KR102176078B1 - 유기물 중 탄수화물과 단백질 및 섬유소에 대한 분해능을 갖는 신규 미생물 바실러스 서브틸리스 bs300 균주를 포함하여 배양하는 고체배양 방법 - Google Patents

유기물 중 탄수화물과 단백질 및 섬유소에 대한 분해능을 갖는 신규 미생물 바실러스 서브틸리스 bs300 균주를 포함하여 배양하는 고체배양 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유기물 중 탄수화물과 단백질 및 섬유소에 대한 분해능을 갖는 신규 미생물 바실러스 서브틸리스 BS300, 바실러스 서브틸리스 BS300균주를 포함하여 배양하는 고체배양 방법에 관한 것이다.
본 발명의 유기물 중 탄수화물과 단백질 및 섬유소에 대한 분해능을 갖는 신규 바실러스 서브틸러스 균주 BS300은, 서열번호 1로 표현되는 염기서열을 갖으면서 KCTC18263P로 기탁된 것이 특징이다.
본 발명에 의해, 동종균주 간에서도 유기물 중 탄수화물과 단백질 및 섬유소에 대한 분해능을 갖는 높은 신규 미생물인 바실러스 서브틸리스 BS300가 제공됨과 동시에, 이 신규 미생물인 바실러스 서브틸리스 BS300을 고농도로 고체배양할 수 있으면서 제조의 용이성 및 유통안정성을 나타내는 바실러스 서브틸리스 BS300의 배양용 고체배지 조성물이 제공되며, 이를 통해 유기물 중 탄수화물과 단백질 및 섬유소에 대한 분해능을 갖는 고체배양물를 함께 제공하게 된다.

Description

유기물 중 탄수화물과 단백질 및 섬유소에 대한 분해능을 갖는 신규 미생물 바실러스 서브틸리스 BS300 균주를 포함하여 배양하는 고체배양 방법{Solid culture method to culture with new microbial bacillus subtilis BS300 strains with resolution to carbohydrates and proteins and fibres among organic matter}
본 발명은 유기물 중 탄수화물과 단백질 및 섬유소에 대한 분해능을 갖는 신규 미생물 바실러스 서브틸리스BS300, 바실러스 서브틸리스 BS300 균주를 포함하여 배양하는 고체배양 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 동종균주 간에서도 유기물 중 탄수화물과 단백질 및 섬유소에 대한 분해능이 높은 신규 균주 및, 제조의 용이성 및 유통안정성을 갖으면서 상기 신규 미생물인 바실러스 서브틸리스 BS300균주를 포함하여 배양하는 고체배양 방법에 관한 것이다.
최근 축산분야는 미생물을 이용한 축산분뇨의 친환경적인 자원화와 생균제등을 이용하여 사육단계에서부터 친환경적인 사육이 가능하도록 시대적 요구를 받고 있고, 또한 화학비료의 과도한 남용으로 인한 환경오염 및 토양 염류집적 문제가 많이 발생되어 이를 대체할 수 있는 친환경 농자재로서 퇴비 및 유기질 비료의 사용이 점차 늘고 있는 실정이다.
그러나, 상기 유기질 비료에 함유된 유기물은 큰 분자량으로 구성되어 있어 실질적으로 작물체가 직접 흡수할 수 없는 상태이며, 이에 별도의 미생물처리에 의한 저분자화를 하여야 뿌리를 통하여 흡수할 수 있게 된다.
이에, 유기물을 분해할 수 있는 미생물제제에 대한 관심도가 높아지면서 여러 연구들이 시행된 바 있다.
그러나, 이러한 미생물제제는 통상 액상의 형태로 제품화 및 유통되고 있으며 이런 경우 보관 조건이 저온저장해야 하는 어려움이 있음과 동시에 유통시 미생물의 농도가 현저히 감소하는 단점이 있다.
또한, 분말화 한다고 해도 광물질 또는 곡물에 흡착시키는 형태로 주로 제조하므로 고농도의 미생물제제를 제조하는 데에는 한계가 있다.
