JP2020036622A - 新規軟骨細胞誘導方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]次の工程を含む多能性幹細胞から軟骨細胞を製造する方法:
(i)多能性幹細胞を接着培養することにより中胚葉細胞を誘導する工程、
(ii)前記工程(i)で得られた細胞をBMP2、TGFβおよびGDF5から成る群より選択される1以上の物質を含む培養液中で接着培養する工程、および
(iii)前記工程(ii)で得られた細胞をBMP2、TGFβおよびGDF5をから成る群より選択される1以上の物質含む培養液中で浮遊培養する工程。
[2]前記工程(iii)で得られた細胞を血清を含有する培養液中で培養する工程をさらに含む、[1]に記載の方法。
[3]前記工程(i)、(ii)および(iii)の工程で用いる培養液が、さらに1%FBSを含む培養液である、[1]または[2]に記載の方法。
[4]前記工程(iii)が、前記工程(ii)で得られた細胞を分離溶液を用いずに、浮遊培養を行う工程である、[1]から[3]のいずれか1項に記載の方法。
[5]前記工程(i)の中胚葉細胞を誘導する工程が、Wnt3aおよびアクチビンAを含む培養液中で培養する工程である、[1]から[4]のいずれか1項に記載の方法。
[6]前記工程(i)が、5日以下である、[1]から[5]のいずれか1項に記載の方法。
[7]前記工程(ii)が、15日以下である、[1]から[6]のいずれか1項に記載の方法。
[8]前記工程(iii)が、10日以上30日以下である、[1]から[7]のいずれか1項に記載の方法。
[9]前記工程(i)が、3日である、[6]に記載の方法。
[10]前記工程(ii)が、11日である、[7]に記載の方法。
[11]前記工程(iii)が、14日以上28日以下である、[8]に記載の方法。
[12][1]から[11]に記載の方法で製造された軟骨細胞を含む、医薬品。
[13]前記軟骨細胞が、軟骨細胞と細胞外マトリックスを含む塊である、[12]に記載の医薬品。
[14]関節軟骨損傷治療用である、[12]または[13]に記載の医薬品。
[15]多能性幹細胞から誘導された誘導軟骨細胞であって、
(1)当該軟骨細胞は、COL2A1遺伝子の発現量が、多能性幹細胞における対応する遺伝子の発現量と比較して、少なくとも100倍であり、
(2)当該軟骨細胞は、 SOX9遺伝子の発現量が、多能性幹細胞における対応する遺伝子の発現量と比較して、少なくとも250倍であり、および
(3)当該軟骨細胞は、外来遺伝子が導入されていない(ただし、iPS細胞の製造に用いた遺伝子は除く)、前記誘導軟骨細胞。
[16]立体構造を有する軟骨様組織であって、
当該軟骨様組織は、外膜および当該外膜に内包された内容物から構成されており、
当該外膜は、COL1線維を含むが、COL2線維を含まず、
当該外膜の厚さが、10μm以上50μm以下であり、
当該内容物が、Col11線維、Col2線維、プロテオグリカンおよび請求項15に記載された細胞を含む、前記軟骨様組織。
(i)多能性幹細胞を接着培養することにより中胚葉細胞を誘導する工程、
(ii)前記工程(i)で得られた細胞をBMP2、TGFβおよびGDF5から成る群より選択される1以上の物質を含む培養液中で接着培養する工程、および
(iii)前記工程(ii)で得られた細胞をBMP2、TGFβおよびGDF5から成る群より選択される1以上の物質を含む培養液中で浮遊培養する工程。
ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚(例えば胚盤胞)の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
ES細胞は、受精卵の8細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ES細胞は、マウスで1981年に発見され (M.J. Evans and M.H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156)、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもES細胞株が樹立された (J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165)。
***幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、***形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、***幹細胞を得ることができる(竹林正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41〜46頁,羊土社(東京、日本))。
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
人工多能性幹(iPS)細胞は、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である(K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008);国際公開WO 2007/069666)。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
