KR20110007607A - 소분자 조절제의 사용을 통한 다능 유전자의 유도에 의한 세포 재프로그래밍 - Google Patents

소분자 조절제의 사용을 통한 다능 유전자의 유도에 의한 세포 재프로그래밍 Download PDF

Info

Publication number
KR20110007607A
KR20110007607A KR1020107024995A KR20107024995A KR20110007607A KR 20110007607 A KR20110007607 A KR 20110007607A KR 1020107024995 A KR1020107024995 A KR 1020107024995A KR 20107024995 A KR20107024995 A KR 20107024995A KR 20110007607 A KR20110007607 A KR 20110007607A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
cell
small molecule
pluripotent
expression
Prior art date
Application number
KR1020107024995A
Other languages
English (en)
Inventor
케네스 제이. 에일러트센
레이첼 에이. 파워
Original Assignee
뉴포텐셜, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 뉴포텐셜, 인크. filed Critical 뉴포텐셜, 인크.
Publication of KR20110007607A publication Critical patent/KR20110007607A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 세포를 재프로그래밍하기 위한 방법, 조성물 및 키트에 관한 것이다. 한 실시예에 있어서, 본 발명은 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 다른 한 실시예에 있어서, 본 방법은 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 소분자 조절제에 세포를 노출시키는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에 있어서, 본 발명은 다양한 분화 세포 타입으로 재분화 또는 교차분화될 수 있는 ES계 세포의 특징을 가질 수 있는 재프로그래밍 세포 또는 농축 재프로그래밍 세포군에 관한 것이다.

