KR101611494B1 - ＰＫＣ－δ 검출용 폴리펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 PKC-δ 검출용 폴리펩티드에 관한 것으로, 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 PKC-δ(Protein Kinase C-delta) 검출용 폴리펩티드 및 이를 이용한 암 진단 시스템을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 암 줄기세포의 분화과정에서 활성을 띄는 세포 내부 신호조절 단백질인 극미량의 PKC-δ를 특이적으로 인지하여 결합할 수 있으므로, 기존의 항원-항체 진단 시스템이 갖는 안정성 및 민감도의 한계를 극복한 초고감도의 펩티드 진단체로서 이용할 수 있으며, 극미량의 질병 표지물질 검출에 따른 질병의 조기 진단과 이를 통한 치료 효율 증대가능성을 제안하는 효과가 있다.

Description

ＰＫＣ－δ 검출용 폴리펩티드 및 이의 용도{Polypeptide for detecting PKC-delta and uses thereof}

본 발명은 PKC-δ 검출용 폴리펩티드에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 PKC-δ 촉매도메인 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다.

암은 인체 내부의 유전적인 변이들의 축적으로부터 발생하는데 이것은 인체 외부 또는 내부의 여러 화학물질에 대한 노출과 인체 내부 여러 인자들의 상호작용으로부터 기인한다. 유전적인 변이들은 인체 내부의 중요한 신호전달 인자들에 영향을 주게 되며 이것은 특정 기능의 장애를 일으킨다. 이러한 유전적 변이로부터 유도된 기능적 장애들이 장기적으로 지속될 경우 세포 내에 비정상 콜로니가 형성되고 이것이 축적되어 암이 발생한다.

암을 치료하기 위해 이용되는 방사선 치료로는 고선량 방사선의 정상세포에 대한 부작용을 줄이기 위하여 상대적으로 저선량의 방사선을 반복 처리하는 분할 방사선 치료법이 주로 이용되고 있다. 하지만 분할 방사선 치료는 암세포에서 적응 방사선저항성(adaptive radioresistance)을 유도하여 암세포의 재분화 및 악성화를 유발한다고 알려져 있다.

한편, 악성 종양조직 내에는 정상 줄기세포와 유사하게 암 조직을 재생하고 유지하는 암 줄기세포(cancer stem cell)가 존재하며, 이러한 암 줄기세포가 혈중 유입되어 전이 표적조직에 침윤/이동한 후 악성화된 특이적인 암으로 분화함으로써 전이암을 유발한다고 보고되고 있다. 또한, 분할 방사선 처리시 적응 방사선저항성 획득의 주된 원인이 암 줄기세포라는 주장이 주목받고 있다.

분할 방사선 처리요법을 포함한 기존의 항암치료는 일차 종양 조직내에서 활발히 분열하는 원발암 세포를 주된 표적으로 하여 시행되는 것으로 원발암에는 치료 효과가 있으나, 상대적으로 증식이 활발하지 않으며 항암저항성을 포함한 새로운 악성화 특성을 획득한 암 줄기세포는 효과적으로 제거하지 못함으로 인하여 혈중으로부터 표적 조직으로의 전이암 형성의 기회를 증가시키는 것으로 설명되고 있다.

최근 암 줄기세포 관련 연구 결과에 따르면, 분할 방사선 처리시 세포내의 여러 신호조절에 관여하는 효소인 단백질 키나제 C(Protein kinase C, PKC)-δ의 활성도가 급격이 증가하고, 활성화된 PKC-δ의 세포내 신호 조절을 통해 세포 표면의 CD133의 발현을 증가시키는 것으로 보고되고 있다. 상기 CD133은 뇌종양, 폐암, 췌장암, 간암, 전립선암, 대장암 등의 조직에서도 발현되는 대표적 암 줄기세포 표지 마커이다. 이전 연구들에서는 PKC-δ의 교종세포(glioma cell)의 세포사멸에 대한 연관성에 대하여 보고된바 있고(Peter M. Blumberg et al., Cancer Res 2001;61:4612-4619 참조), 암 줄기세포가 적응방사선 저항성을 획득하게 될 때 PKC-δ의 활성이 급격이 증가하고 이것이 암 줄기세포의 마커인 CD133의 발현 증대에 직접적인 영향을 주는 것이 보고되었다(Su-jae Lee, Journal of Cell Science 124, 30843094 참조). 이러한 연구 결과는 PKC-δ의 활성도 조절이 암 줄기세포의 조절 및 치료를 가능하게 하고, 활성화된 PKC-δ의 조기 발견을 통한 암 줄기세포의 조기 진단 및 이에 수반되는 암치료 효율을 높일 수 있음을 의미한다. 하지만, PKC-δ는 분할 방사선 처리시 암세포의 적응 방사선저항성의 획득의 주된 원인으로 주목받고 있지만, 아직 PKC-δ를 표지물질로 한 진단 방법이나 치료법에 관한 연구는 아직 미약한 상태이므로, 이와 관련된 실제적인 진단과 치료 목적으로서의 연구가 더 필요한 실정이다.

