MX2012013409A - Metodos relacionados a un micoplasma atenuado. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método para identificar o generar una bacteria de micoplasma atenuado, dicha bacteria comprende una mutación en al menos un gen según listado y uso de la bacteria en una vacuna para producir inmunidad protectora contra micoplasma o para detectar infección por dicha bacteria.

Description

METODOS RELACIONADOS A UN MICOPLASMA ATENUADO CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a usos para Mycoplasma hyopneumoniae, tales como en métodos para diagnosticar la presencia de Micoplasma atenuado en una muestra y para seleccionar Micoplasma atenuado.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Mycoplasma hyopneumoniae es el agente etiológico de la neumonía porcina por Micoplasma (también llamada neumonía enzoótica (EP)). Es una de las enfermedades respiratorias más comunes y económicamente importantes que afectan a la producción porcina mundialmente. La enfermedad está asociada con infecciones secundarias, tasas altas de morbidez y bajas de mortalidad, baja conversión alimenticia y puede ser atribuida a pérdidas económicas globales estimadas en aproximadamente $1 millón de millones por año.

En la EP, la bacteria Mycoplasma hyopneumoniae se une a los cilios de células epiteliales en los pulmones de cerdos destruyendo los cilios normales saludables permitiendo que organismos oportunistas se establezcan por sí mismos en el tejido respiratorio ocasionando la enfermedad. Una vez establecida, M. hyopneumoniae ocasiona lesiones en los pulmones de los cerdos.

La enfermedad es altamente contagiosa y la transmisión es usualmente a través de contacto directo con secreciones infectadas del tracto respiratorio, por ejemplo, gotas expulsadas por el hocico o boca al estornudar o toser.

Actualmente existen varias vacunas contra M. hyopneumoniae. La mayoría de las vacunas actuales son proporcionadas por aproximadamente 10 compañías con 22 marcas registradas de vacuna ya sea individual o bi/multivalente. Todas son preparaciones de M. hyopneumoniae aniquilado o inactivado.

Ejemplos de vacunas de M. hyopneumoniae de célula entera inactivada incluyen RESPISURE™ y STELLAMUNE™ (Pfizer), SUVAXYN M. H YO™ (Fort Dodge), HYORESP™ (Merial), M + PAC™ (Schering-Plough) y PORCILIS™ (Intervet).

Mientras algunas vacunas pueden reducir la severidad de EP, ninguna de las vacunas de célula entera aniquilada o inactivada, disponibles proporcionan la completa protección de infección pro M. hyopneumoniae.

La solicitud copendiente, publicada como WO2010/132932, describe una cepa de M. hyopneumoniae atenuada viva, la cual es sensible a la temperatura. Esta cepa se designó como ts-19 y se depositó bajo el Tratado de Budapest en el National Measurements Institute como NM 04/41259 el 13 Mayo del 2004. Esta cepa, cuando se incorpora a una vacuna, es capaz de conferir inmunidad protectora contra M. hyopneumoniae en cerdos vacunados.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Un primer aspecto proporciona un método para identificar una bacteria de micoplasma atenuado, el método comprende analizar bacterias de micoplasma para presencia de una mutación en al menos un gen que codifica una proteína listada en el Cuadro 1 ó en una molécula de ácido nucleico listada en cualquiera de uno o más de las Cuadros 2 a 5, en donde la presencia de la mutación indica que el Micoplasma está atenuado.

Las vacunas atenuadas son en general ventajosas ya que presentan todos los determinantes inmunogénicos relevantes de un agente infeccioso en su forma natural para el sistema inmune de un huésped y la necesidad de cantidades relativamente pequeñas del agente de inmunización debido a la habilidad del agente para multiplicarse en el huésped vacunado. Los métodos para la atenuación incluyen hacer pasar una cepa virulenta múltiples veces o exponer a irradiación o químicos. Se asume que estos métodos introducen mutaciones en el genoma que presenta el microorganismo menos virulento pero capaz de replicación.

Las desventajas de estos aspectos son que introducen mutaciones aleatorias que no son caracterizadas al nivel molecular. También los métodos para seleccionar la atenuación, tal como al seleccionar una sensibilidad a temperatura asociada son por lo regular consumidores de tiempo, producen resultados falsos ya que una cepa sensible a la temperatura puede no ser atenuada y una cepa atenuada no necesita ser sensible a la temperatura, y requieren un gran reto de ensayo y error. Además, la cepa atenuada puede experimentar mutación adicional y transformarse a virulencia. Una estrategia alternativa podría ser generar Micoplasma atenuada, no reversible, genéticamente definida. Sin embargo, hasta la fecha no se han identificado los genes afectados por la atenuación de Micoplasma. La presente invención identifica mutaciones en Micoplasma atenuado según comparado a su cepa parental y utiliza este conocimiento para determinar qué genes deben ser mutados para proporcionar un Micoplasma atenuado.

El método del primer aspecto permite la selección para una cepa de Micoplasma atenuado y para identificar si una cepa atenuada ha regresado a virulencia.

Un segundo aspecto proporciona un método para generar un Micoplasma atenuado, el método comprende someter una población inicial de bacterias de Micoplasma para atenuar condiciones, produciendo así una población bacteriana putativamente atenuada y analizar clones individuales de la población bacteriana putativamente atenuada para presencia de una mutación en al menos un gen que codifica una proteína listada en el Cuadro 1 o en una molécula de ácido nucleico listada en cualquiera de uno o más de los Cuadros 2 a 5, en donde la presencia de la mutación indica que el Micoplasma es atenuado.

Un tercer aspecto proporciona una bacteria de Micoplasma atenuado seleccionada por el método del primer aspecto o generada por el método del segundo aspecto.

Un cuarto aspecto proporciona una composición inmunogénica que comprende la bacteria de Micoplasma atenuado del tercer aspecto.

Un quinto aspecto proporciona una vacuna de Micoplasma que comprende la composición inmunogénica del cuarto aspecto.

Un sexto aspecto proporciona un método para inducir inmunidad protectora contra una enfermedad, en un sujeto, causada por un Micoplasma el método comprende administrar al sujeto una' cantidad protectora del Micoplasma atenuado del tercer aspecto, la composición inmunogénica del cuarto aspecto o la vacuna del quinto aspecto.

Un aspecto alternativo proporciona el Micoplasma atenuado del tercer aspecto, la composición inmunogénica del cuarto aspecto o la vacuna del quinto aspecto para producir inmunidad protectora contra una enfermedad causada por Micoplasma.

Un aspecto alternativo adicional proporciona el uso del Micoplasma atenuado del tercer aspecto, la composición inmunogénica del cuarto aspecto o la vacuna del quinto aspecto en la elaboración de un medicamento para prevenir una enfermedad causada por Micoplasma.

Los inventores determinaron la secuencia de ácido nucleico de la cepa de Mycoplasma hyopneumoniae atenuado (ts-19) depositada en el National Measures Institute bajo el número de acceso NM04/41259, y la secuencia de la cepa virulenta a partir de la cual se derivó la cepa atenuada mediante mutación NTG (aislado de LKR de Mycoplasma hyopneumoniae, Lloyd & Etheridge (1981) J. Comp. Path. 91:77-83). Al utilizar el análisis de las secuencias alineadas junto con su conocimiento en el campo, los inventores fueron capaces de identificar ciertas mutaciones que creen que están asociadas con la atenuación. Los inventores consideran que estas mutaciones son marcadores para la atenuación en Mycoplasma hyopneumoniae y en otro Micoplasma y se pueden utilizar para seleccionar cepas de Micoplasma atenuado. Esto es particularmente útil cuando las condiciones de atenuación utilizadas para generar un Micoplasma atenuado ocasionan mutagénesis aleatoria. La selección de las mutaciones proporciona un método simple para determinar si una cepa de Micoplasma es atenuada y, por lo tanto, adecuada para la formulación a una vacuna.

Un séptimo aspecto proporciona un método para determinar si un animal es infectado con una cepa atenuada o virulenta de Micoplasma, el método comprende analizar una muestra que comprende un Micoplasma de un animal para la presencia de una mutación en al menos un gen que codifica una proteina listada en el Cuadro 1 o en una molécula de ácido nucleico listada en cualquiera de uno o más de los Cuadros 2 a 5, en donde la ausencia de la mutación indica que el animal está infectado con Micoplasma virulento.

