JP6460482B2 - 多能性幹細胞から生殖細胞への分化誘導方法 - Google Patents
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Description
本発明は、転写因子を用いエピブラスト様細胞から始原生殖細胞様細胞を誘導する方法、そのための該転写因子を含有する試薬、該方法により得られる始原生殖細胞様細胞を含有する細胞集団、及び該細胞集団から生殖細胞系列に属する細胞を誘導する方法に関する。
生殖細胞系列は、合体して全能性の接合子を形成する雄性及び雌性配偶子の形成により、生命の継続を確かなものとする。生殖細胞の決定及び発生は、生殖及び遺伝において、極めて重要である。マウスにおいて、***及び卵母細胞のいずれもの前駆細胞である始原生殖細胞(PGC)は、最も重要なものとして骨形成タンパク質4(BMP4)を含む、胚体外組織からのサイトカインに応答して、エピブラストに生じる(非特許文献1及び2)。私たちは、近年、アクチビンA(ActA)及び塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含むサイトカインを用いて、胚性幹細胞(ESC)/誘導多能性幹細胞(iPSC)をエピブラスト様細胞(EpiLC)へ誘導し、その後、BMP4を含むサイトカインを用いて、始原生殖細胞様細胞(PGCLC)へと誘導する培養系を確立した(特許文献1、非特許文献3及び4)。雄性及び雌性PGCLCは、***形成及び卵子形成への最大限の潜在力を有し、従って、生殖細胞決定経路及びそれに続くin vitroでの発生の機構を明らかにしかつ制御する可能性を有するかもしれない(特許文献1、非特許文献3及び4)。
次に、私たちは、テトラサイクリン制御要素(TRE)の制御下で、Blimp1、Prdm14又はTfap2cを発現するpiggyBacトランスポゾンベースのベクターを構築し(図5d)、BVSCR26rtTA ESC(XY核型)(図5a〜c)にこれらのベクターを組込んで(infected)、3つ全てのTF(BVSCR26rtTA BP14A細胞)、3つのTFのうち2つ(BVSCR26rtTA BP14、BA及びP14A細胞)又は3つのTFのうち1つ(BVSCR26rtTA B、P14及びA細胞)の導入遺伝子を有するBVSCR26rtTA ESCを単離した(図1a、図5d、e)。
[1] 単離したエピブラスト又はエピブラスト様細胞(EpiLC)から始原生殖細胞様細胞(PGCLC)を製造する方法であって、該エピブラスト又はEpiLCに
(i) Blimp1、Prdm14及びTfap2c;
(ii) Blimp1及びPrdm14;
(iii) Blimp1及びTfap2c;
(iv) Prdm14及びTfap2c; 並びに
(v) Prdm14;
から成る群より選択される外来性転写因子を発現させ、それによって、一時的な中胚葉プログラムを獲得することなく、該エピブラスト又はEpiLCをPGC状態へ誘導することを含む、方法。
[2] 外来性転写因子又はそれをコードする核酸がエピブラスト又はEpiLCに導入される、上記[1]に記載の方法。
[3] 外来性転写因子をコードする核酸が、エピブラスト又はEpiLCの誘導に先立ち、条件付き発現を可能とする形態で、エピブラスト又はEpiLCに導入されている、上記[1]に記載の方法。
[4] エピブラスト又はEpiLCが、外来性転写因子をコードする核酸を1〜5日間発現する条件下で培養される、上記[3]に記載の方法。
[5] EpiLCが、アクチビンA(ActA)の存在下、任意でさらに塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)及び/又はKnockout(商標)Serum Replacement (KSR)の存在下で、多能性幹細胞(PSC)を培養することにより得られる、上記[1]〜[4]のいずれか1つに記載の方法。
[6] PSCが、胚性幹細胞(ESC)又は誘導多能性幹細胞(iPSC)である、上記[5]に記載の方法。
[7] 外来性転写因子をコードする核酸が、PGCLCからの消失を可能とする形態である、上記[1]〜[6]のいずれか1つに記載の方法。
[8] 核酸が、プラスミド、エピソームベクター、トランスポゾン、アデノウイルスベクター及びセンダイウイルスベクターから成る群より選択されるベクターで運ばれる、上記[7]に記載の方法。
[9] EpiLCが、マウス又はヒトに由来する、上記[1]〜[8]のいずれか1つに記載の方法。
[10] (i) Blimp1、Prdm14及びTfap2c;
(ii) Blimp1及びPrdm14;
(iii) Blimp1及びTfap2c;
(iv) Prdm14及びTfap2c;
(v) Prdm14;
から成る群より選択される転写因子、又は該転写因子をコードする核酸を含む、単離したエピブラスト又はEpiLCをPGCLCへ誘導するための試薬。
[11] 転写因子をコードする核酸が、エピブラスト又はEpiLCにおいて条件付き発現を可能とする形態である、上記[10]に記載の試薬。
