KR101726212B1 - Cd133 검출용 다중 펩타이드 프로브 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경교종 줄기세포 마커 CD133의 검출을 위한 다중 펩타이드 프로브에 관한 것이다. 본 발명의 다중 펩타이드 프로브를 이용함으로써, 신경교종 줄기세포를 효과적으로 검출하는 것이 가능하다.

Description

CD133 검출용 다중 펩타이드 프로브{Multi Peptide Conjugated Probe for Detecting of CD133}

본 발명은 신경교종 줄기세포 마커인 CD133의 검출을 위한 다중 펩타이드 프로브에 관한 것이다.

최근 10년간 암의 진단과 치료에 있어 큰 기술적 진보가 있었지만, 암으로 인한 치사율을 아직도 높은 편이다. 현재 항암 치료에 있어 가장 큰 문제점은 항암치료에 저항성을 가진 암세포가 지속적으로 남아있어, 암의 재발이 나타나는 것이다.

이러한 암의 재발과 관련이 깊은 암 줄기세포(Cancer stem cell)는 자기 복제능력(self-renewal)과 다른 종류의 세포로 분화될 수 있는 능력(differentiation)을 동시에 가지는 종양 내 특정 세포군으로 정의된다. 암 줄기세포 이론에 따르면 암줄기세포가 새로운 암종괴를 형성 할 수 있기 때문에 암줄기세포가 아닌 종양세포들을 수술로 완전히 제거하고 항암화학치료를 시행해도 암줄기세포가 남아 있으면 암은 다시 재발하게 된다.

좀 더 구체적으로 인체를 구성하는 장기엔 각기 고유한 성체 줄기세포가 있다. 이 세포들은 장기가 손상을 받을 때 장기를 재생하고 유지하는데 필수적이다. 그런데 암 조직에도 일반 장기처럼 암 조직을 유지하는 구실을 하는 암 줄기세포가 존재하며, 이것이 암 치료 후 줄어든 암세포를 재생하는데 관여함으로써 암의 재발이나 전이에 깊은 영향을 미친다고 알려져 있다. 백혈병과 같은 혈액암은 물론이고 유방암이나 뇌암 등 고형암(Solid tumor)의 조직에도 암 줄기세포가 존재한다고 알려져 있다. 따라서 암 조직의 대부분을 차지하는 일반 암세포만 표적으로 이용해온 기존의 암 치료보다는 암 조직의 극히 일부만 차지하면서도 암의 발병과 유지, 재발에 핵심 구실을 하는 암 줄기세포를 표적으로한 암 치료에 주목할 필요가 있다.

이러한 암 줄기세포를 대상으로 한 진단 및 치료에 관한 연구로 대표적인 예를 살펴보면, C. H. Wang 등(Photothermolysis of glioblastoma stem-like cells targeted by carbon nanotubes conjugated with CD133 monoclonal antibody)이 개발한 탄소나노튜브를 기반으로한 CD133 인식/치료기술이 있다. CD133은 세포 외막에 존재하며, 세포가 성장해 나갈 때 발현이 유도되는 단백질로 잘 알려져 있는 CD(Cluster of Differentiation) 계열 단백질이다. CD133 은 악성 뇌종양인 신경교종에서 줄기세포와 유사한 특성을 가진 세포들이 존재한다고 밝혀진 후, 이것들의 표지마커로 가장 먼저 지목된 단백질이다. C. H. Wang 등은 자기 분화 기능이 있는 세포주인 GBM-CD133⁺을 이용하여 생쥐 조직 내에 해당 종양을 성장 시킨 후, 탄소나노튜브와 근적외선을 이용한 방열치료 시 종양의 제거 유무를 분석하였다. 결과적으로 항체를 통해 종양조직에 결합한 탄소나노튜브는 근적외선 노출 시 주위의 GBM-CD133+ 세포를 효과적으로 제거함을 보였다. 이것은 암 줄기세포 마커로써의 CD133 의 역할을 규명함과 동시에 표적 진단 시 효과적이 치료 또한 가능함을 보인 것이다. 하지만 이는 생쥐내의 GBM-CD133⁺를 충분히 성장시킨 후의 치료로써 극미량의 CD133을 인지하는 펩타이드를 통한 조기진단 수반 시 종양이 성장하기 전 조기진단과 동시에 치료효과를 보일 수 있음을 의미한다.

상술한 C. H. Wang 등의 성과 외에도 일반적인 접근법으로 항체를 이용한 진단법이 가장 널리 알려져 있으며, 항체-탄소나노튜브(CNT)를 이용한 진단/치료 시스템까지 다방면의 연구가 진행되었다. 하지만 암 줄기세포는 암 조직 내에 산재하고 있는 일반 암 세포 중에 극미량 으로 존재한다고 알려져 있다. 이런 극미량의 암줄기세포에 존재하는 CD133을 효과적으로 진단 할 수 있는 기술은 암세포 중 암줄기세포만을 선택적으로 표적화 할 수 있는 가능성을 제공한다. 또한 뇌 신경교종에서 유래한 줄기세포 특이표식인자 CD133 단백질 진단에 대한 연구는 암 줄기세포의 존재를 확인시켜 주면서 현재 항암 치료가 부딪힌 여러 가지 문제를 해결해줄 수 있는 실마리를 제공한다.

이러한 암 줄기세포에 대한 연구를 통해, 초기 항암치료의 부작용으로써 암세포로 분화할 수 있는 암 줄기세포를 조기에 탐지하여 효과적인 치료제의 개발이 가능하다. 또한 이것을 기반으로 암의 재발을 원천 방지할 수 있는 신개념의 치료제, 치료법의 개발이 가능함으로써 암 환자 질병의 진단, 예후, 예측 향상에 기여 할 수 있을 것이다.

종래의 목표물을 인지하는 탐침과 새롭고 다양한 영상화를 통한 이미지 기술 및 항암물질들의 혼합은 암의 조기 발견에 따른 치료를 향상시키고 잠재성 있는 진단 방법들을 개발할 수 있는 기회를 제공해왔다. 암의 조기 발견을 목적으로 한 탐침을 개발하기 위해 높은 친화성을 갖고 선별적으로 조기 암 세포에 붙은 탐침을 발굴하여 이를 암 조기 진단에 사용하는 것이다. 또한 유전자 분야에서도 많은 연구가 진행되어왔다. 유전자 분석결과를 토대로 암 유전자의 기능을 끊어버리거나 표현되지 못하도록 하는 유전자 변형 연구가 진행 중이다.

종래 기술에 의하면, 진단 대상체를 진단하기 위한 가장 보편적인 방법으로 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용하는 방법이 있다. 이 방법은 진단 대상체가 지니는 고유한 유전자를 분석한 후, 이를 시험관 내(in vitro) 증폭함으로써 소량의 진단 대상체를 분석하는 방법이다. 또한, 이 방법은 유전자가 지니는 고유한 염기서열을 이용하여 진단 대상체 만의 고유한 염기서열을 분석의 대상으로 하고, 또한 근래의 휴먼 게놈 프로젝트 등을 통한 광범위한 유전자 정보 데이터베이스 확보를 통하여 그 활용 범위를 확대할 수 있다. 또한 PCR 법은 증폭하여 얻은 유전자를 대상으로 이들의 유전적 변이를 다양한 탐침을 이용해 확인하는 SSCP(Single-strand conformation polymorphism), RFLP(Restriction fragment length polymorphism) 및 AFLP(Amplified fragment length polymorphism) 방법들과 연계하여 유용한 정보를 제공하고 있다.

