JP2013526866A - 弱毒化マイコプラズマに関する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、弱毒化されたマイコプラズマ属の細菌を同定又は作製する方法であって、前記細菌が、列挙する少なくとも１つの遺伝子における突然変異を含む方法と、マイコプラズマに対する防御免疫を誘発するため又は前記細菌による感染を検出するためのワクチンにおける前記細菌の使用とを提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、サンプル中の弱毒化マイコプラズマの存在を診断する方法及び弱毒化マイコプラズマを選択する方法等における弱毒化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の使用に関する。

マイコプラズマ・ハイオニューモニエは、ブタマイコプラズマ肺炎（地方病性肺炎（ＥＰ）とも呼ばれる）の原因菌である。ブタマイコプラズマ肺炎は、世界的にブタの生産に影響を与える最も一般的且つ経済的に重要な呼吸器疾患のうちの１つである。この疾患は、二次感染を伴い、罹患率が高く及び死亡率が低く、飼料効率が低下するので、１年間当たり約１０億ドルと推定される世界的な経済損失が生じる恐れがある。

ＥＰでは、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細菌は、ブタの肺における上皮細胞の繊毛に付着して、健常な正常繊毛を破壊し、日和見性生物が呼吸器組織に定着するのを許し、疾患を惹起する。一旦定着すると、Ｍ．ハイオニューモニエは、ブタの肺において病変を惹起する。

この疾患は、非常に伝染性が強く、通常、感染した呼吸器からの分泌物（例えば、くしゃみ又は咳によって鼻又は口から放出される液滴）との直接接触を通して伝染する。

現在、Ｍ．ハイオニューモニエに対する幾つかのワクチンが存在している。大部分の現行のワクチンは、一価又は二価／多価のいずれかとして登録されている２２のワクチン銘柄で約１０社から提供されている。全て、死菌又は不活化Ｍ．ハイオニューモニエ調製物である。

全細胞不活化Ｍ．ハイオニューモニエワクチンの例としては、ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ（商標）及びＳＴＥＬＬＡＭＵＮＥ（商標）（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＳＵＶＡＸＹＮ Ｍ．ＨＹＯ（商標）（Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ）、ＨＹＯＲＥＳＰ（商標）（Ｍｅｒｉａｌ）、Ｍ＋ＰＡＣ（商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）、並びにＰＯＲＣＩＬＩＳ（商標）（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ）が挙げられる。

一部のワクチンはＥＰの重篤度を低下させることができるが、Ｍ．ハイオニューモニエ感染から完全に防御できる入手可能な全細胞死菌又は不活化ワクチンは存在しない。

特許文献１として公開されている出願人による同時係属出願は、温度感受性である生菌弱毒化Ｍ．ハイオニューモニエ株について記載している。この株はｔｓ−１９と命名され、２００４年５月１３日にＮＭ０４／４１２５９としてブダペスト条約に基づいてＮａｔｉｏｎａｌ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託された。この株は、ワクチンに組み込まれたとき、ワクチン接種したブタにＭ．ハイオニューモニエに対する防御免疫を付与することができる。

国際公開第２０１０／１３２９３２号パンフレット

第１の態様は、弱毒化マイコプラズマ属細菌を同定する方法であって、表１に記載するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子、又は表２〜５のうちの任意の１以上に記載する核酸分子における突然変異の存在についてマイコプラズマ属細菌をアッセイすることを含み、前記突然変異の存在が、マイコプラズマが弱毒化されていることを示す方法を提供する。

弱毒化ワクチンは、病原体の関連免疫原性決定因子を全て天然の形態でホストの免疫系に提示するので、また、前記病原体はワクチン接種されたホストにおいて増殖するため免疫化剤を比較的少量にする必要があるので、一般的に有利である。弱毒化する方法は、毒性株を複数回継代するか、又は放射線若しくは化学物質に曝露することを含む。これら方法によって、微生物の毒性は低下させるが依然として複製は可能である突然変異がゲノムに導入されると推測される。

これらアプローチの問題点は、分子レベルで特徴付けられないランダムな突然変異が導入されることである。また、例えば関連する温度感受性について選択することにより弱毒化について選択を行う方法は、多くの場合、時間がかかり、温度感受性株が弱毒化されない場合があったり、弱毒化株が必ずしも温度感受性である訳ではなかったりするので誤った結果が得られ、多くの試行錯誤を必要する。更に、弱毒化株は、更なる突然変異を受けて毒性が復帰する場合もある。別のストラテジーは、不可逆的な遺伝学的に定義された弱毒化マイコプラズマ属を作製することである。しかし、現在まで、マイコプラズマ属の弱毒化によって影響を受ける遺伝子は同定されていない。本発明は、親株と比較して弱毒化マイコプラズマにおける突然変異を同定し、弱毒化マイコプラズマを提供するためにどの遺伝子を突然変異させるべきであるかを決めるためにこの知見を利用する。

第１の態様の方法により、弱毒化マイコプラズマ属株を選択し、弱毒化株の毒性が復帰しているかどうかを同定することが可能になる。

第２の態様は、弱毒化マイコプラズマを作製する方法であって、マイコプラズマ属細菌の初期集団を弱毒化条件に供して、弱毒化されていると推定される細菌集団を作製し、前記弱毒化されていると推定される細菌集団の個々のクローンを、表１に記載するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子又は表２〜５のうちのいずれか１以上に記載する核酸分子における突然変異の存在についてアッセイすることを含み、前記突然変異の存在が、マイコプラズマが弱毒化されていることを示す方法を提供する。

第３の態様は、第１の態様の方法により選択されたか又は第２の態様の方法により作製された弱毒化マイコプラズマ細菌を提供する。

第４の態様は、第３の態様の弱毒化マイコプラズマ属細菌を含む免疫原性組成物を提供する。

第５の態様は、第４の態様の免疫原性組成物を含むマイコプラズマワクチンを提供する。

第６の態様は、被験体においてマイコプラズマ属によって惹起される疾患に対する防御免疫を誘導する方法であって、防御量の第３の態様の弱毒化マイコプラズマ、第４の態様の免疫原性組成物、又は第５の態様のワクチンを前記被験体に投与することを含む方法を提供する。

別の態様は、マイコプラズマによって惹起される疾患に対する防御免疫を誘発するための、第３の態様の弱毒化マイコプラズマ、第４の態様の免疫原性組成物、又は第５の態様のワクチンを提供する。

更なる別の態様は、マイコプラズマ属によって惹起される疾患を予防するための薬剤の製造における第３の態様の弱毒化マイコプラズマ、第４の態様の免疫原性組成物、又は第５の態様のワクチンの使用を提供する。

本発明者らは、アクセッション番号ＮＭ０４／４１２５９としてＮａｔｉｏｎａｌ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託されている弱毒化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ株（ｔｓ−１９）の核酸配列、及びＮＴＧ突然変異によりそれから弱毒化株が誘導された毒性株（マイコプラズマ・ハイオニューモニエ分離株ＬＫＲ、Ｌｌｏｙｄ及びＥｔｈｅｒｉｄｇｅ（１９８１年）Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈ．９１：７７−８３）の配列を決定した。当該分野の知見を用いた、アラインメントした配列の解析を用いて、本発明者らは、弱毒化に関連すると考えられる特定の突然変異を同定することができた。本発明者らは、これら突然変異がマイコプラズマ・ハイオニューモニエ及び他のマイコプラズマにおける弱毒化のマーカであり、弱毒化マイコプラズマ株を選択するために用いることができると考える。これは、弱毒化マイコプラズマを作製するために用いられる弱毒化条件がランダム突然変異誘発を引き起こす場合に特に有用である。突然変異の選択は、マイコプラズマの株が弱毒化されているかどうか、ひいてはワクチンに製剤化するのに適しているかどうかを判定するための簡便な方法を提供する。

第７の態様は、動物がマイコプラズマの弱毒化株又は毒性株に感染しているかどうかを判定する方法であって、表１に記載するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子又は表２〜５のうちの任意の１以上に記載する核酸分子における突然変異の存在について、前記動物から採取したマイコプラズマを含むサンプルをアッセイすることを含み、前記突然変異が存在しないことが、前記動物が毒性マイコプラズマ属に感染していることを示す方法を提供する。