Description

소분자 조절제의 사용을 통한 다능 유전자의 유도에 의한 세포 재프로그래밍 {REPROGRAMMING A CELL BY INDUCING A PLURIPOTENT GENE THROUGH USE OF A SMALL MOLECULE MODULATOR}
본 출원은 2006년 8월 1일자 미국 특허 출원 제 11/497,064 호의 일부 계속 출원(CIP)으로서, 2005년 8월 1일자 미국 특허 가출원 제 60/704,465 호의 35 U.S.C.§119(e) 규정의 이익을 청구하고, 또한 2008년 4월 7일자 미국 특허 가출원 제 61/043,066 호; 2008년 4월 7일자 미국 특허 가출원 제 61/042,890 호; 2008년 4월 7일자 미국 특허 가출원 제 61/042,995 호; 2008년 11월 12일자 미국 특허 가출원 제 61/113,971 호의 35 U.S.C.§119(e) 규정의 이익을 청구하며, 그 전체 내용은 참고사항으로 본 명세서에 포함된다.
기술 분야
본 발명은 세포 생물학, 줄기 세포, 세포 분화, 체세포 핵이식 및 세포 치료법(cell-based therapeutics)에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 실시예는 세포를 재프로그래밍(reprogramming)하기 위한 방법, 조성물 및 키트, 그리고 세포 치료법에 관한 것이다.
재생 의학은 많은 인간의 질환에 대한 치료법으로서 높은 가능성을 가지나, 현대의 과학적 연구에서 대면하게 되는 가장 어려운 기술적 도전들이 수반된다. 재생 의학에 대한 기술적 도전은 낮은 클로닝 효율성, 잠재적 다능 조직 공급 부족, 및 세포 분화를 어떻게 조절하는지, 어떤 타입의 배아 줄기세포가 선별적 치료에 사용될 수 있는지에 대한 전반적 지식 부족 등을 포함한다. ES 세포는 대단한 가소성을 가지고 있는 반면, 미분화된 ES 세포는 조직 타입의 혼합체를 포함하는 기형종(양성 종양)을 형성한다. 또한, 한 소스에서 다른 소스로의 ES 세포 이식에는 새로운 세포에 대한 거부 반응을 방지하기 위한 약물 투여가 필요할 수도 있다.
태아에서 유래되지 않은 조직으로부터 줄기 세포를 형성하기 위한 새로운 방법을 찾아내려는 시도가 행해지고 있다. 한 방법은 자가 성체 줄기세포의 처리를 포함한다. 재생 의학에 자가 성체 줄기세포를 사용할 때의 이점은 이러한 줄기세포가 동일한 환자로부터 유도되고 다시 되돌아 갈 수 있으며, 따라서 면역-매개 거부반응을 겪지 않는다는 사실에 있다. 이 방법의 중대 결점은 이러한 세포는 ES 세포의 가소성 및 다능성이 부족하기 때문에 그 잠재성이 불확실하다는 것이다. 또 다른 방법은 다능 ES 세포와 같은 세포를 생성하기 위해 성인 조직으로부터 체세포를 재프로그래밍하는 것이다. 그러나, 이 방법은 다세포 생물 내의 각 세포 타입이 일단 고정된 세포로 되거나 세포 주기로부터 벗어난 것으로 간주되는 고유의 후생적 특징(epigenetic signature)을 가지기 때문에 어려운 점이 있다.
세포 DNA는 일반적으로 세포핵과 단백질로 구성된 복합체인 염색질(chromatin)의 형태로 존재한다. 사실상, 대부분의 세포 RNA 분자도 핵단백질 복합체의 형태로 존재한다. 당해 분야에 숙련자에게 알려져 있는 바와 같이, 염색질의 핵단백질 구조는 광범위한 연구 대상이며,일반적으로, 염색체 DNA는 뉴클레오좀으로 패키징된다. 뉴클레오좀은 코어와 링커를 포함한다. 뉴클레오좀 코어는 코어 히스톤(H2A, H2B, H3 및 H4 중 각각 2개)의 옥타머와, 이를 둘러싼 약 150개의 염기쌍의 염색체 DNA로 구성된다. 또한, 약 50개의 염기쌍의 링커 DNA 단편이 링커 히스톤 H1와 결합되어 있다. 뉴클레오좀은 고차원 염색사로 조직화되고, 염색사는 염색질로 조직화된다. 예를 들어, Wolffe "염색질:구조 및 기능(Chromatin:Structure and Function)" 3rd Ed.,Academic Press, San Diego, 1998 참조.
염색질 구조는 정적이지 않지만, 염색질 리모델링(chromatin remodeling)으로 알려진 공정에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 염색질 리모델링은 DNA 영역으로부터 뉴클레오좀의 제거, DNA의 한 영역으로부터 다른 영역으로 뉴클레오좀의 이동, 뉴클레오좀 사이의 공간의 변화, 또는 염색체 내의 DNA 영역에 뉴클레오좀의 첨가 등을 포함한다. 또한 염색질 리모델링은 고차원 구조의 변화를 야기함으로써 전사적으로 활성인 염색질(열린구조 염색질 또는 진정 염색질)과 전사적으로 불활성인 염색질(닫힌구조 염색질 또는 이질 염색질)사이의 밸런스에 영향을 줄 수 있다.
염색체 단백질은 다수 타입의 화학적 변형이 가능하다. 코어 히스톤의 번역단계후 수정의 한 메커니즘은 보유되는 고도의 염기성 N-말단 리신 잔기의 엡실런 아미노 기의 가역적 아세틸화이다. 히스톤 아세틸화의 안정 상태는 경쟁하는 히스톤 아세틸트란스퍼라제(들)과 히스톤 데아세틸라제(들)(본 명세서에서, HDAC라고 칭함) 사이의 동적 평형에 의해 달성된다. 히스톤 아세틸화 및 탈아세틸화는 전사단계 조절과 관련되어 있다. 히스톤의 가역적 아실화는 염색질 리모델링을 가능하게 하고 유전자 전사의 조절 메커니즘으로서 역할을 할 수 있다. 일반적으로 히스톤의 과아세틸화(hyperacetylation)는 유전자 발현을 촉진시키는 반면, 탈아세틸화는 전사 억제와 관련이 있다. 히스톤 아세틸트랜스퍼라제는 전사 보조활성제(coactivator)로서 역할을 하는 것으로 밝혀진 반면, 데아세틸라제는 전사 억제 경로에 속하는 것으로 알려져 있다.
히스톤 아세틸화 및 탈아세틸화 사이의 동적 평형은 정상 세포 성장에 있어서 필수적이다. 히스톤 탈아세틸화의 억제는 세포 주기 중지(cell cycle arrest), 세포 분화, 아폽토시스 및 형질전환된 표현형의 역전을 유발한다.
유전자 발현에 관여하는 또 다른 그룹의 단백질은 DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT)로서, 전사 침묵(transcriptional silencing)을 유도하는 게놈 메틸화 패턴을 생성하는 역할을 한다. DNA 메틸화는 배아 발달, X-불활성화, 게놈 각인(genomic imprinting) 및 유전자 발현 조절을 포함한 많은 포유동물의 프로세스에 중심이 된다. 포유동물에서 메틸화는 메틸기가 S-아데노실-메티오닌에서 시토신의 C5 위치로 이동함으로써 달성된다. 이 반응은 DNA 메틸트랜스퍼라제에 의해 촉매화되며, CpG 디뉴클레오티드내의 시토신에 특이적이다. 인간 게놈의 CpG 디뉴클레오티드내의 모든 시토신의 70퍼센트(70%)는 메틸화되어 탈아민화됨으로써, 시토신이 티민으로 전환된다. 이 과정은 구아닌과 시토신의 총 빈도수 감소가 모든 뉴클레오티드의 약 40%가 되도록 하며, 또한 CpG 디뉴클레오티드의 빈도수 감소가 예상 빈도수의 4분의 1이 되도록 한다.
4종의 활성 DNA 메틸트랜스퍼라제는 포유동물에서 확인된다. 이들은 DNMT1, DNMT2, DNMT3A, 및 DNMT3B로 명명된다. 또한 DNMT3L은 구조적으로 DNMT3A 및 DNMT3B와 밀접하게 관련되어 있는 단백질로서 DNA 메틸화에 중요한 물질이지만, 그 혼자서는 불활성인 것으로 보인다. CpG 아일랜드(CpG island)를 포함하는 프로모터 영역내의 시토신의 메틸화는 척추동물 세포에서 다운스트림 코딩 서열의 전사적 불활성화를 유발한다.
메틸-CpG 결합 단백질로 알려져 있는 종류의 단백질(MBD 1 ~ 4)이 메틸화-매개 전사 침묵에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. MeCP2는 특성화된 이러한 종류의 첫번째 멤버로서, 메틸-CpG 결합 도메인(MBD) 및 전사 억제 도메인(TRD)을 함유하며, 메틸화 DNA와의 상호작용을 촉진하고 Sin3A/HDAC 복합체를 표적으로 삼는다. MeCP2와 마찬가지로, MBD1, MBD2, 및 MBD3도 잠재성있는 전사 억제제인 것으로 밝혀졌다. MBD4는 DNA 글리코실라제로서, G:T 부적당한 짝을 정정한다. 이러한 단백질 패밀리의 각 멤버는 MBD3를 제외하고는 포유동물 세포내에서 메틸화 DNA와 복합체를 형성하며, 모든 MBD1 및 MBD4는 알려진 염색질 리모델링 복합체내에 존재한다. Mi-2 복합체는 DNA 메틸화를 염색질 리모델링 및 히스톤 탈아세틸화와 관련되어 있다.
후생적 조절에 관여하는 또 다른 그룹의 단백질은 히스톤 메틸트랜스퍼라제(HMT)로서, 1개 내지 3개의 메틸기를 조효소 S-아데노실 메티오닌으로부터 히스톤 단백질의 리신 및 아르기닌 잔기로 이동하는데 촉매작용을 하는 히스톤-리신 N-메틸트랜스퍼라제 및 히스톤-아르기닌 N-메틸트랜스퍼라제 효소이다. 메틸화된 히스톤은 DNA와 더욱 단단하게 결합하며, 따라서 전사를 억제하게 된다.
염색질의 구조는 염색질 리모델링 복합체로서 알려져 있는 거대분자 어셈블리의 활성에 의해서도 또한 변경될 수 있다. 예를 들어, Cairns(1998) Trends Biochem. Sci. 23:20 25; Workman et al.(1998) Ann. Rev. Biochem. 67:545 579: Kingston et al.(1999) Genes Devel. 13:2339 2352 및 Murchardt et al.(1999) J. Mol. Biol. 293:185 197 참조. 염색질 리모델링 복합체는 뉴클레오솜 배치의 파괴 또는 개선과 관련이 있으며, 따라서 전사, DNA 복제 및 DNA 복구와 관련이 있다(Bochar et al.(2000) PNAS USA 97(3): 1038 43). 많은 이러한 염색질 리모델링 복합체는 서로 다른 서브유니트 조성을 가지지만, 모두 리모델링 활성을 위한 ATP아제 효소에 의존한다. 또한, 생체 내에서 유전자 활성을 위한 염색질 리모델링 복합체의 작용에 대한 필수요건의 몇가지 예가 존재한다.
다능 또는 전능 세포의 분화 및 특수화된 표현형으로의 발달은 발달 과정 동안 발현되는 특정 유전자 세트에 의해 측정된다. 유전자 발현은 양의 조절 또는 음의 조절에 영향을 줄 수 있는 유전자 조절 단백질의 서열-특이적 결합에 의해 직접 유발된다. 그러나, 이러한 조절 단백질의 유전자 발현을 직접 유발할 수 있는 능력은, 적어도 부분적으로 세포 DNA 내의 결합 부위의 접근성에 의존한다. 앞서 기술한 바와 같이, 세포 DNA내의 서열의 접근성은 세포 DNA가 패키징되는 세포 염색질의 구조에 의존한다.
따라서, 전사 억제에 관여하는 HDAC의 활성을 억제할 수 있는 방법, 조성물 및 키트를 포함하여, 다능성에 필요한 유전자의 발현을 유도할 수 있는 방법, 조성물 및 키트를 알아내는 것이 유용하다.
본 발명은 세포를 재프로그래밍하기 위한 방법, 조성물 및 키트에 관한 것이다. 본 발명의 실시예는 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 다른 한 실시예에서, 본 발명은 또한 재프로그래밍된 세포를 생성하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 전사 억제에 관여하는 단백질의 활성을 저해하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 조절 단백질의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 변화시키는 단계를 포함하는 세포 재프로그래밍 방법에 관한 것이다. 이 방법은 또한 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계 및 세포를 재프로그래밍하는 단계를 추가로 포함한다.
또한 본 발명의 실시예는 세포, 세포군, 세포 배양액, 세포 배양액으로부터의 세포 서브세트, 균질성 세포 배양액 또는 이질성 세포 배양액을, 전사 억제에 관여하는 단백질의 활성, 발현 또는 활성과 발현을 억제하는 작용제(agent)와 접촉시키는 단계, 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계, 및 세포를 재프로그래밍하는 단계를 포함하는 세포 재프로그래밍 방법에 관한 것이다. 본 방법은 재프로그래밍된 세포를 재분화시키는 단계를 추가로 포함한다.
다른 한 실시예에서, 본 발명은 조절 단백질의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 변화시키는 소분자 조절제에 세포를 노출시키는 단계; 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계; 세포를 선별하는 단계를 포함하며 분화능(differentiation potential)이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 세포재프로그래밍 방법에 관한 것이다.
전사 억제에 관여하는 단백질 또는 조절 단백질의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 변화시키는 작용제에는 소분자, 소분자 억제제 및 소분자 활성제 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
다능 또는 만능 유전자의 발현을 억제하는 작용제에는 소분자, 소분자 억제제 및 소분자 활성제 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
전사 억제에 관여하는 단백질은 본 발명의 방법에 의해 저해될 수 있으며, 이에는 DNA 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제, 메틸 결합 도메인 단백질, 히스톤 메틸트랜스퍼라제, SWI/SNF 복합체의 구성성분, NuRD 복합체의 구성성분, 및 INO80 복합체의 구성성분이 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
몇몇 실시예에 있어서, DNA 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제, 메틸 결합 도메인 단백질 또는 히스톤 메틸트랜스퍼라제의 활성을 억제하는데 하나 이상의 소분자 억제제가 사용될 수 있다. 다른 한 실시예에서, DNA 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제, 메틸 결합 도메인 단백질 또는 히스톤 메틸트랜스퍼라제(이에 국한되는 것은 아님)를 포함하는 전사 억제에 관여하는 하나 이상의 단백질을 저해하는데 하나 이상의 소분자 억제제가 사용될 수 있다.
다른 한 실시예에 있어서, 본 발명은 세포를 하나 이상의 DNMT의 활성을 억제하는 소분자 억제제와 세포와 접촉시키는 단계, 하나 이상의 CpG 디뉴클레오티드를 탈메틸화시키는 단계, 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 단계, 및 세포를 재프로그래밍하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
다른 한 실시예에서, 본 발명은 하나 이상의 조절 단백질의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 변화시키는 소분자 조절제에 제 1 표현형을 갖는 세포를 노출시키는 단계; 상기 세포의 제 1 표현형과 상기 소분자 조절제에 세포를 노출한 후에 얻어지는 표현형을 비교하는 단계, 및 재프로그래밍되고 다능 또는 만능성인 세포를 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시예에서, 본 방법은 소분자 조절제에 세포를 노출시키기 전의 세포의 유전자형과 소분자 조절제에 세포를 노출시킨 후에 얻어지는 유전자형을 비교하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 소분자 조절제에 세포를 노출시키기 전의 세포의 표현형 및 유전자형과, 소분자 조절제에 세포를 노출시킨 후의 표현형 및 유전자형을 비교하는 단계를 포함한다.
다른 한 실시예에서, 본 발명은 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 소분자 조절제에 세포군을 노출시키는 단계; 세포를 선별하는 단계를 포함하며 분화능이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 세포 재프로그래밍 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 조절 단백질의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 변화시키는 소분자 조절제에 세포를 노출시키는 단계; 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계; 및 세포를 선별하는 단계를 포함하며, 분화능이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 세포 재프로그래밍 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시예에서, 본 방법은 선택된 세포를 세포군으로 배양 및 확장시키는 단계를 포함한다. 다른 한 실시예에서, 본 방법은 다능 또는 만능 유전자에 의해 부호화되는 단백질에 결합하는 항체, 혹은 만능 마커 또는 다능 마커(SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아님)에 결합하는 항체를 사용하여 세포를 분리하는 단계를 포함한다. 다른 한 실시예에서, 본 발명은 소분자에 노출시키기 전의 다능 또는 만능 유전자의 염색질 구조와 소분자에 노출시킨 후에 얻어지는 염색질 구조를 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 세포는 또한 세포를 분리하는데 효율적인 어떠한 방법에 의해서도 분리될 수 있으며, 이에는 형광 세포 활성화 선별기, 면역조직 화학법, ELISA 등이 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 또 다른 실시예에서, 본 방법은 원 세포 보다 덜 분화된 상태의 세포를 선별하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 다능 또는 관능 유전자의 발현을 유도하는 소분자 조절제에 제 1 전사 패턴을 가진 세포를 노출시키는 단계, 세포의 제 1 전사 패턴과 상기 소분자 조절제에 노출시킨 후에 얻어지는 전사 패턴을 비교하는 단계, 및 세포를 선별하는 단계를 포함하며, 분화능이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 세포 재프로그래밍 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시예에서, 세포 선별은 배아 줄기세포로부터 분석된 전사 패턴과 적어도 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-94%, 95% 또는 95-99% 유사한 전사 패턴을 가진 세포를 확인하는 단계를 포함한다. 배아 줄기세포의 총 전사 패턴을 비교할 수도 있으나, 반드시 필요한 것은 아니다. 그 대신에, 배아 유전자의 서브세트를 비교할 수 있으며, 이에는 1-5, 5-10, 10-25, 25-50, 50-100, 100-200, 200-500, 500-1,000, 1,000-2,000, 2,000-2,500, 2,500-5,000, 5,000-10,000 및 10,000 이상의 유전자가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 전사 패턴은 이원 방식으로 비교될 수 있다. 즉, 유전자가 전사되는지 아닌지를 결정하기 위해 비교를 시행한다. 또 다른 실시예에서, 각 유전자 또는 유전자의 서브세트에 대한 전사 속도 및/또는 범위가 비교될 수 있다. 전사 패턴은 당해분야에 알려진 어떠한 방법에 의해서도 결정될 수 있으며, 이러한 방법에는 RT-PCR, 정량적 PCR, 마이크로어레이(microarray), 서던 블로트(southern blot) 및 혼성화 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
다른 한 실시예에서, 본 발명은 제 1 조절 단백질의 활성, 발현 또는 활성과 발현을 저해하는 소분자 조절제에 세포를 노출시키는 단계, 제 2 조절 단백질의 활성, 발현 또는 활성과 발현을 억제하는 제 2 작용제에 상기 세포를 노출시키는 단계로서, 상기 제 2 조절 단백질은 제 1 조절 단백질과는 완전히 다른 기능을 가지는 것을 특징으로 하는 단계, 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계, 세포를 선별하는 단계를 포함하며, 분화능이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 세포 재프로그래밍 방법에 관한 것이다. 다른 한 실시예에서, 세포 또는 세포군이 제 1 및 제 2 작용제에 동시에 또는 순차적으로 노출될 수 있다. 제 2 작용제로는 소분자, 소분자 억제제, 소분자 활성제, 핵산 서열 및 shRNA 구조체 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 실시예는 본 명세서에 기술한 방법에 따라 제조된 재프로그래밍된 세포를 사용하여 다양한 질병을 치료하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 다른 한 실시예에서, 본 발명은 또한 재프로그래밍된 세포 및 재분화된 재프로그래밍 세포의 치료 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 실시예는 본 발명의 방법에 의해 제조된 재프로그래밍된 세포에 관한 것이다. 재프로그래밍된 세포는 하나의 계통(lineage) 또는 하나 이상의 계통으로 재분화될 수 있다. 재프로그래밍된 세포는 만능 또는 다능 세포일 수 있다.
다른 한 실시예에서, 본 발명은 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 소분자 조절제에 세포를 노출시키는 단계, 세포를 선별하는 단계로서 분화능이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 단계, 상기 선별된 세포를 배양함으로써 세포군을 생성시키는 단계를 포함하는 방법에 따라 제조되는 농축 재프로그래밍 세포군에 관한 것이다. 다른 한 실시예에서, 재프로그래밍된 세포는 SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 세포 표면 마커를 발현한다. 또 다른 실시예에서, 재프로그래밍된 세포는 다능 유전자를 발현한다. 다른 한 실시예에서, 재프로그래밍된 세포는 농축 세포군의 적어도 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 96-98%, 또는 적어도 99%를 차지한다.
또한 본 발명의 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 제조하기 위한 키트에 관한 것이다. 이 키트는 세포를 재프로그래밍하는데, 그리고 ES계 세포 및 줄기 세포계 세포를 생성하는데 사용될 수 있다.
도 1은 DNMT 억제제(500μM GR108)로 처리된 일차 인간 폐 섬유아세포 내의 Oct-4 및 Nanog의 상향 조절을 보여주는 막대 그래프이다. MC는 대조용 배지이다.
도 2는 여러 세포 타입에서 VPA의 존재하에 여러 다능 유전자의 발현 증가를 보여주는 막대 그래프이다. HDFa는 성인 인간 진피 섬유아세포를 의미하고, HDFf는 태아 인간 진피 섬유아세포를 의미하며, HDFn는 신생아 인간 진피 섬유아세포를 의미하고, BJF는 BJ 섬유아세포(포피)를 의미한다.
도 3은 VPA로 처리된 성인 및 태아 인간 진피 섬유아세포에서 HDAC11 및 HDAC9의 발현에 미치는 영향을 보여주는 막대 그래프이다.
도 4는 4일 동안 니코틴아미드로 처리된 성인 인간 진피 섬유아세포에서 Oct-4의 발현 증가를 보여주는 막대 그래프이다.
도 5는 4일 동안 페닐부티레이트로 처리된 성인 인간 진피 섬유아세포에서 Oct-4의 발현 증가를 보여주는 막대 그래프이다.
도 6은 4일 동안 밸프록삼(valproxam)으로 처리된 성인 인간 진피 섬유아세포에서 Oct-4의 발현 증가를 보여주는 막대 그래프이다.
도 7은 8일 동안 2-PCPA(히스톤/리신 1 데메틸라제 억제제)로 처리된 BJ 섬유아세포에서 Oct-4의 발현 증가를 보여주는 막대 그래프이다.
도 8A는 섬유아세포 증식 배지 속의 성인 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 8B는 DMEM/F12 배지 속의 성인 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 8C는 마트리젤(matrigel)이 첨가된 mTeSR hES 세포 배지 속의 VPA 처리된(500μM) 성인 인간 진피 섬유아세포 사진이다.
도 8D는 마트리젤이 첨가된 mTeSR hES 세포 배지 속의 VPA 처리된(500μM) 성인 인간 진피 섬유아세포 사진이다.
용어 정의
본 명세서에 수의 범위는 대략적인 것이며, 따라서 별도의 설명이 없는 한 범위 밖의 수치도 포함될 수 있다. 수의 범위는 한 단위씩 증가하고 범위 내의 모든 수치 및 하한치와 상한치를 포함하며, 낮은 수치와 높은 수치 사이에 적어도 두 단위로 분리가 되는 것을 전제로 한다. 한 보기로서, 예를 들어, 분자량, 용융지수(melt index), 온도 등과 같은 조성적, 물리적 또는 다른 특성이 100 ~ 1,000이라면, 100, 101, 102 등과 같은 모든 각각의 수치 및 100 ~ 144, 155 ~ 170, 197 ~ 200 등과 같은 하위 범위도 특별히 열거될 수 있다는 것을 의미한다. 1보다 작거나 큰 소수(예를 들어, 1.1, 1.5 등)를 포함하는 범위인 경우, 한 단위는 경우에 따라 0.0001, 0.001, 0.01 또는 0.1이 될 수 있다. 10보다 작은 한자리 수를 포함하는 범위인 경우, 한 단위는 통상적으로 0.1로 간주된다. 특별히 의도하는 것이 무엇인지에 대한 예로서 최저치와 최고치 사이의 모든 가능한 조합의 수치를 열거하는 것은 본 명세서에서 특별히 설명하고자 하는 의도가 있는 것이다. 수의 범위는 본 방법에서 인용되는 혼합물의 성분의 상대적 농도와 다양한 온도 및 다른 파라미터 범위에 대해 제공된다.
