KR20120132455A - ｂｃｌ?２ 단백질 표적 펩타이드 및 이의 이용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암 유도 마커인 bcl-2 단백질 표적용 펩타이드, 이를 이용한 암 진단 키트 및 약물전달 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 암세포 발현 여부를 진단할 수 있는 저분자 진단 탐침 및 암의 치료 및 예방을 위한 약물 전달 물질로 이용될 수 있다.

Description

ｂｃｌ?２ 단백질 표적 펩타이드 및 이의 이용{PEPTIDES TARGETING THE BCL-2 PROTEIN AND USES THEREOF}
본 발명은 bcl-2 단백질 표적용 펩타이드, 이를 이용한 암 진단 키트 및 약물 전달 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 암 유도 마커인 bcl-2 단백질에 특이적으로 결합하는 진단 탐침용 저분자 펩타이드, 이를 이용한 암 진단 키트 및 약물 전달 물질에 대한 것이다.
인간의 몸을 구성하고 있는 가장 작은 단위인 세포는 정상적일 때 세포 내 조절기능에 의해 분열하며 성장하고 죽어 없어지기도 하면서 세포 수 균형을 유지한다. 어떤 원인으로 세포가 손상을 받는 경우, 치료를 받아 회복하여 정상적인 세포로 역할을 하게 되지만, 회복인 안 된 경우는 스스로 죽게 된다. 그러나 여러 가지 이유로 인해 이러한 증식과 억제가 조절되지 않는 비정상적인 세포들이 과다하게 증식할 뿐만 아니라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴 형성 및 정상 조직의 파괴를 초래하는 상태를 암(cancer)이라 정의한다. 암은 이렇듯 억제가 안 되는 세포의 증식으로, 정상적인 세포와 장기의 구조와 기능을 파괴하기에 그 진단과 치료의 중요성은 매우 크다.
“세포사멸”이라고 하는 아폽토시스(apoptosis)는, 세포가 유전자에 의해 제어되어 죽는 방식으로 괴사나 병적인 원인으로 세포가 죽는 네크로시스(necrosis)와 구별된다. 아폽토시스는 발생 과정에서 몸의 구성을 담당하고, 다 자란 후에는 불필요한 부분을 제거하여 항상성을 유지하는 역할을 한다. 즉, 생리적으로 발생하는 예정된 세포의 죽음으로 원치 않는 세포가 제거되는 자연적 과정을 말한다. 그러나 만약 아폽토시스가 일어나야 하는 부분에서 일어나지 않거나, 과도한 세포사멸이 일어날 경우 각종 질병으로 이어지게 된다. 현재 종양의 발생과 진행에서 아폽토시스와의 관계에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.
이러한 아폽토시스에 관여하는 단백질 중에 bcl-2 단백질이 있다. 이 bcl-2 단백질이 과다한 활성을 가지고 있을 경우 세포사멸사가 억제되고 돌연변이가 일어난 세포(종양)가 증식하여 결국 암세포로 발전하게 되는 것이다. 암의 초기 단계에서는 특별한 증상이 없는 경우가 많고, 증상이 비특이적이기 때문에 다른 질환과의 구분이 어렵다.
상기와 같은 이유로, 세포사멸사 경로를 조절하는 단백질의 연구가 필요하다. 세포사멸사 경로를 조절하는 단백질인 bcl-2 패밀리는 미토콘드리아에 의한 고유의 아폽토시스 경로(intrinsic apoptosis pathway)에 작용하는 단백질로서 다양한 종류가 존재한다. bcl-2 패밀리는 단백질의 종류에 따라 아폽토시스를 일으키기도 하고 항-아폽토시스(anti-apoptosis)를 일으키기도 한다.
좀 더 구체적으로, 세포사멸사는 bcl-2 패밀리 단백질에 의해서 주로 조절되는데, bcl-2 패밀리는 크게 세포사멸사를 억제하는 단백질(bcl2, bclxl, bclw, Mcl1, A1)과 세포사멸사를 유발하는 단백질(bad, PUMA, H가, bcl-G, Noxa, bim, bcl-rambo, bax, bik, bid, bmf)로 나눌 수 있다. 이들 bcl-2 패밀리 구성원은 서로 결합하여 호모다이머(homodimer) 및 헤테로다이머(heterodimer)로서 복잡한 조절 체계를 구성하며, bcl-2 패밀리 단백질의 상대적 비율은 세포사멸사의 반응 정도를 결정하는 중요한 인자이다. 이들은 주로 미토콘드리아에서 작용을 하게 되는데, 프로-아폽토시스 조절자(pro-apoptosis regulator)는 사이토크롬 C의 유출에 관여함으로써 아폽토시스를 일으키게 된다. 프로 생존(pro-survival)은 반대로 유출을 막아 세포사멸사를 막는 역할을 한다. 즉, 어떤 신호에 의해 어떤 단백질이 작용 하느냐에 따라 정반대의 역할을 하게 되는 것이다.
세포사멸사 기전에 관여하는 물질의 이상이 발암 과정에 중요한 역할을 한다는 증거들이 많이 제시되고 있다. bcl-2 패밀리 단백질의 이상 역시 이 과정에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.
