KR20140064971A - c-met 길항제 및 B-raf 길항제를 포함하는 조합 치료 - Google Patents

c-met 길항제 및 B-raf 길항제를 포함하는 조합 치료 Download PDF

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하르트무트 코에펜
마크 머천트
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 성장 인자 조절 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 암과 같은 병리학적 상태의 치료를 위한 요법에 관한 것이다.

Description

c-met 길항제 및 B-raf 길항제를 포함하는 조합 치료 {COMBINATION TREATMENTS COMPRISING C-MET ANTAGONISTS AND B-RAF ANTAGONISTS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2011년 9월 19일에 출원된 미국 특허 출원 번호 61/536,436, 2011년 10월 25일에 출원된 미국 특허 출원 번호 61/551,328, 2012년 2월 14일에 출원된 미국 특허 출원 번호 61/598,783, 및 2012년 5월 1일에 출원된 미국 특허 출원 번호 61/641,139를 우선권 주장하며, 이들은 그의 전체내용이 참조로 포함된다.
서열 목록
본원은 EFS-웹을 통해 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 그의 전체내용이 본원에 참조로 포함된다. 2012년 8월 28일에 생성된 상기 ASCII 복사본은 P47361WO.txt로 명명되고, 크기는 16,669 바이트이다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 성장 인자 조절 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 암과 같은 병리학적 상태의 치료를 위한 요법에 관한 것이다.
암은 인간 건강에 가장 치명적인 위협 중 하나로 남아있다. 미국에서 암은 매년 거의 130만명의 새로운 환자에게 영향을 미치고, 이는 심장 질환 다음의 제2의 주요 사망 원인이며, 사망자 4명 중 대략 1명을 차지한다. 예를 들어, 유방암은 제2의 가장 통상적인 형태의 암이며, 미국 여성 중 제2의 주요 암 사망 원인이다. 또한, 암은 5년내 사망의 1위 원인으로서 심혈관 질환을 능가할 수도 있을 것으로 예측된다. 고형 종양은 대부분의 이러한 사망의 원인이 된다. 특정 암의 의학적 치료에 있어 상당한 진전이 있었으나, 모든 암에 대한 전반적 5년 생존율은 지난 20년 동안 단지 약 10% 정도만 개선되었다. 암 또는 악성 종양은 제어되지 않는 방식으로 신속하게 전이되어 성장하기 때문에, 적기 검출 및 치료가 극도로 어려워진다.
암 치료에서의 상당한 진전에도 불구하고, 개선된 요법이 여전히 추구되고 있다.
특허 출원 및 공개를 포함하는 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그의 전체내용이 참조로 포함된다.
암 환자를 효과적으로 치료하기 위한 c-met 길항제의 용도가 제공된다. 이러한 적용은 또한 임의로 B-raf 길항제와 조합하여 c-met 길항제를 사용하는 질환 치료에 사용하기 위한 보다 우수한 질환 진단 방법을 제공한다. 특히, 기재된 결과는 B-raf 길항제 베무라페닙 (PLX-4032) 및 c-met 길항제를 사용한 조합 치료가 베무라페닙을 단독으로 사용한 치료에 비해 부분 반응에서의 놀라운 개선을 비롯하여 종양 퇴행에서 통계적으로 유의한 개선을 발생시킨다는 것을 입증한다. c-met 발현은 베무라페닙 치료에 대한 감수성과 역으로 상관된다. 또한, 보다 높은 수준의 순환 간세포 성장 인자 (HGF)를 갖는 B-raf 돌연변이체 흑색종을 갖는 환자는 B-raf 길항제를 사용하여 치료한 경우에 B-raf 길항제를 사용하여 치료된 보다 낮은 순환 HGF 수준을 갖는 환자에 비해 유의하게 감소된 무진행 생존 및 전체 생존을 보여주었다.
본 발명은 암과 같은 병리학적 상태를 치료하기 위한 조합 요법을 제공하며, 여기서 c-met 길항제는 B-raf 길항제와 조합되어 유의한 항종양 활성을 제공한다.
한 측면에서, 유효량 (조합)의 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 투여하는 것을 포함하는, B-raf 길항제에 대한 내성이 발생할 증가된 가능성을 갖는 암 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
한 측면에서, 암 환자에게 유효량의 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 투여하는 것을 포함하는, B-raf 길항제에 대한 감수성을 증가시키고/거나 회복시키는 방법이 제공된다.
한 측면에서, 암 환자에게 유효량의 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 투여하는 것을 포함하는, B-raf 길항제 감수성의 기간을 연장시키는 방법이 제공된다.
한 측면에서, 유효량의 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 투여하는 것을 포함하는, B-raf 내성 (B-raf 길항제 내성) 암을 갖는 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
한 측면에서, 유효량의 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 투여하는 것을 포함하는, B-raf 길항제에 대한 반응의 지속기간을 연장시키는 방법이 제공된다.
한 측면에서, 유효량의 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 투여하는 것을 포함하는, HGF-매개 B-raf 내성 암의 발생을 지연시키거나 예방하는 방법이 제공된다.
한 측면에서, 환자의 암이 c-met 바이오마커를 발현시키는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 c-met 바이오마커 발현은 환자가 B-raf 길항제 내성 암을 가질 가능성이 있음을 나타내는 것인, c-met 바이오마커 발현을 결정하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 환자의 암은 B-raf 바이오마커를 발현하는 것으로 나타난다. 일부 실시양태에서, c-met 바이오마커 발현은 단백질 발현이고, 환자로부터의 샘플에서 IHC를 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 높은 양의 c-met 바이오마커 (예를 들어, c-met IHC 또는 예를 들어 ELISA 또는 IHC를 이용하는 HGF의 검출을 이용하여 결정된 바와 같음)는 환자가 B-raf 길항제 내성 암을 가질 가능성이 있음을 나타낸다. 본원에 사용된 "상승된" 또는 "높은" c-met는 치료에 대한 환자 반응성과 연관된 c-met의 양을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 낮은 양의 c-met 바이오마커 (예를 들어, c-met IHC 또는 예를 들어 ELISA 또는 IHC를 이용하는 HGF의 검출을 이용하여 결정된 바와 같음)는 환자가 B-raf 길항제 내성 암을 가질 가능성이 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 높은 c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 낮은, 중간 정도의 또는 높은 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, 높은 c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 중간 정도의 또는 높은 c-met 발현이다. 본원에 사용된 c-met의 "낮은" 양은 치료에 대한 반응의 결손과 연관된 c-met의 양, 또는 일부 실시양태에서, 치료에 대한 악화된 반응 (예를 들어, 치료하지 않은 경우에 비해 감소된 임상적 이익)과 연관된 c-met의 양을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "낮은" c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 낮은 또는 전혀 없는 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, "낮은" c-met 발현은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 전혀 없는 c-met 발현이다.
한 측면에서, 환자의 암이 c-met 바이오마커를 발현하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 c-met 바이오마커 발현은 환자가 B-raf 내성 암이 발생할 가능성이 있음을 나타내는 것인, c-met 바이오마커 발현을 결정하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 환자의 암은 B-raf 바이오마커를 발현하는 것으로 나타난다. 일부 실시양태에서, c-met 바이오마커 발현은 단백질 발현이고, 환자로부터의 샘플에서 IHC를 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 환자는 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 사용하여 치료된다. 일부 실시양태에서, 높은 양의 c-met 바이오마커 (예를 들어, c-met IHC 또는 예를 들어 ELISA 또는 IHC를 이용하는 HGF의 검출을 이용하여 결정된 바와 같음)는 환자가 B-raf 길항제 내성 암을 가질 가능성이 있음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 높은 c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 낮은, 중간 정도의 또는 높은 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, 높은 c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 중간 정도의 또는 높은 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, "낮은" c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 낮은 또는 전혀 없는 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, "낮은" c-met 발현은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 전혀 없는 c-met 발현이다.
한 측면에서, 환자의 암이 c-met 바이오마커를 발현하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 c-met 바이오마커 발현은 환자가 환자의 암의 B-raf 길항제에 대한 감수성을 증가시키고/거나, 환자의 암의 B-raf 길항제에 대한 감수성을 회복시키고/거나, 환자의 암의 B-raf 길항제에 대한 감수성의 기간을 연장시키고/거나 및/또는 환자의 암에서 HGF-매개 B-raf 길항제 내성의 발생을 예방하기 위한, c-met 길항제 및 B-raf 길항제를 사용하는 치료에 대한 후보임을 나타내는 것인, c-met 바이오마커 발현을 결정하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 환자의 암은 B-raf 바이오마커를 발현하는 것으로 나타난다. 일부 실시양태에서, c-met 바이오마커 발현은 단백질 발현이고, 환자로부터의 샘플에서 IHC를 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 환자는 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 사용하여 치료된다. 일부 실시양태에서, 높은 양의 c-met 바이오마커 (예를 들어, c-met IHC 또는 예를 들어 ELISA 또는 IHC를 이용하는 HGF의 검출을 이용하여 결정된 바와 같음)는 환자가 B-raf 길항제 내성 암을 가질 가능성이 있음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 높은 c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 낮은, 중간 정도의 또는 높은 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, 높은 c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 중간 정도의 또는 높은 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, "높은" c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 낮은 또는 전혀 없는 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, "낮은" c-met 발현은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 전혀 없는 c-met 발현이다.
한 측면에서, 환자로부터의 샘플에서 c-met 바이오마커의 발현을 결정하는 것 및 바이오마커의 발현의 수준에 기초하여 암 의약을 선택하는 것을 포함하는, B-raf 바이오마커를 발현하는 것으로 나타난 암을 갖는 환자를 위한 요법을 선택하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 환자는 암 샘플이 c-met 바이오마커를 발현하는 경우에 c-met 길항제를 B-raf 길항제와 조합하여 사용하는 치료를 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 환자는 암에 대해 치료 유효량의 c-met 길항제 및 B-raf 길항제를 사용하여 치료된다. 일부 실시양태에서, 환자는 암 샘플이 실질적으로 검출가능하지 않은 수준의 c-met 바이오마커를 발현하는 경우에 c-met 길항제 이외의 암 의약을 사용하는 치료를 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 높은 양의 c-met 바이오마커 (예를 들어, c-met IHC 또는 예를 들어 ELISA 또는 IHC를 이용하는 HGF의 검출을 이용하여 결정된 바와 같음)는 환자가 B-raf 길항제 내성 암을 가질 가능성이 있음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 높은 c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 낮은, 중간 정도의 또는 높은 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, 높은 c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 중간 정도의 또는 높은 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, "낮은" c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 낮은 또는 전혀 없는 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, "낮은" c-met 발현은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 전혀 없는 c-met 발현이다.
한 측면에서, 환자의 암이 c-met 바이오마커를 발현하는지를 결정하는 것을 포함하는, 환자를 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 사용하는 치료에 대한 후보로 확인하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 높은 양의 c-met 바이오마커 (예를 들어, c-met IHC 또는 예를 들어 ELISA 또는 IHC를 이용하는 HGF의 검출을 이용하여 결정된 바와 같음)는 환자가 B-raf 길항제 내성 암을 가질 가능성이 있음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 높은 c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 낮은, 중간 정도의 또는 높은 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, 높은 c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 중간 정도의 또는 높은 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, "낮은" c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 낮은 또는 전혀 없는 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, "낮은" c-met 발현은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 전혀 없는 c-met 발현이다.
한 측면에서, 환자의 암이 c-met 바이오마커를 발현하는지를 결정하는 것을 포함하는, 환자를 B-raf 길항제에 대한 내성이 발생할 위험이 있는 것으로 확인하는 방법이 제공된다.
한 측면에서, 환자로부터 수득한 샘플에서 c-met 바이오마커 및/또는 B-raf 바이오마커의 존재를 면역검정, elisa, 혼성화 검정, PCR, 5' 뉴클레아제 검정, IHC 및/또는 RT-PCR에 의해 결정하는 것을 포함하며, 여기서 c-met 바이오마커의 존재는 B-raf 길항제가 상기 대상체에서 암을 치료하는데 치료상 효과적인 것임을 나타내는 것인, 환자에서 암을 치료하기 위한 B-raf 길항제의 치료 효능을 결정하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 환자의 암은 B-raf 바이오마커를 발현하는 것으로 나타난다. 일부 실시양태에서, B-raf 바이오마커는 돌연변이체 B-raf이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf는 구성적으로 활성화된 B-raf이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf는 B-raf V600이다. 일부 실시양태에서, B-raf V600은 B-raf V600E이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf는 B-raf V600K (GTG>AAG), V600R (GTG>AGG), V600E (GTG>GAA) 및/또는 V600D (GTG>GAT) 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf 바이오마커 발현은 (a) 샘플 (예컨대, 환자 암 샘플) 상에서 유전자 발현 프로파일링, PCR (예컨대, rtPCR 또는 대립유전자-특이적 PCR), RNA-seq, 마이크로어레이 분석, SAGE, 매스어레이(MassARRAY) 기술 또는 FISH 중 하나 이상을 수행하는 것; 및 (b) 샘플에서 돌연변이체 B-raf 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf 바이오마커 발현은 (a) 환자 암 샘플 (예컨대, FFPE 고정 환자 암 샘플)로부터 추출된 핵산 상에서 PCR을 수행하는 것; 및 (b) 샘플에서 돌연변이체 B-raf 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 환자의 암은 c-met 바이오마커를 발현하는 것으로 나타난다. 일부 실시양태에서, c-met 바이오마커 발현은 면역조직화학 (IHC)을 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, c-met 발현은 대조군 세포 펠릿의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정되고, 높은 c-met 발현은 세포주 HEK-293, A549 및 세포주 H441과 비교하여 결정된 낮은, 중간 및 강한 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, c-met 발현은 대조군 세포 펠릿의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정되고, 높은 c-met 발현은 세포주 A549 및 세포주 H441과 비교하여 결정된 중간 및 강한 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, c-met 발현은 낮은 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, c-met 발현은 대조군 세포 펠릿의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정되고, 낮은 c-met 발현은 세포주 H1155 및 세포주 HEK-293과 비교하여 결정된 전혀 없는 또는 낮은 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, c-met 발현은 대조군 세포 펠릿의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정되고, 낮은 c-met 발현은 세포주 H1155와 비교하여 결정된 전혀 없는 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, c-met 바이오마커 발현은 핵산 발현이고, 환자로부터의 샘플에서 PCR, RNA-seq, 마이크로어레이 분석, SAGE, 매스어레이 기술 또는 FISH를 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, c-met 바이오마커 발현은 포스포-ELISA를 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, c-met 바이오마커 발현은 포스포-met 발현이다. 일부 실시양태에서, c-met 바이오마커 발현은 간세포 성장 인자 (HGF)의 발현을 (예를 들어, ELISA를 이용하여) 결정함으로써 결정된다. 일부 실시양태에서, HGF 발현은 자가분비이다. 일부 실시양태에서, HGF는 종양 또는 종양 기질에서 발현된다 (예를 들어, IHC를 이용하여 결정됨). 일부 실시양태에서, 발현은 환자의 혈청에서 결정된다 (예를 들어, ELISA를 이용하여 결정됨). 일부 실시양태에서, 암은 흑색종, 결장직장암, 유방암, 난소암 또는 갑상선암이다. 일부 실시양태에서, 암은 흑색종이다. 일부 실시양태에서, 암은 유두상 갑상선암이다.
한 측면에서, 본 발명은 흑색종 환자로부터의 샘플에서 c-met 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 c-met 바이오마커는 HGF이고, HGF의 발현은 대상체에서 암에 대한 예후인 것인, 흑색종 환자에 대한 예후를 결정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 증가된 HGF 발현은 환자가 B-raf 억제제 (예를 들어, 베무라페닙)를 사용하여 치료된 경우에 예를 들어 감소된 무진행 생존 및/또는 감소된 전체 생존의 예후이다. 일부 실시양태에서, HGF 발현은 환자 혈청에서 예를 들어 ELISA를 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 환자 혈청 내의 HGF 발현은 중간 HGF 발현 수준 (예컨대, 집단에서의 중간 HGF 발현 수준) 초과이다. 일부 실시양태에서, 환자 혈청 내의 HGF 발현은 예를 들어 약 330 ng/ml 초과이다. 일부 실시양태에서, 환자 혈청 내의 HGF 발현은 약 300 ng/ml, 310 ng/ml, 320 ng/ml, 330 ng/ml, 340 ng/ml, 350 ng/ml, 360 ng/ml, 370 ng/ml, 380 ng/ml, 390 ng/ml, 400 ng/ml, 420 ng/ml, 440 ng/ml, 460 ng/ml, 480 ng/ml, 500 ng/ml 초과이거나 또는 그보다 크다. 일부 실시양태에서, 환자는 유효량의 c-met 길항제 및 B-raf 길항제를 사용하는 치료를 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 환자는 유효량의 c-met 길항제 및 B-raf 길항제를 사용하여 치료된다. 일부 실시양태에서, 흑색종은 B-raf V600을 발현한다 (발현하는 것으로 나타남).
일부 실시양태에서, 환자이 암은 B-raf 바이오마커를 발현하는 것으로 나타난다. B-raf 바이오마커는 돌연변이체 B-raf일 수 있다. 돌연변이체 B-raf는 구성적으로 활성화된 B-raf일 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf는 B-raf V600이다. B-raf V600은 B-raf V600E일 수 있다. 돌연변이체 B-raf의 비-제한적 예시적인 목록은 다음과 같다: B-raf V600K (GTG>AAG), V600R (GTG>AGG), V600E (GTG>GAA) 및/또는 V600D (GTG>GAT). 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf 폴리펩티드가 검출된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf 핵산이 검출된다. "V600E"는 BRAF (T>A) 내의 뉴클레오티드 위치 1799에서의 돌연변이를 지칭하며, 이는 B-raf의 아미노산 위치 600에서 발린의 글루타민으로의 치환을 발생시킨다. "V600E"는 또한 이전의 넘버링 시스템 하에 "V599E" (1796T>A)로 알려져 있다 (문헌 [Kumar et al., Clin. Cancer Res. 9:3362-3368, 2003]).
일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf 바이오마커 발현은 (a) 샘플 (예컨대, 환자 암 샘플) 상에서 유전자 발현 프로파일링, PCR (예컨대, rtPCR 또는 대립유전자-특이적 PCR), RNA-seq, 5' 뉴클레아제 검정 (예를 들어, 택맨(TaqMan)), 마이크로어레이 분석, SAGE, 매스어레이 기술 또는 FISH 중 하나 이상을 수행하는 것; 및 (b) 샘플에서 돌연변이체 B-raf 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf 바이오마커 발현은 (a) 환자 암 샘플 (예컨대, FFPE 고정 환자 암 샘플)로부터 추출된 핵산 상에서 RT-PCR을 수행하는 것; 및 (b) 샘플에서 돌연변이체 B-raf 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf 바이오마커 발현은 (a) 환자 암 샘플 (예컨대, FFPE 고정 환자 암 샘플)로부터 추출된 핵산 상에서 PCR을 수행하는 것; 및 (b) 샘플에서 돌연변이체 B-raf 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf 바이오마커 발현은 (a) 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 B-raf 표적 서열의 하나 이상의 변이체에 혼성화시키는 것 (여기서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드는 표적 서열의 하나 이상의 변이체와 적어도 부분적으로 상보적이고, 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 표적 서열의 하나 이상의 변이체와 적어도 부분적으로 상보적이며 표적 서열의 오직 하나의 변이체에 상보적인 적어도 하나의 내부 선택적 뉴클레오티드를 가짐); (b) 제2 올리고뉴클레오티드를 핵산 폴리머라제로 연장시키는 것 (여기서, 상기 폴리머라제는 우선적으로 상기 선택적 뉴클레오티드가 표적과 염기 쌍을 형성하는 경우에 상기 제2 올리고뉴클레오티드를 연장시킬 수 있고, 상기 선택적 뉴클레오티드가 표적과 염기 쌍을 형성하지 않는 경우에는 실질적으로 적게 연장시킬 수 있음); 및 (c) 상기 올리고뉴클레오티드 연장의 생성물을 검출하는 것 (여기서, 연장은 올리고뉴클레오티드가 상보적인 선택적 뉴클레오티드를 갖는 표적 서열의 변이체의 존재를 의미함)을 포함하는 방법을 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, B-raf 표적 서열의 하나 이상의 변이체는 야생형 B-raf 및 V600E B-raf이다.
일부 실시양태에서, 환자의 암은 c-met 바이오마커를 발현하는 것으로 나타난다. c-met 바이오마커는 c-met 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, c-met 바이오마커 발현은 면역조직화학 (IHC)을 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 높은 양의 c-met 바이오마커 (예를 들어, c-met IHC 또는 예를 들어 ELISA 또는 IHC를 이용하는 HGF의 검출을 이용하여 결정된 바와 같음)는 환자가 B-raf 길항제 내성 암을 가질 가능성이 있음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 높은 c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 낮은, 중간 정도의 또는 높은 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, 높은 c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 중간 정도의 또는 높은 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, "낮은" c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 낮은 또는 전혀 없는 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, "낮은" c-met 발현은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 전혀 없는 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, IHC 스코어는 2이다. 일부 실시양태에서, IHC 스코어는 3이다. 일부 실시양태에서, IHC 스코어는 1이다. 일부 실시양태에서, IHC 스코어는 0이다. 일부 실시양태에서, 높은 c-met 바이오마커 발현은 중간 정도의 c-met 염색 강도, 합한 중간 정도의/높은 c-met 염색 강도 또는 높은 c-met 염색 강도를 갖는 종양 세포가 50% 이상이다. 일부 실시양태에서, c-met 바이오마커 발현은 포스포-ELISA를 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, c-met 바이오마커 발현은 포스포-met 발현이고, 일부 실시양태에서 항-포스포-c-met 항체를 사용하여 검출된다.
c-met 바이오마커 발현은 핵산 발현일 수 있다. 일부 실시양태에서, c-met 바이오마커는 환자로부터의 샘플에서 PCR (예컨대, rtPCR 또는 대립유전자-특이적 PCR), RNA-seq, 마이크로어레이 분석, SAGE, 매스어레이 기술 또는 FISH를 이용하여 결정된다.
c-met 바이오마커는 간세포 성장 인자 (HGF)의 발현을 결정함으로써 결정될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, c-met 바이오마커는 HGF 발현이고, HGF 발현은 예를 들어 혈청에서 (예를 들어, ELISA 이용) 또는 IHC (예를 들어, 또는 종양 또는 종양 기질)에 의해 검출된다. HGF 발현은 자가분비일 수 있다. HGF는 종양 기질에서 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, HGF 발현은 환자의 혈청에서 결정된다. 일부 실시양태에서, HGF 발현 수준은 중간 HGF 발현 수준 초과이다. 일부 실시양태에서, 중간 HGF 발현 수준은 약 330 pg/mL이다. 일부 실시양태에서, 혈청내 HGF 발현은 중간 HGF 발현 수준보다 크다. 일부 실시양태에서, 혈청내 HGF 발현은 약 330 pg/ml 초과이다. 일부 실시양태에서, 환자 혈청내 HGF 발현은 약 300 ng/ml, 310 ng/ml, 320 ng/ml, 330 ng/ml, 340 ng/ml, 350 ng/ml, 360 ng/ml, 370 ng/ml, 380 ng/ml, 390 ng/ml, 400 ng/ml, 420 ng/ml, 440 ng/ml, 460 ng/ml, 480 ng/ml, 500 ng/ml 초과이거나 또는 그보다 크다.
c-met 길항제는 길항제 항-c-met 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-c-met 항체는 (a) 서열 1에 제시된 서열을 포함하는 HVR1-HC; (b) 서열 2에 제시된 서열을 포함하는 HVR2-HC; (c) 서열 3에 제시된 서열을 포함하는 HVR3-HC; (d) 서열 4에 제시된 서열을 포함하는 HVR1-LC; (e) 서열 5에 제시된 서열을 포함하는 HVR2-LC; 및 (f) 서열 6에 제시된 서열을 포함하는 HVR3-LC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-c-met 항체는 1가이며, (a) 중쇄를 포함하는 제1 폴리펩티드 (상기 폴리펩티드는 서열 11에 제시된 서열을 포함함); (b) 경쇄를 포함하는 제2 폴리펩티드 (상기 폴리펩티드는 서열 12에 제시된 서열을 포함함); 및 Fc 서열을 포함하는 제3 폴리펩티드 (상기 폴리펩티드는 서열 13에 제시된 서열을 포함함)를 포함하며, 여기서 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 복합체로 존재하며 단일 항원 결합 아암을 형성하고, 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드는 복합체에 존재하며 상기 항원 결합 아암을 포함하는 Fab 분자에 비해 상기 항체 단편의 안정성을 증가시키는 Fc 영역을 형성한다.
일부 실시양태에서, c-met 길항제는 크리조티닙, 티반티닙, 카르보잔티닙, MGCD-265, 피클라투주맙, 인간화 TAK-701, 릴로투무맙, 포레티닙, h224G11, DN-30, MK-2461, E7050, MK-8033, PF-4217903, AMG208, JNJ-38877605, EMD1204831, INC-280, LY-2801653, SGX-126, RP1040, LY2801653, BAY-853474, GDC-0712 및/또는 LA480 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, c-met 길항제는 크리조티닙이다. 일부 실시양태에서, c-met 길항제는 티반티닙이다. 일부 실시양태에서, c-met 길항제는 GDC-0712이다.
일부 실시양태에서, B-raf 길항제는 소라페닙, PLX4720, PLX-3603, GSK2118436, GDC-0879, N-(3-(5-(4-클로로페닐)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-카르보닐)-2,4-디플루오로페닐)프로판-1-술폰아미드, 베무라페닙, GSK 2118436, RAF265 (노파르티스(Novartis)), XL281, ARQ736, BAY73-4506 중 하나 이상이다. 추가 실시양태에서, B-raf 길항제는 베무라페닙이다. 추가 실시양태에서, B-raf 길항제는 GSK 2118436이다. B-raf 길항제는 B-raf V600E에 대해 선택적일 수 있다.
B-raf 길항제 및 c-met 길항제는 동시에 투여될 수 있다. B-raf 길항제 및 c-met 길항제는 순차적으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, B-raf 길항제는 c-met 길항제 전에 투여된다. 일부 실시양태에서, c-met 길항제는 B-raf 길항제 전에 투여된다.
한 측면에서, 상기 대상체에게 하나 이상의 추가의 치료제 (예컨대, 암 의약)를 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
암은 흑색종, 결장직장암, 난소암, 유방암 또는 유두상 갑상선암일 수 있다. 다른 암은 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 암은 흑색종이다. 일부 실시양태에서, 암은 B-raf 길항제에 대해 내성이다. 일부 실시양태에서, 환자는 이전에 B-raf 길항제를 사용하여 치료받았다. 일부 실시양태에서, 환자는 이전에 B-raf 길항제를 사용하여 치료받지 않았다. 일부 실시양태에서, 환자는 B-raf 길항제에 대해 불응성이다.
또한, 본 발명은 c-met 바이오마커의 발현에 기초하여, 일부 실시양태에서, B-raf 바이오마커 (예를 들어, 돌연변이체 B-raf 바이오마커)의 발현에 추가로 기초하여 암을 갖는 환자를 치료하기 위한 암 의약 (예를 들어, c-met 길항제)의 용도를 표적 청중에게 프로모션하는 것을 포함하는, 상기 암 의약을 광고하는 방법에 관한 것이다. 프로모션은 이용가능한 임의의 수단에 의해 시행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모션은 c-met 길항제 (예컨대, 항-c-met 항체)의 시판 제제를 동봉한 포장 삽입물에 의한 것이다. 프로모션은 또한 제2 의약 (치료가 c-met 길항제 및 제2 의약, 예를 들어 B-raf 길항제, 예컨대 베무라페닙을 사용한 조합 요법인 경우)의 시판 제제를 동봉한 포장 삽입물에 의한 것일 수 있다. 프로모션은 의사 또는 건강 관리 제공자에 대한 서면 또는 구두 커뮤니케이션에 의한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모션은 c-met 길항제를 사용한 요법, 일부 실시양태에서, 제2 의약, 예컨대 B-raf 길항제 (예컨대, 베무라페닙)와 조합된 요법을 받는 것에 대한 지침서를 제공하는 포장 삽입물에 의한 것이다. 일부 실시양태에서, 프로모션은 제2 의약 (예를 들어, 베무라페닙)의 존재 또는 부재 하에 c-met 길항제를 사용한 환자의 치료로 이어진다. 일부 실시양태에서, 프로모션은 c-met 길항제를 사용하는 치료의 존재 또는 부재 하에 제2 의약을 사용한 환자의 치료로 이어진다. 일부 실시양태에서, 포장 삽입물은 c-met 길항제가 환자의 암 샘플이 높은 c-met 바이오마커를 발현하는 경우에 환자를 치료하기 위해 사용될 것임을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 포장 삽입물은 c-met 길항제가 환자의 암 샘플이 낮은 c-met 바이오마커를 발현하는 경우에 환자를 치료하기 위해 사용되지 않을 것임을 나타낸다.
일부 측면에서, 본 발명은 예를 들어 환자의 생존을 증가시키고/거나, 환자의 암 재발 위험을 감소시키고/거나 환자의 생존 가능성을 증가시키기 위해 c-met 길항제 (예를 들어, 항-c-met 항체)를 사용하는 치료, 및 일부 실시양태에서 제2 의약 (예컨대, B-raf 길항제, 예를 들어 베무라페닙)을 사용하는 치료를 받는 것에 대한 지침서를 제공함으로써 c-met 바이오마커를 발현하는 암 (예컨대, 흑색종)을 갖는 환자를 지시하는 방법을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 치료는 B-raf 길항제, 예컨대 베무라페닙과 조합하여 투여되는 항-c-met 항체 (예를 들어, MetMAb)를 흑색종 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 화학요법제를 사용하는 치료를 받는 것에 대한 지침서를 제공하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 환자는 상기 지시 방법에 의해 지시된 바와 같이 치료된다.
본 발명은 또한 인간 환자에서 암 (예를 들어, 흑색종)의 치료를 위해 c-met 길항제 (예를 들어, 항-c-met 항체)를 마케팅하는 것을 포함하며, 여기서 환자의 암은 높은 (상승된) c-met 바이오마커 발현을 나타내어, 예를 들어 생존을 증가시키고/거나 환자의 암 재발 가능성을 감소시키고/거나 환자의 생존 가능성을 증가시키는 것인 비즈니스 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료는 암 환자에게 항-c-met 항체 (예를 들어, 오나르투주맙 (MetMAb)), 및 일부 실시양태에서, 제2 의약 (예를 들어, B-raf 길항제, 예컨대 베무라페닙)을 투여하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 암 (예를 들어, 흑색종) 환자로부터의 샘플에서 c-met 바이오마커의 발현을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함하는 진단 키트를 제공한다. 진단 키트는 본원에 기재된 임의의 방법과 함께 사용하는데 적합하다. 일부 실시양태에서, 키트는 흑색종 환자를 치료하기 위한 c-met 의약을 선택하기 위해 키트를 사용하는 것에 대한 지침서를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료는 암 환자에게 항-c-met 항체 (예를 들어, 오나르투주맙 (MetMAb)), 및 일부 실시양태에서, 제2 의약 (예를 들어, B-raf 길항제, 예컨대 베무라페닙)을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 제약상 허용되는 담체 중 c-met 길항제, 및 c-met 길항제가 c-met 바이오마커의 발현에 기초하여 암을 갖는 환자를 치료하기 위한 것임을 나타내는 포장 삽입물을 함께 포장하여 포함하는 제조품에 관한 것이다. 치료 방법은 본원에 개시된 임의의 치료 방법을 포함한다.
도 1: RTK 리간드는 종양유전자 중독된 암 세포주에서 키나제 억제를 감쇠시켰다. a, RTK 리간드 매트릭스 스크린으로부터의 결과를 도시하는 도면. 키나제 중독된 암 세포주를 RTK 리간드 (50ng/mL)의 존재 또는 부재 하에 증가하는 농도 범위의 적절한 키나제 억제제로 처리하였다. b, 유효한 키나제 억제제 및 각각의 6개의 개별 RTK 리간드로 공동-처리된 41개의 키나제-중독된 암 세포주로부터의 매트릭스 스크린 결과의 요약. NR은 구제 없음을 나타내고, P는 부분 구제를 나타내고, R은 완전 구제를 나타낸다. c, 약물-처리된 암 세포주 (72h)에 대한 RTK 리간드 효과의 다양성을 입증하는 세포 생존율 검정. 세포를 지시된 바와 같이 50ng/mL RTK 리간드로 공동-처리하였으며, 3가지 상이한 결과가 관찰되었다 - 구제 없음, 부분 구제 또는 완전 구제. 오차 막대는 평균 +/- s.e.m.을 나타낸다.
도 2: RTK 리간드 구제와 상관된 생존촉진 경로 재활성화. a, 키나제 억제 (1μM, 2h) 후에 AKT 및 ERK 인산화에 대한 급성 RTK 리간드 처리 (50ng/mL)의 효과를 보여주는 이뮤노블롯. RTK 리간드 구제가 표시되며, 회색 사각형은 초기 스크린에 의해 결정된 바와 같은 완전 구제를 나타내고, 흑색 사각형은 부분 구제를 나타낸다 (도 1b). b, 세포 생존율 검정은 약물 처리 (72h) 후에 3개의 키나제 중독된 암 세포주에서의 세포 증식의 저해를 입증하였다. 세포를 지시된 바와 같이 적절한 2차 키나제 억제제 (0.5μM)의 존재 하에 50ng/mL RTK 리간드로 공동-처리하였다. PD: PD173074, Lap: 라파티닙, Criz: 크리조티닙. 오차 막대는 평균 +/- s.e.m.을 나타낸다. c, AKT 및 ERK 인산화에 대한 RTK 리간드 (50ng/mL, 2h)의 존재 및 부재 하의 급성 키나제 억제 (1μM)의 효과를 보여주는 이뮤노블롯. 세포를 적절하게 2차 키나제 억제제 (0.5μM)로 공동-처리하였다. Sun: 수니티닙, PD: PD173074, PLX: PLX4032, Lap: 라파티닙, Erl: 에를로티닙, Criz: 크리조티닙.
