KR20230064308A

KR20230064308A - 카뎁신 b 검출용 펩타이드

Info

Publication number: KR20230064308A
Application number: KR1020210149756A
Authority: KR
Inventors: 박종필; 강선철; 신재환; 김지홍
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단; 대구대학교 산학협력단
Priority date: 2021-11-03
Filing date: 2021-11-03
Publication date: 2023-05-10

Abstract

본 발명은 박테리오파지 디스플레이 스크리닝을 이용하여 발굴한 신규한 펩타이드에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 상기 펩타이드는 카뎁신 B와 특이적으로 결합할 수 있어 카뎁신 B를 정확하게 검출할 수 있으며, 본 발명에 따른 펩타이드가 고정된 바이오칩 또한 카뎁신 B에 대해 높은 민감도와 특이성을 나타내는 것을 확인한 바, 이를 카뎁신 B 검출, 또는 암 또는 알츠하이머와 같은 카뎁신 B 관련 질환의 진단을 위하여 유용하게 활용할 수 있다.

Description

카뎁신 B 검출용 펩타이드{Peptide for specific detection of cathepsin B}

본 발명은 카뎁신 B 검출용 펩타이드 및 이의 용도에 대한 것이다.

카뎁신(Cathepsin)은 암 성장에서 전이를 위한 분화 및 전이를 포함하는 전체적인 발암과정에 관련된 효소로 현재까지 12개 이상의 카뎁신이 다양한 유기체에서 발견되었다. 그 중 카뎁신 B는 유방암, 난소암, 췌장암, 폐암, 간암, 대장암 등 많은 악성 종양에서 과발현한 것을 관찰하였다는 연구결과가 보고된 바 있다. 상기 카뎁신 B는 세포내 리소좀 및 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 등에서 발견되며 세포외기질 성분의 분해, 세포간 신호교환 방해 및 단백질분해효소 억제제 발현에 관여하는 것으로 알려진 바, 이를 바탕으로 카뎁신 B는 암 성장을 억제하거나 암치료의 대표적인 표적물질로 여겨졌다.

더불어 상기 카뎁신 B가 신경보호 작용을 하고, 아밀로이드 플라크(Amyloid plaque)를 제거하며, 카뎁신 B가 결핍된 쥐의 경우 기억 능력이 감소함이 확인된 바 있다.

현재 활성 측정 기술로 광학(spectroscopy), 전기영동(gel electrophoresis), ELISA, HPLS 등의 기술을 기반으로 한 카뎁신 B를 조기진단 및 검출하기 위한 여러 진단, 검출 시스템이 보고되어 있다. 일반적으로 진단 기술에 사용되는 항체는 광범위하게 사용됨에도 불구하고 분자량이 크고 안정성이 떨어지기 때문에 기능 향상이 필요하고, 특히 동물세포에서 대량 생산하는데 비용이 많이 든다.

따라서 안정성이 높고, 저렴한 비용으로 제작할 수 있으며 카뎁신 B에 대해 높은 친화성을 가지는 검출용 물질의 개발이 필요하다.

본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, 카뎁신 B를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 기술에 대해 연구하던 중, 카뎁신 B에 특이적으로 결합하는 신규한 펩타이드를 발굴하고 상기 펩타이드가 카뎁신 B만 특이적으로 정확하게 검출할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 카뎁신 B(cathepsin B) 검출용 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 카뎁신 B 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 카뎁신 B 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 카뎁신 B 검출용 바이오칩을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 카뎁신 B 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 카뎁신 B 관련 질환의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 일부 또는 전체 서열을 포함하는 카뎁신 B(cathepsin B) 검출용 펩타이드를 제공한다.