암을 검사 및 조기 발견할 수 있는 암 표지마커는 종양의 초기 발생을 동정할 수 있는 항체에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 혈액은 가장 대표적인 체액으로 질병 발병과 진행과정에서 민감하게 그 성분이 변화하는 일종의 '생체 내 바로미터'와 같다. 혈장 단백체는 구성분이 약 50,000 개 이상으로 예측되는 데다, 각 단백질 성분의 농도 또한 매우 다양(1-10-12)하여, 검출한계가 약 10-6-10-9 정도인 항원-항체 반응으로는 저/중농도로 존재하는 바이오마커 단백질의 검출과 정량 분석이 매우 어렵다. 그러나, 높은 감도, 신속성 및 높은 물리 화학적 안정성, 민감도, 특이성, 응용성 등의 특성을 지닌 탐침 물질(diagnostic probe)은 아직까지 제시된 바 없다. 항체는 암에 대한 높은 특이성을 갖고 있기 때문에 암의 발견과 약물 전달을 위해 많은 연구가 진행되고 있으나, 생체 내에서 항체는 면역 반응성을 발생시키는 문제점이 발생하기 때문이다.

또한 위에 언급한 종래기술에서 PCR을 이용하는 진단 방법에는 진단 대상체 만이 지니는 고유한 염기서열을 소량으로 얻는 데에 있어서 높은 감도를 가지는 장점이 있지만, 시료의 전처리 및 현장적응성에 대한 어려움 등의 문제점이 있어서 진단 시스템으로서는 한계가 있다.

이러한 측면에서 근래의 ELISA(Enzyme-Linked Immunsorption Assay)방법은 질병으로 유발된 특정 단백질의 발현량 증가 및 변화를 판단한다. 이러한 특정 단백질의 인식을 위해서 이들 특정 단백질과 특이적 결합을 하는 항체를 진단 탐침으로 사용하여 혈액, 소변 등의 생체 검체로부터 진단 대상체를 분리하며, 이를 위하여 효소-항체 반응(ECL)을 이용한다. 그러나 나노몰(10^-9 M) 수준의 반응감도는 생체 내 단백질을 대상으로 할 수 있다는 장점에도 불구하고, PCR 진단법에 비하여 낮은 민감도를 가진다는 단점이 있다.

상기와 같은 단점을 극복할 수 있는 관련 연구의 일환으로 현재의 진단방법 PCR 및 ELISA 법 등을 기초로 나노기술(NT)이 접목된 표면 증강 라만 분광분석법(SERS) 및 바이오-바코드 기술이 개발되면서, 펨토몰(10^-15 M) 수준의 진단 대상체 분석이 실험적으로 가능함이 입증되었다. 상기 두 방법은 모두 라만 분광분석이 갖는 신호적 특성(좁은 라만 밴드; 습기, 산소 및 담금자에 대한 낮은 민감도; 및 낮은 광표백도)과 형광분석에 상응하는 높은 민감도를 통하여 금속 나노입자를 이용한 신호증폭을 이루어 펨토몰 수준의 진단 대상체 인식이 가능하게 되어, 혈액 등의 손쉬운 검체 시료를 이용한 암 진단(Prostate specific antigen, PSA)에 대한 접근법을 제안하였다. 그러나, 이러한 방법들은 바이오 마커(진단대상체)를 인식하는 항체를 이용한 시스템을 토대로 하는데, 이러한 방법들은 모두 항체의 물리, 화학적 구조에 의한 크기적 제한으로 인하여 결합수가 제한될 뿐만 아니라, 여러 가지의 화학적 반응 하에서 구조변성으로 인한 불안정성을 보인다는 중대한 단점이 있다.

그러므로 기존의 항체를 이용한 진단 시스템 기술과 차별화된 새로운 저분자 탐침의 개발을 요하는 실정이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 신경교종 줄기세포 특이적 마커인 CD133을 타겟팅하는 신규 프로브를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 소정의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 백본에 CD133에 특이적으로 결합하는 단일 펩타이드 프로브를 복수개 결합시키는 경우 단일 펩타이드 프로브에 비하여 민감성이 크게 증진된 다중 펩타이드 프로브를 제공할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 신경교종 줄기세포 특이적 마커로서의 CD133 타겟팅용 다중 펩타이드 프로브를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 다중 펩타이드 프로브를 포함하는 신경교종 줄기세포 검출 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 백본 및 (b) 상기 백본에 결합된 서열목록 제1 서열로 이루어진 복수의 단일 펩타이드 프로브를 포함하는, 신경교종 줄기세포 특이적 마커로서의 CD133 타겟팅용 다중 펩타이드 프로브를 제공한다:

일반식 1

HxGC(GK)yC;

상기 일반식 1에서 x는 2-5의 정수, y는 3-8의 정수이다.

본 발명의 서열목록 제1 서열로 이루어진 단일 펩타이드 프로브의 아미노산 서열은 M13 페이지 펩타이드 라이브러리(12개의 아미노산 서열을 가지도록 제작된 펩타이드 라이브러리-Ph.D^TM phage display peptide lirary kit, New England Biolabs(NEB), 약 2.7 × 10⁹ 개의 아미노산 서열을 지님)를 이용하여 신경교종 줄기세포 특이적 마커인 CD133에 결합하는 서열을 찾아낸 것이다. 본 발명의 "단일 펩타이드 프로브" 또는 "단일 펩타이드"는 저분자 펩타이드로서 그 크기가 작아서 3차원적으로 안정화되어 있고 점막을 쉽게 통과하며 조직 깊은 곳에서도 분자 목표물을 인지할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명에 따른 저분자 단일 펩타이드는 대량 생산이 항체에 비해 상대적으로 간단하고, 독성이 거의 없다. 이외에도 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다.

본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함되나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 Applied Biosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif,1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990. 본 발명의 펩타이드는 N-말단의 아미노 말단의 반응성 제거를 위한 공지된 변성이 가능하고, 예를 들어 아세틸화(Acetylation)가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 신경교종 줄기세포 특이적 마커인 CD133 표적용 다중 펩타이드 프로브 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 다중 펩타이드 프로브에 포함된 단일 펩타이드 프로브와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 포함하는데에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신 (+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).

펩타이드의 상호적인 생물학적 기능 (interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ㅁ 2 이내, 보다 바람직하게는 ㅁ 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ㅁ 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값 (hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 펩타이드를 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0ㅁ 1); 글루타메이트 (+3.0ㅁ 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ㅁ 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ㅁ 2 이내, 보다 바람직하게는 ㅁ 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ㅁ 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 신경교종 줄기세포 특이적 마커인 CD133 표적용 다중 펩타이드 프로브에 포함된 단일 펩타이드는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 단일 펩타이드 프로브 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

상술한 본발명의 "단일 펩타이드 프로브"는 본 발명의 "폴리펩타이드 백본"에 결합된 형태로 제공된다. 본 발명의 "폴리펩타이드 백본"은 상술한 일반식 1로 나타내어지는 서열에 해당한다. 상기 일반식 1의 서열에 있어서, "Hx(x는 2-5의 정수)" 부분은 컬럼 상에 상기 백본을 부착하여 고정시키기 위한 서열에 해당하고, 구체적으로 예를 들면 Ni 컬럼 이용시 상기 백본을 효과적으로 고정시킬 수 있다. 상기 "H"는 히스티딘을 나타내고, 상기 Hx는 히스티딘이 연속적으로 2개 내지 5개 결합되어 있는 것을 나타낸다. 상기 일반식에 포함된 2개의 "C"는 시스테인으로서 측쇄의 -SH 잔기 간의 이황화 결합을 통해 고리형 구조를 형성하는 역할을 한다. 상기 "K"는 라이신(lysine)을 나타내고 측쇄의 아미노기를 이용하여 단일 펩타이드 프로브를 결합시키는 역할을 하고, 상기 "G"는 글라이신을 나타내고, 상기 라이신에 단일 펩타이드 프로브가 결합될 때 입체적 장애를 최소화하기 위하여 사용되었다. 이에 대하여 이하 더욱 구체적으로 설명한다.

