KR101230813B1

KR101230813B1 - 사프로레그니아 속 미생물에 대한 생물학적 방제용 프로바이오틱스

Info

Publication number: KR101230813B1
Application number: KR1020110009792A
Authority: KR
Inventors: 양시용; 우서형; 강인혜; 서효실
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2011-01-31
Filing date: 2011-01-31
Publication date: 2013-02-06
Also published as: WO2012105804A2; KR20120088436A; RU2555549C2; RU2013138150A; WO2012105804A3

Abstract

본 발명은 사프로레그니아 속 미생물(Saprolegnia sp.)에 대한 생물학적 방제용 프로바이오틱스에 관한 것으로, 구체적으로, 병원성 곰팡이인 사프로레그니아(Saprolegnia sp.)의 생육을 저해하고 사이드로포어를 생산하는 신규 분리한 바실러스 균주, 상기 균주를 배양하여 수득한 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물과 상기 균주, 배양액, 농축액 또는 건조물을 포함하는 프로바이오틱스 제제, 사료첨가제, 항균제, 항곰팡이제 또는 수질개선제, 및 상기 균주, 배양액, 농축액 또는 건조물을 이용하여 어류 또는 갑각류를 양식하는 방법, 상기 균주, 배양액, 농축액 또는 건조물을 부가하여 인간을 제외한 동물에서 수생 곰팡이성 질병을 예방하는 방법 또는 물에 상기 균주, 배양액, 농축액 또는 건조물을 처리하여 개질된 물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

사프로레그니아 속 미생물에 대한 생물학적 방제용 프로바이오틱스 { Probiotics Agent Against Saprolegnia sp.}

최근 세계 인구가 증가하고 생활 수준이 향상되면서 미국을 비롯한 유럽, 일본 등의 선진국에서는 성인병 예방을 위하여 식생활 개선에 대한 관심이 급증하고 있다. 이에 수산물의 수요가 지속적으로 증가되어 어류 양식의 생산량은 급증되고 있다. 따라서 양식업은 많은 나라에서 주요한 경제적 수단이 되고 있으며, 양식어류의 질병발생은 경제적 발전에 커다란 영향을 미치고 있는 실정이다(Jose Luis Balcazar et al. Veter.Microbio. 114(2006):173-186; Laurent venrschuere et al. Microbio.Mot. Biol.Rev. Dec. 2000.655-671).

양식장에서 발생하는 질병의 원인은 감염된 물고기로부터 전염되거나, 양식장 연안 수질환경에서 병원체가 유입되어 발생된다. 또한 공급되는 사료의 오염에 의해서 발생하거나 양어장 사육환경의 관리 불량에 따라 발생하게 된다. 어류의 감염성 질병에는 진균성, 병원성 세균성, 바이러스성 질병으로 나뉜다. 이 중 진균성 질병으로는 수생곰팡이인 사프로레그니아(Saprolegnia sp.)에 의한 질병이 대표적이다(어류질병 진단 및 치료대책. 해양수산부. 2001). 사프로레그니아는 담수 생태계에서 생육이 활발하여, 담수어의 곰팡이 감염을 일으키는 대표적인 물 곰팡이종이다. 어류에서, 사프로레그니아는 상피조직에 침입하여, 일반적으로 머리나 지느러미부터 시작해서 몸 전체의 표면으로 퍼져 양식장에서 심각한 질병을 일으킨다. 사프로레그니아에 의해 1차적으로 감염되기도 하지만, 바이러스나 세균과 같은 기생생물에 의해 어류의 외피에 1차적 손상이 일어난 후, 상기 손상부위를 통해 2차적으로 감염되는 것이 대부분인 것으로 보고되었다(Aquatic fungi and fish production in Egypt,Ⅱ- in vivo studies).

상기 사프로레그니아에 의한 피해를 방지하기 위하여, 현재까지는 합성 항진균제(예를 들어, 말라카이트 그린제제 등)를 사용하여 왔으나, 이들 합성 항진균제는 쉽게 생분해되지 않고, 환경에 축적되는 경향이 있어 환경 악화를 초래할 뿐만 아니라, 크고 작은 부작용을 나타내며, 이에 대한 내성균주가 발생하는 등의 문제점이 있어서 점차적으로 그의 사용을 제한하고, 이를 대체할 수 있는 제제를 개발하려는 노력이 계속되고 있다(Ebele M. et al. African Journal of Biotechnology Vol.8 (24),7130-7132, 2009). 이러한 노력의 일환으로, 미국 등록특허 제6160023호에는 곰팡이 등에 감염된 수상생물의 브로노폴(bronopol)을 방출하는 물질을 이용하여 곰팡이 감염, 프로토조아 감염, 세균성 아가미 질병에 감염된 수생생물을 치료하는 방법 및 브로노폴을 이용하여 수조, 어업용 장치를 소독하는 방법이 개시되어 있고, 국내 등록특허 제0782500호에는 스위트 플랙(sweet flag. acorus calamus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 어류의 진균성 질병 치료제가 개시되어 있다.

한편, 친환경 양식업의 요구가 증가됨에 따라 면역증강제로서 프로바이오틱스(probiotics)가 높은 관심을 받고 있다. 프로바이오틱스는 1989년 R. Fuller에 의해 “숙주동물의 장내 미생물 균총의 개선으로 숙주동물에 유익한 작용을 하는 생균제”라고 정의 되었다. 생균제로 사용되는 균주로는 락토바실러스, 엔테로코커스, 비피도박테리움, 바실러스 등의 세균류, 사카로마이세스를 포함하는 효모류, 아스퍼질러스 등을 포함하는 곰팡이류 등이 있다. 프로바이오틱스는 GRAS(Generally Recognized As Safe)로 분류되며, 사람과 동물에 대한 독성유전자를 보유하고 있지 않으며 병원성물질 또한 생산하지 않는다. 그리고 축산 생산성에 대한 개선 효능이 확인된 미생물이여야 한다. 생균제의 특징은 비병원성이며, in vitro 증식이 용이하며, 생체 내에서 빠른 성장을 하며, 내산성, 내담즙성을 가지고 있어야 한다. 또한 사료성분에 의한 활성이 억제되지 않아야 하며, 실온에서 효과를 유지하며, 사료에 혼합하여 사용하기 편리하여야 한다.