또한 상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 카뎁신 B 검출용 조성물을 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 카뎁신 B검출용 키트를 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 카뎁신 B 검출용 바이오칩을 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 시료에 처리하는 단계; 및 상기 펩타이드와 시료의 반응을 검출하는 단계;를 포함하는, 카뎁신 B 검출 방법을 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 카뎁신 B 관련 질환 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 신규한 카뎁신 B 검출용 펩타이드는 비특이적 결합이 없으면서도 카뎁신 B에 대해 높은 정확도 및 민감도를 보이며, 이를 포함하는 바이오칩 또한 카뎁신 B를 정확하게 검출할 수 있는 바, 이를 이용하여 카뎁신 B 검출 또는, 암 또는 알츠하이머병과 같은 카뎁신 B 관련 질환의 진단 또는 경과 관찰 등에 유용하게 활용할 수 있으므로 카뎁신 B와 관련된 질병을 해결하는데 크게 기여할 수 있다.

도 1은 카뎁신 B에 대해 특이적 결합을 보이는 펩타이드를 확인한 결과이다.
도 2는 도 1에서 확인된 카뎁신 B에 대해 특이적 결합을 보이는 펩타이드의 유사체의 카뎁신 B에 대한 결합력을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 펩타이드의 최적 농도를 확인한 결과이다.
도 4 및 도 5는 본 발명에 따른 펩타이드의 카뎁신 B 농도에 따른 검출 효능을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 카뎁신 B를 특이적으로 검출할 수 있는 펩타이드에 대한 것으로, 하기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 일부 또는 전체 서열을 포함하는 카뎁신 B(cathepsin B) 검출용 펩타이드를 제공한다.

SSTTNSNSTSNTK(서열번호 1).

상기 서열번호 1로 표시되는, 본 발명에 따른 펩타이드의 아미노산 서열은 M13 박테리오파지를 이용한 바이오패닝을 통해 카뎁신 B에 결합하는 서열을 찾아낸 것이다.

상기 M13 박테리아파지는 특정 형질(strain)의 대장균만 감염되는 성질을 지니는 나노크기의 물질이며 돌연변이를 일으켜 인체에 감염될 가능성에 대해서는 현재까지 전혀 보고된 바 없다. 특히 2006년 FDA의 승인을 얻어 인스턴트식품의 세균 오염 방지용 첨가물로 활용되고 있으며, 항생제의 내성 문제는 해결할 수 있는 대체제뿐만 아니라 인체에 무해한 생체 진화형 나노물질로 각광을 받고 있다. 더불어 상기 박테리아파지를 이용하는 경우, 제조 공정이 간단하며 생산성과 안정성의 향상을 기대할 수 있고, 다양한 유전공학적, 화학적 변형을 활용할 수 있는 장점이 있다.

본 발명에 따른 펩타이드는 저분자 펩타이드로서 그 크기가 작아서 3차원적으로 안정화되어 있고 점막을 쉽게 통과하며 조직 깊은 곳에서도 분자 목표물을 인지할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 대량 생산이 항체에 비해 상대적으로 간단하고, 독성이 거의 없다. 이외에도 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 표적 물질에 대한 결합력이 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다.

본 발명에 따른 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC(9-fluorenylmethoxycarbonyl) 또는 T-BOC(tert-butyloxycarbonyl) 화학법이 포함되나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 Applied Biosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 더불어 본 발명에 따른 펩타이드는 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위해서 N 말단 또는 C 말단을 변형하거나 여러 유기단으로 보호한 형태일 수 있다. 즉, 상기 펩타이드의 C 말단은 안정성을 증가시키기 위해서 변형될 수 있는 형태라면, 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 히드록시기(-OH) 또는 아미노기(-NH₂)로 변형되는 것일 수 있다. 또한 상기 펩타이드의 N 말단은 안정성을 증가시키기 위해서 변형될 수 있는 형태라면, 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 아세틸(Acetyl)기, 플루오레닐 메톡시카르보닐(Fmoc)기, 포르밀(Formyl)기, 팔미토일(Palmitoyl)기, 미리스틸(Myristyl)기, 스테아릴(Stearyl)기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 이루어진 군에서 선택되는 기로 변형되는 것일 수 있다.

또한 본 발명에 따른 펩타이드는 D형, L형, 펩토이드 모노머를 포함한 펩타이드 모방체 또는 비천연 아미노산 중의 어느 하나의 아미노산을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명에 따른 펩타이드는 이중체(dimer), 삼중체(trimer) 또는 다중체(multimer)인 것을 특징으로 하며, N 말단 혹은 C 말단에 다양한 기능기를 포함할 수 있다.

