KR20130113036A

KR20130113036A - 신규 바실러스 서브틸리스

Info

Publication number: KR20130113036A
Application number: KR1020120035288A
Authority: KR
Inventors: 백승희; 양시용; 우서형; 서효실
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2012-04-05
Filing date: 2012-04-05
Publication date: 2013-10-15
Also published as: KR101370941B1; JP2015521029A; MY173464A; PH12014502242B1; PH12014502242A1; WO2013151361A1; JP5872104B2

Abstract

본원 발명은 신규한 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis) CJMPB150(KCCM11268P) 균주 및 이를 포함하는 프로바이오틱스 제제에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본원 발명은 셀룰라아제, 자일라나아제, 만난아제, 아밀라아제, 프로테아제, 리파아제를 동시에 분비하는 복합 소화 효소 생산능이 우수하여 난소화성 탄수화물 분해능이 뛰어나고, 고온의 조건에서 내생 포자 형성율이 높아 내열성이 뛰어남은 물론, 내산성 및 내담즙성이 뛰어나 가축의 소화 기관 내 생존율이 높은, 바실러스 서브틸리스 CJMPB150(KCCM11268P) 균주 및 이를 포함하는 프로바이오틱스 제제에 관한 것이다.

Description

신규 바실러스 서브틸리스{Novel Bacillus subtilis}

본원 발명은 신규 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis) CJMPB150(KCCM11268P) 균주 및 이를 포함하는 프로바이오틱스 제제에 관한 것이다.

최근 바이오 연료 생산 및 신흥국의 경제 성장에 의한 곡물 수요 증가, 농경지 감소, 원유 가격 급등 등으로 국제 곡물 가격이 상승하고 있는 추세이다. 국제 곡물 가격의 상승은 국내 배합 사료 가격의 상승으로 이어져 축산 농가의 경영에 큰 타격을 주고 있다. 이와 같은 이유로 가축의 성장 촉진과 사료 곡물의 효율적인 이용을 위하여 프로바이오틱스(Probiotics), 프리바이오틱스(Prebiotics), 효소제 등에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

일반적으로 사료 곡물에는 난소화성 탄수화물, 즉 셀룰로오스(Cellulose), 헤미셀룰로오스(Hemicelluloses) 및 리그닌(Lignin)이 다수 함유되어 있다. 난소화성 탄수화물은 소화 기관의 기능을 변형시킴으로써 소화를 억제하고 가축에 연변이나 적리 현상을 일으킨다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 난소화성 탄수화물의 분해를 목적으로 한 다양한 사료용 효소제가 널리 사용되고 있다.

셀룰로오스를 가수분해할 수 있는 셀룰라아제(Cellulase), 헤미셀룰로오스의 주요 구성 성분인 자일란(Xylan)과 이와 결합된 리그닌을 분해하는 자일라나아제(Xylanase)는 사료 첨가용 효소로서 널리 사용되고 있으며, 곡물 사료의 가축의 장내 이용성을 높임으로써 사료 효율을 향상시킬 뿐만 아니라(Beguin and Aubert, FEMS Microbiol. Rev. 13:25-58, 1994), 축산 분뇨의 퇴비화 촉진에도 기여하는 것으로 알려져 있다(김태일 등, 한국미생물학회지. 35(4):277-282, 1999).

만난아제(Mannanase)는 헤미셀룰로오스를 구성하는 주요 성분인 만난(Mannan) 함유 물질을 분해하는 효소이다. 대두 단백질은 돼지, 닭 등의 가축 사료로 사용되는데, 만난아제는 대두박의 에너지원이 되는 탄수화물 중 갈락탄(Galactan)을 분해하여 단위동물이 쉽게 대사할 수 있도록 한다.

최근 상기와 같은 효소를 생산하는 균주를 활용하여 프로바이오틱스로 사용하려는 노력이 진행중에 있다.

프로바이오틱스란, 장내 미생물 균형에 도움을 주는 미생물, 항균 활성 및/또는 효소 활성을 갖는 미생물과 이들이 생산해 내는 생산물을 포함하는 개념이다(Fuller, R. J Appl Bacteriol. 66(5):365-378, 1989).

이러한 프로바이오틱스에 관한 선행 기술로는 다음과 같은 것들이 있다.

대한민국 등록특허 제10-0318554호는 중성 셀룰라아제를 생산하는 바실러스속(Bacillus. Sp) 79-23 균주를 개시하고 있으며, 대한민국 등록특허 제10-1062309호는 셀룰라아제 및 자일라나아제를 분비하는 바실러스 리케니포르미스 DK42(Bacillus licheniformis DK42) 균주 KACC 91410P를 개시하고 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제 10-0426930호는 아밀라아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 리파아제 효소 활성을 갖는 바실러스 아밀로리키페이시엔스 B4(Bacillus amyloliquefaciens B4) 균주 KCTC 18083P를 개시하고 있다.

