KR101946789B1

KR101946789B1 - 이황화결합 이성질화효소 신호 펩타이드를 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101946789B1
Application number: KR1020180010055A
Authority: KR
Inventors: 김영목; 강석찬; 김완섭; 엄기안
Original assignee: (주)휴온스
Priority date: 2018-01-26
Filing date: 2018-01-26
Publication date: 2019-02-12
Also published as: CN111655858A; JP2021511825A; US20210108214A1; EP3744848A4; WO2019147055A1; JP7193552B2; EP3744848A1

Abstract

본 발명은 이황화결합 이성질화효소 신호 펩타이드(Disulfide Bond Isomerase signal peptide)를 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 본 발명의 재조합 벡터를 이용할 경우, 대장균 발현 시스템을 통하여 메티오닌으로 아미노산 서열이 시작되지 않는 단백질을 생산할 수 있다는 장점이 있다. 이에 상업적으로 이용하기 위하여 글리코실화 반응 등과 같은 추가적인 과정을 거쳐야 할 필요가 없으므로, 향후 질병 치료제 개발 등의 다양한 목적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

이황화결합 이성질화효소 신호 펩타이드를 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도 {Recombination vector comprising Disulfide Bond Isomerase signal peptide and use thereof}

본 발명은 이황화결합 이성질화효소 신호 펩타이드(Disulfide Bond Isomerase signal peptide)를 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도에 관한 것이다.

연구, 치료, 또는 기타 상업적 목적 등의 다양한 목적으로 재조합 단백질을 대량 생산하기 위하여 현재 다양한 벡터와 숙주들이 이용되고 있는데, 그 중에서도 대장균 발현시스템을 이용하여 필요한 단백질을 발현시킨 후 이를 정제하는 방법은 적은 비용과 노력으로 대량의 단백질을 얻을 수 있다는 장점을 가지고 있어 유용하게 활용되고 있다.

그러나 포유동물과 세균의 세포내 환경 차이가 있기 때문에 이처럼 대장균 시스템을 이용하여 여러 종류의 인간 단백질을 얻고자 할 때에는 각각의 단백질에 대하여 특정한 발현 및 정제조건을 확립할 필요가 있다. 특히, 대장균에서 생산되는 모든 단백질의 아미노산 서열은 메티오닌(methionine; Met)으로 시작하는데, 이에 반하여, 인체 내에서 발견되거나 고등화된 생물체에서 발현되는 단백질은 단백질 번역 후 수정작업(Post-translational modification)을 통해 단백질 분해효소에 의해 분해되어 활성화되거나 당사슬을 붙이는 당화작용(glycosylation), 인산화작용, 아세틸화, 카르복시화 등 다양한 단백질 변형작업이 이루어진다. 따라서 상업화된 많은 단백질의 아미노산 서열은 메티오닌으로 시작하지 않는바, 이에 따라 대장균에서 생산되는 단백질은 효소반응에 의한 단백질 절단 등과 같은 추가적인 과정을 거쳐야한다는 단점이 있다.

한편, 티모신 베타 4 (Thymosin Beta 4; TB４)는 혈관신생, 상처치유, 및 모발성장 등에 효능을 발휘하는 것으로 알려져, 현재 허혈성 심장질환, 각막 손상, 안구질환 및 수포성 표피박리증 등 다양한 질병의 치료제로 사용하기 위한 임상 실험 및 FDA 승인 심사가 진행 중에 있으며, 탈모 치료제로의 개발도 예상되고 있다.

이처럼 티모신 베타 4는 다양한 질병의 치료제로서 이용가능성이 높기 때문에 향후 치료용 펩타이드로 출시되면 막대한 수요가 있을 것으로 예상되고 있으나, 합성에 의해 상기 펩타이드를 생산할 경우에는 고가의 생산비가 요구되고, 대장균과 같은 숙주(호스트 균주)에서 발현시킬 경우는 메티오닌으로 시작되는 단백질 서열을 수정하기 위하여 생산 후 효소반응에 의해 절단하는 등의 추가적인 작업이 필요하다는 문제점이 있으나, 아직 이에 대한 연구가 미비한 실정이다.

