KR20130086154A

KR20130086154A - 약독화된 미코플라스마와 관련된 방법

Info

Publication number: KR20130086154A
Application number: KR1020127033017A
Authority: KR
Inventors: 리마 유일; 유세프 앱스 엘-오스타
Original assignee: 바이오프로퍼티스 피티와이 엘티디
Priority date: 2010-05-19
Filing date: 2011-05-19
Publication date: 2013-07-31
Also published as: AU2011256137A1; CA2799732A1; JP2013526866A; BR112012029396A2; EP2571980A1; EP2571980A4; MX2012013409A; AU2011256137B2; US9260691B2; WO2011143706A1; EA201291175A1; US20130243819A1; CN102985530A

Abstract

본 발명은 열거된 바와 같은 적어도 하나의 유전자 중 돌연변이를 포함하는 약독화된 미코플라스마 박테리아를 확인하거나 생성하는 방법, 및 미코플라스마에 대한 방어 면역을 유도하거나, 또는 상기 박테리아에 의한 감염을 검출하기 위한 백신 중 상기 박테리아의 용도를 제공한다.

Description

약독화된 미코플라스마와 관련된 방법{METHODS RELATING TO AN ATTENUATED MYCOPLASMA}

본 발명은 약독화된 미코플라스마 하이오뉴모니아에(Mycoplasma hyopneumoniae)에 대한 용도, 예컨대, 샘플 중 약독화된 미코플라스마(Mycoplasma)의 존재를 진단하는 방법 및 약독화된 미코플라스마를 선택하는 방법에서의 용도에 관한 것이다.

미코플라스마 하이오뉴모니아에는 돼지 미코플라스마 폐렴 (돼지유행성 폐렴 (EP)으로도 불림)의 병인체이다. 이는 전세계 돼지 생산에 영향을 미치는 가장 흔하고 경제적으로 중요한 호흡기 질환 중 하나이다. 상기 질환은 2차 감염, 고-이환률 및 저-사망률, 낮은 사료 전환율과 연관되고, 이는 매해 약 10억 달러로 추산되는 세계적 경제 손실의 원인이 될 수 있다.

EP에서, 미코플라스마 하이오뉴모니아에 박테리아는 돼지의 폐내 상피 세포의 섬모에 부착하여 건강한 정상 섬모를 파괴함으로써 기회감염성 유기체가 스스로 호흡기 조직 내로 확립되어 질환을 유발할 수 있도록 한다. 일단 확립되고 나면, 엠. 하이오뉴모니아에(M. hyopneumoniae)는 돼지의 폐에서 병변을 유발한다.

상기 질환은 매우 전염성이 크고, 전염은 보통 감염된 기도 분비물, 예를 들어, 재채기 또는 기침을 할 때 코나 입으로부터 분출되는 소적과의 직접적인 접촉을 통해 이루어진다.

현재 엠. 하이오뉴모니아에에 대한 여러 백신이 존재한다. 현 백신들 대부분은 단일 또는 이가/다가 백신으로서 등록된 22종의 백신 브랜드로 약 10개의 회사에 의해 공급된다. 이러한 백신들은 모두 사멸 또는 불활성화된 엠. 하이오뉴모니아에 제제이다.

전세포 불활성화된 엠. 하이오뉴모니아에 백신의 예로는 레스피슈어(RESPISURE)™ 및 스텔라뮨(STELLAMUNE)™ (화이자(Pfizer)), 수백신 엠. 하이오(SUVAXYN M. HYO)™ (포트 도지(Fort Dodge)), 하이오레스프(HYORESP)™ (메리얼(Merial)), M+팩(M+PAC)™ (셰링-플라우(Schering-Plough)) 및 포실리스(PORCILIS)™ (인터벳(Intervet))를 포함한다

일부 백신이 EP의 중증도를 감소시킬 수는 있지만, 이용가능한 전세포 사멸 또는 불활성화된 백신 중 어느 것도 엠. 하이오뉴모니아에 감염으로부터의 완전한 방어를 제공하지는 못한다.

공-계류 중인 본 발명자들의 출원인 공개공보 WO2010/132932에는 온도 감수성인 생 약독화된 엠. 하이오뉴모니아에가 기술되어 있다. 상기 균주는 ts-19로 명시되고, 부다페스트 조약하에 2004년 5월 13일자로 NM 04/41259로서 호주 국립 성분 검사 연구소(National Measurements Institute)에 기탁되었다. 상기 균주는 백신 내로 혼입되면 백신화된 돼지 중에서 엠. 하이오뉴모니아에에 대한 방어 면역을 부여할 수 있다.

요약

제1 측면은 하기 표 1에 열거된 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자 중의, 또는 하기 표 2 내지 5 중 어느 하나 이상에 열거된 핵산 분자 중의 돌연변이의 존재에 대하여 미코플라스마 박테리아를 검정하는 단계를 포함하며, 여기서, 돌연변이의 존재는 미코플라스마가 약독화된 것임을 시사하는 것인, 약독화된 미코플라스마 박테리아를 확인하는 방법을 제공한다.

약독화 백신은 일반적으로, 이들이 감염원의 모든 관련 면역원성 결정기를 그의 본래 형태로 숙주의 면역계에 제시하고, 백신화된 숙주에서의 면역화제의 증식 능력으로 인하여 상대적으로 적은 양의 면역화제가 필요하기 때문에 유리하다. 약독화 방법으로는 독성 균주를 다회에 걸쳐 계대배양하는 것, 또는 방사선 또는 화학물질에 노출시키는 것을 포함한다. 이러한 방법은 게놈에 돌연변이를 도입함으로써, 미생물이 더 적은 독성을 가지지만 여전히 복제가 가능하도록 하는 것으로 추정된다.

이러한 접근법의 단점은 이들이 분자 수준에서 특징화되지 않은 무작위 돌연변이를 도입한다는 것이다. 또한, 예컨대, 연관 온도 감수성 선택에 의한 약독화 선택 방법은, 온도 감수성 균주가 약독화되지 않을 수 있고, 약독화된 균주가 온도 감수성일 필요는 없으며, 많은 시행착오를 요구하기 때문에, 종종 시간 소모가 많고, 잘못된 결과를 산출한다. 게다가, 약독화된 균주는 추가의 돌연변이가 일어나, 다시 독성으로 복귀할 수 있다. 대안적 전략법은 비-가역적인, 유전적으로 정의된 약독화된 미코플라스마를 생성하는 것이 될 것이다. 그러나, 현재까지는 미코플라스마 약독화에 의해 영향을 받는 유전자는 확인되지 않았다. 본 발명은 그의 모 균주와의 비교를 통해 약독화된 미코플라스마 중의 돌연변이를 확인하고, 상기 정보를 이용하여 약독화된 미코플라스마를 제공하기 위해서는 어느 유전자가 돌연변이되어야 하는지를 결정한다.

제1 측면의 방법을 통해 약독화된 미코플라스마 균주를 선택할 수 있고, 약독화된 균주가 독성으로 복귀하였는지 여부를 확인할 수 있다.

제2 측면은 미코플라스마 박테리아의 초기 집단을 약독화 조건에 적용하여 추정상 약독화된 박테리아 집단을 생성하는 단계, 및 하기 표 1에 열거된 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자 중의, 또는 하기 표 2 내지 5 중 어느 하나 이상에 열거된 핵산 분자 중의 돌연변이의 존재에 대하여 추정상 약독화된 박테리아 집단의 개별 클론을 검정하는 단계를 포함하며, 여기서, 돌연변이의 존재는 미코플라스마가 약독화된 것임을 시사하는 것인, 약독화된 미코플라스마를 생성하는 방법을 제공한다.

제3 측면은 제1 측면의 방법에 의해 선택되거나, 또는 제2 측면의 방법에 의해 생성된 약독화된 미코플라스마 박테리아를 제공한다.

제4 측면은 제3 측면의 약독화된 미코플라스마 박테리아를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.

제5 측면은 제4 측면의 면역원성 조성물을 포함하는 미코플라스마 백신을 제공한다.

제6 측면은 대상체에게 방어량의 제3 측면의 약독화된 미코플라스마 박테리아, 제4 측면의 면역원성 조성물, 또는 제5 측면의 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 미코플라스마에 의해 유발되는 질환에 대한 방어 면역을 유도하는 방법을 제공한다.

대안적 측면은 미코플라스마에 의해 유발되는 질환에 대한 방어 면역을 유도하기 위한 제3 측면의 약독화된 미코플라스마 박테리아, 제4 측면의 면역원성 조성물, 또는 제5 측면의 백신을 제공한다.

추가의 대안적 측면은 미코플라스마에 의해 유발되는 질환 예방용 의약 제조에서 제3 측면의 약독화된 미코플라스마 박테리아, 제4 측면의 면역원성 조성물, 또는 제5 측면의 백신의 용도를 제공한다.

본 발명자들은 기탁 번호 NM04/41259하에 호주 국립 성분 검사 연구소에 기탁된 약독화된 미코플라스마 하이오뉴모니아에 균주 (ts-19)의 핵산 서열, 및 NTG 돌연변이에 의해 상기 약독화된 균주를 생성한 독성 균주의 서열을 측정하였다 (문헌 [Mycoplasma hyopneumoniae isolate LKR, Lloyd & Etheridge (1981) J. Comp. Path. 91:77-83]). 본 분야의 그에 관한 정보와 함께 정렬된 서열의 분석을 사용하여, 본 발명자들은 약독화와 관련이 있다고 생각되는 특정의 돌연변이를 확인할 수 있었다. 본 발명자들은 이러한 돌연변이가 미코플라스마 하이오뉴모니아에 및 다른 미코플라스마에서 약독화에 대한 마커가 되며, 이를 사용하여 약독화된 미코플라스마 균주에 대해 선택할 수 있다고 간주한다. 이는 특히 약독화된 미코플라스마를 생성하는 데 사용되는 약독화 조건이 무작위 돌연변이유발을 일으킬 때에 유용하다. 돌연변이 선택은 미코플라스마 균주가 약독화되었는지, 및 이로써 백신으로 제제화하는 데 적합한지 여부를 측정하는 간단한 방법을 제공한다.

