KR100868248B1 - 탄저 감염 진단용 신규한 펩타이드 탐침 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 탄저 (Anthrax) 감염 진단 탐침으로서 펩타이드를 스크리닝하는 방법, 및 이로부터 얻어진 펩타이드에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 파지 디스플레이를 이용한 높은 특이성과 높은 친화력을 갖는 탄저 방어항원(protective antigen, 이하 'PA'라 한다) 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드(PA-binding peptides)를 스크리닝하는 방법, 및 이를 통하여 발굴된 탄저 감염 진단 탐침으로서의 펩타이드에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 기존의 항체나 엡타머 (aptamer)를 이용한 진단방식과 차별화될 뿐 아니라, 펩타이드의 물리화학적 안정성을 이용하여 다양한 나노바이오 센서 (Nanobiosensor)와도 연계가능한 스크리닝 방법, 및 신규한 탄저 감염 진단 탐침을 제공할 수 있다.
탄저, 방어항원, 펩타이드, 파지 디스플레이

Description

탄저 감염 진단용 신규한 펩타이드 탐침{Novel peptide probes for diagnosing anthrax infection}
도 1(a)는 PA 단백질과 결합하는 펩타이드를 스크리닝하기 위해 대장균에서 유전자 재조합을 이용하여 생산한 탄저 방어항원 단백질을 Ni이 결합된 96 웰 플레이트에 재조합 단백질의 카복시 말단의 6 히스티딘 태그를 이용하여 방향성 있게 플레이트 바닥으로 향하게 결합시킨 상태를 도시한 도면이다.
또한, 도 1(b)는 결합 유무를 확인하고자 PA 인식 항체를 이용한 ELISA 실험결과를 도시한 그래프로서, PA가 결합하였음을 확인할 수 있었다.
도 2는 PA와 결합하는 펩타이드를 스크리닝하기 위한 M13 파지 스크리닝의 계획도이다.
도 3은 PA에 대해 높은 특이성 및 결합력을 가진 펩타이드가 발현된 파지를 검출하기 위한 5단계 바이오패닝 조건을 정리한 도표이다.
도 4는 도 3의 5단계 바이오패닝을 통하여 얻은 PA와 결합하는 파지를 증폭하여 DNA를 분리정제 후 염기서열 분석을 실시하여 파지표면에 발현된 펩타이드의 아미노산 서열을 비교 분석하고 상동성을 바탕으로 유사계통도를 작성한 결과를 도 시한 도면이다.
도 5는 상동성 분석결과 분류된 19개군 가운데 특정 1개군의 서열분석을 도시한 도면이다.
도 6은 19개 군의 대표 펩타이드 발현 파지를 증폭한 뒤 농도를 측정하여 PA와 결합력을 분석한 그래프이다.
도 7은 PA와 결합하는 펩타이드의 결합부위 선별을 위한 계획도이다.
도 8은 도 7에 따라 플레이트 표면에 PA63을 남기고 19개군의 펩타이드를 넣어주어 결합한 펩타이드를 ELISA를 이용하여 확인한 결과를 도시한 도면이다.
도 9는 본 발명을 통하여 얻은 탄저 방어항원 (PA)와 결합하는 펩타이드의 결합위치, 펩타이드 아미노산 서열 및 결합력을 정리한 도면이다.
본 발명은 탄저(Anthrax) 감염 진단 탐침으로서 펩타이드를 스크리닝하는 방법, 및 이로부터 얻어진 펩타이드에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 파지 디스플레이를 이용한 높은 특이성과 높은 친화력을 갖는 탄저 방어항원 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드를 스크리닝하는 방법, 및 이를 통하여 발굴된 탄저 감염 진단 탐침으로서의 펩타이드에 관한 것이다.
일반적으로, 탄저는 그람 양성 간균인 탄저균(Bacillus anthracis)에 의하여 주로 가축에게 감염되나 사람에게도 발병하는 인수 공통 감염성 질환이다.
상기 탄저균은 오래 전부터 생물학 무기로 개발되어 왔는데, 최근에는 실전에도 배치될 정도가 되어 1990년 걸프전 때와 1998년에 재외주둔 미군에 탄저 백신이 접종되는 사태에 이르러 일반인에게도 주요 관심사로 대두되고 있다.
탄저균 감염에 의해서 발생하는 탄저병은 매우 치사율이 높은 것으로 알려져 있는데 치료방법은 다른 세균 감염질환과 마찬가지로 세 가지 접근방법이 가능하다.
첫째는 탄저균 감염을 사전에 봉쇄하는 예방접종이고 둘째는 감염된 탄저균을 항생제로 무력화시키는 것이고 셋째는 감염된 탄저균이 분비하는 주요 병 독소를 해독시키는 것이다.