"세포" 또는 "세포들"은 특별히 그렇지 않다는 언급이 없는 한, 체세포, 배아 줄기(ES) 세포, 성체 줄기세포, 기관 특이적 줄기세포, 핵 이식(NT) 유니트 및 줄기계 세포를 포함한다. 세포 및 세포들은 인간 또는 다른 동물세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 생쥐, 기니아 피그, 집쥐, 돼지, 양, 염소 등의 세포일 수 있다. 또한 세포는 비인간 유인원 세포일 수 있다.
"배양 배지" 또는 "성장 배지"는 세포의 성장을 지지할 수 있는 적절한 배지를 의미한다.
"분화"는 배아 발달 동안 세포가 구조적으로 및 기능적으로 특수화되는 과정을 의미한다.
"DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제" 및 "DNA 메틸트랜스퍼라제의 억제제"는 DNA 메틸트랜스퍼라제와 상호작용하여 그 효소 활성을 억제시킬 수 있는 화합물을 의미한다. "DNA 메틸트랜스퍼라제 활성 억제"는 CpG 디뉴클레오티드 서열과 같은 특정 기질로부터 아세틸기를 제거할 수 있는 DNA 메틸트랜스퍼라제의 능력을 저하시키는 것을 의미한다. 몇몇 실시예에서 이러한 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성 감소는 적어도 약 25%, 다른 실시예에서는 적어도 약 50%, 또 다른 실시예에서는 적어도 약 75%, 또 다른 실시예에서는 적어도 약 90%이다. 다른 실시예에서는 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성이 적어도 95%까지 감소되며, 또 다른 실시예에서는 적어도 99%까지 감소된다.
"후생적"은 뉴클레오티드 서열의 변화없이 기능 변화를 물려줄 수 있는 DNA 상태를 의미한다. 후생적 변화는 DNA의 뉴클레오티드 서열 변화없이 예를 들어 메틸화 및 탈메틸화에 의해 DNA를 수정함으로써 유발될 수 있다.
"히스톤"은 DNA가 핵 내에서 고정되기에 충분하도록 DNA를 응축하는 역할을 하며 염색체내에 존재하는 단백질 분자를 의미한다.
"넉다운"은 유전자 발현이 유전자-특이적 방식으로 억제되는 것을 의미한다. 하나 이상의 유전자 "넉다운"을 가진 세포는 넉다운 생물 또는 간단하게 "넉다운"이라고 칭한다.
"다능"이라는 것은 3 배엽 또는 기본조직 타입의 세포 타입으로 분화될 수 있는 것을 의미한다.
"다능 유전자"는 세포가 다능성이 되는데 기여하는 유전자를 의미한다.
"다능 세포 배양액"은 배아 또는 성인 유래의 분화된 세포와는 명백하게 구별되는 형태를 보이는 "사실상 미분화된" 것이다. 다능 세포는 일반적으로 핵/세포질 비가 높으며, 인이 두드러지고, 식별이 어려운 세포 연접부와 강한 콜로니를 형성하며, 당해 분야에 숙련자에게 널리 인식되고 있는 세포이다. 인지해야 할 점은 미분화 세포 콜로니는 분화된 주변 세포들에 의해 둘러 싸여져 있을 수 있다는 것이다. 그럼에도 불구하고, 적절한 조건하에 배양시에 사실상 미분화된 콜로니가 유지될 것이며, 배양 세포의 분열시에 성장하는 세포의 대부분은 미분화 세포가 차지한다. 본 명세서에서 기술되는 유용한 세포군은 이러한 기준을 가진 사실상 미분화된 다능 세포를 함유한다. 사실상 미분화된 세포 배양액은 미분화 다능 세포를 적어도 약 20%, 40%, 60% 또는 80%(세포군 중 총 세포의 퍼센트) 함유할 수 있다.
"조절 단백질"은 생물학적 변화과정을 조절하는 단백질을 의미하며, 이 조절은 양의 방향 및 음의 방향으로의 조절을 포함한다. 조절 단백질은 생물학적 변화과정에 직접 또는 간접적으로 영향을 줄 수 있으며, 직접적으로 영향력을 행사하거나 복합체에 참여함으로써 영향을 줄 수 있다.
"재프로그래밍"은 핵 속의 후생적 마크를 제거하고, 다른 세트의 후생적 마크를 확립하는 것을 의미한다. 다세포 생물의 발달과정에서, 서로 다른 세포 및 조직은 서로 다는 유전자 발현 프로그램을 획득한다. 이러한 구별되는 유전자 발현 패턴은 DNA 메틸화, 히스톤 변형 및 다른 염색질 결합 단백질과 같은 후생적 변경에 의해 사실상 조절되는 것으로 보인다. 따라서, 다세포 생물내의 각 세포 타입은 통상적으로 일단 세포가 분화되거나 세포 주기를 벗어나면 "고정"되고 변경되지 않는 것으로 생각되는 고유의 후생적 특징을 가진다. 그러나, 일부 세포는 정상적인 발달과정 또는 특정 질환의 상황에서 중요한 후생적 "재프로그래밍"을 경험한다.
"소분자 조절제"는 소분자 억제제 또는 소분자 활성제인 화합물을 포함하는 의미이다. 소분자 조절제는 일부 생리학적 맥락에서는 소분자 억제제로서, 다른 생리학적 맥락에서는 소분자 활성제로서 기능을 한다. 소분자 조절제는 한 표적에 대해서는 소분자 억제제로서, 또 다른 표적에 대해서는 소분자 활성제로서 기능을 할 수 있다. 동일한 소분자 조절제는 소분자 억제제로서도 또한 소분자 활성제로서도 기능을 할 수 있다.
"전능성"은 완전한 배아 또는 기관으로 발육할 수 있는 능력을 의미한다.
본 발명의 실시예는 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시예에서, 본 방법은 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 단계 및 적어도 하나의 계통으로 유도 분화될 수 있는 재프로그래밍 세포를 제조하는 단계를 포함한다.
또한 본 발명의 실시예는 염색질 구조를 변화시키는 단계 및 세포를 다능성 또는 만능성이 되도록 재프로그래밍하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 다른 한 실시예에서, 염색질 구조의 변화는 소분자 조절제를 사용하여 전사 조절에 관여하는 하나 이상의 단백질의 활성을 저해하는 단계를 포함한다.
다른 한 실시예에서, 염색질 구조의 변화는 소분자 억제제를 사용하여 전사 억제에 관여하는 하나 이상의 단백질의 활성을 저해하는 단계를 포함한다.
또한 본 발명의 실시예는 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 유전자의 업스트림 DNA 서열 또는 프로모터 영역을 변화시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 다른 한 실시예에서, 프로모터 구조 또는 업스트림 DNA 서열을 변화시키는 단계는 소분자 조절제를 사용하여 전사에 관여하는 하나 이상의 조절 단백질의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 조절하는 단계를 포함한다.
다른 한 실시예에서, 소분자 조절제를 사용하여 전사 조절에 관여하는 하나 이상의 단백질의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 변화시키는 단계, 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시예에서, 본 방법은 하나 이상의 DNA 메틸트랜스퍼라제의 활성을 억제하는 단계 및 재프로그래밍된 세포를 생성시키는 단계를 포함한다.
다른 한 실시예에서, 본 방법은 소분자 억제제를 사용하여 하나 이상의 DNA 메틸트랜스퍼라제의 활성을 저해하는 단계, CpG 디뉴클레오티드 내의 하나 이상의 시토신을 탈메틸화시키는 단계, 및 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 방법은 재프로그래밍된 세포를 생성시키는 단계를 추가로 포함한다. 재프로그래밍된 세포는 다능성 또는 만능성일 수 있다.
다른 한 실시예에서, 본 방법은 소분자 억제제를 세포와 접촉시키는 단계, 전사 억제에 관여하는 하나 이상의 단백질의 활성을 저해하는 단계, 및 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 방법은 재프로그래밍된 세포를 생성시키는 단계를 추가로 포함한다. 재프로그래밍된 세포는 다능성 또는 만능성일 수 있다.
다른 한 실시예에서, 본 발명은 다능성 또는 만능성 유전자의 발현을 유도하는 소분자 조절제에 세포를 노출시키는 단계, 및 세포를 선별하는 단계를 포함하며, 분화능이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 세포 재프로그래밍 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 하나 이상의 조절 단백질의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 변화시키는 소분자 조절제에 세포를 노출시키는 단계, 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계, 및 세포를 선별하는 단계를 포함하며, 분화능이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 세포 재프로그래밍 방법에 관한 것이다. 다능 또는 만능 유전자는 발현의 배수 증가가 0.25-0.5, 0.5-1, 1.0-2.5, 2.5-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-40, 40-50, 50-100, 100-200, 200-500, 및 500배 이상(이에 국한되는 것은 아님)까지 유도될 수 있다. 다른 한 실시예에서, 본 방법은 분화된 세포를 플레이팅하는 단계, 상기 분화된 세포를 소분자 조절제에 노출시키는 단계, 상기 세포를 배양하는 단계, 및 재프로그래밍된 세포를 확인하는 단계를 포함한다.
다른 한 실시예에서, 조절 단백질의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 변화시킴으로써, 조절 단백질의 활성을 증가시킬 수도 있고, 조절 단백질의 발현을 증가시킬 수도 있으며, 조절 단백질의 활성을 감소시킬 수도 있고, 조절 단백질의 발현을 감소시킬 수도 있다. 조절 단백질의 활성 또는 발현은 1-5%, 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 및 95-99%, 99-200%, 200-300%, 300-400%, 400-500% 및 500% 이상(이에 국한되는 것은 아님)까지 증가 또는 감소될 수 있다.
다른 한 실시예에서, 본 방법은 다능 또는 만능 유전자에 의해 부호화되는 단백질 또는 단백질 단편, 혹은 다능 또는 만능 표면 마커에 대한 항체를 이용하여 세포를 선별하는 단계를 추가로 포함한다. 항체로는 어떠한 종류도 사용될 수 있으며, 이에는 모노클론 항체, 폴리클론 항체, 항체 단편, 펩티드 모방 항체, 활성 영역에 대한 항체, 단백질 보존 영역에 대한 항체 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또 다른 실시예에서, 본 방법은 세포를 선별하고, 이 세포를 다능 세포 배양액으로 확장 또는 배양하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 방법은 다능 또는 만능 유전자 혹은 다능 또는 만능 표면 마커에 의해 작동되는 리포터를 이용하여 세포를 선별하는 단계를 추가로 포함한다. 리포터로는 어떠한 종류도 사용될 수 있으며, 이에는 형광 단백질, 녹색 형광 단백질, 시안 형광 단백질(CFP), 노란색 형광 단백질(YFP), 박테리아 루시퍼라제(bacterial luciferase), 해파리 에쿼린(jellyfish aequorin), 강화 녹색 형광 단백질, 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), dsRED, β-갈락토시다제, 및 알칼리성 포스파타제 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
또 다른 실시예에서, 본 방법은 선별가능한 마커로서의 저항물질을 이용하여 세포를 선별하는 단계를 추가로 포함한다. 저항물질에는 항생제 저항물질, 살균제, 퓨로마이신, 하이그로마이신(hygromycin), 디하이드로폴레이트 환원제, 티미딘 키나제, 네오마이신 저항물질(neo), G418 저항물질, 마이코페놀산 저항물질(gpt), 제오신 저항 단백질 및 스트렙토마이신 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
또 다른 실시예에서, 본 방법은 소분자 조절제에 노출시키기 전에 존재하는 세포의 다능 또는 만능 유전자의 염색질 구조와, 소분자 조절제로 처리한 후에 얻어지는 다능 또는 만능 유전자의 염색질 구조를 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 염색질 구조의 어떠한 특징도 비교할 수 있으며, 이에는 진정 염색질, 이질 염색질, 히스톤 아세틸화, 히스톤 메틸화, 히스톤 또는 히스톤 구성성분의 존재 및 부재, 히스톤의 위치, 히스톤의 배열, 및 염색질과 관련이 있는 조절 단백질의 존재 또는 부재 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 모든 유전자 영역의 염색질 구조가 비교될 수 있으며, 이에는 강화물질 고유영역, 활성자 고유영역, 프로모터, TATA 박스, 전사 개시 부위의 업스트림 영역, 전사 개시 부위의 다운스트림 영역, 엑손, 및 인트론 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
소분자 억제제 또는 "소분자 화합물"은 측정가능한 또는 억제할 수 있는 활성을 가지는, 본 발명의 방법, 조성물 및 키트에 유용한 화합물을 의미한다. 몇몇 실시예에 있어서 소분자 억제제는 상대분자량이 1000D이하이며, 다른 실시예에서는 상대 분자량이 500D이하이다. 소분자 억제제는 무기성일 수도 있고 유기성일 수도 있다. 유기 및 무기 소분자 화합물이외에도, 펩티드, 항체, 환형 펩티드 및 펩티드 유사체도 본 발명에 유용하게 사용될 수 있다.
소분자 조절제는 소분자 라이브러리에 포함되는 어떠한 화합물도 가능하며 소분자 라이브러리에 포함되는 화합물로부터 유도되는 변형 화합물일 수도 있다. 몇몇 소분자 라이브러리는 BIOMOL INTERNATIONAL(현재 Enzo Life Sceince)을 포함한 시중 공급사로부터 구입할 수 있으며, 이에는 바이오액티브 리피드 라이브러리, 엔도칸나비노이드 라이브러리, 패티 애시드 라이브러리, ICCB 논 바이오액티브스 라이브러리, 이온 채널 리간드 라이브러리, 키나제 인히비터 라이브러리, 키나제/포스파타제 인히비터 라이브러리, 뉴트로트랜스미터 라이브러리, 내츄럴 프로덕트 라이브러리, 뉴클리러 리셉터 라이브러리, 오펀 리간드 라이브러리, 프로테아제 인히비터 라이브러리, 포스파타제 인히비터 라이브러리 및 레어 내츄럴 프로덕츠 라이브러리 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
소분자 억제제는 전사 억제에 관여하는 어떠한 단백질도 억제하는데 사용될 수 있으며, 이러한 단백질에는 히스톤 데아세틸라제(HDAC), 메틸 결합 도메인 단백질(MBD), 메틸 아데노실트랜스퍼라제(MAT), DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT), 히스톤 메틸트랜스퍼라제 및 메틸 사이클 효소가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
이러한 억제는 특이적인 것이 바람직하다. 예를 들어, DNMT 소분자 억제제의 경우, DNMT 억제제는 관련없는 다른 생물학적 효과를 제공하기 위해 필요한 억제제의 농도보다 낮은 농도에서 메틸화에 필요한 다른 구성성분과 상호작용할 수 있는 DNA 메틸트랜스퍼라제의 능력을 저하시킨다. DNA 메틸트랜스퍼라제 억제 활성에 필요한 억제제의 농도는 관련없는 생물학적 효과를 제공하기 위해 필요한 농도보다 바람직하게는 적어도 2배 낮으며, 보다 바람직하게는 적어도 5배 낮고, 더욱 바람직하게는 적어도 10배 낮으며, 가장 바람직하게는 20배 낮다.
소분자 조절제는 전사 조절에 관여하는 한 단백질 또는 그 이상의 단백질의 활성, 발현 또는 활성과 발현을 변화시키는데 어떠한 수, 어떠한 배합 및 어떠한 농도로도 사용될 수 있으며, 이에는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11-15, 16-20 및 21-25, 25-50, 50-100, 100-250, 250 이상의 수가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 소분자 조절제는 하나 또는 그 이상의 특이적 단백질, 하나 또는 그 이상의 특정 클래스의 단백질, 하나 또는 그 이상의 특이적 패밀리의 단백질 또는 일반적인 전사 구성성분에 지향적일 수 있다.
소분자 조절제는 비가역적 작용 메커니즘을 가질 수도 있고 가역적 작용 메커니즘을 가질 수도 있다. 소분자 조절제는 어떠한 결합 친화성도 가질 수 있으며, 예를 들어 밀리몰(mM), 마이크로몰(μM), 나노몰(nM), 피코몰(pM) 및 펜타몰(fM)이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 소분자 조절제는 단백질의 조절 부위 또는 촉매 부위에 결합한다. 본 발명의 방법에 의해 억제될 수 있는 단백질의 대표적인 목록은 하기 표 1에 제공된다. 표 1은 억제에 관여하는 단백질의 대표적인 목록이다.
히스톤
데아세틸라제 		메틸 결합 도메인 단백질 메틸 아데노 실- 트랜스퍼라제 DNA 메틸 - 트랜스퍼라제 히스톤 메틸 -트랜스퍼라제 메틸 사이클 효소
클래스 I
(HDAC 1-3,8,11)		 MBD1 MAT2A DNMT1 EHMT1 MTHFR
클래스 II
(HDAC 4-7,9,10)		 MBD2 MAT1A DNMT2 HDM G9A CBS
클래스 III (SIRTI 1-7 ) MBD3 MAT2B DNMT3A SUV39H1
클래스 IV (HDAC 11) MBD4 DNMT3B SETB1
MeCP2 DNMT3L
예를 들어, 메틸 결합 도메인 단백질, 즉 MeCP2는 메틸화 시토신과 결합하여 히스톤 단백질을 탈아세틸화하는 히스톤 데아세틸라제를 모집함으로써 응축된 염색질 구조를 형성하며, 이로써 전사를 억제한다. 본 발명의 방법은 전사 억제에 관여하는 단백질을 저해함으로써, 다능성 유전자의 전사를 유도할 수 있다.
그러므로, 전술한 대표적인 억제 복합체를 기초로 해서, 소분자 억제제는 MeCP2의 활성을 억제함으로써 HDAC가 염색질 구조로 모집되는 것을 현저히 감소시키는데 사용될 수 있다. 이는 세포가 다능 또는 만능으로 되는데 중요한 유전자의 상향 조절을 유도함으로써 체세포 내에서의 분화능을 증가시킬 수 있다. 마찬가지로, 소분자 억제제는 DNMT를 억제하기 위해 사용될 수 있으며, 마찬가지로 이는 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 유전자의 상향 조절을 유도할 수 있다. 또한, DNA 메틸트랜스퍼라제에 지향적인 소분자 억제제 및 메틸 결합 단백질에 지향적인 소분자 억제제는 억제 복합체에 관여하는 하나 이상의 단백질의 활성을 감소시킴으로써 다능 유전자를 유도하고 그럼으로써 세포를 재프로그래밍하기 위해 동시에 또는 순차적으로 사용될 수 있다. 상술한 기술 내용은 단지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
DNMT 소분자 억제제는 DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B 및 DNMT3L(이에 국한되는 것은 아님)을 포함한 어떠한 DNA 메틸트랜스퍼라제와도 상호작용을 할 수 있다. DNMT1은 포유동물 세포 내에 가장 많이 존재하는 DNA 메틸트랜스퍼라제로서 포유동물 내에서 메틸트랜스퍼라제를 유지하는데 관여하는 것으로 생각된다. DNMT1은 주로 포유동물 게놈 내에서 헤미메틸화 CpG 디뉴클레오티드를 메틸화한다. 이 효소는 시험관 내에서는 비메틸화 기질과 비교했을 때 헤미메틸화 DNA에 대해 7 ~ 20배 더 활성적이나, 신메틸화(de novo methylation)에서 다른 DNMT보다 훨씬 더 활성적이다. 이 효소는 약 1620개의 아미노산 길이를 가진다. 처음 1100개의 아미노산은 효소의 조절 도메인을 구성하고 있으며, 그 나머지 아미노산이 촉매 도메인을 구성하고 있다. 이들은 Gly-Lys 리피트에 의해 결합되어 있다. 두 도메인은 DNMT1의 촉매 기능에 필요하다.
DNMT2는 원핵 생물 및 진핵 생물 모두의 5-메틸시토신 메틸트랜스퍼라제와 높은 서열 유사성을 가진다. 또한 DNMT2는 아스파라긴산 운반 RNA(transfer RNA)의 38 위치를 메틸화하는 것으로 알려져 있다.
DNMT3는 헤미메틸화 및 비메틸화 CpG 디뉴클레오티드를 동일한 비율로 메틸화할 수 있는 DNA 메틸트랜스퍼라제의 한 패밀리이다. DNMT3 효소의 구성은 DNMT1과 유사하며, 조절 부위가 촉매 부위와 결합되어 있다. DNMT3A 및 DNMT3B는 발달 과정동안 DNA 메틸화 패턴을 확립하는데 있어서 역할을 한다. DNMT3A 및 DNMT3B 단백질은 서로 다른 배아형성 단계에서 발현된다. DNMT3B는 내부세포괴, 낭배의 외피 및 배아 외배엽 세포와 같은 분화전능성 배아 세포에서 발현되며, DNMT3A는 E10.5후에 어디에서나 발현되는 것으로 보인다.
DNMT3L은 DNA 메틸트랜스퍼라제 모티브를 함유하며, 모계 유전적 각인(maternal genomic imprint)을 확립하는데 관여한다. 또한 DNMT3L은 전사 억제에 역할을 하는 것으로 생각된다.
본 발명의 방법, 조성물, 및 키트에 사용되는 DNMT 소분자 억제제는 DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B 또는 DNMT3L과 상호작용을 할 수 있다. DNMT 억제제는 한 타입의 DNMT, 모든 타입의 DNMT, 또는 DNMT1과 DNMT2; DNMT1과 DNMT3A; DNMT1과 DNMT3B; DNMT1과 DNMT3L; DNMT2와 DNMT3A; DNMT2와 DNMT3B; DNMT2와 DNMT3L; DNMT3A와 DNMT3B; DNMT3A와 DNMT3L; DNMT3B와 DNMT3L; DNMT1, DNMT2 및 DNMT3A; DNMT1, DNMT2 및 DNMT3B; DNMT1, DNMT2 및 DNMT3L; DNMT2, DNMT3A 및 DNMT3B; DNMT2, DNMT3A 및 DNMT3L; DNMT2, DNMT3B 및 DNMT3L; DNMT1, DNMT2, DNMT3A 및 DNMT3B(이에 국한되는 것은 아님)를 포함한 다수의 타입의 DNMT와 상호작용을 할 수 있다. 또한 본 발명의 DNMT 억제제는 알려진 타입들 중 어느 한 타입에 속하지 않는 DNMT 또는 아직 분류되지 않은 DNMT와 상호작용을 할 수 있다.
다른 한 실시예에서, DNMT 억제제는 DNMT의 조절 도메인 또는 촉매 도메인과 결합함으로써 작용을 할 수 있다. 다른 한 실시예에서, DNMT 억제제는 뉴클레오시드 유사체(DNA 또는 RNA에 혼입됨)일 수도 있고 비-뉴클레오시드 유사체일 수도 있다. 또 다른 실시예에서, DNMT 억제제는 DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B 또는 DNMT3L(이에 국한되는 것은 아님)을 포함한 DNMT에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또 다른 실시예에 있어서, DNMT 억제제는 단백질-단백질 상호작용을 차단함으로써 작용을 할 수 있다.
다른 한 실시예에서, Dnmt 활성 및 시토신 메틸화를 억제하기 위해 세포를 다음과 같은 배지 내에서 성장시킬 수 있다.
(a) Dnmt1, 2, 3a, 및/또는 3b siRNA로 처리된 배지(Dharmacon, Inc.);
(b) RG108로 처리된 배지(Analytic Systems Laboratory, LSU School of Vererinary Medicine);
(c) 5-AzadCyd로 처리된 배지(Sigam)
하기의 표 2는 DNMT를 억제할 수 있는 소분자 억제제의 대표적인 목록을 제공한다. 본 발명의 방법, 조성물, 및 키트에 사용되는 DNMT 억제제는 본 명세서에 언급된 DNMT 억제제의 유도체 및 유사체를 포함한다. 표 2는 DNMT를 억제할 수 있는 뉴클레오시드 유사체 및 비-뉴클레오티드 유사체의 대표적인 목록이다.
뉴클레오시드 유사체 비-뉴클레오시드 유사체
5-아자시티딘 하이드라진
5-아자-2-데옥시시티딘 하이드라진 하이드로클로라이드
5-플루오로-2-도에시토딘 프로카인아미드
5,6-디하이드로-5-아자시티딘,
5-플루로오우라실		 프로카인
제불라린 프로카인 하이드로클로라이드
에피갈로카테킨-3-갈레이트(EFOG)
프삼마플린 A
MG98
RG108
표 3은 재프로그래밍에 관여하는 유전자의 발현을 유도, 상향 조절 또는 변화시키기 위해 사용될 수 있는 소분자 조절제의 대표적인 목록이다. 소분자 조절제는 기본 전사 기구(basal transcriptional machinery)의 구성성분, 전사 활성화의 구성성분, 염색질 리모델링 복합체의 구성성분, 전사 억제의 구성성분, DNA 수선의 구성성분, 미스매치 수선의 구성성분, 및 세포의 메틸화 상태 유지에 관여하는 구성성분을 표적으로 삼을 수 있다. 소분자 조절제에는 히스톤 데아세틸라제 억제제(HDACi), 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 억제제(HATi), 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 활성제, 리신 메틸트랜스퍼라제 억제제(LMTi), 히스톤 메틸트랜스퍼라제 억제제(HMTi), 트리코스타틴 A 억제제(TSAi), 히스톤 데메틸라제 억제제(HdeMi), 리신 데메틸라제 억제제(LdeMi), 시르투인 억제제(SIRTi), 및 시르투인 활성제(SIRTa) 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 표 3은 세포를 재프로그래밍하는데 사용될 수 있는 소분자 조절제의 대표적인 목록이다.
소분자 조절제 기능
HC 독소 HDACi
가르시놀 HATi
BML-210 HDACi
채토신 LMTi/HMTi
ITSA1 TSAi
데푸데신 HDACi
트라닐시프로민 HdeMi/LdeMi
EX-527 SIRT1i
레스베라트롤 SIRT1a
M-344 HDACi
니코틴아미드 SIRTi
플루오로-SAHA HDACi
피세아타놀 SIRTa
BML-266 SIRT2i
시르티놀 SIRT2i
발프록삼 HDACi
AGK2 SIRT2i