이렇듯 세포사멸사는 세포 내의 여러 조절인자들의 일련의 활성 및 반응으로 완성되는데, 그 중 세포사멸사를 억제하는 bcl-2 단백질은 내형질세막(endoplamic reticulum), 미토콘드리아와 핵막 등에 존재하면서 사이토카인과 함께 세포사멸사를 억제하여 정상세포의 교체에 중요한 역할을 한다. bcl-2 패밀리 단백질은 평상시에는 BH3 서브 패밀리인 bid/bim과 결합되어 있고 bax, bak은 아무것도 결합되어있지 않은 상태로 미토콘리아 외막에 존재한다. 세포사멸사 신호가 들어오게 되면 bik이나 bad가 bcl-2와 결합하게 되고 bcl-2로부터 떨어져 나온 bid/bim은 bak, Bax와 결합하여 그들의 배좌 변화(conformational change)를 유도하여 세포사멸사를 유발시킨다. 즉, bcl-2는 bax 서브 패밀리와 BH3 서브 패밀리의 세포사멸사 기전을 막는 역할을 함으로써 세포사멸사를 막는 것이다. 세포사멸사가 억제되면 클론의 팽창과 이차적인 유전적 변화 및 악성 전환의 기회가 높아져서 종양이 발생한다.
암의 예후와 세포사멸사와의 관련성은 여러 종류의 암 종에서 연구되어 왔다. 유방암, 폐암 등 대부분의 암 종에서 세포사멸사를 억제하는 bcl-2 단백질 발현 이상이 항암제에 대한 내성을 증가시키고, 많은 경우 환자의 생존기간이 짧고 종양이 진행되어 있다고 보고 되어 있다. bcl-2 유전자의 큰 구조적 이상은 없는 것으로 알려져 있으나, 고형암에서 bcl-2 단백질 발현이 증가되어 있어 bcl-2단백질 발현과 암 종과의 상관관계에 대한 연구가 진행 중이다.
즉, 암세포는 bcl-2 단백질이 과량 발현되어 세포의 사멸을 억제하게 되어 과다 증식하게 된다. 많은 고형암에서 bcl-2 단백질 발현 증가가 종양세포의 항암제 등의 세포사멸사 유발기전으로부터 암세포를 보호한다고 알려져 있어 이러한 부분에 뒷받침해줄 더 많은 연구가 필요하다. 따라서 이 bcl-2 단백질은 암 유발 표지 바이오마커에 해당하고, 이를 효과적으로 인지하는 진단 탐침으로서의 펩타이드 발굴이 필요하다. 이러한 펩타이드를 통해 암 조기 진단을 위한 진단 키트를 개발할 수 있고, 이를 독립적인 암의 예후 인자로 이용할 수도 있다. 또한 이 펩타이드를 실제 암세포를 차단하는 약물을 개발에 이용할 경우 새로운 개념의 광범위 항암제가 마련될 것으로 기대된다.
목표물을 인지하는 탐침과 새로운 다양한 영상화를 통한 이미징 기술 및 항암 물질들의 혼합은 암의 조기 발견에 따른 치료를 향상시키고 잠재성 있는 진단 방법들을 개발할 수 있는 기회를 제공한다. 암의 조기 발견을 목적으로 한 탐침을 개발하기 위해 높은 친화성을 갖고 선별적으로 조기 암 세포에 붙은 탐침을 발굴하여 이를 암 조기 진단에 사용할 필요가 있다.
또한 유전자 분야에서도 많은 연구가 진행되고 있다. 이러한 유전자 분석결과를 토대로 암 유전자의 기능을 끊어버리거나 표현되지 못하도록 하는 유전자 변형 연구가 진행 중이다.
종래 기술에 의하면, 진단 대상체를 진단하기 위한 가장 보편적인 방법으로 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용하는 방법이 있다. 이 방법은 진단 대상체가 지니는 고유한 유전자를 분석한 후, 이를 시험관 내(in vitro) 증폭함으로써 소량의 진단 대상체를 분석하는 방법이다. 또한, 이 방법은 유전자가 지니는 고유한 염기서열을 이용하여 진단 대상체 만의 고유한 염기서열을 분석의 대상으로 한다. 이러한 PCR 방법은 근래의 휴먼 지놈 프로젝트 등을 통한 광범위한 유전자 정보 데이터베이스 확보를 통하여 그 활용 범위를 확대할 수 있다. 또한 PCR 방법은 증폭하여 얻은 유전자를 대상으로 이들의 유전적 변이를 다양한 탐침을 이용해 확인하는 SSCP (Single-strand conformation polymorphism), RFLP (Restriction fragment length polymorphism) 및 AFLP (Amplified fragment length polymorphism) 방법들과 연계하여 유용한 정보를 제공하고 있다.
그러나 PCR을 이용하는 진단 방법의 경우, 진단 대상체만이 지니는 고유한 염기서열을 소량으로 얻는 데에 있어서 높은 감도를 가지는 장점이 있지만, 시료의 전처리 및 현장적응성에 대한 어려움 등의 문제점이 있어서 진단 시스템으로 사용하기에는 한계가 있다.
