KR20150130451A - 암 치료 방법 및 항암제 내성 예방을 위한 방법 - Google Patents

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셰인 버커
마리 클래슨
빅터 에스. 게일링
진-크리스토프 하만게
에리카 엘. 잭슨
준 리앙
하이디 필립스
피터 샌디
제프리 세틀맨
진-필립 스테판
쉴피 아로라
마이클 로버트 코스타
테드 라우
패트릭 트로저
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제넨테크, 인크.
콘스텔레이션 파마슈티칼스, 인크.
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Abstract

본원에서는 KDM5의 길항제를 사용하여 항암제 내성을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법들이 제공된다.

Description

암 치료 방법 및 항암제 내성 예방을 위한 방법{METHODS OF TREATING CANCER AND PREVENTING CANCER DRUG RESISTANCE}
관련 출원의 교차 참조
본원은 U.S. 출원 일련번호 61/801,414(2013 년 3월 15일 출원) 및 미국 출원 일련번호 61/804,083(2013년 3월 21일 출원)의 우선권의 혜택을 주장하고, 상기 출원들은 본원에 참조로 편입되었다.
분야
본원에 기술된 KDM5의 길항제를 사용하여 항암제 내성을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법이 제공된다.
비교적 빠른 항암제 내성 획득이 성공적인 암 치료에 주요한 장애물로 남아 있다. 이와 같은 약제 내성에 대한 분자측면의 기반을 설명하려는 실질적인 노력의 결과로 다양한 기전, 예컨대 약물 유출, 표적의 약제 결합-결핍 변이체의 획득, 선택적 생존 경로들의 교합 및 후성적 변경이 밝혀졌다. 이와 같은 기전들은 일반적으로 약물 치료 중 선택된, 종양 세포 군집 내 희귀한, 확률적, 내성-전달 유전적 변경의 존재를 반영하는 것으로 여겨진다. Sharma 등, Cel1141(1):69-80 (2010) 참조. 암 치료 중 점점 더 많이 관찰되는 현상은 소위 "재치료 반응(re-treatment response)"이다. 예를 들어, EGFR(상피 성장 인자 수용체) 타이로신 키나아제 억제제(TKIs)를 이용한 치료에 잘 반응했으나, 이후 치료에 실패를 경험하는 일부 소세포 폐암(NSCLC) 환자는 "약물 휴가(drug holiday)" 이후 EGFR TKI 재치료에 두 번째 반응을 나타낸다. Kurata 등, Ann. Oncol. 15:173-174 (2004); Yano 등, Oncol. Res. 15:107-111 (2005) 참조. 이와 유사한 재치료 반응들이 여러 기타 암 치료제제에 대해 적절히 확립되어 있다. Cara and Tannock, Ann. Oncol. 12:23-27 (2001) 참조. 이와 같은 결과들은 항암제에 대한 후척적 내성이 가역적인 약제 내성" 상태를 수반할 수 있음을 시사하고, 이것의 기전적 기반이 여전히 확립되어 있다.
일부 특이적 내성을 제공하는 돌연변이가 실제로 후천적 약제 내성을 나타내는 많은 환자들에서 확인된 바 있는데, 약제 내성에 대한 돌연변이 및 비돌연변이 기전의 상대적 기여 및 종양 세포 하위군집의 역할은 여전히 명확하지 않다. 새로운 치료법들은 암 세포 군집 내 이종성(heterogeneity) 및 약물 치료에 대한 암 세포의 내성의 등장을 성공적으로 해결해야 할 필요가 있다.
요약
본원에서 암을 치료하고 및/또는 개인에서 약제 내성을 예방하기 위해, KDM5의 길항제를 사용하는 방법이 제시된다. 예를 들어, 한 개인에서 암을 치료하는 방법은 상기 개인에게 KDM5의 길항제를 단독으로 투여하거나 또는 암 치료제제와 병행하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 개인은 암 치료제제를 사용한 치료(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선 치료)를 위해 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 개인은 암 치료제제를 사용한 치료에 앞서, KDM5의 길항제를 투여하는 것을 포함하는 치료를 시작한다. 일부 구현예에서, 상기 개인은 동시에 KDM5의 길항제와 암 치료제제를 포함하는 치료를 받는다. 일부 구현예에서, KDM5의 길항제는 암 민감성의 기간을 증가시키고 및/또는 암 내성의 발생을 지연시킨다.
또 다른 측면에서, KDM5의 길항제와 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선 치료)를 사용하는 병용 치료가 본원에 제시된다.
특히, 개인에게 (a) KDM5의 길항제 및 (b) 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)를 투여하는 것을 포함하는, 개인에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제시된다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제 각각의 양은 암 민감성의 기간을 증가시키고 및/또는 암 치료제제에 대한 암 세포 내성의 발생을 지연시키는 데 효과적이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제 각각의 양은 상기 암 치료제제를 포함하는 암 치료의 효능을 증대시키는 데 효과적이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, KDM5의 길항제 및 암 치료제제 각각의 양은 KDM5의 길항제 없이 (부재 하에) 상기 암 치료제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 치료(예컨대, 치료기준 치료)와 비교하여, 효능을 증가시키는 데 효과적이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제의 각각의 양은 KDM5의 길항제 없이 (부재 하에) 암 치료제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 치료(예컨대, 치료기준 치료와 비교하여, 반응(예컨대, 완전 반응)을 증대시키는 데 효과적이다.
또한 (a) KDM5의 길항제의 유효량 및 (b) 암 치료제제의 유효량을 상기 개인에게 투여하는 것을 포함하는 암 치료의 효능을 증가시키는 방법들이 본원에 제시된다.
개인에서 암을 치료하는 방법들이 본원에 제시되는데, 여기서 암 치료는 (a) KDM5의 길항제의 유효량 및 (b) 암 치료제제의 유효량을 상기 개인에게 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 암 치료가 KDM5의 길항제 없이 (부재 하에) 암 치료제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 치료(예컨대, 기준 치료 치료법)와 비교하여, 효능을 증대시켰다.
뿐만 아니라, 개인에서 암 치료제제에 대한 암 내성의 발생을 지연시키고 및/또는 예방하는 방법들이 본원에 제시되는데, 여기에 (a) KDM5의 길항제의 유효량 및 (b) 상기 암 치료제제의 유효량을 상기 개인에게 투여하는 것이 포함된다.
암 치료제제에 대한 내성을 발생시킬 가능성이 높은 암 환자 개인을 치료하는 방법들이 본원에 제시되는데, 여기에 (a) KDM5의 길항제의 유효량 및 (b) 암 치료제제의 유효량을 상기 개인에게 투여하는 것이 포함된다.
암 환자 개인에게 암 치료제제에 대한 민감성을 증대시키는 방법들이 본원에 추가로 제시되는데, 여기에 (a) KDM5의 길항제의 유효량 및 (b) 암 치료제제의 유효량을 개인에게 투여하는 것이 포함된다.
또한 암 환자인 개인에서 암 치료제제에 대한 민감성 기간을 연장시키는 방법들이 본원에 제시되는데, 여기에 (a) KDM5의 길항제의 유효량 및 (b) 암 치료제제의 유효량을 상기 개인에게 투여하는 것이 포함된다.
암 환자 개인에서 암 치료제제에 대한 반응의 기간을 연장시키기 위한 방법들이 본원에 제시되는데, 여기에 (a) KDM5의 길항제의 유효량 및 (b) 암 치료제제의 유효량을 상기 개인에게 투여하는 것이 포함된다.
상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 암 치료제제는 표적 치료제다. 일부 구현예에서, 상기 표적 치료제는 EGFR 길항제, RAF 억제제, 및/또는 PI3K 억제제 중 하나 이상이다.
상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 표적 치료제는 EGFR 길항제이다. 상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 EGFR 길항제는 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민 및/또는 이것의 약제학적으로 허용가능한 염이다. 일부 구현예에서, 상기 EGFR 길항제는 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민이다. 일부 구현예에서, 상기 EGFR 길항제는 N-(4-(3-플루오로벤질옥시)-3-클로로페닐)-6-(5-((2-(메틸술포닐)에틸아미노)메틸)퓨란-2-일)퀴나졸린-4-아민,디4-메틸벤젠술포네이트 또는 이것의 약제학적으로 허용가능한 염(예컨대, 라파티닙)이다.
상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 표적 치료제는 RAF 억제제이다. 일부 구현예에서, 상기 RAF 억제제는 BRAF 억제제이다. 일부 구현예에서, 상기 RAF 억제제는 CRAF 억제제이다. 일부 구현예에서, 상기 BRAF 억제제는 베무라페닙이다. 일부 구현예에서, 상기 RAF 억제제는 3-(2-시아노프로판-2-일)-N-(4-메틸-3-(3-메틸-4-옥소-3,4-디히드로퀴나졸린-6-일아미노)페닐)벤즈아미드 또는 이것의 약제학적으로 허용가능한 염(예컨대, AZ628 (CAS# 878739-O6-1))이다.
상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 표적 치료제는 PI3K 억제제이다.
상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 암 치료제제는 화학치료제다. 상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 화학치료제는 탁산(taxane)이다. 일부 구현예에서, 상기 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 구현예에서, 상기 탁산은 도세탁셀이다.
상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 화학치료제는 백금 제제이다. 일부 구현예에서, 상기 백금 제제는 카보플라틴이다. 일부 구현예에서, 상기 백금 제제는 시스플라틴이다. 상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 화학치료제는 탁산 및 백금 제제이다. 일부 구현예에서, 상기 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 구현예에서, 상기 탁산은 도세탁셀이다. 일부 구현예에서, 상기 백금 제제는 카보플라틴이다. 일부 구현예에서, 상기 백금 제제는 시스플라틴이다.
상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 화학치료제는 빈카 알킬로이드이다. 일부 구현예에서, 상기 빈카 알킬로이드는 비노렐빈이다. 상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 화학치료제는 뉴클레오시드 유사체이다. 일부 구현예에서, 상기 뉴클레오시드 유사체는 젬시타빈이다.
상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 암 치료제제는 방사선요법이다.
상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, KDM5의 길항제는 KDM5 소분자 길항제이다.
일부 구현예에서 실행하는 데 유용할 수 있는 KDM5의 소분자 길항제의 예에는 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물, 이들의 이성질체 또는 이들의 이성질체들의 혼합물 또는 이들의 약제학적으로 약제학적으로 허용가능한 염, 용매 화합물 또는 프로드럭이 포함된다. 이와 같은 화합물들 및 이왕 같은 화합물을 제조하는 데 유용한 공정 및 중간물질들이 WO 2012/007007 및 WO 2012/007008에 기술되어 있다.
Figure pct00001
화학식 (I)
여기서 X1은 -A-B를 나타내는데,
이 때 A는 하나의 결합, O, S 또는 NH 결합을 나타내고,
B는
● C1-6-알킬, C2-4-알케닐 또는 C2-4-알키닐
여기서 C1-6-알킬, C2-4-알케닐 또는 C2-4-알키닐은 히드록시, C3-6-시클로알킬, C1-4-알콕시, 히드록시-C1-4-알콕시, 할로, 트리플루오로메틸, -NH2, 메틸아미노, 디메틸아미노, 술파모일, 디메틸술파모일, 메틸술포닐, 메틸술포닐옥소, 메틸술피닐, 메틸술파닐, 시아노, -(C=O)R', 페닐 기 및 1환 또는 2환 이종고리 작용기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있고,
여기서 R'는 히드록시, C1-4-알킬, 할로-C1-4-알킬, C1-4-알콕시, -NH2, 메틸 디메틸아미노, 페닐 기 또는 1환 또는 2환 이종고리 작용기를 나타내고; 그리고
여기서 상기 페닐 기는 메틸, 트리플루오로메틸, 할로, 시아노, 아세트아미노, 메틸술포닐아미노, 및 1환 또는 2환 이종고리 작용기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;
● -OH 또는 -(C=O)R"
여기서 R"는 수소, 히드록시, C1-4-알킬, 시클로프로필, 할로-C1-4-알킬, C1-4-알콕시, -COOH, -NH2, 메틸아미노, 디메틸아미노, 메틸술포닐, 또는 1환 또는 2환 이종고리 작용기를 나타내거나; 또는
여기서 R"는 C1-4-알킬, C1-4-알콕시, 옥시, 카바모일, 아민 또는 1환 또는 2환 이종고리 작용기(히드록시, 메틸, 에틸, -O-C1-6-알킬, 히드록시메틸, 히드록시메틸, 메톡시에틸, 아세틸, 시아노, 에톡시카보닐, 디메틸아미노, N- [3(디메틸아미노)프로필]N'에틸카바미미도일, 메틸술피닐, 메틸술파닐, 메틸술포닐, 메톡시에톡시에틸, (디메틸아미노)에틸 및 메틸술파닐에틸로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환됨)를 나타내고, 여기서 -O-C1-6-알킬은 히드록시, 메톡시 또는 디메틸아미노로 임의로 치환될 수 있고;
● -(C=S)R'"
여기서 R'"은 -NH2, 메틸아미노 또는 디메틸아미노를 나타내고;
● -C(CH3)=N-R""
여기서 R""는 히드록시 또는 메톡시를 나타내고;
● 술파모일, 디메틸술파모일, 술피닐 또는 술포닐,
여기서 술파모일, 술포닐 또는 술포닐은 C1-4-알킬, 할로-C1-4-알킬, 메톡시-C1-4-알킬, 디메틸아미노, (디메틸아미노)메틸, (디메틸아미노)에틸, C3-6-시클로알킬, C2-4-알케닐 및 1환 또는 2환 이종고리 작용기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
● 플루오로, 클로로, 브로모 또는 시아노; 또는
● 1환 또는 2환 이종고리 작용기
여기서 상기 1환 또는 2환 이종고리 작용기는 C1-2-알킬, 할로, 할로-C1-2-알킬, C1-4-알콕시, C1-4-알콕시카보닐, COOH, 시아노, -NH2, 메틸아미노 및 디메틸아미노로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있고; 그리고
X2은
● C1-18-알킬, C2-18-알케닐, 또는 C2-18-알키닐
여기서 C1-18-알킬, C2-18-알케닐, C2-18-알키닐은 C3-6-시클로알킬, 히드록시, 할로, 트리플루오로메틸, C1-6-알콕시, 히드록시-C1-6-알콕시, C1-6-알킬 -C1-6-알콕시, 트리플루오로메틸-C1-6-알콕시, 옥소-C1-6-알킬, -NH2, 디메틸아미노, 시아노, 페닐, 5원자 1환 이종고리 작용기, 또는 6원자 1환 이종고리 작용기(페닐, 5원자 1환 이종고리 작용기, 또는 6원자 1환 이종고리 작용기는 C1-6-알킬 또는 할로로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있고; 또는
● -O-Xa, -(C=O)-O-Xb, -(C=O)-Xc, -NXd1Xd2, -(CO)-NXE1XE2, 또는 -(C=O)-NH-SO2-Xf, 여기서 Xa, Xb, Xc, Xd1, Xd2, Xe1, Xe2 또는 Xf 각각은 독립적으로 수소, C1-18-알킬, C2-18-알케닐, C2-18-알키닐, C3-6-시클로알킬, 페닐, 5원자 1환 이종고리 작용기 또는 6원자 1환 이종고리 작용기를 나타내는데;
C1-18-알킬, C2-18-알케닐, C2-18-알키닐, C3-6-시클로알킬, 페닐, 5원자 1환 이종고리 작용기 또는 6원자 1환 이종고리 작용기는 C3-6-시클로알킬, 히드록시, 할로, 트리플루오로메틸, C1-4-알킬, C1-6-알콕시, C1-6-알콕시카보닐, C1-4-알킬아미노, 히드록시-C1-6-알콕시, C1-6-알킬-C1-6-알콕시, 트리플루오로- C1-6-알콕시, 트리플루오로메틸-O-C1-6-알킬, 옥소-C1-6-알킬, -NH2, 메틸아미노, 디메틸아미노, (메톡시에틸)(메틸) 아미노, [(디메틸아미노)에틸](메틸)아미노, 시아노, -O-C1-6-알킬-페닐, 페닐, 5원자 1환 이종고리 작용기 또는 6원자 1환 이종고리 작용기상기 페닐, 5원자 1환 이종고리 작용기 또는 6원자 1환 이종고리 작용기는 C1-6-알킬, -(C=O)-O-C1-6-알킬 또는 할로로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있고; 또는
여기서 Xe1 및 Xe2 각각은 독립적으로 수소, 히드록시, C1-18-알킬, C2-18-알케닐, C2-18-알키닐, C3 -6-시클로알킬, -O-C1-6-알킬, 페닐, 5원자 1환 이종고리 작용기 또는 6원자 1환 이종고리 작용기를 나타내고,
상기 -O-C1-6-알킬은 히드록시, 메톡시 또는 디메틸아미노로 임의로 치환될 수 있고; 단, 어떤 구현예에서는 Xe1 및 Xe2이 둘 다 수소를 나타낼 수 없고; 어떤 구현예에서는 Xb가 수소를 나타낼 수 없고; 또는
● -(C=O)-O-CH2-CH2-NXjlXj2, -S-Xk, -(C=S)-N(CH3)-Xm 또는 -(C=S)-N-Xn
여기서 Xj1, Xj2, Xk, Xm, Xn 각각은 독립적으로 메틸, 에틸, 프로필, 아미노, 메틸아미노 또는 디메틸아미노상기 메틸, 에틸 또는 프로필은 메톡시카보닐, 디메틸아미노, 카바모일, 페닐, 시아노페닐 및 5원자 또는 6원자 1환 이종고리 작용기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있고를 나타내고; 그리고
X3은 수소, C1-4-알킬, C2-4-알케닐, C2-4-알키닐 또는
● -O-Xg -S-Xh 또는 -NXi1Xi2 (여기서 X9g, Xh, Xi1 및 Xi2는 서로 독립적으로 수소, -(CH2)n-CH3, 또는 -(CH2)n-COOH를 나타내고, n는 0, 1, 2, 3 또는 4임)를 나타냄); 그리고
X4 및 X5는 독립적으로,
● 수소, C1-4-알킬, 할로-C1-4-알킬, C3-6-시클로알킬, 할로, 니트로, -NH2 또는 시아노를 나타낸다.
Figure pct00002
화학식(II)
여기서
X1은 -A-B를 나타내는데,
이때 A는 하나의 결합, O, S 또는 NH 결합을 나타내고,
B는
● C1-6-알킬, C2-4-알케닐, C2-4-알키닐 또는 C3-5-시클로알킬,
여기서 C1-6-알킬, C2-4-알케닐, C2-4-알키닐 또는 C3-5-시클로알킬은 히드록시, C3-6-시클로알킬, C1-4-알콕시, 히드록시-C1-4-알콕시, -NH2, 메틸아미노, 디메틸아미노, 술파모일, 디메틸술파모일, 메틸술포닐, 메틸술포닐옥소, 시아노, -(C=O)R', 페닐 기 및 1환 또는 2환 이종고리 작용기를 나타내고,
상기 R'는 히드록시, C1-4-알킬, 할로겐-C1-4-알킬, C1-4-알콕시, -NH2, 메틸아미노, 시클로프로필, 디메틸아미노, 페닐 기 또는 1환 또는 2환 이종고리 작용기를 나타내고;
상기 페닐 기는 메틸, 트리플루오로메틸, 할로겐, 시아노, 아세트아미노, 메틸술포닐아미노 및 1환 또는 2환 이종고리 작용기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고; 또는
● -OH (단, 어떤 구현예에서 A가 하나의 결합일 경우, B만 -OH를 나타내고;
● 또는 -(C=O)R"
상기 R"는 히드록시, 할로겐-C1-4-알킬, C1-4-알콕시, 히드록시-C1-4-알콕시, -NH2, C1-3-알킬-아미노, 디-C1-3-알킬-아미노, 메틸술포닐, 1환 또는 2환 이종고리 작용기, C3-4-시클로알킬 또는 C1-4-알킬을 나타내고, 상기 C3-4-시클로알킬 또는 C1-4 알킬은 임의로 히드록시, C3-6-시클로알킬, C1-3-알콕시, 히드록시-C1-3-알콕시, -NH2, 메틸아미노, 디메틸아미노, 6 원소 이종고리 환, 술파모일, 디메틸술파모일, 메틸술포닐, 메틸술포닐옥소, 시아노, -(C=O)R', 할로-페닐 기, 및 1환 또는 2환 이종고리 작용기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고, 상기 R'는 앞서 확인되 바와 같고;
● -(C=O)NH-R'"
여기서 R'"은 히드록시에틸, 메톡시에틸, 디메틸아미노에틸, 메탄 술포닐 또는 디메틸아미노로 임의로 치환된 -O-C1-6-알킬을 나타내고;
● 술파모일, 술피닐, 술파닐 또는 술포닐
상기 술파모일은 C1-3-알킬 기 하나 또는 둘로 임의로 치환될 수 있고, 상기 술피닐, 술파닐 또는 술포닐은 임의로 C1-4-알킬, 할로겐-C1-4-알킬, 카보닐-C1-3-알킬, 메틸술파모일, C3-6-시클로알킬, C1-3-알킬-아미노, 디-C1-3-알킬-아미노, 디메틸아미노에틸, 6 원자 이종고리 환, 및 1환 또는 2환 이종고리 작용기로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
● 페닐, 1환 또는 2환 이종고리 작용기
상기 페닐, 1환 또는 2환 이종고리 작용기는 할로겐, 할로겐-C1-3-알킬, C1-3-알콕시, C1-3-알콕시알콕시, C1-3-알콕시카보닐, COOH, 시아노, -NH2, 메틸아미노, 디메틸아미노, 시클로프로필 및 C1-3알킬로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있고, 상기 시클로프로필 또는 C1-3 알킬은 히드록시, 시클로프로필, C1-3-알콕시, 히드록시-C1-3-알콕시, -NH2, 메틸아미노, 디메틸아미노, 6 원자 이종고리 환, 술파모일, 디메틸술파모일, 메틸술포닐, 메틸술포닐옥소, 시아노, -(C=O)R', 할로겐-페닐 기 및 1환 또는 2환 이종고리 작용기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있고, 상기 R'은 앞서 확인된 바와 같고; 그리고
X2는
● -COOH, (C=O)NH2 또는 -CN; 및
X3은
● 수소 또는 -OH; 또는
● -Y-Xa-Xb
상기 Y는 O, C=O 또는 하나의 결합이고;
Xa는 -하나의 결합, C1-18-알킬, C2-18-알케닐, C2-18-알키닐, C3-10-시클로알킬, -C1-18-알킬O-, -O- 또는 -NXb-(단, 어떤 구현예에서는 Y가 O이고 Xa가 0이 아닌 경우에 한 함)이고; 각 Xb는 개별적으로 -H, C3-6-시클로알킬, C1-6 알콕시, 페닐, 페녹시, 5원자 1환 이종고리 작용기, 6원자 1환 이종고리 작용기 또는 2환 이종방향족 기이고; 상기 C3-10-시클로알킬, C1-6 알콕시, 페닐, 페녹시, 5원자 1환 이종고리 작용기, 6원자 1환 이종고리 작용기 또는 2환 이종방향족 기는 할로겐, 할로겐-C1-4-알킬, 히드록시 선형 또는 분지형 C1-4-알콕시, C1-6-알콕시알콕시, C1-4-알콕시카보닐, C1-4-알킬카보닐, COOH, 시아노, -NH2, 메틸아미노, 디메틸아미노, 히드록시 및 선형 또는 분지형 C1-5 알킬로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있고, 여기서 상기 C1-5 알킬은 히드록시, C3-6-시클로알킬, C1-4-알콕시, 히드록시-C1-4-알콕시, -NH2, 메틸아미노, 디메틸아미노, 6 원자 이종고리 환, 술파모일, 디메틸술파모일, 메틸술포닐, 메틸술포닐옥소, 시아노, -(C=O)R', 할로겐-페닐 기, 및 1환 또는 2환 이종고리 작용기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있고, 상기 R'는 앞서 정의된 바와 같고; 그리고
X4 및 X5는 각자가 독립적으로
● 수소, C1-4-알킬, 할로겐-C1-4-알킬, C3-6-시클로알킬, 할로겐, 니트로, -NH2, 메톡시카보닐, 아세틸, 메톡시카바모일 또는 시아노를 나타낸다.
상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 부수적으로 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, KDM5의 길항제는 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법) 이전 및/또는 동시에 투여된다.
상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 암은 폐암, 유방암, 췌장암, 대장암, 및/또는 흑색종이다. 일부 구현예에서, 상기 암은 폐암이다. 일부 구현예에서, 상기 폐암은 NSCLC이다. 일부 구현예에서, 상기 암은 유방암이다. 일부 구현예에서, 상기 암은 흑색종이다.
도면의 간단한 설명
도 1 (A) 히스톤 3 (H3) 꼬리 및 번역후 변형의 아미노산 위치의 도식. KDM5는 H3의 라이신 4에서 트리- 및 디- 메틸 마크를 제거할 수 있는 메틸기분해효소이다. (B) KDM5는 또한 JARID1로도 알려져 있다. 인간의 메틸기분해효소의 상기 KDM5/JARID1 계열은 4가지 구성원 KDM5A, KDM5B, KDM5C 및 KDM5D를 함유한다. 상기 도식에 나타낸 바와 같음. KDM5 계열 구성원은 5개 보존적 도메인: JmjN, ARID, JmjC, PHD 및 C5HC2 아연 핑거를 함유한다.
도 2 (A) KDM5A 및 KDM5B는 둘 다, 모체 PC9 세포와 달리, 인간 비-소세포-폐암 세포주 PC9 약제 내성 지속생존체(persisters)(DTPs)에서 발현이 증가된다. (B) KDM5A mRNA의 상대적 발현 수치는 나이브 폐 선암종 환자와 비교하여, 신규보조제 폐 선암종 환자 샘플에서 높다. (C) 웨스턴 블롯에 의해 나타난 바와 같이 H3K4 me3 및 H3K4 me2는, PC9 모체 세포와 비교하여, PC9 DTP에서 감소된다. (D) H3K4 me3는 MSD ELISA에 의해 나타낸 바와 같이, PC9 모체 세포와 비교하여 PC9 DTP에서 감소된다.
도 3 (A) KDM5A 메틸기분해효소-촉매 사멸 변이체(서열식별번호: 1의 넘버링을 기반으로 하는 H483A)의 도식. (B) 3'-UTR-GFP 녹다운(knockdown)을 갖는 KDM5A 짧은 헤어핀의 발현은 PC9 약제 내성 세포를 제거한다(데이터 표시하지 않음). 3'-UTR-GFP 녹다운을 갖는 KDM5A 쇼트헤어핀에 의한 PC9 약제 내성 세포의 제거는 KDM5A 야생형-FLAG(태깅됨)의 공동 발현에 의해 구제될 수 있다. (C) 그러나 KDM5A 메틸기분해효소-촉매차원에서 불활성인 변이체는 3'-UTR-GFP 녹다운을 가진 KDM5A 짧은 헤어핀에 의한 PC9 약제 내성 세포의 제거를 구제할 수 없다. 이는 DM5A 메틸기분해효소 활성이 약제-내성을 성립시키기 위해 요구됨을 시사한다. 본 실험에서, 약제-내성 세포는 야생형 KDM5a가 존재하지 않는 한, 내인성 유전자의 녹다운을 잃는다.