第８の態様は、弱毒化マイコプラズマ株がワクチン接種されている動物とマイコプラズマに感染している動物とを識別する方法であって、表１に記載するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子又は表２〜５のうちの任意の１以上に記載する核酸分子における突然変異の存在について、マイコプラズマを含むサンプルをアッセイすることを含み、前記サンプル中の前記突然変異の存在が、前記サンプルを採取した動物に弱毒化マイコプラズマワクチンが接種されていることを示す方法を提供する。

マイコプラズマ・ハイオニューモニエは、ブタにおいて地方病性肺炎を惹起する非常に伝染性の強い慢性疾患である。この疾患は、世界的規模の地方病である。第７及び第８の態様の方法により、弱毒化マイコプラズマ株がワクチン接種されているブタと、感染しているか又はワクチン株が毒性復帰しているブタとを識別することができる。

第９の態様は、表１に記載するタンパク質をコードする１以上の遺伝子又は表２〜５のうちの任意の１以上に記載する核酸分子における突然変異に対して特異的なプライマー又はプローブを含むキットを提供する。

第１０の態様は、図１に示す少なくとも１つの突然変異に対して特異的なプライマー又はプローブを含むキットを提供する。

第９及び第１０の態様のキットは、第１、第７、又は第８の態様の方法において使用することができる。

ＮＣ＿００７２９５．１として寄託されているＭ．ｈｙｏ Ｊ株及びＭ．ｈｙｏ ＬＫＲ株と比較した、Ｍ．ｈｙｏ ｔｓ−１９ワクチン株（マスター及びＰ１２）における突然変異の正確な性質及び位置を示す。 ＮＣ＿００７２９５．１として寄託されているＭ．ｈｙｏ Ｊ株及びＭ．ｈｙｏ ＬＫＲ株と比較した、Ｍ．ｈｙｏ ｔｓ−１９ワクチン株（マスター及びＰ１２）における突然変異の正確な性質及び位置を示す。 ＮＣ＿００７２９５．１として寄託されているＭ．ｈｙｏ Ｊ株及びＭ．ｈｙｏ ＬＫＲ株と比較した、Ｍ．ｈｙｏ ｔｓ−１９ワクチン株（マスター及びＰ１２）における突然変異の正確な性質及び位置を示す。 図２Ａ〜Ｄは、標準化グラフモードにおけるゲノム標的ＭＨＰ２の高解像度融解（ＨＲＭ）プロファイルを示す。（Ａ）Ｖａｘｓａｆｅ（登録商標）ＭＨＰ株、Ｖａｘｓａｆｅ（登録商標）ＭＨＰの親株及びＭ．ｈｙｏの野外単離株のＨＲＭ。（Ｂ）Ｖａｘｓａｆｅ（登録商標）ＭＨＰ株及びＶａｘｓａｆｅ（登録商標）ＭＨＰの親株のＨＲＭ。（Ｃ）Ｖａｘｓａｆｅ（登録商標）ＭＨＰ株及び野外単離株のＨＲＭ。（Ｄ）野性型株からの任意の偏差を観察することができるように野性型株が標準化されている差分グラフ。 図３Ａ及びＢは、Ｖａｘｓａｆｅ（登録商標）ＭＨＰワクチン株及び親株についての、標準化グラフモードにおけるゲノム標的ＭＨＰ９／１０の高解像度融解（ＨＲＭ）プロファイルを示す。（Ｂ）ワクチン株からの任意の偏差を観察することができるようにワクチン株が標準化されている差分グラフ。 図４Ａ及びＢは、Ｖａｘｓａｆｅ（登録商標）ＭＨＰワクチン株、親株、及びこれら２つの株の混合物についての、標準化グラフモードにおけるゲノム標的ＭＨＰ９／１０の高解像度融解（ＨＲＭ）プロファイルを示す。（Ｂ）ワクチン株からの任意の偏差を観察することができるようにワクチン株が標準化されている差分グラフ。

Ｍ．ハイオニューモニエ株「ＬＫＲ」は、元々、屠殺場試料から単離された（Ｌｌｏｙｄ及びＥｔｈｅｒｉｄｇｅ １９８１年，Ｊ ｏｆ Ｃｏｍｐ Ｐａｔｈ ９１：７７−８３）。この生物は、実験的に感染させたブタから再単離された後、無細胞培地において約１０代継代されてクローンが単離された（ＣＳＩＲＯ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ）。次いで、前記クローンは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｄｅｌａｉｄｅ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ａｕｓｔｒａｌｉａに寄託された。次いで、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｇｒｏｕｐ）によりＬＫＲ分離株が得られ、そこで保存用に変法Ｆｒｉｓｓ培地で３代インビトロ継代された。保存されたバイアルは、「ＬＫＲ Ｐ３ ２９／５／９７」と命名された。このクローンは、親株を表す。

ＬＫＲ Ｐ３ ２９／５／９７をインビトロ継代し、既に記載されている方法（Ｎｏｎａｍｕｒａ及びＩｍａｄａ（１９８２年）Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２６：７６３−７７５）を使用して、ＮＴＧ突然変異誘発（２００ｍｇ／ｍＬ）に供した。寒天平板から温度感受性クローン（「ｔｓ−１９」）を選択し、３ｍＬの変法Ｆｒｉｓｓ培地中で培養した。このクローンの継代数を「Ｐ０」と命名し、続いて、変法Ｆｒｉｓｓ培地中で継代毎に１：４ｖ／ｖ希釈して更に４代インビトロ継代した。最後の継代レベルを「ＬＫＲ ｔｓ−１９ Ｐ４ ＭＳ」と命名した。

ＬＫＲ ｔｓ−１９ Ｐ４ ＭＳを、３．２×１０^−２１希釈に達するまで変法Ｆｒｉｓｓ培地中で何代もインビトロ希釈継代した。最終的な突然変異体クローンを「ＬＫＲ ｔｓ−１９ ３．２×１０^−２１」と命名した。

ＬＫＲ ｔｓ−１９ ３．２×１０^−２１を凍結乾燥させ、アクセッション番号ＮＭ０４／４１２５９としてＡｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約）に寄託した。

マイコプラズマは、ゲノムサイズが非常に小さいが、これは、生合成能が限定されており、寄生虫のようにホストに依存していることを反映している。マイコプラズマのゲノムでは重複性が限定されていることから、ある経路の特定の成分のＮＴＧ突然変異誘発は、マイコプラズマ細胞の生存に対して著しい効果を有する可能性がある。ＮＴＧ突然変異誘発により、ゲノム内にランダムな突然変異（ヌクレオチドの転位、転換、欠失又は挿入）が生じる。これにより、１以上の突然変異のいずれかを各々が含有する変異体ゲノムの集団が生じる。恐らく、変異体ゲノムの多くは、重要な遺伝子が正常に機能しなくなることにより生存できない。突然変異が生物の増殖能に対して有害な効果を引き起こさない場合、生存している変異体生物について更に選択（例えば、温度による選択）を行ってよい。ｔｓ−１９の開発においては、３３℃の温度では高力価に増殖し且つ３９．５℃では増殖能が低下するという変異体株の能力に基づいて選択を行った。マイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチン株ｔｓ−１９と親株（ＬＫＲ）との間の全ゲノム配列比較に基いて、ｔｓ−１９のゲノム内に多数の突然変異（ヌクレオチドの変化）が同定された。これら突然変異には、ヌクレオチド置換（転位及び転換）に加えて、欠失及び挿入も含まれていた。

突然変異は、ゲノム全体にわたって位置しており、様々な発現遺伝子に加えて、仮定タンパク質及び非コーディング配列も含む。表１は、塩基の置換、欠失又は挿入によって突然変異した公知の遺伝子を記載する。主な機能に従って前記遺伝子を分類した。

表２は、ｔｓ−１９の遺伝子領域及び非コーディング領域において同定されたサイレント突然変異を示す。表３は、ｔｓ−１９の非コーディング領域において同定された欠失を示す。表４は、ｔｓ−１９の仮定遺伝子において同定された突然変異を示す。表５は、ｔｓ−１９の仮定遺伝子において同定された欠失を示す。

