KR101186150B1

KR101186150B1 - 신규 바실러스속 프로바이오틱스 균주

Info

Publication number: KR101186150B1
Application number: KR1020100113932A
Authority: KR
Inventors: 김영옥; 김경길; 남보혜; 이상준; 공희정; 김우진; 김봉석; 김동균; 한현섭; 양시용
Original assignee: 씨제이제일제당 (주); 대한민국(관리부서:국립수산과학원)
Priority date: 2010-11-16
Filing date: 2010-11-16
Publication date: 2012-10-02
Also published as: US20130302299A1; WO2012067341A1; KR20120052667A; US9352005B2

Abstract

프로바이오틱스 활성을 갖는 신규 바실러스속 균주가 제공된다. 본 발명의 균주는 다양한 어류 병원성 세균에 대한 항균활성을 가지고 있을 뿐만 아니라, 프로테아제, 아밀라제, 셀룰라제, 리파제 등 사료의 소화흡수에 도움을 주는 유용한 효소를 분비하는 등 프로바이오틱스로서 기능을 하기 때문에, 어류 및 갑각류의 사료 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규 바실러스속 프로바이오틱스 균주{A novel Bacillus sp. probiotics strain}

본 발명은 신규 프로바이틱스 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

현재, 바다양식은 대량, 고밀도 사육이 행해지고 있고, 이러한 양식어류는 많은 스트레스와 병원성 세균에 노출되고 있어 각종 항생제 제품을 사료와 합하여 투여하므로써 질병예방 및 증체율향상을 유도하고 있다. 그러나, 최근에는 동물 및 어류에게 예방학적 차원에서 사용하고 있는 항생제를 경보호차원에서 그 사용을 규제하고 있고, 또한 일부 이에 대해 법적 규제를 행하고 있다. 따라서, 항생제 대신에 천연 유래의 프로바이오틱스를 사용하고자 하는 시도가 등장했고, 실제로, 동물 및 어류에 프로바이오틱스로서 유산균을 투여했을 때, 그 효과가 우수한 것으로 보고된 바도 있다(Simirnov, V.V. et al., Microbiol. Z. 55(4): 92, 1993).

프로바이오틱스(Probiotics)란 살아있는 생균제로서 사람 및 동물에 투여된 생균이 장내의 소화관 벽에 밀집, 정착하여 유해균이 정착하지 못하게 하는 작용을 하며, 유산을 생성하여 장내의 pH를 낮추어서 유해세균이 증식하지 못하게 하는 역할을 수행한다. 또한, 투여된 생균제는 박테리오신(Bacteriocin) 혹은 과산화물을 생성하여 병원균의 증식을 억제하며 영양분의 흡수를 담당하는 장융모의 활동을 도와준다. 이밖에도, 생균제는 영양소의 흡수와 이용을 돕는 물질을 생성하고, 사료요구율을 개선시키며, 병원균이 생성하는 독성물질을 중화하는 물질을 생성하기도 한다. 생균제는 대체로 동물 혹은 어류가 스트레스로 인한 소화관의 유용균 감소를 제할 목적으로 이용되며, 항생물질을 경구투여하고 난 후 병원균보다 먼저 세균이 없는 소화관 벽에 부착하여 병원균이 정착하는 것을 방지한다.

그러나, 유산균은 종-특이성(Species-specificity)이 있어 사용하고자 하는 동물의 장세포와 어떤 친화력이 있어서 분과 함께 증식되는 데로 배설되지 않고, 장내 흡착하는 특성이 있어야 효과적인 질병 예방 및 치료효과를 얻을 수 있다(Conway, P.L. et al., J. Dairy Sci. 70:1, 1987), Fuller et al., Am. J. Clin. Nutri. 27: 1305, 1974). 그럼에도 불구하고, 현재 프로바이오틱스(Probiotics)로서 사용하고 있는 대부분의 유산균 속들은 사람 및 육상동물의 장내에서 쉽게 분리되는 특성이 있으며, 이를 사람 및 육상동물 뿐만 아니라 해상 및 담수에 생육하는 어류에도 적용하고 있는 실정이다.