제7 측면은 하기 표 1에 열거된 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자 중의, 또는 하기 표 2 내지 5 중 어느 하나 이상에 열거된 핵산 분자 중의 돌연변이의 존재에 대하여 동물로부터 유래된 미코플라스마 포함 샘플을 검정하는 단계를 포함하며, 여기서, 돌연변이의 부재는 동물이 독성 미코플라스마로 감염된 것임을 시사하는 것인, 동물이 약독화된 미코플라스마 균주로 또는 독성 미코플라스마 균주로 감염되었는지를 측정하는 방법을 제공한다.

제8 측면은 하기 표 1에 열거된 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자 중의, 또는 하기 표 2 내지 5 중 어느 하나 이상에 열거된 핵산 분자 중의 돌연변이의 존재에 대하여 미코플라스마 포함 샘플을 검정하는 단계를 포함하며, 여기서, 샘플 중 돌연변이의 존재는 해당 샘플이 채취된 동물이 약독화된 미코플라스마 균주로 백신화된 것임을 시사하는 것인, 약독화된 미코플라스마 균주로 백신화된 동물을 미코플라스마로 감염된 동물과 구별하는 방법을 제공한다.

미코플라스마 폐렴은 돼지에서 동물토착성 폐렴을 유발하는 매우 전염성이 큰 만성 질환이다. 상기 질환은 전 세계적으로 풍토성을 지니고 있다. 제7 및 제8 측면의 방법을 통해 약독화된 균주로 백신화된 돼지와, 독성 균주로 감염된 동물 또는 독성으로 복귀한 백신 균주를 갖는 동물을 분별할 수 있다.

제9 측면은 하기 표 1에 열거된 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자 중의, 또는 하기 표 2 내지 5 중 어느 하나 이상에 열거된 핵산 분자 중의 돌연변이에 대해 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 키트를 제공한다.

제10 측면은 도 1에 제시된 적어도 하나의 돌연변이에 대해 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 키트를 제공한다.

제9 및 제10 측면의 키트가 제1, 제7, 또는 제8 측면의 방법에서 사용될 수 있다.

상세한 설명

엠. 하이오뉴모니아에 균주 "LKR"은 원래 도축된 표본으로부터 단리되었다 (문헌 [Lloyd and Etheridge 1981, J of Comp Path 91:77-83]). 실험상 감염된 돼지로부터 유기체를 재단리시킨 후, 무세포 배지 중에 약 10회에 걸쳐 계대배양하여 클론을 단리시켰다 (CSIRO: 호주 빅토리아주). 이어서, 클론을 애들레이드 대학 미코플라스마 수집회(University of Adelaide Mycoplasma collection: 호주 사우스 오스트레일리아주)에 제출하였다. 이어서, 보관을 위해 변형된 프리스 브로쓰(Friss broth)에서 3회에 걸쳐 시험관내 계대배양된 것인, LKR 단리물을 멜버른 대학 수의학과 (미코플라스마 그룹)(University of Melbourne, Department of Veterinary Science (Mycoplasma Group))에 의해 수득하였다. 저장된 바이알을 "LKR P3 29/5/97"로 명명하였다. 이 클론은 모 균주를 나타낸다.

LKR P3 29/5/97을 시험관내에서 계대배양하고, 선행 기재 방법 (문헌 [Nonamura and Imada (1982) Avian Diseases 26:763-775])을 이용하여 NTG 돌연변이유발 (200 mg/mL)이 일어나도록 하였다. 온도 감수성 클론 ("ts-19")을 아가 플레이트로부터 선택하고, 3 mL의 변형된 프리스 브로쓰에서 배양하였다. 상기 클론의 계대배양 횟수를 "P0"으로 명명하고, 이어서 변형된 프리스 브로쓰에서 1 계대 접종당 1:4 v/v의 희석률로 시험관내에서 4회에 걸쳐 추가로 더 계대배양하였다. 최종 계대배양 수준을 "LKR ts-19 P4 MS"로 명명하였다.

LKR ts-19 P4 MS를 변형된 프리스 브로쓰에서 다회에 걸쳐 시험관내에서 계대배양하며 희석시켜 3.2 x 10^-21에 도달한 희석액을 얻었다. 최종 돌연변이체 클론을 "LKR ts-19 3.2 x 10^-21"로 명명하였다.

LKR ts-19 3.2 x 10^-21을 동결건조시키고, 이를 기탁 번호 NM04/41259하에 호주 정부 분석 실험실(Australian Government Analytical Laboratories)에 제출하였다 (특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약).

미코플라스마는, 이들의 제한된 생합성 능력 및 이들의 숙주에 대한 기생충 유사 의존성을 반영하는 매우 감소된 게놈 크기를 가지고 있다. 게놈에서의 이들의 제한된 중복성을 고려해 볼 때, 경로 중 특정 성분의 NTG 돌연변이 유발은 미코플라스마 세포의 생존에 대해 유의적인 효과를 가질 수 있다. NTG 돌연변이유발은 게놈 내에서 무작위 돌연변이 (뉴클레오티드 전이, 전좌, 결실 또는 삽입)를 일으킨다. 이는 각각 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 변이체 게놈 집단을 생성시킬 것이다. 아마도 다수의 변이체 게놈은, 기능이상이 발생한 중요한 하나의 유전자 또는 유전자들로 인하여 생존하지 못할 것이다. 돌연변이가 유기체의 성장식 능력에 유해한 영향을 미치지 않는 경우, 이러한 생존 변이 유기체는 추가의 선택과정 (예컨대, 온도 선택과정)을 거칠 수 있다. ts-19의 발생에서, 선택과정은 33℃의 온도에서 높은 역가로 성장할 수 있는 변이체 균주의 능력 및 39.5℃에서는 감소된 성장 능력에 기초한다. 미코플라스마 하이오뉴모니아에 백신 균주 ts-19와 모 균주 (LKR)의 것 사이의 전체 게놈 서열 비교에 기초하여, 다수의 돌연변이 (뉴클레오티드 변화)가 ts-19의 게놈에서 확인되었다. 이러한 돌연변이는 뉴클레오티드 치환 (전이 및 전좌) 뿐만 아니라, 결실 및 삽입을 포함하였다.

돌연변이는 게놈 전체 주변에 위치하였고, 이는 다양한 발현된 유전자 뿐만 아니라, 가설 단백질 및 비-코딩 서열을 포함한다. 하기 표 1에는 염기 치환, 결실 또는 삽입에 의해 돌연변이된 공지된 유전자들이 열거되어 있다. 상기 유전자들은 이들의 주요 기능에 따라 분류되었다.

하기 표 2는 ts-19의 유전자 및 비-코딩 영역에서 확인된 침묵 돌연변이를 나타낸다. 하기 표 3은 ts-19의 비-코딩 영역에서 확인된 결실을 나타낸다. 하기 표 4는 ts-19의 가설 유전자에서 확인된 돌연변이를 나타낸다. 하기 표 5는 ts-19의 가설 유전자에서 확인된 결실을 나타낸다.

엠. 하이오 J 균주, 엠. 하이오 LKR 균주, 및 ts-19 약독화된 균주 (마스터 및 12회에 걸친 시험관내 계대배양 이후의 것)의 정확한 성질들 간의 구체적인 차이가 도 1에 제시되어 있다.

유기체의 온도 감수성 및 약독화는 표현형적 특징이 나타나도록 개별적으로 또는 함께 협력하여 작용하는 단일 또는 다중 돌연변이로부터 초래되는 것이라고 가정하였다.

당업자는 제공된 참조 서열 (예컨대, YP_278901.1)과 NM04/41259로서 기탁된 바, 약독화된 균주 ts-19의 서열 사이에 차이가 있는지를 측정함으로써, 엠. 하이오 균주가 하기 표 1에 열거된 유전자들 중 하나에 돌연변이를 함유하는지를 확인하는 방법을 쉽게 알 것이다.

한 실시양태에서, 약독화된 균주는 하기 표 1에 열거된 돌연변이 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34가지, 또는 그 전부를 단독으로, 또는 하기 표 2, 3, 4 또는 5에 열거된 적어도 하나의 돌연변이와 함께 포함한다.

한 실시양태에서, 약독화된 균주는 하기 표 1에 열거된, 독성 인자 중 하나 또는 이들 각각, 및/또는 탄수화물 대사에 관여하는 유전자 중 하나 또는 이들 각각, 및/또는 인지질 대사에 관여하는 유전자, 및/또는 보조-인자 대사에 관여하는 유전자, 및/또는 전사 또는 번역에 관여하는 유전자 중 하나 또는 이들 각각, 및/또는 막 수송에 관여하는 유전자 중 하나 또는 이들 각각, 및/또는 DNA 복제, 수복 또는 대사에 관여하는 유전자 중 하나 또는 이들 각각, 및/또는 트랜스포사제 유전자에서 돌연변이를 포함한다.

한 실시양태에서, 약독화된 균주는 독성 인자들 각각에서 돌연변이를 포함한다.

P95, P69, P216, P146 유전자 뿐만 아니라, 지단백질 유전자는 독성과 관련이 있는 것으로 기술되어 있는 바 (문헌 [Ferreira and de Castro et al., (2007). Genetic and Molecular Biology 30: p245-255]), 상기 유전자내에서 발견되는 돌연변이가 약독화에 영향을 미칠 가능성이 매우 높다.

또 다른 실시양태에서, 약독화된 균주는 하기 표 2에 열거된 돌연변이 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10가지, 또는 그 전부를 단독으로, 또는 하기 표 1, 3, 4 또는 5에 열거된 적어도 하나의 돌연변이와 함께 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 약독화된 균주는 하기 표 3에 열거된 돌연변이 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44가지, 또는 그 전부를 단독으로, 또는 하기 표 1, 2, 4 또는 5에 열거된 적어도 하나의 돌연변이와 함께 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 약독화된 균주는 하기 표 4에 열거된 돌연변이 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10가지, 또는 그 전부를 단독으로, 또는 하기 표 표 1, 2, 4 또는 5에 열거된 적어도 하나의 돌연변이와 함께 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 약독화된 균주는 하기 표 5에 열거된 돌연변이 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31가지, 또는 그 전부를 단독으로, 또는 하기 표 1, 2, 3 또는 4에 열거된 적어도 하나의 돌연변이와 함께 포함한다.