세포내에서 특정 단백질의 정확한 인지, 이와 동시에 영상화를 통한 이미징 기술과 항암물질들과의 혼합은 암의 조기 발견에 따른 치료 효율을 향상시키고 잠재성 있는 진단 방법들을 개발할 수 있는 기회를 제공한다. 암의 조기 진단 및 치료를 목적으로 한 탐침을 개발하기 위해 높은 친화성과 특이도를 갖고 암세포를 찾아내는 탐침을 발굴하여 이를 암 조기 진단에 사용하는 것이다. 종래 기술에 의하면, 특정한 진단 대상체를 진단하기 위한 가장 보편적인 방법은 PCR(Polymerase Chain Reaction)이 있다. 이 방법은 진단 대상체가 지니는 고유한 유전자를 분석한 후, 이를 시험관 내(in vitro) 증폭함으로써 소량의 진단 대상체를 분석하는 방법이다. 이 방법은 근래의 휴먼 게놈프로젝트 등을 통한 광범위한 유전자 정보 데이터베이스를 통해 그 적용 범위가 확장되고 있다. 또한, PCR법은 증폭하여 얻은 유전자를 대상으로 이들의 유전적 변이를 다양한 탐침을 이용해 확인하는 SSCP(Single-strand conformation polymorphism), RFLP(Restriction fragment length polymorphism) 및 AFLP(Amplified fragment length polymorphism) 방법들과 연계하여 유용한 정보를 제공하고 있다. 그러나 시료의 전처리 및 현장적응성에 대한 어려움 등의 문제점이 있어서 진단 시스템으로서는 한계가 있다.

이러한 측면에서 특정 단백질의 발현량 증가 및 변화를 판단하기 위한 방법으로 ELISA(Enzyme-Linked Immunsorption Assay)가 주로 이용되고 있다. 이는 특정 단백질을 인식하기 위해 이와 특이적으로 결합하는 항체를 진단 탐침으로 사용하는 것으로서, 혈액, 소변 등의 생체 검체로부터 진단 대상체를 효과적으로 분리하여 효소-항체 반응을 통해 검체내의 특정 단백질 존재 유무를 판단한다. 하지만 이 또한 나노몰 수준의(10^-9) 낮은 감도는 실제 진단 검체내의 저농도로 존재하는 표지 물질의 진단이 어려우며, PCR 진단법에 비하여도 낮은 민감도를 갖는다는 단점이 있다.

아울러, 약물 스크리닝(drug screening)은 많은 수의 잠재적인 항암제를 동시에 세포에 처리하여 단시간에 그 결과를 확인할 수 있다는 장점이 있지만 이러한 신약 후보물질들은 인공적인 화합물로써 가질 수 있는 인체내에서의 독성 문제와 항암제로써 사용될 시 암세포에 내성이 발생할 수 있다는 단점이 있다.

따라서, 극미량의 암 줄기세포를 진단할 수 있는 저분자 탐침의 개발은 암의 재발을 방지함과 동시에 암의 조기 진단을 통해 암 치료 효율을 높일 수 있을 것이다.

본 발명의 목적은 암 진단 마커인 PKC-δ를 검출할 수 있는 저분자 탐침 및 이를 이용한 암 진단 시스템을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 PKC-δ(Protein Kinase C-delta) 검출용 폴리펩티드를 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 폴리펩티드를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 폴리펩티드를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 폴리펩티드는 암 줄기세포의 분화과정에서 활성을 띄는 세포 내부 신호조절 단백질인 극미량의 PKC-δ를 특이적으로 인지하여 결합할 수 있으므로, 기존의 항원-항체 진단 시스템이 갖는 안정성 및 민감도의 한계를 극복한 초고감도의 펩티드 진단체로서 이용할 수 있으며, 극미량의 질병 표지물질 검출에 따른 질병의 조기 진단과 이를 통한 치료 효율 증대가능성을 제안하는 효과가 있다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 PKC-δ에 대한 발현 플라스미드를 대장균에 형질전환하고 0.5 mM IPTG로 유도한 세포에서 정제된 PKC-δ 단백질의 정제도를 SDS/PAGE를 통해 확인한 젤 사진이다(M: 분자량 마커, BI: 유도 전, AI: 유도 후, So1: 가용성 단백질, InS: 불용성 단백질, 1~7; PKC-δ 촉매도메인 단백질을 포함하는 분획).
도 2는 PKC-δ 촉매도메인 단백질과 결합하는 파지 펩티드를 스크리닝하기 위한 M13 파지 스크리닝의 계획도를 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명에서 확인한 2 종류의 폴리펩티드 발현 파지를 증폭한 뒤 농도를 측정하여 PKC-δ 촉매도메인 단백질과의 결합력을 분석한 그래프이다(펩티드 #1 및 펩티드 #2는 각각 서열번호 6 및 서열번호 7의 폴리펩티드).
도 4는 형광이 합성된 단일 폴리펩티드에 대한 PKC-δ 촉매도메인 단백질과의 결합력을 분석한 그래프이다.

이하, 본 발명에서 사용되는 용어를 설명한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "진단"이란 생물학적 시료 또는 조직 시료에서 본 발명의 PKC-δ 검출용 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 측정함으로써 상기 단백질의 발현과 관련된 질환의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. PKC-δ(Protein Kinase C-delta) 검출용 폴리펩티드

본 발명의 일 측면은 PKC-δ(Protein Kinase C-delta) 검출용 폴리펩티드를 제공한다.