상기 다양한 기능기의 예시로서, N 말단의 기능기는 자유아민(free amine), 아세틸화(acetylation), 바이오틴(biotin) 및 형광단(fluorophore)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, C 말단의 기능기는 유리산(free acid), 아미드화(amidation), 비오틴(biotin) 및 형광단(fluorophore)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 더불어 본 발명에 따른 펩타이드는 검출 또는 동정을 위하여 표지될 수 있으며, 발색효소, 방사선 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표지될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 발색효소는 예를 들어, 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)일 수 있고, 상기 방사성 동위원소는 예를 들어, 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P,35S일 수 있으며, 상기 발광물질 또는 형광물질은 예를 들어, FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots) 등일 수 있다.

유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다.

만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 형광단층촬영(Fluorescence mediated tomography, FMT)으로 카뎁신 B에 결합한 펩타이드의 형광 패턴을 관찰할 수 있고, 형광이 관찰되는 패턴에 따라, 카뎁신 B를 검출할 수 있다.

본 발명의 카뎁신 B 검출용 펩타이드 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 펩타이드와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 포함하는데에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).

펩타이드의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 펩타이드를 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0±1); 글루타메이트 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 카뎁신 B 검출용 펩타이드는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 펩타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있는 어떤 방법이라도 제한없이 사용할 수 있다.

더불어 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 카뎁신 B 검출용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 카뎁신 B 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 카뎁신 B 검출용 키트에는 카뎁신 B 검출을 위한 펩타이드의 분석 방법에 적합한 하나 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물 또는 장치가 포함될 수 있고, 펩타이드의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 안정성을 유지하기 위해, 4℃로 유지된 상태로 제공될 수 있다.

카뎁신 B에 결합한 본 발명에 따른 펩타이드의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 키트에 포함되는 펩타이드는 상술한 바와 같이 표지된 상태로 제공될 수 있다. 한편, 본 발명의 펩타이드가 표지되지 않은 채로 제공되는 경우에는, 본 발명의 키트는 본 발명의 펩타이드의 시험관 내 또는 생체 내에서 카뎁신 B와의 결합 정도 또는 그 위치를 탐색하기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분은 본 발명의 펩타이드의 표지를 위한 공지의 화합물이거나, 항원-항체반응을 통한 탐색을 위하여 본 발명의 펩타이드 또는 본 발명의 펩타이드와 결합하는 특정 수용체에 대한 항체 또는 이들에 대한 2차 항체 및 이의 검출을 위한 시약일 수 있다. 일 구체예로서 본 발명의 키트는 카뎁신 B와 관련된 질환의 진단을 위하여 사용될 수 있고, 상기 진단은 종래의 면역분석(immunoassay) 방식 또는 프로토콜을 변형하여 실시될 수 있다. 예컨대, 종래 면역분석에서 항체 대신에, 본 발명의 펩타이드를 사용하고, 프로세스는 동일하게 하여 진단을 실시할 수 있다.

더불어 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 카뎁신 B 검출용 바이오칩을 제공한다.

본 발명에 따른 펩타이드는 바이오칩으로 사용 가능한 다양한 칩 (금(gold), 은(silver), 자성 비드(magnetic bead), 실리카(silica), 그래핀(graphene), 탄소 나노튜브(carbon nanotube) 등) 상에 특이적으로 고정될 수 있다. 다만, 본 발명의 특징은 전술한 펩타이드의 특징과 관련되며 이와 같이 펩타이드를 바이오칩으로 제조하는 것은 공지기술에 따라 할 수 있는 부분이다.

본 발명에 따른 카뎁신 B 검출용 바이오칩을 이용하여 단백질과 단백질 간의 반응, 단백질과 반응리간드 간의 반응, 목적리간드와 반응단백질 간의 반응 또는 목적리간드와 반응리간드간의 반응을 검출할 수 있다.

