KR20150133824A - 세포의 선별 방법 - Google Patents

Abstract

미분화 세포가 혼입되거나 혼입 우려가 있는 분화 세포 집단으로부터, 미분화 세포를 제거 또는 저감시키는 방법으로서, 그 분화 세포 집단에 색소 표피-유래 인자를 접촉시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 의해 얻어지는 미분화 세포를 실질적으로 포함하지 않는 분화 세포 집단을 포함하는 세포 이식 요법제. 색소 표피-유래 인자를 포함하는, 미분화 세포의 아폽토시스 유도제. 상기 세포 이식 요법제와 상기 아폽토시스 유도제와의 병용.

Description

세포의 선별 방법 {CELL SORTING METHOD}

본 발명은 세포의 선별 방법, 보다 구체적으로는 미분화 세포가 혼입되거나 혼입 우려가 있는 분화 세포 집단으로부터, 미분화 세포를 제거 혹은 저감시킴으로써, 분화 세포를 선별 및/또는 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법을 위한 미분화 세포 제거제, 및 상기 방법에 의해 얻어지는, 종양형성 리스크가 없는 균일하고 안전한 분화 세포로 이루어지는 세포 이식 요법제에 관한 것이다.

재생 의료의 임상 응용이 연구되고 있는 요즈음, iPS 세포나 ES 세포와 같은 다능성 줄기 세포로부터 원하는 세포로 분화 유도하는 것이 활발히 행해지고 있다. 실제로, 슈타르가르트병 및 드라이형 노인성 황반 변성에 대한 ES 세포-유래 RPE (retinal pigment epithelium: 망막 색소 표피) 세포를 사용한 임상 시험이 이미 개시되어 있다. 또한, 웨트형 (wet) 노인성 황반 변성에 대한 자기 iPS 세포 (iPSC)-유래 RPE 세포를 사용한 임상 시험도 몇몇 그룹에 의해 계획되고 있다.

그러나, iPS 세포나 ES 세포와 같은 다능성 줄기 세포는 자주 그 증식에 있어서 암화 (canceration) 가 인정되고, 다능성 줄기 세포-유래의 분화 세포에 있어서는, 잔존한 미분화의 iPS 세포나 ES 세포에서 기인되는 종양 형성의 유무를 주의깊게 평가할 필요가 있다. 이 점은, 면역학적 장벽이 없는 자기 iPSC-유래 세포나 조직을 이식하는 경우 최대의 문제가 되고 있다. 즉, 분화-유도된 세포나 조직을 실용화하는데 있어서, 잔존하는 미분화 세포를 제거하여, 분화 세포를 정제는 것이 매우 중요하다. 본 발명자들은 iPSC-유래 RPE 세포에 있어서의 잔존 iPS 세포를 고감도로 검출하는 방법을 보고하였다 (비특허문헌 1). 그러나, 보다 효율적으로 인비트로 (in vitro) 에서 잔존 미분화 세포를 제거하는 방법이 요구되고 있었다.

그런데, 다능성 줄기 세포 및 거기에서 유래하는 분화 세포가 분비하는 사이토카인, 세포외 매트릭스, 보체 인자 등의 연구도 이루어지고 있다. 그 중에서도 PEDF (pigment epithelium-derived factor: 색소 표피-유래 인자) 는, RPE 세포가 분비하는 단백질로서 발견된, Serpin F1 로서도 알려진 50 kDa 의 분비 단백질이고, 이는 혈관 신생 억제 작용 (비특허문헌 2) 및 신경 보호 작용 (비특허문헌 3) 을 갖는 인자이다. PEDF 는 RPE 세포 뿐만 아니라, 지방세포, 간세포 및 수상 세포에서도 분비가 인정된다 (BioGPS site). 또한, PEDF 는 암 세포 (비특허문헌 4), 혈관 내피 세포 (비특허문헌 5) 및 인간 탯줄 정맥 혈관 내피 세포 (HUVEC) (비특허문헌 6) 에 있어서, 아폽토시스 (apoptosis) 를 유도하는 것이 알려져 있고, 이들의 아폽토시스의 유도 경로로서, FAS/FASL 경로 (비특허문헌 4), 및 p38 MAPK 경로를 들 수 있다 (비특허문헌 5). 그러나, PEDF 가 미분화 세포에게 주는 직접적인 영향에 대해서는 여전히 잘 알려지지 않았다.

Kuroda T. et al., PLoS ONE, 7(5): e37342 (2012) Notari, L. et al., J. Biol. Chem., 281(49): 38022-37 (2006) Cai, J. et al., J. Biol. Chem., 281(6): 3604-13 (2006) Cancer Res., 64(16): 5632-42 (2004) Chen, L. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 348(4): 1288-95 (2006) Cardiovasc. Res., 78(1): 199 (2008)

FACS 를 응용하는 수법 등 여러가지 세포 분별 방법이 제안되고 있지만, 용이하고 저가로 분화 세포와 미분화 세포를 선별하는 방법이 요구되고 있다.

본 발명자들은, RPE 세포가 분비하는 PEDF 가 iPS 세포의 증식을 저해하고 아폽토시스를 유도하는 것을 발견했다. 이 현상은 RPE 세포와의 공-배양에서도, 그리고 재조합 PEDF (rPEDF) 의 투여에 의해서도 관찰되었다. 한층 더, 본 발명자들은 이 아폽토시스의 경로의 일부에 p38 MAPK 가 관여하고 있다는 것과 ES 세포에서도 동일한 아폽토시스가 관찰된다는 것을 발견했다.

본 발명자들은 이들의 발견에 근거해 한층 더 예의 검토하여 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

[1] 미분화 세포가 혼입되거나 혼입 우려가 있는 분화 세포 집단으로부터, 미분화 세포를 제거 또는 저감시키는 방법으로서, 그 분화 세포 집단에 색소 표피-유래 인자를 접촉시키는 것을 포함하는 방법.

[2] 미분화 세포가 3 배엽 계통으로의 분화능을 갖는 다능성 줄기 세포인, 상기 [1] 의 방법.

[3] 미분화 세포가, 추가로 Lin28, Oct3/4 및 Nanog 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미분화 마커를 발현하는, 상기 [2] 의 방법.

[4] 미분화 세포가 iPS 세포 또는 ES 세포인, 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 방법.

[5] 미분화 세포의 아폽토시스를 유도하는, 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 방법.

[6] 분화 세포의 아폽토시스를 유도하지 않는, 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 방법.

[7] 분화 세포가 혈관 내피 세포 이외의 분화 세포인, 상기 [6] 의 방법.

[8] 분화 세포 집단이 미분화 세포의 분화 유도에 의해 얻어지는, 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나의 방법.

[9] 상기 [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어지는 미분화 세포를 실질적으로 포함하지 않는 분화 세포 집단을 포함하는, 세포 이식 요법제.

[10] 색소 표피-유래 인자를 포함하는, 미분화 세포의 아폽토시스 유도제.

[11] 미분화 세포가 3 배엽 계통으로의 분화능을 갖는 다능성 줄기 세포인, 상기 [10] 의 미분화 세포의 아폽토시스 유도제.

[12] 미분화 세포가, 추가로 Lin28, Oct3/4 및 Nanog 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미분화 마커를 발현하는, 상기 [11] 의 미분화 세포의 아폽토시스 유도제.

[13] 미분화 세포가 iPS 세포 또는 ES 세포인, 상기 [10] 내지 [12] 중 어느 하나의 미분화 세포의 아폽토시스 유도제.

[14] 분화 세포의 아폽토시스를 유도하지 않는, 상기 [10] 내지 [13] 중 어느 하나의 미분화 세포의 아폽토시스 유도제.

[15] 분화 세포가 혈관 내피 세포 이외의 분화 세포인, 상기 [14] 의 미분화 세포의 아폽토시스 유도제.

[16] 상기 [10] 내지 [15] 중 어느 하나의 미분화 세포의 아폽토시스 유도제를 조합하여 포함하는, 상기 [9] 의 세포 이식 요법제.

본 발명에 의하면, 분화 세포 집단에 혼입되는 미분화 세포를, 분화 세포로부터 선별하는 일 없이 제거시킬 수 있기 때문에, 용이하고 저가로 분화 세포를 정제할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 미분화 세포를 실질적으로 함유하지 않는 분화 세포 집단은 종양형성 리스크가 저감된 안전한 이식 세포의 소스일 수 있다.