상기 일반식 1에 있어서 y는 3-8의 정수이고, y의 값에 따라 폴리펩타이드 백본에 포함되는 라이신의 수가 정해지고, 이로써 최대로 결합될 수 있는 단일 펩타이드 프로브의 개수가 정해지게 된다. 본 발명의 폴리펩타이드 백본에 포함되는 라이신의 수는 y값에 따라 3개 내지 8개이고, 바람직하게는 4개 내지 6개인 것을 이용할 수 있다.

본 발명의 용어 "다중 펩타이드 프로브"는 상술한 단일 펩타이드 프로브가 2개 이상 결합되어 있는 복합체를 나타내기 위하여 정의된 용어이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 폴리펩타이드 백본은 백본 내에 포함된 두개의 시스테인 간의 이황화 결합을 통해 환형 구조를 형성한다. 본 발명자들은 2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성되지 않은 선형 펩타이드 구조에 비해 환형 구조를 형성하는 경우 폴리펩타이드 백본에 결합되는 단일 펩타이드 프로브의 타겟에 대한 결합력을 더욱 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열은 서열목록 제1서열로 이루어진 것이다. 서열목록 제1서열은 HHHHGCGKGKGKGKGKC(N-말단에서 C-말단 순으로 표기)로 표시된다.

본 발명의 다중 펩타이드 프로브가 신경교종 줄기세포에 결합하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위하여, 본 발명의 다중 펩타이드 프로브에 포함되는 단일 펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 링크는 본 발명의 단일 펩타이드와 검출가능한 표지 사이에 직접 형성되는 것도 가능하지만, 링커를 통해서도 형성 가능하다. 상기 링커는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용 가능하며, 적합한 펩타이드 링커의 서열은 다음과 같은 요소를 고려하여 선택될 수 있다: (a) 유연한 연장된 컨포메이션에 적용될 수 있는 능력; (b) 에피토프와 상호작용 하는 이차구조를 생성하지 않는 능력; 및 (c) 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 잔기 또는 전하를 갖는 잔기의 부재.

상기 검출 가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)), 방사성 동위원소(예:124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P,35S), 크로모포어(chromophore), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots))등 일 수 있다.

유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다.

만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 형광단층촬영(Fluorescence mediated tomography:FMT)으로 신경교종 줄기세포를 검출할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 혈액 내로 투여하게되면 형광단층촬영으로 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 형광이 관찰된다면, 신경교종으로 진단된다.

본 발명인 펩타이드의 타겟인 "CD133"은 세포 외막에 존재하며, 세포가 성장해 나갈 때 발현이 유도되는 단백질로 알려져 있는 CD(Cluster of Differentiation) 계열 단백질이다. 악성 뇌종양인 신경교종의 암 줄기세포의 표지마커로 알려져 있다.

한편, 뇌종양은 가장 높은 치사율을 보이는 암 중 하나이며, 조직학적 특성과 특정 표시 인자 등을 통해 4단계로 나뉜다. 가장 악성인 다형교모세포종(glioblastoma multiforme)의 경우 가장 빈번하게 나타나는 악성 뇌종양으로 방사선 및 항암치료에 저항성을 보여, 치료를 병행하여도 평균 생존 기간이 14.6달에 불과하다. 최근 신경 교종(glioma) 내에 줄기세포와 유사한 특성을 지니는 세포들이 소수 존재하고 있다고 보고되었다(Identification of a cancer stem cell in human brain tumors, (2003), CANCER RESEARCH 63, 5821-5828,).

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 폴리펩타이드 백본은 백본 내에 포함된 두개의 시스테인 간의 이황화 결합을 통해 환형 구조를 형성한다. 본 발명자들은 환형 구조의 폴리펩타이드 백본에 단일 펩타이드 프로브들을 결합시키는 경우, 사슬형 폴리펩타이드 백본에 결합시킨 경우에 비해 민감도가 더욱 증가한다는 것을 밝혔다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 일반식 1에서 y는 5이다. y가 5인 경우의 폴리펩타이드 백본은 특히 펜타 유닛(penta unit, PU) 백본이라고 기재할 수 있다. 펜타 유닛 백본에 2-5개, 바람직하게는 4-5개, 가장 바람직하게는 5개의 단일 펩타이드 프로브가 결합된 다중 펩타이드 프로브를 특히 PUCP(penta unit conjugated probe)라고 기재할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열은 서열목록 제2 서열로 이루어진 것이다. 서열목록 제2 서열은 본 명세서 상의 일반식 1에 있어서, x는 4, y는 5인 아미노산 서열을 나타낸다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 다중 펩타이드 프로브는 상기 폴리펩타이드 백본의 라이신의 측쇄에 포함된 아민기와 아마이드 결합을 형성하는 제1 기능기 및 상기 단일 펩타이드 프로브와 결합을 형성하는 제2 기능기를 포함하는 양기능성 링커를 추가적으로 더 포함한다. 본 명세서 상의 용어 "제1 기능기"는 상술한 바와 같이 아민기와 아마이드 결합을 형성할 수 있는 기능기를 의미하고, 종래 공지된 기능기라면 특별히 제한되지 않는다. 본 명세서 상의 용어 "제2 기능기"는 본 발명의 단일 펩타이드 프로브와 결합을 형성할 수 있는 기능기로서 단일 펩타이드 프로브 서열에 따라 이황화 결합 또는 아마이드 결합을 형성할 수 있는 기능기를 의미한다.