도 4 (A) KDM5 도구 화합물들 및 상대적 KDM5A IC50, KDM2/3 IC50, H3K4 me3　EC50, MDCK 세포에서 측정된 상기 화합물들의 세포 투과성(A:B, 정점 대 측면) 및 상기 화합물들의 특정된 인간 혈장 단백질 결합의 표. (B) CPI-550 또는 CPI-766로 배양된 PC9 세포의 웨스턴블롯. CPI-766은 H3K4의 메틸기 분해반응을 억제하고, H3K4 me3의 축적이 관찰된다. (C) MSD ELISA로 측정된 CPI-550의 CPI-766의 다양한 농도에서의 H3K4 me3/H3의 그래프 재현.
도 5 질량스펙트럼을 통한, KDM5A 억제제 CPI-766 또는 불활성 대조군 CPI-550(불활성)으로 처리된 PC9 세포에서의 H3 K4 마트의 비교. (A) CPI-550 및 CPI-766로 처리된 세포들에서 변형되지 않은, 모노메틸레이티드, 디메틸레이티드, 트리메틸레이티드, 및 아세틸레이티드 H3K4의 몰 분획(상대적 존재비). (B) CPI-766 처리 대 CPI-550 처리에서, 변형되지 않은, 모노메틸레이티드, 디메틸레이티드, 트리메틸레이티드 및 아세틸레이티드 H3K4의 피크 면적의 Log2 비율(0은 변화없음을, +1은 2배 즉가를 나타내고.
도 6 KDM5의 길항제, CPI-455 및 PCI-766은 MSD ELISA에 의해 수회 테스트된 모형 (A) PC9, (B) SKBR3, (C) H441 및 (D) H596)에서 H3K4me3　을 증가시킨다.
도 7 활성 KDM5i는 단독으로 PC9 세포(A)에서 50 uM 미만의 농도로, 그리고 SKBR3(B)에서 25 uM 미만의 농도로, 약물에 96시간 있은 후 측정되는 세포 수에 실질적인 영향을 미치지 않는다. 그러나 이들 농도의 실질적인 차이들은 약제에 있은 지 30일 되는 때조차 관찰되지 않았다(데이터 표시되지 않음).
도 8 소분자 KDM5 억제제들을 결합하는 것은 약제 내성을 방해한다. (A 1-2) PC9 세포가 1uM 타르세바에 상기 세포들을 플레이팅하기 전 5일 동안 25uM의 활성 KDM5 화합물 또는 불활성 대조군으로 배양되었다. 타르세바 처리 30일 후, 플레이트를 염색하였다. 여러 다른 모형에서도 이와 유사한 실험들이 수행되었다. 예를 들어, 다양한 약제를 사용한 SKBR3(B1-3 및 C1-2), HCC1954, H441. 모든 경우에, 상기 KDM5 억제제는 모체 군집의 증식 또는 생존에 아무런 효과가 없었다.
도 9 서로 다른 특이적 siRNAs를 사용하여, 탁산, 파클리탁셀로 처리된 H1299에서 KDM5A의 siRNA 녹다운의 효과(Dharmacon siGenome (x4)). 배지 및 파클리탁셀 조건에서의 Z 스코어가 X축 및 Y축에 각각 제시된다. KDM5A 녹다운 데이터는 이와 유사한 처리 조건에서 기타 염색질 변형 유전자(Epi300 라이브러리 siRNA), 비-표적 (NTC) 및 siTOX 대조군에 대한 데이터와 함께 제시된다.
도 10 H441 DTP의 KDM5 및 H3K4Me3 수치의 조율. (A-B) 화학치료제-처리된 H441 세포에서 H3K4me3 (A) 감소, 그리고 KDM5A 및 KDM5B (B) 수치의 증가를 나타내는 웨스턴 블롯. (C-D) H441 세포는 카보플라틴 (5.38㎛) + 파클리탁셀 (1.25㎛)의 5주기로 처리하기 전 3일 동안 25uM의 활성 또는 불활성 KDM5 화합물과 함께 플레이팅되었다. 활성 KDM5 화합물로의 처리가 DTP를 훼손시켰다.
도 11 (A-B) 5일 동안 CPI-766 KDM5 억제제로 전처리한 결과, 방사선 내성 PC9 세포의 수가 감소되었다. (C) 활성 KDM5 억제제 CPI-445 및 CPI-766으로 5일 동안 PC9 세포를 전처리한 결과, 불활성 대조군과 비교하여, γ-방사선 치료 후 세포의 수가 감소되었다.
도 12 DTP 개발을 위한 발생을 위한 흑색종 암 세포 모형 파악. (A) 선택된 Colo-829 세포들에서 베무라페닙의 GI50를 결정하기 위한 약제 용량 반응 실험. 8개의 서로 다른 용량의 베무라페닙으로의 4일간 배양 후, 세포 적가 Glo 판독기를 사용하여 세포 생존력 분석이 수행되었다. (B) 베무라페닙 (ii)로의 11일 간의 처리 후, DTP와 비교하여, Colo-829 대조군 세포들 (i)을 나타내는 현미경사진.
도 13 반 고속대량 포맷으로 colo-829 흑색종 세포주에서 DTP 분석을 수행하기 위한 분석법 개발. (A) 핵에서 red-형광 마커(Nuc-Red)를 본질적으로 발현하는 세포에서, 인큐사이트 줌(Incucyte Zoom)에서 획득한 현미경사진. 핵 마커의 존재 때문에, 상기 데이터가 실험 과정 내내 실시간으로 획득되었다. 6, 12 및 24웰 포맷으로, 각각 양성 대조군 세포(i, iii 및 v) 및 DTP(ii, iv 및 vi)가 나타난다. (B) 6, 12 및 24웰 포맷으로, 각각 20㎛ 베무라페닙-처리된 Colo-829 세포에서의 DTP의 성립을 보여주는 선 그래프. (C) 실험 완료 시 DMSO 및 억제제-처리 웰에서의 Nuc-Red 양성 세포의 개수를 보여주는 막대 그래프. (D) 6, 12 및 24-웰 분석 플레이트에서 획득된 DTP의 개수를 비교하는막대 그래프. 6 및 12-웰 포맷은 매우 비교되어서, 12-웰 플레이트를 선택하였다.
도 14 KDM5 억제제는 DTP 형성을 억제한다. (A) 베무라페닙 첨가 전 5일 동안 KDM5 활성 (CPI-766) 또는 불활성 (CPI-550) 억제제 각각 25㎛로 Colo-829 세포를 전처리할 경우 DTP 형성의 차이를 보이는 실험의 완전한 기간에 걸친 미처리 데이터를 나타내는 그래프. 상기 데이터를 실험 과정 내내 실시간으로 획득하였다. (B)세포가, CPI-550 또는 DMSO 대조군과 비교할 때, CPI-766으로 전처리된 경우, 형성된 DTP의 개수의 급격한 감소를 묘사하는 상기 언급된 데이터의 히스토그램 플롯. (C) CPI-550 및 DMSO 대조군과 비교하여, CPI-766으로의 처리 시 형성되는 DTP의 개수의 감소를 보여주는 히스토그램.
도 15 용량 의존성 DTP 감소의 존재 여부를 판단하기 위해, 서로 다른 용량의 CPI-766 및 CPI-550의 존재 하에 DTP 분석. (A) 다양한 용량의 CPI-766 및 CPI-550으로의 전처리 후, 형성되는 DTP의 개수의 용량-의존적 감소를 보여주는 히스토그램.
도 16 결합 소분자 KDM5 억제제가 약제 내성을 망가뜨린다. nuc-RED PC9 세포를 1uM 타르세바에 플레이팅하기 전 5일 동안 다양한 농도의 활성 KDM5 화합물CPI-382(B) 또는 불활성 대조군 CPI-383(A)으로 배양하였다. 타르세바 처리하고 30일 후, 플레이트를 염색하였다.
도 17 도 17(A 및 B)은 KDM5 억제제가 대장암 세포주의 약제 내성을 차단함을 묘사하는 결과를 제공한다.
상세한 설명
I. 정의
관심대상인 폴리펩티드의 "길항제" ("억제제"와 상호교환하여 사용될 수 있고는 관심대상인 폴리펩티드의 활성 또는 기능을 방해하는 제제로, 예컨대, 관심대상의 폴리펩티드에 의해 실현되는 생물학적 활성을 부분적으로 또는 전적으로 차단, 억제 또는 중화한다. 예를 들어, 폴리펩티드 X의 길항제는 폴리펩티드 X에 의해 실현되는 생물학적 활성을 부분적으로 또는 전적으로 차단, 억제 또는 중화하는 모든 분자를 가리킬 수 있다. 억제제의 예에는 항체; 리간드 항체; 소분자 길항제; 안티센스 및 억제 RNA (예컨대, shRNA) 분자가 포함된다. 바람직하게는, 상기 억제제는 관심대상의 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 소분자이다. 특정 구현예에서, 억제제는 관심대상의 폴리펩티드에 대한 약 1,000nM 이하의 결합 친화도(해리 상수)를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 억제제는 관심대상의 폴리펩티드에 대한 약 100nM 이하의 결합 친화도를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 억제제는 관심대상의 폴리펩티드에 대해 약 50nM 이하의 결합 친화도를 갖는다. 특정 구현예에서, 억제제는 관심대상의 폴리펩티드에 공유결합된다. 특정 구현예에서, 억제제는 1,000nM 이하의 IC50를 갖는 관심대상의 폴리펩티드의 신호전달을 억제한다. 또 다른 구현예에서, 억제제는 500nM 이하의 IC50를 갖는 관심대상의 폴리펩티드의 신호 전달을 억제한다. 또 다른 구현예에서, 억제제는 50nM 이하의 IC50를 갖는 관심대상의 폴리펩티드의 신호 전달을 억제한다. 어떤 구현예에서, 상기 길항제는 최소한 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상, 관심대상의 폴리펩티드의 발현 수치 또는 생물학적 활성을 감소 또는 억제한다. 일부 구현예에서, 상기 관심대상의 폴리펩티드는 KDM5이다.
본원에 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 달리 명시되지 않는 한, 모든 척추동물, 예컨대 포유류, 예를 들어 유인원(예컨대, 인간) 및 설치류(예컨대, 마우스 및 래트)에서 유래된 관심대상의 모든 천연 폴리펩티드를 가리킨다. 상기 용어는 "전장(full-1ength)" 미처리 폴리펩티드뿐만 아니라 모든 형태의 상기 세포에서 처리된 결과인 모든 형태의 폴리펩티드를 아우른다. 상기 용어는 또한 폴리펩티드의 천연 발생 변종, 예컨대, 스플라이스 변종 또는 대립형질 변종을 아우른다.
본원에서 상호 교환하여 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 모든 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 가리키고, DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합분해효소에 의해, 또는 합성 반응에 의해 하나의 중하바체로 편입될 수 있는 모든 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸레이티드 뉴클레오티드 및 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조의 변형은, 존재할 경우, 상기 중합체의 조합 전 또는 후에 이루어질 수도 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분들에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성 후, 예를 들어 하나의 표지자(label)과의 접합(컨쥬게이션)에 의해 추가로 변형될 수 있다. 기타 유형의 변형에는 예를 들어, "캡", 유사체에 의한 하나 이상의 자연발생 뉴클레오티드의 치환, 예를 들어, 비전하 연결(예컨대, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등)을 갖는 것들 및 전하 연결(예컨대, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것, 예를 들어, 단백질(예컨대, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, ply-L-라이신 등)와 같은 펜던트 모이어티를 함유하는 것들, 삽입제(예컨대, 아크리딘, 프소랄렌 등)를 갖는 것들, 킬레이트제(예컨대, 금속, 방사선 금속, 보론, 산화성 금속 등)을 함유하는 것들, 알킬레이터를 함유하는 것들, 변형된 연결(예컨대, 알파 아노머 핵산 등)을 갖는 것들과 같은 뉴클레오티드 내부 변형뿐만 아니라, 폴리뉴클레오티드(들)의 비변형된 형태들이 포함된다. 추가로, 일반적으로 당에 존재하는 모든 히드록시 기는, 예를 들어, 포스포네이트기, 인산기에 의해 대체되거나, 표준 보호 기에 의해 보호되거나, 또는 활성화되어 추가적 뉴클레오티드에 대한 추가적 연결을 준비할 수 있고, 또는 고체 또는 반고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나 아민 또는 1-20개의 탄소 원자로 이루어진 유기 캡핑 작용기 모이어티로 치환될 수 있다. 기타 히드록시기 역시 표준 보호 작용기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 당해 기술에 잘 알려진, 리보제 또는 데옥시리보제 당의 유사체 형태들, 예를 들어, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보제, 탄소환 당 유사체, a-아노머 당, 아라비노오스, 자일로오스 또는 라이속세스와 같은 에피머성 당, 피라노오스 당, 푸라노오스 당, 세도헵툴로오스, 비고리형 유사체 및 비염기성 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드를 함유한다. 하나 이상의 포스포디에스터 연결은 대안적인 연결 작용기에 의해 대체될 수 있다. 이들 대안적 연결 작용기들은, 비제한적으로, 인산이 P(O)S("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), "(O)NR2　("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2("포름아세탈")로 대체된 구현예들을 포함하고, 여기서 각 R 또는 R' 각각은 독립적으로 H 또는, 에테르 (-O-) 연결, 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아랄딜을 임의로 함유하는 치환된 또는 미치환된 알킬(1-20 C)이다. 폴리뉴클레오티드의 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 앞선 설명은 RNA 및 DNA를 비롯하여, 앞서 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 해당된다.
용어 "소분자"는 약 2000 달턴 이하, 바람직하게는 약 500 달턴 이하의 분자량을 갖는 모든 분자를 가리킨다.
어떤 구현예의 실행에 유용하게 쓰일 수 있는 KDM5의 소분자 길항제의 예에는 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물들, 이들의 이성질체 또는 이들의 이성질체들의 혼합물 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매 화합물 또는 프로드럭이 포함된다. 이와 같은 화합물, 그리고 이와 같은 화합물들을 제조하는 데 유용한 공정 및 중간물질들이 WO 2012/007007 및 WO 2012/007008에 기술되었다.
Figure pct00003
화학식 (I)
여기서 X1은 -A-B를 나타내고,
A는 하나의 결합, O, S 또는 NH을 나타내고,
B는
● C1-6-알킬, C2-4-알케닐 또는 C2-4-알키닐
C1-6-알킬, C2-4-알케닐 또는 C2-4-알키닐은 히드록시, C3-6-시클로알킬, C1-4-알콕시, 히드록시-C1-4-알콕시, 할로, 트리플루오로메틸, -NH2, 메틸아미노, 디메틸아미노, 술파모일, 디메틸술파모일, 메틸술포닐, 메틸술포닐옥소, 메틸술피닐, 메틸술파닐, 시아노, -(C=O)R', 페닐 기 및 1환 또는 2환 이종고리 작용기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있고,
여기서 R'는 히드록시, C1-4-알킬, 할로-C1-4-알킬, C1-4-알콕시, -NH2, 메틸 디메틸아미노, 페닐 기 또는 1환 또는 2환 이종고리 작용기를 나타내고;
상기 페닐기는 메틸, 트리플루오로메틸, 할로, 시아노, 아세트아미노, 메틸술포닐아미노, 및 1환 또는 2환 이종고리 작용기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;
● -OH 또는 -(C=O)R"
여기서 R"는 수소, 히드록시, C1-4-알킬, 시클로프로필, 할로-C1-4-알킬, C1-4-알콕시, -COOH, -NH2, 메틸아미노, 디메틸아미노, 메틸술포닐, 또는 1환 또는 2환 이종고리 작용기를 나타내거나; 또는
R"는 C1-4-알킬, C1-4-알콕시, 옥시, 카바모일, 아민 또는 1환 또는 2환 이종고리 작용기(히드록시, 메틸, 에틸, -O-C1-6-알킬, 히드록시메틸, 히드록시메틸, 메톡시에틸, 아세틸, 시아노, 에톡시카보닐, 디메틸아미노, N-[3(디메틸아미노)프로필]N'에틸카바미미도일, 메틸술피닐, 메틸술파닐, 메틸술포닐, 메톡시에톡시에틸, (디메틸아미노 )에틸 및 메틸술파닐에틸여기서 -O-C1-6-알킬은 히드록시, 메톡시 또는 디메틸아미노로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환됨)을 나타내고;
● -(C=S)R'"
여기서 R'" 은 -NH2, 메틸아미노 또는 디메틸아미노를 나타내고;
● -C(CH3)=N-R""
여기서 R"" 는 히드록시 또는 메톡시를 나타내고;
● 술파모일, 디메틸술파모일, 술피닐 또는 술포닐
여기서 술파모일, 술포닐 또는 술포닐은 C1-4-알킬, 할로-C1-4-알킬, 메톡시-C1-4-알킬, 디메틸아미노, (디메틸아미노)메틸, (디메틸아미노)에틸, C3-6-시클로알킬, C2-4-알케닐 및 1환 또는 2환 이종고리 작용기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
● 플루오로, 클로로, 브로모 또는 시아노; 또는
● 1환 또는 2환 이종고리 작용기
여기서 상기 1환 또는 2환 이종고리 작용기 C1-2-알킬, 할로, 할로-C1-2-알킬, C1-4-알콕시, C1-4-알콕시카보닐, COOH, 시아노, -NH2, 메틸아미노 및 디메틸아미노로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있고를 나타내고; 그리고
X2는
● C1-18-알킬, C2-18-알케닐 또는 C2-18-알키닐
여기서 C1-18-알킬, C2-18-알케닐, C2-18-알키닐 C3-6-시클로알킬, 히드록시, 할로, 트리플루오로메틸, C1-6-알콕시, 히드록시-C1-6-알콕시, C1-6-알킬 -C1-6-알콕시, 트리플루오로메틸-C1-6-알콕시, 옥소-C1-6-알킬, -NH2, 디메틸아미노, 시아노, 페닐, 5원자 1환 이종고리 작용기 또는 6원자 1환 이종고리 작용기(페닐, 5원자 1환 이종고리 작용기, 또는 6원자 1환 이종고리 작용기는 C1-6-알킬 또는 할로로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있고; 또는
● -O-Xa, -(C=O)-O-Xb, -(C=O)-Xc, -NXd1Xd2, -(CO)-NXE1XE2, 또는 -(C=O)-NH-SO2-Xf
여기서 Xa, Xb, Xc, Xd1, Xd2, Xe1, Xe2 또는 Xf는 서로 독립적으로 수소, C1-18-알킬, C2-18-알케닐, C2-18-알키닐, C3-6-시클로알킬, 페닐, 5원자 1환 이종고리 작용기 또는 6원자 1환 이종고리 작용기여기서 C1-18-알킬, C2-18-알케닐, C2-18-알키닐, C3-6-시클로알킬, 페닐, 5원자 1환 이종고리 작용기 또는 6원자 1환 이종고리 작용기는 C3-6-시클로알킬, 히드록시, 할로, 트리플루오로메틸, C1-4-알킬, C1-6-알콕시, C1-6-알콕시카보닐, C1-4-알킬아미노, 히드록시-C1-6-알콕시, C1-6-알킬-C1-6-알콕시, 트리플루오로- C1-6-알콕시, 트리플루오로메틸-O-C1-6-알킬, 옥소-C1-6-알킬, -NH2, 메틸아미노, 디메틸아미노, (메톡시에틸)(메틸) 아미노, [(디메틸아미노)에틸](메틸)아미노, 시아노, -O-C1-6-알킬-페닐, 페닐, 5원자 1환 이종고리 작용기 또는 6원자 1환 이종고리 작용기(페닐, 5원자 1환 이종고리 작용기 또는 6원자 1환 이종고리 작용기는 C1-6-알킬, -(C=O)-O-C1-6-알킬 또는 할로로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있고; 또는
여기서 Xe1 및 Xe2는 서로 독립적으로 수소, 히드록시, C1-18-알킬, C2-18-알케닐, C2-18-알키닐, C3-6-시클로알킬, -O-C1-6-알킬, 페닐, 5원자 1환 이종고리 작용기 또는 6원자 1환 이종고리 작용기(-O-C1-6-알킬은 히드록시, 메톡시 또는 디메틸아미노로 임의로 치환될 수 있고를 나타내는데;
단, 어떤 구현예에서는 Xe1 및 Xe2는 둘 다 수소를 나타낼 수 없다는 전제 조건을; 어떤 구현예에서는 Xb가 수소를 나타낼 수 없음을 단서로 함); 또는
● -(C=O)-O-CH2-CH2-NXjlXj2, -S-Xk, -(C=S)-N(CH3)-Xm 또는 -(C=S)-N-Xn
여기서 Xj1, Xj2, Xk, Xm, Xn은 서로 독립적으로 메틸, 에틸, 프로필, 아미노, 메틸아미노 또는 디메틸아미노를 나타내고,
상기 메틸, 에틸 또는 프로필은 메톡시카보닐, 디메틸아미노, 카바모일, 페닐, 시아노페닐 및 5원자 또는 6원자 1환 이종고리 작용기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있고; 그리고
X3은 수소, C1-4-알킬, C2-4-알케닐, C2-4-알키닐 또는
● -O-Xg -S-Xh 또는 -NXi1Xi2
여기서 Xg, Xh, Xi1 및 Xi2는 서로 독립적으로 수소, -(CH2)n-CH3 또는 -(CH2)n-COOH(n은 0, 1, 2, 3 또는 4)를 나타내고, 그리고
X4 및 X5는 서로 독립적으로
● 수소, C1-4-알킬, 할로-C1-4-알킬, C3-6-시클로알킬, 할로, 니트로, -NH2 또는 시아노를 나타낸다.
Figure pct00004
화학식 (II)
여기서 X1은 -A-B를 나타내고,
이 때 A는 하나의 결합, O, S 또는 NH를 나타내고, 그리고 B는
● C1-6-알킬, C2-4-알케닐, C2-4-알키닐 또는 C3-5-시클로알킬
여기서 C1-6-알킬, C2-4-알케닐, C2-4-알키닐 또는 C3-5-시클로알킬은 히드록시, C3-6-시클로알킬, C1-4-알콕시, 히드록시-C1-4-알콕시, -NH2, 메틸아미노, 디메틸아미노, 술파모일, 디메틸술파모일, 메틸술포닐, 메틸술포닐옥소, 시아노, -(C=O)R', 페닐 기 및 1환 또는 2환 이종고리 작용기로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있고,
이때 R'는 히드록시, C1-4-알킬, 할로겐-C1-4-알킬, C1-4-알콕시, -NH2, 메틸아미노, 시클로프로필, 디메틸아미노, 페닐기 또는 1환 또는 2환 이종고리 작용기를 나타내고; 그리고
상기 페닐기는 메틸, 트리플루오로메틸, 할로겐, 시아노, 아세트아미노, 메틸술포닐아미노 및 1환 또는 2환 이종고리 작용기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고; 또는
● -OH, 단, 어떤 구현예에서 A가 하나의 결합일 경우, B만 -OH를 나타내고; 또는
● -(C=O)R"
여기서 R"는 히드록시, 할로겐-C1-4-알킬, C1-4-알콕시, 히드록시-C1-4-알콕시, -NH2, C1-3-알킬-아미노, 디-C1-3 -알킬-아미노, 메틸술포닐, 1환 또는 2환 이종고리 작용기, C3-4-시클로알킬 또는 C1-4-알킬을 나타내고,
상기 C3-4-시클로알킬 또는 C1-4 알킬은 히드록시, C3-6-시클로알킬, C1-3-알콕시, 히드록시-C1-3-알콕시, -NH2, 메틸아미노, 디메틸아미노, 6 원자 이종고리 환, 술파모일, 디메틸술파모일, 메틸술포닐, 메틸술포닐옥소, 시아노, -(C=O)R', 할로-페닐기 및 1환 또는 2환 이종고리 작용기로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고, 상기 R'는 앞서 확인된 바와 같고;
● -(C=O)NH-R'"
여기서 R'" 히드록시에틸, 메톡시에틸, 디메틸아미노에틸, 메탄술포닐, 또는 디메틸아미노로 임의로 치환되는 -O-C1-6-알킬을 나타내고;
● 술파모일, 술피닐, 술파닐 또는 술포닐,
상기 술파모일은 하나 또는 두 개의 C1-3 알킬로 임의로 치환될 수 있고, 그리고 상기 술피닐, 술파닐 또는 술포닐은 C1-4-알킬, 할로겐-C1-4-알킬, 카보닐-C1-3-알킬, 메틸술파모일, C3-6-시클로알킬, C1-3-알킬-아미노, 디-C1-3-알킬-아미노, 디메틸아미노에틸, 6 원자 이종고리 환 및 1환 또는 2환 이종고리 작용기로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
● 페닐, 1환 또는 2환 이종고리 작용기,
상기 페닐, 1환 또는 2환 이종고리 작용기는 할로겐, 할로겐-C1-3-알킬, C1-3-알콕시, C1-3-알콕시알콕시, C1-3-알콕시카보닐, COOH, 시아노, -NH2, 메틸아미노, 디메틸아미노, 시클로프로필 및 C1-3 알킬로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있고, 상기 시클로프로필 또는 C1-3 알킬은 히드록시, 시클로프로필, C1-3-알콕시, 히드록시-C1-3-알콕시, -NH2, 메틸아미노, 디메틸아미노, 6 원자 이종고리 환, 술파모일, 디메틸술파모일, 메틸술포닐, 메틸술포닐옥소, 시아노, -(C=O)R', 할로겐-페닐기 및 1환 또는 2환 이종고리 작용기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있고, 상기 R'는 앞서 확인된 바와 같고; 그리고
X2는
● -COOH, (C=O)NH2　또는 -CN을 나타내고
X3은
● 수소 또는 -OH; 또는
● -Y-Xa-Xb
여기서 Y는 O, C=O 또는 하나의 결합이고;
Xa는 -하나의 결합, C1-18-알킬, C2-18-알케닐, C2-18-알키닐, C3-10-시클로알킬, -C1-18-알킬O-, -O- 또는 -NXb-이고, 단, 어떤 구현예에서는 Y가 O이면, Xa는 0이 아니고; 각각 Xb는 개별적으로 -H, C3-6-시클로알킬, C1-6 알콕시, 페닐, 페녹시, 5원자 1환 이종고리 작용기, 6원자 1환 이종고리 작용기 또는 2환 이종방향족 기이고, 여기서 C3-10-시클로알킬, C1-6 알콕시, 페닐, 페녹시, 5원자 1환 이종고리 작용기, 6원자 1환 이종고리 작용기 또는 2환 이종방향족 기는 할로겐, 할로겐-C1-4-알킬, 히드록시 선형 또는 분지형 C1-4-알콕시, C1-6-알콕시알콕시, C1-4-알콕시카보닐, C1-4-알킬카보닐, COOH, 시아노, -NH2　, 메틸아미노, 디메틸아미노, 히드록시 및 선형 또는 분지형 C1-5-알킬상기 C1-5 알킬은 히드록시, C3-6-시클로알킬, C1-4-알콕시, 히드록시-C1-4-알콕시, -NH2, 메틸아미노, 디메틸아미노, 6 원자 이종고리 환, 술파모일, 디메틸술파모일, 메틸술포닐, 메틸술포닐옥소, 시아노, -(C=O)R', 할로겐-페닐기 및 1환 또는 2환 이종고리 작용기상기 R'는 앞서 정의된 바와 같고로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있음)를 나타내고; 그리고
X4 및 X5는 서로 독립적으로
● 수소, C1-4-알킬, 할로겐-C1-4-알킬, C3-6-시클로알킬, 할로겐, 니트로, -NH2, 메톡시카보닐, 아세틸, 메톡시카바모일 또는 시아노를 나타낸다.