그러나, 이와 같은 선행 기술들은 셀룰라아제 및/또는 자일라나아제를 분비하는 바실러스 종을 개시하고 있을 뿐, 셀룰라아제, 자일라나아제 및 만난아제 3종을 모두 복합적으로 분비하는 균주 및 이를 활용한 프로바이오틱스 제제에 관한 기술은 보고된 바가 없다.

대한민국등록특허공보 B1 제10-0318554호(2002.10.25.공고) 대한민국등록특허공보 B1 제10-1062309호(2011.09.06.공고) 대한민국등록특허공보 B1 제10-0426930호(2004.04.13.공고)

Beguin and Aubert, FEMS Microbiol. Rev. 13:25-58, 1994 김태일 등., 한국미생물학회지. 35(4):277-282, 1999 Fuller, R. J Appl Bacteriol. 66(5):365-378, 1989

본원 발명은 복합 소화 효소 생산능, 내산성 및 내담즙성이 우수한 바실러스 서브틸리스 CJMPB150(KCCM11268P) 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본원 발명은 바실러스 서브틸리스 CJMPB150(KCCM11268P) 균주의 배양물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본원 발명은 상기의 바실러스 서브틸리스 CJMPB150(KCCM11268P) 균주 또는 그 배양물을 포함하는, 프로바이오틱스 제제, 사료 첨가제 및 사료를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본원 발명의 일 양태는, 복합 소화 효소 생산능, 내산성 및 내담즙성이 우수한 신규 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis) CJMPB150(KCCM11268P) 균주를 제공한다.

본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 바실러스 서브틸리스 CJMPB150(KCCM11268P) 균주의 배양물을 제공한다.

본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 바실러스 서브틸리스 CJMPB150(KCCM11268P) 균주 또는 상기 균주의 배양물을 포함하는, 프로바이오틱스(Probiotics) 제제를 제공한다.

본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 프로바이오틱스 제제를 포함하는, 사료 첨가제를 제공한다.

본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 사료 첨가제를 포함하는 사료를 제공한다.

본원 발명은 복합 소화 효소 생산능, 내산성 및 내담즙성이 우수한 신규 바실러스 서브틸리스 CJMPB150(KCCM11268P) 균주 또는 그 배양물을 포함하는 프로바이오틱스, 사료 첨가제 및 사료를 제공함으로써 가축의 소화력을 향상시켜 가축용 사료의 효율을 증진시킬 뿐만 아니라, 장 내 미생물 균형 유지 및/또는 항균 활성을 향상시켜 축산업 발전에 기여하는 효과를 갖는다.

도 1은 본원 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis) CJMPB150(KCCM11268P) 균주의 전자 현미경 사진이다.
도 2는 실시예 1의 후보 균주 2종의 시간에 따른 성장성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본원 발명의 바실러스 서브틸리스 CJMPB150(KCCM11268P)의 소화 효소 활성을 나타낸 사진이다.
도 4는 본원 발명의 바실러스 서브틸리스 CJMPB150(KCCM11268P)을 인공 위액 또는 인공 담즙으로 처리하였을 때의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 실시예 6에 따른 사료의 소화율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본원 발명의 바실러스 서브틸리스 CJMPB150(KCCM11268P)의 용혈성 유무를 나타낸 사진이다.
도 7은 본원 발명의 바실러스 서브틸리스 CJMPB150(KCCM11268P)의 16s rDNA 염기 서열을 나타낸 것이다.

이하, 본원 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다. 본원 명세서에 기재되지 않은 내용은 본원 발명의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.

본원 발명의 일 양태는, 신규 분리한 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis) CJMPB150(KCCM11268P)(이하, 'CJMPB150')균주를 제공한다.

상기 CJMPB150은 형태학적으로 그람 양성 간균에 해당하며(도 1 참조), 16s rDNA 염기 서열(서열 번호 1, 도 7)의 분석 결과, 바실러스 서브틸리스와 99%의 상동성을 가지는 균주이다.

상기 CJMPB150은 2012년 3월 22일자로 한국 미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 서울시 서대문구 홍제1동 361-221)에 기탁번호 KCCM11268P로 기탁되었다.

상기 CJMPB150은 복합 소화 효소 생산능을 갖는다.

상기 CJMPB150이 생산능을 갖는 소화 효소는 셀룰라아제(Cellulase), 자일라나아제(Xylanase) 및 만난아제(Mannanase)를 포함하며, 프로테아제(Protease), 아밀라아제(Amylase) 및 리파아제(Lipase)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 CJMPB150은 보다 바람직하게는 셀룰라아제, 자일라나아제, 만난아제, 프로테아제, 아밀라아제 및 리파아제를 모두 생산할 수 있다.

상기 CJMPB150은 내열성이 뛰어난 성질을 갖는다.