한국등록특허 제10-0746993호

본 발명자들은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 이황화결합 이성질화효소 신호 펩타이드(Disulfide Bond Isomerase signal peptide)를 포함하는 재조합 벡터를 이용할 경우, 대장균 발현 시스템을 통해 메티오닌이 아닌 원하는 아미노산 서열로부터 시작되는 단백질을 생산할 수 있다는 것을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 이황화결합 이성질화효소 신호 펩타이드(Disulfide Bond Isomerase signal peptide)를 암호화하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 이황화결합 이성질화효소 신호 펩타이드(Disulfide Bond Isomerase signal peptide) 및 티모신 베타 4(Thymosin Beta 4)를 암호화하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환 된 형질전환체를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 대장균을 형질전환한 후 배지에 배양하는 단계를 포함하는 티모신 베타 4(Thymosin Beta 4) 단백질의 생산방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 이황화결합 이성질화효소 신호 펩타이드(Disulfide Bond Isomerase signal peptide)를 암호화하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 이황화결합 이성질화효소 신호 펩타이드는 서열번호 10, 12, 14, 및 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 재조합 벡터는 티모신 베타 4(Thymosin Beta 4)를 암호화하는 염기서열을 더 포함하는 재조합 벡터일 수 있으며, 상기 티모신 베타 4는 서열번호 2의 염기서열로 암호화되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 재조합 벡터는 서열번호 3으로 표시되는 EcoRI, 서열번호 4로 표시되는 Tac 프로모터(promoter), 서열번호 5로 표시되는 Lac 오퍼레이터(operator), 및 서열번호 6으로 표시되는 XhoI로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 이황화결합 이성질화효소 신호 펩타이드(Disulfide Bond Isomerase signal peptide)를 암호화하는 염기서열 및 티모신 베타 4(Thymosin Beta 4)를 암호화하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환 된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 형질전환체는 대장균일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 a) 본 발명의 재조합 벡터를 제작하는 단계; b) 상기 재조합 벡터로 대장균을 형질전환 하는 단계; 및 c) 상기 대장균을 배지에 배양하는 단계를 포함하는, 메티오닌이 아닌 아미노산 서열로 시작되는 것을 특징으로 하는 티모신 베타 4(Thymosin Beta 4) 단백질의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 이황화결합 이성질화효소 신호 펩타이드(Disulfide Bond Isomerase signal peptide)를 포함하는 재조합 벡터를 이용할 경우, 대장균 발현 시스템을 통해 메티오닌이 아닌 아미노산 서열로부터 시작되는 단백질을 생산할 수 있는바, 이에 따라 상업적으로 이용하기 위하여 단백질 분해 효소(Protease) 처리 등과 같은 추가적인 과정을 거쳐야 할 필요가 없다는 장점이 있다. 특히, 그동안 티모신 베타 4는 다양한 질병의 치료제로서 이용가능성이 높음에도 불구하고, 숙주(호스트 균주)에서 발현 될 경우, 세포 내 단백질 분해효소에 의해 분해되어 생산이 불가능하다는 문제점을 갖고 있었다. 본 발명은 대장균 발현 시스템을 통하여 상기 티모신 베타 4의 생산을 가능하게 하였는바. 향후 허혈성 심장질환, 각막 손상, 안구질환 및 수포성 표피박리증 뿐만이 아니라 탈모 치료제 개발에 있어서 유용하게 활용될 수 있으며, 또한, 본 발명의 대장균 발현 시스템은 골다공증치료에 이용하는 부갑상선호르몬(Parathyroid hormone), 인성장 호르몬(human growth hormone), 과립구집락 자극인자(Granulocyte-colony stimulating factor, GCSF) 등 다양한 치료용 단백질 생산에 적용할 수 있어 유요한 기술로 확대 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 합성된 플라스미드인 DsbC-SP TB4의 DNA 서열과 Reference DNA Sequence를 얼라인먼트(Alignment)하여 확인한 결과를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 DsbC-SP TB4의 벡터 맵(vector map)을 나타낸 것이다.
도 3는 형질 전환된 대장균주 BL21의 성장 정도를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 4는 IPTG 1.0 mM로 티모신 베타 4(TB４) 단백질의 발현을 유도한 결과를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 5은 SDS-PAGE로 형질전환 된 타겟 단백질의 Band를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명자들은 이황화결합 이성질화효소 신호 펩타이드(Disulfide Bond Isomerase signal peptide)를 포함하는 재조합 벡터를 이용할 경우, 대장균 발현 시스템을 통해 메티오닌으로 아미노산 서열이 시작되지 않는 단백질을 생산할 수 있다는 것을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 이황화결합 이성질화효소 신호 펩타이드(Disulfide Bond Isomerase signal peptide)를 암호화하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 이황화결합 이성질화효소 신호 펩타이드(Disulfide Bond Isomerase signal peptide)의 카복실 말단(Carboxyl terminus)에 티모신 베타 4(Thymosin Beta 4)가 이어져 있는 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 "벡터(vector)"란, DNA 재조합 실험에 있어서 목적하는 DNA 단편을 숙주균 등에 도입시켜 주고 증식할 수 있는 DNA를 지칭하며, 클로닝 운반체 (cloning vehicle)라고도 하는데, 벡터(vector) DNA는 제한효소 등으로 절단하여 개환하고, 여기에 목적으로 하는 DNA 단편을 삽입하여 연결해 숙주균에 도입시킨다. 목적 DNA 단편을 연결한 벡터 DNA는 숙주균이 증식됨에 따라 복제하여 균의 분열과 더불어 각 낭세포로 분배되어 목적 DNA 단편을 대대로 유지하여 이어져 나가며, 플라스미드(plasmid), 파지 염색체를 주로 사용한다.