도 1 은, iPS 세포-유래의 색소 표피 세포의 특성 해석 결과를 나타내는 도면이다. (A) 는 iPS 클론으로부터의 RPE 분화의 프로토콜을 나타낸다. (B) 는 초대 RPE 세포 (왼쪽 패널) 및 iPS 클론 253G1-유래 RPE 세포 (오른쪽 패널) 의 위상차 상을 나타낸다. 스케일 바 = 50 μm. (C) 는 정량적 RT-PCR 에 의해 검출된 다능성 관련의 미분화 마커 유전자 (Lin28 및 Oct3/4) 및 RPE 세포 특이적 유전자 (RPE65, CRALBP 및 베스트로핀) 의 발현을 나타낸다. GAPDH 를 내부 표준으로서 사용하였다. (D) 는 타이트 교차점 단백질 ZO-1 의 면역형광 염색을 나타낸다. 2 차 항체 Alexa488 을 이용해 염색을 가시화했다. 스케일 바 = 50 μm.
도 2a 는 iPS 세포-유래의 RPE 세포와 공배양하면 iPS 세포의 증식이 저해되는 것을 나타내는 도면이다. (A) 는 iPS 세포와 RPE 세포와의 공배양의 모식도이다. (B) 는 마트리겔-코팅 배양 인서트 중에 iPS 세포를 유지하고, iPS 세포 배지에서, 디쉬의 바닥에 파종한 iPSC-유래 RPE 세포와 공배양했다. 12-트랜스웰 중에서 단독 배양 (위쪽 패널) 또는 253G1-유래 RPE 세포와 공배양 (아래쪽 패널) 한 iPS 세포 253G1 의 배양 2, 4, 6 및 8 일째의 위상차 상을 나타낸다. (C) 는 253G1 세포-유래의 RPE 세포와 공배양한, 또는 단독 배양한 iPS 클론 253G1 의 생육 곡선을 나타낸다. 배양 0, 4, 8 및 12 일째의 12-트랜스웰 중의 iPS 클론 253G1 의 세포수를 계수했다. 3 회의 독립된 실험의 평균치를 플롯팅하여, 표준 편차를 나타내는 에러 바와 함께 꺾은선 그래프로서 제시한다.
도 2b 는 iPS 세포-유래의 RPE 세포와 공배양하면 iPS 세포의 아폽토시스가 유도되는 것을 나타내는 도면이다. (D) 는 TUNEL 어세이에 의해 아폽토시스 세포사를 조사하여 녹색 스폿 (원 내) 으로서 가시화했다 (배양 6 일째). (E) 는 단독 배양 또는 253G1-유래 RPE 세포와 공배양한 253G1 세포의 DAPI 양성 세포에 대한 TUNEL 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 결과는 4 회의 독립된 실험의 평균치 및 표준 편차 (에러 바) 로 나타낸다. (F) 253G1 세포-유래의 RPE 세포와 공배양한 253G1 세포는 배양 6 일째에 미분화 마커 Oct3/4 의 발현을 현저하게 저해시켰다. 배양 6 일째에, 세포를 고정해, Oct3/4 에 대한 항체로 염색한 후, 2 차 항체 Alexa488 (녹색, 오른쪽 패널) 로 가시화했다. 핵은 DAPI 염색했다 (청색, 왼쪽 패널). (G) 253G1-유래 RPE 세포와 공배양한 253G1 에 있어서의 Lin28, Oct3/4 및 Nanog 의 mRNA 레벨을 정량적 RT-PCR 로 측정했다. GAPDH 를 내부 표준으로서 이용하여, 3 개의 유전자의 mRNA 레벨을 보정했다. 3 회의 독립된 실험의 결과를 나타낸다. 단독 배양한 253G1 세포에 있어서의 각 mRNA 레벨로부터의 감소 비율 (평균치) 을 표준 편차 (에러 바) 와 함께 제시한다.
도 3 은 초대 RPE 세포와 공배양하면 iPS 세포의 증식이 저해되는 것을 나타내는 도면이다. (A) 는 iPS 세포와 RPE 세포와의 공배양의 모식도를 나타낸다. (B) 는 12-트랜스웰 중에서 단독 배양 (위 패널) 또는 초대 RPE 와 공배양 (아래 패널) 한 iPS 세포 253G1 의 배양 2, 4, 6 및 8 일째의 위상차 상을 나타낸다. (C) 는 초대 RPE 세포와 공배양한, 또는 단독 배양한 iPS 클론 253G1 의 생육 곡선을 나타낸다. 배양 0, 4, 8 및 12 일째의 12-트랜스웰 중의 iPS 클론 253G1 의 세포수를 계수했다. 3 회의 독립된 실험의 평균치를 플롯팅하여, 표준 편차를 나타내는 에러 바와 함께 꺾은선 그래프로서 나타낸다.
도 4a 는 RPE 세포와의 공배양에 의해 유도되는 iPS 세포사가 항-PEDF 항체의 첨가에 의해 저지되는 것을 나타내는 도면이다. (A) 는 253G1 순화 배지 (253G1 sup) 및 253G1-유래 RPE 순화 배지 (253G1 유래-RPE sup) 의 항-PEDF 항체를 사용한 웨스턴 블롯을 나타낸다. iPS 세포 배지 단독 및 재조합 PEDF 를 각각 음성 대조 및 양성 대조로서 사용하였다. 항-PEDF 항체에 의해 검출된 PEDF 를 화살표로 나타낸다. (B) 초대 RPE 세포 또는 253G1-유래 RPE 세포 순화 배지 중의 PEDF 레벨을 ELISA 에 의해 측정했다. 3 회의 독립된 실험의 평균치 및 표준 편차 (에러 바) 를 나타낸다. (C) 는 대조 IgG1 (위 패널) 또는 항-PEDF 항체 (아래 패널) 의 존재 하에서, 253G1-유래 RPE 세포와 공배양한 iPS 클론 253G1 의, 배양 2, 4, 6 및 8 일째의 위상차 상을 나타낸다.
도 4b 는 RPE 세포와의 공배양에 의해 유도되는 iPS 세포사가 항-PEDF 항체의 첨가에 의해 저지되는 것을 나타내는 도면이다. (D) 대조 IgG1 또는 항-PEDF 항체의 존재 하에서, 253G1-유래 RPE 세포와 공배양한 iPS 클론 253G1 의, 배양 6 일째의 세포수를 계수하여, 시약 없이 단독 배양한 253G1 의 세포수에 대한 비율로 나타낸다. 4 회의 독립된 실험의 평균치 및 표준 편차 (에러 바) 를 나타낸다. (E) 대조 IgG1 (가운데 패널) 또는 항-PEDF 항체 (아래 패널) 의 존재 하에서, 253G1-유래 RPE 세포와 공배양한 iPS 클론 253G1 의, 배양 6 일째에 있어서의 아폽토시스 세포사를 TUNEL 어세이에 의해 조사하여 녹색 스폿 (원 내) 으로서 가시화했다. 시약없이 단독 배양한 iPS 클론 253G1 (위 패널) 을 대조로서 사용하였다. (F) 는 대조 IgG1 또는 항-PEDF 항체의 존재 하에서, 253G1-유래 RPE 세포와 공배양한 253G1 의, 배양 6 일째 에 있어서의 DAPI 양성 세포에 대한 TUNEL 어세이 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 4 회의 독립된 실험의 평균치 및 표준 편차 (에러 바) 를 나타낸다.
도 4c (G) 253G1 세포-유래 RPE 세포와 공배양한 253G1 세포는, 배양 6 일째에 미분화 마커 Oct3/4 의 발현을 현저하게 저해했다. 배양 6 일째에 세포를 고정해, Oct3/4에 대한 항체로 염색한 후, 2 차 항체 Alexa 488 (녹색, 오른쪽 패널) 로 가시화했다. 핵을 DAPI 로 염색했다 (청색, 왼쪽 패널). (H) 대조 IgG1 또는 항-PEDF 항체의 존재 하에서, 253G1-유래 RPE 세포와 공배양한 253G1 세포에 있어서의 Lin28, Oct3/4 및 Nanog 의 mRNA 레벨을 정량적 RT-PCR 로 측정했다. GAPDH 를 내부 표준으로서 이용해, mRNA 의 발현 레벨을 보정했다. 3 회의 독립된 실험의 결과를 나타낸다. 시약없이 단독 배양한 253G1 세포에 있어서의 각 mRNA 레벨에 대한 감소 비율 (평균치) 을 표준 편차 (에러 바) 와 함께 나타낸다.
도 5a 는 재조합 PEDF (rPEDF) 가 iPS 세포의 아폽토시스 세포사를 유도하는 것을 나타내는 도면이다. (A) 는 rPEDF (50 μg/ml) 존재 하 또는 부재 하에서 배양한 iPS 클론 253G1 의, 배양 4 일째에 있어서의 위상차 상을 나타낸다. (B) 는 rPEDF (50 μg/ml) 의 존재 하 또는 부재 하에서 배양한 iPS 클론 253G1 의, 배양 4 일째에 있어서의 세포수의 변화를, 배양 개시시의 세포수에 대한 비율로 나타낸다. 3 회의 독립된 실험의 결과를 평균치 및 표준 편차 (에러 바) 로 나타낸다. (C) rPEDF (50 μg/ml) 존재 하 또는 부재 하에서 배양한 iPS 클론 253G1 의, 배양 4 일째에 있어서의 아폽토시스 세포사를 TUNEL 어세이에 의해 조사해 녹색 스폿 (원 내) 으로서 가시화했다 (오른쪽). DAPI 염색상 (왼쪽) 도 나타낸다. (D) rPEDF 존재 하 또는 부재 하에서 배양했을 경우의, DAPI 양성 세포 당 TUNEL 양성 세포의 백분율을 3 회의 독립된 실험의 평균치±표준 편차로서 나타낸다. (E) rPEDF (50 μg/ml) 존재 하 또는 부재 하에서 배양한 253G1 세포의, 배양 4 일째에 있어서의 Lin28, Oct3/4 및 Nanog 의 mRNA 발현을 정량적 RT-PCR 에 의해 측정했다. GAPDH 를 mRNA 발현 레벨을 교정하기 위한 내부 표준으로서 사용하였다. rPEDF 존재 하에서 배양했을 경우의 각 유전자의 mRNA 발현 레벨을, rPEDF 부재 하에서 배양했을 경우의 발현 레벨에 대한 비율로서 나타낸다. 3 회의 독립된 실험의 결과를 평균치 및 표준 편차 (에러 바) 로 나타낸다.
도 5b 는 PEDF 를 개입시킨 iPSC 에 대한 아폽토시스 유도에, p38 MAPK 및 카스파제-3 의 경로가 관여하고 있다는 것을 나타내는 도면이다. (F) 6 시간 혈청 기아 처리한 iPSC(-), 및 PEDF 의 첨가로부터 5 분 후 또는 15 분 후의 iPSC 중의 인산화 p38 MAPK (P-p38) 또는 p38 MAPK (P38) 를, 특이 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출했다. p38 을 내부 표준으로서 사용하였다 (왼쪽 패널). 혈청 기아 처리한 iPSC(-), 및 PEDF 및 DMSO, 또는 PEDF 와 p38 저해제 (SB203580) 의 첨가로부터 10 분 후의 iPSC 중의 인산화 p38 MAPK (P-p38) 또는 p38 MAPK (P38) 를 웨스턴 블롯팅에 의해 검출했다 (오른쪽 패널). (G) 혈청 기아 처리한 iPSC(-), PEDF 의 첨가로부터 5 분 후 혹은 15 분 후의 iPSC 중의 프로카스파제-3 및 활성화 카스파제-3 을 특이 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출했다.
도 6 은 PEDF 가 사람 ES 세포 (KhES-1) 의 아폽토시스 세포사를 유도하는 것을 나타내는 도면이다. 50 μg/ml rPEDF 존재 하 (아래 패널) 또는 부재 하 (위 패널) 에서 KhES-1 세포를 배양해, 배양 4 일째에 있어서의 KhES-1 세포의 아폽토시스 세포사를 TUNEL 어세이에 의해 조사해 녹색 스폿으로서 가시화했다. 위상차 상 (왼쪽 패널), DAPI 염색 상 (가운데 패널), TUNEL 어세이 상 (오른쪽 패널).
도 7 은 PEDF 의 인비트로에서의 종양 형성 억제 효과를 나타내는 도면이다. 10², 10³ 및 10⁴ 개의 세포의 iPSC 클론 253G1 및 454E2 를, 각각, 253G1 및 454E2-유래의 RPE 세포 시트 (약 2.5 x 10⁵ RPE 세포를 포함) 와 함께, NOG 마우스 (각 군 3 마리) 의 피하에 동시 이식했다. 세로축은, 각 경우 종양이 최초로 검출된 주를 나타낸다. 가로축에 iPSC 및 iPSC-유래 RPE 세포의 수를 나타낸다. 종양을 형성하지 않았던 마우스 개체수는 가로축 하방에 각 기호로 나타낸다. 오른쪽 상단 사진은 24-웰 플레이트 중의 RPE 세포 시트를 나타낸다. RPE 있음 또는 RPE 없음의 경우의 50% 종양 증식에 필요한 iPSC 세포수 (TPD₅₀log₁₀) 를 각 그래프의 하부에 나타낸다. RPE 세포 있음과 RPE 세포 없음과의 사이의 P 값은 0.001 미만이었다. P<0.05 를 유의로 간주했다. 또한 30 주에 종양 없음인 개체를 31 주째에 종양 형성한 것으로 가정한 다음, 통계는 SigmaPlot Ver. 11.0 (Systat Software Inc.제) 로 행했다.
도 8 은 사람 심근 세포의 증식에 미치는 PEDF 의 영향을 나타내는 도면이다. (A) 는 통상적인 심근 세포용 배지 (NC； 위 패널) 또는 iPSC-유래 RPE 세포 순화 배지 (RPE sup； 아래 패널) 중에서 배양한 사람 심근 세포의 배양 1, 3 및 6 일째의 위상차 상을 나타낸다. (B) iPSC-유래 RPE 세포 순화 배지 또는 통상적인 심근 세포용 배지 중에서 배양한 사람 심근 세포의, 배양 6 일째의 세포수를 계수했다. 3 회의 독립된 실험의 평균치를, 단독 배양의 세포수를 1 로 한 상대치로서 막대 그래프로 나타낸다. 에러 바는 표준 편차를 나타낸다. (C) 는 rPEDF (50 μg/ml) 존재 하 (ePEDF； 아래 패널) 또는 부재 하 (NC； 위 패널) 로 배양한 사람 심근 세포의 배양 1, 3 및 6 일째의 위상차 상을 나타낸다. (D) rPEDF (50 μg/ml) 의 존재 하 또는 부재 하에서 배양한 사람 심근 세포의, 배양 6 일째에 있어서의 세포수를 계수했다. 3 회의 독립된 실험의 평균치를, 단독 배양의 세포수를 1 로 한 상대치로서 막대 그래프로 나타낸다. 에러 바는 표준 편차를 나타낸다.
도 9 는 사람 연골 세포의 증식에 미치는 PEDF 의 영향을 나타내는 도면이다. (A) 는 통상적인 연골 세포용 배지 (NC；위 패널) 또는 iPSC-유래 RPE 세포 순화 배지 (RPE sup； 아래 패널) 중에서 배양한 사람 연골 세포의 배양 1, 3 및 5 일째의 위상차 상을 나타낸다. (B) iPSC-유래 RPE 세포 순화 배지 또는 통상적인 연골 세포용 배지 중에서 배양한 사람 연골 세포의, 배양 5 일째의 세포수를 계수했다. 3 회의 독립된 실험의 평균치를, 단독 배양의 세포수를 1 로 한 상대치로서 막대 그래프로 나타낸다. 에러 바는 표준 편차를 나타낸다. (C) rPEDF (50 μg/ml) 의 존재 하 (ePEDF； 아래 패널) 또는 부재 하 (NC； 위 패널) 에서 배양한 사람 연골 세포의, 배양 1, 3 및 5 일째의 위상차 상을 나타낸다. (D) rPEDF (50 μg/ml) 의 존재 하 또는 부재 하에서 배양한 사람 연골 세포의, 배양 5 일째에 있어서의 세포수를 계수했다. 3 회의 독립된 실험의 평균치를, 단독 배양의 세포수를 1 로 한 상대치로서 막대 그래프로 나타낸다. 에러 바는 표준 편차를 나타낸다.
도 10 은 사람 간세포의 증식에 미치는 PEDF 의 영향을 나타내는 도면이다. (A) 는 통상적인 간세포용 배지 (NC； 위 패널) 또는 iPSC-유래 RPE 세포 순화 배지 (RPE sup； 아래 패널) 중에서 배양한 사람 간세포의 배양 1, 3, 6 및 8 일째의 위상차 상을 나타낸다. (B) 는 iPSC-유래 RPE 세포 순화 배지 또는 통상적인 간세포용 배지 중에서 배양한 사람 간세포의 생육 곡선을 나타낸다. 배양 1, 3, 6 및 8 일째의 사람 간세포의 세포수를 계수했다. 3 회의 독립된 실험의 평균치를 플롯하여, 표준 편차를 나타내는 에러 바와 함께 꺾은선 그래프로서 나타낸다. (C) 는 rPEDF (50 μg/ml) 의 존재 하 (ePEDF； 아래 패널) 또는 부재 하 (NC； 위 패널) 에서 배양한 사람 간세포의, 배양 1, 3, 6 및 8 일째의 위상차 상을 나타낸다. (D) 는 rPEDF (50 μg/ml) 의 존재 하 또는 부재 하에서 배양한 사람 간세포의 생육 곡선을 나타낸다. 배양 1, 3, 6 및 8 일째의 사람 간세포의 세포수를 계수했다. 3 회의 독립된 실험의 평균치를 플롯하여, 표준 편차를 나타내는 에러 바와 함께 꺾은선 그래프로서 나타낸다.