이러한 프로바이오틱스의 효능은, 강력한 부착력으로 장점막에 붙어 장질환을 유발하는 병원균을 경쟁적으로 떨어뜨려 밖으로 배설시켜주며, 항생제 투여에 따른 장내균총의 파괴를 신속히 회복시켜준다. 또한 병원성 미생물의 감염에 대한 예방효과와 증식을 억제하며, 장내 유익균의 발육에 최적인 환경 및 증식을 촉진하고, 장내 유기산의 주요 구성성분인 젖산이나 아세트산을 생산하며, 장내 pH를 낮춰 줌으로써 유해 병원균의 발육을 억제한다. 이에 여러가지 복합적인 작용에 의해 급여시 정상균총을 유지하고 가축의 생산성 향상을 도모할 수 있다. 또한, 양식에서의 프로바이오틱스는 사료에 첨가하거나 부수적으로 물에 투여하고 있다. 최근 양어 및 새우에 프로바이오틱스를 급여에 병원성에 대한 면역력 증강 및 수질 개선으로 인한 질병 개선에 대해 활발한 연구가 진행되고 있다(Jiqiu Li et al. Aquaculture 291(2009) 35-40). 이처럼 양식에서 생물 방제제로서 사용되는 프로바이오틱스는 락토바실러스와 엔테로코커스등 유산균과 바실러스를 들 수 있는데, 이 중 바실러스는 그람양성의 간균으로 내생포자를 형성하며 프로바이오틱스로 사용되는 균 중 독특한 형태를 가지고 있다. 이러한 바실러스 중에서 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 바실러스 세레우스(B. cereus), 바실러스 코어규란스(B. coagulans), 바실러스 클라우시(B. clausii), 바실러스 메가테리움(B. megaterium), 바실러스 리케니포미스(B. licheniformis)를 프로바이오틱스로 사용한다. 바실러스는 내생포자를 형성하지 않는 락토바실러스보다 내열성이 우수하다. 또한 위벽의 낮은 pH에도 생존하기 때문에 투여한 대부분의 균이 소장까지 도달할 수 있다(Barbosa,T.M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 71(2005)968-978; Spinosa, M. R. et al. Res. Microbiol. 151(2000):61-368). 이러한 바실러스는 사람의 건강보조제 및 동물의 성장촉진제, 양어 및 양식용 새우의 성장 촉진 및 질병 저항성 증강 목적으로 사용하고, 바실러스가 수질개선 및 양식새우의 성장 촉진을 시킬 뿐만 아니라 비브리오를 감소시킨다고 보고 되었다(Dalmin, G. et al. Indian J. Exp. Biol 39(2001) 939-942; Wang, Y.B. et al. Fish. Sci. 71(2005) 1034-1039).

한편, 사이드로포어는 병원성 세균들을 포함한 미생물들이 다른 미생물과의 경쟁하여 주어진 환경에서 빠르게 성장 및 증식하기 위하여 생산하는 일종의 항생물질로서, 철 이온(Fe3+)과 결합 후 철수송계(high-affinity iron-transport system)를 이용해 세포 내로 수송하며, 상기 철 이온(Fe3+)을 미생물의 생육에 이용한다. 미생물은 경쟁적으로 철 이온(Fe³ ⁺)을 이용하기 위하여 사이드로포어를 생산하며, 사이드로포어 생산이 많은 미생물에 의해 타 미생물의 생육이 억제되기도 한다. 이를 이용해 사이드로포어를 생산하는 미생물을 생물방제에 이용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 1970년대 저병해 경작지의 질병억제토양이 토양 내 미생물들의 길항작용에 의한 것으로 보고된 이후 생물학적 병해충 방제방법의 일환으로 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 등이 분비하는 철성분 특이 결합물질인 사이드로포어에 의해 식물병원균의 생육을 저해하는 경쟁적 길항작용(competition)을 이용한 방제방법에 대한 연구가 진행되었다(우상민 및 김상달, Kor. J. Microbiol. Biotechnol. Vol.36(4):326-335(2008)). 지금까지 알려진 바에 의하면, 사이드로포어는 가용성이고, 1kDa 미만의 저분자량을 가지며, 철 이온과 친화성이 우수한 대사산물이다. 사이드로포어는 철 이온을 결합하는 작용기에 따라 카테콜 종(catechol type)과 하이드록사메이트 종(hydroxamate type)으로 분류되고, 상기 사이드로포어 및 이를 생산하는 프로바이오틱스에 대하여 활발한 연구가 진행되고 있다. 이러한 연구의 일환으로, 미국 등록특허 제6746672호에는 비피도박테리아 속에서 생산되는 사이드로포어를 이용하여 락토코커스 락티스(L. lactis)의 성장을 억제하는 방법이 개시되어 있고, 한국 등록특허 제037043호에는 사이드로포어를 생산하는 신규한 길항균주 슈도모나스 플로오레센스 LS20, 상기 슈도모나스 플로오레센스 LS20을 이용하여 식물근부 병원균인 푸사리움 솔라니의 성장을 억제하는 생물학적 방제법 및 상기 사이드로포어를 이용하여 식물의 병원성 곰팡이로부터 유래된 질병을 치료하는 방법이 개시되어 있으며, 한국 등록특허 제0747700호에는 사이드로포어를 생산하는 바실러스 서브틸리스 및 이로부터 생산되는 사이드로포어를 유효성분으로 포함하는 고추역병균(Phytophtora capsici) 또는 토마토 시들음병균(Fusarium oxysporum)의 방제용 조성물이 개시되어 있다.

특허 분석 결과, 주로 사이드로포어 생산이 우수한 미생물을 이용하여 식물의 병원성 미생물 및 곰팡이의 생물학적 방제 효과에 관한 기술이 주를 이루었으며, 프로바이오틱스인 바실러스를 이용하여 어류 병원성미생물을 저해하기 위한 기술은 보고된 바 없다.

본 발명자들은 양어 및 새우에서 문제시 되고 있는 병원성세균에 대한 항균 및 소화효소 생산이 우수한 프로바이오틱스를 자연계에서 분리하고, 이들의 형태적, 생화학적 및 유전적 특성을 확인한 결과, 상기 프로바이오틱스가 내열성이 우수한 바실러스임을 확인하였으며, 상기 바실러스가 사이드로포어 생산성 및 수생곰팡이인 사프로레그니아의 억제 및 저해가 우수하다는 것을 확인하였다.