図１に、Ｍ．ｈｙｏのＪ株、Ｍ．ｈｙｏのＬＫＲ株、及びｔｓ−１９弱毒化株（マスター及び１２代インビトロ継代後）間の特定の差の正確な性質を示す。

生物の温度感受性及び弱毒化は、表現型の特徴を生じさせるために個々に又は連携して作用する単一の又は複数の突然変異に起因すると考えられる。

当業者は、レファレンス配列（例えば、ＹＰ＿２７８９０１．１）と、ＮＭ０４／４１２５９として寄託されている弱毒化株ｔｓ−１９の配列との間に差が存在するかどうかを判定することにより、Ｍ．ｈｙｏ株が表１に記載する遺伝子のうちの１つに突然変異を含有しているかどうかを同定する方法を容易に認識するであろう。

１つの実施形態では、弱毒化株は、表１に記載する突然変異のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は全てを、単独で、又は表２、３、４、若しくは５に記載する少なくとも１つの突然変異とともに含む。

１つの実施形態では、弱毒化株は、表１に記載する毒性因子のうちの１つ若しくは各々、及び／又は炭水化物代謝に関与する遺伝子のうちの１つ若しくは各々、及び／又はリン脂質代謝に関与する遺伝子のうちの１つ若しくは各々、及び／又は共同因子代謝に関与する遺伝子、及び／又は転写若しくは翻訳に関与する遺伝子のうちの１つ若しくは各々、及び／又は膜輸送に関与する遺伝子のうちの１つ若しくは各々、及び／又はＤＮＡの複製、修復、若しくは代謝に関与する遺伝子のうちの１つ若しくは各々、及び／又はトランスポサーゼ遺伝子に突然変異を含む。

１つの実施形態では、弱毒化株は、毒性因子の各々に突然変異を含む。

Ｐ９５、Ｐ６９、Ｐ２１６、Ｐ１４６遺伝子、並びにリポタンパク質遺伝子内に見出された突然変異は、これら遺伝子は毒性に関連することが報告されている（Ｆｅｒｒｅｉｒａ及びｄｅ Ｃａｓｔｒｏら，（２００７年）．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３０：ｐ２４５−２５５）ので、弱毒化に対して効果を有する可能性が最も高い。

別の実施形態では、弱毒化株は、表２に記載する突然変異のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は全てを、単独で、又は表１、３、４、若しくは５に記載する少なくとも１つの突然変異とともに含む。

別の実施形態では、弱毒化株は、表３に記載する突然変異のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４又は全てを、単独で、又は表１、２、４、若しくは５に記載する少なくとも１つの突然変異とともに含む。

別の実施形態では、弱毒化株は、表４に記載する突然変異のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は全てを、単独で、又は表１、２、４、若しくは５に記載する少なくとも１つの突然変異とともに含む。

別の実施形態では、弱毒化株は、表５に記載する突然変異のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１又は全てを、単独で、又は表１、２、３、若しくは４に記載する少なくとも１つの突然変異とともに含む。

本発明は、温度感受性弱毒化Ｍ．ｈｙｏ株（ｔｓ−１９）及びその親株の核酸配列の決定に基づく。これら株と他の株とをアライメントすることにより、弱毒化株における突然変異の位置及び性質を同定することができた。

温度感受性突然変異は、熱不安定性タンパク質を生成するものと；タンパク質の合成、フォールディング、又はアセンブリにおいて欠陥が生じるものとに大別される。熱不安定性タンパク質の場合、遺伝子のｔｓ突然変異は、許容温度（ｔｓ−１９の場合、３３℃）では高レベルで発現し、非許容温度（ｔｓ−１９の場合、３９．５℃）では低レベルで発現し得る。

本発明で使用する用語「突然変異」は、遺伝物質、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡにおける任意の検出可能な変化、又はこのような変化の任意のプロセス、機序、若しくは結果を指す。このような突然変異は、点突然変異（すなわち、核酸配列内の１以上の塩基が、異なる塩基によって置き換えられている突然変異）、挿入突然変異（すなわち、核酸分子又は遺伝子の全長が、１以上の塩基の挿入により増加している突然変異）、欠失突然変異（核酸分子又は遺伝子の全長が、１以上の塩基の除去により減少している突然変異）及び逆位突然変異（２以上の塩基の領域が１８０°回転している突然変異）、又はこれらの組合せであってよい。

遺伝子間領域における突然変異とは、核酸分子の非コーディング領域に位置する突然変異を指す。

全コドンよりも少ない欠失を含む遺伝子からは、フレームシフト突然変異が生じる。これにより、オリジナルの（ネイティブな）タンパク質との類似点が全く又はほとんど存在しないアミノ酸からなる遺伝子産物が生じる。したがって、タンパク質が正常に機能しなくなる。これが起こると、前記タンパク質は、もはや正確に折り畳まれたり集合したりすることができなくなるので、タンパク質の役割に加えて、恐らくタンパク質の安定性にも影響を与える。したがって、前記タンパク質の発現レベルは、野性型と比較して低下するか又は発現しなくなる。

欠失は、遺伝子産物の発現を早期に終結させる場合がある。この場合も、タンパク質の機能及び安定性に影響を与える。更に、切断型のｍＲＮＡ転写物は、不安定であり、容易に分解する場合がある。したがって、突然変異型タンパク質発現レベルは、野性型と比較して低下するか又は発現しなくなる。

弱毒化ｔｓ−１９株は、外膜タンパク質Ｐ９５、Ｐ２１６、Ｐ１４６、Ｐ６９及びリポタンパク質等の表面タンパク質に影響を与える多数の欠失を含む。また、これらの遺伝子産物が正常に機能しなくなる欠失突然変異により、膜輸送タンパク質も影響を受ける。したがって、これら遺伝子の発現を親株ＬＫＲと比較した場合、これらタンパク質の発現レベルに顕著な差がみられると予測される。

インフレームアミノ酸変化をもたらす単一塩基置換によって惹起される突然変異は、そのタンパク質のフォールディング又はアセンブリを変化させる恐れがあるので、そのタンパク質を合成することはできるが；正確には機能しない場合がある。また、このようなタンパク質は、突然変異型タンパク質の制御又は影響下にある可能性がある多数の他の遺伝子の発現にも影響を与える場合がある。

１つの実施形態では、表１に記載するタンパク質をコードする少なくとも１つのタンパク質における突然変異の存在は、少なくとも１つのタンパク質の発現の変化をアッセイすることにより検出される。１つの実施形態では、発現の変化は、発現の低下又は欠如である。当業者は、例えば、ウェスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び対象タンパク質を検出するか又は対象タンパク質に結合する抗体を用いる酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等の抗体に基づく定量的な方法によって、タンパク質の発現が変化又は低下しているかどうかを判定する方法を容易に認識することができる。更に、ｍＲＮＡレベルは、一般的に、そのｍＲＮＡがコードしているタンパク質の量を反映するので、マイコプラズマが１以上のタンパク質の発現の低下又は欠如を示すかどうかを判定するために定量的核酸法を用いることもできる。例えば、定量的逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法を使用して、特定の対象タンパク質に対応するｍＲＮＡの量を測定することができる。核酸に基づく定量的な方法は、当業者に多数知られている。また、核酸に基づく定性的方法（例えば、ノーザンブロット解析）も当業者に周知である。

１つの実施形態では、ｔｓ−１９は、ロイシル−ｔＲＮＡ合成酵素の突然変異型及びイソロイシル−ｔＲＮＡ合成酵素の欠失型を含み、これらは両方ともタンパク質合成に関与しているので、弱毒化マイコプラズマでは、野性型マイコプラズマと比較して全タンパク合成が変化する場合がある。したがって、１つの実施形態では、当該方法は、全タンパク合成についてマイコプラズマ属細菌をアッセイすることを含む。

「発現の低下」に関して、野性型と比較した低下とは、野性型と比較して少なくとも約５％であってよい。他の実施形態では、発現の低下は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％又は９９％である。別の実施形態では、当該細菌は、野性型細菌において発現するタンパク質を全く発現しないので、発現の低下率は１００％である。

１つの実施形態では、遺伝子レベルでアッセイする、すなわち核酸をアッセイすることにより、表１に記載するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子又は表２〜５のうちの任意の１以上に記載する核酸分子における突然変異の存在を検出する。このようなアッセイは、ＰＣＲアッセイであってよい。

適切な種類のＰＣＲアッセイとしては、従来のＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、蛍光キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、高解像度融解曲線（ＨＲＭ）分析、融解温度（Ｔｍ）分析、可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）、及び多座配列タイピング（ＭＬＳＴ）及び単一ヌクレオチドプライマー伸長アッセイが挙げられる。