Un octavo aspecto proporciona un método para distinguir animales vacunados con una cepa de Micoplasma atenuado de aquellos infectados con Micoplasma, el método comprende analizar una muestra que comprende un Micoplasma para la presencia de una mutación en al menos un gen que codifica una proteína listada en el Cuadro 1 o en una molécula de ácido nucleico listada en cualquiera de uno o más de los Cuadros 2 a 5, en donde la presencia de la mutación en la muestra indica que el animal a partir del cual la muestra se tomó ha sido vacunado con una vacuna de Micoplasma atenuado.

La Mycoplasma hyopneumoniae es una enfermedad altamente contagiosa y crónica que ocasiona neumonía enzoótica en cerdos. Esta enfermedad es endémica mundialmente. Los métodos del séptimo y octavo aspectos permiten la diferenciación de cerdos que han sido vacunados con una cepa atenuada de aquellos que están infectados o aquellos en donde la cepa de vacuna ha invertido la virulencia.

Un noveno aspecto proporciona un equipo que comprende iniciadores o sondas específicos para una mutación en uno o más agentes que codifican una proteína listada en el Cuadro 1 o en una molécula de ácido nucleico listada en cualquiera de uno o más de los Cuadros 2 a 5.

Un décimo aspecto proporciona un equipo que comprende iniciadores o sondas específicos para al menos una mutación mostrada en la Figura 1.

Los equipos de los noveno y décimos aspectos pueden ser utilizados en los métodos de los primero, séptimo u octavo aspectos.

DESCRIPCION DETALLADA La cepa de M. hyopneumoniae, "LKR", fue originalmente aislada de un espécimen de matadero (Lloyd and Etheridge 1981, J of Comp Path 91:77-83). El organismo se volvió a aislar de cerdos experimentalmente infectados antes de hacerse pasar aproximadamente 10 veces en un medio acelular para llegar al aislamiento clonal (CSIRO, Victoria). El clon después fue sometido a la colección de University of Adelaide Mycoplasma, Sur de Australia. El asilado LKR después fue obtenido a través de la University of Melbourne, Department of Veterinary Science (Grupo de Micoplasma), en donde experimentó 3 pasajes in vitro en un caldo de Friss modificado, para almacenamiento. Los frascos almacenados fueron designados como "LKR P3 29/5/97". Este clon representa la cepa parental.

LKR P3 29/5/97 se pasar in vitro y se sometió a mutagénesis NTG (200 mg/ml) utilizando un método descrito anteriormente (Nonamura and Imada (1982) Avian Diseases 26:763-775). Se seleccionó un clon sensible a la temperatura ("ts-19") de una placa de agar y se cultivó en 3 mi de caldo de Friss modificado. El número de pasaje para este clon fue designado como "P0" y subsecuentemente experimentó cuatro pasajes más in vitro a 1:4 v/v de dilución por pasaje en caldo de Friss modificado. El nivel de pasaje final se designó como "LKR ts-19 P4 MS".

LKR ts-19 P4 MS experimentó un número de pasajes de dilución in vitro en caldo de Friss modificado para alcanzar una dilución de 3.2 x 10'21. El clon mutante final fue designado "LKR ts-19 3.2 x 1 0-21„ LKR ts-19 3.2 x 10"21 se secó por congelación y se sometió a los laboratorios Australian Government Analytical Laboratories (Tratado de Budapest en el reconocimiento internacional del depósito de organismos para propósitos de procedimiento de patente) bajo el número de acceso NM04/41259.

Los micoplasmas tienen un tamaño altamente reducido de genoma, lo cual refleja sus habilidades biosintéticas limitadas y su dependencia de tipo parásita sobre su huésped. En vista de la redundancia limitada en sus genomas, la mutagénesis NTG de un componente particular de una trayectoria puede tener un efecto importante en la sobrevivencia de una célula de Micoplasma. La mutagénesis NTG da como resultado mutaciones aleatorias (transiciones de nucleótido, transversiones, eliminaciones o inserciones) dentro del genoma. Esto podría dar como resultado una población de genomas variantes, cada uno conteniendo ya sea una o más mutaciones. Presumiblemente, muchos de los genomas variantes podrían no sobrevivir debido a un gen o genes críticos que se presentan como disfuncionales. Si las mutaciones no incurren en un efecto dañino en la capacidad de los organismos para crecer entonces aquellos organismos variantes que sobreviven pueden experimentar la selección adicional (por ejemplo, selección de temperatura). En el desarrollo de ts-19, la selección se basó en la habilidad de la cepa variante para crecer a una alta titulación a una temperatura de 33°C y la habilidad reducida para crecer a 39.5°C. Con base en la comparación de secuencia completa de genoma entre la cepa de vacuna de Mycoplasma hyopneumoniae, ts-19, y aquella de la cepa parental (LKR), un número de mutaciones (cambios de nucleótido) ha sido identificado dentro del genoma de ts-19. Estas mutaciones incluyeron substituciones de nucleótido (transiciones y transversiones), así como eliminaciones e inserciones.

Las mutaciones se localizaron alrededor de todo el genoma e incluyen una escala de genes expresados así como proteínas hipotéticas y secuencias sin codificación. El Cuadro 1 lista los genes conocidos que han sido mutados a través de substituciones, eliminaciones o inserciones base. Los genes han sido categorizados de acuerdo a su función principal.

El Cuadro 2 muestra mutaciones silenciosas identificadas en genes y en regiones sin codificación de ts-19. El Cuadro 3 muestra eliminaciones identificadas en las regiones sin codificación de ts-19. El Cuadro 4 muestra mutaciones identificadas en genes hipotéticos de ts-19. El Cuadro 5 muestra eliminaciones identificadas en genes hipotéticos de ts-19.

La naturaleza exacta de las diferencias específicas entre la cepa J de M. hyo, cepa LKR de M. hyo, y la cepa atenuada de ts-19 (maestra y después de 12 pasajes in vitro) se muestran en la Figura 1.

Se postula que la sensibilidad a la temperatura y la atenuación de un organismo resultan ya sea de una mutación individual o mutaciones múltiples que actúan individualmente o en conjunto para producir las características fenotípicas.

Los expertos en la técnica podrían apreciar fácilmente cómo identificar si una cepa de M. hyo c ontiene una mutación en uno de los genes listados en el Cuadro 1 al determinar si existe una diferencia entre la secuencia de referencia provista (por ejemplo, YP_278901.1) y la secuencia de la cepa atenuada ts-19, según depositada como NM04/41259.

En una modalidad, la cepa atenuada comprende al menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34 o todas las mutaciones listadas en el Cuadro 1, solas o en combinación con al menos una mutación listada en el Cuadro 2, 3, 4 o 5.

En una modalidad, la cepa atenuada comprende una mutación en uno o cada uno del os factores de virulencia, y/o uno o cada uno de los genes involucrados en el metabolismo de carbohidrato, y/o el gen involucrado en el metabolismo de fosfolípido, y/o el gen involucrado en el metabolismo de co-factor, y/o uno o cada uno de los genes involucrados en la transcripción o traducción, y/o uno o cada uno de los genes involucrados en el transporte de membrana, y/o uno o cada uno de los genes involucrados en la replicación, reparación o metabolismo de ADN, y/o el gen transposasa listado en el Cuadro 1.

En una modalidad, la cepa atenuada comprende una mutación en cada uno de los factores de virulencia.

Las mutaciones encontradas dentro de los genes P95, P69, P216, P146 así como también los genes de lipoproteína es muy probable que tengan un efecto en la atenuación ya que se ha descrito que esos genes están asociados con virulencia (Ferreira y de Castro et al., (2007). Genetic and Molecular Biology 30: p245-255).

En otra modalidad, la cepa atenuada comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o todas las mutaciones listadas en el Cuadro 2, solas o en combinación con al menos una mutación listada en el Cuadro 1, 3, 4 o 5.

En otra modalidad, la cepa atenuada comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44 o todas las mutaciones listadas en el Cuadro 3, solas o en combinación con al menos una mutación listada en el Cuadro 1, 2, 4 o 5.

En otra modalidad, la cepa atenuada comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o todas las mutaciones listadas en el Cuadro 4, solas o en combinación con al menos una mutación listada en el Cuadro 1 , 2, 4 o 5.

En otra modalidad, la cepa atenuada comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o todas las mutaciones listadas en el Cuadro 5, solas o en combinación con al menos una mutación listada en el Cuadro 1, 2, 3 o 4.