엠. 하이오뉴모니아에 백신 균주 ts -19의 유전자 내의 약독화 돌연변이
독성 인자:
추정 외막 단백질 P95	YP_278901.1
추정 지단백질 (MHJ_0213)	YP_279015.1
추정 지단백질 (MHJ_0362)	YP_279161.1
추정 P216 표면 단백질	YP_279290.1
추정 부착 유사-단백질 P146	YP_279457.1

탄수화물 대사:
트리오세포스페이트 이소머라제	YP_278904.1
트랜스케톨라제	YP_279223.1
추정 PTS 시스템 N-아세틸글루코사민-특이 II ABC 성분	YP_279370.1

인지질 대사:
CDP-디아실글리세롤-글리세롤-3-포스페이트-3-포스파티디알 트랜스퍼라제	YP_279075.1

보조인자 대사:
니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제	YP_279204.1

전사/번역:
GidA 유전자 [tRNA 우리딘 5-카르복시메틸아미노메틸 변형 효소	YP_278808.1
50S 리보솜 단백질 L3	YP_278992.1
류실-tRNA 신테타제	YP_279441.1
이소류실 tRNA 신테타제	YP_278833.1

막 수송:
추정 ABC 수송체 퍼미아제 단백질	YP_279164.2
추정 ABC 수송체 ATP 결합	YP_278823.1
추정 크로메이트 수송 단백질	YP_278943.1
추정 ABC 수송체 ATP 결합 및 퍼미아제 단백질	YP_278958.1
추정 내막 단백질 트랜스로카제 성분 YidC	YP_279468.1
추정 ABC 수송 시스템 퍼미아제 단백질 p69-유사	YP_279157.1
추정 ABC 수송체 퍼미아제 단백질	YP_279176.1
추정 ABC 수송체 ATP-결합-Pr1	YP_279419.1

DNA 복제/수복/대사
DNA 토포이소머라제 I	YP_279077.1
우라실-DNA 글리코실라제	YP_278929.1

침묵 돌연변이이거나, 또는 비-코딩 영역 중에 있는 것인, 엠. 하이오뉴모니아 에 백신 균주 ts -19 내의 약독화 돌연변이
돌연변이 #	유전자 중 침묵 돌연변이 및 비-코딩 영역 중의 돌연변이 [ NCBI 참조 서열]
1	추정 MgpA-유사 단백질 [YP_278810.1]
2	아미노산 퍼미아제 [YP_278882.1]과 NADH 옥시다제 [YP_278883.1] 사이의 유전자간 서열
3	미오-이노시톨 이화작용 단백질 [YP_279022.1]
4	추정 ISMHp1 트랜스포사제 [YP_279110.1]과 가설 단백질 [YP_279111.1] 사이의 유전자간 서열
5	추정 트랜스포사제 말단절단형 (슈도)
6	추정 지단백질 [YP_279163.1]
7	추정 트랜스포사제 [YP_279183.1]과 가설 단백질 [YP_279186.1] 사이의 유전자간 서열
8	두 가설 단백질 [YP_279238.1]과 [YP_279239.1] 사이의 유전자간 서열
9	두 가설 단백질 [YP_279238.1]과 [YP_279239.1] 사이의 유전자간 서열
10	두 가설 단백질 [YP_279238.1]과 [YP_279239.1] 사이의 유전자간 서열
11	16S 리보솜 RNA MHJ_0709

상세한 설명

본 발명은 온도 감수성인 약독화된 엠. 하이오 균주 (ts-19) 및 그의 모 균주의 핵산 서열 측정에 기초한다. 이들 균주 및 다른 균주의 정렬을 통해 약독화된 균주에서의 돌연변이의 위치 및 성질을 확인할 수 있다.

온도 감수성 돌연변이는 일반 부류, 즉 열불안정성 단백질을 생성하는 부류; 및 단백질 합성, 폴딩 또는 어셈블리에서 결함을 생성하는 부류로 나뉜다. 열불안정성 단백질의 경우, 유전자의 ts 돌연변이체는 허용 온도 (ts-19의 경우, 33℃)에서는 보다 높은 수준으로, 및 비-허용 온도 (ts-19의 경우, 39.5℃)에서는 보다 낮은 수준으로 발현될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "돌연변이"이라는 용어는 유전 물질, 예컨대, DNA, RNA, cDNA, 또는 임의의 프로세스, 기전에서의 임의의 검출가능한 변화, 또는 상기 변화의 결과를 의미한다. 상기 돌연변이는 점 돌연변이 (즉, 핵산 서열내 하나 이상의 염기가 다른 염기로 대체된 돌연변이), 삽입 돌연변이 (즉, 하나 이상의 염기의 삽입에 의해 핵산 분자 또는 유전자의 전체 길이가 증가한 돌연변이), 결실 돌연변이 (하나 이상의 염기의 제거에 의해 핵산 분자 또는 유전자의 전체 길이가 감소된 돌연변이) 및 역전 돌연변이 (2개 이상의 염기로 이루어진 영역이 180도 회전되어 있는 돌연변이), 또는 그의 조합일 수 있다.

유전자간 영역 내 돌연변이는 핵산 분자의 비-코딩 영역에 위치하는 돌연변이를 의미한다.

하나의 전체 코돈 미만의 결실을 포함하는 유전자는 프레임쉬프트 돌연변이를 유발하게 될 것이다. 이를 통해서는 원래의 (천연) 단백질과는 조금도 유사하지 않거나, 거의 유사하지 않은 아미노산으로 구성되는 유전자 산물이 생성될 것이다. 따라서, 단백질은 기능이상인 단백질이 될 것이다. 이는 더 이상은올바르게 폴딩 또는 어셈블리할 수 없기 때문에, 상기 단백질의 역할 뿐만 아니라, 가능하게는 상기 단백질의 안정성에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 상기 단백질의 발현 수준은 야생형에 비하여 감소되어 있거나, 제거되어 있을 것이다.

결실되면, 유전자 산물의 발현은 미성숙한 상태로 종결될 수 있다. 또 다시, 상기 단백질의 작용 및 안정성이 영향을 받게 될 것이다. 이에 더하여, 말단절단형 mRNA 전사체는 불안정한 상태일 수 있고, 쉽게 분해될 수 있다. 따라서, 돌연변이된 단백질의 발현 수준은 야생형에 비하여 감소되어 있거나, 제거되어 있을 것이다.

약독화된 ts-19 균주는 표면 단백질, 예컨대, 외막 단백질 P95, P216, P146, P69 및 지단백질에 영향을 미치는 다수의 결실을 포함한다. 막 수송 단백질은 또한 이들 유전자 산물이 기능이상을 유발하는 결실 돌연변이에 의해 영향을 받는다. 따라서, 이들 유전자의 발현과 모 균주 LKR의 발현을 비교한다면, 본 발명자들은 이들 단백질의 발현 수준에서의 현격한 차이를 발견할 수 있을 것으로 기대한다.

프레임내 아미노산 변화를 일으키는 단일 염기 치환에 의해 유발되는 돌연변이는 상기 단백질의 폴딩 또는 어셈블리를 변경시킬 수 있고, 따라서, 합성되는 동안, 올바르지 않은 방식으로 작용할 수 있다. 상기 단백질은 또한 돌연변이된 단백질의 제어 또는 영향하에 있을 수 있는 다른 유전자들 다수의 발현에도 영향을 미칠 수 있다.

한 실시양태에서, 표 1에 열거된 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자 중 돌연변이의 존재는 적어도 하나의 단백질의 발현 변화를 검정함으로써 검출된다. 한 실시양태에서, 발현 변화는 발현 감소 또는 부재이다. 당업자는 예를 들어, 관심의 대상이 되는 단백질을 검출하여 그에 결합하는 항체가 사용되는 것인 정량적 항체-기반 방법, 예컨대, 웨스턴 블롯팅, 방사선면역검정법 (RIA) 및 효소 결합 면역흡착 검정법 (ELISA)에 의해 단백질 발현이 변화하였는지 또는 감소하였는지를 측정하는 방법을 쉽게 인지할 것이다. 또한, mRNA 수준이 일반적으로 그로부터 코딩되는 단백질의 정량을 반영하는 바, 정량적 핵산 방법은 또한 미코플라스마가 하나 이상의 단백질의 발현 감소 또는 발현 부재를 나타내는지 여부를 측정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 정량적 역전사효소/중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 방법을 사용하여 관심의 대상이 되는 특정 단백질에 상응하는 mRNA의 정량을 측정할 수 있다. 다수의 정량적 핵산 기반 방법이 당업계에 주지되어 있다. 정성적 핵산 기반 기법 (예컨대, 노던 블롯 분석법) 또한 당업계에 주지되어 있다.

한 실시양태에서, ts-19는 둘 모두가 단백질 합성에 관여하는 것인, 돌연변이된 형태의 류실-tRNA 신테타제 및 결실된 형태의 이소류실 tRNA 신테타제를 포함하는 바, 야생형 미코플라스마와 비교하여 약독화된 미코플라스마에서 전체 단백질 합성이 변경될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 방법은 전체 단백질 합성에 대하여 미코플라스마 박테리아를 검정하는 단계를 포함한다.

"발현 감소"와 관련하여, 야생형과 비교하였을 때 감소는 야생형에 대해 상대적으로 적어도 약 5%일 수 있다. 다른 실시양태에서, 발현 감소는 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95% 또는 99%이다. 또 다른 실시양태에서, 박테리아는 야생형 박테리아에서 발현되는 단백질 발현을 전혀 나타내지 않고, 이로써, 발현 감소율(%)은 100%가 된다.

