JP2003518075A - 生理活性化合物の消失半減期延長のための方法及び組成物 - Google Patents

生理活性化合物の消失半減期延長のための方法及び組成物

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Abstract

(57)【要約】 ＩｇＧ又は血清アルブミンに親和性のあるペプチドリガンドが開示される。また、ペプチドリガンドドメイン及び活性ドメインを含むハイブリッド分子も開示される。活性ドメインは治療又は診断用の薬剤としての有用性をもつ任意の分子を含みうる。本発明のハイブリッド分子は、ハイブリッド分子をコードする単離された核酸で形質転換又は形質移入した組み換え体での生産及びそこからの精製を含む種々の技術を用いて、又はハイブリッドの化学合成によって調製されうる。ハイブリッド分子は活性ドメイン分子の消失半減期を改善するための薬剤として有用性がある。消失半減期は、ペプチドリガンドが血漿タンパク質に結合親和性を有する、本発明のハイブリッド分子を生成することにより改善される。好ましい実施態様では、短い消失半減期を有する生理活性分子は、本発明のハイブリッド分子の活性ドメインとして組み込まれ、又はその中に組み込まれ、さらにペプチドリガンドドメインの結合親和性は該生理活性分子のものと比較してハイブリッドの消失半減期を延長する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、血漿タンパク質等の予定した分子に結合する、ペプチドリガンドと
呼ばれている新規な化合物に関する。特定の態様では、本発明はペプチドリガン
ドドメイン及び例えば生物活性分子といった活性ドメインを含むハイブリッド分
子を含む組成物に関する。活性ドメインは診断又は治療の目的で利用できる分子
を包含しうる。好ましい実施態様では、ペプチドリガンドドメイン及び活性ドメ
インを含むハイブリッド組成物は、薬物動態学的又は薬理学的な特性が改良され
ている。さらに本発明はペプチドリガンドの調査、診断又は治療的用途を提供し
、ペプチドリガンド分子を含む製薬組成物といった組成物を包含する。
【０００２】 （関連した開示文献の説明） ファージディスプレイは、強制的及び非強制的なペプチドライブラリを作成す
る方法を提供する(Devlin等, (1990) Science 249:404-406; Cwirla等, (1990)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; Lowman (1997) Ann. Rev. Biophys
. Biomol. Struct. 26:401-424)。これらのライブラリは、予定標的分子に結合
能力のあるペプチドリガンドを同定及び選択するのに使用することができる(上
掲のLowman (1997))；Clackson及びWells (1994) Trends Biotechnol. 12:173-1
84; 上掲のDevlin等, (1990))。細胞標的に存在し(Arap等, (1998)Science 279:
377-380)；ＩＬ-αの結合を阻害するヒトＩ型インターロイキン１(ＩＬ-１)レセ
プターに結合し(Yanofsky等, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7381-738
6)；サイトカインエリスロポエチン(ＥＰＯ)に対するレセプターに結合及びそれ
を活性化し(Wrighton等, (1996) Science 273:458-463)；ヒトトロンボポエチン
レセプターに結合して、天然リガンドトロンボポエチン(ＴＰＯ)の結合と競合す
る(Cwirla等, (1996) Science, 276:1696-1699)、ペプチド修飾を同定するため
に、又は天然タンパク質結合リガンドから親和性向上又は成熟したペプチドリガ
ンドを生成する(Lowma等, (1991) Biochemistry 30:10832-10838)ために、該技
術が使用される。
【０００３】 一価のファージディスプレイにより作成された構造的に構築されたペプチドラ
イブラリを用いて、インシュリン様成長因子１結合タンパク質(ＩＧＦＢＰ)に特
異的に結合する１４アミノ酸ペプチドが単離された(Lowman等, (1998), Biochem
istry, 37:8870-8878)。ペプチドはヘリックス構造を有し、インビボでＩＧＦＢ
Ｐに結合してインシュリン様成長因子-ａ(ＩＧＦ-１)活性を遊離する(上掲のLow
man等(1998))。インビボでのファージ選択を利用して、脳及び腎臓のような種々
の器官に選択的局在化に媒介可能なペプチド（Pasqualini及びRuoslohti (1996)
Nature 380:364-366）、並びにαＶβ３又はαＶβ５インテグリンを担持する
特定の腫瘍タイプに帰着するペプチドが同定されている(Arapら, (1998) Scienc
e 279：377-380)。米国特許第5,627,263号には、α５β１インテグリンにより認
識され、これと選択的に結合するペプチドが記載されている。親和性又は特異性
が改善されたタンパク質の例には、ヒト成長ホルモン、亜鉛フィンガー、プロテ
アーゼインヒビター、心房性ナトリウム利尿因子、及び抗体が含まれる(Wells,
J. 及びLowman H.(1992), Curr. Opin. Struct. Biol. 2：597-604；Clackson,
T.及び Wells, J.(1994), Trends Biotechnol. 12：173-184；Lowman等, (1991
) Biochemistry 30(10)：832-838；Lowman及びWells J.(1993), J. Mol. Biol.
234：564-578；Dennis M.及び Lazarus R.(1994), J. Biol. Chem. 269(22)：13
7-144)。
【０００４】 血清アルブミンが結合するとインシュリンの薬力学が向上すると考えられる。
１０−１６の炭素原子を有する飽和脂肪酸でのインシュリンのアシル化は、アル
ブミンに対して親和性のあるインシュリンを生成する(Kurtzhals, P.等(1995) B
iochem. J. 312:725-731)。アシル化インシュリン間のアルブミン結合親和性の
差は、様々な分子のウサギへの皮下注射後の血糖低下作用タイミングと相関関係
がある。アルブミンとの結合の緊密さは血糖低下の遅延と相関関係があり、ある
いは、皮下組織のアルブミンに結合しているアシル化インシュリンに依存して、
非アシル化インシュリンと比較した場合にアシル化インシュリン吸収率が低くな
る。 ＣＤ４のＶ１及びＶ２ドメインがヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と融合した血
清アルブミンＣＤ４コンジュゲートが記載されている(Yeh, P等 (1992), Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89:1904-1908)。コンジュゲートの消失半減期は、ウサギ
の実験モデルにおいて溶解性ＣＤ４（ｓＣＤ４）の１４０倍であった。 連鎖球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインに融合したヒト溶解性補
体レセプター１型（ｓＣＲ１）のインビボ半減期延長が報告されている(Makride
s, S.等(1996) J. Pharmacol. Exptl. Ther. 277:532-541)。約８０のアミノ酸
（断片ＢＡ）、及び約１５５のアミノ酸（断片ＢＡＢＡ）を有するタンパク質Ｇ
のアルブミン結合ドメインを含有する構造である。 約６０のアミノ酸を有するタンパク質ＡのＺドメインから誘導した標識ＩｇＧ
結合ドメイン、及び約２００のアミノ酸を有する連鎖球菌タンパク質Ｇ（Ｂドメ
イン）から誘導された血清アルブミン結合ドメインの薬物動態についての記載が
ある（ＥＰ０４８６５２５）。
【０００５】 (発明の概要) 本発明は、血漿タンパク質に結合する新規な化合物を提供する。本発明の化合
物(ペプチドリガンドと呼ぶ)は、例えばペプチド又はペプチド誘導体、例えばペ
プチド模倣物及びペプチド類似物である。本発明の好ましい態様によれば、化合
物は血清アルブミン又はＩｇＧ-Ｆｃ等の免疫グロブリンの一部といった血漿タ
ンパク質に結合する非天然に発生するアミノ酸配列である。好ましくはペプチド
リガンドは約１０〜２０のアミノ酸残基の非天然に生じるアミノ酸配列である。 このような化合物は、好ましくは、約１００μＭ未満、好ましくは１００ｎＭ
未満の解離定数、Ｋｄにより特徴づけられる親和性を有する所望の血漿タンパク
質に結合し、好ましくは他の血漿タンパク質に実質的には結合しない。このよう
な化合物の特定の例は、直鎖状又は環状、特に環状のペプチド、好ましくは約１
０〜２０の長さのアミノ酸残基、その組み合わせ、Ｎ末端又はＣ末端又は両方で
修飾されていてもよいもの、並びにその塩及び誘導体、その機能類似体、及び配
列の末端でアミノ酸又はポリペプチドを有する延長したペプチド鎖を含む。
【０００６】 好ましいペプチドリガンドはＩｇＧ-Ｆｃに結合し、直鎖状又は環状のペプチ
ド、好ましくは次の核となる式を含む環状のペプチド化合物を含む： Xaai-Cys-Xaaj-Cys-Xaak (配列番号：1)、ここで Xaai は欠いている、又は１
〜４のアミノ酸好ましくは４のアミノ酸のペプチドであり；Xj は好ましい配列
Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Val-Trp (配列番号：10)；又は Xaa-Xaa-Xaa-Xaa
-Gly-Glu-Leu-Val-Trp (配列番号：11)；又は Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Gly-Glu-Le
u-Val-Trp(配列番号：12)を有する９のアミノ酸が好ましく、ここで Xaa1 は好
ましくは Ala, Ser, 又は Thr； Xaa2 は好ましくは Trp 又は Tyr； Xaa3 は好
ましくは His, 又は Trp；Xaa4 は好ましくは Leu 又は Met であり、Xaak は欠
いているか、又は１〜５のアミノ酸、好ましくは５のアミノ酸であり、環状のペ
プチド又はその類似物がＩｇＧ-Ｆｃ結合の量的生物活性を保持する限りにおい
て選択できる。 この化合物群の中で好ましいものは、次の配列を含むＩｇＧ-Ｆｃに結合する
化合物である： Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa-Xaa-Xa
a-Xaa-Xaa (配列番号：13)； Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa-Xaa-Xa
a-Xaa-Xaa (配列番号：14)； Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xa
a9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13 (配列番号：15)、ここで Xaa5 は Ala, Ser, 又は Thr； Xaa6 は Trp 又は Tyr；Xaa7 は His 又は Trp；及び Xaa8 は Leu 又
は Met；及び Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xa
a9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13 (配列番号：16)、ここで Xaa4 は Ser, Arg, 又は Asp； Xaa5 は Ala, Ser, 又は Thr； Xaa6 は Trp 又は Tyr； Xaa7 は His
又は Trp； Xaa8 は Leu 又は Met； 及び Xaa9 は Glu, Ser, Thr 又は Val。
【０００７】 血清アルブミンに結合する好ましいペプチドリガンドは、直鎖状又は環状のペ
プチド、好ましくは次の式を含む環状のペプチド化合物を含む： (Xaa)x-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-(Xaa)z (Xaa)x-Phe-Cys-Xaa-Asp-Trp-Pro-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Cys-(Xaa)z (Xaa)x-Val-Cys-Tyr-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Cys-Phe-(Xaa)z (Xaa)x-Cys-Tyr-Xaa1-Pro-Gly-Xaa-Cys-(Xaa)z 及び (Xaa)x-Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-(Xaa)z Xaaがアミノ酸であり、x及びzが０（ゼロ）以上の全ての数、一般的には１０
０未満、好ましくは１０未満、より好ましくは０、１、２、３、４又は５、より
好ましくは４又は５であり、Xaa1がIle、Phe、Tyr及びValからなる群から選択さ
れる一般式のペプチド化合物であることが好ましい。
【０００８】 特定の態様では、本発明はペプチドリガンドドメイン及び活性ドメインを含む
ハイブリッド分子を形成する、生理活性化合物とペプチドリガンドの組み合わせ
に関する。本発明の生理活性化合物は治療又は診断用の薬剤として利用できるあ
らゆる化合物を含む。生理活性化合物の非限定的な例としては、数例を挙げると
、酵素、ホルモン、サイトカイン、抗体又は抗体断片等のポリペプチド、並びに
鎮痛薬、解熱剤、抗炎症剤、抗生物質、抗ウィルス剤、抗真菌剤、心血管作動薬
、腎機能及び電解質代謝に効果のある薬剤、中枢神経系に作用する薬剤及び化学
療法剤等の有機化合物が含まれる。 好ましい実施態様では、ペプチドリガンドドメイン及び活性ドメインを含むハ
イブリッド分子は、活性ドメインを含むがペプチドリガンドドメインを欠く同様
の生理活性分子に比較すると薬物動態的又は薬理学的な特性が改善されている。
ハイブリッドの改善された薬物動態的又は薬理的な特性によって、低用量製剤及
び新規な製薬組成物が提供される。ある態様では、本発明はハイブリッド分子の
治療的又は診断的使用を含む新規な組成物の使用方法を提供する。
【０００９】 特定の態様では、本発明はペプチドリガンドと比較的短い消失半減期を有する
生理活性化合物の組み合わせに関する。組み合わせは、例えば生理活性化合物の
消失半減期を増大させることによって生理活性化合物のインビボ使用を包含する
本発明の態様における生理活性化合物の治療的又は診断的効果を改善させること
を含む、様々な目的を考慮して調製される。血清アルブミン、免疫グロブリン、
アポリポタンパク質又はトランスフェリン等の血漿タンパク質に対するペプチド
リガンドの生理活性化合物との融合又は結合（つまり「コンジュゲート」）は、
増大した消失半減期を有する組成物を提供する。このような組み合わせ又は融合
は、従来から組み換え宿主細胞で、又は二官能性の架橋剤の使用によって作成さ
れる。 本発明の他の態様では、ここで開示される例えばＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガン
ド等の免疫グロブリンに対する結合親和性のあるペプチドリガンドを用いて抗体
を精製するための方法及び組成物が含まれる。 本発明はさらに、ここで開示される組成物の治療又は診断的な用途にも及ぶ。
従って、本発明は、製薬的に許容可能な賦形剤と本発明のハイブリッド分子を含
む製薬組成物を包含する。
【００１０】 （好ましい実施態様の詳細な説明） Ｉ．定義 本発明の文脈における「ペプチドリガンド」なる用語は、特定の標的分子に結
合するように機能する非自然発生アミノ酸配列を指して意味する。本発明の文脈
におけるペプチドリガンドは、一般的に拘束されている(つまり、例えばβター
ン又はβプリーツシートを引き起こすアミノ酸の存在ような構造のいくつかのエ
レメントを有している、又は例えばジスルフィド結合したCys残基の存在により
環化している)か、又は拘束されていない(線形)、約５０アミノ酸残基未満、好
ましくは約４０アミノ酸残基未満のアミノ酸配列である。約４０アミノ酸残基未
満のペプチドリガンドでも、約１０〜約３０アミノ酸残基のペプチドリガンド、
特に約２０のアミノ酸残基のペプチドリガンドが好ましい。しかしながら、現在
の開示を読むと、当業者であれば、本発明のペプチドリガンドを区別するのは特
定のペプチドリガンドの長さではなく、特定の標的分子に結合するその能力であ
ることを認識するであろう。よって、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０
、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２
、２３、２４及び２５アミノ酸残基のペプチドリガンドが、同様に本発明の文脈
におけるペプチドリガンドに適している。 本発明のペプチドリガンドは、ペプチドリガンドが標的分子、例えばインビト
ロで、好ましくはインビボで特定細胞型担持標的分子に「帰着する（homes）」
、「結合する」又は「標的とする」ならば、十分な親和性と特異性を持って標的
分子に結合するであろう(例えば、Pasqualini及びRuoslahti(1996) Nature, 380
：364-366、及びArapら,(1998) Science, 279：377-380における「帰着する」、
「帰着」及び「標的」という用語の使用を参照されたい)。一般的に、ペプチド
リガンドは、約１μＭ未満、好ましくは約１００ｎＭ未満、特に好ましくは約１
０ｎＭ未満の解離定数、Ｋｄで特徴づけられる親和性で標的分子に結合する。し
かしながら、標的分子に対して約１ｎＭ未満、好ましくは約１ｐＭ〜１ｎＭの親
和力を有するペプチドリガンドが、同様に有望な本発明のペプチドリガンドであ
る。一般に、前記のように特定の標的分子に結合するペプチドリガンドは、ここ
に記載されるような当分野に標準的な多くの技術の任意のものにより単離し、同
定することができる。
【００１１】 ペプチドリガンドは自然、並びに非自然的に生じたアミノ酸残基を含有してい
てもよい上述したアミノ酸配列である。よって、特定のアミノ酸又はペプチドの
構造を模倣した非アミノ酸化学構造を含みうる、いわゆる「ペプチド模倣物」及
び「ペプチド類似物」も本発明の文脈におけるペプチドリガンドとできる。この
ような模倣物及び類似物は、類似の物理的特徴、例えば大きさ、電荷又はそれら
のペプチド対の片方に見出されるような適切な空間的配向にある疎水性等を示す
ものとして一般に特徴付けられる。ペプチドの模倣化合物の特定の例は、一又は
複数のアミノ酸間のアミド結合が、例えば炭素-炭素結合又は当該分野でよく知
られている他の結合で置換された化合物である(例えば、Sawyer, in Peptide Ba
sed Drug Design pp.378-422(ACS, Washington DC 1995)を参照のこと)。 従って、本発明の範囲における「アミノ酸」なる用語は最も広い意味に使用さ
れ、自然に生じるＬα-アミノ酸又は残基を含むことを意味する。自然に生じる
アミノ酸に対して一般的に使用されている１文字及び３文字略号がここでも使用
される(Lehninger, A.L., Biochemistry, 第2版, pp.71-92,(1975) Worth Publi
shers, New York)。標準的な１文字の記号と標準的な３文字の記号の間の対応は
、当業者にはよく知られており、ここに記述しておく：Ａ＝Ａｌａ；Ｃ＝Ｃｙｓ
；Ｄ＝Ａｓｐ；Ｅ＝Ｇｌｕ；Ｆ＝Ｐｈｅ；Ｇ＝Ｇｌｙ；Ｈ＝Ｈｉｓ；Ｉ＝Ｉｌｅ
；Ｋ＝Ｌｙｓ；Ｌ＝Ｌｅｕ；Ｍ＝Ｍｅｔ；Ｎ＝Ａｓｎ；Ｐ＝Ｐｒｏ；Ｑ＝Ｇｌｎ
；Ｒ＝Ａｒｇ；Ｓ＝Ｓｅｒ；Ｔ＝Ｔｈｒ；Ｖ＝Ｖａｌ；Ｗ＝Ｔｒｐ；Ｙ＝Ｔｙｒ
。この用語には、Ｄ-アミノ酸、並びに化学的に修飾されたアミノ酸、例えばア
ミノ酸類似物、ノルロイシン等のタンパク質に通常導入されない自然に生じるア
ミノ酸、及びアミノ酸に特徴的な当該分野において公知の特性を有する化学的に
合成された化合物が含まれる。例えば、天然Ｐｈｅ又はＰｒｏと同じペプチド化
合物の配座制限を許容するフェニルアラニン又はプロリンの類似物又は模倣物が
、アミノ酸の定義に含まれる。このような類似物及び模倣物はここではアミノ酸
の「機能的等価物」と称する。アミノ酸の他の例は、出典を明示してここに取り
込まれるRoberts及びVellaccio The Peptides：Analysis, Synthesis, Biology,
Gross及びMeiehofer, eds., Vol.5 p341, Academic Press, Inc, N.Y. 1983に
列挙されている。
【００１２】 ペプチドリガンドは例えば、標準的な固相合成法により合成され、遺伝子によ
りコードされるアミノ酸に限定されない。遺伝子コードによりコードされない一
般的に遭遇するアミノ酸には、例えば国際公開番号ＷＯ９０／０１９４０に記載
されているもの、例えばＧｌｕ及びＡｓｐについての２-アミノアジピン酸（Ａ
ａｄ）；Ｇｌｕ及びＡｓｐについての２-アミノピメリン酸（Ａｐｍ）；Ｍｅｔ
、Ｌｅｕ、及び他の脂肪族アミノ酸についての２-アミノブチル酸（Ａｂｕ）；
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、及び他の脂肪族アミノ酸についての２-アミノヘプタン酸（Ａ
ｈｅ）；Ｇｌｙについての２-アミノイソブチル酸（Ａｉｂ）；Ｖａｌ、及びＬ
ｅｕ及びＩｌｅについてのシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；Ａｒｇ及びＬｙ
ｓについてのホモアルギニン（Ｈａｒ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓについての
２,３-ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及びＡｌａについての
Ｎ-エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及びＡｌａについてのＮ-エ
チルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ａｓｎ、及びＧｌｎについてのＮ-エチルアスパ
ラギン（ＥｔＡｓｎ）；Ｌｙｓについてのヒドロキシルリジン（Ｈｙｌ）；Ｌｙ
ｓについてのアロヒドロキシルリジン（ＡＨｙｌ）；Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、及びＴｈ
ｒについての３-(及び４)-ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ）；Ｉｌｅ
、Ｌｅｕ、及びＶａｌについてのアロ-イソロイシン（ＡＩｌｅ）；Ａｌａにつ
いてのｐ-アミジノフェニルアラニン；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、及びＡｌａについての
Ｎ-メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ、サルコシン）；ＩｌｅについてのＮ-メチルイ
ソロイシイン（ＭｅＩｌｅ）；Ｍｅｔ及び他の脂肪族アミノ酸についてのノルバ
リン（Ｎｖａ）；Ｍｅｔ及び他の脂肪族アミノ酸についてのノルロイシン（Ｎｌ
ｅ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓについてのオルニチン（Ｏｒｎ）；Ｔｈｒ、Ａ
ｓｎ及びＧｌｎについてのシトルリン（Ｃｉｔ）及びメチオニンスルホキシド（
ＭＳＯ）；Ｐｈｅについてのメチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、トリメチ
ルフェニルアラニン、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩ）フェニルアラニン、トリ
フルオリルフェニルアラニンが含まれる。 本発明の文脈におけるペプチドリガンドは「設計」されうる、つまりそれらは
非天然の又は非天然的に生じたペプチドリガンドである。「非天然の」又は「非
天然的に生じた」とは、特定のペプチドリガンドのアミノ酸配列が天然に見出さ
れないことを意味する。つまり、非天然の又は非天然的に生じたペプチドリガン
ドのアミノ酸配列は、天然発生タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列と
一致しない。この多様なペプチドリガンドは、当業者によく知られている種々の
技術を使用して作成又は選択されうる。例えば、拘束されている又は拘束されて
いないペプチドライブラリが無作為に作製され、該分野の標準的な技術、例えば
Lowmanら, (1998) Biochemistry 37：8870-8878を利用してファージにディスプ
レイする。
【００１３】 本発明の文脈で使用される際のペプチドリガンドは、治療又は診断用の物質に
「コンジュゲート」されうる。「コンジュゲート」という用語は、広義に使用さ
れ、当該分野で既知の結合又は接合の全ての方法を包含する。例えば、典型的な
実施態様では、治療又は診断用の物質はタンパク質であり（ここで「タンパク質
性治療剤」と称される）、ペプチドリガンドはタンパク質性治療剤のＣ又はＮ末
端のアミノ酸伸長部分をなすであろう。さらに、タンパク質性治療剤とペプチド
リガンドの間には短いアミノ酸リンカー配列を置いてもよい。このシナリオにお
いて、ペプチドリガンド、任意のリンカー及びタンパク質性治療剤をタンパク質
性治療剤をコードする配列を含む核酸によってコードしていてもよく、場合によ
っては以下に記載する短いポリペプチドをコードする任意のリンカー配列、及び
ペプチドリガンドをコードする配列に（ＤＮＡ配列が近接、又は読み枠にあると
いう意味で）連結している。この典型的なシナリオにおいて、ペプチドリガンド
はタンパク質性治療剤に場合によってはリンカー配列を介して「コンジュゲート
され」ると考えられる。関連した実施態様では、ペプチドリガンドアミノ酸配列
は、当然ペプチドリガンドアミノ酸配列の挿入によってタンパク質性治療剤の機
能を妨げないで提供されるように、タンパク質性治療剤アミノ酸配列の部分に組
み込まれ、又は置換される。この実施態様において、「コンジュゲート」はペプ
チドリガンドをコードする配列に介入され、作用可能に連結されるタンパク質性
治療剤をコードする配列を含む核酸によりコードされうる。更なる典型的な実施
態様では、ペプチドは、タンパク質性治療剤又は他の治療剤に、場合によっては
ペプチドはリンカー配列を介して例えば化学的にコンジュゲートすること等によ
り連結されうる。典型的には、この実施態様においてペプチドリガンドは、アミ
ノ酸の側鎖を介して治療剤の活性を妨げないタンパク質性治療剤の中のどこかで
タンパク質性治療剤に連結されうる。繰り返すと、ペプチドは治療剤に「コンジ
ュゲート」されると考えられる。
【００１４】 本発明の中で使用される「標的分子」という用語は、タンパク質、ペプチド、
糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖、核酸等を含む。標的分
子は、例えば、これに限らないが、血清アルブミン、免疫グロブリン、アポリポ
タンパク質又はトランスフェリン等の血漿タンパク質を含む様々な血清因子等の
細胞外分子、又は赤血球又はリンパ球の表面に見られるタンパク質を含み、当然
、細胞表面タンパク質へのペプチドリガンドの結合は細胞の通常機能を実質的に
妨げないように提供される。 「抗体」及び「免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの
同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパ
ク質である。 抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片又は領域と呼ばれる２つの同一の抗原
結合断片を生成し、各々が単一の抗原結合部位と残りの「Ｆｃ」断片又は領域を
持つ。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、ヒトＩ
ｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０の位置のアミノ酸残基
からカルボキシ末端まで伸展すると定義される。 ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、さらに抗原を架橋させ得る
Ｆ(ａｂ')２断片が得られる。Ｆａｂ’断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第
１定常ドメイン(ＣＨ１)を含む。 「治療」とは、治療的処置及び予防又は抑制手段の両方を指す。治療の必要が
あるものには、既に羅患しているもの、並びに疾患が予防されるべきものが含ま
れる。 治療の目的とされる「哺乳動物」とは、ヒト、家庭及び農場用動物、及び動物
園、スポーツ又はペット用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む、哺乳
動物に分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは哺乳動物はヒトである。 「疾患」は本発明のペプチドリガンドを含有する組成物で治療することで恩恵
を得るあらゆる症状のことである。これには、問題の疾患に哺乳動物を罹患させ
る素因になる病理状態を含む、慢性及び急性の疾患又は病気が含まれる。
【００１５】 「消失半減期」は通常の意味で使用され、Goodman and Gillman's The Pharma
ceutical Basis of Therapeutics 21-25 (Alfred Goodman Gilman, Louis S. Go
odman, and Alfred Gilman, eds., 6th ed. 1980)に記載されている。概略して
言うと、この用語は薬剤消失の時間的経過の量的な測定を包含して意味する。通
常、薬剤濃度は消失過程飽和に要求される値には至らないので、多くの薬剤の消
失は指数関数的である（つまり一次速度式に従う）。指数関数過程の度合は、時
間の単位あたりの機能変化を表すその速度定数ｋにより、又はその半減期ｔ１／ ２ 、過程の完了度が５０％になるのに必要とされる時間によって表される。これ
らの２つの定数の単位はそれぞれ時間−１と時間である。一次速度定数及び反応
の半減期は単純な関係（ｋｘｔ１／２＝０．６９３）であり、適宜交換すること
ができる。一次消失速度は一定割合の薬剤を単位時間あたりに失うことを示すの
で、時間に対する薬剤濃度の対数のプロットは初期分散相（つまり薬剤の吸収と
分散が完了した後）から全ての時間で直線となる。薬剤消失の半減期はグラフ等
から正確に決定することができる。
【００１６】 「形質移入」とはあらゆるコード配列が実際に発現されるかされないにかから
わず、宿主細胞によって発現ベクターが取り込まれることを意味する。数多くの
形質移入法が当業者に知られており、例えばＣａＰＯ４沈殿及びエレクトロポレ
ーションである。成功裏の形質移入はこのベクターの作用の任意の指標が宿主細
胞内で生じる場合に一般に認められる。 「形質転換」は、生物にＤＮＡを導入し、染色体外成分として又は染色体組み
込みとして、ＤＮＡが複製されることを意味する。使用される宿主細胞によって
、形質転換は、該細胞に適した基本的な技術を用いて成される。Sambrook等のMo
lecular Cloning (第２版), Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1989）の１
．８２章に記載されているような塩化カルシウムを使用したカルシウム処理は、
一般に頑丈な細胞壁バリヤーを含む原核生物又は他の細胞で使用される。Shaw等
, (1983)Gene, 23: 315及び１９８９年６月２９日に公開のＷＯ ８９／０５８５
９に記載のように、アグロバクテリウム ツメファシエンスでの感染はある植物
細胞の形質転換に用いられる。そのような細胞壁を持たない哺乳動物細胞にとっ
ては、上掲のSambrook等,の１６．３０−１６．３７章に記載のリン酸カルシウ
ム析出法が好ましい。哺乳動物細胞ホストシステム形質転換の一般的な形態は、
Axelにより、１９８３年８月１６日発行の米国特許第4,399,216号に記載されて
いる。酵母の形質転換は、典型的にはVan Solingen等, (1977)J. Bact., 130:94
6及びHsiao等, (1979)Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76:3829の方法により実施
される。しかしながら、核酸移入、エレクトロポレーション、又はプロトプラス
ト融合によるような細胞にＤＮＡを導入する他の方法もまた使用することができ
る。
【００１７】 ここで使用されるように、「肺投与」という用語は、吸入により肺を通しての
本発明の製品の投与を意味する。ここで使用されるように、「吸入」という用語
は、肺胞への気体の吸気を意味する。特定の実施態様では、取り込みは、本発明
の製品の自己投与により、又は、例えばレスピレータを使用する患者に対しての
レスピレータを介しての投与により生じうる。本発明の製品に関して使用される
「吸入」という用語は、「肺投与」と同義である。 ここで使用される場合、「非経口」なる用語は、腸以外によって、特に静脈内
(i.v.)、動脈内(i.a.)、腹膜内(i.p.)、筋肉内(i.m.)、心室内、及び皮下(s.c.)