암을 검사하고 조기에 발견할 수 있는 암 표지 마커는, 종양의 초기 발생을 동정할 수 있는 항체에 대한 연구를 통해 진행되고 있다. 혈액은 가장 대표적인 체액으로 질병 발병과 진행 과정에서 민감하게 그 성분이 변화하는 일종의 '생체 내 바로미터’와 같다. 혈장 단백체는 구성분이 약 50,000 개 이상으로 예측되는 데다, 각 단백질 성분의 농도 또한 매우 다이나믹(1-10-12 mg/mL)하여, 검출 한계가 약 10-6-10-9 mg/mL 정도인 항원-항체 반응으로는 저/중농도로 존재하는 바이오마커 단백질의 검출과 정량 분석이 매우 어렵다. 그러나, 아직까지 높은 감도, 신속성과 현장 적응성을 지닌 진단 키트 및 높은 물리 화학적 안정성, 민감도, 특이성, 응용성 등의 특성을 지닌 진단 탐침 물질(diagnostic probe)은 아직까지 제시된 바 없다.
항체는 암에 대한 높은 특이성을 갖고 있기 때문에 암의 발견과 약물 전달을 위해 많은 연구가 진행되고 있으나, 생체 내에서 면역 반응성을 발생시키는 문제점이 발생할 수 있다. 또한 항체는 열이나 화학물질 처리에 의해 변성될 위험성이 있다.
근래의 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)는 질병으로 유발된 특정 단백질의 발현량 증가 및 변화를 판단하는 방법이다. 상기 특정 단백질의 인식을 위해서 이들 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 항체를 진단 탐침으로 사용하여 혈액, 소변 등의 생체 검체로부터 진단 대상체를 분리하며, 이를 위하여 효소-항체 반응(ECL)을 이용한다. 그러나 나노몰(10-9M) 수준의 반응감도는 생체 내 작용점인 단백질을 대상으로 할 수 있다는 장점에도 불구하고, PCR 진단법에 비하여 낮은 민감도를 가진다는 단점이 있다.
상기와 같은 단점을 극복할 수 있는 관련 연구의 일환으로, 현재의 진단방법인 PCR 및 ELISA 방법 등을 기초로 나노 기술(NT)이 접목된 표면 증강 라만 분광분석법(SERS) 및 바이오-바코드 기술이 개발되면서, 펨토몰(10-15M) 수준의 진단 대상체 분석이 실험적으로 가능함이 입증되었다. 상기 두 방법은 모두 라만 분광분석이 갖는 신호적 특성(좁은 라만 밴드; 습기, 산소 및 담금자에 대한 낮은 민감도; 및 낮은 광표백도)과 형광분석에 상응하는 높은 민감도를 통하여 금속 나노입자를 이용한 신호증폭을 이루어 펨토몰 수준의 진단 대상체 인식이 가능하게 되어, 혈액 등의 손쉬운 검체 시료를 이용한 암 진단(Prostate specific antigen, PSA)에 대한 접근법을 제안하였다. 그러나 이러한 방법들은 바이오마커(진단 대상체)를 인식하는 항체를 이용한 시스템을 토대로 하는데, 이러한 방법들은 모두 항체의 물리, 화학적 구조에 의한 크기적 제한으로 인하여 결합수가 제한될 뿐만 아니라, 여러 가지의 화학적 반응 하에서 구조변성으로 인한 불안정성을 보인다는 중대한 단점이 있다.
따라서 상기 언급한 항체 진단 시스템 기술과 차별화된 새로운 저분자 진단 탐침의 개발이 필요하다. 이러한 저분자 진단 시스템에 이용될 수 있는 것으로 저분자 펩타이드를 들 수 있다.
이에 본 발명자들은 현재 암 진단을 위하여 사용되는 항체를 대체할 수 있는 새로운 진단 물질로서 신규 펩타이드를 개발하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 암의 조기 진단, 예방 및 치료를 위해 암 유도 단백질을 인식하고 특이적으로 결합하는 신규 펩타이드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 서열번호 1 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 bcl-2 단백질 표적용 펩타이드 및 상기 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 암 진단 키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 서열번호 1 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 bcl-2 단백질 표적용 펩타이드를 제공한다.
상기 bcl-2 단백질은 이 기술분야에서 널리 공지된 단백질이다. 구체적으로서열번호 8의 염기서열을 가지는 유전자로 이루어질 수 있으나 반드시 이에 제한 되는 것은 아니다.
본 발명에서는 앞서 언급한 항체의 단점을 극복하기 위해 저분자 펩타이드를표적 물질로 이용한다. 이러한 저분자 펩타이드는 그 크기가 작아서 3차원적으로 안정화되어 있고 점막을 쉽게 통과하며 조직 깊은 곳에서도 분자 목표물을 인지할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 국소 주사를 통해 안정성이 확보되고 면역 반응성을 최소화 할 수 있기 때문에, 암을 조기 진단할 수 있는 장점이 있다. 그리고 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 대량 생산이 항체에 비해 상대적으로 간단하고, 독성이 약하다.
이외에도 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 항체보다 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용된다.
상기 bcl-2 표적 펩타이드는 bcl-2 단백질의 특정 부위에 결합하는 것을 특징으로 하며, 12개의 아미노산으로 이루어져 있다. 이 아미노산은 bcl-2 단백질에 대해 높은 친화도를 가지는 펩타이드로서, 서열번호 1 내지 서열번호 7에 기재된 아미노산을 포함한다.
본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함되나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 AppliedBiosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al ., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif,1991; 및 Hitzeman et al ., J. Biol . Chem ., 255:12073-12080, 1990.