이에, 본 발명자들은 신규 분리한 바실러스 종이 수생곰팡이인 사프로레그니아 억제하며, 사이드로포어 생산성이 우수하여 철분을 포획하는 능력이 뛰어남에 따라 병원성세균에 대한 경쟁적 길항작용을 하며, 양식어류 및 갑각류용 프로바이오틱스 제제로 사용할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 사프로레그니아 생육 저해 및 사이드로포어를 생산하는 신규 분리한 바실러스 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 균주를 배양하여 수득할 수 있는 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 균주, 배양액, 농축액 또는 건조물을 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 균주, 배양액, 농축액 또는 건조물을 포함하는 사료첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주, 배양액, 농축액 또는 건조물을 이용하여, 어류 또는 갑각류를 양식하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 균주, 배양액, 농축액 또는 건조물을 포함하는 항균제 또는 항곰팡이제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주, 배양액, 농축액 또는 건조물을 부가하여, 수생 곰팡이성 질병을 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주, 배양액, 농축액 또는 건조물을 포함하는 수질개선제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 물에 상기 균주, 배양액, 농축액 또는 건조물을 처리하여 개질된 물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태로서, 신규 분리한 바실러스 종 균주 CJP-14( Bacillus sp., CJP-14)(KCCM11143P)를 제공한다. 상기 균주는 사이드로포어를 생산하고, 사프로레그니아 생육을 저해할 수도 있다.

구체적으로 강화도 일대의 새우 양식장을 중심으로 하여 해수 유래 시료를 채취하여, 3 % 염화나트륨이 첨가된 BHI 고체배지에서 배양 한 후 콜로니 관찰에 따라 그룹화하여 균주들을 분리하였다.

분리 균주들 중 양식어류의 대표적 병원성 세균인 에어로 모나스 살모네시다, 비브리로 하베이, 비브리오 앙길라룸, 에드워드 시엘라 타다, 스트렙토코커스 이니에, 비브리오 헤모라이티쿠스에 대한 항균활성이 우수한 균주를 1차 선발하였다.

또한 항균활성이 우수한 1차 선발균주 중 프로테이즈, 셀룰레이즈, 아밀레이즈, 라이페이즈와 같은 유용 소화효소의 활성이 우수한 균주를 6종을 2차 선발하였다.

2차 선발 균주 중 담수어에서 문제가 되고 있는 병원성 곰팡이인 사프로레그니아의 활성 억제 효과가 우수하며, 사이드로포어 생산성이 우수하여 철분(Fe3+)의 포획능력이 뛰어남에 따라 다른 병원성 세균의 생육을 저해하는 경쟁적 길항작용을 할 수 있는 바실러스 종 CJP-14를 최종 선발하였다.

바실러스 종 CJP-14의 형태학적 특징은 그람 양성 간균이었으며, 16s rDNA 염기서열 분석결과 바실러스 종(Bacillus sp. W30)과 99% 상동성을 가지고 있었다. 상기 결과를, 종래의 사이드로포어를 생산하는 바실러스 서브틸리스 AH18의 16s rDNA 염기서열이 Bacillus subtilis strain CICC 10088의 것과 98% 상동성을 나타낸다는 결과와 비교하면(참조: 대한민국 특허등록 제0717700호), 본 발명의 균주는 종래에 알려지지 않았던 새로운 균주임을 알 수 있었다. 또한, 본 발명의 균주는 사이드로포어 뿐만 아니라, 셀룰레이즈, 프로테이즈, 아밀레이즈, 라이페이즈 등을 생산할 수 있음에 반하여, 상기 바실러스 서브틸리스 AH18은 사이드로포어 이외에 셀룰레이즈와 옥신을 생산할 수 있을 뿐이므로, 본 발명의 균주가 종래에 알려지지 않았던 새로운 균주임을 다시 한번 확인할 수 있었다.

이에 본 발명자들은 신규 분리한 바실러스 종 CJP-14를 사단법인 한국종균협회(서울특별시 서대문구 홍제1동 361-221 유림빌딩 3층, 한국미생물보존센터내 소재)에 2010년 12월 14일자로 "Bacillus sp. CJP-14"로 기탁하였다(KCCM11143P).

본 발명의 다른 양태로서, 상기 신규 분리한 바실러스 종 균주를 배양한 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 배양액은 상기 신규 분리한 바실러스 종 균주 CJP-14를 배양한 배지를 의미하고, 바람직하게는 상기 균주가 포함된 배양 배지이다.

본 발명에서 배양배지란, 동물세포, 식물세포, 또는 세균등을 기르는데 필요한 영양소가 들어있는 배지를 의미하고, 배양액이란, 액체배지에 균주를 접종하여 배양한 것을 의미한다. 상기 배양액은 균주를 포함한 것, 또는 균주를 접종하여 배양한 후, 제균 즉 균주를 제거한 배양여액일 수 있다. 상기 배양액의 농축액이란 상기배양액을 농축한 것을 말하고, 상기 배양액의 건조물이란 상기 배양액의 물기를 없앤 것을 의미한다. 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태로서, 상기 신규 분리한 바실러스 종 균주 또는 상기 균주의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 양제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 완충식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 반산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화 할 수 있다.

본 발명의 프로바이오틱스에 포함된 유효성분인 신규 분리한 바실러스 종 균주는 양식되는 어류 또는 갑각류의 소화관 벽에 정착하여 유해균이 정착하지 못하게 하며, 병원균의 증식을 억제한다. 또한, 상기 균주로부터 생산되는 유익한 소화효소는 영양소의 흡수와 이용을 용이하게 하여 사료의 요구율을 개선시킨다.

본 발명의 상기 제제는 5 x 10⁴내지 5 x 10¹⁰ CFU/ml을 포함하며, 바람직하게는 1 x 10⁶내지 1 x 10⁹ CFU/ml의 바실러스 종 CJP-14을 포함한다.