経路で本発明の化合物を導入することを意味する。 ここで使用されるように、「エアロゾル」という用語は、気体のサスペンショ
ンを意味する。特に、エアロゾルは、本発明の製品の粒子化及び気体へのそのサ
スペンションに関する。本発明によれば、エアロゾル製品は、エアロゾル化に適
した本発明の化合物、例えば吸入又は肺投与のための粒子化及び気体へのサスペ
ンションを含む製品である。
【００１８】 ＩＩ．本発明の実施の方法 Ａ．ペプチドリガンド 本発明の文脈中でのペプチドリガンドは、標的、好ましくは血清アルブミン又
は免疫グロブリン等の血清タンパク質に結合し、直接結合アッセイで、又は標的
結合についての標的に対する既知のリガンドとの競合能力によって同定すること
ができる。血清アルブミンと結合する好ましいペプチドリガンドは、直鎖状又は
環状のペプチド、好ましくは次の式を含む環状の化合物を含むか、又は次の式の
ペプチドを有する特定哺乳動物種の血清アルブミン結合に競合するペプチドであ
る： (Xaa)x-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-(Xaa)z (Xaa)x-Phe-Cys-Xaa-Asp-Trp-Pro-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Cys-(Xaa)z (配列番号：
y) (Xaa)x-Val-Cys-Tyr-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Cys-Phe-(Xaa)z (配列番号：y2) (Xaa)x-Cys-Tyr-Xaa1-Pro-Gly-Xaa-Cys-(Xaa)z (配列番号：y3) 及び(Xaa)x-Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-(Xaa)z (配列番号
：z) 上記の一般式のペプチド化合物であることが好ましく、ここでXaaはアミノ酸
であり、x及びzは０（ゼロ）以上の全ての数、一般的には１００未満、好ましく
は１０未満、より好ましくは０、１、２、３、４又は５、より好ましくは４又は
５であり、Xaa1はIle、Phe、Tyr及びValからなる群から選択される。 血清アルブミンに結合する更に好ましいペプチドリガンドはここで記載される
ように次の一般式 (Xaa)x-Trp-Cys-Asp-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Ala-Xaa-Asp-Leu-Cys-
(Xaa)z 及び (Xaa)x-Asp-Leu-Val-Xaa-Leu-Gly-Leu-Glu-Cys-Trp-(Xaa)z （ここでXaaがアミノ酸であり、x及びzがゼロ以上の全ての数、一般的には１０
０未満、好ましくは１０未満、より好ましくは０、１、２、３、４又は５、より
好ましくは４又は５である）に関して同定される。
【００１９】 本明細書のこの態様に従って、図、及び特に哺乳動物の血清アルブミンに結合
するペプチドリガンド選択に適当なアミノ酸、及び例示されるペプチドについて
はＦｉｇ．５Ａ及び５Ｂ、８Ａ、８Ｂ及び８Ｃ及びＦｉｇ．９を作成した。好ま
しい態様では、数種の血清アルブミンにわたって結合するペプチドリガンドの選
択についてはＦｉｇ．９に具体例を示した。 本発明のこの態様に従う好ましい化合物は次のものを含む： Asp-Leu-Cys-Leu-Arg-Asp-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp (配列番号：z1) Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp (配列番号：z2) Met-Glu-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-Glu-Asp (配列番号：z
3) Gln-Arg-Leu-Met-Glu-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-Glu-Asp-
Asp-Phe (配列番号：z4) Gln-Gly-Leu-Ile-Gly-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-Gly-Asp-
Ser-Val (配列番号：z5) Gln-Gly-Leu-Ile-Gly-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-Gly-Asp-
Ser-Val-Lys (配列番号：z6) Glu-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-Glu-Asp-Asp (配列番号：z
7) Arg-Leu-Met-Glu-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-Glu-Asp-Asp
(配列番号：z8) Met-Glu-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-Glu-Asp-Asp (配列番
号：z9) Met-Glu-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-Glu-Asp (配列番号：z
lO) Arg-Leu-Met-Glu-Asp-Ile-Cys-Leu-Ala-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-Gly-Asp-Asp
(配列番号：z11) Glu-Val-Arg-Ser-Phe-Cys-Thr-Asp-Trp-Pro-Ala-Glu-Lys-Ser-Cys-Lys-Pro-Leu-
Arg-Gly (配列番号：z12) Arg-Ala-Pro-Glu-Ser-Phe-Val-Cys-Tyr-Trp-Glu-Thr-lle-Cys-Phe-Glu-Arg-Ser-
Glu-Gln (配列番号：z13) Glu-Met-Cys-Tyr-Phe-Pro-Gly-Ile-Cys-Trp-Met (配列番号：z14)
【００２０】 好ましい実施態様では、本発明のペプチドリガンドはＩｇＧ-Ｆｃに結合し、 インビトロアッセイにおいてＩｇＧ-Ｆｃの結合についての、次の一般式を有す
るペプチドリガンドとの競合能力によって同定することができる： Xaai-Cys-Xaaj-Cys-Xaak (配列番号：1)、ここで Xaai は欠いている、又は１
〜４のアミノ酸、好ましくは４のアミノ酸のペプチドであり；Xj は好ましい配
列 Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Val-Trp (配列番号：10)；又は Xaa-Xaa-Xaa-
Xaa-Gly-Glu-Leu-Val-Trp (配列番号：11)；又は Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Gly-Glu
-Leu-Val-Trp (配列番号：12)を有する９のアミノ酸が好ましく、ここで Xaa1 は Ala, Ser, 又は Thr；Xaa2 は Trp 又は Tyr；Xaa3 は His, 又は Trp；Xaa4 は Leu 又は Met、及び Xaak は欠いている、又は１〜５のアミノ酸、好ましく
は５のアミノ酸であり、環状のペプチド又はその類似物が上記のようなＩｇＧ-
Ｆｃに結合する量的生物活性を保持する限りにおいて選択される。 この化合物群の中で好ましいものは次の配列を含む化合物である： Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa-Xaa-Xa
a-Xaa-Xaa (配列番号：13)； Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa-Xaa-Xa
a-Xaa-Xaa(配列番号：14)； Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xa
a9-XaalO-Xaa11-Xaal2-Xaal3 (配列番号：15)、ここで Xaa5 は Ala, Ser, 又は Thr；Xaa6 は Trp 又は Tyr；Xaa7 は His, 又は Trp；及び Xaa8 は Leu 又は Met；及び Xaal-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xa
a9-Xaal0-Xaa11-Xaal2-Xaa13 (配列番号：16)、ここで Xaa4 は Ser, Arg, 又は Asp；Xaa5 は Ala, Ser, 又は Thr；Xaa6 は Trp, Tyr；Xaa7 は His, 又は Tr
p；Xaa8 は Leu 又は Met；及び Xaa9 は Glu, Ser, Thr 又は Valである。好ま
しい実施態様では、本発明のＩｇＧ-Ｆｃ結合ペプチドリガンドは、ここで示さ
れる配列番号：3−配列番号：4、配列番号：9；及び配列番号：13−配列番号：1
11に示されるあらゆるペプチドリガンドと競合し、好ましくはＩｇＧ-Ｆｃに結
合する配列番号：9と競合しうる。
【００２１】 他の好ましい実施態様では、本発明のペプチドリガンドはヒト血清アルブミン
に結合し、インビトロアッセイにおけるヒト血清アルブミンの結合についての、
次の一般式を有するペプチドリガンドとの競合能力によって同定することができ
る： (Xaa)x-Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-(Xaa)z (Xaa)x-Phe-Cys-Xaa-Asp-Trp-Pro-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Cys-(Xaa)z (Xaa)x-Val-Cys-Tyr-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Cys-Phe-(Xaa)z 又は (Xaa)x-Cys-Tyr-Xaa1-Pro-Gly-Xaa-Cys-(Xaa)z ここで Xaa はアミノ酸、ｘ及びｚは好ましくは４又は５であり、Xaa1はIle、Ph
e、Tyr及びValからなる群から選択される。 好ましい実施態様では、本発明のヒト血清アルブミン結合ペプチドリガンドは
ここで前記される配列番号：z2−z14に示されるあらゆるペプチドリガンドと競
合し、好ましくはヒト血清アルブミン結合について配列番号：z4と競合しうる。
【００２２】 以上から理解されるように、「競合する」及び「競合能力」という用語は相対
的な用語である。よって、本発明のペプチドリガンドを記述するために用いられ
る際のこの用語は、ここで記載したような標準的な競合アッセイにおいて、５０
μＭで存在する場合、好ましくは１μＭ、より好ましくは１００μＭで存在する
場合、好ましくは１ｎＭ以下で存在する場合の、例えば配列番号：9又は配列番
号：z4の結合の５０％を阻害するペプチドリガンドを意味する。このようなペプ
チドリガンドは、一般的に実施例の章に記載するような標準的な競合アッセイで
測定されるように約１μＭ未満、好ましくは約１００ｎＭ未満、より好ましくは
約１０ｎＭ未満の親和性でＩｇＧ-Ｆｃに結合する。しかしながら、血清タンパ
ク質、例えば血清アルブミン又はＩｇＧ-Ｆｃに対して約１ｎＭ未満、好ましく
は約１ｐＭ〜１ｎＭの親和性を有するペプチドリガンドも同様に本発明の文脈に
おけるペプチドリガンドに適している。 ペプチド又は他の化合物がここで記載したようなＩｇＧ-Ｆｃ（又は他の血漿
タンパク質、例えば血清アルブミン）への結合についてペプチドリガンドと競合
する「能力」を有するかを決定するインビトロアッセイシステムについて、当業
者であれば多数の標準的な競合アッセイの任意のものを使用することができる。
競合結合アッセイは、限定された量のリガンドに結合する試験試料検体と競合す
る、標識した標準物の能力に依存する。試験試料の検体の量は、リガンドに結合
することになる標準物の量に反比例する。 よって、当業者は、限定するものではないが、数例を挙げると、放射免疫測定
（ＲＩＡ）、酵素免疫測定（ＥＩＡ）、好ましくは酵素結合免疫測定（ＥＬＩＳ
Ａ）、「サンドウィッチ」免疫測定、免疫放射定量測定、蛍光免疫測定、及び免
疫電気泳動測定等の技術を用いる競合アッセイシステムを含む手段を用いて、ペ
プチド又は他の化合物がＩｇＧ-Ｆｃ（又は血漿タンパク質等の他の標的）に結
合するペプチドリガンドと競合する能力を有するかを決定してもよい。
【００２３】 これらの目的のために、選択されたペプチドリガンドは検出可能成分で標識さ
れ（検出可能煮標識したペプチドリガンドを、ここで「トレーサー」と呼ぶ）、
ＩｇＧ-Ｆｃドメイン又は他の標的の結合について候補化合物との競合アッセイ
に使用される。多くの検出可能な標識が使用可能であり、好ましくは次の範疇に
グループ分けできる： （ａ）放射性同位体、例えば、３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ
等。ペプチド化合物は、例えばColigen等, 編, Current Protocols in Immunolo
gy, Volumes 1 and 2 (1991), Wiley-Interscience, New York, N. Yに記載され
た技術を用いて放射性同位体で標識され、放射活性はシンチレーションカウンテ
ィングにより測定できる。 （ｂ）蛍光標識、例えば希土類キレート（ユーロピウムキレート）又はフルオ
レセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、リサミン(lis
samine)、フィコエリトリン及びテキサスレッド等が使用できる。蛍光標識は、
例えば上掲のCurrent Protocols in Immunologyに開示された技術を用いてペプ
チド化合物にコンジュゲートさせることができる。蛍光は、蛍光光度計を用いて
定量化できる。 （ｃ）種々の酵素−基質標識が利用でき、米国特許第4,275,149号は、それら
の幾つかの概説を提供している。酵素は好ましくは種々の技術を用いて測定可能
な色素原基質の化学変換を触媒する。例えば、酵素は基質における色変化を触媒
し、それは分光学的に測定可能である。あるいは、酵素は基質の蛍光又は化学発
光を変化させることもある。蛍光変化を定量化する技術は上述している。化学発
光基質は化学反応によって電子的に励起され、次いで（例えば化学発光計を用い
て）測定可能な光を放出する、または蛍光受容体にエネルギーを供与しうる。酵
素標識の例は、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフ
ェラーゼ；米国特許第4,737,456号）、ルシフェリン、２，３-ジヒドロフタラジ
ンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、セイヨウワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラク
トシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソザイム、糖類オキシダーゼ（例えば、グル
コースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-６-ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼ）、ヘテロ環オキシダーゼ（ウリカーゼ及びキサンチンオ
キシダーゼ等）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等を含む。
【００２４】 酵素−基質の組み合わせの例は、例えば以下を含む： (i)セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と基質としての過酸化水素、
過酸化水素が染料前駆物質（例えば、ＡＢＴＳ、オルトフェニレンジアミン（Ｏ
ＰＤ）又は３,３',５,５'-テトラメチルベンジジンヒドロクロリド（ＴＭＢ））
を酸化する； (ii)アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と色素原基質としてのパラ-ニトロフェ
ニルホスフェート；及び (iii)β-Ｄ-ガラクトシダーゼ（β-Ｄ-Ｇａｌ）と色素原基質（例えば、ｐ-ニ
トロフェニル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ）又は蛍光原基質４-メチルウンベリフェ
リル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ。
【００２５】 特定のアッセイによれば、トレーサーは固定化された標的とともに、種々の濃
度の非標識候補化合物の存在下でインキュベートされる。有効候補化合物の濃度
を増加させると、トレーサーの固定化標的への結合と効果的に競合する。最大の
結合トレーサーの５０％の非標識候補化合物の濃度が「ＩＣ５０」と呼ばれ、候
補化合物のＩｇＧ結合親和性を反映する。従って、１ｍＭのＩＣ５０を持つ候補
化合物は、1μＭのＩＣ５０を持つ候補ペプチドよりも標的と実質的に弱い相互
作用を示す。 いくつかのファージディスプレイＥＬＩＳＡアッセイでは、変異した（「ｍｕ
ｔ」）配列の結合親和性は、B.C. Cunningham, D.G. Lowe, B. Li, B.D. Bennet
t, and J.A. Wells, EMBO J. 13:2508 (1994)に記載される方法を用いてコント
ロール（「ｃｏｎ」）ペプチドに対して比較され、パラメータＥＣ５０により特
徴づけられる。アッセイは、ＥＣ５０(con)/ＥＣ５０(mut)がＫｄ(con)/Ｋｄ(mu
t)に近い条件下で実施された。 従って、本発明は、記載したインビトロアッセイにおいてＩｇＧ又はヒト血清
アルブミン等の標的分子結合について「競合する能力を有する」化合物を提供す
る。好ましくは、化合物はＩｇＧ又はヒト血清アルブミン等の標的に対して1μ
Ｍ未満のＩＣ５０を持つ。これらの化合物の中で好ましいのは、約１００ｎＭ未
満、好ましくは約１０ｎＭ未満、又は約１ｎＭ未満のＩＣ５０を持つ化合物であ
る。本発明のこの態様で更に好ましい実施態様では、化合物はＩｇＧ又はヒト血
清アルブミン等の標的分子に対して約１００ｐＭ未満、より好ましくは約１０ｐ
Ｍ未満のＩＣ５０を示す。 ここで記載されるペプチドリガンドと競合する候補化合物の能力を決定するた
めの好ましいインビトロアッセイは次のもので、実施例により十分に記載する。
好ましい実施態様では、候補化合物はペプチドである。ＩｇＧ又はヒト血清アル
ブミンに結合する標識したペプチドリガンドトレーサーと競合する候補化合物の
能力はＥＬＩＳＡを用いて測定される。候補化合物のバッファー希釈物をＩｇＧ
又はヒト血清アルブミンで被覆したマイクロタイタープレートに添加して（実施
例の章に記載されているように）トレーサーと共に１時間おく。マイクロタイタ
ープレートを洗浄バッファーで洗浄し、ＩｇＧ又はヒト血清アルブミンと結合し
たトレーサーの量を測定する。
【００２６】 Ｂ．ペプチドリガンド組み合わせ 本発明によれば、ペプチドリガンドはペプチドリガンドドメインと活性ドメイ
ンを含むハイブリッド分子を形成する生理活性化合物に連結していてもよい。本
発明の生理活性化合物は治療又は診断用の薬剤として利用できるあらゆる化合物
を含む。生理活性化合物の非限定的な例としては、酵素、ホルモン、サイトカイ
ン、抗体又は抗体断片等のポリペプチド、並びに鎮痛薬、解熱剤、抗炎症剤、抗
生物質、抗ウィルス剤、抗真菌剤、心血管作動薬、腎機能及び電解質代謝に効果
のある薬剤、中枢神経系に作用する薬剤、化学療法剤等の有機化合物が含まれる
。本発明によれば、ペプチドリガンドドメインは活性ドメインに場合によっては
可動性のリンカードメインを介して結合する。 本発明のハイブリッド分子は適切なペプチドリガンドと活性ドメインを組み合
わせることにより構築される。結合のタイプ及びその作成方法によれば、そのＮ
又はＣ末端を介してペプチドリガンドドメインは活性ドメインのＮ又はＣ末端に
加えられうる。例えば、組換え技術により本発明のハイブリッド分子を調製する
場合、場合によってはリンカードメインを介して、ペプチドリガンドをコード化
する核酸は活性ドメイン配列をコード化する核酸に作用可能に結合される。典型
的には、構築物は、ペプチドリガンドのＣ末端が活性ドメインのＮ末端に結合さ
れている融合タンパク質をコードしている。しかしながら、特に合成技術が使用
される場合、例えばペプチドリガンドのＮ末端が活性ドメインのＮ又はＣ末端に
結合されている融合体もまた可能である。
【００２７】 ある場合には、ペプチドリガンドドメインは、活性ドメインにそのＮ又はＣ末
端で結合するというよりもむしろ、活性ドメイン分子中に挿入されうる。この構
造はペプチドリガンドドメイン及び活性ドメインの機能を保持する限りにおいて
本発明を実施するのに使用できる。例えば、ペプチドリガンドは、免疫グロブリ
ンのその標的に結合する能力を妨げることなく免疫グロブリンの非結合軽鎖ＣＤ
Ｒに挿入されてもよい。ペプチドリガンドドメインに適合できる活性ドメイン分
子の領域は実験的に（つまり、挿入部位の選択、無作為化、及び生じたコンジュ
ゲートの活性ドメインの機能のアッセイにより）同定してもよく、又は関係する
活性ドメイン分子（例えばタンパク質である活性ドメイン）のファミリーの間の
配列比較によって低い配列相同性の領域があることを同定してもよい。低配列相
同性領域は、高度に保存された領域であるというよりもペプチドリガンドドメイ
ンの挿入を許容すると思われる。３次元構造が（例えば、Ｘ線結晶解析又はＮＭ
Ｒ研究により）分かっている活性ドメイン分子について、３次元構造はペプチド
リガンド挿入部位への誘導を与えうる。例えば、高い変動性（例えば、大きい温
度因子又は「Ｂ」因子）を有するループ又は領域は、高度に規則的な構造領域、
あるいはリガンド結合又は触媒作用に関する領域であるというよりもペプチドリ
ガンドドメイン挿入に順応すると思われる。
【００２８】 Ｃ．リンカードメイン 本発明に従うと、ペプチドリガンドドメインは、ペプチドリガンドドメインは
リンカーを介して活性ドメインに結合されてもよい。本発明のハイブリッド分子
のリンカー成分はハイブリッド分子の機能に必ずしも関与しないが寄与しうる。
従って、本発明では、リンカードメインは、活性ドメインとペプチドリガンドド
メインの間に空間的ブリッジを提供する任意の分子群である。 リンカードメインは変化できる長さ及び構成とできるが、本発明によれば、重
要なのはリンカードメインの長さその構造ではない。リンカードメインは、好ま
しくは、標的分子に対する立体的及び／又は高次構造的制約を実質的に生じない
で、ハイブリッド分子のペプチドリガンドドメインを結合させる。従って、リン
カードメインの長さは、ハイブリッド分子の２つの「機能」ドメイン、つまりペ
プチドリガンドと活性ドメインの性質に依存する。 当業者であれば、原子の様々な組み合わせが様々な結合間の既知の距離に基づ
いて可変長の分子を提供することが分かるであろう（Morrison及びBoyd, Organi
c Chemistry, 3版, Allyn及びBacon, Inc., Boston, MA (1977)）。例えば、リ
ンカードメインは可変長のポリペプチドでありうる。ポリペプチドのアミノ酸組
成がリンカーの性質と長さを決定する。好ましい実施態様において、リンカー分
子は柔軟な親水性ポリペプチド鎖を有する。具体的には、例えばここでの実施例
の章に記載されるもののようにリンカードメインは一又は複数のＧｌｙ及び又は
Ｓｅｒ残基を有する。
【００２９】 Ｄ．組換え合成 本発明は、ここに記載されるようなペプチドリガンド、又はペプチドリガンド
ドメインとポリペプチド活性ドメインを有するハイブリッド分子をコードする単
離された核酸、好ましくはＤＮＡを含む物質の組成物を包含する。本発明のペプ
チドをコードするＤＮＡは当該分野で知られている様々な方法によって調製する
ことができる。これらの方法は、限定されるものではないが、出典明示により開
示の全体がここに取り込まれるEngels等, (1989), Agnew. Chem. Int. Ed. Engl
., 28:716-734に記載された任意の方法、例えばトリエステル、亜リン酸、ホス
ホラミダイト及びＨ-ホスホネート法による化学合成を含む。一実施態様では、
発現宿主細胞により好まれるコドンはコード化ＤＮＡの設計に使用される。ある
いは、ペプチドをコードしているＤＮＡを、組換えＤＮＡ法、例えば部位特異的
突然変異誘発（Kunkel等, (1991) Methods Enzymol., 204:125-139; Carter等,
(1986） Nucl. Acids Res. 13:4331; Zoller等, (1982) Nucl. Acids Res. 10:6
487）、カセット突然変異誘発（Wells等, (1985) Gene 34:315）、制限選択突然
変異誘発（Carter, Directed Mutagenesis: A Practical Approach (M. J. McPh
erson, ed.) IRL Press, Oxford, 1991）等々を使用して一又は複数の変異体を
コードするように変更させることができる。 上記したような好ましい態様では、核酸は標的分子に結合する能力のあるペプ
チドリガンドをコードする。標的分子は、例えば、細胞外分子、例えばこれに限
らないが血清アルブミン、免疫グロブリン、アポリポタンパク質又はトランスフ
ェリン等の血漿タンパク質を含む様々な血清因子、又は赤血球又はリンパ球の表
面に見られるタンパク質を含み、当然、細胞の通常の機能を実質的に妨げない細
胞表面タンパク質へのペプチドリガンドの結合を提供する。
【００３０】 本発明の他の好ましい態様では、核酸はペプチドリガンドドメイン配列及び活
性ドメインを含むハイブリッド分子をコードする。本発明のこの態様において、
活性ドメインは治療又は診断用の薬剤として利用できるあらゆるポリペプチド化
合物、例えば、酵素、ホルモン、サイトカイン、抗体又は抗体断片を含みうる。
本発明のこの態様における核酸分子はハイブリッド分子をコードし、ペプチドリ
ガンドドメイン配列をコードする核酸は生物活性剤をコードする核酸に（ＤＮＡ
配列が近接している又は読み枠にあるという意味で）連結していてもよい。場合
によっては、ＤＮＡ配列はリンカードメインアミノ酸配列をコードする核酸配列
によって連結されうる。 この態様において、本発明は更に、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ分子
に作用可能に結合した発現コントロール配列、ベクターで形質転換した宿主細胞
によりコントロール配列が認識されるＤＮＡ分子を含むプラスミド等の発現ベク
ターを含む。一般的には、プラスミドベクターは宿主細胞と適合性がある種から
取り出された複製及びコントロール配列を含む。ベクターは通常、複製部位並び
に形質転換細胞において表現型の選択を提供することができるタンパク質をコー
ドする配列を有する。
【００３１】 原核生物宿主中での発現に対しては、好適なベクターにはｐＢＲ３２２（ＡＴ
ＣＣ第３７０１７）、ｐｈＧＨ１０７（ＡＴＣＣ第４００１１）、ｐＢＯ４７５
、ｐＳ０１３２、ｐＲＩＴ５、ｐＲＩＴ２０又はｐＲＩＴ３０シリーズの任意の
ベクター（Nilsson及びAbrahmsen (1990), Meth. Enzymol., 185:144-161）、ｐ
ＲＩＴ２Ｔ、ｐＫＫ２３３-２、ｐＤＲ５４０及びｐＰＬ-ラムダが含まれる。本
発明の発現ベクターを含む原核生物宿主細胞には、大腸菌Ｋ１２株２９４(ＡＴ
ＣＣ第３１４４６)、大腸菌株ＪＭ１０１（Messing等, (1981) Nucl. Acid Res.
, 9:309）、大腸菌株Ｂ、大腸菌χ１７７６(ＡＴＣＣ第３１５３７)、大腸菌ｃ
６００、大腸菌Ｗ３１１０(Ｆ-、ガンマ-、原栄養菌株、ＡＴＣＣ第２７３２５)
、大腸菌株２７Ｃ７（Ｗ３１１０、ｔｏｎＡ、ｐｈｏＡ、Ｅ１５、（ａｒｇＦ-
ｌａｃ）１６９、ｐｔｒ３、ｄｅｇＰ４１、ｏｍｐＴ、ｋａｎｒ）（米国特許第
5,288,931号、ＡＴＣＣ第５５２４４）、枯草菌、サルモネラ菌、セラチア・マ
ルセッセンス、及びシュードモナス種が含まれる。 原核生物に加えて、真核生物体、例えば酵母菌、あるいは多細胞生物体由来の
細胞を宿主細胞として使用することができる。一般的なパン酵母又はサッカロミ
セス・セレヴィシアのような酵母宿主細胞中での発現に対しては、好適なベクタ
ーには、２ミクロンプラスミドに基づくエピソーム的に複製するベクター、組込
み型ベクター、及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターが含まれる。ＳＦ９細胞
のような昆虫宿主細胞での発現に対しては、好適なベクターにはバキュロウイル
スベクターが含まれる。植物宿主細胞、特にタバコのような双子葉植物宿主にお
ける発現に対しては、好適な発現ベクターにはアグロバクテリウムツメファシエ
ンスのＴｉプラスミドに由来するベクターが含まれる。
【００３２】 有用な哺乳動物宿主細胞の例には、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓
ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖の
ためにサブクローン化された293細胞、Graham等 (1997), J. Gen Virol., 36:59
）；ハムスター乳児腎細胞(BHK, ATCC CCL 10)；チャイニーズハムスター卵巣細
胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
77:4216)；マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather (1980), Biol. Reprod., 23:24
3-251）；サルの腎細胞 (CV1 ATCC CCL 70)；アフリカミドリザルの腎細胞(VERO
-76, ATCC CRL-1587)；ヒト子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL 2)； イヌ腎細胞 (M
DCK, ATCC CCL 34)；バッファローラット肝細胞 (BRL 3A, ATCC CRL 1442)；ヒ
ト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75)；ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065)；マウス***腫
瘍(MMT 060562, ATTC CCL51)；ＴＲＩ細胞（Mother等 (1982), Annals N.Y. Aca
d. Sci. 383:44-68）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌細胞株(Ｈｅｐ
Ｇ２)が含まれる。哺乳動物宿主細胞における発現に対しては、有用なベクター
には、ＳＶ４０由来のベクター、サイトメガロウイルス由来のベクター、例えば
ｐＲＫ５及びｐＲＫ７を含むｐＲＫベクター（Suva等 (1987), Science, 237:89
3-896; EP307,247(3/15/89)、EP278,776(8/17/88))、ワクシニアウイルス又は他
のポックスウイルス由来のベクター、及びモロニーのマウス白血病ウイルス（Ｍ
ｏＭＬＶ）由来のベクターのようなレトロウイルスベクターが含まれる。 場合によっては、対象のペプチドをコードしているＤＮＡは宿主細胞によって
培地中への発現産物の分泌を生じさせる分泌リーダー配列に作用可能に結合され
る。分泌リーダー配列の例には、ｓｔＩＩ、エコチン（ecotin）、ｌａｍＢ、ヘ
ルペスＧＤ、ｌｐｐ、アルカリホスファターゼ、インベルターゼ、及びアルファ
因子が含まれる。ここでの使用にまた適しているのはプロテインＡの３６アミノ
酸リーダー配列である（Abrahmsenら, (1985) EMBO J., 4:3901）。
【００３３】 宿主細胞はこの発明の上述の発現又はクローニングベクターで形質移入され、
好ましくは形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所
望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように変性された一般的な培
養液中で培養される。 本ペプチドを作成するのに使用される原核宿主細胞は、一般に上掲のSambrook
ら, に記載されるようにして培養することができる。 本発明のペプチドを作成するのに使用される哺乳動物宿主細胞は、様々な培地
で培養することができる。商業的に入手可能な培地、例えばハム(Ham)のＦ１０(
シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ)、シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダ
ルベッコの改良イーグル培地((DMEM)、シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。
さらに、Ham及びWallace, (1979), Meth. in Enz. 58:44, Barnes及びSato, (1
980), Anal. Biochem. 102:255, 米国特許第4,767,704号；同4,657,866号；同4,
927,762号；又は同4,560,655号；WO 90/03430；WO87/00195；米国特許再発行第3
0,985号；又は米国特許第5,122,469号、文献によりここに取り込まれる全ての開
示に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの
培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トラン
スフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、
マグネシウム、及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(
例えばアデノシン、及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン(商品名
）薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として
定義される)、及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充する
ことができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃
度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ば
れた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかで
あろう。 この開示で引用される宿主細胞は、インビトロ培地の細胞、並びに宿主動物内
にある細胞を包含する。
【００３４】 Ｅ．化学合成 本発明の化合物を生成する他の方法は、化学合成を含む。これは、当業者に知
られた方法論を用いて実施される(Kelly, R.F. & Winkler, M.E. in Genetic En
gineering Principles and Methods, Setlow, J.K, ed., Plenum Press, N.Y.,
Vol. 12, pp 1-19(1990); Stewart, J.M. Young, J.D., Solid Phase Peptide S
ynthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)参照；また米国特許第4,
105,603号; 第3,972,859号; 第3,842,067号; 及び第3,862,925号も参照)。 本発明のペプチド類似物は固相ペプチド合成を用いて便利に作成される。Merr
ifield, (1964)J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 ; Houghten,(1985) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 82: 5132 。固相ペプチド合成はまた、活性ドメインがポリペプ
チドであるか、又はそれを含んでいると、本発明のハイブリッド分子組成物を調
製するのに使用することができる。 固相合成は、保護されたアミノ酸を不活性個体支持体に結合させることにより
推定ペプチドのカルボキシ末端において開始される。不活性な固体支持体は、開
始アミノ酸のＣ末端のアンカーとして働くことのできる任意の高分子であり得る
。典型的には、高分子支持体は、上掲のStewart及びYoungの２及び４ページの図
１-１及び１-２に示されるような架橋高分子樹脂（例えば、ポリアミド又はポリ
スチレン樹脂）である。一実施態様では、Ｃ末端アミノ酸はベンジルエステルを
形成するポリスチレン樹脂と連結している。高分子支持体は、例えば、ペプチド
合成の阻害アミノ酸のαアミノ基を解放するのに使用される条件下でペプチドア
ンカー結合が安定であるものが選択される。塩基不安定α保護基が使用され、次
いでペプチドと固体支持体の間の酸不安定結合を使用するのが好ましい。例えば
、酸不安定エーテル樹脂は、上掲のStewart及びYoungの１６ページに記載される
ような塩基不安定Ｆｍｏｃアミノ酸ペプチド合成に効果的である。あるいは、ペ
プチドアンカー結合及び差別的にアシドリシスに移行するα保護基が使用できる
。例えば、フェニルアセトアミドメチル(Ｐａｍ)樹脂のようなアミノメチル樹脂
は、上掲のStewart及びYoungの１１-１２ページに記載されるようにＢｏｃ-アミ
ノ酸ペプチド合成に関連してうまく働く。
【００３５】 開始アミノ酸が不活性固体支持体に連結した後、開始アミノ酸のαアミノ酸保
護基を例えば塩化メチレンのトリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)で除去し、例えばトリエ
チルアミン(ＴＥＡ)で中和する。開始アミノ酸のαアミノ基の脱保護に続いて、
合成における次のα-アミノ-及び側鎖保護したアミノ酸を添加する。次に残りの
α-アミノ酸、必要ならば側鎖保護されたアミノ酸を縮合により所定の順序で続
けて結合させ、個体支持体に結合した中間体化合物を得る。あるいは、ペプチド
断片を伸長している固相ペプチド鎖に付加する前に、幾つかのアミ酸を互いに結
合させて所望のペプチド断片を形成してもよい。 ２つのアミノ酸、又はアミノ酸とペプチド、又はペプチドとペプチドの間の縮
合反応は、通常の縮合方法、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ（Ｎ,Ｎ'
-ジシクロヘキシルカルボジイミド）又はＤＩＣ（Ｎ,Ｎ'-ジイソプロピルカルボ
ジイミド）法、活性エステル法、ｐ-ニトロフェニルエステル法、ＢＯＰ(ベンゾ
トリアゾール-1-イル-オキシ-トリス[ジメチルアミノ]ホスホニウムヘキサフル
オロホスフェート)法、Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミドエステル法など、及びウッ
ドワード試薬Ｋ法等に従って実施される。
【００３６】 ペプチドの化学合成に共通なのは、アミノ酸の任意の反応性側鎖基を適切な保
護基で保護することである。最終的には、これらの保護基は、所望のポリペプチ
ド鎖が連続的に組み立てられた後に除去される。さらに共通なのは、アミノ酸又
はペプチド断片上のαアミノ基を保護するが、それがアミノ酸又はペプチド断片
のＣ末端カルボキシル基で成長固体支持体ポリペプチド鎖の遊離Ｎ末端のアミノ
酸と反応し、続いてαアミノ酸基を選択的に除去し、次のアミノ酸又はペプチド
断片を固体ペプチド鎖に付加させる。従って、ペプチド合成において一般的には
、中間体化合物が生成され、それはペプチド鎖の所望の配列に局在化した各アミ
ノ酸残基を含み、その個々の残基は側鎖保護基を有することである。これらの保
護基は、実質的に同時に除去され、固相から取り外した後に所望のポリペプチド
生成物が生成される。 α-及びε-アミノ酸側鎖基を、ベンジルオキシカルボニル（省略して、Ｚ）、
イソニコチニルオキシカルボニル（ｉＮＯＣ）、ｏ-クロロベンジルオキシカル
ボニル[Ｚ(２Ｃｌ)]、ｐ-ニトロベンジルオキシカルボニル［Ｚ(ＮＯ２)］、ｐ-
メトキシベンジルオキシカルボニル［Ｚ(ＯＭｅ)］、t-ブトキシカルボニル（Ｂ
ｏｃ）、t-アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）、イソボロニルオキシカルボニル
、アダマンチルオキシカルボニル、２-(４-ビフェニル)-２-プロピル-オキシカ
ルボニル（Ｂｐｏｃ）、９-フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、メ
チルスルホンエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、トリフルオロアセチル、フタリル
、ホルミル、２-ニトロフェニルスルフェニル（ＮＰＳ）、ジフェニルホスフィ
ノチオイル（Ｐｐｔ）、及びジメチロホスフィノチオイル（Ｍｐｔ）基などで保
護できる。 カルボキシ官能基の保護基としては、ベンジルエステル（ＯＢｚｌ）、シクロ
ヘキシルエステル（Ｃｈｘ）、４-ニトロベンジルエステル（ＯＮｂ）、t-ブチ
ルエステル（Ｏｂｕｔ）、４-ピリジルメチルエステル（ＯＰｉｃ）等が例示さ
れる。アミノ及びカルボキシル基以外の官能基を有するアルギニン、システイン
、及びセリンなどの特定のアミノ酸は、適当な保護基で保護するのが望ましいこ
とが多い。例えば、アルギニンのグアニジノ基は、ニトロ、ｐ-トルエンスルホ
ニル、ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、ｐ-メトキ
シベンゼンスルホニル、４-メトキシ-２,６-ジメチルベンゼンスルホニル（Ｎｄ
ｓ）、１,３,５-トリメチルフェニルスルホニル（Ｍｔｓ）等で保護される。シ
ステインのチオール基は、ｐ-メトキシベンジル、トリチルなどで保護されうる
。
【００３７】 前記されるような多くの阻害アミノ酸は、Novabiochem(サンディエゴ,CA)、Ba
chem CA（Terrence, CA)又はPeninsula Labs(ベルモント,CA)のように商業的に
入手できる。 上掲のStewart及びYoungは、ペプチド調製のための方法に関して詳細な情報を
提供する。αアミノ基の保護は１４−１８ページに記載され、側鎖ブロックは１
８−２８ページに記載されている。アミン、ヒドロキシル及びスルフヒドリル官
能基の保護基の表が１４９−１５１ページに提供されている。 所望のアミノ酸配列が完成した後、ペプチドは固体支持体から離され、回収さ
れ、精製されうる。ペプチドは、ペプチド固相結合を崩壊することのできる試薬
により固体支持体から取り除かれ、場合によっては、ペプチドの阻害側鎖官能基
を脱保護する。一実施態様では、ペプチドは、液体フッ化水素酸(ＨＦ)を有する
アシドリシスにより固相から取り外すが、残っている側鎖保護基も取り除く。好
ましくは、ポリペプチド中の残基のアルキル化（例えば、メチオニン、システイ
ン、及びチロシン残基のアルキル化）を回避するために、アシドリシス反応混合
物はチオ-クレゾール及びクレゾール捕捉剤を含む。ＦＨ離脱の後、樹脂はエー
テルで洗浄され、遊離ペプチドは酢酸溶液の連続洗浄で固相から抽出される。混
合した洗浄液は凍結乾燥され、ペプチドが精製される。
【００３８】 Ｆ．ハイブリッドの化学コンジュゲート 本発明の特定の実施態様では、ハイブリッド分子は、治療的又は診断的用途を
有する有機化合物である活性ドメイン、あるいは一本鎖の核酸をコードすること
ができない構造のポリペプチド活性ドメインとペプチドリガンドドメインの融合
体を含みうる。後者の実施態様の例としては、ペプチドリガンドのアミノ末端と
活性ドメインのアミノ末端の融合体、又はペプチドリガンドのカルボキシ末端と
活性ドメインのカルボキシ末端の融合体を含む。 化学コンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ
-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミ
ノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピ
ミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、
アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(
ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、
ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例え
ば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,
５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を用いて、これら実施態様のハイブリ
ッド分子の調製に使用することができる。
【００３９】 Ｇ．ジスルフィド結合ペプチド 前記したように、本発明のいくつかの実施態様では、環化ペプチドリガンドを
含む。ペプチドリガンドはシステイン基の間のジスルフィド結合の形成により環
化されうる。このようなペプチドは前記したような化学合成により作成され、次
いでジスルフィド結合の形成に使用される任意の簡単な方法により環化される。
例えば、ペプチドは、還元した形態のメルカプト基を有する固相合成物から回収
され、薄い溶液に溶解されうるが、分子内システイン濃度は、分子内ジスルフィ
ド結合形態を最適化するための分子内システイン濃度を上回り、例えば２５ｍＭ
から１μＭ、好ましくは５００μＭから１μＭ、より好ましくは２５μＭから１
μＭのペプチド濃度であり、次いで分子内ジスルフィド結合を生成するのに十分
な弱酸化剤、例えば金属陽イオン、フェリシアン化カリウム、テトラチオン酸ナ
トリウム等のような触媒を有する又は有しない分子酸素に遊離メルカプト基をさ
らすことにより酸化される。あるいは、ペプチドはPeltonら, (1986) J. Med. C
hem., 29:2370-2375に記載されるようにして環化することができる。 環化は、例えば第１のＣｙｓと第２のＣｙｓの間のジスルフィド結合又はラク
