CN114940955B - 一种鸡毒支原体弱毒疫苗株及其应用 - Google Patents

一种鸡毒支原体弱毒疫苗株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物与免疫技术领域，尤其是一种鸡毒支原体弱毒疫苗株及其应用，该鸡毒支原体弱毒疫苗株保藏号为CGMCC No.45082。本发明的鸡毒支原体弱毒株为分离的自然弱毒株，具有使用安全、鸡体回归毒力不返强、生长滴度高等优点，使用点眼、滴鼻、气雾免疫方式均能获得良好的免疫保护效果；而且临床使用方便，可应用于各种品种、各种日龄的鸡。

Description

一种鸡毒支原体弱毒疫苗株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物与免疫技术领域，具体领域为一种鸡毒支原体疫苗株。
背景技术
鸡毒支原体是鸡慢性呼吸道病中的一种常见、多发性传染病。该病常与大肠杆菌病、新城疫和传染性支气管炎等混发，给养鸡业造成重大损失。
鸡毒支原体感染各个品种、各个日龄的鸡，导致商品鸡成活率低、生长迟缓，蛋鸡产蛋率下降，延迟产蛋高峰期。由于垂直感染，常常造成出生雏鸡的死亡率增加和污染区扩大。被感染鸡食欲不振，体重减轻、消瘦、咳嗽、打喷嚏、喘气并伴有气管罗音，眼睑肿胀，鼻腔、眶下窦中流出渗出物。解剖感染鸡，发现呼吸道感染，气管内壁有炎症，可见黏液或卡它性渗出物，并发现感染鸡患气囊炎、气囊壁增厚、混浊，重者有较多的黄色分泌物，呈块状或干酪样。鸡群发病后的药物使用费用加大，药物治疗效果不够理想，停药后容易复发，该病一旦在鸡场流行，就很难根除。因此，预防、控制和净化鸡毒支原体须采取种源净化、全进全出、疫苗预防、严格环境控制、精细饲养管理等综合性措施，其中疫苗预防在控制鸡毒支原体中起着关键性的作用。
临床常用的鸡毒支原体疫苗，主要分为灭活苗和弱毒苗两种，灭活苗虽然能够降低鸡毒支原体的垂直传播，减少排毒，增强体液免疫，减轻感染症状，但是却不能彻底清除鸡体内的野毒和阻止野毒入侵。弱毒苗可使机体产生局部粘膜免疫，应用较为广泛的主要有F株、6/85株和Ts-11株。
F株疫苗要比6/85和TS-11疫苗株取代攻毒菌株的能力强，并且能在多种年龄商品产蛋区取代鸡毒支原体野毒株，然而，当停止对此地区农场进行免疫时，F菌株继续在鸡群之间循环，不能清除鸡毒支原体。
Ts-11株可以取代F菌株，但是需要干冰或液氮运输保存，运输、使用不方便。
6/85株源于美国，通过气雾免疫，适用于6周龄及以上年龄的鸡免疫，为了达到最佳效果，必须进行至少两次气雾免疫，方能达到效果，不易于临床应用。另外TS-11株、6/85株鸡毒支原体弱毒疫苗还存在针对性弱、造价高等缺点。
因此，开发一种安全性好、免疫原性强的鸡毒支原体弱毒疫苗株成为了本领域亟需解决的技术难题之一。
发明内容
本发明的目的在于克服现有弱毒疫苗的不足，提供一种临床使用方便、安全性好、免疫原性强的鸡毒支原体弱毒疫苗株及其应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种鸡毒支原体弱毒疫苗株，为鸡毒支原体DL弱毒株，其微生物保藏编号为CGMCCNo.45082。
本发明所述的鸡毒支原体弱毒疫苗株可用于制备防治鸡毒支原体感染疾病的药物。
本发明所述的鸡毒支原体弱毒疫苗株可用于制备鸡毒支原体疫苗。
本发明所述的鸡毒支原体弱毒疫苗株还可用于制备诊断或检测鸡毒支原体所致疾病的试剂。
一种鸡毒支原体弱毒疫苗，包括本发明所述的鸡毒支原体弱毒疫苗株。
其中，还包括药学上可接受的辅料或佐剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的鸡毒支原体DL弱毒株具有使用安全，回传至鸡体内毒力不返强，遗传性能稳定，生长滴度高，具有良好的免疫原性，临床使用方便，可应用于各种品种、各种日龄的鸡。