Cuadro 1 Mutaciones de atenuación dentro de genes de la cepa ts-19 de la vacuna de M. hyopneumoniae P número indica Secuencia de Referencia NCBI Cuadro 2 Mutaciones de atenuación dentro de la cepa ts-19 de vacuna de M. h o neumoniae. las cuales son silenciosas o están en la Cuadro 3 Mutaciones de eliminación en regiones sin codificación de la cepa ts-19 de la vacuna de M. hyopneumoniae 10 15 20 25 Cuadro 4 Mutaciones dentro de genes hipotéticos de la cepa ts-19 de vacuna de M. hyopneumoniae ** Estas proteínas hipotéticas han sido descritas como antígenos variables (Ferreira y de Castro, (2007) supra.

Cuadro 5 Eliminaciones dentro de genes hipotéticos de la cepa ts-19 de vacuna de M. hyopneumoniae DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se basa en la determinación de la secuencia de ácido nucleico de una cepa de M. hyo (ts-19) atenuada sensible a la temperatura. La alineación de estas cepas y otras ha permitido identificar la localización y naturaleza de mutaciones en la cepa atenuada.

Las mutaciones sensibles a la temperatura caen dentro de clases generales: aquellas que generan proteínas termolábiles; y aquellas que generan defectos en la síntesis, plegamiento o ensamble de proteína. En el caso de las proteínas termolábiles, los mutantes ts de un gen pueden ser expresados a un nivel más alto a la temperatura permitida (33°C para ts- 19) y a un nivel más bajo a la temperatura no permitida (39.5°C para ts-19).

Como se utiliza aquí, el término "mutación" se refiere a cualquier cambio detectable en el material genético, por ejemplo, ADN, ARN, ADNc o cualquier procedimiento, mecanismo o resultado de dicho cambio. Dichas mutaciones pueden ser mutaciones de punto (es decir, mutaciones en donde una o más bases dentro de la secuencia de ácido nucleico han sido reemplazadas por una base diferente), mutaciones de inserción (es decir, mutaciones en donde la longitud total de la molécula o gen de ácido nucleico ha sido incrementada por la inserción de una o más bases), mutaciones de eliminación (mutaciones en donde la longitud total de la molécula o gen de ácido nucleico ha sido reducida por la remoción de una o más bases) y mutaciones de inversión (mutaciones en donde una región de dos o más bases han sido giradas 180 grados), o combinaciones de éstas.

Una mutación en una región intergénica se refiere a una mutación ubicada en una región sin codificación de la molécula de ácido nucleico.

Los genes que comprenden una eliminación de menos de un codón total producirán una mutación de defase de marco de lectura. Esto dará como resultado un producto de gen que estará compuesto de aminoácidos que no tienen nada o tienen poca semejanza al a proteína original (nativa). Por lo tanto, la proteína será disfuncional. Esto impactará el papel de esa proteína así como posiblemente la estabilidad de de esa proteína ya que no será capaz de plegarse o ensamblarse correctamente. De esta manera, el nivel de expresión para esa proteína será reducido o eliminado, comparado con el tipo silvestre.

Una eliminación puede dar como resultado una terminación prematura de la expresión del producto de gen. Una vez más, la función y la estabilidad de esa proteína serán afectadas. Además de esto, la transcripción de ARNm truncado puede ser inestable y repetidamente degrada. De esta forma, el nivel de expresión de la proteína mutada será reducido o eliminado, comparado con el tipo silvestre.

La cepa ts-19 atenuada comprende numerosas eliminaciones que afectan a proteína de superficie tales como la proteína de membrana externa P95, P216, P146, P96 y lipoproteínas. Las proteínas de transporte de membrana también son afectadas por mutaciones de eliminación, las cuales harán que estos productos de gen sean disfuncionales. Así, si se compara la expresión de estos genes con la cepa parental, LKR, se puede esperar ver una diferencia marcada en los niveles de expresión de estas proteínas.

Una mutación causada por una substitución de base individual que da como resultado un cambio de aminoácido en marco puede alterar el plegamiento o ensamble de esa proteína y de esta manera, aunque puede ser sintetizada, puede no funcionar en una forma correcta. Dicha proteína también afecta la expresión de numerosos otros genes que pueden estar bajo el control o efecto de la proteína mutada.

En una modalidad, la presencia de una mutación en al menos un gen que codifica una proteína listada en el Cuadro 1 se detecta al analizar una cambio en la expresión de al menos una proteína. En una modalidad, el cambio en expresión es una reducción o ausencia de expresión. Los expertos en la técnica fácilmente pueden apreciar métodos para determinar si la expresión de una proteína es cambiada o reducida, por ejemplo, a través de métodos cuantitativos basados en anticuerpo, tales como tinción Western, radioinmunoensayo (RIA) y ensayos con inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISAs) en donde se utiliza un anticuerpo que detecta y se une a la proteína de interés. Además ya que los niveles de ARNm generalmente reflejan la cantidad de la proteína codificada del mismo, también se pueden utilizar métodos cuantitativos de ácido nucleico para determinar si el Micoplasma exhibe expresión reducida o ausencia de expresión de una o más proteínas. Por ejemplo, también se pueden utilizar métodos de reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) para medir la cantidad de ARNm que corresponde a una proteina particular de interés. Numerosos métodos cuantitativos a base de ácido nucleico son bien conocidos en la técnica. También son bien conocidos en la técnica métodos cualitativos a base de ácido nucleico (por ejemplo, análisis de tinción Northern).

En una modalidad, ya que ts-19 comprende una forma mutada de leucil-ARNt sintetasa y una forma eliminada de isoleucil-ARNt sintetasa, las cuales están involucradas en la síntesis de proteína, la síntesis de proteína total puede ser alterada en Micoplasma atenuado comparado con el Micoplasma de tipo silvestre. Por consiguiente en una modalidad, el método comprende analizar bacterias de Micoplasma para la síntesis de proteína total.

Con respecto a "reducción en expresión", la reducción comparada con el tipo silvestre puede ser de al menos aproximadamente 5% comparada con el tipo silvestre. En otras modalidades, la reducción en la expresión es por lo menos de aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 99%. En otra modalidad, la bacteria no exhibe expresión de una proteína expresada en la bacteria de tipo silvestre y de esta forma e porcentaje de reducción en la expresiones de 100%.

En una modalidad, la presencia de una mutación en al menos un gen que codifica una proteína listada en el Cuadro 1 o en una molécula de ácido nucleico listada en cualquiera de uno o más de ios Cuadros 2 a 5 se detecta al analizar a un nivel genético, es decir, analizando el ácido nucleico. Dicho análisis puede ser un análisis de PCR.

Tipos adecuados de ensayo de PCR incluyen PCR convencional, PCR múltiple, PCR cuantitativa (PCRq), PCR en tiempo real (RT-PCR), electroforesis capilar fluorescente (CE), análisis de curva de fusión de alta resolución (HRM), análisis de temperatura de fusión (Tm), repetición en tándem de número variable (VNTR) y tipificación de secuencia de sitios múltiples (MLST) y ensayo de extensión de iniciador de nucleótido individual.

El análisis de productos de PCR convencional serán dirigidos a expertos en la técnica y pueden incluir técnicas tales como análisis de secuencia de nucleótido, análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP), electroforesis de gel de gradiente de desnaturalización (DGGE) y análisis de polimorfismo de conformación de estructura de cadena individual (SSCP).

La amplificación de PCR puede realizarse al seleccionar iniciadores de PCR que flanquean la región de la mutación(es). Cada grupo de iniciador de PCR preferiblemente producirá solo una banda individual (amplicón). El tamaño del amplicón puede ser de un tamaño apropiado para el método de análisis basado en PCR.

Aunque en parte la invención se refiere a cambios entre la secuencia de ADN y una cepa de tipo silvestre de M. hyo y su cepa atenuada sensible a la temperatura, el hallazgo de que estas mutaciones estén enlazadas a atenuación es aplicable a todas las especies de Micoplasma que comprenden los mismos genes debido a la conservación de estas proteínas a través de la especie de Micoplasma .

El método de los primero y segundo aspectos y la batería atenuada de Micoplasma el tercer aspecto pueden referirse a cualquier especie de Micoplasma.