1. 대한민국 공개특허공보 제10-2010-0045621호 '유기물 분해능이 우수한 마실러스 속 균주' 2. 대한민국 등록특허공보 제10-2015-0101789호 '복합 효소 생산능 및 항균 활성을 갖는 바실러스 서브틸리스 BK418 균주 및 이의 용도'
본 발명의 목적은 동종균주 간에서도 유기물 중 탄수화물과 단백질 및 섬유소에 대한 분해능이 높은 신규 미생물 바실러스 서브틸러스 균주 BS300이 제공됨과 동시에, 이 신규 미생물인 바실러스 서브틸리스 BS300을 고농도로 고체배양할 수 있으면서 제조의 용이성 및 유통안정성을 나타내는 바실러스 서브틸리스 BS300균주를 포함하여 배양하는 고체배양 방법을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 신규균주는 프로테아제 500~510 unit, 셀룰라아제 200~220 unit, 아밀라아제 400~420 unit 함량을 갖는 신규미생물 바실러스 서브틸러스 BS300균주(Bacillus subtilis BS300, 수탁번호 :KCTC 18263P)인 것이 특징이다.
또 다른 본 발명인 신규미생물 바실러스 서브틸러스 BS300균주의 배양용 고체배지 조성물은, 탈지강 25~30 중량%, 단백피 45~55 중량%, 글루코스(glucose) 3~5 중량%, 알파 전분 10~15 중량%, 이스트 추출물(Yeast extract) 3~7 중량%, 펩톤(Peptone) 1~2 중량%, 대두분 1~3 중량%, 인산칼륨(K2HPO4) 1~3 중량%, 황산마그네슘·7수화물(MgSO4·7H20) 0.01~0.1 중량%, 황산망간·7수화물(MnSO4·7H20) 0.01~0.1 중량%, 및 염화칼슘(CaCl2) 0.01~0.1 중량%로 구성되는 것이 특징이다.
또 다른 본 발명인 유기물 중 탄수화물과 단백질 및 섬유소에 대한 분해능을 갖는 신규 미생물 바실러스 서브틸리스 BS300 균주를 포함하여 배양하는 고체배양 방법은, 제1항의 신규미생물 바실러스 서브틸러스 BS300균주(Bacillus subtilis BS300, 수탁번호 :KCTC 18263P)의 균체를 액상배양용 배지에 접종하여 액상배양액을 제조하는 제1단계, 탈지강 25~30 중량%, 단백피 45~55 중량%, 글루코스(glucose) 3~5 중량%, 알파 전분 10~15 중량%, 이스트 추출물(Yeast extract) 3~7 중량%, 펩톤(Peptone) 1~2 중량%, 대두분 1~3 중량%, 인산칼륨(K2HPO4) 1~3 중량%, 황산마그네슘·7수화물(MgSO4·7H20) 0.01~0.1 중량%, 황산망간·7수화물(MnSO4·7H20) 0.01~0.1 중량%, 및 염화칼슘(CaCl2) 0.01~0.1 중량%로 혼합하여 고체배지 조성물을 제조하는 제2단계, 상기 제2단계의 고체배지 조성물에 상기 제1단계의 액상배양액을 넣은 후 배양한 다음 건조하여 분말형태의 고체배양물을 제조하는 제3단계를 포함하는 것이 특징이다.
상기 제1단계의 액상배양액 제조시, 상기 액상배양용 배지에는 글루코스(Glucose), 전분(starch), 이스트 추출물(Yeast Extract), 펩톤(Peptone), 염화나트륨(NaCl), 인산칼륨(K2HPO4), 황산마그네슘·7수화물(MgSO4·7H20), 및 황산제1철·7수화물(FeSO4·7H20)가 포함되는 것이 특징이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않는 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명에 의해, 동종균주 간에서도 유기물 중 탄수화물과 단백질 및 섬유소에 대한 분해능이 높은 신규 미생물인 바실러스 서브틸리스 BS300가 제공됨과 동시에, 이 신규 미생물인 바실러스 서브틸리스 BS300을 고농도로 고체배양할 수 있으면서 제조의 용이성 및 유통안정성을 나타내는 바실러스 서브틸리스 BS300 균주를 포함하여 배양하는 고체배양 방법을 제공하게 된다.
도 1은 본 발명의 유기물 중 탄수화물과 단백질 및 섬유소에 대한 분해능을 갖는 신규 미생물 바실러스 서브틸리스 BS300의 16S rRNA 염기서열 및 유전자 은행을 통한 유사도 검색결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 유기물 중 탄수화물과 단백질 및 섬유소에 대한 분해능을 갖는 신규 미생물 바실러스 서브틸리스 BS300에 대한 분자계통도를 나타낸 도면이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예 및 실험예를 상세하게 설명하며, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다.
