MX2007007570A - Vacuna de pasteurella multocida. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a una bacteria viva atenuada, de la especie Pasteurella multocida, a vacunas vivas atenuadas que comprenden dicha bacteria viva atenuada, al uso de dichas bacterias para fabricar dichas vacunas, a metodos para preparar las vacunas y a una prueba de diagnostico para detectar dicha bacteria.

Description

VACUNA DE PASTEURELLA MUL TOCIDA La presente invención se refiere a una bacteria atenuada de la especie Pasteurella multocida, a vacunas vivas atenuadas que comprenden dicha bacteria viva atenuada, al uso de dicha bacteria para la fabricación de esas vacunas, a métodos para la preparación de las vacunas, y a pruebas de diagnóstico para la detección de esa bacteria. Se ha sabido que la bacteria Gram-negativa Pasteurella multocida es el agente causante de enfermedades en varias especies animales, desde hace más de cien años. Se sabe que, entre otros, Pasteurella multocida provoca el cólera aviar en las aves de corral , la septicemia hemorrágica en el ganado vacuno y la rinitis atrófica en los cerdos. Adicionalmente, su importancia como patógeno para los humanos ha quedado cada vez más clara durante los últimos sesenta años. Solamente hay una especie de Pasteurella multocida. No existen subespecies. No obstante, se puede hacer una subdivisión sobre la base de las diferencias en los antígenos capsulares y el antígeno LPS . Se han definido cinco grupos de Pasteurella multocida, los grupos A-E , con base en el antígeno capsular ns, y se han definido 1 6 serotipos somáticos, con base en el antígeno LPS . La patogenicidad o la virulncia no son influenciadas por el grupo de antígeno capsular ni por el serotipo LPS de las cepas. El grupo de antígeno capsular meramente determina el animal huésped de cualquier cepa específica. Las cepas que provocan el cólera aviar pertenecen principalmente al grupo de antígeno capsular A. Se conocen dos clases de enfermedad: el cólera aviar agudo y el crónico. Los síntomas del cólera aviar agudo son: depresión, plumaje descompuesto, fiebre, anorexia, descarga mucosal y régimen respiratorio incrementado. Frecuentemente se observan lesiones, tales como hemorragias petequiales y esquimóticas, hiperemia pasiva general y un incremento en los fluidos peritoneal y pericardial. Los síntomas de la enfermedad en las aves infectadas crónicamente están asociados usualmente con infecciones localizadas. Frecuentemente ocurren inflamaciones de la barba, los senos, los tejidos periorbitales subcutáneos, las articulaciones de las patas o de las alas. También se observa frecuentemente que hay conjuntivitis exudante y faringitis. Las lesiones en las aves infectadas crónicamente por lo general están caracterizadas por exudados de fibras no supurantes, necrosis focal y proliferación de tejido conector. Las cepas que provocan septicemia hemorrágica en el ganado vacuno y en los búfalos de agua, también en cerdos, ovejas, cabras, venados y camellos, pertenecen principalmente a los grupos de antígeno capsular B y E. La septicemia hemorrágica es una enfermedad aguda, caracterizada por una inflamación edematosa, de curso rápido, en la región de cabeza-cuello-pechuga, nodos linfáticos inflamados y hemorrágicos, y la presencia de numerosas hemorragias petequiales subserosas. En los cerdos, Pasteurella multocida provoca rinitis atrófica y neumonía. Estos síndromes son provocados principalmente por cepas del tipo capsular A y D. También se han descrito casos de septicemia aguda, que fueron provocados por el tipo capsular B. Las señales clínicas asociadas con la rinitis atrófica son: estornudos, descarga nasal , acortamiento y torsión de la trompa, neumonía y retardo en el crecimiento. Se considera principalmente la neumonía como una infección secundaria, que incrementa la severidad de las lesiones primarias. Las señales clínicas incluyen una tos seca, no productiva, que se vuelve productiva y, en casos severos, una elevación en la temperatura del cuerpo. En principio, cuando se trata de vacunas contra Pasteurella multocida, hay dos acercamientos para proteger contra la infección por Pasteurella multocida: la vacunación con vacunas muertas (bacterianas) y la vacunación con vacunas vivas, atenuadas. Las bacterianas son económicamente atractivas, ya que son de bajo costo en su producción. Sin embargo, se deben inyectar, y con frecuencia provocan reacciones tisuiares severas, una presión elevada de desafío puede provocar todavía brotes de la enfermedad en los animales vacunados con bacteriana y, lo peor de todo, únicamente dan protección contra el serotipo homólogo. Contrariamente a ello, la vacunación con vacunas vivas atenuadas da buena protección transversal, no sólo contra los serotipos homólogos, sino también contra serotipos heterólogos. Por consiguiente, estas vacunas parecerían ser las vacunas a elegir; pero hay dos desventajas serias conectadas con el uso de vacunas vivas: en primer lugar, las cepas de la vacuna de Pasteurella multocida vivas, atenuadas, actualmente en uso, están definidas deficientemente: se desconoce la naturaleza de su comportamiento atenuado. Por lo tanto, siempre existe el riesgo de reversión a la virulencia. Y en segundo lugar, ha habido brotes de pasteurólisis que pod ían atribuirse a las cepas de vacuna vivas usadas. Una posible razón para dichos brotes podría ser la reversión a la virulencia de la cepa de vacuna usada, o un nivel insuficiente de atenuación . Por lo tanto, hay claramente necesidad de vacunas vivas atenuadas de Pasteurella multocida, que sean eficaces y seguras. Dichas vacunas deben dar protección contra la infección por Pasteurella multocida o sus efectos y, al mismo tiempo, se deben comportar atenuadas, sin que sean proclives a revertirse a la virulencia . Es un objetivo de la presente invención proveer una cepa viva, atenuada, de Pasteurella multocida, que satisfaga esos requisitos. Se ha encontrado ahora, sorprendentemente, que se puede borrar u omitir un gen novedoso, hasta ahora desconocido, de Pasteurella multocida, denominado en lo que sigue gen Orf-1 5, sin dañar la reactividad inmunológica de la cepa, al mismo tiempo que se disminuye dramáticamente la virulencia de la bacteria . La presencia del gen en el tipo silvestre de Pasteurella multocida no está restringida a un grupo específico de antígeno capsular ni a un serotipo somático específico. El gen está presente en las cepas de Pasteurella multocida, independientemente del grupo de antígeno capsular o del serotipo somático: se encuentra en los 1 6 serotipos somáticos y en los cinco grupos de antígeno capsular. Por lo tanto, el gen es un blanco de atenuación universal en Pasteurella multocida, que permite ahora, por primera vez, la preparación de vacunas seguras para la enfermedad relacionada con Pasteurella multocida. Por lo tanto, la aproximación es igualmente adecuada para la preparación , por ejemplo, de vacunas que protejan a los humanos contra la infección por Pasteurella multocida o sus efectos, vacunas que protejan a las aves contra el cólera aviar, vacunas que protejan los cerdos contra la rinitis atrófica y vacunas que protejan al ganado vacuno y los búfalos de agua contra la septicemia hemorrágica. Además, se encontró que las cepas vivas atenuadas de Pasteurella multocida, a las que les falta el gen Orf-1 5, no solamente dan muy buena protección contra su serotipo homólogo, sino también una protección transversal muy buena contra serotipos heterólogos. Por lo tanto , una primera modalidad de la invención se refiere a una bacteria viva atenuada de Pasteurella multocida, que no es capaz de expresar una proteína funcional Orf-1 5. La secuencia del gen Orf-1 5 novedoso en el marco de lectura abierto se presenta en SEQ I D NO: 1 , y la proteína Orf-1 5 que lo codifica está representada en SEQ ID NO: 2.