본 발명은, 미분화 세포가 혼입되거나 혼입 우려가 있는 분화 세포 집단으로부터 미분화 세포를 제거 또는 저감시키는 방법을 제공한다.

여기서 "미분화 세포" 란, 미분화 상태 (다능성 또는 다분화능) 를 유지하고 생체 내에 이식된 후에 종양형성 (본 발명에 있어서는, 기형종 형성 및 암화의 양방을 포함하는 개념) 의 잠재력을 갖는 세포이면 특별히 제한되지 않는다. 전형적으로, 이는 이식되었을 경우에 그 미분화성 때문에 무질서하게 분화하여, 목적 세포 이외의 세포 유형을 형성하여 종양 물질을 형성할 수 있는 세포이며; 보다 전형적으로는, 미분화 상태를 유지한 채로 증식할 수 있는 "자기 재생 능력", 및 3 배엽 계통 모두로 분화할 수 있는 "다능성" 을 갖는 다능성 줄기 세포이다. 다능성 줄기 세포는, 예를 들어 알칼리성 포스파타제 염색 양성, SSEA3 염색 양성, SSEA4 염색 양성, Tra-1-60 염색 양성, Tra-1-81 염색 양성, Lin28, Oct3/4, Nanog, Sox2, Cripto, Dax1, ERas, Fgf4, Esg1, Rex1, Zfp296, UTF1, GDF3, Sall4, Tbx3, Tcf3, DNMT3L, DNMT3B 의 유전자 발현, miR-290 클러스터 miRNA, miR-302 클러스터 miRNA 의 발현 등의, 하나 이상의 미분화 마커의 발현을 특징으로 한다. 보다 구체적으로는, 본 발명에 있어서의 미분화 세포는, 예를 들어, Lin28, Oct3/4, Nanog 중 하나 이상의 미분화 마커를 발현하는 다능성 줄기 세포이다. 이와 같은 다능성 줄기 세포의 예로는, 유도 다능성 줄기 세포 (iPS 세포), 배아 줄기 세포 (ES 세포), 골수 간엽 세포로부터 단리되는 다능성 성체 선구 세포 (MAPC), 골수 간엽 세포 등으로부터 단리되는 Muse 세포, 시원 생식 세포로부터 유래하는 배아 생식 세포 (EG 세포), 정소 조직으로부터의 GS 세포의 수립 및 배양 과정에서 단리되는 multipotent germline stem 세포 (mGS 세포) 등을 들 수 있다. ES 세포는 체세포로부터 핵 초기화에 의해 생긴 ntES 세포일 수 있다. 바람직하게는 iPS 세포 또는 ES 세포이다.

또한, 본 발명에 있어서의 미분화 세포에는, 상기 다능성 줄기 세포에 분화를 유도했을 때에, 다능성은 상실했지만, 목적 분화 세포로 분화되지 않고, 미분화 상태를 유지하여 종양화 잠재력을 갖는, 다분화능을 갖는 세포도 포함된다.

"분화 세포 집단" 이란, 분화 세포를 주된 구성 세포로 포함하는 세포 집단이다. 여기서 "분화 세포" 란, 무한 증식능을 갖지 않고 배엽을 초과하여 분화하는 능력을 갖지 않는 임의의 세포를 말한다. 예를 들어, 피부 세포, 시세포, 뇌세포, 모발 세포, 구강 점막, 폐세포, 간세포, 위점막 세포, 장 세포, 비장 세포, 췌장 세포, 신장 세포, 혈액 세포 (예, 말초혈단핵구 세포 (T 세포 및 비-T 세포를 포함), 말초혈 림프구, 제대혈 세포 등), 표피 세포, 내피 세포, 근육 세포 (심근 세포 등), 연골 세포, 선유아세포 등의 최종 분화된 세포; 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 사랑니 등에서 유래하는 간엽 줄기 세포 등의 다분화능 (복능성) 및 한정적인 자기 재생능을 갖는 조직 줄기 세포; 정자 줄기 세포, 근 줄기 세포 등의 단능성 조직 선구 세포 등을 들 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 또한, 이들의 초대 배양 세포, 계대 세포 등도 포함된다. 조직 줄기 세포는 다분화능을 가질 수 있지만, 체내에서 정상적인 분화 세포 중에 혼합되어, 종래 세포 이식 요법에 있어서의 이식 재료로서 종양형성 리스크가 없거나 극히 낮다는 것이 확인된 조직 줄기 세포는 본 발명의 취지에 비추어 "분화 세포" 로 분류되는 것을 말할 필요도 없다. 본 발명의 목적 면에서, 또한, 탈분화 암 세포는 본 발명에서 "분화 세포" 에 포함되지 않는다.

본 발명의 미분화 세포를 제거 또는 저감시키는 방법에서는, 미분화 세포가 혼입되거나 혼입 우려가 있는 분화 세포 집단에 PEDF 를 접촉시키는 것을 특징으로 한다. 그 결과, 분화 세포 집단으로부터 미분화 세포를 제거 또는 저감시킬 수 있다.

PEDF 를 접촉시킴으로써 미분화 세포를 제거 또는 저감시키는 메커니즘으로서는, 특별히 한정되지 않고, PEDF 에 의한 미분화 세포의 증식 저해, 미분화 세포의 아폽토시스 유도 등을 들 수 있다. 바람직한 메커니즘은, 예를 들어, 미분화 세포의 아폽토시스의 유도이다. PEDF 의 미분화 세포에 대한 아폽토시스 유도 효과를 이용해, 미분화 세포가 혼입되거나 혼입 우려가 있는 분화 세포 집단으로부터 미분화 세포를 제거 또는 저감시킬 수 있고, 분화 세포를 정제시킬 수 있다.

PEDF 에 의해 아폽토시스가 유도되는 분화 세포는, 본 발명의 대상 세포로서 바람직하지 않다. 예를 들어, PEDF 는 분화 세포 중에서도 혈관 내피 세포의 아폽토시스를 유도할 수 있는 것이 이미 알려져 있으므로, 본 발명의 대상이 되는 분화 세포는 바람직하게는 혈관 내피 세포 이외의 분화 세포이다. 또, PEDF 에 의해 각막 표피 세포의 세포사가 유도되는 경우가 있으므로, 본 발명에서 대상이 되는 분화 세포는, 바람직하게는 각막 표피 세포 이외의 세포이다. 다만, 미분화 세포와 분화 세포와의 사이에서의 PEDF 에 대한 감수성의 차이를 이용해, PEDF 의 농도를 조절함으로써, 미분화 세포에서 특이적으로 아폽토시스를 유도하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명은 미분화 세포보다 감수성이 낮은 한, PEDF-감수성의 분화 세포에 대한 적용을 배제하지 않는다.

미분화 세포가 혼입되거나 혼입 우려가 있는 분화 세포 집단도 특별히 제한 되지 않지만, 전형적으로는, 상기 어느 하나의 미분화 세포, 바람직하게는 다능성 줄기 세포의 분화를 유도함으로써 얻어진 분화 세포 집단이다. 당해 분화 세포 집단은, (1) 다능성 줄기 세포를 제조하는 공정, 및 (2) 얻어진 미분화 세포의 분화를 유도하는 공정에 의해 제조되며, 많은 경우, 특히 생체에 투여하는 경우에는, 종양 리스크를 저감하기 위해서 세포의 정제 공정이 필요하다. 본 발명은 이 세포 정제 공정에 있어서 매우 간편하고 유용한 기술이 될 수 있다.

(1) 다능성 줄기 세포의 제조 방법

(a) iPS 세포

iPS 세포는, 특정의 초기화 인자를, DNA 또는 단백질의 형태로 체세포에 도입함으로써 제조할 수 있고 ES 세포와 거의 동등한 특성 (예를 들어 분화 다능성과 자기 복제에 기초한 증식능) 을 나타내는, 체세포-유래의 인공 줄기 세포이다 (K. Takahashi and S. Yamanaka (2006), Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M. et al, Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)； 국제 공개 WO2007/069666). 초기화 인자는, ES 세포에 의해 특이적으로 발현하고 있는 유전자, 그 유전자 산물 또는 비-코딩 RNA, ES 세포의 미분화 유지에 중요한 역할을 하는 유전자, 그 유전자 산물 또는 비-코딩 RNA, 또는 저분자 화합물에 의해 구성될 수 있다. 초기화 인자에 포함되는 유전자로서는, Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, Glis1 등을 들 수 있다. 이들 초기화 인자는 단독으로 또는 조합하여 이용할 수 있다. 초기화 인자의 조합의 예로는 WO2007/069666, WO2008/118820, WO2009/007852, WO2009/032194, WO2009/058413, WO2009/057831, WO2009/075119, WO2009/079007, WO2009/091659, WO2009/101084, WO2009/101407, WO2009/102983, WO2009/114949, WO2009/117439, WO2009/126250, WO2009/126251, WO2009/126655, WO2009/157593, WO2010/009015, WO2010/033906, WO2010/033920, WO2010/042800, WO2010/050626, WO2010/056831, WO2010/068955, WO2010/098419, WO2010/102267, WO2010/111409, WO2010/111422, WO2010/115050, WO2010/124290, WO2010/147395, WO2010/147612, Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797, Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528, Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474, Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275, Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574, Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479, Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135, Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203, R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461, Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917, Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643, Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503, Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74, Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100, Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720, Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9. 에 기재된 조합이 예시된다.

상기 초기화 인자의 예로는, 히스톤 데아세틸라아제 (HDAC) 저해제 [예를 들어, 발프로산 (VPA), 트리코스타틴 A, 부티르산 나트륨, MC 1293, 및 M344 등의 저분자 저해제, HDAC 에 대한 siRNA 및 shRNA (예, HDAC1 siRNA Smartpool® (Millipore), HuSH 29 mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene) 등) 등의 핵산성 발현 저해제 등], MEK 저해제 (예를 들어, PD184352, PD98059, U0126, SL327 및 PD0325901), 글리코겐 신타아제 키나아제-3 저해제 (예를 들어, Bio 및 CHIR99021), DNA 메틸 트랜스퍼라아제 저해제 (예를 들어, 5-azacytidine), 히스톤 메틸 트랜스퍼라아제 저해제 (예를 들어, BIX-01294 등의 저분자 저해제, 및 Suv39hl, Suv39h2, SetDBl 및 G9a 에 대한 siRNA 및 shRNA 등의 핵산성 발현 저해제 등), L-채널 칼슘 작용제 (예를 들어 Bayk8644), 부티르산, TGFβ 저해제 또는 ALK5 저해제 (예를 들어, LY364947, SB431542, 616453 및 A-83-01), p53 저해제 (예를 들어 p53 에 대한 siRNA 및 shRNA), ARID3A 저해제 (예를 들어, ARID3A 에 대한 siRNA 및 shRNA), miR-291-3p, miR-294, miR-295 및 mir-302 등의 miRNA, Wnt Signaling (예를 들어 soluble Wnt3a), 신경펩티드 Y, 프로스타글란딘류 (예를 들어, 프로스타글라딘 E2 및 프로스타글라딘 J2), hTERT, SV40LT, UTF1, IRX6, GLISl, PITX2, DMRTBl 등의 수립 효율을 높이기 위해 사용되는 인자를 들 수 있다. 본 명세서에서는, 이들의 수립 효율의 개선 목적에서 이용된 인자를 초기화 인자와 특별히 구별하지 않는다.