본 발명에서 "플라스미드(plasmid)"란, 세포내에서 세대를 통하여 안정하게 자손에게 유지, 전달되나 염색체와는 별개로 존재하며 자율적으로 증식하는 유전자의 총칭하는데, 다만 진핵세포의 미토콘드리아나 엽록체 등에 포함되는 DNA는 일반적으로 오르가넬 DNA라고 불리며 이와 구별된다. 상기 유전자의 존재는 보통 세포의 생존에 있어서 반드시 필수적인 것은 아니지만 세균 세포에서는 접합전달(F인자), 항생물질 등에 대한 저항성(R인자), 항균물질(박테리오신)의 합성(콜리신인자) 등의 기능을 갖는다. 또한, 토양세균에 존재하는 Ti 플라스미드와 같이 식물 세포를 종양화 하는 것도 있으며, 자기 자신이 전달기구를 갖지 않더라도 전달성 인자가 공존하면 함께 전달되는 경우, 혹은 공존하더라도 전달되지 않는 것 등 여러 가지 형태가 발견되고 있다. 조직변환 DNA실험(유전자 조작기술)에서의 벡터로 자주 사용되고 있다.

본 발명에서 "프로모터(promoter)"란, 구조유전자(gene)의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription) 되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서(enhancer) 등으로 이루어져 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질 들은 세포 내에서 일정 농도를 유지하여야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다. 이에 반하여 평시에는 역할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질 들은 해당 구조유전자의 발현을 유도하는 조직 특이 프로모터(tissue specific promoter) 또는 유도성 프로모터 (inducible promoter)가 연결되어 있다. 즉 조직 특이 프로모터는 생물체의 발달 과정에서, 유도성 프로모터는 주변으로부터의 환경적 요인에서 오는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화된다.

본 발명에서 "오퍼레이터(operator)"란, 작동유전자라고도 불리며, 세균의 유전자 조절 시 특정 유전자의 발현을 조절하는 역할을 담당한다. 주로 구조 유전자의 옆에 위치하고 있으며 특정한 상황에서 필요한 유전자가 발현되거나 발현되지 않도록 조절하는 역할을 한다.

본 발명에서 "재조합 벡터"란 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미하며, 보다 구체적으로, 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결(operably linked)되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 유전자 염기 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는, 이 기술 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 의해 제조된 재조합 벡터로 형질전환 된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 "형질전환(transformation)"이란, 외부로부터 주어진 유전물질인 DNA에 의해 개체 또는 세포의 형질이 유전적으로 변화하는 것을 의미한다.