도 3: HGF는 HER2 증폭된 세포주에서 라파티닙 내성을 촉진한다. a, 지시된 바와 같이 라파티닙 (Lap, 1μM), HGF (50ng/mL) 및 크리조티닙 (Criz, 0.5μM)으로의 처리 후에 AU565 HER2 증폭된 유방암 세포에서 아폽토시스 (절단된 PAPR)의 억제를 보여주는 이뮤노블롯. b, HER2 증폭된 유방암 세포주의 패널에서 pMET 및 MET 발현을 보여주는 이뮤노블롯. HGF 구제가 표시되고, 흑색 사각형은 초기 스크린에 의해 결정된 바와 같은 부분 구제를 나타낸다 (도 1b). c, 지시된 바와 같이 라파티닙 (Lap, 1μM), HGF (50ng/mL) 또는 크리조티닙 (Criz, 0.5μM)으로 처리된 AU565 HER2 증폭된 유방암 세포의 Syto 60 염색. 세포를 지시된 시간 동안 3일마다 처리하였다. 영상은 3회 독립적 실험을 대표하는 것이며, 값은 평균 +/- s.d.를 나타낸다. d, 2개의 MET 양성 (AU565, HCC1954) 및 1개의 MET 음성 (BT474) HER2 증폭된 세포주에서 pAKT 및 pERK의 재활성화를 보여주는 이뮤노블롯. 세포를 지시된 바와 같이 (2h) 라파티닙 (Lap, 1μM), HGF (50ng/mL) 또는 크리조티닙 (Criz, 0.5μM)으로 처리하였다. e, HER2 양성 (3+) 유방암 조직에서의 MET 발현을 보여주는 대표적 슬라이드. f, 라파티닙 (1μM) 및 HGF (50ng/mL)로의 3x 처리 후에 보다 높은 MET 발현 AU565 세포의 선택. g. 지시된 바와 같이 라파티닙 (5μM) 및 크리조티닙 (1μM)으로 처리된 HCC1954 HER2 증폭된 유방암 세포의 Syto 60 염색. 세포를 지시된 시간 동안 매주 2회 처리하였다. 영상은 3회 독립적 실험을 대표하는 것이며, 값은 평균 +/- s.d.를 나타낸다.
도 4: HGF는 BRAF 돌연변이체 흑색종 세포주에서 PLX4032 내성을 촉진하였다. a, 좌측, BRAF 돌연변이체 흑색종 세포주의 패널에서 pMET 및 MET 발현을 보여주는 이뮤노블롯. HGF 구제가 나타나며, 회색 사각형은 완전 구제를 나타내고, 흑색 사각형은 부분 구제를 나타내고, 백색 사각형은 구제 없음을 나타낸다. 우측, HGF (72h)의 존재 하에 PLX4032 (1μM) 처리된 BRAF 돌연변이체 흑색종 세포주에서의 밀도측정법에 의해 결정된 바와 같은 MET 발현과 구제 퍼센트 사이의 상관관계. b, 3개의 MET 양성 (NAE, 624 MEL, A375) 및 2개의 MET 음성 (M14, Hs693T) BRAF 돌연변이체 세포주에서 pERK의 재활성화를 보여주는 이뮤노블롯. 세포를 지시된 바와 같이 (2h) PLX4032 (PLX, 1μM), HGF (50ng/mL) 또는 크리조티닙 (Criz, 0.5μM)으로 처리하였다. c, 지시된 바와 같이 PLX4032 (5μM) 및/또는 크리조티닙 (1μM)으로 처리된 624MEL BRAF 돌연변이체 흑색종 세포의 Syto 60 염색. 세포를 지시된 시간 동안 매주 2회 처리하였다. 영상은 3회 독립적 실험을 대표하는 것이며, 값은 평균 +/- s.d.를 나타낸다. d, 928MEL 이종이식편에서 PLX4032 처리의 효과에 대한 3D6 MET 효능작용 항체를 사용한 MET 수용체 활성화의 효과를 보여주는 종양 성장 검정. 마우스 (군당 10마리)를 4주 동안 지시된 바와 같이 대조군 항체 (항-gp120), 3D6 (항-MET 효능작용 항체), RG7204 (PLX4032) 또는 GDC-0712 (MET 소분자 억제제)로 처리하였다. 오차 막대는 평균 +/- s.e.m.을 나타낸다.
도 5: a, PDGF (50ng/mL, 30분)로의 자극 후에 PDGFR의 활성화를 보여주는 이뮤노블롯. b, 시스플라틴 및 6개의 개별 RTK 리간드로 공동-처리된 6개의 키나제 중독된 암 세포주로부터의 스크린 결과의 요약. NR은 구제 없음을 나타낸다. c, 약물 처리 (72h) 후에 3개의 키나제 중독된 암 세포주에서 세포 증식의 억제를 입증하는 세포 생존율 검정. 세포를 지시된 바와 같이 적절한 2차 키나제 억제제 (0.5μM)의 존재 하에 50ng/mL RTK 리간드로 공동-처리하였다. PD: PD173074, Lap: 라파티닙, Criz: 크리조티닙. 오차 막대는 평균 +/- s.e.m.을 나타낸다. d, AKT 및 ERK 인산화에 대한 RTK 리간드 (50ng/mL, 2h)의 존재 또는 부재 하의 급성 키나제 억제 (1μM)의 효과를 보여주는 이뮤노블롯. 세포를 적절하게 2차 키나제 억제제 (0.5μM)로 공동-처리하였다. Criz: 크리조티닙, PD: PD173074, Lap: 라파티닙.
도 6: a, 매트릭스 스크린으로부터 41개의 키나제 중독된 암 세포주의 패널에서 MET, PDGFRα, IGF1Rβ, EGFR, HER2, HER3, FGFR1, FGFR2 및 FGFR3의 발현을 보여주는 이뮤노블롯. RTK 리간드 구제가 나타나며; 회색 사각형은 완전 구제를 나타내고, 흑색 사각형은 부분 구제를 나타내고, 백색 사각형은 구제 없음을 나타내고, 빗금 표시된 사각형은 리간드-연관 키나제를 나타낸다. X는 제거된 샘플을 나타내고, amp는 증폭된 샘플을 나타내고, mut는 돌연변이된 샘플을 나타낸다. 동일한 부하를 β-튜불린을 사용하여 결정하였다. b, RTK 발현을 RTK 리간드가 키나제 억제로부터 키나제-중독된 세포를 구제하는 능력과 연관시키는 표. 통계적 유의성을 2x2 분할표를 이용하여 결정하였다. p 값이 주어진다.
도 7: a, 수용체 발현 비-RTK 리간드 구제된 세포에서 하류 생존 신호에 대한 커플링이 없는 수용체의 활성화를 입증하는 이뮤노블롯. PLX: PLX4032, Lap: 라파티닙. b, 수용체 발현 비-RTK 리간드 구제된 세포에서 적어도 하나의 하류 생존 신호에 대한 커플링이 있는 수용체의 활성화를 입증하는 이뮤노블롯. PLX: PLX4032, TAE: TAE684, Erl: 에를로티닙. c, 수용체 발현 비-RTK 리간드 구제된 세포에서 RTK 리간드의 적절한 수용체 및 상응하는 하류 생존 신호의 활성화 실패를 입증하는 이뮤노블롯. PLX: PLX4032, TAE: TAE684, Erl: 에를로티닙.
도 8: a, TAE684로의 처리 또는 크리조티닙 처리 (72h) 후에 H3122 EML4-ALK 전위된 NSCLC 암 세포주에서 세포 증식의 억제를 입증하는 세포 생존율 검정. 세포를 50ng/mL HGF로 공동-처리하였다. 오차 막대는 평균 +/- s.e.m.을 나타낸다. b, AKT 및 ERK 인산화에 대한 HGF (50ng/mL, 2h)의 존재 및 부재 하의 급성 TAE684 또는 크리조티닙 (1μM) 처리의 효과를 보여주는 이뮤노블롯. c, 지시된 바와 같이 HGF (50ng/mL)의 존재 및 부재 하에 TAE684 (2μM)로 처리된 H2228 EML4-ALK 전위된 NSCLC 세포의 Syto 60 염색. 세포를 9일 동안 3일마다 처리하였다. d, 지시된 바와 같이 HGF (50ng/mL)의 존재 및 부재 하에 에를로티닙 (5μM)으로 처리된 H358 EGF-유사 리간드-유도된 NSCLC 세포의 Syto 60 염색. 세포를 9일 동안 3일마다 처리하였다. 영상은 3회 독립적 실험을 대표하는 것이며, 값은 평균 +/- s.d.를 나타낸다.
도 9는 a, PLX4032 (72h)로의 처리 후에 2개의 BRAF 돌연변이체 세포주에서 세포 증식의 억제를 입증하는 세포 생존율 검정을 도시한다. 세포를 지시된 바와 같이 50ng/mL RTK 리간드 및 크리조티닙 (Criz, 0.5μM)으로 공동-처리하였다. 오차 막대는 평균 +/- s.e.m.을 나타낸다. b, 라파티닙 (1μM) 처리된 AU565 HER2 증폭된 유방암 세포에서 HGF (50ng/mL) 자극 후에 지속된 생존 신호 (pAKT 및 pERK)를 보여주는 시간 과정.
도 10: BRAF V600F를 사용한 세포에서의 다양한 RTK 리간드의 구제 결과.
도 11: 지시된 바와 같이 라파티닙 (5μM) 및 크리조티닙 (1μM)으로 처리된 HCC1954 HER2 증폭된 유방암 세포의 Syto 60 세포 염색. 세포를 지시된 시간 동안 매주 2회 처리하였다. 영상은 3회 독립적 실험을 대표하는 것이며, 값은 평균 +/- s.d.를 나타낸다.
도 12: a, MET 양성 (NAE, 624MEL, 928MEL, A375) 및 MET 음성 (M14, Hs693T) BRAF 돌연변이체 세포주에서 ERK의 재활성화를 보여주는 이뮤노블롯. 세포를 지시된 바와 같이 (2h) PLX4032 (PLX, 1μM), HGF (50ng/mL) 또는 크리조티닙 (Criz, 0.5μM)으로 처리하였다. b, 928MEL 및 624MEL 이종이식편에서 PLX4032 성장 억제 활성에 대한 3D6 MET 효능작용 항체를 사용한 MET 활성화의 효과를 보여주는 종양 성장 검정. 마우스 (군당 10마리)를 4주 동안 지시된 바와 같이 대조군 항체 (항-gp120), 3D6 (항-MET 효능작용 항체), RG7204 (PLX4032) 또는 GDC-0712 (MET 소분자 억제제)로 처리하고, 종양 부피를 지시된 시간에 측정하였다. 오차 막대는 평균 +/- s.e.m.을 나타낸다. 2개의 군 사이의 차이를 2-원 ANOVA를 사용하여 결정하였다 (*=0.0008).
도 13: PLX4032로 처리된 전이성 흑색종 환자에서의 무진행 생존 및 전체 생존. 환자를 그의 혈장 HGF 수준에 기초하여 2개의 군으로 계층화하였다 (녹색 < 중간 HGF; 적색 > 중간 HGF).
도 14: a, PI3K 및 MAPK 경로 둘 다의 활성화 (72h)에 의한 키나제 억제로부터의 추가의 구제를 입증하는 세포 생존율 검정. AU565 세포를 10ng/mL NRG1 또는 FGF와 조합하여 라파티닙 (1μM)으로 공동-처리하였다. b, PI3K 경로의 억제가 MAPK 경로보다 리간드-유도된 구제의 전도에 보다 강력하다는 것을 입증하는 세포 생존율 검정. 세포를 HGF (50ng/mL)의 존재 하에 적절한 키나제 억제제로 처리하였다. 이어서, 세포를 100nM PI3K 억제제 (BEZ235) 또는 MAPK 억제제 (AZD6244)로 처리하였다. 오차 막대는 평균 +/- s.e.m.을 나타낸다.
도 15: 매트릭스 스크린으로부터 41개의 키나제 중독된 암 세포주의 패널에서 MET, PDGFRα, IGF1Rβ, EGFR, HER2, HER3, FGFR1, FGFR2 및 FGFR3의 발현을 보여주는 이뮤노블롯. RTK 리간드 구제가 나타나며; 회색 사각형은 완전 구제를 나타내고, 암회색 사각형은 부분 구제를 나타내고, 백색 사각형은 구제 없음을 나타내고, 흑색 사각형은 리간드-연관 키나제를 나타낸다. X는 제거된 샘플을 나타내고, amp는 증폭된 샘플을 나타내고, mut는 돌연변이된 샘플을 나타낸다. 동일한 부하를 β-튜불린을 사용하여 결정하였다.
도 16: 지시된 바와 같이 HGF (50ng/mL)의 존재 또는 부재 하에 TAE684 (2μM)로 처리된 H2228 EML4-ALK 전위된 NSCLC 세포의 Syto 60 염색. 세포를 9일 동안 3일마다 처리하였다. 영상은 3회 독립적 실험을 대표하는 것이며, 값은 평균 +/- s.d.를 나타낸다.
도 17: a, SK-MEL-28 세포에서 PLX4032 감수성에 대한 446개의 시험된 분비된 인자의 분석을 도시하는 도면. b, 50ng/mL 리간드의 존재 하의 5μM PLX4032 (72h)의 존재 하에 SK-MEL-28 세포에 대한 446개의 시험된 분비된 인자의 분석으로부터의 결과의 요약. 그래프는 최초 분석으로부터의 리간드 및 PLX4032 감수성으로부터 SK-MEL-28 세포를 구제한 새로 확인된 가용성 인자를 나타낸다. 오차 막대는 평균 +/- s.e.m.을 나타낸다.
도 18: 지시된 바와 같이 PLX4032 (5μM) 및/또는 크리조티닙 (1μM)으로 처리된 A375 및 928MEL BRAF 돌연변이체 흑색종 세포주의 Syto 60 세포 염색. 세포를 지시된 시간 동안 매주 2회 처리하였다. 영상은 3회 독립적 실험을 대표하는 것이며, 값은 평균 +/- s.d.를 나타낸다.
도 19a 및 19b: 928MEL 및 624MEL 이종이식 연구로부터의 결과를 요약한 표.
도 20은 126명의 전이성 흑색종 환자 투여전, 사이클 1로부터의 혈장에서 HGF 단백질 수준의 ELISA 결과의 요약을 보여준다.
도 21: 배양물 내의 BRAF 돌연변이체 흑색종 암 세포에서의 MET의 IHC 염색.
도 22: 크리조티닙 (72 h syto 60 검정)으로의 처리 후에 HCC 1954 및 AU565에서의 세포 증식의 억제를 입증하는 세포 생존율 검정. 세포를 크리조티닙 (0.5μM) (MET TKI) 및 라파티닙 (EGFR/HER2 TKI)의 존재 하에 50ng/mL HGF로 공동-처리하였다.
도 23: AKT 및 ERK 인산화에 대한 NRG1 (50 ng/mL, 2h)의 존재 하의 라파티닙 (1 μM)의 효과를 보여주는 이뮤노블롯. 세포를 지시된 바와 같이 에를로티닙 (0.5 μM)으로 공동-처리하였다. Lap: 라파티닙, Erl: 에를로티닙.
도 24: a, BRIM2 시험에 등록한 126명의 전이성 흑색종 환자, 투여전 사이클 1로부터의 로그 (HGF) 수준의 도수 분포를 중첩된 경험적 밀도 (흑색)과 함께 보여주는 히스토그램 (빗금 표시됨) (정상 상태로부터의 출발에 대한 콜모고로프-스미르노프(Kolmogorov-Smirnoff) p-값은 0.18임). b, PLX4032로 처리된 전이성 흑색종 환자에서의 무진행 생존 (PFS) 및 전체 생존 (OS). 환자를 그의 혈장 HGF 수준에 기초하여 3개의 군으로 계층화하였다. 각각의 군에 대한 사건/환자의 수 및 사건까지의 중간 시간이 제시된다. 연속적 결과에 대한 결과의 콕스(cox)-비례 모델을 이용하여 위험 비 및 상응하는 p-값을 계산하였다.
도 25: a, GDC-0712의 구조. b, cMet 및 선택된 키나제에 대한 효소 IC50. cMet 효력은 활성화된 cMet 키나제 도메인에 의한 폴리(Glu,Tyr)의 인산화를 이용하여 ELISA에 의한 검출과 함께 결정하였다. 데이터는 다중 결정값 (n=5)의 기하 평균이다. 다른 키나제 검정을 인비트로젠(Invitrogen) 표준 프로토콜에 따라 인비트로젠 셀렉티드스크린(SelectedScreen) 서비스를 이용하여 수행하였다. 모든 IC50을 Km에 대한 근사값에서 [ATP]로 결정하였다. c, 세포-기반 검정에서 선택된 RTK에 대한 GDC-0712의 효력 및 선택성. 모든 검정은 10% FBS의 존재 하에 화합물과의 2-시간 인큐베이션 후에 표에 명시된 세포주에서 RTK 자가인산화를 측정하였다. d, 키나제 선택성 프로파일링 데이터. GDC-0712를 인비트로젠 셀렉트스크린(SelectScreen) 서비스를 이용하여 210개의 키나제의 패널에 대해 0.1μM에서 검정하였다. >50% 억제를 갖는 모든 키나제가 열거된다. e, GDC-0712 키나제 선택성의 그래프 표현. 0.1 μM 화합물에서 특이적 키나제의 억제 퍼센트는 인간 키놈 상에 오버레이된 원의 크기 및 색에 의해 나타내어진다.
도 26: GDC-0712는 국제 특허 출원 WO2007103308A2에 요약된 절차에 따라 제조하였다. 시약 및 조건: (a) (EtO)3CH, 멜드룸(Meldrum) 산, 80℃, 76%; (b) 다우섬(Dowtherm), 220℃, 45%; (c) 3,4-디플루오로니트로벤젠, Cs2CO3, DMF, 100℃, 88%; (d) TFA, 70℃, 99%; (e) I2, KOH, DMF, 50℃, 88%; (f) PMBCl, K2CO3, DMF, rt, 61%; (g) SnCl2-2수화물, EtOH, 65℃; (h) CuI, 인돌-2-카르복실산, DMSO, K2CO3, 115℃, 56%; (i) EDCI, HOBt, ipr2EtNH, DMF, 92%; (j) TFA, CH2Cl2, rt; (k) CH3CHO, NaHB(OAc)3, 2 단계에 걸쳐 77%; (l) TFA, 70℃, 73%.
I. 정의
본원에서 "환자"는 인간 환자이다. 환자는 "암 환자", 즉 하나 이상의 암의 증상을 앓고 있거나 이러한 위험이 있는 환자일 수 있다. 또한, 환자는 이전에 치료된 암 환자일 수 있다. 환자는 "흑색종 암 환자", 즉 하나 이상의 흑색종의 증상을 앓고 있거나 이러한 위험이 있는 환자일 수 있다. 또한, 환자는 이전에 치료된 흑색종 환자일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "c-met" 또는 "Met"는, 달리 나타내지 않는 한, 임의의 천연 또는 변이체 (천연이든 또는 합성이든) c-met 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "야생형 c-met"는 일반적으로 자연 발생 c-met 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "c-met 변이체"는 천연 c-met 서열에 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 c-met 폴리펩티드를 지칭한다. 임의로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환(들)을 포함한다.
"항-c-met 항체"는 충분한 친화도 및 특이성으로 c-met에 결합하는 항체이다. 선택된 항체는 통상적으로 c-met에 대해 충분히 강력한 결합 친화도를 가질 것이고, 예를 들어 상기 항체는 100 nM-1 pM의 Kd 값으로 인간 c-met에 결합할 수 있다. 항체 친화도는 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 기반 검정 (예컨대, PCT 출원 공개 번호 WO2005/012359에 기재된 바와 같은 비아코어(BIAcore) 검정); 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA); 및 경쟁 검정 (예를 들어, RIA)에 의해 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-c-met 항체는 c-met 활성이 관여하는 질환 또는 상태를 표적화하고 이를 방해하는데 있어서 치료제로서 사용될 수 있다. 또한, 항체는, 예를 들어 치료제로서의 그의 유효성을 평가하기 위해 다른 생물학적 활성 검정에 적용될 수 있다. 이러한 검정은 당업계에 공지되어 있고, 항체에 대한 표적 항원 및 의도된 용도에 따라 달라진다.
"c-met 길항제" (교환가능하게 "c-met 억제제"로 명명됨)는 c-met 활성화 또는 기능을 방해하는 작용제이다. 특정한 실시양태에서, c-met 억제제는 c-met에 대해 약 1,000 nM 이하의 결합 친화도 (해리 상수)를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, c-met 억제제는 c-met에 대해 약 100 nM 이하의 결합 친화도를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, c-met 억제제는 c-met에 대해 약 50 nM 이하의 결합 친화도를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, c-met 억제제는 c-met에 대해 약 10 nM 이하의 결합 친화도를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, c-met 억제제는 c-met에 대해 약 1 nM 이하의 결합 친화도를 갖는다. 특정한 실시양태에서, c-met 억제제는 c-met에 공유 결합된다. 특정한 실시양태에서, c-met 억제제는 c-met 신호전달을 1,000 nM 이하의 IC50으로 억제한다. 또 다른 실시양태에서, c-met 억제제는 c-met 신호전달을 500 nM 이하의 IC50으로 억제한다. 또 다른 실시양태에서, c-met 억제제는 c-met 신호전달을 50 nM 이하의 IC50으로 억제한다. 또 다른 실시양태에서, c-met 억제제는 c-met 신호전달을 10 nM 이하의 IC50으로 억제한다. 또 다른 실시양태에서, c-met 억제제는 c-met 신호전달을 1 nM 이하의 IC50으로 억제한다.
"c-met 활성화"는 c-met 수용체의 활성화 또는 인산화를 지칭한다. 일반적으로, c-met 활성화는 신호 전달 (예를 들어, c-met 또는 기질 폴리펩티드 내의 티로신 잔기를 인산화하는, c-met 수용체의 세포내 키나제 도메인에 의해 초래됨)을 유발한다. c-met 활성화는 관심 c-met 수용체에 대한 c-met 리간드 (HGF) 결합에 의해 매개될 수 있다. c-met에 대한 HGF 결합은 c-met의 키나제 도메인을 활성화시키고, 이에 따라 c-met 내 티로신 잔기의 인산화 및/또는 추가의 기질 폴리펩티드(들) 내 티로신 잔기의 인산화를 유발할 수 있다.
"B-raf 활성화"는 B-raf 키나제의 활성화 또는 인산화를 지칭한다. 일반적으로, B-raf 활성화는 신호 전달을 발생시킨다.
본원에 사용된 용어 "B-raf"는, 달리 나타내지 않는 한, 임의의 천연 또는 변이체 (천연이든 또는 합성이든) B-raf 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "야생형 B-raf"는 일반적으로 자연 발생 B-raf 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "B-raf 변이체"는 천연 B-raf 서열에 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 B-raf 폴리펩티드를 지칭한다. 임의로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환(들)을 포함한다.
"B-raf 길항제" (교환가능하게 "B-raf 억제제"로 명명됨)는 B-raf 활성화 또는 기능을 방해하는 작용제이다. 특정한 실시양태에서, B-raf 억제제는 B-raf에 대해 약 1,000 nM 이하의 결합 친화도 (해리 상수)를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, B-raf 억제제는 B-raf에 대해 약 100 nM 이하의 결합 친화도를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, B-raf 억제제는 B-raf에 대해 약 50 nM 이하의 결합 친화도를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, B-raf 억제제는 B-raf에 대해 약 10 nM 이하의 결합 친화도를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, B-raf 억제제는 B-raf에 대해 약 1 nM 이하의 결합 친화도를 갖는다. 특정한 실시양태에서, B-raf 억제제는 B-raf 신호전달을 1,000 nM 이하의 IC50으로 억제한다. 또 다른 실시양태에서, B-raf 억제제는 B-raf 신호전달을 500 nM 이하의 IC50으로 억제한다. 또 다른 실시양태에서, B-raf 억제제는 B-raf 신호전달을 50 nM 이하의 IC50으로 억제한다. 또 다른 실시양태에서, B-raf 억제제는 B-raf 신호전달을 10 nM 이하의 IC50으로 억제한다. 또 다른 실시양태에서, B-raf 억제제는 B-raf 신호전달을 1 nM 이하의 IC50으로 억제한다.
"V600E"는 B-Raf의 아미노산 위치 600에서 발린의 글루타민으로의 치환을 발생시키는 BRAF 유전자의 돌연변이를 지칭한다. "V600E"는 또한 이전 넘버링 시스템 하에 "V599E"로 공지되어 있다 (문헌 [Kumar et al., Clin. Cancer Res. 9:3362-3368, 2003]).
"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 포함하는 당업계에 공지된 통상의 방법으로 측정할 수 있다. 결합 친화도 측정을 위한 구체적인 예시적 및 대표적 실시양태를 하기 기재한다.
"선택적" 또는 "보다 큰 친화도"는 야생형 단백질보다 돌연변이체 단백질에 보다 단단하게 (보다 낮은 해리 상수) 결합하는 길항제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 보다 큰 친화도 또는 선택성은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500배 또는 그 초과의 보다 큰 결합이다. 본원에 사용된 용어 "B-raf-표적화된 약물"은 B-raf에 결합하여 B-raf 활성화를 억제하는 치료제를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "c-met-표적화된 약물"은 c-met에 결합하여 c-met 활성화를 억제하는 치료제를 지칭한다.
본원에 사용된, 예를 들어 수용체 키나제 활성에 적용된 용어 "구성적"은 리간드 또는 다른 활성화 분자의 존재에 의존하지 않는 수용체의 지속적인 신호전달 활성을 지칭한다. 수용체의 특성에 따라, 모든 활성이 구성적일 수 있거나 또는 수용체의 활성이 다른 분자 (예를 들어, 리간드)의 결합에 의해 추가로 활성화될 수 있다. 수용체의 활성화로 이어지는 세포 사건이 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 활성화는 더 높은 차수의 수용체 복합체로의 올리고머화, 예를 들어 이량체화, 삼량체화 등을 포함할 수 있다. 복합체는 단일 종의 단백질을 포함할 수 있고, 즉 동종체성 복합체일 수 있다. 대안적으로, 복합체는 적어도 2종의 상이한 단백질 종을 포함할 수 있고, 즉 이종체성 복합체일 수 있다. 예를 들어, 세포 표면 상에서의 정상 형태 또는 돌연변이체 형태의 수용체의 과다발현에 의해 복합체 형성이 일어날 수 있다. 또한 수용체 내의 특정 돌연변이 또는 돌연변이들에 의해 복합체 형성이 일어날 수 있다.
어구 "유전자 증폭"은 특정한 세포 또는 세포주에서 다중 카피의 유전자 또는 유전자 단편이 형성되는 과정을 지칭한다. 중첩된 영역 (증폭된 DNA의 스트레치)이 종종 "앰플리콘"으로 지칭된다. 통상적으로, 생산된 메신저 RNA (mRNA)의 양, 즉 유전자 발현의 수준이 또한 발현되는 특정한 유전자로 이루어진 카피의 수에 비례하여 증가한다.
"티로신 키나제 억제제"는 티로신 키나제, 예컨대 c-met 수용체 또는 B-raf의 티로신 키나제 활성을 어느 정도 억제하는 분자이다.
"c-met 및/또는 B-raf 발현, 증폭, 또는 활성화를 나타내는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, c-met 및/또는 B-raf를 발현 (과다발현 포함)하고/하거나, c-met 및/또는 B-raf 유전자를 증폭시키고/거나, 다르게는 c-met 및/또는 B-raf의 활성화 또는 인산화를 입증하는 것이다.
"c-met 및/또는 B-raf 발현, 증폭, 또는 활성화를 나타내지 않는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, c-met 및/또는 B-raf를 발현 (과다발현 포함)하지 않고/않거나, c-met 및/또는 B-raf 유전자를 증폭시키지 않고/거나, 다르게는 c-met 및/또는 B-raf의 활성화 또는 인산화를 입증하지 않은 것이다.
"c-met 및/또는 B-raf 활성화를 나타내는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, c-met 및/또는 B-raf의 활성화 또는 인산화를 입증하는 것이다. 이러한 활성화는 직접적으로 (예를 들어, IHC의 ELISA에 의해 c-met 및/또는 B-raf 인산화를 측정함으로써) 또는 간접적으로 결정될 수 있다.
"c-met 및/또는 B-raf 활성화를 나타내지 않는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, c-met 및/또는 B-raf의 활성화 또는 인산화를 입증하지 않은 것이다. 이러한 활성화는 직접적으로 (예를 들어, ELISA 또는 IHC에 의해 c-met 및/또는 B-raf 인산화를 측정함으로써) 또는 간접적으로 결정될 수 있다.
"구성적 c-met 및/또는 B-raf 활성화를 나타내는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, c-met 및/또는 B-raf의 구성적 활성화 또는 인산화를 입증하는 것이다. 이러한 활성화는 직접적으로 (예를 들어, ELISA에 의해 c-met 및/또는 B-raf 인산화를 측정함으로써) 또는 간접적으로 결정될 수 있다.
"c-met 증폭을 나타내지 않는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, c-met 유전자를 증폭시키지 않은 것이다.
"c-met를 나타내는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, c-met 유전자를 증폭시킨다.
"구성적 c-met 및/또는 B-raf 활성화를 나타내지 않는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, c-met 및/또는 B-raf의 구성적 활성화 또는 인산화를 입증하지 않은 것이다. 이러한 활성화는 직접적으로 (예를 들어, ELISA에 의해 c-met 및/또는 B-raf 인산화를 측정함으로써) 또는 간접적으로 결정될 수 있다.
"인산화"는 단백질, 예컨대 B-raf 및/또는 c-met, 또는 그의 기질에 1개 이상의 포스페이트 기(들)를 첨가하는 것을 지칭한다.
본원에서 "포스포-ELISA 검정"은 시약, 일반적으로 항체를 사용하여 인산화된 c-met 및/또는 B-raf, 기질, 또는 하류 신호전달 분자를 검출하는 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에서 하나 이상의 c-met 및/또는 B-raf의 인산화를 평가하는 검정이다. 바람직하게는, 인산화된 c-met 및/또는 B-raf를 검출하는 항체가 사용된다. 검정은 바람직하게는 신선한 또는 동결된 생물학적 샘플로부터의 세포 용해물에 대해 수행할 수 있다.
"c-met 과다발현 또는 증폭"을 갖는 암 세포는 동일한 조직 유형의 비암성 세포와 비교하여 유의하게 더 높은 수준의 c-met 단백질 또는 유전자를 갖는 것이다. 이러한 과다발현은 유전자 증폭에 의해 또는 증가된 전사 또는 번역에 의해 유발될 수 있다. c-met 과다발현 또는 증폭은 세포의 표면에 존재하는 증가된 수준의 c-met 단백질을 (예를 들어, 면역조직화학 검정; IHC를 통해) 평가함으로써 진단 또는 예후 검정에서 결정할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 예를 들어 형광 계내 혼성화 (FISH; WO98/45479 (1998년 10월 공개) 참조), 서던 블롯팅, 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술, 예컨대 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 통해, 세포 내의 c-met-코딩 핵산의 수준을 측정할 수 있다. 상기 검정 이외에도, 숙련된 진료의는 다양한 생체내 검정을 이용할 수 있다. 예를 들어, 환자의 신체 내에서 검출가능한 표지, 예를 들어 방사성 동위원소로 임의로 표지된 항체에 세포를 노출시킬 수 있고, 환자에서 세포에 대한 항체의 결합은, 예를 들어 방사선에 대한 외부 스캔 또는 이전에 항체에 노출된 환자로부터 수득한 생검의 분석에 의해 평가할 수 있다.
"c-met를 과다발현하거나 또는 증폭시키지 않는" 암 세포는 동일한 조직 유형의 비암성 세포와 비교하여 c-met 단백질 또는 유전자의 정상 수준보다 높은 수준을 갖지 않는 것이다.
본원에 사용된 용어 "돌연변이"는 각각 야생형 단백질 또는 핵산과 비교하여 특정한 단백질 또는 핵산 (유전자, RNA)의 아미노산 또는 핵산 서열에서의 차이를 의미한다. 돌연변이된 단백질 또는 핵산은 유전자의 한쪽 대립유전자 (이종접합) 또는 양쪽 대립유전자 (동종접합)로부터 발현되거나 이러한 대립유전자 상에서 발견될 수 있고, 체성 또는 배선일 수 있다. 본 발명에서, 돌연변이는 일반적으로 체성이다. 돌연변이는 서열 재배열, 예컨대 삽입, 결실 및 점 돌연변이 (단일 뉴클레오티드/아미노산 다형성)를 포함한다.
"억제하다"는 참조물과 비교하여 활성, 기능, 및/또는 양을 감소 또는 저하시키는 것이다.
단백질 "발현"은 유전자 내에 코딩된 정보가 메신저 RNA (mRNA)로, 이어서 단백질로 전환되는 것을 지칭한다.
본원에서, 관심 단백질 (예컨대, c-met 수용체)을 "발현하는" 샘플 또는 세포는 단백질을 코딩하는 mRNA 또는 그의 단편을 포함한 단백질이 샘플 또는 세포 내에 존재하는 것으로 결정된 것이다.
"차단" 항체 또는 항체 "길항제"는 그가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 것이다. 바람직한 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 완전히 억제한다.
환자의 "집단"은 임상 시험에서와 같이, 또는 흑색종 암 요법과 같은 특정한 적응증에 대한 FDA 승인 후에 종양학자에 의해 관찰되는 바와 같이 암을 갖는 일군의 환자를 지칭한다.
본 발명의 방법에서, 환자를 "지시하는"이라는 용어는 적용가능한 요법, 의약, 치료, 치료 요법 등에 관한 지시를 임의의 수단에 의해, 그러나 바람직하게는 서면, 예컨대 포장 삽입물 또는 기타 서면 프로모션 자료의 형태로 제공하는 것을 의미한다.