본 발명에서 이용되는 "양기능성 링커"는 본 발명의 폴리펩타이드 백본 및 단일 펩타이드 프로브와 결합을 형성할 수 있는 각각의 기능기를 모두 포함하는 링커를 의미하고, 당업계에서 단백질 또는 펩타이드 사이의 결합을 위한 링커로 이용되는 어떠한 화합물도 가능하며, 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로 예를 들면, 본 발명의 링커는 N-숙시니미딜 요오도아세테이드(N-succinimidyl iodoacetate), N-히드록시숙시니미딜 브로모아세테이트(N-Hydroxysuccinimidyl Bromoacetate), m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), m-말레이미도벤조일-N-히드록시설포숙신이미드 에스테르(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester), N-말레이미도부티릴옥시숙신아미드 에스테르(N-Maleimidobutyryloxysuccinamide ester), N-말레이미도부티릴옥시설포숙신아미드 에스테르(N-Maleimidobutyryloxysulfosuccinamide ester), E-말레이미도카프로산 히드라지드ㆍHCl (E-Maleimidocaproic acid hydrazideㆍHCl), [N-말레이디도카프로일옥시-숙신아미드] ([N-(E-maleimidocaproyloxy)-succinamide]), [N-말레이미도카프로일옥시)-설포숙신아미드]([N-(E-maleimidocaproyloxy)-sulfosuccinamide]), 말레이미도프로피온산 N-히드록시숙신이미드 에스테르(Maleimidopropionic Acid N-Hydroxysuccinimide Ester), 말레이미도프로피온산 N-히드록시설포숙신이미드 에스테르 (Maleimidopropionic Acid N-Hydroxysulfosuccinimide Ester), 말레이미도프로피온산 히드라지드ㆍHCl (Maleimidopropionic Acid HydrazideㆍHCl), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate), N-숙시니미딜-4-(요오도아세틸)아미노벤조에이트 (N-Succinimidyl-(4-iodoacetyl) aminobenzoate), 숙시니미딜-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (Succinimidyl-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylate), 숙시니미딜-4-(말레이미도페닐)부틸레이트(Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate), 설포숙시니미딜-(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트 (Sulfosuccinimidyl-(4-iodoacetyl)aminobenzoate), 설포숙시니미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), 설포숙시니미딜-4-(p-말레이미도페닐)부틸레이트 (Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate), m-말레이미도벤조산 히드라지드ㆍHCl (m-Maleimidobenzoic acid hydrazideㆍHCl), 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실산 히드라지드ㆍHCl (4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylic acid hydrazideㆍHCl), 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 히드라지드ㆍHCl (4-(4-N-maleimidophenyl)butyric acid hydrazideㆍHCl), N-숙시니미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate), 비스(설포숙시니미딜)수베레이트(Bis(sulfosuccinimidyl)suberate), 1,2-디[3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미도] 부탄(1,2-Di[3'-(2'pyridyldithio)propionamido] Butane), 디숙시니디밀 수베레이트(Dissuccinimidyl Suberate), 디숙시니미딜 타르타레이트(Dissuccinimidyl Tartarate), 디설포숙시니미딜 타르타레이트 (Disulfosuccinimdiyl Tartarate), 디티오-비스-(숙시니미딜 프로피오네이트) (Dithio-bis-(succinimidyl propionate)), 3,3'-디티오-비스-(설포숙시니미딜-프로피오네이트)(3,3'-Dithio-bis-(sulfosuccinimidyl-propionate)), 에틸렌 글리콜 비스(숙시니미딜숙시네이트 (Ethylene Glycol bis(Succinimidylsuccinate)) 및 에틸렌 글리콜 비스(설포숙시니미딜숙시네이트)(Ethylene Glycol bis(Sulfosuccinimidylsuccinate))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 단일 펩타이드 프로브와 본 발명의 링커의 제2 기능기 사이의 결합은 이황화 결합 또는 아마이드 결합이다. 본 발명의 단일 펩타이드 프로브와 본 발명의 링커의 제2 기능기 사이의 결합이 이황화 결합인 경우, 본 발명의 단일 펩타이드 프로브는 "타겟과의 결합을 위한 펩타이드 서열 부위"의 일 말단에 이황화 결합을 위한 아미노산인 시스테인(Cys)을 포함하는 "링커 결합 올리고펩타이드 부위"를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 링커 결합 올리고펩타이드 부위의 아미노산 서열은 시스테인을 포함하기만 한다면, 특별히 제한되지는 않으며, 다음과 같은 요소를 고려하여 선택될 수 있다: (a) 유연한 연장된 컨포메이션에 적용될 수 있는 능력; (b) 에피토프와 상호작용 하는 이차구조를 생성하지 않는 능력; 및 (c) 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 잔기 또는 전하를 갖는 잔기의 부재. 바람직하게는 시스테인 외에 글리신(Gly), 아스파라진(Asn) 또는/및 세린(Ser) 잔기를 포함할 수 있다. Thr 및 Ala과 같은 다른 중성 아미노산들도 "링커 결합 올리고펩타이드 부위" 서열에 포함될 수 있다. 상술한 링커 결합 올리고펩타이드 부위에 적합한 아미노산 서열은 1-50 아미노산 잔기로 구성될 수 있으며, Maratea et al., Gene 40:39-46( 1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 83:8258-8562(1986); 미국 특허 제4,935,233호, 제4,751,180호 및 제5,990,275호에 개시되어 있다. 구체적으로 예를 들면, 본 발명의 일 실시예에서 이용한 -GCG와 같은 아미노산 서열을 이용할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 다중 펩타이드 프로브를 포함하는 신경교종 줄기세포 검출 키트를 제공한다. 본 발명인 신경교종 줄기세포 검출 키트는 상술한 본 발명의 다른 일 양태인 다중 펩타이드 프로브를 이용하는 바 중복되는 내용에 대하여는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 신경교종 줄기세포 특이적 마커로서의 CD133 타겟팅용 다중 펩타이드 프로브를 제공한다.

(b) 본 발명은 상술한 다중 펩타이드 프로브를 포함하는 신경교종 줄기세포 검출 키트를 제공한다.

(C) 본 발명의 다중 펩타이드 프로브를 이용하면 효과적으로 신경교종 줄기세포를 검출할 수 있다.