일단 감염되면 항생제와 해독제를 투여하여 병균과 병독소를 동시에 무력화시키는 것이 가장 이상적이나 현재 일반적으로 항생제에 비해 해독제의 개발이 미미해 주로 항생제에 의존하는 형편이다. 우리 나라에도 이를 법정 전염병으로 분류하여 대응하고 있으며, 실제 국내에서도 가축 및 폐사우의 식육을 섭취함 사망한 사례가 보고된바 있음으로써 탄저에 대한 방제의 필요성이 대두되었다.
탄저병 균을 죽이는 항생제는 이미 개발돼 있지만 이 약물은 이미 생성된 탄저 독소에는 전혀 영향을 미치지 못하는 단점을 가지고 있다. 그리고 탄저병 백 신의 경우에도 부작용 문제 때문에 광범위한 사용이 어려운 형편이다. 더욱이 높은 치사율을 보이는 탄저의 경우 질병 발병 초기단계에서 발견하여 이에 대한 대중적 치료가 매우 중요하다. 또한 국내 육류소비량의 절반이상이 생물학적 테러위험성(탄저)이 높은 미국 의존적 수입경로를 감안할 때 축산물 수입에 대한 철저한 검역시스템 도입이 절실하다. 그러나 질병증상이 나타나지 않는 감염초기 및 진행기의 가축의 가공물의 경우 질병 원인균의 농도가 매우 낮아 진단 여부가 매우 어려우며 많은 양의 검역이 어렵다.
이같은 탄저균의 병원성은 독소 생성 능력과 협막 형성에 의해 결정되는 것으로 알려져 있다.
이중 탄저의 독소 생성 능력에 영향을 주는 단백질은 방어항원 (protective antigen, PA), 부종요소 (edema factor, EF). 치사요소 (lethal factor, LF) 임이 알려져 이들에 대한 연구가 진행 중이다. 이들 각각은 독성을 나타내지 못하나, 방어항원 (PA)과 부종요소 (EF)가 결합하여 부종독소 (EdTx, edema toxin)를 형성하고, 방어항원 (PA)과 치사요소 (LF)가 결합하여 치사독소 (LeTx, ethal toxin)를 형성한다.
여기서 PA는 대식세포와 같은 감염 세포주 표면의 수용체 단백질 (ATR)에 결합한 후 단백질 분해효소 (furin family protease)에 의해 PA20과 PA63으로 잘리는데, 이중 PA63이 헵타머화되면서 LF 혹은 EF와 결합하여 이를 세포 내로 운반시키는 독소 단백질 운반체 (Toxin delivery channel)의 역할을 수행하는 것이 널리 보고되어 있다.
이들 복합체는 엔도시토시스 기전으로 세포 내로 들어가고 엔도좀의 pH가 낮아지면 PA63 헵타머의 구조적 변화가 생기며 엔도좀 멤브레인에 기공을 형성하고 결과적으로 LF 혹은 EF는 세포질로 유리되어 독성효과를 나타내게 된다. 그러므로 PA는 탄저의 질병 예방과 치료법을 위한 관심 있는 대상이라 할 수 있다. 따라서 탄저 독소를 저해하는 다양한 접근 방법들은 PA에 의거해 많은 연구들이 진행 중이다.
그러나, 높은 감도, 신속성, 현장 적응성을 지닌 진단 킷트 혹은 높은 물리화학적 안정성, 민감도, 특이성, 응용성등의 특성을 지닌 탐지물질 (diagnostic probe)은 아직까지 제시된 바 없다.
한편, 진단 대상체를 진단하기 위한 가장 보편적인 방법으로는 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 이용하는 것으로서, 진단 대상체가 지니는 고유한 유전자를 분석한 뒤 이를 시험관내 (in vitro) 증폭하여 소량의 진단 대상체를 분석한다.
그리고 유전자가 지니는 고유한 염기서열을 이용하여 진단 대상체 만의 고유한 염기서열을 대상으로 하고, 또한 근래의 휴먼 게놈 프로젝트 등을 통한 광범위한 유전자 정보 데이터베이스 확보를 통하여 그 활용범위를 확대할 수 있다.
또한 증폭하여 얻은 유전자를 대상으로 이들의 유전적 변이를 다양한 탐침을 이용해 확인하는 SSCP (Single-strand conformation polymorphism), RFLP (Restriction fragment length polymorphism), AFLP (Amplified fragment length polymorphism) 방법들과 연계하여 유용한 정보를 제공하고 있다.