[12] (i) Blimp1、Prdm14及びTfap2c;
(ii) Blimp1及びPrdm14;
(iii) Blimp1及びTfap2c;
(iv) Prdm14及びTfap2c;並びに
(v) Prdm14;
から成る群より選択される外来性転写因子をコードする核酸を含み、該核酸がエピブラスト又はEpiLCにおいて条件付き発現を可能とする形態である、単離したエピブラスト又はEpiLC。
[13] (i) Blimp1、Prdm14及びTfap2c;
(ii) Blimp1及びPrdm14;
(iii) Blimp1及びTfap2c;
(iv) Prdm14及びTfap2c;並びに
(v) Prdm14;
から成る群より選択される外来性転写因子をコードする核酸を含み、該核酸がPSCから分化したEpiLCにおいて条件付き発現を可能とする形態である、単離したPSC。
[14] 上記[12]に記載のエピブラスト又はEpiLC、及びエピブラスト又はEpiLCに外来性転写因子を発現させる試薬を含む、単離したエピブラスト又はEpiLCをPGCLCへ誘導するためのキット。
[15] 上記[13]に記載のPSC;ActA並びに任意選択でbFGF及び/又はKSRを含む、PSCをEpiLCへ誘導するための試薬;及びEpiLCに外来性転写因子を発現させる試薬を含む、単離したPSCをPGCLCへ誘導するためのキット。
[16] 以下の工程I)及びII)を含む、PSCからPGCLCを製造する方法:
I) ActAの存在下、任意選択でさらにbFGF及び/又はKSRの存在下で、PSCを培養することによりEpiLCを製造する工程;
II) 工程I)で得られたEpiLCを、上記[1]〜[9]のいずれか1つに記載の方法によりPGCLCへ誘導する工程。
[17] III)工程II)で得られた細胞からBlimp1陽性細胞を選択する工程
をさらに含む、上記[16]に記載の方法。
[18] 細胞ソースとして、上記[16]又は[17]に記載の方法により得られるPGCLC細胞集団を利用することを含む、エピブラストに由来するさまざまな細胞型を製造する方法。
(I) エピブラスト又はEpiLCからPGCLCを製造する方法
本発明は、例えばBMP4、LIF、SCF、BMP8b及びEGF等のサイトカインを用いずに、外来性に導入された、PGCにおいて特異的な発現を示す特定のTFを、エピブラスト又はEpiLCに発現させることを含む、単離したエピブラスト又はEpiLCから、PGCLCを製造する方法を提供する。
出発材料として使用される「エピブラスト」は、哺乳動物(例、マウス、ヒト、サル、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギ等、好ましくはマウス及びヒト)胚盤胞の内部細胞塊に由来する、原腸陥入前のエピブラスト細胞(マウスにおいて、胎生期(E)5.5〜E6.0日であるがE6.25を超えるものではない)である。本発明において使用されるエピブラストは、哺乳動物胚を適切な緩衝液中に単離し、トリプシン/パンクレアチンで胚を処理し、ピペッティングにより近位内胚葉(VE)を除去し、ガラスニードルによって胚体外外胚葉(ExE)を切り取ることにより調製することができる。単離したエピブラストは、10〜20%KSR等を添加した無血清培地中で培養することができる。
出発材料として使用される「エピブラスト様細胞(EpiLC)」は、多能性幹細胞(PSC)に由来する、原腸陥入前のエピブラスト細胞の培養均等物である。具体的には、EpiLCは、以下の特性のいずれか又はいずれをも有する細胞として定義される:
(1) 分化誘導前のPSCと比較して、Fgf5、Wnt3及びDnmt3bから選択される少なくとも1つの遺伝子発現の上昇;
(2) 分化誘導前のPSCと比較して、Gata4、Gata6、Sox17及びBlimp1から選択される少なくとも1つの遺伝子発現の減少。
(1) 持続的なOct3/4の遺伝子発現;
(2) 分化誘導前のPSCと比較して、Sox2及びNanogの遺伝子発現の減少;
(3) 分化誘導前のPSCと比較して、Fgf5、Wnt3及びDnmt3bの遺伝子発現の上昇;並びに
(4) 分化誘導前のPSCと比較して、Gata4、Gata6、Sox17及びBlimp1の遺伝子発現の減少。
本発明のEpiLCは、以前に記載したように(WO 2012/020687; Cell 146, 519-532 (2011); Science 338, 971-975 (2012))、PSCから調製することができる。
出発材料として使用される「多能性幹細胞(PSC)」は、未分化状態を保持しながら増殖することを可能とする「自己複製」、及び胚の3つ全ての一次胚葉に分化することを可能とする「多能性」を保有する、いかなる未分化細胞でもあってもよい。例としては、胚性幹(ES)細胞、核移植により得られるクローン胚に由来する胚性幹細胞(ntES細胞)、生殖幹細胞(「GS細胞」)、胚性生殖細胞(「EG細胞」)、誘導多能性幹(iPS)細胞、培養線維芽細胞又は骨髄幹細胞由来の多能性細胞(Muse細胞)等が挙げられる。好ましい多能性幹細胞は、ES細胞、ntES細胞及びiPS細胞である。