본 발명의 펩타이드가 암 세포 조직에 결합하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위하여, 본 발명의 펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)), 방사성 동위원소(예:124I, 125I, 111In,99 mTc, 32P,35S), 크로모포어(chromophore), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots))등 일 수 있다.
유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다.
만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 형광단층촬영(Fluorescence mediated tomography:FMT)으로 암을 진단할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 혈액 내로 순환시키고 형광단층촬영으로 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 형광이 관찰된다면, 암으로 진단된다.
한편, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 상기에서 기재한 바와 같이 수득할 수 있으며, 바람직하게는 각각 서열번호 9 내지 15의 염기서열을 가질 수 있다.
발현벡터는 숙주 세포 내에서 삽입된 핵산을 발현할 수 있는 이 기술분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미하는 것으로서, 이 기술분야에 공지된 통상의 발현벡터에 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 발현벡터는 일반적으로 숙주세포에서 증식할 수 있는 복제원점, 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(예: 프로모터, 인핸서 등), 선별 마커(selective marker) 및 발현 조절 서열과 작동가능하게 연결된 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
형질전환체는 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 것일 수 있다. 바람직하게는 형질전환체는 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 이 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 숙주세포에 도입하여 수득할 수 있다(Wu et al ., J. Bio . Chem ., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio . Chem ., 263:14621-14624, 1988).
본 발명에 사용할 수 있는 숙주세포로는 대장균, 효모, 심장 세포, 림프구, 간 세포, 혈관내피 세포, 비장 세포, 암세포, CHO, Cos7, NIH3T3 같은 동물세포주, 곤충세포로 이루어진 군에서 선택할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니며 가능한 모든 세포는 숙주 세포로 사용이 가능하다.
또한 본 발명은 상기 bcl-2 단백질 표적용 펩타이드에 특이적인 항체를 제공한다. 본 발명에서 “항체”란 항원성 부위에 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 bcl-2 단백질 표적용 펩타이드를 특이적으로 인지하는 항체를 의미하며, 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함한다. 상기한 바와 같이 본 발명에 의해 bcl-2 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다(Sambrook et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition).
단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 융합 방법(fusion method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology, 6:511-519 참조), 재조합 DNA 방법 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al ., J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
다클론 항체는 상기 서열번호 1 내지 7의 아미노산 서열을 갖는 bcl-2 단백질 표적용 펩타이드를 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드를 CFA(Complete Freund's Adjuvant)와 함께 염소나 토끼에 피하 주사로 주입하고, 부스터(booster)를 CFA와 함께 피하 또는 복강 내로 주입함으로써 제조될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소 토끼 이외에 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
항체는 마커, 예컨대, 방사성 또는 형광성 마커로 표지되는 것이 바람직하다. 항체는 마커 화합물에 공유적으로 결합된 항-염소 또는 항-토끼 항체에 결합시킴으로써 간접적으로 표지될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트에 포함되는 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 7의 펩타이드 또는 이를 암호화하는 서열번호 9 내지 15의 폴리뉴클레오타이드를 가질 수 있으며, 상기 기재한 바와 같이 화학적 또는 유전공학적 방법에 의해 수득된 것일 수 있다. 본 발명의 진단용 키트에는 펩타이드의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 안정성을 유지하기 위해, 분말 상태 또는 적절한 완충액에 용해된 상태 또는 4℃ 유지된 상태로 제공될 수 있다.
이 때, 본 발명에서 "진단"이란 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 암의 존재 또는 특징을 확인하는 것이다.
또한 암세포 조직에 결합한 본 발명의 펩타이드의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 펩타이드는 상기에서 기재한 바와 같이 표지된 상태로 제공될 수 있다.
한편, 본 발명의 펩타이드가 표지되지 않은 채로 제공되는 경우에는, 본 발명의 암 진단용 키트는 본 발명의 펩타이드의 시험관 내 또는 생체 내에서 암 유발 부위, 특히 암세포와 결합 여부 또는 그 위치를 탐색하기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분은 본 발명의 펩타이드의 표지를 위한 공지의 화합물이거나, 항원-항체반응을 통한 탐색을 위하여 본 발명의 펩타이드 또는 본 발명의 펩타이드와 결합하는 특정 수용체에 대한 항체 또는 이들에 대한 2차 항체 및 이의 검출을 위한 시약일 수 있다.
또한 본 발명의 펩타이드는 플레이트의 표면에 코팅된 형태로 제공될 수도 있다. 이 경우에는 상기 플레이트에 직접 대상 세포를 접종하여 적당한 조건에서 반응시킨 후, 플레이트의 표면상에서의 암 세포와 펩타이드의 결합을 관찰하여 암을 진단할 수 있다.
상기 방법들에서 이용될 수 있는 실험 과정, 시약 및 반응 조건은 종래 이 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 것들을 이용할 수 있으며, 이는 통상의 기술자들에게 자명한 일이다.
또한 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 약물 전달 조성물을 제공한다. 본 발명의 펩타이드는 항암제와 같은 약물을 암 조직에 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 펩타이드를 종래 항암제와 연결하여 암 치료에 이용한다면 본 발명의 펩타이드에 의해 항암제가 암 세포에만 선택적으로 전달되기 때문에 약의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상 조직에 미치는 항암제의 부작용을 현저히 줄일 수 있다.