"단리된" 항체는 자연 상태의 성분에서 분리된 것이다. 일부 구현예에서, 항체는 예를 들어, 전기영동법(예컨대, SDS-PAGE, 등정점 전기영동(IEF), 모세 전기영동) 또는 크로마토그래피법(예컨대, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정된 바에 따르면, 95% 또는 99% 이상의 순도로 정제된다. 항체 순도 평가 방법에 대한 내용은 예컨대, Flatman 등, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007) 참조.
본원에서 넓은 의미로 사용되는 용어 "항체"는 비제한적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이성 항체(예컨대, 이중특이성 항체) 및 항체 절편(원하는 항원-결합 활성을 보일 경우)을 비롯하여, 다양한 항체 구조를 아우른다.
관심대상의 폴리펩티드에 대한 항체 및 관심대상의 폴리펩티드에 "결합하는 항체"는 관심대상의 폴리펩티드와 충분한 친화도로 결합하여 상기 항체가 관심대상의 폴리펩티드를 표적으로 할 때 진단 및/또는 치료제제로소 유용하게 쓰일 수 있는 항체를 가리킨다. 하나의 구현예에서, 관심대상의 폴리펩티드에 대한 항체가 관련 없는, 관심대상의 폴리펩티드가 아닌 단백질에 결합하는 정도는, 예컨대, 방사선면역분석(RIA)에 의해 측정된 바에 따르면, 항체가 관심대상의 폴리펩티드에 결합하는 것의 약 10% 에도 못 미친다. 어떤 구현예에서, 관심대상의 폴리펩티드에 결합하는 항체는 ≤ 1㎛, ≤ 100nM, ≤ 10nM, ≤ 1nM, ≤ 0.1nM, ≤ 0.01nM 또는 ≤ 0.001nM의 해리 상수 (Kd)(예컨대, 10-8 M 이하, 예컨대, 10-8 M 내지 10-13　M, 예컨대, 10-9　M 내지 10-13　M)를 갖는다. 어떤 구현예에서는, 관심대상의 폴리펩티드에 대한 항체가 다른 종에서 유래된 관심대상의 폴리펩티드들 중에서 보존된 한 관심대상의 폴리펩티드의 항원결정부에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 관심대상의 폴리펩티드는 KDM5이다.
"차단 항체" 또는 "길항제 항체"는 그것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제 또는 감소시키는 것이다. 바람직한 차단 항체 또는 길항제 항체는 실질적으로 또는 완전하게 상기 항원의 생물학적 활성을 억제한다.
"친화도"는 한 분자(예컨대, 항체)의 단일 결합부위와 이것의 결합 파트너(예컨대, 항원) 사이의 비공유적 상호작용의 총합의 힘을 가리킨다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용되는 "결합 친화도"는 결합쌍(예컨대, 항체 및 항원)의 구성원들 사이의 1 :1 상호작용을 반영한 내재적 결합 친화도를 가리킨다. 분자 X의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)로 표현된다. 친화도는 본원에 기술된 것들을 비롯하여, 당해기술에 알려진 일반적인 방법들에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 구체적인 설명 및 예시적 구현예가 아래 기술되었다.
"항체 절편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부분을 포함하는, 온전한 항체가 아닌 분자를 가리킨다. 항체 절편의 예에는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일사슬 항체 분자(예컨대, scFv); 및 항체 절편에서 형성된 다중특이성 항체가 포함된다.
기준 항체와 동일한 "항원 결정부에 결합하는 항체"는 경쟁 분석에서 항원에 대한 기준 항체의 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 가리키고, 반대로 상기 기준 항체 는 경쟁 분석에서 항원에 대한 상기 항체의 결합을 50% 이상 차단한다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 공급원 또는 종에서 유래된 반면, 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 다른 공급원 또는 종에서 유래된 것인 항체를 가리킨다.
본원에서 상호교환하여 사용되는 용어 "전장 항체", "온전한 항체" 및 "전체 항체"는 본래 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 Fc 영역을 함유한 중쇄를 갖는 항체를 가리킨다.
본원에 사용되는 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 동종 항체들의 군집에서 획득된 항체, 즉 동일하고 및/또는 동일한 항원결정부에 결합하는 상기 군집을 포함하는 항체로, 단예컨대, 자연발생적 돌연변이를 함유하거나 또는 단클론 항체 제제의 생성 중 발생한 가능한 변종 항체 (이와 같은 변종은 일반적으로 적은 양으로 존재함)는 제외된다. 전형적으로 서로 다른 결정인자(항원결정부)에 대항하는 서로 다른 항체들을 포함하는 다클론 항체 제제와는 달리, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대항한다. 따라서, 변경유전자 "단클론"은 실질적으로 동종 항체 군집에서 획득된 것이라고 상기 항체의 속성을 나타내고, 어떤 특정 방법에 의해 상기 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지는 않는다. 예를 들어, 본 발명에 맞춰 사용될 상기 단클론 항체는 비제한적으로 하이브리도마 방법, 재조합DNA 방법, 파지-표시 방법 및 인간 면역글루불린 부위 전부 또는 일부를 함유하는 형질전환된 동물을 활용한 방법들, 단클론 항체를 제조하기 위한 방법들 및 기타 예시적 방법들을 포함한 다양한 기법에 의해 제조될 수 있다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 기타 인간 항체-인코딩 서열들을 활용하는 비-인간 공급원에서 유도된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 이와 같은 인간 항체의 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기들을 포함하는 인간화된 항체는 배제한다.
"인간화된" 항체는 비-인간 HVR의 아미노산 잔기 및 인간 FR의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 가리킨다. 어떤 구현예에서, 인간화된 항체는 실질적으로 최소한 하나, 그리고 전형적으로 두 개의 가변부를 모두 포함할 것이고, 여기서 HVR (예컨대, CDRs) 전부 또는 실질적인 전부는 비-인간 항체의 그것들에 상응하고, FR의 전부 또는 실질적인 전부는 인간 항체의 그것에 상응한다. 인간화된 항체는 임의로 인간 항체에서 유래된 항체 불변부 중 최소한 일부분을 포함할 수 있다. 항체, 예컨대, 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 거친 항체를 가리킨다.
본원에 사용되는 용어 "표적 치료" 는 관심대상의 폴리펩티드(들)에 결합하고, 관심대상의 구체적 폴리펩티드(들)의 활성 및/또는 활성화를 억제하는 치료제제를 가리킨다. 이와 같은 제제의 예에는 항체 및 관심대상의 폴리펩티드에 결합하는 소분자가 포함된다.
"화학치료제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물을 가리킨다. 화학치료제의 예에는 알킬레이팅 제제, 예컨대 티오티페 및 시클로스포스파미드(CYTOXAN®; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 유레도파; 에틸에니민 및 메틸라멜 아민 (알트레트아민, 트리에틸렌멜아민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸로멜아민 포함); 아세토제닌(특히 불라탁신 및 불라탁시논); 델타-9-테트라히드로카나비놀(드로나비놀, MARTNOL®; 베타-라파촌; 라파촐; 콜치신; 베툴린산; 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸(HYCAMTIN®, CPT-11(이리노테칸, CAMPTOSAR®, 아세틸캄프토테신, 스코포렉틴 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(이것의 아도젤레신, 카르젤레신 및 브젤리신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토파이신(특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴; 항생제, 예컨대 에네디아인 항생제(예컨대, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감말 및 칼리케아미신 오메갈(예컨대, Nicolaou 등, Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)참조); CDP323, 경구 알파-4 인테그린 억제제; 다이네미신(다이네미신 A 포함); 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 클로모포르 및 관련 크로모단백질 에네디아인 항생제 크로모포르), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우스라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르레우신, 독소루비신(ADRIAMYCIN® 모 홀리노독소루비신, 시아노모 홀리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 주입 (DOXIL®, 리포솜 독소루비신 TLC D-99 (MYOCET®, 페길화된 리포솜 독소루비신 (CAELYX® 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, ?라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질, 예컨대 메토트렉세이트, 젬시타빈(GEMZAR®, 테가푸르(UFTORAL®, 카페시타빈(XELODA®, 에포틸론, 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 나이트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드, 예컨대 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체(JHS Natural Products, Eugene, OR); 라족산; 라이조신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2'-트리클로로트리에틸아민; 트리클로데센(특히 T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A 및 앙귀딘); 우레탄; 빈데신(ELDISINE®, FILDESIN®; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노시드("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예컨대, 파클리탁셀(TAXOL®, 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형(ABRAXANETM 및 도세탁셀(TAXOTERE®; 클로란부실; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 제제, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴(예컨대, ELOXATIN® 및 카보플라틴; 빙카(튜불린 중합반응이 마이크루튜불을 형성하는 것을 방지함), 예컨대 빈블라스틴(VELBAN®, 빈크리스틴(ONCOVIN®, 빈데신(ELDISINE® FILDESIN® 및 비노렐빈(NAVELBINE®; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 류코보린; 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라아제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로르니틴(DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산 (벡사로텐(TARGRETIN® 포함) ; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트(예를 들어, BONEFOS® 또는 OSTAC®, 에티드로네이트(DIDROCAL®, NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트(ZOMETA®, 알렌드로네이트(FOSAMAX®, 파미드로네이트(AREDIA®, 틸루드로네이트(SKELID® 또는 리제드로네이트(ACTONEL®; 트록사시타빈(1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 사이토신 유사체); 및 상기 중 어떤 것의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 및 유도체; 뿐만 아니라 상기 화합물들 중 둘 이상의 조합물, 예컨대 CHOP(시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 병용 요법); 및 FOLFOX(5-FU 및 류코보린과 병합된 옥살리플라틴(ELOXATINTM을 이용한 치료 요법)이 포함된다.
본원에 사용되는 용어 "세포독성 제제 "는 세포 기능을 억제 또는 방지하고 및/또는 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 가리킨다. 상기 용어는 방사선동위원소(예컨대, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사선 동위원소), 화학치료제제 또는 약제(예컨대, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빙카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 삽입성 제제(intercalating agents)), 성장 억제 제제, 효소 및 이것의 절편(예컨대 핵산분해 효소), 항생제 및 독소(예컨대, 소분자 독소 또는 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소)(이들의 절편 및/또는 변종 포함) 및 아래 개시된 다양한 항종양 또는 항암 제제들을 포함하는 것으로 여겨진다. 기타 세포독성 제제가 아래 기술되었다. 종양파괴성 제제는 종양 세포의 파괴를 유발한다.
"면역접합"은 비제한적으로 세포독성 제제를 비롯하여, 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
"개별 반응" 또는 "반응"은 상기 개인이 받는 혜택, 예컨대 비제한적으로 (1) 질병의 진행(예컨대, 암 진행)의 어느 정도의 억제, 예를 들면 둔화 및 완전한 저지; (2) 종양 크기의 감소; (3) 이웃한 주변 기관 및/또는 조직으로의 암 세포 침투의 억제(즉, 감소, 둔화 또는 완전한 정지); (4) 전이의 억제(즉, 감소, 둔화 또는 완전한 정지); (5) 상기 질병 또는 장애(예컨대, 암)와 관련된 하나 이상의 증상의, 어느 정도의 완화; (6) 진행 없는 생존 기간의 증가; 및/또는 (7) 치료 후 어느 시점에서 사망률의 감소를 나타내는 모든 종점을 사용하여 평가될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "실질적으로 동일한"은 2개의 숫자값 사이의 충분히 높은 유사도를 의미함으로, 당해기술의 숙련가는 두 값의 차이가 상기 값들(예컨대, Kd 값 또는 발현)에 의해 측정되는 생물학적 특징이라는 문맥에서, 생물학적 및/또는 통계학적으로 전혀 유의미하지 않은 것이라고 이해할 것이다. 상기 두 값들의 차이는, 기준값/비교값의 함수로, 예를 들어, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만 및/또는 약 10% 미만이다.
본원에 사용되는 구절 "실질적으로 다른"은 두 개의 숫자값 사이의 충분히 높은차이를 의미함으로, 당해기술의 숙련가는 이들 두 값의 차이가 상기 값들(예컨대, Kd 값들)에 의해 측정되는 생물학적 특징이라는 문맥에서 통계학적으로 유의미한 것이라고 이해할 것이다. 상기 두 값 사이의 차이는, 기준/비교 분자에 대한 값의 함수로, 예를 들어 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과, 및/또는 약 50% 초과이다.
물질/분자, 예컨대 약제학적 조성물의 "유효량"은 필요한 시기 동안 필요한 복용으로, 원하는 치료 또는 예방 성과를 달성하기에 효과적인 양을 가리킨다.
물질/분자의 "치료차원의 유효량"은 상기 개인의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 요인들, 그리고 상기 개인에게서 원하는 반응을 이끌어내는 상기 물질/분자의 능력에 따라 달라질 수 있다. 치료차원의 유효량은 또한 상기 물질/분자의 어떤 유해하거나 해로운 효과들이 치료에서의 혜택을 제공하는 효과보다 적을 경우의 양이다. "예방차원의 유효량"은 필요한 복용 및 필요한 시기 동안, 원하는 예방적 성과를 달성하는 데 효과적인 양을 가리킨다. 전형적으로, 그러나 반드시 꼭 그렇지만은 않은데, 예방차원의 용량은 질병 이전 또는 질병의 초기 단계에 개체에 사용되기 때문에, 상기 예방차원의 유효량은 치료차원의 유효량보다 적은 편이다.
용어 "약제학적 제형"은 이 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성을 허용하기 위한 형태를 갖고, 상기 제제가 투여될 개체에 허용가능하지 않게 해로운 부가적 성분들을 함유하지 않은 제제를 가리킨다.
"약제학적으로 허용가능한 운반체"는 활성 성분 이외에, 개체에 해롭지 않은 약제학적 제형 중의 성분을 가리킨다. 약제학적으로 허용가능한 운반체에는 비제한적으로, 완충용액, 부형제, 안정제 또는 보존제가 포함된다.
본원에 사용되는 구절 "약제학적으로 허용가능한 염"은 한 화합물의 약제학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 염을 가리킨다.
본원에 사용되는 용어 "치료 (및 "치료하다" 또는 "치료하는" 과 같은 문법적 변형들)는 치료 받는 중인 개인의 자연적 경과를 변경시키기 위한 시도로 이루어지는 임상적 개입을 가리키고, 이것은 예방을 위해서 또는 임상적 병리의 과정 중에 수행되리 수 있다. 치료의 바람직한 효과에는 비제한적으로, 질병의 발병 또는 재발의 방지, 증상의 완화, 상기 질병의 직간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이의 방지, 질병 진행률의 감소, 질병 상태의 완화 및 차도 또는 개선된 예후가 포함된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체가 질병의 발전을 지연시키고 또는 질병의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
"개인" 또는 "개체"는 포유류이다. 포유류에는 비제한적으로, 가축(예컨대, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 유인원(예컨대, 인간 및, 원숭이와 같은 비-인간 유인원), 토끼 및 설치류(예컨대, 마우스 및 래트)가 포함된다. 어떤 구현예에서, 상기 개인 또는 개체는 인간이다.
용어 "부수적으로"는 둘 이상의 치료제제의 투여를 가리키기 위해 본원에 사용되는데, 이것은 개별 치료 효과가 시간 내에 겹칠 정도로 충분히 가까운 시간적 근접성을 갖고 투여되는 것이다. 이에 따라서, 동시 투여는 하나 이상의 제제(들)의 투여를 중단한 후 하나 이상의 제제(들)의 투여가 이어지는 투여 요법을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 부수적 투여는 순차적으로 및/또는 동시에 투여하는 것이다.
"감소시키다 또는 억제하다"는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 전반적인 감소를 유발하는 능력을 뜻한다. 감소시키다 또는 억제하다는 치료 중인 장애의 증상들, 전이의 존재 또는 크기 또는 1차 종양의 크기와 관련된다.
용어 "포장 삽입물"이 지시사항, 사용법, 복용량, 투여방법, 병용 요법, 사용금지사유 및/또는 이와 같은 치료용 제품의 사용과 관련된 경고문을 함유하는, 치료용 제품의 상업적 포장에 관례적으로 포함되는 지시사항들을 가리키기 위해 사용된다.
"제조 물품"은 모든 제조품(예컨대, 포장 또는 용기) 또는 최소한 하나의 시약을 포함하는 키트, 예컨대, 질병 또는 장애(예컨대, 암)의 치료를 위한 약제, 또는 본원에 기술된 생물학적 표지를 특이적으로 검출하기 위한 프로브를 가리킨다. 어떤 구현예에서, 상기 제조품 또는 키트는 본원에 기술된 방법을 수행하기 위한 단위로서 판촉, 배급 또는 판매된다.
당해기술의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 본원의 값 또는 변수 앞에 "약"이라는 표현은 그 자체로 상기 값 또는 변수에 대한 구현예들을 포함(및 기술)한다. 예를 들어, "약 X"를 가리키는 설명은 "X"의 설명을 포함한다.
본원에 기술된 본원의 측면 및 구현예들은 측면들 및 구현예들로 "구성되거나" 및/또는 "반드시 구성된다". 본원에 사용되는 단수 명사는, 달리 명시되지 않는 한, 복수 참조어 역시 포함한다.
II. 방법 및 사용
본원에 예를 들어, 암을 치료하고 및/또는 약제 내성을 방지하기 위해 (예컨대, 단일 제제 및/또는 병용 요법으로) KDM5의 길항제를 사용하는 방법이 제시된다. 예를 들어, 개인에서 암을 치료하기 위한 방법은 상기 개인에게 KDM5의 길항제를 단독으로 또는 암 치료제제와 병용하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 개인은 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선치료)로의 치료를 위해 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 개인은 상기 암 치료제제로의 치료 이전에 KDM5의 길항제를 투여하는 것을 포함하는 치료를 시작한다. 일부 구현예에서, 상기 개인은 동시에 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제를 포함하는 치료를 받는다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 암 민감성의 기간을 증가시키고 및/또는 암 내성의 발전을 지연시킨다. 일부 구현예에서, KDM5의 길항제는 KDM5A, KMD5B, KDM5C, 및/또는 KDM5D 중 하나 이상의 길항제이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A 및/또는 KDM5B의 길항제이다.
또한 본원에 KDM5의 길항제 및 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)를 활용하는 방법들이 제공된다.
특히, 본원에는 개인에서 암을 치료하기 위한 방법이 제공되고, 여기에는 상기 개인에 (a) KDM5의 길항제와 (b) 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)를 투여하는 것이 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제의 각 양은 암 민감성의 기간을 증가시키고 및/또는 암 치료제제에 대한 세포 내성의 발전을 지연시키는 데 효과적이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제의 각 양은 암 치료제제를 포함하는 암 치료의 효능을 증가시키는 데 효과적이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제의 각 양은 상기 KDM5의 길항제 없이(부재 하에) 암 치료제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 치료(예컨대, 기준치료 치료)와 비교하여, 효능을 증가시키는 데 효과적이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제의 각 양은 KDM5의 길항제 없이(부재 하에) 암 치료제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 치료(예컨대, 기준치료 치료)와 비교하여, 반응(예컨대, 완전한 반응)을 증가시키는 데 효과적이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제는 부수적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 암 치료제제는 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 치료제 및/또는 화학치료제는 EGFR 길항제, RAF 억제제, PI3K 억제제, 탁산, 및 백금 제제 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) EGFR 길항제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) RAF 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) PI3K 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) 탁산(예컨대, 파클리탁셀)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) 백금 제제(예컨대, 카보플라틴 또는 시스플라틴)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제, (b) 탁산 (예컨대, 파클리탁셀) 및 (c) 백금 제제(예컨대, 카보플라틴 또는 시스플라틴)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A, KMD5B, KDM5C, 및/또는 KDM5D의 하나 이상의 길항제이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A 및/또는 KDM5B의 길항제이다.
본원에 한 개인에서 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)를 포함하는 암 치료의 효능을 증대시키는 방법이 추가로 제공되는데, 여기서 상기 개인에게 (a) KDM5의 길항제의 유효량 및 (b) 암 치료제제의 유효량을 투여하는 것이 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제가 부수적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 암 치료제제는 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 치료제 및/또는 화학치료제는 EGFR 길항제, RAF 억제제, PI3K 억제제, 탁산 및 백금 제제 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) EGFR 길항제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) RAF 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) PI3K 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) 탁산(예컨대, 파클리탁셀)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) 백금 제제(예컨대, 카보플라틴 또는 시스플라틴)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제, (b)탁산(예컨대, 파클리탁셀) 및 (c) 백금 제제(예컨대, 카보플라틴 또는 시스플라틴)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A, KMD5B, KDM5C, 및/또는 KDM5D 중 하나 이상의 길항제이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A 및/또는 KDM5B의 길항제이다.
본원에 개인에서 암을 치료하는 방법이 제공되는데, 상기 암 치료는 개인에게 (a) KDM5의 길항제의 유효량 및 (b) 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)의 유효량을 투여하는 것을 포함하고, 상기 암 치료는 KDM5의 길항제 없이(부재 하에) 암 치료제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 치료(예컨대, 기준치료 치료)와 비교하여, 증가된 효능을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제는 부수적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 암 치료제제는 표적 치료제, 화학치료제 및/또는 방사선요법이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 치료제 및/또는 화학치료제는 EGFR 길항제, RAF 억제제, PI3K 억제제, 탁산 및 백금 제제 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) EGFR 길항제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) RAF 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) PI3K 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) 탁산(예컨대, 파클리탁셀)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) 백금 제제(예컨대, 카보플라틴 또는 시스플라틴)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제, (b) 탁산(예컨대, 파클리탁셀) 및 (c) 백금 제제(예컨대, 카보플라틴 또는 시스플라틴)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A, KMD5B, KDM5C, 및/또는 KDM5D 중 하나 이상의 길항제이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A 및/또는 KDM5B의 길항제이다.
또한, 본원에 개인에서 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)에 대한 암 내성의 발생을 지연시키고 및/또는 방지하는 방법이 제공되는데, 여기에는 상기 개인에 (a) KDM5의 길항제의 유효량 및 (b) 상기 암 치료제제의 유효량을 투여하는 것이 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제는 부수적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 암 치료제제는 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 치료제 및/또는 화학치료제는 EGFR 길항제, RAF 억제제, PI3K 억제제, 탁산 및 백금 제제 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) EGFR 길항제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) RAF 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) PI3K 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) 탁산(예컨대, 파클리탁셀)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) 백금 제제(예컨대, 카보플라틴 또는 시스플라틴)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제, (b) 탁산(예컨대, 파클리탁셀) 및 (c) 백금 제제(예컨대, 카보플라틴 또는 시스플라틴)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A, KMD5B, KDM5C, 및/또는 KDM5D 중 하나 이상의 길항제이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A 및/또는 KDM5B의 길항제이다.
본원에 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)에 대한 내성을 발생시킬 가능성이 높은 암을 앓는 개인을 치료하는 방법들이 제공되는데, 여기서 상기 개인에게 (a) KDM5의 길항제의 유효량 및 (b) 상기 암 치료제제의 유효량을 투여하는 것이 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제는 부수적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 암 치료제제는 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 치료제 및/또는 화학치료제는 EGFR 길항제, RAF 억제제, PI3K 억제제, 탁산 및 백금 제제 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) EGFR 길항제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) RAF 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) PI3K 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) 탁산(예컨대, 파클리탁셀)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) 백금 제제(예컨대, 카보플라틴 또는 시스플라틴)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제, (b) 탁산(예컨대, 파클리탁셀) 및 (c) 백금 제제(예컨대, 카보플라틴 또는 시스플라틴)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A, KMD5B, KDM5C, 및/또는 KDM5D 중 하나 이상의 길항제이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A 및/또는 KDM5B의 길항제이다.
추가로 본원에 암을 앓는 개인에서 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)에 대한 민감성을 증대시키는 방법들이 제공되는데, 여기에 상기 개인에 (a) KDM5의 길항제 유효량 및 (b) 상기 암 치료제제의 유효량을 투여하는 것이 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제는 부수적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 암 치료제제는 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 치료제 및/또는 화학치료제는 EGFR 길항제, RAF 억제제, PI3K 억제제, 탁산 및 백금 제제 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) EGFR 길항제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) RAF 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) PI3K 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) 탁산(예컨대, 파클리탁셀)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) 백금 제제(예컨대, 카보플라틴 또는 시스플라틴)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제, (b) 탁산(예컨대, 파클리탁셀) 및 (c) 백금 제제(예컨대, 카보플라틴 또는 시스플라틴)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A, KMD5B, KDM5C, 및/또는 KDM5D 중 하나 이상의 길항제이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A 및/또는 KDM5B의 길항제이다.
또한, 본원에 암을 앓는 개인에서 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법) 민감성의 기간을 연장하는 방법들이 제공되는데, 여기에 상기 개인에 (a) KDM5의 길항제의 유효량 및 (b) 상기 암 치료제제의 유효량을 투여하는 것이 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제는 부수적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 암 치료제제는 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 치료제 및/또는 화학치료제는 EGFR 길항제, RAF 억제제, PI3K 억제제, 탁산 및 백금 제제 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) EGFR 길항제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) RAF 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) PI3K 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) 탁산(예컨대, 파클리탁셀)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) 백금 제제(예컨대, 카보플라틴 또는 시스플라틴)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제, (b) 탁산(예컨대, 파클리탁셀) 및 (c) 백금 제제(예컨대, 카보플라틴 또는 시스플라틴)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A, KMD5B, KDM5C, 및/또는 KDM5D 중 하나 이상의 길항제이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A 및/또는 KDM5B의 길항제이다.
본원에 또한 암을 앓는 개인에서 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)에 대한 반응 기간을 연장하는 방법들이 제공되는데, 여기에 상기 개인에 (a) KDM5의 길항제의 유효량 및 (b) 상기 암 치료제제의 유효량을 투여하는 것이 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제가 부수적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 암 치료제제는 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 치료제 및/또는 화학치료제는 EGFR 길항제, RAF 억제제, PI3K 억제제, 탁산 및 백금 제제 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) EGFR 길항제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) RAF 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) PI3K 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) 탁산(예컨대, 파클리탁셀)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) 백금 제제(예컨대, 카보플라틴 또는 시스플라틴)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제, (b) 탁산(예컨대, 파클리탁셀) 및 (c) 백금 제제(예컨대, 카보플라틴 또는 시스플라틴)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 탁산이 파클리탁셀이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A, KMD5B, KDM5C, 및/또는 KDM5D 중 하나 이상의 길항제이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A 및/또는 KDM5B의 길항제이다.