본 발명의 다른 양태로서, a) 본 발명의 재조합 벡터를 제작하는 단계; b) 상기 재조합 벡터로 대장균을 형질전환 하는 단계; 및 c) 상기 대장균을 배지에 배양하는 단계를 포함하는, 형질전환 단백질 생산방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서는, 신호 펩타이드(Signal Peptide)인 DsbC-SP(Disulfide Bond Isomerase signal peptide)의 카복실 말단(Carboxyl terminus; C-term)쪽에 티모신 베타 4(Thymosin Beta 4; TB４)가 이어져 있는 DNA 서열(Reference DNA Sequence)과 pGE 벡터를 이용하여 플라스미드를 제작하였다(실시예 1 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 제작된 플라스미드를 이용하여 형질전환 된 대장균주 BL21 및 DH5α를 제작하였으며(실시예 2 참조), 상기 형질전환 된 대장균주 BL21의 성장을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 형질전환 된 대장균주에서 TB4이 발현됨을 확인하였다(실시예 4 참조).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 플라스미드 제작

티모신 베타 4(Thymosin Beta 4; TB４)를 발현하도록 하는 플라스미드(Plasmid)를 합성하고자, 신호 펩타이드(Signal Peptide)인 DsbC-SP(Disulfide Bond Isomerase C signal peptide)의 카복실 말단(Carboxyl terminus; C-term)쪽에 TB４가 이어져 있는 DNA 서열(Reference DNA Sequence)과 pGE 벡터(vector)를 이용하여, 벡터에 상기 DNA 서열이 삽입된 플라스미드를 합성하였다.

플라스미드 합성을 위한 염기서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

염기서열		서열번호
DsbC - SP	ATGAAGAAAGGTTTTATGTTATTTACCTTGTTGGCAGCGTTTTCAGGCTTTGTTCAGGCT	서열번호 1
TB4	TCCGACAAACCCGATATGGCTGAGATCGAGAAATTCGATAAGTCGAAACTGAAGAAGACAGAGACGCAAGAGAAAAATCCACTGCCTTCCAAAGAAACGATTGAACAGGAGAAGCAAGCAGGCGAATCGTAA	서열번호 2
EcoRI	GAATTC	서열번호 3
Tac Promoter	TTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATG	서열번호 4
Lac Operator	TTGTGAGCGGATAACAA	서열번호 5
XhoI	CTCGAG	서열번호 6
DsbC - SP TB4	ATGAAGAAAGGTTTTATGTTATTTACCTTGTTGGCAGCGTTTTCAGGCTTTGTTCAGGCTTCCGACAAACCCGATATGGCTGAGATCGAGAAATTCGATAAGTCGAAACTGAAGAAGACAGAGACGCAAGAGAAAAATCCACTGCCTTCCAAAGAAACGATTGAACAGGAGAAGCAAGCAGGCGAATCGTAA	서열번호 7

상기 합성된 플라스미드의 DNA 서열과 Reference DNA Sequence를 얼라인먼트(Alignment)하여 일치함을 확인한 결과(Http://Multalin.toulouse.inra.fr/), 도 1에 나타낸 바와 같이, 100% 일치하였다.

또한, 도 2에 나타낸 바와 같은 벡터 맵(vector map)을 확인할 수 있었으며, 합성된 플라스미드는 "DsbC-SP TB4"로 명명하였다.

실시예 2. 형질전환 된 대장균주의 제작

상기 실시예 1의 방법에 따라 제작된 플라스미드를 이용하여, 하기 실험을 수행하여 형질전환 된 대장균주를 제작하였다.

2-1. LB 배지의 준비

LB 배지(Luria Bertani media broth; LB Broth)를 준비하기 위하여, 3차수 800 mL을 2 L 비커(beaker)에 담고, LB Broth 25.03 g을 측정하여, 상기 2 L beaker에 넣은 후, 완전히 녹을 때까지 교반하였다. 그 다음, 3차수를 추가하여 최종 부피가 1 L가 되도록 맞추고, 2 L 병(bottle)에 옮겨 담아, 121℃, 30 분의 조건으로 멸균하였다.

