KR101564751B1 - Ｓｏｘ２ 검출용 폴리펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Sox2 검출용 폴리펩티드에 관한 것으로, 서열번호 5 내지 서열번호 9로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 Sox2(SRY(Sex-determining Region Y)-box2) 검출용 폴리펩티드 및 이를 이용한 암 진단 시스템을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 암 줄기세포의 분화과정에서 활성을 띄는 세포 내부 신호조절 단백질인 극미량의 Sox2를 특이적으로 인지하여 결합할 수 있으므로, 기존의 항원-항체 진단 시스템이 갖는 안정성 및 민감도의 한계를 극복한 초고감도의 펩티드 진단체로서 이용할 수 있으며, 극미량의 질병 표지물질 검출에 따른 질병의 조기 진단과 이를 통한 치료 효율 증대가능성을 제안하는 효과가 있다.

Description

Ｓｏｘ２ 검출용 폴리펩티드 및 이의 용도{Polypeptide for detecting Sox2 and uses thereof}

본 발명은 Sox2 검출용 폴리펩티드에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 Sox2단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다.

암은 인체 내부의 유전적인 변이들의 축적으로부터 발생하는데 이것은 인체 외부 또는 내부의 여러 화학물질에 대한 노출과 인체 내부 여러 인자들의 상호작용으로부터 기인한다. 유전적인 변이들은 인체 내부의 중요한 신호전달 인자들에 영향을 주게 되며 이것은 특정 기능의 장애를 일으킨다. 이러한 유전적 변이로부터 유도된 기능적 장애들이 장기적으로 지속될 경우 세포 내에 비정상 콜로니가 형성되고 이것이 축적되어 암이 발생한다.

암을 치료하기 위해 이용되는 방사선 치료로는 고선량 방사선의 정상세포에 대한 부작용을 줄이기 위하여 상대적으로 저선량의 방사선을 반복 처리하는 분할 방사선 치료법이 주로 이용되고 있다. 하지만 분할 방사선 치료는 암세포에서 적응 방사선저항성(adaptive radioresistance)을 유도하여 암세포의 재분화 및 악성화를 유발한다고 알려져 있다.

한편, 악성 종양조직 내에는 정상 줄기세포와 유사하게 암 조직을 재생하고 유지하는 암 줄기세포(cancer stem cell)가 존재하며, 이러한 암 줄기세포가 혈중 유입되어 전이 표적조직에 침윤/이동한 후 악성화된 특이적인 암으로 분화함으로써 전이암을 유발한다고 보고되고 있다. 또한, 분할 방사선 처리시 적응 방사선저항성 획득의 주된 원인이 암 줄기세포라는 주장이 주목받고 있다.

분할 방사선 처리요법을 포함한 기존의 항암치료는 일차 종양 조직내에서 활발히 분열하는 원발암 세포를 주된 표적으로 하여 시행되는 것으로 원발암에는 치료 효과가 있으나, 상대적으로 증식이 활발하지 않으며 항암저항성을 포함한 새로운 악성화 특성을 획득한 암 줄기세포는 효과적으로 제거하지 못함으로 인하여 혈중으로부터 표적 조직으로의 전이암 형성의 기회를 증가시키는 것으로 설명되고 있다.

최근 암 줄기세포 관련 연구 결과에 따르면, Sox2는 신경교종, 유방암, 위암 등의 다양한 형태의 암 조직에서 발현되는 대표적 암줄기세포 표지마커이다. 암세포의 경우 Sox2의 과발현으로 인하여 다양한 단백질들이 Sox2에 의하여 유전자 활성이 조절되고, 다양한 단백질들의 발현을 증가시키는 것으로 보고되고 있다. 이러한 연구 결과는 Sox2를 조기에 발견함으로써 암줄기세포의 조기 진단 및 암을 치료하는데 높은 효율성을 제시함을 의미한다.

세포내에서 특정 단백질의 정확한 인지, 이와 동시에 영상화를 통한 이미징 기술과 항암물질들과의 혼합은 암의 조기 발견에 따른 치료 효율을 향상시키고 잠재성 있는 진단 방법들을 개발할 수 있는 기회를 제공한다. 암의 조기 진단 및 치료를 목적으로 한 탐침을 개발하기 위해 높은 친화성과 특이도를 갖고 암세포를 찾아내는 탐침을 발굴하여 이를 암 조기 진단에 사용하는 것이다. 종래 기술에 의하면, 특정한 진단 대상체를 진단하기 위한 가장 보편적인 방법은 PCR(Polymerase Chain Reaction)이 있다. 이 방법은 진단 대상체가 지니는 고유한 유전자를 분석한 후, 이를 시험관 내(in vitro) 증폭함으로써 소량의 진단 대상체를 분석하는 방법이다. 이 방법은 근래의 휴먼 게놈프로젝트 등을 통한 광범위한 유전자 정보 데이터베이스를 통해 그 적용 범위가 확장되고 있다. 또한, PCR법은 증폭하여 얻은 유전자를 대상으로 이들의 유전적 변이를 다양한 탐침을 이용해 확인하는 SSCP(Single-strand conformation polymorphism), RFLP(Restriction fragment length polymorphism) 및 AFLP(Amplified fragment length polymorphism) 방법들과 연계하여 유용한 정보를 제공하고 있다. 그러나 시료의 전처리 및 현장적응성에 대한 어려움 등의 문제점이 있어서 진단 시스템으로서는 한계가 있다.