도 1은 뇌 신경교종 줄기세포 표지마커 CD133 ECD 의 유전자 클로닝 결과를 나타낸다. 도 1의 (a)에서 P는 CD133 ECD gene을 나타내고, 도 1의 (b)에서 P1과 P2는 발현벡터 pET-28a 에 CD133 유전자 삽입 하여 이를 확인하기 위해 제한효소를 처리하기 전(P1)과 처리 후(P2)를 나타낸다. CD133 ECD를 코딩하는 유전자 873bp 가 발현벡터에 올바르게 삽입되어 있음을 확인하였다. 도 1의 M은 분자량 마커를 나타낸다.
도 2는 뇌 신경교종 줄기세포 표지마커 CD133 ECD의 단백질 발현 능력 및 단백질 정제를 나타낸다. 도 2의 (a)에서 B.I(before induction)는 IPTG를 넣기 전, O/N(overnight incubation)은 18℃에서 과발현 시킨 상태의 단백질을 나타낸다. 도 2의 (a)를 통해 발현된 단백질의 수용성(Sol, soluble form protein)과 불용성(InS, insoluble form of protein)의 비율을 알 수 있다. CD133 단백질이 불용성 형태로 발현되는 것을 확인 하였다. 도 2의 (b)는 불용성 단백질 형태로 발현된 CD133를 정제 해내기 위해 변성 조건(denature condition) 정제법을 수행하여, 친화성 크로마토그래피를 통해 CD133 단백질을 선별한 것을 나타낸다. F3-F11은 친화성 크로마토그래피를 통해 모아진 단백질을 나타낸다.
도 3은 CD133 단백질과 결합하는 페이지 펩타이드를 스크리닝하기 위한 M13 페이지 스크리닝의 계획도를 나타낸다. 플레이트의 각 웰에 CD133 을 고정시키고(도 3의 (1)), M13 페이지 표면에 12개의 아미노산으로 구성된 펩타이드들이 발현된 페이지 라이브러리를 첨가한 후(도 3의 (2)), 이에 다양한 세척 조건과 결합 시간을 적용시키면 CD133 단백질에 극한 조건에서도 결합하는 페이지 펩타이드가 웰 에 남는다(도 3의 (3)). 마지막으로 이를 추출해 내면 CD133 단백질에 특이적으로 결합하는 페이지 펩타이드만이 최종적으로 확보 된다(도 3의 (4)). 도 3에서 (1)-(4)까지를 한 라운드(round)라고 보고, 상기와 같은 과정을 반복하는 것을 바이오 패닝(biopanning)이라 칭한다. 본 발명자들은 3 라운드의 바이오 패닝을 실시하였다.
도 4는 CD133 촉매도메인 단백질에 대하여 높은 특이성 및 결합력을 페이지 펩타이드를 검출하기 위한 각 라운드(round)의 바이오 패닝 조건을 나타낸다. 각 라운드 당 NaCl과 Tween-20의 비율을 높여주는 반면 페이지 펩타이드 결합시간은 짧게 하여 극한 조건에서도 CD133 단백질에 결합하는 페이지 펩타이드를 검출해 내었다.
도 5는 CD133 단백질에 결합하는 총 35개의 페이지 플라그를 확보한 결과를 나타낸다. 35개의 페이지 플라그는 4종류의 서로 다른 서열의 펩타이드로 분류되었다.
도 6은 CD133 단백질에 결합하는 총 35개의 페이지 플라그 확보: 35개의 페이지 플라그는 4종류의 서로 다른 서열의 펩타이드로 분류되었다. 네 개의 펩타이드 모두 피코몰 수준으로 CD133 단백질에 효과적으로 결합하는 것을 확인하였다.
도 7은 CD133 단백질에 결합하는 페이지 중, 이차적으로 선별된 펩타이드 서열을 형광 프로브와 합성하였으며, CD133 단백질과 결합력 측정을 수행한 결과를 나타낸다. CD133-GCGK-FITC는 대상물질과 나노몰(nM) 수준의 강한 결합을 이루는 것을 확인하였다.
도 8은 CD133 검출을 위한 다중 펩타이드 프로브 합성의 모식도를 나타낸다. 도 8의 (a)는 양기능성 링커인 SPDP의 석신이미딜 그룹의 반응성을 이용해 피리딜디티올 그룹이 활성화된 PUCP를 나타낸다. 도 8의 (b)는 피리미딜 그룹의 활성도를 이용한 시스테인 아미노산 잔기의 -SH와의 반응 및 최종 합성된 CD133 검출을 위한 다중 펩타이드 프로브의 일례인 PUCP 구조의 모식도를 나타낸다. 도 8의 (c)는 합성된 PUCP의 서열 모식도, 푸른색의 시스테인 잔기는 c-말단의 시스테인과 이황화 결합을 이루어 환형(cyclic) 형태의 PUCP를 구성하며, Peptide* 는 CD133 에 특이적으로 결합하는 단일 펩타이드 프로브로서 다중 펩타이드 프로브가 타겟물질에 결합하는데 기능을 하는 부분이다.
도 9는 CD133과 결합하는 단일 펩타이드 및 PUCP의 결합력을 비교 분석한 결과를 나타낸다. 도 9의 (a)는 단일 펩타이드에 대한 CD133 단백질과의 결합력을 나타내고, (b)는 PUCP에 대한 CD133 단백질과의 결합력을 나타내며, (c)는 PDPP에 대한 CD133 단백질과의 결합력을 나타내고, (d)는 각 프로브와 CD133 단백질간의 결합력을 비교한 표를 나타낸다.
도 10은 세포 면역염색법을 이용한 단일 펩타이드, PUCP, PDPP의 CD133발현 세포주와의 결합 효율 분석 결과를 나타낸다. (a) U87 뇌신경교종 세포내 CD133 단백질을 이용한 세포면역화학법을 통하여 각 프로브(200 nM)에 대한 결합을 확인하였다. 단일 펩타이드와 PUCP가 유사한 형광 신호를 가지며 결합하는 것을 확인하였다. 또한 각각의 프로브가 항체가 보유한 형광 시그널과 유사 시그널을 보임으로써 PUCP 및 펩타이드의 진단프로브로써 유용성을 검증하였다. (b) 같은 농도의 각 프로브(IgG-FITC, sc-펩타이드, 항체, 단일 펩타이드, PDPP, PUCP)를 타겟 세포에 처리하여 형광 신호를 측정하여 신호 분석을 진행하였다. PUCP는 Poly-D-lysine의 고분자로 형성된 PDPP와 대비하여 약한 신호를 방출하였지만, 다른 프로브 대비 강한 형광 신호를 방출하는 것을 확인하였다.
도 11은 세포 독성 비교를 통한 PUCP의 세포 안정성 분석 결과를 나타낸다. 도 11의 (a)는 CD133 에 결합하는 펩타이드의 세포 안정성 분석을 통해 농도에 관계없이 RAW 264.7 세포에 대한 안정성을 보여주는 결과를 나타낸다. (b)는 CD133 에 결합하는 PDPP의 세포 안정성 분석을 통해 적은 농도에도 RAW 264.7 세포에 대한 독성을 나타냄을 보여준다.
(b-1)은 PDL-SPDP는 PDPP가 합성되기 전의 전구체로써 낮은농도에서부터 세포 독성을 보이며, PDL 자체에 대한 세포 독성 효과 역시 RAW 264.7 세포에 대한 독성을 나타내는 것을 확인한 결과이다. (c)는 CD133 에 결합하는 PUCP 의 세포 안정성 분석을 통해 농도에 관계없이 RAW 264.7 세포에 대한 안정성을 보여줌을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: CD133 세포 외부 도메인(ECD) 유전자 클로닝

우선 CD133 단백질을 E.coli 상에서 발현시키고 대량생산 및 분리를 위하여 CD133 유전자를 다음과 같이 PCR을 통하여 증폭하였다: CD133 센스 프라이머는 5'- ATAT GGATCC(BamH1) ATGGCTCTTGTCTTCAGTGCCCTGCTGTTACT-3' 를, CD133 안티센스 프라이머는 5'-ATAT GCGGCC(Not1) GCTCAGTATCGAGACGGGTCGTCGTATACATCCTCTGA-3' 를 사용하였다. 상기 합성 프라이머 및 주형(template) DNA를 포함하는 5 % DMSO가 함유된 반응 용액에서, 전변성(pre-denaturation) 95℃ 1분, 변성(denaturation) 94℃ 30초, 어닐링(annealing) 70℃ 45초, 신장(extension) 72℃ 2분 45초를 1 사이클로 하여, 20 사이클의 PCR 반응 후 얻은 주형 DNA를 유전자 염기서열을 통해 확인하였다(참조: 도1). 이 증폭된 유전자를 각각의 제한효소로 (BamH1, Not1) 잘라 박테리아 발현벡터인 pET-28a(+)에 삽입하여 제조사의 매뉴얼에 따라 클로닝한 뒤 이 발현 벡터를 발현숙주인 단백질 발현용 대장균 BL21(DE3)에 형질 전환시킨 뒤, 0.5 mM IPTG, 18℃ 조건하에서 12시간 동안 CD133 단백질의 생산을 유도하였다. 상기 형질전환 방법을 간략하게 기재하면 다음과 같다: 우선 DNA 5 ㎕를 경쟁세포(competent cell) 100 ㎕에 넣고 잘 섞어 준 뒤 얼음에 30분간 놓아 두었다. 그 다음엔 42℃에서 90초간 열 충격을 가하였다. 오염을 방지하기 위해서, 우선 알콜 램프를 켜놓은 뒤에, LB 배지 800 ㎕을 넣고 37℃에서 45분간 인큐베이션 시켰다. 마지막으로 LBA 플레이트에 도포시켜주고, 37℃ 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션 하였다.

실시예 2: CD133 세포 외부 도메인(ECD) 대량 생산 및 분리법

CD133 유전자를 PCR을 통하여 증폭하여 이를 박테리아 발현벡터인 pET-28a에 삽입한 뒤 이렇게 클로닝한 CD133 발현 플라스미드를 발현숙주인 BL21(DE3)에 형질전환 시켜 0.5 mM IPTG, 18℃ 조건하에서 CD133 생산을 유도하였다. 그리고 박테리아 세포를 원심분리를 통하여 수획하여 단백질의 용해도를 조사하여 본 결과 대부분의 단백질이 불용성(insoluble)임을 확인할 수 있었다(참조: 도 2). 따라서 이렇게 불용성인 단백질을 획득하기 위해 변성(Denature) 조건에서 단백질을 분리 및 정제 하였다.