본 발명의 방법에서, 용어 "프로모션하는"은 특정한 약물, 약물 조합물, 또는 치료 양식을 포장 삽입물 형태와 같은 서면을 비롯한 임의의 수단에 의해 제공하거나 광고하거나 판매하거나 기재하는 것을 의미한다. 본원에서 프로모션은 적응증, 예컨대 흑색종 치료를 위한 치료제(들), 예컨대 항-c-met 항체 및/또는 B-raf 길항제의 프로모션을 지칭하며, 이러한 프로모션은 대상체 집단 내에서 통계적으로 유의한 치료 효능 및 허용되는 안전성과 연관된 것으로 입증되어야 미국 식품 의약품국 (FDA)에 의해 승인된다.
용어 "마케팅"은 제품 (예를 들어, 약물)의 프로모션, 판매 또는 유통을 설명하기 위해 본원에 사용된다. 마케팅은 구체적으로 제품을 상품화할 목적을 갖는 포장, 광고, 및 임의의 비지니스 활동을 포함한다.
본원에서의 목적을 위해, "이전에 치료된" 암 환자는 사전 암 요법을 받은 적이 있다.
"불응성" 암은 항종양제, 예컨대 화학요법제를 암 환자에게 투여함에도 불구하고 진행한다.
"암 의약"은 암 치료에 효과적인 약물이다. 암 의약의 예는 하기 언급되는 화학요법제 및 화학치료 요법; c-met 길항제 (항-c-met 항체 포함), 예컨대 MetMAb; B-raf 길항제를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "바이오마커" 또는 "마커"는 일반적으로 조직 또는 세포 내에서 또는 그 상에서의 그의 발현 또는 분비가 공지의 방법 (또는 본원에 개시된 방법)에 의해 검출될 수 있고, 치료 요법에 대한 세포, 조직 또는 환자의 반응성을 예측하거나 또는 예측하기 위해 (또는 예측을 돕기 위해) 사용될 수 있는, 유전자, mRNA, 단백질, 탄수화물 구조물 또는 당지질을 비롯한 분자를 지칭한다.
암 (예를 들어, 흑색종) 환자에 대한 감소된 임상적 이익과 연관된 바이오마커의 "양" 또는 "수준"은 생물학적 샘플에서 검출가능한 바이오마커의 결손 또는 낮은 검출가능한 수준을 지칭하고, 여기서 상기 바이오마커의 수준은 감소된 환자 임상적 이익과 연관된다. 이들은 당업자들에게 공지되고 또한 본 발명에 의해 개시된 방법에 의해 측정될 수 있다. 평가되는 바이오마커의 발현 수준 또는 양은 치료에 대한 반응을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오마커의 양 또는 수준은 IHC (예를 들어, 환자 종양 샘플의) 및/또는 ELISA 및/또는 5' 뉴클레아제 검정 및/또는 PCR (예를 들어, 대립유전자-특이적 PCR)을 이용하여 결정된다.
일반적으로 용어 "발현의 수준" 또는 "발현 수준"은 교환가능하게 이용되고, 일반적으로 생물학적 샘플에서 폴리뉴클레오티드, mRNA 또는 아미노산 생성물 또는 단백질의 양을 지칭한다. "발현"은 일반적으로 유전자-코딩된 정보가, 세포 내에 존재하고 작동하는 구조로 전환되는 과정을 지칭한다. 따라서, 본 발명에 따르면, 유전자의 "발현"은 폴리뉴클레오티드로의 전사, 단백질로의 번역, 또는 심지어는 단백질의 번역후 변형을 지칭할 수 있다. 전사된 폴리뉴클레오티드, 번역된 단백질 또는 번역후 변형된 단백질의 단편은 또한 이들이 대안적 스플라이싱에 의해 생성된 전사체 또는 분해된 전사체로부터 유래하든지 또는 예를 들어 단백질분해에 의한 단백질의 번역후 프로세싱으로부터 유래하든지 발현되는 것으로 여겨질 것이다. 일부 실시양태에서, "발현의 수준"은 IHC를 이용하여 결정되는 바와 같이 생물학적 샘플 내의 단백질의 양을 지칭한다.
"환자 샘플"은 암 환자로부터 수득된 유사한 세포의 집합을 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결 및/또는 보존된 기관 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고체 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성성분; 체액, 예컨대 뇌척수액, 양수, 복막액 또는 간질액; 대상체의 임신 또는 발생 중의 임의의 시점으로부터의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 자연에서 조직과 자연적으로 서로 혼합되지 않는 화합물, 예컨대 보존제, 항응고제, 완충제, 고정제, 영양소, 항생제 등을 함유할 수 있다. 본원에서 종양 샘플의 예는 종양으로부터 유래되거나 종양-유사 특성을 나타내는 종양 생검, 순환 종양 세포, 혈청 또는 혈장, 순환 혈장 단백질, 복수액, 일차 세포 배양물 또는 세포주 뿐만 아니라 보존된 종양 샘플, 예컨대 포르말린-고정, 파라핀-포매된 종양 샘플 또는 동결된 종양 샘플을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서 샘플은 흑색종 종양 샘플을 포함한다.
의약을 사용하는 치료에 대한 환자의 "유효 반응" 또는 환자의 "반응성", 및 유사한 단어는 암 의약의 투여시에 암 (예를 들어, 흑색종)에 대한 위험이 있거나 또는 이를 앓고 있는 환자에게 부여된 임상 또는 치료 이익을 지칭한다. 이러한 이익은 생존 (전체 생존 및 무진행 생존 포함) 연장; 객관적 반응 (완전 반응 또는 부분 반응 포함) 생성; 또는 암의 징후 또는 증상의 개선 등 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 한 실시양태에서, 바이오마커는 바이오마커를 동일한 수준에서 발현하지 않는 환자에 비교하여, 의약 (예를 들어, 항-c-met 항체)를 사용하여 치료된 경우에 보다 큰 무진행 생존 (PFS)을 가질 것으로 예상되는 환자를 확인하는데 사용된다.
"생존"은 환자가 계속 살아있는 것을 지칭하고, 전체 생존 뿐만 아니라 무진행 생존을 포함한다.
"전체 생존"은 예를 들어 진단 또는 치료시로부터 소정의 기간, 예컨대 1년, 5년 등의 기간 동안 환자가 계속 살아있는 것을 지칭한다.
"무진행 생존"은 암이 진행되거나 악화되지 않으면서 환자가 계속 살아있는 것을 의미한다.
"생존 연장"은 치료받지 않은 환자에 비해 (즉, 의약을 사용하여 치료받지 않은 환자에 비해) 또는 바이오마커를 지정된 수준으로 발현하지 않는 환자에 비해, 및/또는 승인된 항종양제 (예컨대, 에를로티닙의 화학치료 요법)를 사용하여 치료받은 환자에 비해, 치료받은 환자에서의 전체 생존 또는 무진행 생존이 증가하는 것을 의미한다.
"객관적 반응"은 완전 반응 (CR) 또는 부분 반응 (PR)을 포함하여 측정가능한 반응을 의미한다.
"완전 반응" 또는 "CR"은 치료에 반응하여 암의 모든 증상이 사라짐을 의도한다. 이것은 항상 암이 치유되었음을 의미하지는 않는다.
"부분 반응" 또는 "PR"은 치료에 반응하여 하나 이상의 종양 또는 병변의 크기, 또는 신체 내의 암의 정도의 감소를 지칭한다.
"치료"는 치유적 치료, 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 대상은 이미 양성, 전암성 또는 비전이성 종양을 갖는 대상 뿐만 아니라 암의 발생 또는 재발을 예방하고자 하는 대상을 포함한다.
용어 "치료 유효량"은 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 치료제의 양을 지칭한다. 암의 경우에, 치료제의 치료 유효량은 암 세포의 수를 감소시킬 수 있고/거나; 원발성 종양 크기를 감소시킬 수 있고/거나; 말초 기관 내로의 암 세포 침윤을 억제할 수 있고/거나 (즉, 어느 정도까지 느리게 하고, 바람직하게는 정지시킴); 종양 전이를 억제할 수 있고/거나 (즉, 어느 정도까지 느리게 하고, 바람직하게는 정지시킴); 종양 성장을 어느 정도까지 억제할 수 있고/거나; 장애와 연관된 하나 이상의 증상을 어느 정도까지 완화할 수 있다. 약물은, 기존 암 세포의 성장을 방지하고/거나 이를 사멸시킬 수 있는 정도까지 세포증식억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 암 요법의 경우에, 생체내 효능은 예를 들어 생존 기간, 질환 진행까지의 시간 (TTP), 반응률 (RR), 반응 지속기간 및/또는 삶의 질을 평가하여 측정될 수 있다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리적 상태를 지칭하거나 또는 설명한다. 이 정의는 양성 및 악성 암을 포함한다. "초기 병기 암" 또는 "초기 병기 종양"은 침습성 또는 전이성이 아닌 암을 의미하거나, 또는 0, I 또는 II기의 암으로 분류된다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종 (수모세포종 및 망막모세포종 포함), 육종 (지방육종 및 활막 세포 육종 포함), 신경내분비 종양 (카르시노이드 종양, 가스트린종 및 도세포암 포함), 중피종, 슈반세포종 (청신경종 포함), 수막종, 선암종, 흑색종, 및 백혈병 또는 림프성 악성종양을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 흑색종, 결장직장암, 갑상선암 (예를 들어, 유두상 갑상선 암종), 비소세포 폐암 (NSCLC), 복막암, 간세포성암, 위 또는 위장암을 포함하는 위암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암 (전이성 유방암 포함), 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 고환암, 식도암, 담도의 종양, 뿐만 아니라 두경부암을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 흑색종; 결장직장암; 갑상선암, 예를 들어, 유두상 갑상선암; 또는 난소암이다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단수 또는 복수로 사용될 때 일반적으로 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, 예를 들어 본원에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함하는 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함하는 RNA, 단일-가닥 또는 보다 전형적으로는 이중-가닥일 수도 있거나 또는 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함할 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 RNA 또는 DNA, 또는 RNA와 DNA 둘 다를 포함하는 삼중-가닥 영역을 지칭한다. 이러한 영역 내 가닥들은 동일한 분자 또는 상이한 분자로부터의 것일 수 있다. 상기 영역은 모두 1개 이상의 분자를 포함할 수 있지만, 보다 전형적으로는 오직 일부 분자의 영역을 포함한다. 삼중-나선 영역의 분자 중 1개는 종종 올리고뉴클레오티드이다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 구체적으로 cDNA를 포함한다. 용어는 1개 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA (cDNA 포함) 및 RNA를 포함한다. 따라서, 안정성 또는 다른 이유로 인해 변형된 백본을 갖는 DNA 또는 RNA는 "폴리뉴클레오티드"이고, 상기 용어는 본원에 의도된 바와 같다. 또한, 이노신과 같은 비통상적 염기 또는 삼중수소화 염기와 같은 변형된 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA가 본원에 정의된 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오티드"에 포함된다. 일반적으로, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 비변형된 폴리뉴클레오티드의 모든 화학적으로, 효소적으로 및/또는 대사적으로 변형된 형태뿐만 아니라 바이러스 및 세포 (단순 및 복합 세포 포함)의 특징적인 DNA 및 RNA의 화학적 형태를 포함한다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로스포스파미드 (시톡산(CYTOXAN)®); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민 (알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸로멜라민 포함); 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜키신; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (하이캄틴(HYCAMTIN)®) 포함), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); CDP323, 경구 알파-4 인테그린 억제제; 디네미신 (디네미신 A 포함); 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (아드리아마이신(ADRIAMYCIN)®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 주사 (독실(DOXIL)®), 리포솜 독소루비신 TLC D-99 (미오세트(MYOCET)®), PEG화 리포솜 독소루비신 (케릭스(CAELYX)®) 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트, 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)®), 테가푸르 (유프토랄(UFTORAL)®), 카페시타빈 (젤로다(XELODA)®), 에포틸론, 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 항부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체 (JHS 내츄럴 프로덕츠(JHS Natural Products), 오레곤주 유진); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2'-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)®), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제제 (아브락산(ABRAXANE)™), 및 도세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)®); 클로란부실; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 작용제, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)®), 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)®), 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®), 및 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)®)을 비롯한, 튜불린 중합이 미세소관을 형성하는 것을 방지하는 빈카; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 류코보린; 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산 (벡사로텐 (탈그레틴(TARGRETIN)®)); 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)® 또는 오스탁(OSTAC)®), 에티드로네이트 (디드로칼(DIDROCAL)®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (조메타(ZOMETA)®), 알렌드로네이트 (포사맥스(FOSAMAX)®), 파미드로네이트 (아레디아(AREDIA)®), 틸루드로네이트 (스켈리드(SKELID)®), 또는 리세드로네이트 (악토넬(ACTONEL)®); 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 관여하는 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예컨대 테라토프(THERATOPE)® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신, 및 박시드(VAXID)® 백신; 토포이소머라제 1 억제제 (예를 들어, 루르토테칸(LURTOTECAN)®); rmRH (예를 들어, 아바렐릭스(ABARELIX)®); BAY439006 (소라페닙; 바이엘(Bayer)); SU-11248 (화이자(Pfizer)); 페리포신, COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브 또는 에토리콕시브), 프로테오솜 억제제 (예를 들어, PS341); 보르테조밉 (벨케이드(VELCADE)®); CCI-779; 티피파르닙 (R11577); 오라페닙, ABT510; Bcl-2 억제제, 예컨대 오블리메르센 나트륨 (게나센스(GENASENSE)®); 픽산트론; EGFR 억제제 (하기 정의 참조); 티로신 키나제 억제제 (하기 정의 참조); 및 상기 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 중 2종 이상의 조합물, 예컨대 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어) 및 FOLFOX (5-FU 및 류코보린과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴(ELOXATIN)™)을 사용하는 치료 요법에 대한 약어)를 포함한다.
본원에서 화학요법제는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 영향을 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하는 "항호르몬제" 또는 "내분비 치료제"를 포함한다. 이들은 혼합된 효능제/길항제 프로파일을 갖는 항에스트로겐, 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)®), 4-히드록시타목시펜, 토레미펜 (파레스톤(FARESTON)®), 이독시펜, 드롤록시펜, 랄록시펜 (에비스타(EVISTA)®), 트리옥시펜, 케옥시펜, 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM), 예컨대 SERM3; 효능제 특성을 갖지 않는 순수한 항에스트로겐, 예컨대 풀베스트란트 (파슬로덱스(FASLODEX)®) 및 EM800 (이러한 작용제는 에스트로겐 수용체 (ER) 이량체화를 차단하고/거나, DNA 결합을 억제하고/거나, ER 턴오버를 증가시키고/거나 ER 수준을 저해할 수 있음); 아로마타제 억제제, 예를 들어 스테로이드성 아로마타제 억제제, 예컨대 포르메스탄 및 엑세메스탄 (아로마신(AROMASIN)®), 및 비스테로이드성 아로마타제 억제제, 예컨대 아나스트라졸 (아리미덱스(ARIMIDEX)®), 레트로졸 (페마라(FEMARA)®) 및 아미노글루테티미드, 및 다른 아로마타제 억제제, 예를 들어 보로졸 (리비소르(RIVISOR)®), 메게스트롤 아세테이트 (메가세(MEGASE)®), 파드로졸 및 4(5)-이미다졸; 황체화 호르몬-방출 호르몬 효능제, 예를 들어 류프롤리드 (루프론(LUPRON)® 및 엘리가드(ELIGARD)®, 고세렐린, 부세렐린 및 트립테렐린; 성별 스테로이드, 예를 들어 프로게스틴, 예컨대 메게스트롤 아세테이트 및 메드록시프로게스테론 아세테이트, 에스트로겐, 예컨대 디에틸스틸베스트롤 및 프레마린, 및 안드로겐/레티노이드, 예컨대 플루옥시메스테론, 모든 트랜스레티온산 및 펜레티니드; 오나프리스톤; 항프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향 조절제 (ERD); 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 상기 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 중 2종 이상의 조합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 호르몬 그 자체일 수 있다.
본원에서 화학요법제 또는 화학치료 요법의 구체적 예는 다음을 포함한다: 알킬화제 (예를 들어, 클로람부실, 벤다무스틴 또는 시클로포스파미드); 뉴클레오시드 유사체 또는 항대사물 (예를 들어, 플루다라빈), 플루다라빈 및 시클로포스파미드 (FC); 프레드니손 또는 프레드니솔론; 알킬화제-함유 조합 요법, 예를 들어 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니솔론 (CHOP) 또는 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니솔론 (CVP), 등.
"표적 청중"은, 마케팅 또는 광고에 의해서와 같이, 특히 특정한 용도, 치료 또는 적응증을 위한 특정한 의약이 프로모션되고 있거나 프로모션되도록 의도되는 일군의 사람들 또는 기관, 예컨대 개별 환자, 환자 집단, 신문, 의학 문헌 및 잡지의 구독자, 텔레비젼 또는 인터넷 시청자, 라디오 또는 인터넷 청취자, 의사, 제약 회사 등이다.
"포장 삽입물"은, 적응증, 용법, 투여량, 투여, 금기, 포장된 제품과 조합되는 기타 치료 제품, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 경고 등에 관한 정보를 함유하는, 치료 제품의 상업용 패키지에 관례상 포함되는 지침서를 지칭하기 위해 사용된다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
"친화도 성숙" 항체는 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는 변경을 갖지 않는 모 항체와 비교하여 하나 이상의 초가변 영역 (HVR)에서 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭한다.
참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 참조 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하고, 반대로 경쟁 검정에서 참조 항체가 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭한다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래된 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 다른 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 그의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5종의 주요 부류의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포 기능의 억제 또는 저해 및/또는 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 세포독성제는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제); 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예컨대 핵산분해 효소; 항생제; 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함); 및 하기 개시되는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
"이펙터 기능"은 항체 이소형에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실-말단으로 신장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같이 EU 인덱스로도 지칭되는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 하기 FR 도메인으로 이루어진다: FR1, FR2, FR3 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 교환가능하게 사용되며, 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에서 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 이용하여 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 배제된다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열이 초가변성이고/거나 구조적으로 한정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR; VH 내의 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내의 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터의 및/또는 "상보성 결정 영역" (CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 서열 가변성이 가장 높고/거나 항원 인식과 관련된다. 예시적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3)에서 발생한다. (문헌 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)].) 예시적인 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65 및 H3의 95-102에서 발생한다. (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]). VH 내의 CDR1을 제외하고는, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원에 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 단축-CDR, 또는 a-CDR로 지칭되는 CDR의 영역 내에 함유된다. 예시적인 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58 및 H3의 95-102에서 발생한다. (문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조). 달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인에서의 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 본원에서 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다. 한 실시양태에서, 본원에서 c-met 항체는 서열 1-6의 HVR을 포함한다.
"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 포함하는 당업계에 공지된 통상의 방법으로 측정할 수 있다. 결합 친화도 측정을 위한 구체적인 예시적 및 대표적 실시양태를 하기 기재한다.
"면역접합체"는 세포독성제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하기 위해 사용되고, 즉 이러한 집단을 구성하는 개별 항체는 일반적으로 소량으로 존재할 수도 있는, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 포함하거나 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 생성되는 가능한 변이체 항체를 제외하고는 동일하고/하거나, 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로서 간주되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 이뮤노글로불린 로커스의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조할 수 있고, 이러한 방법 및 모노클로날 항체를 제조하기 위한 다른 예시적인 방법이 본원에 기재된다.
"네이키드 항체"는 이종 모이어티 (예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 제약 제제에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 변화하는 구조를 갖는 자연 발생 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디술피드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 영역 (VH) (또한 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로 지칭됨)에 이어 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 영역 (VL) (또한 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로 지칭됨)에 이어 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 지칭되는 2종의 유형 중 하나로 할당될 수 있다.
용어 "제약 제제"는 의약의 생물학적 활성이 유효하게 할 수 있는 형태로 존재하고, 해당 제제가 투여되는 대상체에 대해 허용가능하지 않게 독성인 추가의 성분을 전혀 함유하지 않은 멸균 제제를 지칭한다.
"멸균" 제제는 무균이거나 또는 모든 살아있는 미생물 및 그의 포자가 없다.
"키트"는 하나 이상의 시약, 예를 들어 암 (예를 들어, 흑색종, 결장직장암)의 치료를 위한 의약 또는 바이오마커 유전자 또는 단백질을 특이적으로 검출하기 위한 시약 (예를 들어, 항체)을 포함하는 임의의 제조품 (예를 들어, 포장 또는 용기)이다. 제조품은 바람직하게는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 유닛으로 프로모션되거나, 유통되거나 또는 판매된다.
"제약상 허용되는 담체"는 대상체에게 비독성인, 활성 성분 이외의 제약 제제 내의 성분을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는 서열을 정렬시키고 필요한 경우에는 최대 서열 동일성 퍼센트 달성을 위해 갭을 도입한 후 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 당업계 기술 범위 내의 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교할 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열 정렬에 적절한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 소유로서, 소스 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여 UNIX 운영 시스템에서 사용되도록 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 % (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 또는 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 기재될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다:
X/Y의 분율 x 100
여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B의 프로그램 정렬시에 상기 프로그램에 의해 동일한 매치로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 전체 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는 B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %가 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 상기 단락에 기재한 바와 같이 수득한다.
II. 암 의약
한 측면에서, 본 발명은 대상체에서 병리학적 상태, 예컨대 암을 치료하기 위한 조합 요법에 있어서 c-met 길항제 및 B-raf 길항제의 용도를 특징으로 한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 바이오마커 중 하나 이상의 발현에 기초하여 암 의약을 사용하여 치료될 수 있는 환자를 선택하는 것에 관한 것이다. 암 의약의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
- 항-c-met 항체를 비롯한 c-met 길항제.
- B-raf 길항제.
- 화학요법제 및 화학치료 요법.
- 암, 예를 들어 흑색종을 치료하기 위한 개발 또는 승인된 다른 의약 또는 그의 조합.
c-met 길항제의 예는 가용성 c-met 수용체, 가용성 HGF 변이체, c-met 또는 HGF에 결합하는 압타머 또는 펩티바디, c-met 소분자, 항-c-met 항체 및 항-HGF 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, c-met 길항제는 예를 들어 c-met에 대해 지시되거나 또는 이에 결합하는 항체이다. 본원에서 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 비롯한 모노클로날 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', 1-아암 항체, scFv, 디아바디 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어 무손상 IgG1 항체, 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소형이다. 한 실시양태에서, 항체는 1가이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 Fc 영역을 포함하는 1-아암 항체 (즉, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인이 단일 항원 결합 아암을 형성함)이고, 여기서 Fc 영역은 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드는 복합체로 존재하고, 상기 항원 결합 아암을 포함하는 Fab 분자와 비교하여 상기 항체 단편의 안정성을 증가시키는 Fc 영역을 형성한다. 1-아암 항체는 1가일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항-c-met 항체는 MetMAb (오나르투주맙) 또는 그의 바이오시밀러 버전이다. MetMAb는 예를 들어 WO2006/015371; 문헌 [Jin et al., Cancer Res (2008) 68:4360]에 개시되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 항-c-met 항체는 (a) 서열 GYTFTSYWLH (서열 1)를 포함하는 HVR1-HC; (b) 서열 GMIDPSNSDTRFNPNFKD (서열 2)를 포함하는 HVR2-HC; 및/또는 (c) 서열 ATYRSYVTPLDY (서열 3)를 포함하는 HVR3-HC 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 KSSQSLLYTSSQKNYLA (서열 4)를 포함하는 HVR1-LC; 서열 WASTRES (서열 5)를 포함하는 HVR2-LC; 및/또는 (c) 서열 QQYYAYPWT (서열 6)를 포함하는 HVR3-LC 중 하나 이상을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서 항-c-met 항체는 (a) 서열 GYTFTSYWLH (서열 1)를 포함하는 HVR1-HC; (b) 서열 GMIDPSNSDTRFNPNFKD (서열 2)를 포함하는 HVR2-HC; 및 (c) 서열 ATYRSYVTPLDY (서열 3)를 포함하는 HVR3-HC를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 (a) 서열 KSSQSLLYTSSQKNYLA (서열 4)를 포함하는 HVR1-LC; 서열 WASTRES (서열 5)를 포함하는 HVR2-LC; 및 (c) 서열 QQYYAYPWT (서열 6)를 포함하는 HVR3-LC를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
임의의 상기 실시양태에서, 예를 들어, 항-c-met 항체는 인간화될 수 있다. 한 실시양태에서, 항-c-met 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같이 HVR을 포함하고, 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 항-c-met 항체는 서열 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열과 관련하여 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이 서열을 포함하는 항-c-met 항체는 인간 c-met에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 7에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 변경 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 임의로, 항-c-met-항체는 서열 7의 VH 서열을 포함한다 (이 서열의 번역후 변형 포함).
또 다른 측면에서, 서열 8의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-c-met 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이 서열을 포함하는 항-c-met 항체는 c-met에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 서열 8에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 임의로, 항-c-met 항체는 서열 8의 VL 서열을 포함한다 (이 서열의 번역후 변형 포함).
또 다른 실시양태에서, 항-c-met 항체는 서열 8의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VL 영역, 및 서열 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VH 영역을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항-c-met 항체는 아미노산 서열 서열 1을 포함하는 HVR-L1; 아미노산 서열 서열 2를 포함하는 HVR-L2; 아미노산 서열 서열 3을 포함하는 HVR-L3; 아미노산 서열 서열 4를 포함하는 HVR-H1; 아미노산 서열 서열 5를 포함하는 HVR-H2; 및 아미노산 서열 서열 6을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-c-met 항체가 제공된다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 항-c-met 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 서열 7의 VH 서열 및 서열 8의 VL 서열을 포함하는 항-c-met 항체와 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 상기 항체에 의해 경쟁적으로 억제될 수 있는 항체가 제공된다.
본 발명의 추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-c-met 항체는 1가, 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 비롯한 모노클로날 항체일 수 있다. 한 실시양태에서, 항-c-met 항체는 항체 단편, 예를 들어 1-아암, Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어 무손상 IgG1 또는 IgG4 항체, 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소형이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 항체는 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 HVR을 포함하거나, 상기 기재된 VH 및 VL 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-c-met 항체는 1가이고, (a) 서열:
Figure pct00001
를 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드, CH1 서열, 및 제1 Fc 폴리펩티드; (b) 서열:
Figure pct00002
을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드, 및 CL1 서열; 및 (c) 제2 Fc 폴리펩티드를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하며 (또는 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어짐), 여기서 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 복합체로 존재하고, 단일 항원 결합 아암을 형성하며, 여기서 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드는 복합체로 존재하고, 상기 항원 결합 아암을 포함하는 Fab 분자와 비교하여 상기 항체 단편의 안정성을 증가시키는 Fc 영역을 형성한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 Fc 서열
Figure pct00003
을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 Fc 서열
Figure pct00004
를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-c-met 항체는 1가이고, (a) 중쇄를 포함하는 제1 폴리펩티드 (상기 폴리펩티드는 서열:
Figure pct00005
를 포함함); (b) 경쇄를 포함하는 제2 폴리펩티드 (폴리펩티드는 서열
Figure pct00006
를 포함함); 및 Fc 서열을 포함하는 제3 폴리펩티드 (폴리펩티드는 서열
Figure pct00007
를 포함함)를 포함하며, 여기서 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 복합체로 존재하고, 단일 항원 결합 아암을 형성한다.
본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 다른 항-c-met 항체가 본원에 기재되어 있으며 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, WO05/016382에 개시된 항-c-met 항체 (항체 13.3.2, 9.1.2, 8.70.2, 8.90.3을 포함하나 이에 제한되지는 않음); 제노바의 CBA에 ICLC 번호 PD 03001로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산되거나, 또는 HGF 수용체의 β 쇄의 세포외 도메인 상의 에피토프를 인식하는 항-c-met 항체 (상기 에피토프는 모노클로날 항체에 의해 인식되는 것과 동일함)); WO2007/126799에 개시된 항-c-met 항체 (04536, 05087, 05088, 05091, 05092, 04687, 05097, 05098, 05100, 05101, 04541, 05093, 05094, 04537, 05102, 05105, 04696, 04682를 포함하나 이에 제한되지는 않음); WO2009/007427에 개시된 항 c-met 항체 (CNCM, 인스티튜트 파스퇴르(Institut Pasteur), 프랑스 파리)에 2007년 3월 14일에 번호 I-3731로, 2007년 3월 14일에 번호 I-3732로, 2007년 7월 6일에 번호 I-3786으로, 2007년 3월 14일에 번호 I-3724로 기탁된 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않음); 20110129481에 개시된 항-c-met 항체; US20110104176에 개시된 항-c-met 항체; WO2009/134776에 개시된 항-c-met 항체; WO2010/059654에 개시된 항-c-met 항체; WO2011020925에 개시된 항-c-met 항체 (CNCM, 인스티튜트 파스퇴르 (프랑스 파리)에 2008년 3월 12일에 번호 I-3949로 기탁된 하이브리도마 및 2010년 1월 14일에 번호 I-4273으로 기탁된 하이브리도마로부터 선택된 항체를 포함하는 이에 제한되지는 않음).
한 측면에서, 항-c-met 항체는 항체 단편 내의 Fc 서열의 동종이량체화를 최소화하면서 이종이량체화를 촉진하는 적어도 하나의 특성을 포함한다. 이러한 특성(들)은 이뮤노글로불린 집단의 수율 및/또는 순도 및/또는 동질성을 개선한다. 한 실시양태에서, 항체는 WO2005/063816에서 기재된 바와 같이 "노브(knob)" 및 "홀(hole)"을 구성하는 Fc 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 홀 돌연변이는 Fc 폴리펩티드에서 T366A, L368A 및/또는 Y407V 중 하나 이상일 수 있고, 캐비티 돌연변이는 T366W일 수 있다.
일부 실시양태에서, c-met 길항제는 항-간세포 성장 인자 (HGF) 항체, 예를 들어, 인간화 항-HGF 항체 TAK701, 릴로투무맙, 피클라투주맙 및/또는 WO2007/143090에 기재된 인간화 항체 2B8이다. 일부 실시양태에서, 항-HGF 항체는 US7718174B2에 기재된 항-HGF 항체이다.
일부 실시양태에서, c-met 길항제는 c-met 소분자 억제제이다. 바람직하게는, 소분자 억제제는 바람직하게는 c-met에 특이적으로 결합하는, 본원에 정의된 바와 같은 결합 폴리펩티드 또는 항체 이외의 유기 분자이다. 일부 실시양태에서, c-met 소분자 억제제는 선택적 c-met 소분자 억제제이다. 일부 실시양태에서, c-met 길항제는 키나제 억제제이다.
HGF에 특이적으로 결합하는 c-met 수용체 분자 또는 그의 단편이 예를 들어 HGF 단백질에 결합하여 격리시킴으로써 신호전달을 방지하기 위해 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 바람직하게는, c-met 수용체 분자, 또는 그의 HGF 결합 단편은 가용성 형태이다. 일부 실시양태에서, 가용성 형태의 수용체는 HGF에 결합하여 표적 세포의 표면 상에 존재하는 그의 천연 수용체에 대한 그의 결합을 방지함으로써 c-met 단백질의 생물학적 활성에 대한 억제 효과를 발휘한다. 또한, c-met 수용체 융합 단백질이 포함되고, 그의 예는 하기 기재되어 있다.
본 발명의 가용성 c-met 수용체 단백질 또는 키메라 c-met 수용체 단백질은 막횡단 도메인을 통해 세포 표면에 고정되지 않는 c-met 수용체 단백질을 포함한다. 이에 따라, 가용성 형태의 c-met 수용체 (키메라 수용체 단백질 포함)는 HGF에 결합하여 이를 불활성화시킬 수 있지만, 막횡단 도메인을 포함하지 않아 일반적으로는 분자가 발현되는 세포의 세포막에 결합하지 않는다. 예를 들어, 문헌 [Kong-Beltran, M et al. Cancer Cell (2004) 6(1): 75-84]을 참조한다.
c-met에 특이적으로 결합하고 c-met의 활성화를 차단하거나 감소시킴으로써 그의 신호전달을 방지하는 HGF 분자 또는 그의 단편이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
압타머는 표적 분자, 예컨대 HGF 또는 c-met 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 3차 구조를 형성하는 핵산 분자이다. 압타머의 생성 및 치료 용도는 당업계에 잘 확립되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,475,096을 참조한다. HGF 압타머는 세포외 HGF에 결합할 수 있도록 하는 3차원 형태를 채택한, PEG화 변형된 올리고뉴클레오티드이다. 압타머에 대한 추가의 정보는 미국 특허 출원 공개 번호 20060148748에서 찾아볼 수 있다.
펩티바디는 이뮤노글로불린 분자의 단편 또는 일부를 코딩하는 아미노산 서열에 연결된 펩티드 서열이다. 폴리펩티드는 파지 디스플레이 기술을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 특이적 결합을 위한 임의의 방법에 의해 선별된 무작위화 서열로부터 유래될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 선택된 폴리펩티드는 이뮤노글로불린의 Fc 부분을 코딩하는 아미노산 서열에 연결될 수 있다. HGF 또는 c-met에 특이적으로 결합하고 이에 길항작용을 하는 펩티바디가 또한 본 발명의 방법에 유용하다.
한 실시양태에서, c-met 길항제는 c-met 세포외 도메인에 결합한다. 일부 실시양태에서, c-met 길항제는 c-met 키나제 도메인에 결합한다. 일부 실시양태에서, c-met 길항제는 간세포 성장 인자 (HGF)에 결합하는 c-met와 경쟁한다. 일부 실시양태에서, c-met 길항제는 HGF에 결합한다.