ntES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している(T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502)。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がntES(nuclear transfer ES)細胞である。ntES細胞の作製のためには、核移植技術(J.B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646)とES細胞作製技術(上記)との組み合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47〜52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
Muse細胞は、WO2011/007900に記載された方法にて製造された多能性幹細胞であり、詳細には、線維芽細胞または骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは8時間または16時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞であり、SSEA-3およびCD105が陽性である。
本発明において、中胚葉細胞とは、動物の発生期の原腸胚期において、内胚葉と外肺葉の間に発生する細胞を意味し、好ましくは、BRACHYURYが陽性である細胞を意味する。本発明において、BRACHYURYには、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_001270484またはNM_003181、マウスの場合、NM_009309に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子並びに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。
本工程(ii)では、前記工程(i)で得られた細胞培養物の培養液を除去し、BMP2、TGFβおよびGDF5から成る群から選択される1以上の物質を含有する培養液を添加して行い得る。従って、前記工程(i)において細胞培養物は、培養皿へ接着していることから、本工程(ii)は接着培養によって行い得る。
本工程(iii)では、前記工程(ii)で得られた細胞培養物を培養容器より剥離させ、浮遊培養することで行い得る。本工程(iii)において、細胞培養物を剥離させる方法は、力学的分離方法(ピペッティング等)により行うことが好ましく、プロテアーゼ活性および/またはコラゲナーゼ活性を有する分離溶液(例えば、トリプシンとコラゲナーゼの含有溶液Accutase(TM)およびAccumax(TM)(Innovative Cell Technologies, Inc)が挙げられる)を用いない方法が好ましい。
前記工程(iii)により、軟骨細胞を製造することが可能であるが、より成熟した軟骨細胞を得るために、前記工程(iii)で得られた細胞培養物をさらに、浮遊培養してもよい。
(1)当該軟骨細胞は、COL2A1遺伝子の発現量が、多能性幹細胞における対応する遺伝子の発現量と比較して、少なくとも100倍であり、
(2)当該軟骨細胞は、 SOX9遺伝子の発現量が、多能性幹細胞における対応する遺伝子の発現量と比較して、少なくとも250倍であり、および
(3)当該軟骨細胞は、外来遺伝子が導入されていない(ただし、iPS細胞の製造に用いた外来遺伝子は除く)。
本発明の提供する誘導軟骨細胞は、前記工程(iv)で用いる培養液で培養することができる。培養温度その他条件もまた、前記工程(iv)と同様である。
本発明が提供する軟骨様組織は、直径が0.5mm以上、5mm以下の球状の物質であるが、当該球状の物質を融合することが可能であることから、長径が少なくとも0.5mm以上であれば、特に限定されない。
本発明において、COL2線維とは、COL2遺伝子によってコードされるタンパク質が3重らせん構造を形成している線維である。
本発明において、COL11線維とは、COL11遺伝子によってコードされるタンパク質が3重らせん構造を形成している線維である。
本発明において、プロテオグリカンとは、コアタンパク質のアミノ酸であるセリンと糖質(キシロース、ガラクトース、グルクロン酸)が結合し、コンドロイチン硫酸などの2糖単位で連続する多糖体が結合した化合物である。