ES細胞は、ヒト、マウス等の哺乳動物の初期胚(例えば、胚盤胞)の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
生殖幹細胞は、精巣に由来する多能性幹細胞であり、***形成の起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞のようにさまざまな系列の細胞に分化誘導可能であり、例えば、マウス胚盤胞への移植によるキメラのマウスの作出できる等の特性を示す(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。生殖幹細胞は、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)を含有する培地中で自己複製可能であり、ES細胞のものと同様の培養条件下で継代を繰り返すことにより生殖幹細胞を製造することができる(Masanori Takehashi et al., (2008), Experimental Medicine, Vol. 26, No. 5(Suppl.), pp. 41 - 46, YODOSHA (Tokyo, Japan))。
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞のものと同様の多能性を有する細胞である。胚性生殖細胞は、LIF、bFGF、幹細胞因子等の物質の存在下で始原生殖細胞を培養することにより樹立することができる(Y. Matsui et al. (1992),細胞, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
誘導多能性幹(iPS)細胞は、体細胞に由来する人工的な幹細胞であって、特異的な再プログラム化因子をDNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することにより製造することができ、ES細胞とほぼ同等の特性(例、分化多能性及び自己複製に基づく増殖能)を示す(K. Takahashi及びS. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008); WO2007/069666)。再プログラム化因子は、ES細胞で特異的に発現される遺伝子、その遺伝子産物若しくはその非コードRNA、ES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物若しくはその非コードRNA、又は低分子量化合物で構成されてもよい。再プログラム化因子に含まれる遺伝子の例としては、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c−Myc、N−Myc、L−Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15−2、Tcl1、beta−catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3、Glis1等が挙げられる。これらの再プログラム化因子は、単独で、あるいは組合わせて使用してもよい。再プログラム化因子の組合わせの例としては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720及びMaekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9に記載されている組合わせが挙げられる。
胚盤胞期胚から誘導される従来型のヒトES細胞は、マウスES細胞と非常に異なる生物学的(形態学的、分子的及び機能的)特性を有する。マウス多能性幹細胞は、LIF依存的なES細胞とbFGF依存的なエピブラスト幹細胞(EpiSC)という2つの機能的に区別される状態で存在し得る。分子学的解析から、ヒトES細胞の多能性状態は、マウスES細胞のそれではなく、むしろマウスEpiSCのそれに類似していることが示唆されている。近年、LIFの存在下にOct3/4、Sox2、Klf4、c−Myc及びNanogを異所的に誘導するか(Cell Stem Cells, 6: 535-546, 2010を参照)、あるいはLIF並びにGSK3β及びERK1/2経路阻害剤を組合わせて、Oct3/4、Klf4及びKlf2を異所的に誘導にする(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, オンライン出版doi/10.1073/pnas.1004584107を参照)ことにより、マウスES細胞様多能性状態のヒトES細胞及びiPS細胞(ナイーヴヒトES細胞及びiPS細胞ともいう)が樹立されている。これらのナイーヴヒトES細胞及びiPS細胞は、それらの多能性が従来型のヒトES細胞及びiPS細胞のそれと比較して未熟であるため、本発明の好ましい出発材料であるかもしれない。