従来のＰＣＲ生成物の分析は、当業者にとって容易であり、例えば、ヌクレオチド配列分析、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）及び一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析等の技術を挙げることができる。

突然変異の領域に隣接するＰＣＲプライマーを選択することにより、ＰＣＲ増幅を実施してよい。各ＰＣＲプライマーセットからは、単一バンド（アンプリコン）のみが生じることが好ましい。アンプリコンのサイズは、ＰＣＲに基づく分析の方法に適切なサイズであってよい。

部分的に、本発明はＭ．ｈｙｏ野性型株とその温度感受性弱毒化株との間のＤＮＡ配列の変化に関するが、これら突然変異を弱毒化に関連づけるという知見は、マイコプラズマ属種全体にわたってこれらタンパク質が保存されているので、同じ遺伝子を含むマイコプラズマ属の全ての種に適用することができる。

第１及び第２の態様の方法、並びに第３の態様の弱毒化マイコプラズマ属細菌は、任意のマイコプラズマ属種に関連し得る。

１つの実施形態では、弱毒化細菌は、動物病原性のマイコプラズマ属細菌に由来する。本発明で使用する用語「動物病原性のマイコプラズマ属細菌」は、弱毒化されていない野生型の状態で、感染し、動物における疾患及び／又は疾病を惹起し得る細菌を意味する。「動物における疾患及び／又は疾病」は、動物における有害な身体的徴候に加えて、組織学的、微視的、及び／又は分子的な診断によってのみ示される疾患又は感染の臨床的症候を含む。

動物病原性のマイコプラズマ属細菌は、ヒト及び非ヒトの病原性のマイコプラズマ属細菌を含む。ヒト病原性のマイコプラズマ属細菌としては、マイコプラズマ属種の細菌、例えば、Ｍ．ゲニタリウム（Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、Ｍ．ファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、Ｍ．サリバリウム（Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）、Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｍ．ニューモニエ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、Ｍ．インコグニタス（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔｕｓ）、Ｍ．ペネトランス（Ｍ．ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、Ｍ．ピラム（Ｍ．ｐｉｒｕｍ）、Ｍ．ファウシウム（Ｍ．ｆａｕｃｉｕｍ）、Ｍ．リポフィラム（Ｍ．ｌｉｐｏｐｈｉｌｕｍ）及びＭ．ブカーレ（Ｍ．ｂｕｃｃａｌｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。非ヒト病原性のマイコプラズマ属細菌としては、例えば、トリ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ヤギ又はイヌの病原性のマイコプラズマ属細菌が挙げられる。トリ病原性のマイコプラズマ属細菌としては、例えば、マイコプラズマ属種の細菌、Ｍ．クロアカーレ（Ｍ．ｃｌｏａｃａｌｅ）、Ｍ．ガリナルム（Ｍ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｍ．ガリセプチカム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、Ｍ．ガロパボニス（Ｍ．ｇａｌｌｏｐａｖｏｎｉｓ）、Ｍ．グリコフィラム（Ｍ．ｇｌｙｃｏｐｈｉｌｕｍ）、Ｍ．イネルス（Ｍ．ｉｎｅｒｓ）、Ｍ．アイオワエ（Ｍ．ｉｏｗａｅ）、Ｍ．リポファシエンス（Ｍ．ｌｉｐｏｆａｃｉｅｎｓ）、Ｍ．メレアグリディス（Ｍ．ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）及びＭ．シノビエ（Ｍ．ｓｙｎｏｖｉａｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。ブタ病原性のマイコプラズマ属細菌としては、例えば、マイコプラズマ属種の細菌、Ｍ．フロクラーレ（Ｍ．ｆｌｏｃｃｕｌａｒｅ）、Ｍ．ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｍ．ハイオリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）及びＭ．ヒオシノビエ（Ｍ．ｈｙｏｓｙｎｏｖｉａｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。ヒツジ、ウシ、ヤギ又はイヌの病原性のマイコプラズマ属細菌としては、例えば、マイコプラズマ属種の細菌Ｍ．カプリーコム（Ｍ．ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）の亜種カプリーコム、Ｍ．カプリーコムの亜種カプリニューモニエ（ｃａｐｒｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｍ．ミコイデス（Ｍ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ）の亜種ミコイデスＬＣ、Ｍ．ミコイデスの亜種カプリ（ｃａｐｒｉ）、Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、Ｍ．ボーボクリ（Ｍ．ｂｏｖｏｃｕｌｉ）、Ｍ．カニス（Ｍ．ｃａｎｉｓ）、Ｍ．カリフォルニカム（Ｍ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｍ）及びＭ．ディスパー（Ｍ．ｄｉｓｐａｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。

第２の態様の方法では、マイコプラズマ属細菌の初期集団を弱毒化条件に供する。

本発明のこの態様によれば、「マイコプラズマ属細菌の初期集団」は任意の量のマイコプラズマ属細菌であってよい。特定の実施形態では、前記細菌は野生型の細菌である。あるいは、前記細菌は１以上の突然変異を含有してもよい。１つの実施形態では、初期集団中の細菌は、クローン的に同一であるか又はクローン的に実質的に同一である；すなわち、前記細菌は、好ましくは、全て単一の親マイコプラズマ属細菌細胞に由来し、且つ／又は同一若しくは実質的に同一の遺伝子型及び／若しくは表現型の特性を有する。

本発明で使用する用語「弱毒化条件」は、１以上の遺伝的変化（例えば、ヌクレオチド突然変異）をマイコプラズマ属細菌のゲノムに導入する可能性を有する任意の条件又は条件の組合せを意味する。例示的で、非限定的な弱毒化条件としては、例えば、培養下で細菌を継代する、トランスポゾン（例えば、マイコプラズマのゲノムにランダムに挿入されるトランスポゾン）等のゲノムに挿入可能な遺伝因子で細菌を形質転換する、細菌を１以上の突然変異原（例えば、化学的変異原又は紫外線）に曝露する、部位特異的突然変異誘発、又は欠失等が挙げられる。インビトロ継代により細菌細胞を弱毒化する場合、細胞を任意の回数、例えば、インビトロで１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０回又はそれ以上継代してよい。

マイコプラズマ属細胞の初期集団は、弱毒化条件に供された後、本明細書では、弱毒化されていると推定される細菌集団と呼ばれる。弱毒化されていると推定される細菌集団の個々のクローンは、例えば、細胞を連続希釈し、適切な培地に個々の細胞をプレーティングすることを含む標準的な微生物学的技術により得ることができる。一旦得られると、弱毒化されていると推定される細菌集団の個々のクローンを、表１に記載するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子又は表２〜５のうちの任意の１以上に記載する核酸分子における突然変異の存在についてアッセイする。弱毒化マイコプラズマ属細菌が突然変異を含むかどうかを判定する方法については、本明細書に別記する。例示的な方法としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲに基づく方法、ウェスタンブロット等が挙げられる。

細菌の野生型（弱毒化していない）バージョンに感染しやすい動物にクローンを投与することにより、必要な突然変異のうちの少なくとも１つを含むと同定された個々のクローンの毒性について試験することができる。本発明で使用する「野生型のマイコプラズマ属細菌に感染しやすい動物」は、野生型のマイコプラズマ属細菌に曝露された後に少なくとも１つの臨床症状を示す動物である。このような症状は、当業者に公知である。例えば、表１に記載するタンパク質の各々における突然変異及び表２〜５に記載する各突然変異を示す弱毒化されていると推定されるＭ．ｈｙｏ株の場合、前記株をブタ（通常、野性型Ｍ．ｈｙｏに感染しやすい）に投与してよい。ブタのＭ．ｈｙｏ感染の臨床症状としては、例えば、急性呼吸器症状及び体重増加の低下が挙げられる。したがって、弱毒化されていると推定されるＭ．ｈｙｏ株が、ブタに投与されたとき、野生型のＭ．ｈｙｏ株に感染しているブタに比べて生じる症状がより少ない及び／又は重篤度が低い場合、弱毒化されていると推定されるＭ．ｈｙｏ株は、「毒性が低下した」とみなされる。症状が任意の程度低下すると、弱毒化されていると推定される株の毒性が低下したとみなされる。特定の実施形態では、弱毒化されていると推定される株は無発病性である。