본 발명의 제제는 바람직하게는 경구 투여용 제형으로 제조될 수 있는데, 상기 경구 투여용 제형은, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화 할수 있다. 정제 및 캡슐등의 제형으로 제제화 하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 마니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활류를 포함할 수 있으며, 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 신규 분리한 바실러스 종 균주 또는 상기 균주의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 포함하는 사료첨가제를 제공한다.

통상적으로, 바실러스 종은 내생포자를 형성하여 열에 매우 안정적인 특징을 가지고 있다. 따라서 상기 신규 분리한 바실러스 종 CJP-14은 사료 첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합시키거나, 사료 제조 시 직접 첨가시켜 제조할 수 있다. 본 발명의 사료 내 바실러스 종 CJP-14은 액상 또는 건조상태 일 수 있으며, 바람직하게는 건조된 분말형태이다. 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 바실러스 종 CJP-14은 분말형태로 사료 중량의 0.05 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1% 내지 1 중량%의 성분비로 혼합될 수 있다. 또한 상기 수산양식용 사료는 본 발명의 바실러스 종 CJP-14외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서의 바실러스 종 CJP-14을 포함하는 사료에는 식물성으로는 곡물류, 근과류, 식품가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류 등이 있으며, 동물성으로는 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질, 동물성플랑크톤류, 어분 등이 있으며 이에 한정된 것은 아니다.

본 발명에서의 바실러스 종 CJP-14을 포함하는 프로바이오틱스제에는 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등이 있고, 효용 증대를 위하여 사료에 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 향미제, 비단백질태질소화합물, 규산염제, 완충제, 추출제, 올리고당 등이 있다. 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있으며 이에 한정된 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 신규 분리한 바실러스 종 균주 또는 상기 균주의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 어류 또는 갑각류의 양식장에 처리하는 단계를 포함하는 어류 또는 갑각류의 양식방법을 제공한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 신규 분리한 바실러스 종 CJP-14는 광범위한 항균활성과 함께 다른 병원성 세균의 생육을 저해하는 경쟁적 길항작용을 할 수 있으므로, 상기 균주를 이용하면 양식어류의 대표적 병원성균들에 의해 유발되는 질병을 예방하는 효과를 얻을 수 있어, 보다 안전하게 어류 또는 갑각류를 양식할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 신규 분리한 바실러스 종 균주 또는 상기 균주의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 포함하는 항균제 또는 항곰팡이제를 제공한다.

또한, 상기 신규 분리한 바실러스 종 균주 또는 상기 균주의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 이용하여, 인간을 제외한 동물의 수생 곰팡이성 질병을 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 "예방"이란 조성물의 투여로 질병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 신규 분리한 바실러스 종 CJP-14는 상기 명시된 양식어류의 대표적인 병원성 세균 6종에 대한 항균활성을 가지고 있으며, 사이드로포어를 생산하여 철분을 포획하는 능력이 뛰어남에 따라 다른 병원성 세균의 생육을 저해하는 경쟁적 길항작용을 할 수 있다. 또한 병원성 수생곰팡이인 사프로레그니아의 생육을 저해할 수 있다는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 신규 분리한 바실러스 종 균주를 이용하여 상기 명시된 양식어류의 대표적 병원성균들에 의해 유발되는 질병을 예방할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 신규 분리한 바실러스 종 균주 또는 상기 균주의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 포함하는 수질개선제를 제공한다.

본 발명의 신규 분리한 바실러스 종 CJP-14는 수산양식 환경 내에 존재하는 아질산 함량을 감소시키는데 사용 할 수 있다.

본 발명의 수질개선제는 신규 분리한 바실러스 종 CJP-14를 수질개선제 형태로 따로 제조하거나, 상기 신규 분리한 바실러스 종 균주 또는 상기 균주의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 직접 살포할 수 있다. 본 발명의 수질개선제 내 바실러스 종 CJP-14는 액상 또는 건조상태 일 수 있으며, 바람직하게는 건조된 분말형태이다.

수질개선제제에 있어서 허용되는 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 완충식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 반산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화 할 수 있다.

상기 수질개선제를 이용하면, 양식장의 수질을 개선할 수 있는데, 구체적으로는, 상기 수질개선 제제를 양식장에 양식 이전에 가하거나 또는 양식중에 가할 수 있고, 바람직하게는 양식이전에 가하여 일정기간 방치함으로써, 본 발명의 신규 분리한 바실러스 종 CJP-14로부터 사이드로포어를 충분히 생산하여, 철 포획능력이 우수하여 다른 병원균 생육을 억제하고 또한 사프로레그니아의 생육을 저해함으로써, 양식 중간에 상기 수질개선 제제를 1회 이상 가하여, 사프로레그니아의 추가적인 생육을 억제한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 신규 분리한 바실러스 종 균주 또는 상기 균주의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 물에 처리하는 단계를 포함하는, 병원균이 제거되어 개질된 물을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 개질된 물은 양식장에 사용될 수 있음은 물론, 가축의 사육시 음용수로 사용하거나 또는 사람의 음용수로 사용될 수도 있다. 이때, 상기 신규 분리한 바실러스 종 균주 또는 상기 균주의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물이 처리된 물은 정수하여 사용함이 바람직한데, 상기 물을 정수하는 단계는 공지된 방법에 의하여 수행된다.

본 발명의 신규 분리한 바실러스 종 CJP-14는 수생곰팡이인 사프로레그니아에 대하여 우수한 항진균효과를 나타냄과 동시에 사이드로포어를 생산할 수 있으므로, 수생곰팡이인 사프로레그니아에 대한 진균성 질병과 세균 감염성 질병을 제어할 수 있는 다양한 제품 즉, 양식용 사료 첨가제, 프로바이오틱스제제, 수질개선제 등에 광범위하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 바실러스 종 CJP-14 균주의 수생곰팡이인 사프로레그니아의 생육저해 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 본 발명의 바실러스 종 CJP-14 균주와 양어 병원성 미생물인 비브리오 하베이(V. harveyi VH1, VH2, VH3), 비브리오 콜레라(V. cholerae , VC), 비브리오 블니피쿠스(V. vulnificus, VV), 에어로모나스 살모네시다(A.salmonicida, AS)에 대한 사이드로포어 형성에 의한 항균활성을 CAS 배지에서 평가한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 본 발명의 바실러스 종 CJP-14 균주의 용혈성 유무를 나타내는 사진이다.
도 4는 본 발명의 바실러스 종 CJP-14 균주의 아질산 이용성을 나타내는 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 바실러스 종 ( Bacillus sp .)CJP-14 균주의 분리