2-2. 카나마이신을 첨가한 LB 한천평판의 준비

LB 한천평판(Agar Plate)을 준비하기 위하여, 3차수 300 mL을 2 L 비커(beaker)에 담고, LB Agar 19.98 g을 상기 2 L beaker에 넣은 후, 완전히 녹을 때까지 교반하였다. 그 다음, 3차수를 추가하여 최종 부피가 500 mL가 되도록 맞추고, 2 L 병(bottle)에 옮겨 담아 121℃, 30 분의 조건으로 멸균하였다. 그 다음, 고압증기멸균기(Autoclave)의 온도가 40~50℃일 때 꺼내어, 클린 벤치(Clean Bench)로 옮겨 농도가 50 μg/mL이 되도록 카나마이신(Kanamycin)을(Stock 농도 50 mg/mL) 500 μL 첨가하였다. LB 한천 용액(Agar solution)을 페트리 접시(Petri Dish)에 약 20 mL씩 분주하고, Petri dish의 LB Agar가 굳을 때까지 Clean Bench 안에서 건조시킨 다음, 충분히 건조된 Petri dish는 랩으로 싸서 최대 1 개월간 냉장보관(2~8℃)하였다.

2-3. 단백질 발현을 위한 형질전환 대장균주 제작

먼저, 상기 실시예 1의 방법으로 합성된 플라스미드(DsbC-SP TB4)를 이용해 타켓 단백질 발현을 위하여 형질 전환된 대장균주 BL21(BL21/DsbC-SP TB4)를 제작하고자, User Protocol TB009(Novagen)에 따라 형질전환을 했으며, 상기 형질 전환된 균주배양은 Kanamycin이 50 μg/mL으로 첨가된 LB Agar Plate에 스프레딩(Spreading)하여, 37℃로 설정된 인큐베이터(Incubator)에서 밤새 (14 시간) 배양하였다.

상기 형질 전환된 대장균주 BL21이 Kanamycin(50 μg/mL)이 첨가된 LB Agar Plate에서 콜로니(Colony)가 생성된 것을 확인하고, 루프 겸 니들(Loop and Needle)로 BL21/DsbC-SP TB4의 단독 콜로니(Single Colony)를 채집하였다. Kanamycin(50 μg/mL)이 첨가된 LB Agar Plate는 파라필름(Parafilm)으로 밀봉(Sealing)하여 최대 1 개월간 냉장보관(2~8℃)하였다.

그 다음, 상기 채집한 BL21/DsbC-SP TB4을 LB Broth 4 mL이 담긴 14 mL Round-bottom Tube에 접종하고, 37℃, 200 rpm으로 설정한 진탕배양기(Shaking Incubator)에서 밤새 (14 시간) 배양하고, 배양액 200 μL를 LB Broth 100 mL이 담긴 250mL 플라스크(Flask)에 접종한 후, 30분 간격으로 OD₆₀₀값을 측정하여 OD₆₀₀=0.2가량 되었을 때 배양을 종료하였다. 4000rpm, 15분 간 원심분리(Centrifuge)하여 대장균주를 회수하였는데, OD₆₀₀=1.0이 되도록 하는 부피를 하기 계산식과 같이 계산하였다.

(OD ₆₀₀ =1.0이 되는 부피) = (배양 종료 시 부피) x (배양 종료시점 OD ₆₀₀ 값)

멸균된 글리세롤(Glycerol)이 15%가 되도록 넣은 LB Broth를 위의 식에 따라 계산된 부피만큼 넣어 펠릿(Pellet)을 재부유(Resuspension)한 다음, 200μL씩 멸균된 마이크로튜브(Microtube)에 앨리쿼트(Aliquot)하여 Deep Freezer(-80℃~-70℃) 또는 LN₂ Tank(-196℃)에 보관하였다.

그 다음, 동일한 방법으로 DsbC-SP TB4 플라스미드를 이용해 플라스미드 DNA의 대량생산을 위하여 형질 전환된 대장균주 DH5α(DH5α/DsbC-SP TB4)를 제작한 결과, Colony가 생성된 Plate를 확보하였다.

이와 같이 제작된 DH5α/DsbC-SP TB4는 상기 BL21/DsbC-SP TB4의 단독 콜로니와 동일한 과정을 거쳐서 Deep Freezer(-80℃~-70℃) 또는 LN₂ Tank(-196℃)에 보관하였다.