특정 실시양태에서, c-met 길항제는 하기 중 임의의 하나이다: GDC-0712, SGX-523, 크리조티닙 (PF-02341066; 3-[(1R)-1-(2,6-디클로로-3-플로오로페닐)에톡시]-5-(1-피페리딘-4-일피라졸-4-일)피리딘-2-아민; CAS 번호 877399-52-5); JNJ-38877605 (CAS 번호 943540-75-8), BMS-698769, PHA-665752 (화이자(Pfizer)), SU5416, INC-280 (인사이트(Incyte); SU11274 (수젠(Sugen); [(3Z)-N-(3-클로로페닐)-3-({3,5-디메틸-4-[(4-메틸피페라진-1-일)카르보닐]-1H-피롤-2-일}메틸렌)-N-메틸-2-옥소인돌린-5-술폰아미드; CAS 번호 658084-23-2]), 포레티닙 (GSK1363089), XL880 (CAS 번호 849217-64-7; XL880은 met 및 VEGFR2 및 KDR의 억제제임); MGCD-265 (메틸진(MethylGene); MGCD-265는 c-MET, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, Ron 및 Tie-2 수용체를 표적화함; CAS 번호 875337-44-3), 티반티닙 (ARQ 197; (-)-(3R,4R)-3-(5,6-디히드로-4H-피롤로[3,2,1-ij]퀴놀린-1-일)-4-(1H-인돌-3-일)피롤리딘-2,5-디온; 문헌 [Munchi et al., Mol Cancer Ther June 2010 9; 1544] 참조; CAS 번호 905854-02-6), LY-2801653 (릴리(Lilly)), LY2875358 (릴리), MP-470, 릴로투무맙, (AMG 102, 항-HGF 모노클로날 항체), 항체 223C4 또는 인간화 항체 223C4 (WO2009/007427), 인간화 L2G7 (인간화 TAK701; 인간화 항-HGF 모노클로날 항체); EMD 1214063 (머크 소로노(Merck Sorono)), EMD 1204831 (머크 소로노), NK4, 카보잔티닙 (XL-184, CAS 번호 849217-68-1; 카르보잔티닙은 met 및 VEGFR2의 이중 억제제임), MP-470 (슈퍼젠(SuperGen); c-KIT, MET, PDGFR, Flt3, 및 AXL의 신규 억제제임), Comp-1, 피클라투주맙 (AV-299; 항-HGF 모노클로날 항체), E7050 (Cas 번호 1196681-49-8; E7050은 이중 c-met 및 VEGFR2 억제제임 (에사이(Esai)); MK-2461 (머크; N-((2R)-1,4-디옥산-2-일메틸)-N-메틸-N'-[3-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)-5-옥소-5H-벤조[4,5]시클로헵타[1,2-b]피리딘-7-일]술파미드; CAS 번호 917879-39-1); MK8066 (머크), PF4217903 (화이자), AMG208 (암젠(Amgen)), SGX-126, RP1040, LY2801653, AMG458, EMD637830, BAY-853474, DP-3590. 특정 실시양태에서, c-met 길항제는 크리조티닙, 티반티닙, 카르보잔티닙, MGCD-265, 피클라투주맙, 인간화 TAK-701, 릴로투무맙, 포레티닙, h224G11, DN-30, MK-2461, E7050, MK-8033, PF-4217903, AMG208, JNJ-38877605, EMD1204831, INC-280, LY-2801653, SGX-126, RP1040, LY2801653, BAY-853474 및/또는 LA480 중 임의의 하나 이상이다. 특정 실시양태에서, c-met 길항제는 크리조티닙, 티반티닙, 카르보잔티닙, MGCD-265, 피클라투주맙, 인간화 TAK-701, 릴로투무맙 및/또는 포레티닙 중 임의의 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, c-met 길항제는 GDC-0712이다.
B-raf 길항제는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 소라페닙, PLX4720, PLX-3603, GSK2118436, GDC-0879, N-(3-(5-(4-클로로페닐)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-카르보닐)-2,4-디플루오로페닐)프로판-1-술폰아미드 및 WO2007/002325, WO2007/002433, WO2009111278, WO2009111279, WO2009111277, WO2009111280 및 미국 특허 번호 7,491,829에 기재된 것을 포함한다. 다른 B-raf 길항제는 베무라페닙 (또한, 젤로브라프(Zelobraf)® 및 PLX-4032로 공지됨), GSK 2118436, RAF265 (노파르티스), XL281, ARQ736, BAY73-4506을 포함한다. 일부 실시양태에서, B-raf 길항제는 선택적 B-raf 길항제이다. 일부 실시양태에서, B-raf 길항제는 B-raf V600의 선택적 길항제이다. 일부 실시양태에서, B-raf 길항제는 B-raf V600E의 선택적 길항제이다. 일부 실시양태에서, B-raf V600은 B-raf V600E, B-raf V600K 및/또는 V600D이다. 일부 실시양태에서, B-raf V600은 B-raf V600R이다.
B-raf 길항제는 소분자 억제제일 수 있다. 바람직하게는, 소분자 억제제는 바람직하게는 B-raf에 특이적으로 결합하는 본원에 정의된 바와 같은 폴리펩티드 또는 항체 이외의 유기 분자이다. 일부 실시양태에서, B-raf 길항제는 키나제 억제제이다. 일부 실시양태에서, B-raf 길항제는 항체, 펩티드, 펩티드모방체, 압타머 또는 폴리뉴클레오티드이다.
한 실시양태에서, 항체, 예를 들어 본원의 방법에 사용된 항체는 하기 섹션 1-6에 기재된 바와 같은 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 혼입시킬 수 있다:
1. 항체 단편
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 1-아암 항체 및 하기 기재된 다른 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌 [Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌 [Pluckthuen, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조하고; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458을 참조한다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의에 대해, 미국 특허 번호 5,869,046을 참조한다.
디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 월섬; 예를 들어 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조).
1-아암 항체 (즉, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인이 단일 항원 결합 아암을 형성함)는 예를 들어 WO2005/063816; 문헌 [Martens et al., Clin Cancer Res (2006), 12: 6144]에 개시되어 있다. 길항작용 기능을 필요로 하고 항체의 2가성이 바람직하지 않은 효능 효과를 야기하는 병리학적 상태를 치료하는 경우에, 1-아암 항체 (즉, 단일 항원 결합 아암을 포함하는 항체)의 1가 특성은 항체의 표적 분자에의 결합시에 길항작용 기능을 야기하고/거나 보장한다. 또한, Fc 영역을 포함하는 1-아암 항체는 유사한/실질적으로 동일한 항원 결합 특성을 갖는 Fab 형태와 비교하여 우수한 약동학 특성 (예컨대, 생체내에서 증진된 반감기 및/또는 감소된 제거율)을 특징으로 하며, 이에 따라 종래의 1가 Fab 항체를 사용하는데 있어서의 주요 문제점이 극복된다. 1-아암 항체의 제조 기술은 "노브-인-홀" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참조)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. MetMAb는 1-아암 항체의 예이다.
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 무손상 항체의 단백질분해적 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
2. 키메라 및 인간화 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 부모 항체의 것으로부터 변화된 "부류 스위칭" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 부모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성이 감소하도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 그의 일부)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 그의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래된 1개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 회복시키거나 또는 향상시키기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에서 검토되었고, 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; [Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)] (SDR (a-CDR) 그라프팅 기재); [Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)] ("리서페이싱" 기재); [Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)] ("FR 셔플링" 기재); 및 [Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)] (FR 셔플링에 대한 "가이드 선택" 접근법 기재)에 추가로 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "최적-적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙 (체세포 성숙) 프레임워크 영역 또는 인간 배선 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
3. 인간 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 다양한 당업계의 공지된 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원 접종에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 무손상 인간 항체 또는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여하여 제조할 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 이뮤노글로불린 로커스를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체로 무작위적으로 통합된 인간 이뮤노글로불린 로커스의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 이뮤노글로불린 로커스는 일반적으로 불활성화된다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 문헌 [Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술 기재); 미국 특허 번호 5,770,429 (HuMab® 기술 기재); 미국 특허 번호 7,041,870 (K-M 마우스(K-M MOUSE)® 기술 기재), 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900 (벨로시마우스(VelociMouse)® 기술 기재)을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 조합시켜 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조.) 또한, 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체가 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체 생산 기재) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)] (인간-인간 하이브리도마 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리하여 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 바람직한 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기 기재된다.
4. 라이브러리-유래 항체
본 발명의 항체는 원하는 활성을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 원하는 결합 특성을 갖는 항체에 대하여 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에서 검토되고, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 개별적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 클로닝되고, 파지 라이브러리에 무작위적으로 재조합되며, 이는 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리를 클로닝 (예를 들어, 인간으로부터)하여, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 최종적으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하고 있는 특허 공보는 예를 들어 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 및 2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 여겨진다.
5. 다중특이적 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 c-met에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원 (예를 들어, B-raf)에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 c-met의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 c-met를 발현하는 세포에 세포독성제를 국재화시키는데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))], WO 93/08829, 및 [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "노브-인-홀" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과의 조작 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 이중특이적 항체를 생산하기 위한 류신 지퍼의 사용 (예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 "디아바디" 기술의 사용 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체의 사용 (예를 들어, 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들어 문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체의 제조에 의해 제조될 수 있다.
"옥토퍼스 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576A1 참조).
본원의 항체 또는 단편은 또한 c-met 뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원, 예컨대 EGFR에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).
6. 항체 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변경을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 원하는 특성, 예를 들어 항원-결합을 보유하도록, 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 아미노산 치환은 관심 항체에 도입되고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
치환 변이체의 한 가지 유형은 부모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 1개 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 부모 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 상승된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형 (예를 들어, 개선)을 가질 것이고/거나 부모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 이용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간략하게, 1개 이상의 HVR 잔기가 돌연변이화되고, 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고, 특정한 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드가 상기 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 1개 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에의 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형 이중안테나 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산 뿐만 아니라 이중안테나 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 제조하기 위해 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결손된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정된 Asn 297에 부착된 모든 당구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고만노스 구조물)의 합에 비해 Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균적인 양을 계산하여 결정된다. Asn297은 Fc 영역의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 나타내지만; Asn297은 또한 항체의 부가적 서열 변이에 의해 위치 297의 약 ± 3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294와 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (교와 핫코 고교 캄파니, 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결손" 항체 변이체에 대한 문헌의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]. 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결손된 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1 (Adams et al., 특히 실시예 11)), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다.
이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 추가로 제공되는데, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이중안테나 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항체 변이체는 푸코실화가 감소될 수 있고/거나 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예가, 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 모든 이펙터 기능은 아니지만, 몇몇 이펙터 기능을 보유하고 있으므로, 생체내에서의 항체의 반감기가 중요하긴 하지만 특정의 이펙터 기능 (예컨대, 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 해로운 많은 적용 분야에 대한 바람직한 후보가 되는 항체 변이체를 고려한다.
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에 치환을 갖는 Fc 돌연변이체 (잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는, 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함)를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcR에 대해 개선되거나 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재된다. (예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조.)
특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 나타내는 변경들이 Fc 영역에서 만들어진다.
증가된 반감기, 및 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대한 개선된 결합을 갖는 항체가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826).
Fc 영역 변이체의 다른 예에 관해서는 또한 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조한다.
특정 실시양태에서, 항체의 1개 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킨 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 이와 같이 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 부위에 배치되게 되고, 이것을 이용하여 항체를 본원에 추가로 기재한 바와 같이 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 면역접합체를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 임의의 1개 이상의 하기 잔기가 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 당업계에 공지되고 쉽게 입수가능한 추가의 비단백질성 잔기를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 물에서의 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 변할 수 있고, 하나 초과의 중합체가 부착될 경우, 중합체들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건 하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고려사항을 기반으로 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체, 및 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (문헌 [Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, 의약은 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소에 접합된 항체 (예컨대, c-met 항체)를 포함하는 면역접합체이다.
한 실시양태에서, 면역접합체는 항체가 메이탄시노이드 (미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴, 예컨대 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (미국 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588, 및 7,498,298 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그의 유도체 (미국 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 및 5,877,296; 문헌 [Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 안트라시클린, 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (문헌 [Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국 특허 번호 6,630,579); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 약물에 접합된 항체-약물 접합체 (ADC)이다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 효소 활성 독소 또는 그의 단편 (디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하나 이에 제한되지는 않음)에 접합된 본원에 기재된 항체를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 방사성접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합체의 생산을 위해 이용가능하다. 그 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성접합체는 검출용으로 사용되는 경우에 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123을 포함하거나, 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로도 공지됨)용 스핀 표지, 예컨대 다시 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드를 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO94/11026을 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광분해성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 번호 5,208,020)가 사용될 수 있다.
본원의 면역접합체 또는 ADC는 상업적으로 입수가능한 (예를 들어, 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.; 미국 일리노이주 록포드)로부터의) 가교-링커 시약 (BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 포함하나 이에 제한되지는 않음)으로 제조된 이러한 접합체를 명백하게 고려하나 이에 제한되지는 않는다.
화학요법제
본 발명의 조합 요법은 하나 이상의 화학요법제(들)를 사용하는 치료를 추가로 포함할 수 있다. 조합 투여는 개별 제제 또는 단일 제약 제제를 사용하여 공투여 또는 공동 투여하는 것과, 어느 한 순서로 연속 투여하는 것을 포함하며, 바람직하게는 양쪽 (또는 모든) 활성제가 그의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 기간이 존재한다. 화학요법제는, 투여하는 경우에, 이에 대해 공지된 투여량으로 통상적으로 투여하거나, 또는 임의로는 약물의 조합 작용 또는 화학요법제의 투여에 기인한 부정적 부작용 때문에 투여량을 감소시켜 투여한다. 이러한 화학요법제에 대한 제조 및 투여 스케줄은 제조업체의 지침에 따라 또는 숙련된 진료의가 경험적으로 결정하는 바에 따라 이용될 수 있다.
조합될 수 있는 다양한 화학요법제가 상기 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 조합되는 화학요법제는 탁소이드 (도세탁셀 및 파클리탁셀 포함), 빈카 (예컨대, 비노렐빈 또는 빈블라스틴), 백금 화합물 (예컨대, 카르보플라틴 또는 시스플라틴), 아로마타제 억제제 (예컨대, 레트로졸, 아나스트라졸, 또는 엑세메스탄), 항-에스트로겐 (예, 풀베스트란트 또는 타목시펜), 에토포시드, 티오테파, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 리포솜 독소루비신, PEG화 리포솜 독소루비신, 카페시타빈, 겜시타빈, COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브) 또는 프로테오솜 억제제 (예를 들어, PS342)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 테모졸로미드 및/또는 다카르바진이다.
III. 조합 요법
한 측면에서, 유효량 (예를 들어, 치료 유효량)의 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 암을 갖는 환자를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, c-met 길항제는 항-c-met 항체 (예를 들어, MetMAb)이다. 일부 실시양태에서, 치료는 항-c-met 항체 (예를 들어, MetMAb)를 B-raf 길항제, 예컨대 베무라페닙과 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-c-met 항체는 MetMAb (오나르투주맙)이다.
또 다른 측면에서, 유효량의 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 투여하는 것을 포함하는, B-raf 길항제에 대한 내성이 발생할 증가된 가능성을 갖는 암 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 암 환자에게 유효량의 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 투여하는 것을 포함하는, B-raf 길항제에 대한 감수성을 증가시키는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 암 환자에게 유효량의 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 투여하는 것을 포함하는, B-raf 길항제에 대한 감수성을 복구하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 암 환자에게 유효량의 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 투여하는 것을 포함하는, B-raf 길항제 감수성의 기간을 연장시키는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 유효량의 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 투여하는 것을 포함하는, B-raf 내성 암을 갖는 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 유효량의 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 투여하는 것을 포함하는, B-raf 길항제에 대한 반응을 확장하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 유효량의 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 투여하는 것을 포함하는, HGF-매개 B-raf 내성 암의 발생을 지연시키거나 예방하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 환자의 암이 c-met 바이오마커를 발현하는지 여부를 결정하는 것 및 환자의 암이 c-met 바이오마커를 발현하는 경우에 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 암이 B-raf 바이오마커 (예를 들어, 돌연변이체 B-raf 바이오마커)를 발현하는 것을 나타난 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, (i) b-raf 길항제를 사용하여 치료될 환자를 모니터링하여 환자의 암이 c-met 바이오마커의 발현을 발생시키는지를 결정하는 것, 및 (ii) 환자의 암이 c-met 바이오마커를 발현하는 것으로 나타난 경우에 환자의 치료 요법을 B-raf 길항제 뿐만 아니라 c-met 길항제를 포함하도록 변경하는 것을 포함하는, 암이 B-raf 바이오마커 (예를 들어, 돌연변이체 B-raf 바이오마커)를 발현하는 것으로 나타난 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, (i) B-raf 길항제를 사용하여 치료된 환자를 모니터링하여 환자의 암이 길항제에 대한 내성을 발생시키는지를 결정하는 것, (ii) 환자를 시험하여 환자의 암이 c-met 바이오마커를 발현하는지 여부를 결정하는 것, 및 (iii) 환자의 암이 c-met 바이오마커를 발현하는 것으로 나타난 경우에 환자의 치료 요법을 B-raf 길항제 뿐만 아니라 c-met 길항제를 포함하도록 변경하는 것을 포함하는, 암이 B-raf 바이오마커 (예를 들어, 돌연변이체 B-raf 바이오마커)를 발현하는 것으로 나타난 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
용어 암은 전암성 성장, 양성 종양 및 악성 종양 (이에 제한되지는 않음)을 포함하는 증식성 장애의 총괄적으로 포괄한다. 양성 종양은 발원 부위에 국한되어 유지되고 원위 부위로 침윤, 침습, 또는 전이하는 능력을 갖지 않는다. 악성 종양은 그 주변의 다른 조직에 침습하여 손상시킬 것이다. 이는 본래의 부위로부터 갈라져서 신체의 다른 부위로 확산될 수 있는 능력 (전이)을 갖고 있을 수 있는데, 통상적으로 혈류를 통해서 또는 림프절이 위치한 림프계를 통하여 이루어진다. 원발성 종양은 이들이 발생한 조직의 유형에 따라 분류되고, 전이성 종양은 암 세포가 유래된 조직 유형에 따라 분류된다. 시간이 지남에 따라, 악성 종양 세포는 더욱 비정상적으로 되고 정상 세포와 달라진다. 이러한 암 세포의 외형 상의 변화는 종양 등급으로 지칭되고, 암 세포는 잘 분화된 것 (저등급), 중간 수준으로 분화된 것, 불량한 수준으로 분화된 것, 또는 분화되지 않은 것 (고등급)으로서 설명된다. 고분화성 세포는 상당히 정상적인 외형을 나타내며 이들이 유래된 정상 세포와 유사하다. 미분화성 세포는 세포의 기원을 알 수 없을 정도로 매우 비정상적이 된 세포이다.
암의 병기결정 시스템은 암이 해부학적으로 얼마나 멀리 확산되었는지를 기재하고, 동일한 병기 군에서 유사한 예후 및 치료를 나타내는 환자를 수용하고자 하는 것이다. 생검 및 특정 영상화 시험, 예를 들어 흉부 X선, 유방촬영사진, 골 스캔, CT 스캔, 및 MRI 스캔을 비롯한, 암의 병기결정을 돕기 위한 몇가지 시험을 수행할 수 있다. 또한, 혈액 시험 및 임상 평가를 이용하여 환자의 전반적 건강 상태를 평가하고 암이 특정 기관으로 확산되었는지의 여부를 검출할 수 있다.
암의 병기분류를 위해서, 미국 암 연합 위원회(American Joint Committee on Cancer)는 우선 암, 특히 고형 종양에 TNM 분류 시스템을 이용한 문자 카테고리를 부여한다. 암은 문자 T (종양 크기), N (감지가능한 결절) 및/또는 M (전이)로 지정된다. T1, T2, T3 및 T4는 원발성 병변의 증가 크기를 기재하고, N0, N1, N2, N3은 점진적으로 진행되는 결절의 수반을 나타내고, M0 및 M1은 원격 전이의 부재 또는 존재를 반영한다.
전반적인 병기분류 또는 로마 숫자 병기분류라고도 공지된 제2 병기분류 방법에서는 암을 0기 내지 IV기로 나누며, 원발성 병변의 크기 및 또한 결절성 확산 및 원격 전이의 존재 여부를 도입한다. 이러한 시스템에서는, 사례를 로마 숫자 I 내지 IV로 표시되는 4개의 병기로 분류하거나 "재발"로서 분류한다. 일부 암의 경우에, 0기는 "상피내" 또는 "Tis"라고 지칭되는데, 예컨대 유방암의 경우에 관상피내 암종 또는 상피내 소엽성 암종이다. 고 등급 선종은 또한 0기로 분류될 수도 있다. 일반적으로, I기 암은 통상적으로 치유가능한 작은 국소 암인 반면, IV기 암은 통상적으로 수술이 불가능한 암 또는 전이성 암을 나타낸다. II기 및 III기 암은 통상적으로 국소 진행되고/거나 국소 림프절의 존재를 나타낸다. 일반적으로, 보다 높은 병기 숫자는 보다 광범위한 질환, 예를 들어 보다 큰 종양 크기 및/또는 원발성 종양에 인접한 근처 림프절 및/또는 기관으로의 암의 확산을 표시한다. 이러한 병기는 정확하게 규정되지만, 그 정의는 각 종류의 암에 따라 상이하고 당업자에게 공지되어 있다.
다수의 암 등기소, 예컨대 NCI의 서베일런스, 에피데미올로지, 앤드 엔드 리절츠 프로그램(Surveillance, Epidemiology, and End Results Program: SEER)이 요약 병기분류를 이용한다. 이 시스템은 모든 유형의 암에 사용된다. 이는 암 사례를 5종의 주요 카테고리로 분류한다:
상피내 암은 암이 시작되는 세포 층에만 존재하는 초기 암이다.
국소 암은 암이 시작되는 기관으로 제한되는 암이며, 확산의 증거가 없다.
국부 암은 본래의 (원발성) 부위를 벗어나서 근처 림프절 또는 기관 및 조직으로 확산된 암이다.
원위 암은 원발성 부위로부터 원위 기관 또는 원위 림프절로 확산된 암이다.
미지의 암은 병기 표시에 충분한 정보가 없는 사례를 기재하는데 사용된다.
또한, 원발성 종양이 제거된지 수개월 또는 수년 후에 암이 재발되는 것은 흔한 일이다. 모든 시각적 종양이 근절된 후에 재발되는 암은 재발성 질환이라 불린다. 원발성 종양 부위에서 재발되는 질환은 국소적으로 재발성이고, 전이물로서 재발되는 질환은 원위 재발이라 지칭된다.
종양은 고형 종양 또는 비-고형 또는 연부 조직 종양일 수 있다. 연부 조직 종양의 예는 백혈병 (예를 들어, 만성 골수 백혈병, 급성 골수 백혈병, 성인 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 성숙 B-세포 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 전림프구성 백혈병 또는 모발상 세포 백혈병), 또는 림프종 (예를 들어, 비-호지킨 림프종, 피부 T-세포 림프종 또는 호지킨병)을 포함한다. 고형 종양은 혈액, 골수 또는 림프계 이외의 신체 조직의 임의의 암을 포함한다. 고형 종양은 상피 세포 기원의 종양 및 비-상피 세포 기원의 종양으로 추가로 나뉠 수 있다. 상피 세포 고형 종양의 예는 위장관, 결장, 유방, 전립선, 폐, 신장, 간, 췌장, 난소, 두경부, 구강, 위, 십이지장, 소장, 대장, 항문, 담낭, 음순, 비인두, 피부, 자궁, 남성 생식 기관, 비뇨 기관, 방광, 및 피부의 종양을 포함한다. 비-상피 기원의 고형 종양은 육종, 뇌 종양 및 골 종양을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 흑색종 (예를 들어, B-raf 돌연변이체 흑색종)이다. 일부 실시양태에서, 암은 결장직장암이다. 일부 실시양태에서, 암은 유방암 (예를 들어, Her2 양성 유방암)이다. 일부 실시양태에서, 암은 유두상 갑상선 암종이다. 암의 다른 예는 정의에 제공된다.
일부 실시양태에서, 환자의 암은 B-raf 바이오마커를 발현하는 것으로 나타난다. 일부 실시양태에서, B-raf 바이오마커는 돌연변이체 B-raf이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf는 B-raf V600이다. 일부 실시양태에서, B-raf V600은 B-raf V600E이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf는 구성적으로 활성이다.
일부 실시양태에서, 환자의 암은 c-met 바이오마커를 발현하는 것으로 나타난다. c-met 활성 및 발현의 검출이 본원에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, B-raf 내성 암은 암 환자가 B-raf 길항제 요법을 받는 동안에 진행되거나 (즉, 환자는 "B-raf 불응성"임), 또는 환자가 B-raf 길항제-기반 치료 요법이 완료된 후에 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11,개월, 12개월, 또는 그 초과 이내에 진행된 것을 의미한다.
일부 실시양태에서, 베무라페닙 내성 암은 암 환자가 베무라페닙-기반 요법을 받는 동안 진행되거나 (즉, 환자는 "베무라페닙 불응성"임), 또는 환자가 B-raf 길항제-기반 치료 요법이 완료된 후에 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5,개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11,개월, 12개월, 또는 그 초과 이내에 진행된 것을 의미한다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 B-raf 억제제에 대한 내성은 B-raf 길항제를 사용하는 치료 후에, 또는 예를 들어 HGF에 대한 노출 후에 (예를 들어, HGF-매개 내성) 발생한다 (획득됨). 다른 실시양태에서, 환자 (예를 들어, B-raf 내성 암을 갖는 환자)는 B-raf 길항제를 사용하여 이전에 치료받은 적이 없다.
일부 실시양태에서, 환자는 현재 B-raf 길항제를 사용하여 치료받고 있다. 일부 실시양태에서, 환자는 이전에 B-raf 길항제를 사용하여 치료받았다. 일부 실시양태에서, 환자는 이전에 B-raf 길항제를 사용하여 치료받지 않았다.
한 측면에서, 암 환자는 추가의 암 의약을 사용하여 치료된다. 일부 실시양태에서, 추가의 암 의약은 화학요법제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 암 의약은 예보이(Yervoy)이다. 일부 실시양태에서, 추가의 암 의약은 암 면역요법제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 암 의약은 상이한 (추가의) B-raf 길항제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 암 의약은 상이한 (추가의) c-met 길항제이다.
한 측면에서, 세포를 B-raf 길항제 및 c-met 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포에서 B-raf 인산화를 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포는 B-raf 길항제에 대해 내성이다 (일부 실시양태에서, B-raf 길항제에 대한 내성이 발생함). 일부 실시양태에서, 세포는 c-met 바이오마커를 발현한다.
한 측면에서, 세포를 B-raf 길항제 및 c-met 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포에서 PI3K 매개 신호전달을 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포는 B-raf 길항제에 대해 내성이다 (일부 실시양태에서, B-raf 길항제에 대한 내성이 발생함). 일부 실시양태에서, 세포는 c-met 바이오마커를 발현한다.
한 측면에서, 세포를 B-raf 길항제 및 c-met 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포에서 PI3K 매개 신호전달을 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포는 B-raf 길항제에 대해 내성이다 (일부 실시양태에서, B-raf 길항제에 대한 내성이 발생함). 일부 실시양태에서, 세포는 c-met 바이오마커를 발현한다.
한 측면에서, 세포를 B-raf 길항제 및 c-met 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포에서 MAPk 매개 신호전달을 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포는 B-raf 길항제에 대해 내성이다 (일부 실시양태에서, B-raf 길항제에 대한 내성이 발생함). 일부 실시양태에서, 세포는 c-met 바이오마커를 발현한다.
한 측면에서, 세포를 B-raf 길항제 및 c-met 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포에서 AKT 매개 신호전달을 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포는 B-raf 길항제에 대해 내성이다 (일부 실시양태에서, B-raf 길항제에 대한 내성이 발생함). 일부 실시양태에서, 세포는 c-met 바이오마커를 발현한다.
한 측면에서, 세포를 B-raf 길항제 및 c-met 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포에서 ERK 매개 신호전달을 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포는 B-raf 길항제에 대해 내성이다 (일부 실시양태에서, B-raf 길항제에 대한 내성이 발생함). 일부 실시양태에서, 세포는 c-met 바이오마커를 발현한다.
한 측면에서, 세포를 B-raf 길항제 및 c-met 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포에서 B-raf-매개 신호전달을 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포는 B-raf 길항제에 대해 내성이다 (일부 실시양태에서, B-raf 길항제에 대한 내성이 발생함). 일부 실시양태에서, 세포는 c-met 바이오마커를 발현한다.
한 측면에서, 세포를 B-raf 길항제 및 c-met 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포의 성장 및/또는 증식을 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포는 B-raf 길항제에 대해 내성이다 (일부 실시양태에서, B-raf 길항제에 대한 내성이 발생함). 일부 실시양태에서, 세포는 c-met 바이오마커를 발현한다.
한 측면에서, 세포를 B-raf 길항제 및 c-met 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포의 아폽토시스를 증가시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포는 B-raf 길항제에 대해 내성이다 (일부 실시양태에서, B-raf 길항제에 대한 내성이 발생함). 일부 실시양태에서, 세포는 c-met 바이오마커를 발현한다.
본 발명에 사용된 치료제는 양호한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화, 투약 및 투여된다. 본 명세서에서 고려되는 요인은 치료될 특정한 장애, 치료될 특정한 대상체, 개별 환자의 임상 조건, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴, 조합되는 작용제의 약물-약물 상호작용, 및 진료의에게 공지된 다른 요인을 포함한다.
치료 제제는 원하는 순도를 갖는 활성 성분을 임의의 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 당업계에 공지된 표준 방법을 이용하여 제조한다 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (20th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA]). 허용되는 담체는 염수, 또는 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당 알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 PEG를 포함한다.
임의로, 그러나 바람직하게는, 제제는 제약상 허용되는 염, 바람직하게는 염화나트륨을 함유하고, 바람직하게는 이는 대략 생리학적 농도이다. 임의로, 본 발명의 제제는 제약상 허용되는 보존제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 보존제 농도는 0.1 내지 2.0% (전형적으로는 v/v)의 범위이다. 적합한 보존제는 제약 업계에 공지된 것을 포함한다. 벤질 알콜, 페놀, m-크레졸, 메틸파라벤 및 프로필파라벤이 바람직한 보존제이다. 임의로, 본 발명의 제제는 0.005 내지 0.02% 농도의 제약상 허용되는 계면활성제를 포함할 수 있다.
본원의 제제는 또한 치료할 특정한 적응증에 필요한, 바람직하게는 서로 유해 효과를 내지 않는 상보적 활성을 갖는, 하나 초과의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
활성 성분은 또한, 예를 들어 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기 문헌]에 개시되어 있다.
본 발명의 치료제는 공지된 방법에 따라, 예컨대 볼루스로서 정맥내 투여에 의해 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척수강내, 경구, 국소, 또는 흡입 경로에 의해 인간 환자에게 투여된다. 치료 용도를 위해 생체외 전략을 사용할 수도 있다. 생체외 전략은 대상체로부터 수득된 세포를 c-met 또는 B-raf 길항제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염시키거나 형질도입시키는 것을 수반한다. 이어서, 상기 형질감염되거나 형질도입된 세포를 대상체에게 다시 주입한다. 세포는 조혈 세포 (예를 들어, 골수 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, T 세포 또는 B 세포), 섬유모세포, 상피 세포, 내피 세포, 각질세포 또는 근육 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 광범위한 유형일 수 있다.
예를 들어, c-met 또는 B-raf 길항제가 항체인 경우에, 임의의 적합한 수단에 의해 항체가 투여되고, 이는 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비강내 투여, 및 국부 면역억제 치료를 원하는 경우에 병변내 투여를 포함한다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 항체는 특히 항체의 용량을 감소시킨 펄스 주입에 의해 적합하게 투여된다. 바람직하게는, 투여는 부분적으로는 투여가 단기인지 장기인지에 따라 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공된다.
또 다른 예에서, 종양의 장애 또는 위치가 허용하는 경우에 c-met 또는 B-raf 길항제 화합물이 국소적으로, 예를 들어 직접 주사에 의해 투여되고, 이러한 주사가 주기적으로 반복될 수 있다. 또한, 국부 재발 또는 전이를 방지하거나 감소시키기 위해, 외과적 절제에 의한 종양 제거 후, c-met 또는 B-raf 길항제가 대상체에게 전신적으로, 또는 종양 세포, 예를 들어 종양 또는 종양 층에 직접 전달될 수 있다.
치료제의 조합 투여는 전형적으로 한정된 기간에 걸쳐 수행된다 (통상적으로 선택된 조합에 따라 수분, 수시간, 수일 또는 수주일). 조합 요법은 순차적 방식으로 치료제를 투여하는 것, 즉 각각의 치료제를 상이한 시간에 투여하는 것 뿐만 아니라 치료제 또는 치료제 중 적어도 2종을 실질적으로 동시 방식으로 투여하는 것을 포함하는 것으로 의도된다.
치료제는 동일한 경로 또는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합물 내의 B-raf 및/또는 c-met 길항제는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있는 한편, 조합물 내의 단백질 키나제 억제제는 경구 투여될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 특정 치료제에 따라, 치료제 둘 다가 경구로 투여될 수 있거나, 또는 치료제 둘 다가 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. 치료제를 투여하는 순서도 또한 특정한 작용제에 따라 달라진다.