보다 구체적으로, 상기 CJMPB150은 37℃, 200 rpm 조건에서 24시간 동안 배양한 다음, 95℃에서 10분간 열처리한 후의 내생 포자 형성율이 바람직하게는 80% 이상일 수 있으며, 보다 바람직하게는 85% 이상일 수 있다.

또한, 37℃, 200 rpm 조건에서 48시간 동안 배양한 다음, 95℃에서 10분간 열처리한 후의 내생 포자 형성율이 바람직하게는 100%일 수 있다.

상기 내생 포자는 고온 조건의 환경뿐만 아니라, 자외선, 저온, 건조 및/또는 고압 등의 극한 환경에 저항성을 가지는 것으로, 내생 포자 형성율이 높을수록 균주의 생존율이 높아진다.

상기 CJMPB150은 내산성이 뛰어난 성질을 갖는다.

보다 구체적으로, 상기 CJMPB150은 pH 2.5로 조정한 용액에 펩신(Pepsin)을 1%(w/v)로 첨가하여 제조된 인공 위액을 함유하는 배지에서 3시간 동안 배양한 후의 생존율이 바람직하게는 80% 이상일 수 있다.

상기 CJMPB150은 내담즙성이 뛰어난 성질을 갖는다.

보다 구체적으로, 상기 CJMPB150은 1%(w/v)의 판크레아틴(Pancreatin)이 포함된 인공 담즙을 함유하는 배지에서 3시간 동안 배양한 후의 생존율이 바람직하게는 80% 이상일 수 있다.

본원 발명의 신규 분리한 균주 CJMPB150은 통상적인 바실러스 균주의 배양 방법을 통해 배양할 수 있다. 상기 CJMPB150은 바람직하게는 20 내지 40℃ 범위의 배양 온도에서 12시간 내지 4일간 배양하여 얻을 수 있다.

본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 CJMPB150의 배양물을 제공한다.

상기 배양물이란 상기 CJMPB150 균주를 배양한 배양 배지 또는 배양액, 및 상기 배양 배지 또는 배양액에서 배양한 그 결과물을 포함하는 개념이며, 상기 배양물은 상기 CJMPB150 균주를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

상기 배양물은 그 제형이 특별히 한정되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 제형일 수 있다. 예를 들어 상기 배양물은 액체 또는 고체일 수 있으며, 배양물의 원형 상태이거나 그의 농축된 형태 또는 건조된 형태일 수 있다.

배양 배지

본원 발명의 CJMPB150를 배양하는 배지로는 천연 배지 또는 합성 배지를 사용할 수 있다.

상기 배지의 탄소원은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 알려진 것을 사용할 수 있다. 상기 탄소원의 비제한적인 예로는 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤 또는 녹말 등을 들 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

상기 배지의 질소원은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 알려진 것을 사용할 수 있다. 상기 질소원의 비제한적인 예로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두, 암모늄염, 질산염 및 기타 유기 또는 무기 질소 함유 화합물 등을 들 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

상기 배지에 포함되는 무기염은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 알려진 것을 사용할 수 있다. 상기 무기염의 비제한적인 예로는 마그네슘, 망간, 칼슘, 철, 칼륨 등을 들 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

본원 발명의 CJMPB150를 배양하는 배지에는 상기 탄소원, 질소원 및 무기염 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및/또는 기타 일반적으로 배양 배지에 함유될 수 있는 성분들이 첨가될 수 있다.

배양액

본원 발명의 CJMPB150 균주의 배양액은 배양 원액일 수 있으며, 상기 배양 원액에서 배양 상등액을 제거한 액 및/또는 이를 농축한 액일 수 있다. 상기 배양액에는 상기 CJMPB150 균주가 포함되어 있을 수 있다.

상기 배양액의 조성은 특별히 제한되지 아니하며 통상적으로 바실러스 균주를 배양함에 있어 필요한 것으로 알려진 성분뿐만 아니라, 바실러스의 생장에 상승적으로 작용하는 성분을 추가적으로 포함할 수 있으며, 이에 따른 조성은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 선택될 수 있다.

상기 배양액은 액상 상태 또는 건조 상태일 수 있다.

상기 배양액을 건조하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 상기 건조 방법의 비제한적인 예로는 통풍 건조, 자연 건조, 분무 건조 또는 동결 건조 등을 들 수 있다. 이들은 단독 또는 2가지 이상의 방법을 병합하여 사용할 수 있다.

본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 CJMPB150 균주 또는 상기 균주의 배양물을 포함하는, 프로바이오틱스 제제를 제공한다.

상기 프로바이오틱스(Probiotics)는 인간이나 동물 등 숙주의 건강에 유익한 효과를 나타내는 미생물 또는 그 성분을 의미하는 것으로서, 숙주의 장내의 소화관 벽에 정착하여 다른 유해균의 정착 및 병원균의 증식을 억제하는 역할을 하며, 프로바이오틱스가 생산하는 유익한 소화 효소는 영양소의 흡수 및 이용을 용이하게 하는 것으로 알려져 있다.

