KR100965289B1 - １６Ｓ ｒＤＮＡ 유전자를 이용한 보르데텔라근연종으로부터 보르데텔라 페르투시스 감별을 위한 ＰＣＲ기법 및 이를 위한 ＰＣＲ 프라이머 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 보르데텔라 근연종으로부터 보르데텔라 페르투시스( Bordetella pertussis)의 감별을 위한 PCR 기법 및 이를 위한 PCR 프라이머를 제공한다. 본 발명에 의하면 16S rDNA 유전자를 이용하여 설계된 16S-F2/R1(서열번호 2 및 서열번호 3) 프라이머 세트를 제공하여 보르데텔라 홀메시(B. holmesii)를 포함한 보르데텔라 근연종으로부터 백일해 원인균인 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis)를 신속, 정확하게 감별할 수 있다.
백일해, PCR, 프라이머, 보르데텔라 페르투시스, 보르데텔라 홀메시

Description

１６Ｓ ｒＤＮＡ 유전자를 이용한 보르데텔라 근연종으로부터 보르데텔라 페르투시스 감별을 위한 ＰＣＲ 기법 및 이를 위한 ＰＣＲ 프라이머{PCR method for identification of Bordetella pertussis from closely related Bordetella species using 16S rDNA and PCR primer therefor}
본 발명은 보르데텔라 근연종으로부터 보르데텔라 페르투시스의 감별을 위한 PCR 기법 및 이를 위한 PCR 프라이머에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 16S rDNA 유전자를 이용하여 보르데텔라 홀메시(B. holmesii)를 포함한 보르데텔라 근연종으로부터 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis)를 신속, 정확하게 감별할 수 있는 PCR 기법 및 이를 위한 PCR 프라이머에 관한 것이다.
백일해는 원인균인 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis)에 의해 인후부가 감염되어 발병되는 급성질환으로 유·소아에서 주로 발병되는 전염병이다. 감염 후에는 평균적으로 7일간의 잠복기를 거쳐 카타르기, 경해기, 회복기의 3단계 임상 증상을 나타내며 회복된다. 카타르기는 발병 후 1-2주간 지속하며 콧물, 결막염, 눈물, 경미한 기침, 미열 등의 가벼운 감기증세를 나타내고, 경해기는 발병 후 2주말부터 시작되어 약 2-4주간 지속하는데, 특징적인 발작성 기침이 1분 이상 지속하며 기침 끝에 구토와 점액성 가래를 동반하게 된다. 또한 기침에 의한 호흡곤란으로 청색증을 유발하기도 한다. 회복기는 경해기 이후 기침의 정도와 빈도가 1-2주에 걸쳐 점차적으로 감소하면서 회복되는 시기이다. 백일해에 의한 사망은 주로 호흡기계 합병증에 의한 것으로 알려져 있으며, 특히 폐렴은 백일해에 의한 사망 중 약 54%를 차지하는 중요 원인이다. 이외에 무기폐, 저산소증, 백일해 독소에 의한 급성 뇌증, 중이염, 구토에 의한 영양부족 및 탈수, 발작성기침에 의한 기흉, 탈장, 비출혈, 경막하출혈 등의 주요 합병증상을 나타낸다 (Chapter 8 Pertussis in VPD Surveillance Manual (3rd Edition), 2002, CDC).
상기와 같이 백일해는 세균성 감염에 의한 호흡기 질환으로 특히 유아들에 있어 심각하다. 높은 백일해 발생률은 1980년대까지 보고됐으나(1,928,384건/년), 1940년대부터 시작된 백신화 운동에 의해 발생률은 점차 감소하였다. 그러나 1990 ~ 2000년에 미국, 네덜란드, 일본, 호주와 같은 백신화가 잘 되어 있는 국가에서 백일해의 국지적 발병증가가 보고됐다 (de Melker HE, Schellekens JFP, Neppelenbroek SE, Mooi FR, Rumke HC, Conyn-van Spaendonck MAE: Reemergence of pertussis in the highly vaccinated population of the netherlands: Observations on surveillance data. Emer Inf Dis, 2000, 6:348-357; de Melker HE, Conyn-van Spaendonck MAE, Rumke HC, van Wijngaarden JK, Mooi FR, Schellekens JFP: Pertussis in the netherlands: an outbreak despite high levels of immunization with whole-cell vaccine. Emer Inf Dis, 1997, 3:175-178; Mooi FR, van Loo IHM, King AJ: Adaptation of Bordetella pertussis to vaccination: A cause for its reemergence? Emer Inf Dis, 2001, 7:526-528). 비록 이러한 발병증가의 원인을 규명하기 위한 많은 노력이 있었지만, 아직까지 확실하게 확인되지 않았다. 따라서 초기단계에서 백일해의 국지적 발병증가를 방지하기 위해서는 진단 과정이 중요한 역할을 수행할 것이다.