상기 반응리간드는 단백질이나 펩타이드와 반응하는 저분자량의 생체물질, 펩티드, 탄수화물, 앱타머, 지방산 또는 지질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더불어 상기 반응단백질은 효소 또는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 목적리간드는 단백질이나 펩타이드와 반응하는 저분자량의 화합물, 핵산, 펩티드, 탄수화물, 앱타머, 지방산 또는 지질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더불어 상기 반응 검출은 표지 혹은 비표지체를 이용하여 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 시료에 처리하는 단계; 및 상기 펩타이드와 시료의 반응을 검출하는 단계;를 포함하는, 카뎁신 B 검출 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서 상기 "시료"는 가장 광범위한 의미로 사용된다. 한편으로 이는 검체 또는 배양물(예를 들어 미생물 배양물)을 포함하는 의미이다. 다른 한편으로는 생물학적 및 환경적 시료 양자 모두를 포함하는 의미이다. 더불어 시료는 합성 기원의 검체를 포함할 수 있다. 상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 반응의 검출은 순환 전압 전류법(Cyclic Voltammetry), 사각파전압전류법(Square Wave Voltammetry), 전기화학 임피던스 분광법(Electrochemical impedance spectroscopy), 수정 진동자 마이크로밸런스(Quartz crystal microbalance), 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance), LFA(Lateral flow assay)/VFA(Variable flip angle), 효소 결합 면역 분석법(Enzyme linked immunoassay), 형광 공명 에너지 전달(Fluorescence resonance energy transfer) 및 표면증강 라만 분광법(Surface-enhanced Raman spectroscopy)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 카뎁신 B 관련 질환 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 "진단"은 특정 질병 또는 질환, 또는 이의 원인에 대한 한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 개체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 펩타이드를 이용하여 카뎁신 B의 검출이 가능한바, 이를 이용하여 시료 내 카뎁신 B의 존재 유무를 검출하거나, 카뎁신 B의 양을 정량하기 위한 용도로 활용될 수 있고, 보다 구체적으로는 카뎁신 B 발현과 관련된 질환을 진단하는데 사용될 수 있다. 상기 질환이 카뎁신 B의 과발현에 의한 질환인 경우, 유방암, 난소암, 췌장암, 폐암, 간암, 대장암, 흑색종, 교모세포종 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 질환이 카뎁신 B의 결핍에 의한 질환인 경우, 알츠하이머병(Alzheimer's disease)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.

이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 카뎁신 B에 특이적인 펩타이드의 발굴

카뎁신 B에 특이적인 펩타이드를 발굴하기 위하여 먼저 엔조(Enzo)사에서 카뎁신 B를 구입하였다. 더불어 M13의 박테리오파지 무작위 펩타이드 라이브러리(phage display peptide library)는 NEB(New England BioLab)사의 Ph.D. -12mer를 사용하였다. 특정 아미노산 서열 발굴을 위해 카뎁신 B (농도: 16.2 μg/mL(=0.5 μM)) 100 μL와 Ph.D. -12mer 라이브러리(농도: 1.0 × 10¹¹ PFU/mL) 1 μL를 이용하여 총 4회의 패닝(panning)을 수행하였으며, 스트렙트아비딘(streptavidin)이 코팅되어 있는 평판(Thermo scientific사에서 구입)을 사용하였다. 패닝 결과 하기 표 1과 같이 총 3개 파지 후보군이 발굴되었고, 각각의 결합력은 효소 결합 면역 분석법(Enzyme linked immunoassay)을 이용해 확인하였다. 각 후보군과 카뎁신 B의 결합력을 비교하기 위하여 스트렙트아비딘이 코팅되어 있는 평판에 바이오틴이 부착된 소 혈청 알부민(BSA) 100 μL (농도: 16.5 μg/mL (=0.25 μM))와 바이오틴이 부착된 카뎁신 B 100 μL (농도: 8.1 μg/mL (=0.25 μM))을 고정하였다. 선별된 각각의 파지를 10¹¹ PFU/mL의 농도로 처리하고 상온에서 1시간동안 110 rpm의 속도로 교반하였다. 그 후 PBST로 6회 반복하여 세척한 후, 항-M13-HRP(Anti-M13-HRP) 항체와 ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))를 이용하여 405nm에서 흡광도(OD)값을 측정하였다.