이러한 측면에서 특정 단백질의 발현량 증가 및 변화를 판단하기 위한 방법으로 ELISA(Enzyme-Linked Immunsorption Assay)가 주로 이용되고 있다. 이는 특정 단백질을 인식하기 위해 이와 특이적으로 결합하는 항체를 진단 탐침으로 사용하는 것으로서, 혈액, 소변 등의 생체 검체로부터 진단 대상체를 효과적으로 분리하여 효소-항체 반응을 통해 검체내의 특정 단백질 존재 유무를 판단한다. 하지만 이 또한 나노몰 수준의(10^-9) 낮은 감도는 실제 진단 검체내의 저농도로 존재하는 표지 물질의 진단이 어려우며, PCR 진단법에 비하여도 낮은 민감도를 갖는다는 단점이 있다.

아울러, 약물 스크리닝(drug screening)은 많은 수의 잠재적인 항암제를 동시에 세포에 처리하여 단시간에 그 결과를 확인할 수 있다는 장점이 있지만 이러한 신약 후보물질들은 인공적인 화합물로써 가질 수 있는 인체내에서의 독성 문제와 항암제로써 사용될 시 암세포에 내성이 발생할 수 있다는 단점이 있다.

따라서, 극미량의 암 줄기세포를 진단할 수 있는 저분자 탐침의 개발은 암의 재발을 방지함과 동시에 암의 조기 진단을 통해 암 치료 효율을 높일 수 있을 것이다.

본 발명의 목적은 암 진단 마커인 Sox2를 검출할 수 있는 저분자 탐침 및 이를 이용한 암 진단 시스템을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 5 내지 서열번호 9로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 Sox2(SRY(Sex-determining Region Y)-box2) 검출용 폴리펩티드를 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 폴리펩티드를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 폴리펩티드를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 폴리펩티드는 암 줄기세포의 분화과정에서 활성을 띄는 세포 내부 신호조절 단백질인 극미량의 Sox2를 특이적으로 인지하여 결합할 수 있으므로, 기존의 항원-항체 진단 시스템이 갖는 안정성 및 민감도의 한계를 극복한 초고감도의 펩티드 진단체로서 이용할 수 있으며, 극미량의 질병 표지물질 검출에 따른 질병의 조기 진단과 이를 통한 치료 효율 증대가능성을 제안하는 효과가 있다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 Sox2에 대한 발현 플라스미드를 대장균에 형질전환하고 0.5 mM IPTG로 유도한 세포에서 정제된 Sox2 단백질의 정제도를 SDS/PAGE를 통해 확인한 젤 사진이다(M: 분자량 마커, 1: 유도 전, 2: 유도 후, 3: 가용성 단백질, 4: 불용성 단백질, F1~F7; Sox2 단백질을 포함하는 분획).
도 2는 Sox2 단백질과 결합하는 파지 펩티드를 스크리닝하기 위한 M13 파지 스크리닝의 계획도를 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명에서 확인한 5 종류의 폴리펩티드 발현 파지를 증폭한 뒤 농도를 측정하여 Sox2 단백질과의 결합력을 분석한 그래프이다(SBP1 내지 SBP5는 각각 서열번호 5 내지 서열번호 9의 폴리펩티드).
도 4의 (a) 내지 (c)는 각각 형광이 합성된 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 9의 단일 폴리펩티드들에 대한 Sox2 단백질과의 결합력을 분석한 그래프이다(SBP1, SBP3 alc SBP5는 각각 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 9의 폴리펩티드).

이하, 본 발명에서 사용되는 용어를 설명한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "진단"이란 생물학적 시료 또는 조직 시료에서 본 발명의 Sox2 검출용 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 측정함으로써 상기 단백질의 발현과 관련된 질환의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. Sox2(SRY(Sex-determining Region Y)-box2) 검출용 폴리펩티드

본 발명의 일 측면은 Sox2(SRY(Sex-determining Region Y)-box2) 검출용 폴리펩티드를 제공한다.