nt ES細胞は、核移植技術により作製されたクローン胚に由来するES細胞であり、受精卵に由来するES細胞としてほぼ同じ特性を有する(T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502)。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置き換えることにより得られるクローン胚に由来する胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞が、nt ES(核移植ES)細胞である。nt ES細胞の作製のため、核移植技術(J.B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646)及びES細胞作製技術(上記)の組合わせを用いることができる(Kiyoka Wakayama et al., (2008), Experimental Medicine, Vol. 26, No. 5(Suppl.), pp. 47 - 52)。核移植において、哺乳動物の除核した未受精卵に体細胞の核をインジェクションし、数時間培養することにより再プログラム化を行うことができる。
Muse細胞は、WO2011/007900に記載された方法により製造された多能性幹細胞である。さらに詳細には、線維芽細胞又は骨髄間質細胞を、長時間、好ましくは8時間又は16時間、トリプシン処理し、その後、浮遊状態で細胞を培養することにより得られる多能性を有する細胞であり、SSEA−3及びCD105陽性である。
分化誘導用の基本培地としては、例えば、Neurobasal培地、Neural Progenitor Basal培地、NS−A培地、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、最小必須培地(MEM)、Eagle MEM、αMEM、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、Glasgow MEM、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、199培地、DMEM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、及びこれらの混合培地などが挙げられるが、これらに限定されない。
このように得られたエピブラスト又はEpiLCに、外来性に導入した、PGCにおいて特異的な発現を示す、特定のTFを発現させることにより、BMP4を含むサイトカインを用いずに、エピブラスト又はEpiLCをPGC様細胞(PGCLC)へ誘導することが可能となる。
(i) Blimp1、Prdm14及びTfap2c;
(ii) Blimp1及びPrdm14;
(iii) Blimp1及びTfap2c;
(iv) Prdm14及びTfap2c; 並びに
(v) Prdm14。
別の形態において、本発明は、EpiLCからのPGCLCの製造用キットを提供する。該キットは、前記本発明のPGCLC誘導物質、すなわち、以下のTF:
(i) Blimp1、Prdm14及びTfap2c;
(ii) Blimp1及びPrdm14;
(iii) Blimp1及びTfap2c;
(iv) Prdm14及びTfap2c;
(v) Prdm14;あるいは、
該TFのいずれか又は上記(i)〜(v)をコードする核酸(例、該核酸のアルコール沈殿物、凍結TE溶液及び凍結乾燥物等;タンパク質の凍結乾燥物及び適切な緩衝液中に溶解した凍結液等)を含むPGCLC細胞誘導物質、該因子導入用の、前記ベクター、細胞、試薬及び培地を含有し得る。このキットは、PGCLCへの誘導工程について記載しているプロトコル又は説明書をさらに含有してもよい。
(i) Blimp1、Prdm14及びTfap2c;
(ii) Blimp1及びPrdm14;
(iii) Blimp1及びTfap2c;
(iv) Prdm14及びTfap2c;並びに
(v) Prdm14;
から成る群より選択される外来性転写因子をコードする核酸を含む単離したエピブラスト又はEpiLCを含有し、該核酸は、エピブラスト又はEpiLCにおいて条件付き発現を可能とする形態である。キットは、PGCLC誘導物質の発現を誘導するための試薬をさらに含有し得る。該試薬としては、Tet応答性誘導ベクター用のドキシサイクリン(Dox)、メタロチオネインプロモーター制御下のベクター用の金属イオンなどを例示してもよい。
(i) Blimp1、Prdm14及びTfap2c;
(ii) Blimp1及びPrdm14;
(iii) Blimp1及びTfap2c;
(iv) Prdm14及びTfap2c;並びに
(v) Prdm14;