암에 개선된 치료법을 제공하는 것뿐만 아니라, 본원에 기술된 어떤 조합의 투여는 다른 치료를 받는 동일한 환자가 경험하는 삶의 질과 비교하여, 환자의 삶의 질을 개선할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, KDM5의 길항제와 상기 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)의 조합을 개인에게 투여하는 것은, 암 환자가 요법으로서 암 치료제제만을 투여받은 경우 경험하게 되는 삶의 질과 비교하여, 개선된 삶의 질을 제공할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 조합을 사용한 병용 요법은 필요한 암 치료제제의 용량을 낮출 수 있고, 그럼으로써 상기 치료제와 관련된 부작용(예컨대 어지러움, 구토, 머리 빠짐, 발진, 식욕 감퇴, 체중 감량 등)을 줄일 수 있다. 상기 조합은 또한 종양 부담 및 관련 부작용, 예컨대 통증, 기관 부전, 체중 감량을 감소시킬 수 있다. 따라서, 한 측면은 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)으로 암에 대해 치료를 받은 환자의 삶의 질을 개선하기 위한, 치료용 KDM5의 길항제를 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제는 부수적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 암 치료제제는 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법. 일부 구현예에서, 상기 표적 치료제 및/또는 화학치료제는 EGFR 길항제, RAF 억제제, PI3K 억제제, 탁산 및 백금 제제 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) EGFR 길항제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) RAF 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) PI3K 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) 탁산(예컨대, 파클리탁셀)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) 백금 제제(예컨대, 카보플라틴 또는 시스플라틴)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제, (b) 탁산(예컨대, 파클리탁셀) 및 (c) 백금 제제(예컨대, 카보플라틴 또는 시스플라틴)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A, KMD5B, KDM5C, 및/또는 KDM5D 중 하나 이상의 길항제이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A 및/또는 KDM5B의 길항제이다.
상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 천연 또는 합성 기원의 것이다. 상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 항체, 결합 폴리펩티드, 결합 소분자, 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A, KDM5B, KDM5C, 및/또는 KDM5D 중 하나 이상에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A, KDM5B, KDM5C 및/또는 KDM5D 중 하나 이상에 결합하고 및/또는 그들의 메틸기분해효소 활성을 억제한다. 일부 구현예에서, KDM5는 KDM5A 및/또는 KDM5B이다.
상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 암 치료제제는 표적 치료제이다. 상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 암 치료제제는 화학치료제이다. 상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 암 치료제제는 방사선요법이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 치료에 내성을 갖는 암에는 상기 치료에 반응성이 없고 및/또는 상기 치료에 대한 유의미한 반응(예컨대, 부분 반응 및/또는 완전 반응)을 생성하는 능력을 감소시키는 암이 포함된다. 내성은 치료법의 사용 과정에 발생하는 후천적 내성일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 후천적 약제 내성은 일시적 및/또는 가역적 약제 내성일 수 있다. 치료에 대한 일시적 및/또는 가역적 약제 내성은 상기 치료법의 휴식기 후 상기 치료에 대한 민감성을 획복할 수 있는 약제 내성을 포함한다. 일부 구현예에서, 후천적 내성은 영구적 내성이다. 치료에 대한 영구적 내성은 유전적 변화를 부여하는 약물 내성을 포함한다.
본원에서 사용되는 치료에 민감성을 갖는 암은 반응성이 있고 및/또는 유의미한 반응(예컨대, 부분 반응 및/또는 완전한 반응)을 생성할 수 있는 암을 포함한다.
치료에 대한 내성의 획득 및/또는 민감성의 유지를 판단 또는 평가하는 방법들이 당해기술에 알려져 있고, 실시예들에 기술되었다. 약제 내성 및/또는 민감성은 (a) KDM5의 길항제의 존재 및/또는 부재 하에 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)에 기준 암 세포 또는 세포 군집을 노출시킴으로써, 및/또는 (b) 예를 들어, 암 세포 성장, 세포 생존력, 수치 및/또는 퍼센트 세포소멸, 히스톤 3 라이신 4(H3K4) 메틸화 상태(예컨대, 모노메틸레이티드, 디메틸레이티드, 및/또는 트리메틸레이티드) 및/또는 반응 중 하나 이상에 대한 분석을 수행함으로써, 판단될 수 있다.
약제 내성 및/또는 민감성은 시간 경과, 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)의 다양한 농도 및/또는 KDM5의 길항제의 양에 따라 측정될 수 있다. 약제 내성 및/또는 민감성은 추가로, 모체 세포, 약제 내성 지속생존능 세포, 및/또는 상기 세포주의 약제 내성 확장된 지속생존체 세포를 포함하는 기준 세포주 (예컨대, PC9 및/또는 H1299)와 비교하여 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 생존력은 CyQuant Direct 세포 증식 분석에 의해 분석될 수 있다. 내성 획득 및/또는 민감성의 유지에서의 변화, 예컨대 약제 내성은 상기 실시예들 및 Sharma 등에 기술된 약제 내성 지속생존체s의 성장을 분석함으로써 평가될 수 있다. 내성의 획득 및/또는 민감성의 유지에서의 변화들, 예컨대 영구적 내성 및/또는 확장된 지속생존체는 하기 실시예 및 Sharma 등에 기술된 약제 내성 확장 지속생존체의 성장을 분석함으로써 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 내성은 IC50의 변화, EC50 또는 약제 내성 지속생존체 및/또는 약제 내성 확장 지속생존체에서 종양 성장의 감소에 의해 표시될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 변화는 50%, 100% 및/또는 200% 중 어떤 것보다 크다. 또한, 내성 획득 및/또는 민감성의 유지에서의 변화는 체내에서, 예를 들어 치료에 대한 반응(예컨대, 부분 반응 및 완전 반응), 반응 기간 및/또는 진행 기간을 평가함으로써 평가될 수 있다. 내성 획득 및/또는 민감성의 유지에서의 변화는 개인들의 군집에서 치료에 대한 반응(예컨대, 수많은 부분 반응들 및 완전 반응들) 반응 기간 및/또는 진행 기간의 변화에 기초할 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 암은 고체 종양 암이다. 일부 구현예에서, 상기 암은 폐암, 유방암, 대장암, 결장 암, 흑색종, 및/또는 췌장암이다. 일부 구현예에서, 상기 암은 폐암(예컨대, 소세포 폐암(NSCLC))이다. 일부 구현예에서, 상기 암은 유방암이다. 일부 구현예에서, 상기 암은 CD133 양성이다. 일부 구현예에서, 상기 암은 CD24 양성이다. 일부 구현예에서, 상기 암은 낮은 수치의 H3K4 트리메틸화를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 암은 낮은 수치의 H3K4 디메틸화를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 암은 H3K4 트리메틸화의 수치가 점차 감소할 위험이 있다. 일부 구현예에서, 상기 암은 H3K4 디메틸화의 수치가 점차 감소할 위험이 있다.
상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)를 포함하는 치료 방법을 시작할 때 본원에 기술된 병용요법 방법들 중 하나에서의 암은 상기 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)만을 포함하는 치료 방법에 민감할 수 있다(민감함의 예에는 비제한적으로, 반응성이 있거나 및/또는 유의미한 반응(예컨대, 부분 반응 및/또는 완전 반응)을 생성할 수 있음이 포함됨). 상기 KDM5의 길항제및 상기 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)를 포함하는 치료 방법을 시작할 때 본원에 기술된 병용 요법 방법들 중 하나에서의 암은 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)만을 포함하는 치료 방법에 내성을 갖지 않을 수 있다(내성의 예에는, 비제한적으로, 반응성이 없음 및/또는 감소된 능력 및/또는 유의미한 반응(예컨대, 부분 반응 및/또는 완전 반응)을 생성할 수 없음이 포함됨).
상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 구현예들 중 하나에 따른 상기 개인은 인간일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 부수적으로 시행될 수 있다. 상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 병용 요법들은 병합 투여(둘 이상의 치료제제가 동일한 제제 또는 별도의 제제에 포함됨) 및 별도 투여를 아우를 수 있고, 어떤 경우이든지, 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)의 투여는 부가적 치료제제 및/또는 보조제의 투여 전, 동시에, 순차적으로, 함께 및/또는 이후에 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 상기 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법) 이전에 및/또는 이것과 함께 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 방사선 요법 및/또는 부가적 치료제제를 추가로 포함한다.
상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)은 모든 적절한 수단에 의해 투여될 수 있는데, 예를 들어, 경구, 비경구, 폐내 및 비강내, 그리고 국소 치료가 바람직한 경우, 내부병변 투여가 포함된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 약물 투여는 모든 적절한 경로, 예컨대, 부분적으로 상기 투여가 잠시 또는 만성인지에 따라, 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 이루어질 수 있다. 다양한 약물 투여 스케줄, 예컨대 비제한적으로 1회 또는 다양한 시점에 걸친 수회 투여, 볼루스 투여 및 맥박 주입이 본원에서 고려된다.
상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 본원에 기술된 KDM5의 길항제(예컨대, 항체, 결합 폴리펩티드, 및/또는 결합 소분자) 및 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법) 적절한 의료관행에 따른 방식으로, 제형화되고, 용량화되어 투여될 수 있다. 이와 같은 상황에서 고려애햐 할 요인들에는 치료 중인 특정 질환, 치료 중인 특정 포유류, 상기 개인 환자의 임상적 상황, 상기 질환의 원인, 상기 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정 및 의료 집행자들에게 알려진 기타 요인들이 포함된다. 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)는 문제의 질환을 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제들과 함께 임의로 제형화된다. 이와 같이 다른 제제들의 유효량은 상기 제형에 존재하는 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)의 양, 질환 또는 치료의 유형 및 앞서 논의된 기타 요인들에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 동일한 용량으로, 본원에 기술된 투여 경로로, 또는 본원에 기술된 용량의 약 1 내지 99%로, 또는 어떤 용량으로든, 그리고 경험적/임상점으로 적절하다고 판단되는 모든 경로로 사용된다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 본원에 기술된 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)의 적절한 용량(단독으로 사용되거나 또는 하나 이상의 기타 부가적 치료제제들과 병용하여 사용되거나)은 치료 받을 질병의 유형, 상기 질병의 중증도 및 경과, 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)가 예방차원 또는 치료차원으로 투여되는지 여부, 이전 요법, 환자의 임상 경력 및 상기 KDM5의 길항제 및 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법) 에 대한 반응 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)은 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐, 상기 환자에 적절히 투여된다. 수일에 걸친 반복적 투여의 경우, 상태에 따라, 상기 치료는 일반적으로 원하는 질병증상의 억제가 나타날 때까지 지속될 것이다. 이와 같은 복용은 간헐적으로, 예컨대, 매주 또는 3주마다(그럼으로써 예컨대, 상기 환자가 약 두 번 내지 약 스무번, 또는 예컨대 약 여섯 번, 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)의 투여를 받는다) 투여될 수 있다. 한 차례 이상 적은 용량의 투여 후, 최초의 더 높은 수준의 용량이 투여될 수 있다. 예시적인 용량투여요법이 투여를 포함한다. 그러나, 다른 용량 요법이 유용할 수 있다. 이와 같은 요법의 진행은 종래의 기법 및 분석법에 의해 쉽게 모니터링된다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) EGFR 길항제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) RAF 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) PI3K 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) 탁산(예컨대, 파클리탁셀)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제 및 (b) 백금 제제(예컨대, 카보플라틴 또는 시스플라틴)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 (a) KDM5의 길항제, (b) 탁산(예컨대, 파클리탁셀) 및 (c) 백금 제제(예컨대, 카보플라틴 또는 시스플라틴)을 포함한다.
상기의 제형 또는 치료 방법들 모두 상기 KDM5 및/또는 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)로서 면역접합을 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
III. 치료용 조성물
본원에 기술된 방법들에서 사용할 KDM5의 길항제 및 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)를 포함하는 조합들이 본원에 제공된다. 어떤 구현예에서, 상기 조합은 상기 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)만 투여될 때보다 상기 효능을 증가시킨다. 어떤 구현예에서, 상기 조합은 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)에 대한 암 내성의 발생을 지연 및/또는 방지한다. 어떤 구현예에서, 상기 조합은 암을 앓는 개인에서 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법) 민감성의 기간을 연장한다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제(예컨대, EGFR 길항제, PI3K 길항제, 및/또는 RAF 억제제) 및/또는 상기 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)는 항체, 결합 폴리펩티드, 결합 소분자 및/또는 폴리뉴클레오티드이다.
인간의 메틸기분해효소의 KDM5/JARID1 계열은 4개 구성원, KDM5A, KDM5B, KDM5C 및 KDM5D를 포함한다. 도 1의 도식에 나타난 바와 같이, KDM5 계열구성원은 5개 보존영역(JmjN, ARID, JmjC, PHD 및 C5HC2 아연 핑거)을 함유한다. KDM5A, KDM5B, KDM5C 및 KDM5D의 아미노산 서열은 당해기술에 알려져 있고, 공개적으로 사용가능하다. 예컨대, UniProtKB/Swiss-Prot 참조 (예컨대, KDM5A(예컨대, P29375-1 및/또는 P29375-2), KDM5B(예컨대, Q9UGL1-1 및/또는 Q9UGL1-2), KDM5C(예컨대, P41229-1, P41229-2, P41229-3 및/또는 P41229-4), 및/또는 KDM5D(예컨대, Q9BY66-1, Q9BY66-2, 및/또는 Q9BY66-3). 상기 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A, KDM5B, KDM5C 및 KDM5D 중 하나 이상의 길항제이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 pan-KDM5 억제제이다(예컨대, KDM5A, KDM5B, KDM5C 및 KDM5D를 억제한다). 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM 억제제(예컨대, KDM5(예컨대, KDM5A, KDM5B, KDM5C 및/또는 KDM5D 중 하나 이상) 및 또 다른 KDM(예컨대, KDM1, KDM2, KDM3, KDM4, KDM6, KDM7 및/또는 KDM8 중 하나 이상을 억제함)이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A 및/또는 KDM5B의 길항제이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A 및 KDM5B의 이중 길항제이다. 상기 KDM5의 길항제의 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 특이적 KDM5 길항제로, 예를 들어, KDM5A에 특이적 길항제, KDM5B에 특이적 길항제, 및/또는 KDM5A 및 KDM5B에 특이적 이중 길항제이다.
상기 KDM5의 길항제의 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 4㎛, 2㎛, 1㎛, 500nM, 250nM, 200nM, 150nM, 100nM, 75nM, 50nM 및/또는 30nM 중 어느 하나보다 나은(예컨대, 보다 적은) KDM5A IC50을 갖는다. 한 화합물의 KDM5A IC50의 판단 방법이 당해기술에 알려져 있고, 이것은 전체가 참조로 본원에 편입되어 본원에 기술되었다.
상기 KDM5의 길항제의 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 5㎛, 7.5㎛, 10㎛, 15㎛ 및/또는 20㎛ 중 어느 하나보다 큰 KDM2 및/또는 KDM3 IC50을 갖는다. 한 화합물의 KDM2 및/또는 KDM3 IC50의 판단 방법이 당해기술에 알려져 있고, 본원에 기술되었다. 일부 구현예에서, 상기 KDM2는 KDM2B이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM3은 KDM3B이다.
상기 KDM5의 길항제의 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 25㎛, 15㎛, 10㎛, 7.5㎛, 5㎛, 4㎛, 3.5㎛, 3㎛, 2.5㎛, 2㎛ 및/또는 1㎛ 중 어느 하나보다 나은 (예컨대, 보다 적은) H3K4me3　EC50을 갖는다. 한 화합물의 H3K4me3　EC50의 판단 방법이 당해기술에 알려져 있고(Sayegh 등 JBC Manuscript M112.419861 (2013)(world-wide-webjbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.M112.419861에서 확보 가능) 및 Kristensen 등 FEBS J. 279: 1905-1914 (2012), (이들 전체가 본원에 참조로 편입됨) 참조) 본원에 기술되었다.
상기 KDM5의 길항제의 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 α-케토글루타르산염에 대한 KDM5(예컨대, KDM5A, KDM5B, KDM5C 및/또는 KDM5D)의 결합을 억제한다. 상기 KDM5의 길항제의 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5(예컨대, KDM5A, KDM5B, KDM5C 및/또는 KDM5D)와의 결합을 놓고 α-케토글루타르산염과 경쟁한다. 상기 길항제의 일부 구현예에서, KDM5는 α-케토글루타르산염에 대한 KDM5(예컨대, KDM5A, KDM5B, KDM5C 및/또는 KDM5D)의 결합을 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 중 어느 하나로 및/또는 그보다 크게 억제한다.
KDM5의 길항제와 α-케토글루타르산염의 결합의 억제 및/또는 경쟁을 판단하는 방법이 당해기술에 알려져 있고, 예를 들어, Kruidenier 등 Nature 488:404-408 (16 Aug. 2012), Kristensen 등 FEBS J. 279:1905-1914 (2012) 및 Sayegh 등 JBC Manuscript M112.419861 (2013),(world-wide-web jbc.org/cgi/doi 10.1074/jbc.M112.419861에서 확보가능)(전체가 본원에 참조로 편입됨)에 기술되었다. 예를 들어, 케토글루타르산-α-[1-14C]-소듐염, 알파-케토글루타르산 소듐염, 및 HPLC 정제된 펩티드가 상업적 공급처, 예컨대, Perkin-Elmer (Wellesley MA) 및 Sigma-Aldrich에서 획득될 수 있다. 상기 분석에 사용할 펩티드는 KDM5의 절편일 수 있다. 예를 들어, 상기 분석에 사용할 KDM5 펩티드는 예컨대, 곤충 세포에서 발현되어 정제될 수 있다. 효소 활성이 Kivirikko 및 Myllyla (1982, Methods Enzymol. 82:245-304)에 의해 기술된 분석법을 사용하여 14CO2를 포획함으로써 결정된다. 분석 반응에 50mM HEPES (pH 7.4), 100㎛ α-케토글루타르산 소듐염, 0.30 케토글루타르산-α-[1-14C]-소듐염, 40㎛ FeSO4, 1mM 아스코르베이트, 1541.8 단위/mL 카탈라아제이 함유될 수 있고, 50㎛ 펩티드 기질 및 다양한 농도의 KDM5의 길항제가 함유될 수도 함유되지 않을 수도 있다. 상기 반응은 KDM5 효소의 첨가로 개시된다.
펩티드-의존 퍼센트 회전율이 기질 펩티드의 존재 하의 퍼센트 회전율에서 펩티드의 부재 하의 퍼센트 회전율을 차감함으로써 계산된다. 퍼센트 억제 및 IC50이 소정의 억제제 농도에서 펩티드-의존 퍼센트 회전율을 사용하여 계산된다. 각각의 억제제에 대한 IC50값의 계산이 GraFit 소프트웨어(Erithacus Software Ltd., Surrey UK)를 사용하여 수행된다.
상기 KDM5의 길항제의 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 H3에 대한 KDM5(예컨대, KDM5A, KDM5B, KDM5C 및/또는 KDM5D)의 결합을 억제한다. 상기 KDM5의 길항제의 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5(예컨대, KDM5A, KDM5B, KDM5C 및/또는 KDM5D)와의 결합을 놓고 H3과 경쟁한다. 상기 길항제의 일부 구현예에서, KDM5는 H3에 대한 KDM5(예컨대, KDM5A, KDM5B, KDM5C 및/또는 KDM5D)의 결합을 약 및/또는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 중 어느 하나보다 크게 억제한다. 일부 구현예에서, H3은 H3K4를 포함하는 H3의 폴리펩티드 절편을 포함한다. 일부 구현예에서, H3은 H3K4me3을 포함한다. 일부 구현예에서, H3은 H3K4me2를 포함한다. 일부 구현예에서, H3은 H3K4를 포함하는 H3의 21개 아미노산 폴리펩티드(예를 들어, H2N-ART(KMe3)QTARKSTGGKAPRKQLA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 H3은 H3K4me3[ART-K(Me3)-GTARKSTGGKAPRKQLA-GGK(Biotin)], H3K4me2[ART-K(Me2)-GTARKSTGGKAPRKQLA-GGK(Biotin)], H3K4me1[ART-K(Me1)-QTARKSTGGKAPRKQLA-GGK(Biotin)] 을 포함한다.
KDM5의 길항제 및 H3과 같은 히스톤의 결합의 억제 및/또는 경쟁을 판단하는 방법이 당해기술에 알려져 있고, 예를 들어, Kristensen 등 FEBS J. 279:1905-1914 (2012), Kruidenier 등 Nature 488:404-408 (16 Aug. 2012), 및 Sayegh 등 JBC Manuscript M112.419861 (2013)(world-wide-web jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.M112.419861에서 확보 가능)(이들 전체가 본원에 기준으로 편입됨)에 기술되었다.
상기 KDM5의 길항제의 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 히스톤 3(H3)에 대한 직접 또는 간접, KDM5의 결합(예컨대, 상호작용 및/또는 연합)을 억제한다. 상기 KDM5의 길항제의 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 H3 라이신 4(H3K4)에 대한 직접 또는 간접, KDM5의 결합(예컨대, 상호작용 및/또는 연합)을 억제한다. 상기 KDM5의 길항제의 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 H3K4 트리메틸레이티드 및/또는 디메틸레이티드(H3K4me3　및/또는 H3K4me2)에 대해 직접 또는 간접, KDM5의 결합 (예컨대, 상호작용 및/또는 연합)을 억제한다.
상기 KDM5의 길항제의 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5(예컨대, KDM5A, KDM5B, KDM5C 및/또는 KDM5D)의 메틸기분해효소 촉매 영역과 결합(예컨대, 상호작용 및/또는 연합)한다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5의 JmjC 영역 및/또는 JmjN 영역에 결합(예컨대, 상호작용 및/또는 연합)한다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5A의 길항제이고, KDM5A의 길항제는 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 437-603(JmjC) 및/또는 아미노산 잔기 19-60(JmjN)에 결합(예컨대, 상호작용 및/또는 연합)한다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5A의 길항제는 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 437-603(JmjC)에 결합(예컨대, 상호작용 및/또는 연합)한다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5B의 길항제는 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 483, 486, 및/또는 571에 결합(예컨대, 상호작용 및/또는 연합)한다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5B의 길항제이고, 상기 KDM5B의 길항제는 서열식별번호:2의 아미노산 잔기 453-619(JmjC) 및/또는 아미노산 잔기 32-73(JmjN)에 결합(예컨대, 상호작용 및/또는 연합)한다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5B의 길항제는 서열식별번호:2의 아미노산 잔기 453-619(JmjC)에 결합(예컨대, 상호작용 및/또는 연합)한다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5B의 길항제는 서열식별번호: 2의 아미노산 잔기 499, 502, 및/또는 587에 결합(예컨대, 상호작용 및/또는 연합)한다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5C의 길항제이고, 상기 KDM5C의 길항제는 서열식별번호:3의 아미노산 잔기 468-634(JmjC) 및/또는 아미노산 잔기 14-55(JmjN)에 결합(예컨대, 상호작용 및/또는 연합)한다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5C의 길항제는 서열식별번호:3의 아미노산 잔기 468-634(JmjC)에 결합(예컨대, 상호작용 및/또는 연합)한다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5C의 길항제는 서열식별번호:3의 아미노산 잔기 514, 517, 및/또는 602에 결합(예컨대, 상호작용 및/또는 연합)한다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 KDM5D의 길항제이고, 상기 KDM5D의 길항제는 서열식별번호:4의 아미노산 잔기 458-624(JmjC) 및/또는 아미노산 잔기 14-55(JmjN)에 결합(예컨대, 상호작용 및/또는 연합)한다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5D의 길항제는 서열식별번호:4의 아미노산 잔기 458-624(JmjC)에 결합(예컨대, 상호작용 및/또는 연합)한다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5C의 길항제는 서열식별번호:4의 아미노산 잔기 504, 507, 및/또는 592에 결합(예컨대, 상호작용 및/또는 연합)한다. 상기 KDM5의 길항제 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 메틸기분해효소-촉매 활성을 억제한다.
KDM5의 길항제의 예들이 당해기술에 알려져 있고, 비제한적으로 Sayegh 등 JBC Manuscript M112.419861(2013)(world-wide-web jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.M112.419861에서 확보 가능), Lohse 등, Bioorg. Med. Chem. 19(12):3625-36 (2012), 및 Knstensen 등 FEBS J. 279: 1905-1914 (2012)(이들 전체가 본원에 참조로 편입됨)에 기술되었다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 JmjC 히스톤 메틸기분해효소 억제제로, 비제한적으로 2,4-피리딘디카복실산(2,4-PDCA), 2,4-피리딘-디카복실산, 카테콜, N-페닐-벤즈이소티아졸리논, 및/또는 2-(4-메틸페닐)-1,2-벤즈이소티아졸-3(2H)-온(PBIT)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 하기 화학식의 분자 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
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본원에 기술된 방법들에 유용하게 사용될 수 있는 EGFR 길항제 또한 제공된다. EGFR란 Ullrich 등, Nature (1984) 309:418425에 기술된 수용체 제타이로신 키나아 폴리펩티드 상피 성장 인자 수용체 및 이들의 변종 EGFRvIII을 뜻하고, 대안적으로 Her-1 및 c-erbB 유전자 생성물로 일컬어진다. EGFR의 변종들은 또한 결실, 치환 및 삽입 변종들을 포함하고, 예를 들어 이들은 Lynch 등 (NEJM 2004, 350:2129), Paez 등 (Science 2004, 304:1497), Pao 등 (PNAS 2004, 101 : 13306)에 기술된다. 일부 구현예에서, 상기 EGFR은 야생형 EGFR이고, 이것은 일반적으로 자연발생적 EGFR 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 EGFR 길항제는 항체, 결합 폴리펩티드, 결합 소분자, 및/또는 폴리뉴클레오티드이다.
예시적 EGFR 길항제(항-EGFR 항체)는 인간화된 단클론 항체(니모투주맙(YM Biosciences)), 완전한 인간 ABX-EGF(파니투무맙(Abgenix Inc.)), 그 외 El. 1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6. 3 및 E7.6. 3으로 알려진 온전한 인간 항체들과 같은 항체를 포함하고, 이들은 US 6,235,883; MDX-447 (Medarex Inc)에 기술되었다. 페르투주맙(2C4)은 HER2에 직접 결합하나 HER2-EGFR 이중합체를 방해함으로써, EGFR 신호전달을 억제하는 인간화된 항체이다. EGFR에 결합하는 항체의 다른 예들에는 GA201(RG7160; Roche Glycart AG), MAb 579(ATCC CRL HB 8506), MAb 455(ATCC CRL HB8507), MAb 225(ATCC CRL 8508), MAb 528(ATCC CRL 8509)(미국 특허 No. 4,943, 533, Mendelsohn 등) 및 이들의 변종, 예컨대 키메라화된 225(C225 또는 세툭시맙; ERBUTIX® 및 형태변형된 인간 225(H225)(WO 96/40210 참조, Imclone Systems Inc.); IMC-11F8, 온전한 인간, EGFR-표적 항체(Imclone); 유형 II 변이체 EGFR와 결합하는 항체(미국 특허 No. 5,212,290); 미국 특허 No. 5,891,996에 기술된 바와 같이, EGFR와 결합하는 인간화된 및 키메라 항체 및, EGFR와 결합하는 인간 항체, 예컨대 ABX-EGF(WO98/50433 참조, Abgenix); EMD 55900(Stragliotto 등 Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)); EMD7200(마투주맙), EGFR 결합을 두고 EGF 및 TGF-알파 둘 다와 경쟁하는, EGFR 대항 인간화된 EGFR 항체; 및 mAb 806 또는 인간화된 mAb 806(Johns 등, J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004))가 포함된다. 상기 항-EGFR 항체는 세포독성 제제와 접합되어, 면역접합(예컨대, EP659,439A2 참조, Merck Patent GmbH)을 일으킬 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 항-EGFR 항체는 세툭시맙이다. 일부 구현예에서, 상기 항-EGFR 항체는 파니투무맙이다. 일부 구현예에서, 상기 항-EGFR 항체는 잘루투무맙, 니모투주맙, 및/또는 마투주맙이다.