본 발명은 유기물 분해능 중 특히, 탄수화물과 단백질 및 섬유소의 분해능력이 높아 성장 속도가 빨라 포자를 잘 형성하는 신규균주에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 서열번호 1로 표현되는 염기서열을 갖으며, 다른 동종균주 대비 유기물 중 탄수화물과 단백질 및 섬유소에 대한 높은 분해능과 높은 효소생성량을 갖는 신규 미생물 바실러스 서브틸리스 BS300에 관한 것이다.
구체적으로 설명하면, 옥수수 및 콩잔사(대두박)를 주원료로 하는 퇴비를 시용한 노지 경작지에서 토양시료를 채취하고 본 발명을 완성하기 위한 바실러스속 미생물의 분리를 진행하기 위해, 먼저, 탄수화물 분해능력이 있는 미생물을 선별하고 선별된 미생물을 이용하여 단백질 및 섬유소 분해능력이 있는 미생물을 선별하고 선별된 미생물을 이용하여 인축에 유해요소 작용할 수 있는 바실러스 세레우스 미생물을 제외하고 최종적으로 본 발명의 Bacillus 속 균주를 분리한다.
이때, 상기 탄수화물 분해 능력이 있는 미생물을 선별하기 위해서 솔루블스타치 1.0%(w/w)가 함유된 영양아가배지(Nutrient Agar, Difco사)에 시료를 생리식염수로 희석하여 접종하고 30~32℃에서 16~24시간 배양하여 투명환(Clear Zone)을 최단 시간내에 크게 형성한 순으로 탄수화물 분해 능력이 있는 미생물로 1차로 선별하였다.
그 다음, 단백질 분해 능력이 있는 미생물을 선별하기 위해서 탈지분유(Skim Milk, Difco사)가 1.0%(w/w) 함유된 영양아가배지(Nutrient Agar, Difco사)에 1차로 선별한 미생물을 접종하고 32℃에서 16~24시간 배양하여 투명환(Clear Zone)을 최단 시간내에 크게 형성한 미생물 순으로 2차 선별하였다.
그 다음, 섬유소 분해 능력이 있는 미생물을 선별하기 위해서 CMC(carboxymethyl cellilose)가 1.0%(w/w) 함유된 영양아가배지(Nutrient Agar, Difco사)에 2차로 선별한 미생물을 접종하고 32℃에서 16~24시간 배양하여 투명환(Clear Zone)을 최단 시간내에 크게 형성한 미생물을 선별하였다.
선별된 미생물 중 사람에게 설사등을 유발하는 바실러스 세레우스를 제외하기 위하여 바실러스 세레우스 아가(Bacillus cereus Agar, Difco사)배지에 획선 도말하여 37℃에서 18시간 배양하여 콜로니 및 콜로니 주변이 푸른색을 띄는 미생물을 바실러스 세레우스로 판정하고 제외하였다.
이와 같이 분리된 상기 미생물을 일반세균학적 특성 및 API50CHB Kit(Biomerieux. Co. France) 등으로 조사하여 이의 특성을 확인하였다.
그 결과, 하기 표 1과 같이 나타났다.
Factors Characteristics
Morphological
Characteristics		 Shape Rod
Motility Motility
Spore Oval terminal
Sporangium Not swollen
Gram Stain Positive
Cultural
characteristics		 Colony of
Nutrient Agar
(37℃, 1~2 days)		 Form regular
Surface Smoth
Edge Erose
Elevation Raised
Opacity Opaque
Color Creamy
Brilliancy Not glistening
Nutrient Broth(32℃, 1~2 days) Growth
Physiological
characteristics		 Temperature range for growth 15~65℃
pH range for growth pH 3~9
NaCl tolerance for growth <5%
Catalase +
Lipase +
Hydrolysis of starch +
casein +
cellulose -
esculin +
Levan formation from sucrose +
NH3 production from peptone +
NH3 production from arginine +
Gelatin liquefaction +
Utilization of citrate +
Nitrate reduction +
Denitrification -
Action on milk ; coagulation +
peptonization +
O-F test Fermentation
Hydrolysis of tyrosine +
Facultative Anaerobic growth +
상기 표 1에 나타나 있듯이 본 발명에서 분리한 신규미생물의 특성은 그람 양성균이었고 운동성과 포자형성능이 있으며 간균으로서 호기적인 조건에서 생육이 왕성하고 미호기적인 조건에서도 생육이 가능한 미생물이었다.