상기 폴리펩티드는 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하고, 상기 폴리펩티드는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 것이 보다 바람직하며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 것이 가장 바람직하다. 그러나, 상기 폴리펩티드는 이에 한정되지 아니하고, 암 세포, 암 줄기세포 등의 세포에서 발현되는 PKC-δ, 특히 PKC-δ의 촉매도메인에 특이적으로 결합하는 활성을 갖는 범위 내에서, 상기 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 50% 이상, 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

상기 폴리펩티드는 천연으로부터 유래될 수도 있으며, 공지의 펩티드 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있다.

상기 PKC-δ는 인간 유래인 것이 바람직하고, PKC-δ는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 서열번호 3의 아미노산 중, 서열번호 4의 아미노산 서열에 해당하는 부분의 아미노산 서열은 상기 PKC-δ의 촉매도메인으로서, 상기 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 특이적으로 결합되는 부분이다. 즉, 상기 폴리펩티드는 상기 PKC-δ의 아미노산 서열 중에서 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 촉매도메인에 특이적으로 결합한다.

상기 폴리펩티드에는 검출체가 태깅(tagging)될 수 있다. 상기 검출체는 상기 폴리펩티드가 상기 PKC-δ에 특이적으로 결합하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위한 것으로, 발색효소(퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 등), 형광물질(FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots)), 크로모포어(chromophore) 및 방사성 동위원소(¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹¹¹In, ^99mTc, ³²P, ³⁵S 등)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있다. 상기 검출체가 본 발명의 폴리펩티드에 태깅되는 경우, 상기 검출체는 상기 폴리펩티드에서 표적에 대한 특이성 또는 선택성에 영향이 없도록 부착되는 것이 바람직하고, 이를 위하여 상기 펩티드에 링크(공유결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기와 같은 검출체의 태깅 위치는 당업자가 반복 실험을 통하여 용이하게 결정할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 암 줄기세포의 분화 과정에서 활성을 띄는 세포 내부 신호 조절 단백질인 PKC-δ를 효과적으로 인지하는 탐침으로서의 폴리펩티드를 발굴하기 위하여, PKC-δ 단백질에 결합하는 펩티드를 스크리닝함으로써 저분자 진단 펩티드를 선별하였다. 이때, 파지 디스플레이 기법에 의한 펩티드 라이브러리 스크리닝을 실시하였는데, 구체적으로 플레이트 웰에 PKC-δ 촉매도메인 단백질을 고정시키고, M13 파지 표면에 12개의 아미노산으로 구성된 펩티드들이 발현하는 파지 라이브러리를 첨가한 후, 극한 조건에서도 PKC-δ 촉매도메인 단백질 결합하는 파지 펩티드를 추출함으로써, PKC-δ 촉매도메인 단백질에 특이적으로 결합하는 파지 펩티드만을 최종적으로 선별하였다. 이를 하나의 라운드(round)로 하여, 라운드를 수회 반복하는 바이오 패닝(biopanning)을 실시함으로써 PKC-δ에 결합하는 폴리펩티드를 확보하였다(표 1 및 도 2 참조). 상기 바이오패닝시 3 라운드 이상 실시하는 것이 보다 강한 결합력을 갖는 파지 펩티드를 선별하는데 바람직하다. 상기와 같이 수득한 펩티드의 아미노산 서열을 분석한 결과, 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드인 것을 확인하였다(표 2 참조). 상기와 같은 방법으로 선별된 폴리펩티드는 PKC-δ 촉매도메인 단백질에 대해 우수한 결합력을 갖는 것으로 나타남으로써(도 3 참조), 본 발명의 폴리펩티드는 PKC-δ를 인지하는 신규한 탐침 물질로서 작용할 있음을 확인하였다. 또한, 상기 폴리펩티드에 검출체인 형광 물질을 붙여 합성한 경우에도 PKC-δ 촉매도메인 단백질에 효과적으로 결합하는 것을 확인함으로써, 검출체를 포함하는 폴리펩티드가 진단시 유용하게 이용할 수 있음을 확인하였다(도 4 참조). 따라서, 본 발명의 PKC-δ에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드는 PKC-δ 단백질을 검출하기 위한 저분자 진단 탐침으로써 유용하게 이용될 수 있다.

2. 암 진단용 조성물

본 발명의 다른 측면은 상기 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는, PKC-δ 검출용 폴리펩티드를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

상기 PKC-δ 검출용 폴리펩티드는 상기 PKC-δ를 특이적으로 검출하기 위한 것으로서, 상기 "1. PKC-δ(Protein Kinase C-delta) 검출용 폴리펩티드 " 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서, 상기 PKC-δ 검출용 폴리펩티드에 관해서는 상기 "1. PKC-δ(Protein Kinase C-delta) 검출용 폴리펩티드 " 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고, 이하에서는 상기 암 진단용 조성물에 특이적인 구성에 대해서만 설명하도록 한다.

상기 암은 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 세포사멸 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 일컫는다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내의 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 되는데, 이러한 상태를 암이라고 한다. 이러한 암의 종류로는 뇌종양, 폐암, 췌장암, 간암, 전립선암, 대장암, 유방암, 위암 및 직장암으로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있는데. 활성화된 PKC-δ의 세포내 신호조절을 통해 발현량이 증가하는 CD133이 상기 암들의 조직에서 과발현되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 세포내 PKC-δ가 과발현되는 것으로 검출되는 경우, 상기 세포가 유래한 개체는 암에 걸렸거나 걸릴 위험성이 높은 것으로 진단할 수 있다.