질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의해 투여하든지 또는 연속 주입에 의해 투여하든지, 각각의 치료제의 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg (예를 들어, 0.1-30 mg/kg)이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 용량이다. 상기 언급된 요인에 따라, 전형적인 1일 투여량은 약 1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우에, 상태에 따라 상기 기재된 방법에 의해 측정시에 암이 치료될 때까지 치료를 지속한다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 한 예에서, c-met 또는 B-raf 길항제가 항체인 경우에, 2주 내지 3주마다 약 5 mg/kg 내지 약 150 mg/kg 범위의 용량으로 본 발명의 항체가 투여된다. c-met 또는 B-raf 길항제가 경구 소분자 화합물인 경우에, 약물이 약 25 mg/kg 내지 약 50 mg/kg 범위의 용량으로 매일 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 경구 화합물을 전통적인 고-용량 간헐 요법으로, 또는 계획된 일시 정지 없이 더욱 낮은 용량을 더욱 빈번하게 ("메트로놈 요법"으로 지칭됨) 사용하여 투여할 수 있다. 예를 들어 간헐 요법이 사용될 때, 1일 용량 및 특정한 징후에 의존하여, 약물을 2 내지 3주 동안 매일 투여한 다음 1주 동안 휴지하거나; 또는 4주 동안 매일 투여한 다음 2주 동안 휴지한다. 본 발명의 요법의 진행은 통상의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
본원은 유전자 요법에 의한 c-met 및/또는 B-raf 길항제의 투여를 고려한다. 세포내 항체를 생성하기 위한 유전자 요법의 사용에 대해 예를 들어, 1996년 3월 14일에 공개된 WO96/07321을 참조한다.
IV. 진단 방법
일부 실시양태에서, 예를 들어 요법 전에 및/또는 그 동안 및/또는 후에, 본원에서의 환자가 진단 시험에 적용된다.
한 측면에서, 환자의 암이 c-met 바이오마커를 발현하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 c-met 바이오마커 발현은 환자가 B-raf 길항제 내성 암을 가질 가능성이 있음을 나타내는 것인, c-met 바이오마커 발현을 결정하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 환자의 암이 B-raf 바이오마커 (예컨대, 돌연변이체 B-raf)를 발현하는 것으로 나타난다. 일부 실시양태에서, c-met 바이오마커 발현은 단백질 발현이고, IHC를 이용하여 환자로부터의 샘플에서 결정된다. 일부 실시양태에서, 환자는 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 사용하여 치료된다.
한 측면에서, 환자의 암이 c-met 바이오마커를 발현하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 c-met 바이오마커 발현은 환자가 B-raf 내성 암이 발생할 가능성이 있음을 나타내는 것인, c-met 바이오마커 발현을 결정하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 환자의 암이 B-raf 바이오마커 (예컨대, 돌연변이체 B-raf)를 발현하는 것으로 나타난다. 일부 실시양태에서, c-met 바이오마커 발현은 단백질 발현이고, IHC를 이용하여 환자로부터의 샘플에서 결정된다. 일부 실시양태에서, 환자는 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 사용하여 치료된다
한 측면에서, 환자의 암이 c-met 바이오마커를 발현하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 c-met 바이오마커 발현은 환자가 환자의 암의 B-raf 길항제에 대한 감수성을 증가시키고/거나, 환자의 암의 B-raf 길항제에 대한 내성을 복구하고/거나, 환자의 암의 B-raf 길항제에 대한 감수성의 기간을 연장시키고/거나 환자의 암에서 HGF-매개 B-raf 약물 내성의 발생을 예방하기 위한, c-met 길항제 및 B-raf 길항제를 사용하는 치료에 대한 후보임을 나타내는 것인, c-met 바이오마커 발현을 결정하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 환자의 암이 B-raf 바이오마커 (예컨대, 돌연변이체 B-raf)를 발현하는 것으로 나타난다. 일부 실시양태에서, c-met 바이오마커 발현은 단백질 발현이고, IHC를 이용하여 환자로부터의 샘플에서 결정된다. 일부 실시양태에서, 환자는 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 사용하여 치료된다.
본 발명은 또한 환자로부터의 샘플에서 c-met 바이오마커의 발현을 결정하는 것 및 바이오마커의 발현 수준에 기초하여 암 의약을 선택하는 것을 포함하는, B-raf 바이오마커 (예를 들어, 돌연변이체 B-raf 바이오마커)를 발현하는 것으로 나타난 암을 갖는 환자를 위한 요법을 선택하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 암 샘플이 c-met 바이오마커를 발현하는 경우에 환자는 c-met 길항제 (예를 들어, 항-c-met 항체)를 B-raf 길항제와 조합하여 사용하는 치료를 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 환자는 치료 유효량의 c-met 길항제 및 B-raf 길항제를 사용하여 암에 대해 치료된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 환자의 암 샘플이 c-met 바이오마커를 발현하는 경우에 환자는 c-met 길항제 (예를 들어, 항-c-met 항체)를 사용하는 치료를 위해 선택되고, (선택 후에) 환자는 치료 유효량의 c-met 길항제 및 B-raf 길항제를 사용하여 암에 대해 치료된다. 또 다른 실시양태에서, 암 샘플이 실질적으로 검출불가능한 수준의 c-met 바이오마커를 발현하는 경우에 환자는 c-met 길항제 이외의 암 의약을 사용하는 치료를 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 환자는 치료 유효량의 c-met 길항제 이외의 암 의약을 사용하여 암에 대해 치료된다 (예를 들어, B-raf 길항제를 사용하여 치료됨). 따라서, 일부 실시양태에서, 암 샘플이 c-met 바이오마커를 실질적으로 검출불가능한 수준으로 발현하는 경우에 환자는 c-met 길항제 이외의 암 의약 (예를 들어, B-raf 길항제, 예를 들어 베무라페닙)을 사용하는 치료를 위해 선택되고, (선택 후에) 환자는 치료 유효량의 c-met 길항제를 사용하여 암에 대해 치료된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 환자의 암이 c-met 바이오마커를 발현하는지를 결정하는 것을 포함하는, 환자를 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 사용하는 치료에 대한 후보로 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 환자는 B-raf 길항제를 사용하여 치료받았다 (이전에 치료받음). 일부 실시양태에서, 환자의 암은 상기 B-raf 길항제에 대해 내성이다 (예를 들어, 내성을 획득함).
또 다른 측면에서, 본 발명은 환자의 암이 c-met 바이오마커를 발현하는지를 결정하는 것을 포함하는, 환자를 B-raf 길항제에 대한 내성이 발생할 위험이 있는 것으로 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 환자는 B-raf 길항제를 사용하여 치료받았다 (이전에 치료받음). 일부 실시양태에서, 환자는 B-raf 길항제를 사용하여 치료받고 있다.
한 측면에서, 본 발명은 흑색종 환자로부터의 샘플에서 c-met 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 c-met 바이오마커는 HGF이고, HGF의 발현은 대상체에서 암에 대한 예후인, 흑색종 환자에 대한 예후를 결정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 증가된 HGF 발현은 환자를 B-raf 억제제 (예를 들어, 베무라페닙)를 사용하여 치료한 경우에, 예를 들어 감소된 무진행 생존 및/또는 감소된 전체 생존의 예후이다. 일부 실시양태에서, HGF 발현은 환자 혈청에서, 예를 들어 ELISA를 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 환자 혈청에서 HGF 발현은 중간 HGF 발현 수준 (예컨대, 집단에서의 중간 HGF 발현 수준) 초과이다. 일부 실시양태에서, 환자 혈청에서의 HGF 발현은 예를 들어 약 330 ng/ml 초과이다. 일부 실시양태에서, 환자 혈청에서의 HGF 발현은 약 300 ng/ml, 310 ng/ml, 320 ng/ml, 330 ng/ml, 340 ng/ml, 350 ng/ml, 360 ng/ml, 370 ng/ml, 380 ng/ml, 390 ng/ml, 400 ng/ml, 420 ng/ml, 440 ng/ml, 460 ng/ml, 480 ng/ml, 500 ng/ml 초과이거나 또는 그보다 크다. 일부 실시양태에서, 환자는 유효량의 c-met 길항제 및 B-raf 길항제를 사용하는 치료를 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 환자는 유효량의 c-met 길항제 및 B-raf 길항제를 사용하여 치료된다. HGF 발현은 예를 들어 IHC (예를 들어, 또는 종양 또는 종양 기질)에 의해 검출된다.
c-met 발현, 활성화 및 증폭의 검출 방법은 당업계에 공지되어 있다. 한 측면에서, c-met 바이오마커 발현은 (a) 항-c-met 항체를 사용하여 샘플 (예컨대, 환자 암 샘플)의 IHC 분석을 수행하는 것; 및 b) 샘플에서 c-met 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, c-met IHC 염색 강도는 참조 값과 비교하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 높은 양의 c-met 바이오마커 (예를 들어, c-met IHC 또는 예를 들어 ELISA 또는 IHC를 이용하는 HGF의 검출을 이용하여 결정된 바와 같음)는 환자가 B-raf 길항제 내성 암을 가질 가능성이 있다는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 높은 c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 낮은, 중간 정도의 또는 높은 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, 높은 c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 중간 정도의 또는 높은 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, "낮은" c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 낮은 또는 전혀 없는 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, "낮은" c-met 발현은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 전혀 없는 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, c-met 바이오마커 발현은 본원에서, 예를 들어 표 A에 개시된 c-met 염색 강도 스코어링 계획을 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 방법은 IHC 스코어에 기초하여 환자를 계층화하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, IHC 스코어는 1이다. 일부 실시양태에서, IHC 스코어는 0이고, c-met 발현은 환자의 암에서 관찰된다.
일부 실시양태에서, c-met 발현은 폴리뉴클레오티드 발현이다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 RNA이다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 일부 실시양태에서, 환자의 암은 2 초과, 3 초과, 4 초과, 5 초과, 6 초과, 7 초과, 8 초과, 또는 이 보다 높은 c-met 카피수를 발현하는 것으로 나타난다 (예를 들어, FISH 분석에 의함). 일부 실시양태에서, c-met 카피수는 8 미만, 7 미만, 6 미만, 5 미만, 4 미만, 3 미만이다.
HGF는 본 발명의 방법에 따라 검출될 수 있을 것으로 생각된다. 따라서, 일부 실시양태에서, c-met 바이오마커는 HGF이고, 추가 실시양태에서, HGF 발현은 자가분비 발현이다. 일부 실시양태에서, HGF 발현은 환자의 암에서 검출된다. 일부 실시양태에서, HGF 발현은 환자의 종양 기질에서 검출된다. 일부 실시양태에서, HGF 발현은 환자 혈청에서, 예를 들어 ELISA를 이용하여 검출된다.
한 측면에서, c-met 바이오마커 발현은 샘플 (예컨대, 환자의 암 샘플)에서 c-met 바이오마커의 발현을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 환자의 샘플은 항-c-met 항체를 사용하는 IHC 분석에 적용되는 것인 방법을 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, c-met IHC 염색 강도는 참조 값과 비교하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 높은 양의 c-met 바이오마커 (예를 들어, c-met IHC 또는 예를 들어 ELISA 또는 IHC를 이용하는 HGF의 검출을 이용하여 결정된 바와 같음)는 환자가 B-raf 길항제 내성 암을 가질 가능성이 있다는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 높은 c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 낮은, 중간 정도의 또는 높은 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, 높은 c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 중간 정도의 또는 높은 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, "낮은" c-met는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 낮은 또는 전혀 없는 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, "낮은" c-met 발현은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 대조군 세포 펠릿 A549, H441, H1155 및 HEK-293의 c-met 염색 강도와 비교하여 결정된 전혀 없는 c-met 발현이다. 일부 실시양태에서, c-met 바이오마커 발현은 본원에, 예를 들어 표 A에 개시된 c-met 염색 강도 스코어링 계획을 이용하여 결정된다.
일부 실시양태에서, IHC 분석은 이전 또는 이후의 형태론적 염색을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 헤마톡실린은 슬라이드의 세포 핵산을 염색하기 위해 사용된다. 헤마톡실린은 광범위하게 사용가능하다. 적합한 헤마톡실린의 예는 헤마톡실린 II (벤타나(Ventana))이다. 보다 밝은 청색 핵이 바람직한 경우에, 청색화 시약이 헤마톡실린 염색 후에 사용될 수 있다. IHC를 이용하는 c-met 바이오마커의 검출은 본원에 개시되어 있고, c-met 염색 강도 스코어링 계획은 본원에, 예를 들어 표 A에 개시되어 있다. 본원에 언급된 바와 같이, 다른 바이오마커가 검출될 수 있다. 예시적인 다른 바이오마커가 본원에 개시되어 있다. 본원에 개시된 임의의 본 발명의 일부 실시양태에서, 높은 c-met 바이오마커 발현은 본원의 표 A에 따라 정의된 바와 같이 met 진단 양성 임상 상태이다. 본원에 개시된 임의의 본 발명의 일부 실시양태에서, 낮은 c-met 바이오마커 발현은 본원의 표 A에 따라 정의된 바와 같이 met 진단 음성 임상 상태이다.
한 측면에서, c-met 바이오마커 발현은 (a) 웨스턴 블롯팅, ELISA, 포스포-ELISA, 포스포-met 항체를 사용하는 IHC, 항-HGF 항체를 사용하는 IHC 중 하나 이상을 수행하는 것; 및 (b) 샘플에서 c-met 바이오마커 (예를 들어, HGF 포함)의 발현을 결정하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 결정된다.
한 측면에서, c-met 활성화는 (a) 포스포-c-met 항체를 사용하는 IHC 또는 포스포-ELISA 중 하나 이상을 수행하는 것; 및 (b) 샘플에서 포스포-c-met 바이오마커 (예를 들어, 포스포-c-met)의 존재를 결정하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 결정된다.
한 측면에서, c-met 바이오마커 발현은 c-met 하류 신호전달 경로 분자의 발현 또는 활성, 예를 들어, AKT (예를 들어, 포스포-AKT)의 발현 또는 활성, ERK (예를 들어, 포스포-ERK)의 발현 또는 활성을 결정하는 단계를 포함하는 방법을 이용하여 결정된다.
한 측면에서, c-met 바이오마커 발현은 (a) 샘플 (예컨대, 환자 암 샘플) 상에서 유전자 발현 프로파일링, PCR (예컨대, rtPCR 또는 대립유전자-특이적 PCR), 5' 뉴클레아제 검정 (예를 들어, 택-맨), RNA-seq, 마이크로어레이 분석, SAGE, 매스어레이 기술, 계내 혼성화 (예를 들어, c-met 및/또는 HGF mRNA의 경우), IHC (예를 들어, c-met 및/또는 HGF 폴리펩티드의 경우) 또는 FISH를 수행하는 것; 및 b) 샘플에서 c-met 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 결정된다.
본원에 언급된 바와 같이, 다른 바이오마커가 검출될 수 있다. 예시적인 다른 바이오마커가 본원에 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, ALK 바이오마커가 검출된다. 일부 실시양태에서, FGF, FGFR, PDGF 및/또는 PGFR 바이오마커 중 하나 이상이 검출된다.
B-raf 및 돌연변이체 B-raf의 검출 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, 문헌 [Hailat et al., Diagn Mol Pathol. 2012 Mar;21(1):1-8]을 참조한다. 일부 실시양태에서, V600E 돌연변이 (또한 V599E (1796T>A)로 공지됨)는 엑손 15의 코돈 600 내의 뉴클레오티드 위치 1799에서의 단일-염기 돌연변이 (T>A)의 존재를 결정하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 검출된다. 이 돌연변이는 또한 뉴클레오티드 위치 1799-1800에서 2-염기 돌연변이 TG>AA로부터 발생한다. 2-염기 돌연변이는 또한 위치 1799를 평가함으로써 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 또한 위치 1800에서 치환의 존재에 대해 평가될 수 있다. 다른 돌연변이는 또한 코돈 600에서 일어날 수 있다. 이는 V600K, V600D 및 V600R을 포함한다. 일부 실시양태에서, V600E 돌연변이를 검출하는 프로브는 또한 다른 코돈 600 돌연변이, 예를 들어 V600D, V600K 및/또는 V600R을 검출할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로브는 또한 코돈 601에서 돌연변이를 검출할 수 있다.
V600E 돌연변이의 존재는 핵산, 예를 들어 게놈 DNA 또는 mRNA를 위치 1799에서의 염기 치환의 존재에 대해 평가함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 분석 방법은 다음 중 하나 이상이다: 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드를 이용하는 혼성화, 프라이머 연장, 대립유전자-특이적 라이게이션, 서열분석, 또는 전기영동 분리 기술 기술, 예를 들어 단일-가닥 형태적 다형성 (SSCP) 및 헤테로듀플렉스 분석. 예시적인 검정은 5' 뉴클레아제 검정, 대립유전자-특이적 PCR, 주형-지시된 염료-종결자 혼입, 분자 비콘 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 검정, 단일-염기 연장 검정, 및 실시간 피로포스페이트 서열분석을 이용하는 돌연변이 분석을 포함한다. 증폭된 서열의 분석은 다양한 기술, 예컨대 마이크로칩, 형광 편광 검정, 및 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 (MALDI) 질량 분광측정법을 이용하여 수행될 수 있다. 사용될 수 있는 추가의 방법은 Flap 뉴클레아제를 사용한 침습적 절단 및 패드록 프로브를 이용하는 방법론에 기초한 검정이다.
일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf는 B-raf V600E (V600E 돌연변이 (GTG>GAG)를 포함하는 B-raf 폴리펩티드)이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf는 B-raf V600K (GTG>AAG), V600R (GTG>AGG), V600E (GTG>GAA) 및/또는 V600D (GTG>GAT) 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf는 잔기 V600에서의 돌연변이체이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf 폴리뉴클레오티드는 T1799A 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf 폴리뉴클레오티드는 엑손 11 및/또는 엑손 15에서 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf 발현은 (a) 샘플 (예컨대, 환자 암 샘플) 상에서 유전자 발현 프로파일링, PCR (예컨대, rtPCR 또는 대립유전자-특이적 PCR), 5' 뉴클레아제 검정, IHC, 혼성화 검정, RNA-seq, 마이크로어레이 분석, SAGE, 매스어레이 기술 또는 FISH 중 하나 이상을 수행하는 것; 및 (b) 샘플에서 돌연변이체 B-raf 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 검출된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf 바이오마커 발현은 (a) 환자 암 샘플 (예컨대, FFPE 고정 환자 암 샘플)로부터 추출된 핵산 상에서 PCR을 수행하는 것; 및 (b) 샘플에서 돌연변이체 B-raf 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 검출된다.
환자로부터의 샘플은 본원에서 하나 이상의 바이오마커의 발현에 대해 시험된다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결 및/또는 보존된 기관 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고체 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성성분; 체액, 예를 들어 예컨대 뇌척수액, 양수, 복막액 또는 간질액; 대상체의 임신 또는 발생 중의 임의의 시점으로부터의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 자연에서 조직과 자연적으로 서로 혼합되지 않는 화합물, 예컨대 보존제, 항응고제, 완충제, 고정제, 영양소, 항생제 등을 함유할 수 있다. 본원에서 종양 샘플의 예는 종양으로부터 유래되거나 종양-유사 특성을 나타내는 종양 생검, 순환 종양 세포, 혈청 또는 혈장, 순환 혈장 단백질, 복수액, 일차 세포 배양물 또는 세포주 뿐만 아니라 보존된 종양 샘플, 예컨대 포르말린-고정, 파라핀-포매된 종양 샘플 또는 동결된 종양 샘플을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 환자 샘플은 포르말린-고정 파라핀-포매된 (FFPE) 종양 샘플 (예를 들어, 흑색종 종양 샘플 또는 결장직장암 종양 샘플 또는 종양 기질의 샘플)이다. 샘플은 암 의약 (예컨대, 항-c-met 길항제)을 사용한 환자의 치료 전에 수득될 수 있다. 샘플은 원발성 종양 또는 전이성 종양으로부터 수득될 수 있다. 샘플은 암이 처음 진단될 때 또는 예를 들어 종양이 전이된 후에 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양 샘플은 폐, 피부, 림프절, 골, 간, 결장, 갑상선 및/또는 난소를 갖는다.
mRNA, 단백질의 발현, 또는 유전자 증폭을 결정하기 위한 다양한 방법은 유전자 발현 프로파일링, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 예를 들어 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR), 대립유전자-특이적 PCR, RNA-Seq, FISH, 마이크로어레이 분석, 유전자 발현의 연속 분석 (SAGE), 매스어레이, 단백질체학, 면역조직화학 (IHC) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 단백질 발현이 정량화된다. 이러한 단백질 분석은, 예를 들어 환자 종양 샘플 상에서 IHC를 이용하여 수행될 수 있다.
바이오마커 발현을 결정하기 위한 다양한 예시적인 방법을 이제 보다 상세히 기재할 것이다.
1. 유전자 발현 프로파일링
일반적으로, 유전자 발현 프로파일링의 방법은 2개의 큰 군, 즉 폴리뉴클레오티드의 혼성화 분석에 기초하는 방법 및 폴리뉴클레오티드의 서열분석에 기초하는 방법으로 분류될 수 있다. 샘플 내의 mRNA 발현의 정량화를 위해 가장 일반적으로 사용되는 당업계에 공지된 방법은 노던 블롯팅 및 계내 혼성화 (문헌 [Parker &Barnes, Methods in Molecular Biology 106:247-283 (1999)]); RNAse 보호 검정 (문헌 [Hod, Biotechniques 13:852- 854 (1992)]); 및 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) (문헌 [Weis et al., Trends in Genetics 8:263-264 (1992)])을 포함한다. 대안적으로, DNA 듀플렉스, RNA 듀플렉스, 및 DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스 또는 DNA-단백질 듀플렉스를 포함한 구체적 듀플렉스를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 서열분석-기반 유전자 발현 분석을 위한 대표적인 방법은 유전자 발현의 연속 분석 (SAGE), 및 대용량 병렬 시그너쳐 서열분석 (MPSS)에 의한 유전자 발현 분석을 포함한다.
2. 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 및 5' 뉴클레아제 검정
민감하고 유연한 정량적 방법은 예를 들어 유전자 발현의 패턴을 특성화하고, 밀접하게 관련된 mRNA 사이를 구별하고, RNA 구조를 분석하기 위해 약물 처리의 존재 또는 부재 하에 정상 및 종양 조직에서 상이한 샘플 집단에서 mRNA 수준을 비교하는데 사용될 수 있는 PCR이다. 그러나, 다른 핵산 증폭 프로토콜 (즉, PCR 이외의 것)이 또한 본원에 기재된 핵산 분석 방법에 사용될 수 있음에 주목한다. 예를 들어, 적합한 증폭 방법은 리가제 쇄 반응 (예를 들어, 문헌 [Wu & Wallace, Genomics 4:560-569, 1988] 참조); 표준 대체 검정 (예를 들어, 문헌 [Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396, 1992]; 미국 특허 번호 5,455,166 참조); 및 여러 전사-기반 증폭 시스템 (미국 특허 번호 5,437,990; 5,409,818; 및 5,399,491에 기재된 방법 포함); 전사 증폭 시스템 (TAS) (문헌 [Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177, 1989]); 및 자기-지연 서열 복제 (3SR) (문헌 [Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878, 1990]; WO 92/08800)를 포함한다. 대안적으로, 프로브를 검출가능한 수준으로 증폭시키는 방법, 예컨대 Qβ-레플리카제 증폭이 이용될 수 있다 (문헌 [Kramer & Lizardi, Nature 339:401-402, 1989; Lomeli et al., Clin. Chem. 35:1826-1831, 1989]). 공지된 증폭 방법의 검토는 예를 들어 문헌 [Abramson and Myers in Current Opinion in Biotechnology 4:41-47, 1993]에 제공된다.
mRNA는 출발 조직 샘플로부터 단리될 수 있다. 출발 물질은 전형적으로 각각 인간 종양 또는 종양 세포주, 및 상응하는 정상 조직 또는 세포주로부터 단리된 전체 RNA이다. 따라서, RNA는 건강한 공여자로부터 모은 DNA를 갖는, 유방, 폐, 결장, 전립선, 뇌, 간, 신장, 췌장, 비장, 흉선, 고환, 난소, 자궁 등의 종양을 비롯한 다양한 원발성 종양 또는 종양 세포주으로부터 단리될 수 있다. mRNA의 공급원이 원발성 종양인 경우에, mRNA는 예를 들어, 동결 또는 보존된 파라핀-포매되고 고정된 (예를 들어, 포르말린-고정된) 조직 샘플로부터 추출될 수 있다. mRNA 추출을 위한 일반적 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)]을 비롯한 분자 생물학의 표준 교과서에 개시되어 있다. 파라핀 포매된 조직으로부터의 RNA 추출을 위한 방법은 예를 들어 문헌 [Rupp and Locker, Lab Invest. 56:A67 (1987), 및 De Andres et al., BioTechniques 18:42044 (1995)]에 개시되어 있다. 특히, RNA 단리는 상업적인 제조업체, 예컨대 퀴아젠(Qiagen)으로부터의 정제 키트, 완충제 세트 및 프로테아제를 제조업체의 지시에 따라 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 배양액 중 세포로부터의 전체 RNA는 퀴아젠 RNeasy 미니-칼럼을 이용하여 단리될 수 있다. 다른 상업적으로 입수가능한 RNA 단리 키트는 마스터퓨어(MASTERPURE)® 완전 DNA 및 RNA 정제 키트 (에피센터(EPICENTRE)®, 위스콘신주 매디슨)) 및 파라핀 블록 RNA 단리 키트 (암비온, 인크.(Ambion, Inc.))를 포함한다. 조직 샘플로부터의 전체 RNA는 RNA Stat-60 (텔-검정(Tel-Test))을 이용하여 단리될 수 있다. 종양으로부터 제조된 RNA는 예를 들어, 세슘 클로라이드 밀도 구배 원심분리에 의해 단리될 수 있다.
RNA가 PCR을 위한 주형으로서 기능할 수 없기 때문에, 일부 실시양태에서, PCR에 의한 유전자 발현 프로파일링의 제1 단계는 RNA 주형의 cDNA로의 역전사, 이어서 PCR 반응에서 그의 기하급수적 증폭이다. 다른 실시양태에서, 조합된 역-전사-폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR) 반응은 예를 들어 미국 특허 번호 5,310,652; 5,322,770; 5,561,058; 5,641,864; 및 5,693,517에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 가장 통상적으로 사용되는 2종의 역전사효소는 조류 골수아세포증 바이러스 역전사효소 (AMV-RT) 및 몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스 역전사효소 (MMLV-RT)이다. 역전사 단계는 전형적으로 주위환경 및 발현 프로파일링의 목적에 따라 특이적 프라이머, 랜덤 육량체 또는 올리고-dT 프라이머를 사용하여 프라이밍된다. 예를 들어, 추출된 RNA는 진앰프(GENEAMP)™ RNA PCR 키트 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 미국 캘리포니아주)를 제조업체의 지시에 따라 사용하여 역전사될 수 있다. 이어서, 유도된 cDNA를 후속적인 PCR 반응에서 주형으로서 사용할 수 있다.
미국 특허 번호 5,210,015; 5,487,972; 및 5,804,375; 및 문헌 [Holland et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280]에 기재된 바와 같은 택맨®" 또는 "5'-뉴클레아제 검정"이 이용될 수 있다. 따라서, 택맨® PCR은 전형적으로 그의 표적 앰플리콘에 결합된 혼성화 프로브를 가수분해하기 위해 Taq 또는 Tth 폴리머라제의 5'-뉴클레아제 활성을 이용하지만, 동등한 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 임의의 효소가 사용될 수 있다. PCR 반응에서 전형적인 앰플리콘을 생성하기 위해 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한다. 제3 올리고뉴클레오티드 또는 프로브는 2개의 PCR 프라이머 사이에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위해 설계된다. 프로브는 Taq DNA 폴리머라제 효소에 의해 연장불가능하고, 리포터 형광 염료 및 켄처 형광 염료로 표지된다. 2종의 염료가 프로브 상에 있을 때 함께 근접하여 위치하는 경우에, 리포터 염료로부터 임의의 레이저-유도된 방출은 켄칭 염료에 의해 켄칭시켰다. 증폭 반응 동안, Taq DNA 폴리머라제 효소는 프로브를 주형-의존성 방식으로 절단한다. 생성된 프로브 단편은 용액 내에서 분리되고, 방출된 리포터 염료로부터의 신호는 제2 형광단 켄칭의 영향이 없다. 리포터 염료 중 1개의 분자가 합성된 각각의 새로운 분자에 대해 유리되고, 켄칭되지 않은 리포터 염료의 검출은 데이터의 정량적 해석을 위한 기반을 제공한다. 검정에 사용된 혼성화 프로브는 예를 들어 V600E 돌연변이 부위에서 BRAF의 돌연변이체와 야생형 대립유전자 사이를 구별하는 대립유전자-특이적 프로브일 수 있다. 대안적으로, 방법은 증폭된 생성물에 결합하는 대립유전자-특이적 프라이머 및 표지된 프로브를 이용하여 수행될 수 있다.
분해 산물을 검출하는데 적합한 임의의 방법이 5' 뉴클레아제 검정에 이용될 수 있다. 종종, 검출 프로브는 하나가 다른 염료의 형광을 켄칭할 수 있는 2종의 형광 염료로 표지된다. 프로브는 염료에 부착되어 (바람직하게는 하나는 5' 말단에 부착되고 다른 것은 내부 부위에 부착됨) 프로브가 혼성화되지 않은 상태인 경우에 켄칭이 일어나도록 하고 DNA 폴리머라제의 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단이 2종의 염료 사이에서 일어나도록 한다. 증폭은 켄칭과 동반 제거되는 염료 사이의 프로브의 절단 및 초기에 켄칭된 염료로부터 관찰가능한 형광의 증가를 발생시킨다. 분해 산물의 축적은 반응 형광의 증가를 측정함으로써 모니터링된다. 미국 특허 번호 5,491,063 및 5,571,673 (둘 다 본원에 참조로 포함됨)은 증폭에 함께 일어나는 프로브의 분해를 검출하기 위한 대안적 방법을 기재한다. 5'-뉴클레아제 검정 데이터는 초기에 Ct, 또는 역치 사이클로서 표현될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 형광 값은 모든 사이클 동안 기록되고, 증폭 반응에서 그 지점까지 증폭된 생성물의 양을 나타낸다. 형광 신호가 처음 통계상 유의한 것으로 기록되는 시점이 역치 사이클 (Ct)이다.
오류 및 샘플-대-샘플 편차의 영향을 최소화하기 위해, PCR은 일반적으로 내부 표준을 사용하여 수행된다. 이상적인 내부 표준은 상이한 조직들 사이에서 일정한 수준으로 발현되고, 실험 처리에 의해 영향을 받지 않는다. 유전자 발현 패턴을 정규화하기 위해 가장 빈번하게 사용되는 RNA는 하우스키핑 유전자 글리세르알데히드-3-포스페이트-데히드로게나제 (GAPDH) 및 P-액틴에 대한 mRNA이다.
일부 실시양태에서, V600E를 검출하는 프로브, 예를 들어 TTS155-BRAF_MU는 또한 V600D (1799_1800TG>AT) 및 V600K (1798_1799GT>AA)를 검출한다. 일부 실시양태에서, V600E 돌연변이를 검출하는 프로브는 또한 K601E (1801A>G) 및 V600R (1798_1799GT>AG)을 검출한다.
일부 실시양태에서, 프로브 서열에 실질적으로 동일한 서열이 사용될 수 있다. 프로브 서열에 실질적으로 동일한 서열은 프로브와 동일한 상보적 서열에 혼성화하는 것을 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 프로브 서열은 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드, 때때로 적어도 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 TTS155-BRAF_MU 또는 TTS148-BRAF_WT의 적어도 27, 28, 29 또는 30개의 인접 뉴클레오티드를 갖는다. 다른 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 프라이머는 TTS155-BRAF_MU 또는 TTS148-BRAF_WT에 대해 적어도 80%의 동일성, 일부 실시양태에서 적어도 85%의 동일성, 다른 실시양태에서 적어도 90% 또는 그 초과의 동일성을 갖는다.
mRNA 단리, 정제, 프라이머 연장 및 증폭을 포함하는, RNA 공급원으로서 고정된 파라핀-포매 조직을 사용하여 유전자 발현을 프로파일링하기 위한 대표적인 프로토콜의 단계가 공개된 다양한 학술지 논문에 제시되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Hailat et al., Diagn Mol Pathol. 2012 Mar;21(1):1-8; Godfrey et al., J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)]). 간략하게, 일부 실시양태에서, 대표적인 방법은 파라핀-포매된 종양 조직 샘플을 약 10 마이크로그램 두께의 절편으로 절단하는 것으로 출발한다. 이어서, RNA를 추출하고, 단백질 및 DNA를 제거한다. RNA의 농도 분석 후에, 필요한 경우에 RNA 복구 및/또는 증폭 단계가 포함될 수 있고, RNA는 유전자 특이적 프로모터를 사용하여 역전사되고, 이어서 PCR을 수행한다.
PCR 프라이머 및 프로브는 증폭될 유전자에 존재하는 인트론 서열에 기초하여 설계된다. 이러한 실시양태에서, 프라이머/프로브 설계의 제1 단계는 유전자 내의 인트론 서열의 서술이다. 이것은 공개적으로 이용가능한 소프트웨어, 예컨대 문헌 [Kent, W., Genome Res. 12(4):656-64 (2002)]에서 개발된 DNA BLAT 소프트웨어, 또는 그의 변형을 포함하는 BLAST 소프트웨어에 의해 수행될 수 있다. 후속 단계는 PCR 프라이머 및 프로브 설계의 널리 확립된 방법에 따른다.
비-특이적 신호를 피하기 위해, 프라이머 및 프로브를 설계할 때 인트론 내에 반복 서열을 차폐하는 것이 중요할 수 있다. 이것은, DNA 서열을 반복 요소의 라이브러리에 대해 스크리닝하고 반복 요소가 차폐된 질의 서열로 되돌아가는, 베일러 의과대학(Baylor College of Medicine)을 통해 온-라인으로 이용가능한 리피트 마스커(Repeat Masker) 프로그램을 사용하여 용이하게 달성될 수 있다. 이어서, 차폐된 인트론 서열을 사용하여, 임의의 상업적으로 또는 다르게는 공개적으로 입수가능한 프라이머/프로브 설계 패키지, 예컨대 프라이머 익스프레스(Primer Express) (어플라이드 바이오시스템즈); MGB 어세이-바이-디자인 (어플라이드 바이오시스템즈); 프라이머3 (문헌 [Rozen and Skaletsky (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers., Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, N.J., pp 365-386])을 이용하여 프라이머 및 프로브 서열을 설계할 수 있다.
