KR100621657B1 - 내산성과 내담즙성이 좋고 효소의 생산이 우수한 신규바실러스 서브틸리스 유비티-엠02 균주 , 이 신규 균주를이용 함유하는 사료첨가제 및 이 사료첨가제를 함유하는가축 사료 - Google Patents

내산성과 내담즙성이 좋고 효소의 생산이 우수한 신규바실러스 서브틸리스 유비티-엠02 균주 , 이 신규 균주를이용 함유하는 사료첨가제 및 이 사료첨가제를 함유하는가축 사료 Download PDF

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Abstract

본 발명은 내산성 내담즙성이 우수하며 소화효소의 생산이 우수한 신규 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) UBT-M02 균주와 이 미생물을 이용한 가축 생장촉진용 생균제 및 생균제를 함유하는 가축 성장촉진용 사료 조성물에 관한 것이다
바실러스 섭틸리스, 내산성 내담즙성, 생장촉진용 생균제, 사료첨가제

Description

내산성과 내담즙성이 좋고 효소의 생산이 우수한 신규 바실러스 서브틸리스 유비티-엠02 균주 , 이 신규 균주를 이용 함유하는 사료첨가제 및 이 사료첨가제를 함유하는 가축 사료{New Bacillus subtilis UBT-M02 strain which has an acid and bile acid resistances, feed additive composition using it, and feed of animal having thereof}
도 1은 기존의 Bacillus subtilis와 본 발명의 변이주인 Bacillus subtilis UBT-M02의 당이용성의 차이를 나타낸 사진이다.
본 발명은 자연계에 널리 분포하는 비병원성 세균으로, 특히 공기, 마른 풀, 하수, 토양 속에 존재하는 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 중 내산성과 내답즙성이 높고 소화효소의 생산이 우수한 변종인 바실러스 섭틸리스 UBT-M02(Bacillus subtilis UBT M02)의 신 균주에 관한 것이다.
바실러스 섭틸리스(Bacullus subtilis:枯草菌)은 규조과에 속하는 호기성 간균의 일정으로 토양, 고초(마른 풀) 등의 자연계에 널리 분포하는 세균이다. 고초로부터 잘 분리할 수 있가 때문에 이 이름이 붙여졌으며, 영어명도 같은 이유에서 유래한다. 내열성 포자를 형성하며 그램 양성균이다. 생세포는 주편모에 의하여 운동한다. 포자는 세포의 중앙 또는 중앙보다 약간 떨어진 곳에 형성되어 달걀모양 또는 원기둥 모양을 나타낸다. 포자는 수시간을 끓여도 견디기 때문에 포자의 멸균은 고압멸균에 의하여야 한다. 액체배양에서는 표면에 약간의 주름이 있는 피막을 형성한다. 아밀라제 및 프로테아제를 생산하기 때문에 이들 효소를 공업적으로 생산하는데 이용된다. 바실러스 섭틸리스는 형질전환등의 유전공학 연구에도 이용되고 있는데, 최근에는 유전자조작의 연구에도 이용되고 있다.
본 발명의 목적은 내산성과 내답즙성이 높고 소화효소의 생산이 우수한 변종인 바실러스 섭틸리스 UBT-M02(Bacillus subtilis UBT M02)의 신 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 신규 변종인 바실러스 섭틸리스 UBT-M02는 가축이나 가금에 급여시, 급여하는 가축의 생체내에서 살아있는 채로 장에 도달하여 장시간 생존하면서 소화효소를 생산하고, 이 생산된 소화효소가 소화를 돕고 생산성 향상을 도모하는데 그 목적이 있다.
본 발명의 신규 변종인 바실러스 섭틸리스 UBT-M02(Bacillus subtilis UBT-M02) 균주의 일반적인 특징은 막대 모양의 간균으로 편모가 있어 활발히 운동하며, 균체의 중앙에 원형 또는 난원형의 아포(芽胞)를 형성하며, 보통의 배양기에서도 잘 발육하며 회백색의 큰 취락을 형성하고 그 주위는 방사상을 이룬다.