히스톤 아세틸트랜스퍼라제 억제제로서 기능을 하는 소분자 조절제에는 아나카드산, 가르시놀, 쿠르쿠민, 이소티아졸론, 부티로락톤, 및 MC16626(2-메틸-3-카르베톡시퀴놀린). 폴리이소프레닐화 벤조페논, 에피갈로카테킨-3-갈레이트(EGCG), 및 CPTH2(시클로펜틸리덴-[4-(4'-클로로페닐)티아졸-2-일]히드라존) 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
히스톤 데메틸라제 억제제로서 기능을 하는 소분자 조절제에는 리신 특이적 데메틸라제, LSD1(KIAA0601 또는 BHC110), 플라빈-의존성 아민 옥사이드, 및 주몬지(jumonji) 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
시르투인 활성제로서 기능을 하는 소분자 조절제에는 레버라트롤, 폴리페놀, 시르투인 활성 화합물, SIRT1-SIRT7의 활성제, 및 SIRT-1720 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
한 실시예에 있어서, DNA 메틸화 억제제는 시티딘 유사체 또는 유도체이다. 시티딘 유사체 또는 유도체의 예로는 5-아자시티딘 및 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-아자-CdR 또는 데시타빈)이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
5-아자-CdR은 관련 천연 뉴클레오시드인 데옥시시티딘의 길항물질이다. 이 두 화합물 사이의 오직 구조적 차이점은 5-아자-CdR의 시토신 고리의 5번 위치에 질소가 존재하고, 데옥시티딘의 경우 이 위치에 탄소가 존재한다는 점이다. 5-아자-CdR은 DNA 메틸트랜스퍼라제의 메커니즘-의존성 비가역적 억제제로서 기능을 한다. 5-아자-CdR가 가장 효과적이기 위해서는 DNA에 혼입되는데, 이 과정은 대사 경로를 통한 화합물의 변형을 필요로 한다. DNA 메틸트랜스퍼라제는 5-아자시토신을 천연 기질로서 인식하고 메틸화반응을 개시한다. 그러나, 유사체는 공유결합 반응 중간산물의 분해를 막음으로써, 효소가 갇혀서 기능이 퇴화된다.
1-β-리보푸라노실-1,2-디하이드로피리미딘-2-온 및 1-β-리보푸라노실-2(1H)-피리미디논이라고도 알려진 제불라린(Zebularine)은 시티딘 데아미나제 억제 활성을 가지는 것으로 여겨진다(Kim et al., J.Med.Chem. 29:1374-1380, 1986: McCormack et al., Biochem Pharmacol. 29:830-832, 1980 참조).
DNMT 억제제는 어떠한 수, 어떠한 배합 및 어떠한 농도로도 사용될 수 있으며, 이에는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11-15, 16-20 및 21-25 DNMT 억제제가 포함되나 이에 국한되는 것은 아니다.
또한 염색질 리모델링에 관여하는 다른 복합체 내의 단백질도 본 발명의 방법에 의해 억제될 수 있으며, 이에는 SWI/SNF 복합체, NuRD 복합체, Sin3 복합체, INO80 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. hSWI/SNF 복합체는 염색질 접근성 조절에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 다중 서브유니트 단백질 복합체이다. hSWI/SNF 복합체의 어떠한 구성성분도 본 발명의 방법에 의해 억제될 수 있으며, 이에는 SNF5/INI1, BRG1, BRM, BAF155 및 BAF170 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. SWI/SNF는 다양한 유전자의 활성화를 위해 필요한 것으로 원래 효모에서 확인되었다. hSWI/SNF 복합체는 수개의 발달상 특이적인 유전자 발현 프로그램의 조절에 필수적인 것으로 알려졌다.
Sin3 복합체의 어떠한 구성성분도 본 발명의 방법에 의해 억제될 수 있으며, 이에는 HDAC1, HDAC2, RbAp46, RbAp48, SinA3, SAP30, 및 SAP18 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
NuRD 복합체의 어떠한 구성성분도 본 발명의 방법에 의해 억제될 수 있으며, 이에는 Mi2, p70 및 p32 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
INO80 복합체의 어떠한 구성성분도 본 발명의 방법에 의해 억제될 수 있으며, 이에는 Tip49A, Tip49B, SNF2 종류 헬리카제 Ino80, 액틴 관련 단백질 ARP4, ARP5, 및 Arp8, YEATS 도메인 패밀리 멤버 Taf14, HMG-도메인 단백질, Nhp10 및 Ies 1 ~ 6으로 지정된 6개의 추가적인 단백질 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 유전자의 발현을 유도하기 위해 다양한 수의 소분자 조절제를 사용할 수 있으며, 이에는 1-5, 6-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50, 및 50개 초과의 소분자 조절제가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명은 난세포, 배아, 배아 줄기세포 또는 체세포 핵이식(SCNT)의 부재하에 얻어지는 재프로그래밍 세포를 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 제조되는 재프로그래밍 세포는 다능 또는 만능 세포일 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조되는 재프로그래밍 세포는 배아 줄기세포와 유사한 특성을 포함한 여러가지 다른 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 재프로그래밍된 세포는 미분화 상태로 적어도 10, 15, 20, 30 또는 그 이상의 계대(passages) 동안 증식할 수 있다. 다른 형태로서, 재프로그래밍된 세포는 분화되지 않고 1년을 초과하는 기간 동안 증식될 수 있다. 또한 재프로그래밍된 세포는 증식 및/또는 분화 과정 동안 정상적인 핵형을 유지할 수 있다. 또한 몇몇 재프로그래밍된 세포는 미분화 상태로 생체 내에서 무제한 증식할 수 있는 세포일 수 있다. 또한 몇몇 재프로그래밍된 세포는 장기간 배양을 통해 정상적인 핵형을 유지할 수 있다. 몇몇 재프로그래밍된 세포는 장기간 배양 후에도 3가지 종류의 배아 생식층(내배엽, 중배엽 및 외배엽) 모두의 유도체로 분화되기 위한 잠재성을 유지할 수 있다. 몇몇 재프로그래밍된 세포는 생물체 내에서 어떠한 세포 타입도 형성할 수 있다. 몇몇 재프로그래밍된 세포는 미분화 성장을 유지하지 못하는 배지 상에서의 성장과 같은 특정 조건하에서 배양체(embryoid body)를 형성할 수 있다. 몇몇 재프로그래밍된 세포는 예를 들어, 배반포와의 융합을 통해 키메라를 형성할 수 있다.
재프로그래밍된 세포는 다양한 마커에 의해 한정될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 재프로그래밍된 세포는 알칼리성 포스파타제를 발현한다. 몇몇 재프로그래밍된 세포는 SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, 및/또는 Tra-1-81을 발현한다. 몇몇 재프로그래밍된 세포는 Oct4, Sox2 및 Nanog를 발현한다. 몇몇 재프로그래밍된 세포는 mRNA 레벨로 발현할 것이고, 또한 다른 재프로그래밍된 세포는 예를 들어 세포 표면상에서 또는 세포내에서 단백질 레벨로 발현할 것이라는 것을 알아야 한다.
재프로그래밍된 세포는 어떠한 재프로그래밍된 세포 특성 또는 범주(들) 및 본 명세서에서 기술한 특성의 어떠한 조합도 가질 수 있다. 예를 들어, 재프로그래밍된 세포는 SSEA-1을 발현하지 않고 알칼리성 포스파타제를 발현할 수 있으며, 적어도 20 계대 동안 증식할 수 있고, 어떠한 세포 타입으로도 분화될 수 있다. 예를 들어, 또 다른 재프로그래밍된 세포는 세포 표면상에서 SSEA-1을 발현할 수 있으며, 내배엽, 중배엽 및 외배엽 조직을 형성할 수 있고, 분화없이 1년을 초과하는 기간 동안 배양될 수 있다.
재프로그래밍된 세포는 알칼리성 포스파타제(AP)에 양성, SSEA-1에 양성, SSEA-4에 음성을 나타낼 수 있다. 또한, 재프로그래밍된 세포는 Nanog에 양성, Sox2에 양성, Oct-4에 양성을 나타낼 수 있다. 또한, 재프로그래밍된 세포는 Tcl1에 양성, Tbx3에 양성을 나타낼 수 있다. 또한, 재프로그래밍된 세포는 크립토(Cripto)에 양성, 스텔라(Stellar)에 양성, Daz1에 양성을 나타낼 수 있다. 재프로그래밍된 세포는 모노클론 항체인 TRA-1-60(ATCC HB-4783) 및 TRA-1-81(ATCC HB-4784)의 결합 특이성을 가지는 항체와 결합하는 세포 표면 항원을 발현할 수 있다. 또한 앞서 기술한 바와 같이, 재프로그래밍된 세포는 영양 세포층(feeder layer)없이 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20의 계대 동안 또는 1년을 초과하는 기간 동안 유지될 수 있다.
재프로그래밍된 세포는 섬유아세포, 골아세포, 연골세포, 지방세포, 골격근, 내피, 엽록체, 평활근, 심근, 신경세포, 조혈세포, 췌장소도, 또는 사실상 신체의 세포를 포함하는 광범위한 세포 타입의 다른 계통으로 분화될 수 있는 잠재성을 가진다. 재프로그래밍된 세포는 모든 세포 계통으로 분화될 수 있는 잠재성을 가진다. 재프로그래밍된 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6-10, 11-20, 21-30, 및 30 초과의 계통을 포함하는 다양한 수의 계통으로 분화될 수 있는 잠재성을 가진다.
세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 어떠한 유전자 및 관련 패밀리 멤버도 본 발명의 방법에 의해 유도될 수 있으며, 이러한 유전자로는 N-메틸트랜스퍼라제(Gnmt), Octamer-4(Oct4), Nanog, GABRB3, LEFTB, NR6A1, PODXL, PTEN, SRY(성별 결정 영역 Y)-박스 2(Sox2라고도 알려져 있음), Myc, REX-1(Zfp-42라고도 알려져 있음), 인테그린 α-6, Rox-1, LIF-R, TDGF1(CRIPTO), SALL4(sal계 4), 백혈구 세포로부터 유도되는 케모탁신 1(LECT1), BUB1, FOXD3, NR%A2, TERT, LIFR, SFRP2, TFCP2L1, LIN28, XIST, 및 Klf4와 Klf5 같은 Kruppel계 인자(Klf) 등을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 다양한 수의 유전자는 본 발명의 방법에 의해 유도될 수 있으며, 이에는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 및 50 초과의 유전자가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
또한, 문헌[Ramalho-Santos et al.(Science 298, 597 (2002)), Ivanova et al.(Science 298, 601 (2002))] 및 [Fortunel et al.(Science 302, 393b(2003))]의 3가지 타입의 줄기 세포가 각각 비교되고, 줄기 세포의 기능적 특성을 부여하는데 중요한 것으로 간주되는 통상적으로 "줄기세포성" 유전자라고 표현되는 유전자의 목록이 확인되었다. 상기 언급된 연구에서 확인된 어떠한 유전자도 본 발명의 방법에 의해 유도될 수 있다. 하기의 표 4는 줄기 세포의 기능적 특성을 부여하는데 관여하는 것으로 생각되는 유전자의 목록을 제공한다. 표 4에 기재된 유전자 이외에도, 알려진 유전자와 상동관계가 거의 또는 전혀 없는 93개의 발현 서열 태그(EST) 클러스터도 Ramalho-Santos 등, 그리고 Ivanova 등에 의해 확인되었으며, 이들 또한 본 발명의 방법에 포함된다. 표 4는 줄기 세포 특징을 부여하는데 관여하는 유전자의 목록이다.
기호 유전자 기능
F2r 트롬빈 수용체 G단백질 결합수용체, 응고과정,
맥관 발생에 필요
Ghr 성장호르몬 수용체 성장호르몬 수용체/결합 단백질, Jak2활성화
Itga6 인테그린 알파 6 세포부착, 세포표면 매개신호전달,
인테그린 b1과 결합가능
Itgb1 인테그린 베타 1
(파이브로넥틴 수용체)		 세포부착, 세포표면 매개신호전달,
인테그린 a6과 결합가능
Adam 9 디스인테그린 및
메탈로프로테이나제 도메인 9(멜트린 감마)		 세포부착, 세포밖 단백질분해,
점재적 융합 단백질
Bys 비스틴계(비스틴) 세포부착, 배아착상(태반)에 중요
Ryk 수용체계 티로신키나제 비전통적 수용체 티로신 키나제
Pkd2 다낭성 신종 2 칼슘채널
Kcnab3 전압차 개방 칼륨 통로,
세이커 관련 서브 패밀리, 베타 멤버3		 칼륨 채널의 조절 서브유니트
Gnb1 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질 베타1 G-단백질 결합 수용체 신호전달
Gab1 성장인자 수용체 결합 단백질2(Grb2)-관련 단백질 1 다수의 신호전달 경로의 통합
Kras2 키르스텐 쥐 육종 암유전자 2 GTP와 결합하여 성장인자 수용체로부터 신호전달
Ras p21단백질 활성제(Gap)와 매우 유사한 EST RAS기능 억제제
Cttn 코르악틴 액틴 세포골격 조절, 종양 내에서 과발현
Cops4 COP9(구조적 광형태 형성)
서브유니트 4		 Cop9신호전달 복합체, 다수의 신호전달 경로의 통합, 단백질 분해조절
Cops7a COP9(구조적 광형태 형성)
서브유니트 7a		 Cop9신호전달 복합체, 다수의 신호전달 경로의 통합, 단백질 분해조절
Madh1 Mad 동족체 1(Smad1) TGFb 경로신호 변환기
Madh2 Mad 동족체 2(Smad2) TGFb 경로신호 변환기
Tbrg1 TGFb 조절 1 TGFb에 의해 유도
Stam 신호변환 아덥터 분자(SH3 도메인 및 ITAM 모티브) 1 Jak티로신 키나제와 관련
Statip1 STAT 상호작용 단백질 1 Jak/Stat3결합을 위한 스캐폴드
Cish2 시토킨 유도성 SH2 함유 단백질(Ssi2) STAT 유도 STAT억제제-2,
Igf1R과 상호작용
Jak3와 적당히(moderately) 유사한 ESTs 잠재적 키로신 키나제
PPP2R1B와 매우 유사한 ESTs 단백질 포스파타제 2의 조절서브 유니트, 추정 종양 억제제
Rock2 Rho-관련 감긴 코일 형성 키나제 2 세린/트레오닌 키나제, Rho의 표적
Yes 야마구찌 육종 바이러스 암유전자 동족체 세포내 티로신 키나제, 전암유전자,
Src 패밀리
Yap Yes-관련 단백질1 Yes와 결합, 전사 공활성제
Ptpn2 단백질 티로신 비-수용체 포스파타제 2 데포스포릴레이트 단백질
Ppplr2 단백질 포스파타제 1,
조절(억제제) 2		 단백질 포스파타제 1의 조절 서브유니트
Ywhab 티로신/트립토판 모노옥시게나제 활성화 단백질 베타(14-3-3베타) 포스포세린-단백질과 결합, PKC 경로
Ywhah 티로신/트립토판 모노옥시게나제 활성화 단백질 에타(14-3-3에타) 포스포세린-단백질과 결합, PKC 경로
Axo 액스트로핀 PHD도메인 함유, 아데닐레이 시클라제 도메인 및 G-단백질 상호작용에 대한 일치 영역을 포함,
뉴런 유지에 필요
Trip6 갑상선 호르몬 수용체 상호작용제 6 TH 존재하에 THR과 상호작용,
Rel 전사인자에 대한 추정 공활성화제
Gfer 성장인자, erv1(맥주효모)계 (간재생 증진제) 설피드릴 옥시다제, 간재생 촉진,
EGFR 및 MAPK 경로 자극
Upp 우리딘 포스포릴라제 우리딘과 우라실 상호전환,
형질전환 세포 내에서 고도로 발현,
2-데옥시-D-리보즈 생성, 강력한 혈관 형성인자
Mdfi MyoD 패밀리 억제제 bHLH 및 베타-카테닌/TCF 전사인자의 억제제
Tead2 TEA 도메인 2 전사인자
Yap Yes-관련 65kD Yes와 결합, 전사 공활성제
Fhl1 4와 1/2 LIM RBP-J/Su(H)와 상호작용
Zfx 아연핑거X-결합 아연핑거, 추정 전사인자
Zfp54 아연핑거 54 아연핑거, 추정 전사인자
아연핑거 단백질 아연핑거, 추정 전사인자
D17Ertd197e D17Ertd197e 아연핑거, 추정 전사인자
Zfp와 매우 유사한 ESTs 아연핑거, 추정 전사인자
Zfp와 매우유사한 ESTs 아연핑거, 추정 전사인자
Zfp와 매우유사한 ESTs 아연핑거, 추정 전사인자
Rnf4 RING 핑거 4 스테로이드-매개 전사
Chd1 크로모도메인 헬리카제 DNA결합 단백질 1 염색질 구조의 변경,
SNF2/SW 12 패밀리
Etl1 증감제 트랩 유전자 부위 염색질 구조의 변경,
SNF2/SW 12 패밀리
Rmp Rpb5-매개 단백질 RNA와 결합, Pol II, 전사 억제
Ercc5 절제 수선 5 엔도뉴클레아제 UV-유도 손상의 억제
Xrcc5 X선 수선 5 (Ku80) 헬리카제, V(D)J 재조합에 관여
Msh2 MutS 동족체 2 미스매치 수선, 대장암에서 돌연변이
Rad23b Rad23b 동족체 절제수선
Ccnd1 시클린 D1 G1/S전이, CDk2 및 4 조절, 유방암에서 과다발현, 다른 암에 관련됨
Cdkn1a Cdk 억제제 1a P21 G1/S전이 억제, Cdk2 억제제,
HSC 유지에 필요
Cdkap1 Cdk2관련 단백질 DNA프리마제,
DNA복제의 잠재적 조절제(S상)
Cpr2 세포주기 이행 2 맥주 효모 내에서 G1중지 극복
Gas2 성장중지 특이적 2 성장중지 세포에서 고도발현,
액틴 세포 골격의 일부
CenpC 동원체 단백질 C 활성 동원체 내에 존재
Wig1 야생형 p53 유도1 P53표적, 종양세포 성장억제
Tmk 티미딜레이트 키나제 dTTP합성경로, S상 진행에 필수적
Umps 우리딘 모노포스페이트
합성효소		 피리미딘 생합성
Sfrs3 스프라이싱 인자 RS 리치 3 조직-특이적 차별 스프라이싱에 연관,
세포주기 조절
엑스포틴 1과 매우 유사한 ESTs 세포주기 조절 핵방출 단백질
CAD와 매우 유사한 ESTs 피리미딘 생합성의 3기능성 단백질, MAPK에 의한 활성화(포스포릴화)
Mapkkkk3와 유사한 ESTs Map키나제 캐스케이드
Gas2 성장중지 특이적 2 성장중지 세포 내에서 고도발현,
액틴 세포골격의 일부,
카스파제-3의 표적, p53을 안정화
Wig1 야생형 p53 유도 1 p53표적, 종양세포 성장 억제
Pdcd2 프로그래밍된 세포사멸 2 알려지지 않음
Sfr3 스플라이싱 인자 RS 리치3 조직-특이적 차별 스플라이싱 세포주기 조절
Sfrs6과 매우 유사한 EST 추정 스플라이싱 인자
전-mRNA 스플라이싱 인자 Prp6과 매우 유사한 EST 추정 스플라이싱 인자
Snrp1c 소핵 리보뉴클레오프로테인 폴리펩티드 C U1 snRNPs, 스플라이세오솜의 구성성분
Phax RNA방출에 사용되는 포스포릴화 아댑터 U snRNA 핵방출 매개
NOL5 핵인 단백질 5(SIK와 유사) 전-rRNA 프로세싱
Nop56과 매우 유사한 EST 전-rRNA 프로세싱
Rnac RNA 시클라제 알려지지 않음
Ddx1과 매우 유사한 EST DEAD-박스 단백질, 추정 RNA 헬리카제
Eif4ebp1 단백질 1과 결합하는 진핵생물 번역개시 인자 4E 전사억제제, 수개의 신호 전달경로에 의해 조절(포스포릴화)
Eif4g2 진핵생물 번역개시 인자 4, 감마2 전사 억제제, 장배형성 및 ESC분화에 필요
Eif3s1과 매우 유사한 EST 번역억제인자
Mrps31 미토콘드리아 리보솜 단백질 S31 리보솜의 구성성분, 미토콘드리아
Mrpl17 미토콘드리아 리보솜 단백질 L17 리보솜의 구성성분, 미토콘드리아
Mrpl34 미토콘드리아 리보솜 단백질 L34 리보솜의 구성성분, 미토콘드리아
Hspa11 열충격 70kD 단백질계 1 (Hsc70t) 샤페론, 고환-특이적
Hspa4 열충격 70kD 단백질 4
(Hsp110)		 샤페론
Dnajb6 DnaJ(Hsp40) 동족체, 서브패밀리 B, 멤버6(Dnaj의 포유동물족) 공-샤페론
Hrsp12 열반응성 잠재적 샤페론
Tcp1-rs1 서열 1에 관련한 T-복합 단백질 1 잠재적 샤페론
Ppic 펩티딜프롤릴 이소머라제 C(시클로필린 C) 펩티딜-프롤릴 결합의 이성체화
Fkbp9 FK506-결합단백질 9(63kD) 잠재적 펩티딜-프롤릴 이소머라제
Fkbp13과 적당히 유사한 ESTs 잠재적 펩티딜-프롤릴 이소머라제
Ube2d2 유비퀴틴-공액화 효소 E2D2 E2, 단백질의 유비퀴틴화
Arih1 아리아드네 동족체 E3 가능성, 유비퀴틴 리가제
Fbxo8 F-박스 온리 8 추정SCF 유비퀴틴 리가제 서브유니트
Ubc13과 적당히 유사한 ESTs(bendless) 잠재적 E2, 단백질의 유비퀴틴화
Usp9x 유비퀴틴 프로테아제 9,
X 염색체		 단백질로부터 유비퀴틴 제거
Uchrp 유비퀴틴 c-말단 하이드로라제 관련 폴리펩티드 단백질로부터 유비퀴틴 제거가능성
Axo 악소트로핀 E3와 유사한 RING-CH도메인 함유,
유비퀴틴 리가제
Tpp2 트리펩티딜 펩티다제 II 세린 엑스포펩티다제,
프로테아솜과 관련
Cops4 COP9(구조적 광형태 형성)
서브유니트 4		 Cop9시그널로솜, 다수의 신호전달경로의 통합, 단백질 분해 조절
Cops7a COP9(구조적 광형태 형성)
서브유니트 7a		 Cop9시그널로솜, 다수의 신호전달경로의 통합, 단백질 분해 조절
프로테아솜 26S 서브유니트와 매우 유사한 ESTs, 비-ATP아제, 12(p55) 프로테아솜의 조절 서브유니트
Nyren18 NY-PEN 18항원(NUB1) 인터페론-9 유도, Nedd8의 하향조절, 유비퀴논계 단백질
Rab18 Rab18, 멤버 RAS 암유전자 패밀리 small GTPase, 소낭수송 조절
Rabggtb RAB 게란일게라닐 트랜스퍼라제 b 서브유니트 Rob 단백질의 막결합 조절
Stxbp3 신탁신 결합 단백질 3 소낭/막 융합
Sec23a Sec23a(S. cerevisiae) ER에서 골지로 수송
코아토머 델타와 적당히 유사한 ESTs ER에서 골지로 수송
Abcb1 다제-내성 물질 1(Mdr1) 독성 화학물질 축출
Gsta4 글루타티온 S-트랜스퍼라제 4 산화적 스트레스에 반응
Gslm 글루타메이트-시스테인 리가제 조절제 서브유니트 글루타티ㄹ온 생합성
Txnrd1 티오레독신 리덕타제 티오레독신에 대한 환원성 등가물 전달
Txn1 티오레독신계 32kD 산화환원 밸런스,
단백질의 디설파이드 브릿지 감소
Laptm4a 리소좀-관련 단백질
트랜스막 4A(MTP)		 소분자를 리소좀으로 임포트
Rcn 레티큘로칼빈 ER단백질 Ca+2결합,
종양세포계에서 과발현
Supl15h Lec15 동족체의 억제제 돌리콜 포스페이트-만노즈의 ER합성,
GPI 앵커의 전구물질, N-글리코실화
Pla2g6 포스포리파제 A2,
그룹 VI		 인지질의 가수분해
Acadm 아세틸-조효소 A
데히드로게나제, 중쇄(medium chain)		 지방산 베타-산화
Suclg2 숙시네이트-조효소 A 리가제, GDP-형성, 베타 서브유니트 조절 서브유니트, Krebs 회로
Pex7 페록시솜 생물발생 인자 7 페록시솜 단백질 임포트 수용체
Gcat 글리신 C-
아세틸트랜스퍼라제(KBL)		 트레오닌을 글리신으로 전환
Tjp1 폐쇄이음부 단백질 1 폐쇄이음부의 구성성분, 폐쇄이음부 결핍 세포 내에서 카드헤린과 상호작용
또한 본 발명의 실시예는 본 명세서에 기술한 신규한 방법에 따라 제조된 재프로그래밍된 세포를 이용하여 다양한 질병을 치료하는 방법을 포함한다. 당해 분야의 숙련자는 본 명세서에서 제공하는 기술을 기초로 하여, 광범위한 다혈증 질병을 치료하는데 있어서 재생 의학의 가치 및 가능성을 인정할 것이다. 이러한 질병에는 심장병, 당뇨병, 피부병 및 피부이식, 척추 손상, 파킨슨병, 다발성 경화증, 알츠하이머병 등이 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명은 손상되지 않은 새로운 세포의 도입이 치료적 해소의 형태를 제공하는 병을 치료하기 위하여, 인간을 포함한 동물에 재프로그래밍된 세포를 투여하는 방법을 포함한다.
이 분야의 통상의 기술자는 재프로그래밍된 세포가 재분화된 세포, 예를 들어 뉴런으로서 동물에 투여될 수 있으며, 동물에 있어서 병들거나 손상된 뉴런을 대체하는데 유용할 것이라는 점을 쉽게 이해할 것이다. 또한, 재프로그래밍된 세포는 동물에 투여되어, 주위 환경으로부터 신호 및 큐를 받으면 주변 세포 환경에 의해 지시되는 원하는 세포 타입으로 재분화될 수 있다. 이와 다르게, 세포를 시험관 내에서 재분화시킨 다음, 이 재분화된 세포를 필요로 하는 포유동물에 투여할 수 있다.
재프로그래밍된 세포는 생체내 환경에서 오랜 기간 생존할 수 있도록 하기 위해 외과이식용으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 세포가 성장 및 보존되고 증식하여 포화상태(confluence)가 되도록 하기 위해서, 전구 배지(progenitor medium)와 같은 적합한 배양 배지 내에서 세포를 번식시킬 수 있다. 이 세포를 예를 들어, 트립신을 불활성화시키기 위한 5% 혈청 플러스 1 mg/ml의 포도당, 0.1mg/ml의 MgCl2, 0.1mg/ml의 CaCl2로 보강시킨(완전 PBS) 0.05% 트립신을 함유하는 포스페이트 완충염(PBS)과 같은 완충 용액을 사용하여 배양 기질로부터 느슨해지게 한다. 이 세포를 원심분리를 이용하여 PBS로 세척한 다음, 트립신을 함유하지 않는 완전 PBS 내에서 주입을 위해 선택된 밀도로 재현탁시킬 수 있다.