タム結合の形成により行われる。ジスルフィド結合を形成することのできる残基
は例えばＣｙｓ、Ｐｅｎ、Ｍｐｒ、及びＭｐｐ及びその２-アミノ基含有等価物
を含む。ラクタムブリッジを形成することのできる残基は、例えばＡｓｐ、Ｇｌ
ｕ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、αβ-ジアミノブチル酸、ジアミノ酢酸、アミノ安息香酸
、及びメルカプト安息香酸を含む。ここでの化合物は、例えばＣｙｓのＮ末端ア
ミノ基又は他のアミノ酸に対して共有結合を形成する隣接していない残基の側鎖
基を利用しうるラクタム結合により環化することができる。あるいは、ブリッジ
構築はまた、本発明の化合物を環化するのに使用することができ、例えばペプチ
ド及びペプチド類似物を含み、Ｓ-Ｓ、ＣＨ２-Ｓ、ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２、ラクタム
エステル又は他の結合により環化できる。
【００４０】 Ｈ．医薬組成物 本発明のハイブリッド分子を含有する医薬組成物は、非経口、局所、経口又は
局部的（エアロゾル又は経皮など）又はその任意の組み合わせを含む任意の適切
な形で投与されうる。 本発明の他の適した組成物は、製薬的に許容可能な担体を有する前記組成物の
任意のものを含むが、担体の性質は投与方式によって異なり、例えば経口投与で
は通常固体担体が用いられ、Ｉ.Ｖ.投与では液体塩溶液担体である。 本発明の組成物は、患者及び本発明の組成物のタンパク質に適合する製薬的に
許容可能な成分を含む。これらは一般に懸濁物、溶液及びエリキシル剤、特にリ
ン酸緩衝塩水、生理食塩水、ダルベッコの媒質などの生物学的バッファーを含む
。エアロゾル、又はデンプン、糖、微結晶セルロース、希釈剤、顆粒化剤、潤滑
剤、結合剤、崩壊剤等（経口固体調製物の場合、粉末、カプセル、及び錠剤）の
担体を用いてもよい。 ここで使用する用語「製薬的に許容可能な」とは、一般的に、連邦または州政
府の規制当局に承認されたもの又は米国薬局方又は動物、特にヒトに使用するた
めの他の一般に認められた、薬局方に列挙されているものを意味する。
【００４１】 製剤の選択は、上記のバッファー、又は例えば製薬級のマンニトール、ラクト
ース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウムセルロース
、炭酸マグネシウム、等を含む賦形剤の種々のものを用いてなすことができる。
組成物の「ＰＥＧ化(PEGylation)」は、当該分野で知られた技術を用いて実施し
てもよい（例えば、国際特許公報番号WO92/16555、Enzonの米国特許第5,122,614
号、及び国際特許公報番号WO92/00748を参照）。 本発明の投与の好ましい経路は、エアロゾル又は吸入の形態である。本発明の
化合物は、分散剤と混合され、乾燥粉末のようなエアロゾル形態で、あるいは溶
液又は希釈液での懸濁液として投与することができる。 ここで使用する用語「分散剤」とは、化合物のエアロゾル化又は肺組織でのタ
ンパク質の吸収、又は両方を助ける薬剤を意味する。好ましくは分散剤は製薬的
に許容可能である。適した分散剤は、当該分野にてよく知られ、これに限らない
が界面活性剤等を含む。例えば、液体エアロゾルを形成する溶液の噴霧化によっ
て生じる表面に発生する化合物、特にペプチド化合物の凝集を減少させるために
、当該分野で一般的に使用される界面仮性剤が使用されうる。限定しないが、こ
のような界面活性剤の例は、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル類及びアルコー
ル類、及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等の界面活性剤である
。使用される界面活性剤の量は様々で、一般に製剤の約０．００１重量％から約
４重量％の範囲であろう。特定の様態では、界面活性剤はポリオキシエチレンソ
ルビタンモノオレアート又はソルビタントリオレアートである。適した界面活性
剤は当該分野でよく知られ、特定の処方、化合物の濃度、希釈剤(液体形態の場
合)又は粉末の形態(乾燥粉末の製剤の場合)等による所望の特性をもとに選択す
ることができる。
【００４２】 更に、ペプチドリガンドの選択、所望の治療効果、肺組織の性質(例えば、病
気の又は健康な肺)、及び多くの他の要因によって、液体又は乾燥製剤は更に以
下に記載されるような更なる成分を含むことができる。 一般に液体エアロゾル製剤は、製薬的に許容可能な希釈剤にペプチドリガンド
／活性ドメインハイブリッド及び分散剤を含む。本発明の乾燥粉末エアロゾル製
剤は、ペプチドリガンド／活性ドメインハイブリッド及び分散剤の細かく分離し
た固形からなる。液体又は乾燥粉末エアロゾル製剤のどちらかを用いて、製品は
エアロゾル化されなければならない。つまり、エアロゾル化した投与量が実際に
肺胞に届くようにするために液体又は固体粒子にまで壊さねばならない。一般に
質量中位力学径(mass median dynamic diameter)は、薬の粒子が肺胞に届くため
には５マイクロメーター以下であろう（Wearley, L.L., (1991), Crit. Rev. in
Ther. Drug Carrier Systems 8:333）。「エアロゾル粒子」という用語は、肺
投与に適した、つまり肺胞に届きうる液体又は固体粒子を記載するためにここで
使用される。他の考慮すべきこととしては、例えば送達装置の様式、製剤中の更
なる化合物及び粒子特性が重要である。薬の肺投与のこれらの態様は、当該分野
においてよく知られ、製剤の取り扱い、エアロゾル化方法及び送達装置の様式は
当分野の通常の技術者に最も日常的な実験で必要とされる。
【００４３】 送達装置の様式に関して、当分野で既知のエアロゾル化の任意の形式は、これ
に限らないが、ネブライザー、液体製剤の噴霧化又はポンプエアロゾル化、及び
乾燥粉末製剤のエアロゾル化を含み、本発明の実施に使用することができる。固
体製剤投与の独自に設計した送達装置が示される。しばしば、液体又は乾燥粉末
製剤のエアロゾル化は噴霧剤を必要としうる。噴霧剤は、当分野で一般的に使用
される任意の噴霧剤でよい。特に限定しないが、このように利用できる噴霧剤の
例は、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロカーボン、ヒドロフルオロフルオ
ロカーボン、又はヒドロカーボンであり、トリフルオロメタン、ジクロロジフル
オロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、及び１,１,１,２-テトラフル
オロエタン、又はその組み合わせを含む。 本発明の好ましい態様では、エアロゾル化の装置は、定量吸入器である。定量
吸入器は、投与によって変化する用量ではなくて、投与時に特定の投与量を提供
する。このような定量吸入器は液体又は乾燥粉末エアロゾル製剤のどちらかで使
用されうる。定量吸入器は当分野でよく知られている。 ペプチドリガンド／活性ドメインハイブリッドが肺に到達すると、多くの製剤
依存因子が薬剤吸入に影響を及ぼす。化合物の循環レベルが要求される疾患又は
障害の治療において、エアロゾル粒子サイズ、エアロゾル粒子形態、感染、肺疾
患又は塞栓の有無のような要因が化合物の吸入に影響しうることが理解されるで
あろう。ここに記載される各製剤において、任意のルブリケータ、吸収促進剤、
タンパク質安定剤又は懸濁剤を使用してもよい。これらの更なる薬剤の選択は、
目的により異なる。化合物の局所送達が所望又は探求される場合、吸収促進のよ
うな変化はそれ程重要でないことが理解されるであろう。
【００４４】 Ｉ．液体エアロゾル製剤 本発明の液体エアロゾル製剤は、通常ネブライザーで使用されうる。ネブライ
ザーは圧縮気体吹きつけ又は超音波のどちらかでありうる。当該分野で既知の任
意のネブライザーは、本発明と関連して使用することができ、これに限らないが
：Ultravent、Mallinckrodt社(セントルイス、MO)；アクロンＩＩネブライザー(
Marquest Medical Products、エングルウッドCO)である。本発明と関連して利用
できる他のネブライザーは、1986年11月25日公開の米国特許第4,624,251号；197
2年11月21日公開の同第3,703,173号；1971年2月9日公開の同第3,561,444号及び1
971年1月13日公開の同第4,635,627号に記載されている。 製剤は担体を含みうる。担体は循環系に溶解でき、及び製薬的に許容可能な高
分子であり、ここで製薬的に許容可能とは当該分野での技術者が治療法の一部と
して患者に該担体を注入する製薬的に許容されることを意味する。好ましくは、
担体はクリアランスの許容可能な血中濃度半減期を有する循環系で比較的安定で
ある。このような高分子はこれに限らないが、大豆レシチン、オレイン酸及びソ
ルビタントリオレアートを含み、ソルビタントリオレアートが好ましい。 当実施態様の製剤はまた、タンパク質安定化剤又は浸透圧の調節に利用できる
他の薬剤も含んでいてもよい。薬剤の例は、これに限らないが、塩、例えば塩化
ナトリウム、又は塩化カリウム及び糖類、例えばグルコース、ガラクトース又は
マンノース等を含む。
【００４５】 Ｊ．エアロゾル乾燥粉末製剤 本医薬製剤はペプチドリガンドの細かく分包された粉末形態及び分散剤を含む
乾燥粉末吸入製剤として使用されうる。化合物の形態は、一般に凍結乾燥粉末で
ある。ペプチド化合物の凍結乾燥形態は標準的な技術で得られる。 他の実施態様では、乾燥粉末製剤は、本発明の１又は複数の化合物、分散剤及
び充填剤を含む細かく分包された乾燥粉末を含む。本製剤に混合して使用できる
充填剤は、ラクトース、ソルビトール、スクロース、又はマンニトールのような
薬剤を含み、装置からの粉末の分散を円滑にする量である。
【００４６】 Ｋ．研究、産業、及び診断用組成物 好ましい実施態様では、本発明のペプチドリガンド又はハイブリッド分子は固
体支持体等の高分子と非共有吸着又は共有結合させる。本発明はペプチドリガン
ド又はハイブリッド分子と複合される高分子を包含すると理解される。好ましい
実施態様では、例えば下に開示されるＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガンドのように、
本発明のペプチドリガンドは、免疫グロブリンに対向する。このようなペプチド
リガンドは親和性精製剤と使用してもよい。この方法では、ペプチドリガンドは
当該分野でよく知られた方法を用いてセファデックス樹脂又は濾過紙等の固相支
持体上に固定される。固定したペプチドリガンドは精製するために免疫グロブリ
ンタンパク質（又はその断片）を含有する試料と接触させ、支持体を、固定した
ペプチドリガンドに結合した免疫グロブリンタンパク質以外の試料中の全ての物
質を実質的に取り除く適当な溶媒で洗浄する。最後に、支持体を他の適した溶媒
、例えばグリシン緩衝液、ｐＨ５．０で洗浄して、ペプチドリガンドから免疫グ
ロブリンタンパク質を離す。 一般に、固体支持体はポリマーゲルなどの不活性マトリクスであり、三次元構
造と材料の格子又はネットワークを有する。合成又は天然の殆ど全ての高分子が
、二官能性試薬で架橋されたとき、適切な液体中でゲルを形成する。好ましくは
、選択される高分子は、アフィニティクロマトグラフィでの使用に便利なもので
ある。アフィニティクロマトグラフィに使用される殆どのクロマトグラフマトリ
クスはキセロゲルである。このようなゲルは乾燥時に収縮してゲルマトリクスの
みを含むコンパクトな固体となる。乾燥キセロゲルが液体に再懸濁されると、ゲ
ルマトリクスは液体を吸収し、膨潤し、ゲル状態に戻る。ここで使用するのに適
したキセロゲルは、セルロース、架橋デキストラン（例えばセファロース）、ア
ガロース、架橋アガロース、ポリアクリルアミドゲル、及びポリアクリルアミド
−アガロースゲルなどのポリマーゲルを含む。
【００４７】 あるいは、エアロゲルもアフィニティクロマトグラフィに使用できる。これら
のゲルは乾燥時に収縮しないが、周囲の空気の透過のみを可能にする。乾燥ゲル
が液体に曝露されると、後者はゲル中の空気と置換される。ここでの使用に適し
たエアロゲルは、多孔性ガラス及びセラミックゲルを含む。 またここに包含されるのは、誘導体化ゲルと結合した本発明のペプチドリガン
ド又はハイブリッド分子であり、その誘導体部分はゲルマトリクスへのハイブリ
ッド分子の結合を促進し、アフィニティクロマトグラフィにおけるペプチド−標
的分子相互作用の立体的障害を回避する。あるいは、類似の利点のために、ゲル
マトリクスとハイブリッド分子との間にスぺーサーアームを挿入することもでき
る。 前記の変形としては、遺伝子融合及びペプチドリガンドの精製試薬としての使
用が考えられる。本発明のこの態様によれば、ペプチドリガンドをコードする遺
伝子は、ベクターに他のタンパク質又は他のタンパク質の断片をコードする遺伝
子と関連づけされる。これは、ペプチドリガンドが他のタンパク質又はペプチド
と融合として宿主細胞によって生産される結果をもたらす。「他の」タンパク質
又はペプチドとは、多くの場合、細胞からの分泌が可能なタンパク質又はペプチ
ドであり、所望するペプチドの培養液からの単離及び精製を可能にし、所望する
ペプチドが菌体内に止まる場合に生じる宿主細胞を破壊する必要性を除く。ある
いは、融合タンパク質は細胞内に発現することも可能である。高度に発現される
融合タンパク質を使用するのが有用である。
【００４８】 遺伝子融合の使用は、プロテインＡの結合、より詳しくはプロテインＡのＺド
メインのＩｇＧへの結合が融合タンパク質の精製の為の「親和性ハンドル」を提
供することから頻繁に使用されるタンパク質Ａの使用に類似している。本発明の
好ましい態様に従うと、血清アルブミンに結合するペプチドリガンドは、固体血
清アルブミン支持体上に融合したタンパク質の精製のための「親和性ハンドル」
として使用される。例えば、所望のペプチドリガンドをコードするＤＮＡ配列は
、タンパク質の遺伝子の部位特異的突然変異誘発によって融合することができる
。融合タンパク質の発現と分泌の後、酵素混合物から生成することのできる遊離
ペプチドを得るために、酵素的に切断されうる。融合タンパク質は、メチオニン
、又はヒドロキシアミン、Ａｓｎ及びＧｌｙ残基間を切断する臭化シアンのよう
な化学薬品を使用することによって切断が可能である。標準的な組換えＤＮＡ技
術を使用することにより、これらアミノ酸をコードするヌクレオチド塩基対は、
所望するペプチドをコードする遺伝子の５' 末端の直前に挿入することができる
。あるいは、融合タンパク質のタンパク質分解による切断を使用することが可能
である。Cater, Protein Purification: From Molecular Mechanism to Large-S
cale Process, Ladish等., eds.(American Chemical Society Symposium Series
No.427,1990), Ch13, page 181-193。
【００４９】 以下の実施例は、例示のために提供されるもので、限定するものではない。明
細書中の全ての文献の開示は、ここに出典明示することにより取り込まれる。 実施例１ ＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガンド インビトロでの選択は、インビボでのペプチド機能の作用を制限することなく
、ＩｇＧ-Ｆｃ表面に結合するペプチドリガンドを同定してなされた。選択は様
々な細胞性ホルモン及びレセプターに結合するペプチドを生成するのに近年使用
されている多価及び一価のファージディスプレーの組み合わせを用いて行われた
。N. C. Wrighton, 等(1996), Science 273:458, O. Livnah,等(1996), Science
273:464。単一のジスルフィド制限ペプチドライブラリを４ｘ１０９の Xaai-Cy
s-Xaaj-Cys-Xaak (配列番号：1) の形態の異なるペプチドからなるものが構築さ
れ、ここで Xaa はＮＮＳコドン由来のランダムアミノ酸であり、 i+j+k=18、及
びj=4から10である。このライブラリはグリシンとセリンの残基からなる短いリ
ンカーを有する遺伝子ＶＩＩＩタンパク質とのＮ末端融合体としてＭ１３のバク
テリオファージの表面で発現した。H. B. Lowman等(1998), Biochernistry 37:
8870-8878。より具体的には、ライブラリはＳＴＩＩ分泌シグナルペプチド、２
０アミノ酸長のペプチドライブラリ、つまり Xaai-Cys-Xaaj-Cys-Xaak (配列番
号：1)（ここで、XaaはＮＮＳコドン由来のランダムアミノ酸、i+j+k=18、及びj
=4から10である）、Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Glyリンカー (配列番号：2)、及
び成熟タンパク質の一番目の残基で開始するＭ１３遺伝子ＶＩＩＩを含んでいた
。 原則として、ペプチドは、このライブラリの偏りのない性質によってＩｇＧ-
Ｆｃの任意の領域に潜在的に結合するものが選択された。しかしながら、数回の
選択の後、ライブラリは単一のペプチド、Ｆｃ-Ｉ(Glu-Thr-Gln-Arg-Cys-Thr-Tr
p-His-Met-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Glu-Arg-Glu-His-Asn) (配列番号：3)で特
色付けされた。選択はH. B. Lowman等,上掲に記載されるように、次の修飾で実
施された：マイクロタイターのウェルを５μｇ／ｍｌのＩｇＧ-Ｆｃを用いて被
覆し；非特異性結合を更に防ぐためにカゼイン阻害バッファ（Pierce社）を０．
１％のＢＳＡの代わりに使用し；ファージの溶出に７５ｍＭのＤＤＴ又は同等の
結果となる０．２ｍＭのグリシンｐＨ２．０の何れかを作用させた。ＩｇＧ-Ｆ
ｃはＣＤ４-ＩｇＧ１イムノアドヘシンタンパク質のパパイン切断によって得ら
れる、Capon等, (1989), Nature, 337:525。切断された物質はタンパク質Ａセフ
ァロース、続いてSuperdex-75（Pharmacia社）に通して精製し、次いで２８０ｎ
ｍの吸光度で定量した。
【００５０】 選択実験を再び繰り返してＦｃ-Ｉ、更に関連するペプチド、Ｆｃ-ＩＩ（Lys-
Glu-Ala-Ser-Cys-Ser-Tyr-Trp-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Val-Ala-Gly-Val-
Glu）（配列番号：4）を得た。Ｆｃ-ＩＩペプチドはＦｃ-Ｉに見られる開始Gly-
Glu-Leu-Val-Trp（配列番号：134）配列及びシステインスペーシングを共有する
。明らかに、これら２つのペプチドは、開始プールに存在する他のＩｇＧ-Ｆｃ
結合ペプチドを通しての選択に十分高い親和性を有するＩｇＧ-Ｆｃに結合する
。２つのペプチドは標準９-フルオレニルメトキシカルボニルプロトコルを用い
て固相ファージ上で合成され、逆相ＨＰＬＣにより精製される。質量をエレクト
ロスプレー質量分析により確認し、精製したペプチドを２８０ｎｍのＵＶ吸光度
で定量した。 競合ＥＬＩＳＡをH. B. Lowman,等, 上掲に記載される能能と同様の方法で実
施した。概略して言うと、タンパク質Ａ Ｚｄｏｍｅｉｎｎを５μｇ／ｍｌの濃
度でマイクロタイターウェル上に固定し、遮断して、記述のように洗浄した。濃
度３１２ｎＭから０．３ｎＭのビオチニル化ＩｇＧ-Ｆｃの混合物の基質と濃度
２１５μＭから０．８μＭのペプチドを調製した。これらの混合物は固定したタ
ンパク質Ａ Ｚドメインと１時間インキュベートする。次いでプレートをアビジ
ン／ＨＲＰコンジュゲートを用いて記載したように洗浄して発達させた。次にビ
オチン-ＩｇＧ-Ｆｃの各濃度について阻害曲線を算定し、次いでＫｉを得るため
に最大阻害の半分の値の曲線、「ＩＣ５０」をゼロビオチン-ＩｇＧ-Ｆｃ濃度に
対して推定した。Ｆｃ-Ｉ及びＦｃ-ＩＩペプチド双方を約５μＭの阻害定数（Ｋ
ｉ）でＩｇＧ-Ｆｃと結合するタンパク質Ａ（Ｚドメイン）（B. Nilsson等(1987
), Protein Eng. 1:107）との競合を検出した。結果から、これらのペプチドが
タンパク質Ａ結合部位と一致するＩｇＧ-Ｆｃ上の重複部位に結合することが示
唆された。
【００５１】 Ｆｃ-ＩＩのＤＮＡ配列をＳＴＩＩシグナル配列、Ｆｃ-ＩＩペプチド Lys-Glu
-Ala-Ser-Cys-Ser-Tyr-Trp-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Val-Ala-Gly-Val-Glu
(配列番号：4)、Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly リンカー(配列番号：5)、及び
残基２５３で開始するＭ１３遺伝子ＩＩＩタンパク質を有する構築物を得るため
にカセット突然変異によって一価のファージディスプレイフォーマットを実施し
た。Ｆｃ-ＩＩ配列をファージディスプレイによって親和性成熟した。５組の残
基をペプチド配列の非システイン位置を完全に網羅する６つの分離したライブラ
リで無策位に突然変異させ、次いでＩｇＧ-Ｆｃに対してスクリーニングした。 一組の二次生成の一価のファージディスプレイライブラリをＦｃ-ＩＩ配列 Ly
s-Glu-Ala-Ser-Cys-Ser-Tyr-Trp-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Val-Ala-Gly-Va
l-Glu (配列番号：4) に基づいて構築し、ここで５つの配列残基は２つのシステ
イン以外の１、４、７、１０、１２、及び１６の位置で開始する各ライブラリの
ＮＮＳコドンを用いてランダム化した。各ライブラリは約１ｘ１０８の多様性を
有していた。これらのライブラリをそれぞれＩｇＧ-Ｆｃに結合させるために６
回スクリーニングし、次いで配列決定した。次にこの選択からの好ましい残基を
、完全長ペプチド配列を測定した３つの更なるライブラリを用いて再結合した。
３つの更なるライブラリを１つのペプチドの各位置の好ましいアミノ酸を再結合
するために遺伝子コードの縮重を用いて構築した。これらのライブラリに体ｓる
ＤＮＡ配列は塩基（ＩＵＰＡＣコード）の次の混合物を含む： DRG GWA GMA RRC
TGC KCT TRS CAC MTG GGC GAG CTG GTC TGG TGC RVC RVM BKC GAS KDW (配列番
号：6)、DRS VWG SVG RRC TGC KCC TRS YRS MTG GGC GAG CTG GTC TGG TGC RNC
VVS NBS GWS KDM (配列番号：7)、及び DNS NNS NNS VNS TGC BVG TDS HRS MDS
GGC GAG STC KKG WRG TGC RNM NNS NNS NNS NNM (配列番号：8)。またこれらの
ライブラリをＩｇＧ-Ｆｃに対して６回ソートし、次いで配列決定した。 ＩｇＧ-Ｆｃに対してスクリーニングした後、これらのライブラリからのコン
センサス型は、高度に保存された１３残基を核にする配列(Asp-Cys-Ala-Trp-His
-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr) (配列番号：9)を示唆した。一致するペプ
チド（Ｆｃ-ＩＩＩ）を合成し、１００ｎＭのＩｃ５０を有するＦｃに対するタ
ンパク質Ａ（Ｚドメイン）の結合を阻害することが分かった。従って、Ｆｃ-Ｉ
ＩＩはＦｃ-ＩＩよりも短い７つの残基であるが、５０倍固く結合する。サイズ
が小さいにも関わらず、Ｆｃに対するＦｃ-ＩＩＩの結合親和性はタンパク質Ａ
及びタンパク質Ｇのドメインのものより１０倍弱く、それぞれ約４倍大きく、約
１０ｎＭのＫｄＳで結合する。S. R. Fahnestock,等 in Bacterial Immunoglobl
in-Binding Proteins (Academic Press, Inc. 1990) Vol.1, chap. 11. R. Karl
sson, L. Jendeberg, B. Nilsson, J. Nilsson, P. Nygren (1995), J. Immuno.
Methods 183:43。
【００５２】 表Ｉは例として上記方法を用いて同定したＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガンドのア
ミノ酸配列とＩｇＧ-Ｆｃ結合親和性を挙げる。 表Ｉ ＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガンド配列と親和性 配列 配列番号 結合親和性 ペプチド＊ 全てのペプチドはＮ末端にアミ ン、Ｃ末端にアミドを有する KEASCSYWLGELVWCVAGVE 配列番号：４ 5000 nM (Ki) ETQRCTWHMGELVWCEREHN 配列番号：３ 5000 nM (Ki) DLADCSWHMGELVWCSRVEG 配列番号：１７ 50 nM (Kd) WEADCAWHLGELVWCTPMEF 配列番号：１８ 30 nM (IC50) DCAWHLGELVWCT 配列番号：９ 100 nM (IC50) ファージクローン (M13/gIII ディスプレイ) 全てのファージ 親和性がEC50S N/A = 別々ではなくアッセイした。 結合を選択したので、EC50は＜1uM であるか、それより良い。 列挙した全てのペプチドがＩｇＧ-Ｆｃと結合する。 集束ライブラリ 配列 配列番号 結合親和性 KEASCSYWLGELVWCDTLTE 配列番号：１９ N/A KEASCSYWLGELVWCSPGVE 配列番号：２０ 734 nM KEASCSYWLGELVWCSGVEG 配列番号：２１ N/A KEASCSYWLGELVWCSAGVE 配列番号：２２ N/A ESEDCSYWLGELVWCVAGVE 配列番号：２３ N/A EKEDCSYWLGELVWCVAGVE 配列番号：２４ N/A EDPDCSYWLGELVWCVAGVE 配列番号：２５ N/A EEADCSYWLGELVWCVAGVE 配列番号：２６ N/A NADDCSYWLGELVWCVAGVE 配列番号：２７ N/A SETTCSYWLGELVWCVAGVE 配列番号：２８ N/A AWKTCQWLGELVWCVAGVE 配列番号：２９ N/A DLADCSYWLGELVWCSRVEG 配列番号：３０ 776 nM KEADCAWHLGELVWCVAGVE 配列番号：３１ l38 nM KEAECSYHLGELVWCVAGVE 配列番号：３２ N/A KEARCWYWHGELVWCSDPEE 配列番号：３３ 8O9 nM KEASCSYHLGELVWCVAGVE 配列番号：３４ 416 nM KEASCSWHLGELVWCVAGVE 配列番号：３５ 225 nM KEASCSYWLGELVWCTEGVE 配列番号：３６ 818 nM KEASCSYWLGELVWCDDGVE 配列番号：３７ N/A KEASCSYWLGELVWCSEGVE 配列番号：３８ N/A KEASCSYWLGELVWCSPGVE 配列番号：３９ N/A KEASCSYWLGEVWKCKSGVE 配列番号：４０ N/A KEASCSYWLGELVWCDNGVE 配列番号：４１ N/A KEASCSYWLGELVWCDTFDE 配列番号：４２ 301 nM KEASCSYWLGELVWCDGLDE 配列番号：４３ 326 nM KEASCSYWLGELVWCVGLDE 配列番号：４４ 278 nM KEASCSYWLGELVWCEDTLE 配列番号：４５ N/A KEASCSYWLGELVWCEDTME 配列番号：４６ N/A KEASCSYWLGELVWCEDMME 配列番号：４７ N/A WVEDCSWHMGELVWCDGGEF 配列番号：４８ l39 nM KEASCSYWLGELVWCDWMNG 配列番号：４９ N/A KEASCSYWLGELVWCDDTPV 配列番号：５０ N/A KEASCSYWLGELVWCDDYGE 配列番号：５１ N/A KEASCSYWLGELVWCSDLWE 配列番号：５２ N/A WRGGCSWHMGELVWCEHDME 配列番号：５３ N/A AVSKCSFHMGELVWCSDVMN 配列番号：５４ N/A NQVSCSYSRGELVWCSKQSQ 配列番号：５５ N/A GRMECAWHQGELVWCTPTLE 配列番号：５６ N/A GTMECSWHQGELVWCTPTLA 配列番号：５７ N/A EMRDCSWHLGELVWCAHMEG 配列番号：５８ N/A GSWECAYHLGELVWCETGSG 配列番号：５９ N/A VAEPCAYHLGELVWCEVLKG 配列番号：６０ N/A KEAMCSYWLGELVWCESDMP 配列番号：６１ N/A 設計クローン DLADCSWHLGELVWCSRVEG 配列番号：６２ 9 nM DLADCSWHLGELVWCVGLDE 配列番号：６３ 28 nM WVEDCSWHLGELVWCVGLDF 配列番号：６４ 31 nM 二次最適化 KVADCAWHMGELVWCTEVEG 配列番号：６５ 23 nM GEEDCSYHLGELVMCTELDD 配列番号：６６ 69 nM GVADCAWHLGELVWCTERED 配列番号：６７ N/A GEEDCAWHLGELVWCSGGDF 配列番号：６８ lOOnM WEADCAWHLGELVWCTKVEE 配列番号：６９ 7 nM GEADCSYHLGELVWCNDFEE 配列番号：７０ l56nM WVDCAYHLGELVWCSTFEE 配列番号：７１ 9 uM WVEDCAWHMGELVWCTKVDE 配列番号：７２ 70 nM READCAWHLGELVWCSERDL 配列番号：７３ 47 nM EEASCAYHLGELVWCDAFDV 配列番号：７４ 77 nM RVASCAWHLGELVWCDGLDG 配列番号：７５ N/A GEADCAWHLGELVWCTKVEE 配列番号：７６ 38 uM GEASCAYHLGELVWCDEGEG 配列番号：７７ 386 nM RVEDCAYHLGELVWCTEGDE 配列番号：７８ 63 nM EEPDCSWHLGELVMCTPMEV 配列番号：７９ l4 nM KEADCAWHMGELVWCSEMEG 配列番号：８０ 66 nM EQADCAWHLGELVWCTPMVF 配列番号：８１ 8 nM EEPDCSWHLGELVWCTPIEV 配列番号：８２ l5 nM GEPDCAWHLGELVWCTPMVF 配列番号：８３ 7 nM GEQDCSYHMGELVWCTTVDG 配列番号：８４ 2lO nM GVRNCAYHLGELVWCTPMEF 配列番号：８５ lO nM RVADCAWHMGELVWCSELEV 配列番号：８６ 44 nM GEADCAWHLGELVWCTPMDL 配列番号：８７ N/A GEQDCSWHLGELVWCTPMEV 配列番号：８８ N/A GMRDCSYHLGELVWCSDMEL 配列番号：８９ N/A EVADCSWHLGELVWCTEGEF 配列番号：９０ 54 nM GEEDCAWHLGELVWCTDVED 配列番号：９１ 52 nM EVEDCAYHLGELVWCSDLEG 配列番号：９２ 82 nM WEEDCAWHLGELVWCAEFDE 配列番号：９３ 44 nM KEASCAWHLGELVWCSEVEE 配列番号：９４ 130 nM ファージでのＡＬＡスキャン AEADCAWHLGELVWCTKVEE 配列番号：９５ 20 nM WAADCAWHLGELVWCTKVEE 配列番号：９６ 34 nM WEPDCAWHLGELVWCTKVEE 配列番号：９７ 36 nM WEAACAWHLGELVWCTKVEE 配列番号：９８ 55 nM WEAACSWHLGELVWCTKVEE 配列番号：９９ 10 nM WEADCAAHLGELVWCTKVEE 配列番号：１００ 798 nM WEADCAWALGELVWCTKVEE 配列番号：１０１ 139 nM WEADCAWHAGELVWCTKVEE 配列番号：１０２ 56 nM WEADCAWHLAELVWCTKVEE 配列番号：１０３ 12 nM WEADCAWHLGALVWCTKVEE 配列番号：１０４ 11 nM WEADCAWHLGEAVWCTKVEE 配列番号：１０５ 1890 nM WEADCAWHLGELAWCTKVEE 配列番号：１０６ 4670 nM WEADCAWHLGELVACTKVEE 配列番号：１０７ 3380 nM WEADCAWHLGELVWCAKVEE 配列番号：１０８ 101 nM WEADCAWHLGELVWCTAVEE 配列番号：１０９ 10 nM WEADCAWHLGELVWCTKAEE 配列番号：１１０ 8 nM WEADCAWHLGELVWCTKVAE 配列番号：１１１ 4 nM
【００５３】 実施例２ ＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガンドで標識した抗ＶＥＧＦ Ｆａｂの構築 ペプチドリガンドドメインと活性ドメインを有するハイブリッド分子を形成す
るためにＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガンドを生理活性化合物と結合させてもよい。
この実施例では、ＩｇＧ-ＦｃペプチドリガンドをヒトＶＥＧＦ認識Ｆａｂ断片
と結合させる。ヒトＶＥＧＦに対する中和抗体をヒト化したマウスのハイブリド
ーマから事前に同定しておき、ファージディスプレイで最適化した。Muller等(1
998), Structure 6:1153-1167; Chen等(1999), J. Mol. Biol. 293:865-881; 及
び国際特許公開番号WO98/45331参照。無関係のＩｇＧに対する結合親和性を、抗
体結合親和性を壊すことなくＦａｂに加えることができるかを試験するために、
この抗体の２つのヒト化Ｆａｂ型を選択した。実施例１に記載されたペプチド-
ファージディスプレイ方法で同定され、最適化されたＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガ
ンド、 DCAWHLGELVWGT (配列番号：9)が、ペプチドとＦａｂの間の柔軟性を与え
る短いペプチドリンカー（Gly-Gly-Gly）と共に使用される。この抗体の場合に
は軽鎖が抗体結合への僅かな寄与を有することが既知である（Muller等, 1998,
上掲）ので、Ｆａｂの軽鎖は融合体が選択される。原則としてペプチドリガンド
ドメインはＮ末端、Ｃ末端いずれへの導入であろうとＩｇＧ結合を導入し、又は
もとのＦａｂ配列中に挿入されるように機能することができる。ここで記載され
るのはＮ末端融合 DCAWHLGELVWCTGGG-(軽鎖)(配列番号：112) 並びにＣ末端融合 (軽鎖)-GGGWEADCAWHLGELVWCT (配列番号：113)である。 オリゴデオキシヌクレオチド、ＨＬ-５６９を、抗体軽鎖のＮ末端でＩｇＧ-Ｆ
ｃペプチドリガンドの融合体を作成するために抗ＶＥＧＦプラスミドの突然変異
体を設計し、合成した。ＨＬ-５６９の配列（更なるペプチド配列に下線を引い
た）は： 5'-ACA AAC GCG TAC GCT GAC TGC GCT TGG CAC CTG GGC GAG CTG GTC TGG TGC ACC GGA GGA GGA GAT ATC CAG TTG ACC-3' (配列番号：114)。GACコド
ンは軽鎖のＮ末端のＳＴＩＩ選択シグナル配列にに続き、GATコドンは成熟（野
生型）軽鎖の一番目の残基に相当する。 他のオリゴデオキシヌクレオチド、ＨＬ-５７０を、抗体軽鎖のＣ末端でペプ
チドリガンドの融合体構築のために設計し、合成した。ＨＬ-５７０の配列（更
なるペプチド配列に下線を引いた）は：5'-AAC AGG GGA GAG TGT GGA GGA GGA T GG GAA GCA GAC TGC GCT TGG CAC CTG GGC GAG CTG GTC TGG TGC ACC TAA GCT G
AT CCT CTA C-3'(配列番号：115)。下線を引いたGGAの前にあるTGTコドンは軽鎖
の残基Cys-214に相当し、TAA「停止コドン」は翻訳されるペプチド配列の末端を
特徴づける。ファージミドｐＹ０１９２及びｐＹ０３１７（Muller等, 1998, 上
掲；Chen等, 1999；及び国際特許公開番号WO98/45331に記載）はヒト抗ＶＥＧＦ
抗体の低親和性及び高親和性形態をそれぞれコードし、２つのＩｇＧ-ペプチド
オリゴのそれぞれを突然変異させて構築物ｐＹ０１９２-５６９、ｐＹ０１９２-
５７０、ｐＹ０３１７-５６９、及びｐＹ０３１７-５７０を得た。
【００５４】 実施例３ ペプチドリガンド標識した抗ＶＥＧＦ Ｆａｂを含むハイブリッド分子のファー
ジＥＬＩＳＡ分析 ファージＥＬＩＳＡ競合結合アッセイ（Lowman(1998), MEthods Mol. Biol. 8
7:249-264）をＮ末端とＣ末端でＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガンドで標識した抗ＶＥ
ＧＦ抗体変異体の見かけの結合親和性に比較して用い、遺伝子ＩＩＩタンパク質
のＣ末端ドメインの融合体としてバクテリオファージＭ１３粒子で一価的に表示
した。 ハーセプチン(登録商標)として知られる無関係のヒト化ＩｇＧ、４Ｄ５-Ｉｇ
Ｇによってリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中２マイクロｇ／ｍＬでNunc Maxis
orp免疫吸着プレート上を被覆した。ＸＬ-１ブルー大腸菌（Stratagene）を一晩
培養したファージミド粒子を０．５％のウシ血清アルブミンと０．０５％のＴｗ
ｅｅｎ-２０を含むＰＢＳで希釈した。ファージミド粒子を溶解したハーセプチ
ン(登録商標)の連続希釈液と混合し、非吸着プレート（Nunc F96）で２０分間平
衡化し、次いで非結合ファージの除去のためにハーセプチン(登録商標)被覆した
Maxisorpプレートに移動した。２０分後プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し
、抗ファージモノクローナル抗体ＨＲＰコンジュゲート（Pharmacia）及びＯＰ
Ｄ基質(Sigma)で発達させた。構築物、ｐＹ０１９２-５６９、ｐＹ０１９２-５
７０、ｐＹ０３１７-５６９、及びｐＹ０３１７-５７０のそれぞれについての約
１００−３００ｎＭのＩＣ５０値を置換曲線（Ｆｉｇ．１）で示した。
【００５５】 実施例４ ＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガンドで標識した抗ＶＡＧＦ ＦａｂへのＩｇＧ結合のビ
アコア(商品名)分析 無関係なＩｇＧ、ハーセプチン(登録商標)としても知られる４Ｄ５-ＩｇＧの
、固定ＶＥＧＦバイオセンサーチップに事前に結合させたＦａｂに対する結合を
測定するために、表面プラズモン共鳴器（ビアコア社、ピスカタウェイ、ニュー
ジャージー）を用いた。 ｐＹ０３１７及びｐＹ０３１７-５７０（それぞれコントロール抗ＶＥＧＦ高
親和性のヒト化Ｆａｂ、及び抗ＶＥＧＦ高親和性、ＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガン
ドドメインで標識したヒト化Ｆａｂ；上掲の実施例２、及びWO98/45331参照）に
よりコードされるＦａｂ変異体を大腸菌で発現させ、タンパク質Ｇ（Pharmacia
社）親和性クロマトグラフィーで精製した。組み換えヒトＶＥＧＦを記述される
ように（Muller等, 1998, 上掲）ビアコア(商品名)ＣＭ-５バイオセンサーチッ
プ（ビアコア社）上に固定した。ＶＡＧＦの固定の後、チップをエタノールアミ
ンで遮断し、ペプチドリガンドをＹ０３１７−５７０ Ｆａｂ、又はＹ０３１７
コントロールで標識し、０．０５％のＴｗｅｅｎ-２０と０．０１％のアジ化ナ
トリウムを含有するＰＢＳバッファーに投入した。Ｆａｂ投入の後、ハーセプチ
ン(登録商標)を投入し、投入に従う解離率（ｋｏｆｆ）を得た。 結果（Ｆｉｇ．２）は、ハーセプチン(登録商標)がコントロールＹ０３１７
Ｆａｂ以外の標識物に結合したことを示す。１：１ラングミュア結合モデル（Ka
rlsson等(1991), J. Immunol. Methods 145:229-240(1991)）を用いて、２．８
ｘ１０−３、秒−１のｋｏｆｆ、及び８．５分の対応する消失半減期（ｔ１／２ ）をＹ０３１７-５７０について測定した。物質の制限は正確な結合の測定を妨
げた。しかしながら、得られたｋｏｆｆは３０ｎＭから３００ｎＭ（ｋｏｎは１
０４−１０５Ｍ−１秒−１とみなす）の平衡結合親和性、Ｋｄがペプチド結合と
ファージＥＬＩＳＡの結果（上）に一致することを示唆する。重要なことには、
またビアコア(商品名)の結果は、標識したＦａｂが抗体（固定ＶＥＧＦ）と無関
係のＩｇＧの両方に同時に結合できることを示す。
【００５６】 実施例５ ＩｇＧ-Ｆｃリガンド標識した抗ＶＥＧＦ Ｆａｂは延長した消失半減期を有する ＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガンド標識した抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ（Ｆａｂ-Ｙ０３１
７-５７０）の血液クリアランス速度と組織分布を、標識していないコントロー
ル抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ Ｙ０３１７のものと比較する。消失半減期と分布容積の測
定は重量２．８から３ｋｇのニュージーランドシロウサギで行う。血漿試料中に
存在する被験物質の量は当該分野で既知の任意の方法、例えばＥＬＩＳＡ又はＲ
ＩＡを用いて測定する。 薬物動態分析は被験物質血漿濃度を用いて実施する。投与後の経過時間に対し
てプロットした場合に各被験物質の集団平均血漿データは多次指数関数プロフィ
ールに一致する。データは標準的な２分画モデルによりボーラス投与量と分布及
び消失相の一次速度定数に当てはめる。静脈内投与のデータに最適な一般式は：
ｃ(ｔ)＝Ａｅ−αｔ＋Ｂｅ−βｔであり、ここでｃ(ｔ)は時間ｔにおける血漿濃
度であり、ＡとＢはＹ軸上の切片であり、αとβはそれぞれ分布及び消失相の見
かけの一次速度定数である。α相はクリアランスの初期相であり、動物の全ての
細胞外液中のタンパク質の分布を示すのに対し、衰退曲線の第２又はβ相部分は
真の血漿クリアランスを示す。このような均衡に合わせる方法は当該分野でよく
知られている。例えば、Ａ＝Ｄ／Ｖ(α-ｋ２１)／(α-β)、Ｂ＝Ｄ／Ｖ(β-ｋ２
１)／(α-β)、及びα及びβ（α＞β）は二次方程式の平方根：Ｖ＝分布容積、
ｋ１０＝消失率、ｋ１２＝分画１から分画２への移動率及びｋ２１＝分画２から
分画１への移動率を用いたｒ２＋(ｋ１２＋ｋ２１＋ｋ１０)ｒ＋ｋ２１ｋ１０＝
０であり、Ｄ＝投与量である。
【００５７】 試験日の朝、６羽のニュージーランドシロウサギ（体重２．８−３．０ｋｇ）
を固定器に固定した。血液試料採取用の耳動脈と投与用の事情脈にカテーテルを
挿入した。 ウサギを２つの集団（ｎ＝３／集団）に分けた。集団１の動物はコントロール
抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ-Ｙ０３１７の静脈内投与ボーラスを受けた。集団２のウサギ
はＦａｂ-Ｙ０３１７-５７０を受けた。集団の条件の概要と投与量については以
下の表に示す。 集団 重量 投与集団 公称投与量 投与濃度 投与量 (kg) (mg/kg) (mg/mL) (mL) １ ２．９ コントロール-Fab-Y0317 １ ３ ０．９７ １ ３．０ コントロール-Fab-Y0317 １ ３ １．００ １ ２．９ コントロール-Fab-Y0317 １ ３ ０．９７ ２ ２．８ Fab-Y0317-5701 ３ ０．９３ ２ ３．０ Fab-Y0317-5701 ３ １．００ ２ ２．９ Fab-Y0317-5701 ３ ０．９７ 投与の直前と投与後１０、２０、４０分、１、２、３、４、６、８、２４及び
４８時間に順次血液試料（０．５ｍＬ）を収集した。血液を血清分離管に収集し
、室温で凝血させ（〜３０分）、遠心分離した。血清を採取し、分析までの間直
ちに−７０℃で保存した。
【００５８】 ＥＬＩＳＡプレートを０．５マイクロｇ／ｍｌのＶＥＧＦ含有５０ｍＭの炭酸
バッファー、ｐＨ９．６で、４℃で一晩被覆し、さらに０．５％のウシ血清アル
ブミン、１０ｐｐｍのプロクリン３００（スペルコ社、Bellefonte, PA）含有Ｐ
ＢＳ（８ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２．７ｍＭのＫＣ
ｌ及び１３７ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で室温で１時間遮断した。標準物（
０．４１−１００ｎｇ／ｍｌ）と０．５％のウシ血清アルブミン、０．０５％の
ポリソルベート２０、０．２５％のＣＨＡＰＳ、０．２％のウシγグロブリン（
シグマ社、St. Luis、MO）を含有するＰＢＳ中の２倍連続希釈試料（最小希釈１
：１００）をプレートで２時間インキュベートした。結合した抗体をヤギＦ(ａ
ｂ')２抗ヒトＩｇＧ(ａｂ')２（Jackson ImmunoResearch社、West Grove, PA）
を標識したペルオキシダーゼで、次いで基質として３,３',５,５'-テトラメチル
ベンジジン（Kirkegaard＆Perry Laboratories）希釈した。プレートを工程の間
で洗浄した。吸着をTiterek stacker reader（ＩＣＮ社、コスタメサ、カリフォ
ルニア州）の４５０ｎｍで読み取った。標準曲線を４つのパラメータの回帰曲線
適合プログラム（カレイダグラフ, Synergy software社, Reading, PA）を用い
て当てはめた。標準曲線の範囲にあるデータの点は試料のＦａｂ濃度得お計測す
るのに使用された。 データ分析：時間プロフィールに対する濃度のグラフをカレイダグラフ（カレ
イダグラフ(商品名)Ｖ．３．０９著作権 1986-1997. Synergy software社, Read
ing, PA）を用いて作成した。読み取り不可能（ＬＴＲ）として記録された値は
ＰＫ分析に含まれず、グラフには示されない。薬物動態パラメータはWinNonlin
ソフトウェア（WinNonlin(登録商標)Professional V.3.1 WinNonlin(商品名)著
作権 1998-1999. Pharsight Corporation. Mountain View, CA)を用いた分画別
分析により測定された。薬物動態パラメータを他（Ritschel WA 及びKearms GL.