이러한 PCR을 이용하는 진단 방법에는 진단 대상체 만이 지니는 고유한 염기서열을 소량으로 얻는 데에 높은 감도를 가지는 장점을 지니지만 시료 전처리 및 현장적응성에 대한 어려움 등의 문제점은 진단시스템으로써 한계를 보여주는 단점이 있다.
더욱이 병원체, 바이러스 등의 외부 요인 진단이 아닌 사람의 질병진단에 있어서는 생명체가 가지는 염색체상의 변형보다 단백질 레벨에서의 변화가 많은 점을 감안할 때 진단 대상체로써 단백질의 중요성이 부각되어지고 있으므로 PCR만을 이용한 진단 방법은 적당하다고 할 수 없기에 이를 극복할 수 있는 관련연구와 접목시킬 필요성이 있다.
이러한 측면에서 근래의 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorption Assay) 방법은 질병으로 유발된 특정 단백질의 발현양 증가 및 변화를 판단한다. 이러한 특정 단백질의 인식을 위해서 이들과 특이적 결합을 하는 항체를 진단 탐침으로 사용하여 혈액, 소변등의 생체 검체로부터 진단 대상체를 분리하고 이를 효소-항체를 이용한 반응 (ECL)을 이용한다.
그러나 나노몰 수준의 반응감도는 생체 내 작용점인 단백질을 대상으로 하는 장점에도 불구하고 PCR 진단법에 비한 낮은 민감도를 가짐으로 써 이를 극복할 수 있는 많은 관련연구가 진행 중이다.
최근에는 현재의 진단방법(PCR, ELISA)을 기초로 NT 기술이 접목된 표면 증강 라만 분광분석법 (SERS) 및 바이오-바코드 기술이 개발되어짐으로써 펨토몰 수준의 진단 대상체 분석이 실험적으로 가능함을 보여 주었다.
두 방법은 모두 라만 분광분석이 갖는 신호적 특성 (좁은 라만 밴드; 습기, 산소 및 담금자에 낮은 민감도; 낮은 광표백도)과 형광분석에 상응하는 높은 민감도를 금속 나노입자를 이용한 신호증폭을 이루어 펨토몰 (10-15M) 수준의 진단대상체 인식이 가능해짐으로써 혈액 등의 손쉬운 검체 시료를 이용한 암 진단 (Prostate specific antigen, PSA)에 대한 접근법을 제안하였다.
기존의 방법은 바이오 마커 (진단대상체)를 인식하는 항체를 이용한 시스템을 토대로 하는데 이는 항체의 물리, 화학적 구조는 크기적 제한으로 인한 결합수의 제한 및 여러 가지의 화학적 반응 하에서 구조변성으로 인한 불안정성을 보임으로써 근래의 NT 기술과의 접목에 제한을 갖는다. 따라서 항체가 가지는 특이성 및 결합력을 가지는 저분자 탐침 (small molecular probe)의 개발은 이러한 제한을 극복하는 차세대 진단물질의 근간이 될 것으로 기대된다.
근래의 뉴클레오티드 엡타머는 이러한 항체 대체 진단 탐침으로써 많은 연구 가 되고 있음은 잘 알려져 있다. 기존의 항체 및 엡타머를 이용한 진단 시스템 기술과 차별화된 새로운 저분자 진단 탐침 (Diagnostic probe)의 개발은 차세대 지단 시스템 개발을 위한 기술적 토대가 될 뿐만 아니라 신기술 선점에 있어 매우 중요하다.
이에 본 발명자들은 현재 탄저균 진단을 위하여 사용되는 항체를 대체할 수 있는 새로운 진단 물질로써 펩타이드를 동정해내고, 이를 새로운 탐지물질로 제안하기에 이르렀다.
즉, 본 발명의 목적은 탄저균 감염 진단을 위한 탄저 독소단백질을 인식하고 특이적으로 결합하는 펩타이드를 스크리닝하는 방법을 제공하려는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 방법에 의해 발굴된 펩타이드를 탄저 감염 저분자 진단 탐침의 용도로서 제공하려는데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기존의 탄저 독성을 나타내는 독소 운반 단백질을 진단 대상으로 하여 항원-항체반응에 상응하는 결합력을 갖춘 펩타이드를 선별한 다음 이들의 결합 지역을 PA 단백질의 작용 부위별로(PA20 및 PA63) 구별한다.
즉, 파지 디스플레이 라이브러리 스크리닝을 실시하여 PA에 결합하는 펩타이드를 선별 후 이들의 결합지역 및 결합력을 분석하여 탐침으로서의 수행력을 확인 하며, 이때 파지는 통상적으로 입수가능한 phage λ나 M13 등의 박테리오파지를 사용할 수 있으며, 이중에서 M13을 사용하는 것이 보다 바람직하다.