본원 발명의 프로바이오틱스 제제는 상기 CJMPB150 균주 및/또는 상기 균주의 배양물을 포함하는 것일 수 있다.

본원 발명의 프로바이오틱스는 바람직하게는 상기 CJMPB150 균주를 5 x 10⁴ 내지 5 x 10¹⁰ CFU/㎖로 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 1 x 10⁶ 내지 1 x 10⁹ CFU/㎖로 포함할 수 있다.

상기 프로바이오틱스 제제는 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체와 함께 제제화되어 제공될 수 있다.

상기 약학적으로 허용 가능한 담체란, 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.

상기 담체에 있어서, 액상 용액으로 제제화되는 프로바이오틱스 제제에 사용 가능한 담체로 멸균 및 생체에 적합한 것으로는, 식염수, 멸균수, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액 또는 글리세롤 등을 들 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및/또는 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 프로바이오틱스 제제를 유효 성분으로 포함하는 경구 투여용 제형은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 알려진 제형으로 사용될 수 있다. 상기 경구 투여용 제형의 비제한적인 예로는 정제, 트로키제, 로젠지(lozenge), 수용성 또는 유성 현탁액, 조제 분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.

상기 정제 또는 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유 등을 포함할 수 있으며, 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 추가로 함유할 수 있다.

본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 프로바이오틱스 제제를 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.

본원 발명의 CJMPB150 균주 및/또는 그의 배양물이 포함된 프로바이오틱스 제제는 사료 첨가제 형태로 별도로 제조되어 가축 사료에 혼합될 수 있고, 또는 사료 제조시 상기 프로바이오틱스 제제를 직접 첨가하는 방식으로 혼합될 수 있다.

상기 사료 첨가제의 형태는 특별히 제한되지 아니하며 바람직하게는 액상 또는 건조 상태일 수 있으며, 보다 바람직하게는 건조 분말 형태일 수 있다.

상기 건조 분말형 프로바이오틱스 제제의 건조 방법은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 알려진 방법을 사용할 수 있다. 상기 건조 방법의 비제한적인 예로는 통풍 건조, 자연 건조, 분무 건조 또는 동결 건조 등을 들 수 있다. 이들은 단독 또는 2가지 이상의 방법을 병합하여 사용할 수 있다.

상기 사료 첨가제는 본원 발명의 CJMPB150 및/또는 그의 배양물을 포함하는 프로바이오틱스 제제 이외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 기타 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.

본원 발명의 사료 첨가제에 추가로 포함될 수 있는 첨가제는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 알려진 것을 사용할 수 있다. 상기 첨가제의 비제한적인 예로는, 사료 첨가제의 품질 저하를 방지하는 결착제, 유화제, 보존제 등; 효용을 증대시키는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 향미제, 비단백질태질소화합물(非蛋白質態窒素化合物), 규산염제, 완충제, 추출제, 올리고당 등을 들 수 있으며, 그 밖에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

본원 발명의 프로바이오틱스 제제 또는 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다. 또한 탑 드레싱, 가축 사료에 직접 혼합하거나, 사료와는 별도인 경구 제형으로 투여할 수 있고, 또는 다른 성분과 조합하여 투여할 수 있다.

본원 발명의 상기 사료는 상기 사료 첨가제를 바람직하게는 사료 100 중량부에 대하여 0.05 내지 10 중량부로 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.1 내지 1 중량부로 포함할 수 있다. 상기의 범위 내에서 가축의 소화력을 효과적으로 증진시켜 사료의 효율을 높일 수 있다.

본원 발명의 상기 사료의 성분은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 알려진 것일 수 있다. 상기 사료 성분의 비제한적인 예로는, 식물성으로 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류 등; 동물성으로 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질, 동물성 플랑크톤류, 어분 등을 들 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

본원 발명의 프로바이오틱스 제제, 사료 첨가제 또는 상기 사료 첨가제를 포함하는 사료를 사용할 수 있는 가축으로는 예를 들어 식용우, 젖소, 송아지, 돼지, 새끼 돼지, 양, 염소, 말, 토끼, 개, 고양이 등과 같은 가축 및 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기 등과 같은 가금류를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

이하, 실시예를 기술함으로써 본원 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예는 본원 발명의 일 예시에 불과하며, 본원 발명의 내용이 이에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

실시예 1

바실러스 서브틸리스 ( Bacillus subtilis ) CJMBP150 균주의 분리

(1) 시료 확보 및 균주 분리

전통 발효 식품인 메주 및 각종 장류 시료를 확보하고, 확보된 시료를 단계적으로 희석하여 3% 염화나트륨이 첨가된 BHI 고체 배지(Difco, USA)에 도말 후 37℃ 조건으로 24시간 동안 배양하였다.