현재 백일해의 실험실적 진단은 배양검사와 PCR검사가 유효한 검사방법으로 실시되고 있다 (Chapter 8 Pertussis in VPD Surveillance Manual (3rd Edition), 2002, CDC; WHO, Laboratory manual for the diagnosis of whooping cough caused by Bordetella pertussis / Bordetella parapertussis, WHO/IVB/04.14, 2004). 보통, 진단의 확실한 표준은 배양에 의해 병원균을 확인하는 것이다. 그러나 일반적으로 백일해균은 성장속도가 다른 병원성 미생물에 비해 크게 느리며, 형성되는 균집락의 크기도 작다. 또한 가검물의 수송과정 등에서 원인균이 사멸할 가능성이 있기 때문에 백일해 진단업무에서는 PCR검사가 매우 중요하다. 특히 PCR 진단 검사는 수 시간 이내에 양성 및 음성 여부를 확인할 수 있어 배양검사에 비해 단시간에 결과를 확인할 수 있어 초기 판정에 중요하게 활용된다.
현재까지 상기 백일해 진단을 위한 다양한 진단용 프라이머 세트가 개발되어졌다. 이러한 프라이머 세트 중에서, IS481 인자에 대한 BP1/2 (Fry NK, Tzivra O, Li YT, McNiff A, Doshi N, Maple PA, Crowcroft NS, Miller E, George RC, Harrison TG: Laboratory diagnosis of pertussis infections: the role of PCR and serology. J Med Microbiol 2004, 53:519-525; van der Zee A, Agterberg C, Peeters M, Schellekens J, Mooi FR: Polymerase chain reaction assay for pertussis: simultaneous detection and discrimination of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis. J Clin Microbiol 1993, 31:2134-2140), 페르투시스 독소의 프로모터 영역에 대한 PTp1/p2 (Fry NK, Tzivra O, Li YT, McNiff A, Doshi N, Maple PA, Crowcroft NS, Miller E, George RC, Harrison TG: Laboratory diagnosis of pertussis infections: the role of PCR and serology. J Med Microbiol 2004, 53:519-525; Birkebaek NH, Heron I, Skjodt K: Bordetella pertussis diagnosed by polymerase chain reaction. APMIS 1994, 102:291-294; Houard S, Hackel C, Herzog A, Bollen A: Specific identification of Bordetella pertussis by the polymerase chain reaction. Res Microbiol 1989, 140:477-487), 포린(Porin) 유전자의 윗부분의 P1/2/3 들은 (Li Z, Jansen DL, Finn TM, Halperin SA, Kasina A, O'Connor SP, Aoyama T, Manclark CR, Brennan MJ: Identification of Bordetella pertussis infection by shared-primer PCR. J Clin Microbiol 1994, 32:783-789) 임상적인 적용에서 사용되는 일반적인 프라이머 세트이다. 특히 높은 민감도와 특이도에 의해, IS481 서열을 활용하는 BP 프라이머 세트는 가장 널리 사용되는 백일해 진단용 프라이머이다 (WHO, Laboratory manual for the diagnosis of whooping cough caused by Bordetella pertussis / Bordetella parapertussis, WHO/IVB/04.14, 2004).