복막 투여에 적합한 약제 조성물은 활성 성분과 함께 멸균수 또는 멸균 등장수를 함유한다. 이러한 조성물은 일괄 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 주사투여용 조성물은 보존제를 함유하는 수회 사용량의 용기 또는 앰플과 같은 단위 사용 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 복막 투여용 조성물은 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 부형제 중의 유화액, 페이스트, 및 매몰식 지속-방출 또는 생분해성 조성물을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 조성물은 또한 1종 이상의 추가 성분을 추가로 함유하며, 이러한 성분에는 현탁제, 안정화제, 또는 분산제가 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 CNS, PNS, 피부, 간, 신장, 심장, 췌장 등을 포함한 신체의 질병 또는 외상을 치료하기 위해서 다른 치료적 절차와 함께 재프로그래밍된 세포를 외과이식하는 단계를 포함한다. 따라서, 본 발명의 재프로그래밍된 세포는 다른 세포와 함께 동시-외과이식될 수 있으며, 이 두 세포는 모두 환자에 유익한 영향을 주는 유전적으로 변형된 또는 비유전적으로 변형된 세포로서, 예를 들어 부신의 크롬친화성 세포, 태아 뇌조직 세포 및 태반 세포 등이 있다. 따라서 본 발명의 방법은 본 명세서에 제공되는 기술 내용을 인지한 당해 분야 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이 다른 치료적 절차와 함께 병행될 수 있다.
본 발명의 재프로그래밍된 세포는 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 소개되는 미국 특허 제 5,082,670 호 및 제 5,618,531 호에 기재된 바와 같이 당해 분야에 공지된 기술을 이용하여 "나체 상태"에서 환자에게 또는 신체의 다른 적합한 부위에 이식될 수 있다.
재프로그래밍된 세포는 단일 세포들로 구성되는 혼합물/용액 또는 세포 응집체의 현탁액을 함유하는 용액으로서 이식될 수 있다. 이러한 응집체는 약 10 ~ 500마이크로미터, 보다 바람직하게는 약 40 ~ 50 마이크로미터의 직경을 가질 수 있다. 재프로그래밍된 세포 응집체는 구체 당 약 5 ~ 100, 보다 바람직하게는 약 5 ~ 20의 세포를 포함할 수 있다. 이식 세포의 밀도는 마이크로리터 당 약 10,000 ~ 1,000,000의 세포, 보다 바람직하게는 약 25,000 ~ 500,000의 세포의 범위를 가질수 있다.
본 발명의 재프로그래밍된 세포의 이식은 당해 분야에 잘 알려져 있는 기술, 더욱이 미래에 발전될 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 본 발명은 재프로그래밍된 세포를 동물, 바람직하게는 인간에 이식, 외과이식, 주입 또는 도입하는 방법을 포함한다.
또한 재프로그래밍된 세포는 미세캡슐화(예를 들어, 본 명세서에서 참고문헌으로 소개되는 미국 특허 제 4,352,883 호; 및 제 5,084,350 호 참조) 또는 거대캡슐화(예를 들어, 본 명세서에서 참고문헌으로 소개되는 미국 특허 제 5,284,761 호; 제 5,158,881 호; 제 4,976,859 호 및 제 4,968,733 호; 및 국제 공보 WO 92/19195; WO 95/05452 참조)를 포함하여 공지된 캡슐화 기술에 따라 캡슐화되어 생물학적 활성 분자를 전달하는데 사용될 수 있다. 거대캡슐화의 경우, 기구 내의 세포 수는 다를 수 있는데, 각 기구는 바람직하게는 103 ~ 109 세포를 포함하며, 보다 바람직하게는 약 105 ~ 107 세포를 포함한다. 몇몇 거대캡슐화 기구는 환자에 이식될 수 있다. 세포의 거대캡슐화 및 이식 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 제 6,498,018 호에 기술되어 있다.
또한 본 발명의 재프로그래밍된 세포는 치료 목적을 위해 또는 환자의 조직속에서 통합 및 분화를 추적하기 위해 외부 단백질 또는 분자를 발현하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 예를 들어 Sambrook et al.(1989, Molecular Coloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 및 Ausubel et al.(1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & sons, New York)에 기술한 바와 같이, 재프로그래밍된 세포 내로 외인성 DNA를 도입하는 방법 및 발현 벡터와 함께 재프로그래밍된 세포 내에서 외인성 DNA의 발현을 포함한다.
본 발명의 실시예는 또한 세포를 소분자 라이브러리와 접촉시키는 단계, 게놈으로의 변화를 측정하는 단계, 및 게놈의 조절제를 확인하는 단계를 포함하는 에피게놈(epigenome) 조절제의 확인 방법에 관한 것이다. 다른 한 실시예에서, 본 방법은 다능 또는 만능 유전자의 염색질 구조를 변화시키는 단계를 포함한다. 본 방법은 소분자 조절제를 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 한 실시예에서, 게놈으로의 변화 측정에는 아세틸화, 탈아세틸화, 메틸화, 탈메틸화, 포스포릴화, 유비퀴틴화(ubiquitination), 수모화(sumoylation), ADP-리보실화, 및 탈이민화 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
또한 본 발명의 실시예는 본 발명의 방법에 의해 제조되는 세포를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 다른 한 실시예에서, 본 발명은 소분자 조절제를 사용하여 전사 억제에 관여하는 하나 이상의 단백질의 활성을 저해함으로써 재프로그래밍되는 세포를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도함으로써 재프로그래밍되는 세포를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명의 실시예는 세포를 하나 이상의 소분자 조절제와 접촉시킴으로써 제조되는 재프로그래밍된 세포에 관한 것이다. 다른 한 실시예에서, 본 발명은 RG108, 5-아자-2-데옥시시티딘 및 에피갈로카테킨-3-갈레이트(이에 국한되는 것은 아님)를 포함하는 하나 이상의 DNMT를 억제하는 소분자 억제제와 세포를 접촉시킴으로써 제조되는 재프로그래밍된 세포에 관한 것이다.
또한 본 발명의 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 제조하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 재프로그래밍된 세포를 제조하고 ES계 세포 및 줄기세포계 세포를 생성하는데, 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 유전자의 발현을 유도하는데, 및 전사 억제에 관여하는 하나 이상의 단백질의 활성을 저해하는데 사용될 수 있다. 키트는 하나 이상의 소분자 억제제를 함유할 수 있다. 키트는 다수의 소분자 억제제를 함유할 수 있다. 소분자 억제제는 단일 용기 또는 다수 용기 내에 제공될 수 있다.
키트는 또한 세포가 재프로그래밍 되었는지를 결정하는데 필요한 시약을 함유할 수 있으며, 이러한 시약에는 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 유전자가 유도되었는지를 테스트하기 위한 시약, DNMT를 저해하는지를 테스트하기 위한 시약, CpG 디뉴클레오티드의 탈메틸화를 테스트하기 위한 시약 및 염색질 구조의 리모델링을 테스트하기 위한 시약이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
키트는 또한 재프로그래밍된 세포를 특정 계통 또는 다중 계통으로 분화시키기 위해 사용될 수 있는 작용제를 함유할 수 있으며, 이러한 계통으로는 뉴런, 골아세포, 근육세포, 상피세포 및 간세포 등이 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
키트는 또한 그 속에 제공되는 구성성분의 용도를 설명해 놓은 이해지도 자료를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 "이해지도 자료"는 키트 속에 포함되는 본 발명의 방법의 유용성을 전달함으로써 분화된 세포의 재프로그래밍에 영향을 줄 수 있는데 활용될 수 있는 공보, 기록, 도표 또는 다른 표현 매체를 포함하는 의미로 사용된다. 이해지도 자료는 임의로 또는 번갈아서, 본 발명의 세포를 재분화 및/또는 교차분화(transdifferentiating)시키는 방법을 하나 이상 기술할 수 있다. 본 발명의 키트의 이해지도 자료는 예를 들어, 본 발명의 소분자 억제제를 포함하는 용기에 첨부될 수 있다. 아니면, 이 이해지도 자료는 수령인이 이해지도 자료와 소분자 억제제 또는 그 구성성분을 조합해서 사용하도록 하는 의도에서 용기와는 별도로 배달될 수 있다.
이제 본 발명은 다음의 실시예를 통해 설명될 것이다. 본 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명은 실시예로 인해 제한을 받지 않으며, 본 명세서에 제공되는 기술내용의 결과로서 이루어지는 것이 명백한 모든 변경을 포함한다. 미국 특허, 출원이 인정된 미국 특허 출원서 또는 공개된 미국특허 출원서를 포함한 모든 참고문헌은 그 전체 내용이 참고사항으로서 본 명세서에 기재된다.
실시예
본 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 하기의 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예 1
인간의 체세포 내에서 다능 유전자를 유도 또는 상향조절할 수 있는 소분자 조절제의 능력을 테스트하였다. 이 실시예에서, 소분자 조절제는 하나 이상의 DNMT의 활성을 억제하는 소분자 억제제인 RG108이었다. 그러나, 당해 분야의 숙련자는 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도할 수 있는 어떠한 소분자 조절제도 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
방법
세포 배양: Cell Applications(San Diego, CA)로부터 일차 인간 폐 섬유아세포를 구매하고, 이것을 10% 소태아 혈청(FBS, Hyclone) 및 0.5% 페니실린과 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium, Hyclone) 내에서 습도 95%, 5% CO2 하에 37℃에서 유지하였다. 500μM RG108의 존재하에, 혹은 비처리 상태로 5일 동안 세포를 성장시켰다.
정량적인 RT - PCR : 각 배양조건 하에서(500μM RG108 또는 비처리), 실시간 RT-PCR에 의해 Oct-4 및 Nanog의 발현을 측정하였다. 간단히 기술하면, 제조사의 프로토콜에 따라 DNase I 분해로 Trizol Reagent(Life Technology) 및 RNeasy Mini kit(Qiagen; Valencia, CA)를 사용하여 배양액으로부터 총 RNA를 제조하였다. 각 샘플로부터의 총 RNA(1 ㎍)은 올리고(dT)-프라이밍 역전사(Invitrogen; Carlsburg, MD)를 이행하였다. 7300 실시간 PCR 시스템((Applied Biosystems; Foster City, CA) 상에서 PCR 마스터 믹스를 이용하여 실시간 PCR 반응을 수행한다. 각 샘플에 있어서, PCR 반응의 템플릿(template)으로서 1㎕의 희석된 cDNA(1:10)를 가한다. Oct-4 및 Nanog의 발현 정도는 글리세랄데히드 3-포스페이트-데하이드로게나제(GAPD)에 대해 표준화되었다.
결과
도 1에 도시한 바와 같이, 5일 동안 500μM RG108로 일차 인간 폐 섬유아세포를 처리함으로써 Nanog 유전자의 발현이 현저히(p<0.03) 상향 조절되었다. 또한 Oct-4 유전자 발현의 증가 추세(p<0.07)도 관찰되었다. 또한, DNMT 억제제인 에피갈로카테킨-3-갈레이트의 존재하에 세포를 배양함으로써 다능 유전자 Oct-4 및 Nanog의 상향 조절도 관찰되었다(p<0.08; 도시되지 않음).
이러한 결과는 소분자 억제제가 에피게놈, 예를 들어 DNA 메틸화를 조절하는데 사용될 수 있다는 것을 시사한다. 소분자 억제제는 전사 억제에 관여하는 단백질의 활성을 저해하는데 사용될 수 있다. 또한, 소분자 억제제는 다능 유전자의 발현을 유도하고 분화능을 체세포에 복원시킬 수 있다.
실시예 2
여러 세포 타입에서 다능 유전자를 유도 또는 상향 조절하는데 다양한 소분자 조절제를 사용하였다. 이 실험에서, 조사된 일차 유전자는 Oct-4이었다. 그러나 당해 분야 숙련자는 소분자 조절제를 사용하여 재프로그래밍에 관여하는 어떠한 유전자의 발현도 유도 또는 상향 조절할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
방법 :
세포 배양: 성인 및 신생아 인간 진피 섬유아세포를 Cell Applications(San Diego, CA)로부터 구매하였다. 인간 폐 섬유아세포, HSM 세포 및 BJ 섬유아세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)으로부터 구매하였다.
세포를 10% 소태아 혈청(FBS, Hyclone) 및 0.5% 페니실린과 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 배지 또는 섬유아세포 성장 배지(Cell Applications, San Diego, CA) 내에서 습도 95%, 5% CO2 하에 37℃에서 유지하였다. 소분자 조절제의 존재 또는 부재하에 세포를 성장시켰다. 소분자 조절제의 존재하의 배양 시간은 각 소분자 조절제에 따라 변화되었다(표 5 참조).
정량적인 RT - PCR : 각 배양 조건하에서 실시간 RT-PCR에 의해 관심 대상의 유전자인 Oct-4 , Nanog 또는 Sox-2의 발현을 측정하였다. 간단히 기술하면, 제조사의 프로토콜에 따라 DNase I 분해에 의해 Trizol Reagent(Life Technologies, Gaithersburg, MD) 및 RNeasy Mini kit(Qiagen; Valencia, CA)를 사용하여 배양액으로부터 총 RNA를 제조하였다. 각 샘플로부터의 총 RNA(1 ㎍)는 올리고(dT)-프라이밍 역전사(Invitrogen; Carlsburg, MD)를 이행하였다. 7300 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems; Foster City, CA) 상에서 PCR 마스터 믹스를 이용하여 실시간 PCR 반응을 수행한다. 각 샘플에 있어서, PCR 반응에서 템플릿으로서 1㎕의 희석된 cDNA(1:10)를 가한다. 관심 대상의 유전자의 발현 정도는 글리세랄데히드 3-포스페이트-데하이드로게나제(GAPD)에 대해 표준화되었다.
결과
표 5는 Oct-4의 발현을 유도 또는 상향조절하는 것으로 확인된 소분자 조절제의 목록이다. 소분자 억제제인 VPA 및 RG108도 또한 Nanog를 유도하는 것으로 나타났다(도 1 및 표 5). 표 5에 제시된 데이터는 Oct-4와 같은 다능 유전자의 발현을 유도 또는 상향조절하기 위해 다수의 소분자 조절제가 다양한 농도로 사용될 수 있다는 것을 시사한다. 표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 소분자 조절제는 다양한 농도 및 다양한 배양시간으로, 성인 인간 진피 섬유아세포, 신생아 인간 진피 섬유아세포 , 인간 폐 섬유아세포 및 BJ 섬유아세포(인간 포피)에서 Oct-4의 발현을 유도할 수 있다. 표 5는 다능 유전자의 발현을 증가시키는 소분자 조절제의 목록을 제공한다.
소분자 조절제 표적 투여량 시간
(일) 		세포
타입 		Oct4
FC 		p＜ Nanog
FC 		p＜
VPA 클래스 I HDACi 5mM 5 HDFa 2.5 0.01
VPA 클래스 I HDACi 5mM 3 HLFa 2.7 0.01
VPA 클래스 I HDACi 1mM 3 HDFn ~4 ~2
VPA 클래스 I HDACi 1mM 3 HSMa ＜2
EGCG DNMTi 5ug/ml 5 HLFa 0.08
RG108 DNMTi 500uM 5 HLFa ＜2 0.07 2 0.03
RG108 DNMTi 0.25, 0.5, 1mM 3 HDFn 2~2.5
RG108 DNMTi 500uM 3 HDFa ＜2
하이드라진 HCL DNMTi 500uM 2 HDFa ＜2 0.05
하이드라진 HCL DNMTi 50uM 4 HDFa ＜2 0.07
ALA HDACi 50uM 4 HDFa ~3.5 0.0001
비오틴 HDACi 500uM 4 HDFa ＜2 0.07
니코틴아미드 SIRTi 500uM 4 HDFa ＜2 0.02
니코틴아미드 SIRTi .28mM 4 HDFa ＜3 0.03
니코틴아미드 SIRTi .028mM 4 HDFa 2.3 0.01
프로카인HCL DNMTi 50uM 2 HDFa ＜2 0.09
프로카인HCL DNMTi 500uM 8 BJF 1.6 0.02
프로카인HCL DNMTi 1mM 8 BJF 1.8 0.05
페닐부틸산
나트륨		 HDACi 2.5mM 4 HDFa 2.5 0.06
트라닐시프로민 LdeMi 2.5mM 4 HDFa 2.7
SIRT1
활성제3		 SIRT1a 500uM 4 HDFa 2 0.01
CAY 10433 HDACi 50uM 4 HDFa ~.3 0.05
데푸데신 HDACi 50uM 4 HDFa 1.6 0.01
EX-527 SIRTi 50uM 4 HDFa 2.1 0.01
스플리토마이신 HDACi .5mM 4 HDFa 2 0.02
ITSA TSAi .05mM 4 HDFa 1.3 0.03
발프록삼 HDACi .05mM 4 HDFa 1.2 0.03
발프록삼 HDACi .5mM 4 HDFa 1.5 0.02
레스베라트롤 SIRT1a .05mM 4 BJF 1.3 0.08
레스베라트롤 SIRT1a .5mM 4 BJF 1.8 0.01
2-PCPA HDMi/LSD1i 100uM 8 BJF 1.4 0.06
2-PCPA HDMi/LSD1i 500uM 8 BJF 1.8 0.07
2-PCPA HDMi/LSD1i 1mM 8 BJF 1.7 0.001
트라닐시프로민 HDMi/LSD1 2.5mM 4 HDFa ＜3
EGCG DNMT1 1uM 4 BJF ＜2 0.09
Ro-31-8220 SIRTi 2.5mM 4 BJF
발프로산(Valproic acid; VPA)(5mM)은 성인 인간 진피 섬유아세포, 신생아 인간 진피 섬유아세포, 인간 폐 섬유아세포, 태아 인간 진피 섬유아세포, 및 BJ 섬유아세포(인간 포피)에서 Oct-4, Nanog 및 Sox-2의 발현을 유도하였다. 세포를 4 ~ 6일 동안 VPA로 처리하였다. 발현 정도는 각각의 유전자에 대해 각각의 세포 타입에서 다르게 나타났다. 그러나, 데이터는 소분자 억제제(VPA)의 존재하에 다능 유전자의 상향 조절이 이루어진다는 것을 명백히 보여준다. mRNA의 양을 표준화하기 위해서, 항존 유전자(house keeping genes)인 GAPDH를 사용하였다.
도 3에 도시한 바와 같이, VPA는 또한 성인 및 태아 인간 진피 섬유아세포 에서 HDAC11의 발현을 증가시켰다. HDAC9의 경우, VPA 처리된 세포와 비처리 세포 사이에 통계적인 차이가 없었다. 측정 가능한 영향이 없는 결과는 과학적 장비에 의해 부여되는 실험적 한계 때문이다.
표 6은 VPA의 존재하에 다능 유전자인 Oct-4, Nanog, Sox-2 및 HDAC의 통계분석을 제공한다. 4가지 세포 타입, 즉 성인 인간 진피 섬유아세포 , 태아 인간 진피 섬유아세포, 신생아 인간 진피 섬유아세포 및 BJ 섬유아세포에 대한 정보가 제공되어 있다. 각각의 세포타입에서, Oct-4, Nanog, Sox-2 및 HDAC의 발현 변화는 통계적 유의성을 가졌다. 재프로그래밍에 관여하는 다수의 유전자의 발현은 히스톤 데아세틸라제를 억제하는 기능을 하는 소분자의 존재하에 증가하였다.
세포타입 Oct4
(배수
증가) 		P Nanog
(배수
증가) 		P Sox
(배수
증가) 		P HDAC11
(배수
증가) 		P
HDFa 3.40 ＜0.01 3.82 ＜0.01 3.60 ＜0.01 2.96 ＜0.01
HDFf 5.27 ＜0.01 8.09 ＜0.02 1.11 ＜0.03 4.07 ＜0.001
HDFn 3.66 ＜0.03 2.01 ＜0.03 4.45 ＜0.05
BJF 7.19 ＜0.01 6.64 ＜0.01 8.77 ＜0.02
도 4에 도시한 바와 같이, Oct-4 발현은 성인 인간 진피 섬유아세포를 4일 동안 니코틴아미드로 처리하였을 때 증가하였다. 테스트된 3가지 농도, 즉 0.028mM, 0.28mM 및 1.4mM의 농도 모두에서, 대조용 배지(MC)와 비교했을 때 Oct-4 발현이 증가하였다. 이 데이터는 소분자(이 경우에는 니코틴아미드)가 분화된 세포를 재프로그래밍하고 분화능을 세포에 복원시키는데 관여하는 유전자인 Oct-4의 발현을 증가시킨다는 것을 시사한다.
도 5에 도시한 바와 같이, Oct-4 발현은 성인 인간 진피 섬유아세포를 페닐부틸산 나트륨으로 처리하였을 때 증가하였다. 이 세포를 4일 동안 페닐부틸산 나트륨(2.5mM)의 존재하에 테스트하였다. 대조용 배지(MC)와 비교했을 때, 처리된 세포는 Oct-4 발현의 증가를 보여주었다. 이 데이터는 히스톤 데아세틸라제를 억제하는 기능을 하는 고분자 억제제가 다능 또는 만능 유전자의 발현을 증가시키고 세포를 재프로그래밍하는데 사용될 수 있다는 것을 시사한다.
도 6에 도시한 바와 같이, 다능 유전자인 Oct-4 발현은 성인 인간 진피 섬유아세포를 4일 동안 밸프록삼으로 처리하였을 때 증가하였다. 2가지 농도, 즉 0.05mM 및 0.5mM의 밸프록삼 농도에서, 대조용 배지(MC)와 비교했을 때 Oct-4 발현이 증가하였다. 2.5mM의 밸프록삼 농도에서, Oct-4 발현은 기준선(대조용 배지의 수준과 유사)으로 떨어지는 것으로 나타났다. 이는 생존가능한 세포의 수의 감소를 반영하는 것으로, 과학적 장비에 의해 부여되는 실험적 한계를 시사하는 것이다.
도 7에 도시한 바와 같이, Oct-4 발현은 BJ 섬유아세포를 8일 동안 2-PCPA로 처리하였을 때 증가하였다. 화합물 2-PCPA는 히스톤/리신 1 데메틸라제 억제제이다. 3가지 농도, 즉 0.1mM, 0.5mM 및 1.0mM의 2-PCPA 농도 모두에서, 대조용 배지(MC)와 비교했을 때 Oct-4 발현이 증가하였다.
히스톤 데아세틸라제 및 SIRT(이에 국한되는 것은 아님)를 포함한 다수의 표적을 목표대상으로 삼는 소분자 조절제는 다능 또는 만능 유전자의 발현을 증가시키는데 사용될 수 있으며, 분화된 세포를 재프로그래밍하는데 사용될 수 있다. 이 재프로그래밍 방법은 난세포, 배아 또는 배아 줄기세포와 무관하다. 그러므로, 이 방법은 유해한 영향을 줄 수 있는 바이러스 벡터에 의존하지 않는다. 이 방법은 또한 c-mys 및 Klf4와 같은 암유전자와 무관하다.
또한, 본 발명의 방법은 체세포 핵이식(SCNT)없이 분화된 세포를 재프로그래밍하는데 사용될 수 있다. SCNT는 매우 비효율적이며, 재프로그래밍 분야에서 큰 한계점을 가진다. 본 발명은 SCNT의 필요성을 해소한다.
본 발명의 방법은 강한 리포터 요소를 함유하는 인공 벡터와는 반대로, 내생 Oct-4 유전자의 발현 증가를 보여준다. 인공 벡터는 내생 유전자와 같은 염색질 구조를 가지지도 않고 게놈 환경을 형성하는 프로모터 요소 및 다른 유전자도 함유하지 않는다. 인공 벡터는 천연 게놈의 환경을 재현하는데 필요한 많은 천연 요소를 함유하지 않는다. 이 실시예에서 제시된 결과는 인간 세포를 치료함으로써 얻어지는 효과 및 내생 유전자에 미치는 영향을 보여준다.
마지막으로, 이 실시예에서 제시된 데이터는 소분자 조절제가 히스톤 아세틸라제와 같은 단백질 복합체의 기능을 변화시키는데 사용될 수 있다는 것을 입증한다. 염색질 구조 변화는 분화된 세포를 재프로그래밍하고 분화능을 복원시키는데 있어서 한 단계이다.
실시예 3
VPA에의 노출에 의해 유도되는 형태적 변화를 조사하였다. 배아 세포는 고유의 형태적 특징을 갖는다. 그러므로, 다능 유전자의 발현 증가가 배아 세포와 일치하는 형태적 변화와 상관관계가 있는지를 알아보기 위해 VPA로 처리된 세포를 조사하였다.
방법
24-웰 플레이트에서 5일 동안 섬유아세포 성장 배지 내의 500μM VPA로 성인 인간 진피 섬유아세포를 처리하였다. 3일째에, 500μM VPA로 세포를 재처리하였다. 5일 마지막에, 세포를 6-웰 플레이트로 이동시키고, 16일 동안 더 mTeSR hES 세포 배양 배지(Stem Cell Technologies로부터 구입가능, Vancouver, BC, Canada) 내의 500μM VPA로 매일 처리하였다. mTeSR 배지는 매일 교체하였다. 약 21일에, 현탁액 중에 콜로니가 관찰되었을 때, 세포를 마트리젤 플레이트로 이동시키고 플레이팅 후에 사진을 찍었다.
결과
도 8A ~ 8D는 비처리 세포 및 500μM VPA로 처리된 세포의 사진이다. 도 8A는 섬유아세포 성장 배지 내의 비처리 세포의 사진이다. 도 8B는 DMEM/F12 배지 내의 비처리 세포의 사진이다. 도 8C 및 도 8D는 마트리젤이 첨가된 mTeSR hES 세포 배지 내의 VPA-처리된 세포의 사진이다. VPA로 처리된 세포는 배아 유사 콜로니(도 8C) 및 배아 유사체(도 8D)와 유사하다. 그러나 양성 다능 단백질 염색은 검출되지 않았다(도시되지 않음), 이는 실험적 오류 또는 실험 시스템의 한계의 결과일 수 있다.
소분자 조절제로 처리된 세포는 세포의 다능성을 유지하는데 관여하는 유전자 및 분화된 세포를 재프로그래밍하는데 관여하는 유전자인 Oct-4 및 Nanog 유전자의 발현을 유도하였다. 또한 이러한 유전자 발현의 증가는 세포의 형태적 변화를 유발하였는데, 여기서 형태적 변화는 배양체-유사 세포와 일치하였다. 이러한 결과는 히스톤 데아세틸라제의 억제제가 분화된 세포를 배아 유사 세포로 변형시키는데 사용될 수 있다는 것을 명백하게 입증한다. 이 결과는 세포를 VPA와 같은 소분자 억제제에 노출시킴으로써 세포를 재프로그래밍할 수 있다는 생각을 확인시켜 준다.
본 명세서에서 특정 실시예를 설명 및 기술하고 있지만, 당해 분야 숙련자는 같은 목적을 달성하는 것으로 생각되는 어떠한 배합도 기술된 특정 실시예를 대체할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본 출원서는 본 발명의 원리에 따라 이루어질 수 있는 어떠한 수정 또는 변경도 포함한다. 그러므로, 본 발명은 본 출원서의 특허청구범위 및 그 균등물에 의해서만 제한된다. 본 출원서에서 인용한 특허, 참고문헌 및 공개자료에 대한 기술은 참고문헌으로 포함된다.