더구나, 가축에 대한 생균제의 개발은 전 세계적으로 많이 연구되어 있어 많은 제품들이 상품화되어 있으나, 어류에 대한 생균제의 제품은 그렇게 많지가 않으며, 현재까지 국내에서 사용되고 있는 어류 전용 프로바이오틱스 제품은 대부분 외국에서 수입되는 균주로써 국내의 어류의 생육환경에 잘 적응하지 못하고 있는 실정이다. 또한, 해양어류에 프로바이오틱스로 사용하는 미생물의 유래가 어류에서 분리된 균주라기보다는, 대부분이 포유동물에서 분리되어 포유동물과 함께 사용하고 있어 어류에 대한 효과에 의구심을 불러일으킨다. 게다가, 원료의 수입으로 인하여, 수입에서 국내 유통간의 시간적인 차이로 인한 안정성의 결핍으로 균체의 콜로니형성도(Colony Forming Unit)가 낮다는 점도 상당한 문제점으로 제시되고 있다.

어류용 프로바이오틱스와 관련하여 국내의 선행기술을 살펴보면, 대한민국 특허등록 제206454호는 어류의 장에서 분리한 락토바실러스속 DS-12 균주 및 이를이용한 프로바이오틱스를 개시하고 있고, 대한민국 공개특허 제2008-0104846호는 뱀장어 유래의 락토바실러스 펜토서스 PL-11 균주 및 이를 이용한 뱀장어 전용 프로바이오틱스를 개시하고 있다. 그러나, 전자의 경우 넙치 및 방어의 연쇄구균증의 원인균인 스트렙토코커스속 균에 대한 항균활성이 없고, 후자의 경우에는 배양상층액을 고농도로 처리하는 경우에만 항균활성을 나타나내며, 뱀장어 전용이라는 점에서 활용도가 떨어지는 단점이 있다.

따라서, 상기와 같은 문제점을 극복한 어류용 전문 생균제가 국내 및 세계적으로 절실히 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 어류 및 갑각류용 생균제로 사용가능한 신규 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신규 균주를 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규 균주를 포함하는 어류 또는 갑각류용 사료첨가제를 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명은 상기 신규 균주를 포함하는 어류 또는 갑각류 양식용 사료를 제공한다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위해, 신규 바실러스속 2-4(KCCM11107P) 균주를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 신규 균주를 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.

본 발명은 아울러, 상기 신규 균주를 포함하는 어류 및/또는 갑각류 양식용 사료 첨가제를 제공한다.

본 발명은 더 나아가, 상기 사료 첨가제를 포함하는 어류 및/또는 갑각류 양식용 사료를 제공한다.

본 발명은 뿐만 아니라, 상기 사료를 양식중인 어류 및/또는 갑각류에 급이하는 단계를 포함하는 양식 어류 및/또는 갑각류의 병원균에 의한 집단 폐사를 예방하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명자들은 프로바이오틱스로 사용가능한 신규 바실러스속 2-4 균주를 제공한다.

본 발명의 신규 바실러스속 2-4 균주는 양식 새우의 내장으로부터 분리되었다. 구체적으로 본 발명자들은 국내 새우양식장의 소장과 췌장을 대상으로 BHI와 MRS 한천 배지를 이용하여 형태적으로 다른 400 균주를 선별하였고, 항균 활성 스크리닝을 통해 항균활성이 뛰어난 한 균주를 선별하여, 이에 대한 16S rDNA 염기서열을 결정한 결과(서열번호 1), Bacillus 속에 속하는 신규한 균주임을 확인하였다(도 1 및 2 참조).

상기 신규 Bacillus sp. 2-4 균주는 30℃의 온도에서 배양시간이 경과함에 따라 세포 성장 및 항균활성이 완만하게 저하되는 경향을 나타냈으며(도 3 참조), 대표적인 어류 병원균인 Edwardisella tarda, Streptococcus iniae 및 Vibrio anguillarum에 대해서는 강한 항균활성을 나타냈고, Vibrio harveyi 및 Streptococcus parauberis에 대하여는 약한 항균활성을 타나내었다(도 4 참조).

뿐만 아니라, 본 발명의 신규 Bacillus sp. 2-4 균주는 프로테아제, 아밀라제, 리파제 및 CMCase와 같은 유용 효소를 분비하여, 사료첨가제로서 매우 적절한 균주임을 알 수 있었다(도 5 참조).