상기 폴리펩티드는 서열번호 5 내지 서열번호 9로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하고, 상기 폴리펩티드는 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 것이 보다 바람직하며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 것이 가장 바람직하다. 그러나, 상기 폴리펩티드는 이에 한정되지 아니하고, 암 세포, 암 줄기세포 등의 세포에서 발현되는 Sox2에 특이적으로 결합하는 활성을 갖는 범위 내에서, 상기 서열번호 5 내지 서열번호 9로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 50% 이상, 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

상기 폴리펩티드는 천연으로부터 유래될 수도 있으며, 공지의 펩티드 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있다.

상기 Sox2는 인간 유래인 것이 바람직하고, Sox2는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 폴리펩티드는 상기 Sox2의 아미노산 서열에 특이적으로 결합한다.

상기 폴리펩티드에는 검출체가 태깅(tagging)될 수 있다. 상기 검출체는 상기 폴리펩티드가 상기 Sox2에 특이적으로 결합하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위한 것으로, 발색효소(퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 등), 형광물질(FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots)), 크로모포어(chromophore) 및 방사성 동위원소(¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹¹¹In, ^99mTc, ³²P, ³⁵S 등)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있다. 상기 검출체가 본 발명의 폴리펩티드에 태깅되는 경우, 상기 검출체는 상기 폴리펩티드에서 표적에 대한 특이성 또는 선택성에 영향이 없도록 부착되는 것이 바람직하고, 이를 위하여 상기 펩티드에 링크(공유결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기와 같은 검출체의 태깅 위치는 당업자가 반복 실험을 통하여 용이하게 결정할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 암 줄기세포의 분화 과정에서 활성을 띄는 세포 내부 신호 조절 단백질인 Sox2를 효과적으로 인지하는 탐침으로서의 폴리펩티드를 발굴하기 위하여, Sox2 단백질에 결합하는 펩티드를 스크리닝함으로써 저분자 진단 펩티드를 선별하였다. 이때, 파지 디스플레이 기법에 의한 펩티드 라이브러리 스크리닝을 실시하였는데, 구체적으로 플레이트 웰에 Sox2 단백질을 고정시키고, M13 파지 표면에 12개의 아미노산으로 구성된 펩티드들이 발현하는 파지 라이브러리를 첨가한 후, 극한 조건에서도 Sox2 단백질 결합하는 파지 펩티드를 추출함으로써, Sox2 단백질에 특이적으로 결합하는 파지 펩티드만을 최종적으로 선별하였다. 이를 하나의 라운드(round)로 하여, 라운드를 수회 반복하는 바이오 패닝(biopanning)을 실시함으로써 Sox2에 결합하는 폴리펩티드를 확보하였다(표 1 및 도 2 참조). 상기 바이오패닝시 4 라운드 이상 실시하는 것이 보다 강한 결합력을 갖는 파지 펩티드를 선별하는데 바람직하다. 상기와 같이 수득한 펩티드의 아미노산 서열을 분석한 결과, 서열번호 5 내지 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드인 것을 확인하였다(표 2 참조). 상기와 같은 방법으로 선별된 폴리펩티드는 Sox2 단백질에 대해 우수한 결합력을 갖는 것으로 나타남으로써(도 3 참조), 본 발명의 폴리펩티드는 Sox2를 인지하는 신규한 탐침 물질로서 작용할 있음을 확인하였다. 또한, 상기 폴리펩티드에 검출체인 형광 물질을 붙여 합성한 경우에도 Sox2 단백질에 효과적으로 결합하는 것을 확인함으로써, 검출체를 포함하는 폴리펩티드가 진단시 유용하게 이용할 수 있음을 확인하였다(도 4 참조). 따라서, 본 발명의 Sox2에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드는 Sox2 단백질을 검출하기 위한 저분자 진단 탐침으로써 유용하게 이용될 수 있다.

2. 암 진단용 조성물

본 발명의 다른 측면은 상기 서열번호 5 내지 서열번호 9로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는, Sox2 검출용 폴리펩티드를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

상기 Sox2 검출용 폴리펩티드는 상기 Sox2를 특이적으로 검출하기 위한 것으로서, 상기 "1. Sox2(SRY(Sex-determining Region Y)-box2) 검출용 폴리펩티드 " 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서, 상기 Sox2 검출용 폴리펩티드에 관해서는 상기 "1. Sox2(SRY(Sex-determining Region Y)-box2) 검출용 폴리펩티드 " 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고, 이하에서는 상기 암 진단용 조성물에 특이적인 구성에 대해서만 설명하도록 한다.