상기 조성물이 피검체에 투여되는 경우, 상기 조성물 내의 폴리펩티드는 암 줄기세포에서 발현되는 PKC-δ 촉매도메인 단백질에 특이적, 선택적으로 결합하게 되고, 상기 폴리펩티드에 태깅된 검출체에서 일어나는 반응을 통해 상기와 같이 표적에 결합된 폴리펩티드의 위치 또는 발현량을 측정할 수 있다. 상기 검출체는 발색효소(퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 등), 형광물질(FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots)), 크로모포어(chromophore) 및 방사성 동위원소(¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹¹¹In, ^99mTc, ³²P, ³⁵S 등)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있다. 즉, 피검체의 조직 또는 세포 내에서 상기 검출체의 반응이 많이 일어나면, 상기 피검체의 조직에는 PKC-δ가 과량으로 존재하는 것이고, 상기 피검체는 암에 걸린 것을 조기에 진단할 수 있는 것이다. 또한, 상기 조성물은 체내 투여됨으로써 상기 피검체에서 암 줄기세포 존부를 비침습적으로 확인할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 암 줄기세포에서 과발현되는 PKC-δ 촉매도메인 단백질에 결합하는 펩티드를 스크리닝하였고, 이와 같이 선별된 펩티드가 PKC-δ 촉매도메인 단백질에 특이적으로 결합할 수 있음을 확인한 바(도 3 및 도 4 참조), 본 발명의 PKC-δ 검출용 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 암의 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

3. 암 진단용 키트

본 발명의 또 다른 측면은 상기 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는, PKC-δ 검출용 폴리펩티드를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 암 진단용 키트에는 PKC-δ의 발현 수준을 측정하기 위한 폴리펩티드의 분석 방법에 적합한 하나 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물 또는 장치가 포함될 수 있다. 예를 들면, PKC-δ의 수준을 측정하는 암 진단 키트는 본 발명의 PKC-δ에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 이외에, 단백질 발현수준 측정을 위해 사용되는 공지된 방법을 이용한 키트를 제한 없이 사용할 수 있다.

상기 "단백질 발현수준 측정"이란 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 암 마커 유전자에서 발현되는 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로서, 상기 PKC-δ 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 검출체에 따른 검출 방법은 당업계에 널리 알려져 있으나, 예를 들어 다음과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 만약 검출체로 형광물질을 이용하는 경우에는 면역형광염색법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 형광물질로 표지된 본 발명의 폴리펩티드를 시료와 반응시키고 미결합 또는 비특이적인 결합 산물을 제거한 다음 형광현미경하에서 펩티드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 또한 검출체로 효소를 이용하는 경우에는 효소 반응을 통한 기질의 발색 반응에 의해 흡광도를 측정하고, 방사선 물질인 경우에는 방사선 방출량을 측정함으로써 수행할 수 있다.

본 발명의 키트는 이러한 분석 방법을 실시하기 위해 필요한 성분들을 추가로 포함할 수 있는데, 예를 들면, 서열번호 6 또는 서열번호 7로 기재되는 폴리펩티드가 코팅된 반응기 또는 각 반응단계에 사용할 세척액 등을 포함할 수 있다.

상기 키트는 상기 "2. 암 진단용 조성물 " 항목의 조성물과는 달리 피검체 내로 투여되기 위한 것이 아니라, 피검체로부터 유래된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 생물학적 시료를 이용하여 피검체의 암 세포 유무를 진단하기 위한 것이다. 따라서, 상기 생물학적 시료 내에 포함된 단백질을 검출하기 위한 것이고, 특히 본 발명의 상기 키트는 상기 생물학적 시료 내에 포함된 PKC-δ 촉매도메인 단백질을 검출하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 PKC-δ 촉매도메인 단백질에 결합하는 펩티드를 파지 디스플레이 기법으로 스크리닝하여 선별된 펩티드가 PKC-δ 촉매도메인 단백질에 특이적으로 결합할 수 있음을 확인한 바(도 3 및 도 4 참조), 본 발명의 PKC-δ 검출용 폴리펩티드를 포함하는 키트는 암의 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

PKC-δ 촉매도메인 단백질의 대량 생산 및 분리

서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 정방향 및 역방향 프라이머로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 서열번호 5의 염기서열을 갖는 PKC-δ 촉매도메인 유전자를 증폭하고, 이를 박테리아 발현벡터인 pET-28a(Novagen, 미국)에 삽입하였다. 상기와 같이 서열번호 5의 염기서열이 삽입된 발현벡터를 발현숙주인 대장균(E.coli) Rosetta 세포에 형질전환시킨 후, 0.5 mM IPTG, 37 ℃ 조건하에서 배양하여 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 PKC-δ 촉매도메인의 발현을 유도하였다. 그런 다음, 상기 대장균 세포를 원심분리하여 수득하고, 상기 대장균 세포 내 단백질의 용해도를 확인하여 대부분의 단백질이 불용성임을 확인하였다.