から成る群より選択される外来性転写因子をコードする核酸を含有する単離したPSCを含み、該核酸は、PSCから分化したEpiLCにおいて、条件付き発現を可能とする形態である。キットはさらに、ActA並びに任意選択でbFGF及び/又はKSRを含むPSCをEpiLCへ誘導するための試薬;並びにPGCLC誘導物質の発現を誘導するための前記試薬を含有し得る。
I) ActAの存在下、任意選択でさらにbFGF及び/又はKSRの存在下で、PSCを培養することによりEpiLCを製造する工程;
II) 上記の方法のいずれかにより、工程I)で得られたEpiLCをPGCLCへ誘導する工程。該方法はさらに工程III)を含み得る:
III) 工程II)で得られた細胞から、Blimp1陽性細胞を選択する工程。FACS用の選択マーカーとしては、PGCLCに特異的な表面抗原、SSEA−1、インテグリン−β3等を使用してもよい。
本発明は、前述の工程により製造された、胚から単離したエピブラスト又はPSCから誘導されたEpiLCに由来するPGCLCを含む細胞集団を提供する。細胞集団は、PGCLCの精製された集団であってもよく、PGCLC以外の細胞が1種類以上共存在してもよい。ここで、「PGC様細胞(PGCLC)」は、分化誘導前のEpiLCと比較してBlimp1及び/又はStellaの発現上昇を示し、正常な***形成に寄与する能力を有し、かつ免疫不全マウスに移植した場合にテラトーマを形成しない細胞として定義される。上述のように、出発材料として、Blimp1プロモーター及び/又はStellaプロモーターの制御下に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する胚又はPSCを用いてPGCLCへ誘導する場合、Blimp1及び/又はStella陽性PGCLCは、セルソーターを用いて、前述の工程で得られた細胞集団からソーティングすることにより容易に単離及び精製することができる。PGCLCは、Blimp1及びStellaに付随してその発現が上昇する遺伝子(例、Nanog)の制御下のレポーターをマーカーとして用いたFACSによっても単離及び精製することができる。
本発明の、胚から単離したエピブラスト又はPSCから誘導されたEpiLCに由来するPGCLCは、様々な目的のために使用することができる。例えば、レシピエント動物の精巣に移植されたPGCLCは、精巣における***形成及び健康な子孫の発生に確実に寄与することができるので、不妊又は生殖組織の遺伝性疾患の治療に使用することができる。
1. 動物
Rosa26−rtTAノックインアレルのホモ接合マウスは、両遺伝子座のヘテロ接合マウスB6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)JaeCol1a1tm2(tetO-Pou5f1)Jae/Jの掛け合わせにより得た。それらをBVSCトランスジェニックマウスと交配させ、胎生期(E)2.5で、胚盤胞を回収した。BVSC−R26rtTA ESCを、PCR遺伝子型決定により選択して樹立し、N2B27「2i+LIF」条件下で維持した(Nature 453, 519-523 (2008))。本研究においては雄性細胞株を使用した。
BVSC−R26rtTA ESCをトリプシン処理し、単一細胞懸濁液を調製した。ICR(アルビノ)雌マウスから得たE3.5胚盤胞の胞胚腔に、ピエゾ駆動マイクロマニピュレーターを用いて、およそ15個のESC/胚を注入した。注入された胚を、E2.5の偽妊娠したICR雌マウスの子宮に移植した。キメラマウスは、E18.5で帝王切開により分娩された。キメリズムは、毛色によって決定した。生殖系列への寄与を確認するため、ICR雌マウスとの試験交配を行った。
マウスBlimp1コード配列(CDS)(エクソン3のATGから)及びTfap2c変異体1(Accession number: NM_009335.2)CDSを、それぞれ、SalI−AviTag−XhoI及びNotIサイト並びにNotI及びEcoRIサイトで挟み、PCRによりクローニングした。Prdm14CDSは、AG−P14により得た(Cell Stem Cell 12, doi: 10.1016/j.stem.2012.12.012 (2013))。
BVSC−R26rtTA ESCに、「2i+LIF」条件下、60mmディッシュ中フィーダー細胞(マウス胚性線維芽細胞)上で、Lipofectamine2000(Invitrogen)を用いてキーとなる因子pPBCAG−hph及びpCAGGS−mPBを含有するPB−TETベクターを、トランスフェクトした。ベクターDNAの全量は、8μgより低かった。ハイグロマイシンB(150μg/ml)(Sigma)でトランスフェクタントを選択し、PCRを用いて導入遺伝子についての遺伝子型を同定した。遺伝子型同定用のプライマー配列を表3に示す。
ゲノムDNA8マイクログラムを単離し、BamHIで消化した。DNA断片を0.7%アガロースゲル中で電気泳動し、Hybond N+(GE healthcare)に移し、UV架橋した。β−geoプローブをPB−TETのRsrII/SmaI消化により得て、32P(PerkinElmer)でランダムプライマーDNA標識キットVer.2.0(TaKaRa)により標識し、Illustra ProbeQuantスピンカラム(GE Healthcare)を用いて精製した。放射性同位体画像を、BASシステム(富士フィルム)を用いて、取り込んだ。