박테리아 세포를 원심분리를 통하여 획득하여 단백질의 용해도를 조사하여 본 결과 대부분의 단백질이 불용성(insoluble)임을 확인 할 수 있었다. 따라서 CD133 분리정제를 위하여 세포 내 불용성 단백질만을 얻어낸 뒤 이를 변성 조건 (6M 구아니듐-HCl)에서 용해시킨 뒤 Ni-세파로오스 컬럼을 통과시켜 CD133 단백질을 결합시킨 뒤에 변성(denature) 된 CD133 을 리폴딩(refolding) 시키기 위하여 컬럼에 결합된 상태로 선형 구배(linear gradient)(요소(Urea)의 농도를 감소시키는)를 통하여 서서히 변성(denature)을 제거 시켜가며 CD133 을 리폴딩(refolding) 시키고 500 mM 이미다졸 선형 구배 하에서 일루션한다. 얻어낸 단백질은 다이알리시스 버퍼(50 mM Tris, 2 mM β-머캅토에탄올, pH 7.4) 용액에서 투석하여 과량의 이미다졸을 제거 하였고, 이를 통해 얻은 단백질을 정제도를 SDS/PAGE를 통하여 확인하였으며(참조: 도 2) 브래드포드 시약을 이용하여 양을 확인한 결과 0.6 mg/L 배양물을 얻을 수 있었다.

실시예 3: M13 파지 펩타이드 라이브러리 스크리닝 - 파지 디스플레이

파지 디스플레이는 상기 실시예 1에서 얻은 단백질을 96-웰 플레이트에 고정시키는 단계에서부터 시작된다. 여기서 사용된 96-웰 플레이트는 표면에 폴리스티렌(polystyrene) 재질로 되어 있는 폴리스티렌 플레이트(SPR)를 사용하였는데 이것은 단백질과 플레이트 표면사이의 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)을 이용하여 단백질을 안정적으로 고정시킴으로써 파지디스플레이의 효율을 높이는 역할을 한다. 이렇게 고정된 단백질에 랜덤 펩타이드 라이브러리(12개의 아미노산으로 구성된 무작위 배열을 통하여 27 억개의 다양한 아미노산 서열을 가지도록 제작된 펩타이드 라이브러리-Ph.D^TM(phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB)를 구입하여 사용함)를 넣어줌으로써 단백질과 펩타이드의 상호작용을 유도하여 단백질과 좋은 결합력을 가지는 특정 펩타이드 만을 선별 해 낼 수 있도록 파지 디스플레이 방법을 디자인 하였다. 상기 방법을 도 3에 나타내었다.

구체적으로, 도 3에서는 CD133 단백질과 결합하는 펩타이드를 스크리닝 하기 위하여, CD133 단백질을 플레이트(SPL) 표면에 고정 시킨 후, M13 파지 펩타이드 라이브러리(약 27억 개의 서로 다른 아미노산 서열을 지닌 12개 아미노산으로 구성된 펩타이드가 M13 파지 gp3 minor coat 단백질에 융합된 라이브러리)를 넣어 결합을 유도하였다. 이후, 다양한 결합 시간 및 세척조건을 통하여 높은 친화력으로 결합하는 펩타이드 발현 파지를 선별하였다. 이와 관련한 스크리닝 계획 및 반응조건들을 각각 도 3 및 도 4(스크리닝 컨디션) 에 나타내었다. 구체적으로, 도 3은 CD133 단백질과 결합하는 펩타이드 스크리닝을 위한 M13 파지스크리닝의 계획도로서, (1) 96-웰 플레이트의(SPL) 표면에 CD133 단백질을 고정시키고, (2) M13 파지 표면에 12개 아미노산으로 구성된 펩타이드 라이브러리가 발현된 파지 라이브러리를 CD133 단백질과 결합시킨 뒤에, (3) 이를 다양한 조건으로 세척한 후, (4) 최종적으로 결합된 파지를 화학적 용출 혹은 경쟁적 용출을 통하여 얻었다. 상기와 같이 얻어진 파지를 대장균(ER2738)에 감염시켜 증폭시키고, 증폭된 파지를 다시 CD133 단백질과 결합시킨 후, 세척조건의 강도조절 및 짧은 반응 시간 등의 조건으로 반복시킴으로써 보다 강한 결합력을 갖는 파지를 찾는 과정을 반복하였다. 이러한 일련의 과정을 바이오패닝이라 명명한다(바이오패닝, Biopanning). 도 4는 CD133 단백질에 대하여 높은 특이성 및 결합력을 가진 펩타이드가 발현된 파지를 검출하기 위한 총 3 단계의 바이오 패닝 조건을 도표로 나타낸 것이다. 각각의 단계마다 강한 세척조건, 짧은 반응 시간으로 반응 조건을 다양하게 변화시켰으며, 총3 회의 바이오 패닝을 실시하여 CD133 단백질에 결합하는 펩타이드를 가진 파지를 확보하였다. 상기에 의하여 얻어진 파지를 숙주세포인 대장균 ER2738 세포에 감염시켜서 LB 배지에서 증폭시킨 후, 45여 개의 파지 플라그를 선별 및 M13 파지 게놈성 DNA(단일 스트랜드화 원형 DNA)를 분리 정제하여 각각의 유전자 염기서열을 확인하게 되고, 3 염기조 암호(triplet code)에 의해 파지 표면 단백질(gp3 minor coat 단백질)에 발현되어 CD133 단백질과 결합하도록 제작된 펩타이드 부분의 아미노산 염기서열을 규명하였다. 그 결과를 하기 도 5에 나타내었다.

실시예 4: CD133와 결합하는 펩타이드의 결합력 분석

스크리닝한 펩타이드의 결합력 분석을 위하여 각각의 펩타이드가 발현된 파지를 증폭한 뒤 타이터링(titering)을 통하여 파지 용액의 농도를 결정하였다. 이후 CD133 단백질이 결합된 플레이트에 파지를 농도별로 넣어주어 결합한 파지의 양을 측정함으로써 해당 펩타이드의 결합력을 추론하였다.

구체적으로, CD133 단백질이 결합된 플레이트에 파지를 농도별로 넣어준 뒤 일정시간이 지난 후 세척하였다. 이후 파지 표면 단백질을 인식하는 항체(마우스 항-M13 단일 클론 항체, TBST에 1:5000으로 희석, Amersham Bioscience)를 넣어준 후 1시간동안 반응 시켜주었다. 세척용액으로 다시 5번 씻어낸 후 마우스 항-M13 단일클론항체에 결합하는 2차 항체(마우스 IgG-HRP, TBST에 1:4000으로 희석, Santacruz)를 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 5번의 세척 작업을 거친 다음 TMB 기질 용액(3,3' 5,5'-tetramethylbenzidine(TMB)/H₂O₂, Chemicon)을 넣고 15분 뒤 1 M 황산을 넣어 반응을 종결시켰다. 이 전체 과정을 항체를 이용한 ELISA(Enzyme-linked immunosorbant assay)라 칭하고 이 실험의 결과로 얻는 Kd값은 각 웰의 고정된 단백질에 반응시킨 페이지 펩타이드의 해당 농도에 따른 ELISA 신호 강도를 450 nm에서 측정하여 나타낸 포화곡선으로 정해진다.

그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이, 4개의 펩타이드가 피코몰(picomolarity) 수준의 우수한 결합력을 보여줌으로써 기존의 항체-항원 반응의 결합력에 상응하는 결합력을 확인할 수 있었다. 이 중 가장 우수한 결합력을 보여준 CD133-1 펩타이드의 대상물질과의 특이성 분석을 위해 펩타이드 서열 말단에 형광프로브를 합성하여 주었다.