그러나 BP 프라이머의 높은 민감도에도 불구하고 보르데텔라 홀메 시(Bordetella holmesii)의 교차반응성이 최근에 보고되었다. 더욱 상세하게는 최근에 알려진 바에 따르면 IS481 인자(IS481 element)는 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis) 뿐만 아니라 보르데텔라 홀메시(B. holmesii)에도 존재하는 것으로 확인되었다 (Loeffelholz MJ, Thompson CJ, Long KS, Gilchrist MJ: Detection of Bordetella holmesii using Bordetella pertussis IS481 PCR assay. J Clin Microbiol 2000, 38:467; Poddar SK: Detection and discrimination of B. pertussis and B. holmesii by real-time PCR targeting IS481 using a beacon probe and probe-target melting analysis. Mol Cell Probes 2003, 17:91-98; Reischl U, Lehn N, Sanden GN, Loeffelholz, MJ: Real-Time PCR assay targeting IS481 of Bordetella pertussis and molecular basis for detecting Bordetella holmesii. J Clin Microbiol 2001, 39:1963-1966; Templeton KE, Scheltinga SA, van der Zee A, Diederen BMW, Kruijssen AM, Goossens H, Kuijper E, Claas ECJ: Evaluation of real-time PCR for detection of and Discrimination between Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, and Bordetella holmesii for clinical diagnosis. J Clin Microbiol 2003, 41:4121-4126).
보르데텔라 홀메시(B. holmesii)는 1995년도에 발견되었으며 1998년도까지는 호흡기 질환과 관련이 없는 것으로 알려져 왔으나 1995-1998년도에 매사추세츠(Massachusetts)에서 백일해 유사증상을 나타내는 33인의 환자로부터 발견되어 호흡기질환과 관련되어 있는 것이 확인되었고(Yih WK, Silva EA, Ida J, Harrington N, Lett SM, George H: Bordetella holmesii-like organisms isolated from Massachusetts patients with pertussis-like symptoms. Emerg Infect Dis 1999, 5:441-443; Mazengia E, Silva EA, Peppe JA, Timperi R, George H: Recovery of Bordetella holmesii from patients with pertussis-like symptoms: use of pulsed-field gel electrophoresis to characterize circulating strains. J Clin Microbiol 2000, 38:2330-2333), 또한 비정형폐렴의 원인 미생물 중의 하나로서 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis), 보르데텔라 파라페르투시스(B. parapertussis ) 외에 보르데텔라 홀메시(B. holmesii)를 포함시키고 있으며(Acta Pharmacologica Sinica, 24(12):1308-1313, 2003), 2005년도 ASM의 연례회의(annual meeting)에서 발표된 내용에 따르면, 버지니아주(Virginia)에서 보르데텔라 홀메시(B. holmesii)에 의한 질환발생이 조사되어 발표되었고, 보르데텔라(Bordetella)의 9개 종 중에서 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis)와 함께, 보르데텔라 브론키셉티카(B. bronchiseptica ), 보르데텔라 파라페르투시스(B. parapertussis ), 보르데텔라 홀메시(B. holmesii)가 인간과 다른 포유동물에서 호흡기감염과 관련되어 있다고 언급하고 보르데텔라 홀메시(B. holmesii)는 최근에 발견된 인간의 기관지 감염과 관련된 종이라고 보고하고 있다(CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, 18(2):326-382, 2005). 따라서 보르데텔라 홀메시(B. holmesii)는 인간의 호흡기질환과 매우 밀접한 관련이 있을 것으로 추정된다.
보르데텔라 홀메시(B. holmesii)는 보르데텔라 속의 한 종으로 16S rDNA 서열분석에서 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis)와 가장 높은 유사성을 나타내었다 (Yih WK, Silva EA, Ida J, Harrington N, Lett SM, George H: Bordetella holmesii-like organisms isolated from Massachusetts patients with pertussis-like symptoms. Emerg Infect Dis 1999, 5:441-443). 진단 및 감별을 위한 보르데텔라 홀메시(B. holmesii)의 특이적인 프라이머는 아직 보고되어 있지 않고, BP 프라이머가 현재 보르데텔라 홀메시(B. holmesii) 검출에 적용되고 있다 (WHO, Laboratory manual for the diagnosis of whooping cough caused by Bordetella pertussis/Bordetella parapertussis, WHO/IVB/04.14, 2004).