Nature Methods 8, 409-412 (2011)に記載のエピソーマルベクターによる初期化因子導入法を用いてヒト皮膚線維芽細胞から樹立した409B2株、HDF-11株、KF4009-1株、および、ヒト末梢血から樹立した604B1株の合計4株のヒトiPS細胞を以降の実験に用いた。なお、409B2株(Nat Methods. 8, 409-412(2011))および604B1株(Stem Cells. 31, 458-466(2013))は、京都大学iPS細胞研究所より受領した。樹立したiPS細胞は、フィーダー細胞(マイトマイシンC処理を行ったSNL細胞)上に播き直し、ヒトES細胞維持培地を添加した上で維持培養を行った。ヒトES細胞維持培地は、DMEM/F12 (Sigma), 20% KSR(Invitrogen), 2mM L-グルタミン(Invitrogen), 1×10-4M 非必須アミノ酸(Invitrogen), 1×10-4M 2-メルカプトエタノール(Invitrogen), 50units/ml ペニシリン(Invitrogen), 50mg/ml ストレプトマイシン(Invitrogen), 4ng/ml bFGF(WAKO)を混合することにより調製した。その後、iPS細胞をマトリゲル(Invitrogen)コートディッシュ上に播種し、Essential 8培地(Life Technologies)に50units/ml ペニシリンおよび50mg/ml ストレプトマイシンを添加した培地を加え、フィーダーフリー環境下で維持培養を行った。フィーダーフリー維持培養を開始して10〜15日目に、1〜2×105細胞から成るコロニーを用いて以下に詳述する軟骨細胞への分化誘導を行った。
RT-PCRを実施するためのRNAは、所望の細胞からRNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いて、カラム内でDNae Iでの消化する条件下で製造業者のプロトコールに従って回収された。パーティクル内の細胞からRNAを回収する場合、モルタル処理によりホモジナイズした後に回収した。テンプレートとして用いるため、全RNAのうち500 ngをReverTra Ace (TOYOBO)を用いてcDNAへ変換した。リアルタイムPCRは、KAPA SYBR FAST qPCR kit Master Mix ABI prism (KAPA BIOSYSTEMS)を用いてStep One system (ABI)にて行われた。PCRに用いたプライマーを、以下に示す。
プライマー名 配列
ACTB F TGGCACCACACCTTCTACAATGAGC(配列番号:1)
ACTB R GCACAGCTTCTCCTTAATGTCACGC(配列番号:2)
OCT3/4 FGACAACAATGAGAACCTTCA(配列番号:3)
OCT3/4 R TTCTGGCGCCGGTTACAGAA(配列番号:4)
NANOG F CAAAGGCAAACAACCCACTT(配列番号:5)
NANOG R CTGGATGTTCTGGGTCTGGT(配列番号:6)
BRACHYURY F TATGAGCCTCGAATCCACATAGT(配列番号:7)
BRACHYURY R CCTCGTTCTGATAAGCAGTCAC(配列番号:8)
KDR F GGCCCAATAATCAGAGTGGCA(配列番号:9)
KDR R CCAGTGTCATTTCCGATCACTTT(配列番号:10)
SOX5 F CAGCCAGAGTTAGCACAATAGG(配列番号:11)
SOX5 R CTGTTGTTCCCGTCGGAGTT(配列番号:12)
SOX6 F GGATGCAATGACCCAGGATTT(配列番号:13)
SOX6 R TGAATGGTACTGACAAGTGTTGG(配列番号:14)
SOX9 F AGACCTTTGGGCTGCCTTAT(配列番号:15)
SOX9 R TAGCCTCCCTCACTCCAAGA(配列番号:16)
AGGRECAN F TGAGGAGGGCTGGAACAAGTACC(配列番号:17)
AGGRECAN R GGAGGTGGTAATTGCAGGGAACA(配列番号:18)
COL2A1 F TTTCCCAGGTCAAGATGGTC(配列番号:19)
COL2A1 R CTTCAGCACCTGTCTCACCA(配列番号:20)
COL11A2 F TGTGATGACTACGGGGACAA(配列番号:21)
COL11A2 R CCATATTCCTCTGCCTGGAA(配列番号:22)
LUBRICIN F AAAGTCAGCACATCTCCCAAG(配列番号:23)
LUBRICIN R GTGTCTCTTTAGCGGAAGTAGTC(配列番号:24)
IHH F AACTCGCTGGCTATCTCGGT(配列番号:25)
IHH R GCCCTCATAATGCAGGGACT(配列番号:26)
COL10A1 F ATGCTGCCACAAATACCCTTT(配列番号:27)
COL10A1 R GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT(配列番号:28)
COL1A1 F GTCGAGGGCCAAGACGAAG(配列番号:29)
COL1A1 R CAGATCACGTCATCGCACAAC(配列番号:30)
COL1A2 F AATTGGAGCTGTTGGTAACGC(配列番号:31)
COL1A2 R CACCAGTAAGGCCGTTTGC(配列番号:32)
OSTEOCALCIN F CACTCCTCGCCCTATTGGC(配列番号:33)
OSTEOCALCIN R CCCTCCTGCTTGGACACAAAG(配列番号:34)