본 발명의 펩타이드에 연결될 수 있는 항암제는 종래 암의 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예컨대, 시스플라틴(cisplain), 5-플로오우라실(5-fluouracil), 아드리아마이신(adriamycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 빈블라스틴(vinblastine), 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란(melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard), 니트로소우레아(nitrosourea) 등이 있다.
항암제와 본 발명의 펩타이드의 연결은 이 기술분야에 공지된 방법, 예컨대, 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 펩타이드는, 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서, 화학적으로 수식(modification)될 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 펩타이드의 양은 결합되는 항암제의 종류 및 양에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는 치료를 위해 투여되는 양의 항암제를 암 조직에 충분히 전달할 수 있는 양일 수 있다. 그러나, 약물은 그 투여 경로 및 치료 횟수뿐 만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이다. 그러므로, 이러한 점을 고려할 때 이 기술분야의 통상적인 지식을 가진 자라면, 상기 펩타이드를 항암제와 결합시켜 암을 치료하기 위해, 본 발명의 펩타이드의 적절한 유효량을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 조성물에는 상기 펩타이드의 안정성을 유지 및/또는 보존하기 위한 적당한 완충용액이 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 약물 전달용 조성물은, 본 발명에 의한 효과를 보이는 한, 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다. 예컨대, 본 발명의 펩타이드는 경구 투여 또는 비경구 투여될 수 있다. 경구 투여 시에는 위장관 내 소화효소에 의한 분해를 방지하기 위하여 본 발명의 펩타이드를 L형 아미노산으로 구성하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기 비경구 투여로는 피하 주사, 근육 내 주사, 정맥 주사, 요도 주입 등이 있다.
이외에도 본 발명의 조성물에는 일반적인 약학적 조성물에 통상적으로 첨가되는 약학적으로 허용되는 담체가 추가로 포함될 수 있다. 상기 "약학적으로 허용되는"이란, 생리학적으로 허용되고 사람이나 동물에 투여될 때 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을말한다. 약학적으로 허용되는 담체는 주사제의 경우에는, 예컨대 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제 및 안정화제를 사용할 수 있다.
이와 같이 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다. 본 발명의 펩타이드를 포함하는 약물 전달 조성물은 이 기술분야에 공지된 통상적인 약물 투여 방법으로 투여될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 bcl-2 단백질에 특이적으로 결합하므로, 본 발명의 펩타이드를 진단 탐침으로 이용하여 bcl-2 단백질의 과다 활성을 확인함으로써 암을 진단할 수 있다. 또한 본 발명의 펩타이드는 저분자 물질로서 약물 전달 조성물로 이용될 수 있다. 본 발명의 펩타이드와 항암제와 같은 약물을 연결하여 암 치료에 사용하는 경우, 항암제를 암 조직에 선택적으로 전달하여 약물의 효과를 높이고 면역반응이나 변성 반응 등의 부작용이 거의 없는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 pGEX-KG의 재조합 발현벡터 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시에에 따른 재조합 발현 벡터에 클로닝 된 bcl-2 단백질의 생산, 유도, 분리 및 정제 결과를 보여주는 것이다: M, 분자량 마커; BI, 유도 전; AI,유도 후; S1, 용해성 단백질; S2, 배양되고 소니케이션으로 분쇄된 세포; FT, Frowthrough; W1, PBST 버퍼로 세적한 것; W2,PBS 버퍼로 세척한 것; F1-8, bcl-2 단백질을 포함하는 분획물.
도 3은 파지 디스플레이 전에 GST-프리 단백질을 얻었음을 나타내는 전기영동 결과이다: M, 분자량 마커; P, 펠렛; Thr, 단백질 없음(1 U/ml).
도 4는 GST-태그와 bcl-2의 분리 유무를 확인하고자 트롬빈 처리 후 웨스턴블랏을 한 실험 결과이다: 막은 항-bcl-2 및 항-GST 항체로 표지되었고 전달된 산물은 화살표로 나타내었다.
도 5는 bcl-2와 결합하는 펩타이드를 스크리닝하기 위한 M13 파지 스크리닝의 계획도이다.
도 6은 bcl-2에 대해 높은 특이성 및 결합력을 가진 펩타이드가 발현된 파지를 검출하기 위한 5단계 바이오 패닝 조건을 정리한 도표이다.
도 7은 도 6의 5단계 바이오 패닝을 통하여 얻은 bcl-2와 결합하는 파지를 증폭하여 DNA를 분리 정제 후 염기서열 분석을 실시하여 파지 표면에 발현된 펩타이드의 아미노산 서열을 비교 분석하고 상동성을 바탕으로 유사 계통도를 작성한 결과를 도시한 것이다.
도 8은 상동성 분석결과 분류된 본 발명의 7개 펩타이드에 대한 아미노산 서열분석을 실시한 결과 각각의 펩타이드에서 보존 영역을 관찰할 수 있는 도면이다.
도 9는 본 발명의 7개 펩타이드 발현 파지를 증폭한 뒤 농도를 측정하여 bcl-2와 결합력을 분석한 그래프이다.