상기 암은 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 세포사멸 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 일컫는다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내의 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 되는데, 이러한 상태를 암이라고 한다. 이러한 암의 종류로는 뇌종양, 폐암, 췌장암, 간암, 전립선암, 대장암, 유방암, 위암 및 직장암으로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있는데. 이들 암 세포에서는 Sox2가 과발현되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 세포내 Sox2가 과발현되는 것으로 검출되는 경우, 상기 세포가 유래한 개체는 암에 걸렸거나 걸릴 위험성이 높은 것으로 진단할 수 있다.

상기 조성물이 피검체에 투여되는 경우, 상기 조성물 내의 폴리펩티드는 암 줄기세포에서 발현되는 Sox2 단백질에 특이적, 선택적으로 결합하게 되고, 상기 폴리펩티드에 태깅된 검출체에서 일어나는 반응을 통해 상기와 같이 표적에 결합된 폴리펩티드의 위치 또는 발현량을 측정할 수 있다. 상기 검출체는 발색효소(퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 등), 형광물질(FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots)), 크로모포어(chromophore) 및 방사성 동위원소(¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹¹¹In, ^99mTc, ³²P, ³⁵S 등)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있다. 즉, 피검체의 조직 또는 세포 내에서 상기 검출체의 반응이 많이 일어나면, 상기 피검체의 조직에는 Sox2가 과량으로 존재하는 것이고, 상기 피검체는 암에 걸린 것을 조기에 진단할 수 있는 것이다. 또한, 상기 조성물은 체내 투여됨으로써 상기 피검체에서 암 줄기세포 존부를 비침습적으로 확인할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 암 줄기세포에서 과발현되는 Sox2 단백질에 결합하는 펩티드를 스크리닝하였고, 이와 같이 선별된 펩티드가 Sox2 단백질에 특이적으로 결합할 수 있음을 확인한 바(도 3 및 도 4 참조), 본 발명의 Sox2 검출용 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 암의 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

3. 암 진단용 키트

본 발명의 또 다른 측면은 상기 서열번호 5 내지 서열번호 9로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는, Sox2 검출용 폴리펩티드를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 암 진단용 키트에는 Sox2의 발현 수준을 측정하기 위한 폴리펩티드의 분석 방법에 적합한 하나 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물 또는 장치가 포함될 수 있다. 예를 들면, Sox2의 수준을 측정하는 암 진단 키트는 본 발명의 Sox2에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 이외에, 단백질 발현수준 측정을 위해 사용되는 공지된 방법을 이용한 키트를 제한 없이 사용할 수 있다.

상기 "단백질 발현수준 측정"이란 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 암 마커 유전자에서 발현되는 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로서, 상기 Sox2 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 검출체에 따른 검출 방법은 당업계에 널리 알려져 있으나, 예를 들어 다음과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 만약 검출체로 형광물질을 이용하는 경우에는 면역형광염색법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 형광물질로 표지된 본 발명의 폴리펩티드를 시료와 반응시키고 미결합 또는 비특이적인 결합 산물을 제거한 다음 형광현미경하에서 펩티드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 또한 검출체로 효소를 이용하는 경우에는 효소 반응을 통한 기질의 발색 반응에 의해 흡광도를 측정하고, 방사선 물질인 경우에는 방사선 방출량을 측정함으로써 수행할 수 있다.

본 발명의 키트는 이러한 분석 방법을 실시하기 위해 필요한 성분들을 추가로 포함할 수 있는데, 예를 들면, 서열번호 5 내지 서열번호 9로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열로 기재되는 폴리펩티드가 코팅된 반응기 또는 각 반응단계에 사용할 세척액 등을 포함할 수 있다.

상기 키트는 상기 "2. 암 진단용 조성물 " 항목의 조성물과는 달리 피검체 내로 투여되기 위한 것이 아니라, 피검체로부터 유래된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 생물학적 시료를 이용하여 피검체의 암 세포 유무를 진단하기 위한 것이다. 따라서, 상기 생물학적 시료 내에 포함된 단백질을 검출하기 위한 것이고, 특히 본 발명의 상기 키트는 상기 생물학적 시료 내에 포함된 Sox2 단백질을 검출하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 Sox2 단백질에 결합하는 펩티드를 파지 디스플레이 기법으로 스크리닝하여 선별된 펩티드가 Sox2 단백질에 특이적으로 결합할 수 있음을 확인한 바(도 3 및 도 4 참조), 본 발명의 Sox2 검출용 폴리펩티드를 포함하는 키트는 암의 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

Sox2 단백질의 대량 생산 및 분리

서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 정방향 및 역방향 프라이머로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 서열번호 4의 염기서열을 갖는 Sox2 유전자를 증폭하고, 이를 박테리아 발현벡터인 pET-28a(Novagen, 미국)에 삽입하였다. 상기와 같이 서열번호 4의 염기서열이 삽입된 발현벡터를 발현숙주인 대장균(E.coli) BL21(DE3) 세포에 형질전환시킨 후, 0.5 mM IPTG, 37 ℃ 조건하에서 12시간 동안 배양하여 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 Sox2 단백질의 발현을 유도하였다. 그런 다음, 상기 대장균 세포를 원심분리하여 수득하고, 상기 대장균 세포 내 단백질의 용해도를 확인하여 대부분의 단백질이 불용성임을 확인하였다.