Handbook of basic pharmacokinetics including clinical applications, 5th
edition. American Pharmaceutical Assoc., Washington, DC. 著作権 1999）
に記載されているようにして算定した。
【００５９】 結果をＦｉｇ．３に記載する。ボーラス投与と一次生産性（WinNonlin）を用
いた２分画モデルは時間データに対する得られた血清濃度に当てはめて使用され
た。測定された薬物動態パラメータは以下の表に示した。 薬物動態パラメータ概要 （静脈内投与；１ｍｇ／ｋｇ） パラメータ 集団１ 集団２ コントロールFab-Y0317 Fab-Y0317-570 ＡＵＣ(h*μg/mL) 13.6±1.2 215±56 Ｃｍａｘ(μg/mL) 15.6±0.6 13±0.7 ＣＬ(mL/h/kg) 74.2±6.7 4.8±1.1 Ｋ１０半減期(hr) 0.6±0.02 11.3±3.6 α半減期(hr) 0.39±0.03 1.15±0.31 β半減期(hr) 1.93±0.27 37.6±19 Ｖ１(mL/kg) 64.1±2.37 75.2±4.23 Ｖｓｓ(mL/kg) 112±7.7 225±54 両方の薬剤の分布の開始量は血清量にほぼ等しかった。Ｆａｂ-Ｙ０３１７-５
７０(２２５ｍＬ／ｋｇ)の分布の見かけの定常量は内因性ＩｇＧへの結合に有効
な量を示すコントロールＦａｂ（１１２ｍＬ／ｋｇ）の予測よりも約２倍高かっ
た。コントロールＦａｂ-Ｙ０３１７はＦａｂ-Ｙ０３１７-５７０（４．８ｍＬ
／ｈ／ｄ）に比較して血清から約１５倍早く排除された（クリアランス＝７４ｍ
Ｌ／ｈ／ｋｇ）。Ｆａｂ-Ｙ０３１７-５７０の全体暴露（ＡＵＣ）はＦａｂ-Ｙ
０３１７よりも〜１６倍高かった。Ｆａｂ-Ｙ０３１７を投与の２４時間後血清
で検出不可能であったが、Ｆａｂ-Ｙ０３１７-５７０の血清濃度は依然として投
与の４８時間後１μｇ／ｍＬを超えていた。分布（α）半減期（１．１５ｈ）及
び消失（β）半減期（３７．６ｈ）は共にコントロールＦａｂよりも著しく長か
った。 これらの結果は、婦負陰性ＩｇＧに結合する１３のアミノ酸のＦａｂ-Ｙ０３
１７への付加がＦａｂクリアランスを有意に遅延させ、半減期を増加し、全体の
暴露を促進することができることを示唆する。
【００６０】 実施例６ 血清アルブミンペプチドリガンド ファージライブラリ及び選択条件−ファージディスプレイペプチドライブラリ
をウサギ、ラット及びヒトアルブミンに対して選択した。遺伝子８に融合するラ
ンダムペプチドリガンドを発現するファージライブラリ（Lowman等, Biochem. 3
7, 8870(1998)）は５つのグループにプールした：プールＡはＣＸ２ＧＰＸ４Ｃ
、Ｘ４ＣＸ２ＧＰＸ４ＣＸ４及びＸｉＣＸｊＣＸ２を含み、ここでｊ＝８−１０
；プールＢはＸ２０及びＸｉＣＸｊＣＸｋを含み、ここでｊ＝４−７；プールＣ
はＸ８及びＸ２ＣＸｊＣＸ２を含み、ここでｊ＝４−６；プールＤはＸ２ＣＸｊ ＣＸ２を含み、ここでｊ＝７−１０；プールＥはＣＸ６ＣＸ６ＣＣＸ３ＣＸ６Ｃ
、ＣＣＸ３ＣＸ６Ｃ、ＣＣＸ５ＣＸ４ＣＸ４ＣＣ、ＣＸＣＸ７ＣＸ３ＣＸ６を含
み、ここでＸは２０の天然発生Ｌアミノ酸を示す。それぞれの場合において、ｉ
＋ｊ＋ｋ＝１８及び｜ｉ−ｋ｜＜２。１０のライブラリのそれぞれが１０８のク
ローン以上である。 ファージライブラリプールを結合バッファ（ＰＢＳ、１％のオボアルブミン、
０．００５％のＴｗｅｅｎ-２０）に懸濁し、maxisorpプレート（ＰＢＳ中１０
μｇ／ｍｌ、４℃で一晩；プレートはブロッカーカゼイン（Pierce Chemical, R
ockford, IL）で遮断した）上に直接固定したウサギ、ラット又はヒトアルブミ
ンに対して分類した。２時間後、結合していないファージを洗浄（ＰＢＳ、０．
０５％のＴｗｅｅｎ-２０）を繰り返して取り除き、結合したファージを５００
ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨＣｌ、ｐＨ２で溶出した。溶出したファージをＶＣ
ＳＭ１３ヘルパーファージ（Stratagene, La Jolla, CA）でＸＬ１-Ｂｌｕｅ細
胞で増殖した。濃縮を、オボアルブミン又はカゼインでの成功裏の被覆に比較し
て成功裏に被覆されたアルブミンと結合したファージの数の滴定によって監視し
た。 ファージＥＬＩＳＡ−ファージクローン（〜１０１１ファージ）をラット、ウ
サギ又はヒトアルブミンで被覆したプレートに加えた。マイクロタイタープレー
トを洗浄バッファーで洗浄し、結合したファージをＨＲＰ／抗Ｍ１３コンジュゲ
ートで溶出した。結合したＨＲＰの量をＡＢＳＴ／Ｈ２Ｏ２基質を用いて４０５
ｎｍでの変化を監視することにより測定した。
【００６１】 ウサギ、ヒト又はラットアルブミンへの結合を選択したファージアルブミンに
より示されるペプチド配列がＦｉｇ．４に示される。また固定したアルブミンの
３種に結合する個々のファージクローンの能力が望まれる。これは、ファージＥ
ＬＩＳＡを用いて試験された。ラットアルブミンへの結合を選択しクローンＲＢ
はまた、ヒト及びウサギアルブミン結合能力があることに注意してほしい。 一価のファージでの配列成熟−部分的にランダム化したライブラリをそれぞれ
の選択クローンをコードするオリゴヌクレオチドを用いてＦｉｇ，４に示したが
、記載されているように（Dennis等, Nature 404, 465(2000)）塩基の７０−１
０−１０−１０混合物で合成した。これらのライブラリの潜在的な多様性は当初
の未処置のライブラリと同じであるが、各「ソフトランダム化」ライブラリはＦ
ｉｇ．４の選択配列に偏りを有する。各ライブラリは再びその起源のラット、ウ
サギ又はヒトアルブミンへの結合を選択した。例えば、もとはラットアルブミン
への結合を同定したが、クローンＲＢのソフトランダム化から生じるライブラリ
をラット、ウサギ又はヒトアルブミンに対して選択した。ソフトランダム化に従
って同定された配列はファージＥＬＩＳＡにより決定されるようなそれらの種特
異性と共にＦｉｇ．５に示される。ほとんどのクローンがそれらが選択したアル
ブミンの種に特異性的であるように見えるが、ＲＢソフトランダムかライブラリ
由来のクローンはこれらの種の全てに結合する。 またファージクローンをアカゲザル、マウス及びウシアルブミンへの結合につ
いて試験した。ＲＢソフトランダム化ライブラリ由来のクローンを同様にこれら
の種のアルブミンのそれぞれへの結合に対して検出し、オボアルブミン及びカゼ
インへの結合欠陥に基づいてアルブミンに固有である（Ｆｉｇ．６）。複数種の
アルブミンに結合するクローン（多重特異性結合剤）をＦｉｇ．７に示す。
【００６２】 ハードランダム化−ＲＢ配列のソフトランダム化由来の配列をさらに、ハード
ランダム化法を用いて成熟させた。新しいライブラリは、残りの部分を十分にラ
ンダム化する間に選択残基（下線を付した）定常Ｘ５ＤＸＣＬＰＸＷＧＣＬＷＸ ４ を高度に保存することを示した。第２のライブラリ、Ｎ及びＣ末端の両方でよ
り短い１つの残基がまた、構築された。ラット、ウサギ又はヒトアルブミンに対
して選択された３つのライブラリ由来の配列をそれぞれＦｉｇ．８Ａ、８Ｂ、及
び８Ｃに示す。 ペプチド合成−ペプチドを手動又は自動（Milligen 9050）何れかの、ＰＥＧ
ポリスチレン樹脂を用いた０．２５ｍモル大のＦｍｏｃ基固相合成によって合成
した（Bodanszky M.,(1984) Principles of Peputide Synthesis, Springer, Be
rlin）。側鎖保護基を取り除き、ペプチドを９５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ
）と５％のトリイソプロピルシランの樹脂から分割した。飽和したイオジンの酢
酸溶液をジスルフィド結合の酸化のために添加する。ペプチドを０．１％のＴＦ
Ａを勾配して含有する水／アセトニトリルの用いたファージＨＰＬＣによって精
製した。ペプチドを分析的ＨＰＬＣにより＞９５％に精製し、その同一性を質量
分析により検証した。 ペプチドＳＡ０８のカルボキシ末端リシンは、ＮＨＳ-ＬＣ-ビオチン（Poerce Chemical社, Rockford, IL）で誘導体化し、上記のようにして得られたＳＡ０
８ｂをＨＰＬＣで精製した（Ac-QGLIGDICLPRWGCLWGDSVKb-nここでKbはリシン-ビ
オチンを表す）。 ＳＡ０８結合アッセイ−ウサギ、ラット又はマウスアルブミンをＰＢＳ中１０
μｇ／ｍｌ、４℃で一晩、maxisorpプレート上に直接固定した。プレートを阻害
剤カゼイン（pierce Chemical社, Rockford, IL）を用いて１時間阻害した。続
けて希釈した試料を結合バッファーに懸濁し（上）、プレートに添加して、続い
て１０ｎＭのＳＡ０８ｂを添加して２５℃で１時間おいた。マイクロタイタープ
レートをＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄し、アルブミンに結合した
ＳＡ０８ｂをストレプトアビジン／ＨＲＰで希釈した。ＨＲＰ結合量は、ＡＢＴ
Ｓ／Ｈ２Ｏ２基質を用いて測定し、４０５ｎｍでの変化をモニターした。 同定したファージ配列に対応するペプチドを合成し、ラット、ウサギ又はマウ
スアルブミンに対する親和性をＳＡ０８ｂ結合アッセイを用いて測定した（Ｆｉ
ｇ．９及び１０）。 対照的にアルブミン結合Ｆａｂ融合の発現と精製−アルブミンとの結合がイン
ビボのタンパク質及びペプチドの半減期を増加するかどうかを試験するために、
ＳＡ０６の配列を結合組織因子（ＴＦ）に対するＦａｂ断片（Ｄ３Ｈ４４）に融
合させた。ＳＡ０６配列をＦａｂの軽鎖（Ｄ３Ｈ４４-Ｌ）又は重鎖（Ｄ３Ｈ４
４-Ｌｓ）のどちらかのカルボキシ末端に加えた。さらに、折り畳みの問題に対
する対策として、Ｆｉｇ．１１に記載されるようなアラニン（それぞれ、Ｄ３Ｈ
４４-Ｌｓ及びＤ３Ｈ４４-Ｈｓ）により置換された鎖内ジスルフィド以外は同一
の構築をさせた。
【００６３】 融合物をアルカリホスファターゼプロモーターの制御下で発現させ、ｓｔＩＩ
分泌シグナルを用いて大腸菌から分泌させた。Ｆａｂ融合体を、１ｍＭのＥＤＴ
Ａ、１０ｍＭのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ８、４℃に１時間、細胞を懸濁することに
よりペリプラズムから回収した。細胞の破片を遠心分離によって取り除き、抗Ｔ
Ｆ ＦａｂをＨｉ-Ｔｒａｐ（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）Ｔ
Ｆ親和性カラムを用いて選択的に精製した。適切に折り畳まれたＤ３Ｈ４４-Ｌ
又はＤ３Ｈ４４-Ｌｓをウサギアルブミン親和性カラム（ＣＮＢｒ活性化セファ
ロース４Ｂに結合したウサギアルブミン、Amersham Pharmacia Biotech, Piscat
away, NJ）を用いて更に精製した。両方のカラムをＰＢＳで洗浄し、５０ｍＭの
ＨＣｌで溶出した。溶出した分画を１Ｍのトリス ｐＨ８で中和した。内毒素を
トリトンＸ１１４（Aida及びpabst, J. Immunol. Methods 132, 191(1990)）で
の抽出に従って更に取り除いた。 ＦＸ活性アッセイ（Ｆｉｇ．１２）、及び組織因子依存性凝固の延長を測定す
るプロトロンビンタ時間アッセイ（Ｆｉｇ．１３）（方法についてはDennis 等,
Nature 404, 465(2000)参照）で測定されるように、精製したＤ３Ｈ４４融合体
はＴＦに結合する能力を保持していた。アルブミン結合配列（ＷＴ）を欠くＤ３
Ｈ４４と異なり、Ｄ３Ｈ４４-Ｌ及びＤ３Ｈ４４-Ｌｓは共にＳＡ０８ｂ結合アッ
セイ（Ｆｉｇ．１４）で測定されるように、アルブミンに対する結合能力がある
。更に、Ｄ３Ｈ４４アルブミン結合融合体は共に、ビオチンＴＦ結合アッセイ（
Ｆｉｇ．１５）で判断されるように、ＴＦとアルブミンを同時に結合する能力が
ある。このアッセイにおいて、固定化したアルブミンに対するＤ３Ｈ４４融合体
の結合は、ビオチニル化ＴＦで検出される。野生型Ｄ３Ｈ４４（ＷＴ）はアルブ
ミン結合能力がなく、従ってビオチニル化ＴＦの添加でシグナルを発生しない。 Ｄ３Ｈ４４アルブミン結合融合体の薬物動態−Ｄ３Ｈ４４変異体をウサギに０
．５ｍｇ／ｋｇボーラスとして与えた。各グループは３羽のウサギ（Ｆ(ａｂ')
２グループで５つ）で構成される。提示した時点で得られた血清試料を連続希釈
し、ＴＦ結合ＥＬＩＳＡを用いてＤ３Ｈ４４の濃度を測定した。
【００６４】 薬物動態分析を被験物質血漿濃度を用いて実施する。各被験物質の集団平均血
漿データは投与後の経過時間に対してプロットした際、多次指数関数的プロフィ
ールに従う。データをボーラス投与での標準２分画モデルと分布及び消失相の一
次速度定数に当てはめる。静脈内投与のデータに最も適合する一般式は：ｃ(ｔ)
＝Ａｅ−αｔ＋Ｂｅ−βｔであり、ここでｃ(ｔ)は時間ｔでの血漿濃度、Ａ及び
ＢはＹ軸の切片、及びα及びβはそれぞれ分布及び消失相の見かけの一次速度定
数である。α相はクリアランスの初期相であり、動物の全ての細胞外液にタンパ
ク質の分布を示すが、衰退曲線の第２又はβ相の部分は真の血漿クリアランスを
示す。このような方程式に合致させる方法は当分野でよく知られている。例えば
、Ａ＝Ｄ／Ｖ(α-ｋ２１)／(α-β)、Ｂ＝Ｄ／Ｖ(β-ｋ２１)／(α-β)、α及び
β（α＞β）は次の二次方程式の平方根である：Ｖ＝分布容積、ｋ１０＝消失率
、ｋ１２＝分画１から分画２への移動率及びｋ２１＝分画２から分画１への移動
率、及びＤ＝投与量を用いたｒ２＋(ｋ１２＋ｋ２１＋ｋ１０)ｒ＋ｋ２１ｋ１０
＝０。 データ分析：時間プロフィールに対する濃度のグラフをカレイダグラフ（カレ
イダグラフ(商品名)Ｖ．３．０９著作権 1986-1997. Synergy software社, Read
ing, PA）を用いて作成した。読み取り不可能（ＬＴＤ）として記録された値は
ＰＫ分析に含まれず、グラフには示されない。薬物動態パラメータはWinNonlin
ソフトウェア（WinNonlin(登録商標)Professional V.3.1 WinNonlin(商品名)著
作権 1998-1999. Pharsight Corporation. Mountain View, CA)を用いた分画別
分析により測定された。薬物動態パラメータを他（Ritschel WA 及びKearms GL.
Handbook of basic pharmacokinetics including clinical applications, 5th
edition. American Pharmaceutical Assoc., Washington, DC. 著作権 1999）
に記載されているようにして算定した。 アルブミン結合ペプチドのＤ３Ｈ４４に対する融合によって、改善した薬物動
態パラメータを有するタンパク質となる（Ｆｉｇ．１６及び１７）。Ｄ３Ｈ４４
-Ｌは野生型Ｆａｂに比較して７０倍増加した半減期（Ｋ１０-ＨＬ）及び２０Ｋ
又は４０Ｋポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で誘導体化されたＤ３Ｈ４４ Ｆ
ａｂに対する類似した半減期を有する。 ここに列挙した全ての文献は全文を出典明示によりここに取り込む。
【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ．１】 ペプチド-リガンド標識した抗ＶＥＧＦ Ｆａｂファージミ
ド粒子のＩｇＧ結合を示すファージ競合ＥＬＩＳＡアッセイ。４つの異なる構築
物が示される：ｐＹ０１９２-５６９（塗りつぶした大丸）、ｐＹ０１９２-５７
０（白抜きの大丸）、ＰＹ０３１７-５６９（塗りつぶした小丸）、及びｐＹ０
３１７-５７０（「ｘ」）。
【Ｆｉｇ．２】 ペプチド-リガンド標識した抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ Ｙ０３１
７-５７０（標識したもの；上のパネル）Ｙ０３１７ Ｆａｂ（コントロール；下
のパネル）に結合するＩｇＧのビアコア（商品名）分析。上の略画は、標識した
Ｆａｂ実験で観察された結合現象のモデルを示す。
【Ｆｉｇ．３】 Ｆａｂ-Ｙ０３１７-５７０及びＦａｂ-Ｙ０３１７の時間
に対するグループ平均血清濃度のデータ（±ＳＤ）を図に示す。
【Ｆｉｇ．４】 ウサギ、ヒト又はラットアルブミンに対する結合で選択さ
れたファージクローンにより開示されたペプチド配列をＦｉｇ．４に示す。また
、３種の固定化アルブミンに結合する個々のファージクローンの能力を示す。
【Ｆｉｇ．５Ａ及び５Ｂ】 ソフトランダム化に従って特定した配列を、フ
ァージＥＬＩＳＡにより決定される種特異性と共にＦｉｇ．５に示す。
【Ｆｉｇ．６】 ＲＢソフトランダム化ライブラリ由来のクローンについて
、これらの種の各アルブミンへの結合をＥＬＩＳＡにより検出し、オボアルブミ
ン及びカゼインへの結合の欠損に基づきアルブミンを特定した。
【Ｆｉｇ．７】 複数種のアルブミンに結合するクローン（多種結合型）が
Ｆｉｇ．７に示される。
【Ｆｉｇ．８Ａ、８Ｂ及び８Ｃ】 ラット、ウサギ及びヒトアルブミンに対
して選択されたライブラリ由来の配列がそれぞれＦｉｇ．８Ａ、８Ｂ及び８Ｃに
示される。
【Ｆｉｇ．９】 同定したファージ配列に相当するペプチドを合成し、ラッ
ト、ウサギ又はマウスアルブミンに対するそれらの親和性をＳＡ０８ｂ結合アッ
セイを用いて測定した。
【Ｆｉｇ．１０】 ＳＡ０６同定ファージ配列に相当するペプチドを合成し
、ラット、ウサギ又はマウスアルブミンに対するその親和性をＳＡ０８結合アッ
セイを用いて測定した。
【Ｆｉｇ．１１】 ＳＡ０６配列をＦａｂの軽鎖（Ｄ３Ｈ４４-Ｌ）又は重
鎖（Ｄ３Ｈ４４-Ｌｓ）の何れかのカルボキシ末端に加えた。さらに、個々の構
築物に、Ｆｉｇ．１１に示されるようなアラニン（それぞれＤ３Ｈ４４-Ｌｓ及
びＤ３Ｈ４４-Ｈｓ）により置換された鎖内ジスルフィドを作成した。
【Ｆｉｇ．１２】 精製Ｄ３Ｈ４４融合体は、ＦＸ活性化アッセイを用いて
測定される、ＴＦ結合能力を保持した。
【Ｆｉｇ．１３】 精製Ｄ３Ｈ４４融合体は、組織因子依存性の凝固の延長
を測定するプロトロンビン時間アッセイを用いて測定される、ＴＦ結合能力を保
持した。
【Ｆｉｇ．１４】 アルブミン結合配列（ＷＴ）を欠くＤ３Ｈ４４と異なり
、Ｄ３Ｈ４４-ＬとＤ３Ｈ４４-Ｌｓのどちらもアルブミン結合能力があることが
、ＳＡ０８ｂ結合アッセイで測定された。
【Ｆｉｇ．１５】 どちらのＤ３Ｈ４４アルブミン結合融合体もＴＦとアル
ブミンに同時に結合する能力があることが、ビオチン-ＴＦ結合アッセイにより
決定された。
【Ｆｉｇ．１６】 アルブミン結合ペプチドとＤ３Ｈ４４の融合は改善され
た薬物動態パラメータを有するタンパク質を生じる。
【Ｆｉｇ．１７】 アルブミン結合ペプチドとＤ３Ｈ４４の融合は改善され
た薬物動態パラメータを有するタンパク質を生じる。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年２月１２日（２００１．２．１２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】 生理活性化合物の消失半減期延長のための方法及び組成物
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、血漿タンパク質等の予定した分子に結合する、ペプチドリガンドと
呼ばれている新規な化合物に関する。特定の態様では、本発明はペプチドリガン
ドドメイン及び例えば生物活性分子といった活性ドメインを含むハイブリッド分
子を含む組成物に関する。活性ドメインは診断又は治療の目的で利用できる分子
を包含しうる。好ましい実施態様では、ペプチドリガンドドメイン及び活性ドメ
インを含むハイブリッド組成物は、薬物動態学的又は薬理学的な特性が改良され
ている。さらに本発明はペプチドリガンドの調査、診断又は治療的用途を提供し
、ペプチドリガンド分子を含む製薬組成物といった組成物を包含する。
【０００２】 （関連した開示文献の説明） ファージディスプレイは、強制的及び非強制的なペプチドライブラリを作成す
る方法を提供する(Devlin等, (1990) Science 249:404-406; Cwirla等, (1990)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; Lowman (1997) Ann. Rev. Biophys
. Biomol. Struct. 26:401-424)。これらのライブラリは、予定標的分子に結合
能力のあるペプチドリガンドを同定及び選択するのに使用することができる(上
掲のLowman (1997))；Clackson及びWells (1994) Trends Biotechnol. 12:173-1
84; 上掲のDevlin等, (1990))。細胞標的に存在し(Arap等, (1998)Science 279:
377-380)；ＩＬ-αの結合を阻害するヒトＩ型インターロイキン１(ＩＬ-１)レセ
プターに結合し(Yanofsky等, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7381-738
6)；サイトカインエリスロポエチン(ＥＰＯ)に対するレセプターに結合及びそれ
を活性化し(Wrighton等, (1996) Science 273:458-463)；ヒトトロンボポエチン
レセプターに結合して、天然リガンドトロンボポエチン(ＴＰＯ)の結合と競合す
る(Cwirla等, (1996) Science, 276:1696-1699)、ペプチド修飾を同定するため
に、又は天然タンパク質結合リガンドから親和性向上又は成熟したペプチドリガ
ンドを生成する(Lowma等, (1991) Biochemistry 30:10832-10838)ために、該技
術が使用される。
【０００３】 一価のファージディスプレイにより作成された構造的に構築されたペプチドラ
イブラリを用いて、インシュリン様成長因子１結合タンパク質(ＩＧＦＢＰ)に特
異的に結合する１４アミノ酸ペプチドが単離された(Lowman等, (1998), Biochem
istry, 37:8870-8878)。ペプチドはヘリックス構造を有し、インビボでＩＧＦＢ
Ｐに結合してインシュリン様成長因子-ａ(ＩＧＦ-１)活性を遊離する(上掲のLow
man等(1998))。インビボでのファージ選択を利用して、脳及び腎臓のような種々
の器官に選択的局在化に媒介可能なペプチド（Pasqualini及びRuoslohti (1996)
Nature 380:364-366）、並びにαＶβ３又はαＶβ５インテグリンを担持する
特定の腫瘍タイプに帰着するペプチドが同定されている(Arapら, (1998) Scienc
e 279：377-380)。米国特許第5,627,263号には、α５β１インテグリンにより認
識され、これと選択的に結合するペプチドが記載されている。親和性又は特異性
が改善されたタンパク質の例には、ヒト成長ホルモン、亜鉛フィンガー、プロテ
アーゼインヒビター、心房性ナトリウム利尿因子、及び抗体が含まれる(Wells,
J. 及びLowman H.(1992), Curr. Opin. Struct. Biol. 2：597-604；Clackson,
T.及び Wells, J.(1994), Trends Biotechnol. 12：173-184；Lowman等, (1991
) Biochemistry 30(10)：832-838；Lowman及びWells J.(1993), J. Mol. Biol.