第３の態様の弱毒化マイコプラズマ属細菌は、生菌ワクチンで用いることができる。

用語「インビトロ連続継代」は、培地中で細菌を繰り返し継代することを指す。それは、ブロス培地に生菌培養物を接種し、次いで、適切な温度において一定時間インキュベートすることを含む。次いで、インキュベートした培養物の一部を用いて、新たな無菌培養物に接種し、次いで、一定時間インキュベートする。望ましい回数継代するまでこのサイクルを続ける。増殖及び再接種の各ラウンドを１継代と呼ぶ。

第４の態様の免疫原性組成物は、第３の態様の弱毒化マイコプラズマ属細菌を含む。この免疫原性組成物は、第５の態様のワクチンにおいて適切なキャリアとともに用いてよい。

ワクチンは、特定の疾患に対する免疫を確立するか又は改善する生物学的調製物である。ワクチンは、予防的（例えば、病原体による将来の感染の影響を予防するか又は寛解させるため）であってもよく、又は治療的（例えば、感染を治療するため）であってもよい。第５の態様のワクチンは、マイコプラズマ属細菌によって惹起される疾患について予防的である。

適切なキャリアは、当業者に明らかであり、投与経路に大きく依存する。ワクチンは、懸濁化剤、安定化剤、又は分散剤が挙げられるがこれらに限定されない１以上の更なる成分を更に含んでもよい。ワクチン中に存在してもよい更なる追加成分は、アジュバント、保存剤、化学安定剤、又は他の抗原タンパク質である。典型的に、安定化剤、アジュバント、及び保存剤は、標的動物における効果が最も優れた製剤を決定するために最適化される。適切な例示的保存剤としては、クロロブタノールソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール及びパラクロロフェノールが挙げられる。使用することができる適切な安定化成分としては、例えば、カザミノ酸、スクロース、ゼラチン、フェノールレッド、Ｎ−Ｚアミン、二リン酸一カリウム、ラクトース、ラクトアルブミン加水分解物及び粉乳が挙げられる。従来のアジュバントは、白血球を誘引したり免疫応答を増強したりするために用いられる。このようなアジュバントとしては、特に、ＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ；ＲＩＢＩ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）、鉱油及び水、水酸化アルミニウム、Ａｍｐｈｉｇｅｎ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ、Ｌ１２１／スクアレン、Ｄ−ラクチド−ポリラクチド／グリコシド、ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｌｙｏｉｓ、ムラミルジペプチド、死菌ボルデテラ、Ｑｕｉｌ Ａ又はＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ−２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，Ｍａｓｓ．）等のサポニン、及びコレラ毒素（野生型又は突然変異型のいずれか、例えば、アミノ酸位置２９においてグルタミン酸が別のアミノ酸、好ましくはヒスチジンに置換されている、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２２５２０号に従う）が挙げられる。

１つの実施形態では、ワクチンは、注射した場合、注射部位において有害な反応又は望ましくない反応、例えば、皮膚刺激、腫脹、発疹、壊死、皮膚感作等をほとんど又は全く生じさせない。

第６の態様は、マイコプラズマによって惹起される疾患に対する防御に関する。第５の態様のワクチンは、マイコプラズマによって惹起される疾患について予防的である。

「予防」又は「予防的な」、「防止的」療法、「に対する防御」は、本明細書において、感染が生じるのを防ぐ、又はマイコプラズマによって惹起される疾患の発生若しくは重篤度を妨げるか、発生若しくは重篤度から保護するか又は発生若しくは重篤度から防御することを含み、例えば、疾患に罹患しやすい可能性があるがまだ罹患しているとは診断されていない被験体において疾患の症状又は特徴を予防する、防御する、又は重篤度を低下させることが挙げられる。また、感染期間又は症状の発生頻度の低減、及び任意の病変の大きさの減少も含まれる。

本発明で使用する「予防」は、疾患を完全に予防するか、又は疾患の程度若しくは症状を低減することを包含する。また、この語は、マイコプラズマの伝染の減少若しくは阻害、又はホストにおける細菌の定着の予防、又は他のマイコプラズマ属株若しくは他の感染因子による二次感染からの防御を指す。

第５の態様のワクチンは、例えば、液剤、散剤、エアゾール剤、錠剤、カプセル剤、腸溶コーティングされた錠剤若しくはカプセル剤、又は坐剤の形態で動物に投与する用に調製してよい。投与経路としては、非経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸投与、膣内投与等が挙げられるが、これらに限定されない。

呼吸器官に感染するマイコプラズマ属細菌に関する実施形態では、鼻腔内投与、エアゾール投与、又は口若しくは鼻からの吸入による投与により呼吸器官に投与するためのワクチンを製剤化する。Ｍ．ハイオニューモニエに対する防御免疫の性質が、循環抗体に起因するものではなく、疾患の予防における局所（肺）免疫及び細胞媒介性免疫である場合があるので、この投与経路が好ましい。呼吸器官に対するワクチンの提示は、局所の免疫応答を刺激することができる。したがって、ワクチンの局所的な投与がより有効である場合もある。更に、閉鎖された家畜小屋又は空間にワクチンを投与し（粗スプレー塊投与）、ブタに吸入させることにより、多数の動物に対するワクチン接種にかかる労力が低減される。エアゾールワクチン接種（又はスプレーワクチン接種）は、現在、特定の疾患に対するワクチンを家禽に効率的に接種するために商業ベースで使用されており、ブタにワクチン接種するのにも適している。

鼻腔内投与は、鼻道又は鼻を介する任意の投与を包含する。ワクチンは、溶液、懸濁液又は乾燥粉末として鼻腔に塗布してもよい。溶液又は懸濁液を、例えば、ピペット、スポイト又はスプレー、場合によりエアゾールスプレーを用いて鼻腔内投与してもよい。乾燥粉末を吸入により鼻腔内に投与してもよい。

エアゾール投与は、固体微粒子又は液滴の気体中の浮遊物としてワクチンを投与することを指す。

吸入（吸気としても知られている）は、気道を通じて外的環境から肺の肺胞に空気を移動させることである。

治療上使用されるワクチンの有効量は、例えば、治療対象、投与経路及び動物の症状に依存する。

ワクチンの投与量レベルは、通常、１用量当たり約１０^３〜１０^８色変化単位（ＣＣＵ）／ｍＬ程度、好ましくは、１用量当たり約１０^４〜１０^７ＣＣＵ／ｍＬである。

しかし、任意の特定のブタ科動物のための具体的な用量レベルは、使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、食餌、投与時間及び投与経路を含む様々な要因に依存することが理解される。

有効量の選択及び上方又は下方調節は、当該技術分野のスキルの範囲内である。

株を弱毒化させるマイコプラズマ属細菌における突然変異に関する情報は、動物が弱毒化マイコプラズマ属株又は毒性マイコプラズマ属株に感染しているかどうかを判定することを可能にする。

野性型野外株が動物に感染し、それが毒性株である場合、それ自体が疾患を惹起し得るし、あるいは二次的な細菌及び／又はウイルス感染を導き得る。

感染後、ワクチン株及び任意の野性型マイコプラズマ属株は両方とも、（自然曝露を介する感染を通じて）動物から回収することができる。検出は、ＰＣＲにより行うことができる。感染した組織から（例えば、肺又は気管から）生物を直接抽出し、ＰＣＲによって検出を行うことができる。動物から回収された生物を、より多くのコピーの生物が存在するようにまずインビトロで培養して前記生物を増殖させて、（例えば、ＰＣＲによる又は同定のための生化学的若しくは血清学的方法を介する）検出法の有効性を高めてもよい。

感染の発生の分析に関して、第９の態様の方法は、発生がワクチン株によるものであるかどうか判定することができた。すなわち、動物がマイコプラズマ属ワクチンを接種されており、その直後に疾患を発現した場合、感染に関与したのがワクチンであるか、又は野性型毒性野外株であるかどうかを判定するために、被験体を試験することができる。これは、農場環境において特に重要である。