상기 방법들에서 유용한 항-EGFR 항체는 충분한 친화도 및 특이성으로 EGFR에 결합하는 모든 항체를 포함하고 EGFR 활성을 감소 또는 억제할 수 있다. 상기 선택된 항체는 정상적으로 EGFR에 대해 충분히 강력한 결합 친화도를 가질 것인데, 예를 들어, 싱기 항체는 100nM-1 pM의 Kd 값으로 인간 c-met와 결합할 수 있다.
항체 친화도는 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 기반 분석(예컨대 BIAcore 분석, PCT 출원공보 No. WO2005/012359에 기술됨); 효소-결합 면역흡수 분석(ELISA); 및 경쟁 분석(예컨대, RIA's)에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 ㅎ항-EGFR 항체는 EGFR/EGFR 리간드 활성이 관여하는 질병 또는 질환을 표적으로 삼고 간섭할 때 치료제제로 사용될 수 있다. 또한, 상기 항체에 예컨대, 치료제로서 그것의 효과를 평가하기 위해, 기타 생물학적 활성 분석을 수행할 수 있다. 이와 같은 분석법들은 당해기술에 알려져 있고, 표적 항원 및 상기 항체의 의도적 사용에 따라 달라진다. 일부 구현예에서, EGFR 팔(arm)은 T-세포 수용체 분자(예컨대 CD2 또는 CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체(FcγR), 예를 들어 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)와 같은 백혈구 상의 유도(triggering) 분자에 결합하는 팔과 조합되어, EGFR-발현 세포에 세포 방어 기전을 집중시킬 수 있다. 또한, 이중특이성 항체가 세포독성 제제를 EGFR를 발현하는 세포에 국소화하기 위해 사용될 수 있다. 이들 항체들은 EGFR-결합 팔과, 상기 세포독성 제제(예컨대 사포린, 항-인터페론-α, 빙카 알칼로이드, 리신 A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사선 동위원소 햅텐)과 결합하는 팔을 보유한다. 이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 절편(예컨대, F(ab')2　이중특이성 항체)로 제조될 수 있다.
예시적 EGFR 길항제는 또한 US5616582, US5457105, US5475001, US5654307, US5679683, US6084095, US6265410, US6455534, US6521620, US6596726, US6713484, US5770599, US6140332, US5866572, US6399602, US6344459, US6602863, US6391874, W09814451, WO9850038, WO9909016, WO9924037, W09935146, WO0132651, US6344455, US5760041, US6002008, 및/또는 US5747498에 기술된 화합물과 같은 결합 소분자를 포함한다. 특정 결합 소분자 EGFR 길항제는 OSI-774(CP-358774, 에르로티닙, OSI Pharmaceuticals); PD183805(C11033, 2-프로펜아미드, N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-7-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-6-퀴나졸리닐]-디히드로클로라이드, Pfizer Inc.); Iressa® (ZD1839, 게피티닙, AstraZeneca); ZM 105180((6-아미노-4-(3-메틸페닐-아미노)-퀴나졸린, Zeneca); BIBX-1382(N8-(3-클로로-4-플루오로-페닐)-N2-(1-메틸-피페리딘-4-일)-피리미도[5,4-d]피리미딘-2,8-디아민, Boehringer Ingelheim); PKI-166((R)-4-[4-[(1-페닐에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀); (R)-6-(4-히드록시페닐)-4-[(1-페닐에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘); CL-387785 (N-[4-[(3-브로모페닐)아미노]-6-퀴나졸리닐]-2-부틴아미드); EKB-569(N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-3-시아노-7-에톡시-6-퀴놀리닐]-4-(디메틸아미노)-2-부텐아미드); 라파티닙(Tykerb, GlaxoSmithKline); ZD6474 (Zactima, AstraZeneca); CUDC-101(Curis); 카네르티닙(CI-1033); AEE788(6-[4-[(4-에틸-1-피페라지닐)메틸]페닐]-N-[(1R)-1-페닐에틸]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민, WO2003013541, Novartis) 및 PKI166 4-[4-[[(1R)-1-페닐에틸]아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀, WO9702266 Novartis)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 EGFR 길항제는 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민 및/또는 이것의 약제학적으로 허용가능한 염(예컨대, N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민-HCl)이다. 일부 구현예에서, 상기 EGFR 길항제는 게피티닙 및/또는 이것의 약제학적으로 허용가능한 염이다. 일부 구현예에서, 상기 EGFR 길항제는 라파티닙 및/또는 이것의 약제학적으로 허용가능한 염이다. 일부 구현예에서, 상기 EGFR 길항제는 게피티닙 및/또는 에르로티닙이다.
일부 구현예에서, 상기 EGFR 길항제는 EGFR에 대한 특이적 억제제일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 억제제는 상기 EGFR 길항제가 EGFR 및 하나 이상의 다른 표적 폴리펩티드를 억제하는 것인 이중 억제제 또는 범 억제제일 수 있다.
포스포이노시티드 3-키나아제(PI3K)는 주요 생화학적 기능이 포스포이노시티드의 3-히드록시 기를 인산화하는 것인 지질 키나아제 계열이다. PI3K 억제제의 예들이 당해기술에 알려져 있고, 비제한적으로 Wortmannin, LY294002, SF1126(소분자 프로드럭, 인테그린-결합 성분에 연결된 LY294002 접합체), NVP-BEZ235(이미다조퀴온린 유도체), NVP-BGT226, XL765, GDC-O980, PF-O4691502, PF-O5212384, PKI-587, NVP-B M120, XL147, PX-866, GDC-O941, GSK615, 및/또는 CAL-101을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 PI3K 억제제는 WO2009/114874, WO2009/088990, US7511041, US7666901, US7662977, WO2010/046639, US20100105711, WO2010/037765, US20100087440, WO2010034414, US20100075965, US20100075951, US20100075947, WO2010/038165, WO2010/036380, WO2010/059788, WO2010/049481, WO2009/134825, WO2009/123971, WO2009/099163, 및/또는 WO2009/042607(이들 전체가 본원에 참조로 편입됨)에 기술된 화합물이다.
또한 본원에 기술된 방법들에서 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)로 유용하게 사용될 수 있는 RAF 억제제가 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 RAF 억제제는 BRAF 억제제이다. 일부 구현예에서, 상기 RAF 억제제는 CRAF 억제제이다. 예시적 BRAF 억제제가 당해기술에 알려져 있고, 예를 들어, 소라페닙, PLX4720, PLX-3603, 다브라페닙(GSK2118436), GDC-O879, RAF265 (Novartis), XL281, AZ628, ARQ736, BAY73-4506, 베무라페닙 및 WO2007/002325, WO2007/002433, WO2009111278, WO2009111279, WO2009111277, WO2009111280 및 미국 특허 No. 7,491,829에 기술된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 BRAF 억제제는 선택적 BRAF 억제제이다. 일부 구현예에서, 상기 BRAF 억제제는 BRAF V600의 선택적 억제제이다. 일부 구현예에서, BRAF V600은 BRAF V600E, BRAF V600K 및/또는 V600D이다. 일부 구현예에서, BRAF V600은 BRAF V600R이다. 일부 구현예에서, 상기 BRAF 억제제는 베무라페닙이다. 일부 구현예에서, 상기 BRAF 억제제는 베무라페닙이다.
베무라페닙(RG7204, PLX-4032, CAS Reg. No. 1029872-55-5)은 다양한 암 세포주, 예를 들어 흑색종 세포주에서 프로그램된 세포 사멸을 유발하는 것으로 확인된 바 있다. 베무라페닙은 상기 BRAF/MEK/ERK 경로상기 BRAF가 일반적인 V600E 변이를 가진 경우) 상의 BRAF/MEK 단계를 방해한다. 베무라페닙은 FDA에 승인된 바와 같이, V600E BRAF 변이를 갖는 암 환자, 예를 들어 흑색종 환자에 효과가 있다(즉, BRAF 단백질 상의 아미노산 위치 600에서, 상기 정상적 발린이 글루탐산으로 대체됨). 흑색종의 약 60%가 V600E BRAF 변이를 갖는다. 상기 V600E 변이는 그 밖의 다른 암들, 예컨대 림프종, 결장 암, 흑색종, 후두암 및 폐암에 존재한다. 베무라페닙은 하기 구조를 갖는다:
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ZELBORAF®(베무라페닙)(Genentech, Inc.)은 미국에서 승인된 약품으로 FDA-승인 테스트에서 확인된 바와 같이 BRAF V600E 변이를 갖는 적출불가한 또는 전이성 흑색종 환자의 치료에 사용되도록 지시되었다. ZELBORAF®(베무라페닙)은 BRAF V600E 변이가 없는(야생형 BRAF 흑색종) 흑색종 환자에게 사용이 권장되지 않는다.
또한 본원에 기술된 방법들에 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)로서 유용하게 쓰이는 백금-기반 제제들이 제공된다.
백금 기반 제제는, 비제한적으로, 시스플라틴, 카보플라틴, 올살리플라틴, 사트라플라틴, 피코플라틴, 네다플라틴 및/또는 트리플라틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 백금 기반 제제는 시스플라틴이다. 일부 구현예에서, 상기 백금 기반 제제는 카보플라틴이다.
또한 본원에 기술된 방법들에서 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)로서 유용한 탁산이 제공된다. 탁산은 튜불린에 결합하여, 마이크로튜불 조합 및 안정화를 촉진하고, 및/또는 마이크로튜불 탈중합체를 방지할 수 있는 디터펜이다. 본원에 포함된 탁산은 탁소이드 10-데아세틸박카틴 III 및/또는 이것의 유도체이다. 탁산의 예에는, 비제한적으로, 파클리탁셀(즉, 탁솔, CAS # 33069-62-4), 도세탁셀(즉, 탁소테레, CAS #114977-28-5), 라로탁셀, 카바지탁셀, 밀라탁셀, 테세탁셀 및/또는 오라탁셀을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 구현예에서, 상기 탁산은 도세탁셀이다. 일부 구현예에서, 상기 탁산은 Cremophor(예컨대, Taxol®) Tween 폴리소르베이트 80 (예컨대, Taxotere®)에 제형화된다. 일부 구현예에서, 상기 탁산은 리포솜에 캡슐화된 탁산이다. 일부 구현예에서, 상기 탁산은 탁산의 프로드럭 형태 및/또는 접합체 형태(예컨대, 파클리탁셀, 파클리탁셀 폴리글루멕스 및/또는 니롤레일 카보네이트-파클리탁셀에 공유 접합된 DHA)이다. 일부 구현예에서, 상기 파클리탁셀은 실질적으로 계면활성제 없이 제형화된다(예컨대, Cremophor 및/또는 Tween-예컨대 토코솔 파클리탁셀의 부재 하에). 일부 구현예에서, 상기 탁산은 알부민-코팅된 나노입자(예컨대, Abraxane 및/또는 ABI-O08)이다. 일부 구현예에서, 상기 탁산은 Taxol®이다.
본원에 기술된 방법들에서 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)로 유용한 빈카 알킬로이드가 제공된다. 빈카 알칼로이드는 애초에 Periwinkle 식물 일일초(Catharanthus roseus)에서 유래된 세포 분열 저지 및 마이크로튜불 저지 제제들의 집합체이다. 빈카 알킬로이드의 예는, 비제한적으로 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 및 비노렐빈을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 빙카 알킬로이드는 비노렐빈이다.
본원에 기술된 방법들에서 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)로 유용한 뉴클레오시드 유사체가 제공된다. 뉴클레오시드 유사체의 예는, 비제한적으로, 젬시타빈, 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 시타라빈, 디데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈 및/또는 플록수리딘을 포함하고; 일부 구현예에서, 사기 뉴클레오시드 유사체는 젬시타빈이다.
A. 항체
본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한, KDM5 및/또는 EGFR와 같은 관심대상의 폴리펩티드에 결합하는 단리된 항체가 제공된다. 상기 구현예들 중 어느 하나에서, 항체는 인간화된 것이다. 추가로, 상기 구현예들 중 하나에 따른 상기 항체는 단클론 항체로, 예컨대 키메라, 인간화된 또는 인간 항체를 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 항체는 항체 절편, 예컨대, Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab')2　절편이다. 또 다른 구현예에서, 상기 항체는 전장 항체로, 예컨대, "온전한 IgG1" 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 기타 항체 부류 또는 동위원소이다.
추가적 측면에서, 상기 구현예들 중 하나에 따른 항체는 하기 절에 기술된 바와 같은 특징들을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다:
1. 항체 친화도
어떤 구현예에서, 본원에 제공되는 항체는 ≤ 1㎛ ≤ 100nM, ≤ 10nM, ≤ 1nM, ≤ 0.1nM, ≤ 0.01nM, 또는 ≤ 0.001nM(예컨대, 10-8　M 이하, 예컨대, 10-8　M 내지 10-13　M, 예컨대, 10-9　M 내지 10-13　M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 하나의 구현예에서, Kd는 방사표지된 항원 결합 분석(RIA)에 의해 측정된다. 하나의 구현예에서, 상기 RIA는 관심대상의 항체의 Fab 형태 및 그것의 항원으로 수행된다. 예를 들어, 항원에 대한 Fabs의 용액 결합 친화도는 표지되지 않은 항원의 일련의 적정의 존재 하에 최소한의 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형유지시키고, 그런 다음 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 결합된 항원을 포획함으로써(예컨대, Chen 등, J. Mol. Biol. 293:865-881(1999) 참조) 측정된다. 상기 분석을 위한 조건을 수립하기 위해, MICROTITER® 다중웰 플레이트(Thermo Scientific)는 50mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중 포획된 항-Fab 항체(Cappel Labs)5 ㎍/ml로 밤새 코팅되고, 이후에 실온(대략 23℃)에서 2~5시간 동안, PBS 중 2% (w/v) 소혈청 알부민으로 차단된다. 흡착이 일어나지 않은 플레이트(Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125 I] -항원이 관심대상인 Fab의 연속적인 희석액(예컨대, Presta 등, Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)에서의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치하게)과 혼합된다. 관심대상의 Fab은 이후 밤새 배양된다; 그러나 상기 배양은 평형에 도달할 때까지, 더 긴 시간 동안(예컨대, 약 65시간) 동안 지속될 수 있다. 이후, 상기 혼합물을 실온에서 배양하기 위해(예컨대, 1시간 동안) 포획 플레이트에 옮긴다. 이후, 상기 용액이 제거되고, 상기 플레이트가 PBS 중 0.1 % 폴리소르베이트 20(TWEEN-20®)로 8회 세척된다. 상기 플레이트가 모두 마르면, 반짝이물질(scintillant)(MICROSCINT-20 TM Packard) 150㎕/웰이 첨가되어, 10분 동안 상기 플레이트가 TOPCOUNTTM감마 카운터(Packard)에서 카운팅된다. 경쟁적 결합 분석에 사용하기 위해 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도들이 선택된다.
또 다른 구현예에 따르면, Kd는 BIACORE® 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용하여 측정된다. 예를 들어, BIACORE® 2000 또는 BIACORE® 3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 사용하는 분석은 25℃에서 ~10 반응단위(RU)에서 부동성 항원 CM5 칩으로 수행된다. 하나의 구현예에서, 카복시메틸레이티드 덱스트란 바이오센서칩(CM5, BIACORE, Inc.)은 공급업체의 지시에 따른 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 히드로클로라이드(EDC) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS)이다. 항원은 결합된 단백질의 대략 10 반응단위(RU)를 달성하기 위해, 유속 5 ㎕/분으로 주입하기 전에, 10mM 아세트산나트륨(pH 4.8) 5㎍/ml (~0.2㎛)으로 희석된다. 항원의 주입 후, 1M 에탄올아민이 주입되어 반응하지 않은 작용기를 차단한다. 운동역학 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석액(0.78nM 내지 500nM)이 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20™ 계면활성제 (PBST)와 함께 25℃에서 유속 대략 25 ㎕/분의 유속으로 PBS로 주입된다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(k0ff)는 단순한 1:1 Langmuir 결합 모형(BIACORE® Evaluation 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여, 상기 결합 및 해리 센서그램을 동시에 조절함으로써 계산된다. 평형 해리 상수(Kd)는 koff:kon　의 비율로서 계산된다. 예컨대, Chen 등, J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999) 참조. 만약 상기의 결합 속도가 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 106 M- 1 s- 1를 초과하면, 이어서 상기 on-rate는 교반된 cuvette으로 stop-flow 구비된 분광기(Aviv Instruments) 또는 8000-시리즈 SLM-AMINCO™ 분광기(ThermoSpectronic)와 같은 분광기에서 측정된 바와 같은 항원의 농도들을 증가시키면서, pH 7.2의 PBS에서 항원의 20nM 항-항원 항체(Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도(여기 = 295nM; 방출 = 340nM, 16nM 밴드-통과)의 증가 또는 감소를 측정하기 위한 형광 급냉각 기법을 사용하여 결정될 수 있다.
2. 항체 절편
어떤 구현예에서, 본원에 제공되는 항체는 항체 절편이다. 항체 절편은, 비제한적으로, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 절편 및 아래 기술된 기타 절편들을 포함한다. 일부 항체 절편에 대한 검토는, Hudson 등 Nat. Med. 9: 129-134 (2003) 참조. scFv 절편에 대한 검토는, 예컨대, Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994) 참조; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 Nos. 5,571,894 및 5,587,458 참조. 구조(salvage) 수용체 결합 항원결정부 잔기를 포함하고, 체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2　절편의 논의는, 미국 특허 No. 5,869,046 참조.
디아바디는, 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 절편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161 ; Hudson 등, Nat. Med. 9: 129-134 (2003); 및 Hollinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) 참조. 또한 트리아바디 및 테트라바디가 Hudson 등, Nat. Med. 9: 129-134 (2003)에 기술되었다.
단일부 항체는 항체의 중쇄 불변부의 전부 또는 일부, 또는 경쇄 불변부의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 절편이다. 어떤 구현예에서, 단일부 항체는 인간 단일부 항체(Domantis, Inc., Waltham, MA; see, 예컨대, 미국 특허 No. 6,248,516)이다.
항체 절편은 다양한 기법으로 제조될 수 있는데, 본원에 기술된 바와 같이, 비제한적으로 온전한 항체의 단백질 가수분해 소화 및 재조합 숙주세포(예컨대, 대장균 또는 파지)에 의한 생산을 포함한다.
3. 키메라 및 인간화된 항체
어떤 구현예에서, 본원에 제공되는 항체는 키메라 항체이다. 일부 키메라 항체는 예컨대, 미국 특허 No. 4,816,567; 및 Morrison 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 (1984))에 기술되었다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변부(예컨대, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 유인원, 예컨대 원숭이에서 유도된 가변부) 및 인간 불변부를 포함한다. 추가 예에서, 키메라 항체는 부류(class) 또는 하위부류가 모체 항체의 그것으로부터 변경된 "부류 교환된" 항체이다. 키메라 항체는 그것의 항원-결합 절편을 포함한다.
어떤 구현예에서, 키메라 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역성을 감소시키면서, 모체 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지한다. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVRs, 예컨대, CDRs, (또는 이것의 일부분)가 비-인간 항체에서 유도된 것, 및 FRs (또는 이것의 일부분)이 인간 항체 서열에서 유도된 것인 하나 이상의 불변부이다. 인간화된 항체는 또한 임의로 최소한 인간 불변부의 일부분을 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체 중 일부 FR 잔기는 비-인간 항체(예컨대, 상기 HVR 잔기가 유도된 항체)에서 유래된 상응하는 잔기로 치환되어, 예컨대, 항체 특이성 또는 친화도를 회복 또는 개선한다.
인간화된 항체 및 이것을 제조하는 방법들이 예컨대, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에서 검토되었고, 추가로 예컨대, Riechmann 등, Nature 332:323-329 (1988); Queen 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 Nos. 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409; Kashmiri 등, Methods 36:25-34 (2005)(특이성-결정부(SDR) 접합 기술); Pad1an, Mol Immunol 28:489-498 (1991)("재표면화" 기술); Dall'Acqua 등, Methods 36:43-60 (2005)("FR 셔플링" 기술); 및 Osbourn 등, Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka 등, Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)(FR 셔플링에 대한 "유도된 선택" 방식)에 기술되었다.
인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 기틀부는 비제한적으로: "최적(best-fit)" 방법(예컨대, Sims 등 J. Immuno1151 :2296 (1993) 참조)을 사용하여 선택된 기틀부; 경쇄 또는 중쇄 가변부의 특정 하위그룹의 인간 항체의 공통 서열에서 유도된 기틀부(예컨대, Carter 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta 등 J. Immunol, 151 :2623 (1993) 참조); 인간 성숙한(체세포성 돌연변이된) 기틀부 또는 인간 생식계 기틀부(예컨대, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 참조); 및 스크리닝 FR 라이브러리에서 유도된 기틀부(예컨대, Baca 등, J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok 등, J Biol. Chem. 271 :22611-22618 (1996) 참조).
4. 인간 항체
어떤 구현예에서, 본원에 제공되는 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해기술에 알려진 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)에 기술되었다.
인간 항체는 항원의 면역반응 유도에 반응하는 인간 가변부를 갖는 온전한 인간 항체 또는 온전한 항체를 생산하기 위해 변형된 형질전환된 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이와 같은 동물은 전형적으로 인간 면역글루불린 자리 전부 또는 일부를 함유하고, 이것은 내생적 면역글루불린 자리를 대체하거나, 또는 상기 동물의 염색체 밖에 존재하거나 또는 염색체 안에 임의로 통합된다. 이와 같은 형질전환 마우스에서, 내생적 면역글루불린 자리는 일반적으로 불활성화된 상태다. 형질전환 동물에서 인간 항체를 획득하기 위한 방법들에 대한 검토는 Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125 (2005) 참조. 또한, 예컨대, 미국 특허 Nos. 6,075,181 및 6,150,584(XENOMOUSE™기술 설명); 미국 특허 No. 5,770,429(HuMab®기술 설명); 미국 특허 No. 7,041,870(K-M MOUSE®기술 설명), 및 미국 특허 출원공보No. US 2007/0061900(VelociMouse®기술 설명) 참조. 이와 같은 동물에 의해 생성된 온전한 항체에서 유래된 인간 가변부는, 예컨대, 서로 다른 인간 불변부와의 조합에 의해, 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한, 하이브리도마-기반 방법들에 의해 제조될 수 있다. 인간 단클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종 골수종 세포주가 기술된 바 있다. (예컨대, Kozbor J Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner 등, J. Immunol, 147: 86 (1991) 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 Li 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)에 기술되었다. 추가적 방법ㄷ들은 예를 들어, 미국 특허 No. 7,189,826(하이브리도마 세포주에서 단클론 인간 IgM 항체의 생산을 기술) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)(인간-인간 하이브리도마 기술)에 기술된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술(Trioma technology)은 또한 Vollmers and Brand1ein, Hist. & Histopath., 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brand1ein, Methods Find Exp. Clin. Pharmacol, 27(3): 185-91 (2005)에 기술되었다.
인간 항체는 또한 인간-유도 파지 디스플레이 라이브러리에서 선택되는 Fv 클론 불변부 서열들을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이와 같은 불변부 서열들은 이어서 원하는 인간 불변부와 조합될 수 있다. 항체 라이브러리에서 인간 항체를 선택하기 위한 기법들은 하기에 기술된다.
5. 라이브러리-유도 항체
항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합적 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 원하는 결합 특징들을 갖는 항체에 대한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법들이 당해기술에 알려져 있다. 이와 같은 방법들은 예컨대, Hoogenboom 등 Methods Mol. Biol. 178:1-37(O'Brien 등, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)에서 검토되었고, 추가로 예컨대, McCafferty 등, Nature 348:552-554; Clackson 등, Nature 352: 624-628 (1991); Marks 등, J. Mol. Biol 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, Methods Mol. Biol. 248: 161-175 (Lo, ed., 인간 Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu 등, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee 등, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee 등, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)에 기술되었다.
일부 파지 디스플레이 방법들에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리가 중합분해효소 연쇄반응(PCR)에 의해 별도로 복제되고 파지 라이브러리에서 임의로 재조합되어, 이것은 이어서 Winter 등, Ann. Rev. Immunol, 12: 433-455 (1994)에 기술된 바와 같이, 항원-결합 파지에 대해 스크린될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 절편을, 단일-사슬 Fv(scFv) 절편 또는 Fab 절편 중 하나로 표시한다. 면역화된 공급원에서 유래된 라이브러리는 하이브리도마를 구성해야 하는 필요성 없이 상기 면역원에 친화도가 높은 항체를 제공한다. 선택적으로, 상기 본연의 레퍼토리는 (예컨대, 인간에서) 복제되어 Griffiths 등, EMBO J, 12: 725-734 (1993)에 의해 기술된 바와 같이, 모든 면역반응 없이 광범위한 비자기 및 또한 자기 항원에 항체의 단일 공급원을 제공한다. 마지막으로, 본연 라이브러리는 또한, Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388(1992)에서 기술된 바와 같이, 줄기세포에서 재배열되지 않은 V-유전자 세그멘트를 복제하고, 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 상당히 가변적인 CDR3 부위를 인코딩하고 체외에서 재배열을 완성함으로써, 합성하여 제조될 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기술한 특허 공보는 예를 들어: 미국 특허 No. 5,750,373, 및 미국 특허 공보Nos. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리에서 단리된 항체 또는 항체 절편은 본원의 인간 항체 또는 인간 항체 절편이라 여겨진다.
6. 다중특이성 항체
어떤 구현예에서, 본원에 제공되는 항체는 다중특이성 항체, 예컨대, 이중특이성 항체이다. 다중특이성 항체는 최소한 2개의 서로 다른 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 단클론 항체이다. 어떤 구현예에서, 결합 특이성들 중 하나는 관심대상의 폴리펩티드, 예컨대 KDM5 및/또는 EGFR이고, 다른 하나는 그 밖의 다른 항원에 관한 것이다. 어떤 구현예에서, 이중특이성 항체는 관심대상의 폴리펩티드, 예컨대 KDM5 및/또는 EGFR의 서로 다른 2개의 항원결정부에 결합할 수 있다. 이중특이성 항체는 또한 관심대상의 폴리펩티드, 예컨대 KDM5 및/또는 EGFR를 발현하는 세포에 세포독성 제제를 국소화하기 위해 사용될 수 있다. 이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 절편으로 제조될 수 있다.