초기화 인자는, 단백질의 형태의 경우, 예를 들어 리포펙틴, 세포 투과성 펩티드 (예를 들어, HIV 유래의 TAT 및 폴리아르기닌) 와의 융합, 현미경하주사법 등의 방법에 의해 체세포 내에 도입될 수 있다.

초기화 인자는, DNA 의 형태의 경우, 예를 들어, 바이러스, 플라스미드, 인공 염색체 등의 벡터, 리포펙션, 리포솜, 현미경하주사법 등의 수법에 의해 체세포 내에 도입될 수 있다. 바이러스 벡터의 예로서는, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 (Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007), 아데노바이러스 벡터 (Science, 322, 945-949, 2008), 아데노-수반 바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터 (WO2010/008054) 등을 포함한다. 인공 염색체 벡터의 예로서는, 사람 인공 염색체 (HAC), 효모 인공 염색체 (YAC), 세균 인공 염색체 (BAC, PAC) 등이 포함된다. 플라스미드로서는, 포유동물 세포용 플라스미드를 사용할 수 있다 (Science, 322:949-953, 2008). 벡터에는, 핵 초기화 물질이 발현될 수 있도록 프로모터, 인핸서, 리보좀 결합 시퀀스, 터미네이터, 폴리아데닐화 사이트 등의 제어 시퀀스를 포함할 수 있으며, 게다가 필요에 따라, 약제 내성 유전자 (예를 들어 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자 등), 티미딘 키나아제 유전자, 디프테리아 독소 유전자 등의 선택 마커 시퀀스, 녹색 형광 단백질 (GFP), β 글루쿠로니다아제 (GUS), FLAG 등의 리포터 유전자 시퀀스 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 벡터에는, 체세포로의 도입 후, 초기화 인자를 코딩하는 유전자 또는 프로모터와 그 프로모터에 결합하는 초기화 인자를 코딩하는 유전자 둘 모두를 절단하기 위해서, 그들의 전후에 LoxP 시퀀스를 가질 수 있다.

RNA 의 형태의 경우, 예를 들어, 리포펙션, 현미경하주사법 등의 수법에 의해 체세포 내로 도입될 수 있고, 분해를 억제하기 위해 5-메틸시티딘 및 슈도우리딘 (pseudouridine) (TriLink Biotechnologies) 을 혼입하는 RNA 를 이용할 수 있다 (Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630).

iPS 세포 유도를 위한 배양액의 예로서는, 10~15% FBS-함유 DMEM, DMEM/F12 또는 DME 배양액 (이들의 배양액에는 추가로 LIF, 페니실린/스트렙토마이신, 퓨로마이신, L-글루타민, 비필수 아미노산, β-메르캅토에탄올 등을 적절히 포함할 수 있음) 또는 시판되는 배양액 [예를 들어, 마우스 ES 세포 배양용 배양액 (TX-WES 배양액, Thromb-X), 영장류 ES 세포 배양용 배양액 (영장류 ES/iPS 세포용 배양액, Reprocell), 무혈청 배지 (mTeSR, Stemcell Technologies)] 등을 포함한다.

배양법의 예로서는, 37℃ 에서 5% CO₂ 존재 하에서, 10% FBS-함유 DMEM 또는 DMEM/F12 배양액 상에서 체세포와 초기화 인자를 접촉시키고 약 4 ~ 7 일 동안 배양하고, 그 후, 세포를 피더 세포 (예를 들어, 미토마이신 C-처리 STO 세포, SNL 세포 등) 상에 다시 파종하고, 체세포와 초기화 인자의 접촉 약 10 일 후부터 bFGF-함유 영장류 ES 세포 배양용 배양액에서 배양함으로써, 그 접촉으로부터 약 30 내지 약 45 일 또는 그 이상 후에 iPS-유사 콜로니를 수득할 수 있다.

또는, 37℃ 에서 5% CO₂ 존재 하에서, 피더 세포 (예를 들어, 미토마이신 C-처리 STO 세포, SNL 세포 등) 상에서 10% FBS-함유 DMEM 배양액 (이는 추가로 LIF, 페니실린/스트렙토마이신, 퓨로마이신, L-글루타민, 비필수 아미노산, β-메르캅토에탄올 등을 적절히 포함할 수 있음) 에서 배양하고, 약 25 내지 약 30 일 또는 그 이상 후에 ES-유사 콜로니를 수득할 수 있다. 바람직하게는, 피더 세포 대신에, 초기화되는 체세포 그 자체를 사용하는 방법 (Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4: e8067 또는 WO2010/137746), 또는 세포외 기질 (예를 들어, Laminin-5 (WO2009/123349) 및 Matrigel (BD)) 을 사용하는 방법을 들 수 있다.

이 밖에도, 무혈청 배지를 이용해 배양하는 방법도 예시된다 (Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725). 게다가, 수립 효율을 올리기 위해, 저산소 조건 (0.1% 이상 15% 이하의 산소 농도) 하에서 iPS 세포를 수립할 수 있다 (Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241 또는 WO2010/013845).

상기 배양 동안에는, 배양 개시 2 일째 이후부터 매일 1 회 신선한 배양액으로의 배양액 교환을 실시한다. 핵 초기화에 사용하는 체세포의 세포수는 한정되지 않지만, 배양 디쉬 100 cm² 당 약 5×10³ ~ 약 5×10⁶ 세포이다.

iPS 세포는, 형성한 콜로니의 형상에 따라 선택 가능하다. 체세포가 초기화되었을 경우에 발현하는 유전자 (예를 들어, Oct3/4, Nanog) 와 연동해 발현하는 약제 내성 유전자를 마커 유전자로서 도입한 경우에는, 대응하는 약제를 포함하는 배양액 (선택 배양액) 에서 배양을 실시함으로써, 수립한 iPS 세포를 선택할 수 있다. 마커 유전자가 형광 단백질 유전자인 경우에는, 형광 현미경으로 관찰함으로써, 발광 효소 유전자의 경우에는 발광 기질을 첨가함으로써, 그리고 발색 효소 유전자의 경우에는 발색 기질을 첨가함으로써, iPS 세포를 선택할 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 "체세포" 란 용어는, 난자, 난모세포, ES 세포 등의 생식 계열 세포 및 분화 전능성 세포를 제외한 모든 동물 세포 (바람직하게는, 사람을 포함하는 포유동물 세포) 를 말한다. 체세포에는, 비한정적으로, 태아의 체세포, 신생아의 체세포, 및 성숙한 건강한 혹은 질환성의 체세포가 모두 포함되고, 또, 초대 배양 세포, 계대 세포, 및 주화 세포가 모두 포함된다. 체세포의 구체예로는, (1) 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 간엽계 줄기 세포, 치수 줄기 세포 등의 조직 줄기 세포 (신체 줄기 세포), (2) 조직 선구 세포, (3) 림프구, 표피 세포, 내피 세포, 근육 세포, 선유아세포 (피부 세포 등), 모세포, 간세포, 위점막 세포, 장세포, 비장 세포, 췌장 세포 (췌장 외분비 세포 등), 뇌세포, 폐세포, 신장 세포 및 지방 세포 등의 분화한 세포 등을 포함한다.

iPS 세포를 이식용 세포의 재료로서 사용하는 경우, 거절반응이 일어나지 않기 때문에 이식 받는 개체와 HLA 유전자형이 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 체세포를 사용하는 것이 바람직하다. 여기서, "실질적으로 동일" 이란, 이식한 세포에 대해 면역억제제에 의해 면역 반응을 억제할 수 있는 정도로 HLA 유전자형이 일치하고 있는 것을 의미한다. 예를 들어, HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR 의 3 개의 유전자 자리 또는 HLA-C 추가한 4 개의 유전자 자리가 일치하는 HLA 형을 갖는 체세포이다.

(b) ES 세포

ES 세포는, 사람, 마우스 등의 포유동물의 초기배아 (예를 들어 낭포) 의 내부 세포 덩어리로부터 수립된, 다능성과 자기 복제에 의한 증식능을 갖는 줄기 세포이다.

ES 세포는, 수정란의 8 세포기에서 상실배 후의 배아인, 낭포의 내부 세포 덩어리에서 유래하는 배아-유래 줄기 세포이며, 성체를 구성하는 모든 세포로 분화할 수 있는 능력, 이른바 분화 다능성, 및 자기 복제에 의한 증식능을 가진다. ES 세포는 마우스에서 1981 년에 발견되었고 (M.J. Evans and M.H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156), 그 후, 사람, 원숭이 등의 영장류에서도 ES 세포주가 수립되었다 (J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848; J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165).

ES 세포는, 대상 동물의 수정란의 낭포로부터 내부 세포 덩어리를 꺼내, 내부 세포 덩어리를 선유아세포의 피더 세포 상에서 배양함으로써 수립할 수 있다. 또한, 계대 배양에 의한 세포의 유지는, 백혈병 억제 인자 (leukemia inhibitory factor (LIF)), 염기성 선유아세포 성장 인자 (basic fibroblast growth factor (bFGF)) 등의 물질을 첨가한 배양액을 이용할 수 있다. 사람 및 원숭이의 ES 세포의 수립과 유지의 방법에 대해서는, 예를 들어 미국특허 5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848； Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147； H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932； M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559； H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279; H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585； Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485 등에 기재되어 있다.

ES 세포 제작을 위한 배양액으로서, 예를 들어, 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산, 2 mM L-글루탐산, 20% KSR 및 4 ng/ml bFGF 를 보충한 DMEM/F-12 배양액을 사용하여, 37 ℃, 2% CO₂/98% 공기의 습윤 분위기 하에서 사람 ES 세포를 유지할 수 있다 (O. Fumitaka et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:215-224). 또한, ES 세포는, 3~4 일 간격으로 계대할 필요가 있고, 이 경우, 계대는, 예를 들어 1 mM CaCl₂ 및 20% KSR 을 함유하는 PBS 중의 0.25% 트립신 및 0.1 mg/ml 콜라게나아제 IV 를 이용해 실시할 수 있다.

ES 세포의 선택은, 일반적으로, 알칼리 포스파타아제, Oct-3/4, Nanog 등의 유전자 마커의 발현을 지표로서 사용하는 Real-Time PCR 법에 의해 실시할 수 있다. 특히, 사람 ES 세포의 선택에서는, OCT-3/4, NANOG, ECAD 등의 유전자 마커의 발현을 지표로서 사용할 수 있다 (E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:443-452).

사람 ES 세포주로는, 예를 들어 WA01(H1) 및 WA09(H9) 는 WiCell Reserch Institute 로부터 입수 가능하고, KhES-1, KhES-2 및 KhES-3 은 Insititute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University (쿄토, 일본) 로부터 입수 가능하다.

(c) 그 밖의 다능성 줄기 세포

EG 세포는, 태생기의 시원 생식 세포로부터 수립되는, ES 세포와 유사한 다능성을 갖는 세포이다. LIF, bFGF, 줄기 세포 인자 등의 물질의 존재 하에서 시원 생식 세포를 배양함으로써 수립할 수 있다 (Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551).

(D) 유도 다능성 줄기 세포

nt ES 세포는, 핵이식 기술에 의해 제작된 클론 배아 유래의 ES 세포이며, 수정란 유래의 ES 세포와 거의 동일한 특성을 가진다 (T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502). 즉, 미수정란의 핵을 체세포의 핵으로 치환함으로써 얻어진 클론 배아 유래의 낭포의 내부 세포 덩어리로부터 수립된 ES 세포가 nt ES (nuclear transfer ES) 세포이다. nt ES 세포의 제작을 위해서는, 핵이식 기술 (J.B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646) 과 ES 세포 제작 기술 (상기 언급함) 과의 조합이 이용된다 (Kiyoka Wakayama et al., (2008), Experimental Medicine, Vol. 26, No. 5 (Suppl.), pp. 47-52). 핵 이식에 있어서는, 포유동물의 제핵된 미수정란에 체세포의 핵을 주입하여, 수 시간 배양함으로써 초기화할 수 있다.

Muse 세포는 WO2011/007900 에 기재된 방법에 의해 제조된 다능성 줄기 세포이다. 보다 상세하게는, 선유아세포 또는 골수 간질 세포를 장시간, 바람직하게는 8 시간 또는 16 시간 트립신 처리한 후, 부유 배양함으로써 얻어지는 다능성을 가진 세포이며, SSEA-3 및 CD105 에 대해 양성이다.

mGS 세포는 WO2005/100548 에 기재된 방법에 따라 정소 세포로부터 제조할 수 있다.