한 실시양태에서, 유전자 수준으로 검정함으로써, 즉, 핵산을 검정함으로써 표 1에 열거된 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자 중의, 또는 표 2 내지 5 중 어느 하나 이상에 열거된 핵산 분자 중의 돌연변이의 존재에 대하여 검출한다. 상기 검정법은 PCR 검정법일 수 있다.

적합한 PCR 검정법의 유형으로는 통상의 PCR, 다중 PCR, 정량적 PCR (qPCR), 실시간 PCR (RT-PCR), 형광 모세관 전기영동 (CE), 고해상도 용융 곡선 (HRM) 분석, 융점 (Tm) 분석, 가변수 직렬 반복 (VNTR) 및 다중 유전자좌 서열 타이핑 (MLST) 및 단일 뉴클레오티드 프라이머 연장 검정법을 포함한다.

통상의 PCR 산물 분석은 당업자에게는 쉬운 방법일 것이며, 이는 기법, 예컨대, 뉴클레오티드 서열 분석, 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 분석, 변성 구배 겔 전기영동 (DGGE) 및 단일 가닥 형태 다형성 (SSCP) 분석을 포함할 수 있다.

PCR 증폭은 돌연변이(들)의 영역 측면에 위치하는 PCR 프라이머를 선택함으로써 수행될 수 있다. 각 PCR 프라이머 세트는 바람직하게는 오직 단일 밴드 (앰플리콘)만을 생산할 것이다. 앰플리콘의 크기는 PCR 기반 분석 방법에 적합한 크기일 수 있다.

부분적으로 본 발명은 엠. 하이오 야생형 균주, 및 그의 온도 감수성인 약독화된 균주의 DNA 서열 간의 변화에 관한 것이지만, 이러한 돌연변이가 약독화와 연관되어 있다는 발견은 미코플라스마 종 간에 이들 단백질이 보존되는 바, 같은 유전자를 포함하는 모든 미코플라스마 종에 적용될 수 있다.

제1 및 제2 측면의 방법, 및 제3 측면의 약독화된 미코플라스마 박테리아는 임의의 미코플라스마 종에 대한 것일 수 있다.

한 실시양태에서, 약독화된 박테리아는 동물-병원성 미코플라스마 박테리아로부터 유래된 것이다. 본원에서 사용되는 바, "동물-병원성 미코플라스마 박테리아"라는 용어는 그의 야생형인 비약독화된 상태에서 동물을 감염시킬 수 있고, 동물에서 질환 및/또는 질병을 유발할 수 있는 박테리아를 의미한다. "동물에서의 질환 및/또는 질병"으로는 동물에서의 유해한 신체 소견 뿐만 아니라, 단지 조직학적, 현미경적, 및/또는 분자적 진단 결과 나타는 질환 또는 감염의 임상적 징후를 포함한다. 동물-병원성 미코플라스마 박테리아에는 인간- 및 비-인간-병원성 미코플라스마 박테리아가 포함된다. 인간-병원성 미코플라스마 박테리아로는 예컨대, 미코플라스마 종의 박테리아, 엠. 제니탈륨(M. genitalium), 엠. 페르멘탄스(M. fermentans), 엠. 살리바륨(M. salivarium), 엠. 호미니스(M. hominis), 엠. 뉴모니아(M. pneumonia), 엠. 인코그니투스(M. incognitus), 엠. 페네트란스(M. penetrans), 엠. 피룸(M. pirum), 엠. 파우큠(M. faucium), 엠. 리포필룸(M. lipophilum), 및 엠. 부칼레(M. buccale)가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 비-인간-병원성 미코플라스마 박테리아에는 예컨대, 조류-, 돼지-, 양-, 소-, 염소- 또는 개-병원성 미코플라스마 박테리아가 포함된다. 조류-병원성 미코플라스마 박테리아에는 예컨대, 미코플라스마 종의 박테리아, 엠. 클로아칼레(M. cloacale), 엠. 갈리나룸(M. gallinarum), 엠. 갈리셉티쿰(M. gallisepticum), 엠. 갈로파보니스(M. gallopavonis), 엠. 글리코필룸(M. glycophilum), 엠. 이너스(M. iners), 엠. 아이오와에(M. iowae), 엠. 리포파시엔스(M. lipofaciens), 엠. 멜레아그리디스(M. meleagridis), 및 엠. 시노비아에(M. synoviae)가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 돼지-병원성 미코플라스마 박테리아에는 예컨대, 미코플라스마 종의 박테리아, 엠. 플록쿨라레(M. flocculare), 엠. 하이오뉴모니아에(M. hyopneumoniae), 엠. 하이오리니스(M. hyorhinis), 및 엠. 하이오시노비아에가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 양-, 소-, 염소- 또는 개-병원성 미코플라스마 박테리아에는 예컨대, 미코플라스마 종의 박테리아, 엠. 카프리콜룸 아종 카프리콜룸(M. capricolum subsp . capricolum), 엠. 카프리콜룸 아종 카프리뉴모니아에(M. capricolum subsp . capripneumoniae), 엠. 마이코이데스 아종 마이코이데스 LC(M. mycoides subsp . mycoides LC), 엠. 마이코이데스 아종 카프리(M. mycoides subsp . capri), 엠. 보비스(M. bovis), 엠. 보보쿨리(M. bovoculi), 엠. 카니스(M. canis), 엠. 칼리포르니쿰(M. californicum), 및 엠. 디스파르(M. dispar)가 포함되나, 이에 한정되지 않는다.

제2 측면의 방법에서, 미코플라스마 박테리아의 초기 집단을 약독화 조건에 적용한다.

본 발명의 상기 측면에 따라, "미코플라스마 박테리아의 초기 집단"은 임의 양의 미코플라스마 박테리아일 수 있다. 특정 실시양태에서, 박테리아는 야생형 박테리아이다. 별법으로, 박테리아는 하나 이상의 돌연변이를 함유할 수 있다. 한 실시양태에서, 초기 집단 중 박테리아는 클론상 동일하거나, 클론상 실질적으로 동일하고; 즉, 박테리아는 바람직하게는 모두 단일의 모 미코플라스마 박테리아 세포로부터 유래된 것이고/거나, 동일하거나, 실질적으로 동일한 유전자형 및/또는 표현형의 특징을 가진다.

본원에서 사용되는 바, "약독화 조건"이라는 용어는 하나 이상의 유전적 변화 (예컨대, 뉴클레오티드 돌연변이)를 미코플라스마 박테리아의 게놈 내로 도입할 수 있는 잠재능을 가진 임의의 한 조건 또는 조건들의 조합을 의미한다. 약독화 조건의 비-제한적 일례로는 예컨대, 배양물 중에 박테리아를 계대배양하는 것, 박테리아를 게놈-삽입가능한 유전적 요소, 예컨대, 트랜스포존 (예컨대, 무작위적으로 미코플라스마 게놈 내로 삽입하는 트랜스포존)으로 형질전환시키는 것, 박테리아를 하나 이상의 돌연변이원 (예컨대, 화학적 돌연변이원 또는 자외선)에 노출시키는 것, 부위 지정 돌연변이유발 또는 결실 등이 포함된다. 시험관내에서의 계대배양에 의해 박테리아 세포를 약독화시키는 경우, 세포를 시험관내에서 임의 횟수에 걸쳐, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40회 이상에 걸쳐 계대배양할 수 있다.

약독화 조건에 적용한 후, 미코플라스마 세포의 초기 집단을 본원에서 추정상 약독화된 박테리아 집단으로 지칭한다. 추정상 약독화된 박테리아 집단의 개별 클론은 예컨대, 세포를 연속으로 희석시키고, 개별 세포를 적절한 배지 중에 플레이팅하는 것을 비롯한, 표준 미생물 기법에 의해 수득할 수 있다. 일단 수득하고 나면, 추정상 약독화된 박테리아 집단의 개별 클론을 표 1에 열거된 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자 중의, 또는 표 2 내지 5 중 어느 하나에 열거된 핵산 분자 중의 돌연변이의 존재에 대하여 검정한다. 약독화된 미코플라스마 박테리아가 돌연변이를 포함하는지 여부를 측정하는 방법은 본원 어디에든 기술되어 있다. 예시적인 방법에는 예컨대, RT-PCR-기반 방법, 웨스턴 블롯 등이 포함된다.

필요한 돌연변이 중 적어도 하나를 포함하는 것으로 확인된 개별 클론은 야생형 (비약독화된) 버전의 박테리아에 의해 감염되기 쉬운 동물에게 상기 클론을 투여함으로써 독성에 대하여 시험될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "야생형 미코플라스마 박테리아에 의해 감염되기 쉬운 동물"은 야생형 미코플라스마 박테리아로 시험감염시킨 후에 적어도 하나의 임상적 증상을 보이는 동물이다. 상기 증상은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 표 1에 열거된 각각의 단백질 중 돌연변이 및 표 2 내지 5에 열거된 각각의 돌연변이를 나타내는 추정상 약독화된 엠. 하이오 균주인 경우, 균주는 (보통 야생형 엠. 하이오에 의해 감염되기 쉬운) 돼지에 투여될 수 있다. 돼지의 엠. 하이오 감염의 임상적 증상에는 예컨대, 급성 호흡 증상, 및 체중 증가 감소를 포함한다. 따라서, 추정상 약독화된 엠. 하이오 균주가 돼지에게 투여되었을 때, 야생형 엠. 하이오 균주로 감염된 돼지와 비교하여 증상이 감소하고/거나 증상의 중증도가 감소하였다면, 이때, 추정상 약독화된 엠. 하이오 균주는 "감소된 독성"을 가지는 것으로 간주된다. 임의의 증상의 감소 정도를 통해 추정상 약독화된 균주가 감소된 독성을 가지는 것으로 확인할 수 있을 것이다. 특정 실시양태에서, 추정상 약독화된 균주는 비독성일 것이다.

제3 측면의 약독화된 미코플라스마 박테리아는 생 백신에서 사용될 수 있다.