도 10은 본 발명을 통하여 얻은 bcl-2와 결합하는 펩타이드의 결합 펩타이드 서열 및 결합력을 정리한 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1: bcl -2 단백질의 대량 생산 및 분리
bcl-2 유전자(서열번호 8)를 다음과 같이 PCR을 통하여 증폭하였다: Bcl-2 센스 프라이머는 5'-CTGGTGGACAACATCGCTCTG-3'를, Bcl-2 안티센스 프라이머는 5'-GGTCTGCTGACCTCACTTGTG-3'를 사용하였다. 상기 합성 프라이머 및 주형(template) DNA를 포함하는 5 % DMSO가 함유된 반응 용액에서, 전변성(pre-denaturation) 94℃ 2분, 변성(denaturation) 95℃ 45초, 어닐링(annealing) 55℃ 1분, 신장(extension) 68℃ 3분을 1 사이클로 하여, 28 사이클의 PCR 반응 후 얻은 주형 DNA를 유전자 염기서열을 통해 확인하였다. 이 증폭된 유전자를 박테리아 발현벡터인 pGEX-KG(Promega, USA)에 삽입하여 제조사의 매뉴얼에 따라 클로닝한 뒤(도 1 참고) 이 발현 벡터를 발현숙주인 단백질 발현용 대장균 BL21(DE3)에 형질전환시킨 뒤, 0.5 mM IPTG, 37℃ 조건하에서 5 시간 동안 bcl-2 단백질의 생산을 유도하였다. 상기 형질전환 방법을 간략하게 기재하면 다음과 같다: 우선 DNA 5 ㎕를 경쟁세포(competent cell) 100 ㎕에 넣고 잘 섞어 준 뒤 얼음에 30분간 놓아 두었다. 그 다음엔 42℃에서 90초간 열 충격을 가하였다. 오염을 방지하기 위해서, 우선 알콜 램프를 켜놓은 뒤에, LB 배지 800 ㎕을 넣고 37℃에서 45분간 인큐베이션시켰다. 마지막으로 LBA 플레이트에 도포시켜주고, 37℃ 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다.
그리고 박테리아 세포를 원심분리를 통하여 수획하여 단백질의 용해도를 조사한 결과, 대부분의 단백질이 용해됨을 확인할 수 있었다. 따라서 GST 융합 단백질인 bcl-2의 분리 및 정제를 위하여 수용성 단백질을 얻어낸 뒤 이를 GSH-세파로오스 컬럼을 통과시켜 bcl-2 단백질을 결합시킨 뒤에 20 mM GSH(reduced form of glutathione) 선형 구배(linear gradient)하에 용출시켰다.
얻어낸 단백질은 디솔팅(desalting) 컬럼(Amersham Biosciences, USA)을 이용하여 과량의 GSH를 제거하였고, 이를 통해 얻은 단백질의 정제도를 SDS/PAGE를 통하여 확인하였다(도 2). 그 다음, GST-태그의 분자량(26 KDa)이 Bcl-2의 크기(25 KDa)와 비슷하므로 bcl-2 단백질에만 결합하는 펩타이드를 찾아내는 스크리닝 과정을 진행하기 위해서는 크기가 큰 GST-태그를 제거하여야 bcl-2단백질에만 특이적으로 결합하는 펩타이드를 찾아낼 수 있다. 이를 위하여 트롬빈(thrombin)(5 unit of thrombin/mg of protein)을 이용하여 GST-태그를 잘라냈다. 트롬빈 처리를 하였을 때 GST 융합 bcl-2 단백질은 GST-태그(26KDa)과 bcl-2 (25KDa)로 2개의 단편으로 나눠지기 때문에, 위의 방법으로 분리 정제한 bcl-2 단백질을 트롬빈으로 처리하여 같은 결과가 나오는지를 확인하였다. 트롬빈 처리 결과 GST-태그와 bcl-2의 두 개의 단백질 단편이 생김을 확인하였다. 1 mM의 벤즈아미딘(benzamidine)을 첨가하여 반응을 종료하였다. GST-태그를 제거하고 순수한 GST-프리 단백질만 얻기 위해 음이온교환 크로마토그래피(Mono Q HR 5/5컬럼)를 통해 0.5M NaCl 선형 구배로 GST-프리 단백질을 얻었다(도 3의 F5). GST-태그과 bcl-2의 크기가 비슷하기에 겔 상에서 정확한 확인이 어렵다. 따라서 bcl-2 단백질임을 확인하기 위해 반응 산물을 15% SDS/PAGE에 용해시키고 웨스턴 블랏 방법을 이용하였다.
구체적으로, 15% SDS/PAGE 겔을 만들었다. 그리고 각 각의 샘플을 겔에 걸어 주었다. NC 멤브레인에 단백질을 이동시켰다(transfer). 이동이 다 끝나면 NC 멤브레인에 옮겨진 단백질 밴드를 눈으로 보기 위해서 염색액(Ponceaus S)으로 염색시켜 마커 표시를 하였다. 그 다음 물로 멤브레인을 깨끗하게 씻어 주고 2% BSA로 1 시간 동안 상온에서 50 rpm으로 흔들어주면서 블라킹(blocking)을 하였다. 1차 항체(Anti-bcl-2, Rabbit polyclonal Ab(1:2000 희석; Santacruz, USA))를 1 시간 동안 상온에서 붙여 주었다. 그 다음 멤브레인을 1X TBST 버퍼로 1시간 동안 상온에서 여러 번 세척하였다. 2차 항체(Anti-Rb IgG HRP 컨쥬게이트(1:4000 희석; Santacruz, USA)를 1시간 동안 상온에서 붙여 주었다. 다시 한번 더 멤브레인을 X TBST 버퍼로 1시간 동안 상온에서 여러 번 세척하였다. ECL(Chemiluminescence) 용액을 멤브레인에 충분히 뿌려주고 2차 항체와 함께 반응해 빛을 내게 해 주었다. 마지막으로 필름 인화를 하여 원하는 크기의 밴드가 나오는지 확인하였다. 그 결과 bcl-2 항체를 붙인 부분에서는 bcl-2 단백질 단편 하나만이 보임을 확인할 수 있었다(도 4).