그 결과, 탄저 감염 진단 탐침으로써 저분자 펩타이드로서 8종을 규명할 수 있었다. 하기에 나타낸 아미노산 서열은 아미노 말단부터 나타내는 것으로, L은 루신, S는 세린, T는 트레오닌, A는 알라닌, H는 히스티딘, P는 프롤린, F는 페닐알라닌, M은 메티오닌, R은 아르기닌, N은 아스파라긴, Y는 티로신, V는 발린, Q는 글루타민, I는 이소루신, G는 글리신, D는 아스파르트산, K는 리신, W는 트립토산, X는 기타 불명확한 아미노산을 의미한다.
구체적인 아미노산 서열은 다음과 같다:
P1: LSHNQTIQQDSD
이때, 상기 서열목록 1로 표시되는 아미노산 서열 LSHNQTIQQDSD 중 두번째 아미노산인 S가 T로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 서열목록 1로 표시되는 아미노산 서열 LSHNQTIQQDSD 중 다섯번째 아미노산인 Q가 L로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 서열목록 1로 표시되는 아미노산 서열 LSHNQTIQQDSD 중 일곱번째 아미노산인 I이 L로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 서열목록 1로 표시되는 아미노산 서열 LSHNQTIQQDSD 중 열번째 아미노산인 D가 A로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.
나아가, 상기 서열목록 1로 표시되는 아미노산 서열 LSHNQTIQQDSD 중 두번째 아미노산인 S가 T로 및/또는 다섯번째 아미노산인 Q가 L로 및/또는 일곱번째 아미노산인 I가 L로 및/또는 열번째 아미노산인 D가 A로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 포함한다.
P2: HKHAHNYRLPXS
상기 서열목록 2로 표시되는 아미노산 서열 HKHAHNYRLPXS 중 일곱번째 아미노산인 Y가 T로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.
P3: TPYYWHHHHIPP
P4: QSPVNHHYHYHI
P5: GHKPQVHRHTHI
이때, 상기 서열목록 5로 표시되는 아미노산 서열 GHKPQVHRHTHI 중 첫번째 아미노산인 G가 A로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 서열목록 5로 표시되는 아미노산 서열 GHKPQVHRHTHI 중 두번째 아미노산인 H가 L로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.
나아가, 상기 서열목록 5로 표시되는 아미노산 서열 GHKPQVHRHTHI 중 열두번째 아미노산인 I가 L로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.
P6: LMPTPHHRLFPM
P7: ALHPHRTPHHHH
P8: NAYKHHHPPVFY
또한, 상술한 8종의 펩타이드 중 P1, P5, P7, P8의 4종은 PA20에 결합한 것을 확인할 수 있었으며, 나머지 4종에 해당하는 P2, P3, P4, P6은 PA63에 결합한 것을 확인할 수 있었다(도 9 참조).
이같은 펩타이드는 엡타머와 달리 항체와 같은 아미노산으로 구성되므로 다양한 조합의 특이성을 나타낼 수 있다. 또한 단순한 3차원적 구조로 인한 높은 물리, 화학적 안정성은 다양한 나노 센서 칩과의 연계 및 현장 적용성이 우수한 Kit개발 큰 장점을 가질 수 있을 것으로 기대한다.
이하, 본 발명의 구성 및 효과를 나타내기 위하여 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명하고자 하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 이에 한정하고자 하는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1: PA 단백질의 대량 생산 및 분리법
탄저균주 (Bacillus anthracis sterne)의 게놈성 DNA를 분리한 뒤 PA 유전자를 PCR을 통하여 증폭한 하여 이를 박테리아 발현벡터인 pET22b에 삽입한 뒤 박테리아에서 PA의 대량발현 시 발생하는 단백질 소멸을 억제하기 위하여 생산되는 PA를 박테리아의 periplasmic 영역에 전위시키고자 아미노 말단부위에 leader 시퀀스로 PelB 유전자를 삽입하였다.
이렇게 클로닝한 PA 발현 플라스미드를 발현숙주인 BL21(DE3)에 형질전환시킨 뒤 0.5 mM IPTG, 18℃ 조건하에서 PA 생산을 유도하였다. 그리고 박테리아 세포를 원심분리를 통하여 수획하여 단백질의 용해도를 조사하여 본 결과 대부분의 단백질이 불용성인 것을 확인할 수 있었다.