"시험관내 일련의 계대배양"이라는 용어는 배지 중에서의 박테리아의 반복적 계대배양을 실시하는 것을 의미한다. 이는 살아있는 박테리아의 배양물을 브로쓰 배지 중에 접종한 후, 적절한 온도에서 일정 시간 동안 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 이어서, 인큐베이션된 배양물 중 일부를 신선한 멸균 배양물의 접종에 사용하고, 이어서 일정 시간 동안 인큐베이션시킨다. 원하는 계대배양 횟수만큼 사이클을 계속 실시한다. 각 회의 성장 및 재-접종을 단일 계대배양이라고 지칭한다.

제4 측면의 면역원성 조성물은 제3 측면의 약독화된 미코플라스마 박테리아를 포함한다. 이러한 면역원성 조성물은 적합한 담체와 함께 제5 측면의 백신에 사용될 수 있다.

백신은 특정 질환에 대한 면역성을 확립하거나 개선시키는 생물학적 제제이다. 백신은 예방적인 것 (예컨대, 병원체에 의한 후속 감염의 효과를 예방하거나 또는 경감시키는 것)이거나, 또는 치료적인 것(예컨대, 감염을 치료하는 것)일 수 있다. 제5 측면의 백신은 미코플라스마 박테리아에 의해 유발되는 질환에 대해 예방적인 것이다.

적절한 담체는 당업자에게 명백할 것이고, 주로 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 백신은 현탁화제, 안정화제 또는 분산제를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 백신 중에 존재할 수 있는 추가의 성분은 아주반트, 보존제, 화학적 안정화제 또는 다른 항원성 단백질이다. 전형적으로, 안정화제, 아주반트 및 보존제는 표적 동물에서 효능을 위해 최상의 제제를 결정할 수 있도록 최적화된다. 적합한 예시적 보존제에는 클로로부탄올 칼륨 소르베이트, 소르브산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀 및 파라클로로페놀이 포함된다. 사용될 수 있는 적합한 안정화 성분에는 예를 들어 카사미노산, 수크로스, 젤라틴, 페놀 레드, N-Z 아민, 모노칼륨 디포스페이트, 락토스, 락트알부민 가수분해물 및 분유가 포함된다. 통상의 아주반트는 백혈구를 유인하거나 또는 면역 반응을 증진시키기 위해 사용된다. 이러한 아주반트에는 특히 MPL.TM. (3-O-데아실화 모노포스포릴 지질 A; RIBI 이뮤노켐 리서치, 인크.(RIBI ImmunoChem Research, Inc.: 미국 몬타나주 해밀턴)), 미네랄 오일 및 물, 수산화알루미늄, 암피겐(Amphigen), 아브리딘(Avridine), L121/스쿠알렌, D-락티드-폴리락티드/글리코시드, 플루로닉 플라이오이스(pluronic plyois), 무라밀 디펩티드, 사멸된 보르데텔라(Bordetella), 사포닌, 예컨대 퀼(Quil) A 또는 스티뮬론(Stimulon).TM. QS-21 (아퀼라 바이오파마슈티칼즈, 인크.(Aquila Biopharmaceuticals, Inc.: 미국 메사추세츠주 프레이밍햄)) 및 콜레라 독소 (야생형 또는 돌연변이체 형태, 예컨대, 국제 특허 출원 번호 PCT/US99/22520에 따르면, 아미노산 29번 위치의 글루탐산이 또 다른 아미노산, 바람직하게는 히스티딘으로 대체된 형태)가 포함된다.

한 실시양태에서, 백신이 주사되는 경우, 주사 부위에서의 유해하거나 바람직하지 못한 반응, 예를 들어, 피부 자극, 팽윤, 발진, 괴사, 피부 민감화는 거의 일어나지 않거나 또는 전혀 일어나지 않는다.

제6 측면은 미코플라스마에 의해 유발되는 질환에 대하여 방어하는 것에 관한 것이다. 제5 측면의 백신은 미코플라스마에 의해 유발되는 질환에 대해 예방적인 것이다.

본원에서 언급되는 "예방" 또는 "예방적" 또는 "방지적" 요법, 또는 "~에 대해 방어적"이라는 것은 감염의 발생을 방지하거나, 또는 미코플라스마에 의해 유발되는 질환의 발생 또는 중증도를 저해하거나, 방어하거나 또는 보호하는 것 (특정 질환에 걸린 것으로 진단받은 것은 아니지만, 질환에 걸릴 수 있는 대상체에서 질환을 예방하거나, 보호하거나, 또는 질환의 증상의 중증도 또는 특징이 줄어들게 하는 것을 포함)을 포함한다. 또한, 이는 감염 기간을 단축시키거나, 또는 증상의 빈도를 감소시키고, 임의의 병변의 크기를 축소시키는 것을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "예방"은 질환의 총체적인 방지, 또는 질환의 정도 또는 증상의 감소를 포괄한다. 또한, 이는 미코플라스마의 전염의 감소 또는 억제, 또는 숙주에서의 박테리아 확립의 방지, 또는 다른 미코플라스마 균주 또는 다른 감염원에 의한 2차 감염에 대한 방어를 의미한다.

제5 측면의 백신은 예를 들어, 액체, 분말, 에어로졸, 정제, 캡슐, 장용 코팅 정제 또는 캡슐, 또는 좌제의 형태로 동물에게 투여하도록 제조될 수 있다. 투여 경로에는 비제한적으로 비경구 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 진피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비강내 투여, 폐내 투여, 직장 투여, 질 투여 등이 포함된다.

기도를 감염시키는 미코플라스마 박테리아와 관련된 실시양태에서, 백신은 예를 들어, 비강내 투여, 에어로졸 투여, 또는 입 또는 코에 의한 흡입 투여에 의한 기도 투여용으로 제제화된다. 이러한 투여 경로는 엠. 하이오뉴모니아에에 대한 방어 면역의 성질이 순환 항체로부터 질환을 방지한다기 보다는 국부적 (폐) 면역 및 세포-매개 면역일 수 있기 때문에 바람직하다. 백신을 기도에 제시하는 것이 국부 면역 반응을 자극시킬 수 있다. 따라서, 백신의 국부 투여가 보다 효과적일 수 있다. 추가로, 백신을 밀폐된 반(barn) 또는 공간으로 투여 (입자가 큰 스프레이 매스 투여)하여 돼지가 이를 흡입하도록 함으로써, 다수의 동물을 백신화시키는 데 관련된 노동력을 감축시킬 수 있다. 에어로졸 백신화 (또는 스프레이 백신화)는 현재, 특정 질환에 대해 가금류를 효과적으로 백신화시키는 데 상업적 기반으로 사용되고 있고, 이는 또한 돼지 백신화에도 적합하다.

비강내 투여는 비강 또는 코를 통한 임의의 투여를 포함한다. 백신은 액체, 현탁액 또는 건조 분말로서 비강에 적용될 수 있다. 액체 및 현탁액은 예를 들어, 피펫, 드로퍼 또는 스프레이, 임의로 에어로졸 스프레이를 사용하여 비강내 투여될 수 있다. 건조 분말은 흡입에 의해 비강내 투여될 수 있다.

에어로졸 투여는 고체 미립자의 현탁액 또는 기체 중의 액체 소적으로서의 백신 투여를 지칭한다.

흡입 (흡기로도 공지되어 있다)은 외부 환경으로부터 기도를 거쳐 폐내 폐포내로까지의 공기의 움직임이다.

치료학상 이용되는 백신의 유효 용량은 예를 들어, 치료 목적, 투여 경로, 및 동물의 상태에 따라 달라질 것이다.

백신의 투여량 수준은 일반적으로는 대략 용량당 1 mL당 약 10³ 내지 10⁸ 변색 단위 (CCU), 및 바람직하게는 용량당 1 mL당 약 10⁴ 내지 10⁷ CCU가 될 것이다.

그러나, 임의의 특정 돼지 동물에 대한 구체적인 용량은 사용되는 구체적인 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별, 식이, 투여 시간 및 투여 경로를 비롯한, 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다는 것을 이해할 것이다.

유효 용량을 선택하고, 상향 또는 하향 조정하는 것은 당업자의 기술 범위내 포함되어 있다.

균주를 약독화시킬 수 있는 미코플라스마 박테리아내 돌연변이에 관한 정보를 통해서 동물이 약독화된 균주 또는 독성 미코플라스마 균주로 감염되었는지 여부를 측정할 수 있다.

야생형 현장 균주는 동물을 감염시키고, 독성 균주일 경우, 이때 상기 균주는 혼자 힘으로 질환을 유발할 수 있거나, 2차 박테리아 및/또는 바이러스 감염이 원활히 일어날 수 있도록 기반을 다질 수 있다.

감염 후, (자연적인 노출에 의한 감염을 통해) 백신 균주 및 임의의 야생형 미코플라스마 균주 둘 모두를 동물로부터 회수할 수 있다. PCR에 의해 검출할 수 있다. 유기체는 감염된 조직 (예컨대, 폐, 또는 기도)으로부터 직접 추출할 수 있고, PCR에 의해 검출할 수 있다. 동물로부터 회수된 유기체를 먼저 시험관내에서 배양하여 더 많은 유기체 사본이 (예컨대, PCR에 의한, 또는 확인을 위한 생화학적 또는 혈청학적 방법을 통한) 검출 방법의 유효성을 증가시킬 정도로 존재하도록 유기체를 성장시킬 수 있다.

감염 발생 분석과 관련하여, 제9 측면의 방법은 상기 발병이 백신 균주에 기인한 것인지 여부를 측정할 수 있다. 즉, 동물이 미코플라스마 백신으로 백신화된 후, 곧 질환이 발병하였다면, 대상체를 시험하여 감염의 원인이 백신인지 여부, 또는 야생형 독성 현장 균주인지 여부를 측정할 수 있다. 이는 특히 농장 환경에서 중요하다.

제9 및 제10 측면은 약독화와 관련된 돌연변이를 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브를 포함하는 키트를 제공한다.

한 실시양태에서, 프라이머는 MHP-2F (서열 1) 및 MHP-2R (서열 2)이다.