PCR 프라이머 설계에 고려되는 요인은 프라이머 길이, 용융 온도 (Tm), 및 G/C 함량, 특이성, 상보적 프라이머 서열, 및 3'-말단 서열을 포함한다. 일반적으로, 최적 PCR 프라이머는 길이가 일반적으로 17-30개 염기이고, 약 20-80%, 예컨대 예를 들어 약 50-60%의 G+C 염기를 함유한다. 50 내지 80℃, 예를 들어 약 50 내지 70℃의 Tm이 전형적으로 바람직하다.
PCR 프라이머 및 프로브 설계에 대한 추가의 지침에 대해, 예를 들어 그 전체 개시내용이 본원에 참조로 포함된 문헌 [Dieffenbach et al., "General Concepts for PCR Primer Design", PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp. 133-155; Innis and Gelfand, "Optimization of PCRs", PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, London, 1994, pp. 5-11; 및 Plasterer, T. N. Primerselect: Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70:520- 527 (1997)]을 참조한다.
또 다른 측면에서, 표적 핵산의 대립유전자-특이적 증폭이 핵산 돌연변이의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용될 수 있다. 증폭은 대립유전자-특이적 프라이머의 사용을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 아마도 표적 서열의 적어도 하나의 변이체를 함유하는 샘플을 제공하는 것; 표적 서열의 하나 이상의 변이체에 적어도 부분적으로 상보적인 제1 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것; 표적 서열의 하나 이상의 변이체에 적어도 부분적으로 상보적이나, 표적 서열의 오직 1개의 변이체에 상보적인 적어도 하나의 내부 선택적 뉴클레오티드를 갖는 제2 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것; 상기 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드의 표적 서열의 적어도 하나의 변이체에 대한 혼성화에 적합한 조건을 제공하는 것; 핵산 폴리머라제에 의한 올리고뉴클레오티드 연장에 적합한 조건을 제공하는 것 (여기서, 상기 폴리머라제는 상기 제2 올리고뉴클레오티드를 이것이 상기 상보적 내부 선택적 뉴클레오티드를 갖는 표적 서열의 변이체에 혼성화되는 경우에 연장시킬 수 있으며, 상기 제2 올리고뉴클레오티드가 이것이 비-상보적 내부 선택적 뉴클레오티드를 갖는 변이체에 혼성화되는 경우에는 실질적으로 적게 연장시킬 수 있음); 및 혼성화 및 연장 단계의 순서를 수회 반복하는 것을 포함하는, 여러 변이체 서열의 형태로 존재하는 표적 서열의 변이체의 대립유전자-특이적 증폭 방법이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 증폭은 폴리머라제 연쇄 반응, 즉 주형 변성의 반복된 사이클, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 주형에 대한 어닐링 (혼성화), 및 핵산 폴리머라제에 의한 프라이머의 연장을 포함한다. 일부 실시양태에서, 어닐링 및 연장은 동일한 온도 단계에서 일어난다.
일부 실시양태에서, 증폭 반응은 고온 출발 프로토콜을 포함한다. 대립유전자-특이적 증폭과 관련하여, 미스매치된 표적에 대한 대립유전자-특이적 프라이머의 특이성은 고온 출발 프로토콜의 이용에 의해 증진될 수 있다. 다수의 고온 출발 프로토콜, 예를 들어 반응 혼합물의 나머지로부터 결정적인 시약을 분리하는 왁스의 사용 (미국 특허 번호 5,411,876), 항체에 의해 가역적으로 비활성화된 핵산 폴리머라제 (미국 특허 번호 5,338,671), 그의 활성 부위에 특이적으로 결합하도록 설계된 올리고뉴클레오티드에 의해 가역적으로 비활성화된 핵산 폴리머라제 (미국 특허 번호 5,840,867)의 사용 또는 예를 들어 미국 특허 번호 5,677,152 및 5,773,528에 기재된 바와 같은 가역 화학적 변형을 갖는 핵산 폴리머라제의 사용이 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 대립유전자-특이적 증폭 검정은 실시간 PCR 검정이다. 실시간 PCR 검정에서, 증폭의 척도는 "역치 사이클" 또는 Ct 값이다. 대립유전자-특이적 실시간 PCR 검정과 관련하여, 매치된 및 미스매치된 주형 사이의 Ct 값의 차이는 대립유전자 사이의 구별 및 검정의 선택성의 척도이다. 보다 큰 차이는 미스매치된 주형의 증폭에서의 보다 큰 지연, 및 이에 따른 대립유전자 사이의 보다 큰 구별을 나타낸다. 종종, 미스매치된 주형은 매치된 주형보다 훨씬 더 많은 양으로 존재한다. 예를 들어, 조직 샘플에서, 오직 작은 분획의 세포가 악성일 수 있고, 대립유전자-특이적 증폭 검정에 의해 표적화된 돌연변이 ("매치된 주형")를 보유한다. 정상 세포에 존재하는 미스매치된 주형은 보다 덜 효율적으로 증폭될 수 있으나, 압도적인 수의 정상 세포가 증폭에서의 임의의 지연을 극복하고 돌연변이체 주형의 임의의 이점을 제거할 것이다. 야생형 주형의 존재 하에 희귀 돌연변이를 검출하기 위해, 대립유전자-특이적 증폭 검정의 특이성이 결정적이다. COBAS® 4800 BRAF V600 돌연변이 검정이 상업적으로 이용가능하고, 실시간 PCR 기술을 이용한다. 반응에서 각각의 표적-특이적, 올리고뉴클레오티드 프로브는 리포터로서 작용하는 형광 염료, 및 무손상 프로브 내의 리포터 염료로부터의 형광 방출을 흡수 (켄칭)하는 켄처 분자로 표지된다. 각각의 증폭 사이클 동안, 앰플리콘에서 단일-가닥 DNA 서열에 상보적인 프로브가 결합하여 이후에 Z05 DNA 폴리머라제의 5' → 3' 뉴클레아제 활성에 의해 절단된다. 리포터 염료가 이러한 뉴클레아제 활성에 의해 켄처로부터 분리되면, 특징적인 파장의 형광이 리포터 염료가 광의 적절한 스펙트럼에 의해 여기되는 경우에 측정될 수 있다. 2종의 상이한 리포터 염료를 사용하여 표적-특이적 BRAF 야생형 (WT) 프로브 및 BRAF V600E 돌연변이 (MUT) 프로브를 표지할 수 있다. 2개의 BRAF 서열의 증폭은 전용 광학 채널 내의 2개의 특징적인 파장에서 형광을 측정함으로써 단일 반응 웰에서 독립적으로 검출될 수 있다.
한 실시양태에서, B-raf 및 V600E B-raf 사이를 구별하는 프라이머가 미국 특허 공개 번호 2011/0311968에 따라 활용된다.
일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA)는 (a) 환자 암 샘플 (예컨대, FFPE 고정 환자 암 샘플)로부터 추출된 핵산 (예를 들어, 게놈 DNA) 상에서 PCR을 수행하는 것; 및 (b) 샘플에서 돌연변이체 B-raf 폴리뉴클레오티드의 발현을 결정하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 검출된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf 폴리뉴클레오티드 발현은 (a) 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 B-raf 표적 서열의 적어도 하나의 변이체에 혼성화시키는 것 (여기서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드는 표적 서열의 하나 이상의 변이체에 적어도 부분적으로 상보적이고, 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 표적 서열의 하나 이상의 변이체에 적어도 부분적으로 상보적이며 표적 서열의 오직 1개의 변이체에 상보적인 적어도 하나의 내부 선택적 뉴클레오티드를 가짐); (b) 제2 올리고뉴클레오티드를 핵산 폴리머라제로 연장시키는 것 (여기서, 상기 폴리머라제는 우선적으로 상기 선택적 뉴클레오티드가 표적과 염기 쌍을 형성하는 경우에 상기 제2 올리고뉴클레오티드를 연장시킬 수 있고, 상기 선택적 뉴클레오티드가 표적과 염기 쌍을 형성하지 않는 경우에는 실질적으로 적게 연장시킬 수 있음); 및 (c) 상기 올리고뉴클레오티드 연장의 생성물을 검출하는 것 (여기서, 연장은 올리고뉴클레오티드가 상보적인 선택적 뉴클레오티드를 갖는 표적 서열의 변이체의 존재를 나타냄)을 포함하는 방법을 이용하여 검출된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA)는 (a) 환자 암 샘플 (예컨대, FFPE 고정 환자 암 샘플)로부터 추출된 핵산 (예를 들어, 게놈 DNA) 상에서 PCR을 수행하는 것; 및 (b) 샘플에서 돌연변이체 B-raf 폴리뉴클레오티드의 발현을 결정하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 검출된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA)는 (a) 환자 암 샘플 (예컨대, FFPE 고정 환자 암 샘플)로부터 DNA (예를 들어, 게놈 DNA)를 단리하는 것; (b) 환자 암 샘플로부터 추출된 DNA 상에서 PCR을 수행하는 것; 및 (c) 샘플에서 돌연변이체 B-raf 폴리뉴클레오티드의 발현을 검출하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 검출된다.
일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf 폴리뉴클레오티드 발현은 (a) 환자 암 샘플 (예컨대, FFPE 고정 환자 암 샘플)로부터 DNA (예를 들어, 게놈 DNA)를 단리하는 것; (b) 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 DNA 내의 B-raf 표적 서열의 적어도 하나의 변이체에 혼성화시키는 것 (여기서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드는 표적 서열의 하나 이상의 변이체에 적어도 부분적으로 상보적이고, 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 표적 서열의 하나 이상의 변이체에 적어도 부분적으로 상보적이며 표적 서열의 오직 1개의 변이체에 상보적인 적어도 하나의 내부 선택적 뉴클레오티드를 가짐); (c) 제2 올리고뉴클레오티드를 핵산 폴리머라제로 연장시키는 것 (여기서, 상기 폴리머라제는 우선적으로 상기 선택적 뉴클레오티드가 표적과 염기 쌍을 형성하는 경우에 상기 제2 올리고뉴클레오티드를 연장시킬 수 있고, 상기 선택적 뉴클레오티드가 표적과 염기 쌍을 형성하지 않는 경우에는 실질적으로 적게 연장시킬 수 있음); 및 (d) 상기 올리고뉴클레오티드 연장의 생성물을 검출하는 것 (여기서, 연장은 올리고뉴클레오티드가 상보적인 선택적 뉴클레오티드를 갖는 표적 서열의 변이체의 존재는 나타냄)을 포함하는 방법을 이용하여 검출된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf 폴리뉴클레오티드 발현은 (a) 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 B-raf 표적 서열의 적어도 하나의 변이체에 혼성화시키는 것 (여기서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드는 표적 서열의 하나 이상의 변이체에 적어도 부분적으로 상보적이고, 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 표적 서열의 하나 이상의 변이체에 적어도 부분적으로 상보적이며 표적 서열의 오직 1개의 변이체에 상보적인 적어도 하나의 내부 선택적 뉴클레오티드를 가짐); (b) 제2 올리고뉴클레오티드를 핵산 폴리머라제로 연장시키는 것 (여기서, 상기 폴리머라제는 우선적으로 상기 선택적 뉴클레오티드가 표적과 염기 쌍을 형성하는 경우에 상기 제2 올리고뉴클레오티드를 연장시킬 수 있고, 상기 선택적 뉴클레오티드가 표적과 염기 쌍을 형성하지 않는 경우에는 실질적으로 적게 연장시킬 수 있음); 및 (c) 상기 올리고뉴클레오티드 연장의 생성물을 검출하는 것 (여기서, 연장은 올리고뉴클레오티드가 상보적인 선택적 뉴클레오티드를 갖는 표적 서열의 변이체의 존재는 나타냄)을 포함하는 방법을 이용하여 검출된다.
일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA)는 (a) 환자 암 샘플 (예컨대, FFPE 고정 환자 암 샘플)로부터 추출된 핵산 (예를 들어, 게놈 DNA) 상에서 PCR을 수행하는 것; (b) PCR 증폭된 핵산을 서열분석함으로써 돌연변이체 B-raf 폴리뉴클레오티드의 발현을 결정하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 검출된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B-raf 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA)는 서열분석 (예를 들어, 생어(Sanger) 서열 또는 파이로시퀀싱)을 이용하여 검출된다.
3. 다른 핵산 돌연변이 검출 방법
핵산 돌연변이 (예를 들어, B-raf의 아미노산 위치 600에서 발린의 글루타민으로의 치환을 발생시키는 뉴클레오티드 위치 1799에서의 (GTG>GAA))의 존재 (또는 부재)는 또한 직접적 서열분석에 의해 검출될 수 있다. 방법은 디데옥시 서열분석-기반 방법 및 올리고뉴클레오티드-길이 생성물 파이로시퀀싱™과 같은 방법을 포함한다. 이러한 방법은 종종 증폭 기술, 예컨대 PCR을 사용한다. 서열분석을 위한 또 다른 유사한 방법은 완전 PCR의 이용을 요구하지는 않으나, 전형적으로는 오직 연구될 뉴클레오티드에 상보적인 단일, 형광-표지된 디데옥시리보핵산 분자 (ddNTP)에 의한 프라이머의 연장을 이용한다. 다형성 부위에서의 뉴클레오티드는 1개의 염기에 의해 연장되고 형광 표지된 프라이머의 검출을 통해 확인될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kobayashi et al., Mol. Cell. Probes, 9:175-182, 1995]).
증폭 반응 (예를 들어, PCR)을 이용하여 생성된 증폭 생성물은 또한 변성 구배 겔 전기영동의 이용에 의해 분석될 수 있다. 상이한 대립유전자는 용액에서의 상이한 서열-의존성 용해 특성 및 DNA의 전기영동 이동에 기초하여 확인될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Erlich, ed., PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification, W. H. Freeman and Co, New York, 1992, Chapter 7] 참조).
다른 실시양태에서, 예를 들어 문헌 [Orita et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 2766-2770 (1989)]에 기재된 바와 같이, 표적 서열의 대립유전자는 단일 가닥 PCR 생성물의 전기영동 이동의 변경에 의해 염기 차이를 확인하는 단일-가닥 입체형태 다형성 분석을 이용하여 구별될 수 있다. 증폭된 PCR 생성물을 상기 기재된 바와 같이 생성하고, 가열하거나 다르게는 변성시켜 단일 가닥 증폭 생성물을 형성할 수 있다. 단일-가닥 핵산은 염기 서열에 부분적으로 의존하는 2차 구조를 재폴딩시키거나 형성할 수 있다. 단일-가닥 증폭 생성물의 다양한 전기영동 이동성은 표적 영역의 대립유전자 사이의 서열 차이와 관련될 수 있다.
돌연변이 (예를 들어, 핵산 돌연변이)의 존재 또는 부재는 대립유전자-특이적 증폭 또는 프라이머 연장 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 이러한 반응은 전형적으로 프라이머의 3' 말단에서, 예를 들어 3' 뉴클레오티드 또는 끝에서 두번째 3' 뉴클레오티드에서 미스매치를 통해 돌연변이체 (또는 야생형) 부위를 특이적으로 표적화하도록 설계된 프라이머의 사용을 포함한다. 미스매치의 존재는 폴리머라제가 오류-보정 활성이 결손된 경우에 프라이머를 연장시키는 폴리머라제의 능력에 영향을 미친다. 예를 들어, 대립유전자-특이적 증폭- 또는 연장-기반 방법을 이용하여 V600E 돌연변이체 서열을 검출하기 위해, BRAF의 코돈 600 내의 뉴클레오티드 위치 1799에서 돌연변이체 A 대립유전자에 상보적인 프라이머는 3' 말단 뉴클레오티드가 돌연변이체 위치에서 혼성화되도록 설계된다. 돌연변이체 대립유전자의 존재는 연장을 개시하는 프라이머의 능력에 의해 결정될 수 있다. 3' 말단이 미스매치되는 경우에, 연장은 방해를 받는다. 따라서, 예를 들어, 프라이머가 3' 말단에서 돌연변이체 대립유전자 뉴클레오티드와 매치되면, 프라이머가 효율적으로 연장될 것이다. 증폭은 또한 위치 1799에서의 BRAF 야생형 서열로부터 특이적인 대립유전자-특이적 프라이머를 이용하여 수행될 수 있다.
전형적으로, 프라이머는 증폭 반응에서 제2 프라이머와 함께 사용된다. 제2 프라이머는 돌연변이체 위치와 관련되지 않은 부위에서 혼성화된다. 특정한 대립유전자 형태를 나타내는 검출가능한 생성물을 제공하는 2개의 프라이머로부터의 증폭 과정이 존재한다. 대립유전자-특이적 증폭- 또는 연장-기반 방법은 예를 들어 WO 93/22456; 미국 특허 번호 5,137,806; 5,595,890; 5,639,611; 및 미국 특허 번호 4,851,331에 기재되어 있다.
대립유전자-특이적 증폭-기반 유전자형 결정을 이용할 때, 대립유전자의 확인은 오직 증폭된 표적 서열의 존재 또는 부재의 검출을 요구한다. 증폭된 표적 서열의 검출 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 기재된 겔 전기영동 및 프로브 혼성화 검정은 종종 핵산의 존재를 검출하는데 사용된다.
대안적 프로브-무함유 방법에서, 증폭된 핵산은, 예를 들어 미국 특허 번호 5,994,056; 및 유럽 특허 공개 번호 487,218 및 512,334에 기재된 바와 같이, 반응 혼합물에서 이중-가닥 DNA의 총량의 증가를 모니터링함으로써 검출된다. 이중-가닥 표적 DNA의 검출은 증가된 형광 다양한 DNA-결합 염료, 예를 들어 SYBR 그린에 의존하며, 이중-가닥 DNA에 결합하였을 때 나타난다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 대립유전자-특이적 증폭 방법은 특정한 대립유전자를 표적화하기 위해 다중 대립유전자-특이적 프라이머를 이용하는 반응에서 수행될 수 있다. 이러한 멀티플렉스 적용을 위한 프라이머는 일반적으로 구별가능한 표지로 표지되고, 대립유전자로부터 생산된 증폭 생성물이 크기에 의해 구별가능하도록 선택된다. 따라서, 예를 들어, 단일 샘플에서 야생형 및 돌연변이체 V600E 대립유전자는 둘 다 단일 증폭 반응을 이용하여 증폭 생성물의 겔 분석에 의해 확인될 수 있다.
대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머는 혼성화 영역의 대립유전자 중 하나에 정확하게 상보적일 수 있거나 또는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 이외의 위치에 일부 미스매치를 가질 수 있다. 예를 들어, 끝에서 두번째 3' 뉴클레오티드는 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드에서 미스매치될 수 있다. 다른 실시양태에서, 미스매치는 양쪽 대립유전자 서열에서 (비돌연변이체) 부위에서 일어날 수 있다.
일부 실시양태에서, 대립유전자-특이적 혼성화는 고정화된 표적 또는 고정화된 프로브를 사용하는 검정 포맷으로 수행된다. 이러한 포맷은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 도트-블롯 포맷 및 역 도트 블롯 검정 포맷이 각각 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 5,310,893; 5,451,512; 5,468,613; 및 5,604,099에 기재되어 있다.
4. RNA-Seq
RNA-Seq (홀 트랜스크립톰 샷건 시퀀싱(Whole Transcriptome Shotgun Sequencing; WTSS)으로도 지칭됨)는 샘플의 RNA 함량에 대한 정보를 얻기 위해 cDNA를 서열분석하는 고처리량 서열분석의 사용을 지칭한다. RNA-Seq를 기재하는 공개는 문헌 [Wang et al. "RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics" Nature Reviews Genetics 10 (1): 57-63 (January 2009); Ryan et al. BioTechniques 45 (1): 81-94 (2008); 및 Maher et al. "Transcriptome sequencing to detect gene fusions in cancer". Nature 458 (7234): 97-101 (January 2009)]을 포함한다.
5. 마이크로어레이
차등 유전자 발현은 또한 마이크로어레이 기술을 이용하여 확인 또는 확증될 수 있다. 따라서, 유방암-연관 유전자의 발현 프로파일은 마이크로어레이 기술을 이용하여 신선한 또는 파라핀-포매된 종양 조직 중 하나에서 측정될 수 있다. 이 방법에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열 (cDNA 및 올리고뉴클레오티드 포함)은 마이크로칩 기판 상에 플레이팅되거나 어레이로 배열된다. 이어서, 어레이로 배열된 서열은 관심 세포 또는 조직으로부터의 특이적 DNA 프로브와 혼성화시킨다. PCR 방법에서와 같이, mRNA의 공급원은 전형적으로 인간 종양 또는 종양 세포주, 및 상응하는 정상 조직 또는 세포주로부터 단리된 전체 RNA이다. 따라서, RNA는 다양한 원발성 종양 또는 종양 세포주로부터 단리될 수 있다. mRNA의 공급원이 원발성 종양인 경우에, mRNA는, 통상적으로 제조되고 일상적인 임상 실무 하에 보존된, 예를 들어 냉동된 또는 보관된 파라핀-포매 및 고정된 (예를 들어, 포르말린-고정된) 조직 샘플로부터 추출될 수 있다.
마이크로어레이 기술의 구체적 실시양태에서, cDNA 클론의 PCR 증폭된 삽입물은 조밀한 어레이로 배열된 기판에 적용된다. 바람직하게는, 적어도 10,000개의 뉴클레오티드 서열이 기판에 적용된다. 각각 10,000개 요소로 마이크로칩 상에 고정된, 마이크로어레이 배열된 유전자가 엄격한 조건 하의 혼성화에 적합하다. 형광 표지된 cDNA 프로브는 관심 조직으로부터 추출된 RNA의 역전사에 의한 형광 뉴클레오티드의 통합을 통해 생성될 수 있다. 칩에 적용된 표지된 cDNA 프로브는 어레이 상에서 각 스폿의 DNA에 특이성을 가지면서 혼성화된다. 비특이적으로 결합된 프로브를 제거하기 위한 엄격한 세척 후에, 칩을 공초점 레이저 현미경검사에 의해 또는 또 다른 검출 방법, 예를 들어 CCD 카메라에 의해 스캐닝한다. 각각의 어레이 배열된 요소의 혼성화의 정량화는 상응하는 mRNA 과다에 대한 평가를 허용한다. 이중 색상 형광과 함께, RNA의 2개의 공급원으로부터 생성된 별개로 표지된 cDNA 프로브는 어레이에 쌍으로 혼성화된다. 따라서, 각각의 지정된 유전자에 상응하는 2종의 공급원으로부터의 전사체의 상대적인 과다는 동시에 결정된다. 소형 규모의 혼성화는 매우 많은 유전자에 대한 발현 패턴의 간편하고 신속한 평가를 제공한다. 이러한 방법은 세포당 적은 카피로 발현되는 희귀 전사체를 검출하기 위해, 및 발현 수준에서 적어도 대략 2배의 차이를 재현가능하게 검출하기 위해 필요한 감도를 갖는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(2):106-149 (1996)]). 마이크로어레이 분석은 제조업체의 프로토콜에 따라 상업적으로 입수가능한 설비에 의해, 예컨대 아피메트릭스(Affymetrix) 진칩(GENCHIP)™ 기술, 또는 인사이트의 마이크로어레이 기술을 이용하여 수행할 수 있다.
유전자 발현의 대규모 분석을 위한 마이크로어레이 방법의 개발은 암 분류, 및 다양한 종양 유형에서의 결과 예측을 위한 분자 마커를 시스템적으로 탐색하는 것을 가능하게 한다.
6. 유전자 발현의 연속 분석 (SAGE)
유전자 발현 연속 분석 (SAGE)은 각각의 전사체에 대한 개별 혼성화 프로브를 제공할 필요 없이 다수의 유전자 전사체의 동시 및 정량 분석을 허용하는 방법이다. 먼저, 전사체를 특징적으로 확인하기에 충분한 정보를 함유하는 짧은 서열 태그 (약 10-14 bp)가 생성되며, 단 태그는 각각의 전사체 내의 특징적인 위치로부터 수득된다. 이어서, 다수의 전사체를 함께 연결하여 긴 연속 분자를 형성하고, 이를 서열분석하여 다수의 태그의 동일성을 동시에 밝힐 수 있다. 임의의 집단의 전사체의 발현 패턴은 개별 태그의 존재량을 결정하고, 각각의 태그에 상응하는 유전자를 확인함으로써 정량적으로 평가될 수 있다. 보다 상세한 내용에 대해, 예를 들어 문헌 [Velculescu et al., Science 270:484-487 (1995); 및 Velculescu et al., Cell 88:243-51 (1997)]을 참조한다.
7. 매스어레이 기술
매스어레이 (시쿼놈(Sequenom), 캘리포니아주 샌디에고) 기술은 검출을 위해 질량 분광측정법 (MS)을 이용하는, 유전자 발현 분석의 자동화된 고처리량 방법이다. 이 방법에 따르면, RNA의 단리, 역전사 및 PCR 증폭 후에, cDNA는 프라이머 연장에 적용된다. cDNA-유래의 프라이머 연장 생성물을 정제하고, MALTI-TOF MS 샘플 제조에 필요한 성분이 예비-로딩된 칩 어레이 상에 분배한다. 반응물 내에 존재하는 다양한 cDNA는 얻어진 질량 스펙트럼에서 피크 영역을 분석함으로써 정량화된다.
8. 면역조직화학
면역조직화학 ("IHC) 방법은 또한 본 발명의 바이오마커의 발현 수준을 검출하는데 적합하다. 조직 절편의 면역조직화학 염색은 샘플 내 단백질의 존재를 평가 또는 검출하기 위한 신뢰할 수 있는 방법으로 밝혀졌다. 면역조직화학 기술은 프로브에 대한 항체를 사용하고, 일반적으로는 발색 또는 형광 방법을 통해 계내에서 세포 항원을 시각화한다. 따라서, 각각의 마커에 대해 특이적인 항체 또는 항혈청, 바람직하게는 폴리클로날 항혈청, 가장 바람직하게는 모노클로날 항체가 발현을 검출하기 위해 사용된다. 하기에 보다 상세하게 논의되는 바와 같이, 항체는 예를 들어, 방사성 표지, 형광 표지, 합텐 표지, 예컨대 비오틴, 또는 효소, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제를 사용하는 항체 자체의 직접적인 표지에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, 비표지된 1차 항체는 1차 항체에 특이적인 항혈청, 폴리클로날 항혈청 또는 모노클로날 항체를 포함하는 표지된 2차 항체와 함께 사용된다. 면역조직화학 프로토콜 및 키트는 당업계에 널리 공지되어 있고 상업적으로 입수가능하다.
2가지 일반적인 IHC 방법; 즉 직접 및 간접 검정을 이용할 수 있다. 첫번째 검정에 따라, 표적 항원에 대한 항체의 결합을 직접 결정한다. 이러한 직접 검정은 추가의 항체 상호작용 없이도 시각화될 수 있는 표지된 시약, 예를 들어 형광 태그 또는 효소-표지된 1차 항체를 사용한다. 전형적인 간접 검정에서는, 미접합 1차 항체가 항원에 결합한 후, 표지된 2차 항체가 상기 1차 항체에 결합한다. 2차 항체가 효소 표지에 접합된 경우에, 항원의 시각화를 제공하기 위해 발색 또는 형광 기질을 첨가한다. 여러 2차 항체가 1차 항체 상의 상이한 에피토프와 반응할 수 있기 때문에 신호 증폭이 발생한다.
면역조직화학에 사용되는 1차 및/또는 2차 항체는 전형적으로 검출가능한 모이어티로 표지될 것이다. 다수의 표지가 이용가능하고, 이들은 일반적으로 하기 카테고리로 분류될 수 있다:
(a) 방사성동위원소, 예컨대 35S, 14C, 125I, 3H, 및 131I. 항체는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 방사성동위원소로 표지될 수 있고, 방사성은 섬광 계수를 이용하여 측정될 수 있다.
(b) 콜로이드성 금 입자.
(c) 형광 표지, 예를 들어 이에 제한되지는 않지만, 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트), 텍사스 레드(Texas Red), 로다민, 플루오레세인, 단실, 리사민, 움벨리페론, 피코크리테린, 피코시아닌, 또는 상업적으로 입수가능한 형광단, 예컨대 스펙트럼 오렌지(SPECTRUM ORANGE)® 및 스펙트럼 그린(SPECTRUM GREEN)® 및/또는 상기 중 임의의 하나 이상의 유도체. 형광 표지는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌]에 개시된 기술을 이용하여 항체에 접합될 수 있다. 형광은 형광계를 이용하여 정량화될 수 있다.
(d) 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하고, 미국 특허 번호 4,275,149는 이들 중 일부에 대한 개관을 제공한다. 효소는 일반적으로 발색 기질의 화학적 변경을 촉매하며, 이는 다양한 기술을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 효소는 기질에서의 색 변화를 촉매할 수 있고, 이는 분광학적으로 측정할 수 있다. 대안적으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량화하는 기술은 상기 기재되어 있다. 화학발광 기질은 화학적 반응에 의해 전자적으로 여기된 후에, 측정 (예를 들어, 화학발광계 사용)할 수 있는 광을 방출하거나 또는 에너지를 형광 수용자에게 제공할 수 있다. 효소 표지의 예는 루시페라제 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제; 미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예컨대, 우리카제 및 크산틴 옥시타제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 접합시키는 기술은 문헌 [O'Sullivan et al. Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)]에 기재되어 있다.
효소-기질 조합의 예는 예를 들어 다음을 포함한다:
(i) 기질로서 수소 퍼옥시다제를 갖는 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO) (여기서, 수소 퍼옥시다제는 염료 전구체 [예를 들어, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 히드로클로라이드 (TMB)]를 산화시킨다. 또한, 3,3-디아미노벤지딘 (DAB)을 사용하여 HRP-표지된 항체를 시각화할 수 있음);
(ii) 발색 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트를 갖는 알칼리성 포스파타제 (AP); 및
(iii) 발색 기질 (예를 들어, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광 기질 (예를 들어, 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제)을 갖는 β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal).
다수의 다른 효소-기질 조합이 당업자에게 이용가능하다. 이들의 일반적 검토를 위해서, 미국 특허 번호 4,275,149 및 4,318,980을 참조한다.
때때로, 표지는 항체와 간접적으로 접합된다. 당업자는 이를 달성하기 위한 다양한 기술을 알 것이다. 예를 들어, 항체는 비오틴과 접합될 수 있고, 상기 언급된 4종의 광범위한 카테고리의 표지 중 임의의 것이 아비딘과 접합될 수도 있고, 또는 그 반대의 경우도 가능하다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하며, 이에 따라 표지는 이러한 간접 방식으로 항체와 접합될 수 있다. 대안적으로, 표지와 항체의 간접 접합을 달성하기 위해, 항체는 작은 합텐과 접합되고, 상기 언급된 표지의 상이한 유형 중 하나가 항-합텐 항체와 접합된다. 이에 따라, 표지와 항체의 간접 접합이 달성될 수 있다.
상기 논의된 샘플 제조 절차 이외에, IHC 전에, 그 동안 또는 그 이후에 조직 절편을 추가로 처리하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 에피토프 복구 방법, 예컨대 시트레이트 완충제 중의 조직 샘플의 가열을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Leong et al. Appl. Immunohistochem. 4(3):201 (1996)] 참조).
임의적 차단 단계 후에, 1차 항체가 조직 샘플 중의 표적 단백질 항원에 결합하기에 충분한 기간 동안 및 적합한 조건 하에, 조직 절편을 1차 항체에 노출시킨다. 이를 달성하기에 적절한 조건은 통상적인 실험으로 결정될 수 있다.
샘플에 대한 항체의 결합 정도는 상기 논의된 검출가능한 표지 중 어느 하나를 사용하여 결정된다. 바람직하게는, 표지는 발색 기질, 예컨대 3,3'-디아미노벤지딘 발색체의 화학적 변경을 촉매하는 효소 표지 (예를 들어, HRPO)이다. 바람직하게는, 효소 표지는 1차 항체에 특이적으로 결합하는 항체에 접합된다 (예를 들어, 1차 항체는 토끼 폴리클로날 항체이고, 2차 항체는 염소 항-토끼 항체임).
이에 따라 제조된 시편을 탑재하고 커버글라스를 덮을 수 있다. 이어서, 슬라이드 평가는, 예를 들어 현미경을 이용하여 결정된다.
IHC는 전에 또는 후에 형태론적 염색과 조합될 수 있다. 탈파라핀화 후에, 슬라이드 상에 탑재된 절편은 평가를 위한 형태론적 염색으로 염색될 수 있다. 이용되는 형태론적 염색은 조직 절편의 정확한 형태론적 평가를 위해 제공한다. 상기 절편은 상이한 세포 성분을 명백하게 염색하는 각각의 하나 이상의 염료로 염색될 수 있다. 한 실시양태에서, 헤마톡실린은 슬라이드의 세포 핵산을 염색하기 위해 사용된다. 헤마톡실린은 광범위하게 사용가능하다. 적합한 헤마톡실린의 예는 헤마톡실린 II (벤타나)이다. 보다 밝은 청색 핵이 바람직한 경우, 청색화 시약이 헤마톡실린 염색 후에 사용될 수 있다. 당업자는 슬라이드가 염료에 남아있는 시간 길이를 증가시키거나 감소시킴으로써 주어진 조직에 대한 염색을 최적화할 수 있음을 인지할 것이다.
슬라이드 제조 및 IHC 처리를 위한 자동화 시스템은 상업적으로 이용가능하다. 벤타나® 벤치마크(BenchMark) XT 시스템은 이러한 자동화 시스템의 예이다.
염색 후에, 조직 절편은 현미경검사의 표준 기법에 의해 분석될 수 있다. 일반적으로, 병리학자 등은 비정상 또는 정상 세포 또는 특정 세포 유형의 존재에 대해 조직을 평가하고, 관심 세포 유형의 좌위를 제공한다. 따라서, 예를 들어, 병리학자 등은 슬라이드를 검토하고, 정상 세포 (예컨대, 정상 폐 세포) 및 비정상 세포 (예컨대, 비정상 또는 신생물성 폐 세포)를 확인할 것이다. 관심 세포의 좌위를 규정하는 임의의 수단이 이용될 수 있다 (예를 들어, X-Y 축 상의 좌표).