따라서 현재 백일해 검사에 있어 BP 프라이머세트(primer set)를 이용한 PCR 진단체계 하에서는 BP 프라이머에 대해 양성을 나타내는 검체에 대해서 보르데텔라 홀메시(B. holmesii)의 위양성 여부를 확인할 필요가 있고, 또한 보르데텔라 홀메시 단독 감염에 의한 백일해 유사 병증에 대한 진단도 필요하다. 이러한 이유로 PCR 진단 단계에서 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis)와 보르데텔라 홀메시(B. holmesii)를 감별 진단할 수 있는 프라이머 내지 진단방법이 개발될 필요성이 있다.
본 발명은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 16S rDNA 유전자를 이용하여 보르데텔라 홀메시(B. holmesii)를 포함한 보르데텔라 근연종으로부터 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis)를 신속, 정확하게 감별할 수 있는 PCR 기법 및 이를 위한 PCR 프라이머의 제공에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 16S-F2 프라이머(서열번호 2) 및 16S-R1 프라이머(서열번호 3)로 이루어진 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis) 검출용 PCR 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 16S-F1 프라이머(서열번호 1) 및 16S-R1 프라이머(서열번호 3)로 이루어진 보르데텔라 홀메시(B. holmesii) 검출용 PCR 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 프라이머 세트들을 이용하여 PCR 증폭하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis) 또는 보르데텔라 홀메시(B. holmesii)를 검출하는 PCR 방법을 제공한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 대해 보다 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 보르데텔라 브론키셉티카(B. bronchiseptica ), 보르데텔라 힌지(B. hinzii ), 보르데텔라 홀메시(B. holmesii ), 보르데텔라 파라페르투시스(B. parapertussis), 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis)의 5종의 16S rDNA 서열을 NCBI GenBank로부터 내려받아 다중정렬(multiple alignment)에 의한 방법으로 정렬하고 서열에 차이를 나타내는 부분을 검색하였다.
그 결과 도 1에서와 같이 661 과 782 번째 염기서열에서 각 계통(strain)을 구별할 수 있는 부분을 확인하였으며 이를 근거로 하여 다음과 같이 PCR 프라이머를 설계하여, 보르데텔라 홀메시(B. holmesii ) 및 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis)에 특이적인 프라이머와 다른 3종의 보르데텔라 종(Bordetella spp.)들을 구분할 수 있는 프라이머 조합을 구성하여 본 발명을 완성하였다. 표 1은 본 발명에 의해 설계된 PCR 프라이머들 및 특이적 조합을 나타낸다.
설계된 PCR 프라이머들( Designed PCR primers )
16S-F1 5'-AACTGCATTTTTAACTACCGA-3' (서열번호 1)
16S-F2 5'-AACTGCATTTTTAACTACCGG-3' (서열번호 2)
16S-R1 5'-ATCCTGTTTGCTCCCCACA-3' (서열번호 3)
16S-R2 5'-ATCCTGTTTGCTCCCCACG-3' (서열번호 4)
PCR 특이도( PCR specificity )
B. holmesii 16S-F1 x 16S-R1
B. pertussis 16S-F2 x 16S-R1
B. bronchiseptica , B. parapertussis,
B. hinzii
16S-F2 x 16S-R2
본 발명에 의해 상기와 같이 제작된 프라이머 세트들이 과연 목적하는 대로 각 균종의 감별이 가능한 지의 여부를 확인한 결과, 보르데텔라 홀메시(B, holmesii)를 검출하는 목적으로 설계된 16S-F1/16S-R1 프라이머 세트는 다른 균종에 대해서는 반응하지 않았다. 또한 보르데텔라 브론키셉티카(B. bronchiseptica)와 보르데텔라 파라페르투시스(B. parapertussis )의 검출을 위해 설계된 16S-F2/16S-R2 프라이머 세트는 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis)와는 반응성을 나타내지 않았다. 이와 더불어 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis)를 검출하기 위해 설계된 프라이머 세트인 16S-F2/16S-R1은 오직 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis)에서만 양성반응을 나타내었고, 보르데텔라 브론키셉티카(B. bronchiseptica)와 보르데텔라 파라페르투시스(B. parapertussis)에 대해서는 반응을 나타내지 않았다(도 3 참조).