상기와 같은 세포 내 불용성 단백질만을 얻어낸 뒤 이를 변성(denature) 조건에서 단백질을 분리 및 정제하였다. 구체적으로, 불용성 단백질을 6M 구아니디움-HCl(Guanidium-HCl)의 변성 조건에서 용해시키고 Ni-세파로스 컬럼을 통과시켜 PKC-δ 촉매도메인 단백질을 결합시켰다. 그런 다음, 변성된 PKC-δ 촉매도메인을 리폴딩(refolding) 시키기 위하여 컬럼에 결합된 상태로 선형 구배(linear gradient)(유레아 농도를 점점 감소시킴)를 통하여 서서히 변성을 제거시켜가며 PKC-δ 촉매도메인을 리폴딩시키고 500 mM 이미다졸 선형 구배 하에서 용출하였다. 상기와 같이 수득한 단백질은 투석 버퍼(50 mM Tris, 2 mM β-메르캅토에탄올) 용액에서 투석하여 과량의 이미다졸을 제거하였다. 상기와 같은 과정을 통해 얻은 단백질의 정제도를 SDS/PAGE를 통하여 확인하였으며(도 1), 브래드포드(Bradford) 시약을 이용하여 양을 확인하였다.

그 결과 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 PKC-δ 촉매도메인을 0.5 ㎎/ℓ 농도로 수득하였다.

PKC-δ 촉매도메인에 결합하는 폴리펩티드의 선별 - 파지 디스플레이

상기 실시예 1에서 수득한 서열번호 4의 PKC-δ 촉매도메인 단백질과 펩티드 라이브러리 Ph.D^TM(phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB)))를 이용하여, 대한민국 공개특허공보 제10-2008-0083807호 및 제10-2012-0132455호에 개시된 바와 같은 파지 디스플레이 방법으로 상기 PKC-δ 촉매도메인 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 서열을 선별하였다. 보다 구체적으로는 도 2를 참조하여, 하기와 같다.

암 줄기세포 표지 마커인 PKC-δ 촉매도메인 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 스크리닝하기 위하여, 상기 실시예 1에서 수득한 서열번호 4의 PKC-δ 촉매도메인 단백질을 96웰의 폴리스티렌 플레이트(Qiagen, 미국)에 고정시킨 후, M13 파지 펩티드 라이브러리 Ph.D^TM(phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB)))를 첨가하여 상기 PKC-δ 촉매도메인 단백질과 임의의 폴리펩티드 간의 결합을 유도하였다. 이후, 하기 표 1과 같은 세척조건, 결합 시간 및 용출 조건을 반복시킴으로써 보다 강한 결합력을 갖는 파지를 선별하는 바이오 패닝(Bio-panning) 과정을 3회 반복하였다.

라운드	세척 조건	파지 펩티드 결합 시간	용출
1	50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20	60분	화학적 용출 (0.2 M 글리신 pH 2.2, 1 mg/㎖ BSA)
2	50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.3% Tween-20	40분
3	50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.5% Tween-20	20분	경쟁적 용출 (10 몰라 초과 PKC-δ

상기와 같이 얻어진 파지를 숙주세포인 대장균 ER2738 세포에 감염시키고 LB 배지에서 배양하여 증폭시킨 후, 45여 개의 파지 플라그를 선택하여 M13 파지 게놈성 DNA(단일 가닥화 원형 DNA)를 분리 정제하고, 각각의 유전자 염기서열을 확인하여 파지 표면 단백질(gp3 minor coat 단백질)에서 발현되어 PKC-δ 촉매도메인 단백질과 결합하는 폴리펩티드 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 밝혔다. 상기와 같이 규명된 염기서열을 바탕으로 상기 PKC-δ 촉매도메인 단백질과 결합하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 규명하였다.

그 결과, 하기 표 2에 기재된 바와 같이, 서열번호 4의 PKC-δ 촉매도메인 단백질과 결합하는 서열번호 6 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 두 개의 폴리펩티드가 확인되었다(표 2).

서열번호	펩티드 서열	빈출도 (%)
6	LMNPNNHPRTPR	89%
7	HMSPNGHPTTEP	11%

선별된 폴리펩티드와 PKC-δ 촉매도메인 단백질의 결합력 분석

상기 실시예 2에서 선별된 폴리펩티드의 결합력을 분석하기 위하여, 상기 서열번호 6 및 서열번호 7의 폴리펩티드가 발현된 파지를 각각 증폭한 뒤, 역가측정(titering)을 통하여 파지 용액의 농도를 결정하였다. 그런 다음, 서열번호 4의 PKC-δ 촉매도메인 단백질이 결합된 플레이트에 파지를 농도별로 넣어주어 결합한 파지의 양을 측정함으로써 해당 폴리펩티드의 결합력을 측정하였다.

구체적으로, 상기 서열번호 4의 PKC-δ 촉매도메인 단백질이 결합된 플레이트에 서열번호 6 및 서열번호 7의 폴리펩티드가 발현된 파지를 각각 농도별로 넣어 일정 시간 동안 결합 반응을 유도한 후 세척하였다. 그런 다음, 상기 파지 표면 단백질을 인식하는 항체를 넣어준 후, HRP(horse-radish peroxidase) 및 TMB 용액을 이용한 ELISA를 수행하고, 각각의 농도에 해당하는 ELISA 신호를 수집하여 해리 상수(K_D)를 분석함으로써, 상기 서열번호 4의 PKC-δ 촉매도메인 단백질에 대한 상기 서열번호 6 및 서열번호 7의 폴리펩티드의 결합력을 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 서열번호 6의 폴리펩티드 및 서열번호 7의 폴리펩티드는 K_D 값이 각각 28.16±2.96 ρM 및 59.4±8.6 ρM로 측정되어, 상기 실시예 2에서 수득된 2 종류의 폴리펩티드가 모두 피코몰 농도(ρM) 수준의 우수한 결합력을 가짐을 확인하였다(도 3).

