JP5451619B2 - 弱毒マイコプラズマガリセプティクム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株 - Google Patents

弱毒マイコプラズマガリセプティクム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株 Download PDF

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Description

本発明は、微生物学および免疫学の分野に関する。より詳細には、本発明は、細菌病原体に対する新規ワクチンに関する。
マイコプラズマは、モリクテス網に属する小さな原核生物（０．２〜０．３μｍ）である。モリクテス網のメンバーは、細胞壁をもたず、小さなゲノムサイズを有する。モリクテスには、少なくとも１００種のマイコプラズマが含まれる。マイコプラズマ諸種は、ヒトおよび非ヒト動物ならびに植物におけるいくつかの疾患の原因病原体である。Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）は、例えば、家禽におけるかなりの疾患状態の原因となっている。Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）は、ニワトリおよびシチメンチョウにおける急性呼吸疾患に関連しており、狩猟鳥における上気道疾患も引き起こしうる。加えて、Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）は、北米のメキシコマシコにおける結膜炎の原因として認識されている。
Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）感染によって引き起こされる疾患を予防および管理するための効果的な戦略は、Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌の弱毒生菌株を用いたワクチン接種によるものである。弱毒生ワクチンの利点には、通常、その天然な形態にある感染病原体の重要な免疫原性決定基の全てを宿主の免疫系に提示すること、およびワクチン接種された宿主内におけるこの免疫剤の増殖能により、必要な免疫剤が比較的少量であることが含まれる。
弱毒生ワクチン株は、毒性株を培地中で複数回連続継代することによってしばしば作り出される。Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）に対する弱毒生ワクチン株は連続継代によって得られているが、そのような株は通常、分子レベルでは十分に特徴付けられていない。連続継代によって作られた弱毒株は、その微生物を、より毒性が低いが、依然として複製が可能なものにする変異を蓄積していると考えられている。しかし、弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株に関しては、弱毒化をもたらす変異の結果（例えば、弱毒株でその発現パターンが改変されているタンパク質のアイデンティティー）は、通常、未知である。
したがって、プロテオミクスレベルで特徴付けられており、かつワクチン製剤中で安全かつ有効である新規な弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）生菌の必要性が当技術分野に存在する。
本発明は部分的に、Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）感染に対するワクチンとしてトリで使用される場合、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの発現の低減を示すＭ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌が安全性および有効性の両方を有するという驚くべき発見に基づいている。配列番号１のポリペプチドは「ＭＧＡ＿０６２１」とも呼ばれ、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿８５２７８４を有する。
したがって、本発明は野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）と比較して低減しているＭＧＡ＿０６２１の発現を示す弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）生菌を対象とする。特定の非限定、例示的実施形態では、本発明は、ＭＧＡ＿０６２１の発現の低減を示し、かつ野生型Ｍ．（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）と比較して低減しているピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホピルビン酸ヒドラターゼ、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼおよびリボソームタンパク質Ｌ３５からなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質の発現をさらに示す弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）生菌株を提供する。本発明の特定の実施形態によれば、本発明の弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）生菌は、前述のタンパク質のうち１つまたは複数の発現が低減しているものとしてプロテオミクス分析で特徴付けられる。