第９及び第１０の態様は、弱毒化に関連する突然変異を検出するためのプライマー又はプローブを含むキットを提供する。

１つの実施形態では、このプライマーは、ＭＨＰ−２Ｆ（配列番号１）及びＭＨＰ−２Ｒ（配列番号２）である。

別の実施形態では、当該プライマーは、ＭＨＰ−９／１０−２Ｆ（配列番号３）及びＭＨＰ−９／１０−２Ｒ（配列番号４）である。

１つの実施形態では、当該キットは、突然変異型の遺伝子又は核酸分子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを含む。前記プローブを放射性又は非放射性の標識剤で標識してもよく、後者は、従来のビオチン、Ｄｉｇ（ジゴキシゲニン）、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）又は蛍光色素（Ｃｙ５又はＣｙ３）を含む。更に、オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ増幅に使用してもよい。この場合、キットは、ＰＣＲ反応用のＤＮＡポリメラーゼ、４つのｄＮＴＰ及びＰＣＲバッファを含有してよい。更に、オリゴヌクレオチドをプローブとしてマイクロアレイに結合させてもよい。この場合、キットは、ハイブリダイゼーション反応バッファ、標的遺伝子を増幅するためのプライマーを含有するＰＣＲキット、ハイブリダイズしていないＤＮＡのための洗浄溶液、色素、結合していない色素のための洗浄溶液、及びマイクロアレイのマニュアルシートを含有してよい。

１つの実施形態では、プローブは、単一サンプルから１超の突然変異を同時に検出することができる１超のプローブの組合せであってもよい。実際には、同じハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、同時に、マイコプラズマの複数の標的突然変異ＤＮＡとハイブリダイズするようにプローブを最適化する。

１つの実施形態では、キットは、１以上の突然変異を検出するためのプローブのセットを含むマイクロアレイを提供し、これは、１回の実験で単一サンプルからの多くの突然変異を同時に検出することができる。

この明細書全体にわたって、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、又は「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」若しくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」等の変化形は、記載された要素若しくは整数、又は要素若しくは整数の群を含むが、任意の他の要素若しくは整数、又は要素若しくは整数の群を除外するものではないことを意味すると理解されたい。

また、本明細書において使用されるとき、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に断りのない限り、複数の態様を含むことに留意しなければならない。

明確な理解のために本発明についてかなり詳細に記載したが、本明細書に記載する実施形態及び方法に対して、本明細書に開示する本発明の概念の範囲から逸脱することなく様々な修正及び変更を行ってもよいことが当業者には明らかである。

本明細書に引用する任意の特許又は特許出願を含む全ての参照文献は、参照により本明細書に援用される。多くの先行技術刊行物を本明細書において参照したが、この参照は、これら文書のいずれかが当技術分野における共通の一般認識の一部を形成することを承認するものではないことが明らかに理解される。

次に、以下の実施例を参照することにより本発明について更に詳細に説明する。実施例は、例示の目的のためだけに提供され、別段の定めがない限り制限することを意図するものではない。したがって、本発明は、本明細書に提供される教示の結果として明らかになる任意の及び全ての変形例を包含する。

実施例１：ワクチン株の調製
オーストラリアのマイコプラズマ・ハイオニューモニエ分離株ＬＫＲは、典型的な地方病性肺炎疾患を示すブタ肺の屠殺場試料である（Ｌｌｏｙｄ及びＥｔｈｅｒｉｄｇｅ（１９８１年），Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈ．９１：７７−８３）。分離株を培養し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｄｅｌａｉｄｅ，Ｓｏｕｔｈ ＡｕｓｔｒａｌｉａにおけるＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎで保存した。次いで、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，ＶｉｃｔｏｒｉａのＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｒｏｕｐよりこの分離株の培養物を得た。

培養物を３代インビトロ継代した後、既に報告されている方法（Ｎｏｎａｍｕｒａ及びＩｍａｄａ（１９８２年）Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２６：７６３−７７５）を用いて、２００ｍｇ／ｍＬのＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いる突然変異誘発に供した。簡潔に述べると、Ｍ．ハイオニューモニエ株ＬＫＲの培養物を、後期対数増殖期まで増殖させ、遠心分離によりペレット状にした。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄し、ＮＴＧに曝露した。細胞をペレット状にし、変法Ｆｒｉｉｓ培地（Ｆｒｉｉｓ，Ｎ．Ｆ．１９７５年）に再懸濁させ、３３℃で４時間インキュベートした。次いで、０．４５μｍのフィルタを通して培養物を濾過し、適切に希釈し、アリコートを寒天平板上に置き、３３℃でインキュベートした。増殖したコロニーを３ｍＬのブロスにクローニングし、３３℃でインキュベートした。クローンのアンプルを−７０℃で保存し、各クローンの温度感受性について判定した。

デュープリケートで力価測定し、３３℃及び３９．５℃でインキュベートすることにより、ｔｓ−１９の温度感受性を判定した。力価は、典型的に、３３℃で＞１×１０^８ＣＣＵ／ｍＬ、３９．５℃で＜１×１０^２ＣＣＵ／ｍＬである。

ブダペスト条約の下でＮＭ ０４／４１２５９としてｔｓ−１９株を寄託した。これを、ブタにおけるＭ．ハイオニューモニエ感染から防御するための生菌弱毒化温度感受性ワクチンであるＶａｘｓａｆｅ（登録商標）ＭＨＰにおいて使用する。

実施例２：配列決定及び分析
３つのＭ．ハイオニューモニエ株（ワクチン株ｔｓ−１９マスター、ｔｓ−１９ Ｐ１２、及び親株ＬＫＲ）の全ゲノムシーケンシングを行った。シーケンシングは、４５４シーケンシング技術（Ｒｏｃｈｅ）を利用して実施した。３つのゲノムの各々について、最低１５回分読み取るように読み取りを行った。各個別のゲノムについては、各セットの読取りからコンセンサス配列を推定した。各ゲノムの読取りの重複部を幾つかの大きなコンティグにアラインメントした。Ｍ．ハイオニューモニエＪ株配列（ＮＣ＿００７２９５．１）に対して高い相同性を有するように配列をアラインメントすることによってワクチン株に由来するコンティグを決定した。

次いで、各株からの大きなコンティグをＪ株配列に対してアラインメントし、次いで、ｔｓ−１９又はＬＲＫ配列内のギャップを同定した。ギャップにまたがる幾つかのＰＣＲプライマーを設計し、合成した。プライマー配列は、ワクチン株又はＬＫＲ株から得られた配列、又はヌクレオチドデータベースから入手可能なＪ株の配列（ＧＥＮＢＡＮＫ、ＮＣ＿００７２９５．１）から得られた配列の組合せに基づいていた。前記プライマーを使用して、ＰＣＲによって標的部位を増幅した。次いで、ＰＣＲアンプリコンの配列を決定した。次いで、ギャップ領域にまたがる読取りの重複から得られた配列を、ギャップが埋まり、次いで、全ゲノム配列が完成するまでコンティグにアラインメントした。

一旦ｔｓ−１９（マスター及びＰ１２）並びに親株ＬＫＲの全ゲノム配列が完成すると、次いで、３つの配列を、複数の配列アラインメントにおけるＪ株の全ゲノムに対してアラインメントした。

複数の配列アラインメントから、ＬＫＲ株及びＪ株の配列の両方と比較したときに、ｔｓ−１９マスター及びＰ１２のゲノムの両方から置換、欠失、又は挿入されていたヌクレオチド塩基を突然変異であると同定した。これら突然変異を、公知の遺伝子、仮定遺伝子、遺伝子間領域、又は非コーディング領域内の変化として分類した。表１に、突然変異した遺伝子によってコードされているタンパク質を記載する。更なる突然変異を表２〜５に記載する。突然変異の正確な性質及び位置を図１に示す。

実施例３：新規弱毒化マイコプラズマ属の選択
ｔｓ−１９において突然変異している１以上の遺伝子のクローンについてスクリーニングすることにより、新規マイコプラズマ・ハイオニューモニエ又は他のマイコプラズマ属の種のワクチン候補の選択を行うことができる。

突然変異誘発及びｔｓ選択に続いて、ｔｓマイコプラズマクローンを培地で増殖させ、標準的な方法を用いて生物からｍＲＮＡを抽出した。逆転写酵素を使用して、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換する。また、親株を培養下で増殖させ、生物からｍＲＮＡを抽出した。ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換する。