Taqman human ACTB Hs01060665-gl
Taqman mouse Actb Mn00607939-sl
Taqman rat Actb Rn00667869-ml
eGFP COL11A2 F CATACAATGGGGTACCTTCTGG(配列番号:35)
eGFP COL11A2 R GCATGGACGAGCTGTACAAGTAA(配列番号:36)
軟骨細胞特異的Col11a2遺伝子(XI型コラーゲンα2鎖遺伝子)のプロモーター/エンハンサーに結合したトランスジーンのコンストラクト(Col11a2-EGFP-IRES-Puro、図1参照)を含むpiggyBacベクターをヒトiPS細胞に導入した。導入から10日後に、Col11a2遺伝子特異的に緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するレポーターiPS細胞株を選別した。選別されたiPS細胞株へのレポーター遺伝子の組み込みは、RT-PCRにより確認した。選別されたCol11a2遺伝子レポーターiPS細胞をSCIDマウスの皮下に注入することで形成されたテラトーマを採取して組織染色を行ったところ、軟骨、腸管、神経組織の形成が確認されたが、特に軟骨細胞特異的な発現を示すこともあわせて確認された(図2)。
上述したフィーダーフリー維持培養を開始して10〜15日目のCol11a2遺伝子レポーターiPS細胞の培地を中胚葉培地(DMEM/F12に対し10ng/ml Wnt3A(R&D), 10ng/ml アクチビンA(R&D), 1% インスリン-トランスフェリン-亜セレン酸ナトリウム(Invitrogen), 1% 牛胎児血清, 50units/ml ペニシリン, 50mg/ml ストレプトマイシンを混合して調製)に交換して3日間培養を行った(day3)。その後、DMEM/F12に対し1% インスリン-トランスフェリン-亜セレン酸ナトリウム, 1% FBS, 50units/ml ペニシリン, 50mg/ml ストレプトマイシンを混合した調製溶液へ以下(1)〜(3)に示した各組成の軟骨誘導用添加剤を加え、分化誘導開始から14日目(day14)まで培養を行った。なお、この14日間の培養工程は、全て接着培養法によって行った。また、day3〜day14に増殖を促すために10ng/ml bFGFを加えた。
(1)A: 50μg/mlアスコルビン酸(Nakarai)
(2)ABT: 50μg/mlアスコルビン酸、10ng/ml BMP2(Osteopharma)および10ng/ml TGFβ(Pepro Tech)の混合溶液
(3)ABTG: 50μg/mlアスコルビン酸、10ng/ml BMP2(Osteopharma)、10ng/ml TGFβ(Pepro Tech)および10ng/ml GDF5の混合溶液
図3に記載の細胞分化培養プロトコールにより、iPS細胞を誘導し、day28、day42、day 70およびday140で得られたパーティクルを組織染色により評価した(図6)。なお、day3〜day42に用いた軟骨培地には、DMEM/F12に対し1% インスリン-トランスフェリン-亜セレン酸ナトリウム, 1% 牛胎児血清, 50units/ml ペニシリン, 50mg/ml ストレプトマイシンおよびABTGを添加した調製溶液を用いた。その結果、day28のパーティクルは、サフラニンOでわずかに染色されるECMで包まれていることが確認された(図6a)。day42におけるパーティクルは、サフラニンOにより強く染まったことから、ECMも成熟状態にあることが分かった。ただし、I型コラーゲンとII型コラーゲンのいずれもがECMに含有されていた。一方、day42まで用いた軟骨培地を用いて培養を継続したところ、day70またはday140においては、I型コラーゲンの発現が維持されていたが(図7aおよびb)、day42以降において、軟骨培地をDMEMおよび10% 牛胎児血清のみから組成される通常培地に交換して、培養を続けたところ、day70においてI型コラーゲンの発現が低下し、II型コラーゲンの発現が増大した(図6bおよびc)。ただし、X型コラーゲンの発現は検出限界以下であった。また、パーティクルの表層部は、I型コラーゲンの発現量の増大が確認された。このような変化は、軟骨培地で培養を継続した際には見られなかった。これは、表層部により、パーティクルの内部での硝子軟骨への成熟に寄与するためと考えられる。軟骨細胞に特異的に発現するSOX9を指標としてday56およびday70における、表層部を除くパーティクル内のSOX9陽性の細胞数を調べたところ(図6d)、パーティクル内の軟骨細胞密度はそれぞれ91.8%±0.91%および99.7%±0.2%と時間経過とともに増加することが確認された(図6f)。また、day56でのCOLIIA2-EGFPはほぼ全ての細胞で陽性であることが確認された(図6e)。これらの結果から、パーティクルの三次元構造は、軟骨培地での継続培養を必要としない硝子軟骨の成熟化に重要で効果的であることが示唆された。