특정 균주가 사료 첨가제로 사용되기 위해서는, 자체적으로 병원성이지 않아야 하며, 어류의 부화나 어류 및 갑각류의 사료로 사용되는 물벼룩(로티퍼)과 알테미아의 생육에 영향을 미치지 않아야 한다. 본 발명의 신규 Bacillus sp. 2-4 균주는 넙치의 부화에 전혀 영향을 미치지 않을 뿐만 아니라, 로티퍼 및 알테미아의 활력에 전혀 영향을 미치지 아니하였다(표 1 내지 3 참조).

더 나아가, 본 발명의 신규 Bacillus sp. 2-4 균주는 생체 실험 결과 현저한 프로바이오틱스 효과가 나타났다. 구체적으로 본 발명의 발명자들은 넙치 E. tarda를 넙치에 복강주사로 감염시킨 후, 신규 Bacillus sp. 2-4 균주를 사료에 섞어 급이한 후, 상기 Bacillus sp. 2-4 균주를 급이하지 않은 대조군에 비교하여 폐사 개체수를 조사한 결과, 대조군에 비하여 폐사 개체수가 유의하게 낮음을 확인하였다(도 6 내지 7 참조).

따라서, 본 발명의 신규 Bacillus sp. 2-4 균주는 어류 및 갑각류의 양식을 위한 프로바이오틱스로서 유용하게 사용가능함을 알 수 있다. 이에, 본 발명은 상기 Bacillus sp. 2-4 균주를 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다. 본 발명의 프로바이오틱스 제제에는 상기 유효성분 외에도 약학적, 식품학적 또는 사료용으로 허용되는 공지의 담체 또는 첨가제가 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 Bacillus sp. 2-4 균주를 유효성분으로 포함하는 사료첨가제를 제공한다. 본 발명의 사료첨가제는 상기 유효성분 외에도 약학적, 식품학적 또는 사료용으로 허용되는 공지의 담체 또는 안정제 등 첨가제를 가할 수 있으며, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다. 본 발명의 사료첨가제를 공급하는 경우는 어류 또는 갑각류에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.

본 발명의 대상이 되는 어류는 도미, 넙치, 우럭, 참돔, 민어, 숭어, 능성어 등의 해산어류 및 뱀장어, 은어, 산천어, 송어, 쏘가리 등의 육상어류인 것이 바람직하며, 넙치, 우럭, 참돔인 것이 더욱 바람직하나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다. 갑각류는 흰다리 새우(Litopenaeus vannamei), 보리새우(Marsupenaeus japonicus), 페나에우스 모노돈(Penaeus monodon), 대하(Penaeus chinensis), 피나에우스 모르기엔시스(Penaeus morguiensis) 등을 포함하는 새우류 및 상해 게, 꽃게 등의 게류 등 인 것이 바람직하며, 흰다리 새우인 것이 더욱 바람직하며, 남미 흰다리 새우(Penaeus vannanei)인 것이 가장 바람직하나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.

아울러, 본 발명은 상기 Bacillus sp. 2-4 균주가 함유된 어류 및/또는 갑각류 양식용 사료를 제공한다. 본 발명의 Bacillus sp. 2-4 균주는 포자형성이 가능한 그람양성균이므로, 포자 형태로 제형화되는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 사료는 특별히 한정되는 것은 아니고, 분말사료, 고형사료, 모이스트 펠릿사료, 드라이 펠릿사료, EP(Extruder Pellet) 사료, 날먹이 등 어떠한 사료라도 무방하다.

이 때, 상기 사료는 통상의 사료와 동일한 양 및 급이 간격으로 공급되는 것이 바람직하며, 상기 병원균은 Edwardisella tarda, Streptococcus iniae, Vibrio anguillarum, Vibrio harveyi 또는 Streptococcus parauberis인 것이 바람직하고, Edwardisella tarda, Streptococcus iniae 또는 Vibrio anguillarum인 것이 더욱 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 신규 Bacillus sp. 2-4는 어류의 부화 및 어류의 먹이인 물벼룩 및 알테미아의 활력에 아무 영향을 주지 않으면서도, 어류의 병원균인 Edwardisella tarda, Streptococcus iniae 및 Vibrio anguillarum에 대한 강한 항균활성을 보일 뿐만 아니라, 생체에 유용한 다양한 효소를 분비하므로, 프로바이오틱스 및 사료 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 Bacillus sp. 2-4 균주의 한천배지에서의 배양된 모습을 촬영한 사진이다.
도 2는 본 발명의 Bacillus sp. 2-4 균주의 16S rDNA의 염기서열을 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명의 Bacillus sp. 2-4 균주의 용혈성을 나타낸 그림이다.
도 4는 본 발명의 Bacillus sp. 2-4 균주의 배양 시간에 따른 세포성장과 항균 작용을 나타낸 그래프이다.
도 5은 본 발명의 Bacillus sp. 2-4 균주의 어류 병원성 세균에 대한 항균활성을 나타낸 사진이다.
도 6은 본 발명의 Bacillus sp. 2-4 균주의 다양한 효소 생산능을 나타내는 사진이다.
도 7 및 8은 본 발명의 Bacillus sp. 2-4 균주의 생체 내 항균활성을 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예를 통해 설명하기로 한다. 본 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로서 본 발명의 범위가 본 실시예로 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 균주의 분리 및 동정