IHC에 사용하기 적합한 항-c-met 항체는 당업계에 널리 공지되어 있으며, SP-44 (벤타나), DL-21 (업스테이트(Upstate)), MET4, ab27492 (압캠(Abcam)), PA1-37483 (피어스 안티바디스(Pierce Antibodies))를 포함한다. 당업자는 추가의 적합한 항-c-met 항체가 예를 들어 본원에 개시된 IHC 프로토콜을 이용하여 c-met 항체와 비교함으로써 확인되고 특성화될 수 있음을 이해한다. 항-포스포-c-met 항체는 당업계에 공지되어 있으며, 셀 시그널링 테크놀로지스(Cell Signalling Technologies)로부터의 항-포스포-c-met 항체 Y1234/5를 포함한다. IHC에 사용하기에 적합한 항-HGF 항체는 또한 당업계에 널리-공지되어 있으며, ab24865 (압캠), H00003082-A01 (아브노바(Abnova)), MA1-24767 (써모 피셔(Thermo Fisher)), LS-C123743 (라이프 스팬(Life Span))을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 환자의 종양의 샘플에서의 HGF의 검출은 예를 들어 환자의 종양의 샘플에 존재하는 종양 기질에서의 HGF의 검출 뿐만 아니라 종양 세포에서의 HGF의 검출을 포괄하는 것으로 이해된다. 혈청에서 HGF의 검출을 위한 검정 (예컨대, ELISA 검정)은 상업적으로 이용가능하고, 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Catenacci et al., Cancer Discovery (2011) 1:573]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 다양한 염색 강도를 갖는 대조 세포 펠릿은 IHC 분석용 대조군 뿐만 아니라 스코어링 대조군으로서 이용될 수 있다. 예를 들어, H441 (강한 c-met 염색 강도); A549 (중간 정도의 c-met 염색 강도); H1703 (약한 c-met 염색 강도), HEK-293 (293) (약한 c-met 염색 강도); 및 TOV-112D (음성 c-met 염색 강도) 또는 H1155 (음성 c-met 염색 강도).
일부 실시양태에서, c-met 염색 강도 기준은 표 A에 따라 평가될 수 있다:
[표 A]
Figure pct00008
일부 실시양태, "임상 Met 진단 양성" 및 "임상 Met 진단 음성" 카테고리는 다음과 같이 정의된다:
임상 c-met 진단 양성: IHC 스코어 2 또는 3 (표 A에 정의된 바와 같음), 및
임상 c-met 진단 음성: IHC 스코어 0 또는 1 (표 A에 정의된 바와 같음).
일부 실시양태에서, 연관된 높은 c-met 바이오마커는 2의 IHC 스코어, 3의 IHC 스코어 또는 2 또는 3의 IHC 스코어이다. 일부 실시양태에서, 낮은 c-met 바이오마커는 0의 IHC 스코어, 1의 IHC 스코어 또는 0 또는 1의 IHC 스코어이다.
9. 단백질체학
용어 "프로테옴"은 특정 시점에서 샘플 (예를 들어, 조직, 유기체, 또는 세포 배양물)에 존재하는 단백질의 총체로서 규정된다. 단백질체학은 특히 샘플에서 단백질 발현의 전반적인 변화에 대한 연구를 포함한다 ("발현 단백질체학"으로도 지칭됨). 단백질체학은 전형적으로 다음 단계를 포함한다: (1) 2-D 겔 전기영동 (2-D PAGE)에 의한 샘플 중의 개별 단백질의 분리 단계; (2) 예를 들어 질량 분광측정법 또는 N-말단 서열분석에 의한, 겔로부터 회수된 개별 단백질의 확인 단계, 및 (3) 생물정보학을 이용하는 데이터의 분석 단계. 단백질체학 방법은 다른 유전자 발현 프로파일링 방법에 대한 유용한 보완법이고, 본 발명의 예후 마커의 생성물을 검출하기 위해 단독으로 또는 다른 방법과 조합하여 이용될 수 있다.
10. 유전자 증폭
c-met 유전자 증폭의 검출은 당업자에게 공지된 특정 기술을 이용하여 달성된다. 예를 들어, 비교 게놈 혼성화는 염색체 위치의 함수로서 DNA 서열 카피수의 지도를 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 문헌 [Kallioniemi et al. (1992) Science 258:818-821]을 참조한다. c-met 유전자의 증폭은 또한, 예를 들어, c-met 유전자에 대해 특이적인 프로브를 사용하는 서던 혼성화에 의해 또는 실시간 정량적 PCR에 의해 검출될 수 있다.
특정 실시양태에서, c-met 유전자 증폭의 검출은 예를 들어 c-met 유전자에 혼성화되는 프로브를 사용하여 c-met 유전자의 카피수를 직접적으로 평가하는 것에 의해 달성된다. 예를 들어, FISH 검정이 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, c-met 유전자 증폭의 검출은 예를 들어 c-met 유전자 밖에 놓여있지만 c-met 유전자와 공동-증폭되는 염색체 영역의 카피수를 평가함으로써 c-met 유전자의 카피수를 간접적으로 평가하는 것에 의해 달성된다. 바이오마커 발현은 또한 생체내 진단 검정을 이용하여, 예를 들어 검출하려는 분자에 결합하고 검출가능한 표지 (예를 들어, 방사성 동위원소)로 태그 부착된 분자 (예컨대, 항체)를 투여하고 표지의 국재화에 대해 환자를 외부에서 스캐닝함으로써 평가될 수 있다.
11. 다른 예시적인 방법
바이오마커는 다양한 면역검정 방법 (본원에 기재된, 예를 들어 상기 IHC 포함)에 의해 검출될 수 있다. 면역학적 및 면역검정 절차의 검토를 위해, 문헌 [Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr eds., 7th ed. 1991)]을 참조한다. 또한, 본 발명의 면역검정은 문헌 [Enzyme Immunoassay (Maggio, ed., 1980); 및 Harlow & Lane, 상기 문헌]에서 광범위하게 검토된 임의의 여러 구성으로 수행될 수 있다. 일반적 면역검정의 검토를 위해, 또한 문헌 [Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volume 37 (Asai, ed. 1993); Basic and Clinical Immunology (Stites & Ten, eds., 7th ed. 1991)]을 참조한다.
통상적으로 사용되는 검정은 비경쟁적 검정, 예를 들어 샌드위치 검정 및 경쟁적 검정을 포함한다. 전형적으로는 ELISA 검정과 같은 검정이 이용될 수 있다. 예를 들어 혈장 또는 혈청을 비롯한 매우 다양한 조직 및 샘플을 분석하기 위한 Elisa 검정이 당업계에 공지되어 있다. 혈청에서 HGF를 분석하기 위한 ELISA 검정이 본원에 예시된다. ELISA에 사용하기 적합한 항-HGF 항체는 당업계에 공지되어 있다.
이러한 검정 포맷을 이용한 광범위한 면역검정 기술이 이용가능하고, 예를 들어 미국 특허 번호 4,016,043, 4,424,279, 및 4,018,653을 참조한다. 이들은 비-경쟁적 유형의 단일-부위 및 2-부위 또는 "샌드위치" 검정 뿐만 아니라, 통상적인 경쟁적 결합 검정을 둘 다 포함한다. 또한, 이러한 검정은 표적 바이오마커에 대한 표지된 항체의 직접 결합을 포함한다. 샌드위치 검정이 통상적으로 이용되는 검정이다. 샌드위치 검정 기술의 다수의 변형이 존재한다. 예를 들어, 전형적인 정방향 검정에서, 비표지된 항체는 고체 기질 상에 고정되고, 시험할 샘플은 결합된 분자와 접촉시킨다. 항체-항원 복합체 형성에 충분한 기간 동안의 적합한 인큐베이션 기간 후, 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 리포터 분자로 표지되고 항원에 특이적인 제2 항체를 첨가하고, 항체-항원-표지된 항체의 또 다른 복합체 형성에 충분한 시간 동안 인큐베이션한다. 임의의 미반응 물질을 세척하고, 항원의 존재를 리포터 분자에 의해 생성된 신호를 관찰하여 결정한다. 결과는 시각적인 신호의 단순 관찰에 의해 정성적일 수도 있고, 또는 공지된 양의 바이오마커를 함유하는 대조군 샘플과의 비교로 정량화할 수도 있다.
정방향 검정의 변형은 결합된 항체에 샘플 및 표지된 항체 둘 다를 동시에 첨가하는 동시 검정을 포함한다. 이러한 기술은 용이하게 명백해질 임의의 근소한 변형을 포함하여 당업자에게 공지되어 있다. 전형적인 정방향 샌드위치 검정에서, 바이오마커에 특이성을 갖는 제1 항체는 고체 표면에 공유 또는 수동 결합된다. 고체 표면은 전형적으로 유리 또는 중합체일 수 있고, 가장 통상적으로 사용되는 중합체는 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌이다. 고체 지지체는 튜브, 비드, 마이크로플레이트의 디스크의 형태, 또는 면역검정 수행에 적합한 임의의 다른 표면일 수 있다. 결합 과정은 당업계에 공지되어 있고, 일반적으로 가교 공유 결합 또는 물리적 흡착으로 이루어지고, 중합체-항체 복합체는 시험 샘플 제조시에 세척하였다. 이어서, 시험할 샘플의 분취액을 고체 상 복합체에 첨가하고, 항체에 존재하는 임의의 서브유닛의 결합을 허용하기에 적합한 조건 (예를 들어, 실온 내지 40℃, 예컨대 25℃ (포함) 내지 32℃ (포함)) 하에 충분한 기간 동안 (예를 들어, 2-40분 또는 보다 편리하게는 밤새) 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간 후, 항체 서브유닛 고체 상을 세척하여 건조시키고, 바이오마커의 일부에 특이적인 제2 항체와 함께 인큐베이션한다. 제2 항체는 분자 마커에 대한 제2 항체의 결합을 표시하는데 사용되는 리포터 분자에 연결된다.
대안적 방법은 샘플 중의 표적 바이오마커를 고정시킨 후, 상기 고정된 표적을 리포터 분자로 표지될 수도 있고 표지되지 않을 수도 있는 특이적 항체에 노출시키는 것을 포함한다. 표적의 양 및 리포터 분자 신호의 강도에 따라, 항체를 사용한 직접 표지에 의해 결합된 표적을 검출할 수 있다. 대안적으로, 제1 항체에 특이적인 제2 표지된 항체를 표적-제1 항체 복합체에 노출시켜 표적-제1 항체-제2 항체의 3원 복합체를 형성시킨다. 복합체는 표지된 리포터 분자에 의해 방출되는 신호에 의해 검출된다.
효소 면역검정의 경우에, 효소는 일반적으로 글루타르알데히드 또는 퍼아이오데이트에 의해 제2 항체에 접합된다. 그러나, 용이하게 인지되는 바와 같이, 당업자가 용이하게 이용가능한 다양한 여러가지 접합 기술이 존재한다. 통상적으로 사용되는 효소는 양고추냉이 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제 및 알칼리성 포스파타제를 포함하고, 다른 것도 본원에 논의된다. 특이적 효소와 함께 사용될 기질은 일반적으로 상응하는 효소에 의한 가수분해시에 검출가능한 색상 변화가 생성되는 것으로서 선택된다. 적합한 효소의 예는 알칼리성 포스파타제 및 퍼옥시다제를 포함한다. 상기한 발색 기질 보다는 형광 생성물을 생성하는 형광 기질을 사용하는 것이 또한 가능하다. 모든 경우에서, 효소-표지된 항체를 1차 항체-분자 마커 복합체에 첨가하여 결합시킨 후에 잉여 시약을 세척한다. 이어서, 적절한 기질을 함유하는 용액을 상기 항체-항원-항체의 복합체에 첨가한다. 기질은 2차 항체에 연결된 효소와 반응하여 정성적인 시가적 신호를 생성할 것이고, 이는 샘플 내에 존재하는 바이오마커의 양을 표시하도록 일반적으로는 분광학적으로 추가로 정량화될 수 있다. 대안적으로, 플루오레세인 및 로다민과 같은 형광 화합물이 이들의 결합 능력을 변경시키지 않으면서 항체에 화학적으로 커플링될 수 있다. 특정한 파장의 광을 사용한 조명으로 활성화될 때, 형광색소-표지된 항체는 광 에너지를 흡수하여 분자를 여기가능 상태로 유도한 후, 광학 현미경으로 시각적으로 검출가능한 특징적인 색상의 광을 방출한다. EIA에서와 같이, 형광 표지된 항체는 제1 항체-분자 마커 복합체에 결합하게 된다. 결합되지 않은 시약을 세척한 후에, 남아있는 3원 복합체를 적절한 파장의 광에 노출시키고, 관찰된 형광은 관심 분자 마커의 존재를 나타낸다. 면역형광 및 EIA 기술은 둘 다 당업계에 널리 확립되어 있고, 본원에서 논의된다.
다른 검출 기술, 예를 들어, MALDI가 샘플에서, 바이오마커, 예를 들어 돌연변이체 Braf의 존재를 직접적으로 검출하는데 사용될 수 있다.
V. 제조품
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 암 (예컨대, 흑색종 또는 유두상 갑상선 암종)을 치료하는데 사용하기 위한 제조품이 제공된다. 제조품은 용기, 및 용기 상의 또는 용기와 연관된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 활성제로서의 암 의약을 포함하는 조성물을 보유 또는 함유하고, 멸균 접근 포트를 가질 있을 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 관통가능한 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음).
제조품은 제약상 허용되는 희석 완충제, 예를 들어 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조품은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 제조품은 또한 조성물이 본원의 바이오마커(들)의 발현 수준에 기초하여 암을 치료하기 위해 사용되는 것임을 나타내는 정보를, 예를 들어 포장 삽입물 형태로 포함한다. 삽입물 또는 라벨은 임의의 형태, 예를 들어 종이 또는 전자 매체, 예컨대 자기 기록 매체 (예를 들어, 플로피 디스크) 또는 CD-ROM에 존재할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 또한 키트 또는 제조품 내의 제약 조성물 및 투여 형태에 관한 다른 정보를 포함할 수도 있다. 방법은 본원의 임의의 치료 및 진단 방법을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에 따르면, 제약상 허용되는 담체 중 c-met 길항제 (예를 들어, 항-c-met 항체), 및 c-met 길항제가 c-met 바이오마커의 발현에 기초하여 암 (예컨대, 흑색종)을 갖는 환자를 치료하기 위한 것임을 나타내는 포장 삽입물을 함께 포장하여 포함하는 제조품이 제공된다. 일부 실시양태에서, 치료는 B-raf 길항제와 조합된다. 일부 실시양태에서, 포장 삽입물은 c-met 길항제가 c-met 바이오마커 및 B-raf 바이오마커의 발현에 기초하여 암 (예컨대, 흑색종)을 갖는 환자를 진치료하기 위해 B-raf 길항제와 조합된다는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, B-raf 바이오마커는 B-raf V600E이다.
본 발명은 또한 c-met 길항제 (예를 들어, 항-c-met 항체)를 포함하는 제약 조성물, 및 제약 조성물이 c-met 바이오마커의 발현에 기초하여 암 (예컨대, NSCLC)을 갖는 환자를 치료하기 위한 것임을 나타내는 포장 삽입물을 포장 내에 조합하는 것을 포함하는, 제조품의 제조 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 치료는 B-raf 길항제와 조합된다. 일부 실시양태에서, 포장 삽입물은 c-met 길항제가 c-met 바이오마커 및 B-raf 바이오마커의 발현에 기초하여 암 (예컨대, 흑색종)을 갖는 환자를 치료하기 위해 B-raf 길항제와 조합된다는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, B-raf 바이오마커는 B-raf V600이다. 일부 실시양태에서, B-raf 바이오마커는 B-raf V600E이다.
제조품은 제약상 허용되는 희석 완충제, 예컨대 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및/또는 덱스트로스 용액을 포함하는 추가의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조품은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.
VI. 진단 키트
본 발명은 또한 본원에서 확인된 임의의 하나 이상의 바이오마커(들)를 검출하는데 유용한 진단 키트에 관한 것이다. 따라서, 암 환자로부터의 샘플에서 c-met 중 하나 이상, 및 B-raf, 예컨대 B-raf V600 바이오마커의 발현을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함하는 진단 키트가 제공된다. 임의로, 키트는 환자가 c-met 바이오마커를 발현하고/거나 환자가 B-raf 바이오마커를 발현하는 경우에 암 환자를 치료하기 위한 암 의약 (예를 들어, B-raf 길항제와 조합된 c-met 길항제, 예컨대 항-c-met 항체)을 선택하기 위해 키트를 사용하는 지침을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, B-raf 바이오마커는 B-raf V600이다. 일부 실시양태에서, B-raf 바이오마커는 (a) 환자의 흑색종의 샘플로부터 추출된 핵산 (예를 들어, DNA) 상에서 PCR 또는 서열분석을 수행하는 것; 및 (b) 샘플에서 BRAFV600의 발현을 결정하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 검출된다. 일부 실시양태에서, 흑색종 샘플은 포르말린-고정 파라핀-포매된다. 일부 실시양태에서, c-met 바이오마커는 HGF이고, 발현은 환자의 흑색종 (또는 흑색종 기질)의 샘플에서 IHC를 이용하여 검출된다. 일부 실시양태에서, c-met 바이오마커는 HGF이고, 발현은 환자의 혈청의 샘플에서 ELISA를 이용하여 검출된다. 진단 방법은 본원의 임의의 진단 방법을 포함한다.
VII. 광고 방법
본 발명은 또한 본원에서 표적 청중에게 c-met 바이오마커 및/또는 B-raf 바이오마커의 발현에 기초하여 암을 갖는 환자를 치료하기 위한 암 의약 (예를 들어, 항-c-met 항체)의 사용을 프로모션하는 것을 포함하는, 암 의약을 광고하는 방법에 관한 것이다.
광고는 일반적으로 광고주가 확인되고 메시지가 제어된, 비-개인적인 매체를 통한 유료 커뮤니케이션이다. 본원의 목적을 위한 광고는 선전, 홍보, 간접 광고, 후원, 인수 및 판촉을 포함한다. 이러한 용어는 또한 본원에서 본 발명을 구입하거나 지지하거나 승인하는 유리한 패턴으로 설득하거나 정보를 제공하거나 프로모션하거나 동기부여하거나 또는 다르게는 행동을 변형시키기 위해 대중에게 호소하도록 고안된 인쇄 커뮤니케이션 매체들 중 임의의 것으로 나타나는, 후원받은 정보성 공시를 또한 포함한다.
본원에서의 진단 방법의 광고 프로모션은 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 이러한 메시지를 전달하기 위해 사용되는 광고 매체의 예는 방송 매체에서 메시지를 나타내는, 텔레비젼, 라디오, 영화, 잡지, 신문, 인터넷 및 광고판 (광고방송 포함)를 포함한다. 광고는 또한 식품점 카트의 시트, 공항 보도의 벽 및 버스 측면 상의 것들, 통화중 대기 메시지 또는 점포내 PA 시스템에서 들리는 것들, 시각적 또는 청각적 커뮤니케이션이 존재할 수 있는 어디에서든지 있는 것들을 포함한다.
프로모션 또는 광고 수단의 보다 구체적 예는 텔레비전, 라디오, 영화, 인터넷, 예컨대 웹 캐스트 및 웨비나, 동시 사용자들에게 도달하도록 의도된 쌍방향 컴퓨터 네트워크, 고정형 또는 전자식 광고판 및 기타 공공 간판, 포스터, 전통적인 또는 전자식 인쇄물, 예컨대 잡지 및 신문, 기타 매스컴, 프레젠테이션 또는 개인적인 접촉 (예를 들어, 이메일, 전화, 인스턴트 메시지, 우편, 택배, 대중, 또는 배달 우편, 개인 방문 등에 의한 접촉)을 포함한다.
사용되는 광고의 유형은 많은 요인, 예를 들어 도달하려는 표적 청중의 성질, 예를 들어 병원, 보험 회사, 진료소, 의사, 간호사 및 환자, 뿐만 아니라 비용 고려사항, 및 의약 및 진단 광고를 규제하는 관련 관할 법률 및 규칙에 따라 결정될 것이다. 광고는 서비스 상호작용에 의해 정의되는 사용자 특성화 및/또는 기타 데이터, 예컨대 사용자 통계 및 지리적 위치를 기초로 하여 개별화 또는 주문제작될 수 있다.
실시예
실시예 1 항암 키나제 억제제에 대한 성장 인자-유도 내성
방법
RTK 리간드 매트릭스 스크린. 세포 생존율을 핵산 염색 Syto 60 (인비트로젠)을 사용하여 평가하였다. 세포 (웰당 3000-5000개)를 96 웰 플레이트에 시딩하고, 밤새 부착시켰다. 다음날, 세포를 50ng/mL RTK 리간드로 (또는 상기 리간드 없이) 처리하고, 동시에 증가하는 농도 범위의 관련 키나제 억제제에 노출시켰다. 72시간 약물 노출 후에, 세포를 4% 포름알데히드에서 고정하고, Syto 60으로 염색하고, 세포 수를 오디세이(Odyssey) 스캐너 (리-코르(Li-Cor))를 이용하여 평가하였다. 세포 생존율은 약물-처리된 세포로부터 수득한 형광을 대조군 (약물 없음) 처리된 세포로부터 수득한 형광으로 나누어 계산하였다.
세포주. 인간 암 세포주를 수득하고, 이전에 기재된 바와 같이 자동화 플랫폼을 이용하여 감수성에 대해 시험하였다 (문헌 [Johannessen, C. M. et al. COT drives resistance to RAF inhibition through MAP kinase pathway reactivation. Nature 468, 968-972, doi:10.1038/nature09627 (2010)]). 세포주를 습윤 대기 중에서 5% CO2로 37℃에서 유지하고, 10% 태아 소 혈정 (깁코(GIBCO)), 50 유닛/mL 페니실린 및 50 μg/mL 스트렙토마이신 (깁코)이 보충된 RPMI 1640 또는 DMEM/F12 성장 배지 (깁코)에서 성장시켰다.
시약. 라파티닙, 수니티닙 및 에를로티닙을 LC 래보러토리즈(LC Laboratories)로부터 구입하였다. 크리조티닙, TAE684, AZD6244 및 BEZ235를 셀렉 케미칼스(Selleck Chemicals)로부터 구입하였다. PD173074를 토크리스 바이오사이언스(Tocris Bioscience)로부터 구입하였다. PLX4032를 액티브 바이오켐(Active Biochem)으로부터 구입하였다. 재조합 인간 (rh) HGF, EGF, FGF-염기성, IGF-1 및 PDGF-AB를 페프로테크(Peprotech)로부터 구입하였다. rhNRG1-β1을 알 앤 디 시스템즈(R and D Systems)로부터 구입하였다. 생체내 연구를 위해, 3D6 항-MET 효능제 항체, RG7204 (PLX4032) 및 GDC-0712는 제넨테크에서 생성하였다. GDC-0712가 크리조티닙과 유사한 키나제 프로파일을 가지므로 이를 이종이식편 실험에 사용하였다 (문헌 [Liederer, B. M. et al. Xenobiotica 41, 327-339, doi:10.3109/00498254. 2010.542500 (2011)]) (도 25 및 26).
이뮤노블롯팅. 세포 용해물을 Halt 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))이 보충된 노니뎃(Nonidet)-P40 용해 완충제를 사용하여 수확하고, 단백질의 면역검출을 표준 프로토콜을 이용하여 수행하였다. 포스포-HER2 (Y1248; #2247), HER2 (#2242), 포스포-HER3 (Y1289; #4791), 포스포-MET (Y1234/5; #3126), PDGFRα (#5241), 포스포-FRS2α (Y196; #3864), IGF-1Rβ (#3027), 포스포-ALK (Y1604; #3341), AKT (#9272), 포스포-ERK (T202/Y204; #9101), ERK (#9102), GAPDH (#2118) 및 β-튜불린 (#2146) 항체를 셀 시그널링 테크놀로지스(Cell Signaling Technologies)로부터 구입하였다. HER3 (SC-285), MET (SC-10), 포스포-PDGFRα (SC-12911), FRS2α (SC-8318), FGFR1 (SC-7945), FGFR2 (SC-122), FGFR3 (SC-13121) 및 ALK (SC-25447)에 대한 항체를 산타 크루즈 바이오테크놀로지스(Santa Cruz Biotechnologies)로부터 구입하였다. 포스포-AKT (S473; #44-621G) 항체를 인비트로젠으로부터 구입하였다. 포스포-EGFR (Y1068; ab5644) 항체를 압캠으로부터 구입하였다. EGFR (#610017) 항체를 BD 바이오사이언시스(BD Biosciences)로부터 구입하였다. PARP (#14-6666-92) 항체를 이바이오사이언스(eBioscience)로부터 구입하였다. 밀도측정법을 이미지제이(ImageJ) 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
조직 샘플. 적절한 IRB 승인 및 환자 사전 동의를 받은 원발성 유방 종양 샘플을 하기 공급원으로부터 수득하였다: 큐어라인(Cureline) (캘리포니아주 사우스 샌프란시스코), 아이엘에스바이오(ILSbio) (메릴랜드주 체스터타운) 및 미국 국립 암 연구소(National Cancer Institute)의 코오퍼레이티브 휴먼 티슈 네트워크(Cooperative Human Tissue Network). 전이성 흑색종 종양 샘플을 BRIM2 시험으로부터 수득하였다. 연구에 사용된 인간 조직 샘플은 그의 사용 전에 탈식별 (이중-코드화)하였으며, 이에 따라 이들 샘플을 사용하는 연구는 미국 보건 사회 복지 규정 및 관련 지침 하의 인간 대상체 연구를 고려하지 않았다. MET에 대한 면역조직화학을 양하전된 유리 슬라이드 상에 4μm의 두께로 절단된 포르말린-고정 파라핀-포매 절편 상에서 수행하였다. 염색을 MET 토끼 모노클로날 항체 SP44 (스프링 바이오사이언스(Spring BioScience), 캘리포니아주 플레젠튼; #M3441) 및 CC1 표준 항원 검색을 사용하여 울트라뷰(Ultraview) 검출 (VMSI, 애리조나주 투산)을 이용하는 디스커버리(Discovery) XT 자동염색기 상에서 수행하였다. 절편을 헤마톡실린으로 대비염색하고, c-MET에 특이적인 염색 (예를 들어, 막 염색)을 0 (염색 없음) 내지 3+ (강한 염색)의 스케일 상에서 스코어링하였다.
스코어링 계획은 공동-소유 미국 특허 공개 번호 US20120089541A1 (그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 간략하게, 종양 세포를 c-Met 염색에 대해 스코어링하였다. 염색을 대조군 세포 펠릿에 비해 강한 (3+), 중간 정도의 (2+), 약한 (1+), 불분명한 (+/-) 또는 음성 (-) 염색 강도로 분류하면서 다양한 염색 강도를 IHC 분석을 위한 대조군 뿐만 아니라 스코어링 대조군으로 활용하였다. H441 (강한 c-met 염색 강도); A549 (중간 정도의 c-met 염색 강도); H1703 (약한 c-met 염색 강도), HEK-293 (293) (약한 c-met 염색 강도); 및 TOV-112D (음성 c-met 염색 강도) 또는 H1155 (음성 c-met 염색 강도)를 사용하였다. 염색 강도의 평가 뿐만 아니라, 다양한 염색 강도/패턴의 백분율을 이종 신호를 갖는 샘플에서 시각적으로 평가하였다.
간세포 성장 인자 (HGF) ELISA. 혈장을 전이성 흑색종 환자 투여전 사이클 1로부터 수득하고, 환자-유래 혈장에서의 HGF의 농도를 샌드위치 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)을 이용하여 정량적으로 측정하였다. 눈크 맥시소르프(NUNC MaxiSorp) 마이크로타이터 플레이트의 웰 (ON, 4℃)을 100 μL의 코팅 완충제 (0.05M 탄산나트륨 완충제, pH 9.6) 중 0.5 μg/mL의 친화도-정제된 염소 항인간 간세포 성장 인자 폴리클로날 항체로 코팅한 후에 검정 완충제 (PBS, 0.5% BSA, 0.05% P 20, 0.25% CHAPS, 0.35M NaCl, 5mM EDTA, 10 ppm 프로클린300(Proclin300), pH 7.4) 중 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA)으로 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 검정 완충제 중 희석된 인간 간세포 성장 인자 대조군 및 혈장 샘플 (100 μL)을 이중으로 로딩하고, 2시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후에 100 μL의 친화도-정제된 염소 항인간 간세포 성장 인자 비오틴 (150 ng/mL)을 추가의 1시간 동안 실온에서 첨가하였다. PBS 중 아비딘-접합된 양고추냉이 퍼옥시다제 (40 ng/mL), 0.5% BSA, 0.05% P 20, 10ppm 프로클린300, pH 7.4를 첨가하고 (1시간, 실온), 100 μL의 발색 기질 (TMB)을 15분 동안 첨가하여 반응물을 시각화하였다. 반응을 1M 인산으로 중단시키고, 450 nm에서의 흡광도를 630 nm에서 환원시켜 ELISA 플레이트 판독기로 측정하였다. 플레이트를 각각의 단계 후에 세척 완충제 (0.05% 트윈 20/ PBS)로 3회 세척하였다. 정량화에 대한 참조물로서, 인간 간세포 성장 인자의 연속 희석액 (CritRS CR67; 2000-15.625 pg/mL)에 의해 표준 곡선을 확립하였다.
이종이식 연구. 모든 절차를 제넨테크의 동물 실험 윤리 위원회(Institutional Animal care and Use Committee)에 의해 세워진 지침 및 원칙에 따라 수행하고, AAALAC (실험 동물 관리 평가 인증 협회: Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal care) 승인 시설에서 수행하였다. 10백만개의 928MEL 또는 624MEL BRAF 돌연변이체 흑색종 세포 (HBSS/매트리겔(Matrigel)에 현탁화됨 (예를 들어, 1:1 혼합물))를 CRL C.B-17 SCID.bg 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories))의 오른쪽 옆구리에 접종하였다. 종양이 200mm3의 평균 부피에 도달하였을 때, 마우스 (군당 10마리)를 대조군 항체 (항-gp120; 10mg/kg 1주에 1회; 복강내), 3D6 (항-MET 효능제 항체; 10mg/kg 1주에 1회; 복강내), RG7204 (PLX4032; 50mg/kg 1일에 2회, 안주위), GDC-0712 (MET 소분자 억제제, 100mg/kg 매일, 안주위)로 지시된 바와 같이 4주 동안 처리하였다. 종양을 디지털 캘리퍼 (프레드 브이. 파울러 캄파니, 인크.(Fred V. Fowler Company, Inc.))를 이용하여 1주에 2회 측정하였다. 종양 부피를 식 (Lx(WxW))/2를 이용하여 계산하였다. 본 실시예에서 부분 반응 (PR)은 종양 부피의 50% 초과 100% 미만의 감소로 정의하였다. 본 실시예에서 완전 반응 (CR)은 종양 부피의 100% 감소로 정의하였다. PLX4032-처리 및 PLX4032- 및 GDC-0712-처리 대조군 항체 군 사이의 차이를 2-원 ANOVA를 이용하여 결정하였다 (*=0.0008).
분비 인자 스크린. 재조합 정제된 분비 인자를 적절한 경우에 페프로테크 및 알 앤 디 시스템즈로부터 구입하고, PBS/0.1% BSA에서 재구성하였다. 분비 인자를 96 웰 플레이트에 1μg/mL의 농도로 전달하고, 이후에 약물이 없거나 5μM PLX4032를 함유하는 배지에서 100ng/mL로 희석하였다. 동등 부피의 희석된 인자 (최종 농도 50ng/mL)를 오아시스(Oasis) 액체 취급기를 이용하여 SK-MEL-28 세포로 미리 시딩된 (전날 웰당 500개의 세포를 시딩함) 384 웰 플레이트에 정렬하였다. 72시간 인큐베이션 후에, 세포 생존율을 셀 타이터 글로(Cell Titer Glo) (프로메가(Promega))를 이용하여 결정하였다.
통계. 세포 생존율 검정의 오차 막대를 평균 플러스 또는 마이너스 평균의 표준 오차(s.e.m.)로 나타내었다. 리간드와 수용체의 상관관계를 위해 구제를 2x2 분할표를 이용하여 다음의 군으로 수행하였다: 수용체 양성, RTK 리간드 구제됨; 수용체 양성, RTK 리간드 비-구제됨; 수용체 음성, RTK 리간드 구제됨; 수용체 음성, RTK 리간드 비-구제됨. 유의성을 양측 피셔 정확 확률 검정(Fisher Exact Probability Test)을 이용하여 결정하였다.
BRIM2 임상 샘플의 통계적 분석. HGF 수준을 로그-변환시키고, 콜모고로프-스미어르노프 검정을 이용하여 가우스 분포로부터 출발에 대해 생성된 분포를 시험하였다. 콕스-비례 모델을 이용하여 무진행 생존 (PFS) 및 전체 생존 (OS)과의 연관에 대해 로그-변환된 HGF 수준을 시험하였다. 반응 및 HGF 수준 사이의 연관을 윌콕슨(Wilcoxon) 순위합 검정을 이용하여 시험하였다. 카플란-마이어(Kaplan-Meier) (KM) 곡선을 이용하여 HGF 수준 및 시간-대-사건 결과 (PFS 및 OS) 사이의 관계를 보여주었다. 사건/환자의 수 및 사건까지의 중간 시간을 각각의 군에 대해 나타내었다. 연속적 HGF 수준의 함수로서의 결과의 콕스-비례 모델을 이용하여 위험 비 및 상응하는 p-값을 계산하였다.