本発明のプロトコールにおいて、day14以降は浮遊培養により行われたが、day14以降においても接着培養を続けたところ、day42においてもほとんど軟骨形成が確認されなかった(図8)。この結果より、浮遊培養は軟骨の成熟化を促進させることが示唆された。ところで、day14において浮遊培養するために細胞を培養皿へ移し培養を継続すると、培養皿の底面は接着した細胞でおおわれる。この培養皿底面の細胞は、紡錘状の形状をしており、COL11A2-EGFPは陰性であった(図9a)。これらの細胞をRT-PCRで測定したところ、軟骨細胞マーカー遺伝子の発現はほとんど確認できなかった(図9b)。従って、所望の軟骨細胞以外の細胞が培養皿へ接着することにより、浮遊培養により軟骨細胞が濃縮されると考えられる。
本プロトコールは、細胞分化培養の当初から軟骨培地を用いず、生体内での中胚葉から軟骨細胞への発生系を模倣するため、day0〜day3においては軟骨培地ではなく中胚葉培地を用いる点を特長とした。そこで、培地の交換と共に、分化培養中のヒトiPS細胞にどのような変化が見られるのか、多能性マーカー、中胚葉マーカーおよび軟骨細胞マーカーを用いて、分化誘導開始から特定日数毎の細胞の経時的観測を行った。観測結果を図10aに示す。
上記により得られたヒトiPS細胞由来の軟骨細胞のin vivo環境下における機能解析のため、SCIDマウスの皮下にday42における軟骨細胞を注入した。注入から12週後に組織化学分析を行ったところ、全6箇所の注入箇所の内4箇所において、軟骨組織の形成が確認された(図11a)。この軟骨組織の内、96.4±0.84%がSOX9陽性細胞であった(図11b)。また、SOX9発現により硝子軟骨の形成が確認された軟骨組織は、I型コラーゲンの発現により表層の形成が認められるものであった。さらに、非ヒト由来のビメンチン抗体を用いて免疫染色を行ったところ、皮下形成組織のうち硝子軟骨部位についてはヒトiPS細胞由来、周囲の膜層についてはマウス由来であることが分かった(図11c)。軟骨細胞を移植したいずれの部位においても、腫瘍の形成は確認されず、また腫瘍形成の兆候となるような組織変化も見られなかった。これらの結果から、ヒトiPS細胞由来の軟骨細胞は、in vivo環境において硝子軟骨を組織形成し、少なくとも12週間は同組織形態を保ち得ることが分かった。
上述と同様にSCIDマウスの皮下にday42における軟骨細胞を注入し、12ヶ月後に移植部位を取り出し、組織化学分析を行った。その結果、6例全てにおいて、X型コラーゲンの発現により、軟骨の一部が肥大化していることが確認された(図12)。5例において、軟骨の大部分は骨端軟骨様の形態を保ちながら、軟骨の一部が骨様組織に置き換わっていることが確認された。これらの結果により、本方法で得られたヒトiPS細胞由来の細胞は、ゆっくりではあるが、肥大化していることが示唆された。このことは、関節軟骨欠損に移植した場合に、軟骨内骨化に寄与する可能性が想定される。また、移植部位には、12か月後であってもテラトーマやその他腫瘍形成は見られなかった。
SCIDラットの関節軟骨に予め浅い欠損部位を形成しておき、day42におけるヒトiPS細胞由来の軟骨細胞を当該欠損部位に移植した。ラットの関節軟骨に設けられた浅い欠損部位に移植するには、day42における潤滑性を呈する成熟した軟骨細胞パーティクルは適していなかったため、day28における軟骨細胞パーティクルを用いた。その結果、移植を行った全4箇所の膝部位関節の内3箇所において、4週間後も移植細胞が死滅することなく保持されていたことが組織染色により確認できた(図13a)。また、移植先の関節軟骨と移植細胞とが相互に馴染み強く結合していることも確認された(図13b)。さらに、移植から4週間後および12週間後の時点において、全4箇所の移植箇所全てにおいて腫瘍形成が認められず、また、転移の形跡が見られないことを確認した(図13c)。このことから、day28におけるヒトiPS細胞由来の軟骨細胞は移植に適した細胞であることが示唆された。一方、欠損が深い場合は、成熟したday42を用いることが可能であると考えられる。
Claims (2)
- 多能性幹細胞から誘導された誘導軟骨細胞であって、
(1)当該軟骨細胞は、COL2A1遺伝子の発現量が、多能性幹細胞における対応する遺伝子の発現量と比較して、少なくとも100倍であり、
(2)当該軟骨細胞は、 SOX9遺伝子の発現量が、多能性幹細胞における対応する遺伝子の発現量と比較して、少なくとも250倍であり、および
(3)当該軟骨細胞は、外来遺伝子が導入されていない(ただし、iPS細胞の製造に用いた外来遺伝子は除く)、前記誘導軟骨細胞。 - 立体構造を有する軟骨様組織であって、
当該軟骨様組織は、外膜および当該外膜に内包された内容物から構成されており、
当該外膜は、COL1線維を含むが、COL2線維を含まず、
当該外膜の厚さが、10μm以上50μm以下であり、
当該内容物が、Col11線維、Col2線維、プロテオグリカンおよび請求項15に記載された細胞を含む、前記軟骨様組織。
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JPWO2020130147A1 (ja) | ルブリシン局在軟骨様組織、その製造方法及びそれを含む関節軟骨損傷治療用組成物 |
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