MAPC 는 J. Clin. Invest. 109:337-346 (2002) 에 기재되는 방법에 따라, 골수로부터 단리할 수 있다.

(2) 다능성 줄기 세포로부터 각종 분화 세포로의 분화 유도

줄기 세포로부터 각종 분화 세포로의 분화 유도는 자체 공지된 임의의 방법에 의해 실시할 수 있다. 예를 들어, 사람 ES 세포를 방사선 조사한 C3H10T1/2 세포주와 공배양하여, 낭상 구조체 (ES-sac) 를 유도함으로써 조혈 선구 세포로 분화시킬 수 있다 (Blood, 111: 5298-306, 2008). ES 세포로부터의 신경 줄기 세포, 신경 세포로의 분화 유도법으로서는, 배양체 형성법 (Mech Div 59(1) 89-102, 1996), 레티노산법 (Dev Biol 168(2) 342-57, 1995), SDIA 법 (Neuron 28(1) 31-40, 2000), NSS 법 (Neurosci Res 46(2) 241-9, 2003) 등 여러가지 방법이 알려져 있다. ES 세포로부터 심근 세포로의 유도 방법으로는, 지금까지, 레티노산, TGFβ1, FGF, dynorphin B, 아스코르브산, 일산화질소, FGF2 와 BMP2, Wnt11, PP2, Wnt3a/Wnt 저해제 등의 인자를 배지에 첨가하는 방법, Noggin 의 심근 분화 유도법 (Nat Biotechnol 23(5) 611, 2005) 등이 보고되어 있다. 게다가, SDIA 법 (Proc Natl Acad Sci USA 99 1580-5, 2002) 및 SFEB 법 (Nat Neurosci 8 288-96, 2005) 에 의한 ES/iPS 세포의 망막 세포로의 분화 유도법 등도 알려져 있다. 전자는 미분 ES 세포 콜로니의 세포 덩어리를 마우스 간질 유래의 PA6 세포와 공배양하는 것이며, 후자는 무혈청 배지 중에서 부유 배양하여 배아를 형성시킬 때 Dkk1/Lefty-A 를 첨가하여 망막 선구 세포를 포함하는 전뇌 영역의 세포의 분화 유도 효율을 향상시키는 방법이다. 이것을 한층 더 접착 배양함으로써, 성숙 RPE 세포 및 시 세포를 유도할 수 있다 (Proc Natl Acad Sci USA 102 11331-6, 2005; Nat Biotechnol 26 215-24, 2008).

또한, 조혈 줄기 세포로부터 각종 조혈 세포로의 분화 유도법, 혈관 내피 선구 세포로부터 혈관 세포로의 분화 유도법, 신경 줄기 세포로부터의 각종 신경 세포로의 분화 유도법, 간엽계 줄기 세포로부터의 지방 세포, 근관 세포 등으로의 분화 유도법 등, 조직 줄기 세포로부터 체세포로의 분화 유도법도 또한 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.

본 발명에서 미분화 세포의 제거 또는 저감 방법은, 미분화 세포가 혼입되거나 혼입 우려가 있는 분화 세포 집단에 색소 표피-유래 인자 (PEDF) 를 접촉시켜 미분화 세포의 아폽토시스를 유도하는 것을 특징으로 한다.

분화 세포 집단에 PEDF 를 접촉시키는 방법으로서는, (A) 분화 세포 집단의 배지에 PEDF 를 첨가하여 배양하는 방법, (B) 분화 세포 집단을 PEDF-분비 세포와 공배양하는 방법, 및 (C) 분화 세포에서 PEDF 를 분비 생성시키는 방법으로 크게 나뉜다.

(A) 분화 세포 집단의 배지에 PEDF 를 첨가해 배양하는 방법

배지에 첨가되는 PEDF 의 예로는, 서열 번호 2 로 나타내어지는 아미노산 서열 중, 아미노산 번호 1-399 로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 사람 PEDF (RefSeq Accession No. NP#002606), 다른 포유 동물에 있어서의 그 오르토로그 (예, 마우스 PEDF (RefSeq Accession No. NP#035470), 래트 PEDF (RefSeq Accession No. NP#808788), 소 PEDF (RefSeq Accession No. NP#776565), 개 PEDF (RefSeq Accession No. XP#854014), 침팬지 PEDF (RefSeq Accession No. XP#001155004), 닭 PEDF (RefSeq Accession No. XP#001234865) 등), 그들의 천연의 대립유전자 변이체 및 다형 변이체 (예, 서열 번호 2 의 아미노산 번호 53 (Thr) 이 Met 로 치환된 변이체, 서열 번호 2 의 아미노산 번호 113 (Pro) 이 Arg 로 치환된 변이체 등), 스플라이싱 변이체 (예, Journal of Neuroscience 15(7): 4992-5003, 1995; Protein Expression and Purification 6(4): 447-456, 1995; Investigative Ophthalmology and Visual Science 43(3): 821-829, 2002), 천연 및 인공의 활성 변이체 등을 들 수 있다. 본 발명의 방법에서 대상이 되는 분화 세포가 유래하는 동물 종과 동종이계의 PEDF 를 사용하는 일이 바람직하지만; 이종 PEDF 도 사용할 수 있다.

PEDF 는 온혈 동물의 RPE 세포, 지방 세포, 간세포, 수상 세포 등, 당해 단백질을 생성하는 세포로부터 단리 및 정제할 수 있거나, 또는 화학적 합성 또는 무세포 번역계에서 생화학 합성이 가능하다. 또는, 상기한 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산이 도입된 형질전환체로부터 생성되는 재조합 단백질일 수 있다.

온혈 동물의 RPE 세포, 지방 세포, 간세포, 수상 세포 등, 바람직하게는 RPE 세포로부터 분비되는 천연 PEDF 를 사용하는 경우, 예를 들어, 초대 배양 세포 및 다능성 줄기 세포를 분화 유도해 얻어진 PEDF 생성 세포를 적당한 배지 중에서 배양한 후, 여과, 원심분리 등에 의해 배양 상청을 분리하고, 그 상청 (순화 배지) 을 그대로 사용할 수 있다. 또는, 그 상청을 역상 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등의 크로마토그래피 등에 가하여, PEDF 를 단리 및 정제 또는 부분 정제 후에 사용할 수 있다.

PEDF 생성 세포용의 배지로서는, 동물 세포의 배양에 통상 사용되는 기본 배지에 1-20% 의 혈청 또는 혈청 대체물을 첨가한 기본 배지가 사용된다. 기본 배지로서는, 예를 들어 GMEM (Glasgow Minimum Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), Medium 199, Eagle＇s Minimum Essential Medium (EMEM), αMEM 배지, Dulbecco＇s modified Eagle＇s Medium (DMEM), Ham＇s F12 배지, RPMI 1640 배지, Fischer＇s 배지, 및 이들의 혼합 배지 등이 포함된다. 혈청 대체물의 예로서 알부민, 트란스페린, 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, Knockout Serum Replacement (KSR), ITS－서플리먼트 및 이들의 혼합물 등이 포함된다. PEDF 생성 세포의 배양은, 예를 들어 RPE 의 경우, 30-40℃, 바람직하게는 37-38.5℃ 에서, 6-144 시간, 바람직하게는 24-42 시간, 1-10%, 바람직하게는 2-10% CO₂ 분위기 하에서 실시할 수 있다.

PEDF 원으로서 천연 PEDF 를 사용하는 경우, 순화 배지, 정제 또는 부분 정제 PEDF 에 관계없이, PEDF 의 최종 농도가 0.01 - 100 μg/ml 가 되도록 분화 세포 집단의 배지에 첨가할 수 있다.

PEDF 원으로서 재조합 단백질 (rPEDF) 을 사용하는 경우, PEDF 를 코딩하는 핵산을 함유하는 형질전환체를 적절한 배지 중에서 배양한 후, 여과, 원심분리 등에 의해 배양 상청을 분리하고, 그 상청 (순화 배지) 을 그대로 사용할 수 있거나, 또는 그 상청을 상기와 동일한 크로마토그래피 등에 가하여, rPEDF 를 단리 및 정제 또는 부분 정제하여 사용한다.

PEDF 를 코딩하는 핵산은 DNA 또는 RNA 일 수 있거나, 또는 DNA/RNA 키메라, 바람직하게는 DNA 일 수 있다. 또한, 핵산은 두 가닥 또는 한 가닥일 수 있다. 두 가닥 핵산의 경우, 두 가닥 DNA, 두 가닥 RNA 또는 DNA:RNA 하이브리드일 수 있다. 한 가닥의 경우, 센스 가닥 (즉, 코딩 가닥), 또는 안티센스 가닥 (즉, 비-코딩 가닥) 일 수 있다. PEDF 를 코딩하는 DNA 의 예로서는, 서열 번호 1 로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 사람 pre-PEDF (RefSeq Accession No. NM#002615), 다른 포유동물에 있어서의 그 오르토로그 (예, 마우스 PEDF (RefSeq Accession No. NM#011340), 래트 PEDF (RefSeq Accession No. NM#177927), 소 PEDF (RefSeq Accession No. NM#174140), 개 PEDF (RefSeq Accession No. XM#848921), 침팬지 PEDF (RefSeq Accession No. XM#001155004), 닭 PEDF (RefSeq Accession No. XM#001234864) 등), 또한, 그들의 천연 대립유전자 변이체 및 다형 변이체 (예, 서열 번호 2 의 아미노산 번호 53 (Thr) 이 Met 로 치환된 변이체, 서열 번호 2 의 아미노산 번호 113 (Pro) 이 Arg 로 치환된 변이체 등), 스플라이싱 변이체 (예: Journal of Neuroscience 15(7): 4992-5003, 1995; Protein Expression and Purification 6(4): 447-456, 1995; Investigative Ophthalmology and Visual Science 43(3): 821-829, 2002), 천연 및 인공의 활성 변이체를 코딩하는 DNA 등일 수 있다.

PEDF 를 코딩하는 DNA 로는, 예를 들어, 그 DNA 의 서열 정보에 기초하여 적당한 프라이머를 합성하고, 상기의 PEDF 생성 세포, 바람직하게는 RPE 세포로부터 채취한 RNA 를 주형으로 하여 RT-PCR 를 실시함으로써, cDNA 를 단리할 수 있다. 또는, 온혈 동물의 게놈 DNA 를 통상적인 방법에 따라 제조하고, 게놈 PCR 등을 이용하여 PEDF 의 게놈 DNA 를 단리할 수 있다. PEDF 로는 많은 스플라이싱 변이체의 존재가 알려져 있으며, 변이체의 종류에 따라 미분화 세포에 대한 아폽토시스 유도 활성에 차이가 있을 수 있다. 따라서, 게놈 DNA 의 사용이 유리한 경우가 있다.

단리된 DNA 는, 숙주 세포에 적절한 발현 벡터로 클로닝하고, 통상적인 방법에 따라 숙주 세포에 벡터를 도입하여, 형질 전환체를 제조할 수 있다. 숙주 세포는 특별히 제한되지 않고, 대장균, 고초균 등의 세균, 효모, 곤충 세포, 동물 세포 등을 사용할 수 있다. 천연 PEDF 는 O-글리코실화 및 N-글리코실화, 인산화 등의 후-번역 개질을 거쳐, 이들이 PEDF 의 미분화 세포에서의 아폽토시스 유도 활성에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 바람직하게는 동물 세포, 특히 PEDF 를 코딩하는 DNA 가 유래하는 동물과 동종이계의 동물 세포를 사용할 수 있다. 동물 세포로서는, 예를 들어, 원숭이 COS-7 세포, 원숭이 Vero 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO 세포), dhfr 유전자-결손 CHO 세포, 마우스 L 세포, 마우스 AtT-20 세포, 마우스 골수종 세포, 래트 GH3 세포, 사람 FL 세포, HEK293 세포 등이 사용된다. 형질 전환체의 배양은, 숙주 세포의 종류에 따라 자체 공지된 방법을 적절히 선택해 실시할 수 있다. rPEDF 는 형질 전환체의 배양 상청을, 상기와 마찬가지로 크로마토그래피 등에 가하여 단리할 수 있다. 그 상청을 그대로 분화 세포 집단의 배지에 첨가할 수 있다.

PEDF 원으로서 rPEDF를 사용하는 경우, 순화 배지, 정제 또는 부분 정제 rPEDF 에 관계없이, rPEDF 의 최종 농도가 0.1 - 500 μg/ml 가 되도록 분화 세포 집단의 배지에 첨가할 수 있다.