결과
이전에 정의된 키나제 의존성을 갖는 41개의 상이한 인간 종양-유래 세포주를 사용하여7-9, 본 발명자들은 "매트릭스 분석"을 수행하여 약물 반응에 대한 6종의 상이한 RTK 리간드 (HGF, EGF, FGF, PDGF, NRG1, IGF) - 암 세포 및 종양 기질에서 광범위하게 발현되는 것으로 알려짐10 - 효과를 조사하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 각각의 리간드에 노출된 이들 암 세포주 (예를 들어, AU565 (HER2 amp))의, 다르게는 72시간 내에 그의 성장을 억제하는 키나제 억제제 (예를 들어, 라파티닙)의 IC50에 대한 효과를 정량화하였다 (도 1a). 다중 조직 유형으로부터 유래되고 고유의 키나제 의존성을 갖는 세포 (EGFR, HER2, BRAF, MET, ALK, PDGFR 및 FGFR)를 포함하는 시험된 거의 모든 키나제-의존성 암 세포주는 하나 이상의 RTK 리간드에 의한 약물-유도된 성장 억제로부터 구제될 수 있으며, 이는 키나제-중독된 종양 세포에서 선택적 키나제 억제제에 대한 반응에의 잠재적으로 광범위한 기여를 강조한다 (도 1b).
약물 반응에 대한 리간드 노출의 결과를 3개의 클래스로 분류할 수 있다 (도 1c); "구제 없음": 리간드의 첨가가 약물 반응에 검출가능하게 영향을 미치지 않았다; "부분 구제": 리간드가 치료 반응을 부분적으로 폐지하였다, 또는 "완전 구제": 리간드가 IC50 곡선을 >10-배 "오른쪽-이동"시키거나, 또는 약물 반응을 완전하게 억제하였다. HGF, FGF 및 NRG1에 이어 EGF가 약물 내성의 부여와 관련하여 가장 광범위하게 활성인 리간드인 반면에, IGF 및 PDGF는 그의 상응하는 수용체를 활성화시키는 능력에도 불구하고 상대적으로 적은 영향을 미쳤다 (도 5a 및 7a). 주목할만하게, 시험된 세포주 중 다수가 2종 또는 심지어는 3종의 상이한 리간드에 대한 노출에 의해 치료 감수성으로부터 구제될 수 있었으며, 이는 이러한 세포가 다양한 RTK 리간드에 대한 노출시에 과잉 생존 경로를 이용하는 명백한 능력을 강조한다. 유의하게는, 시험된 RTK 리간드 중 어느 것도 여러 시험된 세포주에서 화학요법 약물 시스플라틴의 성장 억제 효과로부터 세포를 구제할 수 없었으며, 이는 관찰된 리간드 구제 효과가 일반적으로 독성 작용제로부터의 광범위한 보호를 반영하지 않으며, 오히려 경로-특이적 신호 파괴에 제한된다는 것을 시사한다 (도 5b).
키나제 의존성으로부터 리간드-매개 구제와 연관된 신호전달 역학을 추가로 연구하기 위해, 본 발명자들은 통상적으로 RTK에 의해 연관되는 2개의 결정적인 하류 생존 신호전달 경로 - PI3K/AKT 및 MAPK/ERK 경로의 상태를 평가하였다11. 리간드-매개 구제가 달성된 경우에, RTK 리간드는 키나제 억제제의 존재에도 불구하고 이들 경로 중 적어도 하나를 효율적으로 "재활성화"시킬 수 있었다 (도 2a). 경로 재활성화는 중독 키나제의 자가인산화가 RTK 리간드 공동-처리 후에 억제된 채로 남아있었으므로 종양원성 키나제의 재활성화로 인한 것은 아니었다. 다양한 시험된 모델에서, HGF는 PI3K 및 MAPK 경로 둘 다를 재활성화시키고, IGF 및 NRG1는 오직 PI3K를 재활성화시키고, FGF 및 EGF는 오직 MAPK 경로를 재활성화시켰다.
"과잉 RTK"의 활성화 및 결과적인 하류 생존 신호전달은 라파티닙 및 HGF로 공동-처리된 AU565 세포에서 입증된 바와 같이 적어도 48시간 동안 지속되었다 (도 9b). PI3K 및 MAPK 경로 둘 다의 재활성화를 위한 "첨가제" 역할이 NRG1, FGF 또는 조합의 존재 하에 라파티닙-처리된 AU565 세포에서 관찰되었다 (도 14a). 그러나, 특히 PI3K 경로의 억제 (MAPK는 아님)는 HGF-촉진된 약물 내성을 감쇠시켰으며, 이는 양쪽 생존 경로의 동원과 연관되었다 (도 14b).
예상한 바와 같이, 세포 생존 및 경로 신호전달의 관찰된 RTK 리간드-유도된 구제가 2차 활성화된 키나제의 공동-표적화에 의해 전도될 수 있으며, 이는 유효한 리간드가 그의 동족 RTK를 통해 작용한다는 것을 확인한다 (도 2b, c, 도 5c, d, 도 22). 유의하게는, 다양한 시험된 모델에서 리간드-유도 구제를 매개하는 "2차" RTK의 억제제는 이들 세포주에서 단일 작용제 치료제로서 거의 없거나 전혀 없는 효과를 나타내었으며, 이는 키나제-중독된 세포가 처음에는 이용가능한 리간드의 부재 하에 다중 상이한 RTK에 의존하지 않는다는 것을 나타낸다. 유사하게, RTK 리간드 자극은 키나제 억제제의 부재 하에 세포 증식에 대해 거의 없는 또는 전혀 없는 효과를 나타내었다 (도 1c 및 2b).
세포주 패널에 걸친 기준선 RTK 발현의 분석은 이들 키나제-의존성 암 세포 모두가 다중 RTK를 발현한다는 것을 확인하였으며, 이는 다수의 암 세포가 "프라이밍"되어 세포외 리간드로부터 생존 신호를 받는다는 것을 시사한다. 주목할만하게, 리간드-유도된 구제는 일부 경우 (예를 들어, MET/HGF, EGFR/EGF 및 HER3/NRG1)에 특정 RTK의 발현과 잘 상관되었으며 (p<0.01; 도 6), 이는 치료 전의 종양의 RTK 프로파일이 종양 미세환경에서 상응하는 리간드의 이용가능성에 따라 암 세포 생존에 기여할 수 있는 2개 이상의 키나제의 공동-표적화에 대한 필요에 선행하는 최적의 치료 전략을 알려줄 수 있음을 시사한다.
일부 경우에, 리간드는 리간드-연관 RTK의 발현에도 불구하고 약물 감수성으로부터 세포를 구제할 수 없었다. 본 발명자들은 이러한 맥락에서 리간드-유도된 구제의 실패와 연관된 2가지 상이한 생화학적 시나리오를 확인하였다 (도 7). 몇몇 경우에, RTK 리간드는 RTK 인산화에 의해 증명된 바와 같이 그의 수용체를 활성화시킬 수 있었으나; PI3K 또는 MAPK를 통한 결과적인 하류 신호전달이 관찰되지는 않았다. 이는 예를 들어 IGF로의 처리시에 COLO-201 및 BT474 세포주에서 나타났다 (도 7a). 다른 경우에, RTK 리간드는 그의 수용체 뿐만 아니라 적어도 하나의 하류 생존 이펙터를 활성화시켰으나; 키나제 억제로부터 세포를 구제하기에는 충분하지 않았다. 이는 예를 들어 HGF에 대한 노출시에 H2228 및 H358 세포에서 또는 NRG1에 대한 노출시에 COLO-201 세포에서 관찰되었다 (도 7b). 그러나, H2228 및 H358 세포는 장기 처리 후에 HGF에 의해 "구제"되며, 이는 아마도 하기 상술된 바와 같이 HGF에 반응할 수 있고 억제 키나제의 존재 하에 시간 경과에 따라 선택될 수 있는 세포의 하위집단의 존재를 시사할 것이다 (도 8c, d).
세포주 분석은 잠재적으로 중요한 임상적 암시를 갖는 여러 발견을 제공하였다. 예를 들어, ALK-연관된 염색체 전위 (NCI-H3122)를 보유하고 ALK 키나제 중독을 나타내는 2개의 시험된 NSCLC 세포주 중 1개는 HGF에 대한 짧은 노출에 의해 ALK 억제로부터 효율적으로 구제될 수 있다 (도 8). 이들 세포에서, HGF 수용체 MET가 발현된 경우에, HGF는 심지어는 ALK-선택적 억제제 TAE684의 존재 하에서도 ERK 및 AKT 활성화를 촉진한다. 그러나, 유의하게는, 이들 세포의 생존이 심지어는 HGF의 존재 하에 최근에 ALK-전위된 NSCLC에서 인상적인 임상적 활성이 입증된 이중 ALK/MET 키나제 억제제인 크리조티닙으로의 처리에 의해 효율적으로 억제되었다12. 이들 세포가 HGF에 반응하는 관찰된 능력에 미루어 보아, 다수의 ALK-전위된 NSCLC 환자에서 관찰된 상대적으로 오래 지속되는 임상 반응은 부분적으로 ALK- 및 MET-매개 생존 신호를 둘 다 효과적으로 억제할 수 있는 크리조티닙의 이중 억제 특성에 기인할 수 있다. 흥미롭게는, 제2 ALK-전위된 NSCLC 세포주, NCI-H2228이 또한 검출가능한 MET를 발현하지만, 시험된 72시간 시점에서 HGF에 의해 ALK 억제로부터 구제되지 않았다. 그러나, HGF 처리는 TAE684의 존재 하에 AKT 및 ERK 활성을 재활성화시킬 수 있었으며 (도 7b), HGF의 존재 하의 장기 TAE684 처리는 이들 세포에서 TAE684에 대해 획득된 내성을 방지하였다 (도 8c). 이러한 발견은 이전에 기재된 기존의 MET-발현 종양 세포 하위집단이 일부 EGFR 돌연변이체 NSCLC 환자에 존재함이 밝혀졌음을 연상시킨다13.
HGF가 9개의 시험된 HER2-증폭된 유방암 세포주 중 3개를 HER2 키나제 억제제 라파티닙에 의한 성장 억제로부터 구제하는 능력은 또한 예상하지 못한 것이었다 (도 3a). 이들 3개의 세포주는 모두 MET를 발현하고, 발현은 HGF가 라파티닙 반응을 감쇠시키는 능력과 잘 상관된다 (도 3b). NCI-H228 세포주에서와 같이, 부분적으로 HGF-구제된 AU565 MET-발현 세포의 장기 공동-처리 (12일)는 HGF가 아마도 MET-발현 세포의 하위집단의 선택을 유도함으로써 라파티닙에 대한 내성을 빠르게 촉진하였음을 나타내었다 (도 3c, 9b). 실제로, AU565 세포의 9-일 라파티닙 및 HGF 공동-처리는 증가된 MET 발현을 갖는 세포의 집단을 생성하였으며, 이는 이 MET-발현 세포의 하위집단에 대해 선택된 HGF 노출을 시사한다 (도 3f). 생화학적 분석은 HGF가 특히 MET-양성 세포에서 PI3K 및 MAPK 신호전달 경로를 재활성화시켰으나, MET-음성 세포에서는 그렇지 않다는 것을 나타내었다 (도 3d).
다음에 본 발명자들은 HER2-양성 원발성 유방 종양이 MET 단백질을 검출가능하게 발현하는지를 결정하였다 (도 3e). 분석된 10개의 샘플 중에서, 1개의 샘플이 종양 세포 중 ~30%에서 중간 정도의 및 높은 MET 발현을 나타내었고, 5개의 샘플이 종양 세포 중 대략 10%에서 MET 발현을 나타내었다. 1개의 HER2 증폭된 유방암 세포주 (HCC1954)가 외인성 HGF의 부재 하에 상승된 포스포-MET를 나타내었으며, 이는 자가분비 메카니즘을 시사하고 (도 3b), 이들 세포에서 MET 키나제 억제는 라파티닙 내성의 출현을 나타내었다 (도 3g). 총괄적으로, 이들 결과는 MET-발현 HER2-양성 유방 종양이 "프라이밍된" 종양 세포의 하위집단에 MET를 관여시킴으로써 HER2 키나제 억제를 잠재적으로 피할 수 있어 표적화된 요법에 대한 내성을 발생시키고, MET 의존성으로의 이러한 전환이 HGF의 이용가능성에 의해 유도될 수 있음을 시사한다. 이러한 가능성과 일치하게, SKBR3 및 AU565 세포가 동일한 환자로부터 유래되었으며, 이는 아마도 환자 종양 내의 MET 발현의 이질성을 강조할 것이다. 본 발명자들은 또한 9개의 시험된 HER2-증폭된 유방 세포주 중 8개가 HER3 리간드 NRG1에 대한 노출에 의해 라파티닙 감수성으로부터 구제될 수 있다는 것을 발견하였으며, 이는 HER2-표적화된 처리에 대한 가변성 반응에서 종양 미세환경에서의 NRG1 발현에 대한 잠재적으로 중요한 역할을 시사한다 (도 23).
즉각적인 잠재적 임상적 암시를 갖는 또 다른 관찰은 HGF 노출이 여러 시험된 BRAF 돌연변이체 PLX4032-감수성 흑색종 및 결장직장 세포주에서 BRAF 키나제 억제제 PLX4032에 대한 반응을 유의하게 감쇠시킨다는 예상하지 못한 발견이었다. PLX4032는 최근에 BRAF 돌연변이체 흑색종에서 현저한 임상 효능을 입증하여, 최근에 임상적 용도를 위해 승인받았다14.
HGF 이외의 성장 인자 및 다른 시토카인이 PLX4032 감수성에 유사하게 영향을 미치는 잠재적 역할을 결정하기 위해, 본 발명자들은 446개의 상이한 재조합 정제된 분비 인자 각각의 존재 하에 PLX4032에 대한 SK-MEL-28 세포의 감수성을 비교하였다. 이러한 분석은 HGF를 포함하는 매우 적은 수의 인자가 PLX4032 감수성을 감쇠시킬 수 있음을 밝혀냈다 (도 17).
본 발명자들은 PLX4032에 대한 반응에서 HGF-MET 신호전달의 잠재적으로 보다 광범위한 역할을 탐구하기 위해 추가의 12개의 BRAF 돌연변이체 흑색종 세포주를 조사하였다 (도 4a). HGF는 12개의 세포주 중 5개에서 PLX4032 감수성을 유의하게 감쇠시켰다. 10개의 HGF-구제된 세포주 중 8개는 검출가능한 MET 발현을 나타내는 반면, MET는 비-구제된 세포에서 전혀 검출가능하지 않거나 또는 거의 검출가능하지 않았다. 주목할만하게 MET 발현은 HGF-구제가능한 세포주에서 PLX4032 감수성과 역으로 상관되었고, HGF는 HGF에 의해 구제된 세포주에서 MAPK 신호전달을 재활성화시킬 수 있었으나, MET-음성 HGF-비-구제된 세포에서는 그렇지 않았다 (도 4b). 예상되는 바와 같이, HGF에 의한 생존 구제는 MET가 크리조티닙에 의해 억제된 경우에 전도되었다 (도 4b 및 도 9a). 1개의 BRAF 돌연변이체 세포주 (624MEL)는 자가분비 메카니즘과 일치하게 외인성 HGF의 부재 하에 상승된 포스포-MET를 나타내었고 (도 4a), 이들 세포에서의 MET 키나제 억제는 PLX4032 내성의 출현을 지연시켰다 (도 4c).
크리조티닙 공동-처리는 또한 검출불가능한 포스포-MET를 갖는 2개의 세포주 (A375 및 928MEL)에서 PLX4032에 대한 내성을 방지하였으며, 이는 추가로 PLX4032에 대한 내성을 매개하는데 있어 HGF-활성화된 MET에 대한 잠재적 역할을 지지한다 (도 18).
생체내 BRAF 억제에 대한 내성에서 HGF-MET 신호전달에 대한 잠재적 역할을 검증하기 위해, 본 발명자들은 BRAF 돌연변이체 928MEL 흑색종 세포를 사용하여 이종이식편 연구를 수행하였다. 유의하게는, 효능작용 항체 3D6을 사용한 이들 종양에서의 MET의 활성화가 PLX4032의 성장-억제 효과를 폐지하였다 (도 4d). PLX4032에 대한 반응을 감쇠시키는데 있어 3D6에 의한 MET 활성화의 관련성은 MET 소분자 키나제 억제제로의 공동-처리에 의해 입증되었다. 총괄적으로, 이러한 결과는 MET 키나제가 HGF 활성화를 통해 BRAF 돌연변이체 흑색종의 하위세트에서 PLX4032에 대한 임상 반응에 기여할 수 있음을 시사한다.
전체 발견은 대부분의 종양 세포에서 공동-발현될 수 있는 RTK 사이의 신호 혼선의 광범위한 특성 및 암 치료제로서의 선택적 키나제 억제제에 대한 선천적 및 후천적 내성에 기여하는데 있어 RTK 리간드의 잠재적으로 광범위한 역할을 강조한다. 이러한 리간드는 종양 세포 그 자체에 의해 생산되어 자가분비 생존 메카니즘을 유도할 수 있거나 또는 종양 기질에 의해 생산되어 생존 신호전달에 대한 주변분비 효과를 통해 종양 세포에서 약물 반응에 영향을 미칠 수 있다15,16.
인간 종양의 점진적으로 평가된 이질성은 약물 내성 메카니즘의 설명을 상당히 복잡하게 한다17-19. RTK 리간드에 대한 잠재적으로 광범위한 역할을 강조하는 본 발명자들의 발견의 맥락에서, 본 발명자들은 이러한 이질성이 획득된 내성에 기여할 수 있는 특징적인 메카니즘을 상상한다. 따라서, 종양 세포의 하위집단이 생존-촉진 RTK 리간드에 반응할 수 있는 요법 전에 존재하고, 이러한 리간드가 종양 미세환경 내에서 이용하게 되는 경우에 이 하위집단이 약물 치료의 선택적 압력을 통해 확산되는 것이 가능하다. 실제로, BRAF 돌연변이체 흑색종 세포에서 MET 발현의 IHC 분석은 세포의 이질성 집단을 나타내었다 (도 21). EGFR 돌연변이체 NSCLC의 경우에, MET-유도 종양 세포의 하위집단은 EGFR 키나제 억제제를 사용하는 치료 동안 HGF에 대한 노출시에 출현할 수 있다13. 주목할만하게, 다중 RTK의 활성화가 교모세포종에서 보고되었고, 생존촉진 신호의 억제 및 세포 사멸은 오직 다중 활성화된 수용체의 공동-표적화 후에 관찰되었다 (문헌 [Stommel, J. M. et al. Science 318, 287-290, doi:10.1126/science.1142946 (2007)]). 또한, 종양 세포의 하위집단이 RTK 리간드를 생산하는 능력을 획득함으로써 선택되는 것이 가능하다. 선택적 키나제 억제제에 대한 획득된 내성의 다양한 임상전 모델에서, 관찰된 내성 메카니즘은 새로운 RTK 의존성으로의 "전환"이 관여하며20-25, 이는 일부 경우에 RTK 리간드의 생산의 증가에 기인할 수 있다. 이러한 증가된 리간드 생산은 잠재적으로 돌연변이 또는 후성적 메카니즘에 의해 달성될 수 있다. 게놈 바이오마커, 예컨대 BRAF 및 EGFR 돌연변이는 요법으로부터 이익을 얻을 가능성이 가장 큰 환자를 확인하는데 결정적인 반면, 반응의 정도 및 지속기간 둘 다와 관련하여 이러한 환자 사이에 키나제 억제 약물에 대한 아직 설명되지 않은 광범위한 초기 임상 반응이 존재한다12,14. 종양 세포에 의해 분비되거나, 종양 미세환경에서 발현되거나 또는 심지어는 전신에 제공된 RTK 리간드의 잠재적 역할은 지금까지 널리 탐구되지 않았다. 종양-유래 세포주는 돌연변이-정의된 하위세트에서 선택적 키나제 억제제에 대한 유전자형-연관 감수성을 포획하기 위한 강건한 모델로 입증되었으므로7,8, 이러한 매트릭스 분석으로부터의 발견은 이러한 요법으로부터의 전체 임상적 이익에서 RTK 리간드에 대한 잠재적으로 광범위한 역할을 지지하고, RTK 및 이들의 연관된 리간드의 발현에 기초한 바이오마커의 사용에 대한 토대를 제공하여 다수의 광범위하게 발현된 RTK에 공통적인 핵심 이펙터를 통한 과잉 생존 신호전달과 연관된 선천적 및 후천적 내성 메카니즘 둘 다를 예상하는 치료 전략을 알려준다.
실시예 2 BRAF V600E를 갖는 세포에서 다양한 PTK 리간드의 구제 결과
본원에 이용된 방법은 실시예 1에 기재된 것과 유사하다. 본 발명자들은 BRAF V600E를 갖는 세포에서 약물 반응 (PLX4032)에 대한 6종의 상이한 RTK 리간드 (HGF, EGF, FGF, PDGF, NRG1, IGF)의 효과를 조사하였다. 도 10은 PLX4032로 처리된 세포에서 다양한 PTK 리간드에 의한 구제 결과를 보여준다.
실시예 3 라파티닙 내성의 지연에 있어 MET 키나제 억제의 효과
본원에 이용된 방법은 실시예 1에 기재된 것과 유사하다. HCC 1954 세포에서 라파티닙 내성의 지연에 대한 MET 키나제 억제의 효과를 조사하였다. HCC1954 HER2 증폭된 유방암 세포를 라파티닙 (5μM) 및/또는 크리조티닙 (1μM)으로 처리하고, Syto 60으로 염색하였다. 도 11은 HCC1954 세포에서 MET 키나제 억제가 라파티닙 내성의 출현을 지연시켰다는 것을 보여준다.
실시예 4 PLX4032에 대한 세포 반응에서 HGF-MET 신호전달의 역할
본원에 이용된 방법은 실시예 1에 기재된 것과 유사하다. 본 발명자들은 PLX4032에 대한 세포 반응에서 HGF-MET 신호전달의 역할을 조사하였다. 본 발명자들은 HGF가 HGF에 의해 구제된 세포주에서 MAPK 신호전달을 재활성화시킬 수 있었으나, MET-음성 HGF-비-구제된 세포에서는 그렇지 않다는 것을 관찰하였다 (도 4a, 12a). 생체내 BRAF 억제에 대한 내성에서 HGF-MET 신호전달의 잠재적 역할을 검증하기 위해, 본 발명자들은 BRAF 돌연변이체 928MEL 및 624MEL 흑색종 세포로 이종이식 연구를 수행하였다. 유의하게, MET-효능제 항체 3D6을 사용한 이들 종양에서의 MET의 활성화는 PLX4032의 성장-억제 효과를 강하게 제거하였다 (도 12b). PLX4032에 대한 감쇠 반응에서 3D6에 의한 MET 활성화의 관련성을 MET 소분자 키나제 억제제와의 공동-처리에 의해 검증하였다. 시험관내 발견과 유사하게, 본 발명자들은 MET 키나제 활성의 억제가 PLX4032-처리된 이종이식편에서 종양 퇴행에 대해 보다 큰 효과를 갖는다는 것을 관찰하였으며, 보다 많은 부분 반응이 관찰되었다 (928MEL: 1 vs 8; 도 12b 및 도 19). 총괄적으로, 이들 결과는 MET 키나제가 HGF 활성화를 통해 BRAF 돌연변이체 흑색종의 하위세트에서 PLX4032에 대한 임상 반응에 기여할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 5 임상적 맥락에서 HGF-MET 신호전달에 대한 역할
본원에 이용된 방법은 실시예 1에 기재된 것과 유사하다. 임상적 맥락에서 HGF-MET 신호전달을 위한 잠재적 역할을 조사하기 위해, 본 발명자들은 BRAF 돌연변이체 흑색종 환자의 순환 HGF가 임상 결과에 기여할 수 있다는 가설을 시험하였다. 따라서, 사전-처리 혈장 HGF 수준을 BRIM2 임상 시험에 등록한 132명의 전이성 흑색종 환자 중 126명 (PLX4032로 처리된 BRAF 돌연변이체 전이성 흑색종 환자)으로부터 측정하였다. HGF 수준은 33 pg/mL 내지 7200 pg/mL의 범위였으며 중간 수준은 334 pg/mL였다 (도 20). 중간보다 높은 HGF 수준을 갖는 PLX4032-처리된 환자는 중간보다 낮은 HGF 수준을 갖는 환자보다 실질적으로 감소된 무진행 생존 (p=0.005) 및 전체 생존 (p<0.001)을 입증하였다 (도 13). 증가된 HGF는 무진행 생존 (PFS, 위험 비는 1.42이고, p<0.005) 및 전체 생존 (OS, 위험 비는 1.8이고, p<0.001)에 의해 측정된 바와 같이 악화된 결과와 연관된다. 환자를 삼분위로 분리하는 것은 역치 효과보다는 HGF 수준 및 결과 사이의 연속적 관계를 밝혀내었다 (도 24b). 이들 연구는 HGF-MET 신호전달을 질환 진행 및 전체 생존에, 가능하게는 BRAF 억제에 대한 임상 반응을 BRAF 돌연변이체 흑색종에 연관시킨다.
실시예 6 세포에서 리간드-유도된 구제
본원에 이용된 방법은 실시예 1에 기재된 것과 유사하다. 본 발명자들은 세포에서 RTK의 발현 및 리간드-유도된 구제를 분석하였다. 결과는 도 15에 제시된다. 리간드-유도된 구제는 일부 경우에 (예를 들어, MET/HGF, EGFR/EGF 및 HER3/NRG1) 특정 RTK의 발현과 잘 상관되었으며 (p<0.01; 도 15), 이는 처리 전의 종양의 RTK 프로파일이 종양 미세환경에서 상응하는 리간드의 유용성에 따라 암 세포 생존에 기여할 수 있는 2개 이상의 키나제를 공동-표적화할 필요를 예상하는 최적의 치료 전략을 알려줄 수 있음을 시사한다.
실시예 7 TAE684에 대해 획득된 내성을 방지하는데 있어서의 HGF의 효과
본원에 이용된 방법은 실시예 1에 기재된 것과 유사하다. 본 발명자들은 TAE 684로 처리된 H2228 세포에서 HGF의 효과를 조사하였다. 도 16은 HGF의 존재 하의 장기 TAE684 처리가 이들 세포에서 TAE684에 대해 획득된 내성을 방지하였다는 것을 보여준다.
부분 참고문헌 목록
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
상기 발명은 이해를 명확하게 하고자 하는 목적으로 예시 및 실시예로서 어느 정도 상세하게 기재되었지만, 상기 설명 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그의 전체내용이 명백하게 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. ET AL. <120> COMBINATION TREATMENTS COMPRISING C-MET ANTAGONISTS AND B-RAF ANTAGONISTS <130> P4736R1-WO <140> <141> <150> 61/641,139 <151> 2012-05-01 <150> 61/598,783 <151> 2012-02-14 <150> 61/551,328 <151> 2011-10-25 <150> 61/536,436 <151> 2011-09-19 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Leu His 1 5 10 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Asn Phe 1 5 10 15 Lys Asp <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Ala Thr Tyr Arg Ser Tyr Val Thr Pro Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> 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Lys 225

Claims (43)

  1. 유효량의 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 암을 갖는 환자를 치료하는 방법.
  2. 유효량의 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 투여하는 것을 포함하는, B-raf 길항제에 대한 내성이 발생할 증가된 가능성을 갖는 암 환자를 치료하는 방법.
  3. 암 환자에게 유효량의 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 투여하는 것을 포함하는, B-raf 길항제에 대한 감수성을 증가시키고/거나 회복시키는 방법.
  4. 암 환자에게 유효량의 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 투여하는 것을 포함하는, B-raf 길항제 감수성의 기간을 연장시키는 방법.
  5. 유효량의 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 투여하는 것을 포함하는, B-raf 길항제 내성 암을 갖는 환자를 치료하는 방법.
  6. 유효량의 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 투여하는 것을 포함하는, B-raf 길항제에 대한 반응의 지속기간을 연장시키는 방법.
  7. 유효량의 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 HGF-매개 B-raf 길항제 내성 암의 발생을 지연시키거나 예방하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 환자의 암이 B-raf 바이오마커를 발현하는 것으로 나타난 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, B-raf 바이오마커가 B-raf V600인 방법.
  10. 제8항에 있어서, B-raf 바이오마커가 B-raf V600E인 방법.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 환자의 암에서의 돌연변이체 B-raf 바이오마커 발현을 (a) 샘플 상에서 유전자 발현 프로파일링, PCR 혼성화 검정, 계내 혼성화, 5' 뉴클레아제 검정 돌연변이 검출 검정, RNA-seq, 마이크로어레이 분석, SAGE, 매스어레이(MassARRAY) 기술 또는 FISH 중 하나 이상을 수행하는 것 및 (b) 샘플에서 돌연변이체 B-raf 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 결정하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 환자의 암에서의 돌연변이체 B-raf 바이오마커 발현을 (a) 환자 암 샘플로부터 추출된 게놈 DNA 상에서 PCR을 수행하는 것 및 (b) 샘플에서 돌연변이체 B-raf 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 결정하는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 환자의 암이 c-met 바이오마커를 발현하는 것으로 나타난 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, c-met 바이오마커가 폴리펩티드인 방법.
  15. 제14항에 있어서, c-met 바이오마커 발현을 면역조직화학 (IHC)을 이용하여 결정하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, c-met 바이오마커 발현을 간세포 성장 인자 (HGF)의 발현을 결정함으로써 결정하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, HGF가 종양 또는 종양 기질에서 발현되는 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, HGF 발현을 환자의 혈청에서 결정하는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, c-met 길항제가 길항제 항-c-met 항체인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, c-met 길항제가 오나르투주맙, 크리조티닙, 티반티닙, 카르보잔티닙, MGCD-265, 피클라투주맙, 인간화 TAK-701, 릴로투무맙, 포레티닙, h224G11, DN-30, MK-2461, E7050, MK-8033, PF-4217903, AMG208, JNJ-38877605, EMD1204831, INC-280, LY-2801653, SGX-126, RP1040, LY2801653, BAY-853474 및/또는 LA480 중 하나 이상인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, B-raf 길항제가 소라페닙, PLX4720, PLX-3603, GSK2118436, GDC-0879, N-(3-(5-(4-클로로페닐)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-카르보닐)-2,4-디플루오로페닐)프로판-1-술폰아미드, 베무라페닙, GSK 2118436, RAF265 (노파르티스(Novartis)), XL281, ARQ736, BAY73-4506 중 하나 이상인 방법.
  22. 제21항에 있어서, B-raf 길항제가 베무라페닙인 방법.
  23. 제21항에 있어서, B-raf 길항제가 GSK 2118436인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 동시에 투여하는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 순차적으로 투여하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, B-raf 길항제를 c-met 길항제 전에 투여하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, c-met 길항제를 B-raf 길항제 전에 투여하는 것인 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 하나 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 흑색종, 결장직장암, 난소암, 유방암 또는 유두상 갑상선암인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 암이 B-raf V600을 발현하는 것으로 나타난 흑색종인 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 B-raf 길항제에 대해 내성인 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 이전에 B-raf 길항제를 사용하여 치료받은 적이 없는 것인 방법.
  33. 환자의 암이 c-met 바이오마커를 발현하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 c-met 바이오마커 발현은 환자가 B-raf 길항제에 대한 환자의 암의 감수성을 증가시키고/거나, B-raf 길항제에 대한 환자의 암의 감수성을 회복시키고/거나, B-raf 길항제에 대한 환자의 암의 감수성의 기간을 연장시키고/거나 환자의 암에서 HGF-매개 B-raf 길항제 내성의 발생을 예방하기 위한, c-met 길항제 및 B-raf 길항제를 사용하는 치료에 대한 후보임을 나타내는 것인, c-met 바이오마커 발현을 결정하는 방법.
  34. (a) 환자의 암이 c-met 바이오마커를 발현하는지를 결정하는 것; 및 (b) 환자를 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 사용하는 치료에 대한 후보로 확인하는 것을 포함하는, 환자를 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 사용하는 치료에 대한 후보로 확인하는 방법.
  35. (a) 환자의 암이 c-met 바이오마커를 발현하는지를 결정하는 것; 및 (b) 환자를 B-raf 길항제에 대한 내성이 발생할 위험이 있는 것으로 확인하는 것을 포함하는, 환자를 B-raf 길항제에 대한 내성이 발생할 위험이 있는 것으로 확인하는 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 단계 (a) 및 (b) 이후에, 환자를 유효량의 c-met 길항제 및 B-raf 길항제를 사용하여 치료하는 것인 방법.
  37. 환자로부터 수득한 샘플에서 c-met 바이오마커 및/또는 B-raf 바이오마커의 존재를 면역검정, elisa, 혼성화 검정, PCR, 5' 뉴클레아제 검정, IHC 및/또는 RT-PCR에 의해 결정하는 것 및 B-raf 길항제를 사용하는 치료를 위한 환자를 선택하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 치료하기 위한 B-raf 길항제의 치료 효능을 결정하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, c-met 길항제를 사용하는 치료를 위한 환자를 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 유효량의 B-raf 길항제 및 c-met 길항제를 사용하여 환자를 치료하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  40. 흑색종 환자로부터의 샘플에서 c-met 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 c-met 바이오마커는 HGF이고, HGF의 발현은 대상체에서 암에 대한 예후인 것인, 흑색종 환자에 대한 예후를 결정하는 방법.
  41. c-met 길항제 및 B-raf 길항제를 포함하는 키트.
  42. 제41항에 있어서, 흑색종 환자에게 유효량의 c-met 길항제 및 B-raf 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 흑색종 환자를 치료하는 방법에 대한 지침서를 추가로 포함하는 키트.
  43. 제약상 허용되는 담체 중 c-met 길항제, 및 c-met 길항제가 B-raf 바이오마커의 발현에 기초하여 흑색종을 갖는 환자를 치료하기 위한 것임을 나타내는 포장 삽입물을 함께 포장하여 포함하며, 여기서 치료는 B-raf 길항제와 조합되는 것인 제조품.
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