실시예 1-1: 시료 확보 및 균주 분리

환경 및 숙주 특이성이 높은 프로바이오틱스의 균주 특성을 고려하여 본 발명자들은 국내 질병발생이 적고 생산성이 높은 새우 양식장을 중심으로 하여 해수 유래 시료를 확보 하였다. 확보된 시료를 단계희석하여 3% 염화나트륨이 첨가된 BHI agar(Difco, USA)에 도말 후 37℃ 조건으로 24 시간 동안 배양하였다. 각 시료에서 분리 된 균주들은 콜로니 관찰에 따라 그룹화하여 균주들을 분리하였다. 선별된 콜로니는 3차에 걸쳐 새로운 배지에 옮겨 배양하는 방법으로 순수 분리 하였으며, 순수 배양된 균을 20% 글리세롤이 첨가된 배지에 담아 영하 70℃ 이하에서 보존하였다.

실시예 1-2: 항균 및 항곰팡이 활성 우수 균주 선발

양어에서 문제시 되는 대표적인 병원성 세균에 대한 항균 활성이 있는 균주를 1차 선발 하기 위해 에어로모나스 살모네시다(Aeromonas salmonicida ), 비브리오 하베이(Vibrio harveyi), 비브리오 앙겔라륨(Vibrio anguillarum), 에드워드시엘라 타다(Edwardsiella tarda), 비브리오 헤모라이티쿠스(Vibrio hemolyticus) 6 종에 대한 항균평가를 실시하였다.

항균평가는 병원성 균에 대한 생육저해환 분석을 통해 평가하였다. 0.7% 한천(agar)(W/V) 3ml과 상기 병원성 세균 6종의 진탕 배양액(OD₆₀₀=2.0)을 각각 150㎕ 혼합하여 BHI 배지 위에 분주하여 탑-아가를 제조하였다. 상기 제조된 탑-아가 위에 선발된 균주 배양액을 10㎕를 떨어뜨려 30℃에서 18시간 동안 배양한 후 선발 균주 주위에 형성되는 생육저해환(clear zone)의 유무를 관찰하였다. 선발 균주 53종 중 6종의 양어 병원성 세균에 대한 항균성을 나타내는 균주 19종을 1차적으로 선발하였다(표 1).

1차 선발균주의 항균 활성

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18
AS	+	-	+	-	-	+	-	-	+	-	+	+	+	+	-	-	-	-
SI	+	-	+	-	-	-	+	-	-	-	+	+	+	+	+	-	-	-
ET	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	+	+	-	+	-	-	-	-
VH	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	-	+	-	-	-	-
VP	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	-	+	-	-	-	-
VA	+	-	+	-	-	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-
	19	20	21	22	23	24	25	26	27	28	29	30	31	32	33	34	35	36
AS	-	-	-	-	+	-	-	+	+	-	-	-	-	+	-	-	+	-
SI	-	-	-	-	+	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	+	+	-
ET	-	-	-	-	+	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-
VH	-	-	-	-	+	-	-	+	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-
VP	-	-	-	-	-	-	-	+	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-
VA	-	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	37	38	39	40	41	42	43	44	45	46	47	48	49	50	51	52	53
AS	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+
SI	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+
ET	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
VH	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	-
VP	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	-
VA	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

-: 활성없음, +; 활성 있음

AS: 에어로모나스 살모네시다(Aeromonas salmonicida);

SI: 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae);

ET 에드워드시엘라 타다(Edwardsiella tarda);

VH: 비브리오 하베이(Vibrio harveyi);

VP: 비브리오 헤모라이티쿠스(Vibrio hemolyticus);

VA: 비브리오 앙겔라륨(Vibrio anguillarum).

실시예 1-3: 효소 활성 우수 균주 선발

실시예 1-3-1: 조효소액 채취

복합 소화 효소활성이 있는 균주를 선별하기 위해, 복합 항균성이 우수한 균주 39종을 BHI 배지에서 8 시간, 24시간, 48시간 배양한 배양상등액을 채취하여, 4℃, 13,000rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 최종 상층액을 효소 활성 분석을 위한 조효소 액으로 하여 아래와 같이 각 효소별 각각의 기질이 들어있는 배지를 사용하여 기질 분해 정도를 판정하였다.

실시예 1-3-2: 프로테이즈 ( Protease ) 활성

탈지분유(skim milk, Sigma, USA)를 2% 첨가한 YM(Difco, USA)배지 제조하였다. 상기에서 채취한 조효소액 3㎕를 기질배지에 분주한 후, 30℃ 에서 2시간 반응시킨 후 투명환(clear zone) 형성 정도에 따라 효소 활성능력을 측정하였다.

실시예 1-3-3: 셀룰레이즈(Cellulase)활성

1% CMC(carboxyl methyl cellulose) 기질이 첨가된 YM 배지를 제조 하였다. 상기에서 채취한 조효소액 3㎕씩 기질배지에 분주한 후, 30℃ 에서 2시간 반응시킨 후, 0.2% congo red 수용액으로 30분 동안 염색하였으며, 1M NaCl 수용액으로 탈색하였다. 조효소액 주위의 기질이 분해되어 생기는 투명환(clear zone)의 형성 정도에 따라 효소의 활성능력을 측정하였다.

실시예 1-3-4: 아밀레이즈 ( Amylase ) 활성

1% soluble starch 기질이 첨가된 YM 배지를 제조하였다. 상기에서 채취한 조효소액 3㎕씩 기질배지에 분주한 후, 30℃ 에서 2시간 반응시켰다. I₂와 KI가 각각 0.1%, 2% 첨가된 수용액으로 염색한 후 조효소액 주위의 기질은 분해 되어 생기는 환(clear zone)의 형성 정도에 따라 효소의 활성능력을 측정하였다.

실시예 1-3-5: 라이페이즈(Lipase)활성

1% 트리카프릴린(tricaptylin) 첨가된 YM 배지를 제조하였다. 상기에서 채취한 조효소액 3㎕씩 기질배지에 분주한 후, 30℃ 에서 2시간 반응 후 투명환(clear zone) 형성 정도에 따라 효소 활성능력을 측정하였다.