단일 폴리펩티드와 PKC-δ 촉매도메인 단백질의 결합력 분석

상기 실시예 3에서 파지에 발현된 상태에서 서열번호 4의 PKC-δ 촉매도메인 단백질에 높은 결합력을 갖는 것으로 확인된 서열번호 6의 폴리펩티드 서열에 형광 물질(FITC; fluorescein isothiocyanate)을 붙여 하기와 같은 서열의 폴리펩티드를 합성하였다.

서열번호 6의 폴리펩티드-FITC : Ac-LMNPNNHPRTPRGCGK-FITC-NH₂

상기 서열번호 6의 폴리펩티드의 N-말단은 아세틸화시켜 아미노 말단의 반응성을 제거하였고, C-말단에는 FITC를 부착하기 위해 아미노산 라이신(Lysine, K)을 첨가하였다. 상기 서열번호 6의 폴리펩티드의 C-말단에는 GCG 서열이 추가적으로 첨가되었는데, 이는 '서열번호 6의 폴리펩티드-FITC'의 민감도를 극대화시키기 위한 것이다.

상기 서열번호 4의 PKC-δ 촉매도메인 단백질에 대한 상기 '서열번호 6의 폴리펩티드-FITC'의 결합력을 분석하기 위하여, 상기 '서열번호 6의 폴리펩티드-FITC' 폴리펩티드를 서열번호 4의 PKC-δ 촉매도메인 단백질이 고정된 플레이트에 농도별로 희석하여 넣어주었다. 그런 다음, 각 웰을 세척하고, 형광광도계로 상기 폴리펩티드에 연결된 FITC의 흡광도를 측정하여, 상기 서열번호 6의 폴리펩티드의 해리 상수(K_D)를 분석하였다.

그 결과, 서열번호 6의 폴리펩티드는 K_D 값이 74.9±16.1 nM로 측정되어, 상기 서열번호 6의 폴리펩티드가 상기 서열번호 4의 PKC-δ 촉매도메인 단백질에 대하여 나노몰 농도(nM) 수준의 높은 결합력을 가짐을 확인하였다(도 4).

FITC 표식된 펩티드의 실제 세포주와의 특이도 검증 실험

실시예 2를 통해 선별되고 실시예 3을 통해서 그 결합의 테스트를 마친 신규한 펩티드 서열은 실제 세포 내의 PKC-δ 촉매 도메인 단백질과의 결합력 및 특이도 검증을 위한 세포 면역염색화학법(Immunocytochemistry test, ICC test)을 통해 수행 하였다. 본 실시예에서 사용한 세포주는 글리오마(Glioma) 세포주인 U87 글리오마 세포주이다. 분할 방사선(Fractionated radiation)처리 전후 PKC 촉매 도메인 발현 양 비교를 위해 각각의 분할방사선 처리 전후 세포주에 같은 농도의 펩티드를 처리해주었다. 일정 시간 동안 성장한 세포주는 800 nM FITC-펩티드를 하루동안 처리한 후, PBS 완충용액을 통해 세척(washing)과정을 거쳤다. 이후 2% BSA 를 통해 비특이적반응을 막아주는(blocking) 처리를 해주었다. 최종적으로 형광현미경을 통한 결과 확인 시 세포구획구분에 이용하기 위하여, 4,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) 염색을 통해 세포내 핵 염색을 진행하였다.

FITC가 표식된 펩티드를 통해 녹색형광의 세기를 가시적으로 구분이 가능하며, 분할방사선 처리 전에 비하여 분할방사선 처리 후의 형광 세기가 강해진 것을 확인하였다(참조: 도 5의 (1)). 이는 단백질의 발현 정도에 따라 펩티드가 특이적 결합을 하고 있음을 의미한다.