Claims (20)

  1. 세포를 재프로그래밍하는 방법으로서, 다능 유전자의 발현을 유도하는 소분자 조절제에 세포를 노출시키는 단계 및 세포를 선별하는 단계를 포함하며, 분화능(differentiation potential)이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포를 선별하는 단계는 상기 소분자 조절제에 노출시키기 전과 후 세포의 표현형을 비교하는 단계 및 복원된 분화능과 일치하는 표현형을 가진 세포를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 선별된 세포를 세포군으로 확장시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 소분자 조절제는 히스톤 데아세틸라제 억제제, 메틸 결합 도메인 단백질 억제제, 메틸 아데노실트랜스퍼라제 억제제, DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 억제제, 리신 메틸트랜스퍼라제 억제제, 히스톤 데메틸라제 억제제 및 메틸 사이클 효소 억제제로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 소분자 조절제는 DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제는 RG108인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포를 선별하는 단계는 다능 유전자로부터 발현되는 단백질 또는 다능 마커에 지향적인 항체를 사용하여 세포를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포를 선별하는 단계는 다능 유전자에 의해 구동되는 리포터 또는 선별가능한 마커에 대한 저항물질을 이용하여 세포를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 다능 유전자는 Oct-4, Sox-2 및 Nanog로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 소분자 조절제에 노출시키기 전의 상기 세포의 다능 유전자의 염색질 구조와 소분자 조절제에 노출시킨 후에 얻어지는 염색질 구조를 비교하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 세포를 재프로그래밍하는 방법으로서, 소분자 조절제에 제 1 전사 패턴을 가진 세포를 노출시키는 단계로서 상기 소분자 조절제가 다능 유전자의 발현을 유도하는 것을 특징으로 하는 단계; 세포의 제 1 전사 패턴과 상기 조절제에 노출시킨 후에 얻어지는 전사 패턴을 비교하는 단계; 및 세포를 선별하는 단계를 포함하며, 분화능이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 조절제에 노출시킨 후의 전사 패턴은 배아 줄기세포의 전사 패턴과 적어도 50% 유사한 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11 항에 있어서,
    전사 패턴을 비교하는 단계 이전에, 상기 소분자 조절제에 노출시키기 전과 후의 세포의 표현형을 비교하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 11 항에 있어서,
    상기 선별된 세포를 세포군으로 확장시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 11 항에 있어서,
    상기 세포를 선별하는 단계는 다능 유전자로부터 발현되는 단백질 또는 다능 마커에 지향적인 항체를 이용하여 세포를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 11 항에 있어서,
    상기 다능 유전자는 Oct-4, Sox-2 및 Nanog로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 다능 유전자의 발현을 유도하는 소분자 조절제에 세포를 노출시키는 단계; 다능 유전자의 발현을 유도하는 단계; 세포를 선별하는 단계로서 분화능이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 단계; 및 상기 선별된 세포를 확장시킴으로써 세포군을 생성하는 단계를 포함하는 방법에 따라 제조되는 농축 재프로그래밍 세포군.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 재프로그래밍 세포는 SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 세포 표면 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 농축 재프로그래밍 세포군.
  19. 제 17 항에 있어서,
    상기 다능 유전자는 Oct-4, Nanog, 및 Sox-2 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 농축 재프로그래밍 세포군.
  20. 제 17 항에 있어서,
    상기 재프로그래밍 세포는 세포군의 적어도 60%를 차지하는 것을 특징으로 하는 농축 재프로그래밍 세포군.