本発明の例示的一実施形態によれば、弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）生菌株は、野生型のＭ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌と比較して低減しているＭＧＡ＿０６２１、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホピルビン酸ヒドラターゼ、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼおよびリボソームタンパク質Ｌ３５の発現を示す株であり、この株は、２００７年６月１９日にアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、私書箱１５４９、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１０８に寄託され、受託番号ＰＴＡ−８４８５が割り当てられている。この株は、本明細書で、代替的に「Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株ＭＧｘ＋４７」または「ＭＧ−Ｐ４８」とも呼ばれる。
本発明は、本発明の弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）生菌を含むワクチン組成物と、Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）感染に対して動物にワクチン接種する方法とを提供する。
加えて、本発明は、弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）クローンを作製および／または同定する方法を提供する。本発明のこの態様によれば、この方法は、Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌の初期集団を弱毒化条件に供するステップと、ＭＧＡ＿０６２１の発現の野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）と比較した低減について個々のクローンをアッセイするステップと、病原性についてこのクローンを試験するステップとを含む。本発明のこの態様の方法によって産生されたＭ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）クローンは、ＭＧＡ＿０６２１の発現の低減を示し、かつ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホピルビン酸ヒドラターゼ、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼおよびリボソームタンパク質Ｌ３５からなる群から選択される１つまたは複数の追加タンパク質の発現の低減を示していてもよい。前述のタンパク質のうち少なくとも１つの、発現の低減を示す株は、野生型のＭ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌と比較して低減している病原性も示すことが好ましい。
弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株ＭＧｘ＋４７のタンパク質スポットを示す二次元（２−Ｄ）ポリアクリルアミドゲルの写真である。１９、４９、７４、１０８、１１４、１２７、１４７、１６６、１７５および２２５と付番された丸で囲まれているスポットは、野生型株Ｒ−９８０と比較してＭＧｘ＋４７で上方制御されているタンパク質に相当する。４０、６８、９８、９９、１３０、１３６および２１７と付番された丸で囲まれているスポットは、野生型株Ｒ−９８０と比較してＭＧｘ＋４７で下方制御されているタンパク質に相当する。
本発明は、ワクチン製剤中で使用するのに適した弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）生菌を対象とする。本発明のＭ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌は、ＭＧＡ＿０６２１と呼ばれるタンパク質の発現の低減を示す。特定の実施形態では、本発明のＭ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌は、同種の野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌におけるそれらのタンパク質の発現と比較して低減している、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホピルビン酸ヒドラターゼ、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼおよびリボソームタンパク質Ｌ３５からなる群から選択される１つまたは複数の追加タンパク質の発現をさらに示す。
ＭＧＡ＿０６２１は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿８５２７８４下で特定され、以下の１６２アミノ酸配列、すなわち、
ＭＴＲＴＭＫＮＫＫＡＫＫＫＥＲＲＦＴＤＬＳＡＤＬＤＥＥＶＥＫＩＤＰＥＹＥＤＦＫＥＩＫＩＥＫＮＫＤＮＱＶＩＤＫＮＤＰＦＦＹＳＥＳＦＥＥＡＲＩＱＬＩＫＤＫＫＶＥＶＫＫＥＥＥＫＶＱＥＴＴＶＫＮＫＩＳＥＡＫＫＥＥＡＫＤＶＹＩＤＳＳＬＥＩＡＳＱＥＰＬＴＫＧＭＨＦＹＴＮＳＲＩＩＲＫＶＲＥＣＡＫＮＫＧＬＳＩＳＲＬＩＴＭＩＬＤＫＳＩＫＥＥ（配列番号１）
を有する。
マイコプラズマガリセプティクム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）タンパク質の発現の低減