또한, 특이도 검증을 위한 대조군 선정을 위해 실시예 2를 통해 선별된 펩티드가 아닌 임의의 가른 서열(scramble peptide)을 가진 펩티드를 통해 같은 조건에서 실험을 진행하였다. 도5의 (2)에 나타낸 바와 같이 임의의 서열을 가진 펩티드가 대상 단백질 혹은 다른 물질에 결합하지 않음을 알 수 있다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> Polypeptide for detecting PKC-delta and uses thereof <130> PN130257P <150> 12/0149138 <151> 2012-12-20 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for PKC-delta catalytic domain <400> 1 gaattctgga tgccgttc 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for PKC-delta catalytic domain <400> 2 ggattcatct tccaggag 18 <210> 3 <211> 676 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Pro Phe Leu Arg Ile Ala Phe Asn Ser Tyr Glu Leu Gly Ser 1 5 10 15 Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asn Gln Pro Phe Cys Ala Val Lys Met 20 25 30 Lys Glu Ala Leu Ser Thr Glu Arg Gly Lys Thr Leu Val Gln Lys Lys 35 40 45 Pro Thr Met Tyr Pro Glu Trp Lys Ser Thr Phe Asp Ala His Ile Tyr 50 55 60 Glu Gly Arg Val Ile Gln Ile Val Leu Met Arg Ala Ala Glu Glu Pro 65 70 75 80 Val Ser Glu Val Thr Val Gly Val Ser Val Leu Ala Glu Arg Cys Lys 85 90 95 Lys Asn Asn Gly Lys Ala Glu Phe Trp Leu Asp Leu Gln Pro Gln Ala 100 105 110 Lys Val Leu Met Ser Val Gln Tyr Phe Leu Glu Asp Val Asp Cys Lys 115 120 125 Gln Ser Met Arg Ser Glu Asp Glu Ala Lys Phe Pro Thr Met Asn Arg 130 135 140 Arg Gly Ala Ile Lys Gln Ala Lys Ile His Tyr Ile Lys Asn His Glu 145 150 155 160 Phe Ile Ala Thr Phe Phe Gly Gln Pro Thr Phe Cys Ser Val Cys Lys 165 170 175 Asp Phe Val Trp Gly Leu Asn Lys Gln Gly Tyr Lys Cys Arg Gln Cys 180 185 190 Asn Ala Ala Ile His Lys Lys Cys Ile Asp Lys Ile Ile Gly Arg Cys 195 200 205 Thr Gly Thr Ala Ala Asn Ser Arg Asp Thr Ile Phe Gln Lys Glu Arg 210 215 220 Phe Asn Ile Asp Met Pro His Arg Phe Lys Val His Asn Tyr Met Ser 225 230 235 240 Pro Thr Phe Cys Asp His Cys Gly Ser Leu Leu Trp Gly Leu Val Lys 245 250 255 Gln Gly Leu Lys Cys Glu Asp Cys Gly Met Asn Val His His Lys Cys 260 265 270 Arg Glu Lys Val Ala Asn Leu Cys Gly Ile Asn Gln Lys Leu Leu Ala 275 280 285 Glu Ala Leu Asn Gln Val Thr Gln Arg Ala Ser Arg Arg Ser Asp Ser 290 295 300 Ala Ser Ser Glu Pro Val Gly Ile Tyr Gln Gly Phe Glu Lys Lys Thr 305 310 315 320 Gly Val Ala Gly Glu Asp Met Gln Asp Asn Ser Gly Thr Tyr Gly Lys 325 330 335 Ile Trp Glu Gly Ser Ser Lys Cys Asn Ile Asn Asn Phe Ile Phe His 340 345 350 Lys Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys Val Leu Leu Gly Glu Leu 355 360 365 Lys Gly Arg Gly Glu Tyr Phe Ala Ile Lys Ala Leu Lys Lys Asp Val 370 375 380 Val Leu Ile Asp Asp Asp Val Glu Cys Thr Met Val Glu Lys Arg Val 385 390 395 400 Leu Thr Leu Ala Ala Glu Asn Pro Phe Leu Thr His Leu Ile Cys Thr 405 410 415 Phe Gln Thr Lys Asp His Leu Phe Phe Val Met Glu Phe Leu Asn Gly 420 425 430 Gly Asp Leu Met Tyr His Ile Gln Asp Lys Gly Arg Phe Glu Leu Tyr 435 440 445 Arg Ala Thr Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Met Cys Gly Leu Gln Phe Leu 450 455 460 His Ser Lys Gly Ile Ile Tyr Arg Asp Leu Lys Leu Asp Asn Val Leu 465 470 475 480 Leu Asp Arg Asp Gly His Ile Lys Ile Ala Asp Phe Gly Met Cys Lys 485 490 495 Glu Asn Ile Phe Gly Glu Ser Arg Ala Ser Thr Phe Cys Gly Thr Pro 500 505 510 Asp Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Leu Gln Gly Leu Lys Tyr Thr Phe Ser 515 520 525 Val Asp Trp Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Tyr Glu Met Leu Ile Gly 530 535 540 Gln Ser Pro Phe His Gly Asp Asp Glu Asp Glu Leu Phe Glu Ser Ile 545 550 555 560 Arg Val Asp Thr Pro His Tyr Pro Arg Trp Ile Thr Lys Glu Ser Lys 565 570 575 Asp Ile Leu Glu Lys Leu Phe Glu Arg Glu Pro Thr Lys Arg Leu Gly 580 585 590 Val Thr Gly Asn Ile Lys Ile His Pro Phe Phe Lys Thr Ile Asn Trp 595 600 605 Thr Leu Leu Glu Lys Arg Arg Leu Glu Pro Pro Phe Arg Pro Lys Val 610 615 620 Lys Ser Pro Arg Asp Tyr Ser Asn Phe Asp Gln Glu Phe Leu Asn Glu 625 630 635 640 Lys Ala Arg Leu Ser Tyr Ser Asp Lys Asn Leu Ile Asp Ser Met Asp 645 650 655 Gln Ser Ala Phe Ala Gly Phe Ser Phe Val Asn Pro Lys Phe Glu His 660 665 670 Leu Leu Glu Asp 675 <210> 4 <211> 344 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Thr Tyr Gly Lys Ile Trp Glu Gly Ser Ser Lys Cys Asn Ile Asn Asn 1 5 10 15 Phe Ile Phe His Lys Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys Val Leu 20 25 30 Leu Gly Glu Leu Lys Gly Arg Gly Glu Tyr Phe Ala Ile Lys Ala Leu 