그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, 3개의 후보군 중 CTSB 4-1 (WDMWPSMDWKAE)로 명명된 후보군이 BSA에 대한 비특이적 결합이 없으면서도 카뎁신 B에 대해 가장 좋은 결합력을 보이는 것을 확인하였다.

더불어 바이오틴이 붙어있는 Ph.D. -12mer 라이브러리를 혼합한 후 상온에서 1시간동안 교반하였다. 이를 바탕으로 총 5가지의 펩타이드를 새롭게 합성하였고, 합성된 펩타이드 및 그의 유사체의 서열을 하기 표 2에 나타내었다.

후보군	아미노산 서열(N → C)
CTSB 2-3	DGSMLNRMRGFS
CTSB 4-1	WDMWPSMDWKAE
CTSB 4-9	DGFIRPSGVRVA

후보군	아미노산 서열(N → C)
CTSB BP1	WDMWPSMDWKAEK [biotin]
CTSB BP2	WGMWPGMGWPAGK [biotin]
CTSB BP3	SSTTNSNSTSNTK [biotin]
CTSB BP4	HRHRRHRHRKHHK [biotin]
CTSB BP5	DDEDDEEDDEDEK [biotin]

먼저 CTSB BP1 펩타이드는 원본 서열을 그대로 합성하였고, 두 번째로 CTSB BP2는 결합 상호작용에 대한 극성 아미노산 잔기의 영향을 확인하도록 설계되었다. CTSB BP1의 3개 아미노산을 비극성 잔기로 치환하였는데, CTSB BP1에서 두 번째 위치의 아스파트산 (D)과 여섯 번째 위치의 세린(S)은 글라이신 (G) 잔기로 치환되었다. 그리고 열 번째의 라이신(K) 및 글루탐산 (E)가 각각 프롤린 (P) 및 글라이신 (G)으로 대체되어 최종적으로 WGMWPGMGWPAG의 서열을 가진 펩타이드로 합성되었다. 세 번째로 결합 상호작용에 대한 극성 아미노산 잔기 및 친수성의 특징을 가진 아미노산의 영향을 조사하기 위해 트립토팜 (W)을 세린 (S)으로 치환하는 등 SSTTNSNSTSNT서열의 CTSB BP3 펩타이드를 합성하였다. 네 번째로 CTSB BP4 펩타이드는 HRHRRHRHRKHH 서열을 가졌고 이는 결합 상호작용에 대한 양전하 아미노산 잔기의 영향을 알아보기 위해 만들어졌다. 마지막으로 DDEDDEEDDEDE 서열로 합성된 CTSB BP5 펩타이드는 결합 상호작용에 대한 음전하 아미노산의 영향을 보기위해 CTSB BP1의 트립토판 (W)을 아스파트산 (D)으로 치환하여 설계되었다. 합성된 펩타이드는 모두 스트렙트아비딘(streptavidin)이 코팅된 금 전극에 특이적으로 고정하기 위해 C 말단에 비오틴을 부착하였다.

실시예 2. 선별된 후보군의 카뎁신 B에 대한 결합력 확인

카뎁신 B에 대해 우수한 결합력을 가진 펩타이드를 선택하기 위하여, 상기 실시예 1을 통해 도출된 표 2의 후보군을 각각 금 전극에 고정하였다. 먼저 금 전극을 에탄올에 5분 동안 침지한 후 황산(H₂SO₄) : 과산화수소 (H₂O₂)를 7 : 3 비율로 혼합하여 금 전극 연마공정에 사용하였다. 이후 1 mM MUA(Mercaptoundecanoic acid)에 16시간동안 상온에서 전처리 과정을 거치고, 400 mM/100 mM EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride))와 NHS(N-Hydroxysuccinimide)를 1시간 동안 MUA가 고정된 금 전극에 올려 기능기를 활성시켰다. 상기 전극에 스트렙트아비딘 100 μg/mL을 1시간 동안 상온에서 처리하여 아민결합으로 고정되도록 하였다. 이후 50 μM 후보군을 스트렙트아비딘-비오틴 결합을 이용해 금 전극위에 도포한 후 0. 125 μM 농도의 카뎁신 B와 대조군 단백질인 BSA, 카뎁신 S와 카뎁신 L1과 반응시켰다. 펩타이드와 단백질간의 상대적인 결합력은 전기화학 분석법 중 전류의 흐름을 측정하는 사각파전압전류법(Square Wave Voltammetry, SWV)를 통해 확인하였다.