상기와 같은 세포 내 불용성 단백질만을 얻어낸 뒤 이를 변성(denature) 조건에서 단백질을 분리 및 정제하였다. 구체적으로, 불용성 단백질을 6M 구아니디움-HCl(Guanidium-HCl)의 변성 조건에서 용해시키고 Ni-세파로스 컬럼을 통과시켜 Sox2 단백질을 결합시켰다. 그런 다음, 변성된 Sox2 단백질을 리폴딩(refolding) 시키기 위하여 컬럼에 결합된 상태로 선형 구배(linear gradient)(유레아 농도를 점점 감소시킴)를 통하여 서서히 변성을 제거시켜가며 Sox2 단백질을 리폴딩시키고 500 mM 이미다졸 선형 구배 하에서 용출하였다. 상기와 같이 수득한 단백질은 투석 버퍼(50 mM Tris, 2 mM β-메르캅토에탄올) 용액에서 투석하여 과량의 이미다졸을 제거하였다. 상기와 같은 과정을 통해 얻은 단백질의 정제도를 SDS/PAGE를 통하여 확인하였으며(도 1), 브래드포드(Bradford) 시약을 이용하여 양을 확인하였다.

그 결과 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 Sox2 단백질을 0.8 ㎎/ℓ 농도로 수득하였다.

Sox2 단백질에 결합하는 폴리펩티드의 선별 - 파지 디스플레이

상기 실시예 1에서 수득한 서열번호 3의 Sox2 단백질과 펩티드 라이브러리 Ph.D^TM(phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB)))를 이용하여, 대한민국 공개특허공보 제10-2008-0083807호 및 제10-2012-0132455호에 개시된 바와 같은 파지 디스플레이 방법으로 상기 Sox2 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 서열을 선별하였다. 보다 구체적으로는 도 2를 참조하여, 하기와 같다.

암 줄기세포 표지 마커인 Sox2 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 스크리닝하기 위하여, 상기 실시예 1에서 수득한 서열번호 3의 Sox2 단백질을 96웰의 폴리스티렌 플레이트(Qiagen, 미국)에 고정시킨 후, M13 파지 펩티드 라이브러리 Ph.D^TM(phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB)))를 첨가하여 상기 Sox2 단백질과 임의의 폴리펩티드 간의 결합을 유도하였다. 이후, 하기 표 1과 같은 세척조건, 결합 시간 및 용출 조건을 반복시킴으로써 보다 강한 결합력을 갖는 파지를 선별하는 바이오 패닝(Bio-panning) 과정을 4회 반복하였다.

라운드	세척 조건	파지 펩티드 결합 시간	용출
1	50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20	60분	화학적 용출 (0.2 M 글리신 pH 2.2, 1 mg/㎖ BSA)
2	50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.3% Tween-20	40분
3	50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.5% Tween-20	20분
4	50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.5% Tween-20	10분	경쟁적 용출 (10 몰라 초과 Sox2)

상기와 같이 얻어진 파지를 숙주세포인 대장균 ER2738 세포에 감염시키고 LB 배지에서 배양하여 증폭시킨 후, 100여 개의 파지 플라그를 선택하여 M13 파지 게놈성 DNA(단일 가닥화 원형 DNA)를 분리 정제하고, 각각의 유전자 염기서열을 확인하여 파지 표면 단백질(gp3 minor coat 단백질)에서 발현되어 Sox2 단백질과 결합하는 폴리펩티드 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 밝혔다. 상기와 같이 규명된 염기서열을 바탕으로 상기 Sox2 단백질과 결합하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 규명하였다.

그 결과, 하기 표 2에 기재된 바와 같이, 서열번호 3의 Sox2 단백질과 결합하는 서열번호 5 내지 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 다섯 개의 폴리펩티드가 확인되었다(표 2).

서열번호	펩티드 서열	빈출도 (%)
5	IPKRIIPHSRHI	91
6	SPTSIHGNGKMH	1.8
7	PPKRSHHLRPMR	1.8
8	QSHEQNNYNQRS	1.8
9	NVPTVWDNTFWY	3.6

선별된 폴리펩티드와 Sox2 단백질의 결합력 분석

상기 실시예 2에서 선별된 폴리펩티드의 결합력을 분석하기 위하여, 상기 서열번호 5 내지 서열번호 9의 폴리펩티드가 발현된 파지를 각각 증폭한 뒤, 역가측정(titering)을 통하여 파지 용액의 농도를 결정하였다. 그런 다음, 서열번호 3의 Sox2 단백질이 결합된 플레이트에 파지를 농도별로 넣어주어 결합한 파지의 양을 측정함으로써 해당 폴리펩티드의 결합력을 측정하였다.