ｔｓ−１９において同定された突然変異型遺伝子のうちの１以上を標的とする別々のＰＣＲ反応において、ｔｓクローン及び親株の各々に由来するｃＤＮＡを使用する。得られたＰＣＲアンプリコンをマイクロアレイスライドに印刷する。ｔｓクローンのＰＣＲ生成物のアレイを網羅する２枚のスライドを調製し、親ＰＣＲ生成物のアレイを網羅する２枚の他のスライドを調製する。

次いで、ｔｓクローンに由来する全ゲノムｃＤＮＡをＣｙ Ｄｙｅ Ｅｓｔｅｒ（例えばＣｙ３）にカップリングさせ、親に由来する全ゲノムｃＤＮＡを別のＣｙ Ｄｙｅ Ｅｓｔｅｒ（例えばＣｙ４）にカップリングさせる。

Ｃｙ３で標識されたｃＤＮＡは、マイクロアレイスライドの各々（１枚はｔｓクローン、１枚は親）にハイブリダイズする。同様に、Ｃｙ４で標識されたｃＤＮＡは、マイクロアレイスライドの各々（１枚はｔｓクローン、１枚は親）にハイブリダイズする。

遺伝子発現レベルを反映するハイブリダイゼーションシグナル強度及び色に基いて、発現差異を分析する。

実施例４：野外におけるｔｓ−１９と他のＭ．ｈｙｏとの識別
野外サンプル（例えば、感染したブタから回収した鼻腔用綿棒又は肺組織）を、特異的なプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅させる。各プライマーセットは、ｔｓ−１９ワクチン株に特有であることが同定されている様々な突然変異の部位に隣接するように設計する。ＰＣＲアンプリコンは、以下のような突然変異検出技術により分析することができる。

蛍光キャピラリー電気泳動（ＣＥ）：
欠失及び挿入変異については、蛍光ＣＥが使用に適した突然変異検出技術である。この場合、ＰＣＲプライマーは、各々異なるフルオロフォアで標識され、ＰＣＲ反応で用いられる。野外サンプル（試験）及びｔｓ−１９サンプル（ポジティブコントロール）をＰＣＲで増幅する。野外試験サンプル及びポジティブコントロール（ｔｓ−１９）から生成されたＰＣＲ生成物をキャピラリー電気泳動に供し、サイズに基づいてＰＣＲ生成物を分離させる。ＣＥは、単一（又は複数）のヌクレオチド塩基の欠失又は挿入に起因するアンプリコンサイズの変化を同定することができる。したがって、ワクチン株に由来するＰＣＲアンプリコンは、野外サンプルから生成されたＰＣＲアンプリコンとは異なる既知のピーク位置を有する。ｔｓ−１９ワクチン及び野外株の両方がサンプル中に存在する場合、２つの別個のピークが観察される。

一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）：
一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析は、突然変異を検出するための高感度技術である。ＳＳＣＰ分析の原理は、一本鎖ＤＮＡが規定の高次構造を有するという事実に基づく。配列中の単一塩基の変化により高次構造が変化し、非変性電気泳動条件下で一本鎖ＤＮＡが異なる動きをする。したがって、ｔｓ−１９ワクチン株（ポジティブコントロール）のＰＣＲと野外試験サンプルのＰＣＲとは、異なるバンドパターンを示す。

ＳＳＣＰは、塩基の変化、欠失及び挿入に適用することができる。１以上の突然変異領域を、放射性標識した（例えば、Ｐ^３３で標識した）プライマーを使用してＰＣＲで増幅させることができる。ｔｓ−１９ポジティブコントロールのアンプリコンサンプルを、野外試験サンプルと同一の方法で分析する。変性された（すなわち、熱及びアルカリに曝露された）二本鎖ＤＮＡアンプリコンから一本鎖ＤＮＡ分子を生成し、これを、直ちに非変性条件下で電気泳動分離に供する。電気泳動後、ゲルを濾紙（例えば、Ｗｈａｔｍａｎｎ）上で乾燥させ、次いで、オートラジオグラフィーフィルムにさらす。オートラジオグラフを現像した後、野外サンプルのバンドパターンをｔｓ−１９ポジティブコントロールサンプルのバンドパターンと比較する。ｔｓ−１９のパターンとバンドパターンが同一であることは、サンプルがｔｓ−１９ワクチン株であることを示す。異なるバンドパターンは、サンプルがｔｓ−１９ではないことを示す。

非放射性フォーマットでＳＳＣＰ方法を適用してもよい。

高解像度融解（ＨＲＭ）曲線分析：
ＨＲＭ曲線分析は、塩基置換、欠失及び挿入に関与する突然変異に適用可能である。この場合、サイクルシークエンサーを使用して、ｔｓ−１９ポジティブコントロールサンプルに加えて野外試験サンプルも、独自の（突然変異を含有する）領域のリアルタイム（ＲＴ）ＰＣＲ増幅に供する。使用するＰＣＲ装置は、ＨＲＭ曲線分析を行うことができるものである。ＰＣＲ増幅周期の完了時に、ＰＣＲアンプリコンを、ＰＣＲ装置によって行われるＨＲＭ曲線分析に供する。ｔｓ−１９アンプリコンは、野外株アンプリコンと比較して、異なる融解曲線ディスプレイを示す。

実施例５：Ｖａｘｓａｆｅ（登録商標）ＭＨＰのＨＲＭ分析
実施例２から得られた突然変異データに基づいて、Ｖａｘｓａｆｅ（登録商標）ＭＨＰワクチン株とワクチン親株を含む他のＭ．ｈｙｏ株とを識別することができる高解像度融解曲線（ＨＲＭ）アッセイの２つの例が開発された。しかし、ワクチン株内に存在する突然変異変化のうちのいずれかをＨＲＭ分析の標的として用いてもよい。

ＨＲＭ分析の例としてワクチンゲノム内の２つの領域を選択した。これら領域をＭＨＰ２及びＭＨＰ９／１０と命名する。ＭＨＰ２は、単一突然変異（図１Ｂ及びＣの突然変異番号２）を標的とするＨＲＭの例である。ＭＨＰ９／１０は、２つの突然変異（図１Ｂ及びＣの突然変異番号９及び１０）を標的とするＨＲＭの例である。この研究では、Ｔｙｐｅ−ｉｔ（登録商標）ＨＲＭ（商標）キットと合わせて、２又は５Ｐｌｅｘであり且つＨＲＭ能を有するＱｉａｇｅｎ「Ｒｏｔｏｒ Ｇｅｎｅ Ｑ」ユニットを使用した。簡潔に述べると、ＨＲＭは、突然変異のスキャニング及びジェノタイピングに使用することができるポストＰＣＲ技術である。前記方法は、ＰＣＲ後の処理を必要としないので、クロスコンタミネーションのリスクが最小限に抑えられる。更に、分離工程を含まないので、分析時間が短縮される。

ＨＭＲ分析は、コンタミネーションした生物の増殖を最小限に抑えるために、選択的ブロス培地でＭ．ハイオニューモニエを培養した臨床サンプル（例えば、スワブ又は組織標本）等のＤＮＡサンプルに対して実施する。次いで、培養したＭ．ｈｙｏサンプルからＤＮＡを抽出する。精製したＤＮＡを全ての試験サンプルについて標準化する。

実施例５ａ：標的ＭＨＰ２：
Ｍ．ハイオニューモニエゲノムのうちの１５１ｂｐ領域を増幅するために、プライマーセット（ＭＨＰ−２Ｆ及びＭＨＰ−２Ｒ）を選択した。

ＰＣＲ反応
ＨＲＭの反応はトリプリケートで行う。各反応物は、以下を含む：
ＨＲＭ ＰＣＲ Ｓｕｐｅｒ Ｍｉｘ（２×） １２．５μＬ
ヌクレアーゼ不含水 ９．７５μＬ
フォワードプライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ） ０．９μＬ
リバースプライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ） ０．９μＬ
ＤＮＡテンプレート（７０ｐｇ／μＬ） １μＬ
必要な試薬（上記参照）を０．１ｍＬのＰＣＲチューブに分注し、温度サイクリングに供する。

結果
ワクチン又は他のＭ．ｈｙｏ株のいずれかの純粋培養物から抽出したＤＮＡに対してＨＲＭ分析を行った。各株に由来するＤＮＡ又は様々な株に由来するＤＮＡの混合物に対して個々に反応を行った。