실시예 3. 제작된 대장균주의 성장 확인

상기 실시예 2의 방법에 따라 제작된 대장균주 BL21의 성장을 확인하기 위하여, LB Broth 20 mL과 Kanamycin stock(50 mg/ml) 20 μL을 50 mL 코니칼 튜브(Conical Tube)에 담았다. Deep Freezer에 보관되어있던 DsbC-SP TB4 1 Vial을 꺼낸 후, 37℃로 설정된 항온 수조(Water Bath)에서 2~3 분간 상기 Vial을 해동(Thawing)하였다. LB Broth 및 Kanamycin이 담긴 50 mL 상기 Conical tube에 Thawing한 세포를 접종하고, 37℃ Shaking Incubator에서 200 rpm으로 3 시간 배양하였다. 그 다음, 배양액 2.5 mL을 LB Broth 250 mL이 담긴 Baffled Erlenmeyer Flask에 접종하고, 접종 이후부터 1 시간마다 배양액 1 mL을 표본추출(Sampling)하였다. 상기 추출한 배양액의 OD₆₀₀값을 UV 분광 광도계(Spectrophotometer)로 측정하고, 측정된 OD₆₀₀값이 0.8이상일 경우, 희석하여 재 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 합성된 플라스미드(DsbC-SP TB4)를 이용해 형질 전환된 대장균주 BL21(BL21/DsbC-SP TB4)의 배양 6시간 째, OD₆₀₀값이 약 2.5까지 성장하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 제작된 대장균주에서 TB4의 발현 확인

4-1. DsbC-SP TB4의 발현 확인

상기 실시예 2의 방법에 따라 제작된 대장균주에서 티모신 베타 4(TB４) 단백질의 발현을 확인하기 위하여, DsbC-SP TB4 세포 Stock을 Kanamycin(50 μg/mL)이 첨가된 LB 배지 20 mL에 해동하였다. 그 다음, 37℃, 200 rpm으로 설정된 진탕배양기(Shaking Incubator)에서 3시간 배양한 다음(1차 종배양액), 상기 1차 종배양액을 Kanamycin(50 μg/mL)이 첨가된 LB 배지 20 mL에 1/10,000로 희석(Dilution)한 후, 밤새 배양하였다(2차 종배양액). LB 250 mL에 상기 2차 종배양액 2.5 mL을 접종하고, 37℃, 200 rpm으로 설정된 Shaking Incubator에서 다시 배양하여 1시간마다 OD₆₀₀값을 측정하였다.

상기 측정한 OD₆₀₀값이 0.6에 도달하면 IPTG를 1.0 mM이 되도록 첨가하여 Induction하였고, Induction이후 3시간 째 배양을 종료하였다. 배양액 중 10 mL을 4,000 rpm에 30 분간 원심분리(Centrifuge)하여 세포를 회수하였고, User Guide B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent에 따라 펠릿(Pellet)을 B-PER로 파쇄한 다음, 15,000 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 상등액만 분리하였다. 상기 분리한 상등액을 4x Laemmli Sample Buffer와 1:3의 비율로 섞어, SDS-PAGE용 표본(Sample)을 만들어 젤(Gel)에 로딩(Loading)한 후, 200V로 30 분간 전기영동하고, 30 분간 쿠마시 염색(Coomassie Staining) 후에 Destaining 하였다. 그 후, Gel-doc을 이용해 타켓 단백질 밴드를 분석하였다.

단백질의 발현을 유도한 경우에, BL21/DsbC-SP TB4의 성장 정도는 도 4에 나타낸 바와 같다.

4-2. DsbC-SP TB4의 N-term Sequencing

DsbC-SP TB4 세포 Stock을 Kanamycin(50 μg/mL)이 첨가된 LB 배지 20 mL에 해동하였고, 37℃, 200 rpm으로 설정된 진탕배양기에서 3시간 배양(1차 종배양액)하였다. 그 다음, 상기 1차 종배양액을 Kanamycin(50 μg/mL)이 첨가된 LB 배지 20 mL에 1/10,000로 희석 후, 밤새 배양(2차 종배양액)하였다. LB 250 mL에 상기 2차 종배양액 2.5 mL을 접종하고, 37℃, 200 rpm으로 설정된 진탕배양기에서 다시 배양하여 1시간마다 OD₆₀₀값을 측정하였다.