구체적으로, 상기 서열번호 3의 Sox2 단백질이 결합된 플레이트에 서열번호 5 내지 서열번호 9의 폴리펩티드가 발현된 파지를 각각 농도별로 넣어 일정 시간 동안 결합 반응을 유도한 후 세척하였다. 그런 다음, 상기 파지 표면 단백질을 인식하는 항체를 넣어준 후, HRP(horse-radish peroxidase) 및 TMB 용액을 이용한 ELISA를 수행하고, 각각의 농도에 해당하는 ELISA 신호를 수집하여 해리 상수(K_D)를 분석함으로써, 상기 서열번호 3의 Sox2 단백질에 대한 상기 서열번호 5 내지 서열번호 9의 폴리펩티드의 결합력을 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 서열번호 5의 폴리펩티드 내지 서열번호 9의 폴리펩티드는 K_D 값이 각각 4.1 ρM, 129 ρM, 7.3 ρM, 23.5 ρM 및 6.5 ρM로 측정되어, 상기 실시예 2에서 수득된 5 종류의 폴리펩티드가 모두 피코몰 농도(ρM) 수준의 우수한 결합력을 가짐을 확인하였다(도 3).

단일 폴리펩티드와 Sox2 단백질의 결합력 분석

상기 실시예 3에서 파지에 발현된 상태에서 서열번호 3의 Sox2 단백질에 높은 결합력을 갖는 것으로 확인된 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 9의 폴리펩티드 서열에 형광 물질(FITC; fluorescein isothiocyanate)을 붙여 하기와 같은 서열의 폴리펩티드를 합성하였다.

서열번호 5의 폴리펩티드-FITC : Ac-IPKRIIPHSRHIGCGK-FITC-NH₂

서열번호 7의 폴리펩티드-FITC : Ac-PPKRSHHLRPMRGCGK-FITC-NH₂

서열번호 9의 폴리펩티드-FITC : Ac-NVPTVWDNTFWYGCGK-FITC-NH₂

상기 서열번호 5. 서열번호 7 및 서열번호 9의 폴리펩티드의 N-말단은 아세틸화시켜 아미노 말단의 반응성을 제거하였고, C-말단에는 FITC를 부착하기 위해 아미노산 라이신(Lysine, K)을 첨가하였다. 상기 서열번호 5. 서열번호 7 및 서열번호 9의 폴리펩티드의 C-말단에는 GCG 서열이 추가적으로 첨가되었는데, 이는 '서열번호 5의 폴리펩티드-FITC', '서열번호 7의 폴리펩티드-FITC' 및 '서열번호 9의 폴리펩티드-FITC'의 민감도를 극대화시키기 위한 것이다.

상기 서열번호 3의 Sox2 단백질에 대한 상기 '서열번호 5의 폴리펩티드-FITC', '서열번호 7의 폴리펩티드-FITC' 및 '서열번호 9의 폴리펩티드-FITC'의 결합력을 분석하기 위하여, 상기 '서열번호 5의 폴리펩티드-FITC', '서열번호 7의 폴리펩티드-FITC' 및 '서열번호 9의 폴리펩티드-FITC' 폴리펩티드를 서열번호 3의 Sox2 단백질이 고정된 플레이트에 농도별로 희석하여 넣어주었다. 그런 다음, 각 웰을 세척하고, 형광광도계로 상기 폴리펩티드에 연결된 FITC의 흡광도를 측정하여, 상기 서열번호 5. 서열번호 7 및 서열번호 9의 폴리펩티드의 해리 상수(K_D)를 분석하였다.

그 결과, 서열번호 5. 서열번호 7 및 서열번호 9의 폴리펩티드는 K_D 값이 각각 100 nM, 8.9 nM 및 1.3 nM로 측정되어, 상기 서열번호 5. 서열번호 7 및 서열번호 9의 폴리펩티드가 상기 서열번호 3의 Sox2 단백질에 대하여 나노몰 농도(nM) 수준의 높은 결합력을 가짐을 확인하였다(도 4).

Sox2에 결합하는 합성된 펩타이드를 이용한 세포내 Sox2의 결합력 분석

세포내 존재하는 Sox2 단백질을 진단하기 위하여 세포면역화학법 (Immunocytochemistry)을 이용하여 실제 Sox2가 과발현되는 암세포 U87 신경교종세포(U87 glioma cell line)를 이용하여 세포에 존재하는 Sox2 단백질을 진단하였다. 또한 신경교종세포에 일정량의 분할방사선을 처리함으로써 실제 신경교종세포내 Sox2가 과발현되는 것을 이용하여 방사선을 처리하지 않을 경우 일반적인 세포내 Sox2을 발현을 비교 분석하였다.