トランスフェクトしたESCを、誘導に先立ち、無フィーダー条件に適応させた。EpiLC分化は、以前に報告した(Cell 146, 519-532 (2011))ように行った。分化の36時間後に細胞を採取し、凝集させるよう(2,000細胞/ウェルで開始した)、1.5μg/ml Dox(Clonetech)を含むGK15中リピジュアコート96ウェルプレート(NOF)で培養した。以前に記載した(Cell 146, 519-532 (2011))ように、BMP4(500ng/ml)、BMP8A(500ng/ml)、SCF(100ng/ml)、LIF(1000U/ml)及びEGF(50ng/ml)により、PGCLCを誘導した。LDN193189(120pM;Stemgent)は、Dox又はCkと同時に添加した。基底状態のESCからの凝集塊も、上記のように、Doxを含むGK15中で培養した。
内因性転写産物を評価するために、TF誘導BV陽性細胞を、図1c及び図7bに示すゲートを用いて2日目(d2)及び4日目(d4)でFACSソーティングした。d2 CK−PGCLC及びd4 CK−PGCLCのために使用したソーティングゲートを、図9aに示す。凝集塊は、特別に定めのない限り、トリプシン処理し、まとめて溶解した。全RNAを、RNeasy micro(QIAGEN)を用いて精製し、oligo−dTプライマーが用意されたSuperScriptIII(Invitrogen)を用い、製造者の説明書に従ってRTを行った。Power SYBR(Applied Biosystems)及びCFX384(BioRad)を用いて、リアルタイムPCRを行った。遺伝子発現レベルを、Arbp及びPpia14の平均Ct値で標準化(Mech Dev 113, 91-94 (2002))したΔCt(log2スケール)として示す。内因性転写産物を外来性のものから判別するため、oligo−dTプライマー(Invitrogen)及び関心のある遺伝子特異的なプライマーのいずれをもRTに使用し、RTプライミング部位及び増幅領域間の距離の差によるRTバイアスを減少させた。鋳型として対応する単位複製配列を内部に有するpGEM−T−Easyプラスミドを用いて、新しく設計したプライマーセットの増幅効率を決定した。内因性及び外来性のいずれの発現レベルをも検証するため、CDSプライマーを用いて標本を同時に試験した(データは示さない)。プライマー配列を表4に記載する(Biol Reprod 75, 705-716 (2006); Nucleic Acids Res 34, e42 (2006))。
12時間において、細胞凝集塊をトリプシン処理し、2%パラホルムアルデヒド及び0.2%グルタルアルデヒドで固定した。Cytospin4(Thermo Scientific)を用いて固定した細胞を広げ、LacZ染色溶液で一晩染色した(Nature 458, 766-770 (2009))。
細胞凝集塊から標本の調製は、本質的には、以前に記載した(Cell 146, 519-532 (2011))ように行った。蛍光活性化セルソーティング(FACS)は、FACSAria又はFACSAriaIII(BD)セルソーターを用いて行った。BV及びSC蛍光は、それぞれFITC及びAmCyan Horizon V500チャンネルで検出した。FACSDiva(BD)又はFlowjo(Tree Star Inc.)ソフトウェアで、データを解析した。
BV陽性細胞は、BP14A誘導4日目凝集塊から、図9cに示すゲートを用いてソーティングし、EpiLCと1:1の比で混合して、MASコートのスライドガラスに広げた。免疫蛍光染色は、以前に報告した(Cell 146, 519-532 (2011))ように行った。本研究において使用した一次抗体(Ab)は、以下のとおりであった:抗GFP(ラット、モノクローナルAb(MAb);Nacalai Tesque)、抗DNMT3B(マウス、MAb;Imgenex)、抗H3K27me3(ウサギ、ポリクローナルAb(pAb);Millipore)及び抗H3K9me2(ウサギ、pAb)。二次抗体は以下のとおりであった:Alexa Fluor568抗ウサギIgG、Alexa Fluor488抗ラットIgG及びAlexa Fluor647抗マウスIgG(3つ全てInvitrogenより)。画像は、共焦点レーザー走査型顕微鏡(Olympus FV1000)を用いて取り込んだ。
ゲノムDNAを単離し、EpiTect亜硫酸水素塩キット(QIAGEN)を用いて、製造者の説明書に従い亜硫酸水素塩処理を行った。Snrpn及びH19のメチル化可変領域は、以前に報告された(Genomics 79, 530-538)ようにPCRにより増幅した。配列を決定し、QUMA(http://quma.cdb.riken.jp/top/index.html)(Nucleic Acids Res 36, W170-175 (2008))で解析した。