본 발명에 의해 설계된 백일해 진단에 이용될 수 있는 16S-F2/R1 프라이머 세트는 정제된 염색체 DNA를 PCR 주형으로 하였을 경우는 5 pg/reaction 까지 확인이 가능하며, 세포 부유액의 경우는 105 cells/ml의 농도까지 검출이 가능하였다 (도 4 및 도 5 참조). 또한 16S-F2/R1 프라이머 세트는 양성 및 음성의 임상검체에 시험한 결과 오직 백일해 양성환자의 임상검체에서만 양성반응을 나타내는 것으로 확인되어 임상검체에 대해서 적용이 가능함을 확인하였다(도 6 참조).
나아가 본 발명에 의한 상기 PCR 프라이머 세트들은 하나 이상의 조합으로 PCR 기법에 사용되고 키트에 포함될 수도 있어 호흡기 질환의 원인균들을 동시에 신속, 정확하게 검출 및 진단할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 16S rDNA 서열을 기반으로 설계된 보르데텔라 속의 5개 중요 종에 대한 진단 프라이머 세트를 제공하여 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis ), 보르데텔라 홀메시(B. holmesii ), 보르데텔라 파라페르투시스(B. parapertussis ), 보르데텔라 브론키셉티카(B. bronchiseptica ), 보르데텔라 힌지(B. hinzii)를 PCR법에 의해 진단할 수 있는 효과를 도모할 수 있다.
특히, 본 발명에 의한 16S 프라이머 세트(16S-F2/R1)는 종래의 BP 프라이머 세트와 달리 교차 반응성이 없어 보르데텔라 홀메시(B. holmesii)와 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis)를 신속, 정확하게 감별할 수 있는 효과가 있다.
나아가, 본 발명에 의하면 생화학적 검사와 세포성 지방산 분석 등에 의한 동정 시험이 주로 행해지던 보르데텔라 홀메시(B. holmesii)에 특이적인 프라이머 세트(16S-F1/R1)를 제공하여 임상에서 보르데텔라 홀메시(B. holmesii)를 신속하게 동정할 수 있는 이점이 있다.
따라서 본 발명은 보르데텔라 속에 의해 발병되는 유사 호흡기 질환자의 호흡기 검체로부터 주요 원인균을 임상에서 신속, 정확하게 검출하고 진단할 수 있는 유용한 발명이라 할 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지 에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
재료 및 방법 ( Materials and Methods )
1. 균주
본 발명에서 사용된 참조균주들은 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis; ATCC9797), 보르데텔라 홀메시(Bordetella holmesii ; ATCC 51541), 보르데텔라 파라페르투시스(Bordetella parapertussis ; ATCC15237), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica ; ATCC 31124) 등이다. 이러한 참조 균주 이외에 백일해 환자로부터 수집된 비인두흡입 임상검체가 확인시험에 사용되었다.
2. PCR 주형의 준비
4 보르데텔라(Bordetella) 종의 배양된 세포로부터 게놈 DNA를 정제하여 PCR 주형으로 사용하였다. 이를 위해 모든 참조균주들은 르간 로위(Regan-Lowe) 배지에서 세팔렉신(cephalexin) 없이 37℃에서 5-7일간 배양되었다. 배양 후, 균주세포를 긁어 모았고 게놈 DNA를 상업적인 킷트를 사용하여 제작자의 지시대로 분리하였다 (QIAmp DNA Mini Kitm QIAGEN).
임상검체를 위해서는 수집된 비인두흡입물을 직접 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. 검체의 일부(0.5 - 1 ml)를 끓는 물에서 5분간 가열하였다. 그 다음 5분동안 15,000 rpm으로 원심분리한 후에, 상청액 1-2 ㎕를 PCR 주형으로 사용하였다.