그 결과 도 2와 같이, 후보군 중 CTSB BP3 펩타이드는 BSA, 카텝신 L1 및 S에 대한 결합력보다 표적 단백질인 카텝신 B에 대해 높은 결합력을 보였다. CTSB BP3 펩타이드와 달리 CTSB BP4 펩타이드는 BSA, 카텝신 L1 및 S에 대해 높은 비특이적 결합을 갖는 반면 카텝신 B에 대한 결합력은 CTSB BP3 펩타이드에 비해 현저히 낮았다. 이는 CTSB BP4 펩타이드 서열 내 양전하를 띤 아미노산이 매우 풍부하므로 펩타이드와 카텝신 B 간의 결합 상호작용에 영향을 미친 것으로 추측되었다. 더불어 CTSB BP1는 CTSB BP2 및 CTSB BP5와 상대적인 결합력이 비슷했지만 카텝신 B에는 결합하지 않았다. 따라서 CTSB BP3 펩타이드를 본 발명의 카뎁신 B 검출용 펩타이드로 선정하였다.

실시예 3. 후보 펩타이드의 최적 농도 확인

상기 실시예 1을 통해 선별된 CTSB BP3 펩타이드가 고정된 바이오칩의 카뎁신 B에 대한 결합력 최적화를 위해 펩타이드 농도에 따른 결합력을 비교하는 실험을 진행하였고, 다음과 같은 전기화학분석법을 실행하였다.

100 μg/mL 스트렙트아비딘이 코팅된 금 전극에 CTSB BP3 펩타이드를 각각 5, 25, 50, 100 μM 농도로 올린 후 1시간동안 상온에서 교반하였다. 이후 3차 증류수로 6회 반복하여 세척한 후 SWV로 전류의 흐름을 측정하고 카뎁신 B를 0.125 μM 농도로 첨가하여 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 이후 다시 3차 증류수로 6회 반복하여 세척한 후 SWV로 전류의 값을 측정하였다.

그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, CTSB BP3 펩타이드는 농도가 50 μM 일 때 카뎁신 B 단백질과의 결합력이 가장 높은 것으로 나타났다.

실시예 4. 카뎁신 B 농도에 따른 결합력 확인

상기 실시예 1을 통해 선별된 CTSB BP3 펩타이드가 고정된 바이오칩의 카뎁신 B 농도에 따른 결합력을 확인하였다. 상기 실시예 3에서 확인된 바와 같이, CTSB BP3 펩타이드의 농도는 50 μM로 수행하였다. 먼저 100 μg/mL 농도의 스트렙트아비딘이 코팅된 금 전극에 50 μM의 CTSB BP3 펩타이드를 처리하고 1시간 동안 상온에서 교반시켰다. 이후 3차 증류수로 6번 반복하여 세척한 후, 50 μL의 카뎁신 B(농도: 0.0039 - 0.25 μM)를 펩타이드가 고정화된 칩에 올린 후 1시간동안 상온에서 교반시켰다. 그런 후 3차 증류수로 다시 6번 반복하여 세척한 후 SWV로 결합력을 측정하였고, 하기 수학식 1을 통해 결합상수(Kd)와 검출한계(LOD)를 산출하였다:

[수학식 1]

검출한계 (LOD) = 3.3 ×1.451(δ) / 11.578 (slope)

그 결과 도 4 및 도 5와 같이, 카뎁신 B의 농도가 증가할수록 CTSB BP3 펩타이드와의 결합력이 증가되며, 결합상수(결합상수(Kd) = 0.0507 ±0.0076 nM)와 검출한계도 증가하는 것을 확인하였다.