또한 전분, 카제인 등 분해능을 있었고 암모니아 환원능력 등이 있었으며, 고체배지(NA)에서 원형의 집락을 형성하고 집락의 색깔은 흰색을 띔을 확인하였다.
이에, 이를 세균동정에 대한 버어지스 매뉴얼(Bergy's Manual of Derterminative Bacteriology)에 수록되어 있는 일반적인 세균동정법과 분자유전학적 방법을 적용하여 16s rRNA의 염기서열을 분석한 결과, 도 1, 2와 같이 바실러스 서브틸리스 균주와 99%의 유사도를 가진 것으로 확인되는 바, 이상의 형태학적, 생리학적, 분자유전학적 특성 등을 종합하여 상기 분리균주는 Bacillus subtilis로 동정되어 Bacillus subtilis BS300이라고 명명하고, 이를 미생물 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하여 2013년 12월 6일자로 KCTC18263P를 부여 받았으며, 이러한 상기 Bacillus subtilis BS300 균주는 서열번호 1로 기재되는 염기서열 전체 또는 그것의 일부로 이루어지며, 821bp의 오픈 리딩 프레임(ORF)으로 구성된다.
본 발명에서는 이러한 상기 신규미생물 Bacillus subtilis BS300 균주를 포함하여 산업적으로 쉽게 사용가능하도록 고체배양 방법을 제공하되, 이때 제조의 용이성 및 유통안정성을 갖도록 하기 위해 신규미생물 Bacillus subtilis BS300 균주의 배양용 고체배지 조성물도 함께 제공하게 된다.
이때, 상기 신규미생물 Bacillus subtilis BS300 균주는 액상배양액 상태로 제조하여 이를 고체배지의 종균으로 사용하는 것을 특징으로, 상기 균주가 포함된 액상배양액이 충분한 효용성을 나타내도록 하기 위해서는 하기와 같은 최적의 배양조건을 도입하는 것이 좋다.
다시말해, 상기 액상배양액 제조시 사용되는 액상배양용 배지에는 글루코스(Glucose), 전분(starch), 이스트 추출물(Yeast Extract), 펩톤(Peptone), 염화나트륨(NaCl), 인산칼륨(K2HPO4), 황산마그네슘·7수화물(MgSO4·7H20), 및 황산제1철·7수화물(FeSO4·7H20)을 포함하는 것을 특징으로 하며, 보다 바람직하게는 상기 액상배양용 배지 전체 중량을 기준으로 상기 글루코스(Glucose)는 0.1~0.5%(W/V), 상기 전분(starch)은 0.5~1%(W/V), 상기 이스트 추출물(Yeast Extract)은 0.5~1%(W/V), 상기 펩톤(Peptone)은 0.1~0.5%(W/V), 상기 염화나트륨(NaCl)은 0.01~0.1%(W/V), 상기 인산칼륨(K2HPO4)은 0.05~0.3%(W/V), 상기 황산마그네슘·7수화물(MgSO4·7H20)은 0.01~0.05%(W/V), 및 상기 황산제1철·7수화물(FeSO4·7H20)은 0.01~0.05%(W/V)로 포함되도로 하는 것이 좋다.
이렇게 구성된 상기 액상배양용 배지는 균 접종전에 멸균 및 냉각 과정을 거쳐 준비한 후, 여기에 상기 신규미생물 Bacillus subtilis BS300 균주를 접종한 후 pH6~7조건하에 30~35℃에서 15~24시간동안 배양함에 따라 3.0~6.0×108 cfu/g의 균체농도를 갖는 액상배양액을 제조하게 되며, 이는 일반세균보다 30%이상의 빠른 균체증체율을 나타내는 것으로써 이러한 균체농도는 고체배양 종균으로 사용하기에 충분한 효용성을 나타내는 것임을 알 수 있다.
이러한 상기 액상배양액은 또 다른 본 발명인 고체배양 종균으로 사용하게 되는데, 이때 고체배지 조성물에는 탄소원으로서 탈지강, 단백피, 알파 전분, 및 글루코스(glucose)를, 질소원으로서는 이스트 추출물, 펩톤, 및 대두분을, 미량요소로서는 인산칼륨, 황산마그네슘, 황산망간, 및 염화칼슘을 더 첨가하여 고체배지 조성물을 구성하게 된다.