KR1020107024995A 2008-04-07 2009-04-07 소분자 조절제의 사용을 통한 다능 유전자의 유도에 의한 세포 재프로그래밍 KR20110007607A (ko)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US4306608P 2008-04-07 2008-04-07
US4299508P 2008-04-07 2008-04-07
US4289008P 2008-04-07 2008-04-07
US61/042,890 2008-04-07
US61/043,066 2008-04-07
US61/042,995 2008-04-07
US11397108P 2008-11-12 2008-11-12
US61/113,971 2008-11-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20110007607A true KR20110007607A (ko) 2011-01-24

Family

ID=41162444

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107024995A KR20110007607A (ko) 2008-04-07 2009-04-07 소분자 조절제의 사용을 통한 다능 유전자의 유도에 의한 세포 재프로그래밍
KR1020107024996A KR20110019727A (ko) 2008-04-07 2009-04-07 Ｒｎａ 간섭을 통한 다능 유전자의 유도에 의한 세포 재프로그래밍
KR1020107024997A KR20110006672A (ko) 2008-04-07 2009-04-07 Ｈｄａｃ 조절제의 사용을 통한 다능 유전자의 유도에 의한 세포 재프로그래밍

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107024996A KR20110019727A (ko) 2008-04-07 2009-04-07 Ｒｎａ 간섭을 통한 다능 유전자의 유도에 의한 세포 재프로그래밍
KR1020107024997A KR20110006672A (ko) 2008-04-07 2009-04-07 Ｈｄａｃ 조절제의 사용을 통한 다능 유전자의 유도에 의한 세포 재프로그래밍

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20090253203A1 (ko)
EP (3) EP2276838A4 (ko)
JP (3) JP2011516076A (ko)
KR (3) KR20110007607A (ko)
CN (3) CN102083981A (ko)
AU (3) AU2009233845A1 (ko)
WO (3) WO2009126250A2 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140103132A (ko) * 2011-12-13 2014-08-25 플린더스 유니버시티 오브 사우스 오스트레일리아 다능성 줄기세포의 제조방법
WO2018160028A1 (ko) * 2017-03-02 2018-09-07 주식회사 셀라토즈테라퓨틱스 신경세포 분화용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용한 체세포로부터 신경세포로의 분화 방법