또 다른 실시양태에서, 프라이머는 MHP-9/10-2F (서열 3) 및 MHP-9/10-2R (서열 4)이다.

한 실시양태에서, 키트는 돌연변이된 유전자 또는 핵산 분자와 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한다. 프로브는 방사성 또는 비-방사성 표지화제로 표지될 수 있는데, 후자는 통상의 비오틴, Dig (디곡시게닌), FRET (형광 공명 에너지 전이) 또는 형광 염료 (Cy5 또는 Cy3)를 포함한다. 추가로, 올리고뉴클레오티드는 PCR 증폭용 프라이머로서 사용될 수 있다. 이러한 경우, 키트는 DNA 폴리머라제, 4가지 dNTP 및 PCR 반응용 PCR 완충제를 함유할 수 있다. 추가로, 올리고뉴클레오티드는 프로브로서 마이크로어레이에 부착될 수 있다. 이러한 경우, 키트는 혼성화 반응용 완충제를 함유할 수 있으며, PCR 키트는 표적 유전자 증폭용 프라이머, 혼성화되지 못한 DNA 세척용 용액, 염료, 비결합 염료 세척용 용액, 및 마이크로어레이용 사용 설명 시트를 포함한다.

한 실시양태에서, 프로브는 단일 샘플로부터 유래된 1 초과의 돌연변이를 동시에 검출할 수 있는 1 초과의 프로브의 조합일 수 있다. 실제로, 프로브는 같은 혼성화 및 세척 조건하에서 미코플라스마의 다중의 표적 돌연변이 DNA와 동시에 혼성화할 수 있도록 최적화된다.

한 실시양태에서, 키트는 단일 샘플로부터 유래된 다수의 돌연변이를 1회의 실험으로 동시에 검출할 수 있는, 하나 이상의 돌연변이를 검출하기 위한 프로브 세트를 포함하는 마이크로어레이를 제공한다.

본 명세서 전역에 걸쳐 문맥상 달리 요구하지 않는 한, "포함한다(comprise)"라는 단어 또는 예컨대, "포함한다(comprises)" 또는 "포함하는"과 같은 파생어는 언급된 요소 또는 정수, 또는 요소 또는 정수의 군의 포함을 의미하지만, 임의의 다른 요소 또는 정수, 또는 요소 또는 정수의 군의 배제를 의미하는 것은 아니라는 것을 이해할 것이다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 바, 단수형("a", "an" 및 "the")은 문맥상 분명하게 달리 명시되지 않는 한, 복수형의 측면을 포함한다는 것에 주목해야 한다.

본 발명이 명료함과 이해의 목적으로 다소 상세히 기술되었지만, 본 명세서에 개시된 본 발명 개념의 범주로부터 벗어나지 않으면서, 본원에 기술된 실시양태 및 방법에 대해 다양하게 변형 및 변경될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.

본 명세서에서 인용된, 임의의 특허 또는 임의의 특허 출원을 비롯한 모든 참고문헌은 본원에 참고로 포함된다. 비록 다수의 선행 문헌들이 본원에서 언급되기는 하였지만, 이러한 언급이 그러한 임의의 문헌이 당업계의 일반 상식의 일부분을 형성한다는 것을 승인하는 것은 아니라는 것을 분명히 이해할 것이다.

도 1aa-1cc는 NC_007295.1로서 기탁된 엠. 하이오 J 균주 및 엠. 하이오 LKR 균주와 비교되는, 엠. 하이오 ts-19 백신 균주 (마스터 및 P12) 중의 돌연변이의 정확한 성질 및 위치를 나타낸 것이다.
도 2A-D는 정규화된 그래프 모드의, 게놈 표적 MHP2의 고해상도 용융 (HRM) 프로파일을 나타낸 것이다. (A) 박스세이프(Vaxsafe)^® MHP 균주, 박스세이프^® MHP의 모 균주, 및 엠. 하이오의 현장 단리된 균주의 HRM. (B) 박스세이프^® MHP 균주 및 박스세이프^® MHP의 모 균주의 HRM. (C) 박스세이프^® MHP 균주 및 현장 단리물 균주의 HRM. (D) 야생형으로부터의 임의의 편차를 관찰할 수 있도록 하기 위해 야생형 균주가 정규화된 차이 그래프.
도 3A 및 B는 박스세이프^® MHP 백신 균주 및 모 균주에 대한, 정규화된 그래프 모드의 게놈 표적 MHP9/10의 고해상도 용융 (HRM) 프로파일을 나타낸 것이다. (B) 백신으로부터의 임의의 편차를 관찰할 수 있도록 하기 위해 백신 균주가 정규화된 차이 그래프.
도 4A 및 B는 박스세이프^® MHP 백신 균주, 모 균주 및 상기 두 균주의 혼합물에 대한, 정규화된 그래프 모드의 게놈 표적 MHP9/10의 고해상도 용융 (HRM) 프로파일을 나타낸 것이다. (B) 백신으로부터의 임의의 편차를 관찰할 수 있도록 하기 위해 백신 균주가 정규화된 차이 그래프.
본 발명은 이제 하기 실시예를 참조함으로써 추가로 상세히 기술된다. 실시예는 오직 예시의 목적으로만 제공되는 것이며, 달리 명시되지 않는 한 제한적인 것으로서 간주되어서는 안된다. 따라서, 본 발명은 본원에 제공된 교시의 결과로서 명백해진 임의의 모든 변형을 포함한다.

실시예 1 : 백신 균주 제조

호주 미코플라스마 하이오뉴모니아에 단리물 LKR은, 전형적인 동물토착성 폐렴 질환을 나타내는 돼지 폐의 도축된 표본이다 (문헌 [Lloyd and Etheridge (1981), J. Comp. Path. 91:77-83]). 상기 단리물은 애들레이드 대학(호주 사우스 오스트레일리아주)의 미코플라스마 참조 배양물 수집회에서 배양되고 저장되었다. 이어서, 멜버른 대학 (호주 빅토리아주)의 미코플라스마 그룹에 의해 상기 단리물의 배양물을 수득하였다.

배양물을 3회에 걸쳐 시험관내 계대배양한 후, 선행 기재 방법 (문헌 [Nonamura and Imada (1982) Avian Diseases 26:763-775])을 이용하여 200 mg/mL로 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (NTG)을 사용함으로써 돌연변이유발이 일어나도록 하였다. 간략하면, 엠. 하이오뉴모니아에 균주 LKR의 배양물을 후기 로그기까지 성장시키고, 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 세포를 포스페이트 완충 염수 (PBS)에서 세척하고, NTG에 노출시켰다. 세포를 펠릿화하고, 변형된 프리스(Friis) 배지 (Friis, N.F. 1975)에 재현탁시키고, 33℃에서 4 h 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 배양물을 0.45 μm 필터를 통해 통과시키고, 적절하게 희석시키고, 분취액을 아가 플레이트 상에 두고, 33℃에서 인큐베이션시켰다. 성장시킨 콜로니를 3 mL의 브로쓰 내로 클로닝시키고, 33℃에서 인큐베이션시켰다. 클론의 앰플을 -70℃에서 저장하고, 각 클론의 온도 감수성을 측정하였다.

2배수로 적정하고, 33℃ 및 39.5℃에서 인큐베이션을 수행함으로써 ts-19의 온도 감수성을 측정하였다. 역가는 전형적으로 33℃에서 >1 x 10⁸ CCU/mL이고, 39.5℃에서 <1 x 10² CCU/mL였다.

ts-19 균주를 부다페스트 조약하에 NM 04/41259로서 기탁하였다. 이는 돼지에서의 엠. 하이오뉴모니아에 감염에 대한 방어용의 약독화된 온도 감수성 생 백신인 박스세이프^® MHP에 사용되었다.

실시예 2: 서열분석 및 분석

3가지 엠. 하이오뉴모니아에 균주 (백신 균주 ts-19 마스터, ts-19 P12 및 모 균주 LKR)에 대한 전체 게놈 서열분석을 실시하였다. 454 서열분석 기술 (로슈(Roche))을 사용하여 서열분석을 수행하였다. 서열분석되는 3가지 게놈들 각각에 대해 1 판독당 최소 15X 범위로 실시하였다. 각각의 개별 게놈에 대하여 각 판독값 세트로부터 컨센서스 서열을 유추하였다. 각 게놈에 대한 중복 판독물을 수개의 큰 콘티그로 정렬하였다. 서열 정렬을 통해 백신 균주로부터 유래된 콘티그는 엠. 하이오뉴모니아에 J 균주 서열 (NC_007295.1)과 고도의 상동성을 가지는 것으로 측정되었다.

이어서, 각 균주로부터의 큰 콘티그를 J 균주 서열에 대해 정렬한 후, ts-19 또는 LKR 서열 내의 갭을 확인하였다. 갭에 걸쳐지는 수개의 PCR 프라이머를 디자인하고, 합성하였다. 프라이머 서열은 백신 또는 LKR 균주로부터, 또는 뉴클레오티드 데이터베이스 상에서 이용가능한 J 균주의 서열 (진뱅크(GENBANK), NC_007295.1)로부터 생성된 서열의 조합에 기초하였다. 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 표적 영역을 증폭시켰다. 이어서, PCR 앰플리콘의 서열을 분석하였다. 이어서, 갭이 가교될 때까지 갭 영역에 결쳐있는, 중복 판독물로부터 생성된 서열을 콘티그로 정렬한 후, 전체 게놈 서열을 완성하였다.

일단 ts-19 (마스터 및 P12) 뿐만 아니라, 모 균주 LKR의 전체 게놈 서열이 완성되고 나면, 3가지 서열을 다중 서열 정렬 중 J 균주의 전장의 게놈에 대해 정렬하였다.