Ｖａｘｓａｆｅ（登録商標）ＭＨＰワクチン株及び２つの野生型Ｍ．ｈｙｏ（ワクチン親株及び野外単離株）についての、標的ＭＨＰ２のＨＲＭのプロファイルを図２（Ａ、Ｂ及びＣ）に示す。ＨＲＭは、約７５．２℃で分離が始まり、約７７．４℃で終了する融解パターンを示した。ワクチン株は、より低い温度融解プロファイルを示し、これにより両方の野性型株（Ｖａｘｓａｆｅ（登録商標）ＭＨＰの親株及び野外単離株）と区別される。野生型株は、ワクチン株よりも長い時間、より高いレベルの蛍光を維持したので、融解プロファイルが右にシフトした。ワクチン株と他のＭ．ｈｙｏ野生型株とを識別するためにこのシフトを使用することができる。

プロファイルの重複（図２Ａ）により示される通り、２つのＭ．ｈｙｏ野生型株のＨＲＭプロファイルは同一であった。重複するプロファイルを、図２Ｂ及び２Ｃに別々に示す。図２Ｄは、「差分グラフ」を用いて同じデータを示し、これは、ワクチン株と野性型株との明らかな分離を示す。ワクチン株をレファレンスとして定めることにより、差分グラフを作成する。次いで、野生型株の蛍光レベルを約ゼロに標準化し、野生型標準からの任意の偏差を差分グラフに記録する。

実施例５ｂ：標的ＭＨＰ９／１０
Ｍ．ハイオニューモニエゲノムのうちの１６０ｂｐ領域を増幅するために、プライマーセット（ＭＨＰ−９／１０−２Ｆ及びＭＨＰ−９／１０−２Ｒ）を選択した。

ＰＣＲ反応
ＨＲＭの反応はトリプリケートで行う。各反応物は、以下を含む：
ＨＲＭ ＰＣＲ Ｓｕｐｅｒ Ｍｉｘ（２×） １２．５μＬ
ヌクレアーゼ不含水 ９．７５μＬ
フォワードプライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ） ０．９μＬ
リバースプライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ） ０．９μＬ
ＤＮＡテンプレート（７０ｐｇ／μＬ） １μＬ
必要な試薬（上記参照）を０．１ｍＬのＰＣＲチューブに分注し、温度サイクリングに供する。

Ｖａｘｓａｆｅ（登録商標）ＭＨＰワクチン株および親株についての、標的ＭＨＰ９／１０のＨＲＭプロファイルを図３Ａに示す。ＨＲＭは、約７３．７℃で分離が始まり、約７７．０℃で終了する融解パターンを示した。ワクチン株は、より高い温度融解プロファイルを示し、これにより親株と区別される。ワクチン株は、親株よりも長い時間、より高いレベルの蛍光を維持したので、融解プロファイルが右にシフトした。ワクチン株と親株とを識別するためにこのシフトを使用することができる。図３Ｂは、「差分グラフ」を用いて同じデータを示し、これは、ワクチン株と親株との明らかな分離を示す。

Ｖａｘｓａｆｅ（登録商標）ＭＨＰワクチン株及び親Ｍ．ｈｙｏ株ＬＫＲの両方から得られたＤＮＡを１：１の比率で混合し、標的ＭＨＰ９／１０についてのＨＲＭ分析に供した。同じ分析において、各株から得られた個々のＤＮＡもＨＲＭ分析に供した。プロファイル（図４Ａ）は、標的ＭＨＰ９／１０について上記と同じ融解パターンを示し、これにより、ワクチン株と親株とを識別できる。混合Ｍ．ｈｙｏ ＤＮＡ（ワクチン及び親株）のＨＲＭプロファイルを図４（Ａ）に示し、これは、個々のワクチン及び親株の両方のＤＮＡとは異なる融解パターンを示した。差分グラフ（図４Ｂ）では、ワクチンからの任意の偏差を観察することができるように、ワクチン株を標準化した。差分グラフでは、ワクチンを野性型株と識別することができるが、混合サンプルは、野性型及びワクチン株の両方と全く異なる融解プロファイルを示した（図４Ｂ）。

結論
２つの例が、ＨＲＭ曲線分析が、Ｖａｘｓａｆｅ（登録商標）ＭＨＰワクチン株とワクチン親株を含む他のＭ．ｈｙｏ野生型株とを識別するためのツールとして用いることができることを実証するために選択された。実施例５ａは、単一のヌクレオチド塩基に基づく識別を実証した。実施例５ｂは、２つのヌクレオチド塩基の変化に基づく識別を実証した。続いて、感染動物とワクチン接種した動物とを区別する（ＤＩＶＡ）ための手段としての、ワクチン株中に存在する多数の突然変異による変化のうちのいずれを標的とするためにＨＲＭ分析を用いることもできる。１回のＨＲＭ分析で、単一又は多重突然変異のいずれを標的とすることもできる。各突然変異について、フォワードプライマーは、突然変異部位の上流５００ｂｐ内の領域のいかなる箇所に設計してもよい。リバースプライマーは、突然変異部位の下流５００ｂｐ内の領域のいかなる箇所に設計してもよい。好ましくは、生じるアンプリコンは、５０〜２００ｂｐのサイズであるべきである。

Claims (13)

1. 弱毒化マイコプラズマ属細菌を同定する方法であって、表１に記載するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子、又は表２〜５のうちのいずれか１つに記載する核酸分子における突然変異の存在についてマイコプラズマ属細菌をアッセイすることを含み、前記突然変異の存在が、マイコプラズマが弱毒化されていることを示す方法。
2. 弱毒化マイコプラズマを作製する方法であって、マイコプラズマ属細菌の初期集団を弱毒化条件に供して、弱毒化されていると推定される細菌集団を作製し、前記弱毒化されていると推定される細菌集団の個々のクローンを、表１に記載するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子又は表２〜５のうちのいずれか１つに記載する核酸分子における突然変異の存在についてアッセイすることを含み、前記突然変異の存在が、マイコプラズマが弱毒化されていることを示す方法。
3. 表１に記載するタンパク質をコードする遺伝子及び／又は表２〜５のうちのいずれか１つに記載する核酸分子における突然変異の組合せについてアッセイすることを含む請求項１又は請求項２記載の方法。
4. 突然変異の組合せが、表１中のＰ８５、Ｐ６９、Ｐ２１６、Ｐ１４６及びリポタンパク質遺伝子のうちの少なくとも２つにおける突然変異を含む請求項３記載の方法。
5. 請求項１記載の方法により選択されたか又は請求項２記載の方法により作製された弱毒化マイコプラズマ属細菌。
6. 請求項５記載の弱毒化マイコプラズマ属細菌を含む免疫原性組成物。
7. 請求項６記載の免疫原性組成物を含むマイコプラズマワクチン。
8. 被験体においてマイコプラズマによって惹起される疾患に対する防御免疫を誘発する方法であって、防御量の請求項５記載の弱毒化マイコプラズマ、請求項６記載の免疫原性組成物、又は請求項７記載のワクチンを被験体に投与することを含む方法。
9. 動物がマイコプラズマの弱毒化株又は毒性株に感染しているかどうかを判定する方法であって、表１に記載するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子又は表２〜５のうちのいずれか１つに記載する核酸分子における突然変異の存在について、前記動物から採取したマイコプラズマを含むサンプルをアッセイすることを含み、前記突然変異が存在しないことが、前記動物が毒性マイコプラズマに感染していることを示す方法。
10. 弱毒化マイコプラズマ株をワクチン接種されている動物とマイコプラズマに感染している動物とを識別する方法であって、表１に記載するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子又は表２〜５のうちのいずれか１つに記載する核酸分子における突然変異の存在について、マイコプラズマを含むサンプルをアッセイすることを含み、前記サンプル中の前記突然変異の存在が、前記サンプルを採取した動物に弱毒化マイコプラズマワクチンが接種されていることを示す方法。
11. 表１に記載するタンパク質をコードする１以上の遺伝子又は表２〜５のうちのいずれか１つに記載する核酸分子における突然変異に対して特異的なプライマー又はプローブを含むキット。
12. 図１に示す少なくとも１つの突然変異に対して特異的なプライマー又はプローブを含むキット。
13. 前記プライマーが、配列番号１及び配列番号２、又は配列番号３及び配列番号４を含む請求項１２記載のキット。