실시예 5. 본 발명에 따른 펩타이드가 고정화된 바이오칩의 정확도 확인

본 발명에 따른 CTSB BP3 펩타이드 고정된 칩이 사람의 혈장에 있는 카뎁신 B를 검출할 수 있는지 확인하였다.

먼저 100 μg/mL 농도의 스트렙트아비딘이 코팅된 금 전극에 50 μM의 CTSB BP3 펩타이드를 처리하고 1시간 동안 상온에서 교반한 후 3차 증류수로 6번 반복하여 세척하였다. 이후 사람의 혈장과 3가지 농도(0.0313, 0.0625, 0.1250 μM)의 카뎁신 B를 혼합한 후 이를 펩타이드가 고정된 칩에 올려 1시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응이 끝난 후 3차 증류수로 다시 6번 반복하여 세척한 후 SWV로 전류값을 측정하였다.

그 결과 하기 표 3과 같이, 본 발명에 따른 CTSB BP3가 고정된 골드칩은 혈장에 존재하는 카뎁신 B를 검출하였으며, 약 96.03 ~ 99.43 % 정도의 검출 회수율을 보였고, 15 % 미만의 변동계수를 보였다. 따라서 본 발명에 따른 펩타이드가 고정된 바이오칩은 혈장내에서 정확하게 타겟 단백질인 카뎁신 B를 검출함을 확인하였다.

카뎁신 농도(μM)	검출 농도(μM)	변동 계수(%)	회수율(%)
0.0313	0.0301 ± 0.0021	6.99	96.03 ±6.72
0.0625	0.0615 ± 0.0015	2.37	98.37 ±2.33
0.1250	0.1243 ± 0.0016	1.30	99.43 ±1.29

종합적으로, 박테리오파지 디스플레이 스크리닝을 이용하여 발굴한 본 발명의 펩타이드는 카뎁신 B와 특이적으로 결합할 수 있어 카뎁신 B를 정확하게 검출할 수 있음을 확인하였으며, 본 발명에 따른 펩타이드가 고정된 바이오칩도 카뎁신 B에 대해 높은 민감도와 특이성을 나타내는 것을 확인하였다.

<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation Industry Academic Cooperation Foundation, Daegu University <120> Peptide for specific detection of cathepsin B <130> 1-92P <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for specific detection of cathepsin B <400> 1 Ser Ser Thr Thr Asn Ser Asn Ser Thr Ser Asn Thr Lys 1 5 10

Claims

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 일부 또는 전체 서열을 포함하는 카뎁신 B(cathepsin B) 검출용 펩타이드.
제 1항에 있어서,
상기 펩타이드는 이중체(dimer), 삼중체(trimer) 또는 다중체(multimer)인 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
제 1항에 있어서,
상기 펩타이드는 발색효소, 방사선 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표지되는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는 카뎁신 B 검출용 조성물.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는 카뎁신 B검출용 키트.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는 카뎁신 B 검출용 바이오칩.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 시료에 처리하는 단계; 및 상기 펩타이드와 시료의 반응을 검출하는 단계;를 포함하는, 카뎁신 B 검출 방법.
제 7항에 있어서,
상기 반응의 검출은 순환 전압 전류법(Cyclic Voltammetry), 사각파전압전류법(Square Wave Voltammetry), 전기화학 임피던스 분광법(Electrochemical impedance spectroscopy), 수정 진동자 마이크로밸런스(Quartz crystal microbalance), 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance), LFA(Lateral flow assay)/VFA(Variable flip angle), 효소 결합 면역 분석법(Enzyme linked immunoassay), 형광 공명 에너지 전달(Fluorescence resonance energy transfer) 및 표면증강 라만 분광법(Surface-enhanced Raman spectroscopy)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는 카뎁신 B 관련 질환의 진단용 조성물.
제 9항에 있어서,
상기 카뎁신 B 관련 질환은 카뎁신 B의 과발현 또는 결핍에 의한 질환인 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
제 10항에 있어서,
상기 카뎁신 B의 과발현에 의한 질환은 유방암, 난소암, 췌장암, 폐암, 간암, 대장암, 흑색종, 교모세포종 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
제 10항에 있어서,
상기 카뎁신 B의 결핍에 의한 질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease)인 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.