다중특이성 항체를 제조하기 위한 기법들은, 비제한적으로, 서로 다른 특이성을 갖는 2개의 면역글루불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동 발현(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, 및 Traunecker 등, EMBO J. 10: 3655 (1991) 참조), 및 "knob-in-hole" 공학(예컨대, 미국 특허 No. 5,731,168 참조)을 포함한다. 다중특이성 항체는 또한 항체 Fc-이종이합체 분자를 제조하기 위한 정전기 steering effects를 조작(WO 2009/089004A1); 둘 이상의 항체 또는 절편을 가교결합(예컨대, 미국 특허 No. 4,676,980, 및 Brennan 등, Science, 229: 81 (1985) 참조); 이중특이성 항체를 제조하기 위한 류신 지퍼를 사용(예컨대, Kostelny 등, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 참조); 이중특이성 항체 절편을 제조하기 위한 "디아바디" 기술을 사용(예컨대, Hollinger 등, Proc. Natl Acad. Set USA, 90:6444-6448 (1993)참조); 및 단일-사슬 Fv (sFv) 이합체를 사용(예컨대, Gruber 등, J. Immunol., 152:5368 (1994) 참조); 및 예컨대, Tutt 등 J. Immunol. 147: 60 (1991)에 기술된 바와 같이, 삼중특이성 항체를 제조함으로써, 제조될 수 있다.
3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체, 예컨대 "옥토퍼스 항체"가 본원에 포함된다(예컨대, US 2006/0025576 A 1 참조).
본원에 제공되는 항체 또는 절편은 관심대상의 폴리펩티드, 예컨대 KDM5 및/또는 EGFR, 및 또 다른 서로 다른 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 기능 FAb" 또는 "DAF"이다(예를 들어, US 2008/0069820 참조).
7. 항체 변종
a) 글리코실화 변종
어떤 구현예에서, 본원에 제공되는 항체는 상기 항체가 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소시키기 위해 변경된다. 항체에 글리코실화 부위의 첨가 또는 결실은 상기 아미노산 서열을 변경하여 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성 또는 제거되도록 함으로써, 편리하게 달성될 수 있다.
상기 항체가 Fc 부위를 포함하는 반면, 여기에 붙은 탄수화물가 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생산된 본연 항체는 전형적으로 상기 Fc 부위의 CH2 영역의 Asn297에 N-연결에 의해 일반적으로 부착된 분지형, 쌍촉각 올리고당을 포함한다. 예컨대, Wright 등 TIBTECH 15:26-32 (1997) 참조. 상기 올리고당은 다양한 탄수화물, 예컨대, 만노오스, N-아세틸 글루코스아민 (GlcNAc), 갈락토오스 및 시알산 및 쌍촉각 올리고당 구조의 '줄기'에서 GlcNAc에 부착되는 푸코오스를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체에서 올리고당의 변형은 일부 개선된 특성을 갖는 항체 변종을 생성하기 위해 이루어질 수 있다.
하나의 구현예에서, Fc 부위에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코오스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변종이 제공된다. 예를 들어, 이와 같은 항체에서의 푸코오스의 양은 1~80%, 1~65%, 5~65% 또는 20~40%일 수 있다. 푸코오스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546에 기술된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광법에 의해 측정되는, Asn 297에 부착된 모든 글리코구조(예컨대, 복합체, 하이브리드 및 고합량 만노오스 구조물)의 총합 대비, Asn297에서의 당 사슬 내 푸코오스의 평균량을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 부위의 약 297번(Fc 부위 잔기의 Eu 넘버링) 위치에 놓인 아스파라긴 잔기를 가리키는데; 그러나 Asn297은 또한 항체에서의 사소한 서열 변이 때문에, 297번 위치의 상류 또는 하류의 약 ±3개 아미노산에 위치한 것, 즉, 294번 위치 및 300번 위치 사이에 놓일 수 있다. 이와 같은 푸코실화 변종은 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예컨대, 미국 특허 공부 Nos. US 2003/0157108(Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) 참조. "탈푸코실화된" 또는 "푸코오스-결핍" 항체 변종과 관련된 출판물의 예는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621 ; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki 등, J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki 등, Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)을 포함한다. 탈푸코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주는 단백질 푸코실화에 결핍된 Lec13 CHO 세포(Ripka 등 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US Pat Appl No US 2003/0157108 A1, Presta, L; 및 WO 2004/056312 A1, Adams 등, especially at Example 11) 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트란스퍼라아제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포를 포함할 수 있다(예컨대, Yamane-Ohnuki 등 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. 등, Biotechnol. Bioeng, 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107 참조).
이등분된 올리고당, 예컨대, 상기 항체의 Fc 부위에 부착된 biantennary 올리고당이 GlcNAc에 의해 이등분된 것을 갖는 항체 변종이 추가로 제공된다. 이와 같은 항체 변종은 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다.
이와 같은 항체 변종의 예들이 예컨대, WO 2003/011878 (Jean-Mairet 등 ); 미국 특허 No. 6,602,684 (Umana 등); 및 US 2005/0123546 (Umana 등)에 기술되었다. 상기 Fc 부위에 부착된 올리고당에 최소한 하나의 갈락토오스 잔기를 갖는 항체 변종이 또한 제공된다. 이와 같은 항체 변종는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이와 같은 항체 변종이 예컨대, WO 1997/30087 (Patel 등); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기술되었다.
b) Fc 부위 변종
어떤 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공되는 항체의 Fc 부위에 도입됨으로써, Fc 부위 변종을 생성할 수 있다. 상기 Fc 부위 변종은 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 포함하는 인간 Fc 부위 서열(예컨대, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 부위)포함할 수 있다.
어떤 구현예에서, 본 발명은 전부 아닌 일부의 효능기 기능들을 갖는 항체 변종을 고안하고, 이로써 상기 항체 변종은 항체의 체내 반감기가 중요하지만, 그러나 어떤 효능기 기능(예컨대 보완 및 ADCC)이 불필요하거나 또는 제거된 경우의 응용에 바람직한 후보가 된다. 체외 및/또는 체내 세포독성 분석이 수행되어 CDC 및/또는 ADCC 활성의 환원 결실을 확인해줄 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체(FcR) 결합 분석이 수행되어 상기 항체에 FcγR 결합이 없고(그래서 ADCC 활성이 없을 가능성이 있고, 그러나 FcRn 결합능을 보유하게 할 수 있다. ADCC를 중재하기 위한 주요 세포들인, NK 세포는 Fc(RIII)만을 발현하는 반면, 구단핵는 Fc(RI), Fc(RII) 및 Fc(RIII)를 발현한다. 조혈 세포에서의 FcR 발현이 Ravetch and inet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991) 464쪽 표 3에 요약되어 있다. 관심대상의 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 체외 분석의 비제한적인 예들이 미국 특허 No. 5,500,362(예컨대, Hellstrom, I. 등 Proc . Nat l Acad . Sci . USA 83:7059-7063 (1986)) 및 Hellstrom, I 등, Proc . Nat l Acad . Sci . USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337(Bruggemann, M. 등, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) 참조)에 기술되었다. 선택덕으로, 비방사선 분석법이 활용될 수 있다(예를 들어, ACTITM 세포 유속기를 위한 비-방사선 세포독성 분석(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; 및 CytoTox 96® 비-방사선 세포독성 분석(Promega, Madison, WI) 참조). 이와 같은 분석들을 위한 유용한 효능기 세포들은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연괴사(Natural Killer)(NK) 세포를 포함한다. 선택적으로, 또는 부가적으로, 관심대상의 분자의 ADCC 활성이 체내에서, 예컨대, Clynes 등 Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 95:652-656 (1998)에 개시되는 동물 모형에서 평가될 수 있다. Clq 결합 분석은 또한 수행되어 상기 항체가 Clq와 결합할 수 있고, 그래서 CDC 활성이 없음을 확인해 줄 수 있다. 예컨대, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서의 Clq 및 C3c 결합 ELISA 참조. 보완 활성화를 평가하기 위해, CDC 분석이 (예를 들어, Gazzano-Santoro 등, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996); Cragg, M.S. 등, Blood101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood103:2738-2743 (2004) 참조) 수행될 수 있다. FcRn 결합 및 체내 쪼개짐(clearance)/반감기 결정 또한 당해기술에 알려진 방법들을 사용하여 수행될 수 있다(예컨대, Petkova, S.B. 등, Intl. Immuno118(12):1759-1769 (2006) 참조).
감소된 효능기 기능을 갖는 항체는 하나 이상의 Fc 부위 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329(미국 특허 No. 6,737,056)가 치환된 것들을 포함한다. 이와 같은 Fc 변이체는 둘 이상의 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327에서의 치환을 갖는 Fc 변이체를 포함하는데, 여기에는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 변이체(미국 특허 No. 7,332,581)가 포함된다.
FcRs와 개선된 또는 감소된 결합을 갖는 어떤 항체 변종들이 기술되었다(예컨대, 미국 특허 No. 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields 등, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) 참조). 어떤 구현예에서, 항체 변종는 ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예컨대, 298, 333, 및/또는 334번 위치(잔기의 EU 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 Fc 부위에서 변경이 이루어져, 결과적으로 예컨대, 미국 특허 No. 6,194,551, WO 99/51642 및 Idusogie 등 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에서 기술된 바와 같이, 변경된(즉, 개선되거나 또는 감소된) Clq 결합 및/또는 보완 의존성 세포독성(CDC)을 초래한다.
반감기가 증가되고 신생아 Fc 수용체(FcRn)(모체 IgGs의 태아로의 전달을 담당(Guyer 등, J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim 등, J. Immunol. 24:249 (1994))에 대한 결합이 개선된 항체가 US2005/0014934A1(Hinton 등)에 기술되었다. 이들 항체는 Fc 부위의 FcRn으로의 결합을 개선하는, 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 부위를 포함한다. 이와 같은 Fc 변종은 하나 이상의 Fc 부위 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434, 예컨대, Fc 부위의 434번 잔기(미국 특허 No. 7,371,826)의 치환을 갖는 것들을 포함한다. 또한 Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 No. 5,648,260; 미국 특허 No. 5,624,821; 및 Fc 부위 변종의 다른 예들과 관련된 WO 94/29351을 포함한다.
c) 시스테인 조작 항체 변종
어떤 구현예에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된, 시스테인 조작 항체, 예컨대, "thioMAbs"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 잔기 치환은 상기 항체의 접속가능 부위에서 발생한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올 기가 이로써 상기 항체의 접속가능한 부위에 위치에 놓여서, 다른 모이어티, 예컨대 약제 모이어티 또는 링커-약제 모이어티에 상기 항체를 접합시키기 위해 사용되어, 본원에 추가로 기술된 바와 같이, 면역접합을 생성할 수 있다. 어떤 구현예에서, 하나 이상의 하기 잔기들은 시스테인: 상기 경쇄의 V205(Kabat 넘버링); 상기 중쇄의 A118 (EU numbering); 및 중쇄 Fc 부위 S400(EU 넘버링)으로 치환될 수 있다. 시스테인 조작 항체는 예컨대, 미국 특허 No. 7,521,541에 기술된 바와 같이 생성될 수 있다.
B. 면역접합체
관심대상의 폴리펩티드, 예컨대 KDM5 또는 EGFR과 결합하고, 하나 이상의 세포독성 제제, 예컨대 화학치료제제 또는 약제, 성장 억제 제제, 독소(예컨대, 단백질 독소, 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물 기원의 효소활성 독소, 또는 이들의 절편), 또는 본원에 기술된 방법들에 사용되는 방사선 동위원소에 접합되는 항체를 포함하는 면역접합체가 본원에 추가로 제공된다.
하나의 구현예에서, 하나의 면역접합체는, 항체가 하나 이상의 약제에 접합된 항체-약제 접합체(ADC), 예컨대 비제한적으로 메이탄시노이드(미국 특허 Nos. 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 참조); 아우리스타틴, 예컨대 모노메틸아우리스타틴 약제 모이어티 DE 및 DF(MMAE 및 mMAF)(미국 특허 Nos. 5,635,483 및 5,780,588, 및 7,498,298 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 이것의 유도체(미국 특허 Nos. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 및 5,877,296; Hinman 등, Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode 등, Cancer Res. 58:2925-2928 (1998) 참조); 안스라시클린, 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신(Kratz 등, Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey 등, Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov 등, Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik 등, Bioorg. & Med. Chem. Letters 12: 1529-1532 (2002); King 등, J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); 및 미국 특허 No. 6,630,579 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트리초테센; 및 CC1065을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 면역접합체는 본원에 기술된 바와 같이 효소 활성 독소 또는 이것의 절편에 접합된 항체, 예컨대 비제한적으로 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 절편, 엑소독소 A 사슬(Pseudomonas aeruginosa에서 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 유동나무(Aleurites fordii)단백질, 디안틴 단백질, 미국 자리공(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 여주(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 면역접합체는 본원에 기술된 바와 같이, 방사선 원소에 접합되어 방사선접합체를 형성하는 항체를 포함한다. 다양한 방사선 동위원소가 방사선접합체의 생산을 위해 사용될 수 있다. 예에는 At211 , I131, I125, Y90, Re186 , Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212　및 Lu의 방사선 동위원소가 포함된다. 상기 방사성접합체가 검출에 사용되는 경우, 이것은 신티그래프 연구를 위한 방사선 원소, 예를 들어 Tc99m　또는 I123, 또는 핵자기공명(NMR) 영상(자기공명영상(mri))용 스핀 라벨, 예컨대 요오드-123, 요오드-131, 인듐- 111, 플루오린- 19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성 제제의 접합체는 다양한 이작용기 단백질 결합제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이작용기 유도체(예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르(예컨대, 디숙신이미딜 수버레이트), 알데히드(예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예컨대, 툴루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물(예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소가 Vitetta 등, Science 238:1098 (1987)에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)이 방사선 뉴클레오티드의 상기 항체 접합을 위한 예시적 킬레이트 제제이다. W094/11026 참조. 링커는 상기 세포에서 세포독성 약제의 방출을 촉진하는 "절단성 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정 링커, 펩티다아제-민감 링커, 광불안정 링커, 디메틸 링커 또는 디설파이드-함유링커(Chari 등, Cancer Res. 52:127-131 (1992); 미국 특허 No. 5,208,020)가 사용될 수 있다.
본원의 면역접합체 또는 ADCs는 명확히 비제한적으로 가교결합 시약으로 제조되는 접합체, 예컨대 비제한적으로, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC 및 술포-SMPB, 및 구매가능한 SVSB(숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)(예컨대, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A)를 고려한다.
C. 결합 폴리펩티드
결합 폴리펩티드는 관심대상의 폴리펩티드, 예컨대 KDM5 및/또는 EGFR와 결합하는 폴리펩티드로, 본원에 기술된 방법들에 사용되기 위해 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 결합 폴리펩티드는 KDM5 길항제 및/또는 EGFR 길항제이다.
결합 폴리펩티드는 알려진 폴리펩티드 합성 방법을 사용하여 화학적으로 합성되거나 또는 재조합 기술을 사용하여 제조 및 정제될 수 있다. 결합 폴리펩티드는 일반적으로 최소한 약 5개 아미노산 길이, 선택적으로 최소한 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100개 아미노산의 길이 이상으로, 본원에 기술된 바와 같이, 바람직하게는 표적, 예컨대, KDM5 또는 EGFR에 특이적으로 결합할 수 있는 이와 같은 결합 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 상기 결합 폴리펩티드는 KDM5 메틸기분해효소 활성을 억제한다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5는 하나 이상의 KDM5A, KDM5B, KDM5C 및/또는 KDM5D이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5는 KDM5A 및/또는 KDM5B이다.
결합 폴리펩티드는 잘 알려진 기법을 사용하여 과도한 실험 없이 확인될 수 있다. 이런 점에서, 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 폴리펩티드에 대해 폴리펩티드 라이브러리를 스크리닝하기 위한 기법이 당해기술에 잘 알려져 있음이 주목된다(예컨대, 미국 특허 Nos. 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; PCT Publication Nos. WO 84/03506 및 WO84/03564; Geysen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81 :3998-4002 (1984); Geysen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 178-182 (1985); Geysen 등, in Synthetic Peptides as Antibodies, 130-149 (1986); Geysen 등, J. Immunol. Meth,, 102:259-274 (1987); Schoofs 등, J. Immunol, 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. 등 (1990) roc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. 등 (1991) Biochemistry, 30: 10832; Clackson, T. 등 (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. 등 (1991), J. Mol. Biol, 222:581; Kang, A.S. 등 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363, and Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol, 2:668 참조).
또한 펩티드 라이브러리를 생성하고 이들 라이브러리를 스크리닝하는 방법들이 미국 특허 Nos. 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192 및 5,723,323에 개시되었다.
D. 결합 소분자
앞서 기술된 방법들에 사용하기 위해, 관심대상의 폴리펩티드, 예컨대 KDM5 및/또는 EGFR의 결합 소분자 길항제로서 사용하기 위한 결합 소분자가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 결합 소분자 길항제는 KDM5 메틸기분해효소 활성을 억제한다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5는 하나 이상의 KDM5A, KDM5B, KDM5C 및/또는 KDM5D이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5는 KDM5A 및/또는 KDM5B이다.
결합 소분자는 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같이, 바람직하게는 KDM5 및/또는 EGFR에 특이적으로 결합하는, 본원에 정의된 바와 같은, 결합 폴리펩티드 또는 항체 이외의 유기 분자이다.
결합 소분자는 알려진 방법을 사용하여 확인되고 화학적으로 합성될 수 있다(예컨대, PCT Publication Nos. WO00/00823 및 WO00/39585 참조). 결합 소분자는 또한 상기 KDM5의 JmjC 영역 및/또는 JmjN 영역에 결합하는 것들로 확인될 수 있다. 결합 소분자는 일반적으로 크기가 약 2000 달턴 미만, 선택적으로 크기가 약 1500, 750, 500, 250 또는 200 달턴 이하이고, 여기서 바람직하게는 본원에 기술된 폴리펩티드에 특이적으로 결합 할 수 있는 상기 소분자는 잘 알려진 기법들을 사용하여, 과도한 실험 없이 확인될 수 있다. 이런 점에서, 관심대상의 폴리펩티드에 결합할 수 있는 분자들에 대한 유기 소분자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 기법들이 당해기술에 잘 알려져 있다(예컨대, PCT Publication Nos. WO00/00823 및 WO00/39585). 결합 유기 소분자는, 예를 들어, 알데히드, 케톤, 옥심, 히드라존, 세미카바존, 카바지드, 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, N-치환된 히드라진, 히드라지드, 알코올, 에테르, 티올, 티오에테르, 디설피드, 카복실산, 에스테르, 아미드, 우레아, 카르바메이트, 카보네이트, 케탈, 티오케탈, 아세탈, 티오아세탈, 아릴 할라이드, 아릴 술포네이트, 알킬 할라이드, 알킬 술포네이트, 방향족 화합물, 이종고리 화합물, 아닐린, 알켄, 알카인, 디올, 아미노 알코올, 옥사졸리딘, 옥사졸린, 티아졸리딘, 티아졸린, 엔아민, 술폰아미드, 에폭시드, 아지리딘, 이소시아네이트, 술포닐 클로라이드, 디아조 화합물, 염화산 등일 수 있다.
E. 길항제 폴리뉴클레오티드
본원에 기술된 방법들에서 사용하기 위한, 또한 폴리뉴클레오티드 길항제가 또한 제공된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 안티센스 핵산 및/또는 리보자임일 수 있다. 상기 안티센스 핵산은 관심대상 유전자, 예컨대 본원에 기술된 KDM5 유전자 및/또는 EGFR 유전자의 RNA 전사의 최소한 일부분에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5는 하나 이상의 KDM5A, KDM5B, KDM5C 및/또는 KDM5D이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5는 KDM5A 및/또는 KDM5B이다. 그러나, 절대적 상보성은, 비록 바람직하긴 하나, 필요하지 않다.
본원에서 언급된 서열 "하나의 RNA의 최소한 일부분에 상보적인" 서열은 상기 RNA와 혼성화할 수 있을 정도의 충분한 상보성을 가짐으로써, 안정적인 듀플렉스를 형성할 수 있는 서열을 의미하는데; 이중 가닥의 안티센스 핵산과 비교하여, 상기 이중 DNA의 단일 가닥은 따라서 검사될 수 있고, 또는 삼중 제형이 분석될 수 있다. 혼성화 가능성은 상보성의 정도 및 안티센스 핵산의 길이 모두에 달려 있다. 일반적으로 혼성화하는 핵산이 클수록, 이것이 함유할 수 있는 RNA와 염기 불일치가 많아질 수 있고, 여전히 안정적인 이중(또는 해당 경우에, 삼중)를 형성할 수 있다. 당해기술의 숙련가는 표준 절차의 사용에 의해 불일치의 허용 정도를 확인하여, 혼성화된 복합체의 녹는점을 판단할 수 있다.
상기 메시지의 5'번 말달, 예컨대, AUG 개시 코돈까지 포함하는 5' 미번역된 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드가 번역을 억제하는 데 가장 효율적으로 작동해야 한다. 그러나 mRNA의 3' 미번역된 서열에 상보적인 서열은 mRNA의 번역을 억제하는 데도 역시 효과적임을 나타내었다. 일반적으로 Wagner, R., 1994, Nature 372:333-335 참조. 따라서, 5'- 또는 3'-미번역된, 미코딩된 부위에 상보적인 상기 유전자의 올리고 뉴클레오티드가 내생적 mRNA의 번역을 억제하기 위한 안티센스 접근방식에 사용될 수 있다. 상기 mRNA의 5' 미번역된 부위에 상보적인 폴리뉴클레오티드는 상기 AUG 시작 코돈의 상보체를 포함해야 한다. mRNA 코딩 부위에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오티드는 효율이 덜한 번역 억제제이지만, 본 발명에 사용될 수 있다. mRNA의 5'-, 3'- 또는 코딩부위에 혼성화하도록 설계된 안티센스 핵산은 그 길이가 적어도 6개 뉴클레오티드이고, 바람직하게는 길이가 6 내지 약 50개의 뉴클레오티드를 갖는 올리고뉴클레오티드이다. 특정 측면에서, 상기 올리고뉴클레오티는 최소한 10개 뉴클레오티드, 최소한 17개 뉴클레오티드, 최소한 25개 뉴클레오티드 또는 최소한 50개 뉴클레오티드이다.
효과적일 수 있는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)의 예에는 KDM5A(성숙한 안티센스)의 경우, TGCCGTTTCCATTATTCAA(서열식별번호: 5), TCAGTCATGAGAGTCAATT(서열식별번호: 6) 및 TACTAGAGGACTTCACACT(서열식별번호:7)을 기반으로, KDM5B(성숙한 안티센스)의 경우, TCGAAGCTTCAATGCATTC(서열식별번호:8), TATCGAAGTGCATCTCCCT(서열식별번호:9) 및 TTCGGAATAGGATGTGTCT(서열식별번호: 10)를 기반으로 한 shRNA이 포함된다.
F. 항체 및 결합 폴리펩티드 변종
어떤 구현예에서, 본원에 제공되는 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 변종이 구상된다. 예를 들어, 상기 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성들을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 변종은 적절한 변형을 상기 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 도입하거나, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이와 같은 변형에는, 예를 들어, 상기 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 내 잔기의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환이 포함된다. 결실, 삽입 및 치환의 모든 조합이 이루어져 최종 구성물에 도달할 수 있는데, 단, 상기 최종 구성물은 원하는 특징들, 예컨대 항원-결합을 갖는다.
어떤 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환 항체 변종 및/또는 결합 폴리펩티드 변종이 제공된다. 치환성 돌연변이유발을 위한 관심대상 자리에는 HVR 및 FR가 포함된다. 보존적 치환이 "바람직한 치환"이라는 제목으로 표 1에 표시되었다. 좀 더 실질적인 변화가 "예시적 치환"이란 제목으로 표 1에 제공되었고, 아래에 아미노산 측쇄 부류에 대하여 좀 더 상세히 기술되었다. 아미노산 치환은 항체 및/또는 관심대상의 결합 폴리펩티드에 도입되어 상기 생성물이 원하는 활성, 예컨대, 유지된/개선된 항원 결합, 감소된 면역성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
표 1
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(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 방향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존적 치환은 이들 부류들 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로의 교환을 수반한다.
G. 항체 및 결합 폴리펩티드 유도체
어떤 구현예에서, 본원에 제공되는 항체 및/또는 결합 폴리펩티드는 추가로 변형되어 당해기술에 알려져있고 쉽게 확보가능한 부가적 비단백질성 모이어티를 함유할 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 유도화에 적합한 상기 모이어티는, 비제한적으로 수용성 중합체를 포함한다. 수용성 중합체의 비제한적 예는, 비제한적으로, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레 무수물 공중합체, 폴리아미노산(동종중합체 또는 랜덤 공중합체) 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 프롤리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸레이트 폴리올예컨대, 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 물 속에서 그것의 안정성 때문에 제조에 유리함을 가질 수 있다. 상기 중합체는 어떤 분자량도 가질 수 있고, 분지형 또는 미분지형 중 어떤 것이든 될 수 있다. 상기 항체 및/또는 결합 폴리펩티드에 부착되는 중합체의 개수는 다양할 수 있는데, 둘 이상의 중합체가 부착되는 경우, 이들은 동일하거나 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도화에 사용되는 중합체의 개수 및/또는 유형은 고려사항들, 예컨대 비제한적으로 상기 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 개선될 특정 특성들 또는 기능들, 상기 항체 유도체 및/또는 결합 폴리펩티드 유도체가 규정된 조건 하에서 치료에 사용될 것인지 여부 등을 기반으로 결정될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 선택적으로 방사선에 노출됨으로써 가열될 수 있는, 항체 및/또는 결합 폴리펩티드과 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 하나의 구현예에서, 상기 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브(Kam 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))이다. 상기 방사선은 어떤 파장이든 가질 수 있고, 비제한적으로, 일반 세포에 해롭지 않지만, 상기 비단백질성 모이어티를 상기 항체 및/또는 결합 폴리펩티드-비단백질성 모이어티에 가까이 있는 세포들이 사멸되는 온도로 가열하는 파장을 포함한다.
IV. 원하는 기능을 갖는 EDM5 길항제를 스크리닝 및/또는 확인하는 방법
본원에 기술된 방법에 사용하기 위한, 관심대상의 폴리펩티드, 예컨대 KDM5 및/또는 EGFR의 부가적 길항제, 예를 들어 항체, 결합 폴리펩티드 및/또는 소분자가 앞서 기술된 바 있다. 본원에 제공되는 항-KDM5 항체, 결합 폴리펩티드 및/또는 결합 소분자와 같은 부가적 길항제는 당해기술에 알려진 다양한 분석법에 의해 이들의 물리적/화학적 특성들 및/또는 생물학적 활성들에 대해 식별, 스크리닝 또는 특징지어질 수 있다.
어떤 구현예에서, KDM5 폴리펩티드의 원자 좌표를 포함하는 메모리가 포함된 컴퓨터 시스템이 KDM5의 리간드 결합 부위를 갖는 화합물을 합리적으로 식별하기 위한 모형으로 유용하게 쓰일 수 있다. 이와 같은 화합물은 신규로, 또는 예를 들어 알려진 화합물의 변형에 의해, 구성될 수 있다. 기타 경우에, 결합 화합물은 알려진 화합물을 테스트함으로써 확인되어 KDM5의 분자 모형을 갖는 "독(dock)"인지 여부를 확인할 수 있다. 이와 같은 도킹 방법은 일반적으로 당해 기술에 잘 알려져 있다.