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2607477B1 (en) 2007-05-03 2020-09-23 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Multipotent stem cells and uses thereof
US8574567B2 (en) * 2007-05-03 2013-11-05 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Multipotent stem cells and uses thereof
EP2494039B1 (en) * 2009-10-31 2019-06-19 Genesis Technologies Limited Methods for reprogramming cells and uses thereof
WO2011060135A1 (en) 2009-11-12 2011-05-19 Vbi Technologies, Llc Subpopulations of spore-like cells and uses thereof
WO2011109015A1 (en) * 2010-03-02 2011-09-09 The Scripps Research Institute Improved methods of generating pluripotent stem cells
US9517250B2 (en) 2010-04-28 2016-12-13 The J. David Gladstone Institutes Methods for generating cardiomyocytes
WO2012007725A2 (en) 2010-07-16 2012-01-19 Plasticell Ltd Method of reprogramming a cell
JP5681955B2 (ja) 2010-10-08 2015-03-11 ミナ セラピューティクス リミテッド 短いｒｎａ分子
US9677141B2 (en) 2011-07-25 2017-06-13 Kyoto University Method for screening induced pluripotent stem cells
EP2750509B1 (en) 2011-08-30 2016-12-28 The J. David Gladstone Institutes Methods for generating cardiomyocytes
CN103917641B (zh) 2011-10-21 2018-04-27 爱科来株式会社 通过层流进行的维持多能性的单个分散细胞的培养法
CN102417894B (zh) * 2011-10-21 2013-06-05 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种提高诱导生成多能性干细胞效率的方法
WO2013077423A1 (ja) 2011-11-25 2013-05-30 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞の培養方法
EP2955223B1 (en) 2013-02-08 2019-12-18 Kyoto University Production methods for megakaryocytes and platelets
EP2966163B1 (en) 2013-03-06 2018-01-17 Kyoto University Culture system for pluripotent stem cells and method for subculturing pluripotent stem cells
EP2977449B1 (en) 2013-03-21 2020-02-26 Kyoto University Pluripotent stem cell for neuronal differentiation induction
KR102164270B1 (ko) 2013-03-25 2020-10-12 고에키 자이단 호징 고베 이료 산교 도시 스이신 기코 세포의 선별 방법
WO2014168264A1 (ja) 2013-04-12 2014-10-16 国立大学法人京都大学 肺胞上皮前駆細胞の誘導方法
WO2014185358A1 (ja) 2013-05-14 2014-11-20 国立大学法人京都大学 効率的な心筋細胞の誘導方法
KR101870174B1 (ko) 2013-05-31 2018-06-22 아이하트 재팬 가부시키가이샤 하이드로겔을 포함하는 적층화된 세포 시트
RU2696315C2 (ru) 2013-06-11 2019-08-01 Киото Юниверсити Способ получения ренальных клеток-предшественников и содержащее их лекарственное средство
EP3031905A4 (en) 2013-08-07 2017-04-26 Kyoto University Method for producing pancreatic hormone-producing cell
ES2721440T3 (es) 2013-09-05 2019-07-31 Univ Kyoto Nuevo método para inducir células precursoras neurales productoras de dopamina
US10100283B2 (en) 2013-11-01 2018-10-16 Kyoto University Efficient chondrocyte induction method
DK3594348T3 (da) 2013-11-22 2021-10-11 Mina Therapeutics Ltd Kort c/ebp-alpha til aktivering af rna-sammensætninger og anvendelsesfremgangsmåder
CN103751806B (zh) * 2014-01-23 2015-10-14 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 干扰sirt1表达试剂在制备抑制肝癌干细胞干性转录因子表达的试剂中的应用
US20150297638A1 (en) * 2014-04-17 2015-10-22 Muhammad Ashraf Chemically induced pluripotent stem cells for safe therapeutic applications
TWI719939B (zh) 2014-07-14 2021-03-01 日商中外製藥股份有限公司 鑑定蛋白質抗原決定位之方法
KR101647030B1 (ko) 2014-11-20 2016-08-09 한국생명공학연구원 미토푸신 억제제를 포함하는, 세포 리프로그래밍 촉진용 조성물 및 이의 용도
JP7253692B2 (ja) 2014-12-26 2023-04-07 国立大学法人京都大学 肝細胞誘導方法
EP3283502A4 (en) * 2015-04-07 2019-04-03 The General Hospital Corporation METHODS FOR REACTIVATION OF GENES ON INACTIVE X CHROMOSOME
EP3081638A1 (en) 2015-04-16 2016-10-19 Kyoto University Method for producing pseudo-islets
JP6948072B2 (ja) 2016-04-15 2021-10-13 国立大学法人京都大学 Ｃｄ８陽性ｔ細胞を誘導する方法
SG11201809279YA (en) 2016-04-22 2018-11-29 Univ Kyoto Method for producing dopamine-producing neural precursor cells
US20200141921A1 (en) 2016-12-27 2020-05-07 Sumitomo Chemical Company, Limited Evaluation method and selection method for induced pluripotent stem cells, and production method for induced pluripotent stem cells
JP7136454B2 (ja) 2017-01-20 2022-09-13 国立大学法人京都大学 ＣＤ８α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法
EP3575392A4 (en) 2017-01-26 2020-08-26 Osaka University MEDIUM FOR INDUCING THE DIFFERENTIATION OF STEM CELLS INTO MESODERMAL CELLS AND METHOD FOR PRODUCING MESODERMAL CELLS
EP3597734A4 (en) 2017-03-14 2021-03-03 Kyoto University PROCESS FOR THE PRODUCTION OF AUXILIARY T LYMPHOCYTES FROM PLURIPOTENT STEM CELLS
CN110662832B (zh) 2017-05-25 2024-01-05 国立大学法人京都大学 由间介中胚层细胞分化诱导肾祖细胞的方法和由多能干细胞分化诱导肾祖细胞的方法
US20200172969A1 (en) 2017-06-19 2020-06-04 Foundation For Biomedical Research And Innovation At Kobe Method for predicting differentiation ability of pluripotent stem cell, and reagent for same
US20210363496A1 (en) 2017-10-17 2021-11-25 Kyoto University Method for obtaining artificial neuromuscular junction from pluripotent stem cells
CN108588008A (zh) * 2018-04-18 2018-09-28 广西壮族自治区畜牧研究所 一种德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物及应用
CA3106089A1 (en) 2018-07-13 2020-01-16 Kyoto University Method for producing .gamma..delta.t cells
WO2020017575A1 (ja) 2018-07-19 2020-01-23 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞由来の板状軟骨およびその製造方法
WO2020022261A1 (ja) 2018-07-23 2020-01-30 国立大学法人京都大学 新規腎前駆細胞マーカーおよびそれを利用した腎前駆細胞の濃縮方法
US20210386787A1 (en) * 2018-10-12 2021-12-16 Life Technologies Corporation Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Expansion System
JP7016102B2 (ja) 2018-12-06 2022-02-04 キリンホールディングス株式会社 Ｔ細胞又はｎｋ細胞の製造方法、ｔ細胞又はｎｋ細胞の培養用培地、ｔ細胞又はｎｋ細胞の培養方法、未分化ｔ細胞の未分化状態を維持する方法及びｔ細胞又はｎｋ細胞の増殖促進剤
US20220056413A1 (en) 2018-12-21 2022-02-24 Kyoto University Lubricin-localized cartilage-like tissue, method for producing same and composition comprising same for treating articular cartilage damage
CN113226475A (zh) 2018-12-26 2021-08-06 麒麟控股株式会社 改造tcr及其制造方法
CN113692225B (zh) * 2019-03-05 2023-04-18 以色列农业和农村发展部农业研究组织(范卡尼中心) 经基因组编辑的鸟类
JPWO2020230832A1 (ko) 2019-05-15 2020-11-19
EP3974519A4 (en) 2019-05-20 2023-07-12 Ajinomoto Co., Inc. EXPANSION CULTURE METHOD FOR CARTILAGE OR BONE PRECURSOR CELLS
CN111979194A (zh) * 2019-05-24 2020-11-24 北京大学 重编程细胞的方法
JP7058431B2 (ja) 2019-12-12 2022-04-22 国立大学法人千葉大学 巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤
CN110951738B (zh) * 2019-12-23 2021-10-15 华南农业大学 猪hdac2基因的表达抑制剂及其应用
EP4110904A1 (en) 2020-02-28 2023-01-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method for producing natural killer cells from pluripotent stem cells
JPWO2021256522A1 (ko) 2020-06-17 2021-12-23
WO2022014604A1 (ja) 2020-07-13 2022-01-20 国立大学法人京都大学 骨格筋前駆細胞及びその精製方法、筋原性疾患を治療するための組成物、並びに骨格筋前駆細胞を含む細胞群の製造方法
JPWO2022019152A1 (ko) 2020-07-20 2022-01-27
CN116323917A (zh) 2020-08-18 2023-06-23 国立大学法人京都大学 人原始生殖细胞/人原始生殖细胞样细胞的维持扩增方法
JPWO2022196714A1 (ko) 2021-03-17 2022-09-22
CN117597433A (zh) 2021-04-30 2024-02-23 国立研究开发法人理化学研究所 视网膜色素上皮细胞的条状聚集体、用于制造其的装置和制造方法、以及含有该条状聚集体的治疗药物
WO2022255489A1 (ja) 2021-06-04 2022-12-08 キリンホールディングス株式会社 細胞組成物、細胞組成物の製造方法及び細胞組成物を含む医薬組成物
JPWO2022259721A1 (ko) 2021-06-10 2022-12-15
AU2022292988A1 (en) 2021-06-15 2024-01-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method for producing natural killer cells from pluripotent stem cells
EP4372080A1 (en) 2021-07-15 2024-05-22 Astellas Pharma Inc. Pericyte-like cell expressing vascular endothelial growth factor (vegf) at high level
JPWO2023286832A1 (ko) 2021-07-15 2023-01-19
JPWO2023017848A1 (ko) 2021-08-11 2023-02-16
WO2024078119A1 (en) * 2022-10-12 2024-04-18 Peking University Methods for chemical reprogramming and pluripotent stem cells

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4352883A (en) 1979-03-28 1982-10-05 Damon Corporation Encapsulation of biological material
US4353888A (en) 1980-12-23 1982-10-12 Sefton Michael V Encapsulation of live animal cells
US5283187A (en) 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
US5158881A (en) 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
DE3829766A1 (de) 1988-09-01 1990-03-22 Akzo Gmbh Verfahren zur herstellung von membranen
DE3829752A1 (de) 1988-09-01 1990-03-22 Akzo Gmbh Integrale asymmetrische polyaethersulfonmembran, verfahren zur herstellung und verwendung zur ultrafiltration und mikrofiltration
US5082670A (en) 1988-12-15 1992-01-21 The Regents Of The University Of California Method of grafting genetically modified cells to treat defects, disease or damage or the central nervous system
US5084350A (en) 1990-02-16 1992-01-28 The Royal Institution For The Advance Of Learning (Mcgill University) Method for encapsulating biologically active material including cells
US5618531A (en) 1990-10-19 1997-04-08 New York University Method for increasing the viability of cells which are administered to the brain or spinal cord
DK0585368T3 (da) 1991-04-25 1998-03-16 Univ Brown Res Found Implanterbart biokompatibelt immunisolatorisk vehikel til afgivelse af udvalgte terapeutiske produkter
EP1179350A3 (en) 1993-08-12 2003-01-02 Cytotherapeutics, Inc. Encapsulated cell system for implantation into the human CNS
US5968829A (en) 1997-09-05 1999-10-19 Cytotherapeutics, Inc. Human CNS neural stem cells
US20020136709A1 (en) * 2000-12-12 2002-09-26 Nucleus Remodeling, Inc. In vitro-derived adult pluripotent stem cells and uses therefor
JP2004248505A (ja) * 2001-09-21 2004-09-09 Norio Nakatsuji 移植抗原の一部または全てを欠除したｅｓ細胞由来の未分化な体細胞融合細胞およびその製造
US20050170506A1 (en) * 2002-01-16 2005-08-04 Primegen Biotech Llc Therapeutic reprogramming, hybrid stem cells and maturation
EP1838853A2 (en) * 2005-01-06 2007-10-03 Benitec, Inc. Rnai agents for maintenance of stem cells
GB0515006D0 (en) * 2005-07-22 2005-08-31 Univ Nottingham Reprogramming
CN101313065A (zh) * 2005-08-01 2008-11-26 纽珀滕索有限公司 具有恢复的潜能的重编程序细胞的生产
EP4223769A3 (en) * 2005-12-13 2023-11-01 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
GB0615327D0 (en) * 2006-03-30 2006-09-13 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitors and uses thereof
WO2008038148A2 (en) * 2006-05-11 2008-04-03 Andrew Craig Boquest Stem cells and methods of making and using stem cells
US9382515B2 (en) * 2007-04-07 2016-07-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Reprogramming of somatic cells
EP2279243B1 (en) * 2008-03-17 2016-01-06 The Scripps Research Institute Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140103132A (ko) * 2011-12-13 2014-08-25 플린더스 유니버시티 오브 사우스 오스트레일리아 다능성 줄기세포의 제조방법
WO2018160028A1 (ko) * 2017-03-02 2018-09-07 주식회사 셀라토즈테라퓨틱스 신경세포 분화용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용한 체세포로부터 신경세포로의 분화 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20110006672A (ko) 2011-01-20
CN102083982A (zh) 2011-06-01
WO2009126250A2 (en) 2009-10-15
CN102083981A (zh) 2011-06-01
EP2276834A4 (en) 2012-02-08
EP2276838A2 (en) 2011-01-26
AU2009234424A1 (en) 2009-10-15
WO2009126655A3 (en) 2010-01-14
WO2009126251A3 (en) 2010-03-18
WO2009126251A2 (en) 2009-10-15
JP2011516082A (ja) 2011-05-26
EP2276834A2 (en) 2011-01-26
EP2276838A4 (en) 2012-02-01
JP2011516076A (ja) 2011-05-26
WO2009126250A3 (en) 2010-03-18
KR20110019727A (ko) 2011-02-28
EP2274424A2 (en) 2011-01-19
WO2009126655A2 (en) 2009-10-15
CN102083968A (zh) 2011-06-01
EP2274424A4 (en) 2012-02-01
US20090253203A1 (en) 2009-10-08
AU2009233845A1 (en) 2009-10-15
AU2009234423A1 (en) 2009-10-15
JP2011522514A (ja) 2011-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20110007607A (ko) 소분자 조절제의 사용을 통한 다능 유전자의 유도에 의한 세포 재프로그래밍
US20110059526A1 (en) Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through use of an hdac modulator
US8357666B2 (en) Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through RNA interference
US20230015276A1 (en) Methods and compositions to increase somatic cell nuclear transfer (scnt) efficiency by removing histone h3-lysine trimethylation
Casillas et al. Transcriptional control of the DNA methyltransferases is altered in aging and neoplastically-transformed human fibroblasts
US20090275032A1 (en) Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through use of an HDAC modulator
US11377636B2 (en) Endogenous retrovirus transcription as a marker for primate naive pluripotent stem cells
US20120322153A1 (en) Reprogramming a cell by activation of the endogenous transcription factor network
Sharma et al. Lysine methyltransferase G9a is not required for DNMT3A/3B anchoring to methylated nucleosomes and maintenance of DNA methylation in somatic cells
Alcaine Colet Identification and characterization of the molecular pathways regulating the cell cycle-linked pluripotency exit
Lane The lysine acetyltransferase MOF: its interactome, role in breast cancer, and characterisation of a novel isoform
Fasciani Development of an in vitro disease model for dissecting the epigenetic mechanisms underlying pathogenesis of Kabuki syndrome
Goss Histone modifications across the cell cycle in undifferentiated and differentiating mouse embryonic stem cells
Meyers Stem Cells: From Biology to Therapy, 2 Volumes
Hosseini DISSECTING THE ROLE OF LYSINE-SPECIFIC DEMETHYLASE1 (LSD1): IDENTIFICATION OF MARKERS/EFFECTORS OF SENSITIVITY TO LSD1 INHIBITORS IN CANCER.
Carrió Gaspar DNA Methylation Dynamics during Myogenesis
Dhaliwal H3K36me3 in muscle differentiation: Regulation of tissue-specific gene expression by H3K36-specific histone methyltransferases
Rossi The cell cycle genes regulation of IPS cells and the role of SWI/SNF chromatin remodelling enzymes during them differentiation
Frost Genomic Imprinting in Human Stem Cells and Human Peripheral Blood Leukocytes
Autio Investigating the Regulation of Distinct Epigenetic States in Human Embryonic Stem Cells
Wang The histone H3 lysine 36 methyltransferase HypB facilitates embryonic stem cell differentiation
Ma Characterisation of histone modifications at insulator elements

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application