다시말해, 본 발명의 신규균주 배양용 고체배지 조성물은 통상 액상의 형태로 제품화 및 유통되고 있는 기존 미생물제제의 문제점을 보완할 수 있는 것으로써, 설명하면 기존 액상형태의 제품화는 보관 조건이 저온저장해야 하는 어려움이 있음과 동시에 유통시 미생물의 농도가 현저히 감소하는 단점이 있으며, 현재 시판되고 있는 고체배양체 형태의 제품이 있긴 하나 미생물의 농도가 낮고 유기물 분해능이 떨어지는 단점이 있는 바, 본 발명에서는 이를 해소함에 따라 제조의 용이성 및 유통안정성을 갖으면서 고농도의 신규균주를 생산할 수 있는 고체배지 조성물을 제공하게 된다.
이에, 본 발명의 고체배지 조성물은 탈지강, 단백피, 글루코스(glucose), 알파 전분, 이스트 추출물(Yeast extract), 펩톤(Peptone), 대두분, 인산칼륨(K2HPO4), 황산마그네슘·7수화물(MgSO4·7H20), 황산망간·7수화물(MnSO4·7H20), 및 염화칼슘(CaCl2)으로 구성하며 보다 바람직하게는 탈지강 25~30 중량%, 단백피 45~55 중량%, 글루코스(glucose) 3~5 중량%, 알파 전분 10~15 중량%, 이스트 추출물(Yeast extract) 3~7 중량%, 펩톤(Peptone) 1~2 중량%, 대두분 1~3 중량%, 인산칼륨(K2HPO4) 1~3 중량%, 황산마그네슘·7수화물(MgSO4·7H20) 0.01~0.1 중량%, 황산망간·7수화물(MnSO4·7H20) 0.01~0.1 중량%, 및 염화칼슘(CaCl2) 0.01~0.1 중량%로 구성되는 것이 가장 좋다.
이렇게 구성된 상기 고체배지 조성물은 고체배지멸균기에서 스팀으로 멸균하고 냉각한 후 여기에 종균으로서 준비해 둔 신규 미생물 Bacillus subtilis BS300(KCTC18263P) 액상배양액을 상기 고체배지 조성물 중량기준 20~25 중량%로 접종하고, 이를 30~35℃에서 24~36시간 배양한 후, 이를 40~45℃에서 30~40시간동안 건조한 다음, 롤밀에서 10~50μm로 파쇄함으로써, 고체배양체 즉, 고체배양물을 제조하는 고체배양 방법을 제공하게 된다.
이때, 상기 고체배양물은 균체농도가 0.1×109 ~ 6.0×109cfu/g로 이루어짐과 동시에 프로테아제 500~510 unit, 셀룰라아제 200~220 unit, 아밀라아제 400~420 unit 함량을 갖는 것이 특징으로, 이는, 토양미생물제 또는 사료 생균제의 허가상 고초균의 최소농도가 1×106cfu/g인 사항을 고려하면 고초균 분말원체로서의 이용가치가 매우 높을 것임을 알 수 있다.
이하에서는 실험예를 들어 본 발명에 관하여 더욱 상세하게 설명할 것이나, 이들 실험예는 단지 설명의 목적을 위한 것으로 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
<실험예 1> 본 발명의 신규균주의 액상배양 최적화 및 균체농도 확인
1. 실험방법
상기 분리된 신규미생물 Bacillus subtilis BS300는 고체배양 종균으로 사용하기 위하여 액상배양 최적조건을 검토하였다.
탄소원, 질소원, 미량요소, 그로스펙터, 온도, pH등에 대하여 다양한 조건에서 배양하여 최적배양 조건을 확립하였다. 그 결과 최적화된 배지 및 배양조건은 하기 표 2와 같이 나타났다.
2. 실험결과
Ingredient 농도(%,W/V)
Glucose 0.25
Starch(Corn) 0.9
Yeast Extract 0.6
Peptone 0.2
NaCl 0.01
K2HPO4 0.1
MgSO4 7H20 0.02
FeSO4 7H20 0.01
pH 6.8
Temp. 32℃
Culture Time 16~24Hrs
상기 표 2에 나타낸 최적화된 배지를 통해 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BS300(KCTC18263P)를 액체배양한 결과, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BS300(KCTC18263P) 균주의 성장속도(μmax)는 일반 바실러스속 미생물이 0.25인데 비해서 배양 16시간에 0.32를 나타남을 확인하였으며, 24시간 배양 후 균체농도는 5.31×108 cfu/g으로 성장속도가 일반세균보다 30% 정도 빠르게 나타났으므로 고체배양용 종균으로 충분한 효용성이 있는 것으로 확인되었다.