실시예 5: CD133와 결합하는 형광 프로브 합성 펩타이드 서열의 결합력 분석

페이지 펩타이드 상에서 CD133 단백질을 높은 결합력으로 대상물질을 특이적으로 인지하는 하나의 서열에 각각 신호를 나타낼 형광 물질(FITC; fluorescein isothiocyanate 사용)을 붙여 합성하였으며, 그 서열은 다음과 같다.

CD133-GCGK-FITC : Ac - KMPKENPSSWLS GCGK - FITC

표기된 아미노산 서열은 아미노 말단부터 나타낸다. N-말단에는 아미노말단의 반응성 제거를 위해 아세틸화(Acetylation)를 시켰고, C-말단에는 카르복시말단에 FITC를 부착하기 위해 아미노산 K(Lysine, 라이신)를 첨가하였다. 각각의 아미노산 서열의 카르복시 말단 부근에는 GCG가 첨가되었는데, 이는 형광 펩타이드 탐침자 Ac-KMPKENPSSWLS GCGK-FITC 의 민감도를 극대화시키기 위한 과정을 위해서다. CD133-GCGK-FITC의 CD133 단백질에 대한 결합력 분석을 위하여 각각의 펩타이드를 CD133 단백질이 고정된 플레이트에 농도별로 희석하여 넣어주었다. 각 웰의 CD133 단백질에 결합한 펩타이드 양을 측정함으로써 각 펩타이드의 결합력을 추론하는 방법은 실시예4 에서 설명한 바와 비슷하다. 그러나 FITC가 합성된 펩타이드의 경우, 1차 항체, 2차 항체, TMB 기질 용액의 첨가 등 페이지 펩타이드 실험에서와 같이 신호를 나타낼 표지자가 별개로 필요하지 않아서 CD133 단백질과 펩타이드를 결합시킨 후 세척하여 형광 강도계로 펩타이드에 연결되어진 FITC의 최대 파장(Excitation @495nm, Emission @520nm)에서 각 펩타이드 농도의 형광세기를 측정하였다.

펩타이드 해당 농도의 FITC 신호강도는 그래프화 시켜서 펩타이드의 Kd 값을 정하였다(참조: 도6).

실시예 6: 다중인식 프로브로써 PUCP 합성

폴리펩타이드 백본의 일 구체예인 펜타 유닛(Penta-Unit, PU) 백본은 총 17개의 아미노산으로 구성된 짧은 펩타이드이다. 디자인된 백본은 ㈜애니젠을 통하여 합성을 진행 하였으며, PU 백본은 크게 총 4 가지 기능을 지닌 아미노산 잔기로 구성되었다. 17개의 아미노산은 HHHHGCGKGKGKGKGKC(서열목록 제2 서열)이고, 상기 아미노산 서열은 N-말단부터 C-말단 순으로 기재한 것이다. 처음 4개의 H(1-4번)는 PU 백본의 컬럼 내 Ni²⁺와 결합하는 기능을 가지고 있으며, 6번과 17번에 위치한 C는 고리형(cyclic) 구조를 형성하기 위하여 C의 측쇄(side chain)의 -SH끼리 결합을 통한 이황화 결합을 형성한다. 라이신(lysine, K)의 경우 PU 백본에 타겟 물질 결합 프로브 연결을 위한 양기능성 링커인 SPDP를 사용할 경우 라이신의 NH₃ ⁺에 의한 결합을 형성을 유도하는 역할을 한다. 상기 PU 백본에는 총 5개의 라이신 잔기가 존재하므로 5가지 프로브의 연결이 가능하여 총 5가지의 고리화 사슬형 백본을 형성하게 된다. 마지막으로 G(glycine)의 경우 아미노산 중 가장 작은 크기이며, 측쇄에 다른 기능기를 가지고 있지 않으므로 PU 백본의 라이신 사이에 위치하여 다른 프로브 결합 시, 크기에 따른 결합방해를 최소화하기 위하여 사용되었다(참조: 도 1).

상기 디자인된 PU 백본에 복수의 단일 펩타이드 프로브를 연결하기 위하여, 먼저 PU 백본을 SPDP(N-Succinimidyl 3-(2-pridyldithio)-propionate) 링커와 반응을 시켰다. 이는 SPDP 내 석신이미딜 그룹(succinimidyl group)이 좋은 이탈기(leaving group)로 작용하여 라이신의 측쇄에 존재하는 NH₃ ⁺과 반응함으로써 SPDP가 PU 백본에 결합하는 원리이다. 이 후 SPDP-PU 백본을 고정시키기 위하여 Ni^{2 +}-하전된 킬레이팅 세파로오스(Ni^{2 +}-charged chelating sepharose) 컬럼에 1시간 동안 반응시켜 SPDP-PU 백본을 고정시켰다. 이후 결합하고자하는 프로브(CD133 결합 펩타이드, Ac-KMPKENPSSWLSGCGK(FITC)-NH₂)를 1시간 동안 반응시킴으로써 최종적으로 PUCP(Penta-Unit conjugated probe)를 형성시켰다. 합성된 PUCP는 Ni^{2 +}-하전된 킬레이팅 세파로오스 컬럼으로부터 분리하기 위하여 이미다졸을 처리하여 분리시켰으며, 분리된 PUCP는 24시간 동안 탈염 과정을 거쳐 최종적으로 합성하였다. 합성된 PUCP는 형광광도계(Fluorometer)를 이용하여 ATR 결합 펩타이드에 연결되어진 FITC의 최대 파장(Excitation : 495 nm, Emission : 520 nm)에서 각 펩타이드 농도에 대한 형광세기를 측정하여 농도를 결정하였다.

실시예 7: CD133과 결합하는 단일 펩타이드 및 PUCP 의 결합력 비교 분석

CD133을 특이적으로 탐지하는 단일 펩타이드가 다중결합된 PUCP 와의 결합력 비교를 위해 형광 신호기반 결합력을 추론하였다. CD133 단백질이 결합된 플레이트에 파지를 농도별로 넣어주어 결합한 파지의 양을 측정함으로써 해당 펩타이드의 결합력을 추론하였다.

구체적으로, 상기 실시예 6의 방법으로 합성된 PUCP, 그리고 단일 펩타이드에 대한 CD133 결합력 분석을 실시하였다. CD133 단백질(2 μg)을 폴리스티렌 플레이트에 고정시키는 과정으로 2 시간 상온에서 반응 후, 세척과정을 거쳤다. 세척된 플레이트에 비특이적 반응의 최소화를 위해 5% 탈지유(skim milk)로 처리하여 준 후, 1 시간동안 상온에서 반응을 진행시켰다. 반응 후, 10번의 세척과정을 통해 잔여물들을 세척하였으며, 세척이 완료되는 즉시 농도별로 희석된 각각의 프로브(PUCP, 단일 펩타이드)를 처리하여 반응을 유도하였다. 2시간 상온에서 반응을 유도한 후, 세척과정을 거쳐 FITC의 최대 파장(Excitation : 495 nm, Emission : 520 nm)에서 각 펩타이드 농도에 대한 형광세기를 측정하여 결합력을 결정하였다. 도2 는 프로브 각각의 결합력과 이를 수치화한 표를 나타낸다.