따라서 PA 분리정제를 위하여 세포 내 불용성 단백질만을 얻어낸 뒤 이를 변성 조건 (6M 구아니딘-HCl)에서 용해시킨 뒤 Ni-세파로오스 칼럼을 통과시켜 PA 단백질을 결합시킨 뒤에 변성된 PA를 되접힘시키기 (Refolding) 위하여 칼럼에 결합된 상태로 선형 구배 (Linear gradient) (우레아의 저감 농도)를 통하여 서서히 변성체를 제거시켜가며 PA를 되접힘시키고 500 mM 이미다졸 선형 구배 하에 용출시켰다.
얻어낸 단백질은 PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) 용액에서 투석하여 과량의 이미다졸을 제거하였고, 이를 통해 얻은 단백질의 정제도를 SDS/PAGE를 통하여 확인하였으며 Bradford 반응액을 이용하여 양을 확인한 결과 3 mg/L 단백질을 얻을 수 있었다.
그런 다음 PA 단백질의 되접힘 여부확인을 위하여 트립신 처리를 수행하였다. (-) PA의 경우 트립신 처리를 하였을 때 20 kDa 과 63 kDa의 특이적인 2개의 단편이 발생함이 나타남으로 위의 방법으로 분리 정제한 PA 단백질을 트립신으로 처리하여 같은 결과가 나오는지를 확인함으로써 변성 정제 후 단백질의 구조가 정상적으로 돌아왔는지(refolding) 확인하였다.
트립신 처리 결과 PA20 과 PA63의 두개의 단백질 단편이 생김을 확인하였다.
실시예 2: M13 파지 펩타이드 라이브러리 스크리닝 - 파지 디스플레이
우선 유전자 재조합 단백질을 제조시 96-웰 플레이트에 고정시키기 위해서 PA 유전자 카복시 말단에 6 히스티딘 태그가 결합된 상태로 발현될 수 있게 클로닝 하여 플레이트 표면에 Ni이온이 배위 결합으로 고정되어 있는 Ni-Sorb 플레이트 (Qiagen)를 사용하여 카복시 말단이 플레이트 바닥으로 향하게 결합시킴으로써 특이적 방향성을 가진 상태로 PA 단백질을 고정시킴으로써, M13 파지 랜덤 펩타이드 라이브러리 (12 아미노산)를 이용한 스크리닝시 보다 높은 특이성 및 결합지역 분석을 용이하게 디자인하였다. 그 결합을 도 1에서 분석하였다.
구체적으로, 도 1(a)에서는 PA 단백질과 결합하는 펩타이드를 스크리닝하기 위해 대장균에서 유전자 재조합을 이용하여 생산한 탄저 방어항원 단백질을 Ni이 결합된 96 웰 플레이트 (Qiagen)에 재조합 단백질의 카복시 말단의 6 히스티딘 태그를 이용하여 방향성 있게 플레이트 바닥으로 향하게 결합시킴을 확인할 수 있었다.
상기 결합 유무를 확인하고자 PA 인식 항체를 이용한 ELISA 실험결과 도 1(b)에서 보듯이, PA가 결합하였음을 확인하였다.
분리 정제한 PA 단백질을 플레이트 표면에 결합시킨 뒤 M13 파지 펩타이드 라이브러리 (약 27억개의 서로 다른 아미노산 서열을 지닌 12개 아미노산으로 구성된 펩타이드가 M13 파지 g3 minor coat 단백질에 융합된 라이브러리)를 넣어 주어 결합시킨 뒤 다양한 결합 시간 및 세척조건을 통하여 높은 친화력으로 결합하는 펩타이드 발현 파지를 선별하였다. 이에 대한 스크리닝 계획 및 각각의 반응조건은 각각 도 2 및 3에 나타내었다.
구체적으로, 도 2는 PA와 결합하는 펩타이드 스크리닝을 위한 M13 파지 스크리닝의 계획도인 것으로, M13 파지표면에 12개 아미노산으로 구성된 펩타이드 라이 브러리가 발현된 파지 라이브러리를 96 웰 플레이트 표면에 고정된 PA에 넣고 다양한 조건으로 세척한 뒤 결합된 파지를 용출하여 얻었다.
얻은 파지는 대장균에 감염시켜 증폭하여 다시 PA와 결합시킨 뒤 보다 높은 강도의 세척 조건 및 짧은 반응 시간 등의 조건으로 강한 결합파지를 찾는 과정을 반복하였다 (biopanning).
또한, 도 3은 PA에 대해 높은 특이성 및 결합력을 가진 펩타이드가 발현된 파지를 검출하기 위한 5단계 바이오패닝 조건을 도표화한 것으로, 매 단계마다 보다 강한 세척조건, 짧은 결합시간으로 변화시켰으며, 이에 따라 다르게 5회 바이오패닝을 실시하여 PA에 결합하는 펩타이드를 가진 파지를 확보하였다.