항균활성이 우수한 균주 19종 중 아래의 표 2과 같이 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase), 아밀라아제(amylase), 라이페이즈(lipase) 4종의 소화효소 생산하는 6개 균주를 선발하였다(표2)

2차 선발균주의 소화효소 생산성

효소	프로테이즈		아밀라제		셀룰레이즈		라이페이즈
균주배양시간	8hr	24hr	8hr	24hr	8hr	24hr	8hr	24hr
11	+++	+++	+	++	+++	++	-	-
12	+++	++	+++	++	+++	++	-	+
14	++	+	+	++	+++	+++	-	+++
23	+++	++	+	++	+++	++	-	-
26	++	+++	+	+++	+++	+++	-	+++
52	+++	++	+	+	+++	+++	-	++

-: 활성없음, +; 활성 있음, ++: 활성우수, +++: 활성 매우 우수

실시예 2: 담수어 병원성 곰팡이 활성 억제 in vitro 시험

항균 및 항곰팡이, 복합효소 생산성이 우수한 4 개 후보균주를 이용하여 담수어에서 문제 되고 있는 병원성 곰팡이인 사프로레그니아의 활성 억제 효과를 in vitro 상에서 측정하였다.

사프로레그니아를 PDA(Difco, USA)고체배지에서 30℃, 72시간 정치배양하여 사용하였다. 고체배지에서 배양된 사프로레그니아를 5mm x 5mm(가로 x 세로)크기로 절단하여 새로운 PDA 고체배지 중앙에 접종하여 24시간 배양하였다. 활성화된 후보균주 4종을 멸균된 페이퍼 디스크에 20㎕씩 분주한 후, 사프로레그니아가 배양되어 있는 고체배지에 접종하여 30℃에서 48시간 배양하였다. 표 3과 같이 후보균주 주위에 형성되는 생육저해환(clear zone)의 형성유무를 관찰하였다(도 1).

사프로레그니아(Saprolegnia sp.) 생육 저해평가

후보균주	생육저해환 형성유무
CJP11	++
CJP12	+
CJP14	+++
CJP26	+++

-: 활성없음, +; 활성 있음, ++: 활성우수, +++: 활성 매우 우수

액체배지 조건에서 사프로레그니아 활성 저해 및 억제 효과를 평가하기 위해 후보균주 4종을 BHI액체배지에서, 37℃, 200 rpm으로 8시간 배양하였다. 상기 배양액을 24 well plate(Falcon, USA)에 10⁸CFU, 10⁷CFU, 10⁶CFU, 10⁵CFU, 10⁴CFU으로 단계 희석하여, 각 well에 첨가한 후 사프로레그니아를 10²농도로 최종 1 ㎖이 되도록 첨가하였다. 0.5 g/L의 펩톤과 20 g/L의 효모추출액이 첨가된 PDB(Difco, USA)액체배지를 0.5㎖ 첨가한 후 25℃에서 48시간 동안 배양을 실시하였다. 실험 결과는 고체화 정도를 통하여 곰팡이 활성 억제능을 확인하였으며, 아래 표 4과 같이 후보균주 2종이 사프로레그니아의 생육을 저해하였다.

후보균주 2종의 사프로레그니아 생육저해 평가

시험균수	10⁸	10⁷	10⁶	10⁵	10⁴
CJP14	+++	+++	++	-	-
CJP26	+++	+	+	-	-

+, 양성; -, 음성

실시예 3: 사이드로포어 생산성 우수 균주 선발

항균 및 항곰팡이, 복합효소 생산성이 우수한 4개 후보균주에 대한 사이드로포어 생산성을 확인하기 위하여 CAS 시험법으로 평가를 실시하였다. 아래와 같이 CAS 배지를 제조하였다.

사이드로포어 생산성 평가 배지조성

철(Fe) solution(1mM FeCl₃ㆍ6H₂O in 10mM HCl)	1.5㎖
CAS solution(0.121g CAS in 100㎖ 증류수)	7.5㎖
HDTMA(0.0219g HDTMA in 50㎖ 증류수)	50㎖
pH 6.5 piperazine buffer (4.307g piperazine in 30㎖증류수)	30㎖
증류수	100㎖(the rest)

BHI 액체배지에 상기 선발된 4종의 균을 각각 0.1% 씩 접종하여, 37℃, 200 rpm에서 18시간 배양하였다. 또한 2% 염화나트륨이 첨가된 LB 배지에 양어 병원성 미생물인 비브리오 하베이(V. harveyi), 비브리오 콜레라(V. cholerae), 비브리오 블니피쿠스(V. vulnificus), 에어로모나스 살모네시다(A. salmonicida)을 각각 0.1%씩 접종하여, 30℃, 200 rpm에서 18시간 배양하였다. 각각의 배양 상등액을 취하여 0.45㎛ 필터로 여과하여 여과된 배양 상등액으로 시험을 진행하였다. CAS agar에 직경 0.5㎝의 구멍(hole)을 만든 후, 여과된 각 배양 상등액을 50㎕씩 분주하여 37℃에서 8 시간 동안 반응시켰다. 도 2와 같이 철 이용시 구멍(hole)주변에 생성되는 오랜지색 환의 생성여부를 관찰하였다. 표4 와 같이 상기 병원성 미생물 4종보다 사이드로포어 생산성이 우수한 바실러스 종(Bacillus sp.) CJP-14균주를 최종 선발하였다(표 6).