실시예 2: M13 파지 펩타이드 라이브러리 스크리닝 - 파지 디스플레이
상기 실시예 1에서 얻은 단백질을 96-웰 플레이트에 고정시키기 위해서 플레이트 표면이 폴리스티렌(polystyrene) 재질로 되어 있는 폴리스티렌 플레이드 (SPR)를 사용하였다. 단백질과 플레이트 표면 사이의 친수성 상호작용(hydrophilic interaction)을 이용하여 단백질을 플레이트 표면 바닥에 고정시킴으로써, 랜덤 펩타이드 라이브러리(12개의 아미노산으로 구성된 무작위 배열을 통하여 약 27억개의 다양한 아미노산 서열을 가지도록 제작된 펩타이드 라이브러리-Ph.DTM phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB)를 구입하여 사용함)를 이용한 스크리닝 과정에서 보다 높은 특이성 및 결합력 분석이 가능하도록 디자인하였다. 상기 결합을 도 5에 나타내었다.
구체적으로, 도 5에서는 암 유발 표지마커 bcl-2와 결합하는 펩타이드를 스크리닝하기 위하여, bcl-2를 플레이트(Qiagen) 표면에 결합시킨 후, M13 파지 펩타이드 라이브러리(약 27억 개의 서로 다른 아미노산 서열을 지닌 12개 아미노산으로 구성된 펩타이드가 M13 파지 gp3 minor coat 단백질에 융합된 라이브러리)를 넣어 결합시킨 후(M13 파지와 펩타이드 라이브러리의 결합 방법), 다양한 결합 시간 및 세척조건을 통하여 높은 친화력으로 결합하는 펩타이드 발현 파지를 선별하였다. 이와 관련한 스크리닝 계획 및 반응조건들을 각각 도 5 및 도 6에 나타내었다.
구체적으로, 도 5는 bcl-2와 결합하는 펩타이드 스크리닝을 위한 M13 파지 스크리닝의 계획도로서, (1) 96-웰 플레이트의 표면에 bcl-2 단백질을 고정시키고, (2) M13 파지 표면에 12개 아미노산으로 구성된 펩타이드 라이브러리가 발현된 파지 라이브러리를 bcl-2 단백질과 결합시킨 뒤에, (3) 이를 다양한 조건으로 세척한 후, (4) 최종적으로 결합된 파지를 용출하여 파지를 얻었다.
상기와 같이 얻은 파지를 대장균에 감염시켜 증폭시키고, 이를 다시 bcl-2 단백질과 결합시킨 후, 보다 높은 강도의 세척 조건 및 짧은 반응 시간 등의 조건으로 반복시킴으로써, 보다 강한 결합력을 갖는 파지를 찾는 과정을 반복하였다(바이오 패닝; biopanning).
또한, 도 6은 bcl-2 단백질에 대하여 높은 특이성 및 결합력을 가진 펩타이드가 발현된 파지를 검출하기 위한 5 단계 바이오 패닝 조건을 도표화한 것이다. 각각의 단계마다 강한 세척조건, 짧은 반응 시간으로 반응 조건을 다양하게 변화시켰으며, 이에 따라 각각 5 회씩의 바이오 패닝을 실시하여 bcl-2 단백질에 결합하는 펩타이드를 가진 파지를 확보할 수 있었다.
상기에 의하여 얻어진 파지를 숙주세포인 대장균 ER2738 세포에 감염시켜서 LB 배지에서 증폭시킨 후, 50여 개의 파지 플라그를 선택하여 M13 파지 게놈성 DNA(단일 스트랜드화 원형 DNA)를 분리 정제하여 유전자 염기서열을 확인하여, 파지 표면 단백질(gp3 minor coat 단백질)에 발현되어 bcl-2와 결합하도록 제작된 펩타이드 부분의 아미노산 염기서열을 규명하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 이를 Clustal X 서열 분석 프로그램을 통하여 상호간 상동성을 바탕으로 한 유사계통
도를 작성하여 모두 7개의 군을 정리하였으며 그 결과를 도 7에 정리하였다.
서열번호 펩타이드 서열
1 AFTHEAPKRRDS
2 SFPGPASARAGA
3 QIEESFVRGHTT
4 SLYKLRNVAAGR
5 CRWSTPTTSQCP
6 IHWSWTTVERPH
7 WPANIILSHGPKH
또한 서열번호 1 내지 7의 펩타이드의 아미노산 상동성 분석 결과, 분류된 7개 군의 서열분석을 나타낸 도 8에서 확인할 수 있듯이, 같은 군에 속하는 펩타이드의 서열에서는 높은 유사성을 관찰할 수 있으며, 색깔로 표시된 아미노산은 같은 군내의 펩타이드에서 모두 보존되어 있음을 확인하였다. 그 결과는 이들 아미노산이 bcl-2 단백질과 해당 펩타이드와의 결합에 있어 중요한 작용을 하는 잔기임을 시사한다.