본 발명자들은 프로바이오틱스로 사용가능한 신균주를 발굴하기 위해, 국내 새우양식장에서 수득한 새우의 내장과 췌장을 분리하여, 항균 활성이 우수한 균주를 선별하였다. 구체적으로, BHI(Brain Heart Infusion)와 MRS(de Man, Rogosa and Sharpe) 한천 플레이트 상에 새우 내장과 췌장 균질물을 도말한 후 30℃에서 배양하여, 형태적으로 다른 400 균주를 1차 선별하였다. 이어, 이들 균주를 각각 BHI와 MRS 배지에서 48시간 배양 후 배양상층액을 5배 농축하였다. 항균활성 측정을 위하여 Vibrio harveyi 균을 BHI 한천 플레이트에 도말하고 0.8 cm Paper-disk에 농축 배양생층액 50 ㎕를 분주한 후 저지대를 형성하여 항균활성을 보이는 균주를 2차 선별하였다. 이들 균주 중에서 항균 활성이 뛰어난 균주를 최종적으로 선별하였다(도 1). 이 균주는 그람 양성간균으로 생화학적 특성을 분석하기 위하여 API 50 CHB system(한국미생물보존센터)으로 균주의 당 발효 패턴을 분석하였다(표 1). 그리고 분자생물학적 분석을 위하여 16S rDNA에 대한 염기서열을 분석한 결과(도 2), 그람 양성 간균으로서, Bacillus subtilis X-10 균주의 16S rDNA 염기서열과 99% 이상의 상동성을 가진 것으로 판정되었다. 이들 결과를 바탕으로 분리균주를 Bacillus sp. 2-4 균주로 명명하였으며, 이를 2010년 10월 6일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여, 수탁번호 KCCM11107P를 부여받았다.

Bacillus sp. 2-4 균주의 당 발효 패턴 분석

대조구	-	에스쿨린(Esculine)	+
글리세롤(Glycerol)	+	살리신(Salicine)	+
에리쓰리톨(Erythritol)	-	셀로비오스(Cellobiose)	+
D-아라비노스(D-Arabinose)	-	말토스(Maltose)	+
L-아라비노스(L-Arabinose)	+	락토스(Lactose)	+
리보스(Ribose)	+	멜리비오스(Melibiose)	_
D-자이로스(D-Xylose)	+	사카로스(Saccharose)	+
L-자이로스(L-Xylose)	-	트레할로스(Trehalose)	_
아도니톨(Adonitol)	-	이뉼린(Inuline)	_
β메틸-자이로시드(βMethyl-xyloside)	-	메레지토스(Melezitose)	_
갈락토스(Galactose)	-	D-라피노스(D-Raffinose)	+
D-글루코스(D-Glucose)	+	아미돈(Amidon)	_
D_프룩토스(D-Fructose)	+	글리코진(Glycogene)	+
D-만노스(D-Mannose)	+	자일리톨(Xylitol)	_
L-솔보스(L-Sorbose)	_	β겐티오비오스(βGentiobiose)	_
람노스(Rhamnose)	_	D-튜라노스(D-Turanose)	_
둘씨톨(Dulcitol)	_	D-리쏘스(D-Lyxose)	_
이노시톨(Inositol)	+	D-타가토스(D-Tagatose)	_
만니톨(Mannitol)	+	D-푸코스(D-Fucose)	_
소비톨(Sorbitol)	+	L-푸코스(L-Fucose)	_
α메틸-디만노시드(Methyl-Dmannoside)	_	D-아라비톨(D-Arabitol)	_
α메틸-글루코시드(Methyl-glucoside)	+	L-아라비톨(L-Arabitol)	_
N 아세틸 글루코사민(N Acetyl glucosamine)	_	글루코네이트(Gluconate)	_
아미그다린(Amygdaline)	+	2 세토-글루코네이트(2 ceto-gluconate)	_
아뷰틴(Arbutine)	+	5 세토-글루코네이트(5 ceto-gluconate)	_