<실험예 2> 본 발명의 신규균주의 고체배양 최적화 및 균체농도 확인
1. 실험방법
고체배양배지를 최적화하기 위하여 탄소원으로서 탈지강, 단백피, 글루코오스, 전분을, 질소원으로서는 이스트 추출물, 펩톤, 대두분을, 미량요소로서는 인산칼륨, 황산마그네슘, 황산망간, 염화칼슘의 첨가량을 조정하여 하기 표 3에 나타나 있듯이 고체배지를 구성하고 스팀으로 증자하여 살균한 후 냉각하고 상기 실험예1 에서 배양한 Bacillus subtilis BS300(KCTC18263P) 배양액을 종균으로서 20%접종하고 고체배양기(For You Tech.사)에서 온도:32℃, 급기량:30%. 배기량:35%로 하여 24~36시간 배양하고 동일시설에서 온도:42℃, 급기량:40%. 배기량:45%로 하여 36시간 건조하고 롤밀에서 10~50μm로 파쇄하고 균체농도를 측정함으로서 최적배지조건을 확립하였다.
성분명 함량(%)
탈지강 21
단백피 41
Glucose 2.5
알파 전분 8.5
Yeast Extract 3.5
Peptone 1.0
대두분 1.5
K2HPO4 1.0
MgSO47H20 0.01
MnSO47H20 0.01
CaCl2 0.01
이렇게 최적화된 배지를 통해 본 발명의 바실러스 서브틸리스 BS300(KCTC18263P)를 포함하는 고체배양체 균체분말을 제조하고, 이의 균체농도를 측정하기 위해 상기 균체분말 20g을 멸균된 셀라인 용액에 투입한 다음 최종적으로 400ml가 되게 조정한 후 마그네틱스터러를 이용하여 1시간 용출하여 적정비율로 희석하여 영양고체배지(Nutrient Agar)에 도말하고 인규베이터에서 배양온도를 32℃로 하여 24시간 배양하여 콜로니수와 희석비를 환산하여 Bacillus subtilis BS300(KCTC18263P) 균체농도를 측정하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과, 본 발명인 신규미생물 Bacillus subtilis BS300(KCTC18263P) 균체농도는 5.6×109cfu/g으로 확인된 바, 토양미생물제 또는 사료 생균제의 허가상 고초균의 최소농도가 1×106cfu/g인 사항을 고려하면 100배~500배 희석하여 미생물제 제조를 위한 고초균 분말원체로서의 이용가치가 있음을 확인하였다.
<실험예 3> 본 발명의 신규균주의 효소생성량 확인
1. 실험방법
효소 활성을 측정하기 위하여 상기 실험예 2의 용출액 1ml를 취하여 10,000g로 10분간 원심분리한 후, 상등액을 pore size 0.45 μm인 membrane syringe filter로 제균한 것을 조효소로 사용하였다.
Protease의 효소활성은 casein을 100mM Tris-HCI buffer (pH 7.3)에 1%가 되도록 용해하여 기질용액으로 사용하고, 기질용액 0.5 ml에 조효소 0.5 ml를 가하여 32℃에서 1시간 반응시킨 후 0.5 ml의 40% (w/v) TCA(trichloroacetic acid ) 용액을 가하여 반응을 정지시킨 후 실온에서 15분간 방치하였다. 12,000g로 15분 동안 원심분리한 후 상등액을 취하여 가용성 peptide 양을 280 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 L-tyrosine 용액을 사용하였으며, 효소활성 단위는 1분간 1μg에 상당하는 tyrosine을 생성하는 효소의 양을 1unit로 정의하였다.
Amylase 효소활성은 1%(w/v) soluble starch 0.5 ml의 조효소를 가하여 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 차가운 1N HCl 1 ml을 가하여 반응을 정지시킨 후 0.1 ml의 Lugol's iodine 용액을 가하여 발색시켰다. 증류수를 가하여 25 ml로 정용한 수, 620nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 maltose 용액을 사용하였으며 효소활성 단위는 1분간 0.01%의 soluble starch를 줄이는데 상당하는 효소의 양을 1 unit으로 정의하였다.