이와 같이 하여 얻어진 파지를 증폭한 뒤 80여 개의 파지 플라그를 선택하여 M13 파지 게놈성 DNA (단일 스트랜드화 원형 DNA)를 분리 정제하여 유전자 염기서열을 확인하여 파지 표면 단백질 (gp3 minor coat 단백질)에 발현되어 PA와 결합한 펩타이드의 아미노산 디스플레이된 펩타이드 아미노산 염기서열을 추론하였다.
이를 Clustal X 서열 분석 프로그램을 통하여 상호간 상동성을 바탕으로 한 유사계통도를 작성하여 모두 19개의 군을 정리하였으며 그 결과를 도 4에 정리하였다.
또한 각 군의 펩타이드의 아미노산 상동성 분석 결과, 상동성 분석결과 분류 된 19개군 가운데 특정 1개군의 서열분석을 나타낸 도 5에서 확인할 수 있듯이, 같은 군에 속하는 펩타이드의 서열에서는 높은 유사성을 관찰할 수 있으며 색깔로 표시된 아미노산은 같은 군내의 펩타이드에서 모두 보존되어 있음을 확인하였다. 이는 이들 아미노산 PA와 해당 펩타이드와의 결합에 있어 중요한 작용을 하는 잔기에 해당함을 시사한다.
실시예 3: PA 와 결합하는 펩타이드의 결합력 분석
스크리닝한 펩타이드의 결합력 분석을 위하여 각각의 펩타이드가 발현된 파지를 증폭한 뒤 titering을 통하여 파지 용액의 농도를 결정한 뒤 PA가 결합된 플레이트에 농도별로 넣어주어 결합한 파지의 양을 측정함으로써 해당 펩타이드의 결합력을 추론하였다.
PA가 결합된 플레이트에 파지를 넣어준 뒤 세척하여 파지 표면 단백질을 인식하는 항체를 이용한 ELISA를 수행하였다. 해당 농도에 따르는 ELISA 신호강도를 표시하여 이를 포화곡선에 맞추어 외견상 Kd 값을 결정하였다.
그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이, 19개 펩타이드 군 가운데 11개 펩타이드는 피코몰 범위의 결합력을 보여주고 있으며 일부 펩타이드는 20 pM 이하의 우수한 결합력을 보여줌으로써 기존의 항체-항원 반응의 결합력에 상응하는 결합력을 확인할 수 있었다.
실시예 4: PA 와 결합하는 펩타이드의 결합지역 분석
PA는 탄저독성을 나타내기 위한 독소운반 단백질의 역할을 수행함에 있어 감염 대상 세포주 표면에 결합 후 단백질 가수 분해 효소에 의하여 아미노 말단 부위 (PA20) 및 카복시 말단 (PA63)의 형태로 전환되어야 그 기능을 할 수 있음이 알려져 있다.
따라서 본 발명에서는 도 7에 도시한 계획도에 기초하여 동정한 PA 결합 펩타이드의 각각의 해당 부위에 따른 결합지역 분석을 실시하여 다양한 목적으로 이용 할 수 있는 자료를 구축하였다.
구체적으로, (-) PA의 경우 트립신 처리를 하였을 때 20 kDa 과 63 kDa의 특이적인 두 개의 단편이 발생함이 알려져 있음으로 분리 정제한 PA단백질을 도 1(a)에서 나타낸 바와 같이 고정시킨 뒤 트립신 처리하고 이를 세척하여 PA20을 제거하여 PA63단백질만을 플레이트에 고정한 상태에서 19개군의 펩타이드가 발현된 파지를 넣어 주어 결합여부를 판별하였다. 특히, 도 8에 나타낸 것과 같이, 플레이트 표면에 PA63을 남기고 19개군의 펩타이드를 넣어주어 결합하는 펩타이드를 도 6에서 설명한 ELISA를 이용하여 확인한 결과, 펩타이드는 PA63지역에 결합하는 것이며, 반응이 나타나지 않는 것은 PA20지역에 결합하는 것으로 추론할 수 있다
이러한 본 발명을 통하여 얻은 PA단백질과 결합하는 펩타이드 가운데 피코 몰(10-12M) 범위의 우수한 결합력을 갖는 8종의 펩타이드의 아미노산 서열 및 이들의 결합부위에 대한 정보를 도 9에 나타내었다.
구체적으로, 도 9는 본 발명을 통하여 얻은 탄저 방어항원 (PA)와 결합하는 펩타이드의 결합위치 및 결합력에 관한 도면으로서, 본 발명에서는 PA과 결합하는 펩타이드가 표면단백질과 함께 발현된 M13 파지를 이용하여 이들의 결합력을 도 6에 나타낸 바와 같이 측정하였고 도 7에 나타낸 바와 같이 이들을 PA20 및 PA63 지역으로 결합위치를 구분하였다.