상기 KDM5 결정구조 데이터가 컴퓨터 모형 기법과 함께 사용되어, 상기 결정구조 데이터의 분석에 의해 다양한 KDM5-결합 화합물의 결합의 모형을 발전시킬 수 있다. 상기 자리 모형은 자리 표면의 3차원 지형뿐만 아니라, 반데르발스 접촉, 정전기적 상호작용 및 수소-결합 기회와 같은 인자들을 특징으로 한다. 컴퓨터 시뮬레이션 기법이 이어서 사용되어, 상기 모형 자리와 상호작용하도록 고안된 작용기, 예를 들어, 비제한적으로 양자, 히드록시기, 아민기, 2가 양이온, 방향족 및 지방족 작용기, 아미드기, 알코올 기 등에 대한 상호작용 위치를 매핑할 수 있다. 이와 같은 작용기들은 약물분자구조 또는 후보 화합물로 설계될 수 있는데, 이것은 이들 후보 화합물이 상기 자리에 특이적으로 결합할 것이라는 기대 때문이다. 약물분자구조 설계는 따라서 상기 약물분자구조에 속하는 후보 화합물들의능력, 즉 모든 가능한 유형의 화학적 상호작용, 예를 들어, 수소 결합, 반데르발스, 정전기및 공유결합 상호작용을 통해 자리와 상호작용하는 능력의 고려가 수반되는데, 그러나 일반적으로 약물분자구조는 비공유 기전을 통해 자리와 상호작용한다.
KDM5 폴리펩티드에 결합하는 약물분자구조 또는 후보 화합물의 능력은 컴퓨터 모형화 기법을 사용한 실제 합성에 덧붙여 분석될 수 있다. 컴퓨터 모형화에 의해 충분한 결합 에너지(한 예로, 10-2　M 정도 또는 그보다 더 강한 표적과의 해리 상수에 상응하는 결합 에너지)로 상기 표적(예컨대, KDM5 폴리펩티드 결합 부위)에 결합하는 것으로 표시되는 후보 화합물들만이 합성되고, 그들의 능력, KDM5 폴리펩티드에 결합하는 능력, 및 KDM5를 억제하는 능력, 해당되는 경우, 당해기술의 숙련가에 알려진 및/또는 본원에 기술된 효소 분석법을 사용하는 효소 기능에 대해 테스트될 수 있다. 상기 계산적 평가 방법은 따라서 충분한 친화도로 KDM5 폴리펩티드와 결합할 수 없는 화합물들의 불필요한 합성을 방지한다.
KDM5 약물분자구조 또는 후보 화합물은 계산적으로 평가되어 화학적 단위체 또는 절편이 KDM5 폴리펩티드 상의 개인 결합 표적 자리와 결합하는 그들의 능력에 대해 스크리닝 및 선택되는 일련의 단계를 이용하여 설계될 수 있다. 당해기술의 숙련가는 여러 방법들 중 하나를 사용하여 KDM5 폴리펩티드, 좀 더 구체적으로 KDM5 폴리펩티드 상의 표적 자리와 결합할 수 있는 능력에 대해 화학적 단위체 또는 절편을 스크리닝할 수 있다. 이와 같은 과정은 KDM5 폴리펩티드 좌표 또는 당해기술에 알려진 하위집단의 좌표들을 기반으로, 예를 들어 컴퓨터 화면 상의 표적 자리를 시각적으로 검사함으로써 시작될 수 있다.
암 세포 사멸을 유도하는 길항제를 선택하기 위해, 예컨대, 요오드프로피듐(PI), 트리판 블루 또는 7AAD 업테이트에 의해 표시되는 막 온전성 손실이 기준값 대비 평가될 수 있다. PI 업테이트 분석은 상보체 및 면역 효능기 세포의 부재 하에 수행될 수 있다. 종양 세포는 배지만으로 또는 상기의 적합한 병용 요법을 함유하는 배지로 배양된다. 상기 세포는 3일 시간 주기 동안 배양된다. 각각의 처리 후, 세포 덩어리의 제거를 위해 세포가 세척되고, 35mM strainer-마개 씌운 12 x 75 시험관(시험관 1개당 1 ml, 처리군당 시험관 3개)에 분취된다. 이어서 시험관PI(10 ㎍/ml)가 첨가된다. 샘플들은 FACSCAN®유세포 분석기 및 FACSCONVERT®CellQuest 소프트웨어(Becton Dickinson) 를 사용하여 분석될 수 있다. PI 업테이크에 의해 측정된 바와 같이 배지로만 배양 및/또는 단일요법과 비교하여, 세포 사멸의 통계적으로 유의미한 수치를 유도하는 길항제들은 세포 사멸-유도 항체, 결합 폴리펩티드 또는 결합 소분자로 선택될 수 있다.
상기의 스크리닝 및/또는 확인하는 방법들 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 후보 KDM5의 길항제는 항체, 결합 폴리펩티드, 결합 소분자 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제는 결합 소분자이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5 길항제는 KDM5 메틸기분해효소 활성을 억제한다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5는 KDM5A, KDM5B, KDM5C 및/또는 KDM5D 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5는 KDM5A 및/또는 KDM5B이다.
V. 약제학적 제형
본원에 기술된 KDM5의 길항제 및/또는 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)의 약제학적 제형은 원하는 순도를 갖는 항체를 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용가능한 운반체(Remington's Pharmaceutical Sciences 제16판, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합하여, 감압하 동결건조된 제형 또는 수성 용액의 형태로, 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제 및/또는 표적 치료제는 결합 소분자, 항체, 결합 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 상기 암 치료제제는 EGFR 길항제이다. 일부 구현예에서, 상기 암 치료제제는 탁산이다. 일부 구현예에서, 상기 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 구현예에서, 상기 탁산은 도세탁셀이다.
약제학적으로 허용가능한 운반체는 일반적으로 사용되는 용량 및 농도에서 수예자에게 해롭지 않고, 비제한적으로: 완충액, 예컨대 인산염, 구연산염 및 기타 유기산; 항산화제, 예컨대 아스코브산 및 메티오닌; 보존제 (옥타데실디메틸벤질 암모늄클로라이드); 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글루불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예컨대 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린; 킬레이트 제제, 예컨대 EDTA; 당류, 예를 들어 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예컨대, 아연-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 본원에서의 예시적 약제학적으로 허용가능한 운반체는 추가로 간질 약제 분산제, 예컨대 용해성 중성-활성 히알루로니다아제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어, 인간 수용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예컨대 rHuPH20(HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 포함한다. 일부 예시적 sHASEGPs 및 사용 방법, 예를 들어 rHuPH20은 미국 특허 공부 Nos. 2005/0260186 및 2006/0104968에 기술되었다. 한 측면에서, sHASEGP는 하나 이상의 부가적 당아미노글리카나아제, 예컨대 콘드로이티나아제와 조합된다.
예시적 감압하 동결건조된 제형이 미국 특허 No. 6,267,958에 기술되었다. 수성 항체 제형은 미국 특허 No. 6,171,586 및 WO2006/044908에 기술된 것들을 포함하는데, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
본원의 상기 제형은 또한 필요에 따라, 처리되는 특정 표시를 위해, 둘 이상의 성분들, 바람직하게는 상보적 활성을 가지며 서로 부정적인 영향을 미치지 않는 것들을 함유할 수 있다. 이와 같은 활성 성분은 원하는 목적에 효과적인 양으로 ㅈ조합에 존재한다.
활성 성분은, 콜로이드 약제 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노입자들 및 나노캡슐) 또는 마이크로에멀션에서, 예를 들어, 코아세르베이션(coacervation) 기법 또는 계면 중합반응에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예컨대 각각 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 캡슐화될 수 있다. 이와 같은 기법들이 Remington's Pharmaceutical Sciences 제16판, Osol, A. Ed. (1980)에 개시되었다.
서방형 제제가 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예에는 KDM5의 길항제 및/또는 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 기질을 포함하고, 상기 기질은 형태가 있는 입자들, 예컨대, 필름 또는 마이크로캡슐이다.
체내 투여를 위해 사용되는 제형은 일반적으로 살균된다. 살균은 예컨대, 살균된 여과막을 통과시킴으로써, 쉽게 달성될 수 있다.
VI. 제조 물품
본 발명의 또 다른 측면에서, 앞서 기술된 질환의 치료, 예방 및/또는 진단을 위해 유효하게 쓰이는 물질을 함유한 제조 물품이 제공된다. 상기 제조물품은 용기 및 라벨 또는 상기 용기 상에 또는 그것과 결합되는 포장 삽입물을 함유한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 유리병, 주사기, IV 용액 팩등을 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 상기 용기에는 그 자체 또는 질환의 치료, 예방 및/또는 진단을 위해 효과적인 또 다른 조성물과 함께 조합된 조성물이 담기고, 살균된 접속포트(예를 들어, 상기 용기는 피하주사기의 바늘에 의해 구멍을 낼 수 있는 마개를 가진 정맥 용액 팩 또는 유리병일 수 있고가 있을 수 있다. 상기 조성물 중 최소한 하나의 활성 제제는 본원에 기술된 KDM5의 길항제이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 상기 조성물이 선택된 질환을 치료하는 데 사용됨을 표시한다. 뿐만 아니라, 상기 제조 물품은 (a) 안에 조성물이 담긴 제1 용기상기 조성물은 KDM5의 길항제를 포함) 및 (b) 안에 조성물이 담긴 제2 용기상기 조성물은 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법))를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제조 물품은 용기, 상기 용기에 붙은 라벨 및 상기 용기 내 담긴 조성물을 포함하고; 상기 조성물은 하나 이상의 시약(예컨대, 하나 이상의 생물학적 마커 또는 프로브에 결합하는 주요 항체 및/또는 본원에 기술된 하나 이상의 생물학적 마커에 결합하는 프라이머)을 포함하고, 상기 용기에 붙은 라벨은 상기 조성물이 샘플에 하나 이상의 생물학적 마커의 존재를 평가하는 데 사용될 수 있음을 표시하고, 샘플 중 하나 이상의 생물학적 마커의 존재를 평가하기 위해 상기 시약들을 사용하는 것에 대한 지시사항이 있다. 상기 제조 물품은 추가로 상기 샘플을 제조하고 상기 시약을 활용하기 위한 일련의 지시사항 및 재료들을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제조 물품은 1차 및 2차 항체 모두를 비롯한 시약들을 포함할 수 있고, 여기서 상기 2차 항체는 표지자, 예컨대, 효소 표지자에 접합된다. 일부 구현예에서, 상기 제조 물품은 본원에 기술된 하나 이상의 생물학적 마커에 결합하는 하나 이상의 프로브 및/또는 프라이머를 포함한다.
상기 제조 물품 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제 및/또는 상기 암 치료제제는 항체, 결합 폴리펩티드, 결합 소분자, 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 상기 암 치료제제는 탁산이다. 일부 구현예에서, 상기 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 구현예에서, 상기 암 치료제제는 EGFR 길항제이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제 및/또는 EGFR 길항제는 결합 소분자이다. 일부 구현예에서, 상기 EGFR 결합 소분자 길항제는 에르로티닙이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5의 길항제 및/또는 EGFR 길항제는 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 단클론 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 인간, 인간화된, 또는 키메라 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 항체 절편이고 상기 항체 절편은 KDM5 및/또는 억제제와 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5 길항제는 KDM5 메틸기분해효소 활성을 억제한다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5는 KDM5A, KDM5B, KDM5C 및/또는 KDM5D 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 상기 KDM5는 KDM5A 및/또는 KDM5B이다.
본 발명의 본 구현예의 제조 물품은 추가로 상기 조성물이 특정 질환을 치료하는 데 사용될 수 있음을 표시하는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 포장 삽입물은 상기 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법) 이전에 및/또는 동시에 KDM5 길항제를 투여하기 위한 지시사항들을 포함한다. 선택적으로 또는 부가적으로, 상기 제조 물품은 추가로 약제학적으로 허용가능한 완충액, 예컨대 정균처리한 주사용수(BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 포함한다. 이것은 또한 상업적으로 그리고 사용자의 입장에서 바람직한 기타 물질들, 예를 들어 기타 완충액, 희석제, 여과지, 바닐 및 주사기를 포함할 수 있다.
상기 제조 물품 중 기타 선택된 구성물품들은 하나 이상의 완충액(예컨대, 차단 완충액, 세척 완충액, 기질 완충액 등), 기타 시약, 예컨대 기질(예컨대, 크로모겐)(효소 표지자에 의해 화학적으로 변경됨), 항원결정부 회수 용액, 대조군 샘플(양성 및/또는 음성 대조군), 대조군 슬라이드(들) 등을 포함할 수 있다.
상기 제조 물품들 모두 KDM5의 길항제 및 암 치료제제(예컨대, 표적 치료제, 화학치료제, 및/또는 방사선요법)에 대신에 또는 이들과 더불어 본원에 기술된 면역접합체를 포함할 수 있음이 이해되어야 한다.
실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예들이다. 앞서 제공된 일반적인 설명을 고려할 때, 다양한 다른 구현예들이 실행될 수 있음이 이해된다. 결과들은 또한 도면 및 도면 범례에 제시 및 기술된다.
실시예 1
재료 및 방법
세포 배양
모든 세포를 37℃, 5% CO2　하에서 5% 소태아 혈청(FBS) 및 L-글루타민으로 보충된 RPMI 배지(고함량의 글루코오스)에 유지하였다.
세포 생존 분석
3x104　세포를 12-웰 클러스터 디시의 각 웰에 플레이팅하였다. 플레이팅하고 24시간 후, 배지를 제거하고 약제가 함유된 배지로 대체하였다. 처리되지 않은 세포가 합류에 도달할 때까지 2일마다 새 배지로 교체하였다. 이어서 배지를 제거하고, 세포를 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척한 후, PBS 중 4% 포름알데하이드로 15분 동안 고정하였다. 그러고 나서, 세포를 PBS로 세척하고, 15분 동안 형광 핵산 염색제, Syto60(PBS 중 1nM; Molecular Probes)로 염색하였다. 염색제를 제거하고, 세포 단일층을 PBS로 세척하고, Odyssey Infrared Imager (Li-Cor Biosciences)로 700nm에서 형광정량화를 수행하였다.
약제 내성 지속생존체(DTPs)의 생성
약제-민감성 세포를 확립된 IC50　값들의 100배를 초과하는 농도의 본원에 기술된 관련 약제로, 3회 처리하였고, 각각의 처리는 72시간 동안 지속하였다. 관련 약제 3회 처리가 끝나고 여전히 접시에 부착되어 있는 생존가능한 세포는 DTP라고 생각하여, 분석을 위해 수집하였다.
구체적으로 카보플라틴 및 파클리탁셀 DTP의 경우, 세포를 플레이팅하여 세포군집 60~70%에 도달할 때까지 성장시킨 후, 카보플라틴(5.38 uM) 및 파클리탁셀(1.25uM)로 5회 처리하였고, 각각 처리 시간은 24시간이고 사이 휴지 시간은 48시간이었다. DTP를 수집하여 최종 화학치료제 투여 1주일 후 분석하였다.
감마 방사선
감마 방사선의 경우, 상기 세포를 상기 억제제로 500,000개 세포에 리플레이팅되는 억제제로 5일 동안 처리하였다. 세포 부착 후(대략 8시간), 상기 세포에 방사선을 조사하고, 방사선 조사 5일 후 세포를 세었다.
siRNA 및 shRNA 녹다운(Knock -Down)
siRNA 녹다운의 경우, DharmaFECT 1 형질전환 지질(Dharmacon, 카탈로그 #T-2001) 0.0625 ul 및 최종 농도 12.5nM의 단일 siRNA(Dharmacon siGENOME)를 사용하여, 웰당 1000개 세포로, 블랙 96-웰 투명바닥 플레이트(Corning, 카탈로그 #3603)에서 세포를 역형질전환하였다. 추후에 상기 형질전환 배지를 교체하기 48-72시간 전에 배지 중 1uM 관련 약물 처리로 또는 배지 단독으로, 세포를 형질전환하였다. 72시간 동안 배양한 후, 약물이 있는 또는 없는 배지를 새 배지로 교체하여 관련 약제 처리 후에 생존한 약제 내성 지속생존체(DTP)를 회수할 수 있다(회수단계). 회수 단계 3일 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 CyQUANT 직접 세포 증식 분석(Molecular Probes)을 사용하여, 최종 세포 생존력을 측정하였다. GE IN 세포 분석기 2000(4X 대물렌즈)를 사용하여 CyQUANT 형광 신호를 검출하고, GE Developer Tollbox 1.9.1을 사용하여 개발된 영상 분석 알고리즘을 사용해, 웰당 페소 개수를 정량화하였다. 데이터를 마이크로소프트사의 엑셀로 추후에 처리하고, 각 세포주를 완전히 종속된 조건에서 2회 돌렸다.
KDM5 short hairpin RNA (shRNA) 실험의 경우, 상기 KDM5 shRNA를 Dharmacon (Thermo Scientific)에서 획득하였고, 서열은 다음과 같았다: KDM5A shRNA1-TGCCGTTTCCATTATTCAA(서열식별번호:5)(성숙한 안티센스), KDM5A shRNA2-TCAGTCATGAGAGTCAATT(서열식별번호:6)(성숙한 안티센스), KDM5A shRNA3-TACTAGAGGACTTCACACT(서열식별번호:7)(성숙한 안티센스), KDM5B shRNA1-TCGAAGCTTCAATGCATTC(서열식별번호:8)(성숙한 안티센스), KDM5B shRNA2-TATCGAAGTGCATCTCCCT(서열식별번호:9)(성숙한 안티센스), 및 KDM5B shRNA3-TTCGGAATAGGATGTGTCT(서열식별번호:10)(성숙한 안티센스). KDM5A siRNA 실험의 경우, 상기 KDM5A siRNAs를 Dharmacon(Thermo Scientific)에서 획득하였고, 서열은 다음과 같았다: KDM5A siRNA1 -GC AAAUGAGAC AACGGAAA(서열식별번호:11), KDM5A siRNA2-UGACAAUGGUGGACCGCAU(서열식별번호:12), KDM5A siRNA3-CAACACAUAUGGCGGAUUU (서열식별번호:13) 및 KDM5A siRNA4-GGAUGAACAUUCUGCCGAA(서열식별번호: 14).
결합 소분자 억제제 실험
일반적으로, KDM5 억제제 실험의 경우, 화학치료제 처리에 앞서 3 내지 5일 동안 활성 또는 비활성 화합물로 세포를 처리하고, 연구 기간동안 약제에 유지시켰다. 상기 CPI-382 및 CPI-383의 구조는 아래와 같다.
Figure pct00008
세포 수확 및 단백질 분석
세포 용해물을 Laemmli 샘플 완충액에서 제조하고, 앞서 기술된 바와 같이 면역블롯팅에 의해 분석하였다. 세포 용해물을 H3 상에서의 변형에 대한 상업적 항체(Abeam, Active Motif, 및 Cell Signaling Technologies)를 사용하여 분석하였다.
질량 분광법 샘플 제조
천만개 세포를 가진 샘플을 용해하여, Active Motif 히스톤 정제 키트(world wide web activemotif.com/catalog/171.html)를 사용하여 세포 용해물에서 히스톤을 단리하였다. Qubit 형광 플랫포옴(Invitrogen)을 사용하여 단리 후 단백질 정량화를 수행하였다. 목표 수득율은 5백만개 세포 당 정제된 히스톤 최소한 20㎍ 이상이었다. 이어서 상기 샘플을 유도화하고, d0/d10 프로피온산 무수물 및 트립신 소화를 사용하는 2진법 비교를 수행하였다. 구체적으로, 각 샘플의 5㎍ 분취액을 d0 프로피온산 무수물으로 유도화하여 라이신 및 모노-메틸레이티드 라이신 잔기를 차단하였다. 대조군 샘플은 15㎍을 사용하였다. 샘플을 트립신으로 소화시켰다. 대조군 샘플을 d0 프로피온산 무수물로 재유도화(노출된 펩티드 N-단말 상에서)하였다. 실험군 샘플들을 d10 프로피온산 무수물로 재유도화(노출된 N-단말 상에서)하였다. 각각의 실험군 샘플을 독립적으로 대조군 샘플과 1:1로 모았다. 그런다음, 상기 샘플들에 다중-효소 소화를 수행하였다. 샘플 1개당 3가지 효소를 활용하여, 특징지어질 PTM 자리 주변에 대형 펩티드를 생성하고, 모든 자리 주변에 부수적 중첩 서열 범위를 생성한다.
질량 분광법
펩티드 소화물을 LTQ Orbitrap Velos 탠덤형 질량 분광기 상에서 데이터-의존 모드에서 나노 LC/MS/MS로 분석하였다. CID, HCD 및 ETD 분획 요법을 사용하여 데이터를 획득하였다. 데이터 취득 시, Mascot(Matrix Science)를 사용한 데이터베이스 검색을 사용하여 아세틸화, 메틸화, 디메틸화, 트리메틸화, 인산화 및 유비퀴틴화를 판단하였다. 신규 시퀀싱을 비롯한 수동 데이터 분석을 사용하여 추정상 가상현실 할당을 확인하고, Mascot에서 일치되지 않은 변형된 펩티드에 대한 미처리 데이터를 조사하였다. 정확한 질량 완전 스캔 LC/MS 데이터를 조사하여, 샘플들 ㅅ사이의 변형된 펩티드의 상대적 풍성함을 판단하였다. 트립신-소화된 프로피오닐화된 샘플을 d0/d5 쌍을 비교함으로써 각각 LC/MS 실행 내에서 정량화하였다(Garcia 등, JPR, 8, 5367-5374 (2009)의 작업에 따름). LC/MS 실행 사이에, 표지 없이, 하나 걸러 효소 샘플들을 정량화하였다.
KDM2B 메틸기분해효소 분석( MassSpec 분석)
Sf9 곤충 세포에서 전장 재조합 KDM2B 단백질을 정제하여 거의 균일하게 만들었다. 탈메틸화 반응 완충용액은 50mM TrisCl(pH 7.5), 0.02% 트리톤 X-100, 0.001% BSA, 1mM 아스코르브산염(Cat# A4034, Sigma Aldrich), 1mM TCEP 및 50μM Fe2(NH4)2(SO4)2　(Cat# F1543, Sigma Aldrich)을 함유하였다. 25μL 탈메틸화 반응 체계에서, 100nM 재조합 KDM2B 및 2μM 바이오티닐레화된 H3K36me2 펩티드(26-46 aa)를 10분 동안 화합물들과 배양하였고, 이어서 2.0μM α-케토글루타르산염(# K2010, Sigma Aldrich)을 첨가하여 반응을 개시하였다(모든 시약 농도는 최종 시약 농도였듬). 반응물은 실온에서 40분 동안 배양하고, 이어서, 1% 포름산 25㎕를 첨가하여 상기 반응물을 급속냉각하였다. 반응 종료 후, 플레이트를 밀봉하고, 분석을 위해 -80℃에서 동결하였다.
KDM3B 메틸기분해효소 분석( MassSpec 분석)
전장 재조합 Flag 태깅된 KDM3B 단백질을 Sf9 곤충 세포에서 정제하였다.
탈메틸화 반응 완충액은 50mM TrisCl(pH 7.4), 0.01% 트리톤 X-100, 0.05 mg/mL BSA, 0.4mM 아스코르브산염(Cat# A4034, Sigma Aldrich), 1mM TCEP(Cat# D9779, Sigma Aldrich), 1.4μM α-케토글루타르산염(# K2010, Sigma Aldrich) 및 40μM Fe2(NH4)2(SO4)2　(Cat# F1543, Sigma Aldrich)을 함유하였다. 25μL 탈메틸화 반응 체계에서, 15nM 재조합 KDM3B를 상기 완충액에서 10분 동안 화합물들과 배양하고, 이어서 1.4μM α-케토글루타르산염(# K2010, Sigma Aldrich) 및 2.5μM 바이오티닐화된 H3K9me1 펩티드(1-21 aa)를 첨가하여 상기 반응을 개시하였다(모든 시약 농도는 최종 시약 농도임). 반응물을 실온에서 15분 동안 배양하고, 이어서 동일한 부피의 1% 포름산의 첨가로 급속냉각하였다. 반응 종료 후, 플레이트를 밀봉하여 분석을 위해 -80℃에서 동결하였다.
KDM3B 메틸기분해효소 분석 (TR-FRET 분석)
전장 재조합 Flag 태깅된 KDM3B 단백질을 Sf9 곤충 세포에서 정제하였다. 상기 탈메틸화 반응 완충액은 50mM TrisCl(pH 7.3), 0.02% 트리톤 X-100, 0.05mg/mL BSA, 0.4mM 아스코르브산염(Cat# A4034, Sigma Aldrich), 1mM TCEP(Cat# D9779, Sigma Aldrich) 및 40μM Fe2(NH4)2(SO4)2　(Cat# F1543, Sigma Aldrich)을 함유한다. 10μL 탈메틸화 반응 체계에서, 0.5nM 재조합 KDM3B 및 0.1μM 바이오티닐화된 H3K9me1 펩티드(1-21 aa)를 상기 완충액에서 10분 동안 배양하고, 이어서 1.4μM α-케토글루타르산염(# K2010, Sigma Aldrich)을 첨가하여 상기 반응을 개시하였다(모든 시약 농도는 최종 시약 농도임) 반응물을 실온에서 15분 동안 배양하고, 이어서 동일한 부티의 결실 용액(50mM TrisC1pH 7.3, 0.02% 트리톤 X-100, 0.05 mg/mL BSA, 0.05mM EDTA, 0.2mM NOG, 0.05 uM Ulight-SA(Perkin-Elmer Corp.) 및 0.2nM PE Eu-anti-H3K9me0 항체(Perkin-Elmer Corp.))을 첨가하여 급속냉각하였다. 플레이트를 30분 동안 배양하고 Perkin-Elmer Envision 기구에서 판독하였다.
KDM5A 메틸기분해효소 분석 ( MassSpec 분석)
전장 재조합 Flag 태깅된 KDM5A 단백질을 Sf9 곤충 세포에서 정제하였다. 상기 탈메틸화 반응 완충액은 50mM TrisCl(pH 7.4), 0.01% 트리톤 X-100, 0.025mg/mL BSA, 1mM 아스코르브산염(Cat# A4034, Sigma Aldrich), 2mM TCEP(Cat# D9779, Sigma Aldrich), 2.0μM α-케토글루타르산염(# K2010, Sigma Aldrich) 및 50μM Fe2(NH4)2(SO4)2　(Cat# F1543, Sigma Aldrich)을 함유하였다. 25μL 탈메틸화 반응 체계에서, 20nM 재조합 KDM5A를 상기 완충액에서 10분 동안 배양하고, 이어서 2.0 α-케토글루타르산염(# K2010, Sigma Aldrich), 4.0μM 바이오티닐화된 H3K9me1 펩티드(1-21 aa) 및 Fe2(NFL)2(SO4)2를 첨가하여 상기 반응을 개시하였다(모든 시약 농도는 최종 시약 농도임) 반응물을 실온에서 30분 동안 배양하고, 이어서 동일 부피의 1% 포름산을 첨가하여 급속냉각하였다. 반응 종료 후, 플레이트를 밀봉하여 분석을 위해 -80℃에서 동결하였다.