3. PCR 프라이머
4개의 PCR 프라이머들은 5개 보르데텔라(Bordetella) 종 (B. holmesii , B. bronchiseptica, B. pertussis , B. parapertussis, B. hinzi)의 16S rDNA 서열로부터 설계하였다. 16S rDNA 유전자의 DNA 서열정보는 NCBI의 GenBank로부터 내려받았다. 이렇게 수집된 뉴클레오타이드 서열들은 MEGA 프로그램에 의한 다중정렬법을 사용하여 정렬하였고, 서로 다른 뉴클레오타이드를 포함하는 영역은 “Sequence Output” 프로그램을 사용하여 분석하고 PCR 프라이머들을 설계하였다 (도 1). 참조를 위해, BP 프라이머 서열 (BP1:5'-GAT TCA ATA GGT TGT ATG CAT GGT T-3'(서열번호 5), BP2:5'-TTC AGG CAC ACA AAC TTG ATG GGC G-3'(서열번호 6))은 출판된 논문으로부터 인용하였다(Reischl U et al. J Clin Microbial 39: 1963-6, 2001).
4. PCR 조건
표준반응혼합액(20 ㎕)은 2 ㎕의 10배 완충용액, 1 ㎕의 dNTPs 혼합액 (각 2.5 mM), 1 ㎕의 F-primer (10 pmol/㎕), 1 ㎕의 R-primer (10 pmol), 0.25 ㎕의 SP-Taq 폴리머라아제 (2.5 Unit/㎕), 1 ㎕의 주형 (정제된 게놈 DNA 혹은 세균부유액), 그리고 증류수를 첨가하여 전체를 20㎕의 반응액이 되도록 하였다. 16S 프라이머 세트를 위해서는, 5ng의 정제된 게놈 DNA들이 사용되었고, 디메칠설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)를 최종농도가 2.5% 되도록 반응혼합액에 첨가하였다.
16S 프라이머 세트를 위한 온도조건은 35회의 98℃에서 10초간의 변성, 프라 이머 세트에 따른 64℃(16S-F1/R1) 또는 66℃(16S-F2/R1 및 16S-F2/R2)에서 15초간의 결합 및 신장단계로 2-스텝 PCR 조건을 적용하였다. BP 프라이머 세트의 경우는, 35회의 95℃ 5초간의 변성과 54℃ 10초간의 결합 및 신장단계를 수행하였다.
실시예 1. BP 프라이머 세트의 B. holmesii 와의 교차반응
BP 프라이머의 보르데텔라 홀메시(B. holmesii)와 다른 2 Bordetella 종 (B. bronchiseptica와 B. parapertussis)에 대한 교차반응성을 본 발명에서 확인하였다. 도 2에 보여지는 바와 같이, 양성밴드는 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis)와 보르데텔라 홀메시(B. holmesii)의 두 레인 (레인 4 와 5)에서 동시에 나타났다. 그러나 B. parapertussis (레인 2)와 B. brochiseptica (레인 3) 들은 BP 프라이머 세트에 의해서는 검출되지 않았다. 따라서 백일해의 PCR 진단에서 현재 널리 이용되는 BP 프라이머 세트의 사용은 보르데텔라 홀메시(B. holmesii)에 의한 위양성이 고려되어져야만 한다.
실시예 2. PCR 프라이머 세트의 설계
본 발명에서, 발명자들은 백일해의 PCR진단을 위한 새로운 프라이머 세트를 개발하기 위해서 16S rDNA 유전자를 고려하였다. 이를 위해 5개 주요 보르데텔라 종(B. pertussis , B. holmesii , B. bronchiseptica , B. parapertussis and B. hinzi)의 16S rDNA 서열을 NCBI의 GenBank로부터 수집하였고, 서열변이를 확인하기 위해서 다중정렬방법에 의해 정렬하였다. 그 결과 정렬된 집합체에서 661 번째 와 782 번째 염기서열의 두 위치에서 종에 따른 차이를 나타내었다. 본 발명자들은 바로 이 두 위치를 PCR 프라이머 설계를 위한 모티프로 선택하였고, 이를 근거로 4개의 새로운 프라이머들을 설계하였다. 표 1에 나타난 바와 같이 설계된 프라이머들은 그들의 3'-말단의 오직 하나의 뉴클레오타이드만이 다르다.