当業者ならば、弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌が、野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌細胞で通常発現されている１つまたは複数のタンパク質の発現の低減を示すかどうかについて、通常の分子生物学的技法を用いて決定できるであろう。弱毒細菌が、野生型細菌と比較して低減している特定のタンパク質（例えば、ＭＧＡ＿０６２１、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホピルビン酸ヒドラターゼ、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ、リボソームタンパク質Ｌ３５など）の発現を示すかどうかの決定は、当技術分野で知られているいくつかの方法によって実現できる。例示的な方法には、例えば、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの抗体ベースの定量的方法が含まれ、これらでは、対象とするタンパク質を検出し、かつそれに結合する抗体が使用される。加えて、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベルは概ね、それにコードされているタンパク質の量を反映しているので、核酸ベースの定量的方法も、弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌が、１つまたは複数のタンパク質の発現の低減を示すかどうか決定するのに使用できる。例えば、定量的な逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）方法を用いて、対象とする特定のタンパク質に対応するｍＲＮＡの量を測定することができる。多数の核酸ベースの定量的方法が当技術分野でよく知られている。
以下は、弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌が、タンパク質、例えば、ＭＧＡ＿０６２１の発現の低減を示すかどうか決定するのに使用できる限定的でない例示的方法である。
最初に、実質的に同じ培養培地中で、実質的に同じ条件下で、弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細胞の集団および野生型のＭ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細胞の集団を培養する。次に、これら２つの集団の細胞を細胞破壊条件に供する。破壊された細胞（またはそのタンパク質含有画分）を、平行して、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、次に、Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＭＧＡ＿０６２１タンパク質に結合する抗体（そのような抗体は当技術分野でよく知られている標準法を用いて取得できる）を使用するウエスタンブロッティングにかける。その後、それらの細胞に由来するタンパク質の量に比例する測定可能シグナルをもたらすために、標識された二次抗体を添加する。弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株が示すシグナルの量が、野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株が示すシグナルの量より少ない場合、この弱毒株は、野生型株と比較して低減しているＭＧＡ＿０６２１の発現を示していると結論できる。この例示的方法に関する変形、ならびにその代替法は、当業者には直ちに明らかであろう。
本発明は、タンパク質（例えば、ＭＧＡ＿０６２１、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホピルビン酸ヒドラターゼ、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ、リボソームタンパク質Ｌ３５など）の発現において、野生型株で観察される、そのタンパク質の発現と比較して、任意の度合いの低減を示す弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌を含む。特定の実施形態では、弱毒細菌は、野生型細菌と比較して少なくとも約５％少ないタンパク質の発現を示す。一例として、所与の量の野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株が特定のタンパク質１００単位の発現を示し、同じ量の候補弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株がこのタンパク質９５単位の発現を示す場合、この弱毒株は野生型細菌と比較して５％少ないこのタンパク質の発現を示すと結論される（「パーセント少ない発現」の計算についての追加例は本明細書中の他の箇所で詳述されている）。特定の他の実施形態では、弱毒細菌は、野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌と比較して少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％少ないこのタンパク質の発現を示す。さらに他の実施形態では、弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株は、野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌と比較して、このタンパク質の発現を全く示さない（すなわち、１００％少ない発現）。
本発明の特定の例示的実施形態では、弱毒細菌は、野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌と比較して、少なくとも５％少ないＭＧＡ＿０６２１の発現を示し、少なくとも５％少ないピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホピルビン酸ヒドラターゼ、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼおよびリボソームタンパク質Ｌ３５からなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質の発現を示してもよい。