상기 각 시료에서 분리된 균주들은 콜로니 관찰에 따라 그룹화하여 균주들을 분리하였다. 선별된 콜로니는 3차에 걸쳐 새로운 배지에 옮겨 배양하는 방법으로 순수 분리하였으며, 순수 배양된 균을 20% 글리세롤(glycerol)이 첨가된 배지에 담아 영하 70℃ 이하에서 보존하였다.

(2) 효소 활성 우수 균주 선발

복합 소화 효소 활성이 있는 균주를 선별하기 위해, 분리된 장류 유래균에 대해서 프로테아제, 셀룰라아제, 아밀라아제 3종에 대한 효소 활성 평가를 실시하였다. 효소 활성 평가는 각 효소에 대한 기질이 들어있는 배지를 사용하여 투명환(clear zone) 형성 정도에 따라 효소 활성 능력을 측정하였다.

배양액 상태에서 장류 유래균에 대한 소화 효소 활성 결과를 바탕으로 활성이 우수한 균주 약 200여 종을 1차 선발하였고, 2차로 배양액 및 시간대별 배양 상등액에 대한 소화 효소 분비 활성을 분석하였다.

1) 조효소액 채취

1차로 선발된 균주를 BHI 액체 배지에서 24시간, 48시간 배양한 배양 상등액을 채취하여, 4℃, 13,000 rpm에서 5분 동안 원심 분리한 후, 최종 상층액을 효소 활성 분석을 위한 조효소액으로 하여 아래와 같이 각 효소별 각각의 기질이 들어있는 배지를 사용하여 기질 분해 정도를 판정하였다.

2) 프로테아제 활성

탈지 분유(skim milk, Sigma, USA)를 2% 첨가한 YM(Yeast extract 3g/ℓ, Malt extract 3g/ℓ, Peptone 5g/ℓ, Dextrose 10g/ℓ, Agar 20g/ℓ; Difco, USA, 이하, 'YM 배지')배지를 제조하였다. 상기에서 채취한 조효소액을 1.5 ㎕씩 기질 배지에 분주한 후, 30℃에서 15시간 동안 반응시킨 후, 투명환의 형성 정도에 따라 효소 활성 능력을 측정하였다.

3) 셀룰라아제 활성

1% CMC(carboxyl methyl cellulose) 기질이 첨가된 YM 배지를 제조하였다. 상기에서 채취한 조효소액을 1.5 ㎕씩 기질 배지에 분주한 후, 37℃에서 15시간 동안 반응시킨 후, 0.2% 콩고 레드(Congo red) 수용액으로 30분 동안 염색하였으며, 1M NaCl 수용액으로 탈색하였다. 조효소액 주위의 기질이 분해되어 생기는 투명환의 형성 정도에 따라 효소의 활성 능력을 측정하였다.

4) 아밀라아제 활성

1% 가용성 녹말(soluble starch) 기질이 첨가된 YM 배지를 제조하였다. 상기에서 채취한 조효소액을 1.5 ㎕씩 기질 배지에 분주한 후, 37℃에서 15시간 동안 반응시켰다. I₂와 KI가 각각 0.1%, 2% 첨가된 수용액으로 염색한 후, 조효소액 주위의 기질이 분해되어 생기는 투명환의 형성 정도에 따라 효소의 활성 능력을 측정하였다.

상기 2차 평가 결과를 바탕으로 하기의 표 1과 같이 소화 효소 활성이 우수한 균주 19종을 선발하였다. 그 중에서 배양액과 상등액에서 복합 소화 효소 활성이 우수한 150, 470을 후보 균주로 최종 선발하였다.

하기 표 1은 2차 선발 균주의 소화 효소 생산성을 나타낸 것이다.

(3) 성장성 평가

복합 소화 효소 생산성이 우수한 상기 2개 후보 균주에 대해서 성장성 평가를 진행하였다. BHI 액체 배지에서 각 균주를 37℃, 200 rpm으로 15시간 동안 배양하였다. 상기 배양액을 100㎖의 BHI 액체 배지에 0.1% 접종하고, 37℃에서 10시간, 24시간 동안 배양하여 각 배양액을 BHI 고체 배지에 도말하여 균수를 측정하였다.

상기 결과는 도 2에 나타내었고, 24시간 배양 시 후보 균주 2종 중 150의 성장성이 더 우수함을 확인할 수 있었다.

이에, 복합 소화 효소 생산능 및 성장성이 우수한 150 균주를 최종 선발하였고, 이를 CJMPB150이라 명명하였다.

실시예 2

선발 균주 CJMPB150 의 소화 효소 활성

소화 효소 활성 우수 균주로 선발된 CJMPB150의 소화 효소 분비 활성을 알아보기 위해서 프로테아제, 셀룰라아제, 아밀라아제 이외에 자일라나아제, 만난아제, 리파아제의 활성을 평가하였다.