+, 양성 -, 음성

실시예 2: 용혈성 분석

β-용혈이란 유해균 중 인지질 효소를 생산하여 적혈수에 의해서 공급되는 인지질을 가수분해하여 적혈구를 용혈시키는 작용이다. 본 발명의 Bacillus sp. 2-4 균주의 용혈성을 알아보기 위하여 5% 양혈(sheep blood, 기산바이오텍, 대한민국)이 함유되어 있는 TSA(Difco, USA)제조하였다. 제조된 혈액한천배지에 선형 접종(streaking)한 후, 37℃에서 24시간 배양하여 용혈 여부를 확인한 결과 도 3와 같이 용혈성을 나타내지 않아서 비병원성의 안정한 균주임을 확인 할 수 있었다.

실시예 3: 항균활성 분석

본 발명자들은 상기 Bacillus sp. 2-4 균주의 항균활성을 다양한 방법으로 분석하였다.

우선, 본 발명의 Bacillus sp. 2-4 균주를 30℃, BHI 배지에 1% 재접종 후 배양하면서 배양시간에 따른 항균활성을 조사하였다(도 4). 정량적 항균활성은 대조군으로 V. harveyi만 배양하고 실험구로 V. harveyi와 본 발명의 균주를 함께 배양하면서 시간대별로 배양액의 흡광도를 측정하여 600 nm에서 흡광도 0.01 감소값을 1 unit로 계산하였다. 그 결과 48시간까지는 높은 항균활성을 보였으나, 배양시간이 길어질수록 항균활성이 떨어졌다. 그러나, 이는 시험관내 배양에 의한 결과이므로, 동물의 장내에서도 동일한 특성을 나타낼 것이라고 보기는 어렵다.

실시예 4: 항균 스펙트럼 분석

본 발명자들은 본 발명의 Bacillus sp. 2-4 균주의 항균 범위가 어느 정도인지 확인하기 위해, 다양한 어류 병원성 미생물에 대한 항균 활성을 할로테스트를 통해 분석하였다. 구체적으로, 어류 병원성 미생물인 Edwardsiella tarda, Streptococcus iniae, Vibrio anguillarum, Vibrio harveyi 및 Streptococcus parauberis를 각각의 균의 생장에 적합한 배지에서 배양시킨 후, 상기 배지가 함유된 한천 배지위에 도말한 후, 0.8 cm 직경의 종이 디스크를 올린 다음, 본 발명의 Bacillus sp. 2-4 균주를 30℃에서 48시간 배양하여 균 농도가 1.0×10⁸ cfu/ml에 이르렀을 때, 원심분리하여 수득한 5배 농축 배양 상등액을 50 ㎕ 정도 떨어뜨린 후, 25-30℃에서 24-48시간 배양한 후, 형성된 투명환의 크기를 측정하였다. 그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이, 본 발명의 Bacillus sp. 2-4 균주는 E. tarda, S. iniae 및 V. anguillarum에 대하여는 강한 항균 활성을 나타내었고, V. harveyi 및 S. parauberis에 대하여는 약한 항균활성을 타나내었다.