Se entiende que una proteína Orf- 15 funcional es una proteína Orf- 15 capaz de provocar la virulencia plena como en un tipo silvestre de Pasteurella multocida. Por lo tanto, una cepa de Pasteurella multocida que sea efectiva en al menos esta capacidad , se considera que no es capaz de expresar una proteína Orf-1 5 funcional . Cualquier mutación , tal como una mutación por inserción , reemplazo o eliminación, en el gen Orf-1 5, que conduzca a una disminución en la virulencia, cuando se compara con la cepa de Pasteurella multocida de tipo silvestre, se considera que cae dentro del alcance de la presente invención. Una disminución en la virulencia de una cepa , para los fines de la presente invención , se define de dos maneras: Una definición de una disminución en la virulencia se refiere al nivel de protección contra la infección letal : se sabe que la infección de pavos con una cepa de Pasteurella multocida de tipo silvestre, bajo condiciones controladas, da una mortandad de más de 50 por ciento (véase, entre otras, la sección de ejemplos). Una cepa de Pasteurella multocida con virulencia disminuida, debida a una mutación en el gen Orf-1 5, de acuerdo con la invención , es una cepa que, bajo las mismas condiciones, da un nivel de mortandad de menos del 1 0 por ciento. La otra definición de una disminución en la virulencia se refiere al nivel y la seriedad de las lesiones después de la vacunación , cuando se compara con la infección sub-letal con una cepa de Pasteurella multocida de tipo silvestre. Así, de acuerdo con la segunda definición de disminución en la virulencia, una cepa de Pasteurella multocida tiene un nivel reducido de virulencia si provoca un nivel de lesiones que esté por debajo del 30 por ciento del nivel de lesiones provocadas por una infección con una cepa de Pasteurella multocida de tipo silvestre. De tal maneara, se considera que la cepa de Pasteurella multocida queda dentro del alcance de la presente invención si tiene, por ejemplo, una mutación en el gen Orf-1 5 o un agente que interfiera con la expresión de la proteína codificada por el gen Orf-1 5 (véase más adelante) que conduzca a una disminución en la virulencia, de acuerdo con al menos una de las dos definiciones de disminución de la virulencia, dadas más arriba. Dicha mutación puede ser una inserción, una eliminación , una sustitución o una combinación de ellas, siempre y cuando la mutación dé por resultado que no se pueda expresar una Orf- 15 funcional . (No es necesario señalar que una mutación silente, tal como una mutación del codón CTC a CTT, no afecta la proteína Orf-1 5 y, por lo tanto, no conduce a una falta de expresión de una proteína Orf-1 5 funcional . Por consiguiente, para los fines de la presente invención , no entra en consideración dicha mutación). Habitualmente una mutación será la inserción , la recolocación o la eliminación de uno o más nucleótidos. Especialmente la inserción o la eliminación de varios nucleótidos, que no sea divisible entre tres, conduce a un desplazamiento en el marco lo que, a su vez, da por resultado un código sin sentido. Como resultado, se sintetizará una proteína Orf-15 truncada, que tiene una funcionalidad reducida, o incluso que carece en absoluto de funcionalidad. Hay muchas maneras conocidas en la técnica para introducir una mutación en un marco de lectura abierto. Una manera posible de obtener dichas mutaciones es por medio de métodos clásicos, tales como el tratamiento de bacterias de tipo silvestre con agentes mutágenos, tales como análogos de la base; el tratamiento con luz ultravioleta o un tratamiento con temperatura. La selección de los mutantes de Orf-15, sin embargo, sería una tarea bastante tardada. Además, la naturaleza de la mutación causada por técnicas clásicas de mutación, sería desconocida. Esta podría ser una mutación puntual en el gen Orf-15, que eventualmente pudiera revertir al tipo silvestre. A fin de evitar este riesgo pequeño, la mutagénesis por transposón sería una alternativa buena. Formar mutantes mediante mutagénesis por transposón también es una técnica bien conocida en el arte. Esta es una clase de mutación obtenida en un sitio localizado en el cromosoma. De esta manera se pueden producir mutantes estables, no virulentos, inmunogénicos, mediados por transposón, de P. multocida. Los mutantes mediados por transposón son aquellos que tienen el transposón insertado en el genoma bacteriano. Un "transposón" es un elemento de ADN que puede ser insertado en las moléculas de ADN mediante transposición, un proceso de recombinación no homologa, que no requiere de homología extensa de la secuencia de ADN. Usualmente, los trsnsposones incluyen genes que codifican enzimas de transposición , denominadas transposasas , que cortan el ADN al final de los transposones e insertan los transposones en el ADN de destino. Además, los transposones usualmente contienen genes marcadores que codifican la resistencia al antibiótico, que puede ser usada para seleccionar los mutantes con inserciones de transposón. Los transposones conocidos incluyen : Tn3,Tn5, TnhoA, Tn7, Tn9, Tn 1 0, y sus fragmentos funcionales (Mobile DNA, D. E. Berg y M . M . Howe, editores, ASM Press, 1 989). Meramente como ejemplo: el transposón Tn 1 0 es bien conocido en el arte, y está descrito , entre otros, por Lee (Lee, M . D. , Honk, A. D. , Veterinary Microbiology, 50, 1 996, 1 43-1 480). Se puede producir un mutante por inserción de transposón mediante métodos estándar conocidos por quienes tienen experiencia en la materia (Mobile DNA, D. E. Berg y M . M . Howe, editores, ASM Press, 1 989). La selección para las mutaciones por transposón de Orf-1 5 serían más fáciles y menos tardadas, debido al hecho de que una RCP que utilice sensibilizadores localizados en el lado del terminal 3' y en el lado del terminal 5' del gen Orf-1 5, mostraría directamente si la inserción del transposón está situada en el gen Orf-1 5 o en algún otro lugar. Una posibilidad todavía más elegante de introducir una mutación en Orf-1 5, ahora en un sitio predeterminado, en lugar de deliberadamente al azar, es ofrecida por la tecnología de ADN recombinante; más específicamente, por mutagénesis específicamente dirigida al sitio. Esa mutación también puede ser una inserción , una eliminación , un reemplazo de un nucleótido por otro, o una combinación de ellas; con la única condición de que el gen mutado ya no codifique Orf- 15 funcional. Dicha mutación , por ejemplo, puede efectuarse eliminando varios pares de bases. I ncluso las eliminaciones muy pequeñas, tales como las eliminaciones de un solo par de bases, que conduzcan al desplazamiento del marco, pueden hacer suficientemente