실시예 3: bcl -2와 결합하는 펩타이드의 결합력 분석
스크리닝하여 얻어진 bcl-2 표적 특이적인 펩타이드의 결합력 분석을 위하여 각각의 펩타이드가 발현된 파지를 증폭한 뒤 타이터링(titering)을 통하여 파지 용액의 농도를 결정한 뒤 bcl-2가 결합된 플레이트에 농도별로 넣어 주어 결합한 파지의 양을 측정함으로써 해당 펩타이드의 결합력을 추론하였다.
bcl-2가 결합된 플레이트에 파지를 넣어준 뒤 세척하여 파지 표면 단백질을 인식하는 항체를 이용한 ELISA(Biotrak multiwell plate reader, Amersham Bioscience, USA)를 수행하였다. 해당 농도에 따르는 ELISA 신호강도를 표시하여 이를 포화곡선에 맞추어 외견상 Kd 값을 결정하였다.
Kd 값은 이미 알려진 방법을 이용하여 구하였다(Kim JM et . al, (2006) Journal of Microbiolgy and Biotechnology 16, 1784-1790.). 구체적으로, bcl-2 단백질(0.5 g/well)을 SPL(polystyrene plate)에 고정시킨 후 증폭된 파지를 넣어준 뒤 1 시간 고정시켰다. 그 뒤에 1 X TBST 버퍼로 5번 세척해 준 뒤, 항-M13 항체(마우스 모노클로날 항체, TBST에서 1:5000로 희석, Amersham Bioscience)를 1 시간 붙여주었다. 그 후 상기 항체가 붙은 단백질을 10번 세척한 다음 2차 항체를 결합시켰다(항-마우스 IgG-HRP, TBST에서 1:4000로 희석, Santascruz) 그리고 나서 TMB 기질 용액(3,3' 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)/H2O2, Chemicon)을 넣고 15분 뒤 1M 황산을 넣어 반응을 종결시킨 뒤, 450 nm에서 측정하여 얻어진 값으로 포화곡선을 그리고 Kd값을 결정하였다
그 결과, 도 9 및 도 10에서 보는 바와 같이, 7개 펩타이드군 가운데 6개 펩타이드는 피코몰 농도 (pM) 범위의 결합력을 보여주고 있다. 또한 일부 펩타이드는 10 pM 이하의 우수한 결합력을 보여줌으로써 기존의 항체-항원 반응의 결합력에 상응하는 결합력을 확인할 수 있었다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> PEPTIDES TARGETING THE BCL-2 PROTEIN AND USES THEREOF <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 1 targeting the bcl-2 <400> 1 Ala Phe Thr His Glu Ala Pro Lys Arg Arg Asp Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 2 targeting the bcl-2 <400> 2 Ser Phe Pro Gly Pro Ala Ser Ala Arg Ala Gly Ala 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 3 targeting the bcl-2 <400> 3 Gln Ile Glu Glu Ser Phe Val Arg Gly His Thr Thr 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 4 targeting the bcl-2 <400> 4 Ser Leu Tyr Lys Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 5 targeting the bcl-2 <400> 5 Cys Arg Trp Ser Thr Pro Thr Thr Ser Gln Cys Pro 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 6 targeting the bcl-2 <400> 6 Ile His Trp Ser Trp Thr Thr Val Glu Arg Pro His 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 7 targeting the bcl-2 <400> 7 Trp Pro Ala Asn Ile Ile Leu Ser His Gly Pro Lys His 1 5 10 <210> 8 <211> 144 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 aattcccttc tgaaagaaac gaaagcaaca ggaacactca tttgtgccat tgtgttttgc 60 cccctcctcg acccctgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctcagg tgagtcctca 120 ccaccccctc tgagtccact tagg 144 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucloetide of peptide 1 <400> 9 agaatccagc ctcttaggcg cctcatgcgt aaacgc 36 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide of peptide 2 <400> 10 agccccagcc cgagcagaag ccggaccagg aaacga 36 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide of peptide 3 <400> 11 agtagtatgc ccacgaacaa acgactcctc aatctg 36 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide of peptide 4 <400> 12 cctacccgca gccacattag gaagcttata cagaga 36 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide of peptide 5 <400> 13 aggacactga gacgtcgtcg gcgtactcca cagaca 36 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide of peptide 6 <400> 14 atgaggccgc tccacagtcg tccaagacca atgaat 36 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide of peptide 7 <400> 15 atgcttagga ccatgagaca aaatattcgc aggcca 36

Claims (6)

  1. 서열번호 1 내지 5 및 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 bcl-2 단백질 표적용 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 bcl-2 단백질은 서열번호 8의 염기서열을 가지는 유전자로 이루어지는 것을 특징으로 하는 단백질 표적용 펩타이드.
  3. 제1항의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 9 내지 서열번호 13 및 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제3항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현벡터.
  6. 제5항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체.
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