234：564-578；Dennis M.及び Lazarus R.(1994), J. Biol. Chem. 269(22)：13
7-144)。
【０００４】 血清アルブミンが結合するとインシュリンの薬力学が向上すると考えられる。
１０−１６の炭素原子を有する飽和脂肪酸でのインシュリンのアシル化は、アル
ブミンに対して親和性のあるインシュリンを生成する(Kurtzhals, P.等(1995) B
iochem. J. 312:725-731)。アシル化インシュリン間のアルブミン結合親和性の
差は、様々な分子のウサギへの皮下注射後の血糖低下作用タイミングと相関関係
がある。アルブミンとの結合の緊密さは血糖低下の遅延と相関関係があり、ある
いは、皮下組織のアルブミンに結合しているアシル化インシュリンに依存して、
非アシル化インシュリンと比較した場合にアシル化インシュリン吸収率が低くな
る。 ＣＤ４のＶ１及びＶ２ドメインがヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と融合した血
清アルブミンＣＤ４コンジュゲートが記載されている(Yeh, P等 (1992), Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89:1904-1908)。コンジュゲートの消失半減期は、ウサギ
の実験モデルにおいて溶解性ＣＤ４（ｓＣＤ４）の１４０倍であった。 連鎖球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメインに融合したヒト溶解性補
体レセプター１型（ｓＣＲ１）のインビボ半減期延長が報告されている(Makride
s, S.等(1996) J. Pharmacol. Exptl. Ther. 277:532-541)。約８０のアミノ酸
（断片ＢＡ）、及び約１５５のアミノ酸（断片ＢＡＢＡ）を有するタンパク質Ｇ
のアルブミン結合ドメインを含有する構造である。 約６０のアミノ酸を有するタンパク質ＡのＺドメインから誘導した標識ＩｇＧ
結合ドメイン、及び約２００のアミノ酸を有する連鎖球菌タンパク質Ｇ（Ｂドメ
イン）から誘導された血清アルブミン結合ドメインの薬物動態についての記載が
ある（ＥＰ０４８６５２５）。
【０００５】 (発明の概要) 本発明は、血漿タンパク質に結合する新規な化合物を提供する。本発明の化合
物(ペプチドリガンドと呼ぶ)は、例えばペプチド又はペプチド誘導体、例えばペ
プチド模倣物及びペプチド類似物である。本発明の好ましい態様によれば、化合
物は血清アルブミン又はＩｇＧ-Ｆｃ等の免疫グロブリンの一部といった血漿タ
ンパク質に結合する非天然に発生するアミノ酸配列である。好ましくはペプチド
リガンドは約１０〜２０のアミノ酸残基の非天然に生じるアミノ酸配列である。 このような化合物は、好ましくは、約１００μＭ未満、好ましくは１００ｎＭ
未満の解離定数、Ｋｄにより特徴づけられる親和性を有する所望の血漿タンパク
質に結合し、好ましくは他の血漿タンパク質に実質的には結合しない。このよう
な化合物の特定の例は、直鎖状又は環状、特に環状のペプチド、好ましくは約１
０〜２０の長さのアミノ酸残基、その組み合わせ、Ｎ末端又はＣ末端又は両方で
修飾されていてもよいもの、並びにその塩及び誘導体、その機能類似体、及び配
列の末端でアミノ酸又はポリペプチドを有する延長したペプチド鎖を含む。
【０００６】 好ましいペプチドリガンドはＩｇＧ-Ｆｃに結合し、直鎖状又は環状のペプチ
ド、好ましくは次の核となる式を含む環状のペプチド化合物を含む： Xaai-Cys-Xaaj-Cys-Xaak 、ここで Xaai は欠いている、又は１〜４のアミノ
酸好ましくは４のアミノ酸のペプチドであり；Xj は好ましい配列 Xaa-Xaa-Xaa-
Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Val-Trp (配列番号：9)；又は Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Gly-Glu-Leu-
Val-Trp (配列番号：10)；又は Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Gly-Glu-Leu-Val-Trp(配
列番号：10)を有する９のアミノ酸が好ましく、ここで Xaa1 は好ましくは Ala,
Ser, 又は Thr； Xaa2 は好ましくは Trp 又は Tyr； Xaa3 は好ましくは His,
又は Trp；Xaa4 は好ましくは Leu 又は Met であり、Xaak は欠いているか、
又は１〜５のアミノ酸、好ましくは５のアミノ酸であり、環状のペプチド又はそ
の類似物がＩｇＧ-Ｆｃ結合の量的生物活性を保持する限りにおいて選択できる
。 この化合物群の中で好ましいものは、次の配列を含むＩｇＧ-Ｆｃに結合する
化合物である： Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa-Xaa-Xa
a-Xaa-Xaa (配列番号：11)； Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa-Xaa-Xa
a-Xaa-Xaa (配列番号：12)； Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xa
a9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13 (配列番号：13)、ここで Xaa5 は Ala, Ser, 又は Thr； Xaa6 は Trp 又は Tyr；Xaa7 は His 又は Trp；及び Xaa8 は Leu 又
は Met；及び Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xa
a9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13 (配列番号：14)、ここで Xaa4 は Ser, Arg, 又は Asp； Xaa5 は Ala, Ser, 又は Thr； Xaa6 は Trp 又は Tyr； Xaa7 は His 又は Trp； Xaa8 は Leu 又は Met； 及び Xaa9 は Glu, Ser, Thr 又は Val。
【０００７】 血清アルブミンに結合する好ましいペプチドリガンドは、直鎖状又は環状のペ
プチド、好ましくは次の式を含む環状のペプチド化合物を含む： (Xaa)x-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-(Xaa)z (Xaa)x-Phe-Cys-Xaa-Asp-Trp-Pro-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Cys-(Xaa)z (配列番号：1 13) (Xaa)x-Val-Cys-Tyr-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Cys-Phe-(Xaa)z (配列番号：114) (Xaa)x-Cys-Tyr-Xaa1-Pro-Gly-Xaa-Cys-(Xaa)z (配列番号：115) 及び (Xaa)x-Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-(Xaa)z (配列番号：1 16) Xaaがアミノ酸であり、x及びzが０（ゼロ）以上の全ての数、一般的には１０
０未満、好ましくは１０未満、より好ましくは０、１、２、３、４又は５、より
好ましくは４又は５であり、Xaa1がIle、Phe、Tyr及びValからなる群から選択さ
れる一般式のペプチド化合物であることが好ましい。
【０００８】 特定の態様では、本発明はペプチドリガンドドメイン及び活性ドメインを含む
ハイブリッド分子を形成する、生理活性化合物とペプチドリガンドの組み合わせ
に関する。本発明の生理活性化合物は治療又は診断用の薬剤として利用できるあ
らゆる化合物を含む。生理活性化合物の非限定的な例としては、数例を挙げると
、酵素、ホルモン、サイトカイン、抗体又は抗体断片等のポリペプチド、並びに
鎮痛薬、解熱剤、抗炎症剤、抗生物質、抗ウィルス剤、抗真菌剤、心血管作動薬
、腎機能及び電解質代謝に効果のある薬剤、中枢神経系に作用する薬剤及び化学
療法剤等の有機化合物が含まれる。 好ましい実施態様では、ペプチドリガンドドメイン及び活性ドメインを含むハ
イブリッド分子は、活性ドメインを含むがペプチドリガンドドメインを欠く同様
の生理活性分子に比較すると薬物動態的又は薬理学的な特性が改善されている。
ハイブリッドの改善された薬物動態的又は薬理的な特性によって、低用量製剤及
び新規な製薬組成物が提供される。ある態様では、本発明はハイブリッド分子の
治療的又は診断的使用を含む新規な組成物の使用方法を提供する。
【０００９】 特定の態様では、本発明はペプチドリガンドと比較的短い消失半減期を有する
生理活性化合物の組み合わせに関する。組み合わせは、例えば生理活性化合物の
消失半減期を増大させることによって生理活性化合物のインビボ使用を包含する
本発明の態様における生理活性化合物の治療的又は診断的効果を改善させること
を含む、様々な目的を考慮して調製される。血清アルブミン、免疫グロブリン、
アポリポタンパク質又はトランスフェリン等の血漿タンパク質に対するペプチド
リガンドの生理活性化合物との融合又は結合（つまり「コンジュゲート」）は、
増大した消失半減期を有する組成物を提供する。このような組み合わせ又は融合
は、従来から組み換え宿主細胞で、又は二官能性の架橋剤の使用によって作成さ
れる。 本発明の他の態様では、ここで開示される例えばＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガン
ド等の免疫グロブリンに対する結合親和性のあるペプチドリガンドを用いて抗体
を精製するための方法及び組成物が含まれる。 本発明はさらに、ここで開示される組成物の治療又は診断的な用途にも及ぶ。
従って、本発明は、製薬的に許容可能な賦形剤と本発明のハイブリッド分子を含
む製薬組成物を包含する。
【００１０】 （好ましい実施態様の詳細な説明） Ｉ．定義 本発明の文脈における「ペプチドリガンド」なる用語は、特定の標的分子に結
合するように機能する非自然発生アミノ酸配列を指して意味する。本発明の文脈
におけるペプチドリガンドは、一般的に拘束されている(つまり、例えばβター
ン又はβプリーツシートを引き起こすアミノ酸の存在ような構造のいくつかのエ
レメントを有している、又は例えばジスルフィド結合したCys残基の存在により
環化している)か、又は拘束されていない(線形)、約５０アミノ酸残基未満、好
ましくは約４０アミノ酸残基未満のアミノ酸配列である。約４０アミノ酸残基未
満のペプチドリガンドでも、約１０〜約３０アミノ酸残基のペプチドリガンド、
特に約２０のアミノ酸残基のペプチドリガンドが好ましい。しかしながら、現在
の開示を読むと、当業者であれば、本発明のペプチドリガンドを区別するのは特
定のペプチドリガンドの長さではなく、特定の標的分子に結合するその能力であ
ることを認識するであろう。よって、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０
、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２
、２３、２４及び２５アミノ酸残基のペプチドリガンドが、同様に本発明の文脈
におけるペプチドリガンドに適している。 本発明のペプチドリガンドは、ペプチドリガンドが標的分子、例えばインビト
ロで、好ましくはインビボで特定細胞型担持標的分子に「帰着する（homes）」
、「結合する」又は「標的とする」ならば、十分な親和性と特異性を持って標的
分子に結合するであろう(例えば、Pasqualini及びRuoslahti(1996) Nature, 380
：364-366、及びArapら,(1998) Science, 279：377-380における「帰着する」、
「帰着」及び「標的」という用語の使用を参照されたい)。一般的に、ペプチド
リガンドは、約１μＭ未満、好ましくは約１００ｎＭ未満、特に好ましくは約１
０ｎＭ未満の解離定数、Ｋｄで特徴づけられる親和性で標的分子に結合する。し
かしながら、標的分子に対して約１ｎＭ未満、好ましくは約１ｐＭ〜１ｎＭの親
和力を有するペプチドリガンドが、同様に有望な本発明のペプチドリガンドであ
る。一般に、前記のように特定の標的分子に結合するペプチドリガンドは、ここ
に記載されるような当分野に標準的な多くの技術の任意のものにより単離し、同
定することができる。
【００１１】 ペプチドリガンドは自然、並びに非自然的に生じたアミノ酸残基を含有してい
てもよい上述したアミノ酸配列である。よって、特定のアミノ酸又はペプチドの
構造を模倣した非アミノ酸化学構造を含みうる、いわゆる「ペプチド模倣物」及
び「ペプチド類似物」も本発明の文脈におけるペプチドリガンドとできる。この
ような模倣物及び類似物は、類似の物理的特徴、例えば大きさ、電荷又はそれら
のペプチド対の片方に見出されるような適切な空間的配向にある疎水性等を示す
ものとして一般に特徴付けられる。ペプチドの模倣化合物の特定の例は、一又は
複数のアミノ酸間のアミド結合が、例えば炭素-炭素結合又は当該分野でよく知
られている他の結合で置換された化合物である(例えば、Sawyer, in Peptide Ba
sed Drug Design pp.378-422(ACS, Washington DC 1995)を参照のこと)。 従って、本発明の範囲における「アミノ酸」なる用語は最も広い意味に使用さ
れ、自然に生じるＬα-アミノ酸又は残基を含むことを意味する。自然に生じる
アミノ酸に対して一般的に使用されている１文字及び３文字略号がここでも使用
される(Lehninger, A.L., Biochemistry, 第2版, pp.71-92,(1975) Worth Publi
shers, New York)。標準的な１文字の記号と標準的な３文字の記号の間の対応は
、当業者にはよく知られており、ここに記述しておく：Ａ＝Ａｌａ；Ｃ＝Ｃｙｓ
；Ｄ＝Ａｓｐ；Ｅ＝Ｇｌｕ；Ｆ＝Ｐｈｅ；Ｇ＝Ｇｌｙ；Ｈ＝Ｈｉｓ；Ｉ＝Ｉｌｅ
；Ｋ＝Ｌｙｓ；Ｌ＝Ｌｅｕ；Ｍ＝Ｍｅｔ；Ｎ＝Ａｓｎ；Ｐ＝Ｐｒｏ；Ｑ＝Ｇｌｎ
；Ｒ＝Ａｒｇ；Ｓ＝Ｓｅｒ；Ｔ＝Ｔｈｒ；Ｖ＝Ｖａｌ；Ｗ＝Ｔｒｐ；Ｙ＝Ｔｙｒ
。この用語には、Ｄ-アミノ酸、並びに化学的に修飾されたアミノ酸、例えばア
ミノ酸類似物、ノルロイシン等のタンパク質に通常導入されない自然に生じるア
ミノ酸、及びアミノ酸に特徴的な当該分野において公知の特性を有する化学的に
合成された化合物が含まれる。例えば、天然Ｐｈｅ又はＰｒｏと同じペプチド化
合物の配座制限を許容するフェニルアラニン又はプロリンの類似物又は模倣物が
、アミノ酸の定義に含まれる。このような類似物及び模倣物はここではアミノ酸
の「機能的等価物」と称する。アミノ酸の他の例は、出典を明示してここに取り
込まれるRoberts及びVellaccio The Peptides：Analysis, Synthesis, Biology,
Gross及びMeiehofer, eds., Vol.5 p341, Academic Press, Inc, N.Y. 1983に
列挙されている。
【００１２】 ペプチドリガンドは例えば、標準的な固相合成法により合成され、遺伝子によ
りコードされるアミノ酸に限定されない。遺伝子コードによりコードされない一
般的に遭遇するアミノ酸には、例えば国際公開番号ＷＯ９０／０１９４０に記載
されているもの、例えばＧｌｕ及びＡｓｐについての２-アミノアジピン酸（Ａ
ａｄ）；Ｇｌｕ及びＡｓｐについての２-アミノピメリン酸（Ａｐｍ）；Ｍｅｔ
、Ｌｅｕ、及び他の脂肪族アミノ酸についての２-アミノブチル酸（Ａｂｕ）；
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、及び他の脂肪族アミノ酸についての２-アミノヘプタン酸（Ａ
ｈｅ）；Ｇｌｙについての２-アミノイソブチル酸（Ａｉｂ）；Ｖａｌ、及びＬ
ｅｕ及びＩｌｅについてのシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；Ａｒｇ及びＬｙ
ｓについてのホモアルギニン（Ｈａｒ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓについての
２,３-ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及びＡｌａについての
Ｎ-エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及びＡｌａについてのＮ-エ
チルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ａｓｎ、及びＧｌｎについてのＮ-エチルアスパ
ラギン（ＥｔＡｓｎ）；Ｌｙｓについてのヒドロキシルリジン（Ｈｙｌ）；Ｌｙ
ｓについてのアロヒドロキシルリジン（ＡＨｙｌ）；Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、及びＴｈ
ｒについての３-(及び４)-ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ）；Ｉｌｅ
、Ｌｅｕ、及びＶａｌについてのアロ-イソロイシン（ＡＩｌｅ）；Ａｌａにつ
いてのｐ-アミジノフェニルアラニン；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、及びＡｌａについての
Ｎ-メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ、サルコシン）；ＩｌｅについてのＮ-メチルイ
ソロイシイン（ＭｅＩｌｅ）；Ｍｅｔ及び他の脂肪族アミノ酸についてのノルバ
リン（Ｎｖａ）；Ｍｅｔ及び他の脂肪族アミノ酸についてのノルロイシン（Ｎｌ
ｅ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓについてのオルニチン（Ｏｒｎ）；Ｔｈｒ、Ａ
ｓｎ及びＧｌｎについてのシトルリン（Ｃｉｔ）及びメチオニンスルホキシド（
ＭＳＯ）；Ｐｈｅについてのメチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、トリメチ
ルフェニルアラニン、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩ）フェニルアラニン、トリ
フルオリルフェニルアラニンが含まれる。 本発明の文脈におけるペプチドリガンドは「設計」されうる、つまりそれらは
非天然の又は非天然的に生じたペプチドリガンドである。「非天然の」又は「非
天然的に生じた」とは、特定のペプチドリガンドのアミノ酸配列が天然に見出さ
れないことを意味する。つまり、非天然の又は非天然的に生じたペプチドリガン
ドのアミノ酸配列は、天然発生タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列と
一致しない。この多様なペプチドリガンドは、当業者によく知られている種々の
技術を使用して作成又は選択されうる。例えば、拘束されている又は拘束されて
いないペプチドライブラリが無作為に作製され、該分野の標準的な技術、例えば
Lowmanら, (1998) Biochemistry 37：8870-8878を利用してファージにディスプ
レイする。
【００１３】 本発明の文脈で使用される際のペプチドリガンドは、治療又は診断用の物質に
「コンジュゲート」されうる。「コンジュゲート」という用語は、広義に使用さ
れ、当該分野で既知の結合又は接合の全ての方法を包含する。例えば、典型的な
実施態様では、治療又は診断用の物質はタンパク質であり（ここで「タンパク質
性治療剤」と称される）、ペプチドリガンドはタンパク質性治療剤のＣ又はＮ末
端のアミノ酸伸長部分をなすであろう。さらに、タンパク質性治療剤とペプチド
リガンドの間には短いアミノ酸リンカー配列を置いてもよい。このシナリオにお
いて、ペプチドリガンド、任意のリンカー及びタンパク質性治療剤をタンパク質
性治療剤をコードする配列を含む核酸によってコードしていてもよく、場合によ
っては以下に記載する短いポリペプチドをコードする任意のリンカー配列、及び
ペプチドリガンドをコードする配列に（ＤＮＡ配列が近接、又は読み枠にあると
いう意味で）連結している。この典型的なシナリオにおいて、ペプチドリガンド
はタンパク質性治療剤に場合によってはリンカー配列を介して「コンジュゲート
され」ると考えられる。関連した実施態様では、ペプチドリガンドアミノ酸配列
は、当然ペプチドリガンドアミノ酸配列の挿入によってタンパク質性治療剤の機
能を妨げないで提供されるように、タンパク質性治療剤アミノ酸配列の部分に組
み込まれ、又は置換される。この実施態様において、「コンジュゲート」はペプ
チドリガンドをコードする配列に介入され、作用可能に連結されるタンパク質性
治療剤をコードする配列を含む核酸によりコードされうる。更なる典型的な実施
態様では、ペプチドは、タンパク質性治療剤又は他の治療剤に、場合によっては
ペプチドはリンカー配列を介して例えば化学的にコンジュゲートすること等によ
り連結されうる。典型的には、この実施態様においてペプチドリガンドは、アミ
ノ酸の側鎖を介して治療剤の活性を妨げないタンパク質性治療剤の中のどこかで
タンパク質性治療剤に連結されうる。繰り返すと、ペプチドは治療剤に「コンジ
ュゲート」されると考えられる。
【００１４】 本発明の中で使用される「標的分子」という用語は、タンパク質、ペプチド、
糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖、核酸等を含む。標的分
子は、例えば、これに限らないが、血清アルブミン、免疫グロブリン、アポリポ
タンパク質又はトランスフェリン等の血漿タンパク質を含む様々な血清因子等の
細胞外分子、又は赤血球又はリンパ球の表面に見られるタンパク質を含み、当然
、細胞表面タンパク質へのペプチドリガンドの結合は細胞の通常機能を実質的に
妨げないように提供される。 「抗体」及び「免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの
同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパ
ク質である。 抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片又は領域と呼ばれる２つの同一の抗原
結合断片を生成し、各々が単一の抗原結合部位と残りの「Ｆｃ」断片又は領域を
持つ。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、ヒトＩ
ｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０の位置のアミノ酸残基
からカルボキシ末端まで伸展すると定義される。 ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、さらに抗原を架橋させ得る
Ｆ(ａｂ')２断片が得られる。Ｆａｂ’断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第
１定常ドメイン(ＣＨ１)を含む。 「治療」とは、治療的処置及び予防又は抑制手段の両方を指す。治療の必要が
あるものには、既に羅患しているもの、並びに疾患が予防されるべきものが含ま
れる。 治療の目的とされる「哺乳動物」とは、ヒト、家庭及び農場用動物、及び動物
園、スポーツ又はペット用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む、哺乳
動物に分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは哺乳動物はヒトである。 「疾患」は本発明のペプチドリガンドを含有する組成物で治療することで恩恵
を得るあらゆる症状のことである。これには、問題の疾患に哺乳動物を罹患させ
る素因になる病理状態を含む、慢性及び急性の疾患又は病気が含まれる。
【００１５】 「消失半減期」は通常の意味で使用され、Goodman and Gillman's The Pharma
ceutical Basis of Therapeutics 21-25 (Alfred Goodman Gilman, Louis S. Go
odman, and Alfred Gilman, eds., 6th ed. 1980)に記載されている。概略して
言うと、この用語は薬剤消失の時間的経過の量的な測定を包含して意味する。通
常、薬剤濃度は消失過程飽和に要求される値には至らないので、多くの薬剤の消
失は指数関数的である（つまり一次速度式に従う）。指数関数過程の度合は、時
間の単位あたりの機能変化を表すその速度定数ｋにより、又はその半減期ｔ１／ ２ 、過程の完了度が５０％になるのに必要とされる時間によって表される。これ
らの２つの定数の単位はそれぞれ時間−１と時間である。一次速度定数及び反応
の半減期は単純な関係（ｋｘｔ１／２＝０．６９３）であり、適宜交換すること
ができる。一次消失速度は一定割合の薬剤を単位時間あたりに失うことを示すの
で、時間に対する薬剤濃度の対数のプロットは初期分散相（つまり薬剤の吸収と
分散が完了した後）から全ての時間で直線となる。薬剤消失の半減期はグラフ等
から正確に決定することができる。
【００１６】 「形質移入」とはあらゆるコード配列が実際に発現されるかされないにかから
わず、宿主細胞によって発現ベクターが取り込まれることを意味する。数多くの
形質移入法が当業者に知られており、例えばＣａＰＯ４沈殿及びエレクトロポレ
ーションである。成功裏の形質移入はこのベクターの作用の任意の指標が宿主細
胞内で生じる場合に一般に認められる。 「形質転換」は、生物にＤＮＡを導入し、染色体外成分として又は染色体組み
込みとして、ＤＮＡが複製されることを意味する。使用される宿主細胞によって
、形質転換は、該細胞に適した基本的な技術を用いて成される。Sambrook等のMo
lecular Cloning (第２版), Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1989）の１
．８２章に記載されているような塩化カルシウムを使用したカルシウム処理は、
一般に頑丈な細胞壁バリヤーを含む原核生物又は他の細胞で使用される。Shaw等
, (1983)Gene, 23: 315及び１９８９年６月２９日に公開のＷＯ ８９／０５８５
９に記載のように、アグロバクテリウム ツメファシエンスでの感染はある植物
細胞の形質転換に用いられる。そのような細胞壁を持たない哺乳動物細胞にとっ
ては、上掲のSambrook等,の１６．３０−１６．３７章に記載のリン酸カルシウ
ム析出法が好ましい。哺乳動物細胞ホストシステム形質転換の一般的な形態は、
Axelにより、１９８３年８月１６日発行の米国特許第4,399,216号に記載されて
いる。酵母の形質転換は、典型的にはVan Solingen等, (1977)J. Bact., 130:94
6及びHsiao等, (1979)Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76:3829の方法により実施
される。しかしながら、核酸移入、エレクトロポレーション、又はプロトプラス
ト融合によるような細胞にＤＮＡを導入する他の方法もまた使用することができ
る。
【００１７】 ここで使用されるように、「肺投与」という用語は、吸入により肺を通しての
本発明の製品の投与を意味する。ここで使用されるように、「吸入」という用語
は、肺胞への気体の吸気を意味する。特定の実施態様では、取り込みは、本発明
の製品の自己投与により、又は、例えばレスピレータを使用する患者に対しての
レスピレータを介しての投与により生じうる。本発明の製品に関して使用される
「吸入」という用語は、「肺投与」と同義である。 ここで使用される場合、「非経口」なる用語は、腸以外によって、特に静脈内
(i.v.)、動脈内(i.a.)、腹膜内(i.p.)、筋肉内(i.m.)、心室内、及び皮下(s.c.)
経路で本発明の化合物を導入することを意味する。 ここで使用されるように、「エアロゾル」という用語は、気体のサスペンショ
ンを意味する。特に、エアロゾルは、本発明の製品の粒子化及び気体へのそのサ
スペンションに関する。本発明によれば、エアロゾル製品は、エアロゾル化に適
した本発明の化合物、例えば吸入又は肺投与のための粒子化及び気体へのサスペ
ンションを含む製品である。
【００１８】 ＩＩ．本発明の実施の方法 Ａ．ペプチドリガンド 本発明の文脈中でのペプチドリガンドは、標的、好ましくは血清アルブミン又
は免疫グロブリン等の血清タンパク質に結合し、直接結合アッセイで、又は標的
結合についての標的に対する既知のリガンドとの競合能力によって同定すること
ができる。血清アルブミンと結合する好ましいペプチドリガンドは、直鎖状又は
環状のペプチド、好ましくは次の式を含む環状の化合物を含むか、又は次の式の
ペプチドを有する特定哺乳動物種の血清アルブミン結合に競合するペプチドであ
る： (Xaa)x-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-(Xaa)z (Xaa)x-Phe-Cys-Xaa-Asp-Trp-Pro-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Cys-(Xaa)z (配列番号：
113) (Xaa)x-Val-Cys-Tyr-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Cys-Phe-(Xaa)z (配列番号：114) (Xaa)x-Cys-Tyr-Xaa1-Pro-Gly-Xaa-Cys-(Xaa)z (配列番号：115) 及び(Xaa)x-Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-(Xaa)z (配列番号
：116) 上記の一般式のペプチド化合物であることが好ましく、ここでXaaはアミノ酸
であり、x及びzは０（ゼロ）以上の全ての数、一般的には１００未満、好ましく
は１０未満、より好ましくは０、１、２、３、４又は５、より好ましくは４又は
５であり、Xaa1はIle、Phe、Tyr及びValからなる群から選択される。 血清アルブミンに結合する更に好ましいペプチドリガンドはここで記載される
ように次の一般式 (Xaa)x-Trp-Cys-Asp-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Ala-Xaa-Asp-Leu-Cys-
(Xaa)z (配列番号：117)及び (Xaa)x-Asp-Leu-Val-Xaa-Leu-Gly-Leu-Glu-Cys-Trp-(Xaa)z (配列番号：118)
（ここでXaaがアミノ酸であり、x及びzがゼロ以上の全ての数、一般的には１０
０未満、好ましくは１０未満、より好ましくは０、１、２、３、４又は５、より
好ましくは４又は５である）に関して同定される。
【００１９】 本明細書のこの態様に従って、図、及び特に哺乳動物の血清アルブミンに結合
するペプチドリガンド選択に適当なアミノ酸、及び例示されるペプチドについて
はＦｉｇ．５Ａ及び５Ｂ、８Ａ、８Ｂ及び８Ｃ及びＦｉｇ．９を作成した。好ま
しい態様では、数種の血清アルブミンにわたって結合するペプチドリガンドの選
択についてはＦｉｇ．９に具体例を示した。 本発明のこの態様に従う好ましい化合物は次のものを含む： Asp-Leu-Cys-Leu-Arg-Asp-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp (配列番号：119) Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp (配列番号：120) Met-Glu-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-Glu-Asp (配列番号：1 21 ) Gln-Arg-Leu-Met-Glu-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-Glu-Asp-
Asp-Phe (配列番号：122) Gln-Gly-Leu-Ile-Gly-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-Gly-Asp-
Ser-Val (配列番号：123) Gln-Gly-Leu-Ile-Gly-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-Gly-Asp-
Ser-Val-Lys (配列番号：124) Glu-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-Glu-Asp-Asp (配列番号：1 25 ) Arg-Leu-Met-Glu-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-Glu-Asp-Asp
(配列番号：126) Met-Glu-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-Glu-Asp-Asp (配列番
号：127) Met-Glu-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-Glu-Asp (配列番号：1 21 ) Arg-Leu-Met-Glu-Asp-Ile-Cys-Leu-Ala-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-Gly-Asp-Asp
(配列番号：128) Glu-Val-Arg-Ser-Phe-Cys-Thr-Asp-Trp-Pro-Ala-Glu-Lys-Ser-Cys-Lys-Pro-Leu-
Arg-Gly (配列番号：129) Arg-Ala-Pro-Glu-Ser-Phe-Val-Cys-Tyr-Trp-Glu-Thr-lle-Cys-Phe-Glu-Arg-Ser-
Glu-Gln (配列番号：130) Glu-Met-Cys-Tyr-Phe-Pro-Gly-Ile-Cys-Trp-Met (配列番号：131)
【００２０】 好ましい実施態様では、本発明のペプチドリガンドはＩｇＧ-Ｆｃに結合し、
インビトロアッセイにおいてＩｇＧ-Ｆｃの結合についての、次の一般式を有す
るペプチドリガンドとの競合能力によって同定することができる： Xaai-Cys-Xaaj-Cys-Xaak 、ここで Xaai は欠いている、又は１〜４のアミノ
酸、好ましくは４のアミノ酸のペプチドであり；Xj は好ましい配列 Xaa-Xaa-Xa
a-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Val-Trp (配列番号：9)；又は Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Gly-Glu-Le
u-Val-Trp (配列番号：10)；又は Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Gly-Glu-Leu-Val-Trp (
配列番号：10)を有する９のアミノ酸が好ましく、ここで Xaa1 は Ala, Ser, 又
は Thr；Xaa2 は Trp 又は Tyr；Xaa3 は His, 又は Trp；Xaa4 は Leu 又は Me
t、及び Xaak は欠いている、又は１〜５のアミノ酸、好ましくは５のアミノ酸
であり、環状のペプチド又はその類似物が上記のようなＩｇＧ-Ｆｃに結合する
量的生物活性を保持する限りにおいて選択される。 この化合物群の中で好ましいものは次の配列を含む化合物である： Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa-Xaa-Xa
a-Xaa-Xaa (配列番号：11)； Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa-Xaa-Xa
a-Xaa-Xaa(配列番号：12)； Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xa
a9-XaalO-Xaa11-Xaal2-Xaal3 (配列番号：13)、ここで Xaa5 は Ala, Ser, 又は
Thr；Xaa6 は Trp 又は Tyr；Xaa7 は His, 又は Trp；及び Xaa8 は Leu 又は
Met；及び Xaal-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xa
a9-Xaal0-Xaa11-Xaal2-Xaa13 (配列番号：14)、ここで Xaa4 は Ser, Arg, 又は
Asp；Xaa5 は Ala, Ser, 又は Thr；Xaa6 は Trp, Tyr；Xaa7 は His, 又は Tr
p；Xaa8 は Leu 又は Met；及び Xaa9 は Glu, Ser, Thr 又は Valである。好ま
しい実施態様では、本発明のＩｇＧ-Ｆｃ結合ペプチドリガンドは、ここで示さ
れる配列番号：2−配列番号：3、配列番号：8；及び配列番号：11−配列番号：1
11に示されるあらゆるペプチドリガンドと競合し、好ましくはＩｇＧ-Ｆｃに結
合する配列番号：9と競合しうる。
【００２１】 他の好ましい実施態様では、本発明のペプチドリガンドはヒト血清アルブミン
に結合し、インビトロアッセイにおけるヒト血清アルブミンの結合についての、
次の一般式を有するペプチドリガンドとの競合能力によって同定することができ
る： (Xaa)x-Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp-(Xaa)z (配列番号：1 16) (Xaa)x-Phe-Cys-Xaa-Asp-Trp-Pro-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Cys-(Xaa)z (配列番号：1 13) (Xaa)x-Val-Cys-Tyr-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Cys-Phe-(Xaa)z (配列番号：114)又は (Xaa)x-Cys-Tyr-Xaa1-Pro-Gly-Xaa-Cys-(Xaa)z (配列番号：115) ここで Xaa はアミノ酸、ｘ及びｚは好ましくは４又は５であり、Xaa1はIle、Ph
e、Tyr及びValからなる群から選択される。 好ましい実施態様では、本発明のヒト血清アルブミン結合ペプチドリガンドは
ここで前記される配列番号：120−131に示されるあらゆるペプチドリガンドと競
合し、好ましくはヒト血清アルブミン結合について配列番号：122と競合しうる
。
【００２２】 以上から理解されるように、「競合する」及び「競合能力」という用語は相対
的な用語である。よって、本発明のペプチドリガンドを記述するために用いられ
る際のこの用語は、ここで記載したような標準的な競合アッセイにおいて、５０
μＭで存在する場合、好ましくは１μＭ、より好ましくは１００μＭで存在する
場合、好ましくは１ｎＭ以下で存在する場合の、例えば配列番号：8又は配列番
号：122の結合の５０％を阻害するペプチドリガンドを意味する。このようなペ
プチドリガンドは、一般的に実施例の章に記載するような標準的な競合アッセイ
で測定されるように約１μＭ未満、好ましくは約１００ｎＭ未満、より好ましく
は約１０ｎＭ未満の親和性でＩｇＧ-Ｆｃに結合する。しかしながら、血清タン
パク質、例えば血清アルブミン又はＩｇＧ-Ｆｃに対して約１ｎＭ未満、好まし
くは約１ｐＭ〜１ｎＭの親和性を有するペプチドリガンドも同様に本発明の文脈
におけるペプチドリガンドに適している。 ペプチド又は他の化合物がここで記載したようなＩｇＧ-Ｆｃ（又は他の血漿
タンパク質、例えば血清アルブミン）への結合についてペプチドリガンドと競合
する「能力」を有するかを決定するインビトロアッセイシステムについて、当業
者であれば多数の標準的な競合アッセイの任意のものを使用することができる。
競合結合アッセイは、限定された量のリガンドに結合する試験試料検体と競合す
る、標識した標準物の能力に依存する。試験試料の検体の量は、リガンドに結合
することになる標準物の量に反比例する。 よって、当業者は、限定するものではないが、数例を挙げると、放射免疫測定