(B) 분화 세포 집단을 PEDF-분비 세포와 공배양하는 방법

PEDF-분비 세포의 예로서는, 상기한 온혈 동물의 RPE 세포, 지방 세포, 간세포, 수상 세포 등, 바람직하게는 RPE 세포의 초대 배양, 또는 iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 RPE 세포, 지방 세포, 간세포, 수상 세포 등, 바람직하게는 RPE 세포를 들 수 있다. 분화 세포 집단 및 PEDF 분비 세포를 공배양하는 방법은 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는, 후술하는 실시예에 기재되는 대로, PEDF-분비 세포를 적당한 코팅제로 코팅한 배양 디쉬에 파종하고 분화 세포 집단을 배양 인서트에 파종한 트랜스웰 플레이트를 이용해 배양하는 방법을 들 수 있다. 동일한 원리로 스케일 업하여, 대량의 분화 세포 집단을 처리할 수도 있다. 배양은, 예를 들어, 30-40 ℃, 바람직하게는 37-38.5℃ 에서,6-144 시간, 바람직하게는 24-42 시간, 1-10%, 바람직하게는 2-10% CO₂ 분위기 하에서 실시할 수 있다.

(C) 분화 세포 자체에 의해 PEDF 를 분비 생성시키는 방법

분화 세포가 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 RPE 세포, 지방세포, 간세포, 수상 세포, 바람직하게는 RPE 세포인 경우, 배지에 PEDF 를 첨가하거나 PEDF 분비 세포와 공배양하거나 하는 일 없이, 분화 세포 자체에 의해 분비되는 PEDF 의 작용에 의해, 분화 세포 집단에 혼입된 미분화 세포의 아폽토시스가 유도될 수 있다.

또는, iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포에, 상기 (A) 에 있어서의 PEDF 를 코딩하는 DNA 를 포함하는 동물 세포용 발현 벡터를 도입하고, 그 다능성 줄기 세포의 분화를 유도할 때에 또는 분화 유도 후에, rPEDF 를 유도 발현시킴으로써, 잔존하는 미분화 세포를 자살시키거나, 또는 분화 세포로부터 분비되는 rPEDF 의 트랜스 효과에 의해 미분화 세포에 아폽토시스를 유도할 수 있다. 잔존하는 미분화 세포 내 rPEDF 를 유도 발현하는 방법의 예로서는, 메탈로티오네인-1 유전자 프로모터 (금, 아연, 카드뮴 등의 중금속, 덱사메타손 등의 스테로이드, 알킬화제, 킬레이트제, 사이토카인 등이 발현을 유도함) 등의 유도성 프로모터를 갖는 발현 벡터를 사용하는 방법, Cre-loxP 시스템을 이용해, Cre 리콤비나아제가 활성화될 때 PEDF 를 코딩하는 DNA 가 프로모터와 기능적으로 연결되도록 벡터를 디자인하는 방법 (예, 프로모터와 PEDF 코딩 DNA 를 같은 방향으로 배치된 2 개의 loxP 서열로 분리한다. 2 개의 loxP 서열들 사이에 약제 내성 유전자 등의 선택 마커 유전자의 발현 카세트를 삽입하는 것이 바람직하다) 등을 들 수 있다. 한편, 분화 세포로부터 분비되는 rPEDF 의 트랜스 효과에 의해 미분화 세포에 아폽토시스를 유도하는 방법으로서는, 상기와 동일한 방법에 더하여, 분화 세포 특이적 프로모터를 갖는 발현 벡터를 사용하는 방법을 들 수 있다. 분화 세포 특이적 프로모터로서는, 예를 들어, RPE 등에 특이적인 PEDF 의 내인성 프로모터, 간 등에 특이적인 알부민 및 α-페토프로테인의 프로모터, 전립선에 특이적인 전립선 특이적 항원 (PSA) 의 프로모터, 근육, 뇌 등 여러가지 장기에 특이적인 미토콘드리아형 크레아틴 키나아제 (MCK) 의 프로모터, 뇌 등의 신경계에 특이적인 미엘린 염기성 단백질 (MB), 신경교세포 섬유 산성 단백질 (GFAP) 및 신경 특이적 에놀라아제 (NSE) 의 프로모터들 등을 예시할 수 있다.

상기한 바와 같이, 미분화 세포가 혼입되거나 혼입 우려가 있는 분화 세포 집단에 색소 표피-유래 인자 (PEDF) 를 접촉시켜 미분화 세포의 아폽토시스를 유도 함으로써 얻어진 분화 세포 집단은, 미분화 세포를 실질적으로 포함하지 않는 정도까지 정제될 수 있다. 여기서 "미분화 세포를 실질적으로 포함하지 않는다" 란, 이식 상당량의 분화 세포 집단을 수취인에 이식할 경우 종양을 일으키지 않는 정도로 미분화 세포가 저감 및 제거된 것을 의미한다. "미분화 세포를 실질적으로 포함하지 않는다" 는 것의 검증은, 예를 들어, 분화 세포 집단을 다시 미분화 조건 하에서 배양한 후, 미분화 세포의 발생을, 미분화 세포에 특이적인 성질을 이용해 검출함으로써 실시할 수 있다. 이 특이적 성질의 예로는 콜로니의 형성, 미분화 특이적 항원의 발현, 미분화 특이적 유전자의 발현 등을 들 수 있다. 미분화 특이적 항원은 한정되지 않지만, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60 및 Tra1-81 로 이루어진 군에서 선택된다. 사람에서는, 미분화 세포에 있어서 SSEA-1 은 검출되지 않는다. 따라서, SSEA-1 대신에, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60 및 Tra1-81 이 바람직하게 사용된다. 또, 미분화 특이적 유전자의 예로는 WO2007/069666 에 거론되는 유전자를 들 수 있다.

간편하고 또한 충분한 감도 및 특이도를 제공할 수 있다는 점에서, 콜로니의 형성을 관찰하여 미분화 세포의 발생을 검출하는 것이 바람직하다. 콜로니의 측정은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 현미경 하에서 계수되어 그 수에 의해 평가된다. 이 측정은, 기계적으로 행해져도 되고, 육안 관찰로 행해져도 된다. 한편, 미분화 특이적 항원 또는 유전자의 발현을 나타내는 세포는, FACS 를 이용해 그러한 항원 또는 유전자를 발현하고 있는 세포의 수에 기초해 평가할 수 있다.

미분화 세포를 실질적으로 포함하지 않는 분화 세포 집단은, 통상의 수단에 따라 의약상 허용가능한 담체와 혼합하는 것에 의해, 주사제, 현탁제, 링겔제 등의 비경구 제제로서 제조된다. 당해 비경구 제제에 포함될 수 있는 의약상 허용가능한 담체의 예로서는, 생리 식염수, 포도당, 그 밖의 보조약을 포함하는 등장 용액 (예를 들어, D-소르비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등) 등의 주사용 수성액을 들 수 있다. 본 발명의 이식 요법제는, 예를 들어, 완충제 (예를 들어, 인산염 완충액, 아세트산나트륨 완충액), 무통화제 (예를 들어, 염화벤잘코늄, 염산 프로카인 등), 안정제 (예를 들어, 사람 혈청 알부민, 폴리에틸렌 글리콜 등), 보존제, 산화방지제 등과 혼합될 수 있다. 본 발명의 이식 요법제를 수성 현탁제로서 제제화하는 경우, 상기 수성액에 약 1×10⁶ ~ 약 1×10⁸ 세포/mL 가 되도록, 분화 세포를 현탁시킬 수 있다.

본 발명의 이식 요법제는, 세포의 동결 보존에 통상 사용되는 조건으로 동결 보존된 상태로 제공되어 사용시 용융하여 사용할 수 있다. 이 경우, 혈청 혹은 혈청 대체물, 유기 용제 (예, DMSO) 등을 추가로 포함할 수 있다. 이 경우, 혈청 혹은 혈청 대체물의 농도는 특별히 한정되지 않으며, 약 1 ~ 약 30% (v/v), 바람직하게는 약 5 ~ 약 20% (v/v) 일 수 있다. 유기 용제의 농도는 특별히 한정되지 않으며, 0 ~ 약 50% (v/v), 바람직하게는 약 5 ~ 약 20% (v/v) 일 수 있다.

본 발명은 또한 PEDF 를 함유하는 미분화 세포의 아폽토시스 유도제를 제공한다. 여기서, PEDF 는, 상기 (A) 및 (B) 에 기재되는 바와 같이, 천연 혹은 재조합 PEDF 를 분비에 의해 제조하는 세포의 배양 상청 (순화 배지), 그 상청으로부터의 완전 혹은 부분 정제물, 또는 천연 혹은 재조합 PEDF 를 분비에 의해 생성하는 세포 자체일 수 있다.

본 발명의 아폽토시스 유도제는, 상기와 같은 인비트로에서의 사용에 더하여, 분화 세포 집단을 수취인에 이식할 때에, 병용 투여 또는 이식함으로써, 인비트로에서의 종양 형성 억제제로서 사용할 수 있다. 단리된 PEDF 를 사용하는 경우, 필요에 따라 의약상 허용가능한 담체와 혼합하여 주사제 등의 여러가지 제제 형태로 조제하여 수취인에 투여할 수 있다. 약리학적으로 허용가능한 담체로서는, 제제 물질로서 관용되는 각종 유기 또는 무기 담체 물질이 이용될 수 있고, 고형 제제의 경우 부형제, 활택제, 결합제, 붕괴제; 액상 제제의 경우 용제, 용해보조제, 현탁화제, 등장화제, 완충제, 무통화제 등으로서 배합된다. 필요에 따라, 방부제, 항산화제, 착색제, 감미제 등의 제제 첨가물도 또한 사용할 수 있다.

부형제의 바람직한 예로서는, 젖당, 자당, D-만니톨, D-소르비톨, 전분, α화 전분, 덱스트린, 결정 셀룰로오스, 저치환도 하이드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 아라비아검, 풀루란, 경질 무수 규산, 합성 규산 알루미늄, 마그네슘 알루미노 메타실리케이트를 들 수 있다.

활택제의 바람직한 예로서는, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 탤크, 콜로이드 실리카 등을 들 수 있다.

결합제의 바람직한 예로서는, α화 전분, 자당, 젤라틴, 아라비아검, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 결정 셀룰로오스, 자당, D-만니톨, 트레할로스, 덱스트린, 풀루란, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 들 수 있다.

붕괴제의 바람직한 예로서는, 젖당, 자당, 전분, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 크로스카멜로오스 나트륨, 카르복시메틸 전분 나트륨, 경질 무수 규산, 저치환도 하이드록시프로필셀룰로오스 등을 들 수 있다.

용제의 바람직한 예로서는, 주사용수, 생리 식염수, 링거액, 알코올, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 참기름, 옥수수유, 올리브유, 면실유 등을 들 수 있다.

용해 보조제의 바람직한 예로서는, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, D-만니톨, 트레할로스, 벤조산 벤질, 에탄올, 트리스아미노메탄, 콜레스테롤, 트리에탄올아민, 탄산 나트륨, 시트르산 나트륨, 살리실산 나트륨, 아세트산 나트륨 등을 들 수 있다.

현탁화제의 바람직한 예로서는, 스테아릴트리에탄올아민, 라우릴 황산 나트륨, 라우릴 아미노프로피온산, 레시틴, 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 모노스테아르산 글리세롤 등의 계면활성제; 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 메틸셀룰로오스, 하이드록시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스 등의 친수성 고분자; 폴리소르베이트, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 등을 들 수 있다.

등장화제의 바람직한 예로서는, 염화나트륨, 글리세린, D-만니톨, D-소르비톨, 포도당 등을 들 수 있다.

완충제의 바람직한 예로서는, 인산염, 아세트산염, 탄산염, 시트르산염 등의 완충액 등을 들 수 있다.

무통화제의 바람직한 예로서는, 벤질 알코올 등을 들 수 있다.

방부제의 바람직한 예로서는, 파라옥시벤조에이트, 클로로부탄올, 벤질 알코올, 페네틸 알코올, 데히드로아세트산, 소르브산 등을 들 수 있다.

항산화제의 바람직한 예로서는, 아황산염, 아스코르브산염 등을 들 수 있다.

착색제의 바람직한 예로서는, 수용성 식용 타르 색소 (예, 식용 적색 2 호 및 3 호, 식용 황색 4 호 및 5 호, 식용 청색 1 호 및 2 호 등의 식용 색소), 수불용성 레이크 색소 (예, 상기 수용성 식용 타르 색소의 알루미늄 염 등), 천연 색소 (예, β-카로틴, 클로로필, 적색 산화제2철 등) 등을 들 수 있다.