실시예 5: 효소 분비능 분석

본 발명자들은 본 발명의 Bacillus sp. 2-4 균주가 유용한 효소를 분비하는 지 확인하기 위해, 다양한 기질에 대한 분해능을 조사하였다. 먼저, 단백질과 지방분해효소 활성을 조사하기 위해, 탈지분유(skim milk)와 1% 트리카프릴린(Tricaprylin)가 도말된 배지 위해 본 발명의 Bacillus sp. 2-4 균주를 도말하고, 30℃에서 24시간 동안 배양한 후, 균주의 도말 부위 주변에 투명환이 생성되는지 확인하였다. 그 결과 도 6의 a 내지 b에서 보는 바와 같이, 투명환이 생성됨을 확인할 수 있었다. 이어, 본 발명자들은 본 발명의 균주에 아밀라제 및 카르복시메틸셀룰라제(CMCase) 활성이 있는지 확인하기 위해, 각각 수용성 녹말 및 카르복시메틸셀룰로오스가 도포된 한천 평판배지 위에 종이디스크를 놓고 실시예 3에서 사용한 본 발명의 균주의 5배 농축 배양상등액을 50 ㎕ 떨어뜨린 후, 실온에서 16시간 정치시킨 후, 투명환의 생성여부를 관찰하였다. 그 결과, 도 6의 c 내지 d에서 보이는 바와 같이, 아밀라제 및 CMCase 활성이 관찰됨을 확인하였다. 이들 효소는 사료내에 포함된 다양한 바이오매스의 분해를 촉진시켜, 사육하는 개체로 하여금 사료의 효율적인 소화를 돕기 때문에, 이들 효소를 분비하는 비병원성 균은 사료첨가제로 활용가치가 높다. 따라서, 본 발명의 Bacillus sp. 2-4 균주는 사료의 소화 흡수 측면에서도 매우 유용한 균주임을 알 수 있다.

실시예 6: 어류 난 부화 실험

특정 박테리아가 어류의 사료 첨가제로 사용되기 위해서는 비병원성일 뿐만 아니라, 어류 알의 부화에 대한 영향이 없어야 한다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명의 균주의 존재하에서 넙치 알의 부화율을 측정하였다. 구체적으로, 수정된 후 12시간이 경과한 넙치 알 120개 정도를 세어 멸균 해수가 담긴 비이커에 넣고, 본 발명의 균주와 E. tarda를 표 2에 기재된 농도로 접종한 후, 1일 경과 후 부화율을 측정하였다. 그 결과, 표 3에서 보는 바와 같이, 본 발명의 균주는 넙치 알의 부화에 전혀 영향을 미치지 아니하였다. 반면, E. tarda의 경우에는 고농도로 처리할 경우, 폐사 두수가 증가하였으며, 이러한 양상은 본 발명의 균주를 첨가시 억제됨을 알 수 있었다.

어류 난 부화에 미치는 Bacillus sp. 2-4의 영향

실험구	E. tarda	폐사 마리수	생존 마리수	기타
1X10⁶ (Bacillus sp. 2-4 처리구)	no E. tarda	7	105
	1×10⁵ E. tarda	9	111
	1×10⁶ E. tarda	6	97
	1×10⁷ E. tarda	5	110
E. tarda만 처리구	no E. tarda	7	100
	1×10⁵ E. tarda	15	98
	1×10⁶ E. tarda	8	102
	1×10⁷ E. tarda	7	95

로티퍼 활력에 미치는 Bacillus sp. 2-4의 영향

		로티퍼 균수 측정
		1회	2회	3회	4회	5회	6회	7회	8회	9회	10회	로티퍼 평균수
1회	대조구	7	7	6	6	6	6	5	6	5	7	6.1
1회	1×10⁶ (Bacillus sp. 2-4 처리구)	7	6	6	5	7	5	8	5	5	7	6.1
2회	대조구	12	8	8	12	13	9	10	10	10	9	10.1
2회	1×10⁶ (Bacillus sp. 2-4 처리구)	12	9	9	12	12	8	7	10	8	9	9.6

실시예 6: 물벼룩 및 알테미아의 활력에 미치는 영향 조사

박테리아가 어류 및 갑각류의 양식용 사료 첨가제로 사용되기 위해서는 이들에 대한 주 먹이인 물벼룩(로티퍼)와 알테미아의 생존 및 활력에 영향을 미쳐서는 안된다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명의 균주가 로티퍼 및 알테미아 새우의 활력에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다. 구체적으로 동수의 로티퍼를 각각 일반 멸균 해수(대조군)와 본 발명의 균주를 10⁶ CFU/ml로 접종한 멸균 해수에 넣은 후 상온에서 24시간 방치 후, 살아 있는 로티퍼의 개체수를 측정하였다. 그 결과, 표 2에서 보는 바와 같이, 대조군과 비교할 때, 본 발명의 균주의 접종군에서의 로티퍼의 활력은 변화가 없었다. 이어, 본 발명자들은 다른 사료용 플라크톤인 알테미아의 활력에 대한 본 발명의 Bacillus sp. 2-4 균주의 영향을 조사하였다. 구체적으로 동수의 알테미아를 일반 멸균 해수와 본 발명의 균주를 10⁶ CFU/ml로 접종한 멸균 해수에 넣고 상온에서 24시간 방치 후, 살아 있는 알테미아의 개체수를 측정하였다. 그 결과, 표 4에서 보는 바와 같이, 본 발명의 균주는 알테미아의 활력에 영향을 미치지 아니하였다.