（ＲＩＡ）、酵素免疫測定（ＥＩＡ）、好ましくは酵素結合免疫測定（ＥＬＩＳ
Ａ）、「サンドウィッチ」免疫測定、免疫放射定量測定、蛍光免疫測定、及び免
疫電気泳動測定等の技術を用いる競合アッセイシステムを含む手段を用いて、ペ
プチド又は他の化合物がＩｇＧ-Ｆｃ（又は血漿タンパク質等の他の標的）に結
合するペプチドリガンドと競合する能力を有するかを決定してもよい。
【００２３】 これらの目的のために、選択されたペプチドリガンドは検出可能成分で標識さ
れ（検出可能煮標識したペプチドリガンドを、ここで「トレーサー」と呼ぶ）、
ＩｇＧ-Ｆｃドメイン又は他の標的の結合について候補化合物との競合アッセイ
に使用される。多くの検出可能な標識が使用可能であり、好ましくは次の範疇に
グループ分けできる： （ａ）放射性同位体、例えば、３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ
等。ペプチド化合物は、例えばColigen等, 編, Current Protocols in Immunolo
gy, Volumes 1 and 2 (1991), Wiley-Interscience, New York, N. Yに記載され
た技術を用いて放射性同位体で標識され、放射活性はシンチレーションカウンテ
ィングにより測定できる。 （ｂ）蛍光標識、例えば希土類キレート（ユーロピウムキレート）又はフルオ
レセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、リサミン(lis
samine)、フィコエリトリン及びテキサスレッド等が使用できる。蛍光標識は、
例えば上掲のCurrent Protocols in Immunologyに開示された技術を用いてペプ
チド化合物にコンジュゲートさせることができる。蛍光は、蛍光光度計を用いて
定量化できる。 （ｃ）種々の酵素−基質標識が利用でき、米国特許第4,275,149号は、それら
の幾つかの概説を提供している。酵素は好ましくは種々の技術を用いて測定可能
な色素原基質の化学変換を触媒する。例えば、酵素は基質における色変化を触媒
し、それは分光学的に測定可能である。あるいは、酵素は基質の蛍光又は化学発
光を変化させることもある。蛍光変化を定量化する技術は上述している。化学発
光基質は化学反応によって電子的に励起され、次いで（例えば化学発光計を用い
て）測定可能な光を放出する、または蛍光受容体にエネルギーを供与しうる。酵
素標識の例は、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフ
ェラーゼ；米国特許第4,737,456号）、ルシフェリン、２，３-ジヒドロフタラジ
ンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、セイヨウワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラク
トシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソザイム、糖類オキシダーゼ（例えば、グル
コースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-６-ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼ）、ヘテロ環オキシダーゼ（ウリカーゼ及びキサンチンオ
キシダーゼ等）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等を含む。
【００２４】 酵素−基質の組み合わせの例は、例えば以下を含む： (i)セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と基質としての過酸化水素、
過酸化水素が染料前駆物質（例えば、ＡＢＴＳ、オルトフェニレンジアミン（Ｏ
ＰＤ）又は３,３',５,５'-テトラメチルベンジジンヒドロクロリド（ＴＭＢ））
を酸化する； (ii)アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と色素原基質としてのパラ-ニトロフェ
ニルホスフェート；及び (iii)β-Ｄ-ガラクトシダーゼ（β-Ｄ-Ｇａｌ）と色素原基質（例えば、ｐ-ニ
トロフェニル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ）又は蛍光原基質４-メチルウンベリフェ
リル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ。
【００２５】 特定のアッセイによれば、トレーサーは固定化された標的とともに、種々の濃
度の非標識候補化合物の存在下でインキュベートされる。有効候補化合物の濃度
を増加させると、トレーサーの固定化標的への結合と効果的に競合する。最大の
結合トレーサーの５０％の非標識候補化合物の濃度が「ＩＣ５０」と呼ばれ、候
補化合物のＩｇＧ結合親和性を反映する。従って、１ｍＭのＩＣ５０を持つ候補
化合物は、1μＭのＩＣ５０を持つ候補ペプチドよりも標的と実質的に弱い相互
作用を示す。 いくつかのファージディスプレイＥＬＩＳＡアッセイでは、変異した（「ｍｕ
ｔ」）配列の結合親和性は、B.C. Cunningham, D.G. Lowe, B. Li, B.D. Bennet
t, and J.A. Wells, EMBO J. 13:2508 (1994)に記載される方法を用いてコント
ロール（「ｃｏｎ」）ペプチドに対して比較され、パラメータＥＣ５０により特
徴づけられる。アッセイは、ＥＣ５０(con)/ＥＣ５０(mut)がＫｄ(con)/Ｋｄ(mu
t)に近い条件下で実施された。 従って、本発明は、記載したインビトロアッセイにおいてＩｇＧ又はヒト血清
アルブミン等の標的分子結合について「競合する能力を有する」化合物を提供す
る。好ましくは、化合物はＩｇＧ又はヒト血清アルブミン等の標的に対して1μ
Ｍ未満のＩＣ５０を持つ。これらの化合物の中で好ましいのは、約１００ｎＭ未
満、好ましくは約１０ｎＭ未満、又は約１ｎＭ未満のＩＣ５０を持つ化合物であ
る。本発明のこの態様で更に好ましい実施態様では、化合物はＩｇＧ又はヒト血
清アルブミン等の標的分子に対して約１００ｐＭ未満、より好ましくは約１０ｐ
Ｍ未満のＩＣ５０を示す。 ここで記載されるペプチドリガンドと競合する候補化合物の能力を決定するた
めの好ましいインビトロアッセイは次のもので、実施例により十分に記載する。
好ましい実施態様では、候補化合物はペプチドである。ＩｇＧ又はヒト血清アル
ブミンに結合する標識したペプチドリガンドトレーサーと競合する候補化合物の
能力はＥＬＩＳＡを用いて測定される。候補化合物のバッファー希釈物をＩｇＧ
又はヒト血清アルブミンで被覆したマイクロタイタープレートに添加して（実施
例の章に記載されているように）トレーサーと共に１時間おく。マイクロタイタ
ープレートを洗浄バッファーで洗浄し、ＩｇＧ又はヒト血清アルブミンと結合し
たトレーサーの量を測定する。
【００２６】 Ｂ．ペプチドリガンド組み合わせ 本発明によれば、ペプチドリガンドはペプチドリガンドドメインと活性ドメイ
ンを含むハイブリッド分子を形成する生理活性化合物に連結していてもよい。本
発明の生理活性化合物は治療又は診断用の薬剤として利用できるあらゆる化合物
を含む。生理活性化合物の非限定的な例としては、酵素、ホルモン、サイトカイ
ン、抗体又は抗体断片等のポリペプチド、並びに鎮痛薬、解熱剤、抗炎症剤、抗
生物質、抗ウィルス剤、抗真菌剤、心血管作動薬、腎機能及び電解質代謝に効果
のある薬剤、中枢神経系に作用する薬剤、化学療法剤等の有機化合物が含まれる
。本発明によれば、ペプチドリガンドドメインは活性ドメインに場合によっては
可動性のリンカードメインを介して結合する。 本発明のハイブリッド分子は適切なペプチドリガンドと活性ドメインを組み合
わせることにより構築される。結合のタイプ及びその作成方法によれば、そのＮ
又はＣ末端を介してペプチドリガンドドメインは活性ドメインのＮ又はＣ末端に
加えられうる。例えば、組換え技術により本発明のハイブリッド分子を調製する
場合、場合によってはリンカードメインを介して、ペプチドリガンドをコード化
する核酸は活性ドメイン配列をコード化する核酸に作用可能に結合される。典型
的には、構築物は、ペプチドリガンドのＣ末端が活性ドメインのＮ末端に結合さ
れている融合タンパク質をコードしている。しかしながら、特に合成技術が使用
される場合、例えばペプチドリガンドのＮ末端が活性ドメインのＮ又はＣ末端に
結合されている融合体もまた可能である。
【００２７】 ある場合には、ペプチドリガンドドメインは、活性ドメインにそのＮ又はＣ末
端で結合するというよりもむしろ、活性ドメイン分子中に挿入されうる。この構
造はペプチドリガンドドメイン及び活性ドメインの機能を保持する限りにおいて
本発明を実施するのに使用できる。例えば、ペプチドリガンドは、免疫グロブリ
ンのその標的に結合する能力を妨げることなく免疫グロブリンの非結合軽鎖ＣＤ
Ｒに挿入されてもよい。ペプチドリガンドドメインに適合できる活性ドメイン分
子の領域は実験的に（つまり、挿入部位の選択、無作為化、及び生じたコンジュ
ゲートの活性ドメインの機能のアッセイにより）同定してもよく、又は関係する
活性ドメイン分子（例えばタンパク質である活性ドメイン）のファミリーの間の
配列比較によって低い配列相同性の領域があることを同定してもよい。低配列相
同性領域は、高度に保存された領域であるというよりもペプチドリガンドドメイ
ンの挿入を許容すると思われる。３次元構造が（例えば、Ｘ線結晶解析又はＮＭ
Ｒ研究により）分かっている活性ドメイン分子について、３次元構造はペプチド
リガンド挿入部位への誘導を与えうる。例えば、高い変動性（例えば、大きい温
度因子又は「Ｂ」因子）を有するループ又は領域は、高度に規則的な構造領域、
あるいはリガンド結合又は触媒作用に関する領域であるというよりもペプチドリ
ガンドドメイン挿入に順応すると思われる。
【００２８】 Ｃ．リンカードメイン 本発明に従うと、ペプチドリガンドドメインは、ペプチドリガンドドメインは
リンカーを介して活性ドメインに結合されてもよい。本発明のハイブリッド分子
のリンカー成分はハイブリッド分子の機能に必ずしも関与しないが寄与しうる。
従って、本発明では、リンカードメインは、活性ドメインとペプチドリガンドド
メインの間に空間的ブリッジを提供する任意の分子群である。 リンカードメインは変化できる長さ及び構成とできるが、本発明によれば、重
要なのはリンカードメインの長さその構造ではない。リンカードメインは、好ま
しくは、標的分子に対する立体的及び／又は高次構造的制約を実質的に生じない
で、ハイブリッド分子のペプチドリガンドドメインを結合させる。従って、リン
カードメインの長さは、ハイブリッド分子の２つの「機能」ドメイン、つまりペ
プチドリガンドと活性ドメインの性質に依存する。 当業者であれば、原子の様々な組み合わせが様々な結合間の既知の距離に基づ
いて可変長の分子を提供することが分かるであろう（Morrison及びBoyd, Organi
c Chemistry, 3版, Allyn及びBacon, Inc., Boston, MA (1977)）。例えば、リ
ンカードメインは可変長のポリペプチドでありうる。ポリペプチドのアミノ酸組
成がリンカーの性質と長さを決定する。好ましい実施態様において、リンカー分
子は柔軟な親水性ポリペプチド鎖を有する。具体的には、例えばここでの実施例
の章に記載されるもののようにリンカードメインは一又は複数のＧｌｙ及び又は
Ｓｅｒ残基を有する。
【００２９】 Ｄ．組換え合成 本発明は、ここに記載されるようなペプチドリガンド、又はペプチドリガンド
ドメインとポリペプチド活性ドメインを有するハイブリッド分子をコードする単
離された核酸、好ましくはＤＮＡを含む物質の組成物を包含する。本発明のペプ
チドをコードするＤＮＡは当該分野で知られている様々な方法によって調製する
ことができる。これらの方法は、限定されるものではないが、出典明示により開
示の全体がここに取り込まれるEngels等, (1989), Agnew. Chem. Int. Ed. Engl
., 28:716-734に記載された任意の方法、例えばトリエステル、亜リン酸、ホス
ホラミダイト及びＨ-ホスホネート法による化学合成を含む。一実施態様では、
発現宿主細胞により好まれるコドンはコード化ＤＮＡの設計に使用される。ある
いは、ペプチドをコードしているＤＮＡを、組換えＤＮＡ法、例えば部位特異的
突然変異誘発（Kunkel等, (1991) Methods Enzymol., 204:125-139; Carter等,
(1986） Nucl. Acids Res. 13:4331; Zoller等, (1982) Nucl. Acids Res. 10:6
487）、カセット突然変異誘発（Wells等, (1985) Gene 34:315）、制限選択突然
変異誘発（Carter, Directed Mutagenesis: A Practical Approach (M. J. McPh
erson, ed.) IRL Press, Oxford, 1991）等々を使用して一又は複数の変異体を
コードするように変更させることができる。 上記したような好ましい態様では、核酸は標的分子に結合する能力のあるペプ
チドリガンドをコードする。標的分子は、例えば、細胞外分子、例えばこれに限
らないが血清アルブミン、免疫グロブリン、アポリポタンパク質又はトランスフ
ェリン等の血漿タンパク質を含む様々な血清因子、又は赤血球又はリンパ球の表
面に見られるタンパク質を含み、当然、細胞の通常の機能を実質的に妨げない細
胞表面タンパク質へのペプチドリガンドの結合を提供する。
【００３０】 本発明の他の好ましい態様では、核酸はペプチドリガンドドメイン配列及び活
性ドメインを含むハイブリッド分子をコードする。本発明のこの態様において、
活性ドメインは治療又は診断用の薬剤として利用できるあらゆるポリペプチド化
合物、例えば、酵素、ホルモン、サイトカイン、抗体又は抗体断片を含みうる。
本発明のこの態様における核酸分子はハイブリッド分子をコードし、ペプチドリ
ガンドドメイン配列をコードする核酸は生物活性剤をコードする核酸に（ＤＮＡ
配列が近接している又は読み枠にあるという意味で）連結していてもよい。場合
によっては、ＤＮＡ配列はリンカードメインアミノ酸配列をコードする核酸配列
によって連結されうる。 この態様において、本発明は更に、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ分子
に作用可能に結合した発現コントロール配列、ベクターで形質転換した宿主細胞
によりコントロール配列が認識されるＤＮＡ分子を含むプラスミド等の発現ベク
ターを含む。一般的には、プラスミドベクターは宿主細胞と適合性がある種から
取り出された複製及びコントロール配列を含む。ベクターは通常、複製部位並び
に形質転換細胞において表現型の選択を提供することができるタンパク質をコー
ドする配列を有する。
【００３１】 原核生物宿主中での発現に対しては、好適なベクターにはｐＢＲ３２２（ＡＴ
ＣＣ第３７０１７）、ｐｈＧＨ１０７（ＡＴＣＣ第４００１１）、ｐＢＯ４７５
、ｐＳ０１３２、ｐＲＩＴ５、ｐＲＩＴ２０又はｐＲＩＴ３０シリーズの任意の
ベクター（Nilsson及びAbrahmsen (1990), Meth. Enzymol., 185:144-161）、ｐ
ＲＩＴ２Ｔ、ｐＫＫ２３３-２、ｐＤＲ５４０及びｐＰＬ-ラムダが含まれる。本
発明の発現ベクターを含む原核生物宿主細胞には、大腸菌Ｋ１２株２９４(ＡＴ
ＣＣ第３１４４６)、大腸菌株ＪＭ１０１（Messing等, (1981) Nucl. Acid Res.
, 9:309）、大腸菌株Ｂ、大腸菌χ１７７６(ＡＴＣＣ第３１５３７)、大腸菌ｃ
６００、大腸菌Ｗ３１１０(Ｆ-、ガンマ-、原栄養菌株、ＡＴＣＣ第２７３２５)
、大腸菌株２７Ｃ７（Ｗ３１１０、ｔｏｎＡ、ｐｈｏＡ、Ｅ１５、（ａｒｇＦ-
ｌａｃ）１６９、ｐｔｒ３、ｄｅｇＰ４１、ｏｍｐＴ、ｋａｎｒ）（米国特許第
5,288,931号、ＡＴＣＣ第５５２４４）、枯草菌、サルモネラ菌、セラチア・マ
ルセッセンス、及びシュードモナス種が含まれる。 原核生物に加えて、真核生物体、例えば酵母菌、あるいは多細胞生物体由来の
細胞を宿主細胞として使用することができる。一般的なパン酵母又はサッカロミ
セス・セレヴィシアのような酵母宿主細胞中での発現に対しては、好適なベクタ
ーには、２ミクロンプラスミドに基づくエピソーム的に複製するベクター、組込
み型ベクター、及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターが含まれる。ＳＦ９細胞
のような昆虫宿主細胞での発現に対しては、好適なベクターにはバキュロウイル
スベクターが含まれる。植物宿主細胞、特にタバコのような双子葉植物宿主にお
ける発現に対しては、好適な発現ベクターにはアグロバクテリウムツメファシエ
ンスのＴｉプラスミドに由来するベクターが含まれる。
【００３２】 有用な哺乳動物宿主細胞の例には、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓
ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖の
ためにサブクローン化された293細胞、Graham等 (1997), J. Gen Virol., 36:59
）；ハムスター乳児腎細胞(BHK, ATCC CCL 10)；チャイニーズハムスター卵巣細
胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
77:4216)；マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather (1980), Biol. Reprod., 23:24
3-251）；サルの腎細胞 (CV1 ATCC CCL 70)；アフリカミドリザルの腎細胞(VERO
-76, ATCC CRL-1587)；ヒト子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL 2)； イヌ腎細胞 (M
DCK, ATCC CCL 34)；バッファローラット肝細胞 (BRL 3A, ATCC CRL 1442)；ヒ
ト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75)；ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065)；マウス***腫
瘍(MMT 060562, ATTC CCL51)；ＴＲＩ細胞（Mother等 (1982), Annals N.Y. Aca
d. Sci. 383:44-68）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌細胞株(Ｈｅｐ
Ｇ２)が含まれる。哺乳動物宿主細胞における発現に対しては、有用なベクター
には、ＳＶ４０由来のベクター、サイトメガロウイルス由来のベクター、例えば
ｐＲＫ５及びｐＲＫ７を含むｐＲＫベクター（Suva等 (1987), Science, 237:89
3-896; EP307,247(3/15/89)、EP278,776(8/17/88))、ワクシニアウイルス又は他
のポックスウイルス由来のベクター、及びモロニーのマウス白血病ウイルス（Ｍ
ｏＭＬＶ）由来のベクターのようなレトロウイルスベクターが含まれる。 場合によっては、対象のペプチドをコードしているＤＮＡは宿主細胞によって
培地中への発現産物の分泌を生じさせる分泌リーダー配列に作用可能に結合され
る。分泌リーダー配列の例には、ｓｔＩＩ、エコチン（ecotin）、ｌａｍＢ、ヘ
ルペスＧＤ、ｌｐｐ、アルカリホスファターゼ、インベルターゼ、及びアルファ
因子が含まれる。ここでの使用にまた適しているのはプロテインＡの３６アミノ
酸リーダー配列である（Abrahmsenら, (1985) EMBO J., 4:3901）。
【００３３】 宿主細胞はこの発明の上述の発現又はクローニングベクターで形質移入され、
好ましくは形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所
望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように変性された一般的な培
養液中で培養される。 本ペプチドを作成するのに使用される原核宿主細胞は、一般に上掲のSambrook
ら, に記載されるようにして培養することができる。 本発明のペプチドを作成するのに使用される哺乳動物宿主細胞は、様々な培地
で培養することができる。商業的に入手可能な培地、例えばハム(Ham)のＦ１０(
シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ)、シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダ
ルベッコの改良イーグル培地((DMEM)、シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。
さらに、Ham及びWallace, (1979), Meth. in Enz. 58:44, Barnes及びSato, (1
980), Anal. Biochem. 102:255, 米国特許第4,767,704号；同4,657,866号；同4,
927,762号；又は同4,560,655号；WO 90/03430；WO87/00195；米国特許再発行第3
0,985号；又は米国特許第5,122,469号、文献によりここに取り込まれる全ての開
示に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの
培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トラン
スフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、
マグネシウム、及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(
例えばアデノシン、及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン(商品名
）薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として
定義される)、及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充する
ことができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃
度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ば
れた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかで
あろう。 この開示で引用される宿主細胞は、インビトロ培地の細胞、並びに宿主動物内
にある細胞を包含する。
【００３４】 Ｅ．化学合成 本発明の化合物を生成する他の方法は、化学合成を含む。これは、当業者に知
られた方法論を用いて実施される(Kelly, R.F. & Winkler, M.E. in Genetic En
gineering Principles and Methods, Setlow, J.K, ed., Plenum Press, N.Y.,
Vol. 12, pp 1-19(1990); Stewart, J.M. Young, J.D., Solid Phase Peptide S
ynthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)参照；また米国特許第4,
105,603号; 第3,972,859号; 第3,842,067号; 及び第3,862,925号も参照)。 本発明のペプチド類似物は固相ペプチド合成を用いて便利に作成される。Merr
ifield, (1964)J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 ; Houghten,(1985) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 82: 5132 。固相ペプチド合成はまた、活性ドメインがポリペプ
チドであるか、又はそれを含んでいると、本発明のハイブリッド分子組成物を調
製するのに使用することができる。 固相合成は、保護されたアミノ酸を不活性個体支持体に結合させることにより
推定ペプチドのカルボキシ末端において開始される。不活性な固体支持体は、開
始アミノ酸のＣ末端のアンカーとして働くことのできる任意の高分子であり得る
。典型的には、高分子支持体は、上掲のStewart及びYoungの２及び４ページの図
１-１及び１-２に示されるような架橋高分子樹脂（例えば、ポリアミド又はポリ
スチレン樹脂）である。一実施態様では、Ｃ末端アミノ酸はベンジルエステルを
形成するポリスチレン樹脂と連結している。高分子支持体は、例えば、ペプチド
合成の阻害アミノ酸のαアミノ基を解放するのに使用される条件下でペプチドア
ンカー結合が安定であるものが選択される。塩基不安定α保護基が使用され、次
いでペプチドと固体支持体の間の酸不安定結合を使用するのが好ましい。例えば
、酸不安定エーテル樹脂は、上掲のStewart及びYoungの１６ページに記載される
ような塩基不安定Ｆｍｏｃアミノ酸ペプチド合成に効果的である。あるいは、ペ
プチドアンカー結合及び差別的にアシドリシスに移行するα保護基が使用できる
。例えば、フェニルアセトアミドメチル(Ｐａｍ)樹脂のようなアミノメチル樹脂
は、上掲のStewart及びYoungの１１-１２ページに記載されるようにＢｏｃ-アミ
ノ酸ペプチド合成に関連してうまく働く。
【００３５】 開始アミノ酸が不活性固体支持体に連結した後、開始アミノ酸のαアミノ酸保
護基を例えば塩化メチレンのトリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)で除去し、例えばトリエ
チルアミン(ＴＥＡ)で中和する。開始アミノ酸のαアミノ基の脱保護に続いて、
合成における次のα-アミノ-及び側鎖保護したアミノ酸を添加する。次に残りの
α-アミノ酸、必要ならば側鎖保護されたアミノ酸を縮合により所定の順序で続
けて結合させ、個体支持体に結合した中間体化合物を得る。あるいは、ペプチド
断片を伸長している固相ペプチド鎖に付加する前に、幾つかのアミ酸を互いに結
合させて所望のペプチド断片を形成してもよい。 ２つのアミノ酸、又はアミノ酸とペプチド、又はペプチドとペプチドの間の縮
合反応は、通常の縮合方法、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ（Ｎ,Ｎ'
-ジシクロヘキシルカルボジイミド）又はＤＩＣ（Ｎ,Ｎ'-ジイソプロピルカルボ
ジイミド）法、活性エステル法、ｐ-ニトロフェニルエステル法、ＢＯＰ(ベンゾ
トリアゾール-1-イル-オキシ-トリス[ジメチルアミノ]ホスホニウムヘキサフル
オロホスフェート)法、Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミドエステル法など、及びウッ
ドワード試薬Ｋ法等に従って実施される。
【００３６】 ペプチドの化学合成に共通なのは、アミノ酸の任意の反応性側鎖基を適切な保
護基で保護することである。最終的には、これらの保護基は、所望のポリペプチ
ド鎖が連続的に組み立てられた後に除去される。さらに共通なのは、アミノ酸又
はペプチド断片上のαアミノ基を保護するが、それがアミノ酸又はペプチド断片
のＣ末端カルボキシル基で成長固体支持体ポリペプチド鎖の遊離Ｎ末端のアミノ
酸と反応し、続いてαアミノ酸基を選択的に除去し、次のアミノ酸又はペプチド
断片を固体ペプチド鎖に付加させる。従って、ペプチド合成において一般的には
、中間体化合物が生成され、それはペプチド鎖の所望の配列に局在化した各アミ
ノ酸残基を含み、その個々の残基は側鎖保護基を有することである。これらの保
護基は、実質的に同時に除去され、固相から取り外した後に所望のポリペプチド
生成物が生成される。 α-及びε-アミノ酸側鎖基を、ベンジルオキシカルボニル（省略して、Ｚ）、
イソニコチニルオキシカルボニル（ｉＮＯＣ）、ｏ-クロロベンジルオキシカル
ボニル[Ｚ(２Ｃｌ)]、ｐ-ニトロベンジルオキシカルボニル［Ｚ(ＮＯ２)］、ｐ-
メトキシベンジルオキシカルボニル［Ｚ(ＯＭｅ)］、t-ブトキシカルボニル（Ｂ
ｏｃ）、t-アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）、イソボロニルオキシカルボニル
、アダマンチルオキシカルボニル、２-(４-ビフェニル)-２-プロピル-オキシカ
ルボニル（Ｂｐｏｃ）、９-フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、メ
チルスルホンエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、トリフルオロアセチル、フタリル
、ホルミル、２-ニトロフェニルスルフェニル（ＮＰＳ）、ジフェニルホスフィ
ノチオイル（Ｐｐｔ）、及びジメチロホスフィノチオイル（Ｍｐｔ）基などで保
護できる。 カルボキシ官能基の保護基としては、ベンジルエステル（ＯＢｚｌ）、シクロ
ヘキシルエステル（Ｃｈｘ）、４-ニトロベンジルエステル（ＯＮｂ）、t-ブチ
ルエステル（Ｏｂｕｔ）、４-ピリジルメチルエステル（ＯＰｉｃ）等が例示さ
れる。アミノ及びカルボキシル基以外の官能基を有するアルギニン、システイン
、及びセリンなどの特定のアミノ酸は、適当な保護基で保護するのが望ましいこ
とが多い。例えば、アルギニンのグアニジノ基は、ニトロ、ｐ-トルエンスルホ
ニル、ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、ｐ-メトキ
シベンゼンスルホニル、４-メトキシ-２,６-ジメチルベンゼンスルホニル（Ｎｄ
ｓ）、１,３,５-トリメチルフェニルスルホニル（Ｍｔｓ）等で保護される。シ
ステインのチオール基は、ｐ-メトキシベンジル、トリチルなどで保護されうる
。
【００３７】 前記されるような多くの阻害アミノ酸は、Novabiochem(サンディエゴ,CA)、Ba
chem CA（Terrence, CA)又はPeninsula Labs(ベルモント,CA)のように商業的に
入手できる。 上掲のStewart及びYoungは、ペプチド調製のための方法に関して詳細な情報を
提供する。αアミノ基の保護は１４−１８ページに記載され、側鎖ブロックは１
８−２８ページに記載されている。アミン、ヒドロキシル及びスルフヒドリル官
能基の保護基の表が１４９−１５１ページに提供されている。 所望のアミノ酸配列が完成した後、ペプチドは固体支持体から離され、回収さ
れ、精製されうる。ペプチドは、ペプチド固相結合を崩壊することのできる試薬
により固体支持体から取り除かれ、場合によっては、ペプチドの阻害側鎖官能基
を脱保護する。一実施態様では、ペプチドは、液体フッ化水素酸(ＨＦ)を有する
アシドリシスにより固相から取り外すが、残っている側鎖保護基も取り除く。好
ましくは、ポリペプチド中の残基のアルキル化（例えば、メチオニン、システイ
ン、及びチロシン残基のアルキル化）を回避するために、アシドリシス反応混合
物はチオ-クレゾール及びクレゾール捕捉剤を含む。ＦＨ離脱の後、樹脂はエー
テルで洗浄され、遊離ペプチドは酢酸溶液の連続洗浄で固相から抽出される。混
合した洗浄液は凍結乾燥され、ペプチドが精製される。
【００３８】 Ｆ．ハイブリッドの化学コンジュゲート 本発明の特定の実施態様では、ハイブリッド分子は、治療的又は診断的用途を
有する有機化合物である活性ドメイン、あるいは一本鎖の核酸をコードすること
ができない構造のポリペプチド活性ドメインとペプチドリガンドドメインの融合
体を含みうる。後者の実施態様の例としては、ペプチドリガンドのアミノ末端と
活性ドメインのアミノ末端の融合体、又はペプチドリガンドのカルボキシ末端と
活性ドメインのカルボキシ末端の融合体を含む。 化学コンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ
-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミ
ノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピ
ミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、
アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(
ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、
ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例え
ば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,
５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を用いて、これら実施態様のハイブリ
ッド分子の調製に使用することができる。
【００３９】 Ｇ．ジスルフィド結合ペプチド 前記したように、本発明のいくつかの実施態様では、環化ペプチドリガンドを
含む。ペプチドリガンドはシステイン基の間のジスルフィド結合の形成により環
化されうる。このようなペプチドは前記したような化学合成により作成され、次
いでジスルフィド結合の形成に使用される任意の簡単な方法により環化される。
例えば、ペプチドは、還元した形態のメルカプト基を有する固相合成物から回収
され、薄い溶液に溶解されうるが、分子内システイン濃度は、分子内ジスルフィ
ド結合形態を最適化するための分子内システイン濃度を上回り、例えば２５ｍＭ
から１μＭ、好ましくは５００μＭから１μＭ、より好ましくは２５μＭから１
μＭのペプチド濃度であり、次いで分子内ジスルフィド結合を生成するのに十分
な弱酸化剤、例えば金属陽イオン、フェリシアン化カリウム、テトラチオン酸ナ
トリウム等のような触媒を有する又は有しない分子酸素に遊離メルカプト基をさ
らすことにより酸化される。あるいは、ペプチドはPeltonら, (1986) J. Med. C
hem., 29:2370-2375に記載されるようにして環化することができる。 環化は、例えば第１のＣｙｓと第２のＣｙｓの間のジスルフィド結合又はラク
タム結合の形成により行われる。ジスルフィド結合を形成することのできる残基
は例えばＣｙｓ、Ｐｅｎ、Ｍｐｒ、及びＭｐｐ及びその２-アミノ基含有等価物
を含む。ラクタムブリッジを形成することのできる残基は、例えばＡｓｐ、Ｇｌ
ｕ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、αβ-ジアミノブチル酸、ジアミノ酢酸、アミノ安息香酸
、及びメルカプト安息香酸を含む。ここでの化合物は、例えばＣｙｓのＮ末端ア
ミノ基又は他のアミノ酸に対して共有結合を形成する隣接していない残基の側鎖
基を利用しうるラクタム結合により環化することができる。あるいは、ブリッジ
構築はまた、本発明の化合物を環化するのに使用することができ、例えばペプチ
ド及びペプチド類似物を含み、Ｓ-Ｓ、ＣＨ２-Ｓ、ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２、ラクタム
エステル又は他の結合により環化できる。
【００４０】 Ｈ．医薬組成物 本発明のハイブリッド分子を含有する医薬組成物は、非経口、局所、経口又は
局部的（エアロゾル又は経皮など）又はその任意の組み合わせを含む任意の適切
な形で投与されうる。 本発明の他の適した組成物は、製薬的に許容可能な担体を有する前記組成物の
任意のものを含むが、担体の性質は投与方式によって異なり、例えば経口投与で
は通常固体担体が用いられ、Ｉ.Ｖ.投与では液体塩溶液担体である。 本発明の組成物は、患者及び本発明の組成物のタンパク質に適合する製薬的に
許容可能な成分を含む。これらは一般に懸濁物、溶液及びエリキシル剤、特にリ
ン酸緩衝塩水、生理食塩水、ダルベッコの媒質などの生物学的バッファーを含む
。エアロゾル、又はデンプン、糖、微結晶セルロース、希釈剤、顆粒化剤、潤滑
剤、結合剤、崩壊剤等（経口固体調製物の場合、粉末、カプセル、及び錠剤）の
担体を用いてもよい。 ここで使用する用語「製薬的に許容可能な」とは、一般的に、連邦または州政
府の規制当局に承認されたもの又は米国薬局方又は動物、特にヒトに使用するた
めの他の一般に認められた、薬局方に列挙されているものを意味する。
【００４１】 製剤の選択は、上記のバッファー、又は例えば製薬級のマンニトール、ラクト
ース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウムセルロース
、炭酸マグネシウム、等を含む賦形剤の種々のものを用いてなすことができる。
組成物の「ＰＥＧ化(PEGylation)」は、当該分野で知られた技術を用いて実施し
てもよい（例えば、国際特許公報番号WO92/16555、Enzonの米国特許第5,122,614
号、及び国際特許公報番号WO92/00748を参照）。 本発明の投与の好ましい経路は、エアロゾル又は吸入の形態である。本発明の
化合物は、分散剤と混合され、乾燥粉末のようなエアロゾル形態で、あるいは溶
液又は希釈液での懸濁液として投与することができる。 ここで使用する用語「分散剤」とは、化合物のエアロゾル化又は肺組織でのタ
ンパク質の吸収、又は両方を助ける薬剤を意味する。好ましくは分散剤は製薬的
に許容可能である。適した分散剤は、当該分野にてよく知られ、これに限らない
が界面活性剤等を含む。例えば、液体エアロゾルを形成する溶液の噴霧化によっ
て生じる表面に発生する化合物、特にペプチド化合物の凝集を減少させるために
、当該分野で一般的に使用される界面仮性剤が使用されうる。限定しないが、こ
のような界面活性剤の例は、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル類及びアルコー
ル類、及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等の界面活性剤である
。使用される界面活性剤の量は様々で、一般に製剤の約０．００１重量％から約
４重量％の範囲であろう。特定の様態では、界面活性剤はポリオキシエチレンソ
ルビタンモノオレアート又はソルビタントリオレアートである。適した界面活性
剤は当該分野でよく知られ、特定の処方、化合物の濃度、希釈剤(液体形態の場
合)又は粉末の形態(乾燥粉末の製剤の場合)等による所望の特性をもとに選択す
ることができる。
【００４２】 更に、ペプチドリガンドの選択、所望の治療効果、肺組織の性質(例えば、病
気の又は健康な肺)、及び多くの他の要因によって、液体又は乾燥製剤は更に以
下に記載されるような更なる成分を含むことができる。 一般に液体エアロゾル製剤は、製薬的に許容可能な希釈剤にペプチドリガンド
／活性ドメインハイブリッド及び分散剤を含む。本発明の乾燥粉末エアロゾル製
剤は、ペプチドリガンド／活性ドメインハイブリッド及び分散剤の細かく分離し
た固形からなる。液体又は乾燥粉末エアロゾル製剤のどちらかを用いて、製品は
エアロゾル化されなければならない。つまり、エアロゾル化した投与量が実際に
肺胞に届くようにするために液体又は固体粒子にまで壊さねばならない。一般に
質量中位力学径(mass median dynamic diameter)は、薬の粒子が肺胞に届くため
には５マイクロメーター以下であろう（Wearley, L.L., (1991), Crit. Rev. in
Ther. Drug Carrier Systems 8:333）。「エアロゾル粒子」という用語は、肺
投与に適した、つまり肺胞に届きうる液体又は固体粒子を記載するためにここで
使用される。他の考慮すべきこととしては、例えば送達装置の様式、製剤中の更
なる化合物及び粒子特性が重要である。薬の肺投与のこれらの態様は、当該分野
においてよく知られ、製剤の取り扱い、エアロゾル化方法及び送達装置の様式は
当分野の通常の技術者に最も日常的な実験で必要とされる。
【００４３】 送達装置の様式に関して、当分野で既知のエアロゾル化の任意の形式は、これ
に限らないが、ネブライザー、液体製剤の噴霧化又はポンプエアロゾル化、及び