다중 서열 정렬로부터, LKR 및 J 균주 서열 둘 모두와 비교하였을 때, ts-19 마스터 및 P12 게놈 둘 모두로부터 치환, 결실, 또는 삽입된 뉴클레오티드 염기를 돌연변이로서 확인하였다. 이들 돌연변이를 공지의 유전자, 가설 유전자, 유전자간 또는 비-코딩 영역 내의 변화로 분류하였다. 돌연변이된 유전자에 의해 코딩된 단백질은 표 1에 열거되어 있다. 표 2 내지 5에 추가의 돌연변이가 열거되어 있다. 돌연변이의 정확한 성질 및 위치는 도 1에 제시되어 있다.

실시예 3: 신규의 약독화된 미코플라스마 에 대한 선택

ts-19 중에서 돌연변이가 일어난 하나 이상의 유전자에 대하여 클론을 선택함으로써 신규의 미코플라스마 하이오뉴모니아에 또는 다른 미코플라스마 종 백신 후보(들)를 선택할 수 있었다.

돌연변이유발 및 ts 선택과정 후, ts 미코플라스마 클론을 배양물 중에서 성장시키고, 표준 방법을 사용하여 유기체의 mRNA를 추출하였다. mRNA를 역전사효소를 사용하여 cDNA로 전환시켰다. 모 균주 또한 배양액 중에서 성장시키고, 유기체의 mRNA를 추출하였다. mRNA를 cDNA로 전환시켰다.

각각의 ts 클론 및 모 균주로부터의 cDNA를 ts-19에서 확인된 돌연변이된 유전자 중 하나 이상을 표적화하는 개별 PCR 반응에 사용하였다. 생성된 PCR 앰플리콘(들)을 마이크로어레이 슬라이드 상에 프린팅하였다. ts 클론 PCR 산물 어레이를 포함하는 2개의 슬라이드를 제조하고, 모 PCR 산물 어레이를 포함하는 2개의 다른 슬라이드를 제조하였다.

이어서, ts 클론로부터의 전체 게놈 cDNA는 Cy 다이 이스터(Cy Dye Ester) (예컨대, Cy3)에 커플링시키고, 모 균주로부터의 전체 게놈 cDNA는 또 다른 Cy 다이 이스터 (예컨대, Cy4)에 커플링시켰다.

Cy3으로 표지된 cDNA는 각각의 마이크로어레이 슬라이드 (하나는 ts 클론 및 하나는 모 균주)에 혼성화하였다. 유사하게, Cy4로 표지된 cDNA는 각각의 마이크로어레이 슬라이드 (하나는 ts 클론 및 하나는 모 균주)에 혼성화하였다.

유전자 발현 수준을 반영하는 혼성화 신호 강도 및 색상에 기초하여 차별적인 발현을 분석하였다.

실시예 4: 현장에서 ts -19와 다른 엠. 하이오 사이의 구별

특이적인 프라이머(들) 세트를 사용하여 현장 샘플 (예컨대, 감염된 돼지로부터 회수된 폐 조직 또는 비강 면봉)을 PCR 증폭시켰다. 각 프라이머 세트는 ts-19 백신 균주에 독특한 것으로 확인된 돌연변이의 다른 부위 측면에 위치하도록 디자인하였다. PCR 앰플리콘은 예로서, 하기의 것들을 비롯한, 돌연변이 검출 기법에 의해 분석할 수 있었다:

형광 모세관 전기영동 ( CE ):

결실 및 삽입 돌연변이에 대해서는 형광 CE가 사용하기 적합한 돌연변이 검출 기법일 것이다. 이러한 경우, PCR 프라이머를 상이한 형광단을 사용하여 각각 표지하고, PCR 반응에 사용한다. 현장 샘플 (시험군) 뿐만 아니라, ts-19 샘플 (양성 대조군)을 PCR 증폭시킨다. 현장 시험 샘플 및 양성 대조군 (ts-19)으로부터 생성된 PCR 산물을 모세관 전기영동시키고, 이로써 크기에 기초하여 PCR 산물을 분리한다. 단일 (또는 다중) 뉴클레오티드 염기 결실 또는 삽입으로부터 생성된 앰플리콘의 크기 변화를 CE를 통해 확인할 수 있다. 따라서, 백신 균주로부터의 PCR 앰플리콘은 현장 샘플로부터 생성된 PCR 앰플리콘과는 상이한 공지의 피크 위치를 가질 것이다. ts-19 백신 및 현장 균주 둘 모두가 샘플 중에 존재할 경우, 이때 뚜렷이 다른 두 피크가 관찰될 것이다.

단일 가닥 형태 다형성 ( SSCP ):

단일 가닥 형태 다형성 (SSCP) 분석은 돌연변이 검출용의 민감한 기법이다. SSCP 분석의 원리는 단일 가닥 DNA가 정의된 형태를 가지고 있다는 사실에 기초한다. 서열 중 단일 염기 변화에 기인하여 형태가 변경되면 단일 가닥 DNA는 비-변성 전깅영동 조건하에서 다르게 이동하게 된다. 따라서, ts-19 백신 균주 (양성 대조군)로부터의 PCR 및 현장 시험 샘플(들)의 PCR은 다른 밴딩 패턴을 보이게 될 것이다.

SSCP는 염기 변화, 결실, 및 삽입에 대해 적용시킬 수 있다. 방사성 표지된 프라이머 (예컨대, P³³으로 표지된 프라이머)를 사용하여 하나 이상의 돌연변이 영역을 PCR 증폭시킬 수 있다. 현장 시험 샘플과 동일한 방식으로 ts-19 양성 대조군 앰플리콘 샘플을 검정한다. 이중 가닥 DNA 앰플리콘을 변성시키면 (즉, 열 및 알칼리성에 노출시키면) 단일 가닥 DNA 분자가 형성되고, 이를 즉시 비-변성 조건하에서 전기영동으로 분리시킨다. 전기영동 후, 여과지 (예컨대, 와트만(Whatmann)) 상에서 겔을 건조시킨 후, 자가방사선술용 필름에 노출시킨다. 자가방사선사진을 현상시킨 후, 현장 샘플로부터의 밴딩 패턴을 ts-19 양성 대조군 샘플의 것과 비교한다. 밴딩 패턴이 ts-19 패턴과 동일하다면, 이는 샘플이 ts-19 백신 균주임을 시사하는 것이 된다. 밴딩 패턴이 상이하다면, 이는 샘플이 ts-19가 아님을 시사하는 것이 된다.

SSCP 방법은 또한 비-방사선 포맷에도 적용될 수 있다.

고해상도 용융 ( HRM ) 곡선 분석:

염기 치환, 결실, 및 삽입을 포함하는 돌연변이에 대해 HRM 곡선 분석을 적용시킬 수 있다. 이러한 경우, 현장 시험 샘플 뿐만 아니라, ts-19 양성 대조군 샘플도 사이클 서열분석기를 사용하여 (돌연변이를 포함하는) 독특한 영역에 대해 실시간 (RT) PCR 증폭을 수행할 수 있다. 사용되는 PCR 기기는 HRM 곡선 분석을 수행할 수 있는 것이다. PCR 증폭 사이클 종료시, PCR 앰플리콘을 PCR 기기에 의해 수행되는 HRM 곡선 분석에 적용한다. ts-19 앰플리콘은 현장 균주 앰플리콘과 비교하였을 때 구별되는 용융 곡선 디스플레이를 나타낼 것이다.

실시예 5: 박스세이프 ^® MHP 에 대한 HRM 분석

실시예 2로부터 얻은 돌연변이 데이터에 기초하여, 박스세이프^® MHP 백신 균주 및 백신 모 균주를 비롯한 다른 엠. 하이오 균주 사이를 구별할 수 있는 고해상도 용융 곡선 (HRM) 검정법에 관한 2가지 예시적인 방법이 개발되었다. 그러나, 백신 균주내 존재하는 돌연변이 변화 중 임의의 것을 HRM 분석을 위해 표적으로서 사용할 수 있다.

HRM 분석에 대한 일례로서 백신 게놈 내의 두 영역을 선택하였다. 이들 영역을 MHP2 및 MHP9/10으로 명명하였다. MHP2는 단일 돌연변이 (도 1ba 및 1ca 돌연변이 번호 2)를 표적화하는 HRM의 일례였다. MHP9/10은 2개의 돌연변이 (도 1bb 및 1ca 돌연변이 번호 9 및 10)를 표적화하는 HRM의 일례였다. 타이프-잇(Type-it)^® HRM™ 키트와 함께 2 또는 5 플렉스(Plex) 및 HRM 수행능이 있는 퀴아젠(Qiagen) "로터 진 Q(Rotor Gene Q)" 장치를 본 연구에서 사용하였다. 간략하면, HRM은 돌연변이 스캐닝 및 유전자형 분석을 위해 사용될 수 있는 PCR 후속 기법이다. 본 방법은 PCR 후속 처리를 필요로 하지 않으며, 이에 교차 오염의 위험을 최소화시킬 수 있다. 나아가, 분리 단계를 수반하지 않으며, 이로써 분석 시간이 단축된다.

오염성 유기체의 성장을 최소화시키기 위해 선택 브로쓰 배지 중에서 엠. 하이오뉴모니아에에 대하여 배양된, DNA 샘플, 예컨대, 임상 샘플 (예컨대, 면봉 또는 조직 시료)에 대하여 HMR 분석을 수행하였다. 이어서, 배양된 엠. 하이오 샘플로부터 DNA를 추출하였다. 정제된 DNA를 모든 시험 샘플에 대하여 정규화시켰다.

실시예 5a: 표적 MHP2:

엠. 하이오뉴모니아에 게놈의 151 bp 영역을 증폭시키기 위하여 프라이머 세트 (MHP-2F 및 MHP-2R)를 선택하였다.

PCR 반응

HRM 반응을 3중으로 수행하였다. 각 반응물은 하기를 함유하였다:

HRM PCR 슈퍼 믹스(Super Mix) (2x) 12.5 ㎕

뉴클레아제 비함유 물 9.75 ㎕

정방향 프라이머 (10 pmol/㎕) 0.9 ㎕

역방향 프라이머 (10 pmol/㎕) 0.9 ㎕

DNA 주형 (70 pg/㎕) 1 ㎕

필요한 시약 (상기 참조)을 0.1 mL PCR 튜브에 분배하고, 열적 사이클링을 수행하였다.