1) 조효소액 채취

CJMPB150 균주를 BHI 액체 배지에서 24시간 동안 배양한 배양 상등액을 채취하여, 4℃, 13,000 rpm에서 5분 동안 원심 분리한 후, 최종 상층액을 효소 활성 분석을 위한 조효소액으로 하여 아래와 같이 각 효소별 각각의 기질이 들어있는 배지를 사용하여 기질 분해 정도를 판정하였다.

2) 자일라나아제 활성

1% 자일란(xylan)이 첨가된 YM 배지를 제조하였다. 상기 조효소액 1.5 ㎕를 기질 배지에 분주하고, 37℃에서 15시간 동안 반응시킨 후, 0.2% 콩고 레드 수용액으로 30분 동안 염색하였으며, 1M NaCl 수용액으로 탈색하였다. 그 다음, 투명환 형성 정도에 따라 효소 활성능력을 측정하였다.

3) 리파아제 활성

1% 트리카프릴린(tricaprylin)이 첨가된 YM 배지를 제조하였다. 상기 조효소액 1.5 ㎕를 기질 배지에 분주한 후, 37℃에서 15시간 반응시킨 다음, 투명환 형성 정도에 따라 효소 활성 능력을 측정하였다.

4) 만난아제 활성

1% 만난(logust bean gum, sigma, USA)이 첨가된 기질 배지(Yeast extract 3g/ℓ, Peptone 5g/ℓ, KH₂PO₄ 1g/ℓ, Agar 20g/ℓ, pH 5)를 제조하였다. 상기 조효소액 1.5 ㎕를 기질 배지에 분주한 후, 37℃에서 24시간 동안 반응시킨 다음, 투명환 형성 정도에 따라 효소 활성 능력을 측정하였다.

상기 CJMPB150의 소화 효소 활성은 하기 표 2 및 도 3에 나타내었다.

	프로테아제	셀룰라아제	아밀라아제	자일라나아제	만난아제	리파아제
CJMPB150	+++	++++	++++	++	++++	+

표 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이 CJMPB150는 프로테아제, 셀룰라아제, 아밀라아제 이외에 자일라나아제, 만난아제, 리파아제와 같은 6종의 소화 효소를 모두 우수한 수준으로 분비하였다.

실시예 3

CJMPB150 균주의 형태학적, 생화학적 특성 조사 및 동정

(1) 형태학적, 생화학적 특성 조사

복합 소화 효소 활성 우수 균주로 최종 선발된 CJMPB150 균주의 동정을 위하여, 일차적으로 형태학적, 생화학적 조사를 수행하였다. 형태적인 특징으로는 그람 양성 간균임을 확인하였고(도 1), 생화학적 특성을 분석하기 위하여 API 50 CHB 시스템(biomerieux, 프랑스)으로 CJMPB150 균주의 당 발효 패턴을 분석하였다.

하기 표 3은 CJMPB150 균주의 당 발표 패턴을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

상기 표 3에서 '+'는 양성을, '-'는 음성을 나타내며, 대조구는 기질이 없는 시험군이다.

상기 표 3의 결과를 종합하여, CJMPB150 균주는 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis)와 97.8%의 상동성을 갖는 것으로 확인되었다.

(2) CJMPB150 균주의 동정

CJMPB150 균주의 보다 정확한 동정을 위하여, DNA 염기서열에 의한 분자 계통 분류학적 방법을 실시하였다.

염기 서열 분석은 PCR premix(바이오니아, 대한민국)와 유니버셜 프라이머 27F(5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3': 서열번호 2) 및 1492R(5'GGTTACCTTGTTACGACTT 3': 서열번호 3)을 사용하여 16s rDNA의 유전자를 증폭시켰다. 유전자 증폭 시 총 반응액은 20 ㎕로 맞추어 94℃ 1분, 56℃ 1분, 72℃ 1분을 총 30회 반복하여, 증폭된 DNA 염기 서열을 분석하였다. CJMPB150 균주의 분석된 16s rDNA의 염기 서열은 서열번호 1(도 7)과 같다.

상기 분석결과, 바실러스 서브틸리스와 99.9% 상동성을 가지는 미생물로 동정되었다.

상기와 같은 방법으로 동정된 본원 발명의 신규한 미생물인 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis) CJMPB150은 2012년 3월 22일자로 한국 미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 서울시 서대문구 홍제1동 361-221)에 기탁번호 KCCM11268P로 기탁되었다.