本明細書で使用される場合、弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株が示す、特定のタンパク質の、野生型株と比較して「パーセント少ない発現」は、以下の式、すなわち、（Ａ−Ｂ）／Ａ×１００によって計算され、式中、Ａ＝野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株におけるそのタンパク質の相対発現レベルであり、Ｂ＝弱毒株におけるそのタンパク質の相対発現レベルである。例示を唯一の目的として、野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株が０．２５００単位のタンパク質「Ｙ」の発現を示し、Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）の弱毒株が０．１８５０単位のタンパク質「Ｙ」の発現を示した場合、その弱毒株は、野生型株と比較して、［（０．２５００−０．１８５０）／０．２５００×１００］＝２６％低減しているタンパク質「Ｙ」の発現を示すと言われる。本明細書における実施例３の表５は、Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）の例示的弱毒株について計算された、野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株と比較してパーセント少ない発現をさらに例示する例を提供する。
ワクチン組成物
本発明は、本発明の弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）生菌と、薬学的に許容できる担体とを含むワクチン組成物も含む。本明細書で使用される場合、「本発明の弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）生菌」という表現は、本明細書中の他の箇所で記載および／または特許請求されているいかなる弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）生菌も包含する。薬学的に許容できる担体は、例えば、水、安定化剤、保存剤、培養培地または緩衝剤でありうる。本発明の弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌を含むワクチン製剤は、懸濁液の形態もしくは凍結乾燥された形態、または代替として凍結された形態で調製できる。凍結される場合、凍結された際の安定性を増強させるために、グリセロールまたは他の同様な薬剤を添加することができる。
動物にワクチン接種する方法
本発明は、Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）感染に対して動物にワクチン接種する方法も含む。本発明のこの態様による方法は、本発明の弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）生菌を含む免疫学的に有効な量のワクチン組成物を動物に投与するステップを含む。本明細書で使用される場合、「本発明の弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）生菌」という表現は、本明細書中の他の箇所で記載および／または特許請求されているいかなる弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）生菌も包含する。「免疫学的に有効な量」という表現は、ワクチン接種の際に、動物体内で、保護的なレベルの抗体の産生を引き起こすのに必要なワクチン組成物の量を意味する。ワクチン組成物は、経口、鼻腔内、粘膜、局所的、経皮および非経口（例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下または筋肉内）経路を含めた、当技術分野で知られている任意な方法で動物に投与できる。投与は、無針送達装置を用いても実現できる。投与は、複数の経路を併用して、例えば、最初の投与は全身経路を用い、それに続く投与は、粘膜経路を用いるなどして実現できる。
弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株が投与される動物は、トリ、例えば、ニワトリまたはシチメンチョウであることが好ましい。この動物がトリである場合、製剤が直ちにまたは最終的にトリの呼吸器粘膜と接触するに至るように、本発明のワクチン製剤を投与できる。したがって、このワクチン製剤をトリに、例えば、鼻腔内、経口および／または眼内投与できる。トリ投与用のワクチン組成物は、上述の通り、かつ／またはエアロゾル（鼻腔内投与用）もしくは飲水中（経口投与用）を含めたスプレーによる投与に適した形態で処方できる。
スプレーまたはエアロゾルによって投与される本発明のワクチン組成物は、弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）生菌を小さな液体粒子中に組み込むことによって処方できる。これらの粒子は、約１０μｍ〜約１００μｍの初期液滴サイズを有しうる。そのような粒子は、例えば、ナップザックスプレー、孵化場スプレー（ｈａｔｃｈｅｒｙ ｓｐｒａｙ）、霧吹きスプレー（ａｔｏｍｉｓｔ ｓｐｒａｙ）用の市販のスプレー発生器を含めた従来のスプレー装置およびエアロゾル発生器によって生成できる。
弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）クローンを作製する方法