no funcional a Orf- 15. Se prefiere más que se elimine un tramo más largo, por ejemplo, de 1 0, 50 o más pares de bases. Es todavía más preferible que se elimine todo el gen Orf- 15. Las técnicas para la construcción de los mutantes sin Orf- 15, mediante mutagénesis dirigida al sitio, son técnicas estándar bien conocidas. Se refieren, por ejemplo, a la clonación del gen Orf-1 5, la modificación de la secuencia del gen mediante mutagénesis dirigida al sitio, la digestión con enzima de restricción , seguida por religamiento o aproximaciones de RCP, y al reemplazo subsiguiente del gen Orf- 15 de tipo silvestre, con el gen mutante (cambio alélico o reemplazo alélico). Las técnicas de ADN recombinante comunes y corrientes, tales como la clonación del gen Orf- 15 en un plásmido, la digestión del gen con una enzima de restricción , seguida por tratamiento con endonucleasa, el religamiento y la recombinación homologa en la cepa huésped , son bien conocidas en el arte, y están descritas, entre otros, en Maniatis/Sambrook (Sambrook, J . y coautores, Molecular cloning: A laboratory Manual, ISB N 0-87969-309-6). Se pueden efectuar las mutaciones dirigidas al sitio, por ejemplo, por medio de mutagénesis in vitro dirigida al sitio, usando el equipo Transforme®, vendido por Clontech . Las técnicas de RCP están descritas extensamente en ( Dieffenbach y Dreksler, PCR primers, a laboratory manual, I SBN 0-87969-447-3 e ISBN 0-87969-447-5). Los métodos más comunes para la construcción de una bacteria Pasteurella multocida viva, atenuada, que no sea capaz de expresar una proteína Orf-1 5 funcional , se basan , como se explicó más atrás, en mutaciones en el gen Orf-1 5. Sin embargo, hay una forma alternativa de formar bacterias Pasteurella multocida vivas atenuadas, que no sean capaces de expresar una proteína Orf-1 5 funcional . Esta forma alternativa se refiere a la interacción con el ARN mensajero que codifica fa proteína Orf-1 5. La expresión de una proteína es un proceso de dos pasos, que comprenden el paso de generar ARNm de Orf-1 5 mediante la transcripción del ADN , y el paso subsiguiente de trasladar este ARNm a la proteína Orf-1 5. La presencia de ciertos tipos de ARN , tales como, por ejemplo, ARNds específico para Orf-1 5, ARN de interferencia corta, específico para Orf-1 5 , o ARN de sentido opuesto, específico para Orf-1 5, en la bacteria , interferiría con el ARNm de Orf-1 5 y, por lo tanto, bloquearía la translación del ARNm de Orf-1 5 a cantidades de proteína Orf-1 5 de tipo silvestre. Los ARN en los que se basa este mecanismo, o el mecanismo como tal , son conocidos comúnmente como ARN i . Por lo tanto, la presencia, por ejemplo, de ARNsi , ARNds específicos para Orf-1 5, o ARN de sentido opuesto específico para Orf-1 5, tendría el mismo efecto que una mutación en el gen Orf-1 5: dicha bacteria no sería capaz de expresar una proteína Orf-1 5 funcional. El uso de ARN de sentido opuesto para silenciar los genes es conocido desde hace ya algunas décadas, y el uso de ARNi (por ejemplo, ARNds o ARNsi) que está en uso comúnmente desde hace aproximadamente cinco años, también es una técnica bien establecida, bien conocida en el arte. Algunos resúmenes sobre este tópico han sido escritos por Hannon , G. J . , en Nature, 41 8:244-251 (2002) y por Deni , A. M . y Hannon, G. J. en TRENDS in Biochemical Sciences, 28: 1 96-201 (2003). Otros documentos, que describen el uso de ARNsi en el silenciamiento de genes, son los escritos por Bertrand , J . R. y coautores, en B.B. R. C. , 296: 1 000-1004 (2002), y por Sorensen, D. R. y coautores en J. Mol. Biol. , 327: 761 -766 (2003). El uso de ARNi para silenciar virus en mam íferos ha sido sugerido recientemente, y ha sido resumido, entre otros, por Quan-Chun Wang y coautores ( World J. Gastroenterol. , 9: 1657-1661 (2003). En términos generales, las personas expertas en la materia posiblemente tengan una ligera preferencia por la primera aproximación: efectuar una mutación en el gen Orf-15. Esto se debe al hecho de que la mutación de un gen, contrariamente al método basado en la interferencia de ARN , no aporta ningún material genético adicional a la célula. Por lo tanto, una forma preferida de esta modalidad , se refiere a una bacteria viva atenuada, que no es capaz de expresar una proteína Orf-1 5 funcional , debido a una mutación en el gen Orf- 1 5. Una eliminación o una inserción , especialmente una mutación fuera de marco, tendrán un efecto drástico sobre la funcionalidad de la proteína Orf-1 5. Por lo tanto, en una forma más preferida de esta modalidad , la mutación comprende una inserción y/o una eliminación . En una forma muy preferida , se elimina todo el gen Orf-1 5, o por lo menos toda su secuencia codificadora. El gen Orf-1 5 comprende una secuencia codificadora, así como una región promotora y un sitio de unión ribosómica. El sitio promotor comprende por lo menos la región comprendida entre los nucleótidos 22 y 71 de SEQ I D NO: 1 , mientras que el sitio de unión ribosómica se extiende entre los nucleótidos 92 y 96. Por consiguiente, no es necesario decir que cualquier mutación que haga inefectivo el sitio promotor o el sitio de unión ribosómica y, por tanto, dé por resultado la expresión reducida o la carencia de expresión de Orf-1 5 , también se considera que queda dentro del alcance de la presente invención . Dada la gran cantidad de vacunas administradas en la actualidad , tanto a mascotas como a animales de granja, está claro que sería deseable la administración combinada de varias vacunas, así fuera únicamente por razones de menores costos de vacunación . Por lo tanto, es muy atractivo el uso de bacterias vivas atenuadas como un portador recombinante para genes heterólogos, que codifiquen antígenos seleccionados de otros microorganismos o virus patógenos. La administración de dicho portador recombinante tiene la ventaja de que se induce inmunidad contra dos o más enfermedades al mismo tiempo. Las bacterias vivas atenuadas, de acuerdo con la presente invención, proveen portadores muy adecuados para genes heterólogos, debido a su comportamiento atenuado. Por lo tanto, una forma todavía más preferida de esta modalidad se refiere a una bacteria viva, atenuada, de acuerdo con la invención, que lleva un gen heterólogo que codifica uno o más antígenos, seleccionados del grupo de microorganismos y virus patógenos para los humanos y/o para los animales. El uso del gen Orf-15 como un sitio de inserción para el gen heterólogo tiene la ventaja adicional de que, al mismo tiempo, se inactiva el gen Orf-15 y se puede expresar el gen heterólogo recién introducido (concertadamente con los genes bacterianos homólogos).