감미제의 바람직한 예로서는, 사카린 나트륨, 글리시리진산2칼륨, 아스파탐, 스테비아 등을 들 수 있다.

상기와 같이 제형화된 본 발명의 아폽토시스 유도제는, 경구 또는 비경구 투여될 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여이다. 구체예로는 주사 제형, 경비 투여 제형, 경폐 투여 제형, 경피 투여 제형 등을 들 수 있다. 주사 제형의 예로서는, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다.

본 발명의 아폽토시스 유도제의 1 회 투여량은, 예를 들어, PEDF 량으로서 0.1 ~ 100 mg 의 범위내에서 선택될 수 있고, 이것을 1 ~ 3 일에 1 회 간격으로, 1 ~ 3 개월 정도 반복 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 아폽토시스 유도제의 투여량, 투여 간격 및 투여 기간은 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 아폽토시스 유도제의 첫회 투여는, 세포 이식과 동시에 또는 그 전후에 이루어질 수 있다.

한편, 본 발명의 아폽토시스 유도제가 PEDF-분비 세포 형태인 경우에는, 본 발명의 세포 이식 요법제와 마찬가지로 제형화할 수 있다. 이식 세포인 분화 세포와 PEDF-분비 세포가 상이한 세포 종인 경우, 본 발명의 아폽토시스 유도제는 생체적합성 고형 담체 (예, 겔 시트) 에 매립되어, 이식 세포와 동시에 환부에 이식되고, 미분화 세포에서 PEDF 의 아폽토시스 유도 효과가 충분히 달성된 후에 용이하게 제거가능한 형태로 제형화되는 것이 바람직하다. 또는, PEDF-분비 세포에 HSV-tk 유전자 등의 자살 유전자를 도입하고, 이것을 생분해성 폴리머로 이루어지는 고형 담체에 매립시키고 이식용 세포와 동시에 환부에 이식한다. 아폽토시스 유도 효과가 충분히 달성된 후에, 예를 들어 HSV-tk 유전자를 사용한 경우이면, 간시클로비르를 수취인에 투여함으로써 PEDF-분비 세포는 사멸된다. 따라서, 재수술에 의한 세포 제거가 불필요해져, 환자에 대한 부담을 경감할 수 있다.

본 발명을 이하의 실시예를 들어 상세하게 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들의 실시예에 의해 조금도 한정되는 것은 아니다.

실시예

[재료 및 방법]

사람 샘플 및 동물을 사용하는 모든 실험은, Foundation for Biomedical Research Innovation (FBRI) 의 Institutional Review Board (IRB), RIKEN Center for Evelopmental Biology (RIKEN CDB), 및 FBRI 의 동물 실험 위원회에서 심사되었다.

(1) 세포 배양

사람 초대 망막 색소 표피 (RPE, Lonza) 는, 첨가물 (L-글루타민, GA-1000 및 bFGF, Lonza) 을 포함하는 망막 색소 표피 세포 기본 배지 (Lonza Biologics, 바젤, 스위스) 중에 유지했다. 사람 iPS 세포 (iPSC) 주 253G1 (BioResource Center, RIKEN, Tsukuba) 및 454E2 (WO2012/115244 참조) 는, 사람 ES 세포용 배지 및 5 ng/ml bFGF (Peprotech) 중에서 피더 세포 SNL (BMC Genomics (2006) 7: 248) 상에 유지시켰다. iPSC 는 5 ng/ml bFGF 를 첨가한 ReproFF2 (Reprocell) 중에서 배양했다. iPSC-유래 RPE (WO2012/115244 참조) 는 RPE 유지 배지 (B-27 첨가물 (Invitrogen), 2 mM L-글루타민 (Invitrogen), 0.5 mM SB431542 (Sigma-Aldrich) 및 10 ng/ml bFGF (Wako Pure Chemical Industries) 를 첨가한 DMEM:F12 (7:3)(Sigma-Aldrich)) 중에서 유지했다.

(2) 재조합 PEDF (rPEDF) 또는 항-PEDF 항체의 존재하 또는 부재하에서의 iPSC 의 세포 증식

253G1 세포를, Matrigel (BD Bioscience) 로 코팅한 8 μm 구멍 지름의 12-웰 트랜스웰 세포 배양 인서트 (BD) 에 파종하고, 1-50 μg/ml rPEDF (Millipore; cat # GF134 lot: DAM 1821182), 5 μg/ml 항-PEDF 폴리클로날 항체 (BioProducts) 또는 정상 래빗 IgG (SantaCruz) 의 존재하 또는 부재하에, bFGF 를 첨가한 ReproFF2 배지 중에서, 디쉬 저면에 파종한, 초대 RPE 또는 253G1-유래 RPE 와 공배양했다. 공배양 없이 배양 4-6 일째에 있어서의 50 μg/ml rPEDF 존재하 및 부재하에서의 253G1 세포의 세포 증식을 평가했다.

(3) 칩 해석

253G1 또는 253G1-유래 RPE 로부터, RNAeasy Plus Mini Kit (Quiagen) 를 이용해 제조자의 지시내용에 따라, 전체 RNA 를 단리하여, Gene Chip Human Genome U133 Plus ver 2.0 (Affymetrix) 으로 하이브리다이즈시켰다. 해석 데이터는 GEO 데이터 세트 (accession Nos GSE43257) 로부터 검색할 수 있다.

(4) ELISA

초대 RPE 또는 iPSC (253G1)-유래 RPE 의 24 시간 배양물로부터 회수한 배양 배지 (순화 배지) 중의 PEDF 를, 사람 ELISA 키트 (BioVendor) 를 이용해 제조자의 지시내용에 따라 측정했다.

참고예 1: iPS 세포로부터 RPE 세포로의 분화 유도

다능성 줄기 세포로부터 망막 색소 표피 (RPE) 로의 강한 분화 프로토콜을 수립하기 위해, 도 1A 에 나타낸 분화 프로토콜을 사용하였다. 재현성이 있는 iPSC-유래 RPE 의 프로파일을 제공하기 위해서, 시판되는 iPSC 클론 253G1 (Nakagawa M, et al. (2008) Nat Biotechnol. 26:101-106; BioResource Center, RIKEN, Tsukuba) 를 RPE 분화를 위한 세포 소스로서 사용하였다. RPE 는, 디쉬 중에서 배양할 때, 산발적 색소 침착을 보이는 다각형의 단층 세포이다. iPSC 클론 253G1-유래 RPE 및 초대 RPE 는, 현미경 관찰에서 동일한 형태를 나타냈다 (도 1B). iPSC-유래 RPE 가 초대 RPE 에 특징적인 유전자 발현을 나타내는지 여부를 조사하기 위해, RPE65, CRALBP 및 베스트로핀의 발현을 RT-PCR 에 의해 분석했다. 253G1-유래 RPE 세포는 RPE65, CRALBP 및 베스트로핀의 mRNA 를 발현하고 있었지만, Lin28, Oct3/4 등의 다능성 관련 유전자는 발현하고 있지 않았다 (도 1C). 타이트 교차점 특이적 단백질인 ZO-1 도, 면역 형광 염색에 의해, 253G1-유래 RPE 및 초대 RPE 의 양방에서 검출되었다 (도 1D).

실시예 1: iPSC-유래 RPE 세포와의 공배양에 의한 iPS 세포의 증식 저해

iPSC-유래 RPE 로부터 분비되는 인자의, 인비트로에서의 iPS 세포에 미치는 영향을 조사하기 위해, 도 2A 에 나타낸 공배양 실험을 계획했다. 즉, 마트리겔 (BD) 로 코팅 한 배양 인서트 (트랜스웰, Corning) 상에 파종한 iPSC 를, iPS 세포용 배지 (bFGF 를 첨가한 무혈청의 ReproFF) 중에서, CELL start (Invitrogen) 로 코팅한 디쉬 상에 파종한 iPSC-유래 RPE 와 공배양했다. 4 일 마다 배양 인서트중의 iPSC 를 회수하여 세포수를 계수했다. 그 결과, iPSC-유래 RPE 와 공배양함으로써, iPSC 의 증식은 현저하게 저해되는 것이 분명해졌다 (도 2B, 2C). iPSC 를 초대 RPE 와 공배양했을 경우에서도, 동일한 트랜스 효과가 관찰되었다 (도 3A, B 및 C). iPSC-유래 RPE 와 공배양한 iPSC 의 현저한 증식 저해는, 적어도 부분적으로는, 매우 분명한 TUNEL 어세이 양성 세포의 존재에 의해 증명되는 바와 같이, 아폽토시스 세포사에 의해 중재된다 (도 2D, 2E). 공배양에 있어서의 잔존 iPSC 의, 추가의 면역 염색 및 정량적 RT-PCR 분석 결과는, Lin28, Oct3/4 및 Nanog 등의 다능성 관련 유전자의 발현은 현저하게 감소하고 iPSC-유래 RPE 순화 배지는 iPSC 의 분화를 촉진하는 것을 시사한다 (도 2F, 2G).

이들의 지견에 근거해, 본 발명자들은, iPSC 의 증식에 트랜스 효과를 미치는, iPSC-유래 RPE- 및 초대 RPE-유래의 인자를 탐색하기 위하여, 초대 RPE 및 253G1-유래 RPE, 그리고 친주의 iPSC 클론 253G1 에 대해, 유전자 칩 해석을 실시했다. 결과를 표 1 에 나타낸다. 초대 RPE 와 iPSC-유래 RPE 의 양방에서 고발현하고, 또한 iPSC 에 있어서 발현이 낮거나 발현하고 있지 않는 일부 분비 인자가 추출되었다. 이들은 항종양 효과를 나타내는 것으로 보고된 색소 표피-유래 인자 (PEDF), 혈관 내피 증식 인자 (VEGF) 및 뼈형성 단백질 4 (BMP4) 를 포함하였다.

실시예 2: PEDF 에 의한 iPS 세포의 아폽토시스 세포사의 유도

iPSC-유래 RPE 순화 배지 중의 PEDF 단백질을, 항-PEDF 항체 (BioProducts, MD) 를 이용해 웨스턴 블롯팅에 의해 검출했다 (도 4A). 공배양하고 있지 않는 신선한 iPS 세포 배지를 대조 샘플로서 사용하였다. 세포 배양 24 시간 (신선한 배지로 교환 후 24 시간) 에서의 PEDF 레벨을 ELISA 에 의해 측정했다. 초대 RPE 순화 배지 및 iPSC-유래 순화 배지 둘 모두 상당량 (1 μg/ml 초과) 의 PEDF 를 포함하고 있었다 (도 4B).

따라서, iPSC 의 증식에 미치는 PEDF 의 영향을 시험했다. 항-PEDF 중화 항체 (BioProducts, MD) 를 공배양계에 첨가하고, 배양 인서트 중의 iPSC 의 증식을 조사했다. 253G1-유래 RPE 와 공배양한 253G1 의 증식은, 컨트롤 IgG 의 존재하에서 현저하게 저해되었지만, 이러한 세포 증식 저해는 항-PEDF 항체의 존재하에서 상당히 저지되었다 (도 4C). 항-PEDF 중화 항체의 용량 및 종류를 최적화한 것은 아니지만, 항-PEDF 항체의 첨가에 의해 거의 절반 수의 iPSC 가 구출되었다 (도 4D). 이 결과는, iPSC 의 아폽토시스 세포사가 항-PEDF 중화 항체에 의해 저지되는 것을 시사한다 (도 4E, 4F). 그러나, 항-PEDF 항체의 존재하에서 조차도, 다능성 관련 단백질 Oct3/4 의 발현은 저하하고 (도 4G), Lin28, Oct3/4 및 Nanog 의 mRNA 발현도 저하하였다 (도 4H). 253G1-유래 RPE 와 공배양했을 때에, 253G1 세포의 분화가 항-PEDF 항체의 첨가에 의해 저해되지 않았던 것은 흥미로운 일이다. 이들 결과는, PEDF 이외의 RPE 로부터의 분비 인자가 생존 iPSC 의 분화를 촉진할 가능성을 시사한다.