실시예 4

CJMPB150 균주의 내생 포자 형성능

바실러스는 필수 영양원들 중에 한 개 이상의 영양원이 고갈되는 등의 스트레스를 받으면 생존하기 위해 내생 포자를 형성한다. 내생 포자는 자외선, 고온, 저온 건조 및 고압 등의 극한 환경에 저항성을 가지기 때문에, 내생 포자의 형성은 바실러스의 생존율을 유지하는데 있어서 매우 중요하다. 이와 같은 이유로 바실러스 서브틸리스 CJMPB150을 장시간 배양하여 내생 포자 형성능을 확인하였다.

BHI 액체 배지에 균을 0.1% 접종하여, 37℃, 200 rpm에서 24시간, 48시간 동안 배양하였다. 각 시간대별 배양액을 BHI 고체 배지에 도말하여 총 균수를 측정하고, 95℃에서 10분간 열처리한 배양액을 BHI 아가(Agar) 배지에 도말하여 내생 포자의 수를 측정하였다.

하기 표 4는 상기 내생 포자 수의 측정 결과를 나타낸 것이다.

배양 시간(h)	총 균수 ( CFU /㎖)	내생 포자 수( CFU /㎖)	포자 형성율 (%)
24	1.6 × 10⁹	1.3 × 10⁹	87.8
48	1.3 × 10⁹	1.3 × 10⁹	100

상기 표 4에 나타난 바와 같이 CJMPB150을 24시간 배양하였을 때 약 88%가 내생 포자를 형성하였으며, 48시간 배양하였을 때 100% 내생 포자를 형성하는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본원 발명의 바실러스 서브틸리스 CJMPB150은 24시간 이상 배양 시 높은 내생 포자 형성능을 가지고 있어 프로바이오틱스로 사용 시 동물의 소화기관 내에서 높은 생존율을 유지할 수 있을 것으로 판단된다.

실시예 5

CJMPB150 균주의 내산성 및 내담즙성

프로바이오틱스 균주는 구강으로 섭취되어 최종 목적 부위인 장까지 생존하여 도달하기 위해서는 강산성의 위액과 담즙액에 대한 저항성이 있어야 한다. 이와 같은 이유로, 본원 발명의 바실러스 서브틸리스 CJMPB150의 프로바이오틱스 균주로서의 응용 여부를 확인하기 위하여, 내산성 및 내 담즙성을 확인하였다.

(1) 내산성 및 인공 위액 저항성

인공 위액은 HCl을 사용하여 pH 2.5로 조정한 0.05M 인산 나트륨(sodium phosphate) 용액에 펩신(Pepsin; Sigma, USA) 1%(w/v)를 첨가하여 제조하였다.

CJMPB150 균주를 BHI 액체 배지에서 37℃, 200 rpm에서 24시간 동안 배양한 후, 13,000rpm에서 5분간 원심 분리하여 상등액은 버리고 균체를 회수하여 인공 위액을 상등액과 동량으로 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 후 BHI 배지에 도말하여 균수를 측정하여 내산성 및 인공 위액에 대한 저항성을 확인하였다.

(2) 인공 담즙 저항성

인공 담즙은 0.05M 인산 나트륨 용액에 1%(w/v) 판크레아틴(Pancreatin; Sigma, USA)을 첨가하여 멸균한 후 멸균 10%(w/v) oxagall(Difco Co.)용액을 배지의 1%(v/v)가 되도록 첨가하고 pH를 6.8로 조정하여 제조하였다.

상기 (1)의 인공 위액에서 3시간 동안 배양한 CJMPB150 균주를, 13,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 상등액은 버리고 균체를 회수하여 상기 인공 담즙을 상등액과 동량으로 첨가하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 BHI 배지에 도말하여 균수를 측정하여 내산성 및 인공 담즙에 대한 저항성을 확인하였다.

상기 내산성 및 인공 위액과 인공 담즙에 대한 저항성 측정 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, CJMPB150을 pH 2.5의 인공 위액에서 2시간 동안 처리하였을 때 약 83%의 생존율을 나타내었으며, 인공 위액 처리 후 인공 담즙을 24시간 처리하였을 때에도 역시 83%의 생존율이 유지되었다.

따라서, 본원 발명의 바실러스 서브틸리스 CJMPB150은 인공 위액과 인공 담즙의 연쇄 처리 후에도 높은 생존율을 보임으로써 프로바이오틱스 균주로 유용하게 사용 가능함을 확인할 수 있었다.

실시예 6

CJMPB150 의 생체 외( in vitro ) 사료 소화율

복합 소화 효소 생산능이 우수한 바실러스 서브틸리스 CJMPB150이 실제 장과 같은 조건에서 소화율을 높일 수 있는지 알아보기 위해서 사료의 소화율을 조사하였다.

표준 사료(옥수수 50%, 대두박 30%, 소맥 10%, 미강 5% 및 주정박 5%를 혼합하여 제조한 사료) 10g에 바실러스 서브틸리스 CJMPB150을 0.1% 혼합하여, pH 6.0인 125 ㎖의 인산 완충액(phosphate buffer)에 첨가하고, 3M HCl을 사용하여 pH 2로 적정하였다. 이에 2 ㎖의 펩신(20 mg/㎖) 용액을 첨가하고 200 rpm, 38℃에서 2시간 동안 반응시켰다.