Por lo tanto, una forma aún más preferida de esta modalidad, se refiere a una bacteria Pasteurella multocida viva, atenuada, de acuerdo con la invención , que tiene como característica que está insertado el gen heterólogo en el gen que codifica Orf-15. El gen heterólogo puede llevar un promotor homólogo o cualquier otro promotor que se reconocido por la ARN-polimerasa de Pasteurella multocida. También se puede usar el promotor de Orf-15 natural. Esto podría ser arreglado muy fácilmente eliminando la secuencia codificadora de ORF-15 y reemplazándola por el gen heterólogo seleccionado. La construcción de esos portadores recombinantes puede efectuarse rutinariamente, utilizando técnicas comunes y corrientes en la biología molecular, como las descritas más arriba. En una forma muy preferida de esta modalidad, el gen heterólogo codifica uno o más antígenos, seleccionados del grupo de patógenos porcinos, que consisten del virus del síndrome respiratorio reproductor porcino (PRRS), el virus de pseudorrabia, el virus de la influenza porcina, el parvovirus porcino, el virus de gastroenteritis transmisible, rotavirus, circovirus porcino 1 o 2, Escherichia coli, Arysipelathrix rhusi opathiae, Bordetella bronchiseptica, Haemophilus parasuis, Mycoplasma hyopneumoniae y Streptococcus suis. En otra forma muy preferida de esta modalidad, el gen heterólogo codifica uno o más antígenos seleccionados del grupo de patógenos para el ganado vacuno, que consiste del hipervirus bovino, el virus de la diarrea viral bovina, el virus de parainfluenza tipo 3, el paramixovirus bovino, el virus de la fiebre aftosa, Pasteurella haemolytica, Straphylococcus aureus, Escherichla coli, Staphylococcus uberis, el virus sincitial respiratorio bovino, Theileria parva, Theileria annulata, Babesia bovis, Babesis bigemina, Babesia major, Trypanosoma species, Anaplasma margínale, Anaplasma céntrale o Neospora caninum. En otra forma todavía más preferida de esta modalidad, el gen heterólogo codifica uno o más antígenos, seleccionados del grupo de los patógenos para las aves, que consiste del virus de la viruela aviaria, el virus de la bronquitis infecciosa, la enfermedad bursal infecciosa (Gumboro), el virus de la enfermedad de Marek, el agente de anemia de los pollos, el reovirus aviario, Mycoplasma gallisepticum, el virus de rinotraqueítis de los pavos, Haemophilus paragallinarum (Coriza), el virus de la viruela de los pollos, el virus de encefalomielitis aviaria, el virus de la placa de patos, el virus del mal de Newcastle, el virus del síndrome de poner huevos, el virus de laringotraqueítis infecciosa, el virus del herpes de los pavos, las especies Emeria, Ornithobacterium rhinotracheale, Mycoplasma synoviae, Clostridium perfringens, Salmonella species y E. coli. Otra posibilidad atractiva es insertar, de preferencia en el gen Orf-1 5 , un gen que codifique una proteína implicada en disparar el sistema inmunológico, tal como una citoquina, una interleuquina o un interferón, u otro gen implicado en la regulación inmunológica. Debido a su carácter atenuado pero inmunógeno, inesperado, in vivo, las bacterias de acuerdo con la invención son muy adecuadas como base para vacunas vivas atenuadas. Así pues, otra modalidad de la presente invención se refiere a una vacuna viva atenuada para la protección de animales o humanos contra infección por Pasteurella multocida o sus efectos patógenos, que comprende una bacteria viva atenuada de acuerdo con la invención y un portador aceptable para uso farmacéutico. Dichas vacunas comprenden una cantidad inmunógenamente efectiva de una bacteria viva atenuada de acuerdo con la invención .

Inmunógenamente efectiva significa que la cantidad de bacterias vivas atenuadas, administradas en la vacunación , es suficiente para inducir en el huésped una respuesta inmunológica efectiva contra las formas virulentas de la bacteria. Además de una cantidad inmunógenamente efectiva de la bacteria viva atenuada , descrita arriba, una vacuna de acuerdo con la presente invención contiene también un portador farmacéuticamente aceptable. Dicho portador puede ser tan simple como agua , pero también puede comprender, por ejemplo, fluido de cultivo en el que se cultivó la bacteria. Otro portador adecuado es, por ejemplo, una solución de concentración fisiológica de sal . La dosis útil para ser administrada variará , dependiendo de la edad , el peso y del animal vacunado; del modo de administración y del tipo de patógeno contra el que se dirige la vacunación . Los ejemplos que vienen más adelante ejemplifican las dosis adecuadas. Quien tenga experiencia en la materia estará en capacidad de extrapolar esas cifras para otras especies animales. La vacuna puede comprender cualquier dosis de bacterias suficiente para evocar una respuesta inmunológica efectiva. Las dosis por debajo de 1 02 bacterias vivas atenuadas no siempre pueden ser satisfactorias para estimular lo suficiente el sistema inmunológico; y las dosis por encima de 1010 bacterias vivas atenuadas no son muy atractivas desde el punto de vista económico.

Usualmente las dosis que varían entre 103 y 109 bacterias son dosis muy adecuadas.