실시예 3. 설계된 16S PCR 프라이머 세트의 특이도
위에서 언급한 바와 같이, 설계된 새로운 프라이머 세트의 특이도를 4개 Bordetella 종(B. pertussis , B. holmesii , B. parapertussis , B. bronchiseptica에 대해서 검사하였다. 특이적 증폭을 위해서, 이 4개 프라이머들의 조합들을 적용하였다. 보르데텔라 홀메시(B. holmesii)에 대해서는 16S-F1/16S-R1 세트, 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis)에 대해서는 16S-F2/16S-R1, 다른 보르데텔라(Bordetella ) 종에 대해서는 16S-F2/16S-R2 세트를 사용하였다(표 1). 반응 후, 증폭된 표적 밴드는 1.5% 아가로즈 겔 전기영동에 의해 확인되었다. 그 결과, 프라이머 세트들의 조합을 이용하여 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis ), 보르데텔라 홀메시(B. holmesii ), 보르데텔라 파라페르투시스(B. parapertussis ), 보르데텔라 브론키셉티카(B. bronchiseptica)의 특이적 증폭이 성공적으로 수행된 것을 확인할 수 있었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 양성 PCR 밴드는 오직 각각의 표적 종에서만 나타났다 (레인 2, 레인 5, 레인 11, 레인 12). 따라서 설계된 PCR 프라이머 세트들은 각각의 보르데텔라(Bordetella ) 종에 대해서 특이도를 나타내었다.
특히 16S-F2 와 16S-R1 프라이머들은 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis) 에 대해 적용되었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 양성 밴드는 오직 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis ) 샘플에서만 검출되었다 (레인 5). 그러나, 완화된 PCR 조건에서 보르데텔라 홀메시(B. holmesii)의 샘플에서도 또한 비특이적 밴드가 검출되는 경우가 확인되었다. 따라서 16S-F2와 16S-R1 프라이머의 사용에서는 엄격한 PCR 조건이 필요하다. 이러한 이유로, DMSO를 반응혼합액에 최종농도가 2.5% 되도록 첨가하였다.
실시예 4. 설계된 16S PCR 프라이머 세트의 민감도
보르데텔라 페르투시스(B. pertussis)에 대한 16S-F2/R1 프라이머 세트의 민감도를 정제된 게놈 DNA와 세포부유액을 이용하여 평가하였다. 고정된 PCR 조건하에서, 표적 밴드의 검출한계를 우선 정제된 게놈 DNA를 이용하여 검사하였다. 반응 후, 10개의 반응물들은 1.5% 아가로즈 겔에서 전기영동 되었고 증폭된 밴드는 UV 조사기(UV illuminator) 하에서 관찰되었다. 그 결과 도 4에 나타난 바와 같이, 게놈 DNA를 사용하였을 때, 검출한계는 5 pg/reaction 이었다 (도 4의 레인 2).
세포부유액의 경우는, 104 ~ 1010 cells/mL의 세포부유액을 끓는 물에서 5분 동안 가열하였고, 5분 동안 15,000 rpm에서 원심분리되었다. 원심분리 후, 1㎕ 상청액이 주형으로 PCR 반응혼합액에 첨가되었다. 1.5% 아가로즈겔 전기영동 후, 증폭된 PCR 밴드는 UV 조사기로 관찰되었다. 그 결과, 도 5에 나타난 것처럼 본 발 명에 의한 16S rDNA 유전자의 검출한계는 세포 부유액에서 >105 cells/ml 이었다 (도 5의 레인 6).
실시예 5. 임상검체에 대한 적용
임상검체에 대한 본 발명에 의한 16S 프라이머의 적용성을 평가하였다. 검체들은 2006년도에 백일해 의심환자로부터 수집된 비인두흡입물이었다. 이 검체들은 이미 BP 프라이머 PCR과 배양검사를 통해 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis)에 대해 양성여부가 확인된 것들이다. 이들 검체는 상기 실시예 4의 세포부유액 실험과 같은 조건으로 열처리하고 16S-F2/R1 프라이머 세트로 PCR 한 후, 1.5% 아가로즈겔 전기영동 하여 UV 조사기로 관찰한 결과, 도 6에 나타난 것처럼, 모든 양성 검체들은 또한 16S-F2/R1 PCR 프라이머 세트에 의해 양성으로 확인되어졌다 (도 6, 레인 1-4). 따라서 새롭게 개발된 본 발명에 의한 16S-F2/R1 PCR 프라이머 세트는 백일해의 감염여부를 확인하는 실제 임상검체에 적용가능하다 할 것이다.