Cellulase 효소활성은 조효소액 0.1ml과 0.05M glycin-NaOH 완충용액에 용해된 1%(W/V) CMC(Carboxy methyl cellulose) 기질용액 0.5ml를 혼합하여 50℃에서 10분간 반응시켰다. CMC 가수분해로 생성된 환원당은 3,5-dinitrosalicylic acid(DNS)에 의한 방법에 따라 550nm에서 흡광도를 측정, 비색정량하였으며 1분간 1umol의 환원당을 생성하는 효소량을 1unit로 하였다.
또한, 본 발명의 신규미생물 Bacillus subtilis BS300(KCTC18263P의 효소활성의 우수성도 함께 확인하기 위해 통상적으로 효소생산능을 갖고 있는 일반 Bacillus subtilis를 분양받아 효소생산능 및 고체배양 시 균체농도를 비교함으로서 본 발명의 KCTC18263P의 우수성을 확인하였다.
다시말해, Protease와 Cellulase 효소생산능이 있는 Bacillus subtilis(KCTC No. 3042) 및 Amylase 효소생산능이 있는 Bacillus subtilis(KCTC No. 1028)를 분양 받아 비교하였다.
Bacillus subtilis(KCTC No. 3042)는 KCTC Media No. 108의 조성으로, Bacillus subtilis(KCTC No. 1028)는 KCTC Media No. 1의 조성으로 액상배양하여 고체배양 종균으로 사용하였다. 본 발명의 Bacillus subtilis BS300(KCTC18263P)는 상기의 방법으로 액상배양하여 고체배양 종균으로 사용하였다.
고체배양은 상기 본 발명의 실험예 2에 준하여 실시하였고 효소활성은 상기 방법에 준하여 측정하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과, 하기 표 4와 같이 나타났다.
구 분 본 발명
신규 미생물 		일반 미생물
(한국생공학연구원 유전자은행)
Bacillus subtilis BS300(KCTC18263P) Bacillus subtilis
(KCTC No.3042) 		Bacillus subtilis
(KCTC No.1028)
Protease 502 unit 45 unit 9 unit
Cellulase 212 unit 7 unit 11 unit
Amylase 412 unit 12 unit 36 unit
고체배양 균체농도 5.6x109cfu/g 3.2x108cfu/g 5.1x108cfu/g
상기 표 4에 나타나 있듯이, 본 발명의 신규미생물 Bacillus subtilis BS300(KCTC18263P)를 포함하는 상기 실험예 2의 용출액은 Protease의 효소활성은 502unit, Amylase 효소활성은 412unit, Cellulase 효소활성은 212unit로 측정되었다.
이에, 같은 동종 균주라고 할지라도 그 효소활성에서 확연히 차이가 남을 알 수 있었다. 다시말해, 본 발명의 Bacillus subtilis BS300(KCTC18263P)가 월등히 우수한 결과를 보였으며 이는 본 발명의 균주가 신규 미생물로서 충분한 가치가 있었음을 확인시켜 주었다
<실험예 4> 본 발명의 신규균주의 보관성 확인
1. 실험방법
Bacillus subtilis BS300(KCTC18263P) 고체배양체는 분말 미생물제 제조용이성을 부여하고 유통 중에도 균체수 감소를 최대한 방지하기 위해서는 보관조건에 따른 균체안정성을 확인하는 것이 관건이므로, 상기 실험예 2에서 얻은 균체를 비닐백에 100g씩 분주하고 밀봉하여 상온(직사광선을 피하고 통풍이 잘되는 곳)에서 보관성을 확인하였다. 시간 경과에 따른 균체농도는 상기 실험예 2와 동일방법으로 수행하였다.
2. 실험결과
보관개월수 상온보관
- Bacillus subtilis BS300(KCTC18263P) 		상온보관
- Bacillus subtilis (KCTC No. 1028)
균체농도(10 x cfu/g) 균체농도(10 x cfu/g)
0 5.31E+09 5.1E+08
3 5.29E+09 1.30E+08
6 5.27E+09 5.29E+07
9 5.21E+09 2.22E+07
12 5.01E+09 5.11E+06
15 4.81E+09 5.03E+05
상기 표 5에 나타나 있듯이, 통상적으로 미생물제의 최장 유통기간이 1년이라는 사항과 본 결과의 보존성이 1년이상이라는 점을 고려하면 동종균주간에서도 Bacillus subtilis(KCTC No. 1028)는 3개월 경과후 균체 보관율이 급격히 떨어지는 바, 상온보관이 어려운 것으로 판단되는 반면, 본 발명의 Bacillus subtilis BS300(KCTC18263P) 고체배양체는 3개월동안 상온보관하여도 감소율이 0.38%, 6개월 보관시 0.75%, 9개월 보관시 1.88%, 12개월 보관시 5.65%, 15개월 보관시 9.42%로써 상온에서도 안전하게 유통할 수 있으므로 미생물제 제조 원체(원료)로 충분한 효용성 갖는 것으로 판단된다.