Opcionalmente se puede añadir a la vacuna uno o más compuestos que tengan actividad adyuvante. Una bacteria Pasteurella multocida viva, atenuada, de acuerdo con la invención , no necesita por necesidad dicho adyuvante para ser eficaz; pero podría valer la pena añadir un adyuvante, especialmente para vacunas de combinación que comprenden la bacteria Pasteurella multocida viva, atenuada, de acuerdo con la invención , y material antígeno procedente de otro virus u otro microorganismo patógeno (ver más adelante). Los adyuvantes son estimuladores no específicos del sistema inmunológico. Incrementan la respuesta inmunológica del huésped a la vacuna. Los ejemplos de adyuvantes conocidos en el arte son los adyuvantes completo e incompleto de Freund , la vitamina E, los polímeros no iónicos de bloques, los dipéptidos de muramilo, los ISCOM(complejos estimuladores inmunológicos; ver, por ejemplo, la patente europea EP 1 09942), las saponinas, el aceite mineral , el aceite vegetal , y Carbopol . Los adyuvantes especialmente adecuados para aplicación mucosal son , por ejemplo, la toxina térmicamente lábil (LT) de E. coli o la toxina de Cholera (CT). Otros adyuvantes adecuados son, por ejemplo: el hidróxido de aluminio, el fosfato de aluminio o el óxido de aluminio, las emulsiones en aceite (por ejemplo, de Bayol F® o de Marcol 52®, las saponinas o un solubilizado de vitamina E . El uso de tales adyuvantes se prefiere especialmente si se añaden otras vacunas virales o de subunidad, por ejemplo, en el caso de una vacuna combinada de Pasteurella multocida. Por lo tanto, en una forma preferida de esta modalidad, la vacuna viva atenuada de acuerdo con la presente invención incluye un adyuvante. Otros ejemplos de portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables, útiles en la presente invención, incluyen estabilizadores, tales como SPGA, carbohidratos (por ejemplo, sorbitol, mannitol, almidón, sacarosa, glucosa, dextrano), proteínas, tales como albúmina o caseína; agentes que contienen proteínas, tales como suero bovino o leche descremada, y reguladores (por ejemplo, regulador fosfato). Especialmente cuando se añaden esos estabilizadores a la vacuna, la vacuna es muy adecuada para secado por congelación. El secado por congelación tiene la ventaja de que el material secado por congelación no requiere de condiciones de almacenamiento especializadas, tales como almacenamiento por debajo de los -20°C o incluso -80°C. Por lo tanto, en una forma más preferida de esta modalidad, la vacuna viva atenuada está en forma secada por congelación. En una vacuna que comprende una bacteria de acuerdo con la invención , como se describe más arriba, es benéfico incluir antígenos derivados de otro microorganismo, o un virus patógeno para los humanos o los animales, o un anticuerpo contra dicho antígeno.

Hay varias maneras de obtener dicha vacuna. Una aproximación fácilmente aplicable es mezclar una cepa de Pasteurella multocida viva, atenuada, de acuerdo con la invención, con uno o más antígenos de otros patógenos para humanos o animales, y un portador aceptable para uso farmacéutico. Así, una forma todavía más preferida de esta modalidad, se refiere a una vacuna viva atenuada, de acuerdo con la invención, que está caracterizada porque comprende adicionalmente uno o más antígenos, seleccionados del grupo de virus y microorganismos patógenos para los humanos y/o los animales. De preferencia, dichos antígenos son seleccionados del grupo de patógenos porcinos, bovinos o aviarios, descrito más atrás. Nuevamente, otra modalidad de la invención se refiere a la bacteria viva atenuada de acuerdo con la invención, para usarla en una vacuna. Otra modalidad más de la invención se refiere al uso de una bacteria viva atenuada, de acuerdo con la invención, para la fabricación de una vacuna para la protección de humanos o animales contra infección por una bacteria Pasteurella multocida, o contra los efectos patógenos de la infección. Para administración a animales o humanos, se puede dar la vacuna de acuerdo con la presente invención, entre otras, por vía intranasal, subcutánea, oral, o mediante aerosol o intramuscularmente. Para aplicación a aves de corral, son especialmente adecuadas las formas de administración orales (en el agua de beber), por aspersión y como gotas para los ojos, aun si sólo es por la facilidad de dichas rutas de administración . Quien tenga experiencia en la materia sabrá cómo administrar una vacuna de acuerdo con la invención, debido a que el método no diferirá significativamente de los métodos seguidos para la vacunación con las vacunas de Pasteurella multocida existentes en la actualidad , especialmente las vacunas de Pasteurella multocida vivas, atenuadas. Una vacuna de conformidad con la invención , especialmente cuando se usa para aves, de preferencia se administra oralmente a través del agua de beber, o por aspersión . Otra modalidad adicional de la invención se refiere a los métodos para preparar una vacuna de acuerdo con la invención . Dichos métodos comprenden mezclar una bacteria viva atenuada, de acuerdo con la invención , y un portador aceptable para uso farmacéutico. Dado el hecho de que la enfermedad provocada por Pasteurella multocida en la mayoría de los casos es sumamente contagiosa, sería sumamente benéfico el tener una herramienta rápida y fácil , una prueba de diagnóstico, para la detección temprana de la infección por Pasteurella multocida en animales. Dichas pruebas de diagnóstico deben ser rápidas y selectivas, en el sentido de que deben proveer detección temprana y deben ser específicas para Pasteurella multocida, y no deben dar reacciones falsas positivas con otras bacterias, independientemente de si las demás bacterias pertenecen a otra especie de Pasteurella o son especies diferentes de Pasteurella. Las pruebas de diagnóstico basadas en la presencia o ausencia de anticuerpos contra Pasteurella multocida, aunque frecuentemente son confiables, no son muy atractivas si es necesaria la detección temprana de las bacterias. Esto se debe al hecho de que el desarrollo de anticuerpos en el animal infectado contra Pasteurella multocida puede tardar fácilmente dos semanas. Por lo tanto, es otro objetivo de esta invención proveer herramientas de diagnóstico adecuadas para la detección temprana y específica de infección por Pasteurella multocida. Fue sorprendente descubrir ahora que la secuencia del gen rf-15 es única para Pasteurella multocida, y que no está presente en otras pasteureláceas. Por lo tanto, otra modalidad se refiere a pruebas basadas en ARN o en ADN , para la detección de Pasteurella multocida. Una prueba de diagnóstico para la detección de Pasteurella multocida, por ejemplo, se basa en la reacción del ADN o el ARN aislado del animal que se va a analizar, con sondas específicas para ello, por ejemplo, una prueba de (RT-)RCP basada en la secuencia del gen Orf-15, o basada en secuencias de ácido nucleico que son complementarias de aquella secuencia. Si están presentes moléculas de ácido nucleico, específicas para las proteínas asociadas con Pasteurella multocida, de acuerdo con la invención, en el animal, éstas se unirán, por ejemplo específicamente, a sensibilizadores de RCP específicos, y posteriormente se las amplificará en una reacción de (RT-)RCP. El producto de la reacción de RCP