대조군으로 실제 Sox2를 인지하는 항체를 사용하여 본 연구에서 발굴한 Sox2 단백질에 결합하는 펩타이드를 비교 분석하였으며, 실험 방법은 다음과 같다.

U87 세포를 60mm 세포배양 플레이트에 10% 소태아혈청(FBS, fetal bovine serum), 100 U/ml 페니실린(penicillin), 100 μg/ml 스트렙토마이신 (streptomycin)이 함유된 DMEM 배지와 함께 분주하고 37℃, 5% CO₂ 조건하에 성장시켰다. 성장시킨 세포는 일부 분할방사선 처리를 하기 위하여, 3.81 Gy/min 감마선(γ-ray)에 노출시켰다. 각각 준비된 세포(U87 세포와 분할방사선을 처리한 세포)를 정량화하기 위하여 각 세포를 취하여 세포벽을 파괴하고, 세포내 존재하는 단백질을 분리하여 SDS-PAGE 전기영동을 통하여 단백질을 분리하였으며, 면역분석법(Immunoblot assay)을 수행하기위하여 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)에 트랜스퍼시켰다. 트랜스퍼시킨 막에 5% 탈지유(skim milk)를 사용하여 블록킹을 하고, 4℃에서 12시간 동안 Sox2 항체를 결합시켰다. 12시간 후, 이차 항체를 결합시키고, 마지막으로 화학발광법을 통하여 단백질을 정량화하였다. β-액틴은 대조구로 사용하기 위하여 함께 분석하였다. 상대적으로 Sox2만 분할방사선을 처리 시 과발현 되는 것을 확인하였다(참조: 도 5).