열적 사이클링 조건:

결과

백신 또는 다른 엠. 하이오 균주의 순수한 배양물로부터 추출된 DNA에 대하여 HRM 분석을 수행하였다. 각 균주로부터의 DNA, 또는 상이한 균주로부터의 DNA 혼합물에 대하여 개별 반응을 수행하였다.

박스세이프^® MHP 백신 균주 및 2가지 야생형 엠. 하이오 (백신 모 균주 및 현장 단리된 균주)에 대한 표적 MHP2의 HRM 프로파일은 도 2(A, B 및 C)에 제시되어 있다. 대략 75.2℃에서 그의 분리가 시작되었고, 대략 77.4℃에서 종결이 되는 용융 패턴이 HRM을 통해 나타났다. 백신 균주는 보다 낮은 온도의 용융 프로파일을 나타내었고, 이는 야생형 균주 (박스세이프^® MHP의 모 균주 및 현장 단리된 균주) 둘 모두로부터 그의 분리를 초래하였다. 야생형 균주는 백신 균주보다 더 장기간 동안 더 높은 수준으로 형광을 유지하였고, 이에 의해 우측으로 이동된 용융 프로파일을 산출하였다. 이러한 이동을 사용하여 백신 균주와 엠. 하이오 야생형 균주 간의 구별이 가능하였다.

두 엠. 하이오 야생형 균주의 HRM 프로파일은 그의 중복 프로파일에 의해 제시된 것과 동일하였다 (도 2A). 중복된 프로파일은 도 2B 및 C에 따로따로 제시되어 있다. 도 2D는 동일한 데이터를 백신 균주 및 야생형 균주 간에 명확한 분리를 제시하는 "차이 그래프"를 사용하여 나타낸 것이다. 차이 그래프는 참조로서 백신 균주를 정의함으로써 작성되었다. 이어서, 야생형 균주의 형광 수준을 대략 0으로 정규화하고, 야생형으로부터의 표준 편차를 차이 그래프에 기록하였다.

실시예 5b: 표적 MHP9 /10

엠. 하이오뉴모니아에 게놈의 160 bp 영역을 증폭시키기 위하여 프라이머 세트 (MHP-9/10-2F 및 MHP-9/10-2R)를 선택하였다.

PCR 반응

HRM PCR 슈퍼 믹스 (2x) 12.5 ㎕

뉴클레아제 비함유 물 9.75 ㎕

정방향 프라이머 (10 pmol/㎕) 0.9 ㎕

역방향 프라이머 (10 pmol/㎕) 0.9 ㎕

DNA 주형 (70 pg/㎕) 1 ㎕

열적 사이클링 조건:

박스세이프^® MHP 백신 균주 및 모 균주에 대한 표적 MHP9/10의 HRM 프로파일은 도 3A에 제시되어 있다. 대략 73.7℃에서 분리가 시작되었고, 대략 77.0℃에서 종결이 되는 용융 패턴이 HRM을 통해 나타났다. 백신 균주는 보다 높은 온도의 용융 프로파일을 나타내었고, 이를 통해 상기 균주를 모 균주로부터 분별할 수 있었다. 백신 균주는 모 균주보다 더 장기간 동안 더 높은 수준으로 형광을 유지하였고, 이에 의해 우측으로 이동된 용융 프로파일을 산출하였다. 이러한 이동을 사용하여 백신 균주와 모 균주 간의 구별이 가능하였다. 도 3B는 동일한 데이터를 백신 균주 및 모 균주 간에 명확한 분리를 제시하는 "차이 그래프"를 사용하여 나타낸 것이다.

박스세이프^® MHP 백신 균주 및 모체 엠. 하이오 균주 LKR 둘 모두로부터의 DNA를 1:1의 비율로 혼합하고, 표적 MHP9/10에 대해 HRM 분석을 수행하였다. 같은 분석에서, 각 균주로부터의 개별 DNA 또한 HRM 분석에 적용하였다. 프로파일 (도 4A)은 상기 표적 MHP9/10에 대해 기술된 것과 같은 용융 패턴을 나타내었는데, 이를 통해 백신 균주과 모 균주 간의 차이를 구분할 수 있었다. 도 4 (A)에 제시된 혼합된 엠. 하이오 DNA (백신 및 모 균주)의 HRM 프로파일은 개별 백신 및 모 균주의 DNA 둘 모두와는 상이한 용융 패턴을 나타냈다. 차이 그래프 (도 4B)에서, 백신으로부터의 임의의 편차를 관찰할 수 있도록 하기 위해 백신 균주를 정규화하였다. 차이 그래프에서, 백신은 야생형 균주로부터 구별될 수 있었지만, 혼합 샘플은 야생형 및 백신 균주 둘 모두와는 완전히 상이한 용융 프로파일을 나타내었다 (도 4B).

결론

박스세이프^® MHP 백신 균주, 및 백신 모 균주를 비롯한 다른 엠. 하이오 야생형 균주 간의 분별을 위한 도구로서 HRM 곡선 분석이 사용될 수 있다는 것을 입증하기 위해 2가지 실시예를 선택하였다. 실시예 5a는 단일 뉴클레오티드 염기에 기초한 분별을 입증하였다. 실시예 5b는 2개의 뉴클레오티드 염기 변화에 기초한 분별을 입증하였다. 이어서, HRM 분석을 사용하여 감염된 동물을 백신화된 동물로부터 분별 (DIVA: differentiation of infected from vaccinated animals)하기 위한 수단으로서 백신 균주 중에 존재하는 다수의 돌연변이 변화 중 임의의 것을 표적화할 수 있었다. 단일 HRM 분석은 단일 또는 다중 돌연변이를 표적화할 수 있다. 각 돌연변이(들)에 대해 돌연변이 부위(들)의 상류쪽 500 bp 영역 이내의 어느 곳에서든 정방향 프라이머를 디자인할 수 있다. 돌연변이 부위(들)의 하류쪽 500 bp 영역 이내의 어느 곳에서든 역방향 프라이머를 디자인할 수 있다. 생성된 앰플리콘의 크기는 50-200 bp 사이가 되도록 하는 것이 바람직하다.

SEQUENCE LISTING <110> BIOPROPERTIES PTY LTD <120> METHODS RELATING TO AN ATTENUATED MYCOPLASMA <130> P84201.PCT <140> PCT/AU2011/000584 <141> 2011-05-19 <150> 2010902198 <151> 2010-05-19 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 1 gacaaggaac caagcgtttc 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 caggctcttg cattttacag tc 22 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 tgtcaagaac ataagatgga gttca 25 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 attgtcgaat cccctaataa aat 23

Claims

표 1에 열거된 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자 중의, 또는 표 2 내지 5 중 어느 하나에 열거된 핵산 분자 중의 돌연변이의 존재에 대하여 미코플라스마(Mycoplasma) 박테리아를 검정하는 단계를 포함하며, 여기서, 돌연변이의 존재는 미코플라스마가 약독화된 것임을 시사하는 것인, 약독화된 미코플라스마 박테리아를 확인하는 방법.
미코플라스마 박테리아의 초기 집단을 약독화 조건에 적용하여 추정상 약독화된 박테리아 집단을 생성하는 단계, 및 표 1에 열거된 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자 중의, 또는 표 2 내지 5 중 어느 하나에 열거된 핵산 분자 중의 돌연변이의 존재에 대하여 추정상 약독화된 박테리아 집단의 개별 클론을 검정하는 단계를 포함하며, 여기서, 돌연변이의 존재는 미코플라스마가 약독화된 것임을 시사하는 것인, 약독화된 미코플라스마를 생성하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 표 1에 열거된 단백질을 코딩하는 유전자 중의, 및/또는 표 2 내지 5 중 어느 하나에 열거된 핵산 분자 중의 돌연변이의 조합에 대하여 검정하는 단계를 포함하는 방법.
제3항에 있어서, 돌연변이의 조합이 표 1에서 P85, P69, P216, P146 및 지단백질 유전자 중 적어도 2개에서의 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
제1항의 방법에 의해 선택되거나, 또는 제2항의 방법에 의해 생성된 약독화된 미코플라스마 박테리아.
제5항의 약독화된 미코플라스마 박테리아를 포함하는 면역원성 조성물.
제6항의 면역원성 조성물을 포함하는 미코플라스마 백신.
대상체에게 방어량의 제5항의 약독화된 미코플라스마, 제6항의 면역원성 조성물, 또는 제7항의 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 미코플라스마에 의해 유발되는 질환에 대한 방어 면역을 유도하는 방법.
표 1에 열거된 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자 중의, 또는 표 2 내지 5 중 어느 하나에 열거된 핵산 분자 중의 돌연변이의 존재에 대하여 동물로부터 유래된 미코플라스마 포함 샘플을 검정하는 단계를 포함하며, 여기서, 돌연변이의 부재는 동물이 독성 미코플라스마로 감염된 것임을 시사하는 것인, 동물이 약독화된 미코플라스마 균주로 또는 독성 미코플라스마 균주로 감염되었는지를 측정하는 방법.
표 1에 열거된 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자 중의, 또는 표 2 내지 5 중 어느 하나에 열거된 핵산 분자 중의 돌연변이의 존재에 대하여 미코플라스마 포함 샘플을 검정하는 단계를 포함하며, 여기서, 샘플 중 돌연변이의 존재는 해당 샘플이 채취된 동물이 약독화된 미코플라스마 백신으로 백신화된 것임을 시사하는 것인, 약독화된 미코플라스마 균주로 백신화된 동물을 미코플라스마로 감염된 동물과 구별하는 방법.
표 1에 열거된 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자 중의, 또는 표 2 내지 5 중 어느 하나에 열거된 핵산 분자 중의 돌연변이에 대해 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 키트.
도 1에 제시된 적어도 하나의 돌연변이에 대해 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 키트.
제12항에 있어서, 프라이머가 서열 1 및 서열 2, 또는 서열 3 및 서열 4를 포함하는 것인 키트.