乾燥粉末製剤のエアロゾル化を含み、本発明の実施に使用することができる。固
体製剤投与の独自に設計した送達装置が示される。しばしば、液体又は乾燥粉末
製剤のエアロゾル化は噴霧剤を必要としうる。噴霧剤は、当分野で一般的に使用
される任意の噴霧剤でよい。特に限定しないが、このように利用できる噴霧剤の
例は、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロカーボン、ヒドロフルオロフルオ
ロカーボン、又はヒドロカーボンであり、トリフルオロメタン、ジクロロジフル
オロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、及び１,１,１,２-テトラフル
オロエタン、又はその組み合わせを含む。 本発明の好ましい態様では、エアロゾル化の装置は、定量吸入器である。定量
吸入器は、投与によって変化する用量ではなくて、投与時に特定の投与量を提供
する。このような定量吸入器は液体又は乾燥粉末エアロゾル製剤のどちらかで使
用されうる。定量吸入器は当分野でよく知られている。 ペプチドリガンド／活性ドメインハイブリッドが肺に到達すると、多くの製剤
依存因子が薬剤吸入に影響を及ぼす。化合物の循環レベルが要求される疾患又は
障害の治療において、エアロゾル粒子サイズ、エアロゾル粒子形態、感染、肺疾
患又は塞栓の有無のような要因が化合物の吸入に影響しうることが理解されるで
あろう。ここに記載される各製剤において、任意のルブリケータ、吸収促進剤、
タンパク質安定剤又は懸濁剤を使用してもよい。これらの更なる薬剤の選択は、
目的により異なる。化合物の局所送達が所望又は探求される場合、吸収促進のよ
うな変化はそれ程重要でないことが理解されるであろう。
【００４４】 Ｉ．液体エアロゾル製剤 本発明の液体エアロゾル製剤は、通常ネブライザーで使用されうる。ネブライ
ザーは圧縮気体吹きつけ又は超音波のどちらかでありうる。当該分野で既知の任
意のネブライザーは、本発明と関連して使用することができ、これに限らないが
：Ultravent、Mallinckrodt社(セントルイス、MO)；アクロンＩＩネブライザー(
Marquest Medical Products、エングルウッドCO)である。本発明と関連して利用
できる他のネブライザーは、1986年11月25日公開の米国特許第4,624,251号；197
2年11月21日公開の同第3,703,173号；1971年2月9日公開の同第3,561,444号及び1
971年1月13日公開の同第4,635,627号に記載されている。 製剤は担体を含みうる。担体は循環系に溶解でき、及び製薬的に許容可能な高
分子であり、ここで製薬的に許容可能とは当該分野での技術者が治療法の一部と
して患者に該担体を注入する製薬的に許容されることを意味する。好ましくは、
担体はクリアランスの許容可能な血中濃度半減期を有する循環系で比較的安定で
ある。このような高分子はこれに限らないが、大豆レシチン、オレイン酸及びソ
ルビタントリオレアートを含み、ソルビタントリオレアートが好ましい。 当実施態様の製剤はまた、タンパク質安定化剤又は浸透圧の調節に利用できる
他の薬剤も含んでいてもよい。薬剤の例は、これに限らないが、塩、例えば塩化
ナトリウム、又は塩化カリウム及び糖類、例えばグルコース、ガラクトース又は
マンノース等を含む。
【００４５】 Ｊ．エアロゾル乾燥粉末製剤 本医薬製剤はペプチドリガンドの細かく分包された粉末形態及び分散剤を含む
乾燥粉末吸入製剤として使用されうる。化合物の形態は、一般に凍結乾燥粉末で
ある。ペプチド化合物の凍結乾燥形態は標準的な技術で得られる。 他の実施態様では、乾燥粉末製剤は、本発明の１又は複数の化合物、分散剤及
び充填剤を含む細かく分包された乾燥粉末を含む。本製剤に混合して使用できる
充填剤は、ラクトース、ソルビトール、スクロース、又はマンニトールのような
薬剤を含み、装置からの粉末の分散を円滑にする量である。
【００４６】 Ｋ．研究、産業、及び診断用組成物 好ましい実施態様では、本発明のペプチドリガンド又はハイブリッド分子は固
体支持体等の高分子と非共有吸着又は共有結合させる。本発明はペプチドリガン
ド又はハイブリッド分子と複合される高分子を包含すると理解される。好ましい
実施態様では、例えば下に開示されるＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガンドのように、
本発明のペプチドリガンドは、免疫グロブリンに対向する。このようなペプチド
リガンドは親和性精製剤と使用してもよい。この方法では、ペプチドリガンドは
当該分野でよく知られた方法を用いてセファデックス樹脂又は濾過紙等の固相支
持体上に固定される。固定したペプチドリガンドは精製するために免疫グロブリ
ンタンパク質（又はその断片）を含有する試料と接触させ、支持体を、固定した
ペプチドリガンドに結合した免疫グロブリンタンパク質以外の試料中の全ての物
質を実質的に取り除く適当な溶媒で洗浄する。最後に、支持体を他の適した溶媒
、例えばグリシン緩衝液、ｐＨ５．０で洗浄して、ペプチドリガンドから免疫グ
ロブリンタンパク質を離す。 一般に、固体支持体はポリマーゲルなどの不活性マトリクスであり、三次元構
造と材料の格子又はネットワークを有する。合成又は天然の殆ど全ての高分子が
、二官能性試薬で架橋されたとき、適切な液体中でゲルを形成する。好ましくは
、選択される高分子は、アフィニティクロマトグラフィでの使用に便利なもので
ある。アフィニティクロマトグラフィに使用される殆どのクロマトグラフマトリ
クスはキセロゲルである。このようなゲルは乾燥時に収縮してゲルマトリクスの
みを含むコンパクトな固体となる。乾燥キセロゲルが液体に再懸濁されると、ゲ
ルマトリクスは液体を吸収し、膨潤し、ゲル状態に戻る。ここで使用するのに適
したキセロゲルは、セルロース、架橋デキストラン（例えばセファロース）、ア
ガロース、架橋アガロース、ポリアクリルアミドゲル、及びポリアクリルアミド
−アガロースゲルなどのポリマーゲルを含む。
【００４７】 あるいは、エアロゲルもアフィニティクロマトグラフィに使用できる。これら
のゲルは乾燥時に収縮しないが、周囲の空気の透過のみを可能にする。乾燥ゲル
が液体に曝露されると、後者はゲル中の空気と置換される。ここでの使用に適し
たエアロゲルは、多孔性ガラス及びセラミックゲルを含む。 またここに包含されるのは、誘導体化ゲルと結合した本発明のペプチドリガン
ド又はハイブリッド分子であり、その誘導体部分はゲルマトリクスへのハイブリ
ッド分子の結合を促進し、アフィニティクロマトグラフィにおけるペプチド−標
的分子相互作用の立体的障害を回避する。あるいは、類似の利点のために、ゲル
マトリクスとハイブリッド分子との間にスぺーサーアームを挿入することもでき
る。 前記の変形としては、遺伝子融合及びペプチドリガンドの精製試薬としての使
用が考えられる。本発明のこの態様によれば、ペプチドリガンドをコードする遺
伝子は、ベクターに他のタンパク質又は他のタンパク質の断片をコードする遺伝
子と関連づけされる。これは、ペプチドリガンドが他のタンパク質又はペプチド
と融合として宿主細胞によって生産される結果をもたらす。「他の」タンパク質
又はペプチドとは、多くの場合、細胞からの分泌が可能なタンパク質又はペプチ
ドであり、所望するペプチドの培養液からの単離及び精製を可能にし、所望する
ペプチドが菌体内に止まる場合に生じる宿主細胞を破壊する必要性を除く。ある
いは、融合タンパク質は細胞内に発現することも可能である。高度に発現される
融合タンパク質を使用するのが有用である。
【００４８】 遺伝子融合の使用は、プロテインＡの結合、より詳しくはプロテインＡのＺド
メインのＩｇＧへの結合が融合タンパク質の精製の為の「親和性ハンドル」を提
供することから頻繁に使用されるタンパク質Ａの使用に類似している。本発明の
好ましい態様に従うと、血清アルブミンに結合するペプチドリガンドは、固体血
清アルブミン支持体上に融合したタンパク質の精製のための「親和性ハンドル」
として使用される。例えば、所望のペプチドリガンドをコードするＤＮＡ配列は
、タンパク質の遺伝子の部位特異的突然変異誘発によって融合することができる
。融合タンパク質の発現と分泌の後、酵素混合物から生成することのできる遊離
ペプチドを得るために、酵素的に切断されうる。融合タンパク質は、メチオニン
、又はヒドロキシアミン、Ａｓｎ及びＧｌｙ残基間を切断する臭化シアンのよう
な化学薬品を使用することによって切断が可能である。標準的な組換えＤＮＡ技
術を使用することにより、これらアミノ酸をコードするヌクレオチド塩基対は、
所望するペプチドをコードする遺伝子の５' 末端の直前に挿入することができる
。あるいは、融合タンパク質のタンパク質分解による切断を使用することが可能
である。Cater, Protein Purification: From Molecular Mechanism to Large-S
cale Process, Ladish等., eds.(American Chemical Society Symposium Series
No.427,1990), Ch13, page 181-193。
【００４９】 以下の実施例は、例示のために提供されるもので、限定するものではない。明
細書中の全ての文献の開示は、ここに出典明示することにより取り込まれる。 実施例１ ＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガンド インビトロでの選択は、インビボでのペプチド機能の作用を制限することなく
、ＩｇＧ-Ｆｃ表面に結合するペプチドリガンドを同定してなされた。選択は様
々な細胞性ホルモン及びレセプターに結合するペプチドを生成するのに近年使用
されている多価及び一価のファージディスプレーの組み合わせを用いて行われた
。N. C. Wrighton, 等(1996), Science 273:458, O. Livnah,等(1996), Science
273:464。単一のジスルフィド制限ペプチドライブラリを４ｘ１０９の Xaai-Cy s-Xaaj-Cys-Xaak の 形態の異なるペプチドからなるものが構築され、ここで Xaa
はＮＮＳコドン由来のランダムアミノ酸であり、 i+j+k=18、及びj=4から10で
ある。このライブラリはグリシンとセリンの残基からなる短いリンカーを有する
遺伝子ＶＩＩＩタンパク質とのＮ末端融合体としてＭ１３のバクテリオファージ
の表面で発現した。H. B. Lowman等(1998), Biochernistry 37: 8870-8878。よ
り具体的には、ライブラリはＳＴＩＩ分泌シグナルペプチド、２０アミノ酸長の
ペプチドライブラリ、つまり Xaai-Cys-Xaaj-Cys-Xaak （ここで、XaaはＮＮＳ
コドン由来のランダムアミノ酸、i+j+k=18、及びj=4から10である）、Gly-Gly-G
ly-Ser-Gly-Gly-Glyリンカー (配列番号：1)、及び成熟タンパク質の一番目の残
基で開始するＭ１３遺伝子ＶＩＩＩを含んでいた。 原則として、ペプチドは、このライブラリの偏りのない性質によってＩｇＧ-
Ｆｃの任意の領域に潜在的に結合するものが選択された。しかしながら、数回の
選択の後、ライブラリは単一のペプチド、Ｆｃ-Ｉ(Glu-Thr-Gln-Arg-Cys-Thr-Tr
p-His-Met-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Glu-Arg-Glu-His-Asn) (配列番号：2)で特
色付けされた。選択はH. B. Lowman等,上掲に記載されるように、次の修飾で実
施された：マイクロタイターのウェルを５μｇ／ｍｌのＩｇＧ-Ｆｃを用いて被
覆し；非特異性結合を更に防ぐためにカゼイン阻害バッファ（Pierce社）を０．
１％のＢＳＡの代わりに使用し；ファージの溶出に７５ｍＭのＤＤＴ又は同等の
結果となる０．２ｍＭのグリシンｐＨ２．０の何れかを作用させた。ＩｇＧ-Ｆ
ｃはＣＤ４-ＩｇＧ１イムノアドヘシンタンパク質のパパイン切断によって得ら
れる、Capon等, (1989), Nature, 337:525。切断された物質はタンパク質Ａセフ
ァロース、続いてSuperdex-75（Pharmacia社）に通して精製し、次いで２８０ｎ
ｍの吸光度で定量した。
【００５０】 選択実験を再び繰り返してＦｃ-Ｉ、更に関連するペプチド、Ｆｃ-ＩＩ（Lys-
Glu-Ala-Ser-Cys-Ser-Tyr-Trp-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Val-Ala-Gly-Val-
Glu）（配列番号：3）を得た。Ｆｃ-ＩＩペプチドはＦｃ-Ｉに見られる開始Gly-
Glu-Leu-Val-Trp（配列番号：132）配列及びシステインスペーシングを共有する
。明らかに、これら２つのペプチドは、開始プールに存在する他のＩｇＧ-Ｆｃ
結合ペプチドを通しての選択に十分高い親和性を有するＩｇＧ-Ｆｃに結合する
。２つのペプチドは標準９-フルオレニルメトキシカルボニルプロトコルを用い
て固相ファージ上で合成され、逆相ＨＰＬＣにより精製される。質量をエレクト
ロスプレー質量分析により確認し、精製したペプチドを２８０ｎｍのＵＶ吸光度
で定量した。 競合ＥＬＩＳＡをH. B. Lowman,等, 上掲に記載される能能と同様の方法で実
施した。概略して言うと、タンパク質Ａ Ｚｄｏｍｅｉｎｎを５μｇ／ｍｌの濃
度でマイクロタイターウェル上に固定し、遮断して、記述のように洗浄した。濃
度３１２ｎＭから０．３ｎＭのビオチニル化ＩｇＧ-Ｆｃの混合物の基質と濃度
２１５μＭから０．８μＭのペプチドを調製した。これらの混合物は固定したタ
ンパク質Ａ Ｚドメインと１時間インキュベートする。次いでプレートをアビジ
ン／ＨＲＰコンジュゲートを用いて記載したように洗浄して発達させた。次にビ
オチン-ＩｇＧ-Ｆｃの各濃度について阻害曲線を算定し、次いでＫｉを得るため
に最大阻害の半分の値の曲線、「ＩＣ５０」をゼロビオチン-ＩｇＧ-Ｆｃ濃度に
対して推定した。Ｆｃ-Ｉ及びＦｃ-ＩＩペプチド双方を約５μＭの阻害定数（Ｋ
ｉ）でＩｇＧ-Ｆｃと結合するタンパク質Ａ（Ｚドメイン）（B. Nilsson等(1987
), Protein Eng. 1:107）との競合を検出した。結果から、これらのペプチドが
タンパク質Ａ結合部位と一致するＩｇＧ-Ｆｃ上の重複部位に結合することが示
唆された。
【００５１】 Ｆｃ-ＩＩのＤＮＡ配列をＳＴＩＩシグナル配列、Ｆｃ-ＩＩペプチド Lys-Glu
-Ala-Ser-Cys-Ser-Tyr-Trp-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Val-Ala-Gly-Val-Glu
(配列番号：3)、Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly リンカー(配列番号：4)、及び
残基２５３で開始するＭ１３遺伝子ＩＩＩタンパク質を有する構築物を得るため
にカセット突然変異によって一価のファージディスプレイフォーマットを実施し
た。Ｆｃ-ＩＩ配列をファージディスプレイによって親和性成熟した。５組の残
基をペプチド配列の非システイン位置を完全に網羅する６つの分離したライブラ
リで無策位に突然変異させ、次いでＩｇＧ-Ｆｃに対してスクリーニングした。 一組の二次生成の一価のファージディスプレイライブラリをＦｃ-ＩＩ配列 Ly
s-Glu-Ala-Ser-Cys-Ser-Tyr-Trp-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Val-Ala-Gly-Va
l-Glu (配列番号：3) に基づいて構築し、ここで５つの配列残基は２つのシステ
イン以外の１、４、７、１０、１２、及び１６の位置で開始する各ライブラリの
ＮＮＳコドンを用いてランダム化した。各ライブラリは約１ｘ１０８の多様性を
有していた。これらのライブラリをそれぞれＩｇＧ-Ｆｃに結合させるために６
回スクリーニングし、次いで配列決定した。次にこの選択からの好ましい残基を
、完全長ペプチド配列を測定した３つの更なるライブラリを用いて再結合した。
３つの更なるライブラリを１つのペプチドの各位置の好ましいアミノ酸を再結合
するために遺伝子コードの縮重を用いて構築した。これらのライブラリに体ｓる
ＤＮＡ配列は塩基（ＩＵＰＡＣコード）の次の混合物を含む： DRG GWA GMA RRC
TGC KCT TRS CAC MTG GGC GAG CTG GTC TGG TGC RVC RVM BKC GAS KDW (配列番
号：5)、DRS VWG SVG RRC TGC KCC TRS YRS MTG GGC GAG CTG GTC TGG TGC RNC
VVS NBS GWS KDM (配列番号：6)、及び DNS NNS NNS VNS TGC BVG TDS HRS MDS
GGC GAG STC KKG WRG TGC RNM NNS NNS NNS NNM (配列番号：7)。またこれらの
ライブラリをＩｇＧ-Ｆｃに対して６回ソートし、次いで配列決定した。 ＩｇＧ-Ｆｃに対してスクリーニングした後、これらのライブラリからのコン
センサス型は、高度に保存された１３残基を核にする配列(Asp-Cys-Ala-Trp-His
-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr) (配列番号：8)を示唆した。一致するペプ
チド（Ｆｃ-ＩＩＩ）を合成し、１００ｎＭのＩｃ５０を有するＦｃに対するタ
ンパク質Ａ（Ｚドメイン）の結合を阻害することが分かった。従って、Ｆｃ-Ｉ
ＩＩはＦｃ-ＩＩよりも短い７つの残基であるが、５０倍固く結合する。サイズ
が小さいにも関わらず、Ｆｃに対するＦｃ-ＩＩＩの結合親和性はタンパク質Ａ
及びタンパク質Ｇのドメインのものより１０倍弱く、それぞれ約４倍大きく、約
１０ｎＭのＫｄＳで結合する。S. R. Fahnestock,等 in Bacterial Immunoglobl
in-Binding Proteins (Academic Press, Inc. 1990) Vol.1, chap. 11. R. Karl
sson, L. Jendeberg, B. Nilsson, J. Nilsson, P. Nygren (1995), J. Immuno.
Methods 183:43。
【００５２】 表Ｉは例として上記方法を用いて同定したＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガンドのア
ミノ酸配列とＩｇＧ-Ｆｃ結合親和性を挙げる。 表Ｉ ＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガンド配列と親和性 配列 配列番号 結合親和性 ペプチド＊ 全てのペプチドはＮ末端にアミ ン、Ｃ末端にアミドを有する KEASCSYWLGELVWCVAGVE 配列番号：３ 5000 nM (Ki) ETQRCTWHMGELVWCEREHN 配列番号：２ 5000 nM (Ki) DLADCSWHMGELVWCSRVEG 配列番号：１５ 50 nM (Kd) WEADCAWHLGELVWCTPMEF 配列番号：１６ 30 nM (IC50) DCAWHLGELVWCT 配列番号：８ 100 nM (IC50) ファージクローン (M13/gIII ディスプレイ) 全てのファージ 親和性がEC50S N/A = 別々ではなくアッセイした。 結合を選択したので、EC50は＜1uM であるか、それより良い。 列挙した全てのペプチドがＩｇＧ-Ｆｃと結合する。 集束ライブラリ 配列 配列番号 結合親和性 KEASCSYWLGELVWCDTLTE 配列番号：１７ N/A KEASCSYWLGELVWCSPGVE 配列番号：１８ 734 nM KEASCSYWLGELVWCSGVEG 配列番号：１９ N/A KEASCSYWLGELVWCSAGVE 配列番号：２０ N/A ESEDCSYWLGELVWCVAGVE 配列番号：２１ N/A EKEDCSYWLGELVWCVAGVE 配列番号：２２ N/A EDPDCSYWLGELVWCVAGVE 配列番号：２３ N/A EEADCSYWLGELVWCVAGVE 配列番号：２４ N/A NADDCSYWLGELVWCVAGVE 配列番号：２５ N/A SETTCSYWLGELVWCVAGVE 配列番号：２６ N/A AWKTCQWLGELVWCVAGVE 配列番号：２７ N/A DLADCSYWLGELVWCSRVEG 配列番号：２８ 776 nM KEADCAWHLGELVWCVAGVE 配列番号：２９ l38 nM KEAECSYHLGELVWCVAGVE 配列番号：３０ N/A KEARCWYWHGELVWCSDPEE 配列番号：３１ 8O9 nM KEASCSYHLGELVWCVAGVE 配列番号：３２ 416 nM KEASCSWHLGELVWCVAGVE 配列番号：３３ 225 nM KEASCSYWLGELVWCTEGVE 配列番号：３４ 818 nM KEASCSYWLGELVWCDDGVE 配列番号：３５ N/A KEASCSYWLGELVWCSEGVE 配列番号：３６ N/A KEASCSYWLGELVWCSPGVE 配列番号：１８ N/A KEASCSYWLGEVWKCKSGVE 配列番号：３７ N/A KEASCSYWLGELVWCDNGVE 配列番号：３８ N/A KEASCSYWLGELVWCDTFDE 配列番号：３９ 301 nM KEASCSYWLGELVWCDGLDE 配列番号：４０ 326 nM KEASCSYWLGELVWCVGLDE 配列番号：４１ 278 nM KEASCSYWLGELVWCEDTLE 配列番号：４２ N/A KEASCSYWLGELVWCEDTME 配列番号：４３ N/A KEASCSYWLGELVWCEDMME 配列番号：４４ N/A WVEDCSWHMGELVWCDGGEF 配列番号：４５ l39 nM KEASCSYWLGELVWCDWMNG 配列番号：４６ N/A KEASCSYWLGELVWCDDTPV 配列番号：４７ N/A KEASCSYWLGELVWCDDYGE 配列番号：４８ N/A KEASCSYWLGELVWCSDLWE 配列番号：４９ N/A WRGGCSWHMGELVWCEHDME 配列番号：５０ N/A AVSKCSFHMGELVWCSDVMN 配列番号：５１ N/A NQVSCSYSRGELVWCSKQSQ 配列番号：５２ N/A GRMECAWHQGELVWCTPTLE 配列番号：５３ N/A GTMECSWHQGELVWCTPTLA 配列番号：５４ N/A EMRDCSWHLGELVWCAHMEG 配列番号：５５ N/A GSWECAYHLGELVWCETGSG 配列番号：５６ N/A VAEPCAYHLGELVWCEVLKG 配列番号：５７ N/A KEAMCSYWLGELVWCESDMP 配列番号：５８ N/A 設計クローン DLADCSWHLGELVWCSRVEG 配列番号：５９ 9 nM DLADCSWHLGELVWCVGLDE 配列番号：６０ 28 nM WVEDCSWHLGELVWCVGLDF 配列番号：６１ 31 nM 二次最適化 KVADCAWHMGELVWCTEVEG 配列番号：６２ 23 nM GEEDCSYHLGELVMCTELDD 配列番号：６３ 69 nM GVADCAWHLGELVWCTERED 配列番号：６４ N/A GEEDCAWHLGELVWCSGGDF 配列番号：６５ lOOnM WEADCAWHLGELVWCTKVEE 配列番号：６６ 7 nM GEADCSYHLGELVWCNDFEE 配列番号：６７ l56nM WVDCAYHLGELVWCSTFEE 配列番号：６８ 9 uM WVEDCAWHMGELVWCTKVDE 配列番号：６９ 70 nM READCAWHLGELVWCSERDL 配列番号：７０ 47 nM EEASCAYHLGELVWCDAFDV 配列番号：７１ 77 nM RVASCAWHLGELVWCDGLDG 配列番号：７２ N/A GEADCAWHLGELVWCTKVEE 配列番号：７３ 38 uM GEASCAYHLGELVWCDEGEG 配列番号：７４ 386 nM RVEDCAYHLGELVWCTEGDE 配列番号：７５ 63 nM EEPDCSWHLGELVMCTPMEV 配列番号：７６ l4 nM KEADCAWHMGELVWCSEMEG 配列番号：７７ 66 nM EQADCAWHLGELVWCTPMVF 配列番号：７８ 8 nM EEPDCSWHLGELVWCTPIEV 配列番号：７９ l5 nM GEPDCAWHLGELVWCTPMVF 配列番号：８０ 7 nM GEQDCSYHMGELVWCTTVDG 配列番号：８１ 2lO nM GVRNCAYHLGELVWCTPMEF 配列番号：８２ lO nM RVADCAWHMGELVWCSELEV 配列番号：８３ 44 nM GEADCAWHLGELVWCTPMDL 配列番号：８４ N/A GEQDCSWHLGELVWCTPMEV 配列番号：８５ N/A GMRDCSYHLGELVWCSDMEL 配列番号：８６ N/A EVADCSWHLGELVWCTEGEF 配列番号：８７ 54 nM GEEDCAWHLGELVWCTDVED 配列番号：８８ 52 nM EVEDCAYHLGELVWCSDLEG 配列番号：８９ 82 nM WEEDCAWHLGELVWCAEFDE 配列番号：９０ 44 nM KEASCAWHLGELVWCSEVEE 配列番号：９１ 130 nM ファージでのＡＬＡスキャン AEADCAWHLGELVWCTKVEE 配列番号：９２ 20 nM WAADCAWHLGELVWCTKVEE 配列番号：９３ 34 nM WEPDCAWHLGELVWCTKVEE 配列番号：９４ 36 nM WEAACAWHLGELVWCTKVEE 配列番号：９５ 55 nM WEAACSWHLGELVWCTKVEE 配列番号：９６ 10 nM WEADCAAHLGELVWCTKVEE 配列番号：９７ 798 nM WEADCAWALGELVWCTKVEE 配列番号：９８ 139 nM WEADCAWHAGELVWCTKVEE 配列番号：９９ 56 nM WEADCAWHLAELVWCTKVEE 配列番号：１００ 12 nM WEADCAWHLGALVWCTKVEE 配列番号：１０１ 11 nM WEADCAWHLGEAVWCTKVEE 配列番号：１０２ 1890 nM WEADCAWHLGELAWCTKVEE 配列番号：１０３ 4670 nM WEADCAWHLGELVACTKVEE 配列番号：１０４ 3380 nM WEADCAWHLGELVWCAKVEE 配列番号：１０５ 101 nM WEADCAWHLGELVWCTAVEE 配列番号：１０６ 10 nM WEADCAWHLGELVWCTKAEE 配列番号：１０７ 8 nM WEADCAWHLGELVWCTKVAE 配列番号：１０８ 4 nM
【００５３】 実施例２ ＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガンドで標識した抗ＶＥＧＦ Ｆａｂの構築 ペプチドリガンドドメインと活性ドメインを有するハイブリッド分子を形成す
るためにＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガンドを生理活性化合物と結合させてもよい。
この実施例では、ＩｇＧ-ＦｃペプチドリガンドをヒトＶＥＧＦ認識Ｆａｂ断片
と結合させる。ヒトＶＥＧＦに対する中和抗体をヒト化したマウスのハイブリド
ーマから事前に同定しておき、ファージディスプレイで最適化した。Muller等(1
998), Structure 6:1153-1167; Chen等(1999), J. Mol. Biol. 293:865-881; 及
び国際特許公開番号WO98/45331参照。無関係のＩｇＧに対する結合親和性を、抗
体結合親和性を壊すことなくＦａｂに加えることができるかを試験するために、
この抗体の２つのヒト化Ｆａｂ型を選択した。実施例１に記載されたペプチド-
ファージディスプレイ方法で同定され、最適化されたＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガ
ンド、 DCAWHLGELVWGT (配列番号：8)が、ペプチドとＦａｂの間の柔軟性を与え
る短いペプチドリンカー（Gly-Gly-Gly）と共に使用される。この抗体の場合に
は軽鎖が抗体結合への僅かな寄与を有することが既知である（Muller等, 1998,
上掲）ので、Ｆａｂの軽鎖は融合体が選択される。原則としてペプチドリガンド
ドメインはＮ末端、Ｃ末端いずれへの導入であろうとＩｇＧ結合を導入し、又は
もとのＦａｂ配列中に挿入されるように機能することができる。ここで記載され
るのはＮ末端融合 DCAWHLGELVWCTGGG-(軽鎖)(配列番号：109) 並びにＣ末端融合 (軽鎖)-GGGWEADCAWHLGELVWCT (配列番号：110)である。 オリゴデオキシヌクレオチド、ＨＬ-５６９を、抗体軽鎖のＮ末端でＩｇＧ-Ｆ
ｃペプチドリガンドの融合体を作成するために抗ＶＥＧＦプラスミドの突然変異
体を設計し、合成した。ＨＬ-５６９の配列（更なるペプチド配列に下線を引い
た）は： 5'-ACA AAC GCG TAC GCT GAC TGC GCT TGG CAC CTG GGC GAG CTG GTC TGG TGC ACC GGA GGA GGA GAT ATC CAG TTG ACC-3' (配列番号：111)。GACコド
ンは軽鎖のＮ末端のＳＴＩＩ選択シグナル配列にに続き、GATコドンは成熟（野
生型）軽鎖の一番目の残基に相当する。 他のオリゴデオキシヌクレオチド、ＨＬ-５７０を、抗体軽鎖のＣ末端でペプ
チドリガンドの融合体構築のために設計し、合成した。ＨＬ-５７０の配列（更
なるペプチド配列に下線を引いた）は：5'-AAC AGG GGA GAG TGT GGA GGA GGA T GG GAA GCA GAC TGC GCT TGG CAC CTG GGC GAG CTG GTC TGG TGC ACC TAA GCT G
AT CCT CTA C-3'(配列番号：112)。下線を引いたGGAの前にあるTGTコドンは軽鎖
の残基Cys-214に相当し、TAA「停止コドン」は翻訳されるペプチド配列の末端を
特徴づける。ファージミドｐＹ０１９２及びｐＹ０３１７（Muller等, 1998, 上
掲；Chen等, 1999；及び国際特許公開番号WO98/45331に記載）はヒト抗ＶＥＧＦ
抗体の低親和性及び高親和性形態をそれぞれコードし、２つのＩｇＧ-ペプチド
オリゴのそれぞれを突然変異させて構築物ｐＹ０１９２-５６９、ｐＹ０１９２-
５７０、ｐＹ０３１７-５６９、及びｐＹ０３１７-５７０を得た。
【００５４】 実施例３ ペプチドリガンド標識した抗ＶＥＧＦ Ｆａｂを含むハイブリッド分子のファー
ジＥＬＩＳＡ分析 ファージＥＬＩＳＡ競合結合アッセイ（Lowman(1998), MEthods Mol. Biol. 8
7:249-264）をＮ末端とＣ末端でＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガンドで標識した抗ＶＥ
ＧＦ抗体変異体の見かけの結合親和性に比較して用い、遺伝子ＩＩＩタンパク質
のＣ末端ドメインの融合体としてバクテリオファージＭ１３粒子で一価的に表示
した。 ハーセプチン(登録商標)として知られる無関係のヒト化ＩｇＧ、４Ｄ５-Ｉｇ
Ｇによってリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中２マイクロｇ／ｍＬでNunc Maxis
orp免疫吸着プレート上を被覆した。ＸＬ-１ブルー大腸菌（Stratagene）を一晩
培養したファージミド粒子を０．５％のウシ血清アルブミンと０．０５％のＴｗ
ｅｅｎ-２０を含むＰＢＳで希釈した。ファージミド粒子を溶解したハーセプチ
ン(登録商標)の連続希釈液と混合し、非吸着プレート（Nunc F96）で２０分間平
衡化し、次いで非結合ファージの除去のためにハーセプチン(登録商標)被覆した
Maxisorpプレートに移動した。２０分後プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し
、抗ファージモノクローナル抗体ＨＲＰコンジュゲート（Pharmacia）及びＯＰ
Ｄ基質(Sigma)で発達させた。構築物、ｐＹ０１９２-５６９、ｐＹ０１９２-５
７０、ｐＹ０３１７-５６９、及びｐＹ０３１７-５７０のそれぞれについての約
１００−３００ｎＭのＩＣ５０値を置換曲線（Ｆｉｇ．１）で示した。
【００５５】 実施例４ ＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガンドで標識した抗ＶＡＧＦ ＦａｂへのＩｇＧ結合のビ
アコア(商品名)分析 無関係なＩｇＧ、ハーセプチン(登録商標)としても知られる４Ｄ５-ＩｇＧの
、固定ＶＥＧＦバイオセンサーチップに事前に結合させたＦａｂに対する結合を
測定するために、表面プラズモン共鳴器（ビアコア社、ピスカタウェイ、ニュー
ジャージー）を用いた。 ｐＹ０３１７及びｐＹ０３１７-５７０（それぞれコントロール抗ＶＥＧＦ高
親和性のヒト化Ｆａｂ、及び抗ＶＥＧＦ高親和性、ＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガン
ドドメインで標識したヒト化Ｆａｂ；上掲の実施例２、及びWO98/45331参照）に
よりコードされるＦａｂ変異体を大腸菌で発現させ、タンパク質Ｇ（Pharmacia
社）親和性クロマトグラフィーで精製した。組み換えヒトＶＥＧＦを記述される
ように（Muller等, 1998, 上掲）ビアコア(商品名)ＣＭ-５バイオセンサーチッ
プ（ビアコア社）上に固定した。ＶＡＧＦの固定の後、チップをエタノールアミ
ンで遮断し、ペプチドリガンドをＹ０３１７−５７０ Ｆａｂ、又はＹ０３１７
コントロールで標識し、０．０５％のＴｗｅｅｎ-２０と０．０１％のアジ化ナ
トリウムを含有するＰＢＳバッファーに投入した。Ｆａｂ投入の後、ハーセプチ
ン(登録商標)を投入し、投入に従う解離率（ｋｏｆｆ）を得た。 結果（Ｆｉｇ．２）は、ハーセプチン(登録商標)がコントロールＹ０３１７
Ｆａｂ以外の標識物に結合したことを示す。１：１ラングミュア結合モデル（Ka
rlsson等(1991), J. Immunol. Methods 145:229-240(1991)）を用いて、２．８
ｘ１０−３、秒−１のｋｏｆｆ、及び８．５分の対応する消失半減期（ｔ１／２ ）をＹ０３１７-５７０について測定した。物質の制限は正確な結合の測定を妨
げた。しかしながら、得られたｋｏｆｆは３０ｎＭから３００ｎＭ（ｋｏｎは１
０４−１０５Ｍ−１秒−１とみなす）の平衡結合親和性、Ｋｄがペプチド結合と
ファージＥＬＩＳＡの結果（上）に一致することを示唆する。重要なことには、
またビアコア(商品名)の結果は、標識したＦａｂが抗体（固定ＶＥＧＦ）と無関
係のＩｇＧの両方に同時に結合できることを示す。
【００５６】 実施例５ ＩｇＧ-Ｆｃリガンド標識した抗ＶＥＧＦ Ｆａｂは延長した消失半減期を有する ＩｇＧ-Ｆｃペプチドリガンド標識した抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ（Ｆａｂ-Ｙ０３１
７-５７０）の血液クリアランス速度と組織分布を、標識していないコントロー
ル抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ Ｙ０３１７のものと比較する。消失半減期と分布容積の測
定は重量２．８から３ｋｇのニュージーランドシロウサギで行う。血漿試料中に
存在する被験物質の量は当該分野で既知の任意の方法、例えばＥＬＩＳＡ又はＲ
ＩＡを用いて測定する。 薬物動態分析は被験物質血漿濃度を用いて実施する。投与後の経過時間に対し
てプロットした場合に各被験物質の集団平均血漿データは多次指数関数プロフィ
ールに一致する。データは標準的な２分画モデルによりボーラス投与量と分布及
び消失相の一次速度定数に当てはめる。静脈内投与のデータに最適な一般式は：
ｃ(ｔ)＝Ａｅ−αｔ＋Ｂｅ−βｔであり、ここでｃ(ｔ)は時間ｔにおける血漿濃
度であり、ＡとＢはＹ軸上の切片であり、αとβはそれぞれ分布及び消失相の見
かけの一次速度定数である。α相はクリアランスの初期相であり、動物の全ての
細胞外液中のタンパク質の分布を示すのに対し、衰退曲線の第２又はβ相部分は
真の血漿クリアランスを示す。このような均衡に合わせる方法は当該分野でよく
知られている。例えば、Ａ＝Ｄ／Ｖ(α-ｋ２１)／(α-β)、Ｂ＝Ｄ／Ｖ(β-ｋ２
１)／(α-β)、及びα及びβ（α＞β）は二次方程式の平方根：Ｖ＝分布容積、
ｋ１０＝消失率、ｋ１２＝分画１から分画２への移動率及びｋ２１＝分画２から
分画１への移動率を用いたｒ２＋(ｋ１２＋ｋ２１＋ｋ１０)ｒ＋ｋ２１ｋ１０＝
０であり、Ｄ＝投与量である。
【００５７】 試験日の朝、６羽のニュージーランドシロウサギ（体重２．８−３．０ｋｇ）
を固定器に固定した。血液試料採取用の耳動脈と投与用の事情脈にカテーテルを
挿入した。 ウサギを２つの集団（ｎ＝３／集団）に分けた。集団１の動物はコントロール
抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ-Ｙ０３１７の静脈内投与ボーラスを受けた。集団２のウサギ
はＦａｂ-Ｙ０３１７-５７０を受けた。集団の条件の概要と投与量については以
下の表に示す。 集団 重量 投与集団 公称投与量 投与濃度 投与量 (kg) (mg/kg) (mg/mL) (mL) １ ２．９ コントロール-Fab-Y0317 １ ３ ０．９７ １ ３．０ コントロール-Fab-Y0317 １ ３ １．００ １ ２．９ コントロール-Fab-Y0317 １ ３ ０．９７ ２ ２．８ Fab-Y0317-5701 ３ ０．９３ ２ ３．０ Fab-Y0317-5701 ３ １．００ ２ ２．９ Fab-Y0317-5701 ３ ０．９７ 投与の直前と投与後１０、２０、４０分、１、２、３、４、６、８、２４及び
４８時間に順次血液試料（０．５ｍＬ）を収集した。血液を血清分離管に収集し
、室温で凝血させ（〜３０分）、遠心分離した。血清を採取し、分析までの間直
ちに−７０℃で保存した。
【００５８】 ＥＬＩＳＡプレートを０．５マイクロｇ／ｍｌのＶＥＧＦ含有５０ｍＭの炭酸
バッファー、ｐＨ９．６で、４℃で一晩被覆し、さらに０．５％のウシ血清アル
ブミン、１０ｐｐｍのプロクリン３００（スペルコ社、Bellefonte, PA）含有Ｐ
ＢＳ（８ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２．７ｍＭのＫＣ
ｌ及び１３７ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で室温で１時間遮断した。標準物（
０．４１−１００ｎｇ／ｍｌ）と０．５％のウシ血清アルブミン、０．０５％の
ポリソルベート２０、０．２５％のＣＨＡＰＳ、０．２％のウシγグロブリン（
シグマ社、St. Luis、MO）を含有するＰＢＳ中の２倍連続希釈試料（最小希釈１
：１００）をプレートで２時間インキュベートした。結合した抗体をヤギＦ(ａ
ｂ')２抗ヒトＩｇＧ(ａｂ')２（Jackson ImmunoResearch社、West Grove, PA）
を標識したペルオキシダーゼで、次いで基質として３,３',５,５'-テトラメチル
ベンジジン（Kirkegaard＆Perry Laboratories）希釈した。プレートを工程の間
で洗浄した。吸着をTiterek stacker reader（ＩＣＮ社、コスタメサ、カリフォ
ルニア州）の４５０ｎｍで読み取った。標準曲線を４つのパラメータの回帰曲線
適合プログラム（カレイダグラフ, Synergy software社, Reading, PA）を用い
て当てはめた。標準曲線の範囲にあるデータの点は試料のＦａｂ濃度得お計測す
るのに使用された。 データ分析：時間プロフィールに対する濃度のグラフをカレイダグラフ（カレ
イダグラフ(商品名)Ｖ．３．０９著作権 1986-1997. Synergy software社, Read
ing, PA）を用いて作成した。読み取り不可能（ＬＴＲ）として記録された値は
ＰＫ分析に含まれず、グラフには示されない。薬物動態パラメータはWinNonlin
ソフトウェア（WinNonlin(登録商標)Professional V.3.1 WinNonlin(商品名)著
作権 1998-1999. Pharsight Corporation. Mountain View, CA)を用いた分画別
分析により測定された。薬物動態パラメータを他（Ritschel WA 及びKearms GL.