En una modalidad, las bacterias atenuadas se derivan de la bacteria de Micoplasma animal-patogénica. Como se utiliza aquí, el término "bacteria de Micoplasma animal-patogénica" significa una bacteria que, en su tipo silvestre, puede infectar y ocasionar enfermedad y/o trastorno en un animal. "Enfermedad y/o trastorno en un animal" incluye manifestaciones físicas adversas en un animal así como signo clínicos de enfermedad o infección indica solo por un diagnóstico histológico, microscópico y/o molecular. Bacterias de micoplasma animal-patogénicas incluyen bacterias de Micoplasma humanas- y no humanas-patogénicas. Las bacterias de Micoplasma humanas-patogénicas incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, bacterias del as especies de Micoplasma, M. genitalium, M. fermentans, M. salivarium, M. hominis, M. pneumonía, M. incognitus, M. penetrans, M. pirum, M. faucium, M. lipophilum , y M. buccale. Las bacterias de Micoplasma no humanas-patogénicas incluyen, p or ejemplo, bacterias de Micoplasma aviar-, porcina-, ovina-, bovina-, caprina- o canina-patogénica. Las bacterias de Micoplasma aviar-patogénica incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, bacterias de Micoplasma de las especie M. cloacale, M. gallinarum, M. gallisepticum, M. gallopavonis, M. glycophilum, M. iners, M. iowae, M. lipofaciens, M. meleagridis, y M. synoviae. Las bacterias de Micoplasma porcina-patogénica incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, bacterias de Micoplasma de las especies M. flocculare, M. hyopneumoniae, M. hyorhinis, y M. hyosynoviae . Las bacterias de Micoplasma ovina-, bovina-, caprina- o canina-patogénica incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, bacterias de Micoplasma de las especies M. capricolum subsp. capricolum, M. capricolum subsp. capripneumoniae, M. mycoides subsp. mycoides LC, M. mycoides subsp. capri, M. bovis, M. bovoculi, M. canis, M. californicum, y M. dispar.

En el método del segundo aspecto se somete una población inicial de bacterias de Micoplasma a condiciones de atenuación.

De acuerdo con este aspecto de la invención, la "población inicial de bacterias de Micoplasma" puede ser cualquier cantidad de bacterias de Micoplasma. Las bacterias, en ciertas modalidades son bacterias de tipo silvestre. Alternativamente, las bacterias pueden contener una o más mutaciones. En una modalidad, las bacterias en la población inicial son clonalmente idénticas o substancial y clonalmente idénticas, es decir, las bacterias de preferencia todas se derivan de una célula bacteriana de Micoplasma parental individual y/o tienen características genotípicas y/o fenotipicas idénticas o substancialmente idénticas.

Como se utiliza aquí, el término "condiciones de atenuación" significa cualquier condición o combinación de condiciones que tengan el potencial para introducir uno o más cambios genéticos (por ejemplo, mutaciones de nucleótido) en el genoma de una bacteria de Micoplasma. Condiciones de atenuación ilustrativas, no limitantes, incluyen, por ejemplo, hacer pasar las bacterias en cultivo, transformar las bacterias con un elemento genético que se puede insertar en el genoma tal como una transposón (por ejemplo, un transposón que aleatoriamente se inserta en el genoma de Micoplasma), exponer bacterias a uno o más mutágenos (por ejemplo, mutágenos químicos o luz ultravioleta), mutagénesis dirigida al sitio o eliminaciones, etc. Cuando las células bacterianas son atenuadas al hacer pasar in vitro, las células pueden hacerse pasar cualquier número de veces, por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, o más veces in vitro.

La población inicial de células de Micoplasma, después de ser sometidas a condiciones de atenuación, son denominadas aquí como una población bacteriana putativamente atenuada. Se pueden obtener clones individuales de la población bacteriana putativamente atenuada a través de técnicas microbiológicas individuales que incluyen, por ejemplo, diluir en serie las células y colocar las células individuales en placa sobre medios apropiados. Una vez obtenidos, los clones individuales de la población bacteriana putativamente atenuada son analizados para presencia de una mutación en al menos un gen que codifica una proteína listada en el Cuadro 1 o en una molécula de ácido nucleico listada en cualquiera de los Cuadros 2 a 5. Los métodos para determinar si una bacteria de Micoplasma atenuada comprende una mutación se describen aquí en cualquier parte. Los métodos ilustrativos incluyen, por ejemplo, métodos basados en RT-PCR, tinción Western, etc.

Se pueden probar clones individuales identificados por comprender al menos una de las mutaciones requeridas para virulencia mediante la administración de los clones a un animal que es susceptible a infección mediante la versión de tipo silvestre (no atenuada) de la bacteria. Como se utiliza aquí, "un animal que es susceptible a infección por una bacteria de Micoplasma de tipo silvestre" es un animal que muestra al menos un síntoma clínico después de ser atacado con una bacteria de Micoplasma de tipo silvestre. Dichos síntomas son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, en el caso de una cepa de M. hyo putativamente atenuada que exhibe una mutación en cada una de las proteínas listadas en el Cuadro 1 y cada una de las mutaciones listadas en los Cuadros 2 a 5, la cepa puede ser administrada a cerdos (los cuales son normalmente susceptibles a infección por M hyo de tipo silvestre). Los síntomas de infección por M hyo en cerdos incluyen, síntomas respiratorios agudos, y ganancia reducida de peso. De esta manera, si la cepa de M. hyo putativamente atenuada, cuando se administra a un cerdo, da como resultado síntomas que sean pocos y/o menos severos según comparado con un cerdo que ha sido infectado con una cepa de M. hyo de tipo silvestre, entonces se considera que la cepa de M. hyo putativamente atenuada tiene "virulencia atenuada". Cualquier grado de reducción en síntomas identificará la cepa putativamente atenuada por tener virulencia reducida. En ciertas modalidades, la cepa putativamente atenuada será no virulenta.

Las bacterias de Micoplasma atenuadas del tercer aspecto pueden ser utilizadas en una vacuna viva.

El término "paso en serie in vitro" se refiere a la práctica del paso repetido de las bacterias en el medio. Involucra inocular un medio de caldo con un cultivo bacteriano vivo, al cual después se le da tiempo para incubarse a la temperatura apropiada. Una porción del cultivo incubado después se usa para inocular un cultivo fresco estéril, al cual a su vez se la da algo de tiempo para incubarse. El ciclo continua para lograr el número deseado de pasos. Cada ronda de crecimiento y re-inoculación se denomina como un paso individual.

La composición inmunogénica del cuarto aspecto comprende las bacterias de Micoplasma atenuadas del tercer aspecto, esta composición inmunogénica puede ser utilizada con un vehículo adecuado en la vacuna del quinto aspecto.

Una vacuna es una preparación biológica que establece o mejora la inmunidad a una enfermedad particular. Las vacunas pueden ser profilácticas (por ejemplo, para evitar o mejorar los efectos de una futura infección por el patógeno), o terapéuticas (por ejemplo, para tratar la infección). La vacuna del quinto aspecto es profiláctica para una enfermedad causada por una bacteria de Micoplasma.

El vehículo apropiado será evidente para aquellos expertos en la técnica y dependerá en gran parte de la ruta de administración. La vacuna además puede comprender uno o más ingredientes adicionales, que incluyen, pero no se limitan a, agentes de suspensión, de estabilización, o de dispersión. Otros componentes adicionales que pueden estar presentes en la vacuna son adyuvantes, conservadores, estabilizadores químicos, u otras proteínas antigénicas. Típicamente, los estabilizadores, adyuvantes, y conservadores son optimizados para determinar la mejora formulación para eficacia en el animal objetivo. Los conservadores ilustrativos adecuados incluyen sorbato de clorobutanol potásico, ácido sórbico, dióxido de azufre, galato de propilo, los parabenes, etil vainillina, glicerina, fenol, y paraclorofenol. Los ingredientes adecuados de estabilización, que pueden ser utilizados, incluyen, por ejemplo, casaminoácidos, sacarosa, gelatina, rojo fenol, N-Z amina, difosfato monopotásico, hidrolizado de lactoalbúmina, y leche seca. Se utiliza un adyuvante convencional para atraer leucocitos o mejorar una respuesta inmune. Dichos adyuvantes incluyen, entre otros, MPL.TM (lípido A de monofosforilo 3-O-desacilado; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont ), aceite mineral y agua, hidróxido de aluminio, Amfigen, Avridina, L121 /escualeno, D-lactida-polilactida-glucósido, plurónicos plyois, dipéptido de muramilo, Bordetella aniquilada, tal como Quil A o Stimulon.TM. QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, Mass.) y toxina de cólera (ya sea en un tipo silvestre o forma mutante, por ejemplo, en donde el ácido glutámico en la posición 29 de aminoácido se reemplaza por otro aminoácido, de preferencia una histidina, de acuerdo con la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US99/22520).