puede ser detectado entonces con facilidad en electroforesis de ADN en gel . Las reacciones de (RT-)RCP son bien conocidas en el arte (ver la referencia que viene más adelante). Las moléculas de ácido nucleico pueden ser aisladas más fácilmente del tejido afectado de fluidos del cuerpo del animal que se va a analizar. En los cerdos, una torunda nasal de material procedente del tejido pulmonar afectado, provee material adecuado para la prueba de (RT-)RCP. Las torundas traqueales o el material traqueal de tejido hepático, pulmonar o cardiaco afectado, sería la fuente preferida en pollos. En los búfalos, las ovejas y el ganado vacuno, los órganos seleccionados serían la nariz y el tejido pulmonar afectado. Los libros de texto referentes a RCP estándar dan métodos para determinar la longitud de los sensibilizadores para las reacciones de RCP selectivas con moléculas de ácido nucleico específicas para el gen Orf-1 5, de acuerdo con la invención . Frecuentemente se usan sensibilizadores con una secuencia de nucleótidos de por lo menos 1 2 nucleótidos; pero los sensibilizadores con más de 1 5 nucleótidos, más preferible, con más de 1 8 nucleótidos, son un tanto más selectivos. Por lo general son muy aplicables especialmente los sensibilizadores que tienen una longitud de por lo menos 20 nucleótidos, de preferencia por lo menos 30 nucleótidos. Las técnicas de RCP están descritas extensamente en (Dieffenbach y Dreksler, PCR primers, a laboratory manual, I SBN 0-87969-447-5 ( 1 995)). Las moléculas de ácido nucleico del gen Orf-1 5, o partes de esas moléculas de ácido nucleico que tienen una longitud de por lo menos 12, de preferencia 1 5, más preferible 1 8, todavía más preferible 20, 22, 25, 30, 35 o 40 nucleótidos, en ese orden de preferencia, o las moléculas de ácido nucleico complementarias de ellas, por lo tanto, también son parte de la invención . Dichas moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, pueden ser usadas como sensibilizadores en las reacciones de (RT-)RCP, a fin de acrecentar la cantidad de ácido nucleico que codifica las proteínas de acuerdo con la invención . Esto permite la amplificación rápida de las secuencias de nucleótidos específicas para uso como herramienta de diagnóstico, por ejemplo , para detectar Pasteurella multocida en tejido, tal como se indicó con anterioridad aquí. Tanto las reacciones de RCP como las reacciones de hibridación son bien conocidas en la técnica y, entre otros, están descritas en Maniatis/Sambrook (Sambrook, J . y coautores, Molecular cloning: a laboratory manual, ISBN 0-87969-309-6). Por lo tanto, otra modalidad de la invención se refiere a una prueba de diagnóstico para detectar Pasteurella multocida, asociada con ADN o con ARN ; donde esa prueba tiene un aspecto característico que comprende una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de ácido nucleico como la ilustrada en SEQ I D NO: 1 , o una molécula de ácido nucleico que es complementaria con dicha secuencia de ácido nucleico, o un fragmento suyo que tiene una longitud de por lo menos 1 2 nucleótidos, de preferencia por lo menos 1 5 nucleótidos, más preferible, por lo menos 1 8 nucleótidos. Ejemplos Eiemplo 1 Selección de mutante de P-1059 espontáneo, resistente del ácido nal id íxico. Se cultivó una cepa de Pasteurella multocida en caldo de Luria-Bertani (LB ) a 37°C durante la noche. Se esparció 0.2 mL de cultivo sobre placas de agar LB que contenían 1 0 mg/mL de ácido nalidíxico y se incubó a 37°C durante 48 horas. Se recogió un par de colonias resistentes, y se rayó con ellas nuevamente placas de agar LB que contenían ácido nalidíxico. Después de otras 48 horas de incubación se recolectó una colonia resistente y se la inoculó en 1 0 mL de caldo LB que conten ía 20 mg/mL de ácido nalid íxico y se cultivó durante la noche. Se mezcló el cultivo con 5 mL de glicerol ; se formaron al ícuotas en tubos de 1 .8 mL ( 1 mL por tubo) y se almacenaron a -70°C. La cepa resistente al ácido nalid íxico fue designada P-1 059N R. Eiemplo 2 Selección de mutante thyA de P-1059N R espontáneo Se cultivó P-1 059N R en caldo de LB que contenía 20 mg/mL de ácido nalidíxico y 10 mg/mL de timina a 37°C, durante la noche. Se esparció 0.2 mL del cultivo sobre una placa de LB que contenía 20 mg/mL de ácido nalidíxico, 1 0 mg/mL de trimetoprim y 50 mg/mL de timina, y se incubó a 37°C durante 24-48 horas. Se transfirieron diez colonias a la misma clase de placa, y la placa de LB que contenía únicamente 20 mg/mL de ácido nalid íxico y 1 0 mg/mL de trimetoprim. Las colonias que crecieron en la primera placa, pero no en la segunda placa, fueron mutantes thyA . Se inoculó uno de los mutantes thyA en 1 0 mL de caldo de LB que conten ía 20 mg/mL de ácido nalid íxico y 1 50 mg/mL de timina, y se incubó a 37°C durante la noche. Se mezcló el cultivo con 5 mL de glicero, se formó al ícuotas de 1 mL por tubo, y se almacenó a -70°C. El mutante thyA almacenado fue designado P981 8. Eiemplo 3 Construcción de pYL1 .3 en vector Tn Se amplificó el gen thyA de E. coli mediante reacción en cadena en polimerasa (RCP) a partir del ADN genómico de E. coli K-1 2, con sensibilizadores de 5'-AAGCTTGGCTGTCTCAGGTTTGTTCC-3' y 5'-TAGCTTGGCCAGTTTCTATTTCTTCG-3' . Se ajusta el fragmento de RCP con ADN-polimerasa de T4 más dGTP. Se digirió pLOF/Ptt (Herreno, M . , de Lorenzo, V. , Timmis, K. N . , J. Bacteriology, 1 72, 1 990, 6558-6567), con Xbal y Sf para eliminar el gen Ptt y se llenó parcialmente con la enzima Klenow y dCTP. Se ligó el fragmento de RCP ajustado (un extremo) al extremo parcialmente lleno de Xbal del plásmido digerido. Se trunca el otro extremo del fragmento de RCP y el extremo de Sfi del plásmido digerido , con ADN-polimerasa de T4 y dNTP. Se autoligó este plásmido tratado con el fragmento de RCP ligado, y se lo transformó a SM 1 0 de E. coli. Se purificó un transformante que contenía el plásmido de tamaño correcto, se formó al ícuotas cultivadas y se almacenó a -70°C. Se designó el plásmido en este transformante pYL1 .3. Eiemplo 4 Construcción de banco de mutantes Tn de P. multocida Se cultivó P981 8 en caldo de LB ' 200 mg/mL de timina, a 37°C, con sacudimiento vigoroso, durante alrededor de 48 horas. Se cultivó SM 1 0 de E. coli que contenía pYL1 .3, en caldo de LB durante la noche. Se mezcló 0.1 m L de cultivo de P981 8 y SM 1 0 de E. coli, se esparció sobre LB + ( 1 00 mg/mL de I PTG + ' 1 0 mM de MgSO4 + 200 mg/mL de timina) y se incubó a 37°C durante la noche. Se lavó la capa bacteriana de las placas se recolectó. Se esparció 0.1 mL de la suspensión recogida sobre placas LB + 20 mg/mL de ácido nalid íxico y se incubó a 37°C durante 48 horas. Se recogió aproximadamente 1 50 transconjugantes y se volvió a rayar sobre placas LB + 20 mg/mL de ácido nalidíxico, para purificación. Se cultivó estos transconjugantes en caldo LB + 20 mg/mL de ácido nalid íxico y se almacenó a -70°C. Se volvió a rayar estos transconjugantes, simultáneamente, sobre placas LB + 20 mg/mL de ácido nalidíxico y placas LB + 20 mg/mL de ácido nalid íxico + 25 mg/mL de ampicilina, para seleccionar los mutantes de transposón . Se volvió a cultivar los transconjugantes (aproximadamente 1 20) que crecieron únicamente en placas LB + 20 mg/mL de ácido nalid íxico, en caldo LB + 20 mg/mL de ácido nalid íxico, se formaron alícuotas y se almacenó a -70°C.