Handbook of basic pharmacokinetics including clinical applications, 5th
edition. American Pharmaceutical Assoc., Washington, DC. 著作権 1999）
に記載されているようにして算定した。
【００５９】 結果をＦｉｇ．３に記載する。ボーラス投与と一次生産性（WinNonlin）を用
いた２分画モデルは時間データに対する得られた血清濃度に当てはめて使用され
た。測定された薬物動態パラメータは以下の表に示した。 薬物動態パラメータ概要 （静脈内投与；１ｍｇ／ｋｇ） パラメータ 集団１ 集団２ コントロールFab-Y0317 Fab-Y0317-570 ＡＵＣ(h*μg/mL) 13.6±1.2 215±56 Ｃｍａｘ(μg/mL) 15.6±0.6 13±0.7 ＣＬ(mL/h/kg) 74.2±6.7 4.8±1.1 Ｋ１０半減期(hr) 0.6±0.02 11.3±3.6 α半減期(hr) 0.39±0.03 1.15±0.31 β半減期(hr) 1.93±0.27 37.6±19 Ｖ１(mL/kg) 64.1±2.37 75.2±4.23 Ｖｓｓ(mL/kg) 112±7.7 225±54 両方の薬剤の分布の開始量は血清量にほぼ等しかった。Ｆａｂ-Ｙ０３１７-５
７０(２２５ｍＬ／ｋｇ)の分布の見かけの定常量は内因性ＩｇＧへの結合に有効
な量を示すコントロールＦａｂ（１１２ｍＬ／ｋｇ）の予測よりも約２倍高かっ
た。コントロールＦａｂ-Ｙ０３１７はＦａｂ-Ｙ０３１７-５７０（４．８ｍＬ
／ｈ／ｄ）に比較して血清から約１５倍早く排除された（クリアランス＝７４ｍ
Ｌ／ｈ／ｋｇ）。Ｆａｂ-Ｙ０３１７-５７０の全体暴露（ＡＵＣ）はＦａｂ-Ｙ
０３１７よりも〜１６倍高かった。Ｆａｂ-Ｙ０３１７を投与の２４時間後血清
で検出不可能であったが、Ｆａｂ-Ｙ０３１７-５７０の血清濃度は依然として投
与の４８時間後１μｇ／ｍＬを超えていた。分布（α）半減期（１．１５ｈ）及
び消失（β）半減期（３７．６ｈ）は共にコントロールＦａｂよりも著しく長か
った。 これらの結果は、婦負陰性ＩｇＧに結合する１３のアミノ酸のＦａｂ-Ｙ０３
１７への付加がＦａｂクリアランスを有意に遅延させ、半減期を増加し、全体の
暴露を促進することができることを示唆する。
【００６０】 実施例６ 血清アルブミンペプチドリガンド ファージライブラリ及び選択条件−ファージディスプレイペプチドライブラリ
をウサギ、ラット及びヒトアルブミンに対して選択した。遺伝子８に融合するラ
ンダムペプチドリガンドを発現するファージライブラリ（Lowman等, Biochem. 3
7, 8870(1998)）は５つのグループにプールした：プールＡはＣＸ２ＧＰＸ４Ｃ (配列番号：133) 、Ｘ４ＣＸ２ＧＰＸ４ＣＸ４ (配列番号：134)及びＸｉＣＸｊ
ＣＸ２を含み、ここでｊ＝８−１０；プールＢはＸ２０及びＸｉＣＸｊＣＸｋを
含み、ここでｊ＝４−７；プールＣはＸ８及びＸ２ＣＸｊＣＸ２を含み、ここで
ｊ＝４−６；プールＤはＸ２ＣＸｊＣＸ２を含み、ここでｊ＝７−１０；プール
ＥはＣＸ６ＣＸ６ＣＣＸ３ＣＸ６Ｃ (配列番号：135)、ＣＣＸ３ＣＸ６Ｃ (配列 番号：136) 、ＣＣＸ５ＣＸ４ＣＸ４ＣＣ (配列番号：137)、ＣＸＣＸ７ＣＸ３Ｃ
Ｘ６ (配列番号：138)を含み、ここでＸは２０の天然発生Ｌアミノ酸を示す。そ
れぞれの場合において、ｉ＋ｊ＋ｋ＝１８及び｜ｉ−ｋ｜＜２。１０のライブラ
リのそれぞれが１０８のクローン以上である。 ファージライブラリプールを結合バッファ（ＰＢＳ、１％のオボアルブミン、
０．００５％のＴｗｅｅｎ-２０）に懸濁し、maxisorpプレート（ＰＢＳ中１０
μｇ／ｍｌ、４℃で一晩；プレートはブロッカーカゼイン（Pierce Chemical, R
ockford, IL）で遮断した）上に直接固定したウサギ、ラット又はヒトアルブミ
ンに対して分類した。２時間後、結合していないファージを洗浄（ＰＢＳ、０．
０５％のＴｗｅｅｎ-２０）を繰り返して取り除き、結合したファージを５００
ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨＣｌ、ｐＨ２で溶出した。溶出したファージをＶＣ
ＳＭ１３ヘルパーファージ（Stratagene, La Jolla, CA）でＸＬ１-Ｂｌｕｅ細
胞で増殖した。濃縮を、オボアルブミン又はカゼインでの成功裏の被覆に比較し
て成功裏に被覆されたアルブミンと結合したファージの数の滴定によって監視し
た。 ファージＥＬＩＳＡ−ファージクローン（〜１０１１ファージ）をラット、ウ
サギ又はヒトアルブミンで被覆したプレートに加えた。マイクロタイタープレー
トを洗浄バッファーで洗浄し、結合したファージをＨＲＰ／抗Ｍ１３コンジュゲ
ートで溶出した。結合したＨＲＰの量をＡＢＳＴ／Ｈ２Ｏ２基質を用いて４０５
ｎｍでの変化を監視することにより測定した。
【００６１】 ウサギ、ヒト又はラットアルブミンへの結合を選択したファージアルブミンに
より示されるペプチド配列がＦｉｇ．４に示される。また固定したアルブミンの
３種に結合する個々のファージクローンの能力が望まれる。これは、ファージＥ
ＬＩＳＡを用いて試験された。ラットアルブミンへの結合を選択しクローンＲＢ
はまた、ヒト及びウサギアルブミン結合能力があることに注意してほしい。 一価のファージでの配列成熟−部分的にランダム化したライブラリをそれぞれ
の選択クローンをコードするオリゴヌクレオチドを用いてＦｉｇ，４に示したが
、記載されているように（Dennis等, Nature 404, 465(2000)）塩基の７０−１
０−１０−１０混合物で合成した。これらのライブラリの潜在的な多様性は当初
の未処置のライブラリと同じであるが、各「ソフトランダム化」ライブラリはＦ
ｉｇ．４の選択配列に偏りを有する。各ライブラリは再びその起源のラット、ウ
サギ又はヒトアルブミンへの結合を選択した。例えば、もとはラットアルブミン
への結合を同定したが、クローンＲＢのソフトランダム化から生じるライブラリ
をラット、ウサギ又はヒトアルブミンに対して選択した。ソフトランダム化に従
って同定された配列はファージＥＬＩＳＡにより決定されるようなそれらの種特
異性と共にＦｉｇ．５に示される。ほとんどのクローンがそれらが選択したアル
ブミンの種に特異性的であるように見えるが、ＲＢソフトランダムかライブラリ
由来のクローンはこれらの種の全てに結合する。 またファージクローンをアカゲザル、マウス及びウシアルブミンへの結合につ
いて試験した。ＲＢソフトランダム化ライブラリ由来のクローンを同様にこれら
の種のアルブミンのそれぞれへの結合に対して検出し、オボアルブミン及びカゼ
インへの結合欠陥に基づいてアルブミンに固有である（Ｆｉｇ．６）。複数種の
アルブミンに結合するクローン（多重特異性結合剤）をＦｉｇ．７に示す。
【００６２】 ハードランダム化−ＲＢ配列のソフトランダム化由来の配列をさらに、ハード
ランダム化法を用いて成熟させた。新しいライブラリは、残りの部分を十分にラ
ンダム化する間に選択残基（下線を付した）定常Ｘ５ＤＸＣＬＰＸＷＧＣＬＷＸ ４ (配列番号：116)を高度に保存することを示した。第２のライブラリ、Ｎ及
びＣ末端の両方でより短い１つの残基がまた、構築された。ラット、ウサギ又は
ヒトアルブミンに対して選択された３つのライブラリ由来の配列をそれぞれＦｉ
ｇ．８Ａ、８Ｂ、及び８Ｃに示す。 ペプチド合成−ペプチドを手動又は自動（Milligen 9050）何れかの、ＰＥＧ
ポリスチレン樹脂を用いた０．２５ｍモル大のＦｍｏｃ基固相合成によって合成
した（Bodanszky M.,(1984) Principles of Peputide Synthesis, Springer, Be
rlin）。側鎖保護基を取り除き、ペプチドを９５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ
）と５％のトリイソプロピルシランの樹脂から分割した。飽和したイオジンの酢
酸溶液をジスルフィド結合の酸化のために添加する。ペプチドを０．１％のＴＦ
Ａを勾配して含有する水／アセトニトリルの用いたファージＨＰＬＣによって精
製した。ペプチドを分析的ＨＰＬＣにより＞９５％に精製し、その同一性を質量
分析により検証した。 ペプチドＳＡ０８のカルボキシ末端リシンは、ＮＨＳ-ＬＣ-ビオチン（Poerce
Chemical社, Rockford, IL）で誘導体化し、上記のようにして得られたＳＡ０
８ｂをＨＰＬＣで精製した（Ac-QGLIGDICLPRWGCLWGDSVKb (配列番号：124)-nこ
こでKbはリシン-ビオチンを表す）。 ＳＡ０８結合アッセイ−ウサギ、ラット又はマウスアルブミンをＰＢＳ中１０
μｇ／ｍｌ、４℃で一晩、maxisorpプレート上に直接固定した。プレートを阻害
剤カゼイン（pierce Chemical社, Rockford, IL）を用いて１時間阻害した。続
けて希釈した試料を結合バッファーに懸濁し（上）、プレートに添加して、続い
て１０ｎＭのＳＡ０８ｂを添加して２５℃で１時間おいた。マイクロタイタープ
レートをＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄し、アルブミンに結合した
ＳＡ０８ｂをストレプトアビジン／ＨＲＰで希釈した。ＨＲＰ結合量は、ＡＢＴ
Ｓ／Ｈ２Ｏ２基質を用いて測定し、４０５ｎｍでの変化をモニターした。 同定したファージ配列に対応するペプチドを合成し、ラット、ウサギ又はマウ
スアルブミンに対する親和性をＳＡ０８ｂ結合アッセイを用いて測定した（Ｆｉ
ｇ．９及び１０）。 対照的にアルブミン結合Ｆａｂ融合の発現と精製−アルブミンとの結合がイン
ビボのタンパク質及びペプチドの半減期を増加するかどうかを試験するために、
ＳＡ０６の配列を結合組織因子（ＴＦ）に対するＦａｂ断片（Ｄ３Ｈ４４）に融
合させた。ＳＡ０６配列をＦａｂの軽鎖（Ｄ３Ｈ４４-Ｌ）又は重鎖（Ｄ３Ｈ４
４-Ｌｓ）のどちらかのカルボキシ末端に加えた。さらに、折り畳みの問題に対
する対策として、Ｆｉｇ．１１に記載されるようなアラニン（それぞれ、Ｄ３Ｈ
４４-Ｌｓ及びＤ３Ｈ４４-Ｈｓ）により置換された鎖内ジスルフィド以外は同一
の構築をさせた。
【００６３】 融合物をアルカリホスファターゼプロモーターの制御下で発現させ、ｓｔＩＩ
分泌シグナルを用いて大腸菌から分泌させた。Ｆａｂ融合体を、１ｍＭのＥＤＴ
Ａ、１０ｍＭのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ８、４℃に１時間、細胞を懸濁することに
よりペリプラズムから回収した。細胞の破片を遠心分離によって取り除き、抗Ｔ
Ｆ ＦａｂをＨｉ-Ｔｒａｐ（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）Ｔ
Ｆ親和性カラムを用いて選択的に精製した。適切に折り畳まれたＤ３Ｈ４４-Ｌ
又はＤ３Ｈ４４-Ｌｓをウサギアルブミン親和性カラム（ＣＮＢｒ活性化セファ
ロース４Ｂに結合したウサギアルブミン、Amersham Pharmacia Biotech, Piscat
away, NJ）を用いて更に精製した。両方のカラムをＰＢＳで洗浄し、５０ｍＭの
ＨＣｌで溶出した。溶出した分画を１Ｍのトリス ｐＨ８で中和した。内毒素を
トリトンＸ１１４（Aida及びpabst, J. Immunol. Methods 132, 191(1990)）で
の抽出に従って更に取り除いた。 ＦＸ活性アッセイ（Ｆｉｇ．１２）、及び組織因子依存性凝固の延長を測定す
るプロトロンビンタ時間アッセイ（Ｆｉｇ．１３）（方法についてはDennis 等,
Nature 404, 465(2000)参照）で測定されるように、精製したＤ３Ｈ４４融合体
はＴＦに結合する能力を保持していた。アルブミン結合配列（ＷＴ）を欠くＤ３
Ｈ４４と異なり、Ｄ３Ｈ４４-Ｌ及びＤ３Ｈ４４-Ｌｓは共にＳＡ０８ｂ結合アッ
セイ（Ｆｉｇ．１４）で測定されるように、アルブミンに対する結合能力がある
。更に、Ｄ３Ｈ４４アルブミン結合融合体は共に、ビオチンＴＦ結合アッセイ（
Ｆｉｇ．１５）で判断されるように、ＴＦとアルブミンを同時に結合する能力が
ある。このアッセイにおいて、固定化したアルブミンに対するＤ３Ｈ４４融合体
の結合は、ビオチニル化ＴＦで検出される。野生型Ｄ３Ｈ４４（ＷＴ）はアルブ
ミン結合能力がなく、従ってビオチニル化ＴＦの添加でシグナルを発生しない。 Ｄ３Ｈ４４アルブミン結合融合体の薬物動態−Ｄ３Ｈ４４変異体をウサギに０
．５ｍｇ／ｋｇボーラスとして与えた。各グループは３羽のウサギ（Ｆ(ａｂ')
２グループで５つ）で構成される。提示した時点で得られた血清試料を連続希釈
し、ＴＦ結合ＥＬＩＳＡを用いてＤ３Ｈ４４の濃度を測定した。
【００６４】 薬物動態分析を被験物質血漿濃度を用いて実施する。各被験物質の集団平均血
漿データは投与後の経過時間に対してプロットした際、多次指数関数的プロフィ
ールに従う。データをボーラス投与での標準２分画モデルと分布及び消失相の一
次速度定数に当てはめる。静脈内投与のデータに最も適合する一般式は：ｃ(ｔ)
＝Ａｅ−αｔ＋Ｂｅ−βｔであり、ここでｃ(ｔ)は時間ｔでの血漿濃度、Ａ及び
ＢはＹ軸の切片、及びα及びβはそれぞれ分布及び消失相の見かけの一次速度定
数である。α相はクリアランスの初期相であり、動物の全ての細胞外液にタンパ
ク質の分布を示すが、衰退曲線の第２又はβ相の部分は真の血漿クリアランスを
示す。このような方程式に合致させる方法は当分野でよく知られている。例えば
、Ａ＝Ｄ／Ｖ(α-ｋ２１)／(α-β)、Ｂ＝Ｄ／Ｖ(β-ｋ２１)／(α-β)、α及び
β（α＞β）は次の二次方程式の平方根である：Ｖ＝分布容積、ｋ１０＝消失率
、ｋ１２＝分画１から分画２への移動率及びｋ２１＝分画２から分画１への移動
率、及びＤ＝投与量を用いたｒ２＋(ｋ１２＋ｋ２１＋ｋ１０)ｒ＋ｋ２１ｋ１０
＝０。 データ分析：時間プロフィールに対する濃度のグラフをカレイダグラフ（カレ
イダグラフ(商品名)Ｖ．３．０９著作権 1986-1997. Synergy software社, Read
ing, PA）を用いて作成した。読み取り不可能（ＬＴＤ）として記録された値は
ＰＫ分析に含まれず、グラフには示されない。薬物動態パラメータはWinNonlin
ソフトウェア（WinNonlin(登録商標)Professional V.3.1 WinNonlin(商品名)著
作権 1998-1999. Pharsight Corporation. Mountain View, CA)を用いた分画別
分析により測定された。薬物動態パラメータを他（Ritschel WA 及びKearms GL.
Handbook of basic pharmacokinetics including clinical applications, 5th
edition. American Pharmaceutical Assoc., Washington, DC. 著作権 1999）
に記載されているようにして算定した。 アルブミン結合ペプチドのＤ３Ｈ４４に対する融合によって、改善した薬物動
態パラメータを有するタンパク質となる（Ｆｉｇ．１６及び１７）。Ｄ３Ｈ４４
-Ｌは野生型Ｆａｂに比較して７０倍増加した半減期（Ｋ１０-ＨＬ）及び２０Ｋ
又は４０Ｋポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で誘導体化されたＤ３Ｈ４４ Ｆ
ａｂに対する類似した半減期を有する。 ここに列挙した全ての文献は全文を出典明示によりここに取り込む。
【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ．１】 ペプチド-リガンド標識した抗ＶＥＧＦ Ｆａｂファージミ
ド粒子のＩｇＧ結合を示すファージ競合ＥＬＩＳＡアッセイ。４つの異なる構築
物が示される：ｐＹ０１９２-５６９（塗りつぶした大丸）、ｐＹ０１９２-５７
０（白抜きの大丸）、ＰＹ０３１７-５６９（塗りつぶした小丸）、及びｐＹ０
３１７-５７０（「ｘ」）。
【Ｆｉｇ．２】 ペプチド-リガンド標識した抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ Ｙ０３１
７-５７０（標識したもの；上のパネル）Ｙ０３１７ Ｆａｂ（コントロール；下
のパネル）に結合するＩｇＧのビアコア（商品名）分析。上の略画は、標識した
Ｆａｂ実験で観察された結合現象のモデルを示す。
【Ｆｉｇ．３】 Ｆａｂ-Ｙ０３１７-５７０及びＦａｂ-Ｙ０３１７の時間
に対するグループ平均血清濃度のデータ（±ＳＤ）を図に示す。
【Ｆｉｇ．４】 ウサギ、ヒト又はラットアルブミンに対する結合で選択さ
れたファージクローンにより開示されたペプチド配列をＦｉｇ．４に示す。また
、３種の固定化アルブミンに結合する個々のファージクローンの能力を示す。
【Ｆｉｇ．５Ａ及び５Ｂ】 ソフトランダム化に従って特定した配列を、フ
ァージＥＬＩＳＡにより決定される種特異性と共にＦｉｇ．５に示す。
【Ｆｉｇ．６】 ＲＢソフトランダム化ライブラリ由来のクローンについて
、これらの種の各アルブミンへの結合をＥＬＩＳＡにより検出し、オボアルブミ
ン及びカゼインへの結合の欠損に基づきアルブミンを特定した。
【Ｆｉｇ．７】 複数種のアルブミンに結合するクローン（多種結合型）が
Ｆｉｇ．７に示される。
【Ｆｉｇ．８Ａ、８Ｂ及び８Ｃ】 ラット、ウサギ及びヒトアルブミンに対
して選択されたライブラリ由来の配列がそれぞれＦｉｇ．８Ａ、８Ｂ及び８Ｃに
示される。
【Ｆｉｇ．９】 同定したファージ配列に相当するペプチドを合成し、ラッ
ト、ウサギ又はマウスアルブミンに対するそれらの親和性をＳＡ０８ｂ結合アッ
セイを用いて測定した。
【Ｆｉｇ．１０】 ＳＡ０６同定ファージ配列に相当するペプチドを合成し
、ラット、ウサギ又はマウスアルブミンに対するその親和性をＳＡ０８結合アッ
セイを用いて測定した。
【Ｆｉｇ．１１】 ＳＡ０６配列をＦａｂの軽鎖（Ｄ３Ｈ４４-Ｌ）又は重
鎖（Ｄ３Ｈ４４-Ｌｓ）の何れかのカルボキシ末端に加えた。さらに、個々の構
築物に、Ｆｉｇ．１１に示されるようなアラニン（それぞれＤ３Ｈ４４-Ｌｓ及
びＤ３Ｈ４４-Ｈｓ）により置換された鎖内ジスルフィドを作成した。
【Ｆｉｇ．１２】 精製Ｄ３Ｈ４４融合体は、ＦＸ活性化アッセイを用いて
測定される、ＴＦ結合能力を保持した。
【Ｆｉｇ．１３】 精製Ｄ３Ｈ４４融合体は、組織因子依存性の凝固の延長
を測定するプロトロンビン時間アッセイを用いて測定される、ＴＦ結合能力を保
持した。
【Ｆｉｇ．１４】 アルブミン結合配列（ＷＴ）を欠くＤ３Ｈ４４と異なり
、Ｄ３Ｈ４４-ＬとＤ３Ｈ４４-Ｌｓのどちらもアルブミン結合能力があることが
、ＳＡ０８ｂ結合アッセイで測定された。
【Ｆｉｇ．１５】 どちらのＤ３Ｈ４４アルブミン結合融合体もＴＦとアル
ブミンに同時に結合する能力があることが、ビオチン-ＴＦ結合アッセイにより
決定された。
【Ｆｉｇ．１６】 アルブミン結合ペプチドとＤ３Ｈ４４の融合は改善され
た薬物動態パラメータを有するタンパク質を生じる。
【Ｆｉｇ．１７】 アルブミン結合ペプチドとＤ３Ｈ４４の融合は改善され
た薬物動態パラメータを有するタンパク質を生じる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 19/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ロウマン，ヘンリー ビー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94018， エル グラナダ，ピー．オー．ボックス 2556，サン ホワン アベニュー 400 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA40 BA61 BA80 CA02 HA17 4C076 BB11 CC07 EE41 FF68 FF70 4C084 AA02 AA07 AA14 BA01 BA08 BA23 BA41 CA53 CA56 CA59 MA05 MA66 ZB072 ZC752 4C085 AA33 BB14 BB36 CC21 CC22 CC32 EE01 EE05 GG01 4H045 AA10 AA30 BA10 BA16 BA17 BA41 CA42 DA75 EA20 FA74 GA22 GA23

Claims (60)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 治療用又は診断用物質の消失半減期を延長するためのコンジ
    ュゲートであって、血漿タンパク質結合能力のある設計されたアミノ酸配列を有
    するペプチドを含み、前記ペプチドが治療用又は診断用物質にコンジュゲートし
    ており、該コンジュゲートの消失半減期がコンジュゲートしていない治療用又は
    診断用物質のものを超えているコンジュゲート。
  2. 【請求項２】 配列がペプチドライブラリのスクリーニングにより選択され
    る請求項１に記載のコンジュゲート。
  3. 【請求項３】 ライブラリスクリーニングがペプチドのファージディスプレ
    イを含む請求項２に記載のコンジュゲート。
  4. 【請求項４】 ペプチドが約４０残基よりも短い請求項１に記載のコンジュ
    ゲート。
  5. 【請求項５】 ペプチドが約３０残基よりも短い請求項４に記載のコンジュ
    ゲート。
  6. 【請求項６】 ペプチドが約２０残基よりも短い請求項５に記載のコンジュ
    ゲート。
  7. 【請求項７】 配列が Xaai-Cys-Xaaj-Cys-Xaak であり、ここでi、j及びk
    の合計が約２５以下である請求項１に記載のコンジュゲート。
  8. 【請求項８】 血漿タンパク質が免疫グロブリンである請求項１に記載のコ
    ンジュゲート。
  9. 【請求項９】 免疫グロブリンがＩｇＧである請求項８に記載のコンジュゲ
    ート。
  10. 【請求項１０】 配列が Xaai-Cys-Xaaj-Cys-Xaak であり、ここでi、j及
    びkの合計が約２５以下である請求項９に記載のコンジュゲート。
  11. 【請求項１１】 i、j及びkの合計が約１８以下である請求項１０に記載の
    コンジュゲート。
  12. 【請求項１２】 i、j及びkの合計が約１１以下である請求項１１に記載の
    コンジュゲート。
  13. 【請求項１３】 免疫グロブリンがＩｇＭである請求項８に記載のコンジュ
    ゲート。
  14. 【請求項１４】 血漿タンパク質が血清アルブミンである請求項１に記載の
    コンジュゲート。
  15. 【請求項１５】 治療用又は診断用物質がタンパク質を含む請求項１に記載
    のコンジュゲート。
  16. 【請求項１６】 血漿タンパク質に対するペプチドの親和性が約５００ｎＭ
    以下の平衡解離定数、Ｋｄによって特徴付けされる請求項１に記載のコンジュゲ
    ート。
  17. 【請求項１７】 Ｋｄが約１００ｎＭ以下である請求項１５に記載のコンジ
    ュゲート。
  18. 【請求項１８】 Ｋｄが約５０ｎＭ以下である請求項１７に記載のコンジュ
    ゲート。
  19. 【請求項１９】 ペプチドがタンパク質のアミノ末端にコンジュゲートして
    いる請求項に１５記載のコンジュゲート。
  20. 【請求項２０】 ペプチドとタンパク質の間に更にリンカーを含む請求項１
    ９に記載のコンジュゲート。
  21. 【請求項２１】 ペプチドがタンパク質のカルボキシ末端にコンジュゲート
    している請求項１５に記載のコンジュゲート。
  22. 【請求項２２】 ペプチドとタンパク質の間に更にリンカーを含む請求項２
    １に記載のコンジュゲート。
  23. 【請求項２３】 ペプチドがアミノ又はカルボキシ末端以外のタンパク質の
    領域にコンジュゲートしている請求項１５に記載のコンジュゲート。
  24. 【請求項２４】 請求項１９のコンジュゲートをコードするポリヌクレオチ
    ド。
  25. 【請求項２５】 請求項２０のコンジュゲートをコードするポリヌクレオチ
    ド。
  26. 【請求項２６】 請求項２１のコンジュゲートをコードするポリヌクレオチ
    ド。
  27. 【請求項２７】 請求項２２のコンジュゲートをコードするポリヌクレオチ
    ド。
  28. 【請求項２８】 請求項２３のコンジュゲートをコードするポリヌクレオチ
    ド。
  29. 【請求項２９】 ペプチド配列が配列番号：３、４、９、及び１７〜１１１
    からなる群から選択される請求項１に記載のコンジュゲート。
  30. 【請求項３０】 ペプチド配列が配列番号：９である請求項２９に記載のコ
    ンジュゲート。
  31. 【請求項３１】 治療用物質の消失半減期を延長する方法であって、血漿タ
    ンパク質結合能力のある設計されたアミノ酸配列を有するペプチドに物質をコン
    ジュゲートすることを含み、コンジュゲートされた物質の消失半減期がコンジュ
    ゲートされていない治療用物質のものを超える方法。
  32. 【請求項３２】 ｉ）配列 Trp1-Glu1-Ala1-Asp1-Cys1-Ala2-Trp2-His-Leu1 -Gly-Glu2-Leu2-Val-Trp3-Cys2-Thr-Pro-Met-Glu3-Phe (配列番号：18)を含む；
    又は ｉｉ）インビトロアッセイでＩｇＧ-Ｆｃ結合について配列番号：18 と競合し、
    次の： Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa9 -Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13 (配列番号：16)（ここで Xaa4 はSer, Arg, 又はAsp
    ； Xaa5 は Ala, Ser, 又は Thr；Xaa6 は Trp, Tyr；Xaa7 は His, Trp；Xaa5
    は Leu 又は Met；及び Xaa9 は Glu, Ser, Thr 又は Valである）に従って置換
    された配列番号：18の１から６のアミノ酸を有し；及び ｉｉｉ）ｉｉ）のペプチドを含む、 ペプチド。
  33. 【請求項３３】 次の式：Xaai-Cys1-Xaaj-Cys2-Xaak（ここで Xaai は欠い
    ている、又は１から４のアミノ酸であり；Xaaj は９のアミノ酸であり、Xaak は
    欠いている、又は１から５のアミノ酸である）を有する請求項３２に記載のペプ
    チド。
  34. 【請求項３４】 約１ＴＭ未満のＩｇＧ-Ｆｃに対するＩＣ５０を有する請
    求項３２に記載のペプチド。
  35. 【請求項３５】 約１００ｎＭ未満のＩｇＧ-Ｆｃに対するＩＣ５０を有す
    る請求項３４に記載のペプチド。
  36. 【請求項３６】 約１０ｎＭ未満のＩｇＧ-Ｆｃに対するＩＣ５０を有する
    請求項３５に記載のペプチド。
  37. 【請求項３７】 請求項３２のペプチドをコードする単離されたポリヌクレ
    オチド。
  38. 【請求項３８】 請求項３２のペプチドをコードする単離されたポリヌクレ
    オチドの補体。
  39. 【請求項３９】 インビトロアッセイでＩｇＧ-Ｆｃ結合について、Trp1-Gl
    u1-Ala1-Asp-Cys1-Ala2-Trp2-His-Leu1-Gly-Glu2-Leu2-Val-Trp3-Cys2-Thr-Pro-
    Met-Glu3-Phe (配列番号：18) と競合し、式 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-Xaa5-Xa
    a6-Xaa7-Xaa8-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13 (配列
    番号：14)（ここで Xaa(l-4) は欠いているか又は１から４のアミノ酸であり；X
    aa5 は Ala, Ser, 又は Thr からなる群から選択され；Xaa6 は Trp 又は Tyr
    からなる群から選択され； Xaa7 は His 又は Trp からなる群から選択され；Xa
    a8 は Leu 又は Met からなる群から選択され；及び Xaa(9-13) は１から５のア
    ミノ酸である）を有する１１から２０のアミノ酸を有するペプチド。
  40. 【請求項４０】 請求項３９のペプチドをコードする単離されたポリヌクレ
    オチド。
  41. 【請求項４１】 請求項３９のペプチドをコードする単離されたポリヌクレ
    オチドの補体。
  42. 【請求項４２】 治療用又は診断用物質とコンジュゲートするペプチドであ
    って、前記ペプチドが血漿タンパク質結合能力のある設計されたアミノ酸配列を
    有し、該コンジュゲートの消失半減期がコンジュゲートしていない治療用又は診
    断用物質のものを超えるペプチド。
  43. 【請求項４３】 ｉ）配列 (Xaa)5-Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-
    Leu-Trp-(Xaa)4 （ここで Xaa はアミノ酸である）を含む、又は ｉｉ）インビトロアッセイでヒト血清アルブミン結合について、配列 (Xaa)5-As
    p-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-G1y-Cys-Leu-Trp-(Xaa)4 （ここで Xaa はアミノ酸
    である）を有するペプチドと競合し、又は ｉｉｉ）ｉｉ）の配列を含む、 ペプチド。
  44. 【請求項４４】 ペプチド配列が請求項４３のペプチドである請求項１に記
    載のコンジュゲート。
  45. 【請求項４５】 配列 Asp-Leu-Cys-Leu-Arg-Asp-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp (配
    列番号：z1)を有するペプチド。
  46. 【請求項４６】 配列 Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp (配
    列番号：z2)を有するペプチド。
  47. 【請求項４７】 配列 Met-Glu-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu
    -Trp-Glu-Asp (配列番号：z3)を有するペプチド。
  48. 【請求項４８】 配列 Gln-Arg-Leu-Met-Glu-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp
    -Gly-Cys-Leu-Trp-Glu-Asp-Asp-Phe (配列番号：z4)を有するペプチド。
  49. 【請求項４９】 配列 Gln-Gly-Leu-Ile-Gly-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp
    -Gly-Cys-Leu-Trp-Gly-Asp-Ser-Val (配列番号：z5)を有するペプチド。
  50. 【請求項５０】 配列 Gln-Gly-Leu-Ile-Gly-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp
    -Gly-Cys-Leu-Trp-Gly-Asp-Ser-Val-Lys (配列番号：z6)を有するペプチド。
  51. 【請求項５１】 配列 Glu-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp
    -Glu-Asp-Asp (配列番号：z7)を有するペプチド。
  52. 【請求項５２】 配列 Arg-Leu-Met-Glu-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly
    -Cys-Leu-Trp-Glu-Asp-Asp (配列番号：z8)を有するペプチド。
  53. 【請求項５３】 配列 Met-Glu-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu
    -Trp-Glu-Asp-Asp (配列番号：z9)を有するペプチド。
  54. 【請求項５４】 配列 Met-Glu-Asp-Ile-Cys-Leu-Pro-Arg-Trp-Gly-Cys-Leu
    -Trp-Glu-Asp (配列番号：zlO)を有するペプチド。
  55. 【請求項５５】 配列 Arg-Leu-Met-Glu-Asp-Ile-Cys-Leu-Ala-Arg-Trp-Gly
    -Cys-Leu-Trp-Glu-Asp-Asp (配列番号：z11)を有するペプチド。
  56. 【請求項５６】 ペプチド配列が請求項４４ないし５５の何れかのペプチド
    である請求項１に記載のコンジュゲート。
  57. 【請求項５７】 ｉ）配列 (Xaa)x-Phe-Cys-Xaa-Asp-Trp-Pro-Xaa-Xaa-Xaa-
    Ser-Cys-(Xaa)z （ここで Xaa はアミノ酸である）を含み、又は ｉｉ）インビトロアッセイでヒト血清アルブミン結合について、配列 (Xaa)x-Ph
    e-Cys-Xaa-Asp-Trp-Pro-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Cys-(Xaa)z（ここで Xaa はアミノ酸
    である）を有するペプチドと競合し、又は ｉｉｉ）ｉｉ）の配列を含む、 ペプチド。
  58. 【請求項５８】 ｉ）配列 (Xaa)x-Val-Cys-Tyr-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Cys-Phe-
    (Xaa)z （ここで Xaa はアミノ酸である）を含み、又は ｉｉ）インビトロアッセイでヒト血清アルブミン結合について、配列 (Xaa)x-Va
    l-Cys-Tyr-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Cys-Phe-(Xaa)z（ここで Xaa はアミノ酸である）
    を有するペプチドと競合し、又は ｉｉｉ）ｉｉ）の配列を含む、 ペプチド。
  59. 【請求項５９】 ｉ）配列 (Xaa)x-Cys-Tyr-Xaa1-Pro-Gly-Xaa-Cys-(Xaa)z
    （ここで Xaa はアミノ酸であり、Xaa1 は Ile, Phe, Tyr 及び Val からなる群
    から選択される）を含み、又は ｉｉ）インビトロアッセイでヒト血清アルブミン結合について、配列 (Xaa)x-Cy
    s-Tyr-Xaa1-Pro-Gly-Xaa-Cys-(Xaa)z（ここで Xaa はアミノ酸であり、Xaa1 は
    Ile, Phe, Tyr 及び Val からなる群から選択される）を有するペプチドと競合
    し、又は ｉｉｉ）ｉｉ）の配列を含む、 ペプチド。
  60. 【請求項６０】 ペプチド配列が請求項５７、５８又は５９の何れかのペ
    プチドである請求項１に記載のコンジュゲート。
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