En una modalidad, la vacuna, si se inyecta tiene poca o ninguna reacción adversa o no deseada en el sitio de la inyección, por ejemplo, irritación de la piel, hinchazón, salpullido, necrosis, sensibilización de la piel.

El sexto aspecto se refiere a protección contra enfermedad causada por Micoplasma. La vacuna del quinto aspecto es profiláctica para una enfermedad causada por Micoplasma.

"Profilaxis" o terapia "profiláctica" o "preventiva" o "protección contra" como se utiliza aquí, incluye mantener de que la infección ocurra o impedir o defender o proteger de la ocurrencia o severidad de una enfermedad causada por Micoplasma, incluyendo prevenir, proteger o disminuir la severidad de un síntoma o característica de la enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad, pero que aún no ha sido diagnosticado por tenerla. También incluye reducir el período de infección o incidencia de síntomas y reducir el tamaño de cualquiera de las lesiones.

"Profilaxis", como se utiliza aquí, cubre la prevención total de la enfermedad o una reducción en el grado o síntomas de la enfermedad. También se refiere a la reducción o inhibición de ia transmisión de Micoplasma o evitar que la bacteria se establezca en el huésped o protección contra una infección secundaria con otras cepas de Micoplasma u otros agentes infecciosos.

La vacuna del quinto aspecto puede ser preparada para administrarse a animales en la forma de, por ejemplo, líquidos, polvos, aerosoles, tabletas, cápsulas, tabletas o cápsulas cubiertas con capa entérica, o supositorios. Las rutas de administración incluyen, sin limitación, administración parenteral, administración intraperitoneal, administración intravenosa, administración intramuscular, administración subcutánea, administración intradérmica, administración oral, administración tópica, administración intranasal, administración ¡ntra-pulmonar, administración rectal, administración vaginal, y similares.

En una modalidad con relación a bacterias de Micoplasma, las cuales infectan el tracto respiratorio, la vacuna se formula para administrarse al tracto respiratorio, por ejemplo, a través de administración intranasal, administración en aerosol o administración a través de inhalación por la boca o nariz. Esta ruta de administración se prefiere debido a la naturaleza de inmunidad protectora para M. hyopneumoniae puede ser inmunidad local (pulmonar) e inmunidad mediada por célula para evitar la enfermedad en lugar de anticuerpos en circulación. La presentación de la vacuna al tracto respiratorio puede estimular una respuesta inmune local. Por lo tanto, la administración localizada de la vacuna puede ser más -efectiva. Además, al administrar la vacuna en un granero o espacio cerrado (administración de masa de rocío gruesa) y permitir que los cerdos la inhalen, reduce el trabajo involucrado en la vacunación de grandes números de animales. Actualmente la vacunación en aerosol (o vacunación por rocío) se utiliza en una base comercial para vacunar efectivamente aves contra ciertas enfermedades y también es adecuada para vacunar cerdos.

La administración nasal cubre cualquier administración a través de los pasajes nasales u hocico. La vacuna puede ser aplicada a la cavidad nasal como una solución, suspensión o polvo seco. Las soluciones y suspensiones pueden ser administradas intranasalmente utilizando, por ejemplo, una pipeta, un gotero o un espray, opcionalmente un espray en aerosol. Los polvos secos pueden ser administrados intranasalmente a través de inhalación.

La administración en aerosol se refiere a la administración de la vacuna como una suspensión de partículas sólidas finas o gotas líquidas en un gas.

La inhalación (también conocida como inspiración) es el movimiento del aire a partir del ambiente externo, a través de las vías respiratorias y hacia los alveolos en los pulmones.

Una dosis efectiva de vacuna a ser empleada terapéuticamente dependerá de, por ejemplo, los objetivos terapéuticos, la ruta de administración, y la condición del animal.

Los niveles de dosis para la vacuna usualmente serán del orden de aproximadamente 103 a 108 unidades de cambio de color (CCU) por mi por dosis, y de preferencia de aproximadamente 104 a 107 CCU por mi por dosis.

Sin embargo, se entenderá que el nivel de dosis específico para cualquier animal porcino particular dependerá de una variedad de factores incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso del cuerpo, salud en general, sexo, dieta, tiempo de administración y ruta de administración.

La selección y ajuste ascendente y descendente de la dosis efectiva están dentro de la experiencia de la técnica.

La información sobre mutaciones en bacterias de Micoplasma que hace que una cepa atenuada permita la determinación de si un animal está infectado con una cepa de Micoplasma atenuada o virulenta.

Las cepas de tipo silvestre infectan animales y si son cepas virulentas entonces pueden ocasionar enfermedad como tales o preparar la forma para infecciones secundarias bacterianas y/o virales.

Después de la infección, tanto la cepa de vacuna como cualquier cepa de Micoplasma de tipo silvestre (a través de infección mediante exposición natural) pueden ser recuperadas del animal. La detección puede hacerse a través de PCR. El organismo puede ser extraído directamente de tejidos infectados (por ejemplo, de pulmón o tráquea) y experimentar la detección a través de PCR. El organismo recuperado del animal puede ser cultivado in vitro, primero para permitir que el organismo crezca de manera que más copias del organismo estarán presentes para incrementar la efectividad de los métodos de detección (por ejemplo, a través de PCR o mediante métodos bioquímicos o serológicos para identificación) .

Con respecto al análisis de los inicios de la infección, el método del noveno aspecto puede determinar si el inicio se debió o no a una cepa de vacuna. Es decir, si un animal ha sido vacunado con una vacuna de Micoplasma y rápido desarrolla la enfermedad, el sujeto puede ser analizado para determinar si es la vacuna o si es una cepa virulenta de tipo silvestre la responsable de la infección. Esto es particularmente importante en una ubicación de granja.

El noveno y décimo aspectos proporcionan equipos que comprenden iniciadores o sondas para detectar mutaciones relacionadas con la atenuación.

En una modalidad, los iniciadores son MHP-2F (SEC ID NO: 1) y MHP-2R (SEC ID NO: 2).

En otra modalidad, los iniciadores son MHP-9/10-2F (SEC ID NO: 3) y MHP-9/10-2R (SEC ID NO: 4).

En una modalidad, el equipo comprende sondas de oligonucleótido que hibridizan con el gen mutado o molécula de ácido nucleico. Las sondas pueden ser marcadas con un agente de marcación radioactivo o no radioactivo, éste último comprende biotina convencional, Dlg (digoxigenina), FRET (transferencia de energía de resonancia de fluorescencia) o colorante fluorescente (Cy5 o Cy3). Además, los oligonucleótidos pueden ser utilizados como iniciadores para amplificación de PCR. En este caso, el equipo puede contener polimerasa de ADN, 4 dNTPs y regulador de pH de PCR para la reacción de PCR. Además, los oligonucleótidos pueden ser unidos a una micro-disposición como sondas. En este caso, el equipo puede contener un regulador de pH de reacción de hibridación, el equipo de PCR conteniendo iniciadores para amplificar un gen objetivo, solución de lavado para el ADN no hibridizado, colorantes, solución e lavado para colorantes no unidos y lámina manual para la micro-disposición.

En una modalidad, las sondas pueden ser una combinación de más de una sonda capaz de detectar simultáneamente más de una mutación de una muestra individual. Prácticamente, las sondas se optimizaron para h i brid izar simultáneamente con múltiples ADNs de mutación objetivo de Micoplasma bajo las mismas condiciones de hibridación y lavado.

En una modalidad, el equipo proporciona una micro-disposición que comprende un grupo de sondas para detectar una o más mutaciones, las cuales pueden detectar simultáneamente muchas mutaciones a partir de una sola muestra con un solo experimento.

A través de esta especificación, a menos que el contexto requiera de otra cosa, la palabra "comprende", o variaciones tales como "comprender" o "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de un elemento o entero o grupo de elementos o enteros establecidos, pero no la exclusión de ningún otro elemento o entero o grupo de elementos o enteros.

También se debe observar que, como se utiliza en la presente especificación, las formas singulares "un", "una(o)" y "el (la)" incluyen los aspectos plurales a menos que el contexto dicte otra cosa.