Eiemplo 5 Caracterización (mancha Southern) de los mutantes de transposón. Se cosechó aleatoriamente varios mutantes 17 Tn y se los cultivó en caldo LB + 20 mg/mL de ácido nalidíxico. Se extrajo los ADN genómicos de los mutantes, usando un equipo QIAmp (QIAGEN, Inc., Valencia, CA, E. U. A.). Se digirió los ADN con Hindlll. También se incluyó, como control, ADN genómico de P-1059, digerido con Hindlll, pGP704 (Herreno, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N., J. Bacteriology, 172, 1990, 6557-6567) y pYL1.3. Se llevó a cabo un manchado Southern mediante métodos estándar (Sambrook y otros, eds., Molecular Cloning, 2a. edición, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, E. U. A., 1989). Se usó un etiquetado de ADN DIG y un equipo de detección (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, E. U. A.), para marcar la sonda y para la mancha Southern. Se marcó el gen thyA de E. coli amplificado por pGP704 y RCP, con digoxigenina y se sondeó los ADN genómicos digeridos, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados mostraron que la mayoría de los mutantes fueron mutantes por transposición, con una inserción de Tn y unos pocos mutantes fueron mutantes por integración de plásmido. Los mutantes de transposón así obtenidos fueron comprobados en cuanto a su comportamiento atenuado, en pruebas estándar con animales.

De los mutantes por transposón que se comportaron como atenuados, se identificó el sitio de inserción del transposón , y se secuenció el gen alterado . Uno de los mutantes por transposón encontrados es la cepa P 1 5 de Pasteurella multocida ilustrada (abreviado cepa P1 5). Este mutante tiene el transposón insertado en Orf-1 5. Esta cepa es la que se ha utilizado para los experimentos de vacunación en el siguiente ejemplo. Eiemplo 6 Experimentos de vacu nación En estos experimentos se efectuó la vacunación junto con vacunación contra la enfermedad de Newcastle. Esto se hizo debido a que la vacunación con una vacuna de Pasteurella multocida y una vacuna contra la enfermedad de Newcastle, en la práctica veterinaria, se efectuarían de preferencia el mismo d ía, incluso al mismo tiempo . La ventaja de la aproximación experimental descrita aquí , por lo tanto, es que adicionalmente da una impresión acerca del comportamiento de ia vacuna bajo las condiciones de campo . Cultivos de vacuna de PM Se usó cultivos frescos de la cepa P1 5 de Pasteurella multocida en TPB para vacunación mediante aerosol . Se determinó el título de infectividad inmediatamente después del uso. Los cultivos de cepa P1 5 de Pasteurella multocida usados para sensibilizar comprend ían 1 .5 x 1 08 CFU/mL y los cultivos usados para refuerzo comprend ían 1 .6 x 1 09 CU F/mL.

Para administración en agua de beber, se centrifugó 500 mL de cada cultivo y se disolvió la pella en 500 mL de solución de leche descremada. El cultivo de la cepa P1 5 de Pasteurella multocida usado para sensibilizar comprendía 1 .2 x 1 08 CFU/mL y el cultivo usado para el refuerzo comprend ía 1 .3 x 109 CFU/mL. Cultivos N D Los cultivos de vacuna N D contenían 7.3 EI D50 (Dosis infecciosas de huevo) por dosis, por ave. Se administró el agua a pavos para que bebieran ad libitum. Agrupamiento y dosificación Tabla 1 : Esquema de tratamiento Vacunación Ver la tabla 1 para el esquema de tratamiento. Todas las aves fueron vacunadas por aspersión con vacuna N D, usando una lata de aspersión . Se efectuó la vacunación con la cepa P 1 5 mediante aerosol , utilizando un rociador de pintura (las aves permanecieron en el aerosol durante 1 0 minutos, con la circulación de aire cerrada), o mediante el agua de beber. Para la vacunación en el agua de beber, se centrifugó 500 mL de cultivo fresco y se volvió a suspender en 500 mL de leche descremada al 2 por ciento (20 g de leche descremada/litro de agua). Se retiró el agua de los pavos durante al menos seis horas antes de vacunar. Se administró 500 mL de cultivo de vacuna en una torre de agua de beber. Después de la vacunación se aplicó agua de beber normal , de la manera usual . Desafíos con Pasteurella multocida Se efectuó el desafío mediante inyección intramuscular ( 1 .0 mL en la pechuga) de un cultivo fresco, diluido, de una cepa de serotipo 1 de Pasteurella multocida de tipo silvestre, que contenía 1 .5 x 1 05 CFU/mL. Se preparó el cultivo de desafío en TPB como cultivos frescos de 5 horas. Se registró la mortandad diariamente durante siete d ías. Se hizo el intento de aislar P. multocida del hígado de las aves que murieron y de todas las demás aves, a los siete d ías después del desafío, Análisis estadístico Se comparó la mortandad usando la prueba exacta de Fischer ( Statistix para Windows, versión 2.0). Tabla 2: Resu ltados resumidos después de la vacunación Tabla 3 : Resu ltados resumidos después del desafío negrita: significativamente diferente de los controles. Resultados y conclusión Las observaciones posteriores a la vacunación están resumidas en la tabla 2. Después de las vacunaciones y antes del desafío murieron dos aves en el grupo de P1 5 en aerosol ; cero en el grupo de P 1 5 en el agua de beber, y cero en el grupo de control . Esta mortandad probablemente está relacionada con las cepas de vacuna , puesto que no se encontró mortandad en el grupo de control . El examen post-mortem después de la vacunación mostró que la ruta del aerosol indujo ligeramente más anormalidades (lesiones medias en el saco de aire, que se podrían atribuir a las cepas de vacuna), en comparación con el grupo del agua de beber. Las observaciones posteriores al desafío están resumidas en la tabla 3 y en la figura 1 . Después de un desafío heterólogo letal ( 1000 x LD50) se encontraron varios niveles de protección. La ruta de vacunación por aerosol pareció la ruta más eficaz ( 1 