PEDF 가 iPSC 의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위해, 재조합 PEDF 단백질 (rPEDF) 을 사용하였다. 50 μg/ml 의 rPEDF 는 iPSC 의 증식을 저해하고 (도 5A, 5B), TUNEL 어세이에 의해 입증되는 바와 같이 아폽토시스 세포사를 유도했다 (도 5C, 5D). 50 μg/ml 의 rPEDF 는 또한 사람 ES 세포 (KhES-1) 의 아폽토시스 세포사도 또한 유도했다 (도 6). rPEDF 첨가 후에 잔존하는 iPSC 의 형태는, 미처리 iPSC 와 같았다 (도 5A). 또한, 잔존 세포에 있어서, 다능성 관련 유전자 Lin28, Oct3/4 및 Nanog 의 mRNA 발현 저하가 관찰되지 않았다 (도 5E). DAPI 양성 세포의 계수에 의해 얻어진, rPEDF 처리 후의 세포수는 일정하지 않았다. 이것은, rPEDF 첨가 후의 다능성 관련 유전자 mRNA 의 상향규제를 설명할 수 있다. 다음으로, PEDF 를 개재하여 iPSC 에 아폽토시스를 일으키는 시그널 전달 경로에 대해 조사했다. 웨스턴 블롯팅의 결과, 기존 보고 (Gonzaleza R, et al (2010) Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 107 3552-3557) 와 일치하는, iPSC 의 rPEDF 자극 후에, p38 MAP 키나아제의 인산화 및 개열 카스파제-3 분자가 검출되었다 (도 5F, 5G).

이들의 결과를 종합하면, PEDF 는 iPSC 의 아폽토시스 세포사를 유도하지만, iPSC 의 분화는 유도하지 않는다고 생각된다.

실시예 3: RPE 세포 시트의 동시 이식에 의한 iPSC 로부터의 종양 형성 억제

임상의 장소에서는, 약 2-5 x 10⁴ RPE 세포를 포함하는, RPE 세포 시트 (1.3 mm x 3 mm 사이즈) 1 장 또는 2 장을, 노인성 황반 변성 환자의 망막에 이식한다. iPSC-유래 세포 산물에 잔존하는 미분화 iPSC 혹은 충분히 분화하고 있지 않는 세포로부터의 종양 형성의 가능성을 없애는 것은 이식 후의 중요한 과제이다. 그래서, 본 발명자들은, 망막 내 이식 후 잔존하는 iPSC 에 대한 RPE 의 트랜스 효과를 평가하기 위하여, 면역 부전 동물 모델을 이용해, RPE 시트 존재하에서 iPSC 스파이크 시험을 실시하고, iPSC 의 종양 형성 능력을 조사했다. RPE 시트는, WO 2012/115244 에 기재된 방법에 따라 콜라겐 겔 상에 제조했다. 예비 실험으로서 누드 래트 (F344/NJcl-rnu/rnu) 및 누드 마우스 (BALB/cA, JCl-nu/nu, SCID: C.B-17/Icr-scid/scid, Jcl, NOD-SCID: NOD/ShiJic-scid, Jcl, NOG: NOD/ShiJic-scid, IL-2 Rg KO Jic) 를 포함하는 여러 가지의 면역 부전 동물 모델에, 몇가지 용량의 iPSC 를 피하 또는 망막내 주사했다. 그 결과, 기존 보고 (J Biol Chem 277(11): 9492-7, 2002) 와 일치하는, 마트리겔 (BD) 과 함께 피하 주사했을 경우에 iPSC 및 HeLa 세포로부터의 종양 형성에 관해서 NOG 마우스가 가장 감수성이 높았다. 즉, 10² 개, 10³ 개 또는 10⁴ 개의 iPSC (클론 253G1 또는 454E2) 를, 253G1- 또는 454E2-유래의 RPE 세포 시트 (약 2 x 10⁵ RPE 세포를 포함) 와 함께 NOG 마우스에 피하 이식하여 종양 형성을 조사했다. 그 결과, 10³ 개 또는 10⁴ 개의 iPSC 를 이식했을 경우, RPE 를 동시 이식시킨 마우스에서는, RPE 를 이식하지 않았던 마우스에 비해, 종양 형성 빈도가 현저하게 저하함을 나타냈다 (도 7). ANOVA 에 의해 RPE 이식군과 RPE 비이식군과의 유의차 검정을 실시했다. 그 결과, 10³ 개 또는 10⁴ 개의 iPSC 를 이식했을 경우에, 양 그룹 간에 유의차를 인정할 수 있었다 (P<0.01).

실시예 4: 각종 분화 세포의 PEDF 감수성의 검토

여러 가지의 배양 세포 (분화 세포) 로서는, 이하의 세포 (사람 심근 세포 (Human Cardiac Myocytes, Cat.6200, ScienCell), 사람 연골 세포 (NB6) 및 사람 간세포 (Human Hepatocytes, Cat.5200, ScienCell)) 의 P1 ~ P3 을 사용했다. 각 세포용 배지 (Cardiac Myocytes Medium, Cat.6201, Gluta Max 함유 DMEM/F12, 2013-06, Gibco and Hepatocyte Medium, Cat.5201) 에서, 성숙 상태의 iPSC-유래 RPE 세포를 48 시간 배양하여 각 순화 배지를 얻었다. 병행하여, 상기 각 분화 세포를 8-웰 챔버 슬라이드 상에 20,000 개/챔버가 되도록 파종하고, 각 세포용 배지에서 하룻밤 배양했다. 이어서, 상기 배지를, 상기 각 순화 배지, 또는 재조합 PEDF 를 50 μg/ml 의 농도가 되도록 첨가한 각 세포용 배지로 교환했다. 각각의 배지는 48 시간 마다 교환했다.

심근 세포에 대해서는 배양 1, 3 및 6 일째, 연골 세포에 대해서는 배양 1, 3 및 5 일째, 간세포에 대해서는 1, 3, 6 및 8 일째에, 회수하여 세포수를 계수했다. 결과를 도 8 ~ 10 에 나타낸다. 심근 세포 및 연골 세포는, iPSC-유래 RPE 세포 순화 배지 및 재조합 PEDF 첨가 배지의 양쪽 배지에서, 세포 증식에 대한 영향은 보여지지 않았다 (도 8 및 9). 한편, 간세포의 경우에는, iPSC-유래 RPE 세포 순화 배지 및 재조합 PEDF 첨가 배지의 양쪽 배지에서, 세포 증식 속도의 저하를 보였지만, 현저한 아폽토시스는 보여지지 않았다 (도 10).

이상으로부터, PEDF 를 사용한 본 발명의 세포 선별법은, RPE 뿐만 아니라, 여러 가지의 분화 세포 집단에 혼입되는 미분화 세포의 선택적 제거에 적용 가능하다는 것을 보여준다.

산업상 이용가능성

본 발명의 선별 방법에 의하면, PEDF 가 미분화 세포의 아폽토시스를 유도하므로, 미분화 세포를 목적하는 분화 세포로 유도한 후, PEDF 로 처리함으로써 미분화 세포를 제거하고 얻어진 분화 세포의 순도를 높여 투여 대상에 안전하게 투여하는 것이 가능하게 된다. 특히 미분화 세포를 투여하면 암화할 가능성이 있기 때문에, 본 발명은 재생 의료에 있어서의 암화 리스크를 저감시키는데 매우 중요하다.

본 출원은, 2013 년 3 월 25 일자로 일본에 출원된 일본 특허출원 2013-062765 를 기초로 하고 있으며, 그 내용은 모두 본 명세서 중에 포함된다.

<110> FOUNDATION FOR BIOMEDICAL RESEARCH AND INNOVATION <120> Method of selecting cells <130> 092164 <150> JP 2013-062765 <151> 2013-03-25 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1257 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1254) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(57) <220> <221> mat_peptide <222> (58)..(1254) <400> 1 atg cag gcc ctg gtg cta ctc ctc tgc att gga gcc ctc ctc ggg cac 48 Met Gln Ala Leu Val Leu Leu Leu Cys Ile Gly Ala Leu Leu Gly His 1 5 10 15 agc agc tgc cag aac cct gcc agc ccc ccg gag gag ggc tcc cca gac 96 Ser Ser Cys Gln Asn Pro Ala Ser Pro Pro Glu Glu Gly Ser Pro Asp 20 25 30 ccc gac agc aca ggg gcg ctg gtg gag gag gag gat cct ttc ttc aaa 144 Pro Asp Ser Thr Gly Ala Leu Val Glu Glu Glu Asp Pro Phe Phe Lys 35 40 45 gtc ccc gtg aac aag ctg gca gcg gct gtc tcc aac ttc ggc tat gac 192 Val Pro Val Asn Lys Leu Ala Ala Ala Val Ser Asn Phe Gly Tyr Asp 50 55 60 ctg tac cgg gtg cga tcc agc acg agc ccc acg acc aac gtg ctc ctg 240 Leu Tyr Arg Val Arg 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Ile Asn Asn Trp Val Gln Ala Gln Met Lys Gly Lys Leu 180 185 190 gcc agg tcc aca aag gaa att ccc gat gag atc agc att ctc ctt ctc 624 Ala Arg Ser Thr Lys Glu Ile Pro Asp Glu Ile Ser Ile Leu Leu Leu 195 200 205 ggt gtg gcg cac ttc aag ggg cag tgg gta aca aag ttt gac tcc aga 672 Gly Val Ala His Phe Lys Gly Gln Trp Val Thr Lys Phe Asp Ser Arg 210 215 220 aag act tcc ctc gag gat ttc tac ttg gat gaa gag agg acc gtg agg 720 Lys Thr Ser Leu Glu Asp Phe Tyr Leu Asp Glu Glu Arg Thr Val Arg 225 230 235 240 gtc ccc atg atg tcg gac cct aag gct gtt tta cgc tat ggc ttg gat 768 Val Pro Met Met Ser Asp Pro Lys Ala Val Leu Arg Tyr Gly Leu Asp 245 250 255 tca gat ctc agc tgc aag att gcc cag ctg ccc ttg acc gga agc atg 816 Ser Asp Leu Ser Cys Lys Ile Ala Gln Leu Pro Leu Thr Gly Ser Met 260 265 270 agt atc atc ttc ttc ctg ccc ctg aaa gtg acc cag aat ttg acc ttg 864 Ser Ile Ile Phe Phe Leu Pro Leu Lys Val Thr Gln Asn Leu Thr Leu 275 280 285 ata gag gag agc ctc acc tcc gag ttc att cat gac ata gac cga gaa 912 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Pro Leu Asp Tyr His Leu Asn Gln Pro Phe Ile Phe Val Leu Arg Asp 385 390 395 400 Thr Asp Thr Gly Ala Leu Leu Phe Ile Gly Lys Ile Leu Asp Pro Arg 405 410 415 Gly Pro

Claims (16)

1. 미분화 세포가 혼입되거나 혼입 우려가 있는 분화 세포 집단으로부터, 미분화 세포를 제거 또는 저감시키는 방법으로서, 그 분화 세포 집단에 색소 표피-유래 인자를 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 미분화 세포가 3 배엽 계통으로의 분화능을 갖는 다능성 줄기 세포인 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 미분화 세포가, 추가로 Lin28, Oct3/4 및 Nanog 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미분화 마커를 발현하는 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 미분화 세포가 iPS 세포 또는 ES 세포인 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 미분화 세포의 아폽토시스 (apoptosis) 를 유도하는 방법.
6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 분화 세포의 아폽토시스를 유도하지 않는 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 분화 세포가 혈관 내피 세포 이외의 분화 세포인 방법.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 분화 세포 집단이 미분화 세포의 분화 유도에 의해 얻어지는 방법.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어지는 미분화 세포를 실질적으로 포함하지 않는 분화 세포 집단을 포함하는, 세포 이식 요법제.
10. 색소 표피-유래 인자를 포함하는, 미분화 세포의 아폽토시스 유도제.
11. 제 10 항에 있어서, 미분화 세포가 3 배엽 계통으로의 분화능을 갖는 다능성 줄기 세포인 미분화 세포의 아폽토시스 유도제.
12. 제 11 항에 있어서, 미분화 세포가, 추가로 Lin28, Oct3/4 및 Nanog 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미분화 마커를 발현하는 미분화 세포의 아폽토시스 유도제.
13. 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 미분화 세포가 iPS 세포 또는 ES 세포인 미분화 세포의 아폽토시스 유도제.
14. 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 분화 세포의 아폽토시스를 유도하지 않는 미분화 세포의 아폽토시스 유도제.
15. 제 14 항에 있어서, 분화 세포가 혈관 내피 세포 이외의 분화 세포인 미분화 세포의 아폽토시스 유도제.
16. 제 9 항에 있어서, 제 10 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 미분화 세포의 아폽토시스 유도제를 포함하는 세포 이식 요법제.

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