사이드로포어 생산성 평가

후보균주	사이드로포어 생산능	양어병원성 미생물	사이드로포어 생산능
CJP11	++	비브리오 하베이	++
CJP12	+	비브리오 콜레라	++
CJP14	+++	비브리오 블니피쿠스	++
CJP26	++	에어로모나스 살모네시다	+

-: 활성없음, +; 활성 있음, ++: 활성우수, +++: 활성 매우 우수

실시예 4: 선발 균주의 동정 및 생리, 생화학적 특성조사

실시예 4-1: 균주 동정

선발된 균주 중 사프로레그니아 활성 억제능과 사이드로포어 생산성이 우수한 CJP-14 균주를 최종 선발하여 동정 분석하였다. 균주의 동정은 생리, 생화학적 방법과 분자계통분류학적 방법으로 실시하였다. 형태적인 특징으로는 그람 양성 간균임을 확인하였고, 16s rDNA 유전자 염기서열 분석법을 통하여 바실러스 종(Bacillus sp.)와 99 % 상동성을 가지는 신규한 미생물로 동정되었다. 분리 균주의 분석된 16s rDNA의 염기서열은 서열번호 1과 같다. 염기서열분석은 PCR premix(바이오니아, 대한민국)와 하기의 염기서열을 가지는 유니버셜 프라이머 27F 및 492R을 사용하여 16s rDNA의 유전자 증폭을 시켰다. 유전자 증폭시 총 반응액은 20 ㎕로 맞추어 94℃ 1분, 56℃ 1분, 72℃ 1분을 총 30회 반복하여, 증폭된 DNA 염기서열을 분석하였다.

27F: 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(서열번호 2)

92R: 5'-GGYTACCTTGTTACGACTT-3'(서열번호 3)

상기와 같은 방법으로 동정된 본 발명의 신규한 미생물은 사단법인 한국종균협회(서울특별시 서대문구 홍제1동 361-221 유림빌딩 3층, 한국미생물보존센터내 소재)에 2010년 12월 14일자로 "Bacillus sp. CJP-14"로 기탁하였다(KCCM11143P).

실시예 4-2: 생리, 생화학적 특성 조사

발명 균주의 생화학적 특성을 분석하기 위하여 API 50 CHB system(한국미생물 보존센터, 대한민국)으로 균주의 당 발효 패턴을 분석하였다(표 7).

당 발효 패턴 분석결과

대조구	-	에스쿨린(Esculine)	+
글리세롤(Glycerol)	+	살리신(Salicine)	+
에리쓰리톨(Erythritol)	-	셀로비오스(Cellobiose)	+
D-아라비노스(D-Arabinose)	-	말토스(Maltose)	+
L-아라비노스(L-Arabinose)	+	락토스(Lactose)	+
리보스(Ribose)	+	멜리비오스(Melibiose)	-
D-자이로스(D-Xylose)	+	사카로스(Saccharose)	+
L-자이로스(L-Xylose)	-	트레할로스(Trehalose)	+
아도니톨(Adonitol)	-	이뉼린(Inuline)	-
β메틸-자이로시드 (βMethyl-xyloside)	-	메레지토스(Melezitose)	-
갈락토스(Galactose)	-	D_라피노스(D-Raffinose)	+
D-글루코스(D-Glucose)	+	아미돈(Amidon)	+
D_프룩토스(D-Fructose)	+	글리코진(Glycogene)	+
D-만노스(D-Mannose)	+	자일리톨(Xylitol)	-
L-솔보스(L-Sorbose)	-	β겐티오비오스 (βGentiobiose)	-
람노스(Rhamnose)	-	D-튜라노스(D-Turanose)	-
둘씨톨(Dulcitol)	-	D-리쏘스(D-Lyxose)	-
이노시톨(Inositol)	+	D-타가토스(D-Tagatose)	-
만니톨(Mannitol)	+	D-푸코스(D-Fucose)	-
소비톨(Sorbitol)	+	L-푸코스(L-Fucose)	-
α메틸-디만노시드 (αMethyl-Dmannoside)	-	D-아라비톨(D-Arabitol)	-
α메틸-글루코시드 (αMethyl-glucoside)	+	L-아라비톨(L-Arabitol)	-
N 아세틸 글루코사민 (N Acetyl glucosamine)	-	글루코네이트(Gluconate)	-
아미그다린(Amygdaline)	+	2 세토-글루코네이트(2 ceto-gluconate)	-
아뷰틴(Arbutine)	+	5 세토-글루코네이트(5 ceto-gluconate)	-

+, 양성; -, 음성

실시예 5: 안정성 및 유용성

실시예 5-1: 용혈성(β- hemolysis )

β-용혈이란 유해균 중 인지질 효소를 생산하여 적혈구에 의해서 공급되는 인지질을 가수분해하여 적혈구를 용혈시키는 작용이다.

선발 균의 용혈성을 알아보기 위하여 5% 양혈액(sheep blood, 기산바이오텍, 대한민국)이 함유되어 있는 TSA(Difco, USA)제조한다. 제조된 혈액한천배지에 선형 접종(streaking)한 후, 37℃에서 24시간 배양하여 용혈 여부를 확인한 결과 도 3와 같이 용혈성을 나타내지 않았음을 확인 할 수 있었다.

실시예 5-2: 아질산 이용성

발명 균주의 아질산 이용성을 확인하기 위해 아래 표 6과 같이 아질산이 함유된 배지를 제조하였다. 상기 제조된 배지에 바실러스 종 CJP-14를 0.1% 접종 후 30℃, 200rpm으로 배양하면서 6시간, 12시간, 24시간 각 배양액을 채취하였다. 채취한 배양액 샘플은 4℃, 13,000rpm에서 5분간 원심분리하여 얻은 배지의 상등액에 존재하는 아질산을 측정하여 소모량을 정량하였다.

아질산 이용성 평가 배지조성

아질산염(NaNO₂)	0.5 g/L
인산화제이나트륨(Na₂HPO₄)	13.5 g/L
인산제이칼륨(K₂HPO₄)	0.7 g/L
황화마그네슘(MgSO₄ㆍ7H₂O)	0.1 g/L
염화칼슘(CaCl₂)	0.18 g/L
탄산수소나트륨(NaHCO₃)	0.5 g/L
염화제이철(Fecl₃ㆍ6H₂O)	0.014 g/L
포도당(glucose)	0.5 g/L

배지 내 초기 아질산농도는 약 10 mg이었으며, 바실러스 종 CJP-14 균주가 성장하면서 아질산을 이용함에 따라 배양 30시간에는 아질산이 약 94% 소모되었다(참조: 도 4).