단백질에 대한 결합력 분석을 위하여 각각의 펩타이드를 CD133 단백질이 고정된 플레이트에 농도별로 희석하여 넣어주었다. 각 웰(well)의 CD133 단백질에 결합한 펩타이드 양을 측정함으로써 각 펩타이드의 결합력을 추론하는 방법은 실시예4 에서 설명한 바와 유사하다. 그러나 FITC가 합성된 펩타이드의 경우, 1차 항체, 2차 항체, TMB 기질 용액의 첨가 등 페이지 펩타이드 실험에서와 같이 신호를 나타낼 표지자가 별개로 필요하지 않아서 CD133 단백질과 펩타이드를 결합시킨 후 세척하여 형광계(fluorometer)로 펩타이드에 연결되어진 FITC의 최대 파장(Excitation @495nm, Emission @520nm)에서 각 펩타이드 농도의 형광세기를 측정하였다. 펩타이드 해당 농도의 FITC 신호강도는 그래프화 시켜서 펩타이드의 Kd 값을 정하였다.

그 결과 나노 몰 수준의 강한 결합력을 얻을 수 있었다(PUCP의 Kd: 1.4ㅁ0.12 nM, 단일 펩타이드의 Kd: 8.0ㅁ0.7 nM). 이를 통해 PUCP 가 단일 펩타이드보다 8배 강한 결합력을 갖는 것을 확인하였다.

실시예 8: 세포 면역염색법을 이용한 PUCP 와 단일 펩타이드의 CD133발현 세포주와의 결합 효율 분석

면역 세포 화학(Immunocytochemistry) 방법을 이용하여 실제 CD133 발현 세포주에 대한 단일 펩타이드, PUCP, PDPP(Polyvalent Directed Peptide Polymer)의 결합을 형광현미경을 통해 분석하였다. 대조군으로 피코에리트린(phycoerythrin)이 붙어있는 CD133 항체(CD133 antibody-PE)를 이용하였으며, 펩타이드 특이도 분석을 위해 임의의 서열을 가진 펩타이드(Scramble peptide, sc-peptide) 또한 동시에 처리하였다. 상기 실험을 위하여 U87 세포를 60 mm 세포배양 플레이트에 10% 소태아혈청(FBS, fetal bovine serum), 100 U/ml 페니실린(penicillin), 100 μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)이 함유된 DMEM 배지와 함께 분주하고 37℃, 5% CO₂ 조건하에 성장시켰다. 성장시킨 세포는 펩타이드와의 결합을 위해 우선적으로 블록킹 버퍼(Blocking buffer)(2% FBS)로 1시간 반응시킨 후, 워싱 버퍼(Washing buffer) PBS를 통해 세척을 진행하였다. 이후 CD133 항체-PE, sc-펩타이드, 단일 펩타이드, PUCP, PDPP를 이용하여 4시간 4℃에서 반응시켰다. 상기 sc-펩타이드는 scramble-펩타이드로 임의의 서열을 가진 대조군 펩타이드를 의미하고, 단일 펩타이드는 서열목록 제1서열의 CD133 타겟 펩타이드를 의미하며, PDPP는 서열 목록 제 1서열의 CD133 타겟 펩타이드를 poly-D-라이신(150~300kDa)에 연결시킨 형태의 폴리머를 의미한다.

이후 세척과정을 거친 후, 세포 핵 염색을 위해 DAPI를 통해 5분간 추가 반응을 진행한다. 최종적으로 형광현미경을 통하여 세포막 단백질 CD133 에 결합하는 각각의 프로브(항체, sc-펩타이드, 단일 펩타이드, PUCP, PDPP)의 결합력 및 특이도를 분석하였다.

그 결과, sc-펩타이드(대조군)를 제외한, 단일 펩타이드, PUCP 및 PDPP가 모두 세포수준에서 CD133과 결합하여 형광 신호를 방출하는 것을 확인하였으며, 수치적으로 PUCP가 단일 펩타이드 보다 2-3배 정도 강한 형광신호를 나타냄을 관찰하였다. 이러한 결과는 PUCP가 진단 프로브로써 이용가능하며 단일 펩타이드 보다 강한 결합력, 세포 선택적 결합능력을 갖춘 신규한 프로브라고 것을 보여준다.

실시예 9: 세포 독성 비교를 통한 PUCP 의 세포 안정성 분석

발굴된 펩타이드들에 대한 세포 내에서 탄저 독소에 의한 독성 저해 테스트를 위하여, Raw264.7 대식세포에서 세포 독성 테스트를 진행하였다. 먼저 10⁵개의 세포를 DMEM(10% FBS, 1% penicillin-streptomycin) 배지 하에 96웰 세포 배양 플레이트에서 5% CO₂ 조건하에 24시간 배양하였다. 배양된 세포에 각 프로브(단일 펩타이드, PDPP, PUCP)를 농도에 따라 2시간 반응시켰다. 이 후, 모든 반응 용액을 제거하고, 1 mg/ml의 MTT 용액을 4시간 동안 처리하였으며, 마지막으로 DMSO를 넣어 반응을 종결시켰다. 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 신호를 측정함으로써 펩타이드에 대한 세포 내 탄저 독소 저해 효과 검증을 측정하였다(참조: 도 4).

도 4에 나타낸 바와 같이 PDPP의 경우 PUCP 보다 강한 결합력, 높은 형광 신호를 보이지만(참조: 도3) 세포 독성 테스트에 대해 농도가 높아질수록 이에 비례하여 세포의 사멸이 유도되는 것을 확인하였다. 이는 PDPP 의 lysine 잔기의 positive charge 가 세포에 악영향을 주기 때문이라고 알려져 있다. 반면에 단일 펩타이드 보다 강한 결합력, PDPP 보다는 약한 결합력을 갖는 PUCP 의 경우 농도가 증가하더라도 세포자체의 특성에 아무 영향이 없는 것을 확인하였다. 이는 가장 높은 민감도를 갖는 PDPP를 대체하여, 높은 민감도, 세포 안정성을 갖는 PUCP 가 단일 펩타이드 대체물질로 이용 가능함을 의미한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Multi Peptide Conjugated Probe for Detecting of CD133 <130> PN150122 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Single peptide probe for CD133 <400> 1 Lys Met Pro Lys Glu Asn Pro Ser Ser Trp Leu Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide backbone for multi peptide probe <400> 2 His His His His Gly Cys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys 1 5 10 15 Cys

Claims (7)

1. (a) 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 백본 및 (b) 상기 백본에 결합된 서열목록 제1 서열로 이루어진 복수의 단일 펩타이드 프로브를 포함하는, 신경교종 줄기세포 특이적 마커로서의 CD133 타겟팅용 다중 펩타이드 프로브:
   일반식 1
   HxGC(GK)yC;
   상기 일반식 1에서 x는 2-5의 정수, y는 3-8의 정수이다.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 백본은 백본 내에 포함된 두개의 시스테인 간의 이황화 결합을 통해 환형 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 다중 펩타이드 프로브.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 일반식 1에서 y는 5인 것을 특징으로 하는 다중 펩타이드 프로브.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열은 서열목록 제2 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 다중 펩타이드 프로브.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 다중 펩타이드 프로브는 상기 폴리펩타이드 백본의 라이신의 측쇄에 포함된 아민기와 아마이드 결합을 형성하는 제1 기능기 및 상기 단일 펩타이드 프로브와 결합을 형성하는 제2 기능기를 포함하는 양기능성 링커를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 펩타이드 프로브.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 단일 펩타이드 프로브와 상기 양기능성 링커의 제2 기능기 사이의 결합은 이황화 결합 또는 아마이드 결합인 것을 특징으로 하는 다중 펩타이드 프로브.
   
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 다중 펩타이드 프로브를 포함하는 신경교종 줄기세포 검출 키트.
   
   
   

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