相比于国内临床应用的弱毒疫苗株(F株、6/85株和Ts-11株)，本发明的鸡毒支原体DL弱毒株是基于地方临床分离自然弱毒疫苗株，针对性强，保护效果更好；而且鸡毒支原体DL弱毒株比市面广泛应用的F株毒力要弱，安全性好，DL株可以作为取代F株的备选优秀菌株，并且该菌株可以冻干保存，运输方便。
此外，鸡毒支原体DL弱毒株，使用非常方便，点眼、滴鼻或者气雾免疫均可。
附图说明
图1为鸡毒支原体DL弱毒株PCR扩增的电泳鉴定图。M:DL2000Marker，1:MG阳性对照，2:鸡毒支原体DL弱毒株，3:阴性对照，4:空白对照。
图2为鸡毒支原体DL弱毒株在固体培养基上的菌落形态图。
图3-图6为鸡毒支原体DL弱毒株与其它株基因组(TS-11株、R株、685株和F株)共线性比对结果图。
微生物保藏信息
鸡毒支原体DL弱毒株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，保藏机构简称：CGMCC，保藏日期为2022年02月17日，生物保藏编号为CGMCC No.45082，命名：鸡毒支原体DL弱毒株。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1鸡毒支原体(DL株)自然弱毒株分离鉴定
病原分离：辽宁省大连市某养鸡场，疑似鸡慢性呼吸道病的患鸡，采集眶下液、气管和气囊分离支原体，置37℃恒温振荡培养箱中培养，液体变黄者按10％的比例移植于新鲜改良CM2液体培养基内，培养液变黄时即可进行传代培养。
鉴别培养基鉴别培养：将分离菌株分别接种于伊红美蓝培养基、麦康凯培养基、鲜血培养基、巧克力培养基、改良CM2液体培养基中培养，分离菌株仅在改良CM2液体培养基上生长，其余培养基上均不生长。
同时将收获的培养液涂于改良CM2固体培养基进行3次克隆培养，将最后一次克隆纯化得到的菌液，命名为DL分离株，进行PCR鉴定及菌落形态鉴定和颜色变化单位(ColourChange Unit，CCU)测定。
PCR鉴定方法：以鸡毒支原体黏附素蛋白(PvpA)编码基因保守区为模板设计引物，进行PCR扩增。其中引物序列如下(如SEQ ID No:1-2所示)：
PvpA-P1:ACTTACAGATTACAGGAGCAG
PvpA-P2:ATTTCCGTTGGTTGTTGACT，扩增片段321bp。
PCR结果显示以分离株基因组为模板扩增的PvpA基因片段大小与阳性对照组(以鸡毒支原体F株基因组为模板)扩增的片段大小一致，如图1所示。
菌落形态观察：将收获的培养液涂于支原体固体培养基上，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养3～5天后，在低倍显微镜下观察见有煎鸡蛋样菌落，如图2所示。
颜色变化单位(CCU)测定：在试管架上摆好小试管，每只试管内装入1.8mL支原体培养基；取待测菌液0.2ml加入第一支试管，震荡混匀后，移取0.2ml至第2管培养基中，如此依次进行10倍系列稀释至10～11，第12根试管作为对照，做三个平行；标记好各管稀释度，放入37℃恒温培养箱进行培养，培养7日，每日记录各管生长情况。以第7天不再变色的稀释梯度为最高的CCU。CCU测定表明，大连分离株在第5天时，其滴度即可达到1010CCU/ml，具有稳定的生长速度和很高的培养滴度。
将鸡毒支原体DL株进行全基因组测序，并与其它鸡毒支原体菌株(TS-11株、R株、685株和F株)基因组进行共线性比对，结果表明，如图3-图6所示。DL株与F株相比，共线性不是很好，存在大规模的基因倒位、***、缺失等基因重排现象；DL株与685株和R株相比，总体共线性一般，存在多处缺失、倒位等基因重排现象；DL株与毒力较弱的菌株TS-11株总体共线性良好，存在基因缺失、倒位等基因重排现象。
实施例2鸡毒支原体DL株毒力测定
将40只35日龄SPF鸡，分为A、B、C、D四组，每组10只，A、B、C组均点眼、滴鼻及胸腔注射攻毒1ml/只，攻毒剂量均为109CCU。其中，A组攻毒鸡毒支原体DL株，B组攻毒鸡毒支原体F36株，C组攻毒鸡毒支原体R株，D组攻毒生理盐水(空白对照组)。攻毒后，观察21天对所有试验鸡进行解剖，观察气囊病变情况并对其评分。