이와 같은 결과를 토대로 바실러스 종 CJP-14 균주는 수생곰팡이인 사프로레그니아 억제, 사이드로포어 생산성 및 항균성을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 6: 담수어 병원성 곰팡이 사프로레그니아에 대한 효능평가

in vitro 상에서 담수어 병원성 곰팡이 사프로레그니아의 활성 억제효과가 있으며, 사이드로포어 생산성이 우수한 바실러스 종 CJP-14균주에 대한 사프로레그니아에 대한 효능평가를 진행하였다. 따라서, 본 발명자들은 무지개 송어 수정란에서 본 발명의 균주의 존재하에 사프로레그니아를 감염한 후, 발안율(%)을 조사하였다.

구체적으로, 무지개 송어의 수정란을 500개 정도를 세어 멸균된 담수가 담긴 비커에 넣고, 본 발명의 균주와 사프로레그니아를 표 9에 기재된 농도의 약액에 하루에 30분씩 3일 동안 약욕 시킨 후, 발안율(%)을 아래와 같이 측정하였다. 대조군으로 염화나트륨, 포르말린을 사용하였다.

발안율(%)=(발안란의 수 / 사용된 수정란의 수) X 100

아래 표 9와 같이 대조구의 발안율은 0.5% 이었으며, 현재 항곰팡이 대체제로 사용되고 있는 염화나트륨의 경우 52.3%, 포르말린의 경우 19.5%의 발안율을 보였다. 선발된 바실러스 종 CJP-14를 1 x 10⁸ CFU 이상으로 처리하였을 경우, 염화나트륨과 포르말린을 약욕시켰을 때보다 효능이 우수하였다. 따라서 본 발명 균주가 담수어류의 수생곰팡이인 사프로레그니아의 억제에 효과적임을 보여주는 것이다.

사프로레그니아에 대한 효능평가

처리구	농도	수정란 수	발안율(%)
바실러스 종 CJP14	1 x 10⁹ CFU	300	54.7
	1 x 10⁸ CFU	300	53.2
	1 x 10⁷ CFU	300	40.5
염화나트륨	10 ppm	300	52.3
포르말린(37% 포름알데히드 용액)	120 ppm	300	19.5
대조구	-	300	0.5

실시예 7: 프로바이오틱스 효능평가

실제 본 발명의 균주를 사료에 첨가하여 어류에 공급하는 경우, 프로바이오틱스로서 작용을 하는지 알아보기 위해, 실제 본 발명의 균주를 사료에 혼합하여 넙치치어에 8주간 공급 한 후, 증체율, 일간성장률, 사료전환효율, 단백질전환효율 및 생존율을 측정하였다.

구체적으로, 기초사료는 38%의 조단백질과 동일한 에너지 함량이 되도록 표 10과 같이 조성하였다. 프로바이오틱스가 첨가되지 않은 기초사료(대조구)에 본 발명의 균주를 0.5% 농도로 첨가하였으며, 프로바이오틱스가 첨가되는 양 만큼 기초사료의 셀룰레이즈 양을 감소시켜 에너지를 동일하게 하였다.

기초사료 조성표

원료명	%
White fish meal	36.0
Soybean meal	12.0
Corn gluten meal	8.0
Wheat flour	30.4
Squid liver oil	5.0
Soy bean meal	5.0
CMC	1.0
Cellulose	0.5
Mineral premix	1.0
Vitamin premix	1.0

시험에 사용된 넙치 치어의 초기 평균무게는 25g이며, 150L 원형 PP수조에 25마리씩 무작위로 선택하여 배치하였다. 사육수는 모래 여과해수를 사용하여 2~3 L/min의 유수량이 되도록 조절하였고 모든 시험수조에 용존산소 유지와 원활한 사육수 순한을 위하여 에어스톤을 설치하였다. 광주기는 형광등을 이용하여 12L:12D 조건으로 유지시켰고, 전 실험기간동안 사육수온은 21~29℃ 범위로 자연수온에 의존하였다. 실험사료는 1일 2회에 나눠서 만복공급하였다. 성장율 측정은 3 주마다 실시하였고, 측정 전 24시간 동안 모든 실험어류를 절식 시켰다(참조: 표 11).

넙치에서 프로바이오틱스 급여 시 효능평가

	대조구	시험구
최종평균무게(g)	50.6 ± 1.7^a	57.4 ± 3.8^b
증체율(%)	103.03 ± 5.6^a	130.05 ± 9.3^b
일간성장률(%)	1.42 ± 0.06^a	1.67 ± 0.08^b
생존율(%)	77.3 ± 15.1^a	97.3 ± 2.3^b
사료전환효율	15.9 ± 0.15^a	1.16 ± 0.05^b
단백질전환효율	1.10 ± 0.1^a	1.40 ± 0.0^b

상기 표 11에서 보듯이, 바실러스 종 CJP 14균주를 첨가구가 대조구와 비교해서 약 13% 가량의 높은 성장율을 보였으며, 사료전환효율과 단백질전환효율에서도 대조구에 비해 높은 경향을 보였다. 또한 생존율은 대보구에 비해 약 25% 가량 높은 생존률을 나타냄을 확인하였다.

이와 같은 결과를 토대로 바실러스 종 CJP-14 균주는 복합효소 생산이 우수하므로 어류 소화율 촉진, 증체량 개선, 배설물 감소와 수질개선에 복합적으로 작용할 수 있음을 알 수 있었다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11143P

20101214

Claims

바실러스 균주 CJP-14 ( Bacillus sp., CJP-14)(KCCM11143P).
제1항의 바실러스 균주 CJP-14 ( Bacillus sp., CJP-14)(KCCM11143P)의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물.
제1항의 균주 또는 제2항의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물 을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제
제1항의 균주 또는 제2항의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 사료첨가제
제4항에 있어서, 어류 또는 갑각류의 양식에 사용되는 것인 사료첨가제
어류 또는 갑각류의 양식장에서, 제1항의 균주 또는 제2항의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 처리하는 단계를 포함하는, 어류 또는 갑각류 양식방법.
제1항의 균주 또는 제2항의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 포함하는, 항균제 또는 항곰팡이제.
제1항의 균주 또는 제2항의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 부가하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 사프로레그니아 속 미생물(Saprolegnia sp.) 감염성 질병을 예방하는 방법.
삭제
제1항의 균주 또는 제2항의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 수질개선제
물에 제1항의 균주 또는 제2항의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물를 처리하는 단계를 포함하는, 개질된 물의 제조방법.