Será evidente para los expertos en la técnica que aunque la invención ha sido descrita con algún detalle p ara los propósitos de claridad y entendimiento, se pueden hacer varias modificaciones y alteraciones a las modalidades y métodos aquí descritos sin apartarse del alcance del concepto inventivo descrito en esta especificación.

Todas las referencias, incluyendo patentes o solicitudes de patente, citadas en esta especificación se incorporan aqui para referencia. Se entenderá claramente que, aunque un número de publicaciones de la técnica anterior se denomina aquí, esta referencia no constituye una admisión de que cualquiera de estos documentos forme parte del conocimiento general común en la técnica.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A-C muestran la exacta naturaleza y ubicación de mutaciones en la cepa de vacuna ts-19 de M. hyo (maestra y P12) comparado con la cepa J de M. hyo depositada como NC_007295.1 y la cepa LKR de M. hyo.

Las Figuras 2A-D muestran el perfil de fusión de alta resolución (HRM) del genoma objetivo, MHP2, en el modo de gráfica normalizado. (A) de la cepa MHP, Vaxsafe®, la cepa parental de MHP, VaxsafeOm y una cepa de campo aislado de M. hyo, (B) HRM de la cepa MHP, Vaxsafe® y la cepa parental de MHP, Vaxsafe®, (C) HRM de la cepa MHP, Vaxsafe®, y una cepa de aislado de campo, (D) gráfica de Diferencia, en donde las cepas de tipo silvestre han sido normalizadas de manera que puede observarse cualquier desviación desde el tipo silvestre.

Las Figuras 3A y B muestran el perfil de fusión de alta resolución (HRM) del genoma objetivo MHP9/10 en el modo de gráfica normalizada para la cepa de vacuna MHP, Vaxsafe®, y la cepa parental. (B) Gráfica de diferencia en donde la cepa de vacuna ha sido normalizada de tal manera que se puede observar cualquier desviación a partir de la vacuna.

Las Figuras 4A y B muestran el perfil de fusión de alta resolución (HRM) del genoma objetivo MHP9/10 en el modo de gráfica normalizada para la cepa de vacuna MHP, Vaxsafe®, cepa parental y una mezcla de estas dos cepas. (B) Gráfica de diferencia en donde la cepa de vacuna ha sido normalizada de manera que se pueden observar cualquier desviación a partir de la cepa de vacuna.

La invención ahora se describe más con detalle al hacer referencia a los siguientes ejemplos. Los ejemplos se proporcionan solo para propósitos de ilustración, y no pretenden ser limitantes a menos que se especifique otra cosa. De esta manera, la invención abarca cualquiera y todas las variaciones que se hacen evidentes como resultado de la enseñanza aquí provista.

Ejemplo 1: Preparación de la Cepa de Vacuna El aislado, L R, de Mycoplasma hyopneumoniae australiano es un espécimen de matadero de pulmón de cerdo que exhibe la enfermedad de neumonía enzoótica típica (Lloyd y Etheridge (1981), J. Comp. Path. 91:77-83). El asilado se cultivó y se almacenó en la colección de cultivo de referencia de Mycoplasma hyopneumoniae en la Universidad de Adelaide, Sur de Australia. Subsecuentemente se obtuvo un cultivo de este aislado a través del grupo de Mycoplasma hyopneumoniae en la Universidad de Melbourne, Victoria.

El cultivo se hizo pasar in vitro tres veces antes de ser sometido a mutagénesis utilizando N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) a 200 mg/ml utilizando un método descrito previamente (Nonamura e Imada (1982) Avian Diseases 26:763-775). En resumen, se hizo crecer un cultivo de la cepa LKR de Mycoplasma hyopneumoniae p ara retrasar la fase de registro (log) y se formó a pellas a través de centrifugación. Las células se lavaron en salina regulada en su pH de fosfato (PBS) y se expusieron a NTG. Las células se formaron a pellas y se volvieron a suspender en un medio Friis modificado (Friis, N.F. 1975) y se incubaron a 33°C durante 4 horas. El cultivo después se hizo pasar a través de un filtro de 0.45 pm, se hicieron diluciones apropiadas y las alícuotas se colocaron sobre placas de agar y se incubaron a 33°C. Las colonias que se desarrollaron se clonaron en 3 mi de caldo y se incubaron a 33°C. Las ampollas de los clones se almacenaron a -70°C y se determinó la sensibilidad a la temperatura de cada clon.

La sensibilidad a la temperatura de ts-19 se determinó al realizar una titulación por duplicado e incubación a 33°C y 39.5°. La titulación es típicamente >1 x 10B CCU/ml a 33°C y <1 x 1 O2 CCU/ml a 39.5°C.

La cepa ts-19 se depositó bajo el Tratado de Budapest como NM 04/41259. Se utilizó en MHP Vaxsafe®, una vacuna sensible a la temperatura atenuada para protección contra infección por M. hyopneumoniae en cerdos.

Ejemplo 2: Secuenciación y análisis Se realizó secuenciación de genoma entero para tres cepas de M. hyopneumoniae (cepas de vacuna ts-19 Maestra, ts-19 P12 y la cepa parental LKR). La secuenciación se condujo utilizando la tecnología de secuenciación 454 (Roche). Se realizó un mínimo de 15X coberturas por lectura para cada uno de los tres genomas secuencíados. Para cada genoma separado, se dedujo una secuencia de consenso a partir de cada grupo de lecturas. Las lecturas de traslape para cada genoma se alinearon en varios cóntigos (o contigs, clones contiguos) grandes. Los cóntigos derivados de la cepa de vacuna se determinaron a través de alineación de secuencia para tener una alta homología para la secuencia de la cepa J de M. hyopneumoniae (NC_007295.1 ).

Los cóntigos grandes de cada cepa después se alinearon contra la secuencia de la cepa J y subsecuentemente se identificaron los huecos dentro de las secuencias ts-19 o LKR. Se diseñaron y sintetizaron varios iniciadores de PCR que extienden los huecos. Las secuencias de iniciador se basaron en una combinación de secuencia generada a partir de la vacuna o la cepa LKR o de la secuencia de la cepa J disponible en la base de datos de nucleótido (GENBANK, NC_007295.1 ). Los iniciadores también se utilizaron para amplificar, mediante PCR, las regiones objetivo. Después se secuenciaron los amplicones de PCR. Las secuencias generadas a partir de las lecturas de traslape que extienden las regiones de hueco después fueron alineadas en un contigo (contig) hasta que los huecos se unieron como puente y toda la secuencia de genoma subsecuentemente se completó.

Una vez que todas las secuencias de genoma de ts-19 (Maestra y P12) así como la cepa parental, LKR, se completaron, las tres secuencias después fueron alineadas contra el genoma completo de la cepa J en una alineación de secuencia múltiple.

A partir de la alineación de secuencia múltiple, las bases de nucleótido que fueron substituidas, eliminadas o insertadas tanto de los genomas ts-19 Maestra como P12 cuando se comparó con ambas secuencias de la cepa LKR y la cepa J se identificaron como mutaciones. Estas mutaciones fueron categorizadas como cambios dentro de genes conocidos, genes hipotéticos, o regiones intergénicas o sin codificación. Las proteínas cosificadas por los genes mutados se listan en el Cuadro 1. Otras mutaciones se listan en los Cuadros 2 a 5. La exacta naturaleza y ubicación de las mutaciones se muestra en la Figura 1.

Ejemplo 3: Selección de Mycoplasma atenuado novedoso La selección de una vacuna novedosa de Mycoplasma hyopneumoniae u otro candidato(s) de vacuna sp de Micoplasma puede hacerse al clasificar clones para uno o más genes, que han sido mutados en ts-19.

Después de la mutagénesis y selección de ts, un clon, ts, de Micoplasma puede desarrollarse en el cultivo y el organismo sometido a extracción de ARNm utilizando métodos estándares. El ARNm será convertido a ADNc utilizando transcriptasa inversa. La cepa parental también será desarrollada en cultivo y el organismo sometido a extracción de ARNm. El ARNm será convertido a ADNc.

El ADNc de cada uno del clon ts y la cepa parental será utilizado en reacciones de PCR separadas que tienen como objetivo uno o más de los genes mutados identificados en ts-19. El amplicón(es) de PCR resultante será impreso sobre portaobjetos de micro-disposición. Se preparan dos portaobjetos abarcando la disposición de productos de PCR del clon ts y se preparan otros dos portaobjetos para abarcar la disposición de productos de PCR parentales.