毒力测定结果表明，A组与D组对照组没有差异，气囊均表现为清洁透明而薄；B组有2/10只鸡气囊稍有增厚和轻度浑浊；C组有8/10只气囊病变判分大于等于2分。毒力测定结果可以看出，A组鸡毒支原体DL株毒力很弱，气囊病变均分低于F36株。
气囊保护率计算方法及公式如下：
以气囊病变程序来计算保护率，将试验鸡每侧气囊病变程度分为五个等级：
0分——正常的气囊，清洁透明而薄；
1分——气囊稍有增厚和轻度浑浊，局部有少数灰色或黄色渗出物斑点；
2分——部分气囊区域有可见的灰色和黄色渗出物，同时伴有气囊中度浑浊；
3分——大片气囊布满黄色干酪样渗出物；
4分——整个气囊布满黄色干酪样渗出物，气囊失去弹性。
气囊保护率计算公式：
保护率＝[(对照鸡气囊损伤分/只—试验鸡气囊损伤分/只)/对照鸡气囊损伤分/只]×100％
表1 MGDL株毒力测定，气囊病变均分情况
实施例3鸡体传代返强试验
鸡毒支原体DL株传代稳定性试验：应用改良CM2液体培养基按照10％比例接种固体克隆3次的鸡毒支原体DL株，置37℃恒温振荡培养箱中培养，待培养液pH下降超过0.5，即可传下一代，如此传代至60代(DL株/DLF60)，每隔5代取样测定各代次培养液的培养滴度。结果表明，鸡毒支原体DL株传代60代，性状稳定，经传代后每隔5代次的培养液培养滴度稳定在109CCU/ml以上，未发生任何改变。
鸡体传代返强试验：分别将鸡毒支原体DL株和传代60代(DLF60)的新鲜培养液经点眼、滴鼻及胸腔注射10日龄SPF鸡5只，1ml/只，第20天无菌从接种鸡的气囊和气管取样作支原体分离。以第一代回传的分离物继续以1ml/只点眼、滴鼻及胸腔注射，再作支原体分离，如此进行至第十代。每个代次均观察接种后鸡只的呼吸道反应和解剖观察鸡只的气囊病变，同时以未作回传的DL株培养物作为对照。试验结果表明，经回传SPF鸡10代的各代次DL株/DLF60培养物接种小鸡，均未引起接种鸡的呼吸道反应，所有接种鸡解剖后气囊均未出现病变，和未经回传SPF鸡的DL株的结果完全一致。说明鸡毒支原体DL株/DLF60经鸡体回传10代不会毒力返强，对鸡安全，无致病性。
实施例4鸡毒支原体(DL株)弱毒活疫苗不同免疫方式免疫效果测定
将鸡毒支原体DL株和传代60代(DLF60)冻干后，均以108CCU/ml含量分别点眼、滴鼻、气雾免疫接种10日龄左右SPF鸡，接种后35天时，连同相同数量的SPF鸡以500～600ml原培养物(108-9CCU/ml)气溶胶攻击R株强毒，14天时解剖观察结果。按照实施例2所述的气囊保护率计算方法及公式，免疫原性结果表明，鸡毒支原体DL株和传代60代(DLF60)点眼、滴鼻、气雾免疫均可以产生较好的免疫保护效果。
表2 DL株不同免疫方式免疫效果测定结果
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 兆丰华生物科技（南京）有限公司
<120> 一种鸡毒支原体弱毒疫苗株及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acttacagat tacaggagca g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atttccgttg gttgttgact 20

Claims (5)

1.一种鸡毒支原体弱毒疫苗株，其微生物保藏编号为CGMCC No.45082。
2.权利要求1所述的鸡毒支原体弱毒疫苗株在制备防治鸡毒支原体感染疾病的药物中的用途。
3.权利要求1所述的鸡毒支原体弱毒疫苗株在制备鸡毒支原体疫苗中的用途。
4.一种鸡毒支原体弱毒疫苗，其特征在于：包括权利要求1所述的鸡毒支原体弱毒疫苗株。
5.根据权利要求4所述的鸡毒支原体弱毒疫苗，其特征在于：包括药学上可接受的辅料。
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