00 por ciento), seguida por la ruta del agua de beber (81 por ciento). De los resultados se puede concluir que los mutantes Orf-1 5 de Pasteurella multocida de acuerdo con la invención son cepas muy adecuadas para uso como cepas atenuadas en vacunas. La mortandad observada después de la vacunación fue la dosis más alta posible (> 1 09 CFU/mL). Se debe tener en cuenta que tanto la dosis de vacunación como la dosis de desafío usadas en este experimento son altas. La dosis de vacuna puede ser reducida fuertemente hasta un nivel en el que no se observe mortandad ni señales de ella. También se puede reducir fuertemente la dosis de desafío ( 1 00x LD50). Conclusión De los resultados se puede concluir que los mutantes Orf-1 5 de Pasteurella multocida de acuerdo con la invención proveen una base muy buena para vacunas de Pasteurella multocida viva , atenuada, eficaz y segura . Leyendas en las figuras : Figura 1 : Esta figura muestra una comparación de la mortandad acumulativa de animales vacunados (vacunación a través del agua de beber y vacunación por aerosol ) contra los animales de control , después del desafío.

Claims (1)

1. REIVIN DICACIONES 1 , Bacteria Pasteurella multocida viva, atenuada; donde dicha bacteria no es capaz de expresar una proteína Orf-1 5 funcional . 2. Bacteria viva atenuada de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la bacteria no es capaz de expresar una proteína Orf-1 5 funcional debido a una mutación en el gen Orf-1 5. 3. Bacteria viva atenuada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la mutación comprende una inserción y/o una eliminación . 4. Bacteria viva atenuada de conformidad con las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la bacteria lleva un gen heterólogo que codifica uno o más antígenos seleccionados del grupo de virus y microorganismos patógenos para los humanos y/o los animales. 5. Bacteria atenuada viva de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el gen heterólogo está insertado en el gen que codifica Orf-1 5. 6. Bacteria viva atenuada de conformidad con la reivindicación 4 o 5, caracterizada porque el antígeno o los antígenos están seleccionados del grupo que consiste de: virus del síndrome respiratorio de reproducción porcina (PRRS), virus de pseudorrabia, virus de influenza porcina, parvovirus porcino, virus de gastroenteritis transmisible, rotavirus, circovirus porcino 1 o 2, Escherichia coli, Erysipelothrix rhuslopatiae, Bordetella bronchiseptica, Haemophilus parasuis, Mycoplasma hyopneumoniae y Streptococcus suis. 7. Bacteria viva atenuada de conformidad con la reivindicación 4 o 5, caracterizada porque el antígeno o los antígenos están seleccionados del grupo que consiste de: virus de herpes bovino, virus de diarrea viral bovina, virus de parainfluenza tipo 3, paramixovirus bovino, virus de la fiebre aftosa, Pasteurella haemolytica, Staphylococcus aureus, Staphylococcus uberis, Escherichia coli, virus sincitial respiratorio bovino, Theileria parva, Theileria annulata, Babesia bovis, Babesia bigenina, Babesia major, Trypanosoma species, Anaplasma margínale, Anaplasma céntrale o Neospora caninum. 8. Bacteria viva atenuada de conformidad con la reivindicación 4 o 5, caracterizada porque están seleccionados uno o más antígenos del grupo que consiste del virus de la viruela aviar, el virus de la bronquitis infecciosa, la enfermedad bursal infecciosa, el virus de la enfermedad de Marek, el agente de la anemia en pollos, el reovirus aviar, Mycoplasma gallisepticum, el virus de rinotraqueítis en pavos, Haemophilus paragallinarum, el virus de viruela de pollos, el virus de encefalomielitis aviar, el virus de plaga de los patos, el virus de la enfermedad de Newcastle, el virus del síndrome de poner huevos, el virus de laringotraqueítis infecciosa, el virus de herpes en pavos, Eineria species, Ornithobacterium thinotracheale, Mycoplasma synoviae, Clostridium perfringens, Salmonella species y E. coli. 9. Vacuna viva atenuada para la protección de animales o humanos contra infección por Pasteurella multocida o sus efectos patógenos, caracterizada porque la vacuna comprende una bacteria viva atenuada de conformidad con las reivindicaciones 1 a 8, y un portador aceptable para uso farmacéutico. 1 0. Vacuna viva atenuada de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque comprende un adyuvante. 1 1 . Vacuna viva atenuada de conformidad con la reivindicación 9 o 1 0, caracterizada porque está en forma secada por congelación . 1 2. Vacuna viva atenuada de conformidad con la reivindicación 9-1 1 , caracterizada porque comprende adicionalmente uno o más antígenos seleccionados del grupo de virus y microorganismos patógenos para los humanos y/o los animales. 1 3. Bacteria viva atenuada de conformidad con la reivindicación 1 -8, para usarla en una vacuna . 1 4. El uso de una bacteria viva atenuada de conformidad con la reivindicación 1 -8, para la fabricación de una vacuna para la protección de humanos o animales contra infección con una bacteria Pasteurella multocida, o los efectos patógenos de la infección . 1 5. Método para preparar una vacuna de conformidad con las reivindicaciones 9 a 1 2, caracterizado porque el método comprende mezclar una bacteria viva atenuada como se definió en las reivindicaciones 1 a 8, y un portador aceptable para uso farmacéutico. 1 6. Prueba de diagnóstico para la detección de ADN o ARN asociados con Pasteurella multocida, caracterizada porque la prueba comprende una molécula de ácido nucleico como la ilustrada en SEQ I D NO: 1 , o una molécula de ácido nucleico que es complementaria con dicha secuencia de ácido nucleico, o un fragmento de ella que tenga una longitud de por lo menos 1 2 nucleótidos, de preferencia por lo menos 1 5, más preferible, por lo menos 1 8 nucleótidos.