El ADNc entero de genoma del clon ts después se acopló a éster de colorante Cy (por ejemplo, Cy3) y el ADN entero de genoma del parental se acopló a otro éster de colorante Cy (por ejemplo, Cy4).

El ADNc marcado con Cy3 se hibridizó a cada uno de los portaobjetos de la micro-disposición (un clon ts uno parental).

Similarmente, el ADNc marcado con Cy4 se hibridizó a cada uno de los portaobjetos de micro-disposición (un clon ts y uno parental). Se analizó la expresión diferencial basándose en la resistencia de señal de hibridación y color, el cual fue reflexivo de los niveles de expresión de gen.

Ejemplo 4: Distinción entre ts-19 y otro M. hyo en el campo Se sometió una muestra de campo (por ejemplo, torunda nasal o tejido de pulmón recuperado del cerdo infectado) a amplificación de PCR utilizando un grupo específico de iniciadores. Cada grupo de iniciador se diseñó para flanquear un diferente lado de mutación identificado como único a la cepa de vacuna ts-19. El amplicón de PCR puede ser analizado a través de técnicas de detección de mutación tales como: Electroforesis Capilar Fluorescente (CE): Para las mutaciones de eliminación e inserción, la CE fluorescente puede ser una técnica adecuada de detección de mutación para emplear. En este caso, los iniciadores de PCR cada uno podrían ser marcados con fluoroforo diferente y utilizarse en una reacción de PCR. La muestra de campo (prueba) así como una muestra de ts-19 (control positivo) experimentó amplificación de PCR. Los productos de PCR generados a partir de la muestra de prueba de campo y el control positivo (ts-19) se sometieron a electroforesis capilar, en donde la separación del producto de PCR se basó en el tamaño. La CE puede identificar cambios en el tamaño de amplicón que resulta de una eliminación o inserción individual (o múltiple) de base de nucleótido. Por lo tanto, una amplicón de PCR de la cepa de vacuna puede tener una posición pico, la cual será diferente al amplicón de PCR generado a partir de la muestra de campo. Si están presentes tanto la vacuna ts-19 como una cepa de campo en la muestra, entonces se observarán do distintos picos.

Polimorfismo de conformación de estructura de cadena individual (SSCP): El análisis de polimorfismo de conformación de estructura de cadena individual (SSCP) es una técnica sensible para la detección de mutación. El principio del análisis de SSCP se basa en el hecho de que el ADN de estructura de cadena individual tiene una conformación definida. La conformación alterada debido a un cambio de base individual en la secuencia puede ocasionar que el ADN de estructura de cadena individual emigre de manera diferente bajo condiciones de electroforesis sin desnaturalización. Por lo tanto, la PCR de la cepa de vacuna ts-19 (control positivo) y aquella de la muestra(s) de prueba de campo presentarán diferentes patrones de bandas.

El SSCP puede ser aplicado para cambios, eliminaciones e inserciones de base. Una o más regiones de mutación pueden ser amplificadas mediante PCR utilizando un iniciador radioactivamente marcado (por ejemplo, marcado con P33). Se analizó una muestra de amplicón de control positivo, ts-19, en una forma idéntica a la muestra de prueba de campo. Los amplicones de ADN de estructura de cadena doble experimentan desnaturalización (es decir, exposición a calor y álcali) y dará como resultado moléculas de ADN de estructura de cadena individual, las cuales son inmediatamente sometidas a separación por electroforesis bajo condiciones sin desnaturalización. Después de la electroforesis, el gel será secado sobre un papel filtro (por ejemplo, Whatmann) y después se expone a una película autorradiográfica. Después del desarrollo de la autorradiografía, los patrones de bandas de la muestra de campo se compararon con aquellos de la muestra de control positivo, ts-19. Un patrón idéntico de bandas al patrón ts-19 indicó que la muestra es la cepa de vacuna, ts-19. Un patrón diferente de bandas indica que la muestra no es ts-19.

El método de SSPC también puede ser aplicado en un formato no radioactivo.

Análisis de Curva de Fusión de Alta Resolución (HRM): El análisis de curva de HRM será aplicable para mutaciones que involucran substituciones, eliminaciones e inserciones de base. En este caso la muestra de prueba de campo asi como la muestra de control positivo de ts-19 se sometieron a amplificación de PCR en tiempo real (RT) de una única región (que contiene mutación) utilizando un secuenciador de ciclo. La máquina de PCR usada será capaz de realizar el análisis de curva de HRM. Al término del ciclo de amplificación de PCR, el amplicón de PCR se sometió a un análisis de curva de HRM conducido por la máquina de PCR. El amplicón de ts-19 mostró una presentación de curva de fusión distinguida comparada con el amplicón de cepa de campo.

Ejemplo 5: Análisis de HRM para MHP Vaxsafe® Con base en los datos de mutación del Ejemplo 2, se desarrollaron dos ejemplos de ensayos de curva de fusión de alta resolución (HRM) que fueron capaces de distinguir entre la cepa de vacuna MHP Vaxsafe® y otras cepas de M. hyo, incluyendo la cepa parental de vacuna. Sin embargo, cualquiera de los cambios mutacionales presentes dentro de la cepa de vacuna puede ser utilizado como objetivos para el análisis de HRM.

Se eligieron dos regiones dentro del genoma de vacuna como un ejemplo para el análisis de HRM. Estas regiones se designaron como MHP2 y MHP9/10. MHP2 es un ejemplo de HRM que tiene como objetivo una mutación individual (Figura 1B y C, número de mutación 2). MHP9/10 es un ejemplo de HRM que tiene como objetivo dos mutaciones (Figura 1B y C, números de mutación 9 y 10). Se utilizó una unidad de "Rotor Gene Q" de Qiagen con 2 o 5 Plex y capacidad de HRM, en este trabajo, junto con el equipo Type-it® HRM™. En resumen, HRM es una técnica de pos-PCR que puede ser utilizada para exploración de mutación y genotificación. El método no requiere de manipulación de pos-PCR y de esta manera reduce al mínimo el riesgo de contaminación cruzada. Además no existe ningún paso de separación involucrado y esto reduce el tiempo del análisis.

Se condujo el análisis HMR en muestras de ADN tales como muestras clínicas (por ejemplo, torundas o preparaciones de tejido) cultivadas para M. hyopneumoniae en un medio de caldo selectivo para reducir al mínimo el crecimiento de organismos contaminantes. El ADN después se extrajo de las muestras cultivadas de M. hyo. El ADN purificado se normalizó para todas las muestras de prueba.

Ejemplo 5a: MHP2 Objetivo: Los grupos de iniciadores (MHP-2F y MHP-2R) se seleccionaron para amplificar una región de 151 bp del genoma de M. hyopneumoniae.

Reacción de PCR Se condujeron reacciones de HRM por triplicado. Cada reacción contuvo lo siguiente: Mezcla Súper de PCR HRM 12.5 µ? Agua libre de nucleasa 9.75 µ? Iniciador de Avance (10 pmol/µ?) 0.9 µ? Iniciador Inverso (10 pmol/µ?) 0.9 µ? Plantilla de ADN (70 pg/µ?) 1 µ? Se surtieron los reactivos requeridos (ver anteriormente) en tubos de PCR de 0.1 mi y se sometieron a un ciclo térmico Condiciones de ciclo térmico: Resultados Se realizó el análisis de HRM en ADN extraído de cultivos puros ya sea de la vacuna o de otras cepas de M. hyo. Se realizaron reacciones individuales ya sea en ADN de cada cepa o en mezcla de ADN de diferentes cepas.

Los perfiles de HRM de MHP2 objetivo para la cepa de vacuna MHP Vaxsafe® y dos de M. hyo de tipo silvestre (cepa de vacuna parental y una cepa aislada de campo) se muestran en la Figura 2 (A, B y C). El HRM exhibió un patrón de fusión que empezó su separación a aproximadamente 75.2°C y finalizó a aproximadamente 77.4°C. La cepa de vacuna mostró un perfil de fusión de temperatura más bajo, dando como resultado su separación de ambas cepas de tipo silvestre (la cepa parental de MHP Vaxsafe® y la cepa aislada de campo). Las cepas de tipo silvestre se mantuvieron a un nivel más alto de fluorescencia durante un período más largo de tiempo que la cepa de vacuna dando como resultado un perfil de fusión que se desplazó hacia la derecha. Este desplazamiento puede ser utilizado para distinguir entre la cepa de vacuna y otras cepas de M. hyo de tipo silvestre.