상기 측정한 OD₆₀₀값이 0.6에 도달하면 IPTG를 1.0 mM이 되도록 첨가하여 Induction하였고, Induction이후 3시간 째 배양을 종료하였다. 배양액 중 10 mL을 4,000 rpm에 30 분간 원심분리(Centrifuge)하여 세포를 회수하였고, User Guide B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent에 따라 펠릿(Pellet)을 B-PER로 파쇄한 다음, 15,000 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 상등액만 분리하였다. 상기 분리한 상등액을 4x Laemmli Sample Buffer와 1:3의 비율로 섞어, SDS-PAGE용 표본(Sample)을 만들어 젤(Gel)에 로딩(Loading)한 후, 200V로 30 분간 전기영동 하였다. PVDF Membrane에 Transfer 하고 Ponceau로 멤브레인을 염색하여 형질전환 된 타겟 단백질의 Band를 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, TB4 Standard와 같은 위치에 Induction된 Band가 나타나는 것을 확인하였으며, 각 Lane Description은 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.

M	Marker
1	Gly-TB4(Y-20150303)
2	Induction at OD 0.6 with IPTG 1.0mM

또한, 상기 확인된 Expected Target Band Size(5~6kDa)에 해당하는 단백질 N-term의 10개 아미노산에 대한 서열을 분석한 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, WT(wild type)_TB4의 것과 일치하였다.

Sample No 1 : 20160527 _ 5kDa
예측	S-D-K-P-D-M-A-E-I-E
결과	S-D-K-P-D-M-A-E-I-E
N-term Sequencing결과	Expected Target Size Band의 N-term 서열이 TB4의 것과 일치

한편, WT_TB4의 아미노산 서열은 하기 표 4에 나타낸 바와 같으며, 특히 Bold 체로 표기된 부분은 N-term 아미노산 10개의 서열을 의미한다.

WT_TB4의 아미노산 서열	서열번호
SDKPDMAEIE KFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGES	서열번호 8

상기로부터, 상기 실시예 2의 방법에 따라 제작된 대장균주은 WT_TB4의 서열을 지닌 플라스미드로 형질전환 되었고, WT_TB4를 발현하는 균주임을 알 수 있다.

참고로, 본 발명의 이황화결합 이성질화효소 신호 펩타이드의 염기서열 및 아미노산 서열은 하기 표 5에 나타내었으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

서열명	구 분	서 열	서열번호
DsbC -SP1	염기서열	5’-atg aag aaa ggt ttt atg tta ttt acc ttg ttg gca gcg ttt tca ggc ttt gtt cag gct-3’	서열번호 9
DsbC -SP1	아미노산서열	NH₂-MKKGFMLFTLLAAFSGFVQA-COOH	서열번호 10
DsbC -SP2	염기서열	5‘-atg aaa aaa att att aag gca tcg gta tta ctt ctt tca tta agt acc gcc ttc acg atg aat gcc gag 3‘	서열번호 11
DsbC -SP2	아미노산서열	NH₂-MKKIIKASVLLLSLSTAFTMNAE-COOH	서열번호 12
DsbC -SP3	염기서열	5‘- atg cgg aca aaa tta ctt ggg gcg ctg atg gtg ttc ggg att att acc ggc acg gct cat gcg tca-3‘	서열번호 13
DsbC -SP3	아미노산서열	NH₂-MRTKLLGALMVFGIITGTAHAS-COOH	서열번호 14
DsbA - SP	염기서열	5’-atg aaa aag att tgg ctg gcg ctg gct ggt tta gtt tta gcg ttt agc gca tcg gcg gcg-3’	서열번호 15
DsbA - SP	아미노산서열	NH₂-MKKIWLALAGLVLFSASAA-COOH	서열번호 16