35 40 45 Lys Lys Asp Val Val Leu Ile Asp Asp Asp Val Glu Cys Thr Met Val 50 55 60 Glu Lys Arg Val Leu Thr Leu Ala Ala Glu Asn Pro Phe Leu Thr His 65 70 75 80 Leu Ile Cys Thr Phe Gln Thr Lys Asp His Leu Phe Phe Val Met Glu 85 90 95 Phe Leu Asn Gly Gly Asp Leu Met Tyr His Ile Gln Asp Lys Gly Arg 100 105 110 Phe Glu Leu Tyr Arg Ala Thr Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Met Cys Gly 115 120 125 Leu Gln Phe Leu His Ser Lys Gly Ile Ile Tyr Arg Asp Leu Lys Leu 130 135 140 Asp Asn Val Leu Leu Asp Arg Asp Gly His Ile Lys Ile Ala Asp Phe 145 150 155 160 Gly Met Cys Lys Glu Asn Ile Phe Gly Glu Ser Arg Ala Ser Thr Phe 165 170 175 Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Leu Gln Gly Leu Lys 180 185 190 Tyr Thr Phe Ser Val Asp Trp Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Tyr Glu 195 200 205 Met Leu Ile Gly Gln Ser Pro Phe His Gly Asp Asp Glu Asp Glu Leu 210 215 220 Phe Glu Ser Ile Arg Val Asp Thr Pro His Tyr Pro Arg Trp Ile Thr 225 230 235 240 Lys Glu Ser Lys Asp Ile Leu Glu Lys Leu Phe Glu Arg Glu Pro Thr 245 250 255 Lys Arg Leu Gly Val Thr Gly Asn Ile Lys Ile His Pro Phe Phe Lys 260 265 270 Thr Ile Asn Trp Thr Leu Leu Glu Lys Arg Arg Leu Glu Pro Pro Phe 275 280 285 Arg Pro Lys Val Lys Ser Pro Arg Asp Tyr Ser Asn Phe Asp Gln Glu 290 295 300 Phe Leu Asn Glu Lys Ala Arg Leu Ser Tyr Ser Asp Lys Asn Leu Ile 305 310 315 320 Asp Ser Met Asp Gln Ser Ala Phe Ala Gly Phe Ser Phe Val Asn Pro 325 330 335 Lys Phe Glu His Leu Leu Glu Asp 340 <210> 5 <211> 1031 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 acctacggca agatctggga gggcagcagc aagtgcaaca tcaacaactt catcttccac 60 aaggtcctgg gcaaaggcag cttcgggaag gtgctgcttg gagagctgaa gggcagagga 120 gagtactttg ccatcaaggc cctcaagaag gatgtggtcc tgatcgacga cgacgtggag 180 tgcaccatgg ttgagaagcg ggtctgacac ttgccgcaga gaatcccttt ctcacccacc 240 tcatctgcac cttccagacc aaggaccacc tgttctttgt gatggagttc ctcaacgggg 300 gggacctgat gtaccacatc caggacaaag gccgctttga actctaccgt gccacgtttt 360 atgccgctga gataatgtgt ggactgcagt ttctacacag caagggcatc atttacaggg 420 acctcaaact ggacaatgtg ctgttggacc gggatggcca catcaagatt gccgactttg 480 ggatgtgcaa agagaacata ttcggggaga gccgggccag caccttctgc ggcacccctg 540 actatatcgc ccctgagatc ctacagggcc tgaagtacac attctctgtg gactggtggt 600 ctttcggggt ccttctgtac gagatgctca ttggccagtc ccccttccat ggtgatgatg 660 aggatgaact cttcgagtcc atccgtgtgg acacgccaca ttatccccgc tggatcacca 720 aggagtccaa ggacatcctg gagaagctct ttgaaaggga accaaccaag aggctgggag 780 tgacgggaaa catcaaaatc caccccttct tcaagaccat aaactggact ctgctggaaa 840 agcggaggtt ggagccaccc ttcaggccca aagtgaagtc acccagagac tacagtaact 900 ttgaccagga gttcctgaac gagaaggcgc gcctctccta cagcgacaag aacctcatcg 960 actccatgga ccagtctgca ttcgctggct tctcctttgt gaaccccaaa ttcgagcacc 1020 tcctggaaga t 1031 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide #1 <400> 6 Leu Met Asn Pro Asn Asn His Pro Arg Thr Pro Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide #2 <400> 7 His Met Ser Pro Asn Gly His Pro Thr Thr Glu Pro 1 5 10

Claims (12)

1. 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진, PKC-δ(Protein Kinase C-delta) 검출용 폴리펩티드.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 PKC-δ 검출용 폴리펩티드.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 추가적으로 포함되는 발색효소, 형광물질 및 방사성 동위원소로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 검출체로 태깅(tagging)된 것을 특징으로 하는 PKC-δ 검출용 폴리펩티드.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 PKC-δ는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 PKC-δ 검출용 폴리펩티드.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 PKC-δ는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 PKC-δ 검출용 폴리펩티드.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 촉매도메인에 결합하는 것을 특징으로 하는 PKC-δ 검출용 폴리펩티드.
7. 제 1 항의 폴리펩티드를 포함하는 암 진단용 조성물.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것인 것을 특징으로 하는 암 진단용 조성물.
9. 제 7 항에 있어서, 상기 암은 뇌종양, 폐암, 췌장암, 간암, 전립선암, 대장암, 유방암, 위암 및 직장암으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 진단용 조성물.
10. 제 1 항의 폴리펩티드를 포함하는 암 진단용 키트.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것인 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트.
12. 제 10 항에 있어서, 상기 암은 뇌종양, 폐암, 췌장암, 간암, 전립선암, 대장암, 유방암, 위암 및 직장암으로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트.

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