本発明の別の態様では、本発明は、弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）クローンを同定および／または作製する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌の初期集団を弱毒化条件に供し、それによって、推定弱毒細菌集団を産生するステップを含む。次に、ＭＧＡ＿０６２１の発現の野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌と比較した低減について、推定弱毒細菌集団の個々のクローンをアッセイする。ＭＧＡ＿０６２１の発現が低減しているものとして同定されたクローンは、その後、病原性について試験される。野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌と比較して、ＭＧＡ＿０６２１の発現の低減、および病原性の低減の両方を示すクローンが、弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）クローンとして同定される。
本発明のこの態様によれば、「Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌の初期集団」は、任意な量のＭ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌でありうる。この細菌は、特定の実施形態では、野生型細菌である。代替として、この細菌は、１つまたは複数の変異を含有しうる。しかし、この初期集団内の細菌は、クローン的に同じであるか、または実質的にクローン的に同じであることが好ましい。すなわち、この細菌は全て、単一の親Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌細胞に由来し、かつ／または同じか、もしくは実質的に同じ遺伝子型および／または表現型特性を有することが好ましい。
本明細書で使用される場合、「弱毒化条件」という用語は、Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌のゲノムに、１つまたは複数の遺伝的変化（例えば、ヌクレオチド変異）を導入する可能性を有する任意の条件または複数の条件の組合せを意味する。例示的な非限定的弱毒化条件には、例えば、培養中で細菌を継代すること、トランスポゾンなどのゲノム挿入可能な遺伝エレメント（例えばＭ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）ゲノムにランダムに挿入するトランスポゾン）で細菌を形質転換すること、細菌を１つまたは複数の変異原（例えば、化学変異原または紫外線）に供することなどが含まれる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで継代することによって細菌細胞が弱毒化される場合、この細胞は任意な回数、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０回、またはそれを超える回数継代しうる。
Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細胞の初期集団は、弱毒化条件に供された後、本明細書では、推定弱毒細菌集団と呼ばれる。推定弱毒細菌集団の個々のクローンは、例えば、細胞を連続希釈し、個々の細胞を適切な培地上にプレーティングすることを含めた標準的な微生物学技法によって取得できる。ひとたび得られれば、ＭＧＡ＿０６２１および／または１つもしくは複数の追加の特定タンパク質の発現の低減について、推定弱毒細菌集団の個々のクローンをアッセイする。弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌が、野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌細胞で通常発現されている１つまたは複数のタンパク質の発現の低減を示すかどうかを決定する方法は、本明細書の他の箇所で記載されている。例示的方法には、例えば、ＲＴ−ＰＣＲベースの方法およびウエスタンブロットなどが含まれる。
ＭＧＡ＿０６２１の発現が低減しているものとして同定された個々のクローンは、その細菌の野生型（非弱毒）バージョンによる感染に感受性である動物にこのクローンを投与することによって病原性について試験できる。本明細書で使用される場合、「野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌による感染に感受性である動物」は、野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌に曝露した後に、少なくとも１つの臨床症状を示す動物である。そのような症状は、当業者に知られている。例えば、例えばＭＧＡ＿０６２１の発現の低減を示す推定弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株の場合、この株を、例えば、シチメンチョウまたはニワトリ（これらは通常、野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）による感染に感受性である）に投与できる。家禽動物のＭ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）感染の臨床症状には、例えば、急性呼吸症状、心膜炎、肝周囲炎、気嚢炎、気管肥厚、体重増加の低減、繊毛消失、異常杯細胞、毛細血管膨満、リンパ球、形質細胞および／または偽好酸球の数の増加、ならびに一部の場合、卵産生の低減が含まれる。したがって、推定弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株が、ニワトリまたはシチメンチョウに投与された場合に、野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株に感染しているシチメンチョウまたはニワトリと比較してより少ないかつ／またはより軽度な症状をもたらすならば、推定弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株は「低減している病原性」を有すると考えられる。症状の任意の程度の低減から、病原性が低減しているものとして推定弱毒株が同定される。特定の実施形態では、推定弱毒株は無毒となる。