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Huons Co., Ltd. Huons Global Co., Ltd. <120> Recombination vector comprising Disulfide Bond Isomerase signal peptide and use thereof <130> MP17-244 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DsbC-SP <400> 1 atgaagaaag gttttatgtt atttaccttg ttggcagcgt tttcaggctt tgttcaggct 60 60 <210> 2 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB4 <400> 2 tccgacaaac ccgatatggc tgagatcgag aaattcgata agtcgaaact gaagaagaca 60 gagacgcaag agaaaaatcc actgccttcc aaagaaacga ttgaacagga gaagcaagca 120 ggcgaatcgt aa 132 <210> 3 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRI <400> 3 gaattc 6 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tac Promoter <400> 4 ttgacaatta atcatcggct cgtataatg 29 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac Operator <400> 5 ttgtgagcgg ataacaa 17 <210> 6 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XhoI <400> 6 ctcgag 6 <210> 7 <211> 192 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DsbC-SP TB4 <400> 7 atgaagaaag gttttatgtt atttaccttg ttggcagcgt tttcaggctt tgttcaggct 60 tccgacaaac ccgatatggc tgagatcgag aaattcgata agtcgaaact gaagaagaca 120 gagacgcaag agaaaaatcc actgccttcc aaagaaacga ttgaacagga gaagcaagca 180 ggcgaatcgt aa 192 <210> 8 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WT_TB4 <400> 8 Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys 1 5 10 15 Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu 20 25 30 Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser 35 40 <210> 9 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DsbC-SP1 <400> 9 atgaagaaag gttttatgtt atttaccttg ttggcagcgt tttcaggctt tgttcaggct 60 60 <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DsbC-SP1 <400> 10 Met Lys Lys Gly Phe Met Leu Phe Thr Leu Leu Ala Ala Phe Ser Gly 1 5 10 15 Phe Val Gln Ala 20 <210> 11 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DsbC-SP2 <400> 11 atgaaaaaaa ttattaaggc atcggtatta cttctttcat taagtaccgc cttcacgatg 60 aatgccgag 69 <210> 12 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DsbC-SP2 <400> 12 Met Lys Lys Ile Ile Lys Ala Ser Val Leu Leu Leu Ser Leu Ser Thr 1 5 10 15 Ala Phe Thr Met Asn Ala Glu 20 <210> 13 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DsbC-SP3 <400> 13 atgcggacaa aattacttgg ggcgctgatg gtgttcggga ttattaccgg cacggctcat 60 gcgtca 66 <210> 14 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DsbC-SP3 <400> 14 Met Arg Thr Lys Leu Leu Gly Ala Leu Met Val Phe Gly Ile Ile Thr 1 5 10 15 Gly Thr Ala His Ala Ser 20 <210> 15 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DsbA-SP <400> 15 atgaaaaaga tttggctggc gctggctggt ttagttttag cgtttagcgc atcggcggcg 60 60 <210> 16 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DsbA-SP <400> 16 Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Phe Ser Ala 1 5 10 15 Ser Ala Ala

Claims

서열번호 10, 12, 14, 및 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 이황화결합 이성질화효소 신호 펩타이드(Disulfide Bond Isomerase signal peptide)를 암호화하는 염기서열을 포함하는, 타겟 인간 단백질이 메티오닌이 아닌 아미노산 서열로 시작되도록 발현되는 대장균 발현 시스템용 재조합 벡터.
삭제
제1항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 인간의 티모신 베타 4(Thymosin Beta 4)를 암호화하는 염기서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제3항에 있어서,
상기 티모신 베타 4는 서열번호 2의 염기서열로 암호화되는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 서열번호 3으로 표시되는 EcoRI, 서열번호 4로 표시되는 Tac 프로모터(promoter), 서열번호 5로 표시되는 Lac 오퍼레이터(operator), 및 서열번호 6으로 표시되는 XhoI로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
서열번호 10, 12, 14, 및 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 이황화결합 이성질화효소 신호 펩타이드(Disulfide Bond Isomerase signal peptide)를 암호화하는 염기서열 및 인간의 티모신 베타 4(Thymosin Beta 4)를 암호화하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 티모신 베타 4가 메티오닌이 아닌 아미노산 서열로 시작되도록 발현되는 대장균 발현 시스템용 재조합 벡터.
삭제
제6항에 있어서,
상기 티모신 베타 4는 서열번호 2의 염기서열로 암호화되는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제6항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 서열번호 3으로 표시되는 EcoRI, 서열번호 4로 표시되는 Tac 프로모터(promoter), 서열번호 5로 표시되는 Lac 오퍼레이터(operator), 및 서열번호 6으로 표시되는 XhoI로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제1항, 제3항 내지 제6항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된 대장균.
삭제
a) 제1항, 제3항 내지 제6항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 제작하는 단계:
b) 상기 재조합 벡터로 대장균을 형질전환 하는 단계; 및
c) 상기 대장균을 배지에 배양하는 단계를 포함하는 인간의 티모신 베타 4(Thymosin Beta 4) 단백질의 생산방법으로서,
상기 인간의 티모신 베타 4 단백질은 메티오닌이 아닌 아미노산 서열로 시작되는 것을 특징으로 하는, 생산방법.