51. 제 39 항 또는 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이형 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 프로모터(promoter)를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  52. 제 51 항에 있어서, 상기 프로모터가 phoA, tac, lpp, lac-lpp, lac, ara, trp 및 T7 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 원핵생물 프로모터인, 폴리뉴클레오티드.
  53. 제 52 항에 있어서, 상기 프로모터가 phoA 프로모터인, 프로모터.
  54. 제 39 항 또는 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 경쇄에 작동가능하게 연결된 제 1 프로모터 및 (b) 중쇄에 작동가능하게 연결된 제 2 프로모터를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  55. 제 54 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 프로모터가 둘 다 phoA 프로모터인, 폴리뉴클레오티드.
  56. 제 54 항에 있어서, (c) Fc 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 제 3 프로모터를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  57. 제 56 항에 있어서, 상기 프로모터가 phoA 프로모터인, 폴리뉴클레오티드.
  58. 제 39 항 또는 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이형 폴리펩티드가 프로테아제, 면역접합체, 수용체의 세포외 도메인, 이종다량체성 단백질 또는 항체인, 폴리뉴클레오티드.
  59. 제 42 항 또는 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 단클론성 항체인, 폴리뉴클레오티드.
  60. 제 59 항에 있어서, 상기 항체가 키메라성 항체, 이중특이적 항체, 인간화된 항체, 항체 단편 또는 인간 항체인, 폴리뉴클레오티드.
  61. 제 59 항에 있어서, 상기 항체 단편이 단일-아암(one-armed) 항체인, 폴리뉴클레오티드.
  62. 제 59 항에 있어서, 상기 항체가 이중특이적 항체인, 폴리뉴클레오티드.
  63. 제 39 항 또는 제 62 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
  64. 제 63 항에 있어서, 상기 벡터가 발현 벡터인, 벡터.
  65. 제 39 항 또는 제 64 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
  66. 제 64 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 숙주 세포.
  67. 제 66 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 원핵생물 세포인, 숙주 세포.
  68. 제 67 항에 있어서, 상기 원핵생물 세포가 이. 콜라이인, 숙주 세포.
  69. 제 68 항에 있어서, 상기 이. 콜라이가 내인성 프로테아제 활성 결핍된 균주인, 숙주 세포.
  70. 제 68 항 또는 제 69 항에 있어서, 상기 이. 콜라이의 유전자형이 degP 및 prc 유전자 결핍이고, 돌연변이체 spr 유전자를 보유한 것인, 숙주 세포.
  71. 제 66 항 또는 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포가, 원핵생물 샤프론(chaperone) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 숙주 세포.
  72. 제 71 항에 있어서, 상기 원핵생물 샤프론 단백질이 DsbA 및/또는 DsbC인, 숙주 세포.
  73. 제 71 항 또는 제 72 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 원핵생물 샤프론 단백질을 과발현하는, 숙주 세포.
  74. 이형 폴리펩티드(예컨대, 항체 중쇄 및/또는 경쇄)의 제조 방법으로서,
    제 66 항 또는 제 73 항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하여 상기 핵산이 발현되도록 함으로써, 숙주 세포내에서의 상기 핵산의 발현 시, 상기 이형 폴리펩티드가 접힘되어 생물학적으로 활성인 이형 폴리펩티드를 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
  75. 제 74 항에 있어서, 상기 방법이 상기 숙주 세포 배양물로부터 상기 이형 폴리펩티드를 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  76. 제 75 항에 있어서, 상기 이형 폴리펩티드가 상기 숙주 세포 배양 배지로부터 회수되는, 방법.
  77. 제 74 항 또는 제 75 항에 있어서, 상기 방법이 상기 회수된 이형 폴리펩티드를 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 담체와 조합하여 상기 이형 폴리펩티드를 포함하는 약학적 제형을 제조하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  78. 세포로부터 이형 폴리펩티드(예컨대, 항체 중쇄 및/또는 경쇄)를 분비하는 방법으로서,
    제 66 항 내지 제 73 항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하여 상기 핵산이 발현되고 상기 이형 폴리펩티드가 분비되도록 하는 단계를 포함하는 방법.
  79. 세포로부터 이형 폴리펩티드(예컨대, 항체 중쇄 및/또는 경쇄)를 전좌시키는 방법으로서,
    제 66 항 내지 제 73 항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하여 상기 핵산이 발현되고 상기 이형 폴리펩티드가 전좌되도록 하는 단계를 포함하는, 방법.
  80. 제 74 항 내지 제 79 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된, 이형 폴리펩티드.
  81. 제 81 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 항체인, 폴리펩티드.
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