도 1은 보르데텔라 홀메시(B. holmesii), 보르데텔라 브론키셉티카(B. bronchiseptica), 보르데텔라 파라페르투시스(B. parapertussis), 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis) 및 보르데텔라 힌지(B. hinzii)의 16S rDNA 서열의 다중정렬을 나타낸 도면.
도 2는 종래 기술에 의한 BP 프라이머 세트의 보르데텔라 홀메시(B. holmesii)와 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis )에 대한 교차반응성을 나타내는 도면.
도 3은 본 발명에 의한 16S 프라이머 세트들(16S-F1/R1, 16S-F2/R1, 16S-F2/R2)을 이용한 각각의 보르데텔라 종(Bordetella spp.)들의 특이적 증폭을 나타낸 도면.
도 4는 정제된 게놈 DNA를 이용하여 본 발명에 의한 16S 프라이머 세트(16S-F2/R1)에 의한 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis)의 검출 민감도를 확인한 결과를 나타낸 도면.
도 5는 세포부유액을 이용하여 본 발명에 의한 16S 프라이머 세트(16S-F2/R1)에 의한 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis)의 검출 민감도를 비교한 결과를 나타낸 도면.
도 6은 임상검체에 본 발명에 의한 PCR 프라이머 세트(16S-F2/R1)를 적용한 결과를 나타낸 도면.
<110> korea Center for Disease Control and Prevention <120> PCR method for identification of Bordetella pertussis from closely related Bordetella species using 16S rDNA and PCR primer therefor <130> P11-080307-01 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 1 aactgcattt ttaactaccg a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 2 aactgcattt ttaactaccg g 21 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 3 atcctgtttg ctccccaca 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 4 atcctgtttg ctccccacg 19 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 5 gattcaatag gttgtatgca tggtt 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 6 ttcaggcaca caaacttgat gggcg 25

Claims (8)

16S-F2 프라이머(서열번호 2) 및 16S-R1 프라이머(서열번호 3)로 이루어진 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis) 검출용 PCR 프라이머 세트.
16S-F1 프라이머(서열번호 1) 및 16S-R1 프라이머(서열번호 3)로 이루어진 보르데텔라 홀메시(B. holmesii) 검출용 PCR 프라이머 세트.
16S-F2 프라이머(서열번호 2) 및 16S-R2 프라이머(서열번호 4)로 이루어진 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 보르데텔라 파라페르투시스(Bordetella parapertussis) 또는 보르데텔라 힌지(Bordetella hinzii) 검출용 PCR 프라이머 세트.
제1항에 기재된 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 보르데텔라 페르투시스(B. pertussis)를 검출하는 PCR 방법.
제4항에 있어서, 디메칠설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)를 반응혼합액에 최종농도가 2.5% 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 기재된 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭하는 단계를 포함하는 것 을 특징으로 하는 보르데텔라 홀메시(B. holmesii)를 검출하는 PCR 방법.
제3항에 기재된 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 보르데텔라 브론키셉티카(B. bronchiseptica), 보르데텔라 파라페르투시스(B. parapertussis) 또는 보르데텔라 힌지(B. hinzii)를 검출하는 PCR 방법.
다음 프라이머 세트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 PCR 프라이머세트를 포함하는 호흡기 세균인 보르데텔라 종 검출 및 진단용 키트;
(a) 16S-F2 프라이머(서열번호 2) 및 16S-R1 프라이머(서열번호 3)로 이루어진 PCR용 프라이머 세트;
(b) 16S-F1 프라이머(서열번호 1) 및 16S-R1 프라이머(서열번호 3)로 이루어진 PCR용 프라이머 세트; 및
(c) 16S-F2 프라이머(서열번호 2) 및 16S-R2 프라이머(서열번호 4)로 이루어진 PCR용 프라이머 세트.
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