Los perfiles de HRM de las cepas de M. hyo de tipo silvestre fueron idénticos como se muestra por sus perfiles de traslape (Figura 2A). Los perfiles traslapados se muestran en forma separada en la Figura 2B y C. La Figura 2D muestra los mismos datos utilizando una "gráfica de diferencia", la cual muestra una clara separación entre la cepa de vacuna y las cepas de tipo silvestre. La gráfica de diferencia se creó al definir la cepa de vacuna como la referencia. Los niveles de fluorescencia de las cepas de tipo silvestre después se normalizaron a -cero y cualquiera de las desviaciones del estándar de tipo silvestre se registraron en la gráfica de diferencia.

Ejemplo 5b: MHP9/10 Objetivo Se seleccionaron los grupos de iniciador (MHP-9/10-2F y MHP-9/10-2R) para amplificar una región de 160 bp del genoma de M. hyopneumoniae.

Reacción de PCR Se condujeron reacciones de HRM por triplicado. Cada reacción contuvo lo siguiente: Mezcla Súper de PCR HRM 12.5 µ? Agua libre de nucleasa 9.75 µ? Iniciador de Avance (10 pmol/µ?) 0.9 µ? Iniciador Inverso (10 pmol/µ?) 0.9 µ? Plantilla de ADN (70 pg/µ?) 1 µ? Se surtieron los reactivos requeridos (ver anteriormente) en tubos de PCR de 0.1 mi y se sometieron a un ciclo térmico Condiciones de ciclo térmico: Los perfiles de HR; de MHP9/10 objetivo para la cepa de vacuna MHP Vaxsafe® y la cepa parental se muestran en la Figura 3A. El HRM exhibió un patrón de fusión que comenzó la separación a aproximadamente 73.7°C y finalizó a aproximadamente 77.0°C. La cepa de vacuna mostró un perfil de fusión de temperatura más alto, dando como resultado su diferenciación de la cepa parental. La cepa de vacuna se mantuvo a un nivel más alto de fluorescencia durante un período más largo de tiempo que el de la cepa parental dando como resultado un perfil de fusión que se desplazó hacia la derecha. Este desplazamiento puede ser utilizado para distinguir entre la cepa de vacuna y la cepa parental. La Figura 3B muestra los mismos datos utilizando una "gráfica de diferencia", la cual muestra una clara separación entre la cepa de vacuna y la cepa parental.

Se mezclaron el ADN tanto de la cepa de vacuna MHP Vaxsafe® y una cepa LKR de M. hyo parental en una relación de 1:1 y se sometieron a análisis de HRM para MHP9/10 objetivo. En el mismo análisis, el ADN de cada cepa también se sometió a análisis de HRM. Los perfiles (Figura 4A) exhibieron el mismo patrón de fusión como se describió anteriormente para MHP9/10 objetivo, permitiendo la distinción entre la cepa de vacuna y la cepa parental. Los perfiles de HRM del ADN de M. hyo mezclado (cepas de vacuna y parental), mostrados en la Figura 4(A), exhibieron un patrón de fusión, el cual es diferente tanto del ADN de las cepas de vacuna individual como parental. En la gráfica de diferencia (Figura 4B), la cepa de vacuna se normalizó, de manera que se pudieron observar cualquiera de las desviaciones a partir de la vacuna. En las gráficas de diferencia, la vacuna puede distinguirse de la cepa de tipo silvestre, pero la muestra de mezcla exhibió un perfil de fusión totalmente diferente tanto de la cepa de tipo silvestre como de la de vacuna (Figura 4B).

Conclusiones Se seleccionaron 2 ejemplos para demostrar que el análisis de curva de HRM puede ser utilizado como una herramienta para la diferenciación entre la cepa de vacuna MHP Vaxsafe® y otras cepas de tipo silvestre de M. hyo, incluyendo la cepa parental de vacuna. El Ejemplo 5a demuestra la diferenciación basada en una base de nucleótido individual. El Ejemplo 5b demuestra la diferenciación basada en dos cambios de base de nucleótido. El análisis de HRM subsecuentemente puede ser utilizado para tener como objetivo cualquiera de los numerosos cambios mutacionales presentes en la cepa de vacuna como un medio para la diferenciación de animales infectados de los vacunados (DIVA). Un análisis de HRM individual puede tener como objetivo mutaciones tanto individuales como múltiples. Para cada mutación(es) , se puede designar el iniciador de avance en cualquier parte dentro de una región de 500 bp corriente arriba del sitio(s) de mutación. El iniciador inverso puede ser designado en cualquier parte dentro de una región de 500 bp corriente abajo del sitio(s) de mutación. De preferencia, el amplicón utilizado debe tener un tamaño de entre 50 - 200 bp.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un método para identificar una bacteria de Micoplasma atenuado, el método comprende analizar bacterias de Micoplasma para la presencia de una mutación en al menos un gen que codifica una proteína listada en el Cuadro 1 o en una molécula de ácido nucleico listada en cualquiera de los Cuadros 2 a 5, en donde la presencia de la mutación indica que el Micoplasma está atenuado.

2. Un método para generar un Micoplasma atenuado, el método comprende someter una población inicial de bacterias de Micoplasma a condiciones de atenuación, produciendo así una población bacteriana putativamente atenuada y analizar clones individuales de la población bacteriana putativamente atenuada para la presencia de una mutación en al menos un gen que codifica una proteína listada en el Cuadro 1 o en una molécula de ácido nucleico listada en cualquiera de los Cuadros 2 a 5, en donde la presencia de la mutación indica que el Micoplasma está atenuado.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, que comprende analizar una combinación de mutaciones en genes que codifican proteínas listadas en el Cuadro 1 y/o en las moléculas de ácido nucleico listadas en cualquiera de los Cuadros 2 a 5.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la combinación de mutaciones comprende una mutación en al menos dos de P85, P69, P216 y gen de lipoproteína en el Cuadro 1.

5. Una bacteria de Micoplasma atenuado cuando se selecciona a través del método de la reivindicación 1, o cuando se genera a través del método de la reivindicación 2.

6. Una composición inmunogénica que comprende la bacteria de Micoplasma atenuado de la reivindicación 5.

7. Una vacuna de Micoplasma, que comprende la composición inmunogénica de la reivindicación 6.

8. Un método para producir inmunidad protectora contra una enfermedad causada por Micoplasma en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto una cantidad protectora del Micoplasma atenuado de la reivindicación 5, la composición inmunogénica de la reivindicación 6 o la vacuna de la reivindicación 7.

9. Un método para determinar si un animal está infectado con una cepa atenuada o virulenta de Micoplasma, el método comprende analizar una muestra del animal que comprende un Micoplasma para la presencia de una mutación en al menos un gen que codifica una proteína listada en el Cuadro 1 o en una molécula de ácido nucleico listada en cualquiera de los Cuadros 2 a 5, en donde la ausencia de la mutación indica que el animal está infectado con Micoplasma virulento.

10. Un método para distinguir animales vacunados con una cepa de Micoplasma atenuado de aquellos infectados con Micoplasma, el método comprende analizar una muestra de un animal que comprenda un Micoplasma para la presencia de una mutación en al menos un gen que codifica una proteína listada en el Cuadro 1 o en una molécula de ácido nucleico listada en cualquiera de los Cuadros 2 a 5, en donde la presencia de la mutación en la muestra indica que el animal de donde se tomó la muestra ha sido vacunado con una vacuna de Micoplasma atenuado.

11. Un equipo que comprende un iniciador o sonda específica para una mutación en al menos un gen que codifica una proteína listada en el Cuadro 1 o en una molécula de ácido nucleico listada en cualquiera de los Cuadros 2 a 5, en donde los iniciadores o sondas son capaces de diferenciar la cepa de M. hyopneumoniae atenuado de todas las otras cepas de M. hyopneumoniae cuando se utiliza en cualquiera de los métodos de las reivindicaciones 1, 9 ó 10.

12. Un equipo que comprende iniciadores o sondas específicas para al menos una mutación mostrada en la Figura 1, dichos iniciadores o sondas son capaces de la diferenciación de la cepa de M. hyopneumoniae a tenuado a partir de otras cepas de M. hyopneumoniae cuando se utilizan en cualquiera de los métodos de las reivindicaciones 1, 9 o 10.

13. El equipo de acuerdo con la reivindicación 12, en donde los iniciadores comprenden SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4.