図9aの赤の長方形で囲まれた細胞は、FACSによりソーティングした。ここで留意すべきは、2日目でのCK−PGCLC及びTF−PGCLCのソーティングにおいてバックグラウンドレベルが異なったことである。全RNA単離、逆転写及びcDNAの増幅は、以前に記載した(Cell 146, 519-532 (2011); Nucleic Acids Res 34, e42 (2006))ように行った。GeneChipマウスゲノム430_2.0アレイ(Affimetrix)で標本を解析した。データを、dChipで標準化し、log2スケールで示す(Proc Natl Acad Sci U S A 98, 31-36 (2001))。解析用のプローブ選択基準は、以下のとおりであった:(1)最大発現スコア≧8、(2)最大差次的発現レベル≧2、(3)遺伝子に対する複数のプローブがある場合、プローブ間の最高平均発現レベル。既報のデータ(GSE30056(GSM744095-GSM744096、GSM744101-GSM744104))を、解析に含めた(Cell 146, 519-532 (2011))。私たちは、4,479のプローブを選択し、R(バージョン2.15.1)(R_Development_Core_Team. R, R Foundatin for Statistical Computing, 2012)を用いて主成分分析(PCA)を行った。差次的遺伝子発現分析のため、私たちは、以下の基準に従い、生物学的デュプリケート(duplicates)又はクアドロプリケート(quadruplicates)を平均し、「コアPGC遺伝子」(図9b、上)及び「壁側中胚葉遺伝子」(補足図9b、下)を選択した。「コアPGC遺伝子」は、i)BP14A誘導2日目において、EpiLC及びDox使用2日目の親クローンのいずれと比較しても、4倍より多く上方制御され;ii)E9.5PGCにおいて下方制御されない(差次的発現レベルが、BP14A誘導2日目のものと比較して、2倍未満大きい)ものであった。「壁側中胚葉遺伝子」は、PGCLC d2において、EpiLC及びBP14A誘導2日目のいずれと比較しても、少なくとも4倍の上方制御を示した。代表的な遺伝子を明記する。
指定した細胞集団をFACSによりソーティングした後、基本的には以前に記載された(Development 132, 117122 (2005))ように、W/Wvマウス(7dpp)の新生仔の精巣に、1×104細胞/精巣を注入した。必要に応じて免疫抑制のため、抗マウスCD4抗体(50mg/投与量、クローンGK1.5;eBioscience又はBiolegend)を、0日目、2日目又は4日目に、腹腔内に注入した(Biol Reprod 68, 167-173 (2003))。注入10週後に、移植された精巣を解析した。ヘマトキシリン及びエオジン染色のため、精巣標本をブアン溶液で固定し、パラフィンに包埋し、薄片にした。
基本的には以前に報告された(Biol Reprod 52, 709-720 (1995))ように、ICSIを行った。簡潔には、***形成コロニーを有する精細管を穏やかに刻み、精原細胞懸濁液を調製した。***を、BDF1マウスから回収した卵母細胞に注入した。in vitro胚培養後、2細胞期胚をE0.5偽妊娠マウス(ICR)の卵管に移した。仔は、E18.5で帝王切開により分娩された。遺伝子型決定PCRに使用したプライマー配列を表3に記載する。
私たちは、mVenus及びECFPをそれぞれBlimp1及びstella(Dppa3/Pgc7としても知られる)制御要素の制御下で発現し(BVSC)(Reproduction 136, 503-514 (2008))、構成的に活性なRosa26遺伝子座の制御下で、リバーステトラサイクリン調節性トランス活性化因子(rtTA)(Cell 121, 465-477 (2005))(BVSCR26rtTA ESC)(図1a)を発現するESCを得た。マウスの発生期間中、Blimp1の発現は、PGC決定の始まりを意味する一方で、stellaは確立したPGCにおいて発現を開始し、in vivo及びin vitroのいずれにおいても、BVSC発現はPGCの決定及び発生の信頼できる指標である(Cell 146, 519-532 (2011); Science 338, 971-975 (2012); Reproduction 136, 503-514 (2008))。私たちは、テトラサイクリン制御要素(TRE)の制御下でBlimp1、Prdm14又はTfap2cを発現するpiggybackトランスポゾンベースのベクターを構築し、これらのベクターをBVSCR26rtTA ESC(XY核型)(図5a〜c)に組込んで、3つ全てのTF(BVSCR26rtTA BP14A細胞)、3つのTFのうち2つ(BVSCR26rtTA BP14、BA及びP14A細胞)又は3つのTFうち1つ(BVSCR26rtTA B、P14及びA細胞)の導入遺伝子を有するBVSCR26rtTA ESCを単離した(図1a、5d及び5e)。