2시간 반응 후에 인산 완충액(pH 6.8) 50㎖를 첨가하고, 3M NaOH을 사용하여 pH 6.8로 적정하였다. 그 다음, 2㎖의 판크레아틴(50mg/㎖) 용액을 첨가하고, 200 rpm, 38℃에서 18시간 동안 배양한다.

배양 후, 거름 종이(Whatman No.541)를 사용하여 소화되고 남은 사료를 걸러낸 다음, 135℃ 오븐에서 건조시켰다. 이의 건조 무게를 측정하여 하기 식 1에 따라 사료의 소화율을 계산하였다.

[식 1]

사료 소화율(%) = {(반응 전 건조 무게 - 반응 후 건조 무게)/반응 전 건조 무게} X 100

상기 측정된 사료 소화율은 표 5 및 도 5에 나타내었다.

시료	소화율(%)
대조구	22.22
CJMPB150	24.48
효소	23.85

상기 표 5 및 도 5에 나타난 바와 같이 CJMPB150을 사료에 첨가하였을 때, 대조구(상기 표준 사료에 CJMPB150 또는 효소제 등을 첨가하지 않은 시험군)에 비해서 약 2.2% 소화율이 증가하였으며, 시중에 사료첨가제로 사용되고 있는 효소제(Mannanase)를 1% 첨가 하였을 때는 대조구 대비 약 1.6% 소화율이 증가하였다. 따라서 본 발명의 바실러스 서브틸리스 CJMPB150이 사료의 소화율을 높일 수 있으며, 사료첨가제인 효소제를 대체할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 7

CJMPB150 균주의 안정성

CJMPB150의 안정성을 알아보기 위해서 용혈성(β-hemolysis)을 조사하였다. β-용혈이란 유해균 중 인지질 효소를 생산하여 적혈구에 의해서 공급되는 인지질을 가수 분해하여 적혈구를 용혈시키는 작용이다.

바실러스 서브틸리스 CJMPB150의 용혈성을 알아보기 위하여 5% 양혈액(sheep blood, 기산바이오텍, 대한민국)이 함유되어 있는 TSA(Difco, USA)를 제조하였다. 상기 제조된 혈액 한천 배지에 선형 접종(streaking)한 후, 37℃에서 24시간 배양하여 용혈 여부를 확인한 결과, 도 6과 같이 용혈성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11268P

20120322

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Novel Bacillus subtilis <130> P11-1057 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 975 <212> DNA <213> 16s rDNA of Bacillus subtilis CJMPB150 <400> 1 gtcacttcgg cggctggctc ctaaaaggtt acctcaccga cttcgggtgt tacaaactct 60 cgtggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc 120 cgcgattact agcgattcca gcttcacgca gtcgagttgc agactgcgat ccgaactgag 180 aacagatttg tgggattggc ttaacctcgc ggtttcgctg ccctttgttc tgtccattgt 240 agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct 300 ccggtttgtc accggcagtc accttagagt gcccaactga atgctggcaa ctaagatcaa 360 gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat 420 gcaccacctg tcactctgcc cccgaagggg acgtcctatc tctaggattg tcagaggatg 480 tcaagacctg gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt 540 gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca gtcttgcgac cgtactcccc aggcggagtg 600 cttaatgcgt tagctgcagc actaaggggc ggaaaccccc taacacttag cactcatcgt 660 ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc cccacgcttt cgctcctcag 720 cgtcagttac agaccagaga gtcgccttcg ccactggtgt tcctccacat ctctacgcat 780 ttcaccgcta cacgtggaat tccactctcc tcttctgcac tcaagttccc cagtttccaa 840 tgaccctccc cggttgagcc gggggctttc acatcagact taagaaaccg cctgcgagcc 900 ctttacgccc aataattccg gacaacgctt gccacctacg tattaccgcg gctgctggca 960 cgtagttagc cgtgg 975 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 27F <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1492R <400> 3 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

복합 소화 효소 생산능, 내산성 및 내담즙성을 갖는, 신규 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis) CJMPB150(KCCM11268P) 균주.
제1항에 기재된 상기 바실러스 서브틸리스 CJMPB150(KCCM11268P) 균주의 배양물.
제1항에 기재된 상기 바실러스 서브틸리스 CJMPB150(KCCM11268P) 균주 또는 제2항에 기재된 상기 균주의 배양물을 포함하는, 프로바이오틱스(Probiotics) 제제.
제3항의 프로바이오틱스 제제를 포함하는 사료 첨가제.
제4항의 사료 첨가제를 포함하는 사료.