本発明によれば、野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌と比較して、ＭＧＡ＿０６２１（および／または１つまたは複数の追加の特定タンパク質）の発現の低減を示し、かつ低減している病原性を示すＭ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）クローンは弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）クローンである。（低減しているピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホピルビン酸ヒドラターゼ、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼおよびリボソームタンパク質Ｌ３５の発現と共に）低減しているＭＧＡ＿０６２１の発現を示す、本発明の例示的弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）生菌クローンは、ＭＧｘ＋４７と命名された株である。ＭＧｘ＋４７は、２００７年６月１９日にアメリカ培養細胞系統保存機関、私書箱１５４９、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８に寄託され、受託番号ＰＴＡ−８４８５が割り当てられた。
以下の実施例は、本発明の方法および組成物の例示であり、限定ではない。通常、分子生物学および化学で見出される、本開示に鑑みて当業者には明らかである、様々な条件およびパラメーターの他の適した改変および適応も本発明の趣旨および範囲に包含される。
（実施例１）
弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）生菌株の産出
野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株Ｒ９８０をｉｎ ｖｉｔｒｏで複数回継代することによって、新規弱毒マイコプラズマガリセプティクム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）生菌株を産出した。詳細には、野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株Ｒ−９８０の種材料０．１ｍＬを、２０ｍＬの改変フレイ（Ｆｒｅｙ）培地（Ｆｒｅｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．２９、２１６３〜２１７１頁（１９６８））（本明細書では「ＭＧ培養培地」とも呼ばれる）に接種した。これらの野生型細胞を、培地の色が明黄色に変化するまで培養した。続いて、これらの明黄色の培養物を用いて、上述の通りに新たなＭＧ培養培地に再接種した。このようにして、培養物を合計４７回継代した。この結果得られた株を、トリの群にワクチン接種し、続いて野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）に曝露することによって、弱毒化について試験した。曝露の２週間後にこのトリ全てを剖検し、マイコプラズマ関連の病態を観察した。高継代数の株（ｘ＋４７）は、マイコプラズマガリセプティクム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）感染に関連する臨床症状に対する防御をもたらした。ＭＧｘ＋４７と命名されたこの弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株は、２００７年６月１９日にアメリカ培養細胞系統保存機関、私書箱１５４９、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８に寄託され、受託番号ＰＴＡ−８４８５が割り当てられた。
（実施例２）
ニワトリにおける弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）生ワクチンの安全性および有効性の評価
この実施例では、実施例１で得られた新規なＭ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）ワクチン株ＭＧｘ＋４７の安全性および有効性をニワトリで評価した。
７１羽のＳＰＦ白色レグホンニワトリを下記の７つの群に分けた。
Figure 0005451619
群２、３、４ａ、４ｂおよび４ｃのニワトリに、４週齢で粗いスプレーによって投与された、トリ１羽あたり３．６２×１０７ＣＣＵ／ｍＬの弱毒株ＭＧｘ＋４７でワクチン接種した。７週齢で、群１および３のニワトリに、７．７４×１０５ＣＣＵ／ｍＬのマイコプラズマガリセプティクム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株Ｒ ０．５ｍＬで気管内（ＩＴ）曝露した。群１、２、３および５のニワトリの剖検を９週齢で行い、群４ａ、４ｂおよび４ｃのニワトリの剖検を、それぞれワクチン接種の７、１４および２１日後（ＤＰＶ）に行った。平均体重増加、心膜炎、肝周囲炎、気嚢炎および気管炎について、ニワトリを評価した。結果の概要を表２に示す。
Figure 0005451619
Figure 0005451619
Figure 0005451619
安全性表および有効性表の符号（表３および４）：
・「ワクチン接種有り」のトリは全て、粗いスプレーによって、１羽あたり３．６２×１０７ＣＣＵ／ｍＬのワクチン株ＭＧｘ＋４７でワクチン接種された。
・「曝露有り」のトリは全て、７．７４×１０５ＣＣＵ／ｍＬのマイコプラズマガリセプティクム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株Ｒ０．５ｍＬで気管内（ＩＴ）曝露された。
・検査日（表３：安全性表中）＝ワクチン接種の＃日後（ＤＰＶ）で表された、ニワトリが検査されたときにおける、ワクチン接種後の日数