알테미아 활력에 미치는 Bacillus sp. 2-4의 영향

		알테미아 균수 측정
		1회	2회	3회	4회	5회	6회	7회	8회	9회	10회	알테미아 평균수
1회	대조구	6	4	5	6	6	6	6	7	4	4	5.4
1회	1×10⁶ (Bacillus sp. 2-4 처리구)	4	6	5	4	5	4	6	5	6	6	5.1
2회	대조구	5	4	6	6	5	4	8	6	4	5	5.3
2회	1×10⁶ (Bacillus sp. 2-4 처리구)	4	5	6	6	7	5	4	5	6	4	5.2

실시예 7: 프로바이오틱스 효과 분석

본 발명자들은 실제 본 발명의 균주를 사료에 첨가하여 어류에 공급하는 경우, 프로바이오틱스로서 작용을 하는지 알아보기 위해, 실제 본 발명의 균주를 사료에 혼합하여 공급한 후, 대표적인 어류 병원균인 E. tarda를 넙치의 복강에 주사한 후, 폐사 개체수를 조사하였다.

구체적으로, 사료는 표 5와 같이 생균제 첨가사료는 본 발명의 균주 배양체 분말을 0.5%(w/w)로 혼합하고 대조구는 셀룰로오스를 첨가하려 동일하게 맞추어서원료를 혼합 후 사용하였다. 생균제 효과검증을 위하여 공격실험시 넙치(각 80마리)에 대조구와 생균제 첨가사료를 각각 한 달간 급이 후 E. tarda 균 1×10⁶ 세포를 복강주사하고 수온 13-14℃에서 20일간 사육하면서 누적폐사 개체수를 기록하였다. 그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이, 대조군 그룹에 비해 생균제 첨가 그룹에서의 누적 폐사 개체수가 더 적음을 알 수 있었다.

프로바이오틱스 효과검증을 위한 사료조성 표

대조구		생균제
원료명	%	원료명	%
Fishmeal	65.6	Fishmeal	65.6
Wheat meal	20.4	Wheat meal	20.4
Squid liver oil	5.5	Squid liver oil	5.5
Soybean meal	3.0	Soybean meal	3.0
Vitamine premix	1.0	Vitamine premix	1.0
Mineral premix	1.0	Mineral premix	1.0
CMC	3.0	CMC	3.0
cellulose	0.5	생균제(Bacillus sp. 2-4)	0.5
Total	100	Total	100

아울러, 본 발명자들은 계절별 차이점을 알아보기 위해, 표 5와 같이 사료를 제조 후 대조군과 본 발명의 균주를 0.5%(w/w)으로 혼합한 사료를 넙치(각 그룹별 110마리)에 한 달간 급여 하고 각각 E. tarda 5×10⁵를접종한 후, 수온 20 내지 22도에서 2주간 사육하여 누적 폐사 개체수를 기록하였다. 그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이, 본 발명의 균주를 공급한 그룹의 폐사율은 대조군의 폐사율의 약 60% 수준에 불과하였다. 어류 전염병이 빈번하게 발생하는 여름철에도 본 발명의 균주가 어류의 집단폐사의 예방에 효과적임을 보여주는 것이다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11107P

20101006

서열목록 전자파일 첨부

Claims

프로바이오틱스 활성을 갖는 신규 바실러스속 2-4(KCCM11107P) 균주.
제 1 항의 균주를 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제.
제 1 항의 균주 유효성분으로 포함하는 어류 및/또는 갑각류 양식용 사료 첨가제.
제 3 항의 사료 첨가제를 포함하는 어류 및/또는 갑각류 양식용 사료.
제 4 항의 사료를 양식중인 어류 및/또는 갑각류에 급이하는 단계를 포함하는 양식 어류 및/또는 갑각류의 병원균에 의한 집단 폐사를 예방하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 병원균은 Edwardsiella tarda, Streptococcus iniae, Vibrio anguillarum, Vibrio harveyi 또는 Streptococcus parauberis인 방법.