이를 정리하였으며 결합 펩타이드의 아미노산 서열을 해당 펩타이드 발현 파지의 유전자를 분석하여 확인하여 나타내었다. 그 결과 해당하는 8종의 펩타이드의 아미노산 서열목록은 다음과 같다:
P1: LSHNQTIQQDSD
이때, 상기 서열목록 1로 표시되는 아미노산 서열 LSHNQTIQQDSD 중 두번째 아미노산인 S가 T로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 포함한다.
또한, 상기 서열목록 1로 표시되는 아미노산 서열 LSHNQTIQQDSD 중 다섯번째 아미노산인 Q가 L로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 포함한다.
또한, 상기 서열목록 1로 표시되는 아미노산 서열 LSHNQTIQQDSD 중 일곱번째 아미노산인 I가 L로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 포함한다.
또한, 상기 서열목록 1로 표시되는 아미노산 서열 LSHNQTIQQDSD 중 열번째 아미노산인 D가 A로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 포함한다.
나아가, 상기 서열목록 1로 표시되는 아미노산 서열 LSHNQTIQQDSD 중 두번째 아미노산인 S가 T로 및/또는 다섯번째 아미노산인 Q가 L로 및/또는 일곱번째 아미노산인 I가 L로 및/또는 열번째 아미노산인 D가 A로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 포함한다.
P2: HKHAHNYRLPXS
상기 서열목록 2로 표시되는 아미노산 서열 HKHAHNYRLPXS 중 일곱번째 아미노산인 Y가 T로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.
P3: TPYYWHHHHIPP
P4: QSPVNHHYHYHI
P5: GHKPQVHRHTHI
이때, 상기 서열목록 5로 표시되는 아미노산 서열 GHKPQVHRHTHI 중 첫번째 아미노산인 G가 A로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 서열목록 5로 표시되는 아미노산 서열 GHKPQVHRHTHI 중 두번째 아미노산인 H가 L로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.
나아가, 상기 서열목록 5로 표시되는 아미노산 서열 GHKPQVHRHTHI 중 열두번 째 아미노산인 I가 L로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.
P6: LMPTPHHRLFPM
P7: ALHPHRTPHHHH
P8: NAYKHHHPPVFY
또한, 상술한 8종의 펩타이드 중 P1, P5, P7, P8의 4종은 PA20에 결합한 것을 확인할 수 있었으며, 나머지 4종에 해당하는 P2, P3, P4, P6은 PA63에 결합한 것을 확인할 수 있었다(도 9 참조).
결과적으로, 유전자 재조합을 이용하여 대량 생산한 탄저 방어항원 단백질을 플레이트 표면에 Ni이온이 배위결합으로 고정되어 있는 96웰 플레이트에 단백질의 카복시 말단의 6 히스티딘 태그를 이용하여 결합시킨 뒤 램덤 펩타이드 라이브러리(12 아미노산)가 파지표면에 발현된 M13를 이용하여 탄저 방어항원에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 발굴하였다.
이는 기존의 항체나 엡타머를 이용한 진단방식과 차별화 되며 펩타이드의 물리, 화학적 안정성을 이용한 다양한 나노바이오 센서와 연계가 가능할 것으로 기대할 수 있다.
본 발명에 따르면, 탄저 진단 탐침으로써 탄저독소 단백질인 PA와 특이적으 로 결합하는 펩타이드를 발굴하고 이들의 아미노산 서열 및 결합특성 분석함으로써 이에 대한 자료를 확보하였다.
상기 펩타이드 탐침은 뉴클레오타이드 엡타머와 달리 항체와 같은 아미노산으로 구성되어 보다 다양한 조합의 특이성을 가지며 단순한 3차원적 구조로 인한 높은 물리, 화학적 안정성으로 다양한 신호증폭 방법의 연구에 큰 도움이 될 수 있을 것으로 기대된다.
이를 통한 보다 높은 민감도를 가지는 진단법확보를 통하여 질병의 조기진단 및 모니터링 시스템 구축하여 대사성질환, 암, 감염성질환등에 대한 높은 기대효과를 창출할 것으로 예상된다.
더 나아가 본 기술은 진단 기술의 자산화로 국가 기술 경쟁력 확보 및 차세대 미래형 비즈니스 창출에도 일조할 것으로 판단된다.
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Claims (21)

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  4. 탄저 독소단백질 방어항원과 특이적으로 결합하여, 탄저 감염 진단 저분자 피코몰 탐침으로 작용하는 진단용 펩타이드 탐침에 있어서, 상기 펩타이드의 아미노산 서열은 서열목록 1로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 진단용 펩타이드 탐침.