이 균의 특징은 아포를 갖고 있어 저항력이 강하며, 균체는 글리코겐을 함유하는 그람양성균인 점과 다수의 탄수화물을 분해하여 산을 생성하는 점이다. 또, 30∼70℃에서 가장 잘 증식하며, 50∼56℃의 고온에서도 잘 발육되는 것 등을 들 수 있다.
1. 균주의 분리 및 선별
본 발명의 신규 생균제의 선발을 위하여 충청도 일원의 닭, 돼지 사육농장의 축사근처 토양 및 축분시료 50여점을 채취하여 분리한 바실러스 섭틸리스 균주들을 멸균 증류수를 첨가하여 80℃로 1시간 열처리하였다. 이렇게 처리한 시료를 베네트 아가 플레이트(Bennett agar plate)에 도말하여 배양하였다. 37℃에서 7일간 배양하여 바실러스 섭틸리스를 분리하였다.
이와같이 선별과정을 통하여 내산성과 내담즙성이 우수하고 소화효소의 생산이 우수하며 가축이나 가금의 생체내에서 살아있는 채로 장에 도달하여 장시간 생존하면서 생산된 소화효소를 생산하는 우수한 균주를 선별할 수 있었다.
2. 균주의 특성
1)형태 및 배양학적 특성
최적생육 배지인 M-LB배지에서 배양한 균주를 그람염색을 행한 결과 그람 양성균이고, 배양학적인 특징은 통성 호기성(Facaltative aerobes)미생물이고 세포는 막대형(rod)이고 아가(agar)배지상의 콜로니(colony)형은 불규칙적이고 표면은 흐리고 불투명하다. 콜로니의 색은 크림색을 띄고 있으며, 내생포자(Endospore)를 형성하며 카타아라제(catalase) 시험결과 양성반응을 나타내었다.
2) 생리학적 특성
미생물의 균체의 생리학적인 특성은 알앤에이 시퀀싱(RNA sequencing)과 당이용성을 조사한 결과 표1과 같이 Bacillus subtilis(KCTC3135)와는 비슷하지만 정확하게 일치하는 균주는 없지만, Bacillus sp.임은 확정할 수 있었다.
3) 특허미생물 UBT-M02의 동정 및 명명
형태적, 배양학적 및 생리적 특성을 분석한 결과 분리된 특허균주는 Bacillus sp.에 속하는 미생물임을 Bergey's Manual Systematic Bacteriology Vol 2( William & Wilkins Co.,1989)에서 확인할 수 있었지만, 동정결과가 정확하게 일치되는 균주는 없고 다만, Bacillus subtilis와 가장 비슷한 결과를 가지는 것으로 보아 Bacillus subtilis의 변종으로 판단된다.
분리된 미생물을 Bacillus subtilis UBT-M02로 명명하고, 2004년 1월 17일부로 대한민국 특허균주 기탁기관인 유전자은행에 기탁하여 수탁번호 KCTC 10581BP을 부여받았다.
표 1: 분리된 UBT-M02균주와 생리적특성이 비슷한 균의 비교
Figure 112004016935631-pat00001
실시예 1
선발균주 Bacillus subtilis UBT-M02의 생산
선발된 균주를 생산시험하기 위해서 발효기(Fermanter)를 사용하여 균체생산시험을 행하였다. 본 발명에서는 5리터 발효기를 이용하여 Trytone 10g, Yeast extract 5g, NaCl 5g, K2HPO4 10g, MgSO4 0.45g, Trace element 2g을 1L의 증류수에 녹인 배지 3리터에 미리 배양된 Bacillus subtilis UBT-M02의 종배양 30ml를 접종하여 공기공급량 1vvm, 교반속도 300rpm의 조건에서 37℃에서 배양시켰다. 생산결과는 표 2에 나타난 바와 같이 균접종 후 18시간에 최대의 균주인 9.2×108/ml을 생산할 수 있었다.
표 2 : 균주 생산결과
Figure 112004016935631-pat00002
실시예 2
균체의 생산
위에서 생산된 균주를 200ml 원심분리기를 사용 4℃ 5000rpm에서 30분 가량 원심분리하여 균체(PPT)와 상등액을 분리하였다. 상등액을 버리고 buffer(0.85% NaCl에 10% glycenol)를 450ml첨가하여 다시 같은 조건에서 원심분리하는 세척과정을 3회 반복하여 균체를 생산하였다.
실시예 3
특허미생물(Bacilus subtilis UBT-M02)의 담즙산 내성시험