메틸기분해효소 분석을 위한 고속대량 질량 분광법(HT-MS) 분석
모든 반응물을 Agilent(이전 명칭은 BioCius Inc)에서 개발한 RapidFire™HT-MS 플랫포옴으로 판독하고, 상세히 기술하였다(Analysis and Drug Development Technologies, 2004; 2(4): 373-381). 요약하면, 플레이트를 해동하고, 그 즉시 Sciex API4000 트리플 quadrapole 질량 분광기와 결합된 RapidFire™시스템을 사용하여 분석하였다. 상기 샘플을 상기 플레이트에서 클린업 카트리지(Agilent column A)로 직접 옮겨서 3-초 세척 주기로 0.1% 포름산을 사용하여 비휘발성 분석 성분을 제거하였다. 상기 펩티드 기질 및 탈메틸화된 생성물을 80% 아세토니트릴, 0.1% 포름산으로 상기 질량 분광기에 공동용출시켰다. 상기 기질 및 생성물 신호들은 모두 +5 전하종에서 판독하였고, 기질에서 생성물로의 전환을 평가하였다.
JARID 세포 분석( 전범위 H3K4me3 변화 측정)
세포를 96-웰 이미징 플레이트(BD Falcon #353219)에 10% DMEM 중에 플레이팅하였다. 대략 24시간 후, 배지를 0% DMEM로 바꾸고, 화합물을 0% DMEM 중에 적절하게 첨가하였다. 화합물 첨가하고 24시간 후, 세포를 실온에서 10분 동안 4% PFA에 고정시키고, 얼음처럼 차가운 메탄올을 -20℃에서 10분 동안 첨가하였다. 이어서 세포를 세척하고, PBS를 첨가하였다. 플레이트를 염색될 때까지 4℃에 보관하였다.
차단 용액(PBS 중 1% BSA, 5% 정상적 염소혈청, 0.3% 트리톤 X-100, 살균된 필터)으로 차단함으로써 H3K4me3 염색을 위해 세포를 실온에서 30분 동안 염색하고, 이어서 제 1 항체 혼합물(토끼 항-H3K4me3(Cell Signaling #9751) 1:200 및/또는 마우스 항-총 히스톤(Millipore #MAB3422) 1:300을 갖는 차단 용액)을 실온에서 45분 동안 첨가하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 이어서 제2 항체 혼합물(염소 항-토끼 IgG Alexa Fluor 488(Invitrogen #A11034) 1:500, 염소 항-마우스 IgG Alexa Fluor 594(Invitrogen #A11032) 1:500, 및/또는 Hoechst 33342(Invitrogen #H3570) 1:4000을 갖는 차단 용액)을 실온 암식에서 45분 동안 첨가하였다. 차후에 세포를 PBS로 세척하고 촬영할 때까지 4℃의 PBS(D100)에 보관하였다. 세포의 영상을 ImageXpress에서 획득하였다.
H3K4me3 MSD
세포를 PBS로 헹구고, MSD 버퍼 AT(10mM HEPES, pH 7.9, 5mM MgC12, 0.25M 수크로오스, 벤조나아제(1:10000), 새 1x 프로테아제 억제제 칵테일로 보충된 1% 트리톤 X-100 및 1mM PMSF/AEBSF)를 첨가하였다. 세포를 30분 동안 용해하고, 이어서 5M NaC110 uL를 첨가하고 또 다시 15분 동안 얼음에서 용해되게 두었다. 용해물을 150uL 얼음처럼 찬, 무염, 무세제 완충액(20mM Tris pH 7.5, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 새로운 1x 프로테아제 억제제 칵테일 및 1mM PMSF로 보충됨)로 헹궜다.
MSD 플레이트(카탈로그 #L15XA-3)를 포획 항체 항-히스톤(Millipore 카탈로그 # MAB3422)으로 분석하였고, H3K4me3의 경우 2ug/mL 최종 농도 및/또는 H3에 대한 플레이트 테스팅의 경우: 1ug/mL 최종 농도. MSD 플레이트를 이어서 5% Blocker A(MSD 카탈로그 #R93 AA-2)로 차단하였다. 추후에 MSD 플레이트로 용해물을 옮기고, 밀봉하며 실온에서 2.5시간 동안 교반하며 배양하고, 이어서 TBST 중 1% Blocker A에서 검출 항체로 30분 동안 배양하였다(0.125μg/mL의 항-히스톤 H3(세포신호에서 #4499) 및/또는 1μg/mL의 항-K4Me3(세포신호에서 #9751). TBST 중 1% Blocker A에서 설포-태그 토끼 항체를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 항-K4Me3(9751) 1μg/mL 및 항-히스톤 H3(#4499) 0.5μg/mL을 사용하였다. 1x Read 버퍼(Read 완충액)(MSD 카탈로그 #R92TD-3)를 첨가하고, MSD SECTOR® Imager 2400에서 판독하였다. 0% 또는 Min(최소)의 DMSO로 처리된 샘플을 사용하여 제공된 MACRO 템플릿을 사용해 데이터를 분석하였다. 각 웰의 메틸 마크 수치와 상응하는 히스톤 H3 수치의 비율을 계산하고, 상기를 정상화 및 평균화함으로써 데이터를 또한 총 히스톤 H3으로 정상화하였다.
결과
KDM5는 H3의 라이신 4에서 트리- 및 디- 메틸 마크를 제거할 수 있는 메틸기분해효소이다. KDM5는 또한 JARID1라고도 하며, 인간의 메틸기분해효소의 상기 KDM5/JARID1 계열은 4가지 구성원 KDM5A, KDM5B, KDM5C 및 KDM5D를 함유한다. 도 1에 나타난 바와 같이, KDM5 계열 구성원들은 5개의 보존적 영역을 함유한다: JmjN, ARID, JmjC, PHD 및 C5HC2 아연 핑거.
도 2A에 나타낸 바와 같이, KDM5A 및 KDM5B는 둘 다 모체 PC9 세포와 비교하여, 인간 비-소세포-폐암 세포주 PC9 약제 내성 지속생존체(DTPs)에서 발현이 증가된다. 추가로, 도 2B에 나타난 바와 같이, KDM5A mRNA의 상대적 발현 수치는 나이브 폐 선암종 환자와 비교하여, 신보조제 폐 선암종 환자 샘플에서 높다. 웨스턴 블롯팅 및 MSD ELISA에 의한, KDM5A 및 KDM5B의 발현 수치의 변화와 상응하게, H3K4 me3 및 H3K4 me2는 도 2C-D에 나타난 바와 같이, PC9 모체 세포와 비교하여, PC9 DTP에서 감소된다.
KDM5A 메틸기분해효소 활성이 약물 내성의 성립을 위해 필요함을 확인하기 위해, 3'-UTR-GFP 녹다운을 갖는 KDM5A 짧은 헤어핀의 발현이 나타나 PC9 약제 내성 세포를 제거하였다. 3'-UTR-GFP 녹다운을 갖는 KDM5A 짧은 헤어핀에 의한 PC9 약제 내성 세포의 제거를 KDM5A 야생형-FLAG 태깅된의 공동 발현에 의해 구제하였다; 그러나 KDM5A 메틸기분해효소-촉매 불활성 변이체는 3'-UTR-GFP 녹다운을 갖는 KDM5A 짧은 헤어핀에 의한 PC9 약제 내성 세포의 제거를 구제할 수 없다. 도 3B-C 참조. 이와 같은 실험들은 wt KDM5a가 존재하지 않는 한, 약제-내성 세포가 내인성 유전자의 녹다운을 잃음을 입증하였다.
도 4에 나타나고 앞서 기술된 소분자 KDM5 길항제는 H3K4의 탈메틸화를 억제할 수 있고, H3K4 me3의 축적을 웨스턴 블롯팅, MSD ELISA 및 질량 분광법으로 관찰하였다. 도 4B-C, 도 5A-B, 도 10 및 데이터 표시되지 않음 참조. 이와 같은 소분자 KDM5 길항제, 예컨대 CPI-455 및 PCI-766은 도 6A-D에 나타난 바와 같이 MSD ELISA에 의한 다중 테스트 모형 PC9(NSCLC), SKBR3(유방암), H441(NSCLC) 및 H596(폐상피 선편평세포암종)에서 H3K4me3을 증가시켰다.
상기 활성 소분자 KDM5 길항제, CPI-455 및 CPI-766은 단독으로는 도 7A-B에 나타난 바와 같이, PC9 세포의 50uM 미만의 농도 및 SKBR3 중 25 uM 미만의 농도의 약제에서 96시간 후 측정된 세포 개수에 실질적으로 영향을 미치지 않았다.
그러나, 상기 농도의 상기 소분자 KDM5 길항제는 암 치료제제와 조합된 경우, 약제 내성을 망가뜨릴 수 있었다. 도 8 및 데이터 표시되지 않음에 나타난 바와 같이, 활성 소분자 KDM5 길항제, 예를 들어 CPI-455 및 CPI-766은 언급된 암 치료제제와 조합으로 PC9, SKBR3, HCC1954(유방암) 및 H441 세포주에서의 약제 내성 지속생존체의 발생을 억제할 수 있었다. 모든 경우에, 상기 KDM5 억제제는 모체 군집의 증식 또는 생존에 어떤 영향을 미치지 않는다.
이와 유사하게, 상기 활성 소분자 KDM5 길항제를 사용하여, 에르로티닙과 조합된 CPI-382는 PC9 세포에서 약제 내성 지속생존체의 발생을 감소시킬 수 있는 반면, 불활성 대조군 분자 CPI-383는 유의미한 영향을 끼치지 않았다(도 16 참조).
뿐만 아니라, 도 11 및 데이터 표시되지 않음에 나타난 바와 같은 방사선 요법의 상황에서, 활성 소분자 KDM5 길항제, 예컨대 CPI-455 및 CPI-766은 방사선 요법과 조합하여 약제 내성 지속생존체의 발생을 억제할 수 있다.
이와 같은 실험들은 상기 활성 KDM5 억제제가 웨스턴 블롯팅, MSD 분석 및 질량 분광법에 의해 측정된 바와 같이, H3K4me3의 용량-의존적 증가를 나타냄을 입증하였다.
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
실시예 2
siRNA 스크리닝 방법
DharmaFECT 1 형질전환 지질(Dharmacon, 카탈로그 #T-2001) 0.0625 ul 및 12.5nM 최종 농도의 단일 siRNA(Dharmacon siGENOME)을 사용하여 웰당 1000개 세포의 블랙 96 웰 투명 바닥 플레이트(Corning, 카탈로그 #3603)에서 세포를 역 형질전환하였다. 추후에 배지 내 1uM 관련 약제 처리에 의해 또는 배지 단독으로 상기 형질전환 배지를 교체하기 전에 48~72시간 동안 세포를 형질전환하였다. 72시간 배양 후, 약제가 있는 또는 없는 배지를 새 배지로 교체하여 관련 약제 처리 후 생종한 약제 내성 지속생존체(DTP)의 회수를 가능하게 하였다(회수 단계). 회수 단계를 거치고 3일 후, 제조업체 프로토콜에 따라 CyQUANT Direct 세포 증식 분석(Molecular Probes)을 사용하여 최종 세포 생존력을 측정하였다. GE IN 세포 분석기 2000 (4X 대물렌즈)을 사용하여, CyQUANT 형광 신호를 검출하고, GE Developer Tollbox 1.9.1를 사용하여 개발한 이미지 분석 알고리즘을 사용하여 웰당 세포의 개수를 정량화하였다. 차후에 스크리닝 데이터를 마이크로소프트 엑셀에서 처리하였다. 전체 Epi300 siRNA 스크린을, 완전히 독립적인 조건 하에서, 각 세포주에 대해 2회 실행하였다.
하기의 siRNA 서열을 사용하였다.
Figure pct00013
결과:
상기 약제로 탁산, 파클리탁셀을 사용하여 앞서 기술된 바와 같이 H1299 DTP 세포를 제조하고 스크리닝하였다. 도 6에 나타나 바와 같이 KDM5A siRNAs는 배지 단독인 경우와 비교하여, 파클리탁셀의 존재 하에, H1299 DTP 생존력을 실질적으로 감소시켰다.
실시예 3
DTP 형성에 KDM5 억제제의 역할을 연구하기 위한 흑색종 DTP 모형의 사용
흑색종은 일반적이지는 않지만, 피부암 관련 사망의 대부분을 유발하는 가장 위험한 형태의 피부암이다. 미국에서는, 약 160,000건의 새로운 흑색종이 매년 진단되고 있고, 이들 중 절반 이상이 공격적 흑색종(American Cancer Society. Cancer Facts & Figures 2014. Atlanta, Ga: American Cancer Society; 2014)이다. 흑색종 치료에서의 최근의 전개상황 중 하나는 표적 화학치료제인 베무라페닙(Chapman 등 N Engl J Med 2011; 364:2507-2516)의 사용에서부터 나오고 있다. 이 약제는 V600E BRAF 변이를 갖는 암을 가진 흑색종 환자에게서만 효과가 있다. 이와 같은 변이는 흑색종 환자의 약 절반 정도에서 발생하고, 약제에 대한 최초 반응은 좋으나, 다른 수많은 제제들과 마찬가지로, 시간경과에 따라, 세포가 본 치료에 내성을 발전시켜 더 이상 상기 치료에 반응하지 않는다.
약제 내성의 기전을 이해하기 위해, 흑색종 세포주를 활용하였다. 18개 흑색종 세포주(야생형 및 V600E 변이체 모두)를 스크리닝하여 베무라페닙-민감 세포주를 식별하였다. 상기 결과는 변이체 세포주가 베무라페닙에 민감함을 입증하였다. 3개의 서로 다른 변이체 세포주를 선택하여(A375, HT144 및 Colo-829) 약제 내성 지속생존능(DTP)을 확고히 한다. 테스트한 3개 세포주 중, Colo-829는 일관된 DTP 단계를 나타내어, 상기 세포주는 실험하기에 용이하였다. 따라서 본 세포주를 DTP 형성을 위한 선택 모형으로 선택하였다. 이후, 반 고속대량 방식으로 DTP 분석을 수행하기 위해 광범위한 분석 발생을 수행하였다. 이와 같은 단계에는 Incucyte Zoom(Essen Bio)을 사용하고, 다양한 플레이트 포맷을 테스트하여 데이터 일관성을 손상시키지 않으면서 최대수의 웰을 갖는 플레이트를 선택함으로써, 각 세포에서 이미지를 획득하는 것을 돕는 핵(Nuc-Red) 세포 내 붉은-형광 마커를 본질적으로 발현하는 colo-829 세포의 생성을 포함한다. 상기 분석이 개발되면, KDM5 억제제를 사용해 실험을 수행하여, 이들 세포에서 DTP 형성에 KDM5의 억제 효과가 있는지 여부를 판단하였다. 이와 같은 결과는 분명히 활성 KDM5 억제제로의 전처리가 베무라페닙 처리 시 형성되는 DTP의 개수를 유의미하게 감소시킴을 보여주었다.
결론적으로, Colo-829는 흑색종 세포주에서 DTP 형성을 연구하기 위한 대표적 모형 시스템으로, 여기서 얻은 결과는 기타 다른 DTP 모형과 유사하고, KDM5 억제제가 본 흑색종 모형에서 DTP 군집을 없애는데 유의미한 역할을 수행한다.
재료 및 방법
1. DTP 성립을 위한 흑색종 세포주의 선택
한 가지 목적은 베무라페닙에 민감하고 DTP 형성에 친하적인 세포주를 식별하는 것이었다. 이를 위해, 18개 흑색종 세포주 한 세트를 8개의 서로 다른 용량의 베무라페닙으로 4일간 배양한 후, 세포 적가법 Glo 판독을 사용하여 표준 세포 생존력 분석법에 의해 테스트하였다. 상기 별과는 600nM 미만의 GI50를 갖는 3가지 흑색종 세포주(A375, Colo829 및 HT144)를 확인하였다. 이들 세포주들 3가지 모두 BRAF 변이체였다. 이들 세포주를 사용한 실험 후, Colo-829를 DTP 성립을 위한 바람직한 세포주로 선택하였다.
방법
화합물: 베무라페닙을 사용하였다(P1x-4032, Selleck Chemicals)
1.1 베무라페닙에 민감한 흑색종 세포주를 식별
제0일: 1000개 세포/웰를 96-웰 평면바닥 플레이트에 총 부피 100㎕으로 플레이팅하였다.
제1일: 상기 세포를 베무라페닙으로 처리하였다. 분석 시 가장 높은 농도는 20μM고, 희석하여 농도를 3배 낮추었다(최저 농도는 9nM).
제5일: 100㎕의 Cell Titer Glo를 각 웰에 첨가하고, 상기 플레이트를 Envision에서 판독하였다. 상기 데이터를 Graphpad Prism을 사용하여 플롯팅하였다.
1.2 흑색종 세포주에서 DTP 성립
제0일: 세포(4.5x106 세포/P150 접시)를 플레이팅하였다(4 플레이트/세포주).
제2일: 모든 세포주는 60~80% 세포군집(confluent)이었다. 각 세포주에 대해 2개 플레이트를 20μM 베무라페닙으로 처리하고, 나머지 2개 플레이트를 DMSO(대조군)로 처리하였다.
제5일: 배지를 교체하였다. DMSO 처리 플레이트의 세포가 꽉 찼다. 이들 플레이트의 세포를 센 후, 이들 개수의 1/8을 새로운 2개 P150 접시에 다시 플레이팅하였다. 다른 모든 플레이트를 베무라페닙으로 처리하였다.
제8일: 배지를 교체하였다: 상기 플레이트를 베무라페닙 또는 DMSO으로 각각 처리하였다.
제11일: 상기 세포를 PBS 및 트립시나이즈로 세척하였다. 상기 세포의 개수를 세고, 상기 베무라페닙 처리 접시 대 대조군 접시에 납은 세포들의 백분율을 확인하였다. 베무라페닙 처리 접시에 남은 세포를 약제 내성 지속생존체(DTP)라고 명명하였다.
2. 반 고속대량 포맷으로 DTP 분석을 실행하기 위한 분석법 개발
2.1 NucLight Red 양성 Colo-829 세포 제조
재료: Essen Bio의 CellPlayer™NucLight Red(Lenti, EF-1 알파, bleo).
100K 세포를 6-웰 플레이트에 플레이팅하고, 다음날 NucLight Red 바이러스를 MOI 1로 첨가하였다. 차후에 상기 세포를 제오신에서 선택하여 Nuc-red 세포를 정기적으로 제오신에 유지시켰다.
2.2 6, 12 및 24 웰 포맷으로 DTP 형성의 테스트
1 x 105 세포/ml Nuc-red colo-829 세포를 6-(3ml), 12-(2ml) 및 24-(1ml) 웰 플레이트에 각각 플레이팅하였다. 2일 후, 베무라페닙(20㎛) 또는 DMSO(대조군)을 첨가하여 웰을 복제하고 DTP 형성 분석을 앞서 기술된 바와 같이 수행하였다.
3. DTP 분석에서 KDM5 억제제 테스트
사용 화합물: CPI-766(활성) 및 CPI-550(불활성)
제0일: 2 x 106 Colo-829 세포를 10cm 접시에 플레이팅하였다.
제1일: 세포를 CPI-766 또는 CPI-550 또는 DMSO 각각 25μM로 처리하였다.
제3일: 이들 KDM5 억제제로 전처리된 세포들을 12-웰 플레이트(웰 1개당 2 x 105 세포, 부피 2ml)에 4차례 플레이팅하고, 각각 KDM5 억제제를 첨가하였다. 상기 플레이트를 Incucyte에 넣어 데이터를 수집하기 시작하였다.
제5일: 상기 세포를 새로운 KDM5 억제제로 처리하였다. 웰의 개수의 절반을 20μM 베무라페닙으로 처리하고, 남아 있는 웰에 DMSO를 첨가하였다.
제8일 내지 제11일: 5일째와 마찬가지로 상기 화합물로 상기 처리를 반복하였다.
제14일: 상기 실험을 완료하였다.
실시예 4
KDM5 억제제가 대장암 세포주의 약제 내성 차단
5-플루오로우라실과 이리노테칸 활성 대사물질 SN-38의 조합물(이들의 상대적 IC50　값들의 비율로(33μM5-FU 및 6ηM SN-38))로 CRC 세포주 SW480를 연속 16일 동안 처리하고, 이어서 약제를 퇴출시킴으로써, 대장암(CRC) 치료 기준 화학치료제에 대한 내성의 모형을 개발하였다. 상기 세포들은 본 처리 기간동안 계속해서 사멸하였다. 남은 DTP 세포는 최초 세포 군진의 대략 8%를 차지하고, 크기가 크고 분열이 없는 것으로 보였다. 약제 퇴출 후, 이후 며칠 더 세포가 계속 사멸하였으나, 증식을 재개하여 확장되어 약제 없는 약 2주만에 DTEP 결장을 형성하였다.
도 17에 묘사된 바와 같이, 화학치료 전 7일 동안 KDM5 억제제 CPI-766(20μM으로 SW480 세포를 전처리함으로써 16일째에 분석된 DTP 세포 생존율이 2.9-배 감소되었다. 뿐만 아니라, 상기 KDM5 억제제는 16일째 약물 퇴출 후 생존 세포가 모두 죽자, DTP 세포 확장을 완전히 억제하고, 결장을 형성하지 않았다. 이 농도에서의 CPI-766은 화학치료의 부재 하에, 최소한 27일 동안 처리할 때 모체 SW480 세포주의 세포 생존 또는 증식에 검출할 만큼 영향을 미치지 않았다. 상기 불활성 유사체 CPI-550(20μM은 DTP 생존에 영향을 미치지 않았고, 테스트한 다른 염색질 조절제의 억제제에도 영향을 미치지 않았다(예컨대, 0.2㎛ 5-아자시티딘 및 20ηM Trichostatin A). 이와 같은 결과는 화학요법으로의 치료 동안 SW480 세포의 DTP 군집의 생존을 위해, 그리고 약물 퇴출 후 이들 세포의 확산을 위해, 특이적으로 KDM5 활성이 요구됨을 입증한다.
비록 앞서 본 발명이 이해를 명확히 하기 위해 묘사 및 예로 좀 더 상세히 기술되었으나, 이와 같은 설명 및 예들은 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것으로 여겨져서는 안 된다. 본원에서 언급된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 명백히 전체가 본원에 참조로 편입되었다.
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Claims (32)

  1. 개인에서 암을 치료하는 방법으로, 상기 개인에게 (a) KDM5의 길항제 및 (b) 암 치료제제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제 각각의 양이 암 민감성의 기간을 증가시키고 및/또는 상기 암 치료제제에 대한 세포 내성의 발생을 지연시키는 데 효과적인 것인 방법.
  3. 한 개인에서 암 치료제제를 포함하는 암 치료의 효율을 증가시키기 위한 방법으로, 상기 개인에게 KDM5의 길항제의 (a) 유효량을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  4. 한 개인에서 암을 치료하는 방법으로, 상기 암 치료가 (a) KDM5의 길항제의 유효량을 투여하고 (b) 암 치료요법을 시행하는 것을 포함하며, 상기 암 치료가 KDM5의 길항제 없이(부재 하에) 상기 암 치료제제를 유효량만큼 투여하는 것을 포함하는 치료(예컨대, 기준치료 치료)와 비교하여 효능이 증가된 것인 방법.
  5. 한 개인에서 암 치료제제에 대한 암 내성의 발생을 지연 및/또는 방지하는 방법으로, 상기 개인에게 (a) KDM5의 길항제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  6. 암 치료제제에 대한 내성을 키울 가능성을 증가시킨 암을 앓는 개인을 치료하는 방법으로, 상기 개인에게 (a) KDM5의 길항제의 유효량 및 (b) 암 치료제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  7. 암을 앓는 개인에서 암 치료제제에 대한 민감성을 증대시키는 방법으로, 상기 개인에게 KDM5의 길항제의 (a) 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  8. 암을 앓는 개인에서 암 치료제제 민감성의 기간을 연장하는 방법으로, 상기 개인에게 (a) KDM5의 길항제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  9. 암을 앓는 개인에서 암 치료에 반응하는 기간을 연장하는 방법으로 상기개인에게 (a) KDM5의 길항제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  10. 청구항 3, 5, 7, 8 또는 9 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 방법이 상기 개인에게 (b) 상기 암 치료제제의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 KDM5의 길항제가 항체 억제제, 결합 소분자 억제제, 결합 폴리펩티드 억제제, 및/또는 폴리뉴클레오티드 길항제인 것인 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 KDM5의 길항제가 KDM5와 결합하고, KDM5 메틸기분해효소 활성을 억제하는 것인 방법.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 KDM5가 KDM5A, KDM5B, KDM5C 및 KDM5D 중 하나 이상인 것인 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 KDM5가 KDM5A 및/또는 KDM5B 중 하나 이상인 것인 방법.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 KDM5가 KDM5A 및 KDM5B인 것인 방법.
  16. 청구항 13에 있어서, 상기 KDM5가 KDM5B인 것인 방법.
  17. 청구항 13에 있어서, 상기 KDM5가 KDM5A, KDM5B, KDM5C 및 KDM5D인 것인 방법.
  18. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 암 치료제제가 화학치료제인 것인 방법.
  19. 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 암 치료제제가 화학치료제이고, 상기 화학치료제가 탁산을 포함하는 것인 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 탁산이 파클리탁셀 또는 도세탁셀인 것인 방법.
  21. 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 암 치료제제가 화학치료제이고, 상기 화학치료제가 백금 제제를 포함하는 것인 방법.
  22. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 암 치료제제가 표적 치료제인 것인 방법.
  23. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 암 치료제제가 표적 치료제이고 상기 표적 치료제가 EGFR의 길항제를 포함하는 것인 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 EGFR의 길항제가 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민 또는 이것의 약제학적으로 허용가능한 염(예컨대, 에를로티닙)인 것인 방법.
  25. 청구항 22에 있어서, 상기 암 치료제제가 표적 치료제이고 상기 표적 치료제가 RAF 억제제인 것인 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 RAF 억제제가 BRAF 및/또는 CRAF 억제제인 것인 방법.
  27. 청구항 25에 있어서, 상기 RAF 억제제가 베무라페닙인 것인 방법.
  28. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 암 치료제제가 표적 치료제이고 상기 표적 치료제가 PI3K 억제제인 것인 방법.
  29. 청구항 1 내지 청구항 28 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 KDM5의 길항제가 KDM5의 소분자 길항제인 것인 방법.
  30. 청구항 1 내지 청구항 29 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 KDM5의 길항제 및 상기 암 치료제제가 부수적으로 투여되는 것인 방법.
  31. 청구항 1 내지 청구항 30 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 KDM5의 길항제가 및/또는 동시에 상기 암 치료제제 이전에 및/또는 동시에 투여되는 것인 방법.
  32. 청구항 1 내지 청구항 30 중 어느 한 청구항에 있어서, 상기 암이 폐암 (예컨대, 소세포 폐암(NSCLC)), 흑색종, 대장암, 췌장암, 및/또는 유방암인 것인 방법.
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