・繊毛：「Ｎ」＝正常繊毛；「−」＝繊毛消失
・杯細胞／Ｍ（「−」＝正常な杯細胞；「＋」＝気管表面に粘液がある）
・毛細血管膨満（「−」＝膨満も炎症もない；「＋」＝中等度の毛細血管膨満または炎症；「＋＋」＝重度の毛細血管膨満または炎症）
・ＬＣ／ＰＣ＝リンパ球および形質細胞（「−」＝無し；「＋」＝少数；「＋＋＋＋」＝多数）
・ＰＭＮ＝偽好酸球（「−」＝無し；「＋」＝少数；「＋＋＋＋」＝多数）
群２のニワトリ（ワクチン接種有り、曝露無し）の組織学的分析は、群５のニワトリ（ワクチン接種無し、曝露無し）のものと実質的に同様であった（例えば、上記表２を参照）。これは、新たに産出されたＭＧｘ＋４７ワクチン株の安全性を実証している。
有効性に関しては、群３のニワトリ（ワクチン接種有り、曝露有り）は、群１のニワトリ（ワクチン接種無し、曝露有り）と比較して、有意に低減している気嚢炎を示した（例えば、表２および４を参照）。加えて、表４に例示されるように、群３のニワトリは、繊毛、杯細胞、毛細血管膨満、リンパ球および形質細胞（ＬＣ／ＰＣ）、偽好酸球（ＰＭＮ）および気管の厚さに関して、Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）感染の、より少ない組織学的徴候を示した（表４参照）。
したがって、この実施例は、ＭＧｘ＋４７が安全かつ有効な弱毒Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）生ワクチン株であることを実証する。
（実施例３）
ＭＧｘ＋４７ワクチン株のプロテオミクス特性分析
ＭＧｘ＋４７ワクチン株（実施例１および２を参照）を分子レベルで、より正確に特定する目的で、この株のプロテオミクス分析に着手した。
この実施例では、野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）株Ｒ−９８０および新規に同定されたワクチン株ＭＧｘ＋４７から、総タンパク質を単離した。各株からのタンパク質を二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、それに続いて、ゲル画像のコンピューター分析を行った（図１参照）。ワクチン株で示差的に発現されたタンパク質のスポットを同定した。野生型株と比較して、ワクチン株で無くなっているか、または有意に低減しているレベルで発現されているタンパク質のスポットをゲルから切り出した。
ＭＧｘ＋４７ワクチン株において、野生型Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）と比較して有意に低レベルで発現されている５つのスポットを同定した。これらのタンパク質スポットをそれぞれゲルから切り出して、酵素的に消化し、それに続いて、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）を用いたペプチド質量フィンガープリンティングを行った。各タンパク質スポットについて同定された質量分析スペクトルをペプチド質量データベースと比較して、上記タンパク質と、それらをコードする対応遺伝子とを同定した。この分析の結果の概要を以下の表に示す。
Figure 0005451619
これらの遺伝子産物の発現の低減は、「発現低減の倍率」で表すこともできる。例えば、表５では、株ＭＧｘ＋４７は、野生型ＭＧと比較して、それぞれ２．２、３．９、１．７、４．５および５．４倍低減しているａｃｏＡ、ｅｎｏ、ｄｅｏＣ、ｒｐｍｌおよびＭＧＡ＿０６２１の発現を示していると言うことができる。
表５に示したように、弱毒ＭＧｘ＋４７ワクチン生菌株で、野生型Ｒ−９８０株と比較して発現が有意に低減している５つの遺伝子産物、すなわち、ＡｃｏＡ、Ｅｎｏ、ＤｅｏＣ、ＲｍｐｌおよびＭＧＡ＿０６２１（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿８５２７８４として特定される仮想タンパク質）を同定した。発現の、最も大きな低減は、ＭＧＡ＿０６２１で観察された。したがって、ＭＧＡ＿０６２１発現の低減を引き起こす変異または増殖条件の結果として、Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）の弱毒化が起きている可能性が高い。したがって、ＭＧＡ＿０６２１の下方制御が、Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）の弱毒化株を産生するための効果的な戦略であるように考えられる。
明快な理解を目的として、図示および例示を用いて上記の発明を一部詳細に説明したが、本発明は、開示した特定の実施形態に限定されず、添付されている特許請求の範囲によって定義されている本発明の趣旨および範囲に包含されるあらゆる変更および修正も包含するものとする。
本明細書で言及した全ての出版物および特許は、本発明が属する当業者の技術レベルを示すものである。全ての出版物および特許を、個々の出版物または特許出願を具体的かつ個別的に参照により組み込むと示されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込む。
ＡＴＣＣ ＰＴＡ−８４８５

Claims (4)

  1. 受託番号ＰＴＡ−８４８５の下でＡＴＣＣに寄託されている弱毒化マイコプラズマガリセプティクム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）生菌。
  2. 請求項１に記載のマイコプラズマガリセプティクム生菌、及び薬学的に許容できる担体を含んでなるワクチン組成物。
  3. 免疫学的に有効な量の請求項２に記載のワクチン組成物を非ヒト動物に投与することを含む、マイコプラズマガリセプティクム感染に対して非ヒト動物にワクチン接種する方法。
  4. 直接注射、スプレー投与または飲水投与によって前記ワクチン組成物を前記動物に投与する、請求項３に記載の方法。
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