이와 같이 본 발명에 의해, 동종균주 간에서도 유기물 중 탄수화물과 단백질 및 섬유소에 대한 분해능이 높은 신규 미생물인 바실러스 서브틸리스 BS300가 제공됨과 동시에, 이 신규 미생물인 바실러스 서브틸리스 BS300을 고농도로 고체배양할 수 있으면서 제조의 용이성 및 유통안정성을 나타내는 바실러스 서브틸리스 BS300균주를 포함한 고체배양 방법을 제공한다.
상기의 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC18263P
수탁일자 : 20131202
<110> LEE, Jeong-Bok <120> New microorganism Bacillus subtilis BS300 having an excellent decomposition effect of organic matter and solid medium composition for culture of Bacillus subtilis BS300 and the microbial agent comprising the same <130> 01-000001 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 821 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac cggggctaat 60 accggatggt tgtttgaacc gcatggttca aacataaaag gtggcttcgg ctaccactta 120 cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcaacgatg 180 cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc cagactccta 240 cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg 300 tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca agtaccgttc 360 gaatagggcg gtaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca 420 gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgca 480 ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt cattggaaac 540 tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag 600 agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga cgctgaggag 660 cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag 720 tgctaagtgg ttagggggtt tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg 780 cctgggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat t 821

Claims (5)

  1. 프로테아제 500~510 unit, 셀룰라아제 200~220 unit 및 아밀라아제 400~420 unit 함량을 포함하고,
    유기물 중 탄수화물과 단백질 및 섬유소에 대한 분해능 및 고체 배양시 상온에서 15개월 동안 생존 가능한,
    신규미생물 바실러스 서브틸러스 BS300균주(Bacillus subtilis BS300, 수탁번호 :KCTC 18263P)
  2. 삭제
  3. 유기물 중 탄수화물과 단백질 및 섬유소에 대한 분해능을 갖도록 선별된 바실러스 서브틸러스 BS300균주(Bacillus subtilis BS300, 수탁번호 :KCTC 18263P)를 분리하여,
    분리된 균주를 액상배양용 배지 전체 중량을 기준으로 글루코스(Glucose)는 0.1~0.5%(W/V), 전분(starch)은 0.5~1%(W/V), 이스트 추출물(Yeast Extract)은 0.5~1%(W/V), 펩톤(Peptone)은 0.1~0.5% (W/V), 염화나트륨(NaCl)은 0.01~0.1% (W/V), 인산칼륨(K2HPO4)은 0.05~0.3%(W/V), 황산마그네슘·7수화물(MgSO4·7H20)은 0.01~ 0.05%(W/V), 및 황산제1철·7수화물(FeSO4·7H20)은 0.01~0.05%(W/V)를 포함하는 조성물로 이루어진 액상배양용 배지에 접종하여 액상배양액을 제조하는 제1단계;
    탈지강 25~30 중량%, 단백피 45~55 중량%, 글루코스(glucose) 3~5 중량%, 알파 전분 10~15 중량%, 이스트 추출물(Yeast extract) 3~7 중량%, 펩톤(Peptone) 1~2 중량%, 대두분 1~3 중량%, 인산칼륨(K2HPO4) 1~3 중량%, 황산마그네슘·7수화물(MgSO4·7H20) 0.01~0.1 중량%, 황산망간·7수화물(MnSO4·7H20) 0.01~0.1 중량%, 및 염화칼슘(CaCl2) 0.01~0.1 중량%로 혼합하여 고체배지 조성물을 제조하는 제2단계;
    상기 제2단계의 고체배지 조성물에 상기 제1단계의 액상배양액을 넣은 후 배양한 다음 건조하여 분말형태의 고체배양물을 제조하는 제3단계;를 포함하되,
    유기물 중 탄수화물과 단백질 및 섬유소에 대한 분해능 및 고체 배양시 상온에서 15개월 동안 생존 가능한 신규미생물 바실러스 서브틸러스 BS300균주 (Bacillus subtilis BS300, 수탁번호 :KCTC 18263P)를 포함하여 배양하는 고체배양 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
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