정량화한 단백질을 확인하고, 실제 세포 내 Sox2를 진단하기 위하여 위에서 언급한 두 가지 형태의 U87 세포를 0.1% Triton-X와 NP40이 함유된 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 1시간 세포를 고정시켰다. 다음으로 1% BSA (bovine serum albumin)로 블록킹을 시킨 후, Sox2 결합 펩타이드/Sox2 결합 항체를 2시간 결합시키고, 핵을 염색하기 위하여 DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole)를 사용하여 5분 동안 반응시켜주었다. 마지막으로 형광 현미경을 통하여 세포내 존재하는 Sox2에 결합하는 펩타이드 및 항체를 확인하였다. 대조구로 Sox2 항체를 사용하였으며, 상대적으로 펩타이드 처리 시 항체에 비하여 진단 신호가 증가된 것을 확인하였다. 또한, 분할방사선 처리한 세포에서 Sox2의 과발현으로 인하여 펩타이드를 이용한 세포내 Sox2 단백질을 확인하였다(참조: 도 6). 도 6의 (a)는 DAPI, (b)는 FITC, (c)는 도합(Merge)을 나타낸다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> Polypeptide for detecting Sox2 and uses thereof <130> PN130451 <150> 10-2012-0149167 <151> 2012-12-20 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Sox2 <400> 1 aaggatccat gtacaacatg atggagacgg ag 32 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Sox2 <400> 2 aactcgagtt atcacatgtg tgagaggggc ag 32 <210> 3 <211> 317 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Tyr Asn Met Met Glu Thr Glu Leu Lys Pro Pro Gly Pro Gln Gln 1 5 10 15 Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn Ser Thr Ala Ala Ala Ala Gly Gly 20 25 30 Asn Gln Lys Asn Ser Pro Asp Arg Val Lys Arg Pro Met Asn Ala Phe 35 40 45 Met Val Trp Ser Arg Gly Gln Arg Arg Lys Met Ala Gln Glu Asn Pro 50 55 60 Lys Met His Asn Ser Glu Ile Ser Lys Arg Leu Gly Ala Glu Trp Lys 65 70 75 80 Leu Leu Ser Glu Thr Glu Lys Arg Pro Phe Ile Asp Glu Ala Lys Arg 85 90 95 Leu Arg Ala Leu His Met Lys Glu His Pro Asp Tyr Lys Tyr Arg Pro 100 105 110 Arg Arg Lys Thr Lys Thr Leu Met Lys Lys Asp Lys Tyr Thr Leu Pro 115 120 125 Gly Gly Leu Leu Ala Pro Gly Gly Asn Ser Met Ala Ser Gly Val Gly 130 135 140 Val Gly Ala Gly Leu Gly Ala Gly Val Asn Gln Arg Met Asp Ser Tyr 145 150 155 160 Ala His Met Asn Gly Trp Ser Asn Gly Ser Tyr Ser Met Met Gln Asp 165 170 175 Gln Leu Gly Tyr Pro Gln His Pro Gly Leu Asn Ala His Gly Ala Ala 180 185 190 Gln Met Gln Pro Met His Arg Tyr Asp Val Ser Ala Leu Gln Tyr Asn 195 200 205 Ser Met Thr Ser Ser Gln Thr Tyr Met Asn Gly Ser Pro Thr Tyr Ser 210 215 220 Met Ser Tyr Ser Gln Gln Gly Thr Pro Gly Met Ala Leu Gly Ser Met 225 230 235 240 Gly Ser Val Val Lys Ser Glu Ala Ser Ser Ser Pro Pro Val Val Thr 245 250 255 Ser Ser Ser His Ser Arg Ala Pro Cys Gln Ala Gly Asp Leu Arg Asp 260 265 270 Met Ile Ser Met Tyr Leu Pro Gly Ala Glu Val Pro Glu Pro Ala Ala 275 280 285 Pro Ser Arg Leu His Met Ser Gln His Tyr Gln Ser Gly Pro Val Pro 290 295 300 Gly Thr Ala Ile Asn Gly Thr Leu Pro Leu Ser His Met 305 310 315 <210> 4 <211> 954 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgtacaaca tgatggagac ggagctgaag ccgccgggcc cgcagcaaac ttcggggggc 60 ggcggcggca actccaccgc ggcggcggcc ggcggcaacc agaaaaacag cccggaccgc 120 gtcaagcggc ccatgaatgc cttcatggtg tggtcccgcg ggcagcggcg caagatggcc 180 caggagaacc ccaagatgca caactcggag atcagcaagc gcctgggcgc cgagtggaaa 240 cttttgtcgg agacggagaa gcggccgttc atcgacgagg ctaagcggct gcgagcgctg 300 cacatgaagg agcacccgga ttataaatac cggccccggc ggaaaaccaa gacgctcatg 360 aagaaggata agtacacgct gcccggcggg ctgctggccc ccggcggcaa tagcatggcg 420 agcggggtcg gggtgggcgc cggcctgggc gcgggcgtga accagcgcat ggacagttac 480 gcgcacatga acggctggag caacggcagc tacagcatga tgcaggacca gctgggctac 540 ccgcagcacc cgggcctcaa tgcgcacggc gcagcgcaga tgcagcccat gcaccgctac 600 gacgtgagcg ccctgcagta caactccatg accagctcgc agacctacat gaacggctcg 660 cccacctaca gcatgtccta ctcgcagcag ggcacccctg gcatggctct tggctccatg 720 ggttcggtgg tcaagtccga ggccagctcc agcccccctg tggttacctc ttcctcccac 780 tccagggcgc cctgccaggc cggggacctc cgggacatga tcagcatgta tctccccggc 840 gccgaggtgc cggaacccgc cgcccccagc agacttcaca tgtcccagca ctaccagagc 900 ggcccggtgc ccggcacggc cattaacggc acactgcccc tctcacacat gtga 954 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide #1 <400> 5 Ile Pro Lys Arg Ile Ile Pro His Ser Arg His Ile 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide #2 <400> 6 Ser Pro Thr Ser Ile His Gly Asn Gly Lys Met His 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide #3 <400> 7 Pro Pro Lys Arg Ser His His Leu Arg Pro Met Arg 1 5 10 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide #4 <400> 8 Gln Ser His Glu Gln Asn Asn Tyr Asn Gln Arg Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide #5 <400> 9 Asn Val Pro Thr Val Trp Asp Asn Thr Phe Trp Tyr 1 5 10

Claims (11)

1. 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 9로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는, Sox2(SRY(Sex-determining Region Y)-box2) 검출용 폴리펩티드.
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 발색효소, 형광물질 및 방사성 동위원소로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 검출체로 태깅(tagging)된 것을 특징으로 하는 Sox2 검출용 폴리펩티드.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 Sox2는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 Sox2 검출용 폴리펩티드.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 Sox2는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 Sox2 검출용 폴리펩티드.
6. 제 1 항의 폴리펩티드를 포함하는 암 진단용 조성물.
7. 삭제
8. 제 6 항에 있어서, 상기 암은 뇌종양, 폐암, 췌장암, 간암, 전립선암, 대장암, 유방암, 위암 및 직장암으로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 진단용 조성물.
9. 제 1 항의 폴리펩티드를 포함하는 암 진단용 키트.
10. 삭제
11. 제 9 항에 있어서, 상기 암은 뇌종양, 폐암, 췌장암, 간암, 전립선암, 대장암, 유방암, 위암 및 직장암으로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트.
    

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