Claims (18)
- 単離したエピブラスト又はエピブラスト様細胞(EpiLC)から、始原生殖細胞様細胞(PGCLC)を製造する方法であって、該エピブラスト又はEpiLCに
(i) Blimp1、Prdm14及びTfap2c;
(ii) Blimp1及びPrdm14;
(iii) Blimp1及びTfap2c;
(iv) Prdm14及びTfap2c;並びに
(v) Prdm14;
から成る群より選択される外来性転写因子を発現させ、それによって、該エピブラスト又はEpiLCをBMP4の非存在下でPGC状態へ誘導することを含む方法。 - 外来性転写因子又はそれをコードする核酸が、エピブラスト又はEpiLCに導入される、請求項1に記載の方法。
- 外来性転写因子をコードする核酸が、エピブラスト又はEpiLCの誘導に先立ち、条件付き発現を可能とする形態で、エピブラスト又はEpiLCに導入されている、請求項1に記載の方法。
- エピブラスト又はEpiLCが、外来性転写因子をコードする核酸を1〜5日間発現する条件下で培養される、請求項3に記載の方法。
- EpiLCが、
(i) アクチビンA(ActA)の存在下、あるいは
(ii) ActAと、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)及び/又はKnockout(商標)Serum Replacement(KSR)の存在下で、
多能性幹細胞(PSC)を培養することにより得られる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。 - PSCが、胚性幹細胞(ESC)又は人工多能性幹細胞(iPSC)である、請求項5に記載の方法。
- 外来性転写因子をコードする核酸が、PGCLCからの消失を可能とする形態である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸が、プラスミド、エピソームベクター、トランスポゾン、アデノウイルスベクター及びセンダイウイルスベクターから成る群より選択されるベクターで運ばれる、請求項7に記載の方法。
- EpiLCが、マウス又はヒトに由来する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- (i) Blimp1、Prdm14及びTfap2c;
(ii) Blimp1及びPrdm14;
(iii) Blimp1及びTfap2c;
(iv) Prdm14及びTfap2c;
(v) Prdm14;
から成る群より選択される転写因子、又は該転写因子をコードする核酸を含む、単離したエピブラスト又はEpiLCをBMP4の非存在下でPGCLCへ誘導するための試薬。 - 転写因子が前記(i)、(iii)、(iv)又は(v)のいずれかである、請求項10に記載の試薬。
- 転写因子をコードする核酸が、条件付き発現を可能とする形態である、請求項10又は11に記載の試薬。
- (i) Blimp1、Prdm14及びTfap2c;
(ii) Blimp1及びTfap2c;
(iii) Prdm14及びTfap2c;並びに
(iv) Prdm14;
から成る群より選択される外来性転写因子をコードする核酸を、条件付き発現を可能とする形態で含む、単離したエピブラスト、EpiLC又はPSC。 - (a) 請求項13に記載のエピブラスト又はEpiLC、及び
(b) 該エピブラスト又はEpiLCに含まれる外来性転写因子の条件付き発現を誘導する試薬を含む、
単離したエピブラスト又はEpiLCをPGCLCへ誘導するためのキット。 - (a) 請求項13に記載のPSC;
(b) (i)ActA、あるいは
(ii)bFGF及び/又はKSR;
を含む、PSCをEpiLCへ誘導するための試薬;及び
(c)該EpiLCに含まれる外来性転写因子の条件付き発現を誘導する試薬;
を含む、単離したPSCをPGCLCへ誘導するためのキット。 - 以下の工程I)及びII)を含む、PSCからPGCLCを製造する方法:
I) (i)ActAの存在下、あるいは
(ii)ActAと、bFGF及び/又はKSRの存在下で、
PSCを培養することによりEpiLCを製造する工程;
II) 工程I)で得られたEpiLCを、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法によりPGCLCへ誘導する工程。 - III)工程II)で得られた細胞からBlimp1陽性細胞を選択する工程
をさらに含む、請求項16に記載の方法。 - 請求項16又は17に記載の方法により得られたPGCLCを、***若しくはその前駆細胞、又は卵子若しくはその前駆細胞に分化誘導することを含む、***若しくはその前駆細胞、又は卵子若しくはその前駆細胞を製造する方法。
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