  5. 제4항에 있어서, 상기 서열목록 1로 표시되는 아미노산 서열 LSHNQTIQQDSD 중 두번째 아미노산인 S가 T로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 진단용 펩타이드 탐침.
  6. 제4항에 있어서, 상기 서열목록 1로 표시되는 아미노산 서열 LSHNQTIQQDSD 중 다섯번째 아미노산인 Q가 L로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 진단용 펩타이드 탐침.
  7. 제4항에 있어서, 상기 서열목록 1로 표시되는 아미노산 서열 LSHNQTIQQDSD 중 일곱번째 아미노산인 I이 L로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 진단용 펩타이드 탐침.
  8. 제4항에 있어서, 상기 서열목록 1로 표시되는 아미노산 서열 LSHNQTIQQDSD 중 열번째 아미노산인 D가 A로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 진단용 펩타이드 탐침.
  9. 제4항에 있어서, 상기 서열목록 1로 표시되는 아미노산 서열 LSHNQTIQQDSD 중 두번째 아미노산인 S가 T로, 다섯번째 아미노산인 Q가 L로, 일곱번째 아미노산인 I가 L로, 열번째 아미노산인 D가 A로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 진단용 펩타이드 탐침.
  10. 탄저 독소단백질 방어항원과 특이적으로 결합하여, 탄저 감염 진단 저분자 피코몰 탐침으로 작용하는 진단용 펩타이드 탐침에 있어서, 상기 펩타이드의 아미노산 서열은 서열목록 2로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 진단용 펩타이드 탐침.
  11. 제10항에 있어서, 상기 서열목록 2로 표시되는 아미노산 서열 HKHAHNYRLPXS 중 일곱번째 아미노산인 Y가 T로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 진단용 펩타이드 탐침.
  12. 탄저 독소단백질 방어항원과 특이적으로 결합하여, 탄저 감염 진단 저분자 피코몰 탐침으로 작용하는 진단용 펩타이드 탐침에 있어서, 상기 펩타이드의 아미노산 서열은 서열목록 3으로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 진단용 펩타이드 탐침.
  13. 탄저 독소단백질 방어항원과 특이적으로 결합하여, 탄저 감염 진단 저분자 피코몰 탐침으로 작용하는 진단용 펩타이드 탐침에 있어서, 상기 펩타이드의 아미노산 서열은 서열목록 4로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 진단용 펩타이드 탐침.
  14. 탄저 독소단백질 방어항원과 특이적으로 결합하여, 탄저 감염 진단 저분자 피코몰 탐침으로 작용하는 진단용 펩타이드 탐침에 있어서, 상기 펩타이드의 아미노산 서열은 서열목록 5로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 진단용 펩타이드 탐침.
  15. 제14항에 있어서, 상기 서열목록 5로 표시되는 아미노산 서열 GHKPQVHRHTHI 중 첫번째 아미노산인 G가 A로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 진단용 펩타이드 탐침.
  16. 제14항에 있어서, 상기 서열목록 5로 표시되는 아미노산 서열 GHKPQVHRHTHI 중 두번째 아미노산인 H가 L로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 진단용 펩타이드 탐침.
  17. 제14항에 있어서, 상기 서열목록 5로 표시되는 아미노산 서열 GHKPQVHRHTHI 중 열두번째 아미노산인 I가 L로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 진단용 펩타이드 탐침.
  18. 제14항에 있어서, 상기 서열목록 5로 표시되는 아미노산 서열 GHKPQVHRHTHI 중 첫번째 아미노산인 G가 A로, 두번째 아미노산인 H가 L로, 열두번째 아미노산인 I가 L로 치환된 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 진단용 펩타이드 탐침.
  19. 탄저 독소단백질 방어항원과 특이적으로 결합하여, 탄저 감염 진단 저분자 피코몰 탐침으로 작용하는 진단용 펩타이드 탐침에 있어서, 상기 펩타이드의 아미노산 서열은 서열목록 6으로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 진단용 펩타이드 탐침.
  20. 탄저 독소단백질 방어항원과 특이적으로 결합하여, 탄저 감염 진단 저분자 피코몰 탐침으로 작용하는 진단용 펩타이드 탐침에 있어서, 상기 펩타이드의 아미노산 서열은 서열목록 7로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 진단용 펩타이드 탐침.
  21. 탄저 독소단백질 방어항원과 특이적으로 결합하여, 탄저 감염 진단 저분자 피코몰 탐침으로 작용하는 진단용 펩타이드 탐침에 있어서, 상기 펩타이드의 아미노산 서열은 서열목록 8로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 진단용 펩타이드 탐침.
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