위에서 제시된 생산배지에 담즙으로 옥스갈(Oxgall)을 0, 0.15, 0.3, 0.5, 1.0%가 되게 농도를 맞춘후 기배양된 균주를 접종한 후, 37℃에서 24시간 배양후 균의 생육여부를 조사한 결과 옥스갈 1%에서도 균이 정상적인 생육을 보여주어 동물체내에서 담즙산이 분비되더라도 투여된 생균체가 사멸하지 않고 무사히 십이지장을 통과할 수 있다는 결론을 내릴 수 있었다.
실시예 4
균체를 이용한 제품의 생산
실시예 3에서 생산된 균주 Bacillus subtilis UBT-M02을 균체만을 분리하여 사용하거나 열풍건조를 한 후 글루텐밀, 규조토, 소맥분, 탈지강, 콘콥밀, 옥수수 전분, 대두박, 맥주효모, 포도당 등에 스프레이 드라이하여 균체수를 1×107, 1×106, 1×105 등으로 희석하여 제품을 구성할 수 있다.
본 실시예에서는 실시예 1에서 생산된 균주를 1kg의 탈지강에 100mg을 스프레이 하여 균체의 수가 5.0×107가 되는 제품을 얻었다.
실시예 5
효소의 생산
본 발명이 신규 균주로 효소의 생산을 측정하였다. 그 결과는 다음의 표 3과 같았다.
표 3 : 효소의 생산
Figure 112004016935631-pat00003
위의 표에서와 같이 12시간에서 가장 많은 효소가 생산되었다.
실험예 1
산란계의 동물실험
사료, 동물체중, 사육두수, 산란율, 증체율, 폐사율등에 대하여 실험을 행하였다.
산란계 시험
(1) 시험장소 : 경기도 육계농장
(2) 시험수수 : 시험구 - 10,000수
(3) 시험방법 : 87주령 산란계(환우후)에게 2주간 UBT-M02 사료 1톤당 1,000 gm 첨가
(4) 시험결과 : 다음의 표 4과 같았다.
(5) 고찰 : 시험 결과 UBT-M02 균주를 투여한 계군에서 대조구보다 1~2%의 계란을 더 생산하였으며, 폐사율 또한 현저히 줄어들었다.(시험이 끝난후 폐사율이 늘어났음을 볼 수 있다)
표 4 : 산란계 시험결과
Figure 112004016935631-pat00004
실험예 2
돼지의 동물실험
교잡종 육성돈 36두를 공시하였다. 시험개시 체중이 16.09±0.2kg으로 21일간 사양시험을 실시하였다. 처리구는 대조구와 첨가구로 구성되었으며 처리당 6반복, 반복당 3마리씩 완전임의 배치하였다.
시험사료는 옥수수 대두박 위주의 사료로 NRC(1998)사양 표준의 영양소 요구량보다 약간 높게 구성하였다.
시험결과는 다음의 표 5와 같았다.
표 5 : 육성돈에서 바실러스 섭틸리스 신균주의 첨가 효과
Figure 112004016935631-pat00005
본 발명의 신 균주인 바실러스 섭틸리스 UBT-M02(기탁번호 KCTC 10581BP)는 내산성과 내담즙성이 우수하며, 효소의 생산이 우수하여 산란계에서 계란의 상선성이 우수하며 폐사율이 현저히 줄고, 육계의 동물실험 및 돼지의 증체량이 우수하였다.

Claims (5)

  1. 다음의 미생물학적 성질을 보유하는 내산성과 내담즙성이 우수한 새로운 바실러스 섭틸리스 UBT-M02(기탁번호 KCTC 10581BP) 균주.
    (1) 그람 양성
    (2) 내생포자 형성
    (3) 단간균
    (4) 운동성 있음
    (5) 통성 호기성
    (6) 카탈라제 : 양성
    (7) 유산생산 게스비생산
    (8) 생육온도범위 10-70℃
    (9) 내담즙성 : 1%(w/v)에서 생육
  2. 제 1항의 새로운 바실러스 섭틸리스 UBT-M02(기탁번호 KCTC 10581) 균주의 배양액.
  3. 제 1항의 새로운 Bacillus subtilis UBT-M02(기탁번호 KCTC 10581BP) 균주의 균체, 그 배양액, 그 배양액의 농축물 또는 그 건조물을 첨가한 동물사료.
  4. 제 1항의 새로운 바실러스 섭틸리스 UBT-M02(기탁번호 KCTC 10581) 균주의 배양액 농축물
  5. 제 1항의 새로운 바실러스 섭틸리스 UBT-M02(기탁번호 KCTC 10581) 균주의 배양액을 건조한 건조물
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